CN110381993B - 具有3’utr缺失的活减毒寨卡病毒、含有所述病毒的疫苗及其用途 - Google Patents

具有3’utr缺失的活减毒寨卡病毒、含有所述病毒的疫苗及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寨卡病毒(ZIKV)的活减毒毒株，所述毒株具有病毒基因组的3’非翻译区(3’UTR)的缺失，所述缺失会影响病毒RNA合成和对I型干扰素抑制的敏感性，但不会影响病毒RNA翻译。本发明还公开了这些活减毒ZIKV毒株在制备ZIKV疫苗并提供针对ZIKV感染和先天性ZIKV综合征的免疫保护中的用途，特别是在妊娠女性中。

Description

具有3’UTR缺失的活减毒寨卡病毒、含有所述病毒的疫苗及其 用途
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明由NIH授予号AI120942资助。
相关申请
本PCT申请要求2017年2月14日提交的美国临时申请号62/458,839的优先权，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及寨卡病毒(ZIKV)的活减毒毒株和包含此毒株的疫苗组合物的开发。毒株和包含所述毒株的疫苗可用于人和动物中，以用于针对ZIKV进行治疗或提供免疫保护，所述ZIKV可引起先天性ZIKV综合征和格林-巴利综合征(Guillan-Barrésyndrome)。本发明具体地公开了防止先天性ZIKV综合征，包括小头畸形的方法。
背景技术
蚊媒ZIKV最近对公共健康造成了全球性威胁。与寨卡病毒(ZIKV)感染相关的最具破坏性的疾病是广泛的先天性畸形(包括小头畸形)，现在统称为先天性ZIKV综合征(参考文献1)。预防先天性ZIKV综合征是减轻家庭和社会流行病负担的最紧迫任务(参考文献2)。具体地说，在疾病流行的国家，没有ZIKV免疫力的孕妇有胎儿感染和先天性缺陷的风险。由于ZIKV也可以通过性传播，因此生活在非疾病流行地区的妇女在接触去过疾病流行国家的男性时也会有风险。
ZIKV主要通过感染的物种伊蚊的叮咬传播给人们。ZIKV的最常见症状为发烧、皮疹、关节疼痛和结膜炎。这种病通常是轻微的，在被感染的蚊子叮咬后2至7天出现症状，并持续数天至一周。然而，有报道称，妊娠期间感染ZIKV的母亲的婴儿具有先天性ZIKV综合征，例如严重的出生缺陷，尤其是小头畸形，以及其他不良妊娠结局。在疑似ZIKV感染的患者中也报道了格林-巴利综合征(GBS)的病例。GBS是一种罕见的疾病，其中一个人的自身免疫系统损害神经细胞，从而导致肌肉无力，有时是麻痹。这些症状可在任何地方持续数周至数月，虽然一些人具有永久性损害，在极少数情况下，GBS可导致死亡。
ZIKV为黄病毒(Flavivirus)属(在黄病毒科中)的成员，所述黄病毒属还包括其他重要的人病原体，例如黄热病病毒(YFV)、西尼罗病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱媒脑炎病毒(TBEV)和登革病毒(DENV)。与黄病毒属的其他成员一样，寨卡含有编码多蛋白的正单链基因组RNA，所述多蛋白被加工成三种结构蛋白(衣壳[C]蛋白、前膜(premembrane)[prM]蛋白和包膜[E]蛋白)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白形成病毒粒子，而非结构蛋白参与病毒RNA合成、病毒粒子组装和免疫应答的逃避。
已开发了用于黄病毒的灭活疫苗和活减毒疫苗，包括YFV、JEV、TBEV和DENV(参考文献3)。ZIKV疫苗开发取得了迅速和有前途的进展(参考文献4和5)。灭活ZIKV疫苗和亚单位疫苗(表达病毒prM/E蛋白)已在小鼠和非人灵长类动物中显示出功效(参考文献6-8)。成功的疫苗需要在免疫原性与安全性之间取得良好的平衡。活减毒疫苗通常提供快速和持久的免疫力，但有时要降低安全性；而灭活疫苗和亚单位疫苗以降低免疫原性为代价提供增强的安全性，并且通常需要多次剂量和定期的加强剂。
本发明解决了对新型ZIKV疫苗的需求问题，所述新型ZIKV疫苗服务于高危人群以便针对由ZIKV引发的感染进行治疗和/或提供免疫保护，并且预防先天性ZIKV综合征，尤其是小头畸形。
发明内容
本发明总体上涉及活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含ZIKV基因组的3’非翻译区(3’UTR)的缺失。
本发明更具体地涉及活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，其中3’UTR缺失的范围为10个核苷酸缺失至50个核苷酸缺失(即，Δ10、Δ11、Δ12、Δ13、Δ14、Δ15、Δ16、Δ17、Δ18、Δ19、Δ20、Δ21、Δ22、Δ23、Δ24、Δ25、Δ26、Δ27、Δ28、Δ29、Δ30、Δ31、Δ32、Δ33、Δ34、Δ35、Δ36、Δ37、Δ38、Δ39、Δ40、Δ41、Δ42、Δ43、Δ44、Δ45、Δ46、Δ47、Δ48、Δ49或Δ50 3’UTR缺失)，在示例性实施方案中，3’UTR缺失为10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失或30个核苷酸缺失。
