JP2001514509A

JP2001514509A - 抗原性産物または治療的産物をコードする核酸のデリバリーのためのコクサッキーウイルスベクター

Info

Publication number: JP2001514509A
Application number: JP53879098A
Authority: JP
Inventors: トレイシー，スティーブン・エム; チャップマン，ノーラ・エム; コルベック，ピーター; マローン，ジェイムズ
Original assignee: UNIVERSITY OF NEBRASKABOARD OF REGENTS
Current assignee: UNIVERSITY OF NEBRASKABOARD OF REGENTS
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2001-09-11
Also published as: US6071742A; US6323024B1; WO1998039426A2; EP0973879A2; CA2282717A1; AU726500B2; WO1998039426A3; AU6346098A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一時的感染において、免疫転調蛋白または他の生物学的に活性のある蛋白および／または抗原性エピトープをデリバリーして、感染性ウイルスによる心臓疾患を予防、改善および／または除去し、あるいは心臓移植拒絶反応を感染に除去するための、弱毒化コクサッキーウイルスによるカージオトロピックウイルスベクターの使用に関する。さらに、他の器官または組織を特定のピコルナウイルスで標的化することもできる。詳細には、サイトカインを発現できる弱毒化ＣＶＢ３ウイルスベクターが提供される。このサイトカイン発現ウイルスベクターはサイトカインを標的組織にデリバリーし、疾病の徴候を軽減させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】抗原性産物または治療的産物をコードする核酸のデリバリーのためのコクサッキーウイルスベクター本発明は、一部には、National Institute of Healthからの承諾により得られた基金を用いて行われた。したがって、米国政府は本発明において一定の権利を有する。発明の分野本発明は、一般的には、分子生物学およびウイルス学の分野に関する。より詳細には、本発明は、生物学的に処理され、弱毒化されたコクサッキーウイルス（ Coxsackievirus）ならびにその抗原性蛋白または生物学的活性蛋白をコードする核酸のデリバリー担体としての使用に関する。発明の背景ピコルナウイルス科（Picornaviridae）のメンバーであるコクサッキーウイルスは、本質的には、新生マウスにおけるそれらの病原性および複製に基づいて２群に分けられる。Ｂ群コクサッキーウイルス（ＣＶＢ）は６種のセロタイプから構成される（１−６）。ピコルナウイルス科の他のメンバーと同様に、ＣＶＢゲノムは１本鎖、メッセンジャーセンス、ポリアデニル化ＲＮＡ分子である（説明としては、Romero，J．R．et al.，Current Topics in Microbiology and Immun ology 223:97-152，1997参照）。ＣＶＢのゲノム分析により、他のピコルナウイルスと同様に、それらが５'非翻訳領域、単一の読み枠を含む蛋白コーディング領域、３'非翻訳領域および末端ポリＡテイル中に組織化されていることが示されている。ＣＶＢ蛋白コーディング領域はさらに３つの領域Ｐ１、Ｐ２およびＰ３に分けることができる。Ｐ１は４種のカプシド蛋白ＶＰ４（１Ａ）、ＶＰ２（１Ｂ）、ＶＰ３（１Ｃ）およびＶＰ１（１Ｄ）をコードしており、Ｐ２およびＰ３は、ＣＶＢの生活環に必要な非構造蛋白２Ａ（プロテアーゼ）、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ（Ｖｐｇ）、３Ｃ（プロテアーゼ）および３Ｄ（ポリメラーゼ）をコードしている（上記のRomero et al.，1997参照）。十分に配列決定されたＣＶＢのゲノムは、７３８９ヌクレオチド（ＣＶＢ１）ないし７４０２ヌクレオチド（ＣＶＢ５）の範囲の長さであることにおいて、互いに類似している（上記のRomero et al.，1997）。長さのバリエーションは、ＶＰＩおよびＶＰ２（カプシド蛋白）のコーディング領域ならびに５'および３' 非翻訳領域中の相違によるものである。５'非翻訳領域もまた、長さにおいて著しい類似性を示す。ＣＶＢゲノム間の類似性に関する詳細な説明としては、上記のRomero et al.，1997参照のこと。Ｂ群コクサッキーウイルスの６種のセロタイプのうちの１つであるコクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）は、特に十分に研究されており、他のコクサッキーウイルスのプロトタイプとして役立つ。ＣＶＢ３ゲノムは、２１８５アミノ酸のポリ蛋白をコードする単一分子のポジティブセンスＲＮＡである。単一の長い読み枠は、７４２ヌクレオチドの５'非翻訳領域（５'ＮＴＲ）ならびにポリアデニル化部位で終了するかなり短い３'ＮＴＲに隣接している。ポリオウイルス(ＰＶｓ)と同様に、感染ＨｅＬａ細胞において、ＣＶＢ３は宿主細胞の蛋白翻訳をシャットオフする。ＣＶＢ３ウイルス粒子の類似した微細構造が解明され、ＣＶＢ３カプシドが一般的に関連するエンテロウイルスおよびライノウイルスと類似したカプシド構造を有することが示された。コクサッキーＢウイルスは、ヒトの急性炎症性心臓疾患の、はっきりとわかっている病原体であり(Cherry，J．D．Infectious Diseases of the Fetus and Ne wborn Infant，4th ed.，pp．404-446，1995に説明されている)、心臓のＣＶＢ３感染は拡張性心筋症を引き起こす可能性がある。全身的なＣＶＢ３感染は新生児によく見られる。しばしば、重篤または生命を脅かすものであり、通常、それらは心筋の炎症および壊死を伴う。生後３カ月の新生児についての１の研究により、ＣＶＢ感染率は３６０／１０００００であり、死亡率８％であることが示唆された（Kaplan，M．H.，et al.，Rev．Infect．Dis．5:1019-1032，1983）。世界中で１０万人につき約５〜８人が急性および慢性の感染による心臓疾患にかかっている（Manolio，T．A.，et al．Am．J．Cardiol．69:1458-1466，1992）。エンテロウイルスが関与しているという分子的証拠に基づけば、急性の炎症性心筋疾患および拡張性心筋症のケースの約２０〜３０％は、エンテロウイルスが病原体として関与している（例えば、Kandolf，R．Coxsackieviruses-A General Updat e，p．292-318，1988;およびMartino，T．A.，et al.，Circ．Res．74:182-188 ，1994参照）。エンテロウイルス感染による炎症性心臓疾患を特徴づけている炎症のプロセスが、ネズミのモデルにおいて広く研究されている(Gauntt，C.，et al.，Medical Virology，8th ed.，p．161-182，1989;Leslie，K.，et al.，Clin．Microbiol ．Rev．2:191-203，1989;Sole，M.，and P．Liu.，J．Amer．Coll．Cardiol．22 (Suppl．A):99A-105A，1994;およびWoodruff，J．F.，Am．J．Pathol．101:425- 484，1980)。しかしながら、急性疾患の誘導および慢性状態の継続における、細胞により媒介される免疫応答の種々の成分がいかなる役割を果たしているのかは正確にはわかっていない。