KR20180135913A - 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체 그리고 그 방법 및 용도 - Google Patents
살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체 그리고 그 방법 및 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180135913A KR20180135913A KR1020187031480A KR20187031480A KR20180135913A KR 20180135913 A KR20180135913 A KR 20180135913A KR 1020187031480 A KR1020187031480 A KR 1020187031480A KR 20187031480 A KR20187031480 A KR 20187031480A KR 20180135913 A KR20180135913 A KR 20180135913A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ires
- virus
- ala
- leu
- val
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36161—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/36162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y02A50/51—
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
구체예들은 여기서 모기 세포에서 복제 불가능하고 모기 벡터에 의한 전염이 불가능한 살아있는 약독화된 알파바이러스에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스 생성 방법, 그 구조체 및 면역원성 조성물에서 이들 살아있는 약독화된 알파바이러스의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함하는 약학 조성물 및 이러한 살아있는 약독화된 알파바이러스 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 알파바이러스 감염에 대한 백신과 같이 휴대용 용도를 위한 키트에서의 이들 조성물의 용도 및 그 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 살아있는 약독화된 알파바이러스는 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스이다.
Description
우선권
본 PCT 출원은 미국 가특허출원 제62/316,264호(2016.03.31. 출원)에 대하여 35 USC § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 여기에 참조로 수록된다.
발명의 분야
구체예들은 여기서 모기 세포에서 복제 불가능하고 모기 벡터에 의한 전염이 불가능한 살아있는 약독화된 알파바이러스에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 그 구조체의 생성 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는 약독화된 알파바이러스는 알파바이러스에 의한 감염에 대한 면역원성 조성물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함하는 약학 조성물 및 이러한 살아있는 약독화된 바이러스 제조 방법에 관한 것이다. 일부 구체예는 알파바이러스 감염에 대한 면역원성 조성물과 같이 휴대용 용도를 위한 키트에서의 이들 조성물의 용도 및 그 방법에 관한 것이다. 여기에 개시된 특정 구체예는 재조합 알파바이러스 구조체에 관한 것이다.
배경
병원성 바이러스 감염을 예방하기 위한 백신은 인간 질병의 발생률을 줄이기 위해 효과적으로 사용되었다. 바이러스 백신에 사용되는 가장 성공적인 기술 중 하나는 약화되거나 약독화된 바이러스 균주("살아있는 약독화된 바이러스(live, attenuated virus)")를 동물 또는 사람에게 면역하는 것이다. 면역조치 후 제한된 복제로 인하여, 약독화된 균주는 숙주 또는 기타 대상체에서 질병을 일으키지 않는데 왜냐하면 균주가 변형되었기 때문이다. 그러나, 이 제한된 바이러스 복제는 바이러스 항원의 전체 레퍼토리를 표현하기에 충분하며 그러한 백신을 받는 대상체에서 바이러스에 대한 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 발생할 수 있다. 따라서, 바이러스의 병원성 균주에 후속 노출시, 면역화된 개체는 바이러스에 의해 유발되는 질병으로부터 보호될 수 있다. 이들 살아있는 약독화된 바이러스 백신은 여러 중에서 공중 보건에서 사용되는 가장 성공적인 백신이다.
토가바이러스 ( Togaviridae ) 과의 알파바이러스 속은 다수의 중요한 인간 및 동물 병원균을 함유한다. 이들 바이러스는 남극 지방을 제외하고 모든 대륙에 광범위하게 분포되어 있으며, 중요한 공중 보건 위협체를 대표한다. 대부분의 알파바이러스는 모기에 의해 전달되고, 여기서 이들은 균주에서 오랜-수명 감염의 원인이 된다. 그들의 혈액 섭취 동안 모기에 의해 감염된 척추동물에서, 알파바이러스는 급성 감염을 일으킬 수 있으며, 이는 새로운 모기 감염의 전제조건인 바이러스혈증 및 이의 자연에서의 연속 순환을 특징으로 한다.이들 바이러스에 대한 백신은 한정되어 있다.
백신 제형에서 사용되는 유전적으로 변형된 바이러스가 모기 벡터에 의해 매개되는 자연 순환계에 도입될 수 있고, 모기에서 장기간의 복제 동안 또는 척추동물 숙주에서 바이러스혈증 발달 동안 추가 진화를 보일 수 있다는 건강 문제가 있다. 따라서, 백신에서 사용되는 살아있는 바이러스 균주의 신규 생성을 설계할 때, 모기와 같은 이들의 벡터에 의해 분포되는 것이 불가능한 약독화된 바이러스를 만드는 것이 중요하다.
개요
구체예들은 여기서 모기 세포에서 복제 불가능하고 모기 벡터에 의한 전염이 불가능한 살아있는 약독화된 알파바이러스에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스 생성 방법, 그 구조체 및 면역원성 조성물에서 이들 살아있는 약독화된 알파바이러스의 용도에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 여기에 개시된 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함할 수 있는 약학 조성물 및 이들 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 휴대용 응용분야 및 방법을 위한 키트에서 알파바이러스에 대한 이들 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는, 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 하나의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에 적어도 하나의 바이러스의 내부 리보솜 도입 부위가 삽입된, 알파바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosome entry site, IRES) 서열은 포유류 세포에서 유전자의 전사/발현을 가능하게 하는 알파바이러스의 게놈에 삽입된 서로 다른 IRES 서열을 포함할 수 있다. 이들 IRES 서열은, 대조적으로, 곤충 세포에서 본질적으로 발현이 불가능하다. 특정 구체예에서, 상이한 IRES 서열은, 비제한적으로, 유형 I로 지정된 피코르나바이러스로부터의 하나 이상의 IRES 서열(예컨대 엔테로바이러스: 하위유형, 엔테로바이러스 71 (EV71) 및 하위유형, 인간 라이노바이러스 (HRV)) 및/또는 유형 II IRES 서열로 지정된 피코르나바이러스로부터의 하나 이상의 IRES 서열(예컨대, 카르디오바이러스: 하위유형, EMCV IRES 이외의 더일로바이러스 (TMEV), 및 아프토바이러스: 하위유형, 구제역 바이러스 (FMDV))를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, IRES 서열은 플라비바이러스에서 유래하거나 발견되는 하나 이상의 IRES 서열(예컨대, 하위유형, 헤파시바이러스 (HCV))을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는 전술한 바와 같이 IRES 서열의 삽입에 부가하여 비활성화된 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 비활성화된, 서브게놈 프로모터는 돌연변이유발, 점 돌연변이, 결실 및 삽입(예컨대, 골격구조이동(frameshift)을 초래하지 않는 것 또는 번역의 특정 영역이 보존되는 것) 등과 같은 해당 분야에서 공지된 임의 방법에 의해 비활성화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 말단과 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에서 서브게놈 RNA의 5' UTR의 결실에 의해 비활성화될 수 있다.또 다른 구체예, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스의 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 서브게놈 RNA의 5'UTR에 위치한 알파바이러스 핵산 내의 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 서브게놈 프로모터 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며 여기서 돌연변이는 비구조적 단백질 4의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 변형시키지 않는다. 또 다른 구체예에서, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 알파바이러스의 비-구조적 단백질의 어느 하나 내에서 적응형 돌연변이를 더욱 포함할 수 있으며, 여기서 적응형 돌연변이는 바이러스 복제, 방출 및 바이러스 역가를 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 살아있는 약독화된 바이러스는 살아있는 약독화된 바이러스의 번역을 최적화하기 위한 코돈 최적화를 위한 조작(manipulation)을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 모기 및 모기 세포에서 복제가 불가능한 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 포유동물 및 포유류 세포에서의 발현이 가능하다.
또 다른 구체예, 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 알파바이러스 구조체는, 비제한적으로, 알파바이러스 예컨대 치쿤구니야(chikungunya) 바이러스, 오뇽뇽(o'nyong'nyong) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 서부 말 뇌염(Western equine encephalitis) 바이러스 또는 코로나바이러스(Coronaviridae) 및 토가바이러스(Togaviridae) 과(families)의 또 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 복합체는, 비제한적으로, 베바루(Bebaru) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 하위유형: 우나(Una) 바이러스, 오뇽 뇽(O'Nyong Nyong) 바이러스: 하위유형: 이그보-오라(Igbo-Ora) 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타(Getah) 바이러스; 하위유형: 사지야마(Sagiyama) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스를 포함한다. 특정 구체예에서, 살아있는 약독화된 알파바이러스 및/또는 알파바이러스 구조체는 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스일 수 있다.
특정 구체예에서, 벡터는 여기에 개시된 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.일부 구체예는 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 벡터를 발현할 수 있는 숙주 세포를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 알파바이러스 구조체는 약학 조성물의 일부일 수 있으며 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 구조체는 약학 조성물의 일부로서 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 알파바이러스 구조체에 대한 면역 반응을 유발하기 위하여 대상체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 여기에 개시된 약학 조성물은 대상체에 1회 이상의 복용량으로 투여하기 위하여 사용되는 백신 조성물의 일부일 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 대상체는 인간 대상체(예컨대 성인 또는 소아 또는 유아) 또는 가축 예컨대 말, 소, 낙타, 알파카 또는 또 다른 가축 동물 또는 애완동물일 수 있다.
특정 구체예에서, 여기에 개시된 면역원성 알파바이러스 조성물은 알파바이러스의 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드의 혼합물일 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 면역원성 알파바이러스 조성물은 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 다양한 폴리펩타이드의 유무에 관계 없이 여기에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 방법은 살아있는 약독화된 알파바이러스의 약학적으로 허용되는 면역원성 조성물의 1회 이상의 복용량을 대상체에, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 경피, 경구, 흡입, 질내, 국소적, 비강내 또는 직장 또는 또 다른 공지된 응용방법을 포함하는 모든 허용되는 방법에 의해 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 면역원성 제형은 1회 복용량 또는 2회 이상의 복용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역원성 제형은 서로 약 365일(1년) 이하 이내에, 서로 약 120일 이하 이내에, 서로 약 90일 이하 이내에, 서로 약 60일 이하 이내에, 서로 약 30일 이하 이내에, 및 서로 약 30일 미만 이내에, 투여될 수 있다. 또 다른 구체예, 2회 이상의 복용량이 대상체에 동일자에 동일하거나 상이한 해부학적 위치에서 제공될 수 있다. 또 다른 구체예, 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체는 1회 또는 수 회 복용량으로 대상체에 투여하기에 적합한 또 다른 백신과 혼합될 수 있으며, 예를 들어, 병원성 바이러스를 옮길 수 있는 모기에 감염된 풍토병 지역에 진입하는 여행자에게 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스, 구조체 및 조성물은 비제한적으로, 여기에 개시된 적어도 1종의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스 또는 구조체와 적어도 하나의 용기를 포함하는 키트의 일부일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 키트는, 비제한적으로, 1종 이상의 안정화제, 식염수 또는 완충액, 및/또는 전달 장치를 더욱 포함할 수 있다. 위에서 언급한 구체예 중 임의 것이 목표를 달성하기 위해 출원인에 의해 결합될 수 있음에 유의하라.
도면의 간단한 설명
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 구체예의 특정 양상을 더욱 설명하기 위해 포함된다. 구체예는 여기에 제시된 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일부 구체예의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성시키는 개략적 방법을 예시한다.
도 2는 본 발명의 일부 구체예의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성시키는 대안적인 개략적 방법을 예시한다.
도 3은 양성 및 음성 대조군과 비교하여 포유류 세포에서 성장된 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 그래프 도표를 나타낸다.
도 4는 곤충 세포에서 성장된 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 그래프 도표를 나타낸다.
도 5는 양성 대조군과 비교할 때 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 판형 형태를 도시한다.
도 6은 연구 백신 및 살아있는 약독화된 알파바이러스의 양성 대조군과 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스에 대한 중화 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 양성 대조군 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 연구 백신과 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 중화 역가 범위를 나타내는 표이다.
도 8은 양성 대조군 알파바이러스 구조체와 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 다양한 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체의 약학 조성물의 투여 이후 야생형 알파바이러스에 의한 접종 후 예상되는 중화 역가 범위를 나타내는 표이다.
도 9는 IRES 삽입을 갖는 여러 알파바이러스의 대표적인 배열을 나타낸다.
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 구체예의 특정 양상을 더욱 설명하기 위해 포함된다. 구체예는 여기에 제시된 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일부 구체예의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성시키는 개략적 방법을 예시한다.
도 2는 본 발명의 일부 구체예의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성시키는 대안적인 개략적 방법을 예시한다.
도 3은 양성 및 음성 대조군과 비교하여 포유류 세포에서 성장된 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 그래프 도표를 나타낸다.
도 4는 곤충 세포에서 성장된 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 그래프 도표를 나타낸다.
도 5는 양성 대조군과 비교할 때 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 판형 형태를 도시한다.
도 6은 연구 백신 및 살아있는 약독화된 알파바이러스의 양성 대조군과 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스에 대한 중화 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 양성 대조군 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 연구 백신과 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 특정한 살아있는 약독화된 알파바이러스의 중화 역가 범위를 나타내는 표이다.
도 8은 양성 대조군 알파바이러스 구조체와 비교하여 본 발명의 일부 구체예의 다양한 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체의 약학 조성물의 투여 이후 야생형 알파바이러스에 의한 접종 후 예상되는 중화 역가 범위를 나타내는 표이다.
도 9는 IRES 삽입을 갖는 여러 알파바이러스의 대표적인 배열을 나타낸다.
서열의 상세한 설명
SEQ ID NO:1은 CHIKV-EV71 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:2는 CHIKV-HRV2 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:3은 CHIKV-FMDV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:4는 CHIKV-TMEV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:5는 CHIKV-HCV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:6은 EV71 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:7은 HRV2 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:8은 FMDV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:9는 TMEV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:10은 HCV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:11은 CHIKV-HAV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:12는 CHIKV-FGF1 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:13은 HAV IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:14는 FGF1 IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이며; SEQ ID NO:15는 여기에 개시된 특정 구체예에서 사용되는 프라이머의 DNA 서열의 예이며; SEQ ID NO:16은 여기에 개시된 특정 구체예에서 사용되는 프라이머의 DNA 서열의 예이며; SEQ ID NO:17은 여기에 개시된 특정 구체예에서 사용되는 프로브의 DNA 서열의 예이며; SEQ ID NO:18은 CHIK-IRES의 일부 구조적 폴리펩타이드를 나타내며; SEQ ID NO:19는 CHIK-IRES 비-구조적 폴리펩타이드의 비-구조적 폴리펩타이드를 나타내며 그리고 SEQ ID NO:20은 EMCV-IRES의 폴리뉴클레오타이드 서열의 예이다.
예시적인 구체예의 설명
정의
여기서 사용되듯이, 부정관사 ("a") 또는 ("an")은 항목 중 하나 이상을 의미할 수 있다.
여기서 사용되듯이, "약"은 최대 및 이를 포함하여 ± 5%를 의미할 수 있고, 예를 들어, 약 100은 95 및 최대 105를 의미할 수 있다.
여기에 사용되듯이, "약독화된 바이러스(attenuated virus)"는 동물에게 투여될 때 질병의 임상 증상이 감소되거나 전혀 나타내지 않는 바이러스를 의미할 수 있다.
상세한 설명
이하의 섹션에서, 다양한 예시적인 조성물 및 방법이 다양한 구체예를 상세히 설명하기 위해 기재된다. 다양한 구체예를 실시하는 것이 여기에 설명된 특정 세부사항 전부 또는 일부의 사용을 필요로하지 않고, 오히려 농도, 시간 및 기타 특정 세부사항이 일상적 실험을 통해 수정될 수 있음이 해당 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 경우에 따라, 잘 알려진 방법이나 구성요소가 설명에 포함되지 않은 경우도 있다.
여기에 개시된 구체예에 따르면, 해당 분야의 기술 내에서 통상적인 분자 생물학, 단백질 화학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986)를 참조하라.
여기에 개시된 특정 구체예는 살아있는 약독화된 알파바이러스의 신규한 구조체에 관한 것이다.이들 구체예에 따르면, 이들 살아있는 약독화된 알파바이러스는 척추동물 세포에서 효율적으로 복제 가능하나, 곤충 세포에서는 발현이 감소되어 나타나지 않았다. 일부 구체예에서, 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는, 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 하나의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에 적어도 하나의 바이러스의 내부 리보솜 도입 부위가 삽입된, 알파바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, IRES 서열은 포유류 세포에서 유전자의 발현을 유도할 수 있는 구조체를 생성할 수 있는 상이한 IRES 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상이한 IRES 서열은, 비제한적으로, 유형 I로 지정된 피코르나바이러스로부터의 하나 이상의 IRES 서열(예컨대 엔테로바이러스: 하위유형, 엔테로바이러스 71 (EV71) 및 하위유형, 인간 라이노바이러스 (HRV)) 및/또는 EMCV IRES 이외의 유형 II IRES 서열로 지정된 피코르나바이러스로부터의 하나 이상의 IRES 서열(예컨대, 카르디오바이러스: 하위유형, 더일로바이러스(TMEV) 및 아프토바이러스: 하위유형, 구제역 바이러스(FMDV))를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, IRES 서열은 플라비바이러스에서 유래하거나 발견되는 하나 이상의 IRES 서열(예컨대, 하위유형, 헤파시바이러스 (HCV))을 포함할 수 있다. 여기에 개시된 구조체는 EMCV IRES 삽입을 갖지 않음에 유의하라.
또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 비활성화된 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 여기에 개시된 IRES 삽입을 포함할 수 있으며 또한 관심 알파바이러스(예컨대 CHIK)의 돌연변이 또는 또 다른 형태의 비활성화에 의한 비활성화된 서브게놈 프로모터를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 생존가능하며 고도로 약독화된 표현형으로서 특성화될 수 있으며 한편, 예를 들어, 대상체에서 알파바이러스 감염을 감소 또는 예방하기 위해 투여될 때 대상체에서 알파바이러스에 대한 면역 반응을 복제 및 유도할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 비활성화된, 서브게놈 프로모터는 돌연변이유발, 점 돌연변이, 결실, 삽입(예컨대, 골격구조이동(frameshift)을 초래하지 않는 것 또는 번역의 특정 영역이 보존되는 것) 등과 같은 해당 분야에서 공지된 임의 방법에 의해 비활성화될 수 있다. 또 다른 구체예, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 서브게놈 RNA의 5'UTR에 위치한 알파바이러스 핵산 내의 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 서브게놈 프로모터 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며 여기서 돌연변이는 비구조적 단백질 4의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 변형시키지 않는다. 또 다른 구체예, 약독화된 재조합 알파바이러스는 알파바이러스의 비-구조적 단백질의 어느 하나 내에서 적응형 돌연변이를 더욱 포함할 수 있으며, 여기서 적응형 돌연변이는, 예를 들어, 제조 목적을 위하여, 바이러스 복제, 바이러스 방출 및/또는 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 조직 배양이나 또는 배아에서 계대배양(passaging)에 의한 알파바이러스의 약독화(attenuation)는 알파바이러스의 구조적 및 비구조 유전자에서, 그리고 바이러스 게놈의 시스-작용 요소(cis-acting element)에서 점 돌연변이를 유도할 수 있다. 또한, 돌연변이는 화학적 돌연변이유발에 의해 증가될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA+ 바이러스의 감염성 cDNA 클론의 서열을 변경함에 따른 유전자 조작은 바이러스 게놈의 안정하고 중요한 변형(예컨대 결실, 삽입, 역전, 돌연변이)을 발생시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 야생형 또는 또 다른 곤충-감염성 게놈 서열로, 또는 변이체의 면역원성을 향상시킬 수 있는 추가적인 유전 물질로 역전하는 것을 매우 어렵게 하거나 또는 불가능하게 한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 모기 및 모기 세포에서 복제가 불가능한 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 포유동물 및 포유류 세포에서의 발현이 가능하다.
또 다른 구체예, 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 알파바이러스 구조체는, 비제한적으로, 알파바이러스 예컨대 치쿤구니야(chikungunya) 바이러스, 오뇽뇽(o'nyong'nyong) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 서부 말 뇌염(Western equine encephalitis) 바이러스 또는 코로나바이러스(Coronaviridae) 및 토가바이러스(Togaviridae) 과(families)의 또 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다.또 다른 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 복합체는, 비제한적으로, 베바루(Bebaru) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 하위유형: 우나(Una) 바이러스, 오뇽 뇽(O'Nyong Nyong) 바이러스: 하위유형: 이그보-오라(Igbo-Ora) 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타(Getah) 바이러스; 하위유형: 사지야마(Sagiyama) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스를 포함한다. 특정 구체예에서, 살아있는 약독화된 알파바이러스 및/또는 알파바이러스 구조체는 치쿤구니야 바이러스이다. 또 다른 구체예에서, 병원성 알파바이러스에 대한 약학 조성물은 대상체에 투여하기 위한 상용성 조합 약학 조성물에서 다수의 살아있는 약독화된 알파바이러스 또는 또 다른 살아있는, 약독화된 또는 사멸된 바이러스를 포함할 수 있다.
알파바이러스는 가축의 질병을 포함하여 상당수의 인간 및 동물 질병을 일으키는 작고, 구형이며, 외피형(enveloped)이며, 양-방향(positive-sense) RNA 바이러스이다. 예를 들어, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV; 토가바이러스 ( Togaviridae ): 알파바이러스)는 최근에 아프리카와 아시아에서와 같이 전세계 수백만 명의 사람들이 관여된 폭발적인 도시 창궐을 일으킨 아보바이러스(arboviral) 병원체이다. 이들 바이러스에 대한 살아있는 아보바이러스 백신 균주는 절지동물 벡터에 의해 전염이 가능해서는 안되는데, 왜냐하면 보유 숙주 사이에서의 순환이 증가된 병독성 및 적어도 또 다른 숙주로의 전염 기회를 포함하는 예상치 못한 변화로 이어질 수 있기 때문이다. 이전의 위험은 텍사스로 한정되었던 가축유행병(epizootic)/유행병(epidemic) 밖의 지역인 루이지애나에서 1971년 동안 수집된 모기에서의 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) TC-83 백신 균주의 발견에 의해 강조되었다. 이러한 백신 균주, VEEV TC-83은 모기 세포에서 복제 가능하고, 백신접종 이후 모기를 감염시킬 수 있으며; 따라서, 모기에 의한 전염 가능성은 여전히 남아있다.
특정 구체예에서, 여기에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 벡터는 여기에 개시된 살아있는 약독화된 알파바이러스 또는 구조체를 생성시키기 위해 사용되는 것으로 고려된다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스 또는 알파바이러스 구조체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예는 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 벡터를 발현할 수 있는 숙주 세포를 포함할 수 있다. 이들 구조체를 발현할 수 있는 임의 벡터가 여기에 개시된 방법을 위하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 하나 이상의 알파바이러스 구조체는 약학 조성물의 일부일 수 있으며 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 약학 조성물의 일부를 형성하는 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 구조체는 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스 또는 알파바이러스 구조체에 대한 면역 반응을 유발하기 위하여 대상체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 여기에 개시된 약학 조성물은 대상체에 1회 이상의 복용량으로 투여하기 위하여 사용되는 백신 조성물의 일부일 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 대상체는 인간 대상체(예컨대 성인 또는 소아 또는 유아) 또는 가축 또는 또 다른 동물 예컨대 말, 소, 낙타, 알파카, 동물원이나 야생의 동물 또는 가축화된 동물 또는 애완동물일 수 있다.
