EA016490B1 - Псевдоинфекционный флавивирус и его применение - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении описывается дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, не содержащий ген капсида, где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус размножается только в клетках, экспрессирующих капсид или капсид, prM и белок оболочки флавивируса. В настоящем изобретении также описывается способ широкомасштабного производства таких вирусов и использование таких псевдоинфекционных вирусов в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызванных инфекциями человека и животных вирусами, принадлежащими к этому семейству.

Description

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. В общем, настоящее изобретение раскрывает конструирование дефектных по репликации вирусов семейства НауМпбае и их использование в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызываемых вирусами этого семейства. В частности, настоящее изобретение относится к дефектным по репликации флавивирусам или псевдоинфекционным флавивирусам (Ρίν или ЯерИУАХ) и к их применению в качестве профилактических вакцин против заболеваний, опосредованных флавивирусами.

Предшествующий уровень техники

Род ΕΊηνίνίπικ семейства ИауМпбае включает большое число важных патогенов человека и животных; его разделяют на четыре различных антигенных комплекса на основании разницы в реактивности в иммунологических тестах. Обычно флавивирусы циркулируют между амплифицирующими вирус хозяевами - птицами или млекопитающими и переносчиками - насекомыми или клещами.

Геном флавивируса представляет собой одноцепочечную кэпированную РНК положительной полярности без концевой поли(А)-последовательности на З'-конце. Геном кодирует единственный полипептид, который процессируется котрансляционно и посттрансляционно с получением структурных белков вируса С, ргМ/М и Е, образующих вирусные частицы, и неструктурных белков N81. Ν82Α, Ν82Β, N83, Ν84Β и N85, необходимых для репликации вирусного генома и его упаковки в инфекционные вирионы (СйатЬегк, 1990). Вирионы содержат единственную копию геномной РНК вируса, упакованную в нуклеокапсид, содержащий белок С, окруженный липидной оболочкой, содержащей гетеродимеры белков М и Е. В отличие от многих других оболочечных вирусов, взаимодействие между нуклеокапсидом и выступами оболочки не является специфическим, то есть оболочка, содержащая димеры М/Е может успешно образоваться вокруг нуклеокапсида, полученного из гетерологичного флавивируса, демонстрируя ограниченный уровень гомологии капсидной последовательности (йогеп/, 2002). С другой стороны, экспрессия ргМ и Е в отсутствие С может приводить к образованию субвирусных частиц (8νΡ), не содержащих РНК или белкок С (Макоп, 1991).

Кассеты ргМ/М-Е, продуцирующие субвирусные частицы, составляют основу нескольких вакцинкандидатов, известных из уровня техники. Эти вакцины-кандидаты включают субъединичные вакцины (КошкЫ, 1992; 2001; 2002; О1ао, 2004), ДНК-вакцины (Рй111ройк, 1996; Косйе1, 1997; 8сйтаЦойи, 1997; Со1отЬаде, 1998; АЬег1е, 1999; КошкЫ, 2000; КошкЫ, 2000; Косйе1, 2000; Иаущ, 2001) и живые векторные вакцины (Макоп, 1991; КоЫкЫ, 1992; Ртсик, 1992; Еопкеса, 1994; Ридасйеу, 1995; Со1отЬаде, 1998; Капека, 2000; Мтке, 2004). Однако у этих вакцин существует ряд серьезных недостатков. Например, субъединичные вакцины безопасны в употреблении, но их трудно получить в больших количествах; ДНК-вакцины слабоиммуногенны, а векторные вакцины недостаточно эффективны при наличии иммунитета к вектору.

Поэтому, несмотря на серьезную озабоченность заболеваниями, опосредованными флавивирусами, и продолжающимся распространением флавивирусов на новые территории, для этих инфекций пока не разработано средств противовирусной терапии, и на сегодняшний день создано очень ограниченное количество одобренных вакцин. Инактивированные вирусные вакцины (ΙΝν) были разрешены к применению для профилактики клещевого энцефалита (ΤΒΕν) и японского энцефалита (ΙΕν). Однако, как и другие инактивированные вирусные вакцины, эти вакцины имеют низкую эффективность и требуют повторных вакцинаций. Несмотря на эти недостатки, преимуществом ΙΝν против японского энцефалита и клещевого энцефалита являются хорошие показатели безопасности. Единственной разрешенной к применению живой аттенуированной вакциной (ЬАУ) против флавивируса является широкоиспользуемая живая аттенуированная вакцина на основе штамма 17Ό вируса желтой лихорадки (УЕУ), полученного путем многократных перевиваний дикого типа штамма Ак1Ь1 вируса желтой лихорадки в культуре тканей куриных эмбрионов. Несмотря на то, что эта вакцина считается высокоэффективной и безопасной, были описаны случаи заболевания желтой лихорадкой среди вакцинированных, включая недавний случай заболевания новобранца ВС США (ОетаЫтоп, 2005). Кроме того, эта вакцина не рекомендована к применению у новорожденных, беременных женщин или пациентов с ослабленным иммунитетом из-за побочных эффектов, включая энцефалит, опосредованный вакциной.

Однако развитие систем обратной генетики для флавивирусов привело к разработке и производству новых типов живой аттенуированной вакцины, основанных на рациональной аттенуации этих вирусов. Этот новый класс вакцин включает в себя химеры на основе штамма 17Ό вируса желтой лихорадки, в которых кассета, содержащая фрагмент генома вируса желтой лихорадки, кодирующий белки ргМ-Е, была заменена на кассету, кодирующую белки ргМ-Е, полученную из гетерологичных флавивирусов (СйатЬегк, 1999). Аналогичный подход, основанный на использовании химерных вирусов, был проведен с использованием материала лихорадки Денге или клещевого энцефалита (Р1е1пеу, 2002; Ниапд, 2003). В большинстве случаев химерные флавивирусы демонстрируют значительно ослабленный фенотип, сохраняя при этом способность вызывать эффективный защитный иммунный ответ и способность защищать против последующих инфекций вирусами, структурные белки которых экспрессируются химерами (Мопа1й, 2002). Показано, что существующий иммунитет к вектору не снижает эффективности вакци

- 1 016490 нации такими химерными вакцинами-кандидатами (МоиаШ, 2002), но снижает эффективность вирусных рекомбинантных вакцин на основе других вирусных векторов. Кроме того, несмотря на то, что химерные флавивирусы могут представлять собой достаточно универсальный подход для производства новых вакцин, существуют опасения, что химеры сами по себе могут оказаться патогенными (СйатЬега, 1999), по крайней мере, для пациентов с ослабленным иммунитетом, или что патогенные химеры могут возникнуть, поскольку в процессе распространения этих вирусов были выявлены случаи мутаций (Рцдаейеу,

2004) .

Еще одно многообещающее направление развития разработки вакцин основано на индукции в геноме флавивируса неисправимых делеций, при которых продуктивная репликация вируса в вакцинированном хозяине либо малоэффективна, либо невозможна. В последнем случае вирусный геном, полностью кодирующий белки, необходимые для репликации вируса, но не содержащий области, кодирующей, например, белок С, может быть предоставлен для иммунизации ίη νίνο в виде способной к саморепликации РНК, синтезированной ίη νίίτο (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005) или, возможно, в виде ДНК (под контролем промоторов РНК-полимеразы II или в виде способной к саморепликации РНК, синтезированной ίη νίίτο (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005). Было показано, что прямая иммунизация дефектными РНК-геномами, синтезированными ίη νίίτο, ведущая к производству 8УР в отсутствие полного цикла репликации вируса, является эффективным и безопасным методом стимуляции защитного иммунитета (КоДет, 2004; АЬег1е,

2005) . Однако для производства вакцины-кандидата, основанной на РНК, могут существовать серьезные препятствия из-за проблем, связанных с синтезом, стабильностью и доставкой вакцины.

Таким образом, в известном уровне техники отсутствует безопасный, сильный и эффективный вид вакцин, который может быть использован против заболеваний, вызываемых вирусами, принадлежащими семейству Е^Мпбае. Настоящее изобретение удовлетворяет давние потребности существующего уровня техники.

Сущность изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описано получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Пауцапбае. Такой псевдоинфекционный вирус содержит делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) , при этом делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М, или их комбинацию, где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный С, мутантный белок ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства ЕЩМпбае.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описано получение системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства ЕЩщшбае, делающие возможным размножение вышеописанного дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае в подходящих условиях.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описан способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Иа'утпбае, описанного выше. Такой способ включает получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае, содержащего делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида, таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства ЕЩМпбае, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков Е1ау1У1Г1бае. необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства ЕЩМпбае; и инфицирование клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства ЕЩМпбае, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Е^Мпбае.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывается фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае, полученный способом, описанным в настоящей заявке.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описан способ защиты пациента от инфекций, возникающих в результате контакта с вирусами семейства Пауцзпбае. Такой способ включает назначение пациенту иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, полученной по способу, описанному в настоящей заявке, которая индуцирует у пациента иммунный ответ против вирусов семейства ЕЩМпбае, защищая, таким образом, пациента от инфекций.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение репликации Ρΐν-флавивируса в клетках, продуцирующих С или все структурные белки вируса, обеспечивающие транс-комплементацию дефекта. Репликация Ρΐν в нормальных клетках ίη νί\Ό или ίη νίίΐΌ приводит к выходу 8Ρν, не содержащих нуклеокапсида.

- 2 016490

На фиг. 2А-2С показано, что клеточные линии, экспрессирующие белок С УВУ и белки С, ргМ и Е УВУ, могут комплементировать репликацию Р1У УВ. На фиг. 2А приведено схематическое изображение геномов УВУ и Р1У УВУ, экспрессирующего СВР. На фиг. 2В приведено схематическое изображение репликонов УЕЕУ, экспрессирующих гены Рас и С УВУ, а также сигнальный пептид для ргМ (заякоренный в мембране С; УЕЕгер/С1/Рас), или заякоренный в мембране С с 20 аминокислотными остатками ргМ (УЕЕгер/С2/Рас), или все структурные белки УВУ (УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас). На фиг. 2С показан выход Р1У УВ из клеточных линий, трансфицированных геномом Р1У, синтезированным ίη νίίτο. Культуральную среду меняли в указанные моменты времени и измеряли титры Р1У. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5.

На фиг. 3А-3В показаны кривые роста Р1У УВУ в пакующих клеточных линиях. Клетки ВНК-21, содержащие репликоны УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, инфицировали Р1У УВУ с множественностью инфекции (МО1), указанной в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших Р1У. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5. На фиг. ЗА показана кривая роста при множественности инфекции 10 инф. ед./кл, на фиг. ЗВ показана кривая роста при множественности инфекции 0,1 инф. ед./кл.

На фиг. 4А-4С показано, что клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный ген С, продуцировали Р1У УВ. На фиг. 4А показана нуклеотидная последовательность синтезированного гена. Введенные мутации обозначены строчными буквами (8ЕО ΙΌ N0: 1). На фиг. 4В приведены кривые роста Р1У УВ в пакующих клеточных линиях. Клетки ВНК-21, содержащие репликоны УЕЕгер/С2/Рас, УЕЕгер/СргМ-Е/Рас, УЕЕтер/С2ор1/Рас и УЕЕтер/СорЕртМ-Е/Рас, были инфицированы Р1У УВ при указанных значениях множественности инфекции в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших Р1У. На фиг. 4С показаны бляшки, образованные в пакующей клеточной линии, содержащей УЕЕтер/С2ор1/Рас УВУ и Р1У УВ через 4 дня инкубации при 37°С.

На фиг. 5А-5С показано, что Р1У ΧΥΝ вызывает распространение инфекции в пакующих клетках. На фиг. 5А приведено схематическое изображение генома Р1У ΧΥΝ и репликона УЕЕУ, экспрессирующего структурные гены вируса νΗΥ. На фиг. 5В показано, что Р1У ΧΥΝ вызывали образование фокусов клеток, позитивных на антиген νΗΥ (обнаружено с помощью антител к N81 после инфекции клеток ВНК (УЕЕгер/С*-Е*-Рас) через 70 ч инкубации). На фиг. 5С показано, что те же самые препараты Р1У \νΝ вызывали образование только единичных инфицированных клеток при инфицировании монослойных клеток Уего (выявлено через 70 ч после инфекции способом окрашивания с помощью трагаканта, аналогично фиг. 5В).