しかしながら、無傷のネズミ免疫系の存在下において、ＣＶＢ３により誘導される炎症性の心臓疾患は、マウスに心臓毒性ＣＶＢ３株を接種した後にのみ発症されるということが明らかとなっている（Chapman，N． M.，et al.，Arch．Virol．135:115-130，1994;Gauntt，C．J.，et al.，J．Med ．Virol．3:207-220，1979;Tracy，S.，et al.，Arch．Virol．122:399-409，19 92;およびWoodruff，J．F.，and E．D．Kilbourne，J．Infect．Dis．121:137-1 63，1970）。心臓毒性（疾病を誘発しうる）および非心臓毒性のＣＶＢ３株はいずれも、実験的に感染したマウスの心臓においてよく複製する。しかしながら、心臓毒性ＣＶＢ３株のみが、重大な心筋細胞の破壊およびその後の急性心筋炎の特徴的な心臓の炎症を引き起こす（Chapman，N．M.，et al.，Arch．Virol．135:115-130(1 994)；およびTracy，S.，et al.，Arch．Virol．122:399-409，1992）。非心臓毒性ＣＶＢ３は、感染後７〜１０日以内に、実験的に感染したネズミ心臓から排除されるが、感染性の心臓毒性ＣＶＢ３は、感染後２週間までは心臓に留どまることができ、検出可能である（Klingel，K.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． U．S．A．89:314-318，1992;Lodge，P．A.，et al.，Am．J．Pathol．128:455-4 63，1987;およびTracy，S.，et al.，Arch．Virol．122:399-409，1992）。ネズミの心筋感染性ＣＶＢ３力価の低下は、抗ＣＶＢ３中和抗体力価の上昇と同時に起こる（Beck，M．A.，and S．Tracy，J．Virol．63:4148-4156，1988;Ganutt， C.，et al.，Medical Virology，8th ed.，p．161-182，1989;およびLeslie，K. ，et al.，Clin．Microbiol．Rev．2:191-203，1989）。ヒト心筋細胞におけるエンエロウイルス複製ならびにネズミ心筋細胞における心臓毒性ＣＶＢ３複製についての直接的in situハイブリダイゼーションの証拠に加えて、ＣＶＢ３は、ネズミおよびヒトの心筋細胞、ネズミ胎児心臓繊維芽細胞および心臓内皮細胞を包含する種々の培養心筋細胞タイプに感染する。心臓移植および急性エンテロウイルス心臓疾患が類似の免疫応答を引き起こすということは、非常に興味深い。移植された心臓に対する急性の拒絶反応は、最初にＴｈ１タイプのＴ細胞応答があり、それは、よく研究されている、ＣＶＢ３により誘導される炎症性心臓疾患のネズミモデルにおける急性心筋炎のＣＶＢ３による誘導において観察されるのと同じタイプのＴ細胞応答である。疾病の消滅と同時に起こる、この応答のＴｈ２タイプの応答へのスイッチングは、重要なモジュレーションを引き起こすサイトカインＩＬ−４またはＩＬ−１０の非経口投与によりマウスにおいて達成された。しかしながら、ヒトへのサイトカインの非経口投与は、しばしば、望ましくない臨床的副作用を引き起こす。よって、先行技術においては、免疫転調活性または生物学的活性のある遺伝子または抗原性エピトープを、選択された細胞、組織ならびに心臓を包含する器官を特異的に標的としてデリバリーする遺伝子デリバリーベクターとしての弱毒化コクサッキーウイルスの使用がなかった。かかる投与または遺伝子デリバリーのモードは、免疫転調作用剤、抗原または他の治療分子の非経口投与の望ましくない副作用を回避する。よって、本発明は、この長く待ち望まれていた必要性および渇望を満たすものである。発明の概要本発明の１の目的は、個体の細胞、組織または器官を標的とする、抗原性エピトープまたは免疫転調サイトカイン（これに限らない）のごとき特異的な生物学的活性遺伝子産物をコードする核酸をデリバリーすることにより、ヒトの疾病における治療または予防用途のウイルスベクターを提供することである。よって、本発明の１の態様によれば、異種核酸を細胞、組織または器官にデリバリーするためのウイルスベクターであって、弱毒化コクサッキーウイルスをコードするように修飾されたコクサッキーウイルスのゲノム（さらに該ゲノムは少なくとも１種の発現可能な異種核酸を挿入するための少なくとも１つのクローニング部位を含む）を含むウイルスベクターが提供される。好ましい具体例において、コクサッキーウイルスのゲノムはコクサッキーウイルスＢのゲノムであり、最も好ましくは、コクサッキーウイルスＢ３のゲノムである。本発明の１の具体例において、ゲノムの転写調節領域を変化させることによってコクサッキーウイルスの弱毒化を行う。好ましくは、転写調節領域はゲノムの５'非翻訳領域を含む。１の具体例において、５'非翻訳領域を、ポリオウイルスおよびエコーウイルスからなる群より選択される非エンテロウイルスゲノムの５ '非翻訳領域と置換する。もう１つの具体例において、ゲノムのヌクレオチド位置２３４においてＵのかわりにＣまたはＧとすることによりコクサッキーウイルスＢ３ゲノムを修飾する。コクサッキーウイルスベクターのクローニング部位を、カプシド蛋白のコーディング配列とウイルスプロテアーゼのコーディング配列との間に置くことができる。もう１つの具体例において、クローニング部位をゲノムの読み枠の開始点に置いて、挿入された発現可能異種ＤＮＡが翻訳開始コドンおよびウイルスプロテアーゼにより認識される３'配列を含むようにクローニング部位を構築する。１の具体例において、本発明コクサッキーウイルスベクターにより担持される発現可能な異種ＤＮＡは抗原性産物をコードする。もう１つの具体例において、それは、生物学的に活性のある蛋白のごとき生物学的に活性のある産物をコードする。好ましくは、蛋白はＩＬ−４またはＩＬ−１０のごときサイトカインである。あるいはまた、蛋白はＢ−７（Ｂ−７−１またはＢ−７−２）のごとき別の免疫転調蛋白であってもよい。本発明のもう１つの態様において、少なくとも１種の異種遺伝子を個体中の標的器官または器官系に治療的にデリバリーするための、コクサッキーウイルスＢ３(ＣＶＢ３)を含む生体工学により得られるウイルスが提供され、該コクサッキーウイルスＢ３は弱毒化されており、該ＣＶＢ３のゲノムは該少なくとも１種の異種遺伝子をコードしている。転写機構によってＣＶＢ３の弱毒化を行ってもよい。好ましい具体例は、コクサッキーウイルスＢ３のゲノムのヌクレオチド２３４の位置にあるヌクレオチドをウラシルシトシンまたはグアノシンヌクレオチドに置換することによりウイルスを弱毒化することを包含する。もう１つの好ましい具体例は、コクサッキーウイルスＢ３のゲノムのヌクレオチド２３３およびヌクレオチド２３６の位置での点突然変異、あるいはヌクレオチド２３３〜２３６の全部の欠失を包含する。さらに、コクサッキーウイルスＢ３のゲノムの５'非翻訳領域を非エンテロウイルス由来のゲノムの５'非翻訳領域と置換して弱毒化を行ってもよい。好ましい具体例において、非エンテロウイルスはポリオウイルスまたはエコーウイルスである。最も好ましい具体例において、生体工学により得られるコクサッキーウイルスＢ３のゲノムは、ベーシックなＣＶＢ３／０ゲノム(Chapman，N．M.，et al.，A rch．Virol．135:115-130(1994)により報告されている)を包含し、その中で、異種遺伝子のコーディング配列はカプシド蛋白コーディング配列とウイルスプロテアーゼコーディング領域部位との間に挿入されている。あるいはまた、カプシド蛋白１Ａのすぐ上流の読み枠の開始点に異種遺伝子を挿入してもよく、該異種遺伝子は開始コドンＡＵＧで開始し、ウイルスプロテアーゼにより認識される配列で終了する。