本发明更具体地涉及活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含与SEQ ID NO:2、3、4或5的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％同一性的3’UTR。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株无法感染蚊子。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，与野生型ZIKV毒株相比，所述活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株表现出减少的病毒RNA合成。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，与野生型ZIKV毒株相比，所述活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株表现出增加的对I型干扰素抑制的敏感性。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，其中缺失不影响病毒RNA翻译。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株为mCherry ZIKV毒株。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含SEQID NO:6的缺失变体或由其组成，其中序列“CCAGAAGAGG”(3’UTR 10个核苷酸缺失)(SEQ IDNO:8)从SEQ ID NO:6中缺失。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含SEQID NO:6的缺失变体或由其组成，其中序列“CTGTGGATCTCCAGAAGAGG”(3’UTR 20个核苷酸缺失)(SEQ ID NO:9)从SEQ ID NO:6中缺失。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含SEQID NO:7的缺失变体或由其组成，其中序列“CCAGAAGAGG”(3’UTR 10个核苷酸缺失)(SEQ IDNO:8)从SEQ ID NO:7中缺失。
本发明还具体地涉及如上所述的活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株包含SEQID NO:7的缺失变体或由其组成，其中序列“CTGTGGATCTCCAGAAGAGG”(3’UTR 20个核苷酸缺失)(SEQ ID NO:9)从SEQ ID NO:7中缺失。
本发明还具体地涉及包含如上所述的活减毒ZIKV毒株的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还具体地涉及包含如上所述的活减毒ZIKV毒株的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物适用于胃肠外或肠内施用。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其诱导针对ZIKV的CD8+ T细胞应答、抗体应答和/或细胞免疫应答。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其产生相当于野生型ZIKV感染的中和抗体滴度(titer)。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其中受试者为妊娠女性。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，以便预防先天性ZIKV综合征。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，以便预防小头畸形。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其中至少1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105或1.0×106IFU的活减毒ZIKV毒株施用至受试者。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其中所述组合物的施用在随后用野生型ZIKV毒株攻击后预防所述受试者中的病毒血症。
本发明还具体地涉及在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如上所述的活减毒ZIKV毒株或免疫原性组合物，其中受试者为人。
附图说明
图1A-1F包含了细胞培养中3’UTR缺失突变体的表征。图1A提供了ZIKV 3’UTR缺失的序列。图1B示出了突变病毒的免疫染色集落测定。将从其对应的感染性cDNA克隆物转录的等量RNA(10μg)电穿孔到Vero细胞中。在转染后的第4天或第5天，收获来自转染细胞的培养液，并使用免疫染色集落测定在Vero细胞上定量感染性病毒(定义为P0病毒)。图1C展示了野生型(WT)病毒和突变病毒的复制动力学。用MOI为0.01的野生型病毒和突变病毒感染24孔板(每孔2×105个细胞)中的Vero细胞。使用免疫染色集落测定，在第1至5天定量培养液的感染性病毒。针对每天从左到右，条形对应于：野生型、10个核苷酸缺失(10-del)、20个核苷酸缺失(20-del)、30个核苷酸缺失-a(30-del-a)和30个核苷酸缺失-b(30-del-b)。图1D示出了海肾荧光素酶报告基因复制子构建体。图1E包含了3’UTR缺失的复制子分析。用各种3’UTR缺失工程化ZIKV的海肾荧光素酶报告基因复制子(图1D)。将等量的复制子野生型RNA和突变RNA(10μg)电穿孔到Vero细胞中。在指定时间点测量荧光素酶信号。包括含有NS5聚合酶失活的GDD突变的非复制性复制子作为阴性对照。