특정 구체예에서, 여기에 개시된 면역원성 알파바이러스 조성물은 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드의 혼합물일 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 면역원성 알파바이러스 조성물은 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 다양한 폴리펩타이드의 유무에 관계 없이 여기에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 방법은 여기에 개시된 약학적으로 허용되는 면역원성 조성물의 1회 또는 그 이상의 복용량을 공지된 방식으로 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 투여 방식은 비제한적으로 조성물을 대상체에 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 경피, 경구, 흡입, 질내, 국소적, 비강내 또는 직장으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 면역원성 제형은 1회 복용량 또는 2회 이상의 복용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역원성 제형은 촉진제로서 서로 약 365일(1년) 이하 이내에, 서로 약 120일 이하 이내에, 서로 약 90일 이하 이내에, 서로 약 60일 이하 이내에, 서로 약 30일 이하 이내에, 및 서로 약 30일 미만 이내에, 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 대상체는 성인, 소아 또는 유아 또는 동물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 면역원성 조성물은 피하 또는 피부내 또는 비강내로 대상체에 어느 한 날에 투여되고 이어서 첫 번째 복용 이후 30일 또는 최대 6개월 내지 1년 이내의 다른 날에 두 번째 복용으로 촉진으로 투여될 수 있다.
현재 치쿤구니야에 대한 백신이나 치료제가 거의 없기 때문에, 이러한 바이러스의 창궐은 단지 모기 벡터에 대한 사람들의 노출을 방지하고 질병의 증상을 치료함으로써 통제될 수 있다. 1980년대에, 월터 리드 육군 연구소(Walter Reed Army Institute of Research)의 과학자들은 181/클론 25 (이하 181-25라고 함)라고 하는 연구 백신을 생산했다. 이러한 살아있는, 약독화된 균주는 야생형 CHIKV 균주의 연속적인 플라크-대-플라크(plaque-to-plaque) 계대(passage)를 통해 생성되었다. 바이러스는 설치류와 비인간 영장류 모두에서 약독화되어 있으며 인간에서 면역원성이 높다. 그렇지만, 이러한 181-25 균주는 2기 임상 시험에서 경미하고 일시적인 관절통을 일으켰으며 자연 모기 벡터, Ae . Aegyptus 에 의해 실험적으로 전염되는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 포르말린-비활성화된 백신은 비싸고 비효율적이다. 이러한 백신은 또한 여러 번, 반복된 백신접종을 요구할 수도 있다. 따라서, CHIKV에 대한 개선된 면역원성제(immunogenic agent)의 필요성이 존재한다.
알파바이러스에 대하여 풍토적인 자원-제한적 국가에서 효율적이며 유행병과 싸우기 위해서, 이상적인 알파바이러스 백신은 1회 복용 이후 신속하고 장기간의 면역성을 유발하고, 반응성(reactogenicity) 및 병독성으로의 역전의 낮은 위험을 가지며, 저렴하여야 한다. 특히 비-유행병 지역에서 사용될 때 바이러스 혈증이 발생하는 경우, 면역된 사람으로부터 모기를 통한 전염의 낮은 위험성을 가져야 한다. 복제-결함이 있는 면역원성 후보군이 안전성을 강조하는 것으로 기술되어 있으나, 1회 복용 이후 신속하거나 장기간의 면역성을 유발하는 것으로 밝혀진 것은 없으며, 일부는 생산하는데 고비용일 수도 있다.
여기의 특정 구체예는 포유류 세포에서는 복제 가능하지만 모기 및 모기 세포에서는 복제 불가능한 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함한다. 이들 구체예에 따르면, 이러한 구조체는 EMCV IRES 서열 이외의 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 모든 IRES 서열이 EMCV IRES에 대하여 치환 가능한 것은 아닌데 왜냐하면 몇몇 서열이 원하는 표현형을 달성하는 것에 실패했기 때문임을 유의해야 한다. 특정 IRES 서열을 신중하게 선택하고 다양한 외래종의 특정 IRES 서열의 제어하에 알파바이러스 복제의 번역 제어를 배치함으로써, 본 명세서의 살아있는 약독화된 알파바이러스가 달성되었다. 이들 구체예에 따르면, 외인성 IRES 서열은 EMCV IRES를 제외하지만, 비제한적으로, 플라비바이러스, 피코르나바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 부니야바이러스, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 페스티바이러스, 칼리시바이러스, 레오바이러스, 파르보바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 및/또는 폭스바이러스의 IRES 서열을 포함할 수 있다. 미국 특허 제8,426,188호를 참조하며, 그 명세서는 본 명세서의 명시적인 교시와 모순되지 않는 정도에서 그 전체로 참고문헌으로 수록된다.
피코르나바이러스(Picornaviridae)는 정이십면체 캡시드(icosahedral capsid)를 갖는 비-외피형(non-enveloped) 양성 가닥(positive strand) RNA 바이러스이며, 이는 많은 공지된 인간 및/또는 동물 질병을 일으킨다. 피코르나바이러스는, 다른 바이러스보다 인간을 더욱 자주 감염시키는 라이노바이러스; 지난 수년간 수백만 명을 마미시키거나 사망시킨 폴리오바이러스; 및 전 세계의 전용 연구소의 개설을 유발시킨 구제역 바이러스를 비롯하여, 일부 주목할만한 멤버를 포함한다.
피코르나바이러스는, 캡-의존성 번역이 손상되었을 때 mRNA에서 캡-비의존성 번역 개시를 제어하는 능력과 결합된 시스-작용(cis-acting) RNA 조절 서열인, 내부 리보솜 도입 부위 (IRES) 요소를 함유한다. 피코르나바이러스 IRES 서열은 그 1차 및 2차 구조에 따라 세 가지 유형으로 분류된다. 유형 I IRES 서열을 갖는 피코르나바이러스는, 비제한적으로, 엔테로바이러스: 하위유형, 엔테로바이러스 71 (EV71), 인간 라이노바이러스 (HRV), 인간 엔테로바이러스 A (HEV), 콕사키바이러스 B (CVB) (인간 엔테로바이러스 B), 폴리오바이러스 (PV) (인간 엔테로바이러스 C), 소(bovine) 엔테로바이러스 (BEV)를 포함한다. 유형 II IRES 서열을 갖는 피코르나바이러스는, 비제한적으로, 아프토바이러스: 하위유형, 구제역 바이러스 (FMDV), 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스 (ERAV), 및 소 비염(bovine rhinitis) B 바이러스 (BRBV); 카르디오바이러스: 하위유형, 더일로바이러스 (TMEV) 및 뇌심근염(encephalomyocarditis) 바이러스 (EMCV); 에르보바이러스: 하위유형, 말 비염(equine rhinitis) B 바이러스 (ERBV); 파레초바이러스: 하위유형, 인간 파레초바이러스 (HPeV); 코부바이러스: 하위유형, 아이치 바이러스 (AiV); 아비시바이러스, 코사바이러스, 및 훈니바이러스를 포함한다. 이들 IRES 유형은 숙주 단백질 요구사항뿐만 아니라 도입 부위와 관련하여 개시 코돈의 위치가 다르다. A형 간염 바이러스(HAV)의 IRES는 또 다른 피코르나바이러스의 그것과 다르며 그룹(유형 III)을 자체적으로 구성한다.
일부 구체예에서, 유형 I 또는 유형 II 피코르나바이러스 IRES 서열은 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스에 사입될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 비-피코르나바이러스로부터의 IRES 서열을 포함할 수 있다. 이러한 비-피코르나바이러스 IRES 서열은, 비제한적으로, 플라비바이러스: 하위유형, 하파시바이러스 (HCV), 페스티바이러스, 디시스트로바이러스, 및 레트로바이러스로부터의 IRES 서열을 포함할 수 있다. 이들 IRES 서열 중 일부는 여기에 개시된 면역원성 조성물을 위하여 사용되는 알파바이러스 구조체를 생성하는데에 성공적으로 사용되었다.
또 다른 구체예, 살아있는 약독화된 알파바이러스 및 알파바이러스 구조체는, 비제한적으로, 알파바이러스 예컨대 치쿤구니야(chikungunya) 바이러스, 오뇽뇽(o'nyong'nyong) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 서부 말 뇌염(Western equine encephalitis) 바이러스 또는 코로나바이러스(Coronaviridae) 및 토가바이러스(Togaviridae) 과(families)의 또 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다.또 다른 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 복합체는, 비제한적으로, 베바루(Bebaru) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 하위유형: 우나(Una) 바이러스, 오뇽 뇽(O'Nyong Nyong) 바이러스: 하위유형: 이그보-오라(Igbo-Ora) 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타(Getah) 바이러스; 하위유형: 사지야마(Sagiyama) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스 또는 그 조합 또는 또 다른 살아있는 약독화된 바이러스 제형과의 조합을 포함한다.
여기에 개시된 일부 구체예는 모기 또는 또 다른 곤충 세포에서 복제 불가능한 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함할 수 있다.특정 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 말단과 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에서 서브게놈 RNA의 5' UTR의 결실에 의해 비활성화될 수 있다.또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 서브게놈 프로모터 내의 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 서브게놈 RNA의 5'UTR에 위치한 핵산의 클러스터 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 비-구조적 단백질의 야생형 아미노산을 보존하면서 동의 돌연변이(synonymous mutation)를 사용하여 비활성화될 수 있다. 하나의 실시예에서, 알파바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 서브게놈 프로모터는 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 유사한 클러스터된 점 돌연변이가 또 다른 알파바이러스의 서브게놈 프로모터를 비활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 클러스터된 점 돌연변이는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열의 7474, 7477, 7480, 7481, 7483, 7486, 7489, 7492, 7495, 7498, 및/또는 7501-7503 위치에서 둘 이상의 돌연변이의 동의 점 돌연변이(synonymous point mutation)를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 및 SEQ ID NO:5 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터를 비활성화시키는데 사용되는 클러스터된 점 돌연변이는 상기 언급된 돌연변이 중 예컨대 2개 이상, 4개 이상, 6개 이상 또는 알파바이러스 표적의 서브게놈 프로모터에서 최대 12개 돌연변이 모두와 같은, 역전을 감소 또는 방지하기 위한 충분한 수이다. 여기에 개시된 특정 구체예에서 알파바이러스들은 유전적으로 유사하다(예를 들어, 도 9, 일부 알파바이러스의 배열 참조).
여기에 개시된 일부 구체예는 포유류 세포에서는 발현되는 것이 가능하지만 모기 및 모기 세포에서는 복제 불가능한 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스의 제조 방법을 포함한다. 이들 구체예에 따르면, 이러한 살아있는 약독화된, 재조합 알파바이러스는 돌연변이를 알파바이러스 게놈에 도입하고, 알파바이러스의 구조적 단백질(구조적 단백질들)의 캡-의존성 번역을 비활성화시키고, 그리고 척추동물 기원의 세포에서 번역을 선택적으로 개시하는 IRES를 구조적 유전자의 상류에 있는 알파바이러스 게놈으로 클로닝함으로써 생성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스는 a) 외피 글리코단백질(envelope glycoprotein) 유전자의 하류에 그리고 알파바이러스의 3' UTR의 상류에 위치하는 캡시드 유전자; b) 외피 글리코단백질 유전자의 3' 말단과 상기 위치된 캡시드 유전자 사이에 도입된 적어도 하나의 IRES 여기서 상기 유전자는 외피형 글리코단백질 유전자, 삽입된 IRES, 위치된 캡시드 유전자 및 3' UTR로 5' 에서 3'로 위치함; 및 c) 위치된 캡시드가 IRES-의존성 방식으로 번역되는 반면에 IRES-비의존성 방식으로 번역되며 IRES의 상류에 위치하는 외피 글리코단백질 유전자;를 포함할 수 있다.
도 1을 참고하면, 알파바이러스의 게놈이 도시되며, 개략도가 나타내는 알파바이러스는 4개의 비-구조적 단백질(nsP1-4) 및 3개의 주요 구조적 단백질(캡시드, E1, 및 E2 외피 글리코단백질)을 인코딩한다. 복제 동안, 2개의 구별되는 RNA가 생성되는데: 게놈 및 서브게놈 RNA이다. 서브게놈 RNA는, 감염 중에, nsP4 유전자의 3' 말단에서 발견될 수 있는 서브게놈 프로모터(SG 프로모터)로부터 늦게 전사된다. 일부 구체예는 외인성 바이러스 또는 인간/포유동물 IRES(예컨대, 피코르나바이러스 및/또는 플라비바이러스)의 IRES 서열을 알파바이러스 cDNA 클론의 SG 프로모터의 직접 하류에 삽입시킴으로써, 모기 세포에서 복제 불가능한, 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성하는 방법을 포함한다(도 1; 중간 그림). 여기에 개시된 또 다른 구체예는 또한 비활성화된 SG 프로모터를 갖는, 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서브게놈 프로모터는 비활성화될 수 있다(예컨대 하나 이상의 점 돌연변이, 도 1 아래부분). 비활성 SG 프로모터를 갖는 이러한 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 모기 요소-의존성 번역으로 되돌릴 수 없다는 측면에서 안정적이다. 이러한 역전은 IRES 결실뿐만 아니라 기능성 서브게놈 프로모터의 복원을 필요로 할 수 있기 때문에 이는 매우 드문 경우이다.
이제 도 2를 참조하면, 여기에 개시된 일부 구체예는, 3' UTR의 바로 상류의 서브게놈 영역의 3' 말단에 캡시드 유전자를 유지하면서, IRES 서열을 외피 글리코단백질 유전자의 하류에 배치시킴으로써, 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 생성하는 방법을 포함할 수 있다. (도 2; 버전 2). 이러한 전략에 의해 생산되는 이들 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 활성 서브게놈 프로모터를 유지할 수도 있다. 이러한 실시예에서, 캡-의존성 방식으로 번역된 외피형 단백질 유전자 및 IRES-의존성 방식으로 번역된 캡시드 단백질을 갖는 서브게놈 메시지가 만들어질 수 있다. 여기에 개시된 또 다른 구체예는 비활성 SG 프로모터를 갖는, 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스를 포함할 수 있다. 여기에 개시된 하나의 약독화 전략에 기초하여, 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스가 사전에 설계되었으며, 이는 유전자 발현을 변경하고 알파바이러스를 약독화시키기 위해 뇌심근염 바이러스 (EMCV) IRES를 사용하였다. 하나의 살아있는 약독화된 알파바이러스인 IRES 삽입이 있는 치쿤구니야에서, 클러스터된 점 돌연변이가 서브게놈 프로모터를 비활성화시키기 위해 사용되었고, IRES는 구조적 단백질 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류에서 유전자간 영역에 삽입되었다. 두 번째 버전의 CHIKV/IRESv2는 야생형 서브게놈 프로모터을 유지하였으나 캡시드 단백질 유전자를 외피형 단백질 유전자의 하류에 그리고 IRES의 뒤에 위치시켰다. 일부 구체예에서, 여기서 제시되는 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 개시된 바와 같이 약독화된 전략을 사용하여 살아있는 약독화된 바이러스의 이러한 버전을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제8,426,188호를 참조하며, 그 명세서는 본 명세서의 명시적인 교시와 모순되지 않는 정도에서 그 전체로 참고문헌으로 수록된다. EMCV IRES 서열을 사용하는 이러한 기존의 구조체를 고려하면, 놀랍게도 모든 IRES 서열이 사전에 설계된 구조체에서 사용될 수 있는 것은 아니라는 것이 발견되었다. 또한, EMCV IRES가 속하는 모든 피코르나바이러스 유래 IRES 서열이 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스에서 적합한 대체물은 아니었다. 단지 특정한 IRES 서열만이 생존력을 유지하면서 알파바이러스를 약독화시키기 위해 살아있는 약독화된 알파바이러스에서 기능을 한다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 시험된 유형 I 및 유형 II 피코르나바이러스 IRES 서열 중 일분만이 기능성 구조체를 생성하였으며 유형 III 피코르나바이러스 IRES (HAV, A형 간염) 서열은 작동하지 않았다. 또한, 세포성 FGF(예컨대, 포유동물) IRES 서열은 또한 여기에 개시된 구조체에 삽입될 때 생존가능한 알파바이러스를 생산하는데 실패했다.
IRES 서열은 RNA에서 생성된 2차 구조의 광범위한 스템-루프/헤어핀 서열(stem-loop/hairpin sequence)을 포함한다. 이러한 구조들은 모든 IRES 유형에서 공유되지 않으며, 실제로 세 가지 유형(유형 I, II, 및 III) 사이에 상당히 다르다. 그렇지만, 유형 III은 2차 구조에 있어서 유형 I 및 II와 더욱 극적으로 다르다. 어느 번역 인자가 IRES 구조에 결합하고 이들 프로모터로부터 폴리펩타이드 생성을 개시할 수 있는지에 영향을 미칠 수 있다(또한, Martinez-Salas E. et al., Picornavirus IRES elements: RNA structure and host protein interactions, Virus Research, vol. 206, pp. 62-73, 2015를 참조하고, 그 명세서는 본 명세서의 명시적인 교시와 모순되지 않는 정도에서 그 전체로 참고문헌으로 수록된다.) 또한, 세 가지 유형의 피코르나바이러스 IRES 서열 내의 또 다른 구조적 차이가 여기에 개시된 면역원성 조성물에서 사용되는 알파바이러스 구조체를 생성할 때 상이한 효과에 기여할 수 있는 것으로 보인다.
약학 조성물
여기의 구체예는 생물학적으로 호환되는 형태로 필요한 대상체에 투여하기 위한 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 생체 내 투여에 적합한 생물학적으로 호환되는 형태는 임의의 독성 효과에 비하여 활성 작용제의 치료 효과가 더 크도록 투여되는 활성 작용제 형태(예컨대 특정 구체예의 살아있는 약독화된 알파바이러스 조성물)일 수 있다. 치료 조성물의 치료적 활성 양의 투여는 복용시에 그리고 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 시간 기간 동안 효과가 있는 양으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 화합물의 치료적 활성 양은 개인의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 개인에서 원하는 반응을 유발하는 제형 능력과 같은 요인에 따라 다를 수 있다. 복용 요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다.
일부 구체예에서, 여기에 개시된 조성물(예컨대 일부 구체예의 약학적 면역원성 조성물)은, 비제한적으로, 피하, 정맥내, 경구 투여, 흡입, 경피 투여, 피부내 투여, 질내 투여, 국소 투여, 비강내 또는 직장 투여를 비롯하여, 이러한 조성물에 대하여 작동하는 임의의 공지된 방식에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 조성물은 피하 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 조성물은 피하 또는 근육내 또는 피부내 또는 비강내 투여 또는 최초 복용과 촉진 요법의 조합에 의해 투여될 수 있다.
면역원성 조성물은 상기 조성물과 함께 투여되는 적절한 담체 또는 희석제 내에서 대상체에 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 여기에 사용되듯이 식염수 또는 수용성 완충 용액과 같은 희석제를 포함하는 것으로 의도된다. 여기에 개시된 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체는 또한 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액이 또한 HEPES 완충액 또는 또 다른 적절한 완충액과 같은 적절한 완충액에서 제조될 수 있다. 통상적인 조건의 저장 및 사용에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유할 수도 있다.
투여에 적합한 약학 조성물은 해당 분야에서 공지된 모든 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분삭액 및 멸균 분말 또는 동결건조/동결-건조 케이크가 사용될 수도 있다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균될 수 있고 용이한 주사가능성이 존재할 정도로 유동성일 수 있다. 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 더욱 보존성일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 이들의 적절한 조합을 함유하는 용매, 안정화 조성물 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
멸균 주사 용액은 활성 화합물을 적절한 용매 또는 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 필요한만큼 혼합한 다음 멸균함으로써 제조될 수 있다.
제형화하는 경우, 용액은 복용 제형과 호환가능한 방식으로 치료 효과가 있는 양으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 환자의 건강 또는 복지에 대해 단일 또는 누적적으로 유익한 효과를 갖는 생물학적 활성 화합물의 양이다. 상기 제형은 앞서 기술된 주사가능 용액의 유형과 같이, 다양한 복용 형태로 용이하게 투여된다. 서방형 캡슐(slow release capsule), 지연-방출형 미세입자(timed-release microparticle) 등이 또한 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다.
살아있는 약독화된 바이러스 백신이 효과적이기 위해서는, 이들은 면역접종 후 복제가 가능해야 한다. 바이러스를 비활성화시키는 모든 요소가 살아있는 약독화된 알파바이러스를 손상시킬 수 있다. 일반적으로 사용되는 백신 중 일부는 극한 온도에 민감하며; 과도한 열 또는 우발적인 동결은 백신을 비활성화시킬 수 있다. 분포 전반에 걸쳐 이러한 "콜드 체인(cold chain)"을 유지하는 것은 알파바이러스에 대한 풍토가 있는 자원-제한 국가에서 특히 어렵다. 특정 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 액체 또는 수성 제형 또는 냉동 또는 동결건조된 형태로 저장되어 이들 알파바이러스의 퇴화 또는 비활성화를 감소 또는 방지할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스는 실온(예컨대 약 20℃ 내지 약 25℃ 또는 심지어 40℃까지) 또는 냉장 온도(예컨대 약 0℃ 내지 약 10℃)에서 연장된 시간 동안 안정성을 유지하기 위해 다양한 첨가제를 사용하여 제형화될 수 있다. 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스의 퇴화 또는 비활성화를 감소시키는 첨가제는, 비제한적으로, 탄수화물 및/또는 아미노산이 있는 HEPES(예컨대 약 10.0 내지 약 200 mM HEPES) 또는 PBS 완충액 또는 또 다른 적절한 완충액을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 단백질제가 제형에 첨가될 수 있으며 이는, 비제한적으로, 젤라틴 또는 본질적으로 비활성인, 감소된 알러지 또는 면역원성 반응을 갖는 약제를 포함할 수 있다. 여기서 또 다른 구체예는 수성 및/또는 재구성된 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스의 저온(예컨대 냉장 또는 냉동 저장)에 대한 요구를 감소시키고 유통 기간을 증가시키는 것에 관한 것이며 여기서 살아있는 약독화된 알파바이러스를 보존하기 위하여 사용되는 제형은 HEPES 완충액 또는 또 다른 적절한 완충액을 포함할 수 있다.
활성 치료제는 복용량 당 표적 알파바이러스에 대한 면역 반응(예컨대 중화 항체 생산)을 유발하는 플라크 형성 단위(plaque forming unit, PFU)에 의해 측정된 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함할 수 있는 혼합물 내에 제형화될 수 있다. 단일 복용량 또는 다중 복용량이 또한 사전 결정된 상황에 대한 적절한 계획으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 복용량은 여기에서 고려되는 바이러스에 노출되기 이전에, 도중에 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, log PFU는 조성물이 투여되는 대상체에 따라 변할 수 있다. 복용량 당 PFU의 범위는 2 Log10 내지 8 Log10일 수 있다.특정 구체예에서, 복용량 범위는 대상체에서 알파바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 투여될 때 3Log10 내지 6Log10일 수 있거나 또는 건강 전문가에 의해 적합한 것으로 밝혀진 또 다른 복용량일 수 있다.
특정 구체예에서, 여기에 사용되는 살아있는 약독화된 알파바이러스 면역원성 조성물은 약학 조성물의 일부일 수 있으며 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 혼합물로 제시되는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함할 수 있다. 이들 구체예에 따르면, 여기에 개시된 조성물은 이러한 치료가 필요한 대상체를 치료하기 위해 또는 알파바이러스에 대한 노출에 의해 야기된 장애 또는 감염의 시작의 예방을 위해 사용될 수 있다.