この好ましい具体例において、免疫転調遺伝子または抗原性エピトープに関する遺伝子を使用する。より好ましい具体例において、サイトカイン遺伝子がデリバリーされる。最も好ましい具体例において、サイトカインはＩＬ− ４またはＩＬ−１０である。７種までのサイトカインの遺伝子を１のベクターでデリバリーすることができる。さらに、抗原性エピトープおよびサイトカインの両方を同時にデリバリーしてもよい。また、好ましい具体例は、ウイルスプロテアーゼＰ２−ＡおよびＰ３−Ｃに関する配列を使用する。本発明のさらなる目的は、免疫転調遺伝子を含有する、生体工学により得られる治療ウイルスを個体に投与する工程を含む、個体における免疫応答の抑制方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、抗原性エピトープに関する遺伝子を含有する、生体工学により得られる治療ウイルスを個体に投与する工程を含む、個体へのワクチン接種方法を提供することである。本発明の他の、さらなる態様、特徴、および利点は、本発明の目下好ましい具体例についての下記説明から明らかであろう。これらの具体例は開示目的で示される。図面の簡単な説明上記した本発明の特徴、利点および目的を明らかにし、詳細に理解できるようにするために、添付図面を本明細書に含める。これらの図面は本明細書の一部を構成する。添付図面は本発明の好ましい具体例を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。図１は、ＣＶＢ３／０−ＩＬ４ゲノム中のｍＩＬ４インサートを示す。ｍＩＬ４配列をウイルスカプシド蛋白Ｐ１−Ｄとウイルスプロテアーゼ２Ａ（Ｐ２−Ａ）との間に組み込んだ。ウイルスポリ蛋白の翻訳の間における、最も可能性のある機構は、プロテアーゼＰ２−Ａが形成期の蛋白から自分自身をシス様式で開裂し、ついで、カプシド蛋白Ｐ１−ＤとｍＩＬ４配列との間の部位をトランス様式で開裂するというものである。図２は、ＰＬＳ−ＣＶＢ３ゲノムおよびｍＩＬ−１０−ＣＶＢ３のアミノ酸配列のプロテアーゼ２Ａ開裂部位を示す。この構築物において、クローニング手順を修飾してポリリンカー部位（ＰＬＳ）を含むようにして、汎用クローニングおよび発現ビヒクルとしてのＣＶＢ３の使用を容易ならしめる。さらなる修飾は、形成期のポリ蛋白中のプロテアーゼＰ２−Ａ開裂部位をコードする非ダイレクトリピート遺伝学的配列を用いるものである。ＰＬＳにより与えられるアミノ酸に下線を付し、２Ａ開裂認識シグナルを形成するアミノ酸に二重下線を付す。ｍＩＬ−１０挿入配列は太字である。図３は、ＰＬＳ−ＣＶＢ３ゲノムおよびｍＩＬ−１０−ＣＶＢ３ゲノムの読み枠の開始部位のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この構築物において、外来または異種の配列は、第１のコードされているウイルス蛋白の上流の読み枠中に組み込まれる。よって、翻訳開始は、ｍＩＬ１０配列（または目的とする他の配列）の最初から開始される。この構築物では、第１のウイルスカプシド蛋白Ｐ１−Ａから外来蛋白（本図ではｍＩＬ１０）を開裂するためにウイルスプロテアーゼ３Ｃを使用する。ＰＬＳのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に下線を付し、プロテアーゼ３Ｃ認識部位に二重下線を付す。ｍＩＬ−１０挿入配列は太字である。図４は、ＣＰＶ／４９−ポリリンカーゲノムの構造を示す。図５は、ＣＶＢ３／０−ＩＬ４の逐次継代を用いて接種されたＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡのスロットブロットの結果であり、ｍＩＬ４特異的オリゴヌクレオチドでプローブ(左)あるいはＣＶＢ３特異的オリゴヌクレオチドでプローブ(右) したものである。ｐＣＶＢ３／０−ＩＬ４ｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションし、子孫ウイルスを得た後、ＨｅＬａ細胞中でストックした（１代目）。ストックを用いて、１００ｍｍディッシュ中のＨｅＬａ細胞を感染の多重度２０で接種を行った（２代目）。力価測定後、２代目を用いて新たなＨｅＬａ細胞に接種し（３代目）、かかる操作を繰り返した。これらの実験のＲＮＡを得るために、１〜５代目を用いて、ほぼ集密となった１００ｍｍディッシュ中のＨｅＬａ細胞に、感染の多重度２０で接種を行った。１時間後に細胞を洗浄し、感染５時間後に集めた。全核酸をＤＮａｓｅで消化した。各継代ごとに２ｘ１０⁵ および０．４ｘ１０⁵個の細胞の等価物をブロットした。同等の比放射活性を有する同量のオリゴヌクレオチドプローブを各片に使用した。アルファーチューブリンプローブを用いる対照ブロットは、各ＲＮＡの使用濃度が同じであることを示した。対照ブロットのＲＮａｓｅ処理は、ＲＮＡもＤＮＡも検出不可能であることを示した。図６は、ＣＶＢ３／０（左のパネル）またはＣＶＢ３／０−ＩＬ４（右のパネル）のいずれかで感染した後のマウス膵臓組織の組織学的切片を示す。マウスを感染１０日後に屠殺した。ＣＶＢ３／０は重篤な膵臓細葉細胞の破壊を誘発したが、パネルの右下角に無傷の細葉細胞が見られる。ＣＶＢ３／０−ＩＬ４はマウス膵臓における観察可能な病理学的変化を誘発していない（右のパネル）。発明の詳細な説明本発明の範囲および精神から離れることなく本明細書開示の本発明に対して種々の置換および修飾を行うことができることは、当業者に明らかであろう。本明細書の用語「コクサッキーＢ３ウイルス」または「ＣＶＢ３」は、ピコルナウイルス科、エンテロウイルス属のヒトのコクサッキーＢエンテロウイルスの特定のセロタイプをいう。ＣＶＢ３ゲノムは、２１８５アミノ酸のポリ蛋白をコードする単一分子のポジティブセンスＲＮＡにより特徴づけられる。本明細書の用語「カージオトロピック（cardiotropic）」は、ウイルス、この場合コクサッキーウイルスＢ３により心臓組織が標的化されていることをいう。本明細書の用語「弱毒化」は、野生型コクサッキーウイルスＢ３よりも毒性（発病性）が低くなるように処理されたウイルス（この場合コクサッキーウイルスＢ３）をいう。本明細書の用語「ワンウェイウイルスベクター（one way viral vector）」は、ウイルス生成のためには複製しないが、感染細胞中で種々の期間においてそのＲＮＡゲノムが自律的に複製できるウイルスデリバリービヒクルをいう。かかるベクターは、本質的にはすべてのカプシドコーディング領域を目的とする他の配列で置換することを可能にし、７種までのサイトカインサイズのコーディング配列をウイルスゲノムに入れてデリバリーすることが可能である。ポリメラーゼ配列の欠失により欠損を生じ、哺乳動物プロモーターの支配下に置かれたかかるゲノムを、注射または経口投与のごとき標準的手段によりデリバリーされるＤＮＡワクチンまたは治療薬のためのベクターとして使用してもよい。本明細書の用語「ベーシックなＣＶＢ３／０ゲノム」は、Chapman，N．M.，et a l.，Arch．Virol．122:399-409(1994)により報告されたような生体工学により得られるコクサッキーウイルスＢ３を意味する。本明細書の用語「ウイルスプロテアーゼ」または「ウイルスによりコードされるプロテアーゼ」は、アミノ酸残基間のペプチド結合を加水分解することにより蛋白を分解する、ウイルスによりコードされる酵素をいう。いくつかのかかるプロテアーゼは単一の特異的配列を認識し、開裂する。本明細書の用語「免疫転調遺伝子」は、その発現が、特定の刺激物質または種々の刺激物質に対する免疫反応の過程を転調させるものである遺伝子をいう。例としては、インターロイキン４、インターロイキン１０、腫瘍壊死因子α等がある。本明細書の用語「サイトカイン」は、特定の刺激物質に対する免疫応答の過程に影響し、これに指令を下すことのできる免疫系の細胞により生成される小型蛋白をいう。