给出三次重复的平均值。误差条表示标准偏差。RLU，相对光单位。顶部曲线对应于野生型，并且底部曲线对应于GDD对照。图1F示出了野生型ZIKV和突变ZIKV的干扰素-β抑制。在干扰素治疗和病毒感染前一天，将Vero细胞种在96孔板(每孔1.5×104个细胞)中。在IFN-β(55、167、500或1,500IU/ml)存在下，以MOI 0.05感染细胞。同时开始病毒感染和干扰素治疗。在感染和干扰素-β治疗后48小时，使用免疫染色集落测定在Vero细胞上定量病毒滴度。以log10标度给出病毒滴度抑制的百分比。将没有干扰素-β治疗的病毒滴度设定为100％。示出了三次独立实验的平均结果。误差条表示标准偏差。符号**和***分别指示P值<0.01和<0.001。针对每天从左到右，条形对应于：野生型、10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失-a和30个核苷酸缺失-b。
图2A-2B示出了3’UTR和缺失突变体的序列形成。图2A描绘了ZIKV 3’UTR的预测RNA二级结构。如先前所报道，给出了ZIKV基因组的3’UTR的茎-环结构(参考文献33、34)。示出了阴影茎-环的核苷酸序列。分别用蓝色、洋红色、绿色和橙色显示10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失-a和30个核苷酸缺失-b突变体的缺失序列。图2B示出了3’UTR中缺失区(核苷酸位置10,630-10,674)的序列比对。指示了10个核苷酸缺失的核苷酸。在10个核苷酸缺失区内，针对早期分离物(分别在1966年、1947年和1984年分离出P6-740、MR766和DAK-41525)观察到序列变异，而针对2010年后分离的毒株(FSS13025、H/PF2013、PRVABC59、Natal RGN和ZKV2015)观察到相同的序列。
图3示出了用野生型或3’UTR缺失ZIKV RNA转染的细胞中病毒蛋白表达的免疫荧光测定(IFA)。用10μg的ZIKV的基因组野生型或3’UTR缺失RNA电穿孔Vero细胞。在转染后第2天和第3天，使用小鼠mAb(4G2)和Alexa488山羊抗小鼠IgG分别作为一抗和二抗，进行IFA以检查病毒E蛋白表达。绿色和蓝色分别表示E蛋白和细胞核(用DAPI染色)。在这两天均可见野生型和所有突变体组的病毒E蛋白染色。
图4A-4C包含了3’UTR缺失ZIKV在细胞培养中的稳定性分析。将P0病毒(来自图1的RNA转染细胞的培养液)在Vero细胞上连续培养5轮(每轮培养5天)，从而产生P5病毒。然后表征P5病毒。图4A示出了免疫染色集落测定的结果。使用免疫染色集落测定，在Vero细胞上分析野生型病毒和P5突变病毒。针对每种突变病毒，在Vero细胞上进行三次独立选择。给出了每种P5突变病毒的感染性病灶的代表性图像。图4B示出了复制动力学。用MOI为0.01的野生型病毒和P5突变病毒感染24孔板(每孔2×105个细胞)中的Vero细胞。使用免疫染色集落测定，在第1至5天在Vero细胞上定量培养液的感染性病毒。针对每天从左到右，条形对应于：野生型、10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失-a和30个核苷酸缺失-b。图4C示出了P5突变病毒中的适应性突变。针对三种独立选择中的每一种，进行P5突变病毒的完整基因组测序。基于ZIKV FSS13025毒株(GenBank号KU955593.1)，由其指定基因的氨基酸位置指示适应性突变。
图5A-5G示出了A129小鼠模型中3’UTR突变体的表征。图5A包含了实验方案。在两个单独的实验中，通过皮下途径用1×104IFU野生型病毒和突变病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝8)。监测免疫小鼠的体重减轻、存活率和病毒血症。图5B示出了体重减轻的结果。使用免疫前一天的体重作为100％，由百分比指示体重减轻。最低曲线对应于野生型。图5C示出了存活率的结果。最低曲线对应于野生型。图5D示出了病毒血症的结果。从感染后第2天至第4天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。针对每天从左到右，条形对应于：野生型、10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失-a和30个核苷酸缺失-b。图5E示出了攻击前中和抗体滴度。在免疫后第28天，使用mCherry ZIKV感染测定测量小鼠血清的中和滴度(图6A-6B)。图5F示出了攻击后病毒血症。在免疫后第28天，通过腹膜内途径用1×105PFU亲代病毒(ZIKV毒株FSS13025)攻击小鼠。使用免疫染色集落测定，定量攻击后第2天的病毒血症。图5G示出了攻击后中和抗体滴度。在攻击后第28天，使用mCherry ZIKV感染测定定量小鼠血清的中和滴度。L.O.D.：检测限。
图6A-6B示出了mCherry ZIKV的构建。图6A示出了mCherry ZIKV的示意性基因组。DNA片段(编码C基因、mCherry基因和口蹄疫病毒2A蛋白的前25个氨基酸)与ZIKV基因组的开放阅读框框内融合。图6B示出了用mCherry ZIKV RNA转染的Vero细胞中的mCherry表达。在转染后的指定天数里，通过荧光显微镜分析转染的Vero细胞中mCherry的表达。如方法中所述，mCherry ZIKV用于估计小鼠血清的抗体中和滴度。
