KR20200103020A - 코돈쌍 탈최적화 영역을 가진 재조합 바이러스 및 암 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

코돈쌍 탈최적화 영역을 가진 재조합 바이러스 및 암 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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존 로버트 콜먼
스테판 뮬러
첸 양
잉 왕
찰스 스토프트
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코다제닉스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 다양한 형태의 악성 종양 치료를 위해 디자인된 재조합 바이러스의 용도이다. 본 발명의 재조합 바이러스는 야생형 바이러스의 하나 이상의 영역이 인간 코돈쌍 편향에 대해 코돈쌍 스코어를 감소시키거나, 또는 CpG 디-뉴클레오티드에 대한 수를 증가시키거나, 또는 UpA 디-뉴클레오티드의 수를 증가시키는 합성 재코딩된 서열로 교환된 것이다. 본 발명의 방법은 특히 유방, 피부, 결장, 기관지 통로, 위장관의 상피 표면, 상기도 및 비뇨-생식관, 간, 전립선 및 뇌와 같은 다양한 장기의 악성 종양 치료에 유용하다. 악성 다형 교모세포종의 치료뿐만 아니라, 유방암 및 흑색종의 치료에 있어서 실험 동물에서 놀라운 완화를 나타내었다.

Description

코돈쌍 탈최적화 영역을 가진 재조합 바이러스 및 암 치료를 위한 이의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2017년 12월 22일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/609,945호, 2018년 3월 8일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/640,362호, 2018년 5월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/677,132호, 및 2018년 3월 8일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/640,355호에 대한 우선권 주장을 포함하며, 각 전문은 본원에 참조로 통합된다.
발명 분야
본 발명은 암 치료에 사용되는 복수의 뉴클레오티드 치환을 함유하는 변형된 바이러스 게놈을 포함하는 변형된 바이러스에 관한 것이다. 상기 뉴클레오티드 치환으로 코돈의 다른 동의 코돈 (synonymous codon)에 대한 교환 및/또는 코돈 재배열 및 코돈쌍 편향 (codon pair bias)의 변이를 유도한다. 이들 변형된 바이러스는 악성 종양 치료에 사용된다.
본원에서 모든 공보는 각 개별 공보 또는 특허 출원이 참고로 통합되는 것으로 명시적 및 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 참고로 통합된다. 하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 또는 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 또는 구체적 또는 암시적으로 참조된 임의의 공보가 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
합성 바이러스학
DNA 합성 기술의 급속한 향상은 바이러스학에서 사용된 전통적인 방법에 혁명을 가져올 것이다. 바이러스 게놈의 상이한 영역의 기능을 제거하는데 전통적으로 사용되는 접근법 중 하나는 바이러스 균주의 게놈에서 작은 서열 변이의 영향을 탐색하기 위해 부위-지정 돌연변이 유발을 광범위하지만 힘들게 사용하였다. 그러나, 바이러스 게놈, 특히 RNA 바이러스 게놈은 10,000개 미만의 염기 길이로 상대적으로 짧아서, 현재 이용 가능한 기술을 사용하여 전체 게놈 합성을 가능하게 한다. 최근에 개발된 마이크로플루이딕 칩-기반 기술 (microfluidic chip-based technologies)은 각각 수백 달러에 불과한 사양으로 디자인된 새로운 게놈의 드 노보 (de novo) 합성을 수행할 수 있다. 이는 전통적인 클로닝 방법으로는 실질적으로 불가능한 정도까지 기존 서열의 조절 또는 완전히 새로운 코딩 서열의 생성을 허용한다. 이러한 디자인의 자유는 하기를 위해 DNA/RNA 코딩 서열의 대규모 재디자인을 수행할 수 있는 엄청난 파워를 제공한다: (1) 바이러스 번역 및 복제 효율에 있어서 코돈 편향, 코돈쌍 편향 및 RNA 2차 구조와 같은 파라미터 변경의 영향을 연구하기 위해; (2) 성공적인 바이러스 재현을 위해 필요한 알려져 있지 않은 조절 요소 및 다른 신호에 대해 효율적인 전체 게놈 스캔을 수행하기 위해; (3) 바이러스 균주의 유전자 조작 및 항-바이러스 백신 디자인을 위한 새로운 생명공학을 개발하기 위해; (4) 종양용해 요법에서 사용하기 위한 변형된 바이러스를 합성하기 위함.
폴리오바이러스의 역유전학
역유전학 (Reverse genetics)은 일반적으로 고전 유전학의 이른바 포워드 유전자 접근법 (forward genetic approaches)과는 반대 방향으로 진행하는 유전자 기능을 발견하기 위한 실험적 접근법을 지칭한다. 즉, 포워드 유전자 접근법은 표현형 특성의 유전적 기초를 설명함으로써 유전자 기능을 결정하고자 하였고, 역유전학에 기반한 전략은 단리된 유전자로 시작하여 야생형 또는 돌연변이된 유전자의 발현에 의해 생성된 가능한 표현형을 조사함으로써 그 기능을 발견하고자 하였다. 바이러스 시스템과 관련하여 본원에서 사용되는, "역유전학" 시스템은 RNA로 만들어진 바이러스 게놈의 유전자 조작을 허용하는 기술의 이용가능성을 지칭한다. 간단하게, 바이러스 게놈는 비리온 (virions) 또는 감염된 세포로부터 단리되고, 역전사 효소에 의해 DNA ("cDNA")로 전환되며, 가능하다면 원하는 대로 변형되고, 통상 RNA 중간체를 통해 감염성 바이러스 입자로 역전된다. 피코르나바이러스 (picornaviruses)에서 이 과정은 매우 간단하며; 사실상, 임의의 동물 RNA 바이러스에 대해 개발된 최초의 역유전학 시스템은 PV용이었다. 바이러스 역유전학 시스템은 네이키드 (naked) 바이러스 게놈 RNA가 적절한 포유동물 세포로 형질감염될 때 감염성이 있다는 역사적 발견에 기초한다. 1970년대 역전사효소의 발견 및 분자 클로닝 기술의 개발로 과학자들은 RNA 바이러스 게놈의 cDNA 카피를 생성하고 조작할 수 있었다. 가장 일반적으로, 게놈의 전체 cDNA 카피는 파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 하류에서 즉시 클로닝되어, 게놈 RNA의 인 비트로 (in vitro) 합성을 허용하고, 이어서 바이러스 생성을 위해 세포로 형질감염된다. 대안으로서, 동일한 DNA 플라스미드가 세포질에서 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포로 형질감염될 수 있다.
바이러스 게놈의 드 노보 합성
컴퓨터-기반 알고리즘을 사용하여 바이러스 게놈을 드 노보 디자인 및 합성하였다. 본원에 기재된 변형된 PV의 합성에 의해 예시되는, 이들 합성된 게놈은 야생형 (wt) 바이러스와 정확하게 동일한 단백질을 코딩하지만, 대체 동의 코돈을 사용함으로써, 코돈 편향, 코돈쌍 편향, RNA 2차 구조 및/또는 디뉴클레오티드 함량을 포함하는 다양한 파라미터가 변경된다. 제시된 데이터는 이들 코딩-비의존적 변경이 종종 단백질의 불량한 번역으로 인해 고도로 변형된 바이러스를 생성한다는 것을 보여 주었다.
본원에서 사용되는 "변형된 바이러스" 및 "변형된 바이러스들"은 달리 지시하지 않는 한, 이들 게놈의 전부 또는 일부가 동의 코돈 및/또는 코돈 재배열 및 코돈쌍 편향의 변이를 갖는 바이러스 및 바이러스들을 지칭한다. 본 발명의 변형된 바이러스는 암 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 재조합 바이러스는 달리 지시하지 않는 한, 변형된 바이러스이다.
모든 바이러스의 기본적인 기능, 즉 단백질 번역을 표적으로 함으로써, 종양용해 요법을 수행하는데 유용한, 변형된 바이러스를 예측 가능하고, 안전하며, 신속하고, 저렴하게 생성하기 위해 본원에 기재된 본 발명의 방법이 개발되었다. PV 캡시드 (capsid) 코딩 영역에서 코돈 및 코돈쌍 탈최적화 모두는 PV 적합성 (fitness)을 크게 감소시키는 것으로 본원에 개시되어 있다. 본 발명은 동의 코돈의 치환을 통한 바이러스 약독화에 기반하는 임의의 특정 분자 기전으로 제한되지 않는다.
대체 코딩
주어진 펩티드는 다수의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 짧은 10-mer 올리고펩티드는 대략 410 　(약 106)개의 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있으며, PV의 단백질은 약 10442개의 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 자연 선택은 궁극적으로 이들 가능한 10442개의 핵산 중 하나를 PV 게놈으로서 선택하였다. 1차 아미노산 서열은 주어진 mRNA에 의해 코딩된 가장 중요한 수준의 정보인 반면에, 상이한 종류의 RNA 서열 내에 추가적인 종류의 정보가 존재한다. 이들은 구별되는 기능의 RNA 구조 요소 (예: PV의 경우, cis-작용 복제 요소, 또는 CRE, 번역 키네틱 신호 (정지 부위, 프레임이동 부위 등), 폴리아데닐화 신호, 스플라이스 신호, 효소 기능 (리보자임) 및 아직 확인되지 않은 정보 및 신호와 같은 다른 가능성)를 포함한다.
CRE와 같은 신호가 보존되어야 한다는 경고에도 불구하고, 10442개의 가능한 코딩 서열은 동일한 단백질을 코딩하는 능력을 유지하면서 폴리오 (polio)의 RNA 서열을 크게 변화시킬 수 있는 상당한 유연성을 제공한다. 코돈 편향 또는 코돈쌍 편향에서 변경이 만들어질 수 있고, RNA에서 핵산 신호 및 2차 구조가 부가되거나 또는 제거될 수 있다. 추가 또는 신규한 단백질은 대체 프레임에서 동시에 코딩될 수 있다.
코돈쌍 편향
코딩 서열의 구별되는 특징은 이의 코돈쌍 편향이다. 이는 8개의 상이한 코돈쌍에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 쌍 Ala-Glu를 고려함으로써 예시될 수 있으며, 상기 쌍은 인간 세포에서 인간 및 바이러스 유전자의 번역에 영향을 주는 편향을 가질 수 있다 (표 1). 각 개별 코돈의 빈도 (표 2에 개시됨) 이외의 요인이 코돈쌍의 빈도를 담당하지 않는 경우, 8개의 코딩 각각의 예상 빈도는 2개의 관련 코돈의 빈도를 곱하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 상기 계산에 의해, 코돈쌍 GCA-GAA는 모든 Ala-Glu 코딩쌍으로부터 0.097의 빈도로 발생할 것으로 예상될 것이다 (0.23Х0.42; 표 2의 빈도에 기반함). 각 코돈쌍의 예상 (가정) 빈도를 인간 게놈에서 실제 관찰되는 빈도와 연관시키기 위해, 총 14,795개의 인간 유전자를 함유하는 일관되게 주석이 달린 인간 코딩 영역의 컨센서스 CDS (Consensus CDS: CCDS) 데이터베이스를 사용하였다. 이 유전자 세트는 인간 코딩 서열의 가장 포괄적인 표현이다. 이 유전자 세트를 사용하여, 코돈 사용의 빈도는 코돈의 발생 수를 동일한 아미노산을 코딩하는 모든 동의 코돈의 수로 나눔으로써 재계산되었다. 예상되는 바와 같이, 상기 빈도는 표 2에 제공된 것과 같이 이전에 공개된 빈도와 밀접한 상관관계가 있었다. 약간의 빈도 변동은 Kazusa DNA Research Institute (http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)의 코돈 사용 데이터베이스에 의해 제공된 데이터에서 오버샘플링 효과 (oversampling effect)에 기인하며, 여기서 84949개의 인간 코딩 서열이 상기 계산에 포함되었다 (실제 인간 유전자 수보다 훨씬 많음). 그 다음에 이와 같이 계산된 코돈 빈도를 사용하여 먼저 2개의 관련 코돈의 빈도를 서로 곱한 후에 (표 1 예상 빈도 참조), 그 다음에 상기 결과에 해당 코돈쌍에 의해 코딩된 아미노산 쌍이 발생하는 관찰된 빈도 (전체 CCDS 데이터 세트)를 곱하여 예상 코돈쌍 빈도를 계산하였다. 코돈쌍 GCA-GAA의 예에서, 상기 두번째 계산은 0.098의 예상 빈도를 제공한다 (Kazusa 데이터세트를 사용한 첫번째 계산에서 0.97과 비교됨). 마지막으로, 14,795개의 인간 유전자 세트에서 관찰되는 실제 코돈쌍 빈도는 상기 세트에서 각 코돈쌍의 총 발생 수를 계수하고, 상기 세트에서 동일한 아미노산 쌍을 코딩하는 모든 동의 코딩쌍의 수로 이를 나눔으로써 결정되었다 (표 2; 관찰된 빈도). 8개의 상이한 코돈쌍에 의해 코딩될 수 있는, 아미노산 쌍 Ala-Glu에 대한 빈도 및 관찰된/예상 값은 표 1 및 14,795개의 인간 유전자 세트에 기반한 3721 (612)개의 코돈쌍의 완전한 세트 (Coleman et al. 2008)에 제시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 코돈쌍의 관찰된 빈도/예상 빈도의 비율이 1보다 크면, 상기 코돈쌍은 과표현 (overrepresented)된다고 한다. 상기 비율이 1보다 작으면, 이는 저표현 (underrepresented)된다고 한다. 상기 예에서, 코돈쌍 GCA-GAA는 1.65배 과표현되고, 코딩쌍 (coding pair) GCC-GAA는 5-배 초과로 저표현된다.
많은 다른 코돈쌍은 매우 강한 편향을 보이며; 일부 쌍은 저표현되지만, 다른 쌍은 과표현된다. 예를 들면, 코돈쌍 GCCGAA (AlaGlu) 및 GATCTG (AspLeu)는 3배 내지 6배 저표현되며 (바람직한 쌍은 각각 GCAGAG 및 GACCTG임), 코돈쌍 GCCAAG (AlaLys) 및 AATGAA (AsnGlu)는 약 2배 과표현된다. 코돈쌍 편향은 아미노산 쌍의 빈도 또는 개별 코돈 빈도와 관련이 없다는 것이 주목할 만하다. 예를 들면, 저표현된 쌍 GATCTG (AspLeu)는 가장 빈번한 Leu 코돈인 (CTG)을 사용한다.
코돈쌍 편향은 원핵생물 세포에서 발견되었지만, 이후 인간을 포함하는 모든 다른 검사된 종에서 관찰되었다. 상기 효과는 매우 높은 통계적 유의성을 가지며, 확실히 노이즈 (noise) 만은 아니다. 그러나, 이의 기능적 유의성은 미스터리이다. 하나의 제안은 tRNA의 일부 쌍이 리보솜 상에 함께 모이는 경우 잘 상호작용하지만, 다른 쌍은 충분하지 않게 상호작용한다는 것이다. 상이한 코돈이 상이한 tRNA에 의해 통상 판독되기 때문에, 코돈쌍은 비호환성 tRNA 쌍이 함께 모이는 것을 피하기 위해 편향될 수 있다. 다른 아이디어는 많은 (전부는 아님) 저표현된 쌍이 중심 CG 디뉴클레오티드 (예: GCCGAA, AlaGlu 코딩)를 가지며, 상기 CG 디뉴클레오티드는 포유동물에서 조직적으로 저-표현된다는 것이다. 따라서, 코돈쌍 편향 효과는 2가지 종류를 가질 수 있으며, 하나는 포유동물 게놈에서 CG 저-표현의 간접적 효과이고, 다른 하나는 번역 효율, 속도 및/또는 정확도와 관련된다. 본 발명은 코돈쌍 편향의 임의의 특정 분자 기전에 한정되지 않는다는 것이 강조된다.
코돈쌍 편향 계산
코돈쌍 (예: GTT-GCT)을 함유하는 가능한 3721개의 비-"STOP"의 모든 개별 코돈쌍은 주어진 유전자의 "트레이닝 세트 (training set)"에 특이적인, 배정된 "코돈쌍 스코어 (codon pair score)" 또는 "CPS"를 지니고 있다. 주어진 코돈쌍의 CPS는 상기 유전자 세트 (본 예에서 인간 게놈)에서 예상될 수 있는 수에 대한 관찰된 발생 수의 로그 비율 (log ratio)로서 정의된다. 특정 코돈쌍의 실제 발생 수 (또는 특정 아미노산 쌍이 특정 코돈쌍에 의해 코딩될 가능성)를 결정하는 것은 단순히 특정 코딩 서열 세트에서 코돈쌍의 실제 발생 수를 계수하는 문제이다. 그러나, 예상되는 수를 결정하려면 추가적 계산을 필요로 한다. 예상되는 수는 Gutman 및 Hatfield와 유사하게 아미노산 빈도 및 코돈 편향 모두와는 무관하게 계산된다. 즉, 예상 빈도는 아미노산이 특정 코돈에 의해 코딩되는 횟수의 상대적 비율에 기초하여 계산된다. 포지티브 CPS 값은 주어진 코돈쌍이 인간 게놈에서 통계적으로 과-표현된 것을 나타내고, 네가티브 CPS 값은 상기 쌍이 통계적으로 저-표현된 것을 나타낸다.
인간의 맥락에서 이들 계산을 수행하기 위해, 총 14,795개의 유전자를 함유하고, 일관되게 주석이 달린 인간 코딩 영역의 최신 컨센서스 CDS (CCDS) 데이터베이스를 사용하였다. 상기 데이터 세트는 코돈 및 코돈쌍, 따라서 게놈 규모로 아미노산 및 아미노산 쌍 빈도를 제공하였다.
Federov 등 (2002)의 패러다임은 Gutman 및 Hatfield (1989)의 접근 방식을 추가적으로 향상시키는데 사용하였다. 이는 특정 아미노산 쌍을 코딩하는 이웃 코돈 (neighboring codons)의 코돈 빈도 및 비-무작위 회합과 무관하게 주어진 코돈쌍의 예상 빈도를 계산하게 하였다. CPB를 계산하는데 사용되는 상세한 식은 WO 2008/121992 및 WO 2011/044561에 개시되어 있고, 이는 참고로 통합된다.
Figure pct00005
상기 계산에서, Pij는 이의 동의 그룹에서 NO(Pij)의 빈도로 발생하는 코돈쌍이다. Ci 및 Cj는 이들의 동의 그룹에서 각각 빈도 F(Ci) 및 F(Cj)로 발생하는, Pij를 포함하는 2개의 코돈이다. 보다 구체적으로, F(Ci)는 상응하는 아미노산 Xi가 모든 코딩 영역에 걸쳐 코돈 Ci에 의해 코딩되는 빈도이고, F(Ci)=NO(Cj)/NO(Xi), 여기서 NO(Ci) 및 NO(Xi)는 코돈 Ci 및 아미노산 Xi　각각의 관찰된 발생 수이다. F(Cj)는 이에 따라 계산된다. 또한 NO(Xij)는 모든 코딩 영역에 걸쳐 아미노산 쌍 Xij의 발생 수이다. Pij의 코돈쌍 편향 스코어 S(Pij)는 Ne(Pij)의 예상된 발생 수에 대한 관찰된 빈도 No(Pij)의 로그-오드 비율 (log-odds ratio)로서 계산되었다.
상기 식을 사용하여, 개별 코딩 서열에서 개별 코돈쌍이 과표현되거나 또는 저표현되는 지의 여부는 전체 인간 CCDS 데이터 세트를 사용하여 계산된 상응하는 게놈 Ne(Pij) 값과 비교하여 결정하였다. 상기 계산 결과, 포지티브 S(Pij) 스코어 값은 인간 코딩 영역에서 과-표현된 코돈쌍을 나타내고, 네가티브 값은 저표현된 코돈쌍을 나타낸다.
개별 코딩 서열의 "조합된" 코돈쌍 편향은 하기 식에 따라 모든 코돈쌍 스코어를 평균하여 계산하였다:
Figure pct00006
따라서, 전체 코딩 영역의 코돈쌍 편향은 상기 영역을 포함하는 개별 코돈쌍 스코어 모두를 더하고, 이의 합을 코딩 서열의 길이로 나눔으로써 계산된다.
코돈쌍 편향의 계산, 코돈쌍 편향을 변경하기 위한 알고리즘 구현
코돈쌍 편향을 정량화하기 위한 알고리즘을 개발하였다. 모든 가능한 개별 코돈쌍에 "코돈쌍 스코어" 또는 "CPS"를 부여하였다. CPS는 모든 인간 코딩 영역에 걸쳐 각 코돈쌍의 예상되는 발생 수에 대한 관찰된 발생 수의 비율의 자연 로그 (natural log)로서 정의되며, 여기서 인간은 재코딩되는 (recoded) 본 백신 바이러스의 숙주 종을 나타낸다.
Figure pct00007
특정 코돈쌍의 관찰된 발생의 계산은 간단하지만 (유전자 세트 내의 실제 계수), 코돈쌍의 예상되는 발생 수는 추가적인 계산을 필요로 한다. 본 발명자는 Gutman 및 Hatfield와 유사하게 아미노산 빈도 및 코돈 편향과는 무관하게 예상되는 수를 계산하였다. 즉, 상기 예상 빈도는 아미노산이 특정 코돈에 의해 코딩되는 횟수의 상대적 비율에 기반하여 계산하였다. 포지티브 CPS 값은 주어진 코돈쌍이 통계적으로 과-표현된 것을 나타내고, 네가티브 CPS 값은 상기 쌍이 인간 게놈에서 통계적으로 저-표현된 것을 나타낸다.
이들 계산된 CPS를 사용하여, 임의의 코딩 영역은 코돈쌍 스코어의 평균을 취하여 과표현 또는 저표현된 코돈쌍을 사용하는 것으로 평가될 수 있고, 따라서 전체 유전자에 대한 코돈쌍 편향 (CPB)을 제공한다.
Figure pct00008
하기에서 추가적으로 논의되는 바와 같이, 코돈쌍 편향은 코딩 서열의 전체 길이에 대해 평균된 코딩 서열에서 각 코돈쌍에 대한 스코어를 고려한다. 본 발명에 따르면, 코돈쌍 편향은 하기 식에 의해 결정된다:
Figure pct00009
따라서, 코딩 서열에 대한 유사한 코돈쌍 편향은 예를 들어, 부분서열에 대해 최소화된 코돈쌍 스코어 또는 코딩 서열의 전체 길이에 대해 약간 감소된 코돈쌍 스코어에 의해 수득될 수 있다.
모두 61개의 센스 코돈 (sense codons) 및 모든 센스 코돈쌍 (sense codon pairs)이 확실하게 사용될 수 있기 때문에, 단일 희귀 코돈 (rare codon)을 빈번한 코돈으로 치환하거나, 또는 희귀 코돈쌍을 빈번한 코돈쌍으로 치환하는 것이 큰 효과가 있을 것으로 예상되지 않는다. 정확한 기전에 관계 없이, 상기 데이터는 동의 탈최적화 코돈의 바이러스 게놈으로의 대규모 치환으로 심각하게 약독화된 바이러스가 유도되는 것을 나타낸다. 변형된 바이러스를 생성하는 이러한 절차는 SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering)라고 한다.
본 발명의 양상에 따르면, 바이러스 변형은 바이러스 게놈의 하나 이상의 부분에서 코돈 편향뿐만 아니라 코돈쌍 편향의 변화에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 코돈쌍 편향을 조정하는 것이 특히 유리할 것으로 예상된다. 예를 들어, 코돈 편향을 통해 바이러스를 약독화하는 것은 일반적으로 공통 코돈의 제거를 필요로 하므로, 뉴클레오티드 서열의 복잡성이 감소된다. 대조적으로, 코돈쌍 편향 감소 또는 최소화는 더 큰 서열 다양성을 유지하면서 달성될 수 있고, 결과적으로 핵산 2차 구조, 어닐링 온도 및 다른 물리적 및 생화학적 특성을 보다 제어할 수 있다. 본원에 개시된 연구는 코돈이 셔플 (shuffle)되지만, 코돈 사용 프로파일은 변화되지 않는, 변형된 코돈쌍 편향-감소 또는 -최소화된 서열을 포함한다.
악성 종양은 장기에서 세포의 조절되지 않는 성장으로부터 기인하는 것으로 알려져 있다. 종양 침습, 기능성 조직의 대체, 필수 자원의 경쟁 및 종종 2차 부위로의 전이성 확산에 의해 정상 장기 기능이 심각하게 손상될 수 있는 정도로 종양이 성장한다. 악성 암은 미국에서 주요 사망 원인의 두번째이다.
현재까지, 악성 종양을 치료하는 방법은 외과적 절제술, 방사선 및/또는 화학요법을 포함한다. 그러나, 다수의 악성 종양은 모든 전통적으로 이용 가능한 치료 옵션에 충분하지 않게 반응하여, 알려진 실시 방법에 대해 심각한 유해 부작용이 있다. 통상적으로 실시된 치료 요법의 효율을 증가시키면서 부작용의 심각도를 감소시키기 위한 많은 진보가 있었다. 그러나, 많은 문제가 여전히 남아 있고, 대체 치료 방식에 대한 연구가 필요하다. 특히 중추 신경계의 원발성 악성 종양에 대한 연구가 시급하다. 뇌 종양, 특히 교모세포종 (glioblastomas)은 가장 어려운 치료 과제 중 하나이다. 수술, 방사선 및 화학요법을 단독 및 조합한 적용에도 불구하고, 교모세포종은 거의 항상 치명적이며, 중간 생존율은 1년 미만이고, 5년 생존율은 5.5% 이하이다. 이용 가능한 치료 방식 중 어느 것도 교모세포종의 끊임 없는 진행을 실질적으로 변화시키지 못했다.
악성 신경아교종 (glioma)으로 진단받고, 수술하여 전부 또는 일부의 종양을 제거한 후에 화학요법 및/또는 방사선 요법을 받은 환자의 체계적인 연구에서 1년 후 생존율은 특히 환자가 60세 이상인 경우 매우 낮은 것을 보여 주었다. 악성 신경아교종은 방사선 및 화학요법에 대해 상대적으로 저항성이 있는 것으로 입증되었다. 외과적 절제 및 보조 방사선/화학요법 후에 국소 재발에 대한 빈번한 경향이 악성 신경아교종에 대한 불량한 예후에 추가된다.