На фиг. 6А-6С показано обнаружение белка Е после выхода из клеток, инфицированных Р1У УВ и νΝ. На фиг. 6 А клетки ВНК-21 были инфицированы Р1У УВ при множественности инфекции 5 инф. ед. на клетку. Вышедшие 8УР собирались и очищались с помощью ультрацентрифугирования. Полученные образцы разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (8Ό8 РАСЕ), переносились на фильтры; белок Е детектировался с помощью моноклональных антител Э1-4С2. Дорожка 1 - культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 2 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У УВ, через 48 ч после инфекции; дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У УВ, через 72 ч после инфекции, дорожка 4 - УВУ (2х10⁷ бляшкообразующих единиц). На фиг. 6В клетки Уего были инфицированы νΝ УВ в течение 24 ч, затем порции осветленной культуральной жидкости (собранной до обнаружения лизиса клеток) разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносились на фильтры и к фильтрам добавлялись моноклональные антитела, специфичные к белку Е (7Н2, производство Вютейапсе). Добавление поликлональной сыворотки к этому образцу на выявило никаких неструктурных белков, ассоциированных с клетками (не показано), что подтверждает факт активной секреции белка Е. Дорожка 1 - образец VNУ, дорожка 2 культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У νΝ, через 48 ч после инфекции. На фиг. 6С приведены результаты Вестерн-блот-анализа, показывающие содержание белка Е во фракциях, полученных с помощью градиента сахарозы, полученных из 8УР, собранных с нормальных (не пакующих) клеток ВНК, в которые была введена РНК Р1У УВУ с помощью электропорации. Пик реактивности белка Е (32%) соответствует плотности 8УР и в соответствии с этим фактом мигрирует медленнее, чем УВУ (42%) при параллельном анализе.

На фиг. 7А-7В показано схематическое изображение плазмид, использовавшихся для выработки псевдоинфекционных вирусов (Р1У) желтой лихорадки (УВ), лихорадки Западного Нила (νΝ). На фиг. 7А показана рУВР1У, на фиг. 7В показана рVNРIУ, на фиг. 7С показана рУЕЕгер/С1/Рас, на фиг. 7Ό показана рУЕЕгер/С2/Рас, на фиг. 7Е показана рУЕЕгер/С3/Рас, на фиг. 7В показана рУЕЕгер/С*-Е*-Рас.

На фиг. 8А-8У приведены последовательности плазмид, использовавшихся в настоящей работе. На фиг. 8Α-8Ό приведена последовательность рУВР1У (8ЕО ΙΌ N0: 6), на фиг. 8Е-8Н приведена последовательность рУЕЕгер/С1/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 7), на фиг. 81-8К приведена последовательность рУЕЕгер/С2/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 8), на фиг. 8Ь-8О приведена последовательность рУЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 9), на

- 3 016490 фиг. 8Р-8В приведена последовательность рУЕЕгер/С2ор1/Рас (8ЕО ΙΌ N0: 10), на фиг. 88-8У приведена последовательность рУЕЕгер/Сор!-ргМ-Е/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 11).

На фиг. 9 показано схематическое изображение перекрывающихся областей КерНУАХ и репликона УЕЕ, использованного для транс-выработки белка С. ¹В УЕЕгер/Рас-ИЫ-С* было введено тридцать шесть мутаций для уменьшения вероятности гомологической рекомбинации с фрагментом С, кодируемым геномом КерЕУАХ. ²Положения 5'- и З'-последовательностей циклизации в геноме ВерИУЛХ.

На фиг. 10 для сравнения показаны фокусы инфекции, образовавшиеся в клеточной линии, экспрессирующей белок С {ВНК(УЕЕгер/Рас-ЦЬ1-С*)}, под действием ВерИУЛХ νΝ на пассаже 0 (считая от электропорации) и пассаже 10 видно, что легко отбираются варианты, растущие лучше.

На фиг. 11 показаны результаты титрования Р1У ВерБУАХ, продуцированные клетками Уего, сертифицированными ВОЗ, содержащими кассету экспрессии С (УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*). Несмотря на то, что получившийся титр Р1У немного ниже титра, полученного из клеток ВНК, клетки Уего позволяют многократно собрать Р1У с высоким титром, что невозможно при работе с клетками ВНК.

На фиг. 12А-12В показаны мутанты по циклизации. На фиг. 12 А показана репликация репликона \VNУ/IКΕ8-К.^ис с заменой одного основания, сопоставление мутаций последовательности циклизации показывает, что некоторые мутанты с заменой одного основания реплицируются на уровне дикого типа. На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним - 5'- и З'последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера КБис, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания. На фиг. 12В показана репликация репликона \VNУ/IКΕ8-К.^ис с соответствующими изменениями двух оснований (т17), полученного при комбинации т10 и т13 (раздел А) в сравнении с уровнями репликации мутантов, сочетающих мутантную последовательность циклизации с последовательностью циклизации дикого типа в любом возможном формате, а также мутант, продуцирующий неактивную полимеразу (отрицательный контроль). На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним 5'- и З'-последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера КЕис, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания. * Означает, что репликация не обнаружена.

Подробное описание изобретения

Безопасные и эффективные вакцины существуют лишь против некоторых заболеваний, вызываемых флавивирусами. С помощью классических способов получения инактивированной вирусной вакцины (ШУ) и живой аттенуированной вакцины (ЪАУ), использующихся для получения вакцин против ΥΕ, 1Е и ТВЕУ, до сих пор не удалось получить лицензированные продукты для профилактики заболеваний, вызванных другими флавивирусами, в частности лихорадки Денге и энцефалита Западного Нила (νΝΞ). Существуют проблемы безопасности существующих ЬАУ (остаточная вирулентность или реверсия вирулентности) и ШУ (реактогенность ввиду антигенной нагрузки и добавочных антигенов). К тому же для ШУ, как правило, требуется множественная вакцинация. Кроме того, для обоих типов вакцины существуют проблемы производства, включая необходимость избегать реверсии вирулентности во время размножения живой аттенуированной вакцины и принимая во внимание количество материала, необходимое для стимуляции сильного иммунного ответа на инактивированную вирусную вакцину, а также потребность в лабораториях с высокой степенью защиты для размножения вирулентных вирусов, необходимых для получения продуктов ШУ. Несмотря на существование перспективных кандидатов новых типов вакцин против флавивирусов, путь к их получению предусматривает необходимость решения всех этих проблем.

В целом, настоящее изобретение направлено на конструирование и использование дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, принадлежащих семейству Е1аугушкае. В этой связи настоящее изобретение относится к разработке нового типа дефектных по репликации флавивирусов, также называемых КерйУАХ, сочетающих безопасность инактивированных вакцин, эффективность и масштабируемость производства живых аттенуированных вакцин. Эти флавивирусы, также называемые в настоящем изобретении псевдоинфекционными вирусами (Р1У), содержат генетически измененные геномы флавивирусов, несущие делецию большей части области, кодирующей капсид (С), таким образом, этот геном неспособен производить инфекционное потомство в нормальных клеточных линиях или вакцинированных животных. Однако эти псевдоинфекционные вирусы могут быть размножены в клетках, экспрессирующих кассеты С или С-ргМ-Е, в которых репликация вируса достигает высокого уровня. Таким образом, эти псевдоинфекционные флавивирусы неспособны индуцировать распространение инфекции в нормальных клетках ίη уйго или ίη νί\Ό по причине отсутствия транс-комплементации с белком С, следовательно, неспособны вызывать заболевание у животных.

В отличие от вакцин и способов получения этих вакцин, известных из уровня техники, настоящее изобретение относится к системе для производства псевдоинфекционных флавивирусов в промышленных масштабах, что позволит сделать такие вакцины более дешевыми и в то же время более эффективными, чем живые аттенуированные вакцины. В настоящем изобретении предлагается новый тип рекомбинантной вакцины, способной к единственному раунду репликации в иммунизированных животных

- 4 016490 или людях, ведущему к высвобождению субвирусных частиц (8ΥΡ), которые не содержат генетического материала, но могут служить эффективными иммуногенами.

В настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы могут быть получены для вируса желтой лихорадки (ΥΕν) или вируса лихорадки Западного Нила (ΥΝν). На этом основании в соответствии с настоящим изобретением было сделано предположение, что метод, описанный в настоящем изобретении, может широко использоваться для разработки вакцин против других флавивирусов. Кроме того, заражение нормальных клеток такими псевдоинфекционными флавивирусами приводило к выходу 8УР, не содержащих нуклеокапсида и генетического материала. Показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, описанные в настоящем изобретении, не способны вызывать заболевания и, таким образом, являются безопасными. Кроме того, эти псевдоинфекционные флавивирусы оказались иммуногенными для мышей благодаря своей способности к единственному раунду репликации и высвобождению 8УР, несущих вирусные антигены. Также ΥΝ Ρίν оказались способными к профилактике смертельно опасного энцефалита у мышей при контрольном заражении ΥΝν.

Ρίν, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены способами, обеспечивающими высокий уровень выхода продукта в клеточной культуре и неспособными вызывать заболевания у животных. Эти продукты могут вводиться в организм животных, где дефектный процесс репликации не допускает распространения инфекции и развития заболевания, но допускает продукцию 8УР, иммуногенных субъединиц флавивируса, для которых показана эффективность индукции эффективного иммунного ответа на заболевания, вызываемые некоторыми флавивирусами.

Настоящее изобретение также демонстрирует, что способ создания вакцины с применением псевдоинфекционных флавивирусов может быть использован в отношении двух флавивирусов с низкой степенью родства, переносимых комарами. Аналогичная технология может использоваться для РНК-вакцин к клещевому энцефалиту (КоДет, 2004), что указывает на то, что технология на основе Ρίν может использоваться для флавивирусов с более низкой степенью родства. Кроме того, результаты работы с РНКвакцинами против ТВЕУ показали, что кроме иммунного ответа антител на δνΡ (сходный с описанным в настоящем изобретении), введение репликационно активных геномов флавивируса в клетки вакцинированных хозяев также может вызвать Т-клеточный иммунный ответ (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005) . Несмотря на то, что Т-клеточный иммунный ответ не анализировался в настоящей работе, было сделано предположение, что Ρίν способны вызывать Т-клеточный иммунный ответ, сходный с вызываемым вирусной инфекцией.

Несмотря на то, что вакцины, содержащие Ρίν, описанные в настоящем изобретении, основываются на той же стратегии, которая использовалась для получения РНК-вакцин против ΤΒΕν (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005), для вакцин, содержащих Ρίν, не требуется использование генной пушки для доставки в организм животных, они легко растут в клеточных культурах и выдерживают процедуры стабилизации и хранения (лиофилизация) при тех же условиях, которые используют в настоящее время для коммерчески производимой вакцины ΥΕν 17Ό, давая, таким образом, масштабируемый и легко хранимый товарный продукт-вакцину. Предварительные исследования стабильности Κ^ρΙίνΑΧ ΥΝ показали, что хранение лиофилизированных препаратов в течение 30 дней при 4°С не оказывает заметного влияния на титр.

Для разработки оптимальных условий для быстрого роста, необходимого для эффективной транскомплементации (и, следовательно, высокого уровня выхода) псевдоинфекционных флавивирусов, в настоящем изобретении использовали клетки, экспрессирующие высокие уровни С (или С-ргМ-Е) с репликонов νΕΕν. Репликоны νΕΕν обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны, полученные из других альфавирусов, так что в некоторых клеточных линиях позвоночных и насекомых устанавливается их постоянная репликация. Такая система подходит для получения псевдоинфекционных флавивирусов, поскольку: ί) репликоны νΕΕν высокоэффективны для синтеза гетерологичных белков, и в настоящем изобретении синтезировали С на уровне, необходимом для образования капсида вокруг генома флавивируса; ίί) не отмечено взаимодействия между репликонами νΕΕν и репликацей флавивируса (ТеЕакоуа. 2005). Кроме того, репликоны νΕΕ и геномы Ρίν ΥΕ могут реплицироваться вместе в клетках ВНК, не приводя к заметному цитопатогенному эффекту; ίίί) репликоны νΕΕν могут паковаться с высоким титром в вирионы νΕΕ, которые можно использовать для быстрого получения пакующих клеточных линий, производящих структурные белок (белки) флавивируса.

Кроме того, исследование влияния контекста экспрессии С на уровень выхода Ρίν показало, что пакующие клетки, экспрессирующие заякоренную в мембране форму С, содержащую 20 дополнительных аминокислотных остатков ргМ, производили большее количество частиц, чем клетки, экспрессирующие только С, что указывает на важность соблюдения правильной последовательности событий процессинга при сборке вириона. Неясно, почему конструкция, содержащая первые 20 аминокислот ргМ, пакуется более эффективно, однако это явление можно объяснить требованием к соблюдению специфического порядка расщепления по двум близкорасположенным сайтам расщепления (специфичных для Ν82Β/Ν83 и сигнальной пептидазы) (АапъйеЫкоу апй Сотрапк, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белковых продуктов гена С в двух разных контекстах. Кроме того, было показано, что коэкспрессия С с ргМ и Е (νΕΕκρ^-ρτΜ-Ε/Ραε) приводила лишь к небольшому повышению уровня выхода Ρίν по сравнению с νΕΕι^/ίν/Ραο, экспрессирующему заякоренный в мембране С, содержащий

- 5 016490 фрагмент ргМ.