本明細書の用語「抗原性エピトープ」は、免疫系の細胞により抗原性であると認識され、ついで、それに対して免疫応答、例えば抗体応答が向けられる蛋白の配列をいう。本明細書の用語「ウイルスベクター」は、外来性または異種の遺伝学的情報を宿主に伝達することのできるウイルスをいう。この外来性の遺伝学的情報は蛋白産物に翻訳されてもよいが、外来性の情報にとり、このことは必須事項ではない。本明細書の用語「読み枠」は、ＡＵＧ翻訳開始シグナルと１またはそれ以上の既知終結コドンとの間の一定の長さのＲＮＡ配列をいい、それは潜在的に翻訳されてポリペプチド配列となりうる。本明細書の用語「カプシドコーディング領域」は、ウイルス粒子の蛋白コート中にパッケージされる蛋白サブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含むウイルスゲノムの領域をいう。本発明によれば、当該分野における慣用的な分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ法を使用してもよい。かかる方法は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(19 89); "DNA Cloning:A Practical Approach,"Volumes I and II(D．N．Glover ed．198 5);"Oligonucleotide Synthesis" (M．J．Gait ed． 1984); ”Nucleic Aci d Hybridization”[B．D．Hames & S．J．Higgins eds．(1985)];"Transcripti on and Translation"[B．D．Hames & S．J．Higgins eds．(1984)];"Animal Cel l Culture"[R．I．Freshney，ed．(1986)];”Immobilized Cells and Enzymes” [IRS Press，(1986)];B．Perbal，"A Practical Guide To Molecular Cloning"( 1984);または"Current Protocols in Molecular Biology"，eds．Frederick M． Ausbel et al.，John Wiley & Sons，1997参照。それゆえ、本明細書において、下記用語がある場合には、下記定義を有する。「ベクター」は、プラスミド、ファージコスミド、またはウイルスのごときレプリコンをいい、別のＤＮＡまたはＲＮＡセグメントを結合して、その結合セグメントを複製させるものをいう。ベクターは、その投与が受容哺乳動物に耐えられるものである場合には、「医薬上許容される」といわれる。かかる作用剤は、投与量が生理学的に有意である場合には、「治療上有効量」で投与されるといわれる。その存在が受容哺乳動物の生理学的状態の変化を引き起こすものである場合には、作用剤は生理学的に有意なものである。例えば、レトロウイルス感染の治療において、感染または感染による生理学的ダメージの程度を小さくする化合物は治療上有効であると考えられる。「複製開始点」は、ＤＮＡ合成の開始に関与するＤＮＡ配列をいう。転写および翻訳制御配列はＤＮＡ調節配列であり、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等であり、それらは宿主細胞においてコーディング配列を発現させる。「プロモーター配列」は、細胞中においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流 (３'方向)コーディング配列の転写を開始させることのできるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ一配列は３'末端において転写開始部位に結合されており、上流（５'方向）に伸長して、バックグラウンド以上の検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含んでいる。プロモーター配列中には、転写開始部位（慣用的には、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングにより決定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となる蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核プロモーターは、しばしば（常にではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列のほかにシャイン−ダルガルノ配列を含む。「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写する場合には、コーディング配列は細胞中において転写および翻訳制御配列の「制御下」にあり、ついで、それはコーディング配列によりコードされる蛋白に翻訳される。「シグナル配列」は、コーディング配列の前に含まれていてもよい。本明細書の用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、特定のヌクレオチド配列において、あるいはその付近において２本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。外来性または異種ＤＮＡが細胞中に導入された場合、かかるＤＮＡにより細胞は「形質転換」または「トランスフェクション」されている。形質転換を起こすＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれてもよく（共有結合されてもよく）、あるいは組み込まれなくてもよい。例えば、原核細胞、酵母、および哺乳動物細胞において、形質転換を起こすＤＮＡはプラスミドのごときエピソームエレメント上に維持されてもよい。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、その染色体中に形質転換を起こすＤＮＡが組み込まれて、染色体の複製により娘細胞に遺伝されるようになっている。形質転換を起こすＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力により、この安定性が示される。「クローン」は、単一細胞または共通の祖先から有糸分裂により分裂した細胞の集団である。「細胞系」は、インビトロにおいて何世代にもわたって安定に増殖できる初代細胞のクローンである。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子中の同定可能なＤＮＡセグメントであり、自然界においては当該より大きなＤＮＡ分子と結合した状態では見いだされない。よって、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、通常には、その遺伝子は、それがもとの生物のゲノム中で隣接している哺乳動物ゲノムＤＮＡではないＤＮＡに隣接している。もう１つの例において、コーディング配列は、当該コーディング配列自体が自然界において見いだされないものである構築物である（例えば、ゲノムコーディング配列がイントロンを含んでいるｃＤＮＡ、あるいはもとの遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変種または自然発生的突然変異は、上記のようなＤＮＡの異種領域を生じさせない。本発明は、異種核酸を標的細胞、組織または器官にデリバリーするためのウイルスベクターであって、弱毒化コクサッキーウイルスをコードするように修飾されたコクサッキーウイルスゲノムを含むウイルスベクターを提供する。