최근에, 암 치료를 위해 바이러스를 하기와 같이 사용하는 것에 대한 제안이 있었다: (1) 유전자 전달 비히클; (2) 병원성 특징을 상실하도록 유전자 변형된 바이러스를 사용하는 직접 종양용해 제제; 또는 (3) 상기 목적을 위해 유전자 조작된 바이러스를 사용하여 악성 세포를 선택적으로 손상시키는 제제.
악성 신경아교종에 대한 바이러스 사용의 예는 하기를 포함한다. 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex Virus) dlsptk (HSVdlsptk)는 HSV의 티미딘 키나제 (TK)-음성 돌연변이체이다. 상기 바이러스는 TK 유전자에서 360-염기-쌍 결실로 인해 신경독성 (neurovirulence)이 약독화되며, 이의 산물은 정상 바이러스 복제에 필수적이다. HSVdlsptk는 악성 세포를 빠르게 분열시켜서 세포 용해 및 사멸을 야기하는 전파 가능성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 불행하게도, 약독화된 신경병원성 (neuropathogenicity)을 가진 모든 결함이 있는 헤르페스 바이러스는 실험 동물에서 심각한 뇌염 증상과 연관되어 있다. 예를 들어, HSVdlsptk로 뇌내 감염된 마우스에서, LD50　Ic 　(두개내 투여)는 106pfu로, 다소 낮은 용량이다. 이는 상기 돌연변이체 HSV의 사용을 제한한다. HSV의 다른 돌연변이체가 제안되고 시험되었다. 그럼에도 불구하고, 바이러스성 뇌염으로 인한 사망은 여전히 문제이다.
다른 제안은 HSV tk 유전자를 함유하도록 조작된 레트로바이러스 (retroviruses)를 사용하여 간시클로비르 (gancyclovir) 또는 아시클로비르 (acyclovir)와 같은 뉴클레오시드 유사체의 인 비보 (in vivo) 인산화를 유발하는 티미딘 키나제를 발현시켜서, DNA 복제를 차단하고 분열하는 세포를 선택적으로 사멸시키는 것이다. Izquierdo, M., et al.,　Gene Therapy,　2:66-69 (1995)는 HSV tk 유전자를 그 자신의 프로모터에 삽입하여 조작된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (Moloney murine Leukemia Virus: MoMLV)의 사용을 보고하였다. 치료용 레트로바이러스의 종양내 (intraneoplastic) 접종으로 치료된 교모세포종 환자를 MRI에 의한 추적 관찰에서, 명백한 단기 부작용 없이 종양 수축을 나타내었다. 그러나, 실험 요법은 이환 환자의 단기 또는 장기 생존에는 영향을 미치지 않았다. 레트로바이러스 요법은 전형적으로 심각한 장기간 부작용의 위험과 관련이 있다 (예: 삽입 돌연변이유발).
아데노바이러스 (adenovirus) 감염에 자연적으로 취약한 조직내에서 유래하고 용이하게 접근 가능한 종양인, 상기도 악성종양을 표적으로 하는 유사한 시스템이 개발되었다. 그러나, 광범위한 이종 세포 타입 (따라서 다형 교파 (denomination multiforme))으로 구성된 고도 악성 종양인 다형 교모세포종 (Glioblastoma multiforme)은 매우 가변적인 유전자형을 특징으로 하며, 균일한 유전자 이상을 갖는 동종 종양에 대한 종양용해 바이러스 시스템에 반응하지 않을 것이다.
본 발명의 바이러스 변형의 효과는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법으로 확인될 수 있다. 비-제한적인 예는 플라크 분석 (plaque assays), 성장 측정, RNA 바이러스의 역유전학, 및 시험 동물애서 치사율 감소를 유도한다. 본 출원은 변형된 바이러스가 숙주에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
하기 구체예 및 그의 양상은 범위를 제한하지 않고 예시 및 설명을 위한 것으로 의도된 조성물 및 방법과 함께 개시되고 예시된다.
본 발명의 목적은 다양한 타입의 암 치료를 위한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 항-PDL-1 항체 요법 또는 다른 면역-종양학 요법과 병용하여 사용될 수 있는, 다양한 타입의 암 치료를 위한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시켜서 암 세포 용해 및 사멸을 유도함으로써 암 세포를 치료하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시킴으로써 암 세포를 치료하고, 이에 의해 항-종양 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시킴으로써 암 세포를 치료하고, 이에 의해 PD-1, CTLA-4, IDO1, TIM3, lag-3과 같은 항-종양 면역 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 항-종양 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시킴으로써 암 세포를 치료하고, 이에 의해 종양에서 선천성 신호전달 수용체 RIG-I, STNG, 및 선천성 면역 전사 인자 IRF3, IRF7 또는 NFkB의 활성화를 통해 종양 세포에서 선천성 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시킴으로써 암 세포를 치료하고, 이에 의해 종양에서 선천성 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시키고, 이에 의해 종양에서 염증유발 (pro-inflammatory) 면역 반응을 유도함으로써 암 세포를 치료하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시키고, 이에 의해 염증유발 백혈구 세포를 종양으로 모집함으로써 암 세포를 치료하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 세포를 변형된 바이러스로 감염시키고, 이에 의해 상기 종양으로부터 조절 백혈구 세포를 감소시킴으로써 암 세포를 치료하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 치료를 위해 바이러스를 투여하기 전에, 수용자 (recipient)를 변형된 바이러스로 사전-치료하여 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 암 치료를 위해 바이러스의 천연 단리물을 투여하기 전에, 수용자를 변형된 바이러스로 사전-치료하여 면역 반응을 유도하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 신경아교종, 구체적으로 교모세포종의 치료 및 치유에 적합할 수 있는, 신규한 야생형 바이러스 변형된 바이러스 키메라를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 선암종 (adenocarcinomas), 구체적으로 자궁경부암 (cervical cancer) 치료에 적합할 수 있는, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 유방암 치료에 적합할 수 있는, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 면역퍼옥시다제 염색 (immunoperoxidase staining)에 의해 케라틴에 대해 양성인 암 세포 치료에 적합할 수 있는, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 p53 유전자 발현이 낮거나 또는 부재한 것으로 보고된 암 세포 치료에 적합할 수 있는, 신규한 변형된 바이러스를 추가로 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 세포가 차아이배수체 (hypodiploid)인 종양 치료에 적합할 수 있는, 신규한 변형된 바이러스를 추가로 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 폐 암종, 구체적으로 폐암 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 차아삼배수체 (hypotriploid) (예: 세포의 약 40%에서 64, 65 또는 66 크로모좀 수)인 암 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 세포당 크로모좀 N2 및 N6의 단일 카피를 갖는 암 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 효소 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PD)의 효소 중 이소효소 G6PD-B를 발현하는 암 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 흑색종 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 멜라닌세포 (melanocytes) 유래 악성 세포 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 신경모세포종 (neuroblastoma) 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 적어도 3-배의 MYCN 종양유전자 증폭을 갖는 암 치료에 적합한, 신규한 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 유방암 치료에 적합한, 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 방광암 치료에 적합한, 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 결장암 치료에 적합한, 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 전립선암 치료에 적합한, 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명의 추가적 목적은 말초 신경초 종양 (peripheral nerve sheath tumors) 치료에 적합한, 변형된 바이러스를 개발하는데 있다.
본 발명은 게놈의 하나 이상 (예: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상)의 위치에서 조작된 뉴클레오티드 치환을 함유하는 변형된 바이러스 게놈을 포함하는 변형된 바이러스를 제공하며, 상기 치환은 복수의 동의 코돈을 게놈에 도입한다. 상기 동의 코돈의 치환은 게놈에서 코돈 편향, 코돈쌍 편향, 탈최적화 코돈 및 탈최적화 코돈쌍의 밀도, RNA 2차 구조, CpG 디뉴클레오티드 함량, C+G 함량, UpA 디뉴클레오티드 함량, 번역 프레임이동 부위 (translation frameshift sites), 번역 정지 부위 (translation pause sites), 조직 특이적 마이크로RNA 인식 서열의 존재 또는 부재, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 다양한 파라미터를 변경한다. 관련된 다수의 결함으로 인해, 본 발명의 변형된 바이러스는 다양한 상이한 종양 타입에 대해 안정적으로 변형된 종양용해 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 모체 바이러스의 상응하는 서열과 동일한 바이러스 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 바이러스가 제공되며, 상기 변형된 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 이것이 유래된 모체 서열의 코돈을 함유하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 모체 바이러스의 뉴클레오티드 서열과 98% 미만의 동일성이다. 다른 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 모체 바이러스의 서열과 90% 미만의 동일성이다. 변형을 제공하는 치환된 뉴클레오티드 서열은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 250개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된다.
일 구체예에서, 모체 바이러스의 상응하는 서열과 유사한 바이러스 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 바이러스가 제공되며, 상기 변형된 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 모체 바이러스의 뉴클레오티드 서열과 98% 미만의 동일성인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 다른 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 모체 바이러스의 서열과 90% 미만의 동일성이다. 변형을 제공하는 치환된 뉴클레오티드 서열은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 250개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 상기 변형된 서열의 CpG 디-뉴클레오티드 함량은 상기 모체 바이러스에 대해 적어도 19, 또는 적어도 41 만큼 증가한다.
일 구체예에서, 모체 바이러스의 상응하는 서열과 유사한 바이러스 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 바이러스가 제공되며, 상기 변형된 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 상기 모체 바이러스의 뉴클레오티드 서열과 98% 미만의 동일성인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 다른 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 모체 바이러스의 서열과 90% 미만의 동일성이다. 변형을 제공하는 치환된 뉴클레오티드 서열은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 250개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 상기 변형된 서열의 UpA 디-뉴클레오티드 함량은 상기 모체 바이러스에 대해 적어도 13, 또는 상기 모체 바이러스에 대해 적어도 약 26 만큼 증가한다.
본 발명의 구체예는 또한 대상에서 치료를 위한, 상기 변형된 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암을 가진 대상에서 면역 반응을 유도하기 위한, 상기 변형된 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 야생형 숙주 세포에서 생존할 수 없는 변형된 바이러스에 대해 허용되도록 특별히 조작된 변형된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 변형된 바이러스는 변형된 바이러스 게놈을 숙주 세포로 형질감염시켜서, 변형된 바이러스 입자를 생성함으로써 제조된다. 본 발명은 또한 암 치료에 적합한 변형된 바이러스를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다양한 구체예는 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다: 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 상기 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 및 이들의 조합들.
본 발명의 다양한 구체예는 프라임 용량 (prime dose)의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및 하나 이상의 부스트 용량 (boost dose)의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 프라임 용량 및 부스트 용량의 변형된 바이러스는 하기로 구성된 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택된다: 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 및 이들의 조합들.
다양한 구체예에서, 상기 프라임 용량은 피하, 근육내, 피부내, 비강내 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 하나 이상의 부스트 용량은 종양내 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 하나 이상의 부스트 용량의 첫번째 부스트 용량은 1회 프라임 용량 후 약 2주후에, 또는 1회 초과의 프라임 용량인 경우 최종 프라임 용량 후 약 2주후에 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 대상은 암을 가질 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 대상은 암 발병 위험이 더 높을 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 프라임 용량은 상기 대상이 암을 갖지 않는 경우에 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 하나 이상의 부스트 용량은 상기 대상이 암을 갖지 않는 경우에 프라임 용량 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년마다 투여될 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 하나 이상의 부스트 용량은 상기 대상이 암으로 진단받은 후에 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 방법은 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 PD-1 저해제는 항-PD1 항체일 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 피딜리주맙 (pidilizumab), AMP-224, AMP-514, 스파르탈리주맙 (spartalizumab), 세미플리맙 (cemiplimab), AK105, BCD-100, BI 754091, JS001, LZM009, MGA012, Sym021, TSR-042, MGD013, AK104, XmAb20717, 티슬렐리주맙 (tislelizumab) 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 PD-1 저해제는 PF-06801591, 만능성 킬러 T 림프구를 발현하는 항-PD1 항체 (PIK-PD-1), 자가 항-EGFRvIII 4SCAR-IgT 세포 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체일 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 항-PD-L1 항체는 BGB-A333, CK-301, FAZ053, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 두르발루맙 (durvalumab), BMS-936559, CK-301 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 항-PD-L1 저해제는 M7824이다.
다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 악성 종양 재발 가능성을 감소시킬 수 있다. 다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 악성 종양과는 상이한 속발성 암을 가질 가능성을 감소시킬 수 있다.
다양한 구체예에서, 대상에서 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 상기 악성 종양의 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킬 수 있다.
다양한 구체예에서, 악성 종양의 완화 후에, 대상에서 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 상기 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킬 수 있다.
다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 종양에서 염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 염증유발 세포를 종양로 모집할 수 있다. 다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 항-종양 면역 반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 재조합 변형된 바이러스일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 피코르나바이러스 (picornavirus)로부터 변형될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 엔테로바이러스 (enterovirus)이다. 다양한 구체예에서, 상기 엔테로바이러스는 엔테로바이러스 C이다. 다양한 구체예에서, 상기 엔테로바이러스 C는 폴리오바이러스이다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 오르토믹소바이러스 (orthomyxovirus)로부터 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 오르토믹소바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus)일 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 세그먼트가 재코딩될 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 HA, NA 또는 HA 및 NA 영역 모두가 재코딩된다 (예: 탈최적화).
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 서열번호:5 또는 서열번호:6일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 플라비바이러스 (flavivirus)로부터 변형될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 플라비바이러스는 지카 바이러스 (Zika virus)일 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 지카 바이러스의 프리-멤브레인 (pre-membrane)/외피 (E) 코딩 영역, 또는 비구조 단백질 3 (NS3) 코딩 영역, 또는 이들 모두가 재코딩될 수 있다. 다양한 구체예에서, 재코딩은 E 및 NS3 코딩 서열에서 CG 및/또는 TA 디뉴클레오티드의 빈도를 변경하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 재코딩된 E 단백질-코딩 서열, 또는 NS3 코딩 서열, 또는 이들 모두는 -0.1 미만의 코돈쌍 편향을 가질 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 재코딩된 E 단백질-코딩 서열, 또는 NS3 코딩 서열, 또는 이들 모두는 0.1-0.4의 코돈쌍 편향 감소를 가질 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 악성 종양은 고형 종양일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 악성 종양은 교모세포종, 선암종, 흑색종, 폐 암종, 신경모세포종, 유방암, 방광암, 결장암, 전립선암 또는 간암일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 종양내, 정맥내, 뇌내, 근육내, 척추내 또는 경막내로 투여될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 PV1-MinY일 수 있고, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 제조되며, 이의 P1 영역의 중간 부분은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열로 치환된다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 재조합 변형된 바이러스는 PV1-MinY일 수 있고, 이전에 변형된 바이러스 PVl(M) 또는 야생형 바이러스 PV1(M)으로부터 제조되며, 이의 P1 영역의 중간 부분은 증가된 UpA 및 또는 CpG 디-뉴클레오티드를 위해 재코딩된 합성 서열로 치환된다.
다양한 구체예에서, 상기 재조합 바이러스는 PV1(M)으로부터 제조된 PV1-MinY일 수 있고, 상기 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 뉴클레오티드 단편은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환된다.
본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 변형된 바이러스는 PV1(M)으로부터 제조된 PV1-MinY이고, 상기 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470으로 구성된 뉴클레오티드 단편은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환된다.
본 발명의 다양한 구체예는 하기 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법을 제공한다: 야생형 피코르나바이러스의 P1 도메인에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편을 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환함으로써, 및 선택적으로 야생형 피코르나바이러스의 P1을 PV1(S), PV2(S) 및 PV3(S)로 구성된 그룹으로부터 선택된, 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 P1로 치환함으로써, 야생형 피코르나바이러스로부터 재조합 변형된 피코르나바이러스를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계.
다양한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편의 치환은 상기 변형된 바이러스의 P1 도메인인 서열번호:1의 nt#1513-nt#2470을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편을 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환하는 것을 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 재조합 바이러스는 종양내, 정맥내, 뇌내, 근육내, 척추내 또는 경막내로 투여되어, 종양 세포에서 세포 용해를 유도할 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 악성 종양은 다형 교모세포종, 속질모세포종 (medulloblastoma), 유방 암종, 전립선 암종, 결장직장 암종, 간세포 암종, 기관지 암종 및 표피모양 암종으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 엔테로바이러스 C 종일 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 폴리오바이러스일 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 P1 도메인은 사빈 백신 균주 (Sabin vaccine strains) PV1(S), PV2(S) 및 PV3(S)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 예로서 본 발명의 구체예의 다양한 특징을 예시하는 첨부 도면과 함께, 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
예시되는 구체예는 참조 도면에 도시되어 있다. 본원에 개시된 구체예 및 도면은 제한적인 것이 아니라 예시인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 모든 인간 ORF 및 합성 P1 영역의 코돈쌍 편향을 도시하였다. 모두 14,795개의 각주가 달린 인간 유전자에 대한 계산된 코돈쌍 편향 (CPB) 스코어. 각 회색 점은 이의 아미노산 길이에 대해 플로팅된 유전자의 계산된 CPB 스코어를 나타낸다. 상기 PV(M)-wt P1 영역의 CPB뿐만 아니라 디자인된 합성 폴리오바이러스 캡시드인 PV-Min, PV-MinXY, PV-MinZ 및 PV-Max의 CPB는 화살표와 라벨로 표시되었다.
도 2는 제작된 PV-Min 서브클론의 생존력을 도시하였다. (상단) 단일 오픈 리딩 프레임으로서 번역되는 폴리오바이러스 게놈. (하단) 분자 클로닝을 통해 제작된 다양한 키메라 합성 폴리오바이러스 제작물의 cDNA, 및 배양된 HeLa R19 세포에서 이의 생존력. 적어도 하나의 PV-Min의 세그먼트를 함유하는 바이러스를 수득하고, 어느 하나의 합성 영역 (X, Y 또는 Z)에서도 중대한 결함이 존재하지 않았다. 상기 영역들을 분리하는 뉴클레오티드 위치를 나타내었다. 모든 리딩 프레임에서 처음 12개의 뉴클레오티드 (4개 코돈)는 번역의 적절한 개시를 허용하기 위한 PV(M)-wt 서열이다. 서열에 해당하는 색상: 검정색: PV(M)-wt; 회색: PV-Min; 새치 (Thatched): PV-Max
도 3은 제작된 합성 바이러스의 성장 역가 (growth titer)를 도시하였다. 모든 생존 바이러스 제작물로부터 전사 RNA의 형질감염 후에 (도 4), 바이러스는 HeLa R19 세포에서 2회의 후속하는 계대배양을 통해 증폭되었다. 그 다음에 이들 바이러스가 성장한 역가를 HeLa R19 세포 단층 상에서 플라크 분석을 통해 측정하였다. PV-Max 및 PV(M)-wt 바이러스는 유사한 역가로 성장하였고 (~109), 반면에 PV-Min 키메라 바이러스는 더 낮은 PFU/ml 역가를 수득하였으며, 역가는 명백하게 단계적으로 감소하였다. PV-Min 서열의 P1 영역에의 부가는 PFU 역가를 감소시켰다. 그래프는 표준편차 값을 나타내는 오차 막대와 함께 3회 독립적 실험의 평균 역가를 나타내었다.
도 4A-4B는 번역에 있어서 변경된 코돈쌍 편향의 효과를 도시하였다. (도 4A) 디시스트론 리포터 (dicistronic reporter)의 구조. 제1 시스트론 (cistron)은 레닐라 루시퍼라제 (Renilla luciferase: R-Luc)의 번역을 개시하기 위해 C형 간염 바이러스 (HCV) IRES (Internal Ribosome Entry Site)를 사용한다. 상기 제1 시스트론은 입력 RNA의 양을 정규화하기 위해 내부 대조군을 제공한다. 제2 시스트론은 반딧불이 루시퍼라제 (Firefly luciferase: F-Luc)의 번역을 개시하기 위해 폴리오바이러스 IRES를 사용한다. "P1"으로 표시된 영역은 CPB-변경된 바이러스의 합성 P1 영역으로 대체되었다. 이들 제작물로부터 (+)RNA가 전사되었다. (도 4B) 각 디시스트론 RNA가 2 mM GuHCl의 존재하에 HeLa R19 세포로 형질감염되었다. 6시간 후에, 상기 R-Luc 및 F-Luc 활성을 측정하였다. 상기 F-Luc/R-Luc 비율 값을 PV(M)-wt P1 영역에 대해 F-Luc/R-Luc 비율로 정규화하고, 이를 100%로 설정하였다. 그래프는 표준편차 값을 나타내는 오차 막대와 함께 3회 독립적 실험의 평균을 나타내었다. 저표현된 코돈쌍 (PV-Min, PV-MinZ 및 PV-MinXY)을 이용하는 P1은 번역 속도가 감소되었고, 반면에 과표현된 코돈쌍 (PV-Max)을 함유하는 P1은 이의 번역 효율이 약간 증가한 것으로 나타났다.
도 5A-5B는 변형된 폴리오바이러스 MV-MinY로 치료된 NCR 누드 마우스에서 종양 성장 제어를 도시하였다. 각 마우스 (n=7; A)를 상기 종양이 0.2cm3의 크기에 도달한 후 0일, 3일 및 5일차에 2 x 107 PFU의 PV-MinY로 치료하거나 또는 모의 (mock) 주사하였다.
도 6은 NCR 누드 마우스에서 PV-MinY에 의한 별아교세포종 (astrocytoma)의 종양용해 (하단)를 치료하지 않은 대조군 마우스 (상단)와 비교하여 도시하였다. NCR 누드 마우스에게 1 x 106 HTB-14 세포를 피하로 주사하고, 종양 크기가 0.2 cm3에 도달하면 실험을 시작하였다. 0일, 3일 및 5일차에, 상기 종양에 모의 희석제 (상단) 또는 2 x 107 PFU의 PV-MinY (하단)를 주사하였다. PV-MinY가 주사된 종양의 크기는 유지되거나 또는 감소되었지만, 모의 치료 그룹의 동물은 종양 크기로 인해 7일 후에 안락사되었다.
도 7은 A549 세포의 변형된 바이러스 PV-MinY에 의한 종양용해를 도시하였다. A549 세포는 차아삼배수체 (세포의 40%에서 64, 65 또는 66개의 크로모좀 수) 인간 폐 상피 암종 세포주의 세포이다 (Giard et al., 1973). 크로모좀 N2 및 N6은 세포당 단일 카피를 가지며; N12 및 N17은 통상 4개의 카피를 갖는다. A549 세포는 면역퍼옥시다제 염색에 의해 케라틴에 대해 양성이다. A549는 효소 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PD)의 이소효소 G6PD-B를 발현한다. 본 발명자는 A549 세포를 폐 암종 모델로서 사용하였다. A549 세포를 PV-MinY에 의해 1.0의 MOI로 감염시켰다. A549 세포를 DMEM+10% FBS에서 성장시켰다. 세포를 106 PFU PV-MinY로 90% 융합에서 감염시키고, 실온에서 1시간 진탕시킨 후에; 접종물을 제거하고, DMEM+2% FBS로 교체하였다. 감염된 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 도 7에 의해 명백한 바와 같이, 감염되지 않은 폐 암종 세포와 비교하여, PV-MinY는 감염 후에 36시간까지 대부분의 세포를 및 72시간까지 모든 세포를 종양용해할 수 있었다.
도 8A-8B는 동물 성분이 없는 조건하에 Vero 세포에서 성장시킨 1개월 이내에 6개의 SAVE-탈최적화, 생-약독화된 지카 바이러스 백신 후보체의 신속한 제작을 도시하였다. (도 8A) 인간 ORFeome과 관련하여 지카 prM/E 및 NS3 유전자의 코돈쌍 편향 및 이의 SAVE-탈최적화 대응물. 코돈쌍 편향 (CPB)은 주어진 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 평균 코돈쌍 스코어로서 표시되었다. 포지티브 및 네가티브 CPB 값은 ORF에서 각각 통계적으로 과표현 또는 저표현된 코돈쌍의 우위성 (predominance)을 나타낸다. 적색 원은 14,795개의 인간 ORF 각각의 CPB를 나타내며, 분석 시에 알려져 있는 각주가 달린 인간 유전자 대부분을 나타낸다 (ORFeome). 야생형 prM/E 및 NS3 유전자의 CPB는 인간 숙주 세포 유전자의 정상 범위에 속한다. SAVE를 통한 코돈쌍-'탈최적화 (deoptimization)'에 이어서, 결과의 탈최적화 prM/E 및 NS3 유전자 세그먼트는 극도로 네가티브인 CPB에 의해 명백한 바와 같이 저표현된 인간 코돈쌍에 의해 우세하게 코딩되었고, 임의의 인간 유전자와는 크게 다르다. (도 8B) 야생형 및 합성 '탈최적화' 키메라 지카 백신 변이체의 cDNA 게놈. 도 8A로부터 SAVE-탈최적화 합성 prM/E 및 NS3은 드 노보 및 WT PRVABC59 (PR15) 또는 MR766 게놈으로 각각 서브클로닝된 중복 PCR (overlapping PCR)을 사용하여 합성되어 - 각각 합성 '탈최적화' 단편(들)을 함유하는 6개의 독립적인 cDNA 게놈을 수득하였다. 본 발명자는 7일 내에 wt PR15 및 MR766에 대한 감염성 cDNA 게놈을 제작하였고, 그 다음에 RNA의 BHK 세포로의 형질감염을 통해 27일 내에 6개의 탈최적화 ZIKV 백신 후보체에 대해 완전히 감염성인 복제 바이러스를 회수하였다.
도 9는 prM + E 코딩 영역에서 탈최적화 서열의 길이를 감소시킴으로써 약독화를 감소시키거나 또는 면역원성을 증가시키는 서브클로닝 전략의 다이아그램을 도시하였다. 2세대 지카 백신 후보체는 SAVE 플랫폼의 유연성을 활용하여 탈최적화 영역을 2014 bp (E-min)에서 997 bp (E-W/Min)까지 또는 추가적으로 664 bp (E-W/W/Min)까지 감소시키면서 아미노산 서열의 동일성은 100% 유지하였다.