키트
일부 구체예에서, 여기에 개시된 살아있는, 약독화된 재조합 알파바이러스, 구조체 및 조성물은 비제한적으로, 여기에 개시된 적어도 1종의 살아있는, 약독화된, 재조합 알파바이러스 또는 구조체와 적어도 하나의 용기를 포함하는 키트의 일부일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 키트는, 비제한적으로, 1종 이상의 안정화제, 완충액, 및/또는 전달 장치를 더욱 포함할 수 있다. 키트는 여기에 개시된 조성물과 함께 전달되기에 적합한 1종 이상의 추가 약제를 또한 포함할 수 있다.
키트는 이를 필요로하는 대상체에에서 사용되는 적절하게 분액된 조성물을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 여기서 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수되거나 수성일 수도 있다. 여기에 고려된 키트는 특정 제형에 따라 여기에 개시된 실온 또는 냉장 온도에서 저장될 수도 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 조성물이 배치될 수 있는, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함 할 것이다. 추가 구성요소가 제공되는 경우, 키트는 또한 일반적으로 이 약제 또는 구성요소가 배치될 수 있는 하나 이상의 추가 용기를 포함할 것이다. 여기서 키트는 전형적으로 또한 상업적 판매를 위한 밀폐 상태로 약제, 조성물 및 기타 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 보유되는 주입 또는 블로우-성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
실시예
여기에 제시된 특정 구체예를 보여주기 위해 아래 실시예들이 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 여기에 개시된 실시예에서 기능을 하는 것으로 밝혀진 기술을 나타내므로, 그 실시를 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것은 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자는, 본 개시에 비추어, 본 명세서의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 개시된 특정 구체예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야한다.
실시예
1
플라스미드 생성 및 서열분석
하나의 예시적인 방법에서, 비활성화 돌연변이를 사용하여 제거된 서브게놈 프로모터를 갖는 EMCV IRES를 함유하는 CHIKV cDNA 클론(CHIKV/IRES= EMCV IRES-함유 양성 대조군 바이러스)이 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되었는데 여기서 앞서 기술된 라 리유니온(La Reunion) 균주의 감염성 클론이 템플레이트 및 아래 개시되는 또 다른 구조체에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 서브게놈 프로모터의 비활성화가 위치-특이성 돌연변이유발을 사용하여 수행되었다. 서브게놈 프로모터를 통하여 nsP4 유전자의 3' 말단을 인코딩하는 중간 구조체가 Finnzymes(Espoo, Finland)사로부터 입수한 높은 충실도의 푸션(Phusion) DNA 폴리머라제가 있는 PCR을 사용하여 생성되었다. 생성된 앰플리콘(amplicon)을 셔틀 벡터, prS2로 클로닝시키고, 빅다이(BigDye) 키트(예컨대 Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 서열화하였다. LR 균주로부터의 캡시드 유전자의 5' 말단을 IRES 서열에 대하여 상보적인 오버행(overhang)을 갖는 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 이어서 IRES-함유 및 캡시드 단편을 융합 PCR을 사용하여 결합시키고, 이 단편을 셔틀 벡터로 역으로 클로닝하고 재서열화하였다. IRES/캡시드 단편 및 돌연변이된 서브게놈 단편을 최종적으로 두 단편 내로 도입된 스펠 부위(SpeI site)를 통해 함께 연결시켰다. 완성된 삽입부를 LR 백본(LR backbone)으로 클로닝하고 이 최종 구조체를 완전히 서열화했다.
또한, 비활성화 돌연변이(예컨대, EV71 및 HRV)를 사용하여 비활성화된 서브게놈 프로모터를 갖는 피코르나바이러스 유형 I IRES 서열을 함유하는 CHIKV cDNA 클론, 비활성화 돌연변이(예컨대, FMDV 및 TMEV)를 사용하여 비활성화된 서브게놈 프로모터를 갖는 피코르나바이러스 유형 II IRES 서열을 함유하는 CHIKV cDNA 클론, 비활성화 돌연변이(예컨대, HAV)를 사용하는 비활성화된 서브게놈 프로모터를 갖는 피코르나바이러스 유형 III IRES 서열을 함유하는 CHIKV cDNA 클론, 비활성화 돌연변이(예컨대, HCV)를 사용하여 제거된 서브게놈 프로모터를 갖는 비-피코르나바이러스 IRES 서열을 함유하는 CHIKV cDNA 클론, 및 비활성화 돌연변이(예컨대, FGF1)를 사용하는 비활성화된 서브게놈 프로모터를 갖는 비-바이러스성, 포유동물 IRES를 함유하는 CHIKV cDNA 클론이 앞서 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되었다.
실시예
2
RNA 전사, 형질주입, 및 바이러스 생성
대규모 플라스미드 정제를 음이온 교환 컬럼을 사용하여 수행하였다. 정제된 DNA를 그 후 NotI 제한 엔도뉴클레아제(예컨대 New England BioLabs, Ipswich, MA)를 사용하여 선형화하고, 선형화를 확인하기 위하여 소규모 샘플을 1.2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 분석했다. 나머지 DNA를 아비온(Ambion) SP6 체외 전사 키트를 사용하여 전사시켰다. RNA를 정량화하고 BTX ECM 830 전기천공기를 사용하여 베로(Vero) 세포를 전기천공하는데 사용하였다. 간단히 말해, 90% 융합(confluent) 베로(Vero) 세포를 함유한 2개의 T-150 플라스크를 트립신처리하고 무-RNase DPBS에서 3번 세척하였다. 세포를 700 μl의 DPBS에 재현탁시키고 10 μg의 RNA를 첨가하였다. 용액을 4mm 큐벳에 넣고 250v에서 10 msec 동안 1 sec 간격으로 2회 펄스했다. 세포를 그 후 실온에서 10분 동안 방치하고 T-75 플라스크에 넣었다. 바이러스를 전기천공 후 48시간에서 또는 명백한 CPE가 관찰되고 771Xg에서 원심분리될 때까지 수확했다. 상청액을 수집하고 베로(Vero) 세포에서 TCID50 검정에 의해 역사를 측정하였다.
세포 배양
하나의 실시에에서, 베로(Vero) 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포를 입수하였다(예컨대 American Type Cell Culture (Bethesda, MD)로부터). 세포를 10% 태야 소 혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 37℃로 유지시켰다. C6/36 Ae . albopictus 세포를 또한 28℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 유지시켰다.
세포 배양 성장 곡선
복제 속도론(Replication kinetics)을 시험된 각 바이러스에 대해 T-25 플라스크에서 중복하여 측정하였다. 플라스크를 베로(Vero) 또는 C6/36 세포를 사용하여 95%의 융합으로 접종하였다. 배지를 제거하고 이들을 0.001의 MOI에서 1 시간 동안 감염시켰다. 그 후 5% FBS를 함유하는 5 ml의 DMEM을 첨가하였다. 0 타임 포인트를 즉시 제거 하였다(300 μl). 여러 날의 나머지 시간 포인트 각각에서 1-6300 μl를 제거하였다. 샘플을 TCID50 검정에 의해 역가하였다.
실시예
3
바이러스 및 항체
역가
또 다른 예시적인 구체예에서, 억제 요구와 민감성 필요에 따라, 알파바이러스 스톡(stock)과 실험 샘플을 플라크 검정(plaque assay) 또는 TCID50에 의해 역가하거나 또는 (플라크 형성 단위) PFU 역가를 외삽할 수 있는 표준 곡선을 생성하기 위해 바이러스 희석액이 있는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 평가하였다. 이러한 특정 검정에서, 프라이머가 사용되었는데, 예를 들어, (5'-GAYCCCGACTCAACCATCCT-3' - SEQ ID NO:15) 및 (5'-CATMGGGCARACGCACTGGTA-3' - SEQ ID NO:16) 그리고 예시적인 염료 FAM을 함유하는 프로브 (5'-AGYGCGCCAGCAAGGAGGAKGATGT-3' - SEQ ID NO:17)가 사용되었다. Ab 역가는 50% 감소 종점을 갖는 플라크 감소 중화 시험을 사용하여 측정되었다.
실시예
4
바이러스 구조
특정한 예시적인 방법에서, 서브게놈 프로모터에 여러 돌연변이를 갖는 재조합 알파바이러스 구조체를 앞서 기술된 IRES-기반 약독화 전략을 사용하는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 cDNA에서 생성하였다. 체외-전사된 RNA를 베로(Vero) 세포로 전기천공하여 구한 모든 결과 바이러스(예컨대 FMDV, HCV, EV71, TMEV, 및 HRV로부터의 IRES)는 비-기능성 서브게놈 프로모터를 함유하였다. FGF1 및 HAV IRES 구조체는 어떠한 CPE도 나타내지 않았다. 또한, 베로(Vero) 세포에서 수집된 FGF1 및 HAV의 IRES 서열을 갖는 구조체는 바이러스성 활성을 나타내지 않았다.
실시예
5
베로 세포(
Vero
Cell)에서의 성장 속도론
베로(Vero) 세포의 생존력을 평가하기 위해, 전기천공으로부터 유래한 바이러스를 CHIKV (치쿤구니야 바이러스) 감염 후에 비교하였다. 이제 도 3을 참조하면, CHIK-IRES 및 또 다른 살아있는 약독화된 알파바이러스를 연구 백신 치쿤구니야 181-25 균주와 비교하여 베로(Vero) 세포에서의 생존력과 성장 감쇠에 대하여 연구하였다. 유사하게, FMDV, EV71, HCV, TMEV, 및 HRV의 IRES 서열을 함유하는 재조합 알파바이러스 구조체는 베로(Vero) 세포에서 생존가능하다는 것이 밝혀졌고 전형적으로 약독화된(세포 배양에서 계대 이후) 181-25 균주와 비교하여 성장에서 CHIK-IRES와 유사한 감쇠 수준을 나타냈다. HCV 및 FMDV는 CHIK-IRES와 비교하여 성장 감쇠를 보였다. 그렇지만, FGF1 및 HAV IRES 구조체는 생존가능한 바이러스를 생성하지 않았다.
C6/36 모기 세포에서의 성장 속도론
모기 세포에서의 생존력을 평가하기 위해, 전기천공으로부터 유래한 바이러스를 C6/36 모기 세포의 감염 이후에 비교하였다. 이제 도 4를 참조하면, 181-25 균주는 C6/36 모기 세포에서 생존가능한 유일한 균주이었다. 여기서 시험된 모든 재조합 알파바이러스 구조체는 생존가능하지 않았으며 C6/36 모기 세포에서 어떠한 성장도 나타내지 않았다.
실시예
6
플라크 검정(Plaque Assay)
치쿤구니야 181-25 균주 및 CHIK-IRES(EMCV IRES, 양성 대조군)는 베로(Vero) 세포에서 플라크를 생성하였다. 이제 도 5를 참조하면, 일부 재조합 알파바이러스 구조체(예컨대, EV71, HCV, TMEV, 및 HRV로부터의 IRES)가 베로(Vero) 세포에서 플라크를 생성하였으나, 서로 다른 크기의 플라크를 나타냈다. 예를 들어, EV71 IRES 서열 삽입을 갖는 구조체는 대조군 CHIK-IRES보다 일관되게 더 큰 플라크를 생성하였으며; 반면에, HCV, HRV, 및 TMEV로부터의 IRES 서열을 갖는 구조체와 같은 또 다른 재조합 알파바이러스 구조체는 EV71 IRES 서열 삽입 구조체, CHIK-IRES (EMCV, 양성 대조군 구조체), 및 181-25 균주보다 더 작은 플라크를 생성하였다. FMDV는 플라크를 생성하는데 실패하였다. 플라크 크기는 바이러스 적합성을 나타내는 지표이며, 각 구조체는 고유한 플라크 표현형을 가졌으며-또한 모든 IRES 삽입이 이러한 약독화 생성 방법에서 똑같이 수행되는 것은 아니라는 것을 뒷받침한다.
실시예
7
중화
역가
치쿤구니야 바이러스, 181-25에 대하여 성장된 중화 토끼 다클론 항체가 공개적으로 입수가능하다. 이 항체를 이 시약으로 중화될 이들 IRES 구조체 각각의 능력에 대하여 TCID50 중화 검정에서 시험하였다. 각각의 살아있는 약독화된 알파바이러스 균주를 중화 다클론 항체(nPab)를 중화시키는 능력에 대하여 시험하였다.이 항체는 생체 내 면역원성 및 중화 항체 반응을 유도하는 능력을 갖는 바이러스에서 에피토프에 결합하는 것으로 이해된다. 일정한 양의 바이러스(1x104 TCID50)를 항체의 2-배 희석액에 연속하여 첨가하였다. 입력 바이러스의 50%가 중화된 희석액을 각각의 살아있는 약독화된 알파바이러스 균주에서 비교하였다.
이제 도 6을 참조하면, 이 히스토그램 플롯에 도시된 바와 같이, 대조군 항-치쿤구니야 토끼 혈청 풀(pool)을 1:4 내지 1:8192까지 연속하여 희석시켰다. 5종의 재조합 알파바이러스 구조체, 치쿤구니야-EMCV IRES (IRES 대조군, CHIK/IRES), 및 181-25 아미(army) 치쿤구니야 백신 균주를 2000 TCID50 /mL의 동일 바이러스 역가까지 희석하였다. 동등 부피의 각 항체 희석액과 각 바이러스 샘플을 혼합하고 37°C에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 100ul의 각각의 바이러스-항체 샘플을 96-웰 베로(Vero) 세포 플레이트의 웰 당 플레이팅하였다. 5 일 후, 바이러스가 완전히 중화된 항체의 가장 높은 희석액이 세포 층에 CPE가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 도면의 값들은 2가지 서로 다른 경우에서 3회 반복의 산술평균이다. EMCV IRES 대조군은 그래프의 수직선으로 표시된 것처럼, 32-161의 GMT 값을 나타낸다.
이제 도 7을 참조하면, 대조군 항-치쿤구니야 토끼 혈청 풀(pool)을 1:4 내지 1:8192까지 연속하여 희석시켰다. 시험된 IRES 알파바이러스 구조체, 치쿤구니야 EMCV-IRES (IRES 대조군), 및 전통적으로 약독화된 살아있는 181/25 아미(army) 치쿤구니야 백신 균주를 2000 TCID50 /mL의 동일 바이러스 역가까지 희석하였다. 동등 부피의 각 항체 희석액과 각 바이러스 샘플을 혼합하고 37°C에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 100ul의 각각의 바이러스-항체 샘플을 96-웰 베로(Vero) 세포 플레이트의 웰 당 플레이팅하였다. 5 일 후, 바이러스가 완전히 중화된 항체의 가장 높은 희석액이 세포 층에 CPE가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 도면의 값들은 2가지 서로 다른 실험에서 3회 반복의 산술평균이다. 각각의 생존가능한 알파바이러스 구조체는 중화 항체에 의해 중화될 수 있었다. GMT는 백신 유전자형에 걸쳐 동일하지는 않았지만, 역가 범위는 1 또는 2회 희석 이내였으며-이는 강력한 중화를 나타낸다.
실시예
8
동물 연구
마우스를 예비 동물 연구에서 사용할 수 있다. 예를 들어, A129 마우스를 입수하여 대조군 구조체, EMCV-IRES 알파바이러스 구조체의 이전 연구와 유사한 마우스 연구를 위하여 사용할 수 있다. 3주 내지 10주 연령의 동물을 선택된 구조체의 약 1x104 PFU 또는 또 다른 적절한 복용량으로 왼쪽 뒷다리 발바닥에서 피부내 투여로 감염시킬 수 있다. 발바닥 측정은 백신 접종 후 48 시간 동안 캘리퍼(caliper)로 볼(balls)에서 뒷발(hind feet)의 수직 높이로 취할 수 있다. 동물은 15 일 내지 45 일(또는 약 38 일) 동안 유지될 수 있으며 21일차와 35일차에 채혈될 수 있다. 이 동물들은 약 100 PFU 또는 알파바이러스의 다른 적합한 시도로 감염시킬 수 있다(예컨대 CHIKV, 자연-발생 및 감염 증상, 이환율 및 사망률에 대한 모니터링). 이러한 시도에 대한 반응은 CHIKV 또는 또 다른 표적 알파바이러스에 의한 감염에 대한 예방 및 감소된 감염을 위하여 관찰될 수 있다.
예비 데이터에 근거하여, 5가지 구조체(도 7 또는 도 8 참조)로 면역된 마우스는 바이러스 감염 및 후속 바이러스성 감염 조건에 대한 예방으로 CHIK 야생형 접종에 반응한다. 이러한 결한 데이터에 근거하여, 마우스는 GMT로 측정된, 도 8에 있는 표에 예시된 중화 역가 경향을 생성할 것이다. EV71 IRES 알파바이러스 구조체는, EMCV CHIK-IRES를 포함하여, 검사된 다른 구조체보다 일관되게 큰 플라크를 생성하는 능력에 부분적으로 기초하여 EMCV CHIK-IRES 대조군보다 우수하지 않을지라도, 잘 수행할 것이다. 도 8에 예시된 모든 시험 구조체는 표적 알파바이러스에 노출되었을 때 대상체에서 표적 알파바이러스의 감염을 감소시키는데 적합한 구조체를 투여받는 대상체에서 중화 역가를 일으킬 것이다.
단계 I 연구 설계
또 다른 실시예에서, 유전적으로 변형된 살아있는-약독화된 치쿤구니야 백신 후보군에 대한 단계 I, 오픈-라벨, 플라시보-대조군 복용량-확대 첫 번째-인간 단일 중심 시험이 개시되며 여기서 18세-49세인 44명의 건강한 남성 및 여성 성인을 연구에서 분석한다. 공지된 동의 절차에서, 시험 참가 및 백신접종-전 채혈에 대한 적격성 평가(HIV/만성 간염을 배제하고 기준선 치쿤구니야 항체 역가를 위한, 기준선 일상 실험실 파라미터를 위해)가 1일차에 CHIKV 백신 후보군의 단일 복용량으로 백신접종을 하기 최대 28일 이전에 일어나는 0일차에 수행될 것이다. 백신접종 후 7, 14, 28, 182 및 364일 동안 안전성, 내약성 및 면역원성이 평가될 것이다. 도 8 및 도9에서 도시된 시험 구조체 각각에 대하여 앞서 설명된 예비 연구 때문에, 모든 구조체가 구조체의 투여 후 대상체에서 CHIK에 대한 중화 항체를 생성할 가능성이 있다.
계획 1: 연구 설계:
실시예
9
모기 감염
모기로부터의 Ae . albopictus 콜로니(colony)가 수집될 수 있고 이들 실험에서 사용될 수 있다. 이러한 종들이 선택될 수 있는데 왜냐하면 이들 곤충들이 LR CHIKV 균주(및 또 다른 알파바이러스)에 매우 취약하기 때문이다. 부화 후 3-4일에 수집된 성충 암컷 모기를 진정 테이블(Bioquip, Rancho Dominguez, CA)을 사용하여 마취시킬 수 있으며 ca. 1.0 μL의 104 베로(Vero) PFU/ml 바이러스 스톡을 흉막 내로 주사시킬 수 있다. 모기를 임의로 공급된 10% 수크로오스에서 7 일 동안 27°C에서 배양시킬 수 있다. 모기를 동결시키고 배지, 예를 들어, 2% FBS 및 살균제를 함유한 MEM에서 분쇄시킬 수 있다. 10 분 동안 10,000XG에서의 원심분리 이후, 상청액을 96 웰 플레이트를 사용하여 베로 (Vero) 세포 상에 도말할 수 있다. 세포를 1 시간 동안 37°C에서 감염시키고 그 후 MEM을 함유하는 2% FBS로 덮고 48 시간 동안 배양하여 CPE를 측정할 수 있다. 그런 다음 세포는 구조체에 의한 곤충 세포의 감염성을 평가하기 위한 표적 구조체의 존재에 대해 평가될 것이다. 위에서 제시된 예비 증거에 기초하여, 도 8 및 도 9에 도시된 시험 구조체 중 어느 하나도 곤충 세포에서 살아있는 약독화된 알파바이러스의 유의미한 수준을 생성하지 않을 것이나 예시된 것 처럼 구조체는 포유류 세포에서는 성장 가능하다.
******************************************************
여기에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 관하여 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 조성물 및 방법이 바람직한 구체예에 의해 기술되었지만, 여기에 개시된 조성물 및 방법 그리고 상기 방법의 단계 또는 단계의 순서에 대하여 변형이 본 명세서의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 적용될 수 있음이 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 약제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 여기에 개시된 약제에 대하여 대체될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자에게 자명한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
<110> TAKEDA VACCINES, INC.