При исследовании оптимизации кодонов генов С, кодируемых репликонами νΕΕν, с целью выяснения, может ли такое изменение последовательности гена С повышать уровень выхода Ρίν, не было обнаружено большой разницы в уровне выхода ΥΕ Ρίν по сравнению с клетками, не экспрессирующими кодон-оптимизированный ген С. Это наблюдение позволяет предположить, что репликоны νΕΕν, даже содержащие неоптимизированные кодоны, продуцируют С на уровне насыщения. Эти результаты подтверждаются результатами других работ, показывающими, что клеточные линии, экспрессирующие репликоны νΕΕν, кодирующие кассеты νΝν С-Е, продуцировали более высокий уровень Е, чем клетки, инфицированные νΝν. Несмотря на неспособность транс-экспрессируемого оптимизированного гена С к повышению уровня выхода ΥΕ Ρίν, в клетках, содержащих репликон νΕΕν, экспрессирующий Сор!, наблюдался цитопатический эффект и образование бляшек при инфекции ΥΕ Ρίν. Таким образом, инфекция Ρίν в клетках Сор! оказывается еще более сходной с инфекцией, вызываемой вирусом, способным к репликации. Дополнительным преимуществом использования репликонов νΕΕν, кодирующих ген Сор! ΥΕν, в производстве псевдоинфекционных флавивирусов является повышение уровня безопасности, поскольку изменение в кодонах снижает вероятность гомологичной рекомбинации с геномом псевдоинфекционного флавивируса. Кроме того, последовательность циклизации гена Сор! также подвергалась изменениям (в настоящем изобретении описано для области, кодирующей ген С νΝν в клетках ВНК (VΕΕр/С*-Ε*-Ρас)) для снижения вероятности рекомбинации, в результате которой может получиться реплицирующийся флавивирус, кодирующий С. На сегодняшний день ни одна из систем νΝ и ΥΕ Ρίν, описанных в настоящем изобретении, не продуцировала реплицирующихся флавивирусов, которые могут быть обнаружены в клеточной культуре или у высоковосприимчивых животных. Кроме того, эксперименты ίη у1уо показали, что как ΥΕ, так и νΝ Ρίν оказались безопасными и не вызывали заболевания даже после интрацеребральной инокуляции 3-4-дневных мышат самой высокой дозой Ρίν. Тем не менее, νΝ Ρίν были способны индуцировать высокий титр нейтрализующих антител и предохраняли мышей от инфекции способных к репликации νΝν.

Кроме того, гепатит С попадает наравне со СПИДом в категорию инфекций, являющихся причиной наибольшей заболеваемости и смертности, против которых на сегодняшний день не существует вакцин. В Японии и Корее вклад вируса гепатита С (НСУ) превышает вклад гепатита В в развитие гепатоцеллюлярной карциномы, одного из наиболее распространенных типов раковых заболеваний и распространенной причины смерти от заболевания печени. Это соотношение, скорее всего, будет распространяться шире по азиатским странам и другим развивающимся странам из-за возрастающего преобладания НСV одновременно с эффективной иммунизацией против гепатита В. В некоторых районах Египта и других стран гепатит С является чрезвычайно распространенной инфекцией, вероятно отчасти по причине традиционных практик здравоохранения и/или по причине внедрения опасных западных технологий в прошлом (таких как перенос вируса с кровью при использовании одной иглы во время публичных кампаний по охране здоровья, направленных на борьбу с шистосомиазом).

Во многих развивающихся странах, где частота заболеваний раком печени и циррозом высока, не существует эффективного контроля переноса гепатита С при переливании крови. Гепатит С также представляет собой большую проблему для здравоохранения в США, где проживают около 4 млн носителей НСV, многие из которых находятся в группе риска смерти по причине терминальной стадии заболевания печени или рака печени. На данный момент подсчитано, что в США ежегодно от гепатита С умирает 8000-10000 человек. В течение следующих 10-20 лет в отсутствие новых терапевтических или профилактических подходов, возможно, это число утроится, превзойдя количество смертей от СПИДа.

Однако не существует вакцины для профилактики этой инфекции, в то время как попытки (как национальные, так и международные) разработки вакцины сильно затруднены из-за очевидных технических затруднений, недостаточного интереса к разработке вакцин со стороны фармацевтических компаний, а также отсутствия интереса со стороны финансирующих организаций. Так же, как и в случае многих других инфекционных заболеваний, малоимущие слои населения оказываются в группе наибольшего риска развития серьезного заболевания печени или смертности по причине гепатита С.

На сегодняшний день попытки создания эффективной вакцины против инфекции НСV не привели к успеху. Однако в течение последних нескольких лет область НСУ начала быстро развиваться, в результате чего в настоящее время этот вирус реплицируется в культуре с достаточно высоким титром, достигающим 10⁶ инф. ед./мл. Между геномом НСУ и геномами других флавивирусов, таких как ΥΕ, ΙΕν, ТВЕ и других, существует ряд очевидных сходных черт. Следовательно, стратегия разработки дефектных по репликации флавивирусов может быть применена к членам не только рода Е1ау1У1ги8, но также и рода Нерас1У1ги8, включая НСУ. Капсидный белок НСУ может быть получен с помощью рекомбинантного альфавирусного репликона (на основе 8ίΝν, νΕΕν, ΕΕΕν и других) в различных клеточных линиях, включая клетки Ний-7 и Ний-7.5, обладающие известной восприимчивостью к инфекции НСУ. Геномы НСУ, дефектные по репликации, не содержащие гена, кодирующего капсид, могут быть трансфицированы в клеточную линию, продуцирующую капсид, и упакованы в инфекционные частицы, содержащие капсид.

Последующие раунды инфицирования, необходимые для масштабного производства, также могут

- 6 016490 проводиться на этих клетках. Однако ίη νίνο в наивных гепатоцитах (а также, возможно, и в других типах клеток), геномы НСУ, не содержащие полного гена капсида или вообще не содержащие гена капсида, будут производить только неструктурные вирусные белки, а также гликопротеины Е1 и Е2. Эти белки будут презентироваться иммунной системе ί) после протеасомной деградации; ίί) на поверхности клеток; ίίί) в форме вирусоподобных частиц с оболочкой, содержащей Е1 и Е2. Отсутствие капсида будет препятствовать распространению вируса, таким образом, присутствие вируса будет ограничиваться клетками, получившими дозу вакцины.

Таким образом, в настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, не содержащие капсида: ί) способны вызывать распространение инфекции в клеточных линиях, экспрессирующих капсид или все структурные гены флавивируса; ίί) Р1У оказались неспособными к распространению инфекции в нормальных клетках; ίίί) Р1У продуцировали 8УР, содержащие белок Е, при инфекции нормальных клеток; ίν) Р1У продемонстрировали высокий уровень безопасности для животных; ν) Р1У обеспечивали профилактику мышей от последующей флавивирусной инфекции. В целом, настоящее изобретение показывает, что флавивирусные Р1У могут представлять собой безопасную, мощную и эффективную основу для создания вакцин против инфекций, вызываемых флавивирусами, и инфекций, вызываемых вирусами, сходными с ΡΊανίνίπίδ.

Настоящее изобретение относится к разработке дефектных по репликации псевдоинфекционных Иацщшбае, включающих делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей капсидный белок (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию, где Наубзпбае реплицируются исключительно в клетках, экспрессирующих принадлежащие вирусу семейства Е^Мпбае белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию. Как правило, Наупзпбае включает вирус, принадлежащий к роду Εΐανίνίπίδ. НерасМтик или РейМтик, или химеры вышеупомянутых вирусов, полученные путем обмена кассет ргМ-Е других вирусов на кассеты ргМ-Е псевдоинфекционных Е1ацщш6ае. Список вирусов, принадлежащих к роду Е^Мтик, может включать в себя, но ими не ограничивается, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сент-Луиса, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррей. Кроме того, пример вирусов, принадлежащих к роду НерасМтик, включает, но им не ограничивается, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих к роду РейМтик, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров, вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней.

В случае флавивируса, делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С флавивируса, может кодировать аминокислотные остатки 26-100 белка С или комбинацию аминокислотных остатков, находящихся в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С. Такие комбинации могут включать, но ими не ограничиваются, аминокислотные остатки 26-93, 31-100 или 31-93. Средний специалист в данной области может по такому принципу делетировать нуклеотидную последовательность белка С других вирусов, принадлежащих семейству Е^Мпбае, или других вирусов со сходной организацией генома. В общем и применительно ко всем вирусам, делетированный ген заменяют геном, кодирующим маркерный белок или антиген. Пример маркерного белка включает, но им не ограничивается, зеленый флуоресцентный белок.

Настоящее изобретение также относится к разработке системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства Е^Мпбае, эффективно поддерживающих размножение вышеописанных дефектных по репликации Паубзпбае в соответствующих условиях. Для этой цели клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки Е1ацщшбае, могут быть получены с помощью репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.

В общем, ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства Е1ацщшбае, в репликоне заменяют на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок или белки вируса семейства Е^Мпбае, таким образом, что эта замена уменьшает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Наубзпбае и/или увеличивает производство псевдоинфекционного вируса семейства Е1ацщшбае.

Например, такие репликоны могут экспрессировать белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Е1ацщшбае. Репликон может экспрессировать белок С в репликоне, который содержит неприродную последовательность циклизации таким образом, что присутствие последовательностей циклизации снижает вероятность продуктивной рекомбинации дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами. Кроме того, репликон может экспрессировать белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, в клеточной культуре, уровень выхода 8УР, содержащих ргМ/Е, ίη νίνο или их комбинации.

Далее репликоны, экспрессирующие белки Е1ацщшбае, вводят в клетку путем трансфекции РНК

- 7 016490 репликона, синтезированной ίη νίίτο, путем трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНКполимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки. Вирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой альфавирусы. Типичные примеры таких альфавирусов могут включать, но ими не ограничиваются, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей (\УЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс (Κοββ ВКсг νίπιβ).

Настоящее изобретение также относится к способу получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае, включающему получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мббае, содержащего делецию в гене капсида таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей принадлежащие вирусу семейства Б1а\'бзпбае белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков, необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае; и инфицирования клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства Ек-ινί νί Нбае, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Б1а\'бзпбае. Все остальные аспекты, касающиеся типа вирусов, положения делеции в гене капсида, способа получения клеточной линии, экспрессирующей мутантные белки и белки дикого типа Е^Мпбае, типа репликона и мутаций внутри репликонов и модификаций генов, кодирующих мутантные белки и белки дикого типа Е^Мпбае, такие, как описано выше.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Е^Мпбае, полученный способом, описанным выше. Настоящее изобретение также относится к способу защиты индивида от инфекций, возникающих при контакте с Е^Мпбае, путем введения в организм индивида иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, при этом композиция индуцирует в организме индивида иммунный ответ на Е^Мпбае, защищая таким образом индивида от инфекций. Эта композиция может доставляться в организм внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально. Кроме того, индивидом, для которого введение такой композиции может быть эффективно, является человек или животное.

При использовании в настоящем описании единственного числа следует понимать, что его использование подразумевает и множественное число. При использовании в формуле изобретения в сочетании со словом содержащий единственное число также включает и множественное. При употреблении в настоящем описании слова другой оно может обозначать, по крайней мере, второй, тот же самый или отличный элемент пункта формулы изобретения или его компонентов. При употреблении в настоящем описании под термином Е^Мббае понимают род Ρΐηνίνίπιβ. НерасМтив и Рев1Мги5. Примеры вирусов, принадлежащих роду Е^Мтив, включают, но ими не ограничиваются, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита СентЛуиса, вирус японского энцефалита или вирус энцефалита долины Мюррей. Также примеры вирусов, принадлежащих роду НерасМтив, включают, но ими не ограничиваются, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих роду Рев1Мги5, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров, вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней.

Кроме того, несмотря на то, что в настоящем изобретении описано конструирование и применение дефектного по репликации псевдоинфекционного Е^Мпбае, средний специалист в данной области может, используя те же принципы, сконструировать химеры, содержащие другие вирусы семейства Е^Мпбае, или сконструировать химеры путем обмена кассет ргМ-Е между вирусами, принадлежащими к Е^Мпбае, или другими сходными вирусами и вирусами, принадлежащими к Б1а\з\зпбае.