도 10은 ZIKV 감염된 세포에서 단백질 및 RNA 발현의 감소를 도시하였다. 웨스턴 블롯 (Western blot)을 사용하여 33℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에 ZIKV 균주 PRVABC59 (PR15) 및 MR766의 E-Min (min) 및 야생형 (WT) 변이체로 감염된 Vero 세포에서 외피 당단백질 발현을 측정하였다. ZIKV의 균주 모두에서, 외피 당단백질 발현은 E-Min 변이체에 대해 크게 감소되었다.
도 11은 감염된 마우스에서 바이러스 표현형을 도시하였다. AG129 마우스에서 SAVE ZIKV 백신 후보체의 약독화. AG129 마우스에게 하기 중 하나를 주사하였다: i) 102의 용량으로 합성으로 유래된 야생형 바이러스 MR766 및 PR15 바이러스 (포지티브 대조군); ii) 104 또는 102 PFU 용량의 백신 후보체 PR15 E-Min 또는 MR766 E-Min 및 NS3-Min; iii) 104의 단회 용량의 백신 후보체 PR15 NS3+E-Min; 모두 100 μL 중에 피하로 전달되었다. 주사된 마우스를 사망률 및 이환률 (체중 손실)에 대해 검사하였다. 102 wt 바이러스로 접종한 마우스 모두 및 104 MR766 NS3-Min으로 접종한 마우스의 80%를 감염시켰다. 104 PFU의 선두 후보체 MR766 E-Min으로 백신화된 마우스 모두를 포함하는 모든 다른 마우스가 생존하였고, 임의의 체중 손실을 나타내지 않았다.
도 12는 높은 수준의 중화 항체를 유도하고 AG129 마우스에서 치명적인 챌린지로부터 보호하는 SAVE-약독화된 ZIKV 백신 후보체를 도시하였다. A) 단회 투여 후에 항-PR15 지카 항체. 백신화된 동물 유래 혈청을 28일차에 수집하고, Vero 세포에서 PRNT50 분석을 통해 ZIKV 균주 PR15에 대해 항체를 정량화하였다. 104 용량으로 PR15 E-Min 및 MR766 E-Min 모두로 백신화된 마우스는 높은 수준의 중화 항체를 발생시켰다 (2.8 log10 PRNT50).
도 13은 시노몰구스 마카크 (Cynomolgus macaques)에서 E-W/W/Min 백신화의 면역원성을 도시하였다. 지카 바이러스 혈청음성 (seronegative) 마카크를 0.5 mL 부피로 피하로 전달되는 105 또는 107 PFU (plaque-forming units)의 E-W/W/Min로 백신화하였다. 모의 백신화된 동물에게 0.5 mL의 백신 희석제를 주사하였다. 마카크를 처음에 0일차에 백신화하고, 그 다음에 28일차에 부스트하였다. 혈청 샘플은 0일, 14일, 21일, 28일 및 50일차에 수집하고, Vero 세포에서 FRNT50 (focus-reduction neutralization 50%) 분석을 사용하여 야생형 ZIKV 균주 MR766에 대한 중화 활성을 시험하였다. 107 또는 105 PFU E-W/W/Min에 의한 백신화는 제1 백신화 후에 NIH 불활성화 ZIKV 백신 후보체보다 우수한 것으로 밝혀졌고, 두 용량은 비슷한 수준의 중화 항체를 유도하였다. E-W/Min로 백신화된 모든 동물은 백신화 후에 14일까지 혈청전환 (seroconvert)되었다. FRNT50 역가의 증가는 28일차 부스트 후에 관찰되지 않았고, 이는 2차 감염이 면역기억 반응 (anamnestic response)을 유도하는 것을 방지하는 살균 면역 (sterilizing immunity)을 나타낸다. 이는 또한 비교적 저용량의 단일 E-W/WMin으로 높은 수준의 중화 항체를 유도하는데 충분할 수 있다는 것을 나타낸다 (≥1,028 FRNT50).
도 14는 CCL53.1 뮤린 (murine) 상피 흑색종 세포가 면역-적격 DBA/2 마우스로 이식된 인 비보 종양 모델을 사용하여 MR766 E-W/W/Min 지카 바이러스의 종양용해 특성을 시험하기 위한 실험 개요를 도시하였다. 마우스를 MR766 E-W/W/Min으로 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일차에 5회 백신화하였다. CCL53.1 세포를 최종 백신화 후 11일차인 97일차에 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스로 이식하였다. 이식은 1x106 CCL53.1 세포를 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 피하로 주사하여 수행하였다. 또한 일부는 2.5 x 105 CCL53.1 세포를 좌측 하부 옆구리에 피하로 주사하였다. 이식된 마우스를 종양 이식 후 10일차인 103일차에 우측 옆구리 종양에만 직접 1 x 107 PFU MR766 E-W/W/Min로 치료하거나 또는 OptiPro SFM을 주사하여 모의 치료하였다. 주사되지 않은 종양의 면역-매개 종양용해를 관찰하기 위해 우측 옆구리 종양에만 치료를 수행하였다. 동일한 치료를 105일차 (종양 이식 12일 후) 및 107일차 (종양 이식 14일 후)에 2회 반복하였다. 치료 후 10일 동안 (107-117일) 매일 및 치료후 20일 (118-127)까지 격일로 마우스의 체중 및 종양 크기 측정을 모니터하였다.
도 15는 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 종양내 경로로 주사된 MR766 E-W/W/Min으로 3회 치료된 마우스에서 종양 크기 감소를 도시하였다. 종양은 치료된 동물에서 5일까지 유의하게 줄어들었지만, 모의 치료된 DBA/2 마우스에서 종양 크기가 개선되지 않고 증가하였다.
도 16은 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 종양 크기에 있어서 지카 바이러스 MR766 W- E-W/W/Min으로 사전 면역화 효과를 도시하였다. 마우스를 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일차에 MR766 E-W/W/Min로 5회 백신화하거나 또는 OptiPro 배지로 모의 백신화하였다. 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 1x106 CCL53.1 세포를 피하로 주사하여 CCL53.1 세포를 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스에 이식하였다. 이식된 마우스를 우측 옆구리 종양에 직접 주사하여 1 x 107 PFU MR766 E-W/W/Min, 1 x 107 PFU MR766 WT로 치료하거나, 또는 모의 치료하였다. 치료는 격일로 3회 수행하였고, 종양 크기는 치료후 10일 동안 매일 측정하였다. 모의 면역화된:모의 치료된 DBA/2 마우스 종양은 10일 동안 꾸준히 증가하였지만, MR766 WT 및 MR766 E-W/W/Min 치료는 MR766 E-W/W/Min으로 이전에 면역화된 마우스에서 평균 종양 부피를 감소시키는데 효과적이었다.
도 17은 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 종양 크기에 있어서 지카 바이러스 E-W/Min 및 E-W/W/Min으로 사전 면역화 효과를 도시하였다. 마우스를 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일차에 MR766 E-W/W/Min 및 MR766 E-W/Min으로 5회 백신화하거나 또는 OptiPro 배지로 모의 백신화하였다. 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 1x106 CCL53.1 세포를 피하로 주사하여 CCL53.1 세포를 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스에 이식하였다. 이식된 마우스를 우측 옆구리 종양에 직접 주사하여 1 x 107 PFU MR766 E-W/W/Min, 1 x 107 PFU MR766 WT로 치료하거나, 또는 모의 치료하였다. 치료는 격일로 3회 수행하였고, 종양 크기는 치료후 10일 동안 매일 측정하였다. 모의 면역화된:모의 치료된 DBA/2 마우스 종양은 10일 동안 꾸준히 증가하였지만, MR766 WT 및 MR766 E-W/W/Min 치료된 종양은 크기가 감소하였다. MR766 E-W/W/Min 치료는 백신화된 마우스에서 MR766 WT 치료보다 우수했다.
도 18은 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 종양 크기에 있어서 MR766 WT 치료 효과를 도시하였다. 마우스를 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일에 MR766-W-W-E-Min로 5회 백신화하거나, 또는 OptiPro 배지로 모의 백신화하였다. 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 1x106 CCL53.1 세포를 피하로 주사하여, CCL53.1 세포를 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스에 이식하였다. 이식된 마우스를 우측 옆구리 종양에 직접 주사하여 1 x 107 PFU MR766 WT로 치료하거나, 또는 모의 치료하였다. 치료는 격일로 3회 수행하였고, 종양 크기는 치료후 10일 동안 매일 측정하였다. 모의 면역화된:모의 치료된 DBA/2 마우스 종양은 모의 백신화된 마우스에서 MR766 WT 치료된 종양과 같이 10일 동안 꾸준히 증가하였다. MR766 E-W/W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서, MR766 WT 치료는 10일까지 종양 크기를 크게 감소시키는데 효과적이었다.
도 19는 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 종양 크기에 있어서 지카 바이러스 MR766 -E-W/W/Min 치료의 효능에 있어서 백신화 효과를 도시하였다. 마우스를 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일차에 MR766 E-W/W/Min, MR766 E-W/W/Min 및 E-W/Min로 5회 백신화하거나, 또는 OptiPro 배지로 모의 백신화하였다. 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 1x106 CCL53.1 세포를 피하로 주사하여 CCL53.1 세포를 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스에 이식하였다. 이식된 마우스를 우측 옆구리 종양에 직접 주사하여 1 x 107 PFU MR766 E-W/W/Min로 치료하거나, 또는 모의 치료하였다. 치료는 격일로 3회 수행하였고, 종양 크기는 치료후 10일 동안 매일 측정하였다. 모의 면역화된:모의 치료된 DBA/2 마우스 종양은 모의 백신화된 마우스에서 MR766 E-W/W/Min 치료된 종양과 같이 10일 동안 꾸준히 증가하였다. MR766 E-W/W/Min 및 조합된 MR766 E-W/W/Min 플러스 E-W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서, 종양 크기는 MR766 E-W/W/Min 치료 후에 제거되었다.
도 20은 OptiPro 배지로 모의 백신화 또는 MR766 E-W/W/Min로 백신화되고 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포가 이식된 DBA/2 마우스에서 오프-사이드 (off-side) 종양 크기에 있어서 MR766 E-W/W/Min 치료 효과를 도시하였다. 본 연구에서 마우스의 우측 하부 옆구리에 1x106 CCL53.1 뮤린 상피 흑색종 세포를 피하로 주사하고, 이를 MR766 E-W/W/Min로 종양내 주사로 치료하거나 또는 OptiPro 배지로 모의 치료하였다. 또한, 이들 마우스의 좌측 하부 옆구리에 2.5 x 105 CCL53.1 세포를 피하로 주사하고, 이는 치료하지 않았다. 또한 이들 종양 크기를 측정하여 바이러스 종양용해의 면역-매개 클리어런스 오프사이트 (immune-mediated clearance offsite)를 평가하였다. 모의-백신화되고, 모의 치료된 좌측 옆구리 종양에서, 치료후 10일 동안 크기가 꾸준히 증가하였다. 좌측 옆구리 종양 크기는 모의 백신화되고, MR766 E-W/W/Min 치료된 마우스에서 유지되었지만, MR766 E-W/W/Min 백신화되고, E-W/W/Min 치료된 마우스의 좌측 옆구리 종양 크기는 수배 증가한 후에 다시 감소하였다. MR766 E-W/W/Min 치료 그룹 모두의 좌측 옆구리 종양은 one way ANOVA (p<0.001)에 의해 모의 백신화되고, 모의 치료된 동물에서보다 유의하게 더 작았다.
도 21A-21B는 지카 바이러스 치료된 동물이 종양 리챌린지 (rechallenge)로부터 보호됨을 보여주었다. DBA/2 마우스는 처음에 희석제 (모의), MR766 WT 바이러스 (WT), MR766 E-W/Min (EW), 또는 MR766 E-W/W/Min (EWW)로 백신화되었다. 21A) WT 또는 EWW로 치료에 의해 CCL53.1 종양 (흑색종)이 치유된 마우스를 반대쪽 옆구리에서 1x106 CCL53.1 세포로 리챌린지하고, 나이브 (naive) 대조군 DBA/2 마우스와 비교하였다 (n=5; RC01-13-1,2,3,4,5). 옆구리에서 종양 성장은 각 그룹에 대해 종양 세포 투여 후 22일에 걸쳐 평가하였다. Y 축은 mm3으로 측정된 평균 종양 크기이고, X 축은 챌린지 후 일수 (day post-challenge: DPC)이며; 21B) 각 마우스의 종양을 주사 후 22일차에 촬영하였다.
도 22A-22C는 지카 바이러스 치료된 동물이 이종 종양 리챌린지로부터 보호됨을 보여주었다. DBA/2 마우스를 처음에 MR766 E-W/Min로 백신화하고, MR766 E-W/Min으로 3회 부스트하였다. WT 또는 EWW로 치료하여 CCL53.1 종양이 치유된 마우스를 22A) 양쪽 옆구리에서 1x106 CRL 2947 세포 (신장암 세포) (n=4) (양쪽 옆구리로부터 종양 크기를 모음) 또는 22B) 우측 옆구리에서 KLN-205 세포 (폐암 세포) (n=5)로 리챌린지하고, 나이브 대조군 DBA/2 마우스 (n=3)와 비교하였다. 옆구리에서 종양 성장은 각 그룹에 대해 챌린지 후 21일에 걸쳐 평가하였다. Y 축은 mm3으로 측정된 평균 종양 크기이고, X 축은 챌린지 후 일수 (DPC)이다. 면역 마우스는 11일 (p=0.0064) 및 21일 (p=0.0012)에서 유의하게 더 작은 CRL 2947 종양 크기를 갖는 "종양 저항성"이었다. KLN-205 종양 크기는 또한 챌린지 후 11일 (p=0.0179) 및 14일 (p=0.0478)에서 더 작았고, 다른 시점은 유의성에 접근했다 (p=.0.0532). 22C) 각 마우스의 종양을 주사 후 21일 (CRL 2947) 및 17일 (KLN-205)에 촬영하였다.
도 23은 예시되는 치료 프로토콜을 나타내었다.
도 24는 CodaVax-H1N1 M101/V6 접종된 마우스에서 사망률 및 이환률이 관찰되지 않았음을 나타내었다.
도 25A-25C는 이식 후 8, 10, 12, 14, 16, 18, 26 및 28일차 (DPI)에 전달된 107 PFU의 8회 치료 과정 동안 관찰된, Balb/C 마우스에서 이식된 동종 4T1 TNCB 세포를 치료하는데 있어서 종양용해 CodaVax-H1N1 M101/V6의 효능을 도시하였다. 도 25A는 4T1 세포가 이식되고, 모의-치료되거나 (n=5, 적색) 또는 이식 후 8, 10, 12, 14, 16, 18, 26 및 28일차 (DPI)에 107 PFU의 CodaVax-H1N1 M101/V6 (n=8, 청색)으로 치료된 Balb/C 마우스에서 경시적으로 평균 종양 부피 (mm3)를 도시하였다. 도 25B는 생존율을 도시하였고, ≥ 400mm3 종양 부피의 인간 초기 엔드 포인트 (end point)를 사용하여 계산하였다. 도 25C는 4T1 세포가 이식되고, 모의-치료되거나 (n=5, 적색) 또는 이식 후 8, 10, 12, 14, 16, 18, 26 및 28일차 (DPI)에서 107 PFU의 CodaVax-H1N1 M101/V6 (n=8, 청색)으로 치료된 Balb/C 마우스에서 경시적으로 평균 종양 부피 (시작 부피의 퍼센트)를 도시하였다.
도 26은 CCL53.1 세포가 피하로 이식된 DBA/2 마우스의 치료 계획을 나타내었다. 마우스에게 0일차에 이식하고, 8, 10, 12, 14 및 16일차에 CodaVax-H1N1 M101/V6으로 치료하였다. 종양을 측정하여 치료 진행을 모니터하였다. 모의-치료된 마우스의 한 그룹 및 CodaVax-H1N1 M101/V6 치료된 마우스의 한 그룹에게 이식 후 3, 7 및 10일차에 0.1 mg의 항 PD-1 항체를 주었다.
도 27은 CodaVax-H1N1 접종된 마우스에서 사망률 및 이환률이 관찰되지 않았음을 보여주었다.
도 28은 8 DPI에서 치료 시작 시에 종양 크기 (mm3) 비교를 도시하였다. CCL53.1 세포가 이식되고 3일 및 7일차에 0.1 mg의 항 PD-1 항체로 치료된 마우스는 CodaVax-H1N1 M101/V6 치료 시작시에 더 작은 종양을 가졌다 (p=0.0466, Student's t-test).
도 29는 8, 10, 12, 14 및 16 DPI에서 전달된 8 x 105 PFU의 5회 치료 과정 동안 관찰된, DBA/2 마우스에서 이식된 동종 CCL53.1 흑색종 세포 치료에 있어서 종양용해 CodaVax-H1N1 M101/V6의 효능을 도시하였다. A) 생존율은 ≥400 mm3 종양 부피의 인간 초기 엔드 포인트를 사용하여 계산하였다. 종양 크기를 측정하여, 부피 (mm3)로 보고하고, B) 평균 ± 표준편차로 그래프로 나타내었다.
도 30은 배양된 인간 단핵구 (THP-1)가 배양 배지에 100nM PMA의 부가를 통해 마크로파지로 분화되도록 유도되고, 지시된 바이러스로 감염되고, 그 다음에 37℃, 5% CO2에서 1일 및 3일 동안 인큐베이션되는 경우 효과를 보여주었고, IL-1B의 분비는 ELISA를 통해 상등액에서 측정되었다.
도 31A-F는 0일, 14일, 28일 및 42일차에 107 FFU MR766 E-W/Min으로 백신화되거나 또는 바이러스 희석제로 모의-백신화된 DBA/2 마우스에서 면역 세포 활성화를 보여주었다. 백신화된 및 모의-백신화된 마우스에게 63일차에 피하 경로로 전달되는 1 x 106 CCL53.1 흑색종 세포를 이식하고, 치료는 73일차에 시작하여 107 PFU MR766 E-W/W/Min 또는 바이러스 희석제를 73일, 75일 및 77일차에 종양내 전달하였다. 종양을 수집하고, 면역조직화학을 위해 치료 후 1일 및 7일차 (74일 및 80일)에 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 염색하여 면역 마커를 계수하고 CD4+/CD8+ 세포 침습을 측정하였다. 도 31A) MR766 E-W/W/Min 단독으로 치료 또는 E-W/Min 백신화 이후에 E-W/W/Min 치료 후 1일차에 이식된 CCL53.1 종양에 존재하는 CD45+ 세포의 퍼센트. 도 31B) MR766 E-W/W/Min 단독으로 치료 또는 E-W/Min 백신화 이후에 E-W/W/Min 치료 후 1일 및 7일차에 이식된 CCL53.1 종양에 존재하는 CD4+ 세포의 퍼센트. 도 31C) 치료 후 7일차에 이식된 CCL53.1 종양에 존재하는 CD8+ 세포의 퍼센트. 도 31D) 치료 후 1일차에 이식된 CCL53.1 종양에 존재하는 FoxP3+ 세포의 퍼센트. 이식된 CCL53.1 흑색종 세포의 면역조직화학에서. 도 31E) 치료 후 1일차에서 이식된 CCL53.1 종양에서 CD45+ 세포 침습은 면역조직화학에 의해 시각화된 바와 같이 사전 MR766 E-W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서 크게 증가하였다. 도 31F) 치료 후 7일차에 이식된 CCL53.1 종양에서 CD8+ 세포 침습은 면역조직화학에 의해 시각화된 바와 같이 사전 MR766 E-W/Min 백신화에 의해 증가되었다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 완전히 제시된 것처럼 참고로 통합된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); and Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 본 출원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 가이드를 당업자에게 제공한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 다수의 방법 및 물질을 알 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 제한되지 않는다.
코돈쌍 편향을 탈최적화함에 의한 바이러스 변형
본 발명의 양상에 따르면, 코돈쌍 편향은 코돈 사용과 무관하게 변경될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 단백질 코딩 서열에서, 코돈쌍 편향은 이의 코돈의 직접 재배열에 의해 간단하게 변경될 수 있다. 구체적으로, 숙주 생물체에서 다양한 빈도를 가질 수 있는, 모체 서열에서 나타나는 동일한 코돈이 변경된 서열에서 사용되지만, 상이한 위치에서 사용된다. 가장 간단한 형태에서, 모체 서열에서와 동일한 코돈이 사용되기 때문에, (코딩된 아미노산 서열에서와 같이) 고려되는 단백질 코딩 영역에 대한 코돈 사용은 변경되지 않은 채로 남아 있다. 그럼에도 불구하고, 소정의 코돈은 새로운 맥락으로 나타나며, 즉 모체 서열에서와 동일한 아미노산을 코딩하지만, 상이한 뉴클레오티드 삼중체를 사용하는 코돈이 선행 및/또는 후행한다. 이상적으로, 코돈 재배열은 모체 서열에서보다 덜 빈번한 코돈쌍을 유도한다. 실제로, 코돈 재배열은 하나의 위치에서 코돈쌍이 덜 빈번하게 나타내고, 제2 위치에서 코돈쌍이 더 빈번하게 나타난다. 코돈의 신중한 재배열에 의해, 주어진 길이의 코딩 서열에 대한 코돈쌍 사용 편향이 모체 서열과 비교하여 감소될 수 있다. 대안으로서, 상기 코돈은 모체 서열에서보다 숙주에서 더 빈번하게 코돈쌍을 사용하는 서열을 생성하도록 재배열될 수 있다.
코돈쌍 편향은 본원에 개시된 바와 같이, 각 코돈쌍을 차례로 고려하고, 상기 코돈쌍이 숙주의 단백질 코딩 서열에서 관찰되는 빈도에 따라 각 쌍을 스코어링한 다음, 상기 서열에 대한 코돈쌍 편향을 결정함으로써 평가된다. 당업자는 동일한 코돈쌍 편향을 갖는 다수의 상이한 서열을 형성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 코돈쌍 편향은 코돈이 재배열되는 방식에 따라 더 크게 또는 더 적은 정도로 변경될 수 있다. 코딩 서열의 코돈쌍 편향은 전체 코딩 서열을 재코딩하거나, 또는 하나 이상의 부분서열을 재코딩하여 변경될 수 있다. 본원에서 사용되는, "코돈쌍 편향 (codon pair bias)"은 서열의 일부만이 돌연변이될 수 있지만, 코딩 서열 길이에 대해 평가된다. 숙주 생물체의 코돈 사용과 관련하여 코돈쌍이 스코어링되기 때문에, 코돈쌍 편향 값은 야생형 바이러스 서열 및 돌연변이체 바이러스 서열에 대해 배정될 수 있다. 본 발명의 양상에 따르면, 코돈쌍 편향을 감소시키기 위해서 바이러스의 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 재코딩함으로써 바이러스가 변형될 수 있다.
본 발명의 양상에 따르면, 코돈쌍 편향은 숙주의 코돈쌍 사용으로부터 결정된 정량적 특성이다. 따라서, 절대 코돈쌍 편향 값이 임의의 주어진 바이러스 단백질 코딩 서열에 대해 결정될 수 있다. 대안으로서, 탈최적화 바이러스 단백질 코딩 서열이 유래되는 "모체" 서열과 관련시키는 코돈쌍 편향 값의 상대 변화를 결정할 수 있다. 바이러스가 다양한 타입 (즉 Baltimore 분류법에 의한 타입 I 내지 VII)으로 나오고, 상이한 바이러스의 자연 (즉 악성) 단리물은 절대 코돈쌍 편향의 상이한 값을 산출하기 때문에, 코돈쌍 편향의 상대적 변화는 통상 원하는 약독화 수준을 결정하는데 보다 관련이 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열이 돌연변이에 의해 코돈쌍 편향이 감소된 바이러스 게놈을 변형된 바이러스가 포함하는, 변형된 바이러스, 및 이를 제조 및 사용하는 방법, 및 악성 종양에 대한 치료법을 제공한다. 단일 단백질 (즉, 다중단백질 (polyprotein))만을 코딩하는 바이러스에서, 상기 다중단백질의 전부 또는 일부는 원하는 정도로 돌연변이되어 코돈쌍 편향을 감소시킬 수 있고, 상기 돌연변이된 서열의 전부 또는 일부가 재조합 바이러스 구조체에 제공될 수 있다. 다수의 단백질을 개별적으로 코딩하는 바이러스의 경우, 모든 단백질 코딩 서열의 코돈쌍 편향을 동시에 감소시키거나, 또는 변형을 위해 하나 또는 수 개의 단백질 코딩 서열을 선택할 수 있다. 코돈쌍 편향의 감소는 단백질 코딩 서열 길이에 대해 결정되며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.15, 또는 적어도 약 0.2, 또는 적어도 약 0.3, 또는 적어도 약 0.4이다. 바이러스에 따라, 숙주의 코돈쌍 사용에 기반하는, 절대 코돈쌍 편향은 약 -0.05 이하, 또는 약 -0.1 이하, 또는 약 -0.15 이하, 또는 약 -0.2 이하, 또는 약 -0.3 이하, 또는 약 -0.4 이하일 수 있다.
코돈쌍 편향이 또한 다른 서열 변이에서 중첩될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 코딩 서열은 하나 이상의 아미노산 변화를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하고, 또한 변경된 코돈쌍 편향을 갖도록 변경될 수 있다. 또한, 일부 사례에서, 모체 단백질 코딩 서열에서와 같이 코돈-편향이 감소된 단백질 코딩 서열에서 동일한 코돈 사용 프로파일을 정확하게 유지하기 위해 코돈을 셔플링 (shuffle)할 수 있다. 이 과정은 코돈쌍 편향 변화의 파워를 강조하는 것으로, 준수할 필요는 없다. 대안으로서, 코돈 선택은 코딩 서열의 전체 코돈 사용 변화를 유도할 수 있다. 이와 관련하여, 본원에 제공된 소정의 예에서 (예: PV-Min의 디자인), 코돈 사용 프로파일이 코돈쌍 편향이 최소화된 서열을 생성하는 과정에서 변화되지 않더라고, 상기 서열의 일부가 돌연변이되지 않은 서열로 서브클로닝되는 경우 (예: PV-MinXY 또는 PV-MinZ), 상기 서브클로닝된 부분에 대한 코돈 사용 프로파일은 생성된 하이브리드에서 원래의 돌연변이되지 않은 단백질 코딩 서열의 프로파일에 부합되지 않을 것임을 주목해야 한다. 그러나, 이러한 코돈 사용 프로파일의 변화는 코돈쌍 편향의 효과를 최소화한다.