图7A-7C示出了用100IFU的10个核苷酸缺失病毒免疫的功效。图7A示出了用100IFU的野生型(左条形)或10个核苷酸缺失ZIKV(右条形)免疫后的病毒血症。通过皮下途径，用100IFU的野生型或10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。从第2天至第6天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。L.O.D.：检测限。图7B示出了攻击前中和抗体滴度。在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。图7C示出了用ZIKV(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击后的病毒血症。在免疫后第28天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV攻击小鼠。在攻击后第2天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。
图8A-8C示出了用10IFU的10个核苷酸缺失病毒免疫的功效。图8A示出了用10IFU的野生型或10个核苷酸缺失ZIKV免疫后的病毒血症。通过皮下途径，用10IFU的野生型或10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。从第4天至第7天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。L.O.D.：检测限。图8B示出了攻击前中和抗体滴度。通过皮下途径，用10IFU的10个核苷酸缺失ZIKV和PBS免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。在同一天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击小鼠。图8B示出了用流行病ZIKV(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击后的病毒血症。在攻击后第2天，使用免疫染色集落测定定量病毒血症。L.O.D.：检测限。
图9A-9D示出了用ZIKV野生型或10个核苷酸缺失突变体初次感染后的T细胞应答。用1×104IFU野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒感染A129小鼠。在感染后第28天，收获小鼠脾脏。计数脾细胞，用野生型ZIKV离体培养24小时，并且对标志物(IFN-γ、CD3和CD4或CD8)染色。基于对这些标志物的染色，对T细胞进行门控(gate)。图9A示出了CD4+IFN-γ+细胞和CD8+IFN-γ+细胞的百分比。图9B示出了每个脾脏的T细胞亚群的平均总数。在野生型ZIKV再刺激后第2天收获来自离体培养物的上清液，并且测量IFN-γ和IL-2的产生。图9C示出了IFN-γ产生。图9D示出了IL-2产生。以平均值±SEM给出数据，n＝2-4/组。病毒感染小鼠与模拟感染小鼠之间的差异为*P<0.05或**P<0.01。
图10A-10C示出了10个核苷酸缺失病毒的安全性评估。图10A示出了感染的A129小鼠器官中的病毒载量。用1×104IFU野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠。在感染后第6天和第10天收集来自感染小鼠的器官并且均质化。使用免疫染色集落测定，在Vero细胞上定量病毒的量。给出了来自三个动物的平均结果。条形指代标准误差。“*”指代无可检测病毒。在每天从左到右，条形对应于：心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、脑、睾丸和眼睛。图10B示出了CD1新生小鼠中野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒的神经毒力比较。通过颅内途径，用10至1×104IFU的野生型病毒或10个核苷酸缺失病毒注射一日龄CD1小鼠的组(n＝7-10)。所有10个核苷酸缺失病毒曲线示出了100％存活率，而野生型曲线示出了小于100％存活率。图10C示出了蚊感染性测定的结果。用野生型或10个核苷酸缺失病毒的人造血餐喂食埃及伊蚊。在喂食后第7天，将各个饱血的、孵育的蚊子均质化，并且通过在接种的Vero细胞上对病毒蛋白表达免疫染色来测定感染(详见方法)。指示了感染蚊子的数量和饱血蚊子的总数。
图11A-11C示出了P0和P5 10个核苷酸缺失病毒的病毒血症和功效的比较。图11A示出了用100IFU的P0或P5 10个核苷酸缺失ZIKV免疫后的病毒血症。通过皮下途径，用100IFU的P0或P5 10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。从第4天至第6天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。L.O.D.：检测限。图11B示出了攻击前中和抗体滴度。在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。图11C示出了用野生型ZIKV攻击后的病毒血症。在免疫后第28天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV流行病毒株(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击小鼠。在攻击后第2天，使用免疫染色集落测定定量病毒血症。