<120> LIVE, ATTENUATED ALPHAVIRUS CONSTRUCTS AND METHODS AND USES
THEREOF
<130> 2018-FPA-8957
<150> US 62/316,264
<151> 2016-03-31
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIK-EV71 IRES
<400> 1
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt ttaaaacagc ctgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgctag 7560
cactctggta ctgaggtacc tttgtgcgcc tgtttttact ccccttcccc cgaagtaact 7620
tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca ccagtcatac cttgatcaag 7680
cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg cgcggctgaa ggagaaaacg 7740
ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac catgaacgag gcagggtgtt 7800
tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc actgcaaccc ccatgggcga 7860
ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa tccatgggac gctctaattc 7920
tgacatggtg tgaagagcct attgagctag ctggtagtcc tccggcccct gaatgcggct 7980
aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg gtgtgtcgta acgggcaact 8040
ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcctat attggctgct 8100
tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgtgcaa 8160
cagggcaatt gtttacctat ttattggttt tgtaccatta tcactgaagt ctgtgatcac 8220
tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaacatgga gttcatccca acccaaactt 8280
tttacaatag gaggtaccag cctcgaccct ggactccgcg ccctactatc caagtcatca 8340
ggcccagacc gcgccctcag aggcaagctg ggcaacttgc ccagctgatc tcagcagtta 8400
ataaactgac aatgcgcgcg gtaccacaac agaagccacg caggaatcgg aagaataaga 8460
agcaaaagca aaaacaacag gcgccacaaa acaacacaaa tcaaaagaag cagccaccta 8520
aaaagaaacc ggctcaaaag aaaaagaagc cgggccgcag agagaggatg tgcatgaaaa 8580
tcgaaaatga ttgtattttc gaagtcaagc acgaaggtaa ggtaacaggt tacgcgtgcc 8640
tggtggggga caaagtaatg aaaccagcac acgtaaaggg gaccatcgat aacgcggacc 8700
tggccaaact ggcctttaag cggtcatcta agtatgacct tgaatgcgcg cagatacccg 8760
tgcacatgaa gtccgacgct tcgaagttca cccatgagaa accggagggg tactacaact 8820
ggcaccacgg agcagtacag tactcaggag gccggttcac catccctaca ggtgctggca 8880
aaccagggga cagcggcaga ccgatcttcg acaacaaggg acgcgtggtg gccatagtct 8940
taggaggagc taatgaagga gcccgtacag ccctctcggt ggtgacctgg aataaagaca 9000
ttgtcactaa aatcaccccc gagggggccg aagagtggag tcttgccatc ccagttatgt 9060
gcctgttggc aaacaccacg ttcccctgct cccagccccc ttgcacgccc tgctgctacg 9120
aaaaggaacc ggaggaaacc ctacgcatgc ttgaggacaa cgtcatgaga cctgggtact 9180
atcagctgct acaagcatcc ttaacatgtt ctccccaccg ccagcgacgc agcaccaagg 9240
acaacttcaa tgtctataaa gccacaagac catacttagc tcactgtccc gactgtggag 9300
aagggcactc gtgccatagt cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa gcgacagacg 9360
ggacgctgaa aatccaggtc tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgac agccacgatt 9420
ggaccaagct gcgttatatg gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg gcggggctat 9480
ttgtaagaac atcagcaccg tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc atcctggccc 9540
gatgtccaaa aggggaaact ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag attagtcact 9600
catgtacgca cccatttcac cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa ttccattccc 9660
gaccgcagca cggtaaagag ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc gccgcaacta 9720
ccgaggagat agaggtacac atgcccccag acacccctga tcgcacatta atgtcacaac 9780
agtccggcaa cgtaaagatc acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag tgtaattgcg 9840
gtggctcaaa tgaaggacta acaactacag acaaagtgat taataactgc aaggttgatc 9900
aatgtcatgc cgcggtcacc aatcacaaaa agtggcagta taactcccct ctggtcccgc 9960
gtaatgctga acttggggac cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg ctggcaaatg 10020
taacatgcag ggtgcctaaa gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa aaccaagtca 10080
tcatgctact gtatcctgac cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg ggagaagaac 10140
caaactatca agaagagtgg gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc gtgccgactg 10200
aagggctcga ggtcacgtgg ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg cagttatcta 10260
caaacggtac agcccatggc cacccgcatg agataattct gtattattat gagctgtacc 10320
ccactatgac tgtagtagtt gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg atggtgggta 10380
tggcagcggg gatgtgcatg tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat gaactgacac 10440
caggagctac cgtccctttc ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca gctaaagcgg 10500
ccacatacca agaggctgcg atatacctgt ggaacgagca gcaacctttg ttttggctac 10560
aagcccttat tccgctggca gccctgattg ttctatgcaa ctgtctgaga ctcttaccat 10620
gctgctgtaa aacgttggct tttttagccg taatgagcgt cggtgcccac actgtgagcg 10680
cgtacgaaca cgtaacagtg atcccgaaca cggtgggagt accgtataag actctagtca 10740
atagacctgg ctacagcccc atggtattgg agatggaact actgtcagtc actttggagc 10800
caacactatc gcttgattac atcacgtgcg agtacaaaac cgtcatcccg tctccgtacg 10860
tgaagtgctg cggtacagca gagtgcaagg acaaaaacct acctgactac agctgtaagg 10920
tcttcaccgg cgtctaccca tttatgtggg gcggcgccta ctgcttctgc gacgctgaaa 10980
acacgcagtt gagcgaagca cacgtggaga agtccgaatc atgcaaaaca gaatttgcat 11040
cagcatacag ggctcatacc gcatctgcat cagctaagct ccgcgtcctt taccaaggaa 11100
ataacatcac tgtaactgcc tatgcaaacg gcgaccatgc cgtcacagtt aaggacgcca 11160
aattcattgt ggggccaatg tcttcagcct ggacaccttt cgacaacaaa attgtggtgt 11220
acaaaggtga cgtctataac atggactacc cgccctttgg cgcaggaaga ccaggacaat 11280
ttggcgatat ccaaagtcgc acacctgaga gtaaagacgt ctatgctaat acacaactgg 11340
tactgcagag accggctgtg ggtacggtac acgtgccata ctctcaggca ccatctggct 11400
ttaagtattg gctaaaagaa cgcggggcgt cgctgcagca cacagcacca tttggctgcc 11460
aaatagcaac aaacccggta agagcggtga actgcgccgt agggaacatg cccatctcca 11520
tcgacatacc ggaagcggcc ttcactaggg tcgtcgacgc gccctcttta acggacatgt 11580
cgtgcgaggt accagcctgc acccattcct cagactttgg gggcgtcgcc attattaaat 11640
atgcagccag caagaaaggc aagtgtgcgg tgcattcgat gactaacgcc gtcactattc 11700
gggaagctga gatagaagtt gaagggaatt ctcagctgca aatctctttc tcgacggcct 11760
tagccagcgc cgaattccgc gtacaagtct gttctacaca agtacactgt gcagccgagt 11820
gccacccccc gaaggaccac atagtcaact acccggcgtc acataccacc ctcggggtcc 11880
aggacatctc cgctacggcg atgtcatggg tgcagaagat cacgggaggt gtgggactgg 11940
ttgttgctgt tgccgcactg attctaatcg tggtgctatg cgtgtcgttc agcaggcact 12000
aacttgacaa ttaagtatga aggtatatgt gtcccctaag agacacactg tacatagcaa 12060
ataatctata gatcaaaggg ctacgcaacc cctgaatagt aacaaaatac aaaatcacta 12120
aaaattataa aaacagaaaa atacataaat aggtatacgt gtcccctaag agacacattg 12180
tatgtaggtg ataagtatag atcaaagggc cgaataaccc ctgaatagta acaaaatatg 12240
aaaatcaata aaaatcataa aatagaaaaa ccataaacag aagtagttca aagggctata 12300
aaacccctga atagtaacaa aacataaaat taataaaaat caaatgaata ccataattgg 12360
caaacggaag agatgtaggt acttaagctt cctaaaagca gccgaactca ctttgagaag 12420
taggcatagc ataccgaact cttccacgat tctccgaacc cacagggacg taggagatgt 12480
tattttgttt ttaatatttc 12500
<210> 2
<211> 12355
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-HRV2 IRES
<400> 2
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt atccaggttg ttcccacctg gatttcccac agggagtggt actctgttat 7560
tacggtaact ttgtacgcca gttttatctc ccttccccca tgtaacttag aagtttttca 7620
caaagaccaa tagccggtaa tcagccagat tactgaaggt caagcacttc tgtttccccg 7680
gtcaatgttg atatgctcca acagggcaaa aacaactgcg atcgttaacc gcaaagcgcc 7740
tacgcaaagc ttagtagcat ctttgaaatc gtttggctgg tcgatccgcc atttcccctg 7800
gtagacctgg cagatgaggc tagaaatacc ccactggcga cagtgttcta gcctgcgtgg 7860
ctgcctgcac accctatggg tgtgaagcca aacaatggac aaggtgtgaa gagccccgtg 7920
tgctcgcttt gagtcctccg gcccctgaat gtggctaacc ttaaccctgc agctagagca 7980
cgtaacccaa tgtgtatcta gtcgtaatga gcaattgcgg gatgggacca actactttgg 8040
gtgtccgtgt ttcacttttt cctttatatt tgcttatggt gacaatatat acaatatata 8100
tattggcacc atggagttca tcccaaccca aactttttac aataggaggt accagcctcg 8160
accctggact ccgcgcccta ctatccaagt catcaggccc agaccgcgcc ctcagaggca 8220
agctgggcaa cttgcccagc tgatctcagc agttaataaa ctgacaatgc gcgcggtacc 8280
acaacagaag ccacgcagga atcggaagaa taagaagcaa aagcaaaaac aacaggcgcc 8340
acaaaacaac acaaatcaaa agaagcagcc acctaaaaag aaaccggctc aaaagaaaaa 8400
gaagccgggc cgcagagaga ggatgtgcat gaaaatcgaa aatgattgta ttttcgaagt 8460
caagcacgaa ggtaaggtaa caggttacgc gtgcctggtg ggggacaaag taatgaaacc 8520
agcacacgta aaggggacca tcgataacgc ggacctggcc aaactggcct ttaagcggtc 8580
atctaagtat gaccttgaat gcgcgcagat acccgtgcac atgaagtccg acgcttcgaa 8640
gttcacccat gagaaaccgg aggggtacta caactggcac cacggagcag tacagtactc 8700
aggaggccgg ttcaccatcc ctacaggtgc tggcaaacca ggggacagcg gcagaccgat 8760
cttcgacaac aagggacgcg tggtggccat agtcttagga ggagctaatg aaggagcccg 8820
tacagccctc tcggtggtga cctggaataa agacattgtc actaaaatca cccccgaggg 8880
ggccgaagag tggagtcttg ccatcccagt tatgtgcctg ttggcaaaca ccacgttccc 8940
ctgctcccag cccccttgca cgccctgctg ctacgaaaag gaaccggagg aaaccctacg 9000
catgcttgag gacaacgtca tgagacctgg gtactatcag ctgctacaag catccttaac 9060
atgttctccc caccgccagc gacgcagcac caaggacaac ttcaatgtct ataaagccac 9120
aagaccatac ttagctcact gtcccgactg tggagaaggg cactcgtgcc atagtcccgt 9180
agcactagaa cgcatcagaa atgaagcgac agacgggacg ctgaaaatcc aggtctcctt 9240
gcaaatcgga ataaagacgg atgacagcca cgattggacc aagctgcgtt atatggacaa 9300
ccacatgcca gcagacgcag agagggcggg gctatttgta agaacatcag caccgtgtac 9360
gattactgga acaatgggac acttcatcct ggcccgatgt ccaaaagggg aaactctgac 9420
ggtgggattc actgacagta ggaagattag tcactcatgt acgcacccat ttcaccacga 9480
ccctcctgtg ataggtcggg aaaaattcca ttcccgaccg cagcacggta aagagctacc 9540
ttgcagcacg tacgtgcaga gcaccgccgc aactaccgag gagatagagg tacacatgcc 9600
cccagacacc cctgatcgca cattaatgtc acaacagtcc ggcaacgtaa agatcacagt 9660
caatggccag acggtgcggt acaagtgtaa ttgcggtggc tcaaatgaag gactaacaac 9720
tacagacaaa gtgattaata actgcaaggt tgatcaatgt catgccgcgg tcaccaatca 9780
caaaaagtgg cagtataact cccctctggt cccgcgtaat gctgaacttg gggaccgaaa 9840
aggaaaaatt cacatcccgt ttccgctggc aaatgtaaca tgcagggtgc ctaaagcaag 9900
gaaccccacc gtgacgtacg ggaaaaacca agtcatcatg ctactgtatc ctgaccaccc 9960
aacactcctg tcctaccgga atatgggaga agaaccaaac tatcaagaag agtgggtgat 10020
gcataagaag gaagtcgtgc taaccgtgcc gactgaaggg ctcgaggtca cgtggggcaa 10080
caacgagccg tataagtatt ggccgcagtt atctacaaac ggtacagccc atggccaccc 10140
gcatgagata attctgtatt attatgagct gtaccccact atgactgtag tagttgtgtc 10200
agtggccacg ttcatactcc tgtcgatggt gggtatggca gcggggatgt gcatgtgtgc 10260
acgacgcaga tgcatcacac cgtatgaact gacaccagga gctaccgtcc ctttcctgct 10320
tagcctaata tgctgcatca gaacagctaa agcggccaca taccaagagg ctgcgatata 10380
cctgtggaac gagcagcaac ctttgttttg gctacaagcc cttattccgc tggcagccct 10440
gattgttcta tgcaactgtc tgagactctt accatgctgc tgtaaaacgt tggctttttt 10500
agccgtaatg agcgtcggtg cccacactgt gagcgcgtac gaacacgtaa cagtgatccc 10560
gaacacggtg ggagtaccgt ataagactct agtcaataga cctggctaca gccccatggt 10620
attggagatg gaactactgt cagtcacttt ggagccaaca ctatcgcttg attacatcac 10680
gtgcgagtac aaaaccgtca tcccgtctcc gtacgtgaag tgctgcggta cagcagagtg 10740
caaggacaaa aacctacctg actacagctg taaggtcttc accggcgtct acccatttat 10800
gtggggcggc gcctactgct tctgcgacgc tgaaaacacg cagttgagcg aagcacacgt 10860
ggagaagtcc gaatcatgca aaacagaatt tgcatcagca tacagggctc ataccgcatc 10920
tgcatcagct aagctccgcg tcctttacca aggaaataac atcactgtaa ctgcctatgc 10980
aaacggcgac catgccgtca cagttaagga cgccaaattc attgtggggc caatgtcttc 11040
agcctggaca cctttcgaca acaaaattgt ggtgtacaaa ggtgacgtct ataacatgga 11100
ctacccgccc tttggcgcag gaagaccagg acaatttggc gatatccaaa gtcgcacacc 11160
tgagagtaaa gacgtctatg ctaatacaca actggtactg cagagaccgg ctgtgggtac 11220
ggtacacgtg ccatactctc aggcaccatc tggctttaag tattggctaa aagaacgcgg 11280
ggcgtcgctg cagcacacag caccatttgg ctgccaaata gcaacaaacc cggtaagagc 11340
ggtgaactgc gccgtaggga acatgcccat ctccatcgac ataccggaag cggccttcac 11400
tagggtcgtc gacgcgccct ctttaacgga catgtcgtgc gaggtaccag cctgcaccca 11460
ttcctcagac tttgggggcg tcgccattat taaatatgca gccagcaaga aaggcaagtg 11520
tgcggtgcat tcgatgacta acgccgtcac tattcgggaa gctgagatag aagttgaagg 11580
gaattctcag ctgcaaatct ctttctcgac ggccttagcc agcgccgaat tccgcgtaca 11640
agtctgttct acacaagtac actgtgcagc cgagtgccac cccccgaagg accacatagt 11700
caactacccg gcgtcacata ccaccctcgg ggtccaggac atctccgcta cggcgatgtc 11760
atgggtgcag aagatcacgg gaggtgtggg actggttgtt gctgttgccg cactgattct 11820
aatcgtggtg ctatgcgtgt cgttcagcag gcactaactt gacaattaag tatgaaggta 11880
tatgtgtccc ctaagagaca cactgtacat agcaaataat ctatagatca aagggctacg 11940
caacccctga atagtaacaa aatacaaaat cactaaaaat tataaaaaca gaaaaataca 12000
taaataggta tacgtgtccc ctaagagaca cattgtatgt aggtgataag tatagatcaa 12060
agggccgaat aacccctgaa tagtaacaaa atatgaaaat caataaaaat cataaaatag 12120
aaaaaccata aacagaagta gttcaaaggg ctataaaacc cctgaatagt aacaaaacat 12180
aaaattaata aaaatcaaat gaataccata attggcaaac ggaagagatg taggtactta 12240
agcttcctaa aagcagccga actcactttg agaagtaggc atagcatacc gaactcttcc 12300
acgattctcc gaacccacag ggacgtagga gatgttattt tgtttttaat atttc 12355
<210> 3
<211> 12216
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-FMDV IRES
<400> 3
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt agcaggtttc cccaactgac acaaaacgtg caacttgaaa ctccgcctgg 7560
tctttccagg tctagagggg taacactttg tactgtgttt ggctccacgc tcgatccact 7620
ggcgagtgtt agtaacagca ctgttgcttc gtagcggagc atgacggccg tgggaactcc 7680
tccttggtaa caaggaccca cggggccaaa agccacgccc acacgggccc gtcatgtgtg 7740
caaccccagc acggcgactt tactgcgaaa cccactttaa agtgacattg aaactggtac 7800
ccacacactg gtgacaggct aaggatgccc ttcaggtacc ccgaggtaac acgcgacact 7860
cgggatctga gaaggggact ggggcttcta taaaagcgct cggtttaaaa agcttctatg 7920
cctgaatagg tgaccggagg tcggcacctt tcctttacaa ttaatgaccc tatggagttc 7980
atcccaaccc aaacttttta caataggagg taccagcctc gaccctggac tccgcgccct 8040
actatccaag tcatcaggcc cagaccgcgc cctcagaggc aagctgggca acttgcccag 8100
ctgatctcag cagttaataa actgacaatg cgcgcggtac cacaacagaa gccacgcagg 8160
aatcggaaga ataagaagca aaagcaaaaa caacaggcgc cacaaaacaa cacaaatcaa 8220
aagaagcagc cacctaaaaa gaaaccggct caaaagaaaa agaagccggg ccgcagagag 8280
aggatgtgca tgaaaatcga aaatgattgt attttcgaag tcaagcacga aggtaaggta 8340
acaggttacg cgtgcctggt gggggacaaa gtaatgaaac cagcacacgt aaaggggacc 8400
atcgataacg cggacctggc caaactggcc tttaagcggt catctaagta tgaccttgaa 8460
tgcgcgcaga tacccgtgca catgaagtcc gacgcttcga agttcaccca tgagaaaccg 8520
gaggggtact acaactggca ccacggagca gtacagtact caggaggccg gttcaccatc 8580
cctacaggtg ctggcaaacc aggggacagc ggcagaccga tcttcgacaa caagggacgc 8640
gtggtggcca tagtcttagg aggagctaat gaaggagccc gtacagccct ctcggtggtg 8700
acctggaata aagacattgt cactaaaatc acccccgagg gggccgaaga gtggagtctt 8760
gccatcccag ttatgtgcct gttggcaaac accacgttcc cctgctccca gcccccttgc 8820
acgccctgct gctacgaaaa ggaaccggag gaaaccctac gcatgcttga ggacaacgtc 8880
atgagacctg ggtactatca gctgctacaa gcatccttaa catgttctcc ccaccgccag 8940
cgacgcagca ccaaggacaa cttcaatgtc tataaagcca caagaccata cttagctcac 9000
tgtcccgact gtggagaagg gcactcgtgc catagtcccg tagcactaga acgcatcaga 9060
aatgaagcga cagacgggac gctgaaaatc caggtctcct tgcaaatcgg aataaagacg 9120
gatgacagcc acgattggac caagctgcgt tatatggaca accacatgcc agcagacgca 9180
gagagggcgg ggctatttgt aagaacatca gcaccgtgta cgattactgg aacaatggga 9240
cacttcatcc tggcccgatg tccaaaaggg gaaactctga cggtgggatt cactgacagt 9300
aggaagatta gtcactcatg tacgcaccca tttcaccacg accctcctgt gataggtcgg 9360
gaaaaattcc attcccgacc gcagcacggt aaagagctac cttgcagcac gtacgtgcag 9420
agcaccgccg caactaccga ggagatagag gtacacatgc ccccagacac ccctgatcgc 9480
acattaatgt cacaacagtc cggcaacgta aagatcacag tcaatggcca gacggtgcgg 9540
tacaagtgta attgcggtgg ctcaaatgaa ggactaacaa ctacagacaa agtgattaat 9600
aactgcaagg ttgatcaatg tcatgccgcg gtcaccaatc acaaaaagtg gcagtataac 9660
tcccctctgg tcccgcgtaa tgctgaactt ggggaccgaa aaggaaaaat tcacatcccg 9720
tttccgctgg caaatgtaac atgcagggtg cctaaagcaa ggaaccccac cgtgacgtac 9780
gggaaaaacc aagtcatcat gctactgtat cctgaccacc caacactcct gtcctaccgg 9840
aatatgggag aagaaccaaa ctatcaagaa gagtgggtga tgcataagaa ggaagtcgtg 9900
ctaaccgtgc cgactgaagg gctcgaggtc acgtggggca acaacgagcc gtataagtat 9960
tggccgcagt tatctacaaa cggtacagcc catggccacc cgcatgagat aattctgtat 10020
tattatgagc tgtaccccac tatgactgta gtagttgtgt cagtggccac gttcatactc 10080
ctgtcgatgg tgggtatggc agcggggatg tgcatgtgtg cacgacgcag atgcatcaca 10140
ccgtatgaac tgacaccagg agctaccgtc cctttcctgc ttagcctaat atgctgcatc 10200
agaacagcta aagcggccac ataccaagag gctgcgatat acctgtggaa cgagcagcaa 10260
cctttgtttt ggctacaagc ccttattccg ctggcagccc tgattgttct atgcaactgt 10320
ctgagactct taccatgctg ctgtaaaacg ttggcttttt tagccgtaat gagcgtcggt 10380
gcccacactg tgagcgcgta cgaacacgta acagtgatcc cgaacacggt gggagtaccg 10440
tataagactc tagtcaatag acctggctac agccccatgg tattggagat ggaactactg 10500
tcagtcactt tggagccaac actatcgctt gattacatca cgtgcgagta caaaaccgtc 10560
atcccgtctc cgtacgtgaa gtgctgcggt acagcagagt gcaaggacaa aaacctacct 10620
gactacagct gtaaggtctt caccggcgtc tacccattta tgtggggcgg cgcctactgc 10680
ttctgcgacg ctgaaaacac gcagttgagc gaagcacacg tggagaagtc cgaatcatgc 10740
aaaacagaat ttgcatcagc atacagggct cataccgcat ctgcatcagc taagctccgc 10800
gtcctttacc aaggaaataa catcactgta actgcctatg caaacggcga ccatgccgtc 10860
acagttaagg acgccaaatt cattgtgggg ccaatgtctt cagcctggac acctttcgac 10920
aacaaaattg tggtgtacaa aggtgacgtc tataacatgg actacccgcc ctttggcgca 10980
ggaagaccag gacaatttgg cgatatccaa agtcgcacac ctgagagtaa agacgtctat 11040
gctaatacac aactggtact gcagagaccg gctgtgggta cggtacacgt gccatactct 11100
caggcaccat ctggctttaa gtattggcta aaagaacgcg gggcgtcgct gcagcacaca 11160
gcaccatttg gctgccaaat agcaacaaac ccggtaagag cggtgaactg cgccgtaggg 11220
aacatgccca tctccatcga cataccggaa gcggccttca ctagggtcgt cgacgcgccc 11280
tctttaacgg acatgtcgtg cgaggtacca gcctgcaccc attcctcaga ctttgggggc 11340
gtcgccatta ttaaatatgc agccagcaag aaaggcaagt gtgcggtgca ttcgatgact 11400
aacgccgtca ctattcggga agctgagata gaagttgaag ggaattctca gctgcaaatc 11460
tctttctcga cggccttagc cagcgccgaa ttccgcgtac aagtctgttc tacacaagta 11520
cactgtgcag ccgagtgcca ccccccgaag gaccacatag tcaactaccc ggcgtcacat 11580
accaccctcg gggtccagga catctccgct acggcgatgt catgggtgca gaagatcacg 11640
ggaggtgtgg gactggttgt tgctgttgcc gcactgattc taatcgtggt gctatgcgtg 11700
tcgttcagca ggcactaact tgacaattaa gtatgaaggt atatgtgtcc cctaagagac 11760
acactgtaca tagcaaataa tctatagatc aaagggctac gcaacccctg aatagtaaca 11820
aaatacaaaa tcactaaaaa ttataaaaac agaaaaatac ataaataggt atacgtgtcc 11880
cctaagagac acattgtatg taggtgataa gtatagatca aagggccgaa taacccctga 11940
atagtaacaa aatatgaaaa tcaataaaaa tcataaaata gaaaaaccat aaacagaagt 12000
agttcaaagg gctataaaac ccctgaatag taacaaaaca taaaattaat aaaaatcaaa 12060