유사하게, 하나 또는 다수의 아미노산 치환을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 뉴클레오티드 서열을 자체적으로 변경하는 것은 또한 코돈쌍 편향의 유의한 변화를 가진 서열을 생성할 가능성이 거의 없음에 주목해야 한다. 결과적으로, 코돈쌍 편향 변경은 돌연변이된 아미노산 서열을 코딩하도록 추가적으로 변형된 뉴클레오티드 서열에서도 인식될 수 있다. 또한, 코돈 편향을 증가시키기 위한 자체적 돌연변이는 코돈쌍 편향에 미치는 영향이 크지 않다는 점도 주목할 만하다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 비선호 코돈 (PV-AB)의 사용을 최대화하기 위해 재코딩된 변형된 바이러스 돌연변이체에 대한 코돈쌍 편향은 야생형 (PV-1(M))으로부터 약 0.05 만큼 감소한다 (Mueller et al. 2006). 또한, 이러한 단백질 코딩 서열은 서열 다양성을 크게 감소시킨다는 점이 주목된다. 반대로, 실질적인 서열 다양성은 본 발명의 코돈쌍 편향 변형된 서열에서 유지된다. 더욱이, 희귀 코돈의 사용 증가 없이 수득 가능한 코돈쌍 편향의 유의한 감소는 비선호 코돈의 사용을 최대화하는 대신에, 코돈쌍 편향을 보다 효과적으로 감소시키기 위해, 비선호 코돈을 충분한 수의 선호 코돈으로 재배열하는 것이 유리할 수 있다는 것을 시사하였다.
돌연변이의 정도 및 강도는 전체 또는 일부가 돌연변이될 수 있는 단백질 코딩 핵산의 길이, 및 원하는 코돈쌍 편향의 감소에 따라 가변될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 단백질 코딩 서열은 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 200개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 300개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 1000개의 뉴클레오티드 길이에 대해 변형된다.
본원에서 사용되는 용어 "모체" 바이러스 또는 "모체" 단백질 코딩 서열은 다소 변형될 수 있는 새로운 서열이 유래되는 바이러스 게놈 및 단백질 코딩 서열을 지칭한다. 따라서, 모체 바이러스는 "야생형" 또는 "자연 발생하는" 프로토타입 (prototypes) 또는 단리체 또는 실제 또는 인지된 바람직한 특성을 기반으로 특이적으로 형성되거나 선택된 변이체 또는 돌연변이체일 수 있다.
드 노보 DNA 합성을 사용하여, PV(M)의 캡시드 코딩 영역 (뉴클레오티드 755에서 뉴클레오티드 3385까지의 P1 영역)을 재디자인하여 가장 많은 수의 거의 사용되지 않는 코돈쌍 (바이러스 PV-Min)을 도입하였다. PV-Min 돌연변이체 RNA로 형질감염된 세포는 사멸되지 않았고, 생존 가능한 바이러스가 회수될 수 없었다. PV-Min의 캡시드 영역의 단편 (PV-Min755 -2470, PV-Min2470 - 3386)의 wt 배경으로의 서브클로닝은 매우 쇠약하지만, 죽지 않는 바이러스를 생성하였다. 이 결과 전체 서열에 대한 코돈쌍 편향을 가변시키기 위해 야생형 모체 바이러스 게놈으로 치환된 코돈쌍 탈최적화 서열의 정도를 변화시키는 효과 및 바이러스 산물의 약독화를 입증하였다.
탈최적화 코돈쌍 편향을 가진 바이러스는 약독화된다. 2008년에 Coleman 등의 문헌에서 예시되는 바와 같이, CD155tg 마우스는 야생형 바이러스에 대해 치명적일 수 있는 것보다 1000-배 더 많은 양의 약독화된 바이러스의 뇌내 주사에 의한 챌린지에서 생존하였다. 이러한 발견은 바이러스의 치사율을 최소화하기 위한 코돈쌍 편향의 탈최적화 파워를 입증하였다. 또한, 바이러스의 생존력은 코돈쌍 편향 탈최적화 정도를 선택함으로써 감염률 감소와 균형을 이룰 수 있다. 또한, 원하는 약독화 특성을 제공하는 코돈쌍 편향 탈최적화의 정도 또는 정도의 범위가 결정되면, 코돈쌍 편향의 정도를 달성하도록 추가의 서열이 디자인될 수 있다. 예를 들어, 서열번호:1은 약 -0.2의 코돈쌍 편향을 가진 변형된 바이러스 서열을 제공하며, PV-MinY의 돌연변이된 부분을 포함하는 영역에 돌연변이가 분포되었다.
서열 디자인을 위한 알고리즘
본 발명자는 DNA 서열을 특정 원하는 특성에 최적화하면서 동시에 주어진 아미노산을 코딩하는 유전자 디자인을 위해 몇몇 알고리즘을 개발하였다. 특히, 서열에서 원하는 RNA 2차 구조를 최대화 또는 최소화할 (Cohen and Skiena, 2003)뿐만 아니라 명시된 패턴 세트를 최대로 부가 및/또는 제거하는 (Skiena, 2001) 알고리즘을 개발하였다. 전자의 문제는 살아있는 바이러스를 디자인하는데 발생하는 반면에, 후자에서는 기술적인 이유로 제한 부위를 최적으로 삽입하는데 유용하다. 대체 리딩 프레임에서 2개 이상의 유전자를 동시에 코딩하는 중첩 유전자가 디자인될 수 있는 정도로 연구되었다. 단일 핵산의 상이한 리딩 프레임에서 코딩되는 상이한 기능성 폴리펩티드의 특성이 바이러스에서 일반적이며, 항생제 내성 유전자에서 위빙 (weaving)과 같은 기술적 목적을 위해 이용될 수 있다.
합성 생물학을 위한 1세대 디자인 툴은 Jayaraj et al. (2005) 및 Richardson et al. (2006)에 의해 개시된 바와 같이 구축되었다. 이들은 주로 생물학적 활성에 대해 서열을 최적화하는 대신에 제조가능성 (즉, 국소 2차 구조 및 말단 반복이 없는 올리고뉴클레오티드)에 최적화된 디자인에 중점을 두었다. 이들 1세대 툴은 고차원 디자인 원리를 뒷받침하는 대신에 디자인 규칙-확인을 기반으로 구축된 초기 VLSI CAD 툴과 유사한 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 예시되는 바와 같이, 컴퓨터-기반 알고리즘이 임의의 코딩 영역의 코돈쌍 편향을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 상기 알고리즘은 기존 코돈을 셔플하고, 결과의 CPB를 평가한 다음에 서열을 재셔플 (reshuffle)하여 선택적으로 특히 "유용한" 코돈쌍을 잠그는 능력을 갖는다. 상기 알고리즘은 또한 국소 최소값 (local minima)에 걸리지 않도록 "시뮬레이션된 어닐링 (simulated annealing)" 형태를 사용한다. RNA 폴딩의 자유 에너지와 같은 다른 파라미터는 원하지 않는 2차 구조의 형성을 피하기 위해 상기 알고리즘의 제어하에 선택적으로 존재할 수 있다. 상기 알고리즘은 최소 코돈쌍 편향을 가진 서열을 찾는데 사용될 수 있고, 이러한 서열이 살아있는 바이러스를 제공하지 않는 경우에, 상기 알고리즘은 감소되지만, 최소화되지는 않은 편향을 가진 서열을 찾도록 조정될 수 있다. 물론, 살아있는 바이러스 서열은 또한 컴퓨터 최소화 서열의 부분서열만을 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 구배 하강 (gradient descent), 또는 시뮬레이션된 어닐링, 또는 다른 최소화 루틴 (minimization routine)을 사용하여, 컴퓨터의 도움으로 수행되는지 여부. 개시 서열에 존재하는 코돈을 재배열하는 과정의 예는 하기 단계들로 나타낼 수 있다:
1) 야생형 바이러스 게놈 서열을 수득하는 단계.
2) 변형된 디자인을 표적으로 하는 단백질 코딩 서열을 선택하는 단계.
3) 비-코딩 기능을 가진 알려져 있거나 또는 추측되는 DNA 세그먼트를 잠그는 단계.
4) 재디자인된 단백질에 남아 있는 아미노산들에 대한 원하는 코돈 분포를 선택하는 단계.
5) 잠기지 않은 코돈 위치의 무작위 셔플을 수행하고, 코돈쌍 스코어를 계산하는 단계.
6) 선택적으로 시뮬레이션된 어닐링 과정을 사용하여 코돈쌍 스코어를 추가로 감소 (또는 증가)시키는 단계.
7) 결과의 디자인을 과도한 2차 구조 및 원치 않는 제한 부위에 대해 검사하는 단계:
a. 예 (yes)이면 단계 (5)로 진행하고, 그렇지 않으면 문제가 있는 영역을 야생형 서열로 대체하여 디자인을 수정하고 단계 (8)로 진행함.
8) 바이러스 디자인에 상응하는 DNA 서열을 합성하는 단계.
9) 바이러스 구조체를 형성하고 발현을 평가하는 단계:
a. 너무 약독화된 경우, 서브클론 구조체를 제조하고, 단계 9로 진행함;
b. 충분하게 약독화되지 않은 경우, 단계 2로 진행함.
대안으로서, 코돈이 단백질 코딩 서열의 다른 곳에서 교환될 필요 없이 코돈쌍을 선택함으로써 각 아미노산 쌍이 탈최적화되는 과정을 고안할 수 있다.
바이러스 및 변형된 바이러스
암 치료에 사용하기 위해 본원에 개시된 방법에 의해 많은 바이러스가 변형될 수 있다. 상기 바이러스는 dsDNA 바이러스 (예: 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (Herpesviruses), 폭스바이러스 (Poxviruses)), 단일 가닥 "플러스" 센스 DNA 바이러스 (예: 파르보바이러스 (Parvoviruses)) 이중 가닥 RNA 바이러스 (예: 레오바이러스 (Reoviruses)), 또는 단일 가닥 "마이너스" 센스 RNA 바이러스 (예: 오르토믹소바이러스, 랍도바이러스 (Rhabdoviruses))일 수 있다. 본 발명의 소정의 비-제한적인 구체예에서, 상기 바이러스는 폴리오바이러스 (PV), 리노바이러스 (rhinovirus), 인플루엔자 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일병 바이러스 (West Nile disease virus), 수두 (바리셀라-조스터 바이러스 (varicella-zoster virus)), 홍역 (파라믹소바이러스 (paramyxovirus), 볼거리 (파라믹소바이러스), 광견병 (리사바이러스 (Lyssavirus)), 인간 유두종바이러스 (human papillomavirus), 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV 타입 1), 또는 생식기 헤르페스 (genital herpes) (HSV 타입 2)이다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 피코르나비리데 (Picornaviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
회색질척수염 (Poliomyelitis)은 폴리오바이러스 감염에 의해 야기되는 중추신경계 질환이다. 폴리오바이러스는 피코르나비리데 과에 속하는 인간 엔테로바이러스이며, 3개의 안정한 혈청형으로 분류된다. 이는 구형이고, 크기는 20 nm이며, 단백질로 구성된 캡슐로 코팅된 RNA 코어를 함유한다. 이는 입, 인후 또는 소화관의 점막을 통해 전염된다. 모두 세가지의 변형된 바이러스 혈청형은 비록 다른 빈도이지만 (타입 1>타입 2>타입 3), 마비성 회색질척수염의 원인체로서 보고되었다.
그러나, 변형된 바이러스에 의한 감염이 반드시 회색질척수염의 발병을 초래하지는 않는다. 반대로, 대부분의 감염 (98-99%)은 바이러스의 국소 위장관 복제로 이어지므로 가벼운 증상만이 나타나거나 또는 증상이 전혀 나타나지 않는다. 변형된 바이러스는 CNS에는 거의 침입하지 않으며, 여기서 이는 척수 전각 (spinal cord anterior horn) 및 골수 운동 뉴런 (medullary motor neurons)을 선택적으로 표적화하여 파괴한다. Bodian, D., in:　Diseases of the Nervous System,　Minckler, J. ed., McGraw-Hill, New York, pp. 2323-2339 (1972).
변형된 바이러스의 비통상적으로 제한된 세포 향성 (tropism)은 독특한 질병특유 특성 (pathognomonic features)을 초래한다. 이들은 척수 및 골수에서 운동 뉴런 손실을 특징으로 하며, 회색질척수염, 이완성 마비 (flaccid paralysis)의 특징적인 임상 징후를 일으킨다. 신경아교 세포 (glial cell)뿐만 아니라 중추 신경계의 다른 뉴런 성분은 전형적으로 감염을 피한다. 전자 현미경 하에 감염된 뇌 조직에서, 운동 뉴런에서 심각한 변화가 관찰된 반면에 신경아교 성분 (neuroglial components)에서 유의한 변경이 관찰되지 않았다. 감염 또는 반응의 증거 없이 정상 별아교세포 (astrocytes) 및 희소돌기아교세포 (oligodendrocytes)가 퇴행성 뉴런 또는 축삭 옆에서 볼 수 있다. Bodian, D., supra. 상기 변형된 바이러스의 제한된 향성은 이해되지 않았다. 제한된 세포 및 조직 향성에 더하여, 변형된 바이러스는 영장류 및 영장류 세포 배양물만 감염시킨다. 다른 포유동물 종은 이환되지 않는다.
1908년에 변형된 바이러스의 단리는 감염 기전을 이해하기 위한 집중적인 연구 노력으로 이어졌다. 초기 연구에는 원숭이와 침팬지를 동물 모델로 사용해야 했다. 이러한 수명이 긴 동물은 매우 비싸고 연구에 사용하기 어렵다. 폴리오바이러스의 세포 도킹 분자인 CD155로도 알려진 인간 폴리오바이러스 수용체 (PVR)의 발견은 회색질척수염의 새로운 동물 모델로서 인간 변형된 바이러스의 수용체를 발현하는 유전자이식 마우스의 개발로 이어졌다. 변형된 바이러스의 병원성은 유전자이식 마우스를 사용하여 연구될 수 있다.
초기의 연구 노력은 또한 신경병원성 잠재력이 결여된 약독화된 PV 균주의 개발로 이어졌고, 곧 회색질척수염 예방을 위한 잠재적인 백신 후보체로서 시험되었다. 이 중 A. Sabin에 의해 개발된 변형된 바이러스의 타입 1, 2 및 3의 사빈 균주가 가장 효과적이다. 변형된 바이러스의 살아 있는 약독화된 균주 (사빈 균주)의 경구 투여 후에, 백신-관련 마비성 회색질척수염은 매우 드문 경우로 관찰되었다. 백신-관련 마비성 소아마비의 발생은 면역화 후에 약독화된 사빈 균주의 신경독성 변이체의 출현과 관련이 있다.
본 발명을 이해하기 위해, 폴리오바이러스의 구조를 이해하는 것이 중요하다. 엔테로바이러스, 카디오바이러스 (cardioviruses), 리노바이러스, 아프토바이러스 (aphthoviruses), 헤파토바이러스 (hepatovirus) 및 파레코바이러스 (parechoviruses)를 포함하는 모든 피코르나바이러스는 VP1, VP2, VP3 및 VP4의 4개의 폴리펩티드 사슬 각각의 60 카피를 함유한다. 이들 사슬은 성숙한 "프로토머 (protomers)"로 불리는 단백질 서브유닛의 요소이다. 상기 프로토머는 바이러스의 가장 작은 동일한 서브유닛으로 정의된다. VP2 및 VP4로 절단되는 제5 단백질인 VP0이 또한 미량으로 관찰된다. 함께, 이들 단백질은 폴리오바이러스의 껍질 (shell) 또는 코트 (coat)를 형성한다.
상기 피코르나바이러스 게놈은 단일 가닥의 메신저-활성 RNA를 갖는다. 상기 게놈 메신저 활성 RNA는 3' 말단에서 폴리아데닐화되고 5' 말단에 공유결합으로 부착된 작은 단백질인 VPg를 운반하는 "+" 가닥을 갖는다. DNA로 완전히 서열화되고 클로닝되는 최초 피코르나바이러스 RNA는 타입 1 폴리오바이러스의 RNA이었다. 그러나, 폴리오바이러스는 5'm7GpppG 캡 구조가 결여되어 있고, RNA의 효율적인 번역은 5' 비번역된 영역 (5'NTR) 내에 IRES (internal ribosomal entry site)를 통해 달성되는 리보솜 결합을 필요로 한다.
변형된 바이러스의 일반적인 조직 패턴은 도 2에 개략적으로 도시되어 있고, 이는 5'NTR, P1, P2, P3 및 폴리아데닐화 테일을 갖는 3'NTR을 포함한다. 상기 5'NTR은 임의로 I, II, III, IV, V 및 VI으로 지정된 6개의 도메인을 포함한다. 상기 IRES는 도메인 II-VI을 포함한다. P1은 캡시드 단백질로도 알려져 있는 구조 단백질에 대한 코딩 영역이다. P2 및 P3은 비-구조 단백질을 코딩한다.
사실상, 3개의 면역학적으로 구별되는 변형된 바이러스 타입이 나타난다: 혈청형 1, 2 및 3. 이들 혈청형은 중화 항체의 특정 세트와 상호작용하는 이의 캡시드 단백질에서 특정 서열에 의해 구별된다. 3가지 혈청형 모두 상이한 균주에서 발생하며, 모든 자연 발생하는 혈청형 및 균주는 회색질척수염을 야기할 수 있다. 따라서, 이들은 신경독성이다. 상기 혈청형의 복제 기전 및 유전자 조직은 동일하며; 이들 게놈의 뉴클레오티드 서열은 >90% 동일하다. 더욱이, 모든 폴리오바이러스, 심지어 약독화된 백신 균주는 숙주 세포로 진입 및 감염을 위해 동일한 세포 수용체 (CD155)를 사용하며; 이들은 인간 및 감수성 유전자이식 동물에서 조직에 대해 동일한 향성을 발현한다.
상기 변형된 바이러스의 신경병원성은 P1 및 P3 단백질을 특정하는 영역에서뿐만 아니라 5'NTR 내에 IRES (internal ribosomal entry site)에서의 돌연변이에 의해 약독화될 수 있다. 타입 1, 2 및 3의 사빈 백신 균주는 약독화 표현형에 관련된 IRES 요소의 도메인 V에서 각각 단일 돌연변이를 보유한다. 백신으로서의 효과에도 불구하고, 사빈 균주는 회색질척수염에 대한 동물 모델에서 신경병원성 잠재력을 유지한다. 매우 낮은 속도이지만, 이들은 백신으로 질병을 야기할 수 있다.
실제로, 각 사빈 백신 균주의 IRES 요소에서 단일 점 돌연변이 (single point mutations)는 36시간 내지 수 일의 기간 내에 백신에서 회귀될 수 있다. 전반적으로, 백신 관련된 급성 회색질척수염은 미국에서 530,000개의 백신 중 1개의 비율로 발생한다. 회색질척수염으로 백신화된 환자로부터 단리된 폴리오바이러스는 또한 이들 게놈의 다른 위치에서 돌연변이가 회귀될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 또는 인플루엔자 바이러스 C로부터 유래된다. 추가의 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 A는 서브타입 H10N7, H10N1, H10N2, H10N3, H10N4, H10N5, H10N6, H10N7, H10N8, H10N9, H11N1, H11N2, H11N3, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N2, H12N4, H12N5, H12N6, H12N8, H12N9, H13N2, H13N3, H13N6, H13N9, H14N5, H14N6, H15N2, H15N8, H15N9, H16N3, H1N1, H1N2, H1N3, H1N5, H1N6, H1N8, H1N9, H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H3N9, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N7, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N3, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N7, H7N8, H7N9, H8N2, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 및 동정되지 않은 서브타입에 속하지만, 이에 한정되지 않는다. 다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 본원에 개시된 바와 같이 H1N1 M101/V6이다. 다양한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 A의 하나 이상의 세그먼트는 재코딩된다 (예: 탈최적화). 다양한 구체예에서, 상기 HA 세그먼트가 재코딩된다. 다양한 구체예에서, 상기 NA 세그먼트가 재코딩된다. 다양한 구체예에서, HA 세그먼트 및 NA 세그먼트 모두가 재코딩된다. 다양한 구체예에서, 상기 재코딩된 인플루엔자 바이러스 A는 다른 바이러스에 대해 본원에서 논의된 바와 같이 코돈 편향 또는 코돈쌍 편향 감소를 갖는다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 플라비비리데 (Flaviviridae)　바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다. 다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 본원에서 추가로 논의된 바와 같이, 지카 바이러스 종이다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 예를 들어 인간 아데노바이러스 A, B, C에 한정되지 않는, 아데노비리데 (Adenoviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스에 한정되지 않는, 헤르페스비리데 (Herpesviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 레오비리데 (Reoviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 파필로마비리데 (Papillomaviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 폭스비리데 (Poxviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 분야비리데 (Bunyaviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 니도비랄레스 (Nidovirales) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 칼리시비리데 (Caliciviridae) 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 랍도비리데 (Rhabdoviridae) 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 토가비리데 (Togaviridae) 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속한다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나이다.
변형된 지카 바이러스
본 발명의 구체예는 바이러스 단백질의 발현이 감소되고, 백신 생산에 유용한 우수한 성장 특성을 가지며, 탁월한 안전성 프로파일 및 증진된 보호 특성을 갖는 약독화된 지카 바이러스를 사용한다. 야생형 바이러스뿐만 아니라 약독화된 바이러스는 간신히 증식하고, LD50　값에 의해 밝혀진 바와 같이 고도로 약독화된 표현형을 가지며, 동일한 균주의 지카 바이러스에 의한 챌린지에 대해 보호 면역을 제공하는데 특히 효과적이고, 또한 다른 균주의 지카 바이러스에 의한 챌린지에 대해 보호 면역을 제공한다.
본 발명의 소정의 구체예에서, 본 발명의 약독화된 지카 바이러스는 재코딩된 프리-멤브레인/외피 (E) 코딩 영역, 재코딩된 비구조 단백질 3 (NS3) 코딩 영역, 또는 E 및 NS3 코딩 영역 모두를 포함한다. 상기 C, NS1, NS2, NS4 또는 NS5 단백질 코딩 영역이 재코딩되지 않는다는 것은 이들 서열에서 돌연변이 및 다른 변이를 배제하지 않으며, 단지 이들 서열에서 만들어지는 임의의 돌연변이 또는 변이가 약독화에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 의미한다. 약독화에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것은 하기 중 하나 또는 모두를 포함한다: 1) 변이체 C, NS1, NS2, NS4 또는 NS5 코딩 영역이 시험 지카 바이러스에서 유일한 변이체인 경우 상기 C, NS1, NS2, NS4 또는 NS5 코딩 영역이 바이러스 복제 또는 바이러스 감염도를 20% 이상 감소시키지 않는 돌연변이 또는 변이; 2) 상기 C, NS1, NS2, NS4 또는 NS5 코딩 영역 중 어느 것이 상기 코딩 서열에서 10% 미만의 뉴클레오티드를 나타내는 돌연변이 또는 변이.
본 발명에 사용된 지카 바이러스는 고도로 약독화된다. 본 발명의 구체예에서, 야생형과 비교하여, 상기 지카 바이러스는 동일한 서열의 단백질을 갖지만, 상이한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 야생형 바이러스와 비교하여 AG129 마우스 모델에서 적어도 5,000배 약독화, 또는 적어도 10,000배 약독화, 또는 적어도 20,000배 약독화, 또는 적어도 33,000배 약독화, 또는 적어도 50,000배 약독화, 적어도 100,000배 약독화된다.
본 발명에 사용되는 약독화된 지카 바이러스는 또한 큰 안전성 한계 (즉, LD50 및 PD50 사이의 차이)를 나타내며, 따라서 LD50/PD50의 비율로서 본원에 정의된 높은 안전성 계수 (safety factors)를 갖는다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 상기 안전성 계수는 적어도 102, 또는 적어도 103, 또는 적어도 104, 또는 적어도 105, 또는 적어도 2Х105, 또는 적어도 5Х105, 또는 적어도 106, 또는 적어도 2Х106, 또는 적어도 5Х106이다. 소정의 구체예에서, 상기 안전성 계수는 102　내지 103, 또는 103　내지 104, 또는 104　내지 105, 또는 105　내지 106이다.
본 발명의 약독화된 바이러스의 E 및 NS3 단백질 코딩 서열의 재코딩은 당업계에 알려져 있거나 또는 단백질 코딩 서열을 재코딩하기 위해 새롭게 고안된 임의의 알고리즘 또는 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 뉴클레오티드 치환은 E 및 NS3 코딩 서열의 다수 위치에서 조작되며, 상기 치환은 복수의 동의 코돈을 게놈으로 도입한다. 소정의 구체예에서, 상기 동의 코돈 치환은 상기 게놈에서 코돈 편향, 코돈쌍 편향, 빈번하지 않은 코돈 또는 빈번하지 않게 발생하는 코돈쌍의 밀도, RNA 2차 구조, CG 및/또는 TA (또는 UA) 디뉴클레오티드 함량, C+G 함량, 번역 프레임이동 부위, 번역 정지 부위, 마이크로RNA 인식 서열의 존재 또는 부재 또는 임의의 이들의 조합들을 변경한다. 상기 E 및 NS3 코딩 서열을 통해 분포된 다수의 위치에서, 또는 상기 E 및 NS3 코딩 서열의 일부로 제한된 다수의 위치에서 상기 코돈 치환이 조작될 수 있다. 관여된 다수의 결함 (즉, 뉴클레오티드 치환)으로 인해, 본 발명은 안정적으로 약독화된 바이러스 및 생백신을 제조하는 수단을 제공한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 일부 구체예에서, 바이러스 코딩 서열은 하나 이상의 코돈을 지카 숙주 (예: 인간, 모기)에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환함으로써 재코딩된다. 일부 구체예에서, 바이러스 코딩 서열은 하나 이상의 코돈을 지카 바이러스에서 덜 빈번하게 사용되는 동의 코돈으로 치환함으로써 재코딩된다. 소정의 구체예에서, 동의 코돈으로 치환된 코돈의 수는 적어도 5개이다. 일부 구체예에서, 적어도 10개, 또는 적어도 20개의 코돈이 동의 코돈으로 치환된다.