さらにゲノムは、少なくとも１種の発現可能な異種核酸を挿入するための少なくとも１つのクローニング部位を含む。好ましい具体例において、コクサッキーウイルスゲノムはコクサッキーウイルスＢゲノム、最も好ましくはコクサッキーウイルスＢ３ゲノムであるが、いずれのコクサッキーウイルスゲノムであっても本発明における使用に適すると考えられる。このことは、コクサッキーウイルス間、そして実際のところ、一般的にはエンテロウイルス間の高レベルの構成類似性によるものである（例えば、Romero et al.，Current Topics in Microbiology and Immu nology 223:97-152，1997（Ｂ群コクサッキーウイルス間の遺伝学的関連性を説明）;Chapman et al.，Current Topics in Microbiology and Immunology 223:2 27-258，1997（コクサッキーウイルスの毒性についでの遺伝学を説明）;およびT racy et al.，Trends in Microbiology 4:175-179，1996(コクサッキーウイルスＢの心臓毒性および炎症性の心筋の疾病についての遺伝学を説明)参照)。よって、本発明において、種々の方法(その大部分がゲノムの転写調節領域、例えば、ゲノムの５'非翻訳領域を変化させることに関する)でゲノムを処理することによりＣＶＢ３を弱毒化できることが示された。これらの変化につき、以下の説明ならびに実施例において詳細に説明する。同様の操作を行って他の５種のコクサッキーウイルスＢセロタイプ、ならびにコクサッキーウイルスＡまたは他のエンテロウイルスを弱毒化することができる。本発明によれば、異種ＤＮＡが翻訳開始コドンおよびウイルスプロテアーゼにより認識される３'配列を含むように、異種ＤＮＡセグメントをＣＶＢ３ゲノムのいくつかの位置のうちの１つ（例えば、カプシド蛋白のコーディング配列とウイルスプロテアーゼのコーディング配列との間、あるいはゲノムの読み枠の開始点）に挿入できることも示された。これらの挿入につき、以下の説明および実施例においてより詳細に説明する。同様の挿入を他のコクサッキーウイルスまたは他のエンテロウイルスのゲノムにおいて行うことができ、これらの異種核酸の発現の成功が期待される。そのうえ、当業者は、コクサッキーウイルスゲノム中に他の有用な挿入部位が存在し、利用できることも理解するであろう。本発明コクサッキーウイルスベクターに挿入できる異種核酸のサイズに関しては、ゲノムは２００〜４００個までのアミノ酸をコードするインサートを含むことができることが見いだされた。ゲノムの特定部分（例えば、カプシド蛋白コーディング配列）が欠失されている場合には、インサートのサイズを大きくしてもよい(例えば、インサートが８００〜１０００個のアミノ酸をコードするまで)。この具体例において、ウイルスのパッケージングを行わせるために、ヘルパーウイルスを供給して失われたカプシドをトランス様式で提供することが必要であろう。ウイルスベクターに対するかかる処理は当業者によく知られている。本発明コクサッキーウイルスにより担持される異種核酸配列は、ＲＮＡ、ペプチドおよび蛋白を包含するすべての遺伝子産物をコードすることができる。１の具体例において、本発明コクサッキーウイルスベクターにより担持される発現可能な異種ＤＮＡは抗原性産物をコードする。もう１つの具体例において、それは、生物学的に活性のある蛋白のごとき生物学的に活性のある産物をコードする。好ましくは、以下の説明および実施例においてより詳細に説明するように、蛋白はＩＬ−４またはＩＬ−１０のごときサイトカインである。詳細には、本発明の好ましい態様は、少なくとも１種の異種遺伝子を個体中の標的器官または器官システムに治療的にデリバリーするための、生体工学により得られるウイルスに指向され、該ウイルスはコクサッキーウイルスＢ３を含み、該コクサッキーウイルスＢ３はカージオトロピックであり、弱毒化されおり、ＣＶＢ３のゲノムは少なくとも１種の異種遺伝子をコードしている。さらに本発明は、（１）免疫転調遺伝子を含有するコクサッキーウイルスベクターを個体に投与することを含む、個体における免疫応答を抑制する方法、および（２）抗原性エピトープに関する遺伝子を含有するコクサッキーウイルスを個体に投与することを含む、個体にワクチン接種する方法を提供する。遺伝子デリバリー用途には、分子生物学、遺伝子治療および薬学の当業者は、過度の実験を行うことなく、本発明新規コクサッキーウイルス遺伝子デリバリーベクターの適当な用量および投与経路を決定することができよう。本発明の１の特別な目的は、一時的な感染において免疫転調蛋白および／または抗原性エピトープをデリバリーして、感染性のウイルスによる心臓疾患を予防、改善および／または除去することを促進するための、有効な遺伝子移行ベクターとしての人工的に弱毒化されたカージオトロピックウイルスベクターの使用である。本発明は、弱毒化カージオトロピックウイルスベクターによりデリバリーされた免疫抑制サイトカインの治療的使用による、心臓移植拒絶反応の軽減または完全な消失を包含する。本発明は、種々の器官の他の炎症性疾患または症状に対しても同様に適用可能である。よって、この態様において、本発明は、３つの要素を必要とする。第１に、弱毒化ＣＶＢ３ウイルスベクターが提供されなくてはならない。第２に、ＣＶＢ３ウイルスベクターは、サイトカインのごとき免疫転調蛋白を発現できるものでなくてはならない。第３に、ベクターは、免疫転調蛋白を標的組織にデリバリーし、疾病の徴候の軽減を観察可能なものにすることができるものでなくてはならない。これら３つの要素は本発明において提供される。５'ＮＴＲ全体を非コクサッキーエンテロウイルスの５'ＮＴＲと置換することにより、心臓疾患に関して完全に弱毒化されるまでＣＶＢ３の心臓毒性が低減された。ネズミのサイトカインＩＬ−４（ｍＩＬ−４）が弱毒化ＣＶＢ３株の読み枠中で発現され、生物学的に活性のあることが示された。膵臓毒性ＣＶＢ４株を接種してから１〜３日後のマウスにＣＶＢ３キメラ発現ｍＩＬ−４を接種すると、ＣＶＢ４により誘発された膵臓疾患が消失した。これらのデータは、本発明の炎症性疾患に対するユニークな治療アプローチを例示するものであり、下記実施例において詳細に説明される。下記実施例は、本発明の種々の具体例を説明する目的で示され、何ら本発明を限定するものではない。実施例１マウスの心臓疾患に関するＣＶＢ３の人工的弱毒化関連エンテロウイルスの５'ＮＴＲを交換することができ、ポリオウイルスタイプ１の５'ＮＴＲをＣＶＢ３のいくつかまたはすべてと置換した場合、生きた子孫ウイルスが得られることが示されている（Johnson V．H.，and B．L．Semle r，Virology 162(1):47-57(1988);およびSemler B．L.，et al.，Proc-NATl Aca d Sci USA 83(6):1777-1781(1986)）。本発明のために、５'および／または３' 非翻訳領域（ＮＴＲ）配列においてキメラなゲノムを有する種々のＣＶＢ３株を、ポリオウイルスタイプ１から構築した。ＰＶ１／Ｍａｈｏｎｅｙ由来の５'ＮＴＲおよびＣＶＢ３／２０由来のゲノムの残の部分からなる構築物を、本発明の検討において最も多く使用した。このキメラウイルス(ＣＰＶ／４９)を５代継代し、配列分析を行ったところ、供与ポリオウイルス５'ＮＴＲにおける遺伝学的変化は生じていなかった。心臓毒性ＣＶＢ３の５'ＮＴＲを神経毒性ＰＶ１Ｍａｈｏｎｅｙ株由来のホモログと置換したところ、（ａ）５'ＮＴＲのＰＶ配列を維持することに関して、細胞培養において遺伝学的に安定な子孫ウイルス；および（ｂ）マウスにおいて心筋炎を誘発する能力が非常に弱められた子孫ウイルスが生じ、それらは親の心臓毒性ＣＶＢ３／２０株と比較して、マウス心臓において複製して３〜４ｌｏｇ弱い力価となる。