tgaataccat aattggcaaa cggaagagat gtaggtactt aagcttccta aaagcagccg 12120
aactcacttt gagaagtagg catagcatac cgaactcttc cacgattctc cgaacccaca 12180
gggacgtagg agatgttatt ttgtttttaa tatttc 12216
<210> 4
<211> 12310
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-TMEV IRES
<400> 4
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt ttggactccg gtcccccggt ctaagccgct cggaatatga cagggttatt 7560
ttcacctctt cttttctact ccacagtgtt ctatactgtg gaagggtatg tgttgcccct 7620
tccttcttgg agaacgtgcg cggcggtctt tccgtctctc gacaagcgcg cgtgcaacat 7680
acagagtaac gcgaagaaag cagttctcgg tctagctcta gtgcccacaa gaaaacagct 7740
gtagcgacca cacaaaggca gcggaacccc cctcctggta acaggagcct ctgcggccaa 7800
aagccacgtg gataagatcc acctttgtgt gcggtgcaac cccagcaccc tggtttcttg 7860
gtgacactct agtgaacccc tgaatggcaa tctcaagcgc ctctgtaggg aagccaagaa 7920
tgtccaggag gtaccccttc ctctcggaag ggatctgacc tggagacaca tcacacgtgc 7980
tttacacctg tgcttgtgtt taaaaattgt tacagcttcc ccgaaccaag tggtcttggt 8040
tttcactttt tatcacactg tcaatatgga gttcatccca acccaaactt tttacaatag 8100
gaggtaccag cctcgaccct ggactccgcg ccctactatc caagtcatca ggcccagacc 8160
gcgccctcag aggcaagctg ggcaacttgc ccagctgatc tcagcagtta ataaactgac 8220
aatgcgcgcg gtaccacaac agaagccacg caggaatcgg aagaataaga agcaaaagca 8280
aaaacaacag gcgccacaaa acaacacaaa tcaaaagaag cagccaccta aaaagaaacc 8340
ggctcaaaag aaaaagaagc cgggccgcag agagaggatg tgcatgaaaa tcgaaaatga 8400
ttgtattttc gaagtcaagc acgaaggtaa ggtaacaggt tacgcgtgcc tggtggggga 8460
caaagtaatg aaaccagcac acgtaaaggg gaccatcgat aacgcggacc tggccaaact 8520
ggcctttaag cggtcatcta agtatgacct tgaatgcgcg cagatacccg tgcacatgaa 8580
gtccgacgct tcgaagttca cccatgagaa accggagggg tactacaact ggcaccacgg 8640
agcagtacag tactcaggag gccggttcac catccctaca ggtgctggca aaccagggga 8700
cagcggcaga ccgatcttcg acaacaaggg acgcgtggtg gccatagtct taggaggagc 8760
taatgaagga gcccgtacag ccctctcggt ggtgacctgg aataaagaca ttgtcactaa 8820
aatcaccccc gagggggccg aagagtggag tcttgccatc ccagttatgt gcctgttggc 8880
aaacaccacg ttcccctgct cccagccccc ttgcacgccc tgctgctacg aaaaggaacc 8940
ggaggaaacc ctacgcatgc ttgaggacaa cgtcatgaga cctgggtact atcagctgct 9000
acaagcatcc ttaacatgtt ctccccaccg ccagcgacgc agcaccaagg acaacttcaa 9060
tgtctataaa gccacaagac catacttagc tcactgtccc gactgtggag aagggcactc 9120
gtgccatagt cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa gcgacagacg ggacgctgaa 9180
aatccaggtc tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgac agccacgatt ggaccaagct 9240
gcgttatatg gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg gcggggctat ttgtaagaac 9300
atcagcaccg tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc atcctggccc gatgtccaaa 9360
aggggaaact ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag attagtcact catgtacgca 9420
cccatttcac cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa ttccattccc gaccgcagca 9480
cggtaaagag ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc gccgcaacta ccgaggagat 9540
agaggtacac atgcccccag acacccctga tcgcacatta atgtcacaac agtccggcaa 9600
cgtaaagatc acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag tgtaattgcg gtggctcaaa 9660
tgaaggacta acaactacag acaaagtgat taataactgc aaggttgatc aatgtcatgc 9720
cgcggtcacc aatcacaaaa agtggcagta taactcccct ctggtcccgc gtaatgctga 9780
acttggggac cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg ctggcaaatg taacatgcag 9840
ggtgcctaaa gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa aaccaagtca tcatgctact 9900
gtatcctgac cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg ggagaagaac caaactatca 9960
agaagagtgg gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc gtgccgactg aagggctcga 10020
ggtcacgtgg ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg cagttatcta caaacggtac 10080
agcccatggc cacccgcatg agataattct gtattattat gagctgtacc ccactatgac 10140
tgtagtagtt gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg atggtgggta tggcagcggg 10200
gatgtgcatg tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat gaactgacac caggagctac 10260
cgtccctttc ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca gctaaagcgg ccacatacca 10320
agaggctgcg atatacctgt ggaacgagca gcaacctttg ttttggctac aagcccttat 10380
tccgctggca gccctgattg ttctatgcaa ctgtctgaga ctcttaccat gctgctgtaa 10440
aacgttggct tttttagccg taatgagcgt cggtgcccac actgtgagcg cgtacgaaca 10500
cgtaacagtg atcccgaaca cggtgggagt accgtataag actctagtca atagacctgg 10560
ctacagcccc atggtattgg agatggaact actgtcagtc actttggagc caacactatc 10620
gcttgattac atcacgtgcg agtacaaaac cgtcatcccg tctccgtacg tgaagtgctg 10680
cggtacagca gagtgcaagg acaaaaacct acctgactac agctgtaagg tcttcaccgg 10740
cgtctaccca tttatgtggg gcggcgccta ctgcttctgc gacgctgaaa acacgcagtt 10800
gagcgaagca cacgtggaga agtccgaatc atgcaaaaca gaatttgcat cagcatacag 10860
ggctcatacc gcatctgcat cagctaagct ccgcgtcctt taccaaggaa ataacatcac 10920
tgtaactgcc tatgcaaacg gcgaccatgc cgtcacagtt aaggacgcca aattcattgt 10980
ggggccaatg tcttcagcct ggacaccttt cgacaacaaa attgtggtgt acaaaggtga 11040
cgtctataac atggactacc cgccctttgg cgcaggaaga ccaggacaat ttggcgatat 11100
ccaaagtcgc acacctgaga gtaaagacgt ctatgctaat acacaactgg tactgcagag 11160
accggctgtg ggtacggtac acgtgccata ctctcaggca ccatctggct ttaagtattg 11220
gctaaaagaa cgcggggcgt cgctgcagca cacagcacca tttggctgcc aaatagcaac 11280
aaacccggta agagcggtga actgcgccgt agggaacatg cccatctcca tcgacatacc 11340
ggaagcggcc ttcactaggg tcgtcgacgc gccctcttta acggacatgt cgtgcgaggt 11400
accagcctgc acccattcct cagactttgg gggcgtcgcc attattaaat atgcagccag 11460
caagaaaggc aagtgtgcgg tgcattcgat gactaacgcc gtcactattc gggaagctga 11520
gatagaagtt gaagggaatt ctcagctgca aatctctttc tcgacggcct tagccagcgc 11580
cgaattccgc gtacaagtct gttctacaca agtacactgt gcagccgagt gccacccccc 11640
gaaggaccac atagtcaact acccggcgtc acataccacc ctcggggtcc aggacatctc 11700
cgctacggcg atgtcatggg tgcagaagat cacgggaggt gtgggactgg ttgttgctgt 11760
tgccgcactg attctaatcg tggtgctatg cgtgtcgttc agcaggcact aacttgacaa 11820
ttaagtatga aggtatatgt gtcccctaag agacacactg tacatagcaa ataatctata 11880
gatcaaaggg ctacgcaacc cctgaatagt aacaaaatac aaaatcacta aaaattataa 11940
aaacagaaaa atacataaat aggtatacgt gtcccctaag agacacattg tatgtaggtg 12000
ataagtatag atcaaagggc cgaataaccc ctgaatagta acaaaatatg aaaatcaata 12060
aaaatcataa aatagaaaaa ccataaacag aagtagttca aagggctata aaacccctga 12120
atagtaacaa aacataaaat taataaaaat caaatgaata ccataattgg caaacggaag 12180
agatgtaggt acttaagctt cctaaaagca gccgaactca ctttgagaag taggcatagc 12240
ataccgaact cttccacgat tctccgaacc cacagggacg taggagatgt tattttgttt 12300
ttaatatttc 12310
<210> 5
<211> 12096
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-HCV IRES
<400> 5
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga 7560
ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag 7620
cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg 7680
gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg 7740
gcgtgccccc gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact 7800
gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catggagttc 7860
atcccaaccc aaacttttta caataggagg taccagcctc gaccctggac tccgcgccct 7920
actatccaag tcatcaggcc cagaccgcgc cctcagaggc aagctgggca acttgcccag 7980
ctgatctcag cagttaataa actgacaatg cgcgcggtac cacaacagaa gccacgcagg 8040
aatcggaaga ataagaagca aaagcaaaaa caacaggcgc cacaaaacaa cacaaatcaa 8100
aagaagcagc cacctaaaaa gaaaccggct caaaagaaaa agaagccggg ccgcagagag 8160
aggatgtgca tgaaaatcga aaatgattgt attttcgaag tcaagcacga aggtaaggta 8220
acaggttacg cgtgcctggt gggggacaaa gtaatgaaac cagcacacgt aaaggggacc 8280
atcgataacg cggacctggc caaactggcc tttaagcggt catctaagta tgaccttgaa 8340
tgcgcgcaga tacccgtgca catgaagtcc gacgcttcga agttcaccca tgagaaaccg 8400
gaggggtact acaactggca ccacggagca gtacagtact caggaggccg gttcaccatc 8460
cctacaggtg ctggcaaacc aggggacagc ggcagaccga tcttcgacaa caagggacgc 8520
gtggtggcca tagtcttagg aggagctaat gaaggagccc gtacagccct ctcggtggtg 8580
acctggaata aagacattgt cactaaaatc acccccgagg gggccgaaga gtggagtctt 8640
gccatcccag ttatgtgcct gttggcaaac accacgttcc cctgctccca gcccccttgc 8700
acgccctgct gctacgaaaa ggaaccggag gaaaccctac gcatgcttga ggacaacgtc 8760
atgagacctg ggtactatca gctgctacaa gcatccttaa catgttctcc ccaccgccag 8820
cgacgcagca ccaaggacaa cttcaatgtc tataaagcca caagaccata cttagctcac 8880
tgtcccgact gtggagaagg gcactcgtgc catagtcccg tagcactaga acgcatcaga 8940
aatgaagcga cagacgggac gctgaaaatc caggtctcct tgcaaatcgg aataaagacg 9000
gatgacagcc acgattggac caagctgcgt tatatggaca accacatgcc agcagacgca 9060
gagagggcgg ggctatttgt aagaacatca gcaccgtgta cgattactgg aacaatggga 9120
cacttcatcc tggcccgatg tccaaaaggg gaaactctga cggtgggatt cactgacagt 9180
aggaagatta gtcactcatg tacgcaccca tttcaccacg accctcctgt gataggtcgg 9240
gaaaaattcc attcccgacc gcagcacggt aaagagctac cttgcagcac gtacgtgcag 9300
agcaccgccg caactaccga ggagatagag gtacacatgc ccccagacac ccctgatcgc 9360
acattaatgt cacaacagtc cggcaacgta aagatcacag tcaatggcca gacggtgcgg 9420
tacaagtgta attgcggtgg ctcaaatgaa ggactaacaa ctacagacaa agtgattaat 9480
aactgcaagg ttgatcaatg tcatgccgcg gtcaccaatc acaaaaagtg gcagtataac 9540
tcccctctgg tcccgcgtaa tgctgaactt ggggaccgaa aaggaaaaat tcacatcccg 9600
tttccgctgg caaatgtaac atgcagggtg cctaaagcaa ggaaccccac cgtgacgtac 9660
gggaaaaacc aagtcatcat gctactgtat cctgaccacc caacactcct gtcctaccgg 9720
aatatgggag aagaaccaaa ctatcaagaa gagtgggtga tgcataagaa ggaagtcgtg 9780
ctaaccgtgc cgactgaagg gctcgaggtc acgtggggca acaacgagcc gtataagtat 9840
tggccgcagt tatctacaaa cggtacagcc catggccacc cgcatgagat aattctgtat 9900
tattatgagc tgtaccccac tatgactgta gtagttgtgt cagtggccac gttcatactc 9960
ctgtcgatgg tgggtatggc agcggggatg tgcatgtgtg cacgacgcag atgcatcaca 10020
ccgtatgaac tgacaccagg agctaccgtc cctttcctgc ttagcctaat atgctgcatc 10080
agaacagcta aagcggccac ataccaagag gctgcgatat acctgtggaa cgagcagcaa 10140
cctttgtttt ggctacaagc ccttattccg ctggcagccc tgattgttct atgcaactgt 10200
ctgagactct taccatgctg ctgtaaaacg ttggcttttt tagccgtaat gagcgtcggt 10260
gcccacactg tgagcgcgta cgaacacgta acagtgatcc cgaacacggt gggagtaccg 10320
tataagactc tagtcaatag acctggctac agccccatgg tattggagat ggaactactg 10380
tcagtcactt tggagccaac actatcgctt gattacatca cgtgcgagta caaaaccgtc 10440
atcccgtctc cgtacgtgaa gtgctgcggt acagcagagt gcaaggacaa aaacctacct 10500
gactacagct gtaaggtctt caccggcgtc tacccattta tgtggggcgg cgcctactgc 10560
ttctgcgacg ctgaaaacac gcagttgagc gaagcacacg tggagaagtc cgaatcatgc 10620
aaaacagaat ttgcatcagc atacagggct cataccgcat ctgcatcagc taagctccgc 10680
gtcctttacc aaggaaataa catcactgta actgcctatg caaacggcga ccatgccgtc 10740
acagttaagg acgccaaatt cattgtgggg ccaatgtctt cagcctggac acctttcgac 10800
aacaaaattg tggtgtacaa aggtgacgtc tataacatgg actacccgcc ctttggcgca 10860
ggaagaccag gacaatttgg cgatatccaa agtcgcacac ctgagagtaa agacgtctat 10920
gctaatacac aactggtact gcagagaccg gctgtgggta cggtacacgt gccatactct 10980
caggcaccat ctggctttaa gtattggcta aaagaacgcg gggcgtcgct gcagcacaca 11040
gcaccatttg gctgccaaat agcaacaaac ccggtaagag cggtgaactg cgccgtaggg 11100
aacatgccca tctccatcga cataccggaa gcggccttca ctagggtcgt cgacgcgccc 11160
tctttaacgg acatgtcgtg cgaggtacca gcctgcaccc attcctcaga ctttgggggc 11220
gtcgccatta ttaaatatgc agccagcaag aaaggcaagt gtgcggtgca ttcgatgact 11280
aacgccgtca ctattcggga agctgagata gaagttgaag ggaattctca gctgcaaatc 11340
tctttctcga cggccttagc cagcgccgaa ttccgcgtac aagtctgttc tacacaagta 11400
cactgtgcag ccgagtgcca ccccccgaag gaccacatag tcaactaccc ggcgtcacat 11460
accaccctcg gggtccagga catctccgct acggcgatgt catgggtgca gaagatcacg 11520
ggaggtgtgg gactggttgt tgctgttgcc gcactgattc taatcgtggt gctatgcgtg 11580
tcgttcagca ggcactaact tgacaattaa gtatgaaggt atatgtgtcc cctaagagac 11640
acactgtaca tagcaaataa tctatagatc aaagggctac gcaacccctg aatagtaaca 11700
aaatacaaaa tcactaaaaa ttataaaaac agaaaaatac ataaataggt atacgtgtcc 11760
cctaagagac acattgtatg taggtgataa gtatagatca aagggccgaa taacccctga 11820
atagtaacaa aatatgaaaa tcaataaaaa tcataaaata gaaaaaccat aaacagaagt 11880
agttcaaagg gctataaaac ccctgaatag taacaaaaca taaaattaat aaaaatcaaa 11940
tgaataccat aattggcaaa cggaagagat gtaggtactt aagcttccta aaagcagccg 12000
aactcacttt gagaagtagg catagcatac cgaactcttc cacgattctc cgaacccaca 12060
gggacgtagg agatgttatt ttgtttttaa tatttc 12096
<210> 6
<211> 748
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 6
ttaaaacagc ctgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgctag cactctggta 60
ctgaggtacc tttgtgcgcc tgtttttact ccccttcccc cgaagtaact tagaagctgt 120
aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt 180
tccccggact gagtatcaat aggctgctcg cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc 240
gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca 300
caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt 360
ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa tccatgggac gctctaattc tgacatggtg 420
tgaagagcct attgagctag ctggtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact 480
gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga 540
accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcctat attggctgct tatggtgaca 600
atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgtgcaa cagggcaatt 660
gtttacctat ttattggttt tgtaccatta tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc 720
attttgaccc tcaacacaat caaacatg 748
<210> 7
<211> 604
<212> DNA
<213> Human rhinovirus
<400> 7
atccaggttg ttcccacctg gatttcccac agggagtggt actctgttat tacggtaact 60
ttgtacgcca gttttatctc ccttccccca tgtaacttag aagtttttca caaagaccaa 120
tagccggtaa tcagccagat tactgaaggt caagcacttc tgtttccccg gtcaatgttg 180
atatgctcca acagggcaaa aacaactgcg atcgttaacc gcaaagcgcc tacgcaaagc 240
ttagtagcat ctttgaaatc gtttggctgg tcgatccgcc atttcccctg gtagacctgg 300
cagatgaggc tagaaatacc ccactggcga cagtgttcta gcctgcgtgg ctgcctgcac 360
accctatggg tgtgaagcca aacaatggac aaggtgtgaa gagccccgtg tgctcgcttt 420
gagtcctccg gcccctgaat gtggctaacc ttaaccctgc agctagagca cgtaacccaa 480
tgtgtatcta gtcgtaatga gcaattgcgg gatgggacca actactttgg gtgtccgtgt 540
ttcacttttt cctttatatt tgcttatggt gacaatatat acaatatata tattggcacc 600
atgg 604
<210> 8
<211> 461
<212> DNA
<213> Foot-and-mouth disease virus
<400> 8
agcaggtttc cccaactgac acaaaacgtg caacttgaaa ctccgcctgg tctttccagg 60
tctagagggg taacactttg tactgtgttt ggctccacgc tcgatccact ggcgagtgtt 120
agtaacagca ctgttgcttc gtagcggagc atgacggccg tgggaactcc tccttggtaa 180
caaggaccca cggggccaaa agccacgccc acacgggccc gtcatgtgtg caaccccagc 240
acggcgactt tactgcgaaa cccactttaa agtgacattg aaactggtac ccacacactg 300
gtgacaggct aaggatgccc ttcaggtacc ccgaggtaac acgcgacact cgggatctga 360
gaaggggact ggggcttcta taaaagcgct cggtttaaaa agcttctatg cctgaatagg 420
tgaccggagg tcggcacctt tcctttacaa ttaatgaccc t 461
<210> 9
<211> 960
<212> DNA
<213> Theiler's encephalomyelitis virus
<400> 9
ggttaccccc tttcgacgcg ggtactgcga tagtgccacc ccagtctttc ctactcccga 60
ctcccgaccc taacccaggt tcctcggaac aggaacacca atttactcat cccctggatg 120
agaggaacgt cagcattttc cggcccaggc taagagaagt agataagtta gaatccaaat 180
tgatttatca tccccttgac gaattcgcgt tggaaaaaca cctctcactt gccgctcttc 240
acacccatta atttaattcg gcctctgtgt tgagcccctt gttgaagtgt ttccctccat 300
cgcgacgtgg ttggagatct aagtcaaccg actccgacga aactaccatc atgcctcccc 360
gattatgtga tgctttctgc cctgctgggt ggagcaccct cgggttgaga aaaccttctt 420
cctttttcct tggactccgg tcccccggtc taagccgctc ggaatatgac agggttattt 480
tcacctcttc ttttctactc cacagtgttc tatactgtgg aagggtatgt gttgcccctt 540
ccttcttgga gaacgtgcgc ggcggtcttt ccgtctctcg acaagcgcgc gtgcaacata 600
cagagtaacg cgaagaaagc agttctcggt ctagctctag tgcccacaag aaaacagctg 660
tagcgaccac acaaaggcag cggaaccccc ctcctggtaa caggagcctc tgcggccaaa 720
agccacgtgg ataagatcca cctttgtgtg cggtgcaacc ccagcaccct ggtttcttgg 780
tgacactcta gtgaacccct gaatggcaat ctcaagcgcc tctgtaggga agccaagaat 840
gtccaggagg taccccttcc tctcggaagg gatctgacct ggagacacat cacacgtgct 900
ttacacctgt gcttgtgttt aaaaattgtt acagcttccc cgaaccaagt ggtcttggtt 960
960
<210> 10
<211> 383
<212> DNA
<213> Hepacivirus
<400> 10
gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg 60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180
gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240
gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300
gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 360
ctcaaagaaa aaccaaacgt aac 383
<210> 11
<211> 12339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-HAV IRES
<400> 11
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt taattcctgc aggttcaggg ttcttaaatc tgtttctcta taagaacact 7560
catttttcac gctttctgtc ttctttcttc cagggctctc cccttgccct aggctctggc 7620
cgttgcgccc ggcggggtca actccatgat tagcatggag ctgtaggagt ctaaattggg 7680
gacacagatg tttggaacgt caccttgcag tgttaacttg gctttcatga atctctttga 7740
tcttccacaa ggggtaggct acgggtgaaa cctcttaggc taatacttct atgaagagat 7800
gccttggata gggtaacagc ggcggatatt ggtgagttgt taagacaaaa accattcaac 7860
gccggaggac tgactctcat ccagtggatg cattgagtgg attgactgtc agggctgtct 7920
ttaggcttaa ttccagacct ctctgtgctt agggcaaaca tcatttggcc ttaaatggga 7980
ttctgtgaga ggggatccct ccattgacag ctggactgtt ctttggggcc ttatgtggtg 8040
tttgcctctg aggtactcag gggcatttag gtttttcctc attcttaaat aataatggag 8100
ttcatcccaa cccaaacttt ttacaatagg aggtaccagc ctcgaccctg gactccgcgc 8160
cctactatcc aagtcatcag gcccagaccg cgccctcaga ggcaagctgg gcaacttgcc 8220
cagctgatct cagcagttaa taaactgaca atgcgcgcgg taccacaaca gaagccacgc 8280
aggaatcgga agaataagaa gcaaaagcaa aaacaacagg cgccacaaaa caacacaaat 8340
caaaagaagc agccacctaa aaagaaaccg gctcaaaaga aaaagaagcc gggccgcaga 8400
gagaggatgt gcatgaaaat cgaaaatgat tgtattttcg aagtcaagca cgaaggtaag 8460
gtaacaggtt acgcgtgcct ggtgggggac aaagtaatga aaccagcaca cgtaaagggg 8520
accatcgata acgcggacct ggccaaactg gcctttaagc ggtcatctaa gtatgacctt 8580
gaatgcgcgc agatacccgt gcacatgaag tccgacgctt cgaagttcac ccatgagaaa 8640
ccggaggggt actacaactg gcaccacgga gcagtacagt actcaggagg ccggttcacc 8700
atccctacag gtgctggcaa accaggggac agcggcagac cgatcttcga caacaaggga 8760
cgcgtggtgg ccatagtctt aggaggagct aatgaaggag cccgtacagc cctctcggtg 8820
gtgacctgga ataaagacat tgtcactaaa atcacccccg agggggccga agagtggagt 8880
cttgccatcc cagttatgtg cctgttggca aacaccacgt tcccctgctc ccagccccct 8940
tgcacgccct gctgctacga aaaggaaccg gaggaaaccc tacgcatgct tgaggacaac 9000
gtcatgagac ctgggtacta tcagctgcta caagcatcct taacatgttc tccccaccgc 9060
cagcgacgca gcaccaagga caacttcaat gtctataaag ccacaagacc atacttagct 9120
cactgtcccg actgtggaga agggcactcg tgccatagtc ccgtagcact agaacgcatc 9180
agaaatgaag cgacagacgg gacgctgaaa atccaggtct ccttgcaaat cggaataaag 9240
acggatgaca gccacgattg gaccaagctg cgttatatgg acaaccacat gccagcagac 9300
