JP2009528032A - 偽感染性フラビウイルスおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は分子生物学、ウイルス学および免疫学の分野に関する。一般に、本発明は、フラビウイルス科に属する複製能欠損型(replication-deficient)ウイルスの構築、およびこの科に属するウイルスによって引き起こされる疾患の予防におけるワクチンとしてのそれらの利用を開示する。より詳細には、本発明は、複製能欠損型フラビウイルスもしくは偽感染性(peudoinfectious)フラビウイルス(PIV、別名RepliVAX)、およびフラビウイルス関連性疾患に対する予防ワクチンとしてのそれの利用を開示する。
フラビウイルス科のフラビウイルス属は、様々なヒトおよび動物の病原体を含み、免疫試験における異なる反応性に基づいて、4つの異なる抗原複合体に分類される。一般に、フラビウイルスは、増幅する宿主である鳥類もしくは哺乳類、またはベクターである蚊もしくはマダニの間で伝播する。
本発明の1つの態様において、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスが提供される。そのようなフラビウイルス科複製能欠損型偽感染性ウイルスは以下を含む:欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド(C)タンパク質をコードするヌクレオチド配列における欠失を含み、フラビウイルス科のウイルスの、Cタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞においてのみ複製する、複製能欠損型偽感染性ウイルス。
安全および有効なワクチンは、フラビウイルスが原因の一握りの疾患のために作られるだけだった。YF、JE、およびTBEVに対するワクチンを製造するのに用いられてきた、古典的な不活化ウイルスワクチン(INV)および弱毒化生ワクチン(LAV)の方法は、他のフラビウイルスが原因の疾患、特にデング熱および西ナイル脳炎(WNE)を予防するためのライセンス製品をまだ得ていない。既存のLAV(残余菌力または毒力復帰変異)およびINV産物(抗原負荷および外来抗原による反応源性)に関する安全に対する懸念が残っている。さらに、通常、INVは複数のワクチン接種を必要とする。さらに、両タイプのワクチンは、弱毒化生ワクチンの増殖中の毒力復帰変異を回避する必要性、および不活化ウイルスワクチン産物に対する強い免疫応答を引き起こすために必要な材料の量に起因する、INV産物の産生に用いられる毒性ウイルス増殖用の高度封じ込め施設の必要性を含む、製造の問題を免れない。フラビウイルスワクチンの新型については有望な候補があるが、それらの開発への道は、これらの問題を克服する必要があると考えられる。
細胞培養
BHK-21細胞はPaul Olivoから提供された(ワシントン大学, St. Louis, Mo)。それらを、10%ウシ胎仔血清(FBS)およびビタミンを添加したアルファ最小必須培地(αMEM)において37℃で維持した。ヒトのワクチン製造に用いるため最初に調製されたWHO-認定Vero細胞は、NIHのSteve Whitehead博士から提供された。Vero細胞を6% FBS含有MEMで維持した。
プラスミド構築
標準的な組換えDNA技術をすべてのプラスミド構築に用いた。用いたプラスミドの概略図を図7A〜7Fに示す。地図および配列を図8A〜8Fに示す。YFV 17D株ゲノムの感染性cDNAを含む低コピー数親プラスミドpACNR/FLYF-17Dxは他で述べられており(Bredenbeek ら、2003)、Charles M. Rice博士(ロックフェラー大学, New York, N.Y.)より提供された。pYFPIVは、YFカプシド遺伝子のアミノ酸26〜93をコードする断片がpEGFP-N1(Clontech)由来のコドン最適化GFP遺伝子により置換されている、欠損のあるYFVゲノム(YF PIV)を有した。WN PIVゲノム(pWNPIV)は、Cのコドン30をCのコドン101へ融合することにより、Texas 2002感染性cDNA(Rossi ら、2005)から得た(図5A参照)。プラスミドpVEErep/Cl/Pac、pVEErep/C2/Pac、およびpVEErep/C-prM-E/Pac(図2A)は、二重サブゲノムVEEVレプリコンをコードし、そこでは、最初のサブゲノムのプロモーターが、YFVゲノムのnt 119〜481、119〜541、および119〜2452にそれぞれ相当する配列が後に続くVEEV26S RNAの5'UTRを含むRNAの転写を誘導した。2番目のサブゲノムプロモーターは、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ(Pac)遺伝子の発現を誘導し、その遺伝子産物は細胞をピューロマイシン(Pur)が原因の翻訳阻止に抵抗するようにしていた。