图12A-12B示出了用野生型或10个核苷酸缺失突变病毒感染的A129小鼠的精子计数分析。用1×104IFU的野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒感染雄性A129小鼠(n＝4/组)。在感染后第16天，收获附睾用于精子计数分析。图12A示出了总精子计数。图12B示出了活动精子计数。进行单向ANOVA检验以指示不同感染组之间的统计学显著性。n.s.：不显著的；***非常显著的(p值<0.001)；****极其显著的(p值<0.0001)。
图13A-G示出了ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV保护妊娠的C57BL/6小鼠及其发育中的胎儿。图13A示出了用105FFU的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV(Δ10；n＝12)或PBS假对照(n＝16)免疫野生型(WT)C57BL/6雌性小鼠的方案。图13B示出了其中在免疫后第28天收集血清并使用mCherry感染性ZIKV分析中和活性的实验。示出了代表性中和曲线。误差条指代两次重复的技术重复的标准偏差(SD)。图13C示出了针对各个动物测量的中和抗体的NT50值。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图13D-G示出了在免疫后第35天，将接种疫苗的雌性小鼠与雄性WTC57BL/6交配。一部分雌性小鼠出现阴道栓。在胚胎第5天(E5)，给妊娠小鼠(n＝8，汇集自两个独立的实验)施用2mg的抗Ifnar1封闭抗体(blocking antibody)，并在一天后(E6)，用105FFU的致病性、小鼠适应的ZIKV Dakar 41519毒株攻击。在E13，使动物安乐死；收获母体脾脏(图13D)、母体脑(图13E)、胎盘(图13F)和胎儿头部(图13G)并定量病毒RNA水平。每组指示中值病毒RNA水平。星号指示显著性差异(曼-惠特尼检验：****，P值<0.0001)。以检测限的半值绘制所有阴性样品。附图中的结果汇集自两个独立的实验。
图14A-I示出了ZIKV-3’-UTR-Δ10-LAV保护年轻A129雄性小鼠免受睾丸感染和损伤。图13A包含了用104FFU的ZIKV-3’-UTR-Δ10-LAV(Δ10；n＝6)或PBS假对照(n＝4或6)免疫3周龄A129雄性小鼠的方案。在免疫后第28天，测量小鼠的中和抗体滴度。在同一天，用106FFU的ZIKV-PRVABC59攻击来自一个假对照组的小鼠和来自Δ10免疫组的小鼠，并且在攻击后第2天(免疫后第30天)测量病毒血症。在免疫后第49天，分析小鼠的睾丸中的精子计数和病毒载量。图14A-B示出了用Δ10候选疫苗免疫后的病毒血症。图14C包含了测量每组中各个动物在免疫后第28天的抗体中和的NT50值。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图14D示出了用ZIKV PRVABC59攻击后第2天(免疫后第30天)的病毒血症。图14E示出了攻击后第21天(免疫后第49天)的睾丸中病毒载量。图14F-G示出了攻击后第21天的总精子计数(F)和活动精子计数(G)。(H-I)在攻击后第21天，来自假对照组、受攻击的假对照组以及Δ10免疫和攻击组的动物的睾丸重量(H)，和睾丸代表性图像(i)。标度条，1mm。星号指示显著性差异(单方向ANOVA：****，P值<0.0001；***，P值<0.001)。不显著的(n.s.)，P值>0.5。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图15A-D示出了ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV和ZIKV-3’UTR-Δ20-L AV保护恒河猴(RM)免受ZIKV感染。图15A示出了通过皮下途径，用103FFU的野生型ZIKV毒株FSS13025(n＝4)、ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV(Δ10；n＝4)、ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV(Δ20；n＝3)或PBS假对照(n＝2)免疫RM的方案。图15B示出了通过qRT-PCR免疫后第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第10天测量的病毒血症。每条彩色线表示来自每组中不同动物的数据。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图15C示出了攻击前和攻击后的抗体中和滴度。在免疫后各种天数里，使用mCherry ZIKV感染测定测量血清的中和滴度。红色箭头指示在免疫后第56天，通过皮下途径用103FFU的流行病ZIKV毒株PRVABC59攻击。针对每个实验组，攻击后抗体中和滴度增加≥4倍的动物数量由符号“↑”指示。图15D示出了攻击后病毒血症。在攻击后第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第10天，通过qRT-PCR测量病毒血症。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图16A-H示出了ZIKV-3’-UTR-Δ20-LAV(Δ20)候选疫苗的安全性评估。图16A示出了感染的A129小鼠器官中的病毒载量。用103FFU的野生型ZIKV FSS13025(左图)及其衍生物Δ20候选疫苗(右图)皮下免疫三周龄A129小鼠(n＝7)。在感染后第6天和第10天收集来自感染小鼠的器官并且均质化。