Фармацевтические композиции, содержащие дефектные по репликации псевдоинфекционные вирусы семейства Е^Мпбае, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться одновременно или последовательно в сочетании друг с другом или с другими фармацевтическими композициями. Эффект совместного приема таких композиций состоит в защите индивида от инфекций, вызванными такими вирусами, а также других заболеваний, лечение которых с помощью вакцин может быть эффективно. Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая композиция или их комбинации может приниматься независимо друг от друга, системно или местно, любым способом, известным из уровня техники, как, например: подкожно, внутривенно, парентерально, внутрибрюшинно, чрескожно, внутримышечно, наружно, энтерально, ректально, назально, защечно, вагинально, путем ингаляции спрея, с помощью насоса, или содержаться в трансдермальном пластыре или импланте. Состав композиции, описанной в настоящем изобретении, может включать общепринятые нетоксичные, физиологически или фармацевтически приемлемые носители, подходящие для способа введения и хорошо известные среднему специалисту

- 8 016490 в данной области.

Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая фармацевтическая композиция или их комбинации может вводиться независимо один или более раз с целью достижения, закрепления и улучшения терапевтического эффекта. Определение дозы, а также содержания подходящей дозы одной или обеих композиций в одной или нескольких дозах для приема находится в пределах компетенции специалиста. Подходящая доза рассчитывается исходя из состояния здоровья пациента, степени защиты пациента от флавивирусных инфекций, способа применения и используемой формулы.

Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение хорошо приспособлено для выполнения поставленных задач и достижения упомянутых в настоящем изобретении целей и преимуществ, а также подразумеваемых задач, целей и преимуществ. Специалист в данной области может принимать решения, связанные с изменениями и другими способами употребления, охватываемыми сущностью изобретения, определяемыми рамками формулы изобретения.

Пример 1. Культуры клеток.

Клетки ВНК-21 были предоставлены Полом Олайво (Раи1 Οΐίνο, АакЫпдЮп Ипуегайу, 81. Ьошк, Мо). Клетки растили в минимальной среде α (αΜΕΜ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8) и витаминов. Клетки Уего, сертифицированные ВОЗ (АНО), были предоставлены д-ром Стивом Уайтхедом (Ότ. 81ете Аййейеаб, ΝΙΗ) . Клетки Уето растили в среде ΜΕΜ, содержащей 6% ЕВ8.

Пример 2. Плазмидные конструкции.

Для получения плазмидных конструкций использовались стандартные приемы работы с рекомбинантной ДНК. Схематическое изображение использовавшихся плазмид приведено на фиг. 7А-7Е. Карты и последовательности плазмид приведены на фиг. 8А-8Е. Родительская низкокопийная плазмида ρΑΟΝΚ/ΡΕΥΡ-17Όχ, содержащая инфекционную кДНК генома штамма 17Ό УЕУ, была описана ранее (ВтебепЬеек е! а1, 2003); плазмида была предоставлена д-ром Чарльзом М. Райсом (Ότ. Сйат1е8 М. Ктсе, Коске£е11ет Ипщегкйу, №\ν Уотк, Ν.Υ.). рУРР1У содержала дефектный геном УРУ (УЕ Р1У), в котором фрагмент, кодирующий аминокислотные остатки 26-93 гена капсида УЕ, был заменен на кодоноптимизированный ген СЕР, полученный из ρΕΟΕΡ-Ν1 (производство С1оШес11). Геном ΑΝ Р1У (ρΑΝΡΙΥ) был получен из инфекционной кДНК Техак 2002 (К.о881 е! а1., 2005) путем слияния кодона 30 гена С с кодоном 101 гена С (см. фиг. 5А). Плазмиды рУЕЕгер/С1/Рас, рУЕЕгер/С2/Рас и рУЕЕгер/СргМ-Е/Рас (фиг. 2А) кодировали двойные субгеномные репликоны УЕЕУ, в которых первый субгеномный промотер регулировал транскрипцию РНК, содержащей 5'-ИТК. УЕЕУ 268 РНК, за которой следовали последовательности, соответствующие нуклеотидам 119-481, 199-541 и 119-2452 генома УЕУ в указанном порядке. Второй субгеномный промотер регулировал экспрессию гена пуромицинацетилтрансферазы (Рас), продукт которого делает клетки резистентными к остановке трансляции, вызванной пуромицином (Риг). Нецитопатические репликоны УЕЕУ, экспрессирующие кассету С-ргМ-Е ΑΝΧ {полученные из репликона вируса Синдбис (8с1ю11е е! а1., 2004)}, слитую с геном Рас (обозначенную рУЕЕгер/С*-Е*-Рас), были получены из нецитопатического репликона УЕЕ (Ρеΐ^акονа е! а1., 2005); последовательность, кодирующая Е, была слита с геном Рас посредством линкера, состоящего из первых 9 кодонов N81 и последних 25 кодонов Ν82Β, за которыми следовали 2 кодона N83, слитых напрямую с ЕМОУ 2Α (см. фиг. 5А). Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая капсид УЕУ 17Ό и первые 20 аминокислотных остатков ргМ, была получена с использованием данных частот кодонов, описанных ранее (Наак е! а1., 1996). Этот ген был синтезирован с помощью полимеразной цепной реакции из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов.

Амплифицированный фрагмент секвенировали перед клонированием в кассеты экспрессии УЕЕтер/С2ор1/Рас и УЕЕтер/Сор1/ргМ-Е/Рас. Последние репликоны имели строение, сходное с рУЕЕгер/С2/Рас и рУЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, но содержали кодон-оптимизированную последовательность, представленную на фиг. 4А.

Кроме того, был получен химерный АХ-ВерПУАХ, экспрессирующий ргМ-Е 1ЕУ. Это было достигнуто путем замены генов ргМ и Е штамма Накаяма 1ЕУ в Α ВерНУАХ, кодирующем геном АNУ. Обмен генами производился путем прямого слияния последнего кодона процессированного белка С АNУ с первым кодоном последовательности, кодирующей ргМ 1ЕУ (штамм Накаяма). Эта же схема слияния была применена на 3'-конце кассеты, где последний кодон белка Е 1ЕУ сливался напрямую с первым кодоном Ν81 АNУ. Слияние производили на плазмиде ВАС, кодирующей полную последовательность кДНК ВерйУАХ ΑΝ, ограниченную промотором Т7 и рибозимом, и РНК, полученная с этой ДНК ВАС, была введена в клетки ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*). Полученный ВерНУАХ (обозначенный 1Е КерНУАХ) формировал фокусы распространения инфекции в ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*). Что касается ΑΝ К.ер11УАХ, фокусы, формирующиеся на этой клеточной линии, имели меньший размер, чем фокусы, продуцируемые полностью инфекционной химерой АХУ-1ЕУ. 1Е ВерНУАХ росли до значений титров, приблизительно в 10 раз ниже титров ΑΝ ВерНУАХ, титр в ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*) достигал 10⁶ ед./мл. Как и ожидалось, 1Е ВерНУАХ связывается с моноклональными антителами, специфичными к !Е, и предполагается, что как и химерные флавивирусы 1Έ РерйУАХ будет индуцировать высокие титры

- 9 016490 антител, нейтрализующих 1ЕУ, и, как следствие, предохранять от 1Е.

Пример 3. Транскрипция РНК.

Плазмиды очищали путем центрифугирования в градиенте СзС1. Перед реакцией транскрипции плазмиды линеаризовали с помощью Х1юГ (для рУТР1У) или М1иГ (для репликона УЕЕ и плазмид, кодирующих хэлпер УЕЕ) или 8\ναΙ (для ОТЫРГУ). РНК синтезировали с помощью 8Р6 или Т7 РНКполимеразы в присутствии аналога кэпа. Выход и целостность транскриптов анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. Аликвоты транскрипционной реакции использовали для электропорации без дополнительной очистки.

Пример 4. Трансфекции РНК и анализ репликации РГУ.

Электропорация клеток ВНК-21 проводили в условиях, описанных ранее (и1)с51гот с1 а1., 1991). Для получения пакующих клеточных культур в среду добавляли Риг в концентрации 10 г/мл через 24 ч после электропорации репликонов УЕЕУ. Трансфекцию синтезированного ίη νίΐτο генома УТ РГУ проводили 5 дней спустя, когда клетки, содержащие репликон, возобновляли результативный рост. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем замены среды на такую же среду, содержащую Риг. Во многих экспериментах клетки, секретирующие РГУ, рассаживали по достижении конфлюэнтного монослоя.

Репликоны УЕЕУ упаковывали в инфекционные вирионы УЕЕУ путем коэлектропорации репликона, синтезированного ίη νίΐτο, и 2 РНК-хэлперов ^ο^ονα с1 а1., 2006) в клетки ВНК-21. Вирусные частицы, содержащие репликон, собирали через 24 ч после трансфекции и использовали для инфицирования наивных клеток ВНК-21 с последующей селекцией Риг. В случае ОТЫ РГУ, РНК РГУ, синтезированную ίη νίΐτο, трансфицировали в клетки ВНК, содержащие репликон УЕЕгер/С*-Е*-Рас, экспрессирующий ОТЫ С, ргМ и Е и Рас [клетки ВНК(УЕЕгер/С*-Е*-Рас)]. Схема генома УЕЕгер/С*-Е*-Рас представлена на фиг. 5А. Собранные РГУ пассировались на эти клетки с использованием стандартных способов (Κοβδί еΐ а1., 2005).

Пример 5. Измерение титров УТ РГУ.

Для измерения титра вышедших УТ РГУ, клетки ВНК-21 рассаживали в 6-луночные планшеты производства ί.'ο8ΐ3Γ в концентрации 5х10⁵ клеток на лунку. Через 4 ч клетки инфицировали различными разведениями упакованных репликонов и через 1 ч инкубации при 37°С и 5% СО₂ клетки покрывали 2 мл среды МЕМ, содержащей 10% ЕВ8. Количество инфицированных клеток определяли путем подсчета клеток, дающих положительную реакцию на СЕР под инвертированным УФ-микроскопом. Долю инфицированных клеток от исходного количества определяли путем подсчета флуоресцирующих клеток в определенной области поля зрения микроскопа. Подсчеты по 5 различным полям усредняли и пересчитывали для титра, соответствующего каждому последовательному разведению. В последующих экспериментах титры также измеряли с помощью анализа бляшек на монослойных клетках ВНК-21, несущих репликон УЕЕ^ер/Сοрΐ-р^М-Е/Рас, в условиях, описанных ранее (Ьетт еΐ а1., 1990), за исключением того, что клетки инкубировали под слоем агарозы в течение 5 дней для развития бляшек, затем фиксировали 2,5%-ным раствором формальдегида и окрашивали кристаллическим фиолетовым.

Пример 6. Пассирование ΥΕ РГУ.

Пакующие клеточные линии получали с помощью трансфекции синтезированной ίη νίΐτο РНК репликона УЕЕУ или инфекции клеток теми же репликонами, упакованными в структурные белки УЕЕУ, с множественностью инфекции (МОГ) 10 инф. ед. на клетку. После селекции Риг клетки инфицировали ΥΕ РГУ при различных МОГ. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем смены среды.

Пример 7. Анализ продукции ΥΕ 8УР.

Клетки ВНК-21 рассаживали в концентрации 2х 10⁶ клеток на 100-миллиметровую чашку. После 4 ч инкубации при 37°С клетки инфицировали ΥΕ РГУ с МОГ, равной 10 инф. ед. на клетку, и затем инкубировали в течение 24 ч в 10 мл МЕМ с добавлением 10% ЕВ8. Далее среду заменяли на 10 мл бессывороточной среды УР-8Е (производство ^Φο^η), которую меняли раз в 24 ч для анализа выхода 8УР. Собранные образцы УР-8Е очищали путем центрифугирования на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин, 4°С) и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования через 2 мл 10%-ного раствора сахарозы в РВ8, в роторе 8ОТ-41 при 39000 об/мин, 4°С, в течение 6 ч. Осадочный материал растворяли в наносном буфере для δΌδ-полакриламидного гель-электрофореза в отсутствие β-меркаптоэтанола (чтобы сохранить сайт связывания с моноклональными антителами Ό1-4Ο2) и анализировали далее методом Вестернблоттинга. После переноса белков нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами Ό1-4Ο2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (НКР) (производство 8ао1а Стих В^οΐесйο1οду). Активность НКР определяли с использованием реагента Люминола для Вестерн-блотов согласно указаниям производителя (8ао1а Стих В^οΐесйηο1οду). Чтобы получить образцы, служащие положительным контролем, ΥТУ (2х10⁸ бляшкообразующих единиц) центрифугировали сквозь 10%-ную сахарозную подушку, как описано ранее для 8УР.