gcagagaggg cggggctatt tgtaagaaca tcagcaccgt gtacgattac tggaacaatg 9360
ggacacttca tcctggcccg atgtccaaaa ggggaaactc tgacggtggg attcactgac 9420
agtaggaaga ttagtcactc atgtacgcac ccatttcacc acgaccctcc tgtgataggt 9480
cgggaaaaat tccattcccg accgcagcac ggtaaagagc taccttgcag cacgtacgtg 9540
cagagcaccg ccgcaactac cgaggagata gaggtacaca tgcccccaga cacccctgat 9600
cgcacattaa tgtcacaaca gtccggcaac gtaaagatca cagtcaatgg ccagacggtg 9660
cggtacaagt gtaattgcgg tggctcaaat gaaggactaa caactacaga caaagtgatt 9720
aataactgca aggttgatca atgtcatgcc gcggtcacca atcacaaaaa gtggcagtat 9780
aactcccctc tggtcccgcg taatgctgaa cttggggacc gaaaaggaaa aattcacatc 9840
ccgtttccgc tggcaaatgt aacatgcagg gtgcctaaag caaggaaccc caccgtgacg 9900
tacgggaaaa accaagtcat catgctactg tatcctgacc acccaacact cctgtcctac 9960
cggaatatgg gagaagaacc aaactatcaa gaagagtggg tgatgcataa gaaggaagtc 10020
gtgctaaccg tgccgactga agggctcgag gtcacgtggg gcaacaacga gccgtataag 10080
tattggccgc agttatctac aaacggtaca gcccatggcc acccgcatga gataattctg 10140
tattattatg agctgtaccc cactatgact gtagtagttg tgtcagtggc cacgttcata 10200
ctcctgtcga tggtgggtat ggcagcgggg atgtgcatgt gtgcacgacg cagatgcatc 10260
acaccgtatg aactgacacc aggagctacc gtccctttcc tgcttagcct aatatgctgc 10320
atcagaacag ctaaagcggc cacataccaa gaggctgcga tatacctgtg gaacgagcag 10380
caacctttgt tttggctaca agcccttatt ccgctggcag ccctgattgt tctatgcaac 10440
tgtctgagac tcttaccatg ctgctgtaaa acgttggctt ttttagccgt aatgagcgtc 10500
ggtgcccaca ctgtgagcgc gtacgaacac gtaacagtga tcccgaacac ggtgggagta 10560
ccgtataaga ctctagtcaa tagacctggc tacagcccca tggtattgga gatggaacta 10620
ctgtcagtca ctttggagcc aacactatcg cttgattaca tcacgtgcga gtacaaaacc 10680
gtcatcccgt ctccgtacgt gaagtgctgc ggtacagcag agtgcaagga caaaaaccta 10740
cctgactaca gctgtaaggt cttcaccggc gtctacccat ttatgtgggg cggcgcctac 10800
tgcttctgcg acgctgaaaa cacgcagttg agcgaagcac acgtggagaa gtccgaatca 10860
tgcaaaacag aatttgcatc agcatacagg gctcataccg catctgcatc agctaagctc 10920
cgcgtccttt accaaggaaa taacatcact gtaactgcct atgcaaacgg cgaccatgcc 10980
gtcacagtta aggacgccaa attcattgtg gggccaatgt cttcagcctg gacacctttc 11040
gacaacaaaa ttgtggtgta caaaggtgac gtctataaca tggactaccc gccctttggc 11100
gcaggaagac caggacaatt tggcgatatc caaagtcgca cacctgagag taaagacgtc 11160
tatgctaata cacaactggt actgcagaga ccggctgtgg gtacggtaca cgtgccatac 11220
tctcaggcac catctggctt taagtattgg ctaaaagaac gcggggcgtc gctgcagcac 11280
acagcaccat ttggctgcca aatagcaaca aacccggtaa gagcggtgaa ctgcgccgta 11340
gggaacatgc ccatctccat cgacataccg gaagcggcct tcactagggt cgtcgacgcg 11400
ccctctttaa cggacatgtc gtgcgaggta ccagcctgca cccattcctc agactttggg 11460
ggcgtcgcca ttattaaata tgcagccagc aagaaaggca agtgtgcggt gcattcgatg 11520
actaacgccg tcactattcg ggaagctgag atagaagttg aagggaattc tcagctgcaa 11580
atctctttct cgacggcctt agccagcgcc gaattccgcg tacaagtctg ttctacacaa 11640
gtacactgtg cagccgagtg ccaccccccg aaggaccaca tagtcaacta cccggcgtca 11700
cataccaccc tcggggtcca ggacatctcc gctacggcga tgtcatgggt gcagaagatc 11760
acgggaggtg tgggactggt tgttgctgtt gccgcactga ttctaatcgt ggtgctatgc 11820
gtgtcgttca gcaggcacta acttgacaat taagtatgaa ggtatatgtg tcccctaaga 11880
gacacactgt acatagcaaa taatctatag atcaaagggc tacgcaaccc ctgaatagta 11940
acaaaataca aaatcactaa aaattataaa aacagaaaaa tacataaata ggtatacgtg 12000
tcccctaaga gacacattgt atgtaggtga taagtataga tcaaagggcc gaataacccc 12060
tgaatagtaa caaaatatga aaatcaataa aaatcataaa atagaaaaac cataaacaga 12120
agtagttcaa agggctataa aacccctgaa tagtaacaaa acataaaatt aataaaaatc 12180
aaatgaatac cataattggc aaacggaaga gatgtaggta cttaagcttc ctaaaagcag 12240
ccgaactcac tttgagaagt aggcatagca taccgaactc ttccacgatt ctccgaaccc 12300
acagggacgt aggagatgtt attttgtttt taatatttc 12339
<210> 12
<211> 12189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV-FGF1 IRES
<400> 12
atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60
agattaataa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120
gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa ccaaggcagg tcacaccgaa 180
tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240
tgaccccgac tcaaccatcc tggatatcgg cagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300
caggaagtac cactgcgtct gcccgatgcg cagtgcggaa gatcccgaga gactcgccaa 360
ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420
gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480
acacacagac gtctcatgta gacagagagc agacgtcgct atataccaag acgtctatgc 540
tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgag tggcgtactg 600
ggttgggttc gacacaaccc cgttcatgta caatgccatg gcgggtgcct acccctcata 660
ctcgacaaac tgggcagatg agcaggtact gaaggctaag aacataggat tatgttcaac 720
agacctgacg gaaggtagac gaggcaagtt gtctattatg agagggaaaa agctaaaacc 780
gtgcgaccgt gtgctgttct cagtagggtc aacgctctac ccggaaagcc gcaagctact 840
taagagctgg cacctgccat cggtgttcca tttaaagggc aaactcagct tcacatgccg 900
ctgtgataca gtggtttcgt gtgagggcta cgtcgttaag agaataacga tgagcccagg 960
cctttatgga aaaaccacag ggtatgcggt aacccaccac gcagacggat tcctgatgtg 1020
caagactacc gacacggttg acggcgaaag aatgtcattc tcggtgtgca catacgtgcc 1080
ggcgaccatt tgtgatcaaa tgaccggcat ccttgctaca gaagtcacgc cggaggatgc 1140
acagaagctg ttggtggggc tgaaccagag aatagtggtt aacggcagaa cgcaacggaa 1200
tacgaacacc atgaaaaatt atctgcttcc cgtggtcgcc caagccttca gtaagtgggc 1260
aaaggagtgc cggaaagaca tggaagatga aaaactcctg ggggtcagag aaagaacact 1320
gacctgctgc tgtctatggg cattcaagaa gcagaaaaca cacacggtct acaagaggcc 1380
tgatacccag tcaattcaga aggttcaggc cgagtttgac agctttgtgg taccgagtct 1440
gtggtcgtcc gggttgtcaa tccctttgag gactagaatc aaatggttgt taagcaaggt 1500
gccaaaaacc gacctgatcc catacagcgg agacgcccga gaagcccggg acgcagaaaa 1560
agaagcagag gaagaacgag aagcagaact gactcgcgaa gccctaccac ctctacaggc 1620
agcacaggaa gatgttcagg tcgaaatcga cgtggaacag cttgaggaca gagcgggcgc 1680
aggaataata gagactccga gaggagctat caaagttact gcccaaccaa cagaccacgt 1740
cgtgggagag tacctggtac tctccccgca gaccgtacta cgtagccaga agctcagtct 1800
gattcacgct ttggcggagc aagtgaagac gtgcacgcac aacggacgag cagggaggta 1860
tgcggtcgaa gcgtacgacg gccgagtcct agtgccctca ggctatgcaa tctcgcctga 1920
agacttccag agtctaagcg aaagcgcaac gatggtgtat aacgaaagag agttcgtaaa 1980
cagaaagcta caccatattg cgatgcacgg accagccctg aacaccgacg aagagtcgta 2040
tgagctggtg agggcagaga ggacagaaca cgagtacgtc tacgacgtgg atcagagaag 2100
atgctgtaag aaggaagaag ccgcaggact ggtactggtg ggcgacttga ctaatccgcc 2160
ctaccacgaa ttcgcatatg aagggctaaa aatccgccct gcctgcccat acaaaattgc 2220
agtcatagga gtcttcggag taccgggatc tggcaagtca gctattatca agaacctagt 2280
taccaggcag gacctggtga ctagcggaaa gaaagaaaac tgccaagaaa tcaccaccga 2340
cgtgatgaga cagagaggtc tagagatatc tgcacgtacg gttgactcgc tgctcttgaa 2400
tggatgcaac agaccagtcg acgtgttgta cgtagacgag gcgtttgcgt gccactctgg 2460
aacgctactt gctttgatcg ccttggtgag accaaggcag aaagttgtac tttgtggtga 2520
cccgaagcag tgcggcttct tcaatatgat gcagatgaaa gtcaactata atcacaacat 2580
ctgcacccaa gtgtaccaca aaagtatctc caggcggtgt acactgcctg tgaccgccat 2640
tgtgtcatcg ttgcattacg aaggcaaaat gcgcactacg aatgagtaca acaagccgat 2700
tgtagtggac actacaggct caacaaaacc tgaccctgga gacctcgtgt taacgtgctt 2760
cagagggtgg gttaaacaac tgcaaattga ctatcgtgga tacgaggtca tgacagcagc 2820
cgcatcccaa gggttaacca gaaaaggagt ttacgcagtt agacaaaaag ttaatgaaaa 2880
cccgctctat gcatcaacgt cagagcacgt caacgtactc ctaacgcgta cggaaggtaa 2940
actggtatgg aagacacttt ccggcgaccc gtggataaag acgctgcaga acccaccgaa 3000
aggaaacttc aaagcaacta ttaaggagtg ggaggtggag catgcatcaa taatggcggg 3060
catctgcagt caccaaatga ccttcgatac attccaaaat aaagccaacg tttgttgggc 3120
taagagcttg gtccctatcc tcgaaacagc ggggataaaa ctaaatgata ggcagtggtc 3180
tcagataatt caagccttca aagaagacaa agcatactca cctgaagtag ccctgaatga 3240
aatatgtacg cgcatgtatg gggtggatct agacagcggg ctattttcta aaccgttggt 3300
gtctgtgtat tacgcggata accactggga taataggcct ggagggaaaa tgttcggatt 3360
taaccccgag gcagcatcca ttctagaaag aaagtatcca ttcacaaaag ggaagtggaa 3420
catcaacaag cagatctgcg tgactaccag gaggatagaa gactttaacc ctaccaccaa 3480
catcataccg gccaacagga gactaccaca ctcattagtg gccgaacacc gcccagtaaa 3540
aggggaaaga atggaatggc tggttaacaa gataaacggc caccacgtgc tcctggtcag 3600
tggctataac cttgcactgc ctactaagag agtcacttgg gtagcgccgt taggtgtccg 3660
cggagcggac tacacataca acctagagtt gggtctgcca gcaacgcttg gtaggtatga 3720
cctagtggtc ataaacatcc acacaccttt tcgcatacac cattaccaac agtgcgtcga 3780
ccacgcaatg aaactgcaaa tgctcggggg tgactcattg agactgctca aaccgggcgg 3840
ctctctattg atcagagcat atggttacgc agatagaacc agtgaacgag tcatctgcgt 3900
attgggacgc aagtttagat cgtctagagc gttgaaacca ccatgtgtca ccagcaacac 3960
tgagatgttt ttcctattca gcaactttga caatggcaga aggaatttca caactcatgt 4020
catgaacaat caactgaatg cagccttcgt aggacaggtc acccgagcag gatgtgcacc 4080
gtcgtaccgg gtaaaacgca tggacatcgc gaagaacgat gaagagtgcg tagtcaacgc 4140
cgctaaccct cgcgggttac cgggtggcgg tgtttgcaag gcagtataca aaaaatggcc 4200
ggagtccttt aagaacagtg caacaccagt gggaaccgca aaaacagtta tgtgcggtac 4260
gtatccagta atccacgctg ttggaccaaa cttctctaat tattcggagt ctgaagggga 4320
ccgggaattg gcagctgcct atcgagaagt cgcaaaggaa gtaactaggc tgggagtaaa 4380
tagtgtagct atacctctcc tctccacagg tgtatactca ggagggaaag acaggctgac 4440
ccagtcactg aaccacctct ttacagccat ggactcgacg gatgcagacg tggtcatcta 4500
ctgccgcgac aaagaatggg agaagaaaat atctgaggcc atacagatgc ggacccaagt 4560
agagctgctg gatgagcaca tctccataga ctgcgatatt gttcgcgtgc accctgacag 4620
cagcttggca ggcagaaaag gatacagcac cacggaaggc gcactgtact catatctaga 4680
agggacccgt tttcatcaga cggctgtgga tatggcggag atacatacta tgtggccaaa 4740
gcaaacagag gccaatgagc aagtctgcct atatgccctg ggggaaagta ttgaatcgat 4800
caggcagaaa tgcccggtgg atgatgcaga cgcatcatct ccccccaaaa ctgtcccgtg 4860
cctttgccgt tacgctatga ctccagaacg cgtcacccgg cttcgcatga accacgtcac 4920
aagcataatt gtgtgttctt cgtttcccct cccaaagtac aaaatagaag gagtgcaaaa 4980
agtcaaatgc tctaaggtaa tgctatttga ccacaacgtg ccatcgcgcg taagtccaag 5040
ggaatataga tcttcccagg agtctgcaca ggaggcgagt acaatcacgt cactgacgca 5100
tagtcaattc gacctaagcg ttgatggcga gatactgccc gtcccgtcag acctggatgc 5160
tgacgcccca gccctagaac cagcactaga cgacggggcg acacacacgc tgccatccac 5220
aaccggaaac cttgcggccg tgtctgattg ggtaatgagc accgtacctg tcgcgccgcc 5280
cagaagaagg cgagggagaa acctgactgt gacatgtgac gagagagaag ggaatataac 5340
acccatggct agcgtccgat tctttagggc agagctgtgt ccggtcgtac aagaaacagc 5400
ggagacgcgt gacacagcaa tgtctcttca ggcaccaccg agtaccgcca cggaaccgaa 5460
tcatccgccg atctccttcg gagcatcaag cgagacgttc cccattacat ttggggactt 5520
caacgaagga gaaatcgaaa gcttgtcttc tgagctacta actttcggag acttcttacc 5580
aggagaagtg gatgacttga cagacagcga ctggtccacg tgctcagaca cggacgacga 5640
gttaagacta gacagggcag gtgggtatat attctcgtcg gacaccggtc caggtcattt 5700
acaacagaag tcagtacgcc agtcagtgct gccggtgaac accctggagg aagtccacga 5760
ggagaagtgt tacccaccta agctggatga agcaaaggag caactattac ttaagaaact 5820
ccaggagagt gcatccatgg ccaacagaag caggtatcag tcgcgcaaag tagaaaacat 5880
gaaagcagca atcatccaga gactaaagag aggctgtaga ctatacttaa tgtcagagac 5940
cccaaaagtc cctacttacc ggactacata tccggcgcct gtgtactcgc ctccgatcaa 6000
cgtccgattg tccaatcccg agtccgcagt ggcagcatgc aatgagttct tagctagaaa 6060
ctatccaact gtctcatcat accaaattac cgacgagtat gatgcatatc tagacatggt 6120
ggacgggtcg gagagttgcc tggaccgagc gacattcaat ccgtcaaaac tcaggagcta 6180
cccgaaacag cacgcttacc acgcgccctc catcagaagc gctgtaccgt ccccattcca 6240
gaacacacta cagaatgtac tggcagcagc cacgaaaaga aactgcaacg tcacacagat 6300
gagggaatta cccactttgg actcagcagt attcaacgtg gagtgtttca aaaaattcgc 6360
atgcaaccaa gaatactggg aagaatttgc tgccagccct attaggataa caactgagaa 6420
tttagcaacc tatgttacta aactaaaagg gccaaaagca gcagcgctat tcgcaaaaac 6480
ccataatcta ctgccactac aggaagtacc aatggatagg ttcacagtag atatgaaaag 6540
ggacgtaaag gtgactcctg gtacaaagca tacagaggaa agacctaagg tgcaggttat 6600
acaggcggct gaacccttgg cgacagcata cctatgtggg attcacagag agctggttag 6660
gaggctgaac gccgtcctcc tacccaatgt acatacacta tttgacatgt ctgccgagga 6720
tttcgatgcc atcatagccg cacactttaa gccaggagac actgttttgg aaacggacat 6780
agcctccttt gataagagcc aagatgattc acttgcgctt actgctttga tgctgttaga 6840
ggatttaggg gtggatcact ccctgctgga cttgatagag gctgctttcg gagagatttc 6900
cagctgtcac ctaccgacag gtacgcgctt caagttcggc gccatgatga aatcaggtat 6960
gttcctaact ctgttcgtca acacattgtt aaacatcacc atcgccagcc gagtgctgga 7020
agatcgtctg acaaaatccg cgtgcgcggc cttcatcggc gacgacaaca taatacatgg 7080
agtcgtctcc gatgaattga tggcagccag atgtgccact tggatgaaca tggaagtgaa 7140
gatcatagat gcagttgtat ccttgaaagc cccttacttt tgtggagggt ttatactgca 7200
cgatactgtg acaggaacag cttgcagagt ggcagacccg ctaaaaaggc tttttaaact 7260
gggcaaaccg ctagcggcag gtgacgaaca agatgaagat agaagacgag cgctggctga 7320
cgaagtgatc agatggcaac gaacagggct aattgatgag ctggagaaag cggtatactc 7380
taggtacgaa gtgcagggta tatcagttgt ggtaatgtcc atggccacct ttgcaagctc 7440
cagatccaac ttcgagaagc tcagaggacc cgtgattacg ctttatggag gaccgaagta 7500
ataaactagt gtgggcatac cagtgtcagc tgcacttgta ggggcccaag tgcctcatga 7560
cccactcggc agccttcctc tccaggatcc ccaaggctag gaggccaacc tactaacagg 7620
tgggtgggta tggtgtgtgg tttcactcag ttcttctcat ggggtttctc tgagctccat 7680
tcataccaga aagggagcag gagagagagg acaagtggat ccaacagcct tcgctccagg 7740
ggaatcaggg catcgcctcc ttttctggga ggacactccc ttctgatggt gaatgggaac 7800
tcccttcctc ctgcagcagc ctgcctgcag ctgtcctggt agaacagtgt ggacattgca 7860
gaagctgtca ctgccccaga aagaaagcac cccagagcca aggcaaagag tcttgaaagc 7920
gccacaagca gcagctgctg agccatggag ttcatcccaa cccaaacttt ttacaatagg 7980
aggtaccagc ctcgaccctg gactccgcgc cctactatcc aagtcatcag gcccagaccg 8040
cgccctcaga ggcaagctgg gcaacttgcc cagctgatct cagcagttaa taaactgaca 8100
atgcgcgcgg taccacaaca gaagccacgc aggaatcgga agaataagaa gcaaaagcaa 8160
aaacaacagg cgccacaaaa caacacaaat caaaagaagc agccacctaa aaagaaaccg 8220
gctcaaaaga aaaagaagcc gggccgcaga gagaggatgt gcatgaaaat cgaaaatgat 8280
tgtattttcg aagtcaagca cgaaggtaag gtaacaggtt acgcgtgcct ggtgggggac 8340
aaagtaatga aaccagcaca cgtaaagggg accatcgata acgcggacct ggccaaactg 8400
gcctttaagc ggtcatctaa gtatgacctt gaatgcgcgc agatacccgt gcacatgaag 8460
tccgacgctt cgaagttcac ccatgagaaa ccggaggggt actacaactg gcaccacgga 8520
gcagtacagt actcaggagg ccggttcacc atccctacag gtgctggcaa accaggggac 8580
agcggcagac cgatcttcga caacaaggga cgcgtggtgg ccatagtctt aggaggagct 8640
aatgaaggag cccgtacagc cctctcggtg gtgacctgga ataaagacat tgtcactaaa 8700
atcacccccg agggggccga agagtggagt cttgccatcc cagttatgtg cctgttggca 8760
aacaccacgt tcccctgctc ccagccccct tgcacgccct gctgctacga aaaggaaccg 8820
gaggaaaccc tacgcatgct tgaggacaac gtcatgagac ctgggtacta tcagctgcta 8880
caagcatcct taacatgttc tccccaccgc cagcgacgca gcaccaagga caacttcaat 8940
gtctataaag ccacaagacc atacttagct cactgtcccg actgtggaga agggcactcg 9000
tgccatagtc ccgtagcact agaacgcatc agaaatgaag cgacagacgg gacgctgaaa 9060
atccaggtct ccttgcaaat cggaataaag acggatgaca gccacgattg gaccaagctg 9120
cgttatatgg acaaccacat gccagcagac gcagagaggg cggggctatt tgtaagaaca 9180
tcagcaccgt gtacgattac tggaacaatg ggacacttca tcctggcccg atgtccaaaa 9240
ggggaaactc tgacggtggg attcactgac agtaggaaga ttagtcactc atgtacgcac 9300
ccatttcacc acgaccctcc tgtgataggt cgggaaaaat tccattcccg accgcagcac 9360
ggtaaagagc taccttgcag cacgtacgtg cagagcaccg ccgcaactac cgaggagata 9420
gaggtacaca tgcccccaga cacccctgat cgcacattaa tgtcacaaca gtccggcaac 9480
gtaaagatca cagtcaatgg ccagacggtg cggtacaagt gtaattgcgg tggctcaaat 9540
gaaggactaa caactacaga caaagtgatt aataactgca aggttgatca atgtcatgcc 9600
gcggtcacca atcacaaaaa gtggcagtat aactcccctc tggtcccgcg taatgctgaa 9660
cttggggacc gaaaaggaaa aattcacatc ccgtttccgc tggcaaatgt aacatgcagg 9720
gtgcctaaag caaggaaccc caccgtgacg tacgggaaaa accaagtcat catgctactg 9780
tatcctgacc acccaacact cctgtcctac cggaatatgg gagaagaacc aaactatcaa 9840
gaagagtggg tgatgcataa gaaggaagtc gtgctaaccg tgccgactga agggctcgag 9900
gtcacgtggg gcaacaacga gccgtataag tattggccgc agttatctac aaacggtaca 9960
gcccatggcc acccgcatga gataattctg tattattatg agctgtaccc cactatgact 10020
gtagtagttg tgtcagtggc cacgttcata ctcctgtcga tggtgggtat ggcagcgggg 10080
atgtgcatgt gtgcacgacg cagatgcatc acaccgtatg aactgacacc aggagctacc 10140
gtccctttcc tgcttagcct aatatgctgc atcagaacag ctaaagcggc cacataccaa 10200
gaggctgcga tatacctgtg gaacgagcag caacctttgt tttggctaca agcccttatt 10260
ccgctggcag ccctgattgt tctatgcaac tgtctgagac tcttaccatg ctgctgtaaa 10320
acgttggctt ttttagccgt aatgagcgtc ggtgcccaca ctgtgagcgc gtacgaacac 10380
gtaacagtga tcccgaacac ggtgggagta ccgtataaga ctctagtcaa tagacctggc 10440
tacagcccca tggtattgga gatggaacta ctgtcagtca ctttggagcc aacactatcg 10500
cttgattaca tcacgtgcga gtacaaaacc gtcatcccgt ctccgtacgt gaagtgctgc 10560
ggtacagcag agtgcaagga caaaaaccta cctgactaca gctgtaaggt cttcaccggc 10620
gtctacccat ttatgtgggg cggcgcctac tgcttctgcg acgctgaaaa cacgcagttg 10680
agcgaagcac acgtggagaa gtccgaatca tgcaaaacag aatttgcatc agcatacagg 10740
gctcataccg catctgcatc agctaagctc cgcgtccttt accaaggaaa taacatcact 10800
gtaactgcct atgcaaacgg cgaccatgcc gtcacagtta aggacgccaa attcattgtg 10860
gggccaatgt cttcagcctg gacacctttc gacaacaaaa ttgtggtgta caaaggtgac 10920
gtctataaca tggactaccc gccctttggc gcaggaagac caggacaatt tggcgatatc 10980
caaagtcgca cacctgagag taaagacgtc tatgctaata cacaactggt actgcagaga 11040
ccggctgtgg gtacggtaca cgtgccatac tctcaggcac catctggctt taagtattgg 11100
ctaaaagaac gcggggcgtc gctgcagcac acagcaccat ttggctgcca aatagcaaca 11160
aacccggtaa gagcggtgaa ctgcgccgta gggaacatgc ccatctccat cgacataccg 11220
gaagcggcct tcactagggt cgtcgacgcg ccctctttaa cggacatgtc gtgcgaggta 11280
ccagcctgca cccattcctc agactttggg ggcgtcgcca ttattaaata tgcagccagc 11340
aagaaaggca agtgtgcggt gcattcgatg actaacgccg tcactattcg ggaagctgag 11400
atagaagttg aagggaattc tcagctgcaa atctctttct cgacggcctt agccagcgcc 11460
gaattccgcg tacaagtctg ttctacacaa gtacactgtg cagccgagtg ccaccccccg 11520
aaggaccaca tagtcaacta cccggcgtca cataccaccc tcggggtcca ggacatctcc 11580
gctacggcga tgtcatgggt gcagaagatc acgggaggtg tgggactggt tgttgctgtt 11640
gccgcactga ttctaatcgt ggtgctatgc gtgtcgttca gcaggcacta acttgacaat 11700
taagtatgaa ggtatatgtg tcccctaaga gacacactgt acatagcaaa taatctatag 11760
atcaaagggc tacgcaaccc ctgaatagta acaaaataca aaatcactaa aaattataaa 11820
aacagaaaaa tacataaata ggtatacgtg tcccctaaga gacacattgt atgtaggtga 11880
taagtataga tcaaagggcc gaataacccc tgaatagtaa caaaatatga aaatcaataa 11940
aaatcataaa atagaaaaac cataaacaga agtagttcaa agggctataa aacccctgaa 12000
tagtaacaaa acataaaatt aataaaaatc aaatgaatac cataattggc aaacggaaga 12060
gatgtaggta cttaagcttc ctaaaagcag ccgaactcac tttgagaagt aggcatagca 12120
taccgaactc ttccacgatt ctccgaaccc acagggacgt aggagatgtt attttgtttt 12180
taatatttc 12189
<210> 13
<211> 584
<212> DNA
<213> Hepatitis A virus
<400> 13