使用集落形成测定，在Vero细胞上定量病毒的量。给出了来自七个动物的平均结果。条形指代标准误差。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图16D-F示出了Δ20疫苗接种对睾丸的作用。用1×103FFU的野生型ZIKV FSS13025或Δ20候选疫苗皮下感染三周龄A129小鼠(n＝5)。在感染后第28天，分析来自每组的动物的睾丸重量(图16B)、睾丸大小(图16C)、总精子计数(图16D)、活动精子计数(图16E)和病毒RNA载量(图16F)。标度条，1mm。(图16G)远交CD-1小鼠中野生型ZIKV FSS13025和Δ20候选疫苗的神经毒力比较。用10至104FFU的野生型ZIKV或103至104FFU的Δ20候选疫苗颅内注射一日龄CD-1小鼠(n＝7-8/组)。指示存活小鼠和总感染动物。(图16H)载体能力的分析。用掺有106FFU/ml的野生型ZIKV FSS13025或Δ20疫苗病毒的人造血餐喂食埃及伊蚊。在喂食后第7天，通过在接种的Vero细胞上对病毒蛋白表达免疫染色来测定各个饱血蚊子的感染。指示了感染蚊子的数量和饱血蚊子的总数。星号指示显著性差异(单方向ANOVA：***，P值<0.001；**，P值<0.01；*，P值<0.05)。不显著的(n.s.)，其中P值>0.5。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图17A-C示出了来自假对照或ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的母兽(dam)的胎盘和胎头中感染性ZIKV负担。在妊娠保护实验(参见图13中的细节)中，在攻击后第7天(相当于E13)，从PBS假对照和ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的母兽收集胎盘(图17A)和胎头(图17B)，并使用集落形成测定定量感染性ZIKV。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。结果汇集自两个独立的生物实验，并且每个符号表示来自各个胎盘(n＝23)或胎仔(n＝30)的数据。(图17C)E13胎盘病毒负担与ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的抗体中和NT50值的相关性。P和R2值反映了Pearson相关性检验。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图18A-I包含了示出ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV保护成年A129雄性小鼠免受睾丸感染和损伤的实验。(A)用1×104FFU的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV(Δ10；n＝5)或PBS假对照(n＝5)免疫15周龄A129雄性小鼠的方案。在免疫后第28天，测量小鼠的中和抗体滴度。在同一天，用106FFU的ZIKV-PRVABC59攻击小鼠。在攻击后第2天(免疫后第30天)，测量峰值病毒血症。在免疫后第49天，使小鼠安乐死，并且测量睾丸中的总精子计数和活动精子计数以及病毒载量。图18B示出了在ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫后的病毒血症。图18C示出了在免疫后第28天的抗体中和的NT50值。通过mCherry ZIKV测量每组中各个动物的抗体中和滴度。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图18D示出了攻击后第2天(免疫后第30天)的病毒血症。在攻击后第21天，分析来自每组的动物的睾丸病毒载量，图18E示出了睾丸病毒载量，图18F示出了总精子计数，图18G示出了活动精子计数，图18H示出了睾丸重量，并且图18I示出了睾丸大小。在(i)中给出了睾丸的代表性图像。标度条，1mm。星号指示显著性差异(单方向ANOVA：*，P值<0.05；**，P值<0.01；****，P值<0.0001)。不显著的(n.s.)，P值>0.5。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图19A-B示出了受攻击的恒河猴血清中的感染性病毒。通过集落形成测定，定量在免疫后(图19A)或攻击后(图19B)第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第10天收集的RM血清中的感染性病毒(病毒血症)。(参见图15A-D中的详细实验方案)。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。以检测限的半值绘制所有阴性样品。
图20A-I示出了ZIKV-3’-UTR-Δ20-LAV保护年轻A129雄性小鼠免受睾丸感染和损伤。图20A示出了用103FFU的ZIKV-3’-UTR-Δ20-LAV(Δ20；n＝6)或PBS假对照(n＝4或6)免疫3周龄A129雄性小鼠的方案。图20B示出了免疫后病毒血症。在免疫后第28天，测量免疫小鼠的中和抗体滴度。在同一天，用106FFU的ZIKV-PRVABC59攻击来自一个假对照组的小鼠和来自Δ20免疫组的小鼠。图20D示出了在攻击后第2天(免疫后第30天)测量的病毒血症。图20E和20F示出了在免疫后第49天，分析小鼠的睾丸中的精子计数和病毒载量。图20C示出了测量每组中各个动物在免疫后第28天的抗体中和的NT50值。虚线指示测定的检测限(L.O.D.)。图20D示出了攻击后第2天(免疫后第30天)的病毒血症。图20E和20F代表性地示出了攻击后第21天(相当于免疫后第49天)的总精子计数(E)和活动精子计数(F)。图20G示出了在攻击后第21天，来自假对照组、受攻击的假对照组以及Δ20免疫和攻击组的动物的睾丸重量。图20H示出了攻击后第21天的睾丸中病毒载量。图20I包含了在攻击后第21天收获的睾丸的代表性图像。标度条，1mm。星号指示显著性差异(单方向ANOVA：****，P值<0.0001)。不显著的(n.s.)，其中P值>0.5。以检测限的半值绘制所有阴性样品。误差条表示标准偏差。