この弱毒化にもかかわらず、接種マウスにおいてＣＶＢ３に対する抗体力価が誘導され、マウスが心臓毒性ＣＶＢ３株の接種により攻撃された場合、心臓疾患が予防される。これらのデータは、ＰＶ１由来の５'ＮＴＲで置換されてキメラとなったＣＶＢ３ウイルス株は、マウスおよび動物において測定した場合、心臓疾患に関して安定に弱毒化されたＣＶＢ３株を生じ、そのうえ、心臓毒性ＣＶＢ３感染による攻撃による心臓疾患を予防することにより、ワクチン株として作用する。よって、かかるウイルス株は、本発明で企図されるデリバリーシステムとして作用する。さらに、非心臓毒性ＣＶＢ３株（ＣＶＢ３／０）が心臓毒性に関して弱毒化される機構がマッピングされ、同定された。無毒および心臓毒性ＣＶＢ３株の完全ヌクレオチド配列を比較し、潜在的な遺伝学的部位を試験するように設計された一連のタイプ内キメラウイルスを分析することにより、単一部位ヌクレオチド２３４がこれらのウイルス株における心臓毒性に影響する唯一の部位であることが示された（Tu Z.，et al.，J．Virol．69:4607-4618(1995)）。心臓毒性株においてヌクレオチド２３４はＵであり、無毒株においてはＣである。ネズミの心臓細胞におけるアッセイにより、当該２種の株におけるウェスタンブロットされたウイルス蛋白の相違はわずかであるか、あるいは検出可能な相異はないことが示されたが、ウイルスＲＮＡ転写速度において少なくとも１０倍の相違が確認された。さらなる研究により、感染細胞中のネガティブウイルスＲＮＡに対するポジティブウイルスＲＮＡの割合は通常高いものであるが、ヌクレオチド２３４がＵでなくてＣである場合、その割合が有意に変化してほとんど同じとなることが示された。さらに２つの観察結果により、ある種の５'ＮＴＲ配列の変化が弱毒化を引き起こすことが明らかとなった。１つは、ヌクレオチド２３４ＵがＧへと変異すると、ヌクレオチド２３４Ｃについて観察されたのと同様の機構により弱毒化が起こると思われることである。もう１つは、ＰＶ１／Ｍａｈｏｎｅｙにおけるこの同じヌクレオチドのＧへの変異もまた、ＨｅＬａ細胞において親ウイルスよりも強力には増殖しないウイルス株を生じることである。ヌクレオチド２３４は、いままで試験されたすべてのすべてのエンテロウイルスＲＮＡにおいてＵとして保存されており（Chapman N．M.，et al.，J．Med．Virol．52:258-261，1997）、また、周囲の５個のヌクレオチド５'−ＣＧＵＵＡ(ヌクレオチド２３４に下線を付した)も同様に保存されているので、一般的には、この部位での変異はエンテロウイルスの健康にとり有害であると思われる。ＰＶ１配列を用いて５'ＮＴＲにおいてキメラとなっており、相当するＰＶのヌクレオチド２３４においてＵからＧへの変異を有しているＣＶＢ３株は、安定に弱毒化された(おそらく非常に毒性が弱い)ＣＶＢ３株を生じ、それは、上記の安定に弱毒化されたＣＶＢ３／ＰＶ１キメラよりも心臓毒性株に復帰しにくい。これらのキメラＣＶＢ３株は本発明ウイルスデリバリーベクターに適しており、ベクターにおいて、ネズミのインターロイキンが人工的に弱毒化されたＣＶＢ３株の読み枠中で発現される。実施例２ＣＶＢ３読み枠からの生物学的に活性のあるネズミＩＬ−４の発現の成功本発明により企図される１のウイルスベクター構築物を図１に示す。移植された心臓に対する急性の拒絶反応には、まず、Ｔｈ１タイプのＴ細胞応答が関与し、十分に研究されているＣＶＢ３により誘導される炎症性心臓疾患のネズミモデルにおけるＣＶＢ３による急性心筋炎の誘導において観察されるのと同じタイプのＴ細胞応答である。Ｔｈ２タイプの応答への応答のスイッチングは、同時に疾病の消失を引き起こす。Ｔｈ２タイプの応答の増大についての興味が増したので、ネズミＩＬ−４遺伝子（ｍＩＬ−４）の発現を選択した。使用ウイルスベクターはＣＶＢ３／０の感染性ｃＤＮＡクローンであり、ＣＶＢ３／０株は、ヌクレオチド２３４における変異（ＵからＣ）によりネズミの心臓疾患に関して効果的に弱毒化されたＣＶＢ３株である。ｍＩＬ−４配列は、発現されたインターロイキン蛋白の細胞外への輸送を容易にするためのシグナル配列を含んでいた(Sider as P.，et al.，Adv Exp Med Biol 213:227-236(1987)参照)。ｍＩＬ−４インサートに隣接して、ＣＶＢ３プロテアーゼ２Ａにより認識されるのと同じ配列を組み込んだ。ｍＩＬ−４インサートにプロテアーゼ２Ａ認識開裂部位をコードする隣接配列を加えたものを、カプシド蛋白１Ｄおよびプロテアーゼ２Ａのジャンクションにおいてイン−フレームで組み込んだ。ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした場合、構築物は子孫ウイルス（ＣＶＢ３／０−ＩＬ４）を生じた。逆転写酵素によるＰＣＲ、ついで、アンプリマーの配列決定による配列分析により、子孫ウイルスがインサートを含み、ウイルスの読み枠が維持されていることが確認された。ＨｅＬａ細胞中で５代継代（その後、すみやかに欠失が起こる）してスロットブロット分析を行うことによりウイルスＲＮＡ中のｍＩＬ−４コーディング配列が容易に検出された(図５)。これは、プロテアーゼ２Ａ開裂部位を複製するように処理された７２ヌクレオチドのダイレクトリピート（図１参照）中での組み換えによる可能性が最も高い。このことは、予想されなかったことである。ＣＶＢ３／０ゲノムがｍＩＬ−４コーディング配列を欠失すると、より迅速に複製が起こり、すみやかに優性類似種になると考えられる。このことは、ＣＶＢ３ＲＮＡによるブロットに反映されるのかもしれない。後期の継代は、試料中にウイルスＲＮＡがわずかに多いことを示唆している。ＨｅＬａ細胞においてＣＶＢ３／０−ＩＬ４株により発現されたネズミＩＬ− ４をＥＬＩＳＡにより確認した。ウイルスをＨｅＬａ細胞に接種し、感染１時間後に洗浄することにより過剰のウイルスを除去し、細胞に再度養分を与えた。接種後の特定の時点において上清を取り、ついで、同体積の新鮮培地に入れて細胞を凍結した。凍結および融解し、遠心分離により細胞残渣を除去した後、市販ネズミＩＬ−４用ＥＬＩＳＡテスト（BioSource International，Inc.）を用いて細胞培地試料および細胞フラクションをアッセイした。ＣＶＢ３／０−ＩＬ４はｍＩＬ−４を対照バックグラウンドよりも十分多く細胞内に生じさせ、６時間で培養物中３００ｐｇ／ｍｌに達し、１ｍｌあたり１０⁶ＴＣＩＤ₅₀ユニットのウイルスが得られた。当該ウイルスに感染させ、培地で洗浄し、６〜８時間培養し、ついで、凍結および融解したＨｅＬａ細胞から得た上清を用いて、ＣＶＢ３／０−ＩＬ４により発現されたネズミＩＬ−４の生物学的活性を評価した。ＭＴＴアッセイ（Mosman n T.，J Immunol Methods 65(1-2):55-63(1983);およびGieni S，et al.，J Imm unol Methods 187(1):85-93(1995)）を用い、組み換えｍＩＬ−４を標準物質として、ＭＣ／９マウス肥満細胞の増殖を誘導する能力について細胞残渣を除去した上清をアッセイした。ＣＶＢ３／０−ＩＬ４ＨｅＬａ培養物は３ユニット／ｍｌ（２５０ｐｇ／ｍｌの組み換えｍＩＬ−４と等価）を生じた。これは、心臓移植患者の冠状静脈洞血液中の濃度（229pg/ml;Fyfe A，et al.，J Am Coll Cardiol 21(1):171-176(1993)と比肩しうるレベルである。現在に至るまで、これらは、インターロイキンがうまくクローン化され、エンテロウイルスの読み枠中で発現されたことを示す唯一のデータである。実施例３ｍＩＬ−４発現ＣＶＢ３を用いる治療による、マウスにおいてＣＶＢ４により誘発された膵臓疾患の軽減エンテロウイルスにより誘発された炎症性疾患を軽減させるＣＶＢ３−ＩＬ４株の能力についての最初の試験において、炎症性疾患インデューサーとして毒性ＣＶＢ４株を使用した。