일부 구체예에서, 바이러스 코돈쌍은 코돈쌍 편향을 감소시키기 위해 (즉, 이의 값을 더 낮추기 위해) 재코딩된다. 소정의 구체예에서, 감소될 수 있는 코돈쌍 스코어를 갖는 E 또는 NS3 코딩 서열에서 코돈쌍을 동정하고, 상기 코돈쌍을 더 낮은 코돈쌍 스코어를 갖는 코돈쌍으로 치환하여 코돈쌍 편향을 감소시킴으로써, 코돈쌍 편향이 감소된다. 일부 구체예에서, 상기 코돈쌍의 치환은 서열의 기존 코돈을 재배열하는 형태를 취한다. 일부 이러한 구체예에서, 코돈쌍의 서브세트는 동의 코돈의 서브세트를 재배열함으로써 치환된다. 다른 구체예에서, 코돈쌍은 재배열된 동의 코돈의 수를 최대화함으로써 치환된다. 코돈의 재배열이 전체적으로 바이러스 코딩 서열에 대해 감소된 (보다 네가티브가 되는) 코돈쌍 편향으로 이어지고, 재배열로 많은 위치에서 CPS가 감소하지만, 다른 위치에서 CPS 증가를 수반할 수 있지만, 평균적으로 변형된 서열의 코돈쌍 스코어, 따라서 CPB가 감소되는 것에 유의해야 한다. 일부 구체예에서, 코돈 또는 코돈쌍의 재코딩은 E 및 NS3 코딩 서열의 G+C 함량의 변경을 고려할 수 있다. 일부 구체예에서, 코돈 또는 코돈쌍의 재코딩은 E 및 NS3 코딩 서열에서 CG 및/또는 TA 디뉴클레오티드 빈도의 변경을 고려할 수 있다.
소정의 구체예에서, 상기 재코딩된 E 단백질-코딩 서열은 -0.1 미만, 또는 -0.2 미만, 또는 -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈쌍 편향을 갖는다. 소정의 구체예에서, 상기 재코딩된 (즉, 감소된 발현) NS3 단백질-코딩 서열은 -0.1 미만, 또는 -0.2 미만, 또는 -0.3 미만, 또는 -0.4 미만의 코돈쌍 편향을 갖는다. 소정의 구체예에서, 상기 재코딩된 HA 단백질 코딩 서열의 코돈쌍 편향은 유래되는 모체 E 단백질 코딩 서열과 비교하여, 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4 만큼 감소된다. 소정의 구체예에서, 상기 재코딩된 NS3 단백질 코딩 서열의 코돈쌍 편향은 유래되는 모체 NS3 단백질 코딩 서열과 비교하여, 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4 만큼 감소된다. 소정의 구체예에서, 상기 E 단백질-코딩 서열의 동의 코돈의 재배열은 유래되는 모체 E 단백질 코딩 서열의, 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4의 코돈쌍 편향 감소를 제공한다. 소정의 구체예에서, 상기 NS3 단백질-코딩 서열의 동의 코돈의 재배열은 유래되는 모체 NS3 단백질 코딩 서열의, 적어도 0.1, 또는 적어도 0.2, 또는 적어도 0.3, 또는 적어도 0.4의 코돈쌍 편향 감소를 제공한다.
일반적으로, 이들 치환 및 변경이 수행되어, 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 코딩된 바이러스 단백질의 발현을 감소시킨다. 소정의 구체예에서, 본 발명은 또한 E 및/또는 NS3 코딩 서열에서 변경을 포함하며, 이는 보존적이거나 또는 보존적이지 않을 수 있는, 코딩된 단백질에서 아미노산 치환 및 비-동의 코돈의 치환을 유도한다.
대부분의 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 코딩된다. 하기 표 6에 유전자 코드를 참조한다. 예를 들면, 알라닌은 GCU, GCC, GCA 및 GCG에 의해 코딩된다. 3개의 아미노산 (Leu, Ser 및 Arg)은 6개의 상이한 코돈에 의해 코딩되며, Trp 및 Met 만이 유일한 코돈을 갖는다. "동의" 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈이다. 따라서, 예를 들어, CUU, CUC, CUA, CUG, UUA 및 UUG는 Leu를 코딩하는 동의 코돈이다. 동의 코돈은 동일한 빈도로 사용되지 않는다. 일반적으로, 특정 생물체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 동족 tRNA가 풍부한 코돈이며, 이들 코돈의 사용은 단백질 번역의 속도 및/또는 정확도를 향상시킨다. 반대로, 드물게 사용되는 코돈에 대한 tRNA는 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 희귀 코돈의 사용은 번역 속도 및/또는 정확도를 감소시키는 것으로 생각된다.
Figure pct00010
a 특정 아미노산을 코딩하는 각 코돈에서 제1 뉴클레오티드는 가장 왼쪽 행에 개시되어 있고; 제2 뉴클레오티드는 상부 열에 개시되어 있으며; 제3 뉴클레오티드는 가장 오른쪽 행에 개시되어 있다.
본 발명에 따르면, 바이러스 약독화는 E 및 NS3 코딩 서열의 코돈쌍 탈최적화를 통해 바이러스 단백질 발현을 감소시킴으로써 달성된다. 코딩 서열의 발현을 감소시키는 한가지 방법은 코돈쌍 편향의 감소에 의한 것이지만, 다른 방법도 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 코돈 편향이 변경될 수 있지만, 코돈쌍 편향을 조정하는 것이 특히 유리하다. 예를 들어, 코돈 편향을 통한 바이러스 약독화는 일반적으로 공통 코돈의 제거를 필요로 하며, 뉴클레오티드 서열의 복잡성이 감소된다. 대조적으로, 훨씬 더 큰 서열 다양성을 유지하여, 결과적으로 핵산 2차 구조, 어닐링 온도, 및 다른 물리적 및 생화학적 특성에 대해 더 크게 제어하면서 코돈쌍 편향 감소 또는 최소화를 달성할 수 있다.
단백질-코딩 서열 (즉, 오픈 리딩 프레임)의 코돈쌍 편향은 상기에 기재되고 Coleman et al., 2008에 개시된 바와 같이 계산된다.
바이러스 약독화 및 유도 또는 보호 면역 반응은 본원에 개시된 방법 및 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법으로 확인될 수 있다. 비-제한적인 예는 플라크 분석, 성장 측정, 시험 동물의 감소된 치사율, 및 야생형 바이러스로 후속 감염에 대한 보호를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 고도로 약독화된 바이러스를 사용한다. 이러한 지카 바이러스 다양성은 소위 아프리카 및 아시아 계열의 바이러스를 포함한다. 약독화된 지카 단백질 코딩 서열의 예는 서열번호: 2, 3 및 4를 포함한다.
코돈 치환
소정의 구체예에서, 상기 변형된 바이러스에 대한 동의 코돈 치환은 게놈에서 코돈 편향, 코돈쌍 편향, 탈최적화 코돈 및 탈최적화 코돈쌍의 밀도, RNA 2차 구조, CpG 디뉴클레오티드 함량, C+G 함량, 번역 프레임이동 부위, 번역 정지 부위, 마이크로RNA 인식 서열의 존재 또는 부재 또는 이의 임의의 조합을 변경한다. 코돈 치환은 게놈을 통해 분포된 다수의 위치에서, 또는 상기 게놈의 일부에 제한된 다수의 위치에서 조작될 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 게놈의 일부는 캡시드 코딩 영역이다.
추가의 구체예에서, 상기 게놈의 일부는 게놈의 구조 단백질 코딩 영역이다.
추가의 구체예에서, 상기 게놈의 일부는 게놈의 비-구조 단백질 코딩 영역이다.
변형된 종양용해 바이러스 조성물
본 발명은 또한 본원에 기재된 변형된 바이러스를 합성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 바이러스 게놈의 적어도 하나의 비-조절 부분내 다수의 위치에서 코돈을 동정하는 단계로서, 상기 코돈은 동의 코돈에 의해 대체될 수 있는 것인 단계; (b) 각 동정된 코돈으로 치환될 동의 코돈을 선택하는 단계; 및 (c) 각 동정된 코돈에 대해 동의 코돈으로 치환하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 소정의 구체예에서, 단계 (a) 및 (b)는 탈최적화 코돈 분포 및/또는 탈최적화 코돈쌍 분포의 특정 패턴 세트를 바람직한 한계내에서 가변함으로써 바이러스 게놈 디자인을 허용하는 SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering)용 컴퓨터-기반 알고리즘에 의해 가이드된다. 본 발명은 또한 상기 패턴 세트가 대안으로서 또는 추가적으로 탈최적화 코돈 및 탈최적화 코돈쌍의 밀도, RNA 2차 구조, CpG 디뉴클레오티드 함량, UpA 디뉴클레오티드 함량 C+G 함량, 중첩 코딩 프레임, 제한 부위 분포, 프레임이동 부위 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 단계 (c)는 동의 코돈 및/또는 코돈쌍을 함유하는 DNA의 드 노보 합성 및 게놈의 상응하는 영역의 합성된 DNA로의 치환에 의해 수행된다. 추가의 구체예에서, 전체 게놈은 합성된 DNA로 치환된다. 다른 추가의 구체예에서, 상기 게놈의 일부는 합성된 DNA로 치환된다. 또 다른 구체예에서, 상기 게놈의 일부는 캡시드 코딩 영역이다.
"대상 (subject)"은 임의의 동물 또는 인공적으로 변형된 동물을 의미한다. 동물은 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 양, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 흰담비 (ferrets), 설치류 예컨대 마우스, 래트 (rats) 및 기니아 피그 (guinea pigs), 및 조류 (birds)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 인공적으로 변형된 동물은 인간 면역계를 가진 SCID 마우스, 및 인간 폴리오바이러스 수용체 CD155를 발현하는 CD155tg 유전자이식 마우스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 대상은 인간이다. 조류의 바람직한 구체예는 닭, 칠면조, 오리 및 거위를 포함하지만 이에 한정되지 않는 가금류이다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있다.
다양한 구체예에서, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있다.
재조합 폴리오바이러스의 합성
재조합 변형된 바이러스 키메라는 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. DNA 기술에 대한 임의의 표준 매뉴얼은 본 발명의 변형된 바이러스 키메라를 제조하는 상세한 프로토콜을 제공한다.
변형된 바이러스의 감소된 병원성의 결정
PV-Min 키메라 XY 및 Z 및 PV-Max의 신경독성을, 증가하는 용량의 바이러스로 뇌내 주사를 통해 CD155tg 마우스에서 시험하였다. 특히, 4 내지 6마리의 6-8 주령의 CD155tg 마우스 그룹에게 다양한 용량으로 접종하고, 그 다음에 회색질척수염의 발병을 관찰하였다. 대조군 마우스 그룹에게 PV(M)-wt로 병렬 실험 (parallel experiments)에서 주사하였다. 주사 용량은 뇌로 삽입되는 비리온의 정량을 정규화하기 위해 PFU 보다는 입자에 기반한다. 상기 마우스를 회색질척수염의 특징적 증상인 이완성 마비의 발병에 대해 매일 모니터링하였다. 바이러스의 독성 (virulence)을 정량화하는데 사용되는 표준 값은 LD50 (Lethal Dose 50)이다. 상기 값은 동물의 50%는 살아 있고 50%는 죽는 수준으로 바이러스를 접종하는 용량을 나타낸다. 상기 합성 바이러스 PV-MinXY 및 PV-MinZ는 PV(M)-wt보다 더 높은 LD50을 가지므로, 입자에 기반하여 1,500-배 또는 PFU에 기반하여 20-배이며, 병원성이 더 낮았다 (표 4).
폴리오바이러스의 종양용해 특성의 평가
본 발명의 변형된 바이러스 키메라의 종양용해 특성은 또한 하기와 같이 인 비보 평가될 수 있다. 악성 세포의 피하 또는 정위 (stereotactic) 뇌내 이식에 의해 실험 종양이 무흉선 마우스 (athymic mice)에서 생성된다. 치료되지 않은 무흉선 마우스 및 종양용해 변형된 바이러스 재조합체가 투여된 다음에 다양한 치료 요법이 수행된 무흉선 마우스에서 종양 진행은 임상적 관찰 및 병리학적 검사를 수행하였다. 무흉선 마우스로의 종양 이식 기술은 Fogh, J. 등에 상세하게 기재된 표준 절차이다.
약학적 조성물
본 발명의 변형된 바이러스 키메라는 유방, 결장, 기관지 통로 (bronchial passage), 위장관의 상피 표면 (epithelial lining of the gastrointestinal), 상기도 (upper respiratory) 및 비뇨-생식관 (genito-urinary tracts), 간, 전립선, 뇌 또는 임의의 다른 인간 조직과 같은 다양한 장기에서 악성 종양을 치료하기 위한 예방용 및 치료용 조성물에서 유용하다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스 키메라는 고형 종양을 치료하는데 유용하다. 특정 구체예에서, 치료된 종양은 교모세포종, 선암종, 흑색종 또는 신경모세포종이다. 다양한 구체예에서, 치료된 종양은 삼중-음성 유방암 (triple-negative breast cancer)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 악성 종양 예방을 위한 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 바이러스 키메라는 수술, 방사선 요법 및/또는 화학요법과 병용하여 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 변형된 바이러스 키메라는 2 이상의 상기 치료 절차와 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 병용 요법은 유익하게 투여되는 치료제를 더 적은 용량으로 이용하므로, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 유해 효과를 피할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 변형된 바이러스 키메라 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. "치료적으로 유효한 양"은 암 세포의 용해를 유발하여 종양 괴사를 유발할 수 있는 양을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 이를 투여한 환자에서 알레르기 반응 또는 다른 원치 않는 효과를 유발하지 않는 담체를 의미한다.
적절한 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 하나 이상의 물, 식염수 (saline), 포스페이트 완충된 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 유사물뿐만 아니라 이들의 조합들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 변형된 바이러스 키메라의 저장 수명 또는 효과를 증진시키는, 소량의 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들어 액체 용액, 분산액 또는 현탁액, 주사 및 주입 가능한 용액과 같은 액체 제형을 포함한다. 바람직한 제형은 의도된 투여 방식 및 예방 또는 치료 적용에 의존한다. 바람직한 조성물은 주사 또는 주입 가능한 용액의 형태이다.
예방용 및 치료용 암 치료
본 발명은 상이한 종양 타입을 치료하기 위한 종양용해 요법으로서 사용될 수 있는 변형된 바이러스의 제조 및 본원에 기재된 변형된 바이러스를 투여하여 종양 및 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 다양한 구체예는 게놈의 하나 또는 다수의 위치에서 조작된 뉴클레오티드 치환을 함유하는 변형된 바이러스 게놈을 포함하는, 변형된 바이러스를 제공하며, 상기 치환은 복수의 동의 코돈을 게놈에 도입하고 및/또는 동일한 아미노산에 대한 기존 코돈의 순서를 변경한다 (코돈쌍 이용의 변화). 두 경우에서, 바이러스 유전자 산물의 원래의 야생형 아미노산 서열은 98% 내로 유지된다.
대부분의 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 코딩된다. 표 1의 유전자 코드를 참조한다. 예를 들면, 알라닌은 GCU, GCC, GCA 및 GCG에 의해 코딩된다. 3개의 아미노산 (Leu, Ser 및 Arg)은 6개의 상이한 코돈에 의해 코딩되는 반면, Trp 및 Met 만이 유일한 코돈을 갖는다. "동의" 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈이다. 따라서, 예를 들어 CUU, CUC, CUA, CUG, UUA 및 UUG는 Leu를 코딩하는 동의 코돈이다. 동의 코돈은 동일한 빈도로 사용되지 않는다. 일반적으로, 특정 생물체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 동족 tRNA가 풍부한 코돈이며, 이들 코돈의 사용은 단백질 번역 속도 및/또는 정확도를 증진시키는 것이다. 반대로, 드물게 사용되는 코돈에 대한 tRNA가 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 희귀 코돈의 사용은 번역 속도 및/또는 정확도를 감소시키는 것으로 생각된다. 따라서, 핵산에서 주어진 코돈을 동의이지만 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 대체하는 것은 "탈최적화" 코돈을 핵산으로 치환하는 것이다.
기존 암 치료
본 발명의 다양한 구체예는 종양 또는 암 세포에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 상기 치료 타입은 대상이 암으로 진단받은 경우에 이루어질 수 있다. 상기 방법은 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된다.
본 발명의 다양한 구체예는 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공하며, 변형된 바이러스는 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되며, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있다.
프라임 용량 및/또는 부스트 용량으로 이용될 수 있는 다른 약독화된 바이러스의 예는 피코르나비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 헤르페스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 랍도비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 레오비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 폭스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 토가비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스뿐만 아니라 본원에 (예: 상기 "바이러스 및 변형된 바이러스" 단락에서) 기재된 바이러스의 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물을 포함한다.
다양한 구체예에서, 악성 종양에서 종양용해 효과를 유도하여 악성 종양을 치료한다.
다양한 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-L1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제 모두를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 PD-1 저해제는 항-PD1 항체이다. 다양한 구체예에서, 상기 PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체이다. PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제의 예가 본원에 제공된다.
다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 악성 종양 재발 가능성을 감소시킨다. 이는 또한 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암을 가질 가능성을 감소시킬 수 있다. 대상에서 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병한 경우 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다. 일부 구체예에서, 악성 종양 완화 후에, 대상에서 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다.
프라임 - 부스트 치료
본 발명의 다양한 구체예는 프라임-부스트-타입 치료 요법을 사용하여, 면역 반응을 유도하여 종양 또는 암 세포에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 면역 반응을 유도하고 종양 또는 암 세포에서 종양용해 효과를 유도하여 악성 종양을 치료한다.
본 발명의 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스의 프라임 용량을 투여하여 초기 면역 반응을 유도한다. 그 후에, 본 발명의 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스의 부스트 용량을 투여하여 종양에서 종양용해 효과 유도 및/또는 종양에 대한 종양용해 효과를 포함하는 면역 반응을 유도한다.
다양한 구체예에서, 상기 프라임 용량 및 부스트 용량은 본 발명의 동일한 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스를 함유한다. 다른 구체예에서, 상기 프라임 용량 및 부스트 용량은 본 발명의 상이한 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스이다.
다양한 구체예에서, 상기 방법은 프라임 용량의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및 하나 이상의 부스트 용량의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 프라임 용량 및 부스트 용량의 변형된 바이러스는 하기로부터 각각 독립적으로 선택된다: (1) 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스, (2) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스, (3) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, (4) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, (5) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 또는 (6) 이들의 조합들.
다양한 구체예에서, 프라임 용량이 피하, 근육내, 피부내, 비강내 또는 정맥내로 투여된다.
다양한 구체예에서, 하나 이상의 부스트 용량이 종양내, 정맥내, 경막내 또는 종양내 (종양으로 직접)로 투여된다. 바람직한 투여 방식은 종양 부위에 직접 투여하는 것이다.
프라임 용량과 부스트 용량 사이의 시기는 예를 들어 암 타입, 암의 단계 및 환자 건강 상태에 따라 가변될 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 하나 이상의 부스트 용량의 첫번째 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 2주후에 투여된다. 즉, 프라임 용량이 투여되고, 약 2주 후에, 부스트 용량이 투여된다.
다양한 구체예에서, 하나 이상의 부스트 용량은 프라임 용량 후 약 2주후에 투여된다. 다양한 구체예에서, 2, 3, 4 또는 5회의 부스트 용량이 투여된다. 다양한 구체예에서, 부스트 용량들 사이의 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주일 수 있다. 추가의 구체예에서, 부스트 용량들 사이의 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 프라임 용량이 투여될 수 있고, 약 2주 후에 제1 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제1 부스트 용량 후 약 1개월 후에, 제2 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제2 부스트 용량 후 약 6개월 후에, 제3 부스트 용량이 투여될 수 있다. 다른 비-제한적인 예로서, 프라임 용량이 투여될 수 있고, 약 2주 후에 제1 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제1 부스트 용량 후 약 6개월 후에, 제2 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제2 부스트 용량 후 약 12개월 후에, 제3 부스트 용량이 투여될 수 있다. 추가의 구체예에서, 추가의 부스트 용량이 주기적으로 투여될 수 있다; 예를 들어, 1년 마다, 2년 마다, 5년 마다, 10년 마다 등.
다양한 구체예에서, 투여 용량은 프라임 용량과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 상기 프라임 용량은 부스트 용량과 비교하여 더 적은 카피의 바이러스를 함유할 수 있다.
다른 구체예에서, 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스 또는 본 발명의 변형된 바이러스의 타입은 프라임 용량과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 본 발명의 변형된 바이러스가 프라임 용량으로 사용될 수 있고, 동일하거나 또는 상이한 과, 속, 종, 그룹 또는 목의 약독화된 바이러스 (코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법으로 생성됨)가 부스트 용량으로 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스 또는 본 발명의 변형된 바이러스의 타입은 또한 프라임 용량 및 부스트 용량으로서 이용될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 약독화된 바이러스가 프라임 용량으로 사용될 수 있고, 동일하거나 또는 상이한 과, 속, 종, 그룹 또는 목의 약독화된 바이러스 (코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법으로 생성됨)가 부스트 용량으로 사용될 수 있다.
프라임 용량 및/또는 부스트 용량으로 이용될 수 있는 다른 약독화된 바이러스의 예는 피코르나비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 헤르페스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 랍도비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 레오비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 폭스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 토가비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스뿐만 아니라 본원에 (예: 상기 "바이러스 및 변형된 바이러스" 단락에서) 기재된 바이러스의 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물을 포함한다.
다른 구체예에서, 투여 경로는 프라임 용량과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 프라임 용량은 피하로 투여될 수 있고, 부스트 용량은 종양으로의 주사를 통해 투여될 수 있으며; 접근 가능하거나 또는 접근이 어려운 종양의 경우, 부스트 용량이 정맥내로 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-L1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제 모두를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 둘 다가 치료 (부스트) 단계에서 투여되고, 프라임 단계 중에는 투여되지 않는다.
다양한 구체예에서, PD-1 저해제는 항-PD1 항체이다. 다양한 구체예에서, PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체이다. PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제의 예가 본원에 제공된다.
암에 걸리기 전에 프라임 - 부스트 치료
본 발명의 다양한 구체예는 암에 걸리지 않은 대상에서 면역 반응을 유도하고, 종양 또는 암 세포가 대상에서 발병한다면 및 발병할 때 종양 또는 암 세포에서 종양용해 효과를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 프라임-부스트-타입 치료 요법을 사용한다. 다양한 구체예에서, 면역 반응을 유도하고 종양 또는 암 세포에서 종양용해 효과를 유도하여 대상에서 암이 발병한다면 및 발병할 때 악성 종양을 치료한다.
본 발명의 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스의 프라임 용량이 대상이 암에 걸리지 않은 경우 또는 대상이 암을 갖는다고 사료되지 않는 경우 초기 면역 반응을 유도하기 위해 투여된다. 후자는 검출 가능하지 않거나 검출되지 않는 암에 기인할 수 있다.
프라임 용량의 약독화된 바이러스는 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스일 수 있거나, 또는 본 발명의 변형된 바이러스는 대상이 암을 갖지 않거나 또는 대상이 암을 갖는 것으로 사료되지 않는 경우 프라임 및 부스트 용량으로서 이용될 수 있다. 다시, 후자는 검출 가능하지 않거나 검출되지 않는 암에 기인할 수 있다.
그 후에, 일부 구체예에서, 본 발명의 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스의 부스트 용량이 면역 반응 유도를 지속하기 위해 주기적으로 투여된다. 예를 들어, 부스트 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년마다 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 부스트 용량은 약 5년마다 투여될 수 있다.
대안으로서, 다른 구체예에서, 본 발명의 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스의 부스트 용량은 대상이 암으로 진단받은 후에 투여된다. 예를 들어, 대상이 암으로 진단받으면, 부스트 용량의 투여를 포함하는 치료 요법은 종양에서 종양용해 효과를 유도 및/또는 종양에 대한 종양용해 효과를 포함하는 면역 반응을 유도하기 위해 바로 시작될 수 있다. 추가의 구체예에서, 추가 부스트 용량은 암 치료를 지속하기 위해 투여될 수 있다.
임의의 특정 이론 또는 정해진 요법에 구속되지 않고, 프라임 용량 및 부스트 용량(들)은 바이러스-감염된 세포를 인식하도록 대상의 면역계를 "가르치는" 것으로 여겨진다. 따라서, 대상에서 암이 발병하고 부스트 용량이 투여된 경우, 상기 대상의 면역계는 바이러스 감염된 세포를 인식하고; 이 때, 상기 바이러스 감염된 세포는 암 세포이다. 상기 바이러스 감염된 암 세포에 대한 면역 반응 중에, 상기 면역계는 또한 암 항원으로 프라이밍되고, 따라서 면역계는 암 항원을 발현하는 세포를 표적으로 할 것이므로 항암 면역을 향상시킨다.
이와 같이, 다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 악성 종양 재발 가능성을 감소시킨다. 또한 이는 악성 종양과 상이한 속발성 암을 가질 가능성을 감소시킬 수 있다. 대상에서 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병한 경우, 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다. 일부 구체예에서, 악성 종양 완화 후에, 대상에서 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병한 경우, 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다.
암이 발병한 경우 치료된 종양 세포를 표적으로 하는 면역계를 준비하는, 항암 백신으로서 프라임 및 부스트 용량을 생각할 수 있다.
다양한 구체예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 본 발명의 동일한 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스를 함유한다. 다른 구체예에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 본 발명의 상이한 약독화된 바이러스 또는 변형된 바이러스이다.
다양한 구체예에서, 상기 방법은 프라임 용량의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및 하나 이상의 부스트 용량의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 프라임 용량 및 부스트 용량의 변형된 바이러스는 하기로부터 각각 독립적으로 선택된다: (1) 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스, (2) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스, (3) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, (4) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, (5) 야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 또는 (6) 이들의 조합들.