Pac遺伝子と融合したWNV{シンドビスウイルスレプリコン(pVEErep/C*-E*-Pacと命名)(Scholle ら、2004)に由来}のC-prM-Eカセットを発現する非細胞変性VEEVレプリコンは、VEE非細胞変性レプリコン(Petrakova ら、2005)から作製した;E-コード配列は、NS1の最初の9つのコドンおよびNS2Bの最後の25のコドンから成るリンカーを介したPac遺伝子と融合し、続いてNS3の2つのコドンは直接FMDV2Aと融合した(図5A参照)。YFV 17Dカプシドをコードするコドン最適化配列および最初のprMの20アミノ酸を、別の文献に記載されたコドン頻度データを利用して設計した(Haas ら、1996)。この遺伝子を、オーバーラップする合成オリゴヌクレオチドからPCRによって合成した。増幅された断片を、発現カセットVEErep/C2opt/Pacおよび VEErep/Copt-prM-E/Pac中にクローニングする前に配列決定した。後者のレプリコンは、基本的にpVEErep/C2/PacおよびpVEErep/C-prM-E/Pacと同じデザインを有したが、図4Aに示したコドン最適化配列を含んだ。
RNA転写
プラスミドをCsCl勾配において遠心分離によって精製した。転写反応前に、プラスミドをXhoI(pYFPIV用)またはMhuI(VEEレプリコンおよびVEEヘルパーをコードするプラスミド用)またはSwaI(pWNPIV用)によって直鎖状にした。RNAをキャップアナログの存在下でSP6またはT7RNAポリメラーゼにより合成した。転写物の収量および完全性を非変性条件下でゲル電気泳動によって分析した。転写反応物のアリコートを、さらなる精製をせずにエレクトロポレーションに用いた。
RNAトランスフェクションおよびPIV複製分析
BHK-21細胞のエレクトロポレーションを、以前に記載された条件(Liljestrom ら、1991)下で行った。パッケージング細胞培養を確立するため、VEEVレプリコンのエレクトロポレーションの24時間後に10 g/mlの濃度となるようにPurを培地に添加した。インビトロ合成されたYF PIVゲノムのトランスフェクションを、レプリコン含有細胞が効率的な増殖を再開する、5日後に行った。図面に示された時点で、Purを含む同じ培地で培地交換することによってサンプルを回収した。多くの試験において、PIV-分泌細胞をコンフルエントに達した後分割した。
YF PIVの力価の測定
放出されたYF PIVの力価を測定するため、BHK-21細胞を6-ウェルコースター皿中に、5 x 105 細胞/ウェルの濃度で播いた。4時間後、細胞を、異なる希釈度のパッケージングされたレプリコンに感染させ、5% CO2インキュベーターにおいて37℃で1時間インキュベートした後、それらを10%FBSを添加した2 ml MEMで覆った。感染細胞数を、倒立UV顕微鏡下でGFP-陽性細胞を数えることによって測定した。播いた量から感染細胞の割合を、顕微鏡視野の規定の領域における蛍光産生細胞の計数により求めた。5つの異なる領域に対する計数を平均し、各希釈系列に対応する力価について再計算した。後者の実験では、細胞をプラーク発生のためにアガロース下で5日間インキュベートし、その後2.5%のホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したことを除いて、力価は、以前に記載された条件(Lemm ら、1990)を用いて、VEErep/Copt-prM-E/Pacレプリコンを保持する単層のBHK-21細胞のプラークアッセイにより測定した。
YF PIVの継代
パッケージング細胞株を、インビトロ合成されたVEEVレプリコンRNAのトランスフェクション、または10 inf.u/細胞の感染の多重度(MOI)でVEEV構造タンパク質へパッケージングされた同じレプリコンを細胞に感染させることによって樹立した。Pur選択後、それらを異なるMOIでYF PIVに感染させた。培地を交換することによって、サンプルを図面に指摘された時点で回収した。
YF SVP産生の分析