Для анализа ΥТУ 8УР методом градиента сахарозы клетки ВНК-21 электропорировали синтезированной ίη νίΐτο геномной РНК ΥΕ РГУ. Через 24 ч после трансфекции полную среду МЕМ заменяли на

- 10 016490 среду УР-8Р, которую собирали через 24 ч. К этому времени более 95% клеток имели положительную реакцию на СРР и не проявляли никаких признаков цитопатического эффекта. Собранные образцы очищали центрифугированием на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин, 4°С) и затем концентрировали центрифугированием в течение ночи в роторе 8ν-28 при 25000 об/мин, 4°С. Полученный осадок суспендировали в буфере ΤΝ (10 нМ Тп5-НС1 (рН 7,5), 100 мМ ЫаС1, 0,1 % В8А) и проводили дальнейший анализ по описанной ранее методике (8ο1ι;·ι1ίο1ι е! а1., 1996).

Вкратце, образцы объемом 0,5 мл помещали в прерывистый сахарозный градиент (1,5 мл 50%, 1,5 мл 35% и 1,5 мл 10%-ного раствора сахарозы в буфере РВ8). Центрифугирование проводили в роторе 8\У-55 при 45000 об/мин и 4°С в течение 1 ч на ультрацентрифуге Орйша МАХ иИтасепйтРцде (производство Весктап). Осадки растворяли в буфере для нанесения на 8И8-полиакриламидный гель для проведения электрофореза без β-меркаптоэтанола (чтобы сохранить связывание с моноклональными антителами Ό1-4Ο2) и анализировали методом Вестерн-блоттинга. После переноса белков, нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами Ό1-4Ο2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (НИР), приобретенными у 8ап1а Сти/ Вю1ес11по1оду. Активность НИР определяли с помощью реагента люминола для Вестерн-блотов согласно рекомендациям производителя (8ап1аС’гих Вю1ес1шо1оду). Параллельный градиентный анализ проводили на УРУ (2х10⁸ бляшкообразующих единиц, РРИ), подвергнутом процедурам, описанным выше для 8УР, полученных из УРУ-Р1У.

Пример 8. Анализ νΝ Р1У.

Титры νΝ Р1У определяли путем инфицирования монослойных клеток Уего последовательными разведениями вируса, фиксацией спустя 24 ч и иммуногистохимического окрашивания поликлональной гипериммунной мышиной асцитной жидкостью, специфичной к νΝν, как описано ранее (Ио551 е! а1., 2005). Инфицированные клетки подсчитывали и использовали для определения титра. Чтобы оценить способность νΝ Р1У к формированию фокусов на клетках Уего или ВНК(УЕЕгер/С*-Е*-Рас), монослойные культуры инфицировали разведениями νΝ Р1У, покрывали полутвердым трагакантом, инкубировали при 37°С, затем фиксировали и окрашивали моноклональными антителами, специфичными к νΝν N81 (предоставлены Е. КошкЫ, КоЬе, 1арап) как описано выше.

Пример 9. Исследования безопасности Р1У.

Безопасность Р1У исследовали путем инокуляции различных доз вируса (инфекционные кДНК, полученные из родительских инфекционных штаммов УРУ 17Ό или νΝν ТХ02) или Р1У мышам в возрасте 3-4 дней (аутбредные 8\νί55 VеЬ5ΐе^, Наг1ат) интракраниально (ΐ.ο) (объем 20 мл) или самкам мышей в возрасте 4-5 недель (аутбредные 8\νί55 VеЬ5ΐе^, Наг1ат) внутрибрюшинно (1.р.) (объем 100 мл). За признаками заболевания и смертностью мышей наблюдали в течение 14 дней, агонизирующих животных, которые очевидно не доживали до следующего дня, умерщвляли гуманным способом и засчитывали как мертвых на следующий день.

Пример 10. Исследования действенности и эффективности Р1У νΝ.

Выбранных животных, инокулированных νΝ Р1У, как описано выше, умерщвляли и спускали кровь через 21 день после инокуляции. У животных собирали сыворотку, смешивали и проверяли на способность ослаблять образование фокусов νΝν на монослойных клетках Уего, используя методы, описанные выше. Остальных животных инокулировали 1000 инф. ед. (определено с помощью теста на образование фокусов на клетках Уего), что соответствовало примерно 100 ЬП₅₀ штамма ΝΏ99 νΝν (Х1ао е! а1., 2001), и животных наблюдали в течение 14 дней, как описано выше.

Пример 11. Кассеты, экспрессирующие как УРУ С, так и УРУ С-ргМ-Е, могут комплементировать репликацию УРУ Р1У.

Общая стратегия комплементации дефекта, вызванного делецией С в геноме флавивируса, приведена на фиг. 1. Эта стратегия основана на получении геномов с отсутствующим геном С и размножении этих псевдоинфекционных вирусных геномов (Р1У-геномы) в клетках, экспрессирующих С (или все вирусные структурные белки), но не в нормальных клетках. Репликация в последних клетках, продуцирующих невирусные структурные белки, необходимые для транс-комплементации дефекта генома Р1У, приводит к высвобождению 8УР, содержащих критический защитный иммуноген Е, но не содержащих нуклеокапсид, содержащий С и генетический материал.

Был создан рекомбинантный геном УРУ (геном УРУ Р1У), содержащий СРР вместо аминокислотных остатков 26-93 С, клонированный в той же рамке считывания, что и остальная часть полипептида (фиг. 2 А). Экспрессия СРР предоставляет удобный способ экспериментального определения титров Р1У, содержащих геном. Ожидалось, что делеция последовательности, кодирующей С, из этого генома Р1У ликвидирует способность С к образованию функционального нуклеокапсида, но не повлияет на продукцию функциональных форм ргМ и Е. Таким образом, клетки, экспрессирующие этот геном, продуцирующие флуоресценцию СРР, неспособны к высвобождению инфекционного вируса. Однако ожидалось, что пакующие клетки, экспрессирующие С на высоком уровне, будут производить инфекционное потомство.

Для быстрого получения клеточных линий для эффективной продукции Р1У использовали систему

- 11 016490 экспрессии, основанную на геноме вируса венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ) (репликоны) (Рейакоуа с1 а1., 2005). Репликоны УЕЕУ обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны, полученные из других альфавирусов, и в некоторых клеточных линиях, полученных от позвоночных и насекомых, легко устанавливается их персистирующая репликация. Кассеты экспрессии были разработаны в виде двойных субгеномных конструкций (см. фиг. 2В), в которых один из субгеномных промоторов регулировал экспрессию Рас, предоставляя, таким образом, эффективный способ элиминации клеток, не содержащих репликона УЕЕУ, экспрессирующего Рас, из трансфицированных культур. Второй субгеномный промотор регулировал транскрипцию субгеномной РНК, кодирующей структурные белки УЕУ. Для определения наиболее эффективных пакующих кассет репликоны УЕЕУ, кодирующие ί) УЕУ С с сигнальным пептидом ргМ, также известный как заякоренный в мембране С (ЫибеиЬасй аиб К1се, 2001) (УЕЕгер/С1/Рас), или и) С с сигнальным пептидом и 20 аминокислотными остатками ргМ (УЕЕгер/С2/Рас), или ΐΐΐ) все структурные белки ΥΕΎ (УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас). Дизайн этих кассет основывался на сохранении в кассетах, кодирующих С, сигнального пептида, предположительно необходимого для направления С в надлежащий клеточный компартмент.

РНК репликонов УЕЕУ, синтезированные ίη νίίτο, трансфицировали в клетки ВНК-21, и стабильные клеточные линии, устойчивые к Риг, селектировались в течение 4-5 дней в среде, содержащей Риг. В течение первых 2-3 дней после трансфекции репликация полученной из РНК УЕЕУ приводила к остановке роста, затем, как было описано ранее (Реί^акονа еί а1., 2005), эффективность репликации снижалась, и клетки возобновляли рост. Полученные Риг-резистентные культуры трансфицировали синтезированными ίη νίίτο РНК репликонов ΥΕ Р1У и определяли титры вышедших инфекционных частиц, содержащих СЕР-экспрессирующие геномы, в различные моменты времени после инфекции (фиг. 2С). Как оказалось, присутствие двух различных реплицирующихся РНК (специфичных для ΥΕΎ и УЕЕУ) в клетках ВНК-21 не приводило к цитопатическому эффекту (СРЕ) и обуславливало как резистентность к Риг, так и высокий уровень экспрессии СЕР, что подтверждало репликацию обоих репликонов УЕЕУ и РНК ΥΕ Р1У. Как показано на фиг. 2С, культуры, экспрессирующие оба этих маркерных гена, были способны к росту и требовали пересадки (в разведении 1:5 каждые 4 дня), чтобы предотвратить образование конфлюэнтного монослоя. Результаты экспериментов, представленные на фиг. 2, показывают, что все три репликона УЕЕУ оказались способны продуцировать ΥΕΥ С на уровне, достаточном для образования инфекционных Р1У; наивные клетки ВНК-21, трансфицированные РНК ΥΕ Р1У в отсутствие репликонов УЕЕУ, не продуцировали инфекционных частиц (не показано). Однако клетки, экспрессирующие эти пакующие кассеты, различались по своей способности продуцировать Р1У. Конструкции, экспрессирующие С с сигнальным пептидом ргМ (заякоренный в мембране С; УЕЕгер/С1/Рас), продемонстрировали самый низкий уровень упаковки РНК ΥΕ Р1У по сравнению с кассетами, экспрессирующими более длинные белковые последовательности. Причина более низкой пакующей эффективности конструкции С1 остается неясной, но этот феномен может объясняться необходимостью в специфическом порядке расщепления по двум близлежащим сайтам расщепления (Ν82/Ν83 и сигнальной пептидазой) (УапъНсЫко!' апб Сошрапк, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белка С, продуцированного в двух разных контекстах стабильности этого белка. Таким образом, после проведения этих экспериментов УЕЕгер/С1/Рас был исключен из всех дальнейших экспериментов. Оба репликона УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас упаковывали ΥΕ Р1У до сходных титров, достигавших более 10⁷ инф.ед./мл. Кроме того, выход Р1У-частиц продолжался до окончания эксперимента, при этом каждая клетка высвобождала около 20 ΥΕ Р1У за период времени, равный 24 ч. Вероятно, что эти клетки высвобождали также 8УР, содержащие ргМ/Е и не содержащие нуклеокапсид и геном, но эта возможность далее не исследовалась.

Пример 12. ΥΕ Р1У с дефектным геномом могут производиться в больших масштабах.

В конечном счете, применимость Р1У в качестве вакцин-кандидатов зависит от возможности получения этих частиц в количестве, необходимом, например, для коммерческого производства. Уверенность в системе, основанной на транскомплементации РНК (репликоны УЕЕУ), для производства вакцин требует выработки дальнейших стандартов, поскольку существует возможность накопления мутаций в гетерологичных генах, клонированных в геномы РНК-вирусов. Использование клеточных линий ранних пассажей является одним из возможных вариантов решения этой проблемы. С другой стороны, аккумуляция мутаций в геномах УЕЕгер может быть сведена к минимуму с помощью повторных трансфекций репликона в наивные клетки или с помощью продукции упакованных репликонов УЕЕУ и последующей инфекции наивных клеток. Использование пакующих репликонов УЕЕ считалось самым простым и эффективным способом получения пакующих клеточных линий.

Для эффективной продукции Р1У использовали технологию получения культур клеток, экспрессирующих репликоны альфавируса, в предварительно упакованых репликонах УЕЕУ. Вкратце, репликоны УЕЕУ упаковывались в инфекционные вирионы УЕЕУ при помощи описанной ранее системы двух хэлперов (Уο1кονа еί а1., 2006), в препараты, содержащие титры, достигающие 10⁹ инф. ед./мл. Клетки ВНК21, инфицированные этими частицами и селектированные в присутствии Риг, могли использоваться для получения клеточных культур, кодирующих структурные белки ΥΕΎ, через 3-5 дней. После получения клеточные линии, содержащие УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, инфицировали ранее полученными

- 12 016490 образцами ΥΡ Ρίν с высокой (10 инф.ед. на клетку) и низкой (0,1 инф. ед. на клетку) величиной ΜΟΙ. В всех случаях дефектные ΥΡν реплицировались продуктивно (см. фиг. 3) и инфицировали все клетки монослоев, производящих высокие титры Ρίν. Таким образом, получение пакующих клеточных линий путем инфекции клеток упакованными репликонами νΕΕν с последующей инфекцией Ρίν производит впечатление простой и эффективной системы, подходящей для широкомасштабного производства Ρίν с делетированной последовательностью С в геноме.