다양한 구체예에서, 프라임 용량은 피하, 근육내, 피부내, 비강내 또는 정맥내로 투여된다.
다양한 구체예에서, 하나 이상의 부스트 용량이 암에 걸리지 않았거나 또는 암에 걸린 것으로 의심되지 않는 대상에게 투여되는 경우, 이는 피하, 근육내, 피부내, 비강내 또는 정맥내로 투여된다.
다양한 구체예에서, 하나 이상의 부스트 용량이 암으로 진단받은 대상에게 투여되는 경우, 이는 종양내, 정맥내, 경막내 또는 종양내 (종양으로 직접)로 투여된다. 바람직한 투여 방식은 종양 부위에 직접 투여된다.
프라임 용량과 부스트 용량 사이의 시기는 예를 들어 암 타입, 암의 단계 및 환자 건강 상태에 따라 가변될 수 있다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 부스트 용량의 첫번째 부스트 용량은 대상이 암에 걸리지 않았거나 또는 암에 걸린 것으로 의심되지 않는 경우, 프라임 용량 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10마다 투여된다. 특정 구체예에서, 부스트 용량은 약 5년 마다 투여된다.
다양한 구체예에서, 예를 들어, 대상이 암으로 진단받은 경우, 하나 이상의 부스트 용량은 암 진단 후에 투여된다. 다양한 구체예에서, 2, 3, 4 또는 5회의 부스트 용량이 투여된다. 다양한 구체예에서, 부스트 용량들 사이의 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주일 수 있다. 추가의 구체예에서, 부스트 용량들 사이의 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 프라임 용량이 투여될 수 있고, 약 5년 후에 제1 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제1 부스트 용량 후 약 1년 후에, 대상이 암으로 진단되고, 제2 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제2 부스트 용량 후 약 2주 후에, 제3 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제3 부스트 용량 후 약 2주 후에, 제4 부스트 용량이 투여될 수 있고, 제4 부스트 용량 후 약 1개월 후에, 제5 부스트 용량이 투여될 수 있다. 암이 완화된 것으로 결정되면, 추가 주기적 부스트 용량이 투여될 수 있다; 예를 들어, 6개월 마다, 1년 마다, 2년 마다, 3년 마다, 4년 마다 또는 5년 마다.
다양한 구체예에서, 투여량은 프라임 용량과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 프라임 용량은 부스트 용량과 비교하여 더 적은 카피의 바이러스를 함유할 수 있다.
다른 구체예에서, 코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스 또는 본 발명의 변형된 바이러스의 타입은 프라임 용량과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 본 발명의 변형된 바이러스가 프라임 용량으로 사용될 수 있고, 동일하거나 또는 상이한 과, 속, 종, 그룹 또는 목의 약독화된 바이러스 (코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법으로 생성됨)가 부스트 용량으로 사용될 수 있다.
프라임 용량 및/또는 부스트 용량으로 이용될 수 있는 다른 약독화된 바이러스의 예는 피코르나비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 헤르페스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 랍도비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물에 속하는 약독화된 바이러스; 레오비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 폭스비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스; 토가비리데 바이러스 과 및 모든 관련 속, 균주에 속하는 약독화된 바이러스뿐만 아니라 본원에 (예: 상기 "바이러스 및 변형된 바이러스" 단락에서) 기재된 바이러스의 과 및 모든 관련 속, 균주, 타입 및 단리물을 포함한다.
다른 구체예에서,투여 경로는 프라임과 부스트 용량 사이에서 가변될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 프라임 용량은 피하로 투여될 수 있으며, 부스트 용량은 종양으로의 주사를 통해 투여될 수 있고; 접근 가능하거나 또는 접근이 어려운 종양의 경우, 부스트 용량은 정맥내로 투여될 수 있다.
다양한 구체예에서, 이들 치료 (예: 암 이전에 프라임 용량, 또는 암 이전에 프라임 및 부스트 용량, 그 다음에 암에 걸린 후에 부스트 용량)를 받은 대상은 암 발병 위험이 높은 대상일 수 있다. 이러한 대상의 예는 유전적 소인 (genetic dispositions) (예: BRCA1 또는 BRCA2 돌연변이, TP53 돌연변이, PTEN 돌연변이, KRAS 돌연변이, c-Myc 돌연변이, 암을 유발하는 돌연변이로서 National Cancer institute에 의해 간주되는 임의의 돌연변이 등), 암의 가족력, 고령 (예: 40, 45, 55, 65세 이상), 정상 방사선 노출 초과, 연장된 일광 노출, 담배 사용 이력 (예: 흡연, 씹기 (chewing)), 알코올 남용 이력, 약물 남용 이력, 체질량 지수 >25, 만성 염증 질환(들) 병력 (예: 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 천식, 류마티스 관절염 등), 면역 억제 병력, 암 위험 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있는 만성 감염 병력 (예: C형 간염, B형 간염, EBV, CMV, HPV, HIV, HTLV-1, MCPyV, H. 피로리 (H. Pylori) 등)을 가진 대상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구체예에서, 이들 치료 (예: 암 이전에 프라임 용량 및 부스트 용량, 또는 암 이전에 프라임 및 부스트 용량, 그 다음에 암 이후에 부스트 용량)를 받은 대상은 보다 높은 위험 카테고리에 속하지는 않지만, 임상의가 미래 암 위험에 대한 예방 조치로서 프라임 및 부스트 용량을 처방한 대상일 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-L1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제 모두를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 둘 다가 치료 (부스트) 단계 중에 투여되고, 프라임 단계 중에는 투여되지 않는다.
다양한 구체예에서, PD-1 저해제는 항-PD1 항체이다. 다양한 구체예에서, PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체이다. PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제의 예가 본원에 제공된다.
염증 반응
본 발명의 변형된 바이러스의 투여는 IL-1B를 자극한다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않으면서, 본 발명의 변형된 바이러스는 RIG-I, STNG, IRF3, IRF7 및 NFkB의 자극을 제공하며, 이는 지속적인 염증 반응을 촉진하고, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 내인성 IL-1B 생성을 자극한다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않으면서, 본 발명의 변형된 바이러스는 선천성 면역 수용체 RIG-I 및 STNG의 자극을 제공하며, 지속적인 염증 반응을 자극 및 촉진하고, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 내인성 IL-1B 생성을 자극한다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않으면서, 본 발명의 변형된 바이러스는 선천성 면역 전사 인자인 IRF3, IRF7 및 NFkappaB의 자극을 제공하며, 이는 지속적인 염증 반응을 자극 및 촉진하고, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 IL-1B 생성의 치료적으로 유효한 양을 유지하여, 지속적인 염증 반응을 촉진하고, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 내인성 타입-1 인터페론 생성을 자극하여, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 타입-1 인터페론 생성의 치료적으로 유효한 양을 유지하여, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 대상에서 타입 I 인터페론을 활성화하여 대상에서 이온화 방사선 및 화학요법 감작을 유지한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 CD45+ 백혈구, 호중구, B-세포, CD4+ T-세포 및 CD8+ 면역 세포를 포함하는 염증유발 면역 세포를 암 부위로 모집하여, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 변형된 바이러스의 투여로 암 부위로부터 FoxP3+ T-조절 세포 또는 M2-마크로파지와 같은 항-염증성 면역 세포를 감소시켜서, 부분적으로 치료 효능을 제공한다.
다양한 구체예에서, 악성 종양 치료는 악성 종양 재발 가능성을 감소시킨다. 이는 또한 악성 종양과 상이한 속발성 암을 가질 가능성을 감소시킬 수 있다. 대상에서 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다. 일부 구체예에서, 악성 종양의 완화 후에, 대상에서 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병한 경우, 악성 종양 치료는 속발성 암의 성장을 지연시킨다.
PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제
본원에서 논의된 바와 같이 사용될 수 있는 항-PD1 항체의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, AMP-224, AMP-514, 스파르탈리주맙, 세미플리맙, AK105, BCD-100, BI 754091, JS001, LZM009, MGA012, Sym021, TSR-042, MGD013, AK104, XmAb20717 및 티슬렐리주맙을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
PD-1 저해제의 추가 예는 PF-06801591, 만능성 킬러 T 림프구를 발현하는 항-PD1 항체 (PIK-PD-1) 및 자가 항-EGFRvIII 4SCAR-IgT 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
항-PD-L1 항체의 예는 BGB-A333, CK-301, FAZ053, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, BMS-936559 및 CK-301을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항-PD-L1 저해제의 추가 예는 M7824이다.
투여 경로
상기에 논의된 것에 추가하여, 치료용 종양용해 변형된 바이러스는 종양내, 정맥내, 경막내 또는 종양내 (종양으로 직접)로 전달될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 종양 부위로 직접 투여된다. 치료 목적을 위해 적용된 바이러스 접종물을 1-10 μl 범위의 매우 작은 부피로 투여될 수 있다.
본 발명의 변형된 바이러스 키메라의 치료적으로 유효한 양은 투여 계획, 투여된 변형된 바이러스 키메라의 단위 용량, 변형된 바이러스 키메라가 다른 치료제와 병용하여 투여되는지 여부, 환자의 상태 및 건강에 의존할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.
종양용해 재조합 바이러스의 치료적으로 유효한 양은 안전하게 투여될 수 있는 재조합 바이러스의 최대량 및 효율적인 종양용해를 발휘하는 재조합 바이러스의 최소량에 따라 실험으로 결정될 수 있다.
종양용해 변형된 바이러스의 치료적 접종은 초기 치료 요법의 효과에 따라 반복적으로 제공될 수 있다. 투여된 특정 종양용해 변형된 바이러스에 대한 숙주의 면역 반응이 초기에 그 효과를 제한한다면, 다른 변형된 바이러스의 혈청형을 가진 종양용해 변형된 바이러스의 추가 주사를 수행할 수 있다. 특정 변형된 바이러스에 대한 숙주 면역 반응은 혈청학적으로 용이하게 결정될 수 있다. 그러나, 선택된 투여 계획에 따라 용량이 상기에 지시된 것보다 적거나 또는 많다는 것을 인식될 것이다.
이러한 목적을 위해, 임의의 주어진 변형된 바이러스에 대한 면역 상태에 관한 혈청학적 데이터를 사용하여 변형된 바이러스의 어느 변이체가 사용될지에 대해 정보에 근거한 결정을 내릴 수 있다. 예를 들어, 종양용해 바이러스로 치료하기 위한 후보 환자의 혈청학적 분석을 통해 변형된 바이러스 혈청형 1에 대한 높은 역가가 명백하다면, 대체 변형된 바이러스 제제가 종양 요법을 위해 사용되어야 한다.
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실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특정 물질이 언급되는 경우에, 단지 예시 목적이며, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 능력을 발휘하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1
인간 코돈쌍 편향에 대해 코돈쌍 스코어를 변경하기 위한 PV 서열의 변형.
본 발명의 알고리즘에 폴리오바이러스 타입-1 마호니 (Mahoney) 균주 (PV(M)-wt)의 P1 구조 영역에 대한 DNA 코딩 서열을 입력하고, 상기 영역의 CPB를 맞춤화하였다 (도 2). 시뮬레이션된 어닐링을 사용한 맞춤화 (customization) 후에, 본 발명자는 셔플된 코돈과 신규한 코돈쌍을 가진 2개의 신규한 세그먼트를 생성하였다. 제1 디자인은 +0.246의 포지티브 CPB를 갖는 PV-Max였다. 상기 포지티브 CPB는 PV-Max가 평균적으로 과표현된 코돈쌍을 사용하였음을 나타낸다. 제2 디자인은 PV-Min이었고, 이는 -0.474의 네가티브 CPB를 갖는다. 상기 네가티브 CPB는 PV-Min이 평균적으로 저표현된 코돈쌍을 사용하였음을 나타낸다 (도 1). 처음 4개의 코돈 (12개의 뉴클레오티드)은 PV-Min 및 PV-Max에서 변경되지 않았고, 야생형 폴리오바이러스 코돈과 동일하게 유지되었다. 이는 모든 구조체에서 번역이 동일하게 개시되도록 하기 위해 수행되었다. 또한, 상기 P1 영역은 합성 단편에 의해 대체하기에 적절한 영역으로서 선택되었으며, 이는 상기 영역의 제거 또는 외래의 비-폴리오 유래 서열로의 대체가 복제에 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었기 때문이다. 상기 P1 영역에서 외래 서열의 이러한 허용은 상기 영역내 복제 조절 요소의 부재를 강력하게 시시한다. 하나의 후보체 서열인 PV-MinY (서열번호:1)는 비-제한적인 예이다.
폴리오바이러스 P1 영역의 컴퓨터 변경으로 극단의 CPB를 갖는 2개의 신규한 서열을 유도하였다. PV-Max는 631개의 침묵 돌연변이 (silent mutation)를 보유하는 PV(M)-wt 및 PV-Min과 비교할 때, 566개의 침묵 돌연변이를 보유하였다 (도 2). 앞서 언급한 식을 사용하여 신규한 P1 영역과 모든 주석이 달린 인간 ORF의 계산된 CPB 스코어를 도 1에서 관찰할 수 있다. 상기 디자인된 PV-Max 및 PV-Min는 각각 +0.246 및 -0.474의 극단의 CPB를 가지며, 이는 자연 발생하는 인간 서열의 외부 한계를 초과하였다 (도 1).
실시예 2
코돈쌍 탈최적화 폴리오바이러스의 제작
상기 언급된 유전자형의 생성된 재조합 바이러스 또는 임의의 다른 변이체의 cDNA를 함유하는 플라스미드를 증폭하고, 정제하고, 선형화를 위해 제한 엔도뉴클레아제 FspI으로 소화하였다 (상기 엔도뉴클레아제는 벡터 서열 내에서 절단). 결과의 선형화된 cDNA (바이러스 cDNA의 5' 삽입 부위 앞에 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 T7에 대한 인식 모티프를 함유함)는 T7 폴리머라제를 사용하는 인 비트로 전사에 사용하여 전장의 바이러스 RNA를 생성하였다. 이와 같이 생성된 바이러스 RNA를 사용하여 감염성 바이러스를 생성하기 위한 덱스트란-설페이트 방법 (Dextran-sulfate method)에 의해 HeLa 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 생산적인 변형된 바이러스 감염을 나타내는 세포병변 효과 (cytopathic effect)의 발생에 대해 관찰하였고, 감염성 바이러스는 HeLa 세포에서 전파되고, 정제되고, 무기한 저장을 위해 동결되었다.
실시예 3
변형된 바이러스는 야생형과 비교하여 약독화되었지만 , 선암종 자궁경부암 세포-HeLa R19 세포를 사멸시킴.
5개의 PV-Min 유도체 RNA를 HeLa R19 세포로 형질감염시킨 후에, RNA 형질감염이 바이러스 자체에 의한 자연 감염 만큼 효율적이지 않기 때문에, 바이러스가 적절하게 증폭되도록 보장하기 위해 각 산물 바이러스를 2회 계대하였다. 다음, 플라크 분석을 수행하여 각 바이러스에 대한 겉보기 PFU/ml 역가를 설명하였다 (도 3). 이들 서브클론은 다양한 정도로 약독화된 바이러스를 산출하였다. P1 단편 X 및 Y를 함유하는 바이러스는 각각 0.8-1 log10 만큼 약독화되었다; 그러나, 함께 부가되는 경우, 이들은 바이러스 PV-MinXY를 산출하고, 이는 2.5배 정도 만큼 유의하게 약독화되었다. 상기 바이러스 PV-MinZ는 PV-MinXY와 같이 2.5 log10 정도로 약독화되었다. 따라서, Y 단편을 PV-MinZ로 되돌릴 때, 구조체 PV-YZ는 생존 가능한 바이러스를 수득하는데 실패하였다 (도 3). 그러므로, 이들 다양한 정도의 약독화는 명백한 부가 효과에 기인한다. 따라서, 전장 PV-Min 구조체의 널 표현형 (null phenotype)이 다양한 3개의 부분영역에서 결함의 합으로 인한 것이라고 결론지을 수 있다.
HeLa R19 세포는 p53 유전자 발현이 낮거나 또는 부재하고, 면역퍼옥시다제 염색에 의해 케라틴에 대해 양성인 선암종 자궁경부암 세포이다.
실시예 4
변형된 서열에서 CpG 및 UpA 디뉴클레오티드 빈도 증가
CPB의 추가적 설명을 제공하는 다른 중요한 관찰로 코돈쌍 사이의 N3 - N1 뉴클레오티드 (즉, 코돈 A의 마지막 뉴클레오티드 및 코돈 B의 첫번째 뉴클레오티드)는 사실상 CPB에 있어서 가장 큰 영향을 미치므로, 페어링 (pairing)에 크게 영향을 준다는 것을 시사하였다. 특히, N3에서 C 및 N1에서 G를 갖는 코돈쌍 (CpG 또는 CG3-1로 지정)은 피하거나, 또는 강하게 저표현된다. 실제로, 이 디뉴클레오티드는 코돈내에서도 억제되며 (CG12, CG23), 이 디뉴클레오티드가 회피되는 이유는 불확실하다. 개별 코돈 내에 또는 코돈들 사이에 CpG 디뉴클레오티드는 번역에 있어서 영향을 미치고, 게놈 힘 (genomic forces)으로 인해 억제될 수 있거나, 또는 CpG의 존재는 진핵생물에서 자신 (self)을 자신이 아닌 것 (non-self)으로부터 구별하는데 사용된다. 가장 드문 개별 코돈은 또한 내부 CG (즉, CG1-2 및 2-3)를 함유하는 것이 중요하며, 이 디뉴클레오티드가 일부 목적을 위해 적극적으로 회피되는 것을 시사한다.
제1 가정은 CpG가 번역에 영향을 미친다는 것이며, 첫 번째로 희귀 코돈은 이를 (즉, CG1-2 및 2-3) 함유하고, 또한 CG3-1 디뉴클레오티드에 상응하는 비호환성 tRNA의 결과이기 때문이다. 특히, 상기 뉴클레오티드 쌍의 높은 적층 에너지는 이동하는 리보솜을 방해하는 역할을 한다. 다른 그룹은 포유동물 게놈에서 DNA 메틸화의 간접적인 결과로서 CpG 디뉴클레오티드가 유전자내에서 억제된다고 가정하였고; 그러나, CpG는 여전히 mRNA에서 나타나므로, 메틸화 표적 가능성이 적다. 마지막으로, CpG-함유 DNA 및 CpG-함유 단일 가닥 RNA는 면역 자극인자이므로, 진핵 생물체 자신의 유전자 내에 CpG의 저표현은 선천성 반응을 자극하는 세포 자신의 유전자의 자기-반응성을 방지하는 수단일 수 있다고 알려져 있다. 자기 인식 대 비-자기 인식을 위한 수단으로 사용되는 CpG에 대한 아이디어는 몇 가지 뒷받침되는 관찰이 있었다. 먼저, CpG를 함유하는 코돈 자신 (즉, CG1-2 및 2- 3)은 희귀 코돈이며, 이들 접합부 (junction)에서 CpG를 갖는 코돈쌍 (CG3- 1)은 저표현된다. 또한, 바이러스, 특히 진핵생물을 감염시키는 작은 RNA 바이러스는 이의 게놈에서 CpG를 억제하며, 아마도 이들은 선천성 면역 인식과 반응 유발을 피하기 위해 이들 CpG 함량을 낮추도록 진화했기 때문이다. 마지막으로, CpG를 함유하는 단일 가닥 RNA는 단핵구를 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 코돈-코돈 접합부에서 핵산 조성물의 효과에 대한 이러한 모든 관찰은 단지 CPB를 추가적으로 정의하는 역할을 하지만; 이러한 관찰은 CPB의 생물학적 효과를 명확하게 하는데는 실패하였다.
실시예 5
코돈쌍 편향의 변형에 의한 단백질 발현의 감소 및 CpG 또는 UpA 증가.
도 4에 도시된 바와 같이, 단백질 발현은 코돈쌍 편향의 변형에 의해 감소되었다.
PV -WT 및 PV - MinY에서 CpG 및 UpA 증가.
디-뉴클레오티드 PV-WT PV-MinY 증가
CpG 176 218 +41
UpA 366 392 +26
실시예 6
변형에 의한 인 비보 약독화
PV-Min 키메라 XY 및 Z 및 PV-Max의 신경독성을 CD155tg 마우스에서 증가하는 용량의 바이러스로 뇌내 주사를 통해 시험하였다. 특히, 4 내지 6마리의 6-8 주령의 CD155tg 마우스 그룹에게 다양한 용량으로 접종하고, 그 다음에 회색질척수염의 발병을 관찰하였다. 대조군 마우스 그룹에게 PV(M)-wt로 병렬 실험에서 주사하였다. 주사 용량은 뇌로 삽입되는 비리온의 정량을 정규화하기 위해 PFU 보다는 입자에 기반한다. 상기 마우스를 회색질척수염의 특징적 증상인 이완성 마비의 발병에 대해 매일 모니터링하였다. 바이러스 독성을 정량화하는데 사용되는 표준 값은 LD50 (Lethal Dose 50)이다. 상기 값은 동물의 50%는 살아 있고 50%는 죽는 수준으로 바이러스를 접종하는 용량을 나타낸다. 상기 합성 바이러스 PV-MinXY 및 PV-MinZ는 PV(M)-wt보다 더 높은 LD50을 가지므로, 입자에 기반하여 1,500-배 또는 PFU에 기반하여 20-배이며, 병원성이 더 낮았다 (표 3).
뇌내 (i.c.) 주사를 통한 야생형 폴리오바이러스 , 및 변형된 바이러스에 대해 계산된 LD 50 .
바이러스 LD50 (i.c.)
(입자)
PV(M)-wt 104.0
PV-MinY 105.0
PV-MinXY 107.1
PV-MinZ 107.3
실시예 7
키메라 폴리오바이러스에 의한 별아교세포종의 인 비보 종양용해
별아교세포종 세포주 HTB-14 (ATCC로부터 입수)를 사용하여, 106개의 세포를 Taconic Farms NCR 누드 마우스에게 피하 이식을 통해 악성 신경아교종을 수립하였다. 종양이 0.2cm3의 크기에 도달한 후에 0, 3 및 5일차에 상기 마우스를 100μL의 부피로 2 x 107 PFU의 PV-MinY, WT PVM 또는 희석제로 치료하거나 또는 모의 치료하였다. PV-MinY 및 PVM은 누드 마우스에서 종양 성장을 예방하는데 효과적이었다 (도 5 및 6).
U-87 MG 세포로도 알려진 HTB-14 세포는 차아이배수체 인간 암 세포주인 악성 교모세포종 세포이다.
실시예 8
폐 암종 세포의 종양용해
본 발명자는 A549 세포를 PV-MinY에 의해 1.0의 MOI로 감염시킴으로써 본 발명의 종양용해 후보체 PV-MinY에 대한 모델로서 폐 암종 세포주 A549 (ATCC CCL-185)를 사용하였다. A549 세포를 DMEM+10% FBS에서 성장시켰다. 세포를 1e+6 PFU PV-MinY로 90% 융합에서 감염시키고, 실온에서 1시간 진탕한 후에, 접종물을 제거하고, DMEM+2% FBS로 대체하였다. 감염된 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 도 7에 의해 명백한 바와 같이, 감염되지 않은 폐 암종 세포와 비교하여, PV-MinY는 감염 후에 36시간까지 대부분의 세포를, 72시간까지 모든 세포를 종양용해할 수 있었다.
A549 세포는 차아삼배수체 (세포의 40%에서 64, 65 또는 66개의 크로모좀 수) 인간 폐 상피 암종 세포주이다 (Giard et al., 1973). 크로모좀 N2 및 N6은 세포당 단일 카피를 가지며; N12 및 N17은 통상적으로 4개의 카피를 가졌다. A549 세포는 면역퍼옥시다제 염색에 의해 케라틴에 대해 양성이다. A549는 효소인 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PD)의 이소효소 G6PD-B를 발현한다.
실시예 9
조직 배양물에서 E, NS3 및 E-NS3 코돈쌍 -편향 감소된 지카 바이러스의 제작 및 특성화
지카 바이러스 균주 PRVABC59 및 MR766의 약독화를 달성하기 위해, prM/E 및 NS3 유전자의 코돈쌍 편향은 바이러스 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 컴퓨터 알고리즘 및 화학 합성에 따라 바이러스 유전자에서 감소되었다 (저표현된 코돈쌍을 도입함) (도 8).
실시예 10
SAVE 플랫폼 유연성을 활용하여 2세대 지카 바이러스 백신 후보체 형성
약독화 및 면역원성을 미세-조정하기 위해, SAVE 플랫폼을 사용하여 2세대 지카 바이러스 백신 후보체를 제작하였다 (도 9). E-Min 디자인에 기반하여 (도 8), 신규한 백신 후보체는 탈최적화 서열을 2014개의 염기-쌍 (E-Min)에서 997개의 염기-쌍 (E-W/Min) 또는 664개의 염기-쌍 (E-W/W/Min)까지 낮춘 더 적은 비율로 함유하고, 나머지는 야생형 서열로 복귀되었다. 3개의 후보체 MR766 E-Min (서열번호: 2), E-W/Min (서열번호: 3), 및 E-W/W/Min (서열번호: 4)의 서열이 본원에 비-제한적인 예로서 제공된다.
실시예 11
인간 뉴런 세포주에서 감소된 코돈쌍 편향 변이체의 신경약독화
MR766과 같은 더 오래된 ZIKV 균주와는 달리, 현재의 ZIKV 균주는 소두증 (microcephaly) 및 길랭-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome)과 같은 신경계 질환을 유발한다. 따라서, 본 발명자의 FDA와의 사전-IND 미팅에 기초하여, 임의의 생-약독화된 지카 백신이 인간 뉴런 세포에서 인 비트로 신경-약독화 및 비인간 영장류에서 인 비보 신경-약독화를 나타낼 필요가 있다 (제안된 II상 연구). 본 발명의 선두 후보체의 전임상 개발을 시작하기 위해, 본 발명자는 2개의 잘-특성화된 인간 뉴런 세포주 HTB-14 (U-87로도 알려져 있음) 및 HTB-15 (U-118로도 알려져 있음)를 감염시켰고, 이는 발병 중인 인간 뇌에서 지카 바이러스 세포 향성을 특성화하고, 잠재적인 항-지카 저해제를 시험하기 위해 이전에 사용되었다. 본 발명자는 인간 뉴런 세포주 HTB-14 및 HTB-15를 감염시키고, 4일 후에 피크 역가를 정량화하였다. 본 발명자는 인간 HTB-14 세포에서, MR766 E-Min이 거의 4 Log10s 약독화되고, 인간 HTB-15 세포에서, 성장은 2개의 독립적인 실험에서 검출 가능하지 않거나, 또는 하나의 실험에서 검출 한계 (100 PFU/ml)에 있고 거의 4 Log10 수준의 인 비트로 신경 약독화를 나타내었다 (데이터가 개시되지 않음).