二重感染マウスにおいて中和抗体がＣＶＢ３−ＩＬ４の複製を減じるかもしれないという可能性（Beck M.，et al.，Am．J．Pathol．13 6:669-681(1990)）を最小にするために、異なるＣＶＢセロタイプを選択した。ＣＶＢ４−Ｖと命名されたＣＶＢ４株は、マウス膵臓細葉細胞の重大な破壊を繰り返し誘発できるようになるまで無毒株ＣＶＢ４／Ｐをマウス中で繰り返し継代することにより誘導された(Ramsingh A.，et al，Virus Res 23(3):281-292(199 2))。このウイルスにより誘発された膵臓疾患は、膵臓における毒性とウイルス複製の程度との間の相関関係の欠如ならびに宿主の遺伝学的背景への依存状態に基づく免疫成分を有する可能性がある。さらに、ＣＶＢ４／ＶはオスのＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（ＣＶＢ３による炎症性心臓疾患の研究に常套的に使用されている）において膵臓毒性があることも示されている（Kiel R．J.，et al.，European Journal of Epidemiology 5:348-350(1989)参照）。ＣＶＢ３／０−ＩＬ４がこのＣＶＢ４株により誘発された膵臓疾患に有効かどうかを調べるために、表１に示す実験を行った。表１：ＣＶＢ４／ＣＶＢ３実験のアウトラインならびに感染１０日目に観察された疾患数／全膵臓数の結果０日目の接種１日目の接種３日目の接種マウス数 10日目の膵臓疾患培地せずせず３なし（３） CVB3/0 せずせず４軽症（１）重症（３） CVB3/0-IL4 せずせず８なし（７）軽症（１） CVB4/V せずせず５重症（５） CVB4/V CVB3/0 せず５中程度（１）重症（４） CVB4/V せず CVB3/0 ４重症（４） CVB4/V CVB3/0-IL4 せず９軽症（２）中程度（５）重症（２） CVB4/V せず CVB3/0-IL4 １０軽症（２）中程度（４）重症（４）簡単に説明すると、０．１ｍｌの無添加培地中の５ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀ユニットのＣＶＢ４をマウスに接種した。１日後または３日後、同用量のＣＶＢ３／ＩＬ４（トランスフェクション後２代目のウイルスストック）をマウスに接種した。対照マウスには親のＣＶＢ３／０（ＩＬ−４インサートおよび２Ａ開裂部位インサートがない）を同時期に接種した。それ以外に、ウイルス不含の無添加培地または以下の単一種ウイルスを含む無添加培地をマウスに接種した：ＣＶＢ３／ＩＬ４、ＣＶＢ４／ＶまたはＣＶＢ３／０。感染１０日目に膵臓をホルマリン中で固定し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ついで、顕微鏡観察した。観察された病気のタイプの例を図６に示す。ＣＶＢ４／Ｖのみを接種されたすべてのマウスは大きな膵臓のダメージを受けた（表１）。ＣＶＢ４、ついで、感染１日目また１ま３日目のいずれかにＣＶＢ３／０−ＩＬ４を接種されたマウスは、疾病の拡張が有意に抑制された。感染（ＣＶＢ４での感染）１日目または３日目にＣＶＢ３／０−ＩＬ４を接種されたマウスからの膵臓組織間においては有意な相異が観察されなかった。ＣＶＢ４／Ｖを接種され、ついで、１日目または３日目に弱毒化された親のＣＶＢ３／０株を接種されたマウスは、ＣＶＢ４／Ｖのみを接種されたマウスと区別できない膵臓を呈した。よって、最初に膵臓毒性ＣＶＢ４／Ｖ、ついで、感染１日目または３日目にＣＶＢ３／０−ＩＬ４を接種されたマウスにおいて観察された膵臓のダメージの軽減は、キメラＣＶＢ３株中のｍＩＬ−４の発現によるものである。さらに、ＣＶＢ３／０−ＩＬ４構築物は膵臓に対して毒性がなかった。ＣＶＢ３／０は心臓疾患に関して完全に弱毒化されているとしても、それは有意かつ広範なネズミ細葉細胞の破壊を引き起こす。ＣＶＢ３／０のみを接種されたマウスは有意な膵臓ダメージを示したが、ＣＶＢ３／０ゲノムにおけるｍＩＬ− ４コーディング配列の存在により、マウスにおいて膵臓疾患を誘発しないウイルスが得られたことは注目すべきことである。ＣＶＢ４により引き起こされた膵臓疾患の、ＣＶＢ３／０−ＩＬ４キメラの投与による軽減を示す上記データと合わせると、これらのデータは、エンテロウイルスにより引き起こされる膵臓疾患の軽減に対する有益な役割と矛盾しない。実施例４５'非翻訳領域における２つの点突然変異によるコクサッキーウイルスＢ３複製の抑制実施例１において、我々は、エンテロウイルスゲノムの複製にとり重要と思われる、ＣＶＢ３ゲノムのヌクレオチド２３４周辺の保存された５個のヌクレオチドの領域について記載した。この実施例において、エンテロウイルスの５'非翻訳領域中の当該５'−ＣＧＵＵＡ(ヌクレオチド２３２〜２３６)の完全な保存性に関する分子的根拠について調べる。十分に特徴づけられたエンテロウイルスモデル系を用い、標準的方法による部位特異的突然変異法を用いてＣＶＢ３５'非翻訳領域中のヌクレオチド２３３（Ｇ→Ｃ）およびヌクレオチド２３６（Ａ→Ｕ）における点突然変異を作成した。二重変異体（ｐＣＶＢ３−８８）をＨｅＬａ細胞中にエレクトロポレーションし、子孫ウイルス（ＣＶＢ３／８８）をＨｅＬａ細胞において連続的に６代継代した。各継代において得られたウイルスを１工程増殖曲線およびヌクレオチド配列分析においてアッセイしら。３代目の継代の前に、ＣＶＢ３／８８は非常に弱毒化され、かろうじて検出可能な力価を示した。３代目のＣＶＢ／８８は３時間後に対数期の複製に入り、親（対照）ＣＶＢ３株よりも１００倍低い最終力価を示した。４代目は複製速度が改善され、最終力価は親ウイルスよりも１０倍低かった。ＣＶＢ３／８８の５代目は本質的に親株と区別できなかった。ＲＴ−ＰＣＲを用いるＣＶＢ３／８８ＲＮＡの直接配列分析により、５代目までに完全な復帰が起こったことが示されたが、４代目のウイルスはヌクレオチド２３３における部分的な復帰（Ｇ／Ｃ）およびヌクレオチド２３６における完全な復帰（Ｕ→Ａ）を示した。３代目は両方の位置における部分的な復帰を示した。野生型の複製速度および有効性の再獲得は、変異の野生型配列への復帰と直接相関関係がある。最初の弱毒化の程度、ならびに同時に起こる復帰の速度は、ウイルスゲノムの他の場所で生じる強力な補正的変異に対抗するものであり、この５個のヌクレオチドの並びが有効なエンテロウイルスの複製のために絶対的に保存されたものであるという以前の証拠と矛盾しない。生きた、弱毒化ウイルスは、培養細胞における数代の継代により野生型に復帰するとしても、ワクチンまたは遺伝子デリバリービヒクルとして有用であることに注目すべきである。実際、生きた、弱毒化ポリオウイルスは野生型への復帰を示すが、これらは多年にわたり非常に成功した経口ワクチンとして使用されている。正常個体はウイルスに対する免疫応答を起こし、ウイルスが複製して重要標的組織（例えば、ニューロン）において発病レベルに達する機会を得る前にウイルスを系外に除去するので、生きた個体への１回の投与後の復帰の危険性は低い（培養細胞中での数回の継代とは逆に）。結果として、生きた、弱毒化ポリオウイルスは、それが培養細胞における継代後に野生型に復帰するとしても、有効なワクチンである。同様に、培養において野生型に復帰しうる、コクサッキーウイルスおよび他のエンテロウイルスの生きた、弱毒化形態もやはり有効であり、種々の目的に有用であろう。実施例１で説明したＣＰＶ／４９のごとき、より復帰傾向の小さいウイルスは、復帰傾向のある弱毒化ウイルスが不適切である場合に有用でありうる。本明細書において述べられた特許または刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示すものである。さらに、これらの特許および刊行物は、参照により、本明細書に記載されているものともなされる。