Пример 13. ΥΡ Ρίν, использующие репликоны νΕΕν, содержащие кодон-оптимизированную форму гена ΥΡν С.

Еще одна вероятная проблема, связанная с использованием пакующих систем для поддержки репликации дефектных вирусов, заключается в рекомбинации дефектного вирусного генома и РНК, кодирующей транс-комплементирующий ген (гены). Такая рекомбинация может привести к возникновению инфекционных вирусов. В экспериментах, описанных в настоящем изобретении, тест на образование бляшек ни разу не выявил инфекционных ΥΡν, но было необходимо исключить возможность появления живого вируса в этих клетках.

Кроме того, считается, что эволюция белков, кодируемых многими вирусами, переносимыми членистоногими, была направлена на использование трансляционного аппарата двух весьма различных хозяев. Следовательно, нельзя ожидать использования кодона, оптимального для экспрессии в одном из хозяев. Таким образом, последовательность, кодирующая С в кассетах экспрессии, была модифицирована для двух целей: ί) повысить уровень продукции С и ίί) понизить вероятность гомологичной рекомбинации между геномом ΥΡ Ρίν и последовательностью, кодирующей С, в составе субгеномной РНК репликонов νΕΕ. ΥΡν С синтезировали с использованием частот кодонов, обнаруженных в наиболее эффективно транслирующихся генах млекопитающих (фиг. 4А). Такие молчащие мутации также нарушали последовательность циклизации, необходимую для репликации генома флавивируса, таким образом, снижая вероятность образования способного к репликации ΥΡν в результате рекомбинации между геномом ΥΡ ΡΙν и РНК, кодирующей С, в составе репликона νΕΕν.

Ген Сор! клонировали в конструкции νΕΕτθρ, νΕΕτορ/ΕορΙ/Ραο и νΕΕτορ/ΕορΙ-ρΓΜ-Ε/Ραο, используя ту же стратегию, что при получении νΕΕΓορ/Ε2/Ρ;·ιο и νΕΕτορ/Ε-ρΓΜ-Ε/Ραο, и транскомплементирующие Ρи^-резистентные клеточные линии получали путем трансфекции РНК или инфекции клеток упакованными РНК. Трансфекция этих клеток синтезированной ίη νίίτο геномной РНК Ρίν позволяла получить ΡΙν с эффективностью, сравнимой с таковой у клеток, экспрессирующих репликоны νΕΕν, экспрессирующие неоптимизированный ген С (фиг. 4В). Однако клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный С, оказались удобным реагентом из-за своей склонности к развитию цитопатического эффекта и формированию хорошо заметных бляшек при инфекции ΥΡ ΡΙν и покрывании агарозой, содержащей среду с низкой концентрацией ЕВ8 (фиг. 4С). Таким образом, хотя кодон-оптимизация гена С ΥΡν не приводила к изменениям продукции ΡΙν этими клетками, клетки, экспрессирующие кодоноптимизированный ΥΡν С, представляют собой очень удобную систему для оценки ΥΡ ΡΙν, особенно не экспрессирующих флуоресцентные маркеры. В дополнительных экспериментах наблюдалась очень хорошая корреляция между титрами одних и тех же образцов, определенными с помощью анализа формирования бляшек и с помощью анализа фокусов клеток, положительных на ΟΕΡ.

Бляшки, образованные ΥΡ Ρίν, были меньшего размера, чем бляшки, образованные ΥΡν, показывая, что структурные белки, продуцируемые ίη С18, по всей вероятности, являются более эффективными для построения вирусных частиц. Каким образом достигается способность образовывать бляшки, до сих пор полностью не выяснено. Однако предполагается, что ΥΡν С обладает некоторым уровнем цитотоксичности, поскольку клеточные линии, содержащие репликоны νΕΕν, экспрессирующие кодоноптимизированную версию данного белка, имели более низкие показатели роста, чем аналогичные клетки с репликоном, содержащим природный ген С. Таким образом, репликация генома ΥΡ ΡΙν может приводить к дополнительным изменениям во внутриклеточном пространстве, достаточным для возникновения цитопатического эффекта.

Пример 14. ΡΙν могут быть получены из других флавивирусов.

Чтобы доказать, что Ρίν могут быть легко получены из других флавивирусов, стратегию, описанную выше, применяли к ΑΝν. Для этого был сконструирован геном ΑΝ Ρίν с белком С, состоящим из 35 аминокислотных остатков (фиг. 5А). Для упаковки этого генома ΑΝ Ρίν использовалась пакующая клеточная линия, полученная путем трансфекции клеток ВНК нецитопатическим репликоном νΕΕν, экспрессирующим ΑΝν С/ρτΜ/Ε и Рас |ΒΗΚ(νΕΕτορ/Ε*-Ε*-Ραο)|. Чтобы минимизировать вероятность того, что рекомбинация между геномами ΑΝ ΡΙν, реплицирующимися в этой клеточной линии, и белком С, кодируемым РНК νΕΕτθρ, может привести к возникновению инфекционного ΑΝν, ген, кодирующий С в составе репликона νΕΕν, был модифицирован так, чтобы он содержал кластеры молчащих мутаций в домене циклизации ΑΝν.

Среда, собранная с клеток ВНК (νΕΕΓθρ/Ε*-Ε*-Ρα^, трансфицированных синтетическим геномом ΑΝ ΡΙν, оказалась способна вызывать образование антиген-позитивных фокусов на пакующих клетках (фиг. 5В), что подтверждало продукцию инфекционных ΑΝ Ρίν. Однако после инфекции монослойных клеток Усго теми же образцами обнаруживались только антиген-позитивные клетки (фиг. 5С). Титр ΑΝ

- 13 016490

Ρίν в пакующих клетках достигал 1 х 10⁸ инф. ед./мл, и, как и ожидалось, на этой клеточной линии Ρίν может быть многократно пассирован. Таким образом, при использовании полученной клеточной линии могут быть легко получены стоки ^Ν Ρίν с высоким титром с использованием такой же системы комплементации, как при работе с ΥΡν. Интересно, что в случае подходящей для ^Νν пакующей клеточной линии и ^Ν Ρίν было отмечено, что выход вируса достигал плато через некоторое время после инфекции одновременно с проявлением цитопатического эффекта (не показано), в то время как клетки, кореплицирующие геном ΥΡ Ρίν и репликоны νΕΕν продолжали продуцировать Ρίν в течение многих дней (фиг. 2).

Пример 15. Клетки, инфицированные ΥΡ или ^Ν Ρίν продуцируют 8νΡ.

Чтобы показать, что клетки, инфицированные Ρίν, продуцируют 8νΡ, клетки ВНК-21 трансфицировали синтезированной ίη νίΐτο РНК ΥΡ Ρίν или инфицировали ΥΡ Ρίν, продуцированными клетками, экспрессирующими С. Частицы, полученные из клеток ВНК-21, очищали с помощью ультрацентрифугирования и анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител (МАВ), специфичных к Е (Ώ1-4Θ2) (ОепУгу е! а1., 1982). Как клетки, трансфицированные РНК, так и клетки, инфицированные Ρίν, продуцировали белок Е, осаждающийся из среды (фиг. 6А), что показывает, что он находился в корпускулярной форме. Поскольку эти клетки не проявляют признаков цитопатического эффекта, а образцы очищались путем центрифугирования на низких скоростях перед ультрацентрифугированием, маловероятно, чтобы белок Е, обнаруженный в осадке, представлял из себя клеточный дебрис. Сходным образом, Вестерн-блот-анализ показал, что клетки Vе^ο, инфицированные ^Ν Ρίν, продуцировали (до проявления цитопатического эффекта) внеклеточные формы Е, неотличимые по размеру от продуцированных клетками Vе^ο, инфицированными ^Νν (фиг. 6В).

Для дальнейшей оценки физической природы белка Е, высвобождаемого клетками, инфицированными Ρίν, среда, собранная с клеток, содержащих только реплицирующиеся геномы Ρίν, была проанализирована с помощью метода градиента плотности сахарозы в соответствии с опубликованными данными (8еЬа11еЕ е! а1., 1996). 8νΡ обнаруживались во фракции, содержащей 2% сахарозы (фиг. 6С). В том же самом эксперименте вирионы ΥΡν демонстрировали высокую плотность и обнаруживались во фракции, содержащей 42% сахарозы. Также в культурах, инфицированных ^Νν Ρίν, были обнаружены частицы, содержащие белок Е, мигрирующие на уровне размера ^Νν 8νΡ. Присутствие Е в среде клеток, инфицированных Ρίν, согласуется с продукцией 8νΡ клетками, экспрессирующими только ргМ/Е или ΤΒΕν РНК-вакцины, не содержащими функционального гена С.

Пример 16. Безопасность, мощность и эффективность Ρίν для животных.

Безопасность ^Ν и ΥΡ Ρίν определяли путем интрацеребральной инокуляции пометов 3-4дневных мышей. Эти исследования показали, что мыши, инокулированные ШТ ΥΡν или ^Νν, быстро погибали, и 50%-ная летальная доза этих вирусов (ΕΏ₅₀) для этих животных составила приблизительно 1 ΡΡυ (табл. 1). Однако инокуляция мышат-сосунков ^Ν и ΥΡ Ρίν в дозировке 2х10⁶ инф. ед. не приводила к смерти ни одного животного (табл. 1). Далее безопасность была подтверждена путем внутрибрюшинной инокуляции взрослым мышам вирусов дикого типа (\\1) и ^Ν Ρίν. Данные исследования показали, что ^Ν Ρίν оказались абсолютно безопасными для взрослых мышей (табл. 2). Кроме того, \\1 ШШТ привел к гибели значительной части взрослых мышей, его ΕΏ50 составила менее 1 ΡΡυ, в то время как дозы до 3х10⁶ инф. ед. Ш^ Ρίν не вызывали гибели животных (табл. 2). Наиболее же интересным был тот факт, что Ш^ Ρίν оказались чрезвычайно мощными иммуногенами (титры нейтрализующих антител обнаруживались при инокуляции всего лишь 30000 инф. ед.), и 100% животных, вакцинированных 3х10⁴, 3х10⁵ или 3х10⁶ инф. ед. при контрольном заражении 100 ΕΏ50 штамма ΝΥ99 ^Ί№Νν, оказались защищенными от вируса (табл. 2).

Таблица 1

Безопасность Ρίν для мышат-сосунков

Инокулят*	Доза (инф. ед)ь	% выживаемости0	Среднее время выживанияа
ΚΝ Ρίν	2000000	100 (9/9)	ΝΑθ
ШУ ТХ02	0,2	56 (5/9)	8,5 (+/-2,9)
«ΝΫ ТХ02	2	0 (0/9)	5,4 (+/-0,5)
ИНУ ΤΧ02	20	0 (0/8)	6 (+/-0)
ΠΝν ΤΧ02	200	0 (0/10)	4,9 ( + /-0,3)
ΥΕ Ρίν	2000000	100(10/10)	ΝΑθ
ΥΕν 17ϋ	0,2	89 (8/9)	8 (+/-0)
ΥΕν 17ϋ	2	56 (5/9)	7 (+/-0)
ΥΕν 17ϋ	20	11 (1/9)	6,9 (+/-2,4)
ΥΕν 17ϋ	200	0 (0/12)	6 (+/-0)

а - инокулируемый препарат, разведенный в культуральной среде, содержащей 10% ΡΒ8,

- 14 016490

Ь - введенный внутрибрюшинно в объеме 20 мл/животное, с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых), ά - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение), е - неприменимо.

Таблица 2 Безопасность, мощность и эффективность Ρίν для взрослых мышей

Инокулят3	Доза (инф ед)ь	% выживаемости0	Среднее время выживания0	Титр нейтрализующих антител6	% защитыг
Нет (разбавитель)	0	100 (8/8)	ΝΑ8	<1/40ь	14(1/7)
ΨΝΡΐν	30000	100(10/10)	ΝΑ8	1:40	100 (8/8)
νΝΡΐν	300000	100(10/10)	ΝΑ8	1:160	100 (8/8)
νΝΡΐν	3000000	100(10/10)	ΝΑ8	1:160	100 (8/8)
νΝν ТХ02	1	40 (4/10)	8,5 (+/-1,4)

νΝν ΤΧ02	10	30 (3/10)	8 (+/-1,2)
νΝν ΤΧ02	100	10(1/10)	7,8 (+/-1,4)

а - инокулируемый препарат, разведенный в культуральной среде, содержащей 10% БВ8,

Ь - введенный внутрибрюшинно в объеме 100 мл/животное, с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых), ά - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение), е - титр нейтрализующих антител в объединенной сыворотке крови 2 животных через 21 дней после инокуляции (приведенный титр - наибольшее разведение, дающее 80%-ное уменьшение образования фокусов νΝν), £ - защита от контрольного заражения 100ΤΌ₅₀ штамма ΝΥ99 νΝν, проиллюстрированная количеством выживших животных через 14 дней после контрольного заражения; единственное выжившее животное из группы, инокулированной разбавителем, проявляло признаки заболевания (сгорбленная спина, взъерошенная шерсть, общее недомогание) в дни 8-14. Ни одно из животных, инокулированных Ρίν, не проявляло признаков заболевания в течение 14-дневного наблюдаемого периода после контрольного заражения, д- неприменимо, й - титры нейтрализующих антител в сыворотке крови неиммунизированных мышей при параллельном анализе с сывороткой крови мышей, инокулированных Ρίν.