실시예 12
PRVABC59 또는 MR766 유래 E-Min 감염된 세포에서 단백질 수준이 감소됨 .
ZIKV 감염된 세포로부터 채취된 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 상이한 PRVABC59 및 MR766 변이체들 간의 단백질 발현 수준을 비교하였다. 바이러스 감염을 위해, Vero 세포를 37℃에서 OptiPRO 배지에서 90% 융합될 때까지 성장시켰다. 합성 야생형 및 탈최적화 (E-Min) MR766 및 PRVABC59를 포함하는 지카 바이러스를 0.5의 MOI로 희석시키고, 세포에 부가하였다. 상기 세포를 R.T.에서 15분 동안 진탕한 다음에, 33℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 접종물을 제거하고, 감염된 세포를 33℃에서 24시간 동안 OptiPRO 배지에서 배양을 지속하였다.
24시간 인큐베이션 후에, 전체 세포 용해물 제조를 위해, 세포를 차가운 PBS로 간단히 린스한 다음에, RIPA 버퍼 (150mM NaCl, 5mM b-메르캅토에탄올, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 50mM 트리스-HCl, pH8.0)로 얼음 상에서 용해시켰다. 전체 세포 용해물을 수집하고, b-메르캅토에탄올을 가진 6x Laemmli 버퍼와 직접 혼합하고, 끓이고, 저장을 위해 분취하였다.
웨스턴 블롯을 위해, 각 샘플로부터 동일한 부피의 WCL을 SDS-PAGE에 의해 분획화하고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 R.T.에서 1시간 동안 PBS 중 5% 송아지 혈청 (BCS)으로 차단한 다음에, 4℃에서 밤새 뎅기 타입-2 외피(E) 단백질 4G2에 대한 마우스 모노클로날 항체와 인큐베이션하고, PBS-Tween으로 3회 세척하고, 그 후에 R.T.에서 1시간 동안 5% BCS 중 HRP 접합된 항-마우스 2차 항체와 인큐베이션하였다. 상기 멤브레인을 3회 세척하고, 단백질을 Pierce 1-단계 Ultra TMB 블로팅 용액 (Blotting solution)을 사용하여 시각화하였다.
외피 당단백질의 수준은 야생형과 비교하여 ZIKV의 PRVABC59 및 MR766 균주의 E-Min 변이체에서 감소된 것으로 밝혀졌다 (도 10).
실시예 13
AG129 마우스에서 약독화
상기에 기재된 바와 같이, 상기 AG129 성체 마우스 모델은 플라비바이러스 백신 및 치료제의 연구를 위해 허용되었다. 본 발명자는 AG129 마우스를 사용하여 하기를 시험하였다: 1) 102의 용량으로 각각 합성으로 유래된 야생형 바이러스 MR766 및 PR15 바이러스 (포지티브 대조군); 2) 2개 용량 (104 및 102 PFU)의 백신 후보체 PR15 E-Min 또는 MR766 E-Min 및 NS3-Min; 및 3) 104의 단일 용량의 백신 후보체 PR15-NS3/E-Min. 상기 연구에서, 본 발명자는 약독화, 효능 및 면역원성을 검사하였다. 5마리의 동물 그룹으로 동물을 무작위로 배정하였다. 그룹들을 다양하게 약독화된 합성 야생형 바이러스로 감염시켰다. 마우스를 백신화하기 위해 0일차 및 28일차에 2회의 백신화를 수행하였다. 약독화를 측정하기 위해, 백신화 후에 생존 및 체중을 측정하였다 (도 11).
생존, 체중 및 임상 증후 데이터는 실험 과정 동안 매일 수집하였다. SAVE 탈최적화 PR15 및 MR766 균주는 합성 야생형 바이러스와 비교하여 고도로 약독화되었고, 여기서 104 용량의 MR766 NS3-Min는 마우스의 40%에서 사망을 유발하였다. 따라서, 모든 다른 균주는 적어도 500-배 약독화되었다. 102 PFU의 합성 야생형 PR15 또는 MR766 ZIKV로 감염시킨 마우스는 "천연" 야생형 ZIKV에서 관찰된 패턴과 유사하게, 사망 직전에 급격한 체중 손실을 경험하였다. 104 PFU의 후보체 MR766 E-Min으로 감염시킨 마우스는 유의한 체중 손실 또는 사망률을 경험하지 않았다 (도 12).
MR766 E-Min 및 NS3-Min뿐만 아니라 PRVABC59 E-Min 및 E-Min/NS3-Min　변이체의 성장 표현형 및 발병기전을 동물 모델에서 검사하였다. 5마리의 AG129 마우스 그룹에게 102 또는 104 PFU의 용량으로 각 바이러스를 피하로 수여하고, 상기 동물의 체중 및 생존율을 주사후 (p.i.) 28일 동안 지속적으로 모니터링하였다. 이환률 및 사망률 (체중 손실, 감소된 활동, 사망)을 모니터링하였다. 야생형 바이러스 및 백신 후보체의 LD50 (Lethal Dose 50)을 Reed 및 Muench의 방법에 의해 계산하였다 (Reed, L. J.; Muench, H., 1938, The American Journal of Hygiene 27: 493-497). 놀랍게도, PRVABC59 및 MR766에 대한 E-Min 변이체 및 PRVABC59 E-Min/NS3-Min 바이러스는 104　이하의 PFU 용량 후에 사망률 없이 최소 체중 손실로 명백하게 질병을 유발하지 않았다. 그러므로, E-Min　변이체의 이론적 LD50은 3.16Х104 PFU 이상으로 계산되었고, 이는 wt PRVABC59 또는 MR766의 것보다 적어도 1,000배 초과하였다 (표 5). 상기 MR766 NS3-Min 바이러스의 LD50은 ≤42인 것으로 계산되었다.
약독화된 바이러스의 LD 50 및 PD 50
바이러스 LD50 PD50
WT MR766 <3.16x101 NA
MR766 E-Min >3.16Х104 6.81x101
MR766 NS3-Min <4.20Х101 <6.81x103
WT PRVABC59 <3.16x101 NA
PRVABC59 E-Min 3.16Х104 1.47x102
PRVABC59 E/NS3-Min 3.16Х104 <6.81x103
실시예 14
AG129 마우스에서 면역원성
백신 후보체는 동물당 102.3 세포-배양물 감염 용량 (CCID50)과 동일한 치사량의 wt 바이러스로 챌린지로부터 저용량으로 장기간 방어를 제공할 수 있어야 한다. E-Min 변이체는 세포 배양물 및 AG129 마우스에서 고도로 약독화되었지만, 68 PFU (MR766 E-Min) 또는 147 PFU (PRVABC59 E-Min)로 챌린지 후에 AG129 마우스에서 사망률을 방지하는데 성공적이었다. 본 발명자는 약독화 연구로부터 각 생존 마우스에서 백신 효능을 시험하였다. 먼저, 28일차에 표재 관자 정맥 (superficial temporal vein)을 통해 생존 마우스로부터 혈청을 수집하고, 동물을 28일차에 두번째로 동일한 백신 용량으로 부스트하였다. 또한 49일차에 (부스트 후 21일) 혈청을 수집하였다. 이들 동물로부터 중화 항체는 백신화 후 14, 28 및 49일차에 수집된 혈청의 PRNT50 (50% plaque reduction neutralization titer) 분석을 사용하여 정량화하였다. 시험 혈청의 1/10 희석에서 시작하여 1/2의 연속 희석이 수행되었다. 그 다음에 희석물은 102.4 PFU의 ZIKV 균주 Puerto Rico 2015 PRVABC-59 (PR15)와 1:1로 혼합하였다. 그 다음에 바이러스-혈청 혼합물을 Vero 76 세포와 함께 12-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 부가하였다. 바이러스 대조군으로부터 평균 플라크의 ≥50% 감소를 초래한 시험 혈청의 희석의 역수를 PRNT50 값으로 기록하였다. 28일차 및 단회 백신화 후에, MR766 E-Min는 모든 동물에서 현재 PR15 균주에 대한 강력한 항체 반응을 생성할 수 있었다 (도 12). 유사하게, PR15 E-Min는 또한 단회 백신화 후에 강력한 항체 반응을 제공하였다.
실시예 15
비-인간 영장류에서 효능
시노몰구스 마카크 (CM)는 황열병 (Yellow Fever), 뎅기열, 웨스트 나일병 및 ZIKV를 포함하는 플라비바이러스 감염을 평가하기 위한 모델로서 통상적으로 사용된다. ZIKV 단리물은 또한 자연적으로 감염된 시노몰구스 마카크로부터 회수되었다. 이전 연구는 CM의 실험적 ZIKV 감염이 임상적 질환을 발생시킬 가능성이 없지만, ZIKV는 복제되고 혈액, 소변 및 다른 조직에서 발견될 수 있다는 것을 시사하였다. 서던 연구 (Southern Research)에 의해 수행된 비-GLP 연구에서, 본 발명자는 나이브 (naive) CM에서 살아 있는 약독화된 지카 바이러스 (ZIKV) 백신 후보체의 효능을 평가하였다. 총 15마리 (10마리 수컷 및 5마리 암컷) ZIKV 혈청음성 CM을 5개의 치료 그룹으로 무작위 배정하였다. 그룹 1-4의 CM을 500 μL 부피의 107 또는 105 PFU의 용량으로 약독화된 바이러스 (MR766 E-W/W/Min)를 피하 (SC) 주사에 의해 프라임-부스트 요법 (일 0 및 28)을 사용하여 백신화하였다. 모의 대조 그룹으로 배정된 CM (그룹 5)에게 SC 주사를 통해 PBS를 제공하였다. 백신 유도된 항-ZIKV 중화 항체 (Nab)의 존재는 FRNT (focus reduction neutralization test)에 의해 14, 21, 28, 50 및 61일에 평가하였다. FRNT 값은 단일 용량 후 NIH 불활성화 백신과 비교하여 MR766 E-W/W/Min (도 13) 백신화된 마카크에 대해 2-4배 더 높았다. W-W-E-Min 백신화된 마카크의 FRNT 값은 28일에 부스트 후에 증가하지 않았고, 이는 상기 백신이 부스팅 바이러스에 의한 추가적 감염을 예방하는 살균 면역을 유도했음을 나타내었다. E-W/W/Min에 의해 백신화된 모든 동물은 백신화 후 14일까지 혈청전환되었다. 상기 데이터는 E-W/W/Min의 단일의 상대적으로 적은 용량으로 높은 수준을 유발하는데 충분할 수 있음을 나타낸다 (≥1,028 FRNT50).
실시예 16
면역-적격 마우스에서 종양용해 효능
DBA/2 마우스 (4-6 주령)를 MR766 E-W/W/Min, MR766 E-W/Min (1x107 PFU의 용량)으로 먼저 백신화하거나, 또는 OptiPro 배지를 모의 주사하여 50μL 부피로 등쪽에서 경추로 피하로 전달하였다. 마우스를 0일, 14일, 26일, 71일 및 85일차에 5회 백신화하였다 (도 14). PRNT50 (plaque-reduction neutralization test 50%)에 의해 지카 바이러스에 대한 중화 항체의 발생을 확인하기 위해 이들 일자에 혈청 샘플을 수집하였다. CCL53.1 상피 흑색종 세포 (DBA 마우스 배경)를 97일, 최종 백신화 후 11일차에 백신화되거나 또는 모의-백신화된 마우스에 이식하였다. 이식은 1x106 CCL53.1 세포를 모든 동물의 우측 하부 옆구리에 피하로 주사함으로써 수행하였다. 일부는 또한 2.5 x 105 CCL53.1 세포를 좌측 하부 옆구리에 피하로 주사하였다 (도 20).
이식된 마우스를 103일, 종양 이식 후 10일차에 우측 옆구리 종양에 직접 주사에 의해 1 x 107 PFU MR766 E-W/W/Min, MR766 WT로 치료하거나, 또는 모의 치료하였다 (도 15). 치료되지 않은 종양의 면역-매개된 종양용해를 관찰하기 위해 우측 옆구리 종양에서만 치료를 수행하였다. 동일한 치료를 105일 (종양 이식 후 12일차) 및 107일 (종양 이식 후 14일차)에 2회 더 반복하였다. 치료 후 10일 (일 107-117) 동안 매일, 및 치료 후 20일 (118-127)까지 격일로 마우스의 체중을 모니터링하고, 종양 크기를 측정하였다. MR766 E-W/W/Min 치료에 의한 종양 크기의 유의한 감소를 관찰하였다 (도 15). 모의 면역화:모의 치료된 DBA/2 마우스 종양은 10일 동안 꾸준히 증가하였다 (도 16-19). MR766 WT 및 MR766 E-W/W/Min 치료는 MR766 E-W/W/Min으로 이전에 면역화된 마우스에서 평균 종양 부피 감소에 효과적이었다 (도 18). MR766 WT 및 MR766 E-W/W/Min 치료된 종양 모두는 크기가 감소되었지만, MR766 E-W/W/Min 치료는 백신화된 마우스에서 MR766 WT 치료보다 예상치 않게 우수했다 (도 17). 모의 백신화된 마우스에서 MR766 WT 치료된 종양은 개선되지 않았고 꾸준히 증가하였다. E-W/W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서, MR766 WT 치료는 10일까지 종양 크기의 급격한 감소에 효과적이었다 (도 18). 모의 백신화된 마우스에서 종양의 MR766 E-W/W/Min 치료는 성공적이지 않았지만, MR766 E-W/W/Min 및 조합된 MR766 E-W/W/Min 플러스 E-W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서, 종양 크기는 MR766 E-W/W/Min 치료 후에 제거되었다 (도 19). 이들 실험은 사전-백신화가 지카 바이러스에 의한 흑색종의 성공적인 종양용해 치료에서 필수적인 역할을 하며, 바이러스 복제로부터 종양이 파괴될 가능성이 없음을 나타내었다.
모의-백신화되고, 모의 치료된 좌측 옆구리 종양에서, 치료 후 10일 동안 크기가 꾸준히 증가하였다. 좌측 옆구리 종양 크기는 모의 백신화된, MR766 E-W/W/Min 치료된 마우스에서 유지되었지만, MR766 E-W/W/Min 백신화되고, E-W/W/Min 치료된 마우스에서 좌측 옆구리 종양 크기는 몇 배 증가한 다음에 다시 감소하였다. MR766 E-W/W/Min 치료된 그룹 모두에서 좌측 옆구리 종양은 one-way ANOVA에 의해 모의 백신화되고, 모의 치료된 동물에서 유의하게 더 작았다 (p<0.001; 도 20). 이러한 실험은 MR766 E-W/W/Min에 의한 종양용해 치료가 소형 동물 모델에서 치료 부위뿐만 아니라 신체 전체에서 종양 성장을 성공적으로 제어할 수 있다는 강력한 증거를 제공하였다.
실시예 17
Balb /C 마우스에서 이식된 공통 유전자 ( Syngeneic ) 4t1 세포를 사용하여 삼중-음성 유방암의 Codavax-H1N1 치료
CodaVax-H1N1은 105의 용량으로 미세 폐 병변의 부재에 의해 측정되는 바와 같이 돼지 (swine)에서 야생형 인플루엔자 A 바이러스 A/CA/04/2009와 비교하여 유의하게 약독화되고 (2), 임상 I상 시험 동안 안전했다. 본 연구에서, 본 발명자는 CodaVax-H1N1을 종양용해 제제로서 사용할 가능성을 시험하고자 하였다. 상기 파일럿 실험에서, 본 발명자는 MDCK 세포에서 101회 및 Vero 세포에서 6회 계대 배양한 CodaVax-H1N1 사용을 선택하였다.
본 연구의 목적을 위해, Balb/C 마우스 (n=8)에 105 4T1 유선 종양 세포 (ATCC CRL-2539)를 초기에 이식하고, 이식 8일 후 (days post-implantation: DPI)에, 107 PFU의 CodaVax-H1N1 M101/V6을 함유하는 100 μl를 주사하여 치료를 시작하였다. 10, 12, 14, 16, 26 및 28 DPI에 상기 종양을 다시 주사하였다. 모의 대조군 마우스 (n=5)를 백신 희석제 (0.2% BSA MEM)로 치료하였다. 사망률의 경우, ≥20%의 체중 손실 또는 ＞ 400mm3의 종양 성장의 초기 인간 엔드-포인트를 사용하였다. 샘플 크기는 이전 실험에서 관찰된 종양 크기의 표준 편차에 기반하며, 충분한 통계적 파워 (0.80)를 달성하기 위해 GraphPad Statmate 2 사용을 선택하였다.
마우스 이식 프로토콜: 동물 모델: 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 마우스 균주: Balb/C (Taconic); 연령: 8-9주령 (암컷); 세포 배지: RPMI-1640; 세포 농도: 1 x 105/0.1 mL (4T1).
처음에, 4T1 세포를 RPMI-1640에서 1 x 105/0.1 mL의 농도로 재현탁하였다. Balb/C 마우스 우측 옆구리를 면도하고, 0.1 ml를 피하로 주사하고, 종양 크기가 ~40mm3이 될 때까지 관찰하였다 (일 8).
종양 치료 프로토콜: 동물 모델: 무스 무스쿨루스; 마우스 균주: Balb/C (Taconic); 연령: 8-9 주령 (암컷); 바이러스 배지: 0.2% BSA MEM; 바이러스 농도:1 x 107/0.1 mL (CodaVax-H1N1 M101/V6)
이식 후 8, 10, 12, 14, 16, 26 및 28일차에 대조군으로서 바이러스 배지 또는 CodaVax-H1N1 M101/V6을 함유하는 0.1ml를 직접 주사하여 종양을 치료하였다.
모의-주사되거나 또는 CodaVax-H1N1 M101/V6으로 치료된 Balb/C 마우스에서 유의한 체중 손실이 검출되지 않았으며, 임의의 접종된 마우스는 인플루엔자 감염으로 인한 안락사에 대해 초기 시점을 충족하지 못했다 (도 25A-25C).
21 DPI까지, 모든 모의-주사된 대조군 마우스는 ≥400mm3의 종양 부피로 인해 초기 인간 엔드포인트를 충족하였다 (도 25A-25C). 대조적으로, CodaVax-H1N1 M101/V6 치료된 마우스에서 종양 성장은 지연되고 35-일 생존율이 증가하였다. 열의 멀티 t-테스트 수단 (Holm-Sidak 방법)을 사용하여, 유의하게 감소된 종양 크기가 이식 후 11일 (p=0.0066), 13일 (p=0.0097), 15일 (p=0.0048), 16일 (p=0004), 17일 (p=0.0011), 19일 (p=0.0004) 및 21일 (p=0.0099)에 관찰되었다. log-rank Mantel-Cox (p=0.0052) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 테스트 (p=0.0138)를 사용하는 생존율 곡선 분석으로 35 DPI 이후에 치료된 마우스에서 유의하게 증가된 생존율을 나타내었다.
TNBC는 4T1 세포 이식을 사용하여 Balb/C 마우스에서 잘 모델링될 수 있으며, 본 연구에서 CodaVax-H1N1 M101/V6에 의한 치료에 감수성이 있는 것으로 나타났다. 종양 크기는 5/8 마우스에 대해 정적이거나 또는 감소되었고, 치료는 2마리의 마우스에서 효과적이지 않았지만, 1마리의 마우스에서 보이는 종양이 완전히 제거되었다. 이 데이터는 유망하며, 투여 용량 또는 빈도의 변경이 보다 성공적인 것으로 입증될 수 있다. 중요하게도, 인플루엔자 A 바이러스에 의한 종양용해 활성을 프라임하기 위한 사전 면역화는 필요하지 않았다.
실시예 18
CCL53 .1 세포가 이식된 DBA/2 마우스의 CodaVax - H1N1의 연속 종양내 주사에 의한 치료
CodaVax-H1N1은 105의 용량으로 미세 폐 병변의 부재에 의해 측정된 바와 같이 돼지에서 야생형 인플루엔자 A 바이러스 A/CA/04/2009와 비교하여 유의하게 약독화되었고 (1), 임상 I상 시험 중에 안전했다. 본 연구에서 본 발명자는 CodaVax-H1N1을 종양용해 제제로서 사용할 가능성을 시험하고자 하였다. 상기 파일롯 실험에서, 본 발명자는 마스터 시드 스톡 (master seed stock)인 CodaVax-H1N1 M101/V6으로부터 계대 배양된 CodaVax-H1N1 사용을 선택하였다.
본 연구의 목적을 위해, DBA/2 마우스 (n=7, 8)에게 초기에 105 Clone M3, Cloudman S-91 흑색종 종양 세포 (ATCC CCL-53.1)를 이식하고, 이식 8일 후에 (DPI) 치료는 모의 희석제, 또는 8 x 105 PFU의 CodaVax-H1N1을 함유하는 100 μl를 주사하여 시작하였다 (도 26). 상기 마우스는 또한 이식 후 3, 7 및 10일차에 모의 희석제 또는 0.1 mg 항 마우스 PD-1 항체로 i.p.로 치료하였다. 10, 12, 14 및 16 DPI에 상기 종양을 다시 주사하였다. 모의 대조군 마우스 (n=5)를 백신 희석제 (0.2% BSA MEM)로 치료하였다. 사망률의 경우, ≥20%의 체중 손실 또는 ＞ 400mm3의 종양 성장의 초기 인간 엔드-포인트를 사용하였다. 샘플 크기는 이전 실험에서 관찰된 종양 크기의 표준 편차에 기반하며, 충분한 통계적 파워 (0.80)를 달성하기 위해 GraphPad Statmate 2 사용을 선택하였다.
실험 절차:
마우스 이식 프로토콜: 동물 모델: 무스 무스쿨루스, 마우스 균주: DBA/2 (Taconic); 연령: 8-9주령 (암컷); 세포 배지: F-12K 배지; 세포 농도: 1 x 105/0.1 mL (CCL53.1).
처음에, CCL53.1 세포를 F12-K 배지 중 1 x 105/0.1 mL의 농도로 재현탁하였다. DBA/2 마우스 우측 옆구리를 면도하고, 0.1 ml를 피하로 주사하고, 종양 크기가 ~100mm3이 될 때까지 관찰하였다 (일 8).
종양 치료 프로토콜: 동물 모델: 무스 무스쿨루스; 마우스 균주: DBA/2 (Taconic); 연령: 8-9 주령 (암컷); 바이러스 배지: 0.2% BSA MEM; 바이러스 농도: 8 x 105/0.1 mL (CodaVax-H1N1 P7)
이식 후 8, 10, 12, 14 및 16일차에 대조군으로서 바이러스 배지 또는 CodaVax-H1N1을 함유하는 0.1ml를 직접 주사하여 종양을 치료하였다.
모의-주사되거나 또는 CodaVax-H1N1로 치료된 DBA/2 마우스에서 유의한 체중 손실이 검출되지 않았고, 임의의 접종된 마우스는 인플루엔자 감염으로 인한 안락사에 대해 초기 시점을 충족하지 못했다 (도 27). 흥미롭게도, 항 PD-1 항체를 단독으로 주사한 마우스는 PD-1/CodaVax-H1N1 치료 그룹을 포함하는 다른 그룹 만큼 체중이 증가하지 않았다.
(일 3 및 7에) 항 PD-1 항체로 치료된 마우스 (n=14) 또는 항체 희석제로 모의 치료된 마우스(n=15)에 대해 8 DPI에서 종양 크기 데이터를 수집하는 경우, 종양 크기가 치료 그룹에서 약간이지만 유의하게 감소된 것을 발견하였다 (도 28; p=0.0466; Student's t-test).
14 DPI까지, 모든 모의-주사된 대조군 마우스는 ≥400mm3의 종양 부피로 인해 초기 인간 엔드포인트를 충족하였다 (도 29). 대조적으로, 종양 성장은 CodaVax-H1N1 치료된 마우스, PD-1 항체 치료된 마우스에서 더 지연되고 34-일 생존율이 증가하였고, 병용 요법에 의해 생존율이 유의하게 향상되었다 (p=0.0008, Gehan-Breslow-Wilcoxon test). 열의 멀티 t-테스트 수단 (Holm-Sidak 방법)을 사용하여, 이식 후 11일 (p=0.0066), 13일 (p=0.0097), 15일 (p=0.0048), 16일 (p=0004), 17일 (p=0.0011), 19일 (p=0.0004) 및 21일 (p=0.0099)에서 유의하게 감소된 종양 크기를 관찰하였다. log-rank Mantel-Cox (p=0.1218) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 테스트 (p=0.1137)를 사용한 생존율 곡선 분석은 PD-1 항체 단독 또는 CodaVax-H1N1과 조합하여 치료한 마우스 간에 생존율이 거의 유의하게 증가하였음을 나타내었다. 생존율 곡선은 PD-1 항체 치료된 마우스와 CodaVax-H1N1 치료된 마우스 간에 매우 유사하였다 (p>0.9999, Gehan-Breslow-Wilcoxon test).
흑색종은 CCL53.1 세포 이식을 사용하여 DBA/2 마우스에서 잘 모델링될 수 있으며 (2), 본 연구에서 CodaVax-H1N1 또는 PD-1 항체 단독에 의한 치료에 대해 다소 감수성이 있는 것으로 나타났다. 이 데이터는 유망하며, 투여 용량 및 빈도의 변경으로 보다 성공적인 것으로 입증될 수 있다. 중요하게도, 인플루엔자 A 바이러스에 의한 종양용해 활성을 프라이밍하기 위한 사전 면역화를 필요로 하지 않으며, 이는 PD-1 요법과 조합하여 더욱 효과적이었다.