图21包含了在细胞培养中评估ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的稳定性的实验总结。将P0病毒(来自RNA转染细胞的培养液)在Vero细胞上连续培养5轮(每轮培养5天)，从而产生P5病毒。对P5突变病毒的完整基因组进行测序。所有P5病毒均保留了3’UTR的20个核苷酸缺失。另外，恢复了数种适应性突变，这些突变基于ZIKV FSS13025毒株(GenBank号KU955593.1)，由其指定基因的氨基酸位置给出。给出了来自三次独立传代(passage)的结果。
图22描绘了其中通过电穿孔将5微克根据本发明的寨卡DNA质粒转染到Vero细胞中的实验结果。从第1天至第5天收集培养液。通过噬斑测定，在Vero细胞上测量感染性病毒滴度。
图23示出了Vero细胞上候选ZIKV DNA疫苗的产量。通过电穿孔将5微克指定的DNA质粒转染到Vero细胞中。从第1天至第5天收集培养液。通过噬斑测定，在Vero细胞上测量感染性病毒滴度。
具体实施方式
本发明总体上涉及新型活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株的构建和表征，所述毒株具有3’非翻译区(3’UTR)的一种或多种缺失。这些ZIKV缺失突变体可具有减少的RNA产生和增加的对干扰素-β抑制的易感性，因此可用作针对ZIKV的有效活减毒疫苗。具体地说，在本文中我们示出了，含有ZIKV基因组的3’非翻译区缺失的活减毒ZIKV候选疫苗(ZIKV-3’UTR-LAV)在小鼠妊娠和睾丸损害期间预防病毒传播，以及抑制非人灵长类动物的感染。我们还证明了候选疫苗的期望安全特性。我们的研究结果表明，ZIKV-3’UTR-LAV可潜在地用于针对寨卡病毒感染，对人进行疫苗接种。
此外，如本文公开的结果所证明，根据本发明的突变的活减毒寨卡病毒株和含有所述毒株的组合物可用于针对由ZIKV引发的感染进行治疗或提供免疫保护，所述感染包括先天性ZIKV综合征、小头畸形和格林-巴利综合征(GBS)。
本发明提供了一种疫苗，所述疫苗可用于预防孕妇和去往流行病地区/疾病流行地区的旅行者的病毒血症，以避免先天性ZIKV综合征，并且所述疫苗还可有用于抑制流行病传播。本发明的ZIKV毒株为活减毒候选疫苗，其包含ZIKV基因组的3’非翻译区的缺失或“Δ”，优选地10个核苷酸缺失(10个核苷酸缺失ZIKV)或20个核苷酸缺失(20个核苷酸缺失ZIKV)，并且更优选地包含具有如附录B所述修饰的附录A中序列的寨卡毒株或由其组成。10个核苷酸缺失ZIKV在A129小鼠模型中为高度减毒的、免疫原性的和保护性的。单剂量的10IFU 10个核苷酸缺失ZIKV引发高水平的中和抗体并且在攻击后完全预防病毒血症。除了抗体应答以外，免疫小鼠还出现强烈的T细胞应答。用1×104IFU的10个核苷酸缺失ZIKV对一日龄CD1小鼠颅内接种并未引起可检测的疾病，而用10IFU的野生型ZIKV进行感染可致死。从机理上来说，10个核苷酸缺失ZIKV通过减少的病毒RNA合成和增加的对I型干扰素抑制的敏感性来减弱其毒力。减毒的10个核苷酸缺失ZIKV无法感染蚊子，从而体现出在非疾病流行地区使用的额外安全特征。总体来说，安全性和功效结果需要对这种有前途的活减毒ZIKV候选疫苗进一步开发。
本发明的活减毒ZIKV毒株还可包含ZIKV基因组的另外突变。突变可以是，但不限于非编码核苷酸或编码核苷酸的缺失、一个或多个氨基酸的缺失、一个或多个氨基酸的添加、一个或多个氨基酸的取代(保守型或非保守型)或其组合。ZIKV可例如使用3’UTR的缺失，使得降低ZIKV的感染性来进行突变。在某些实施方案中，ZIKV的感染性降低至少5、10、50、100、500、10、5×103、104、5×104、105、5×105或至少106倍。
另外，ZIKV可以例如具有3’UTR缺失和/或使用点突变，使得重组病毒的复制速率降低或增加来进行突变。复制速率可以通过技术人员已知的任何标准技术来确定。复制速率由病毒的生长速率表示，并且可以通过随感染后的时间绘制病毒滴度来确定。病毒滴度可以通过技术人员已知的任何技术来测量。在某些实施方案中，将含有病毒的悬浮液与易受病毒感染的细胞一起孵育，所述细胞包括但不限于Vero细胞、LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF 1043(HEL)细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、tMK细胞、293T细胞、QT 6细胞、QT 35细胞、或鸡胚成纤维细胞(CEF)。将病毒与细胞一起孵育后，确定感染的细胞数量。在某些具体实施方案中，病毒包含报告基因。因此，表达报告基因的细胞数量表示感染的细胞数量。在具体实施方案中，病毒包含编码mCherry的异源核苷酸序列，并且表达mCherry的细胞数量(即被病毒感染的细胞数量)使用FACS来确定。