BHK-21細胞を100-mm皿あたり2 x 106の濃度で播いた。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を10 inf.u/細胞のMOIでYF PIVに感染させ、その後、10%FBSを添加したMEM 10 ml中で24時間インキュベートした。その後、培地を無血清培地VP-SF(Invitrogen) 10mlに交換し、SVP放出を分析するため24時間ごとに交換した。回収されたVP-SFサンプルを低速遠心分離(5,000 r.p.m, 10分, 4℃)によって精製し、その後、39,000 r.p.m, 4℃で6時間SW-41ローターにおいて、PBSにおいて調製された、10%ショ糖 2mlを介する超遠心分離により濃縮した。ペレット材料を、b-メルカプトエタノールを欠く(D1-4G2 MABへの結合維持のため)、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のローディングバッファー中に溶解し、さらにウエスタンブロッティングにより分析した。タンパク質のトランスファー後、ニトロセルロース膜をD1-4G2 MAB、およびSanta Cruz Biotechologyから購入したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)-結合ロバ抗マウス二次抗体により処理した。HRPを、製造元(Santa Cruz Biotechnology)の推奨に従って、ウエスタンブロッティングルミノール試薬を用いて検出した。陽性対照サンプルを得るため、YFV (2x108 PFU)を、SVPに関して上述したように、10%ショ糖クッションを介して超遠心分離に供した。
WN PIVの分析
WN PIVの力価を、ウイルスの系列希釈をVero細胞単層に感染させ、それから24時間後に固定し、既に記載されたように(Rossi ら、2005)、WNVに特異的なポリクローナル過免疫マウス腹水で免疫組織化学染色を行うことにより測定した。感染細胞を数え、力価の測定に用いた。Vero細胞またはBHK(VEErep/C*-E*-PAC)細胞における増殖巣形成に関するWN PIVの能力を評価するために、上記同様、単層に希釈液のWN PIVを感染させ、半固体トラガカントオーバーレイで覆い、37℃でインキュベートし、それから固定し、WNV NS1に特異的なMAB(E.Konishi、神戸、日本により提供された)で染色した。
PIV安全性調査
PIVの安全性を、頭蓋内(i.c.)経路(20 ml容量)による3〜4日齢マウス(非近交系Swiss Webster, Harlan)への、または腹腔内(i.p.)経路(100 ml容量)による4〜5週齢メスマウス(非近交系Swiss Webster、Harlan)への、異なる用量のウイルス(親の感染性cDNAから回収したYFV 17DまたはWNV TX02)またはPIVの接種により確認した。マウスを、疾患の兆候および死亡について14日間モニタリングし、瀕死、および翌日まで生存が不可能とみられた動物は、人道的に安楽死させ、翌日に「死亡」と記録した。
WN PIV効力および有効性調査
上述のようにWN PIVを接種され選択された動物を、接種の21日後に安楽死させ且つ採血した。血清を動物から回収し、プールし、上述の方法を用いて、Vero細胞単層上におけるWNV増殖巣形成を減少させるそれらの能力について試験した。残った動物をWNVのNY99株(Xiao ら、2001)の約100 LD50に対応する、1,000 inf.u(Vero細胞上の増殖巣形成アッセイによって決定された)で接種し、また動物をその後上述のようにさらに14日間観察した。
YFV C-およびYFV C-prM-E発現カセットは両方、YFV PIVの複製を補完できる
フラビウイルスゲノムにおける、あるC欠失の欠陥を補完するための全体的な戦略を図1に示す。これは、C遺伝子を欠いているゲノムの発生、および、Cを発現する細胞におけるこれらの偽感染性ウイルスゲノム(PIVゲノム)の伝播(または、ウイルス性構造タンパク質のすべて)に基づいているが、正常細胞におけるものではない。PIVゲノムにおける欠陥のトランス型の補完に必要なウイルス性構造タンパク質を産生しない、後者の細胞における複製は、重要な保護的な免疫原Eを含むが、Cおよびウイルス性の遺伝物質を含むヌクレオカプシドを欠いているSVPの放出につながる。
欠陥ゲノムを有するYF PIVは大規模に産生可能である
ワクチン候補としてのPIVの究極の有用性は、例えば商業生産に必要な規模でこれらの粒子を産生する能力に依存する。ワクチン製造に関するRNAベースのトランス型相補性系(VEEVレプリコン)への信頼性は、RNAウイルスのゲノムの中にクローニングされた異種遺伝子における変異蓄積の可能性があるため、更に標準化が必要とされる。継代数の少ない細胞株の使用は、この限界を克服するための解答の1つである。あるいは、ナイーブ細胞へのレプリコンのトランスフェクションの繰り返しによって、またはナイーブ細胞の感染が後に続くパッケージングされたVEEVレプリコンの産生によって、VEErepゲノムにおける変異の蓄積を最小にできる。パッケージングされたVEEレプリコンの使用は、パッケージング細胞株を樹立するための1つの単純且つ効率的な手段であると考えられた。
YFV C遺伝子のコドン最適化形態を発現するVEEレプリコンを用いるYF PIV