当業者は、本発明が目的達成に十分なものであり、述べられた目的および利点、ならびに本明細書固有の目的および利点を得るに十分なものであることを容易に理解するであろう。本明細書記載の実施例、ならびに方法、手順、処理、分子、および特定の化合物は、目下のところ好ましい具体例の典型例であり、それらは例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その中での変更および他の使用が当業者によりなされるであろうし、それらは請求の範囲により画定される本発明の精神の範囲内のものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ０７Ｋ 14/54 // Ａ６１Ｋ 38/00 16/00 Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チャップマン，ノーラ・エムアメリカ合衆国68104ネブラスカ州オマハ、ノース・フィフティサード・ストリート 1622番 (72)発明者コルベック，ピーターアメリカ合衆国95608カリフォルニア州カーマイケル、キングズフォード・ドライブ 1416番 (72)発明者マローン，ジェイムズアメリカ合衆国68106ネブラスカ州オマハ、サウス・フィフティース・ストリート3420 番

Claims

【特許請求の範囲】１.異種核酸を標的細胞、組織または器官にデリバリーするためのウイルスベクターであって、弱毒化コクサッキーウイルスをコードするように修飾されたコクサッキーウイルスのゲノムを含み、さらに該ゲノムが少なくとも１種の発現可能な異種核酸を挿入するための少なくとも１つのクローニング部位を含むものであるウイルスベクター。２.コクサッキーウイルスのゲノムがコクサッキーウイルスＢのゲノムである請求項１のベクター。３.コクサッキーウイルスのゲノムがコクサッキーウイルスＢ３のゲノムである請求項２のベクター。４.コクサッキーウイルスのゲノムが、ゲノムの転写調節領域を変化させることによって修飾されている、請求項３のベクター。５.転写調節領域がゲノムの５'非翻訳領域を含むものである請求項４のベクター。６.ポリオウイルスおよびエコーウイルスからなる群より選択される非エンテロウイルスのゲノムの５'非翻訳領域で５'非翻訳領域が置換されている、請求項５のベクター。７.ゲノムの位置２３４のウラシルヌクレオチドがシトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドにより置換されている請求項５のベクター。８.ゲノムの位置２３３のグアニンヌクレオチドがシトシンヌクレオチドにより置換され、ゲノムの位置２３６のアデニンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドにより置換されている請求項５のベクター。９.クローニング部位がカプシド蛋白のコーディング配列とウイルスプロテアーゼのコーディング配列との間にある、請求項１のベクター。１０.クローニング部位がゲノムの読み枠の開始点に置かれ、挿入された発現可能な異種ＤＮＡが翻訳開始コドンおよびウイルスプロテアーゼにより認識される３'配列を含むようにクローニング部位が構築されている、請求項１のベクター。１１.発現可能な異種ＤＮＡが抗原性産物をコードしている請求項１のベクター。１２.発現可能な異種ＤＮＡが生物学的に活性のある産物をコードしている請求項１のベクター。１３.生物学的に活性のある産物が蛋白である請求項１２のベクター。１４.蛋白がサイトカインである請求項１３のベクター。１５.少なくとも１種の異種遺伝子を個体中の標的器官または器官系に治療的にデリバリーするための、生体工学により得られるウイルスであって、コクサッキーウイルスＢ３を含み、該コクサッキーウイルスＢ３が弱毒化されており、該ＣＶＢ３のゲノムが少なくとも１種の異種遺伝子のコーディング領域を含むものであるウイルス。１６.転写機構によって該コクサッキーウイルスＢ３が弱毒化されている請求項１５の生体工学により得られるウイルス。１７.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノムがベーシックなＣＶＢ３／０ゲノムを含み、該異種遺伝子のコーディング配列がカプシド蛋白コーディング配列とウイルスプロテアーゼコーディング領域部位との間に挿入されている、請求項１６の生体工学により得られるウイルス。１８.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノムがベーシックなＣＶＢ３／０ゲノムを含み、該異種遺伝子のコーディング配列が、カプシド蛋白１Ａのすぐ上流に挿入されていて、開始コドンＡＵＧで開始し、ウイルスプロテアーゼにより認識される配列で終了するものである、請求項１６の生体工学により得られるウイルス。１９.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノム中のヌクレオチド２３４の位置においてウラシルヌクレオチドがシトシンヌクレオチドとなっている、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２０.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノム中のヌクレオチド２３４の位置においてウラシルヌクレオチドがグアノシンヌクレオチドとなっている、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２１.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノムの５'非翻訳領域が非エンテロウイルス由来のゲノムの５'非翻訳領域と置換されている、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２２.該非エンテロウイルスがポリオウイルスおよびエコーウイルスからなる群より選択されるものである、請求項２１の生体工学により得られるウイルス。２３.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノムが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８からなる群より選択される１またはそれ以上の配列を含むものである、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２４.該コクサッキーウイルスＢ３のゲノムのカプシドコーディング領域が少なくとも１種の異種遺伝子で置換されている、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２５.該少なくとも１種の異種遺伝子が免疫転調遺伝子である請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２６.該免疫転調遺伝子がサイトカインである請求項２５の生体工学により得られるウイルス。２７.該サイトカインがＩＬ−４およびＩＬ−１０からなる群より選択されるものである請求項２６の生体工学により得られるウイルス。２８.７種までのサイトカイン遺伝子を含む請求項１５の生体工学により得られるウイルス。２９.該少なくとも１種の異種遺伝子が抗原性エピトープをコードしている、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。３０.異種免疫転調遺伝子および抗原性エピトープをコードする異種遺伝子を含む、請求項１５の生体工学により得られるウイルス。３１.請求項２５の生体工学により得られるウイルスを個体に投与する工程を含む、個体における免疫応答の抑制方法。３２.請求項２９の生体工学により得られるウイルスを個体に投与する工程を含む、個体へのワクチン接種方法。