taattcctgc aggttcaggg ttcttaaatc tgtttctcta taagaacact catttttcac 60
gctttctgtc ttctttcttc cagggctctc cccttgccct aggctctggc cgttgcgccc 120
ggcggggtca actccatgat tagcatggag ctgtaggagt ctaaattggg gacacagatg 180
tttggaacgt caccttgcag tgttaacttg gctttcatga atctctttga tcttccacaa 240
ggggtaggct acgggtgaaa cctcttaggc taatacttct atgaagagat gccttggata 300
gggtaacagc ggcggatatt ggtgagttgt taagacaaaa accattcaac gccggaggac 360
tgactctcat ccagtggatg cattgagtgg attgactgtc agggctgtct ttaggcttaa 420
ttccagacct ctctgtgctt agggcaaaca tcatttggcc ttaaatggga ttctgtgaga 480
ggggatccct ccattgacag ctggactgtt ctttggggcc ttatgtggtg tttgcctctg 540
aggtactcag gggcatttag gtttttcctc attcttaaat aata 584
<210> 14
<211> 434
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gtgggcatac cagtgtcagc tgcacttgta ggggcccaag tgcctcatga cccactcggc 60
agccttcctc tccaggatcc ccaaggctag gaggccaacc tactaacagg tgggtgggta 120
tggtgtgtgg tttcactcag ttcttctcat ggggtttctc tgagctccat tcataccaga 180
aagggagcag gagagagagg acaagtggat ccaacagcct tcgctccagg ggaatcaggg 240
catcgcctcc ttttctggga ggacactccc ttctgatggt gaatgggaac tcccttcctc 300
ctgcagcagc ctgcctgcag ctgtcctggt agaacagtgt ggacattgca gaagctgtca 360
ctgccccaga aagaaagcac cccagagcca aggcaaagag tcttgaaagc gccacaagca 420
gcagctgctg agcc 434
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
gaycccgact caaccatcct 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
catmgggcar acgcactggt a 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 17
agygcgccag caaggaggak gatgt 25
<210> 18
<211> 1248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a structural peptide of CHIK-IRES
<400> 18
Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro
1 5 10 15
Arg Pro Trp Thr Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro
20 25 30
Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn
50 55 60
Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn
65 70 75 80
Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys
85 90 95
Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp
100 105 110
Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys
115 120 125
Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile
130 135 140
Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser
165 170 175
Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly
180 185 190
Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly
195 200 205
Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val
210 215 220
Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu
225 230 235 240
Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu
245 250 255
Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Ile Pro Val Met Cys Leu Leu Ala
260 265 270
Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr
275 280 285
Glu Lys Glu Pro Glu Glu Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met
290 295 300
Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Gln Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro
305 310 315 320
His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala
325 330 335
Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser
340 345 350
Cys His Ser Pro Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp
355 360 365
Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp
370 375 380
Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro
385 390 395 400
Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys
405 410 415
Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys
420 425 430
Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His
435 440 445
Ser Cys Thr His Pro Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu
450 455 460
Lys Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr
465 470 475 480
Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met
485 490 495
Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn
500 505 510
Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys
515 520 525
Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn
530 535 540
Cys Lys Val Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp
545 550 555 560
Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg
565 570 575
Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg
580 585 590
Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val
595 600 605
Ile Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn
610 615 620
Met Gly Glu Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys
625 630 635 640
Glu Val Val Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly
645 650 655
Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr
660 665 670
Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr
675 680 685
Pro Thr Met Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu
690 695 700
Ser Met Val Gly Met Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg
705 710 715 720
Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu
725 730 735
Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Ala Thr Tyr Gln
740 745 750
Glu Ala Ala Ile Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu
755 760 765
Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu
770 775 780
Arg Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met
785 790 795 800
Ser Val Gly Ala His Thr Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile
805 810 815
Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly
820 825 830
Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu
835 840 845
Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile
850 855 860
Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys
865 870 875 880
Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe
885 890 895
Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu
900 905 910
Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala
915 920 925
Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val
930 935 940
Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp
945 950 955 960
His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys Phe Ile Val Gly Pro Met Ser
965 970 975
Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp
980 985 990
Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln
995 1000 1005
Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala
1010 1015 1020
Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro Ala Val Gly Thr Val His Val
1025 1030 1035 1040
Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg
1045 1050 1055
Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr
1060 1065 1070
Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala Val Gly Asn Met Pro Ile Ser
1075 1080 1085
Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr Arg Val Val Asp Ala Pro Ser
1090 1095 1100
Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro Ala Cys Thr His Ser Ser Asp
1105 1110 1115 1120
Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys
1125 1130 1135
Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu
1140 1145 1150
Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala
1155 1160 1165
Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His
1170 1175 1180
Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro
1185 1190 1195 1200
Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met
1205 1210 1215
Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu Val Val Ala Val
1220 1225 1230
Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His
1235 1240 1245
<210> 19
<211> 2474
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a non-structural peptide of CHIK-IRES
<400> 19
Met Asp Pro Val Tyr Val Asp Ile Asp Ala Asp Ser Ala Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ala Leu Gln Arg Ala Tyr Pro Met Phe Glu Val Glu Pro Arg Gln Val
20 25 30
Thr Pro Asn Asp His Ala Asn Ala Arg Ala Phe Ser His Leu Ala Ile
35 40 45
Lys Leu Ile Glu Gln Glu Ile Asp Pro Asp Ser Thr Ile Leu Asp Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Pro Ala Arg Arg Met Met Ser Asp Arg Lys Tyr His Cys
65 70 75 80
Val Cys Pro Met Arg Ser Ala Glu Asp Pro Glu Arg Leu Ala Asn Tyr
85 90 95
Ala Arg Lys Leu Ala Ser Ala Ala Gly Lys Val Leu Asp Arg Asn Ile
100 105 110
Ser Gly Lys Ile Gly Asp Leu Gln Ala Val Met Ala Val Pro Asp Thr
115 120 125
Glu Thr Pro Thr Phe Cys Leu His Thr Asp Val Ser Cys Arg Gln Arg
130 135 140
Ala Asp Val Ala Ile Tyr Gln Asp Val Tyr Ala Val His Ala Pro Thr
145 150 155 160
Ser Leu Tyr His Gln Ala Ile Lys Gly Val Arg Val Ala Tyr Trp Val
165 170 175
Gly Phe Asp Thr Thr Pro Phe Met Tyr Asn Ala Met Ala Gly Ala Tyr
180 185 190
Pro Ser Tyr Ser Thr Asn Trp Ala Asp Glu Gln Val Leu Lys Ala Lys
195 200 205
Asn Ile Gly Leu Cys Ser Thr Asp Leu Thr Glu Gly Arg Arg Gly Lys
210 215 220
Leu Ser Ile Met Arg Gly Lys Lys Leu Lys Pro Cys Asp Arg Val Leu
225 230 235 240
Phe Ser Val Gly Ser Thr Leu Tyr Pro Glu Ser Arg Lys Leu Leu Lys
245 250 255
Ser Trp His Leu Pro Ser Val Phe His Leu Lys Gly Lys Leu Ser Phe
260 265 270
Thr Cys Arg Cys Asp Thr Val Val Ser Cys Glu Gly Tyr Val Val Lys
275 280 285
Arg Ile Thr Met Ser Pro Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Thr Gly Tyr Ala
290 295 300
Val Thr His His Ala Asp Gly Phe Leu Met Cys Lys Thr Thr Asp Thr
305 310 315 320
Val Asp Gly Glu Arg Met Ser Phe Ser Val Cys Thr Tyr Val Pro Ala
325 330 335
Thr Ile Cys Asp Gln Met Thr Gly Ile Leu Ala Thr Glu Val Thr Pro
340 345 350
Glu Asp Ala Gln Lys Leu Leu Val Gly Leu Asn Gln Arg Ile Val Val
355 360 365
Asn Gly Arg Thr Gln Arg Asn Thr Asn Thr Met Lys Asn Tyr Leu Leu
370 375 380
Pro Val Val Ala Gln Ala Phe Ser Lys Trp Ala Lys Glu Cys Arg Lys
385 390 395 400
Asp Met Glu Asp Glu Lys Leu Leu Gly Val Arg Glu Arg Thr Leu Thr
405 410 415
Cys Cys Cys Leu Trp Ala Phe Lys Lys Gln Lys Thr His Thr Val Tyr
420 425 430
Lys Arg Pro Asp Thr Gln Ser Ile Gln Lys Val Gln Ala Glu Phe Asp
435 440 445
Ser Phe Val Val Pro Ser Leu Trp Ser Ser Gly Leu Ser Ile Pro Leu
450 455 460
Arg Thr Arg Ile Lys Trp Leu Leu Ser Lys Val Pro Lys Thr Asp Leu
465 470 475 480
Ile Pro Tyr Ser Gly Asp Ala Arg Glu Ala Arg Asp Ala Glu Lys Glu
485 490 495
Ala Glu Glu Glu Arg Glu Ala Glu Leu Thr Arg Glu Ala Leu Pro Pro
500 505 510
Leu Gln Ala Ala Gln Glu Asp Val Gln Val Glu Ile Asp Val Glu Gln
515 520 525
Leu Glu Asp Arg Ala Gly Ala Gly Ile Ile Glu Thr Pro Arg Gly Ala
530 535 540
Ile Lys Val Thr Ala Gln Pro Thr Asp His Val Val Gly Glu Tyr Leu
545 550 555 560
Val Leu Ser Pro Gln Thr Val Leu Arg Ser Gln Lys Leu Ser Leu Ile
565 570 575
His Ala Leu Ala Glu Gln Val Lys Thr Cys Thr His Asn Gly Arg Ala
580 585 590
Gly Arg Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Asp Gly Arg Val Leu Val Pro Ser
595 600 605
Gly Tyr Ala Ile Ser Pro Glu Asp Phe Gln Ser Leu Ser Glu Ser Ala
610 615 620
Thr Met Val Tyr Asn Glu Arg Glu Phe Val Asn Arg Lys Leu His His
625 630 635 640
Ile Ala Met His Gly Pro Ala Leu Asn Thr Asp Glu Glu Ser Tyr Glu
645 650 655
Leu Val Arg Ala Glu Arg Thr Glu His Glu Tyr Val Tyr Asp Val Asp
660 665 670
Gln Arg Arg Cys Cys Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly Leu Val Leu Val
675 680 685
Gly Asp Leu Thr Asn Pro Pro Tyr His Glu Phe Ala Tyr Glu Gly Leu
690 695 700
Lys Ile Arg Pro Ala Cys Pro Tyr Lys Ile Ala Val Ile Gly Val Phe
705 710 715 720
Gly Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Ala Ile Ile Lys Asn Leu Val Thr
725 730 735
Arg Gln Asp Leu Val Thr Ser Gly Lys Lys Glu Asn Cys Gln Glu Ile
740 745 750
Thr Thr Asp Val Met Arg Gln Arg Gly Leu Glu Ile Ser Ala Arg Thr
755 760 765
Val Asp Ser Leu Leu Leu Asn Gly Cys Asn Arg Pro Val Asp Val Leu
770 775 780
Tyr Val Asp Glu Ala Phe Ala Cys His Ser Gly Thr Leu Leu Ala Leu
785 790 795 800
Ile Ala Leu Val Arg Pro Arg Gln Lys Val Val Leu Cys Gly Asp Pro
805 810 815
Lys Gln Cys Gly Phe Phe Asn Met Met Gln Met Lys Val Asn Tyr Asn
820 825 830
His Asn Ile Cys Thr Gln Val Tyr His Lys Ser Ile Ser Arg Arg Cys
835 840 845
Thr Leu Pro Val Thr Ala Ile Val Ser Ser Leu His Tyr Glu Gly Lys
850 855 860
Met Arg Thr Thr Asn Glu Tyr Asn Lys Pro Ile Val Val Asp Thr Thr
865 870 875 880
Gly Ser Thr Lys Pro Asp Pro Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Phe Arg
885 890 895
Gly Trp Val Lys Gln Leu Gln Ile Asp Tyr Arg Gly Tyr Glu Val Met
900 905 910
Thr Ala Ala Ala Ser Gln Gly Leu Thr Arg Lys Gly Val Tyr Ala Val
915 920 925
Arg Gln Lys Val Asn Glu Asn Pro Leu Tyr Ala Ser Thr Ser Glu His
930 935 940
Val Asn Val Leu Leu Thr Arg Thr Glu Gly Lys Leu Val Trp Lys Thr
945 950 955 960
Leu Ser Gly Asp Pro Trp Ile Lys Thr Leu Gln Asn Pro Pro Lys Gly
965 970 975
Asn Phe Lys Ala Thr Ile Lys Glu Trp Glu Val Glu His Ala Ser Ile
980 985 990
Met Ala Gly Ile Cys Ser His Gln Met Thr Phe Asp Thr Phe Gln Asn
995 1000 1005
Lys Ala Asn Val Cys Trp Ala Lys Ser Leu Val Pro Ile Leu Glu Thr
1010 1015 1020
Ala Gly Ile Lys Leu Asn Asp Arg Gln Trp Ser Gln Ile Ile Gln Ala
1025 1030 1035 1040
Phe Lys Glu Asp Lys Ala Tyr Ser Pro Glu Val Ala Leu Asn Glu Ile
1045 1050 1055
Cys Thr Arg Met Tyr Gly Val Asp Leu Asp Ser Gly Leu Phe Ser Lys
1060 1065 1070
Pro Leu Val Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Asn His Trp Asp Asn Arg Pro
1075 1080 1085
Gly Gly Lys Met Phe Gly Phe Asn Pro Glu Ala Ala Ser Ile Leu Glu
1090 1095 1100
Arg Lys Tyr Pro Phe Thr Lys Gly Lys Trp Asn Ile Asn Lys Gln Ile
1105 1110 1115 1120
Cys Val Thr Thr Arg Arg Ile Glu Asp Phe Asn Pro Thr Thr Asn Ile
1125 1130 1135
Ile Pro Ala Asn Arg Arg Leu Pro His Ser Leu Val Ala Glu His Arg
1140 1145 1150
Pro Val Lys Gly Glu Arg Met Glu Trp Leu Val Asn Lys Ile Asn Gly
1155 1160 1165
His His Val Leu Leu Val Ser Gly Tyr Asn Leu Ala Leu Pro Thr Lys
1170 1175 1180
Arg Val Thr Trp Val Ala Pro Leu Gly Val Arg Gly Ala Asp Tyr Thr
1185 1190 1195 1200
Tyr Asn Leu Glu Leu Gly Leu Pro Ala Thr Leu Gly Arg Tyr Asp Leu
1205 1210 1215
Val Val Ile Asn Ile His Thr Pro Phe Arg Ile His His Tyr Gln Gln
1220 1225 1230
Cys Val Asp His Ala Met Lys Leu Gln Met Leu Gly Gly Asp Ser Leu
1235 1240 1245
Arg Leu Leu Lys Pro Gly Gly Ser Leu Leu Ile Arg Ala Tyr Gly Tyr
1250 1255 1260
Ala Asp Arg Thr Ser Glu Arg Val Ile Cys Val Leu Gly Arg Lys Phe
1265 1270 1275 1280
Arg Ser Ser Arg Ala Leu Lys Pro Pro Cys Val Thr Ser Asn Thr Glu
1285 1290 1295
Met Phe Phe Leu Phe Ser Asn Phe Asp Asn Gly Arg Arg Asn Phe Thr
1300 1305 1310
Thr His Val Met Asn Asn Gln Leu Asn Ala Ala Phe Val Gly Gln Val
1315 1320 1325
Thr Arg Ala Gly Cys Ala Pro Ser Tyr Arg Val Lys Arg Met Asp Ile
1330 1335 1340
Ala Lys Asn Asp Glu Glu Cys Val Val Asn Ala Ala Asn Pro Arg Gly
1345 1350 1355 1360
Leu Pro Gly Gly Gly Val Cys Lys Ala Val Tyr Lys Lys Trp Pro Glu
1365 1370 1375
Ser Phe Lys Asn Ser Ala Thr Pro Val Gly Thr Ala Lys Thr Val Met
1380 1385 1390
Cys Gly Thr Tyr Pro Val Ile His Ala Val Gly Pro Asn Phe Ser Asn
1395 1400 1405
Tyr Ser Glu Ser Glu Gly Asp Arg Glu Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Glu
1410 1415 1420
Val Ala Lys Glu Val Thr Arg Leu Gly Val Asn Ser Val Ala Ile Pro
1425 1430 1435 1440
Leu Leu Ser Thr Gly Val Tyr Ser Gly Gly Lys Asp Arg Leu Thr Gln
1445 1450 1455
Ser Leu Asn His Leu Phe Thr Ala Met Asp Ser Thr Asp Ala Asp Val
1460 1465 1470
Val Ile Tyr Cys Arg Asp Lys Glu Trp Glu Lys Lys Ile Ser Glu Ala
1475 1480 1485
Ile Gln Met Arg Thr Gln Val Glu Leu Leu Asp Glu His Ile Ser Ile
1490 1495 1500
Asp Cys Asp Ile Val Arg Val His Pro Asp Ser Ser Leu Ala Gly Arg
1505 1510 1515 1520
Lys Gly Tyr Ser Thr Thr Glu Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Leu Glu Gly
1525 1530 1535
Thr Arg Phe His Gln Thr Ala Val Asp Met Ala Glu Ile His Thr Met
1540 1545 1550
Trp Pro Lys Gln Thr Glu Ala Asn Glu Gln Val Cys Leu Tyr Ala Leu
1555 1560 1565
Gly Glu Ser Ile Glu Ser Ile Arg Gln Lys Cys Pro Val Asp Asp Ala
1570 1575 1580
Asp Ala Ser Ser Pro Pro Lys Thr Val Pro Cys Leu Cys Arg Tyr Ala
1585 1590 1595 1600
Met Thr Pro Glu Arg Val Thr Arg Leu Arg Met Asn His Val Thr Ser
1605 1610 1615
Ile Ile Val Cys Ser Ser Phe Pro Leu Pro Lys Tyr Lys Ile Glu Gly
1620 1625 1630
Val Gln Lys Val Lys Cys Ser Lys Val Met Leu Phe Asp His Asn Val
1635 1640 1645
Pro Ser Arg Val Ser Pro Arg Glu Tyr Arg Ser Ser Gln Glu Ser Ala
1650 1655 1660
Gln Glu Ala Ser Thr Ile Thr Ser Leu Thr His Ser Gln Phe Asp Leu
1665 1670 1675 1680
Ser Val Asp Gly Glu Ile Leu Pro Val Pro Ser Asp Leu Asp Ala Asp
1685 1690 1695
Ala Pro Ala Leu Glu Pro Ala Leu Asp Asp Gly Ala Thr His Thr Leu
1700 1705 1710
Pro Ser Thr Thr Gly Asn Leu Ala Ala Val Ser Asp Trp Val Met Ser
1715 1720 1725
Thr Val Pro Val Ala Pro Pro Arg Arg Arg Arg Gly Arg Asn Leu Thr
1730 1735 1740
Val Thr Cys Asp Glu Arg Glu Gly Asn Ile Thr Pro Met Ala Ser Val
1745 1750 1755 1760
Arg Phe Phe Arg Ala Glu Leu Cys Pro Val Val Gln Glu Thr Ala Glu
1765 1770 1775
Thr Arg Asp Thr Ala Met Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Thr Ala Thr
1780 1785 1790
Glu Pro Asn His Pro Pro Ile Ser Phe Gly Ala Ser Ser Glu Thr Phe
1795 1800 1805
Pro Ile Thr Phe Gly Asp Phe Asn Glu Gly Glu Ile Glu Ser Leu Ser
1810 1815 1820
Ser Glu Leu Leu Thr Phe Gly Asp Phe Leu Pro Gly Glu Val Asp Asp
1825 1830 1835 1840
Leu Thr Asp Ser Asp Trp Ser Thr Cys Ser Asp Thr Asp Asp Glu Leu
1845 1850 1855
Arg Leu Asp Arg Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Thr Gly Pro
1860 1865 1870
Gly His Leu Gln Gln Lys Ser Val Arg Gln Ser Val Leu Pro Val Asn
1875 1880 1885
Thr Leu Glu Glu Val His Glu Glu Lys Cys Tyr Pro Pro Lys Leu Asp
1890 1895 1900
Glu Ala Lys Glu Gln Leu Leu Leu Lys Lys Leu Gln Glu Ser Ala Ser
1905 1910 1915 1920
Met Ala Asn Arg Ser Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Val Glu Asn Met Lys
1925 1930 1935
Ala Ala Ile Ile Gln Arg Leu Lys Arg Gly Cys Arg Leu Tyr Leu Met
1940 1945 1950
Ser Glu Thr Pro Lys Val Pro Thr Tyr Arg Thr Thr Tyr Pro Ala Pro
1955 1960 1965
Val Tyr Ser Pro Pro Ile Asn Val Arg Leu Ser Asn Pro Glu Ser Ala
1970 1975 1980
Val Ala Ala Cys Asn Glu Phe Leu Ala Arg Asn Tyr Pro Thr Val Ser
1985 1990 1995 2000
Ser Tyr Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Asp Ala Tyr Leu Asp Met Val Asp
2005 2010 2015
Gly Ser Glu Ser Cys Leu Asp Arg Ala Thr Phe Asn Pro Ser Lys Leu
2020 2025 2030
Arg Ser Tyr Pro Lys Gln His Ala Tyr His Ala Pro Ser Ile Arg Ser
2035 2040 2045
Ala Val Pro Ser Pro Phe Gln Asn Thr Leu Gln Asn Val Leu Ala Ala
2050 2055 2060
Ala Thr Lys Arg Asn Cys Asn Val Thr Gln Met Arg Glu Leu Pro Thr
2065 2070 2075 2080
Leu Asp Ser Ala Val Phe Asn Val Glu Cys Phe Lys Lys Phe Ala Cys
2085 2090 2095
Asn Gln Glu Tyr Trp Glu Glu Phe Ala Ala Ser Pro Ile Arg Ile Thr
2100 2105 2110
Thr Glu Asn Leu Ala Thr Tyr Val Thr Lys Leu Lys Gly Pro Lys Ala
2115 2120 2125