실시예 19
변형된 바이러스는 IL-1B를 자극함
도 30에서 볼 수 있는 바와 같이, 배양된 인간 단핵구 (THP-1)는 배양 배지에 100nM PMA를 부가하고, 37℃, 5% CO2로 3일 동안 인큐베이션함으로써 마크로파지로 분화되도록 유도되었다. 350,000 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트의 개별 웰에 부착시킨 후에, 상기 배지를 신선하고, 따뜻한 배양 배지 (10% FBS RPMI-1640)로 교체하고, 세포를 250 μl 부피의 5.0의 MOI (1.75 x 106 FFU)로 감염시켰다. 상기 세포를 실온에서 30분 동안 진탕한 다음에, 추가 250 μl의 배양 배지를 부가하고, 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 상기 바이러스 접종물을 제거하고, 상기 배지를 따뜻한 배양 배지로 교체하였다. 감염 후 1 및 3일에, 상등액 샘플을 수집하고, -80℃에서 동결하고, 정량화 키트 (Thermo Fisher Catalog # BMS224-2)를 사용하여 인간 IL-1β ELISA를 시험하였다. IL-1β는 활성화된 마크로파지에 의해 생성되고 염증 반응의 중요한 매개인자인 시토킨의 인터루킨 1 패밀리의 멤버로서 선택되었다. IL-1β 생성은 레티노산 유도 유전자 1 (RIG-I)에 의해 바이러스 RNA를 인식하고, 후속하여 NFκB-IRF3 신호전달을 유도한 후에 활성화된다. RIG-I의 활성화는 또한 STING 발현을 유도하고 포지티브 피드백 기전을 통해 지속적인 염증 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
실시예 20
면역 세포의 종양으로의 모집
도 31에서 볼 수 있는 바와 같이, 면역 세포 활성화는 0, 14, 28 및 42일차에 107 FFU MR766 E-W/Min으로 백신화되거나 또는 바이러스 희석제로 모의-백신화된 이식 및 치료된 DBA/2 마우스에서 분석되었다. 백신화된 마우스 및 모의-백신화된 마우스에게 63일차에 1 x 106 CCL53.1 흑색종 세포를 피하 경로로 전달하여 이식하고, 치료는 73일차에 시작하여 107 PFU MR766 E-W/W/Min 또는 바이러스 희석제를 73, 75 및 77일차에 종양내로 전달하였다. 종양을 수집하고, 면역 마커를 계수하고 CD4+, CD8+, CD45+ 및 FoxP+ 세포 침습을 측정하기 위한 면역조직화학 및 염색을 위해 치료 후 1 및 7일차 (일 74 및 80)에 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 치료 후 7일차에 이식된 CCL53.1 종양에서 CD8+ 세포 침습은 면역조직화학에 의해 시각화된 바와 같이 사전 MR766 E-W/Min 백신화에 의해 향상되었다. 치료 후 1일차에 이식된 CCL53.1 종양에서 CD45+ 세포 침습은 면역조직화학에 의해 시각화된 바와 같이 사전 MR766 E-W/Min 백신화된 DBA/2 마우스에서 크게 증가하였다. FoxP3+ 세포는 치료된 종양에서 감소되었다.
본 발명의 다양한 구체예는 상세한 설명에서 상술되었다. 이들 설명은 상기 구체예를 직접 기재하지만, 당업자는 본원에 개시되고 기재된 특정 구체예에 대한 수정 및/또는 변형을 생각할 수 있는 것으로 이해된다. 본 설명의 범위 내에 포함되는 이러한 수정 또는 변형은 또한 본원에 포함되는 것이다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명자의 의도는 본 명세서 및 청구 범위의 단어 및 문구가 적용 가능한 기술 분야(들)의 당업자에게 통상적이고 익숙한 의미로 제공되는 것이다.
출원 시에 출원인에게 알려진 발명의 다양한 구체예에 대한 전술한 설명이 제시되었으며, 예시 및 설명의 목적으로 의도된다. 본 설명은 개시된 정확한 형태로 본 발명을 총망라하거나 제한하려는 것이 아니며, 상기 교시에 비추어 많은 수정 및 변형이 가능하다. 기재된 구체예는 본 발명의 원리 및 그 실제 적용을 설명하고, 당업자가 본 발명을 다양한 구체예에서 그리고 고려된 특정 용도에 적합한 다양한 변형으로 이용할 수 있게 하는 역할을 한다. 그러므로, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정 구체예로 제한되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 구체예가 개시되고 기재되었지만, 본원의 교시에 기반하여, 당업자에게는 변경 및 수정이 본 발명 및 더 넓은 양상에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있으며, 따라서 첨부된 청구 범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 있는 모든 이러한 변경 및 수정을 그 범위 내에 포함한다는 것이 명백할 것이다. 일반적으로 본원에서 사용되는 용어는 "개방 (open)" 용어로 의도된 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다 (예: 용어 "포함하는 (including)"은 "포함하지만, 이에 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는 (having)"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다 (includes)"는 "포함하지만, 이에 한정되지 않는다"로 해석되어야 한다).
본원에서 사용되는 용어 "포함하는 (comprising)" 또는 "포함하다 (comprises)"는 조성물, 방법 및 이의 개별 성분(들)을 참조하여 일 구체예에는 유용하지만, 유용하거나 또는 유용하지 않은 명시되지 않은 요소의 포함에 대해 개방적으로 사용된다. 일반적으로 본원에서 사용되는 용어는 "개방" 용어로 의도된 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다 (예: 용어 "포함하는"은 "포함하지만, 이에 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다"는 "포함하지만, 이에 한정되지 않는다"로 해석되어야 한다). 포함하는, 함유하는 또는 갖는과 같은 용어의 동의어로서 개방형 용어인 "포함하는 (comprising)"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본원에서 사용되지만, 본 발명 또는 이의 구체예는 "구성된 (consisting of)" 또는 "필수적으로 구성된 (consisting essentially of)"과 같은 대체 용어를 사용하여 대안으로서 기재될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CODAGENIX INC. COLEMAN, John Robert MUELLER, Steffen YANG, Chen WANG, Ying STAUFT, Charles <120> RECOMBINANT VIRUS WITH CODON-PAIR DEOPTIMIZED REGION AND USES THEREOF FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> 064955-000002WO00 <150> 62/609,945 <151> 2017-12-22 <150> 62/640,362 <151> 2018-03-08 <150> 62/677,132 <151> 2018-05-28 <150> 62/640,355 <151> 2018-03-08 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 ttaaaacagc tctggggttg tacccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60 attgcggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccttccc gtaacttaga cgcacaaaac 120 caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga acaagcactt ctgtttcccc 180 ggtgatgtcg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg gatccgttat ccgcttatgt 240 acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg ttgcgctcag cactcaaccc 300 cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac cggtgacggt ggtccaggct 360 gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta gttgtgaaca aggtgtgaag 420 agcctattga gctacataag aatcctccgg 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gtgctgccca 7320 gaaaaggaca gcagctggca tcatgaagaa tcccgttgtg gatggaatag tggtaactga 7380 cattgacaca atgacaatag acccccaggt ggagaagaag atgggacaag tgttactcat 7440 agcagtagcc atctccagtg ctgtgctgct gcggaccgcc tggggatggg gggaggctgg 7500 agctctgatc acagcagcga cctccacctt gtgggaaggc tctccaaaca aatactggaa 7560 ctcctctaca gccacctcac tgtgcaacat cttcagagga agctatctgg caggagcttc 7620 ccttatctat acagtgacga gaaacgctgg cctggttaag agacgtggag gtgggacggg 7680 agagactctg ggagagaagt ggaaagctcg tctgaatcag atgtcggccc tggagttcta 7740 ctcttataaa aagtcaggta tcactgaagt gtgtagagag gaggctcgcc gtgccctcaa 7800 ggatggagtg gccacaggag gacatgccgt atcccgggga agtgcaaagc tcagatggtt 7860 ggtggagaga ggatatctgc agccctatgg gaaggttgtt gacctcggat gtggcagagg 7920 gggctggagc tattatgccg ccaccatccg caaagtgcag gaggtgagag gatacacaaa 7980 gggaggtccc ggtcatgaag aacccatgct ggtgcaaagc tatgggtgga acatagttcg 8040 tctcaagagt ggagtggacg tcttccacat ggcggctgag ccgtgtgaca ctctgctgtg 8100 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagag acacgaacac tcagagtgct 8160 ctctatggtg ggggactggc ttgaaaaaag accaggggcc ttctgtataa aggtgctgtg 8220 cccatacacc agcactatga tggaaaccat ggagcgactg caacgtaggc atgggggagg 8280 attagtcaga gtgccattgt ctcgcaactc cacacatgag atgtactggg tgtctggggc 8340 aaagagcaac atcataaaaa gtgtgtccac cacaagtcag ctcctcctgg gacgcatgga 8400 tggccccagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaac ctcggctcgg gtacacgagc 8460 tgtggcaagc tgtgctgagg ctcctaacat gaaaatcatc ggcaggcgca ttgagagaat 8520 ccgcaatgaa catgcagaaa catggtttct tgatgaaaac cacccataca ggacatgggc 8580 ctaccatggg agctacgaag cccccacgca aggatcagcg tcttccctcg tgaacggggt 8640 tgttagactc ctgtcaaagc cttgggacgt ggtgactgga gttacaggaa tagccatgac 8700 tgacaccaca ccatacggcc aacaaagagt cttcaaagaa aaagtggaca ccagggtgcc 8760 agatccccaa gaaggcactc gccaggtaat gaacatagtc tcttcctggc tgtggaagga 8820 gctggggaaa cgcaagcggc cacgcgtctg caccaaagaa gagtttatca acaaggtgcg 8880 cagcaatgca gcactgggag caatatttga agaggaaaaa gaatggaaga cggctgtgga 8940 agctgtgaat gatccaaggt tttgggccct agtggatagg gagagagaac accacctgag 9000 aggagagtgt cacagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga agcaaggaga 9060 gttcgggaaa gcaaaaggta gccgcgccat ctggtacatg tggttgggag ccagattctt 9120 ggagtttgaa gcccttggat tcttgaacga ggaccattgg atgggaagag aaaactcagg 9180 aggtggagtc gaagggttag gattgcaaag acttggatac attctagaag aaatgaatcg 9240 ggcaccagga ggaaagatgt acgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagtaa 9300 gtttgatctg gagaatgaag ctctgattac caaccaaatg gaggaagggc acagaactct 9360 ggcgttggcc gtgattaaat acacatacca aaacaaagtg gtgaaggttc tcagaccagc 9420 tgaaggagga aaaacagtta tggacatcat ttcaagacaa gaccagagag ggagtggaca 9480 agttgtcact tatgctctca acacattcac caacttggtg gtgcagctta tccggaacat 9540 ggaagctgag gaagtgttag agatgcaaga cttatggttg ttgaggaagc cagagaaagt 9600 gaccagatgg ttgcagagca atggatggga tagactcaaa cgaatggcgg tcagtggaga 9660 tgactgcgtt gtgaagccaa tcgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720 catgggaaaa gttaggaaag acacacagga gtggaaaccc tcgactggat ggagcaattg 9780 ggaagaagtc ccgttctgct cccaccactt caacaagctg tacctcaagg atgggagatc 9840 cattgtggtc ccttgccgcc accaagatga actgattggc cgagctcgcg tctcaccagg 9900 ggcaggatgg agcatccggg agactgcctg tcttgcaaaa tcatatgcgc agatgtggca 9960 gctcctttat ttccacagaa gggaccttcg actgatggct aatgccattt gctcggctgt 10020 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac cacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080 gatgaccact gaggacatgc tcatggtgtg gaatagagtg tggattgagg agaacgacca 10140 tatggaggac aagactcctg taacaaaatg gacagacatt ccctatctag gaaaaaggga 10200 ggacttatgg tgtggatccc ttatagggca cagaccccgc accacttggg ctgaaaacat 10260 caaagacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320 tctatccacc caagtccgct acttgggtga ggaagggtcc acacccggag tgttgtaagc 10380 accaatttta gtgttgtcag gcctgctagt cagccacagt ttggggaaag ctgtgcagcc 10440 tgtaaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagctcatag tcaggccgag aacgccatgg 10500 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560 gcgcttggaa gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620 gcctgaactg gagactagct gtgaatctcc agcagaggga ctagtggtta gaggagaccc 10680 cccggaaaac gcacaacagc atattgacgc tgggaaagac cagagactcc atgagtttcc 10740 accacgctgg ccgccaggca cagatcgccg aacttcggcg gccggtgtgg ggaaatccat 10800 ggtttct 10807 <210> 5 <211> 1777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 agcaaaagca ggggaaaata aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat 60 atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa 120 cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt aacacactct gttaacctat 180 tggaggataa gcataacagt aagctatgca aactgagagg cgtagcacca ttgcatctag 240 gtaagtgtaa tatagccgga tggattctag ggaatcccga atgcgaatca ctatcaaccg 300 ctagctcatg gtcatacata gtcgaaacac catcaagcga taacggtaca tgttatcccg 360 gagactttat cgattacgaa gagcttagag agcaattgtc tagcgtaagc tcattcgaaa 420 gattcgaaat ttttccgaaa actagctcat ggcctaatca cgatagtagt aaaggcgtaa 480 ctgccgcatg cccacacgcc ggagctaaat cattctataa gaatctgatt tggttagtga 540 aaaaagagaa ttcatatccg aaactatcta aatcatacat taacgataag ggtaaggagg 600 tactagtgtt gtgggggata caccatccat caactagcgc cgatcagcaa tcattgtatc 660 agaacgcaga cgcatacgta ttcgtagggt ctagtagata ctctaaaaaa tttaaacccg 720 aaatcgcaat tagaccgaaa gtgagaggcc aagagggtag aatgaattac tattggacac 780 tagtcgaacc aggcgataag attacattcg aagcgacagg gaatctagtc gtaccgagat 840 acgcattcgc aatggagaga aacgccggat ccggaattat tattagcgat acacccgtac 900 acgattgcaa tactacgtgt cagacaccaa aaggcgcaat taatactagt ctgccatttc 960 agaatataca cccaattaca atcggtaagt gtccaaaata cgttaagtca actaagttga 1020 gactcgcaac agggttgaga aatacaccgt caattcaatc tagggggttg ttcggagcaa 1080 tcgcagggtt tatcgaaggg gggtggacag gtatggttga cggatggtac ggataccatc 1140 atcaaaacga acagggatcc ggatacgcag ccgaactgaa aagtacacag aacgctatag 1200 acgaaattac gaataaagtg aatagcgtaa tcgaaaaaat gaatacgcaa tttacagccg 1260 taggtaagga gtttaatcat ctcgaaaaaa ggattgagaa tctgaataaa aaagtcgacg 1320 acggattctt agacatttgg acttataacg ccgaaatgtt agtgttactc gaaaacgaaa 1380 gaacactaga ctatcacgat tcaaacgtta agaatctata cgaaaaagtg agatcgcaat 1440 tgaaaaataa cgctaaagag atagggaatg ggtgtttcga attctatcat aaatgcgata 1500 atacatgtat ggaatccgtt aaaaacggaa catacgatta ccctaagtat agcgaagagg 1560 ctaaactgaa tagggaagag atagacggag tggaacttga atcaactagg atttatcaga 1620 tactcgcaat ttatagtacg gttgccagtt cattggtact ggtagtctcc ctgggggcaa 1680 tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc tacagtgtag aatatgtatt taacattagg 1740 atttcagaag catgagaaaa acacccttgt ttctact 1777 <210> 6 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 agcaaaagca ggggtttaaa atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct 60 gtatgacaat tggaatggct aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga 120 ttagccactc aatccaattg gggaatcaga atcaaatcga aacatgcaat caatccgtaa 180 ttacatacga gaataatact tgggtgaatc agacatacgt taacatatcg aatactaatt 240 tcactgccgg acaatccgtc gtgagtgtga aactagccgg taatagtagt ctatgtcccg 300 ttagcggatg ggctatatac tctaaagaca atagcgttag aatcggatct aaaggcgacg 360 tattcgttat acgcgaacca ttcataagtt gtagtccatt agagtgtagg actttttttc 420 tgacacaggg cgcactattg aacgataagc attctaacgg tacaatcaaa gataggtcac 480 catatagaac actaatgtca tgtccgatag gcgaagtgcc tagtccatac aatagtagat 540 tcgaatccgt cgcttggtcc gctagcgcat gccatgacgg tattaattgg ttgacaatcg 600 ggattagcgg acccgataac ggcgcagtcg ccgtacttaa gtataacggt ataattaccg 660 atactattaa gagttggcga aataatatat tgcgaacaca ggaatccgaa tgcgcatgcg 720 ttaacggatc atgttttacc gttatgactg acggaccatc taacgggcaa gcgtcatata 780 agatttttag aatcgaaaaa ggtaagatag tgaaatccgt cgaaatgaac gctcctaatt 840 atcattacga agagtgctca tgttatcccg attctagcga aattacatgc gtatgtagag 900 acaattggca cggatctaat agaccttggg tgtcattcaa tcagaatcta gagtatcaaa 960 tcgggtatat atgctcaggg atattcggag acaatcctag acctaacgat aagacagggt 1020 catgcggacc agtgagttct aacggcgcta acggcgttaa ggggtttagt ttcaaatacg 1080 gtaacggcgt atggataggg agaactaagt caatctctag tagaaacgga ttcgaaatga 1140 tatgggaccc taacggatgg accggaaccg ataataattt ttcgattaaa caggatatcg 1200 tagggattaa cgaatggtca gggtatagcg gatcattcgt acagcatcca gagttaaccg 1260 gactcgattg catacgacca tgtttttggg tcgaactgat tagggggaga ccgaaagaga 1320 atactatatg gactagcggg agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg 1380 gttggtcttg gccagacggt gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa tttgttcaaa 1440 aaactccttg tttctact 1458

Claims (55)

  1. 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 변형된 바이러스는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법:
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역 (codon-pair deoptimized region)으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향 (codon pair bias)은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예 (instances), 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 및
    이들의 조합들.
  2. 프라임 용량 (prime dose)의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및
    하나 이상의 부스트 용량 (boost dose)의 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는,
    악성 종양을 치료하는 방법으로서,
    상기 프라임 용량 및 부스트 용량의 변형된 바이러스는 하기로 구성된 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 방법:
    코돈쌍 탈최적화 이외의 다른 방법에 의해 생성된 약독화된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 코돈쌍 탈최적화 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 변형된 서열의 코돈쌍 편향은 모체 바이러스의 코돈쌍 편향보다 작으며, 적어도 약 0.05, 또는 적어도 약 0.1, 또는 적어도 약 0.2 만큼 감소된 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 41개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 21개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 적어도 26개의 예, 또는 모체 바이러스 게놈보다 많은 적어도 13개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스,
    야생형 바이러스의 적어도 하나의 게놈 영역을 유사한 단백질 서열을 코딩하는 증가된 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드를 가진 영역으로 치환함으로써, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 유래되는 변형된 바이러스로서, 상기 UpA 및 CpG 디-뉴클레오티드의 증가에서 모체보다 많은 조합된 적어도 42개의 예가 있는 것인 변형된 바이러스, 및
    이들의 조합들.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 프라임 용량이 피하, 근육내, 피부내, 비강내 또는 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 하나 이상의 부스트 용량이 종양내 또는 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 하나 이상의 부스트 용량 중 첫 번째 부스트 용량은 1회의 프라임 용량 후 약 2주 후에, 또는 1회 초과의 프라임 용량인 경우, 최종 프라임 용량 후 약 2주 후에 투여되는 것인 방법.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 대상은 암을 갖는 것인 방법.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 프라임 용량은 상기 대상이 암을 갖지 않은 경우에 투여되는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 대상은 암 발병 위험이 더 높은 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 하나 이상의 부스트 용량은 상기 대상이 암을 갖지 않은 경우에 프라임 용량 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년마다 투여되는 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 하나 이상의 부스트 용량은 상기 대상이 암으로 진단 받은 후에 투여되는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 항에 있어서, 상기 방법은 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 항-PD1 항체인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 피딜리주맙 (pidilizumab), AMP-224, AMP-514, 스파르탈리주맙 (spartalizumab), 세미플리맙 (cemiplimab), AK105, BCD-100, BI 754091, JS001, LZM009, MGA012, Sym021, TSR-042, MGD013, AK104, XmAb20717, 티슬렐리주맙 (tislelizumab) 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 PF-06801591, 만능성 킬러 T 림프구를 발현하는 항-PD1 항체 (PIK-PD-1), 자가 항-EGFRvIII 4SCAR-IgT 세포 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 BGB-A333, CK-301, FAZ053, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 두르발루맙 (durvalumab), BMS-936559, CK-301 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 항-PD-L1 저해제는 M7824인 것인 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양 치료는 상기 악성 종양의 재발 가능성을 감소시키는 것인 방법.
  19. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양 치료는 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암을 가질 가능성을 감소시키는 것인 방법.
  20. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 대상이 상기 악성 종양과 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 상기 악성 종양 치료는 상기 속발성 암의 성장을 지연시키는 것인 방법.
  21. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양의 완화 후에, 상기 대상이 상기 악성 종양과는 상이한 속발성 암이 발병하는 경우, 상기 악성 종양 치료는 상기 속발성 암의 성장을 지연시키는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양 치료는 종양에서 염증성 면역 반응을 자극하는 것인 방법.
  23. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양 치료는 염증유발 (pro-inflammatory) 세포를 종양으로 모집하는 것인 방법.
  24. 청구항 1 내지 17 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양 치료는 항-종양 면역 반응을 자극하는 것인 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 재조합 변형된 바이러스인 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  26. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 피코르나바이러스 (picornavirus)로부터 변형된 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 엔테로바이러스 (enterovirus)인 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 엔테로바이러스 C (enterovirus C)인 것인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 엔테로바이러스 C는 폴리오바이러스 (poliovirus)인 것인 방법.
  30. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 오르토믹소바이러스 (orthomyxovirus)로부터 변형된 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 오르토믹소바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus)인 것인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 세그먼트가 재코딩 (recoded)되는 것인 방법.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 HA, NA, 또는 HA 및 NA 세그먼트 모두가 재코딩되는 것인 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 서열번호:5 또는 서열번호:6인 것인 방법.
  35. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 플라비바이러스 (flavivirus)로부터 변형된 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 플라비바이러스는 지카 바이러스 (Zika virus)인 것인 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 지카 바이러스의 프리-멤브레인 (pre-membrane)/외피 (E) 코딩 영역, 또는 비구조 단백질 3 (NS3) 코딩 영역, 또는 이들 모두가 재코딩되는 것인 방법.
  38. 청구항 35에 있어서, 상기 재코딩은 E 및 NS3 코딩 서열에서 CG 및/또는 TA 디뉴클레오티드의 빈도를 변경하는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 청구항 37에 있어서, 상기 재코딩된 E 단백질-코딩 서열, 또는 NS3 코딩 서열, 또는 이들 모두는 -0.1 미만의 코돈쌍 편향을 갖는 것인 방법.
  40. 청구항 37에 있어서, 상기 재코딩된 E 단백질-코딩 서열, 또는 NS3 코딩 서열, 또는 이들 모두는 0.1-0.4의 코돈쌍 편향 감소를 갖는 것인 방법.
  41. 청구항 36에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4인 것인 방법.
  42. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양은 고형 종양인 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  43. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 악성 종양은 교모세포종, 선암종, 흑색종, 폐 암종, 신경모세포종 유방암, 방광암, 결장암, 전립선암 또는 간암인 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  44. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 종양내, 정맥내, 뇌내, 근육내, 척추내 또는 경막내로 투여되는 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  45. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서 , 상기 변형된 바이러스는 PV1-MinY이고, 야생형 바이러스 또는 이전에 변형된 바이러스로부터 제조되며, 이의 P1 영역의 중간 부분은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열로 치환되는 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  46. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 재조합 변형된 바이러스는 PV1-MinY이고, 이전에 변형된 바이러스 PVl(M) 또는 야생형 바이러스 PV1(M)으로부터 제조되며, 이의 P1 영역의 중간 부분은 증가된 UpA 및 또는 CpG 디-뉴클레오티드를 위해 재코딩된 합성 서열로 치환되는 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 PV1(M)으로부터 제조된 PV1-MinY이고, P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 뉴클레오티드 단편은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환되는 것인 방법.
  48. 청구항 1 내지 24 중 어느 항에 있어서, 상기 변형된 바이러스는 PV1(M)으로부터 제조된 PV1-MinY이며, 상기 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470으로 구성된 뉴클레오티드 단편은 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 P1 영역의 뉴클레오티드 위치 1513 내지 뉴클레오티드 위치 2470을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환되는 것인 악성 종양을 치료하는 방법.
  49. 하기 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법:
    야생형 피코르나바이러스의 P1 도메인에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편을 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환함으로써, 및
    선택적으로 야생형 피코르나바이러스의 P1을 PV1(S), PV2(S) 및 PV3(S)으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 P1로 치환함으로써, 야생형 피코르나바이러스로부터 재조합 변형된 피코르나바이러스를 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 변형된 바이러스를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편의 치환은 상기 변형된 바이러스의 P1 도메인인 서열번호:1의 nt#1513-nt#2470을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 단편을 인간 코돈쌍 편향에 따라 감소된 코돈쌍 스코어를 위해 재코딩된 합성 서열을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 치환하는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 종양내, 정맥내, 뇌내, 근육내, 척추내 또는 경막내로 투여되고, 종양 세포에서 세포 용해를 유도하는 것인 방법.
  52. 청구항 49에 있어서, 상기 악성 종양은 다형 교모세포종 (glioblastoma multiforme), 속질모세포종 (medulloblastoma), 유방 암종, 전립선 암종, 결장직장 암종, 간세포 암종, 기관지 암종 및 표피모양 암종 (epidermoid carcinoma)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  53. 청구항 49에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 엔테로바이러스 C 종인 것인 방법.
  54. 청구항 49에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 폴리오바이러스인 것인 방법.
  55. 청구항 49에 있어서, 상기 P1 도메인은 사빈 백신 균주 (Sabin vaccine strains) PV1(S), PV2(S) 및 PV3(S)로부터 선택되는 것인 방법.
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