Пример 17. Дальнейшие модификации с целью повышения выхода и безопасности ΡίV/Кер1^VАX.

В настоящем изобретении продемонстрировано, что многократное пассирование КерБ¥АХ не приводило к рекомбинации, но отбирались варианты, характеризующиеся более быстрым ростом: νΝν Кер11¥АХ многократно пассировали на клеточной линии, кодирующей белок С νΝν. Этот белок С был получен путем слияния копии гена С νΝν с геном Рас, регулируемым субгеномным промотором нецитопатического νΕΕι-ер (йеи'акота е! а1., 2005). В получившейся конструкции (VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*) ген убиквитина (ИЬ1) был вставлен перед геном С, а за геном С следовал стоп-кодон. В таком контексте слитый белок Ρас-υЬ^ будет продуцироваться вместе со зрелым белком С (не содержащим гидрофобного якоря, см. фиг. 9). Ген С в этом νΐ-Ттер (обозначенный С*) далее модифицировали путем вставки 36 мутаций, удаляющий сигнал последовательности циклизации, таким образом, этот регион, содержащий 11 нуклеотидов, превращался из ОИСААИАИОСи (8Ερ ίΌ ΝΟ: 2) в Ои^ААсАИОиИ 4ΕΟ ίΌ ΝΟ: 3), сохраняя при этом кодирующие способности С. Такое большое число мутаций резко снижает вероятность гомологичной рекомбинации и, кроме того, если рекомбинация между геномами все же имеет место, продукции генома, активного по репликации, не происходит из-за несовпадения кодирующих последовательностей РНК, что делает репликацию невозможной (фиг. 9).

Чтобы исследовать маловероятную возможность продуктивной репликации, из клеток линии ВНК21, экспрессирующих VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С* {ВНК(VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*)}, была получена линия клеток клонального происхождения, и эту линию клеток использовали для десятикратного пассирования νΝ Кер11¥АХ (в каждом случае при уровне инфекции ΜΟί=0,01), и полученные Кер^АХ были детально охарактеризованы. Чтобы определить, содержала ли популяция пассажа 10 (р10) живые вирусы, монослойные клетки Ус'го инфицировали νΝ Кер^АХ 10 пассажа при множественности инфекции, равной 0,1, 1 и 10, и тщательно отмывали от внеклеточных Кер1^АХ. Эти монослойные культуры промывали еще раз спустя 24 ч и собирали среду спустя 2 дня. При переносе культуральной жидкости от этих культур на свежие культуры клеток Ус'го не обнаруживалось иммунопозитивных клеток при окраске высокочувствительными поликлональными антителами к νΝν, что показывало, что продуктивная рекомбинация Кер^АХ с белком С, кодируемым пакующей клеточной линией, не имела место.

- 15 016490

Интересно, что при сравнении р10 νΝ КерйУАХ с р0 КерйУАХ на клеточной линии ВНК(УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*), р10 КерйУАХ вызывали образование полиморфных фокусов инфекции, многие из которых были значительно больше фокусов, продуцируемых р0 КерйУАХ (фиг. 10). Кроме того, р 10 КерйУАХ реплицируются в 10 раз больше чем р0 КерйУАХ в ранние моменты времени, и их конечный титр оказывается в два раза большим.

Анализ продуктов РСК, полученных из кДНК, продуцированной клетками Уего, инфицированными этими р10 КерйУАХ, показал, что среди них не присутствовало ни одного продукта, содержащего полноразмерную область, кодирующую С. Однако анализ последовательности соединения С-ргМ в продукте, содержащем эту область, показал возникновение двух мутаций в процессе пассирования. Как и ожидалось, исходя из гетерогенной природы фокусов, продуцируемых р10 КерйУАХ на пакующих клетках (фиг. 10), обе мутации присутствовали в виде смеси с исходной последовательностью КерйУАХ. Одна из мутаций, обнаруженная в половине популяции нуклеиновых кислот в этих реакциях секвенирования (секвенированных в обоих направлениях), представляла собой мутацию АСС>иСС (8>С) в положении Р4 перед сайтом расщепления сигнальной пептидазой (8 (с)УСА | УТБ8 (8ЕО ΙΌ N0: 4) в геноме КерйУАХ. Вторая мутация, присутствовавшая только в 30% амплифицированных последовательностей (опять в реакциях, завершенных в обоих направлениях), представляла собой ААС>АиС (К>М) в положении РЗ позади сайта расщепления Ν82Ε/Ν83 (ОККК | СОК (т)Т) (8Е0 ΙΌ N0: 5). Несмотря на то, что эти мутации находятся в положении делетированной 8Ь5, они не меняют предсказанных структур РНК. Быстрый отбор лучше растущих КерйУАХ (всего 10 циклов роста) вызывает исключительный интерес, поскольку указывает, что отбор вариантов, растущих лучше, является мощным методом усовершенствования КерйУАХ. Положения мутаций не являются неожиданными, поскольку известно, что изменение эффективности расщепления №2ВШ83 по отношению к расщеплению сигнальной пептидазой может повлиять на уровень выхода и инфекционность флавивирусных частиц (Кее1арапд е! а1., 2004; Бее е! а1., 2000; БоЬщв апк Бее, 2004; Уатвйсйкоу е! а1., 1997). Продолжаются исследования по отбору еще лучше растущих вариантов, и планируется вставка этих двух мутаций в конструкции КерйУАХ второго поколения, чтобы подтвердить их способность положительно действовать вместе (или по отдельности) на выход КерйУАХ и продукцию антигена. Тем не менее, данные, представленные в настоящей заявке, показывают, что при данных условиях пассирования: 1) рекомбинации не происходит; 2) может применяться положительный отбор для получения улучшенных КерйУАХ.

Слепой пассаж 1Е КерйУАХ также привел к получению лучше растущих вариантов с мутациями в тех же областях генома. Возможность слепого пассажа КерйУАХ для получения лучше растущих вариантов является ключевой особенностью настоящего изобретения и явным преимуществом по сравнению с традиционным методом БАУ, где получение лучше растущих вариантов всегда сопряжено с проблемой того, что эти лучше растущие варианты могут потерять свою аттенуацию по отношению к человеку.

Кроме того, мутированная, улучшенная кассета экспрессии С (УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*), для которой была показана стабильность и отсутствие рекомбинации при использовании в клеточных линиях ВНК (не одобренных для получения человеческих вакцин), оказалась также стабильной и подходящей для размножения РЙУ при введении в клетки Уего (клеточная линия, одобренная для производства человеческих вакцин). В частности, РНК, соответствующую репликону УЕЕ, вводили в клетки Уего из сертифицированной затравочной культуры с использованием тех же методов, что и для клеток ВНК. После введения РНК в клетки Уего эти клетки велись в бессывороточной среде (важный момент для производства вакцины), содержащей пуромицин, и было показано, что такие клетки подходят для размножения РБУ Было показано, что в таких условиях размножения клетки продуцируют титры РЙУ немного ниже, чем клетки ВНК, полученные сходным образом, но клетки УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*-Уего лучше выдерживают такие условия культивирования, что позволяет собирать материал многократно. На фиг. 11 проиллюстрирована возможность производства РЙУ этими клетками при многократном сборе материала в условиях бессывороточного культивирования.

В целом, размножение РкУ в клеточных линиях, экспрессирующих С (особенно кассеты экспрессии С, содержащие сигнальную последовательность ргМ или эту область плюс части генов ргМ и Е), теоретически может рекомбинировать с геномом РЙУ с получением живого вируса, способного вызывать заболевание, повышая риск способа получения вакцины. Для решения этой проблемы, в настоящем изобретении продемонстрировано, что клеточные линии, предназначенные для продуцирования VN РЙУ, могут быть получены с использованием белка С, который заканчивается точно на месте расщепления №2ВШ83, таким образом минимизируя вероятность рекомбинации в этой области генома РЙУ и давая преимущество перед другими методами размножения, в которых клеточные линии кодируют РНК, кодирующие часть якоря С (также известную как сигнальный пептид ргМ), которые также содержатся в РЙУ.

Чтобы далее повысить безопасность кассеты экспрессии С, в настоящем изобретении продемонстрировано, что в часть кассеты, используемой для получения кодируемого УЕЕгер С, который комплементирует с геномом РЙУ (т.е. первые 30 кодонов, кодирующие аминокислотную последовательность, необходимую для производства реплицирующегося генома РЙУ из-за элементов РНК, необходимых для репликации вируса), могут быть внесены специфические мутации для получения кассеты, отличающейся

- 16 016490 от генома Ρίν по 36 нуклеотидным позициям (введение которых не меняет белковый продукт), таким образом, вероятность рекомбинации получившегося гена С с геномом Ρίν резко снижается. (фиг. 9). Далее в этот мутантный ген были внесены три мутации в сигнале циклизации (С8), который должен быть комплементарен С8 в 3'υΤΚ генома Ρίν для успешной вирусной репликации, обеспечивая еще одну меликон УЕЕ вслед за селективным маркерным геном (рас) с использованием гена убиквитина к интактному продукту С полученного полипротеина (альтернативные последовательности саморасщепления, такие как автопротеиназа 2А или ЕМЭУ или другие родственные последовательности могут быть легко заменены на убиквитин). Создание такой кассеты, кодирующей единый полипротеин, дает преимущество за счет получения генетически более стабильного репликона УЕЕ, уменьшения вероятности рекомбинации в размножающих клеточных линиях, элиминации кассеты экспрессии С и уменьшения выхода Ρίν. Получившаяся конструкция (УΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*, фиг. 9) была введена в клетки ВНК, и эти клетки использовали для получения клеточной линии клональной природы, экспрессирующей репликон УЕЕ, путем стандартных методик (ТаухиПп е1 а1., У1го1оду, 2006).

Была проанализирована одна клональная линия через 18 пассажей после клонирования из одной клетки, и анализ не выявил признаков какой-либо генетической делеции кассет С (методом ΚΤ-ΡΟΚ.), а также не было обнаружено никаких мутаций в кассете экспрессии С. Наиболее важно, что эта клеточная линия продемонстрировала сходные способности к размножению ^Νν Ρίν на уровне пассажа 41. И наконец, после 10 пассажей Ρίν на этой клеточной линии не было выявлено признаков рекомбинации, ведущей к появлению ΡΙν, способных к продуктивной репликации в клетках, не экспрессирующих кассету С (таких как клетки \УТ Уего), и не было выявлено признаков введений последовательностей, кодирующих С, в геном Ρίν с помощью ΚΤ-Ρί,’Κ.

Кроме того, чтобы решить проблему возможной рекомбинации ΡΙν с флавивирусами вакцин в момент вакцинации, ведущей к появлению новых вирулентных флавивирусов, в настоящем изобретении продемонстрировано, что возможно синтезировать геномы ^Νν, содержащие неприродные сигналы циклизации (С8), присутствующие во всех известных флавивирусах в естественной циркуляции, и эти геномы будут реплицироваться на высоком уровне. В нескольких лабораториях было показано, что две С8, обнаруженные на 5'- и З'-концах геномов всех флавивирусов, должны быть комплементарны на 100% для обеспечения продуктивной репликации вируса (Кйготусй е1 а1., 1. У1го1., 2001; Ьо е1 а1., 1. Упо1., 2003; АЬагех е1 а1., У1го1., 2003). Эти исследования также показали, что неприродные С8 могут продуцировать реплицирующиеся геномы, если эти С8 комплементарны на 100%. Однако исследователи указали, что у всех геномов с неприродными последовательностями С8 имелись дефекты репликации. Путем систематического анализа С8 в геномах ^Νν, в особенности анализа способности к обеспечению репликации на высоком уровне тщательно отобранных замен одного основания, были идентифицированы замены одного основания и последующие замены двух оснований, дающие геному возможность реплицироваться на высоком уровне (фиг. 12А). На фиг. 12В показано, что возможен высокий уровень репликации генома ^Νν с заменой двух оснований, и что геномы, в которые намеренно ввели несовпадающие последовательности С8 (такие как \УТ и мутант по двум основаниям), не являются репликационно активными. Таким образом, эта мутация и другие, подобные ей, могут быть использованы для получения Ρίν с повышенным уровнем безопасности, поскольку любой рекомбинантный вирус, полученный в результате одноточечной генетической рекомбинации между вакциной на основе ΡΙν с модифицированной С8 и вирусом, циркулирующим в областях, где население проходит вакцинацию, не будет репликационно активным и, следовательно, не сможет вызвать заболевания.