欠陥ウイルスの複製をサポートするためにパッケージングシステムを用いることに対する別の起こりうる問題は、欠陥ウイルスゲノムとトランス型相補性遺伝子をコードするRNAとの間の組換えである。そのような組換えは、感染性ウイルスの発生につながると考えられる。本明細書において記載された実験では、感染性YFVはプラーク分析法を用いても全く検出されなかったが、生ウイルスがこれらの細胞において形成されうる可能性を排除する必要があった。
PIVは他のフラビウイルスに関しても作製可能である
PIVが他のフラビウイルスに関して容易に作製可能であることを立証するため、上記戦略をWNVに適用した。このために、35アミノ酸長のCタンパク質を有するWN PIVゲノムを作製した(図5A)。このWN PIVゲノムをパッケージングするため、WNV C/prM/E およびPac を発現する非細胞変性VEEVレプリコンをBHK細胞にトランスフェクションすることにより作製したパッケージング細胞株[BHK(VEErep/C*-E*-Pac)]を用いた。この細胞株で複製するWN PIVゲノムとCタンパク質をコードするVEErep RNAとの間の組換えが、感染性WNVの発生につながる機会を最小にするため、VEEVレプリコン中のWNV Cをコードする遺伝子を、WNV環状化ドメインにクラスター化したサイレント突然変異を含むように改変した。
YFまたはWN PIVで感染した細胞はSVPを産生する
PIVに感染した細胞がSVPを産生したことを示すために、BHK-21細胞を、インビトロ合成されたYF PIV RNAでトランスフェクトするか、またはC-発現細胞において産生されたYF PIVに感染させた。BHK-21細胞から放出された粒子を、超遠心分離で精製し、Eに特異的なマウスモノクローナル抗体(MAB)であるD1-4G2(Gentry ら、1982)を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。RNAトランスフェクト細胞およびPIV感染細胞の両方が、培地からペレット化できたEタンパク質を産生し(図6A)、これは、Eタンパク質が粒子形状で存在したことを示している。これらの細胞がいかなるCPEも示さず、またサンプルが超遠心分離前に低速遠心分離で精製されたため、ペレット化画分で検出されたEタンパク質が、細胞性デブリを示す可能性は低い。同様に、WN PIVで感染したVero細胞が、(CPEのいかなる兆候の発生前に)WNV感染Vero細胞により産生されたものとサイズにおいて区別がつかなかった細胞外形状のEを産生したことが、ウェスタンブロット分析により示された(図6B)。
動物における、PIVの安全性、効力、および有効性
WNおよびYF PIVの安全性は、すなわち、3〜4日齢のマウスの同腹子の頭蓋内接種により証明した。これらの研究は、WT YFVまたはWNVを接種されたマウスはすぐに死に、これらウイルスがこれらの動物において約1PFUの50パーセント致死量(LD50)を示すことを示した(表1)。しかしながら、2 x 106 inf.uの用量で乳飲みマウスに接種されたWNおよびYF PIVは、いかなるマウスも殺すことができなかった(表1)。安全性は、野生型(wt)ウイルスおよびWN PIVによる成体マウスの腹腔内接種によってさらに実証した。これらの研究は、WN PIVが成体マウスで完全に安全であることを示した(表2)。さらに、1 PFU未満のLD50でwt WNVは成体マウスの多くを殺し、WN PIVの最大3 x 106 inf.uの用量では、どんな死も引き起こすことができなかった(表2)。しかしながら、もっとも興味深い知見は、WN PIVが非常に強力な免疫原(NEUT力価はわずか3万 inf.uの接種で検出した)であり、3 x 104、3 x 105、または3 x 106 inf.uでワクチン接種された動物の100%が、WNVのNY99株の100 LD50病原菌投与から保護されたことである(表2)。
a 10%FBS含有培地で希釈された、接種された調製物。
b 20 ml/動物の容量で頭蓋内経路により送達。
c 接種後14日目の生存(生/死)。
d 感染により死んだ動物に基づく平均生存期間(標準偏差)。
e 不適切。
a 10%FBS含有培地で希釈された、接種された調製物。
b 100 ml/動物の容量で腹腔内経路により送達。
c 接種後14日目の生存(生/死)。
d 感染により死んだ動物に基づく平均生存期間(標準偏差)。
e 接種後21日目に2匹の動物から採取しプールした血清のNEUT力価(示された力価は、WNV増殖巣形成の80%の減少をもたらす最も高い希釈である)。
f 病原菌投与後14日目の生存により示された、WNVのNY99株の100 LD50の病原菌投与からの保護;希釈接種群から唯一生存した動物は、8〜14日の間、疾患の兆候(曲った背中、波立つ毛皮、および倦怠)を見せた。PIV接種動物はいずれも、病原菌投与後14日の観察期間に疾患のいかなる兆候も見せなかった。
g 不適切。