Ala Ala Leu Phe Ala Lys Thr His Asn Leu Leu Pro Leu Gln Glu Val
2130 2135 2140
Pro Met Asp Arg Phe Thr Val Asp Met Lys Arg Asp Val Lys Val Thr
2145 2150 2155 2160
Pro Gly Thr Lys His Thr Glu Glu Arg Pro Lys Val Gln Val Ile Gln
2165 2170 2175
Ala Ala Glu Pro Leu Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Ile His Arg Glu
2180 2185 2190
Leu Val Arg Arg Leu Asn Ala Val Leu Leu Pro Asn Val His Thr Leu
2195 2200 2205
Phe Asp Met Ser Ala Glu Asp Phe Asp Ala Ile Ile Ala Ala His Phe
2210 2215 2220
Lys Pro Gly Asp Thr Val Leu Glu Thr Asp Ile Ala Ser Phe Asp Lys
2225 2230 2235 2240
Ser Gln Asp Asp Ser Leu Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Leu Glu Asp
2245 2250 2255
Leu Gly Val Asp His Ser Leu Leu Asp Leu Ile Glu Ala Ala Phe Gly
2260 2265 2270
Glu Ile Ser Ser Cys His Leu Pro Thr Gly Thr Arg Phe Lys Phe Gly
2275 2280 2285
Ala Met Met Lys Ser Gly Met Phe Leu Thr Leu Phe Val Asn Thr Leu
2290 2295 2300
Leu Asn Ile Thr Ile Ala Ser Arg Val Leu Glu Asp Arg Leu Thr Lys
2305 2310 2315 2320
Ser Ala Cys Ala Ala Phe Ile Gly Asp Asp Asn Ile Ile His Gly Val
2325 2330 2335
Val Ser Asp Glu Leu Met Ala Ala Arg Cys Ala Thr Trp Met Asn Met
2340 2345 2350
Glu Val Lys Ile Ile Asp Ala Val Val Ser Leu Lys Ala Pro Tyr Phe
2355 2360 2365
Cys Gly Gly Phe Ile Leu His Asp Thr Val Thr Gly Thr Ala Cys Arg
2370 2375 2380
Val Ala Asp Pro Leu Lys Arg Leu Phe Lys Leu Gly Lys Pro Leu Ala
2385 2390 2395 2400
Ala Gly Asp Glu Gln Asp Glu Asp Arg Arg Arg Ala Leu Ala Asp Glu
2405 2410 2415
Val Ile Arg Trp Gln Arg Thr Gly Leu Ile Asp Glu Leu Glu Lys Ala
2420 2425 2430
Val Tyr Ser Arg Tyr Glu Val Gln Gly Ile Ser Val Val Val Met Ser
2435 2440 2445
Met Ala Thr Phe Ala Ser Ser Arg Ser Asn Phe Glu Lys Leu Arg Gly
2450 2455 2460
Pro Val Ile Thr Leu Tyr Gly Gly Pro Lys
2465 2470
<210> 20
<211> 565
<212> DNA
<213> Encephalomyocarditis virus
<400> 20
aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt 60
tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg 120
acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc 180
gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt 240
tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta 300
taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg 360
gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag 420
gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtaca catgctttac atgtgtttag 480
tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa 540
acacgatgat aatatggcca caacc 565
<210> 21
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV ZPC938 Wild-type
<400> 21
ttcagctacc tgagaggggc ccctataact ctctacggct aacctgaatg gactacgaca 60
tagtctagtc cgccaagatg ttc 83
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV ZPC938 Wild-type
<400> 22
Phe Ser Ile Leu Arg Gly Ala Pro Ile Thr Leu Tyr Gly Met Phe
1 5 10 15
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV ZPC938 Mutant
<400> 23
ttcagctacc tgagaggggc cccgattacg ttgtatggat gataaatgtt c 51
<210> 24
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV 68U201 Wild-type
<400> 24
ttcagttgtc taagaggggc ttctatatcc ctctacggct aacctgaatg gactgcgacg 60
tagtcaagtc cgccgaaatg ttt 83
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV 68U201 Wild-type
<400> 25
Phe Ser Cys Leu Arg Gly Ala Ser Ile Ser Leu Tyr Gly Met Phe
1 5 10 15
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEEV 68U201 Mutant
<400> 26
ttcagttgtc taagaggggc ttccataagt ctgtatggat gataaatcga tatgttt 57
<210> 27
<211> 92
<212> DNA
<213> WEEV Imp181 Wild-type
<400> 27
ttcaagagca taagagggag cccaatcacc ctctacggct gacctaaata ggtgacgtag 60
tagacacgca cctacccatc gccataatgt tt 92
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WEEV Imp181 Wild-type
<400> 28
Phe Lys Ser Ile Arg Gly Ser Leu Ile Thr Leu Tyr Gly Met Phe
1 5 10 15
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WEEV Imp181 Mutant
<400> 29
ttcaagagca taagagggag cccgattacg ttgtatggat aataaatgtt t 51
<210> 30
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EEEV FL93-939 Wild-type
<400> 30
cacataagag gtcaccccat aaccctctac ggctgaccta aataggttgt gcattagtac 60
ctaacctatt tatattatat tgctatctaa atatcagaga tgttc 105
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EEEV FL93-939 Wild-type
<400> 31
His Ile Arg Gly His Pro Ile Thr Leu Tyr Gly Met Phe
1 5 10
<210> 32
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EEEV FL93-939 Mutant
<400> 32
cacataagag gtcacccgat tacgttgtat ggataataaa acgttaatgt tc 52
<210> 33
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV LaReunion Wild-type
<400> 33
aagctcagag gacccgtcat aactttgtac ggcggtccta aataggtacg cactacagct 60
acctattttg cagaagccga cagcaagtat ctaaaacact aatcagctac aatggag 117
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV LaReunion Wild-type
<400> 34
Lys Leu Arg Gly Pro Val Ile Thr Leu Tyr Gly Gly Pro Lys Met Glu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHIKV LaReunion Mutant
<400> 35
aagctcagag gacccgtgat tacgctttat ggaggaccga agtaataaac tagtatggag 60
60
Claims (45)
- (i) 비활성화된 서브게놈 프로모터, 및 (ii) 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 하나의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이의 내부 리보솜 도입 부위(IRES)의 삽입;을 갖는 알파바이러스 핵산을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 바이러스 IRES는 유형 I 또는 유형 II 피코르나바이러스 IRES 또는 생존가능한 살아있는 약독화된 알파바이러스를 생성할 수 있는 다른 IRES 서열을 포함하는, 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스.
- 청구항 1에 있어서,
상기 IRES 서열은 엔테로바이러스 IRES, 엔테로바이러스 71 IRES (EV71 IRES), 라이노바이러스 IRES, 인간 라이노바이러스 IRES (HRV IRES), 아프토바이러스 IRES, 아프토바이러스: 하위유형: 구제역 바이러스 (FMDV IRES), 더일로바이러스IRES (TMEV IRES), 및 플라비바이러스 IRES, 플라비바이러스 하위유형: 헤파시바이러스 (HCV IRES)로 구성딘 군으로부터 선택되며; 상기 알파바이러스는 약독화된 것인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 서브게놈 프로모터는 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 말단과 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에서 서브게놈 RNA의 5' UTR의 결실에 의해 비활성화되는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 서브게놈 프로모터는 상기 알파바이러스의 비구조적 단백질 4의 카르복시 말단에 위치한 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성화되는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스 또는 코로나바이러스(Coronaviridae) 및 토가바이러스(Togaviridae) 과(families)의 다른 알파바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽 뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타 바이러스; 하위유형: 사지야마 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스 및 이들의 조합을 포함하는 셈리키 포레스트 바이러스 복합체 중 하나 이상을 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 4에 있어서,
클러스터된 점 돌연변이는, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 및 SEQ ID NO:5로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열의 7474, 7477, 7480, 7481, 7483, 7486, 7489, 7492, 7495, 7498, 7501, 7502, 및 7503 위치에서 둘 이상의 점 돌연변이를 포함하는 동의 점 돌연변이(synonymous point mutation)인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 3, 청구항 4 및 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 서브게놈 프로모터의 돌연변이는 비구조적 단백질 4의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 변형시키지 않는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스의 비-구조적 단백질의 어느 하나 내에서 적응형 돌연변이를 추가로 포함하며, 상기 적응형 돌연변이는 바이러스 복제, 방출 및 바이러스 역가를 증가시키기 위해 선택될 수 있는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 엔테로바이러스 71 IRES (EV71 IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 인간 라이노바이러스 IRES (HRV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 구제역 바이러스 IRES (FMDV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IRES는 더일로바이러스IRES (TMEV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스.
- 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 헤파시바이러스IRES (HCV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스는 동부 말 뇌염 바이러스인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스는 서부 말 뇌염 바이러스인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스는 모기 및 모기 세포에서 복제 불가능한, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 살아있는 약독화된 알파바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
- 청구항 19의 벡터를 포함하고 발현하는 숙주 세포.
- 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 약독화된 재조합 알파바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 상기 알파바이러스에 대한 노출로부터 상기 알파바이러스로부터의 감염의 개시를 감소시키기 위하여 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 청구항 21에 따른 약학 조성물의 용도.
- 청구항 22에 있어서,
상기 대상체는 인간, 가축, 또는 다른 가축화된 동물 또는 애완동물인, 용도. - 엔테로바이러스 IRES, 라이노바이러스 IRES, 아프토바이러스 IRES, 아프토바이러스: IRES, 및 플라비바이러스 IRES로 구성된 군으로부터 선택되는 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를, 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 하나의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에 클로닝하는 단계를 포함하는, 모기를 감염시키는 것이 불가능한 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스 제조 방법.
- 청구항 24에 있어서,
상기 알파바이러스는 서브게놈 프로모터를 비활성화시키는 것에 의해 추가로 약독화되는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 IRES는 EV71 IRES를 포함하는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 IRES는 HRV IRES를 포함하는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 IRES는 FMDV IRES를 포함하는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 IRES는 TMEV IRES를 포함하는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 IRES는 HCV IRES를 포함하는, 방법. - 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
상기 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스 또는 코로나바이러스 및 토가바이러스 과의 다른 알파바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽 뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타 바이러스; 하위유형: 사지야마 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스 및 이들의 조합을 포함하는 셈리키 포레스트 바이러스 복합체 중 하나 이상을 포함하는, 방법. - 청구항 21에 따른 약독화된 재조합 알파바이러스 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알파바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
- 청구항 32에 있어서,
상기 대상체는 인간, 가축, 애완동물 또는 다른 동물인, 방법. - 청구항 32 또는 청구항 33에 있어서,
상기 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스 또는 코로나바이러스 및 토가바이러스 과의 다른 알파바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽 뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타 바이러스; 하위유형: 사지야마 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스 및 이들의 조합을 포함하는 셈리키 포레스트 바이러스 복합체 중 하나 이상을 포함하는, 방법. - 다음을 포함하는 키트:
청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스; 및
적어도 하나의 용기. - 청구항 35에 있어서,
1종 이상의 안정화제를 포함하는 조성물을 추가로 포함하고, 상기 조성물은 상기 살아있는 약독화된 재조합알파바이러스의 비활성화를 감소시키는, 키트. - a) 외피 글리코단백질 유전자의 하류와 알파바이러스의 3' UTR의 상류에 위치하는 캡시드 유전자;
b) 상기 외피 글리코단백질 유전자의 3' 말단과 상기 위치된 캡시드 유전자 사이에 도입된 적어도 하나의 IRES로서, 상기 유전자는 외피형 글리코단백질 유전자, 삽입된 IRES, 위치된 캡시드 유전자 및 3' UTR로 5' 에서 3'로 위치함; 및
c) 위치된 캡시드가 IRES-의존성 방식으로 번역되는 반면에 IRES-비의존성 방식으로 번역되며 IRES의 상류에 위치하는 상기 외피 글리코단백질 유전자;를 포함하는 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스로서,
상기 적어도 하나의 바이러스 IRES는 유형 I 또는 유형 II 피코르나바이러스 IRES 또는 생존가능한 살아있는 약독화된 알파바이러스를 생성할 수 있는 다른 IRES 서열인, 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스. - 청구항 1에 있어서,
상기 IRES 서열은 엔테로바이러스 IRES, 라이노바이러스 IRES, 아프토바이러스 IRES, 더일로바이러스IRES, 및 플라비바이러스 IRES로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 알파바이러스는 약독화된 것인, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 또는 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 엔테로바이러스 71 IRES (EV71 IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 또는 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 인간 라이노바이러스 IRES (HRV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 또는 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 구제역 바이러스 IRES (FMDV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 또는 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 더일로바이러스IRES (TMEV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 또는 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IRES는 헤파시바이러스IRES (HCV IRES)를 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 약독화된 재조합 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스 또는 코로나바이러스 및 토가바이러스 과의 다른 알파바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽 뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 제타 바이러스; 하위유형: 사지야마 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스:하위유형: 메 트리(Me Tri) 바이러스 및 이들의 조합을 포함하는 셈리키 포레스트 바이러스 복합체 중 하나 이상을 포함하는, 약독화된 알파바이러스. - 청구항 37 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 약독화된 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)인, 약독화된 알파바이러스.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662316264P | 2016-03-31 | 2016-03-31 | |
US62/316,264 | 2016-03-31 | ||
PCT/US2017/024450 WO2017172698A1 (en) | 2016-03-31 | 2017-03-28 | Live, attenuated alphavirus constructs and methods and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180135913A true KR20180135913A (ko) | 2018-12-21 |
Family
ID=58501809
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020187031480A KR20180135913A (ko) | 2016-03-31 | 2017-03-28 | 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체 그리고 그 방법 및 용도 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190106682A1 (ko) |
EP (1) | EP3436062A1 (ko) |
JP (1) | JP2019509750A (ko) |
KR (1) | KR20180135913A (ko) |
CN (1) | CN109195625A (ko) |
AU (1) | AU2017241669A1 (ko) |
BR (1) | BR112018069079A2 (ko) |
CA (1) | CA3019536A1 (ko) |
CO (1) | CO2018010359A2 (ko) |
CR (1) | CR20180457A (ko) |
DO (1) | DOP2018000209A (ko) |
EC (1) | ECSP18081582A (ko) |
MX (1) | MX2018011839A (ko) |
PE (1) | PE20190178A1 (ko) |
PH (1) | PH12018502120A1 (ko) |
SG (1) | SG11201808479VA (ko) |
WO (1) | WO2017172698A1 (ko) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2020013236A (es) | 2018-06-06 | 2021-02-22 | Massachusetts Inst Technology | Acido ribonucleico (arn) circular para traduccion en celulas eucariotas. |
CN110213711B (zh) * | 2019-04-22 | 2021-06-18 | 腾讯科技(深圳)有限公司 | 一种常驻点的估计方法、装置、设备和介质 |
CN114561366B (zh) * | 2022-03-30 | 2023-06-20 | 西南民族大学 | 一种山羊库布病毒分离株及其应用 |
CN117925540A (zh) * | 2024-03-22 | 2024-04-26 | 北京昭衍新药研究中心股份有限公司 | 一种cv2117-hav-htlv-2多基因假病毒及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050112095A1 (en) * | 2002-07-09 | 2005-05-26 | Tsu-An Hsu | Internal ribosome entry sites for recombinant protein expression |
CA2910235C (en) | 2008-01-24 | 2021-07-06 | Scott C. Weaver | Attenuated recombinant alphaviruses incapable of replicating in mosquitoes and uses thereof |
-
2017
- 2017-03-28 MX MX2018011839A patent/MX2018011839A/es unknown
- 2017-03-28 JP JP2018551252A patent/JP2019509750A/ja not_active Withdrawn
- 2017-03-28 CA CA3019536A patent/CA3019536A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-28 SG SG11201808479VA patent/SG11201808479VA/en unknown
- 2017-03-28 KR KR1020187031480A patent/KR20180135913A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-03-28 CN CN201780032818.3A patent/CN109195625A/zh active Pending
- 2017-03-28 US US16/088,815 patent/US20190106682A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-28 BR BR112018069079A patent/BR112018069079A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2017-03-28 PE PE2018001927A patent/PE20190178A1/es unknown
- 2017-03-28 AU AU2017241669A patent/AU2017241669A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-28 WO PCT/US2017/024450 patent/WO2017172698A1/en active Application Filing
- 2017-03-28 CR CR20180457A patent/CR20180457A/es unknown
- 2017-03-28 EP EP17716083.5A patent/EP3436062A1/en not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-09-27 CO CONC2018/0010359A patent/CO2018010359A2/es unknown
- 2018-09-28 DO DO2018000209A patent/DOP2018000209A/es unknown
- 2018-10-01 PH PH12018502120A patent/PH12018502120A1/en unknown
- 2018-10-30 EC ECSENADI201881582A patent/ECSP18081582A/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ECSP18081582A (es) | 2019-02-28 |
PH12018502120A1 (en) | 2019-07-15 |
DOP2018000209A (es) | 2019-01-31 |
EP3436062A1 (en) | 2019-02-06 |
WO2017172698A1 (en) | 2017-10-05 |
SG11201808479VA (en) | 2018-10-30 |
CA3019536A1 (en) | 2017-10-05 |
BR112018069079A2 (pt) | 2019-01-29 |
JP2019509750A (ja) | 2019-04-11 |
PE20190178A1 (es) | 2019-02-01 |
US20190106682A1 (en) | 2019-04-11 |
MX2018011839A (es) | 2019-05-23 |
CR20180457A (es) | 2019-04-09 |
AU2017241669A1 (en) | 2018-11-22 |
CN109195625A (zh) | 2019-01-11 |
CO2018010359A2 (es) | 2018-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI626308B (zh) | 抗原類及針對人腸病毒之疫苗類 | |
US6071742A (en) | Coxsackie virus as a vector for delivery of anti-inflammatory cytokines | |
Tsai et al. | Enterovirus A71 containing codon-deoptimized VP1 and high-fidelity polymerase as next-generation vaccine candidate | |
KR20180135913A (ko) | 살아있는 약독화된 알파바이러스 구조체 그리고 그 방법 및 용도 | |
EA016490B1 (ru) | Псевдоинфекционный флавивирус и его применение | |
US8921101B2 (en) | Attenuated poliovirus | |
KR20200056982A (ko) | 면역원성 치쿤구니야 바이러스 chikv-델타5nsp3을 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법 | |
WO1998039426A9 (en) | Coxsackie virus vectors for delivery of nucleic acids encoding antigenic or therapeutic products | |
BRPI0510016B1 (pt) | Vetor lentiviral recombinante, composição imunogênica e uso dos mesmos como vacina | |
US20210346492A1 (en) | SARS-CoV-2 Vaccines | |
US8343506B2 (en) | Chimeric chikungunya virus and uses thereof | |
KR101045165B1 (ko) | 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 | |
JP2021507713A (ja) | アルファウイルスレプリコン粒子 | |
Gutiérrez-Álvarez et al. | Middle East respiratory syndrome coronavirus vaccine based on a propagation-defective RNA replicon elicited sterilizing immunity in mice | |
Kim et al. | Application of attenuated coxsackievirus B3 as a viral vector system for vaccines and gene therapy | |
Hunziker et al. | Generation and analysis of an RNA vaccine that protects against coxsackievirus B3 challenge | |
US9402890B2 (en) | Methods and compositions for pseudoinfectious alphaviruses | |
WO2017097875A1 (en) | Kit-of-parts for use in a prime-boost vaccination strategy to protect cloven-footed animals against foot-and-mouth disease virus infection | |
AU2022328756A1 (en) | Coronavirus vaccine formulations incorporating prime and boost | |
CN116769735A (zh) | 一种甲病毒减毒株的构建方法及应用 | |
JP2023511823A (ja) | A型肝炎ウイルスの製造方法及び前記方法により製造されたa型肝炎ウイルス | |
CN118076729A (en) | Coronavirus vaccine formulations incorporating prime and boost vaccines | |
Khan | Poliovirus pathogenesis: A study of New World Monkey CD155 receptors and a new Mouse model for oral pathogenesis | |
Trujillo | T cell responses to S-glutathionylated And heteroclitic viral epitopes and CCl2-mediated immune dysregulation in mice infected with a neurotropic coronavirus | |
Brooke | Evaluation of the protective roles of complement activation and T cells during Venezuelan equine encephalitis virus infection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E601 | Decision to refuse application |