Пример 18. Клетки ВНК, экспрессирующие ген С ^Νν, сохраняют свой фенотип в течение многих пассажей.

Исследования клональной клеточной линии, экспрессирующей ^Νν С, полученной из клеток ВНК, трансфицированных УΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*, продемонстрировали ее продолжительную стабильность, а также удобство для получения Кер11УАХ по нескольким причинам. Во-первых, эти клетки подходят для многократного пассирования КерИУАХ. Во-вторых, параллельный анализ образования фокусов на клетках двух разных уровней пассажей (пассажи 8 и 24 после клонирования из одной клетки) не показал заметных различий в титрах ЯерИУАХ \¥Ν и размерах фокусов. И, наконец, при прямом анализе последовательности кассеты, кодирующей С, в этих клетках на уровне 24 пассажа не обнаружилось никаких отличий от исходной последовательности УЕЕгер. В сумме эти данные указывают на то, что клетки, содержащие УЕЕгер, экспрессирующие С, являются достаточно стабильными для использования в общепринятом формате маточной серии клеток для производства человеческих вакцин. Кроме того, поскольку УЕЕгер уже использовали в испытаниях на людях, применение технологии УЕЕгер-клеток к клеткам Уего не должно встретить неожиданных препятствий при получении разрешения контролирующего органа.

Пример 19. Направление ^Νν УТЬ в лимфоидную ткань.

Как указано выше, ^Νν УБ-Ρ сходны с КерйУАХ за исключением того, что вместо белка флавивируса ргМ/Е, они могут кодировать репортерный ген, или могут просто содержать флавивирусный репликон без репортера. УБ-Ρ легко продуцируются в пакующих клетках, экспрессирующих все три структур

- 17 016490 ных белка ΥΝν, описано получение высоких титров УД-Ρ (Εανζιιΐίη е! а1., 2006). При инокуляции 10⁷ единиц ΥΈΡ в мышей, через 24 ч после инокуляции в сыворотке крови животных содержалось 1000-1500 ед./мл интерферона ί типа (ίΕΝ). Как внутрибрюшинная, так и подкожная инъекция в подушечку лап вызывала ίΕΝ-ответ. Кроме того, подколенные лимфатические узлы, вскрытые через 24 ч после прививки в подушечку лап ΥΈΡ, экспрессирующими β-галактозидазу, содержали большое количество клеток, положительных по β-галактозидазе, что показывает, что ΥΈΡ, входящие в клетку таким же образом, как и КерДУАХ, направляются в важнейшие лимфатические органы. Этот результат хорошо согласуется со высоким уровнем ΙΕΝ, вызванным инфекцией ΥΈΡ, и предполагает, что подобное направление обеспечивает высокий потенциал и эффективность КерДУАХ.

Список процитированных источников.

АЬег1е, 1.Н. е! а1., 1999, I. 1ттипо1. 163, 6756-61.

АЬег1е, 1.Н. е! а1., 2005, I. УДо1. 79, 15107-13.

ВгейепЬеек, Ρ4. е! а1., 2003, I. Сеп. У1го1. 84, 1261-8.

СДатЬегк, ТД. е! а1., 1999, I. УДо1. 73, 3095-101.

С1уае апа Натк, 2006, I. УДо1. 80:2170-2182.

Со1отЬаде, С. е! а1., 1998, У1го1оду 250, 151-63.

ОатЬ, В.8.е! а1., 2001, 1оигиа1 о£ У1го1оду 75, 4040-4047.

Εауζи1^п е! а1., 2006, У1го1оду 351:196-209.

Е11ота!ог1 е! а1., 2006, Сепек Ьет. 20:2238-2249.

Еопкеса, В.А., е! а1.,1994, Уасс1пе 12, 279-85.

СепДу, М.К. е! а1., 1982, АтДТгор Меа. Нуд. 31, 548-55. Сегак1топ, С., апа Ьо^гу, К., 2005, 8ои!Д Меа I. 98, 653-6.

Наак, I., е! а1., 1996, Сигг Вю1, 6, 315-24.

На11, К.А., е! а1., 2003, 1’гос ЫаД Асаа 8ш И8А 100, 10460-10464.

Ниапд, С-Υ., е! а1., 2003, I. УДо1. 77, 11436-47.

Капека, Τ.Ν., е! а1., 2000, Уасс1пе 19, 483-491.

Кее1арапд е! а1., 2004, I. УДо1. 78: 2367-2381.

КосДе1, Т. е! а1., 1997, Уасс1пе, 15, 547-52.

КосДе1, ТД. е! а1., 2000, Уасс1пе, 18, 3166-3173.

КоДет, К.М., е! а1., 2004, 1’гос. ЫаЙ. Асаа. 8сЬ И8А 101, 1951-6.

КоЫкЫ, Ε., апа ЕиЩ, А., 2002, Уасс1пе 20, 1058-67.

КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2001, 1оитпа1 о£ У1го1оду 75, 2204-2212.

КошкЫ, Ε. е! а1., 1992а, У1го1оду 190, 454-8.

КошкЫ, Ε. е! а1., 1992Ь, У1го1оду 188, 714-20.

КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2000а, Уасс1пе. Ьт. 18, 1133-1139.

КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2000Ь, У1го1оду 268, 49-55.

Ьее е! а1., 2000, I. У1го1., 74:24-32.

Ьешт, ТА. е! а1., 1990, I. У1го1. 64, 3001-11.

Ь1Г)ек!гот, Ρ. е! а1., 1991, I, У1го1. 65, 4107-13.

ЬоЫдк апа Ьее, 2004, I. УДо1. 78: 178-186.

ЬЫаепЬасД е! а1., 2001, Е1ау1ушаае: !Де уиикек апа !Де1г терДсаДоп КЫре е! а1., (Дак. 4'¹' Εа. Е1е1ак У1го1оду, Уо1. 1, Ырршсой ^ДДатк апа ^Дкшк, ΡЫ1аае1ρЫа., рр. 991-1041 (2уо1к)).

Ьоте^, 1.С. е! а1., 2002, I. УДо1. 76, 5480-91.

Макоп, Ρ.Υ. е! а1., 1991, УДЫоду 180, 294-305.

Мшке, ЬМ. е! а1., 2004, АтсД У1го1 8ирр1, 221-30.

МЫшт ν.Ρ. е! а1., 2001, УДик КекеагсД 81, 113-123.

Мопа!Д, ТТ., 1991, Ат. I. Тгор. Меа. Нуд. 45, 1-43.

Мопа!Д, ТТ. е! а1., 2002, Уассше 20, 1004-18.

Ρеΐ^акоνа, О. е! а1., 2005, I. У1го1. 79, 7597-608. ΡЫ11ρоик. КД. е! а1., 1996, АгсД. УДо1. 141, 743-9. Ριμ^, 8., е! а1., 1992, У1го1оду, 187, 290-7.

Ρ^!^ν е! а1., 2002, Ριτκ. Nа!^опа1 Асааету о£ 8с1епсек И8А 99, 3036-3041.

ΡидасДеν, К.У. е! а1., 2004, I. УДо1. 78, 1032-8.

ΡидасДеν, К.У. е! а1., 1995, У1го1оду, 212, 587-94.

Р1ао, М. е! а1., 2004, I. 1Ыес!. О1к. 190, 2104-8.

Кокк1, 8.Ь. е! а1., 2005, УДо1оду, 331, 457-70.

8сДаДсД е! а1., 1996, УДо1оду, 70:4549-4557.

8сДта1^оДи, С. е! а1., 1997, I. У1го1. 71, 9563-9.

8сДо11е, Ε. е! а1., 2004, I. У1го1. 78, 11605-14.

УоДом-т Ε. е! а1., 2006, УДо1оду, 344, 315-27.

Х1ао, 8.Υ. е! а1., 2001, Ειικι^ίι^ ШесДоик ОЬеакек Ы1 Аид 7, 714-721.

- 18 016490

УаткксЫкоу, ν.Κ, аиб Сотращ, К.А., 1994, 1. Мго1. 68, 5765-71.

УаткНсЫкот е1 а1., 1997, 1. Мго1, 71:4364-4371.

2икег, 2003, Хискчс Ас1б Кек 31: 3406-3415.

Все патенты или публикации, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, эти патенты и публикации являются включенными в настоящее изобретение путем ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация включена путем ссылки.

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства И^Мпбае, содержащий делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания ргМ/М, или их комбинацию, где указанный дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Е^Мпбае.
2. 2. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.1, где указанный вирус представляет собой ЕПуМгик, НерасМгик или РекЦИгик или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты ргМ-Е других вирусов с кассетой ргМ-Е псевдоинфекционного вируса.
3. 3. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный ЕПуМгик является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
4. 4. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Иа'утпбае по п.3, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного ЕПуМгик, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
5. 5. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный НерасМгик является вирусом гепатита С.
6. 6. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный РекНуйик является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
7. 7. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.1, где указанный делетированный ген заменен на ген, кодирующий маркерный белок или антиген.
8. 8. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ΠηνίνίιΜι^ по п.7, где маркерный белок является зеленым флуоресцентным белком.
9. 9. Популяция клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Е1аν^ν^^^бае, эффективно поддерживающая размножение дефектного по репликации вируса по п.1 в подходящих условиях, где ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства ЕЩМпбае в составе репликона, заменен на кодоноптимизированную версию гена, кодирующую белок (белки) указанного вируса, так что эта замена снижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Па\'П'1пбае и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Е1аν^ν^^^бае.
10. 10. Популяция клеток по п.9, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
11. 11. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства ЕЩщшбае.
12. 12. Популяция клеток по п.10, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной рекомбинации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
13. 13. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода δνΡ, содержащих ргМ/Е, ίη νί\Ό или их комбинацию.
14. 14. Популяция клеток по п.10, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства ЕЩщшбае, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных ίη ν 11го РНК

    - 19 016490 репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы ΙΙ, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
15. 15. Популяция клеток по п.10, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
16. 16. Популяция клеток по п.15, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей ^ЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс.
17. 17. Способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Вклмпбае, включающий инфицирование популяции клеток по п.9 дефектным по репликации псевдоинфекционным вирусом семейства В1а\'Етпбае. который содержит делецию в капсидном гене таким образом, что эта делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания ргМ/М, или их комбинацию, получая таким образом дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Вкллтбае.
18. 18. Способ по п.17, где указанный вирус представляет собой В^Мтик, НерасМтик или РекШиик или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты ргМ-Е других вирусов с кассетой ргМ-Е псевдоинфекционного вируса.
19. 19. Способ по п.18, где указанный ВЩМтик является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
20. 20. Способ по п.19, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного ВЩМтик, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
21. 21. Способ по п.18, где указанный НерасМтик является вирусом гепатита С.
22. 22. Способ по п.18, где указанный РейМтик является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
23. 23. Способ по п.17, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса, получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
24. 24. Способ по п.23, где ген, кодирующий мутантный белок (белки) вируса семейства ВЩМпбае в составе репликона, заменен на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок (белки) указанного вируса, так что эта замена понижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства В^Мпбае и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства В^Мпбае.
25. 25. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства ВЩМпбае.
26. 26. Способ по п.24, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
27. 27. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода 8УР, содержащих ргМ/Е, ίη νί\Ό или их комбинацию.
28. 28. Способ по п.23, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства В^Мпбае, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных ίη νίΙΐΌ РНК репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы ΙΙ, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
29. 29. Способ по п.23, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
30. 30. Способ по п.29, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей ^ЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс.
31. 31. Фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ВЩМпбае, полученный способом по п.17.
32. 32. Способ защиты индивидуума от инфекций, возникающих в результате контакта с В^Мпбае, включающий введение в организм индивидуума иммунологогически эффективного количества фармацевтической композиции по п.31, которая индуцирует у индивидуума иммунный ответ против Вк-ινίνιπбае, защищая таким образом индивидуума от инфекций.
33. 33. Способ по п.32, где указанное введение производится внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально.
34. 34. Способ по п.32, где индивидуумом является человек или животное.