h WN PIV接種マウス由来の血清と並行して試験された、非免疫マウス由来の血清のNEUT力価。
PIV/RepliVAXの収量および安全性を増加させるためのさらなる修飾
本発明は、RepliVAXの繰り返しの継代は組換えを起こさないが、増殖が増強された変異体が選択されたことを示す: WNV RepliVAXは、WNV Cタンパク質をコードする細胞株において繰り返し継代されている。このCタンパク質は、非細胞変性VEErepのサブゲノムプロモーターによって誘導されたPac遺伝子にWNVのC遺伝子のコピーを融合させることによって作製された(Petrakova ら、2005)。結果として得られた構築物(VEErep/Pac-Ubi-C*)において、ユビキチン(Ubi)遺伝子をC遺伝子の前に挿入し、またCの後ろに停止コドンを配置した。この場合、Pac-Ubi融合タンパク質は成熟Cタンパク質(疎水性のアンカーを欠く; 図9参照)と共に作製されると考えられる。このVEErep(「C*」として表わされる)におけるC遺伝子は、CSシグナルを除去する36個の変異を導入して、この11塩基の領域を、Cのコード能を維持しながら、GUCAAUAUGCU(SEQ ID NO:2)からGUgAAcAUGuU(SEQ ID NO:3)に変換することにより、さらに修飾した。この多くの変異が相同組換えの可能性を劇的に減少させ、またさらに、組換えがゲノムの間に生じた場合、結果として生じるRNAは非対応のCSを有し、複製を防ぐと考えられるため、複製活性ゲノムの産生は起こらない(図9)。
WNV C遺伝子を発現するBHK細胞は、多数継代の間それらの表現型を維持する
VEErep/Pac-Ubi-C*でトランスフェクトしたBHK細胞由来のWNV C発現クローン細胞株による研究は、いくつかの理由から、その長期間安定性およびRepliVAX作製における有用性を示した。まず第一に、これらの細胞はRepliVAXの繰り返しの継代に有用であった。第二に、2つの異なる継代レベル(単一細胞クローニング後の8および24継代)での細胞における並行増殖巣形成アッセイは、区別できないWN RepliVAX力価および増殖巣サイズを示した。最後に、継代24レベルでのこれらの細胞におけるCコードカセットの配列の直接分析は、元のVEErep配列と比較して、変化がないことを明らかにした。これらのデータを一緒にすると、C-発現VEErepsを有する細胞が、ヒトワクチン製造において使用される、現在認可されたマスター細胞シードロットフォーマットにおける使用において、十分安定しているはずであることを示す。さらに、VEErepが人体試験で既に用いられているという事実は、規制許可の間、Vero細胞に対するVEErep細胞工学の適用がいかなる予期しないハードルにも遭遇することがないようにする。
WNV VLPのリンパ系組織標的化
上記のように、フラビウイルスprM/Eタンパク質を除き、WNV VLPはRepliVAXと同様であり、レポータ遺伝子をコードでき、またはレポーターなしでフラビウイルスレプリコンを単に含むことができる。VLPは、すべての3つのWNV構造タンパク質を発現するパッケージング細胞中で容易に作製され得、かつ高力価で産生されていた(Fayzulin ら、2006)。VLP 107Uを、マウスに接種をした場合、これらの動物は、接種後24時間でそれらの血清中に、1,000〜5,000 U/mlのI型インターフェロン(IFN)を産生した。IFN反応は、腹腔内および皮下組織の足蹠注射(fp)の両方によってもたらされた。さらに、b-ガラクトシダーゼ発現VLPによるfp接種後24時間後に解剖された膝窩のリンパ節は、多数のb-ガラクトシダーゼ陽性細胞を含み、このことは、RepliVAXから区別できない方法で細胞に入るVLPが重要なリンパ器官を標的にしていることを示している。この結果は、VLP注射により誘発された高レベルのIFNと一致し、同様の標的化がRepliVAXの高い効力および有効性に関係することを示唆する。
Claims (35)
- フラビウイルス科の複製能欠損型(replication-deficient)偽感染性(peudoinfectious)ウイルスであって、
欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド(C)タンパク質をコードするヌクレオチド配列における欠失を含み、フラビウイルス科のウイルスの、Cタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞においてのみ複製する、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。 - ウイルスがフラビウイルス、ヘパシウイルス、もしくはペスチウイルス、または、他のウイルスのprM-Eカセットを偽感染性ウイルスのprM-Eカセットと交換することにより作製された、該ウイルスの他のキメラである、請求項1記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスである、請求項2記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- 欠失した、フラビウイルスのCタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、Cタンパク質のアミノ酸26〜100、またはアミノ酸26〜100内のアミノ酸の組み合わせをコードする、請求項3記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- ヘパシウイルスがC型肝炎ウイルスである、請求項2記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- ペスチウイルスが、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタ熱ウイルス、またはブタコレラウイルスである、請求項2記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- 欠失した遺伝子が、マーカータンパク質または抗原をコードする遺伝子により置き換わっている、請求項1記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- マーカータンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項7記載のフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルス。
- 適切な条件下で請求項1記載の複製能欠損型ウイルスの増殖を可能にするのに有効な、フラビウイルス科のウイルスの、Cタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞培養システム。
- ウイルスの野生型または変異型タンパク質を発現する細胞が、ウイルスベクターから得られた遺伝子操作されたレプリコンを用いて作製される、請求項9記載の細胞培養システム。
- レプリコン中のフラビウイルス科のウイルスのタンパク質をコードしている遺伝子が、該ウイルスのタンパク質をコードしている遺伝子のコドン最適化バージョンにより置換されており、該置換が、細胞株にコードされている遺伝子のフラビウイルス科の偽感染性ウイルスのゲノムと組換えを起こす能力を減少させ、かつ/またはフラビウイルス科の偽感染性ウイルスの産生を増加させる、請求項10記載の細胞培養システム。
- レプリコンが、フラビウイルス科に属するウイルスのCタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも36ヌクレオチド部位に変異を有するCタンパク質を発現する、請求項11記載の細胞培養システム。
- 非天然の環状化配列を含むレプリコンにおいてレプリコンがCタンパク質を発現し、該環状化配列の存在が複製能欠損型偽感染性ウイルスと天然ウイルスとの増殖性の組換えの機会を減少させる、請求項11記載の細胞培養。
- タンパク質を発現する前記レプリコンが、切り詰められたC-rpM接合部をコードする改変ヌクレオチド配列を含み、該改変配列の存在が、細胞培養における複製能欠損型偽感染性ウイルスの収量、インビボにおけるprM/E含有SVPの収量、またはそれらの組み合わせを増加させる、請求項11記載の細胞培養。
- フラビウイルス科のウイルスの野生型または変異型タンパク質を発現するレプリコンが、インビトロ合成されたレプリコンRNAのトランスフェクション、細胞性RNAポリメラーゼII特異的プロモーターから機能的なアルファウイルスレプリコンを合成するために設計されたプラスミドDNAのトランスフェクション、またはアルファウイルス構造タンパク質内にパッケージングされたアルファウイルスレプリコンの感染によって細胞に導入される、請求項10記載の細胞培養システム。
- ウイルスベクターがアルファウイルスである、請求項10記載の細胞培養システム。
- アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、またはロスリバーウイルスである、請求項16記載の細胞培養システム。
- 以下を含むフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを産生する方法;
欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド遺伝子における欠失を有する、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを作製する工程、
フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスの増殖に必要な高レベルのタンパク質を提供する細胞株である、フラビウイルス科のウイルスのカプシドタンパク質、またはカプシド、prM、Eタンパク質、変異カプシドタンパク質、変異prM、変異Eタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞株を作製する工程;ならびに
フラビウイルス科の偽感染性ウイルスに細胞株を感染させ、それによってフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを作製する工程。 - 前記ウイルスがフラビウイルス、ヘパシウイルス、もしくはペスチウイルス、または、他のウイルスのprM-Eカセットを偽感染性ウイルスのprM-Eカセットと交換することによって作製された、該ウイルスの他のキメラである、請求項18記載の方法。
- 前記フラビウイルスが黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスである、請求項19記載の方法。
- 欠失した、前記フラビウイルスのCタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、Cタンパク質のアミノ酸26〜100、またはアミノ酸26〜100内のアミノ酸の組み合わせをコードする、請求項20記載の方法。
- ヘパシウイルスがC型肝炎ウイルスである、請求項19記載の方法。
- ペスチウイルスが、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタ熱ウイルス、またはブタコレラウイルスである、請求項19記載の方法。
- ウイルスの野生型または変異型タンパク質を発現する細胞が、ウイルスベクターから得られた遺伝子操作されたレプリコンを用いて作製される、請求項18記載の方法。
- 前記レプリコン中のフラビウイルス科のウイルスの変異タンパク質をコードしている遺伝子が、該ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子のコドン最適化バージョンにより置換されており、該置換が、細胞株にコードされている遺伝子の偽感染性のフラビウイルス科ウイルスのゲノムと組換えを起こす能力を減少させ、かつ/または偽感染性のフラビウイルス科ウイルスの産生を増加させる、請求項24記載の方法。
- 前記レプリコンが、フラビウイルス科に属するウイルスのCタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも36ヌクレオチド部位に変異を有するCタンパク質を発現する、請求項25記載の方法。
- 非天然の環状化配列を含むレプリコンにおいてレプリコンがCタンパク質を発現し、該環状化配列の存在が複製能欠損型偽感染性ウイルスと天然ウイルスとの増殖性の組換えの機会を減少させる、請求項25記載の方法。
- タンパク質を発現する前記レプリコンが、切り詰められたC-prM接合部をコードする改変ヌクレオチド配列を含み、該改変配列の存在が、細胞培養における複製能欠損型偽感染性ウイルスの収量、インビボにおけるprM/E含有SVPの収量、またはそれらの組み合わせを増加させる、請求項25記載の方法。
- フラビウイルス科のウイルスの野生型または変異型タンパク質を発現するレプリコンが、インビトロ合成レプリコンRNAのトランスフェクション、細胞性RNAポリメラーゼII特異的プロモーターから機能的なアルファウイルスレプリコンを合成するために設計されたプラスミドDNAのトランスフェクション、またはアルファウイルス構造タンパク質内にパッケージングされたアルファウイルスレプリコンの感染によって細胞に導入される、請求項24記載の方法。
- ウイルスベクターがアルファウイルスである、請求項24記載の方法。
- アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、またはロスリバーウイルスである、請求項30記載の方法。
- 請求項18記載の方法によって作製されたフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを含む、薬学的組成物。
- 請求項32の薬学的組成物の免疫学的有効量を被検者に投与することを含む、フラビウイルス科への暴露に起因する感染から被検者を保護する方法であって、該組成物が被検者においてフラビウイルス科に対する免疫応答を誘発し、それにより感染から被検者を保護する方法。
- 前記投与が腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、口腔、または鼻腔内経路を介する、請求項33記載の方法。
- 被検者がヒトまたは動物である、請求項33記載の方法。
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