本文描述的测定可用于随时间测定病毒滴度以确定病毒的生长特征。在具体实施方案中，病毒滴度通过以下方式来确定：从感染的细胞或感染的受试者中获得样品，制备样品的系列稀释液，并在允许出现单个噬斑的病毒稀释度下感染易受病毒感染的单层细胞。然后可以计数噬斑并且病毒滴度表示为每毫升样品的噬斑形成单位。在本发明的具体实施方案中，受试者中本发明的病毒的生长速率通过针对受试者中病毒的抗体滴度来估计。不受理论约束，受试者中的抗体滴度不仅反映了受试者中的病毒滴度而且还反映了抗原性。如果病毒的抗原性是恒定的，受试者中抗体滴度的增加可用于确定受试者中病毒的生长曲线。在优选的实施方案中，动物或人体中病毒的生长速率最好通过在感染后的多个时间点对宿主的生物体液进行取样并测量病毒滴度来测试。
在细胞培养系统或受试者中异源基因序列的表达可以通过技术人员已知的任何技术来确定。在某些实施方案中，异源基因的表达通过定量转录物的水平来测量。转录物的水平可以通过RNA印迹分析(Northern blot analysis)或通过RT-PCR，使用分别特异于转录物的探针或引物来测量。转录物可以与病毒的基因组区分开，因为病毒处于反义方向，而转录物处于有义方向。在某些实施方案中，异源基因的表达通过定量异源基因的蛋白质产物的水平来测量。蛋白质的水平可以通过蛋白质印迹分析(Western blot analysis)，使用特异于蛋白质的抗体来测量。
本发明提供了一种活减毒ZIKV毒株，所述毒株包含ZIKV基因组的3’UTR的一个或多个核苷酸缺失。在一些实施方案中，本发明的ZIKV毒株可包含ZIKV基因组的3’UTR的1个核苷酸缺失、2个核苷酸缺失、3个核苷酸缺失、4个核苷酸缺失、5个核苷酸缺失、6个核苷酸缺失、7个核苷酸缺失、8个核苷酸缺失、9个核苷酸缺失、10个核苷酸缺失、11个核苷酸缺失、12个核苷酸缺失、13个核苷酸缺失、14个核苷酸缺失、15个核苷酸缺失、16个核苷酸缺失、17个核苷酸缺失、18个核苷酸缺失、19个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、21个核苷酸缺失、22个核苷酸缺失、23个核苷酸缺失、24个核苷酸缺失、25个核苷酸缺失、26个核苷酸缺失、27个核苷酸缺失、28个核苷酸缺失、29个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失、31个核苷酸缺失、32个核苷酸缺失、33个核苷酸缺失、34个核苷酸缺失、35个核苷酸缺失、36个核苷酸缺失、37个核苷酸缺失、38个核苷酸缺失、39个核苷酸缺失、40个核苷酸缺失、41个核苷酸缺失、42个核苷酸缺失、43个核苷酸缺失、44个核苷酸缺失、45个核苷酸缺失、46个核苷酸缺失、47个核苷酸缺失、48个核苷酸缺失、49个核苷酸缺失或50个核苷酸缺失。
本发明的活减毒ZIKV毒株、编码所述毒株的核苷酸序列、编码所述毒株的载体以及包含编码所述的核苷酸序列的细胞可进一步修饰、工程化、优化或增补，以便提供或选择各种特征。除了3’UTR内的缺失，减毒病毒还可包含其他突变，包括但不限于用不同物种、不同亚组或不同变体的病毒的类似基因替换人病毒的基因。
在一些实施方案中，可以将可引入到病毒中的其他突变(例如，错义突变)引入到重组病毒的C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5蛋白中。同样，突变可包括添加、取代、缺失或其组合。例如，可引入C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5蛋白中任一种的缺失突变。在其他实施方案中，可引入错义突变，所述错义突变导致冷敏感突变或热敏感突变。在一些实施方案中，可去除病毒蛋白的主要磷酸化位点。
在其他实施方案中，将缺失引入到重组病毒的基因组中。在更具体的实施方案中，可以将缺失引入到重组病毒的C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5蛋白中。
在某些实施方案中，改变重组病毒的基因间隔区。在一个实施方案中，改变基因间隔区的长度。在另一个实施方案中，可从病毒基因组的5’端至3’端对基因间隔区进行改组(shuffle)。在其他实施方案中，可以改变重组病毒的一个基因或多个基因的基因组位置。
在某些实施方案中，病毒的减毒通过用不同物种、不同亚组或不同变体的病毒基因替换野生型病毒的基因来进一步增强。
本发明的重组病毒的减毒表型可以通过技术人员已知的任何方法来测试。可以例如测试候选病毒的感染宿主的能力或细胞培养系统中的复制速率。在某些实施方案中，在不同温度下的生长曲线用于测试病毒的减毒表型。例如，减毒病毒能够在35℃下生长，但不能在39℃或40℃下生长。在某些实施方案中，不同细胞系可用于评估病毒的减毒表型。例如，减毒病毒可仅能够在猴细胞系中生长，但不能在人细胞系中生长，或对于减毒病毒，不同细胞系中可达到的病毒滴度是不同的。在某些实施方案中，小动物模型(包括但不限于仓鼠、棉鼠、小鼠和豚鼠)呼吸道中的病毒复制用于评估病毒的减毒表型。在其他实施方案中，由病毒诱导的免疫应答，包括但不限于抗体滴度(例如，通过噬斑减少中和测定或ELISA测定)用于评估病毒的减毒表型。在某些实施方案中，可以测试重组病毒在动物模型中引发病理性症状的能力。病毒在动物模型系统中引发病理性症状的能力降低表明了其减毒表型。在具体实施方案中，在猴模型中测试了候选病毒的鼻部感染，所述鼻部感染由粘液产生指示。
各种测定可用于测试疫苗的安全性。例如，蔗糖梯度和中和测定可用于测试安全性。蔗糖梯度测定可用于确定异源蛋白是否插入病毒粒子中。如果异源蛋白插入病毒粒子中，即使亲代毒株不会引起症状，也应该测试病毒粒子引起症状的能力。不受理论约束，如果异源蛋白并入在病毒粒子中，病毒可获得新的(可能是病理性的)性质。
根据本发明产生的减毒病毒将用于在易感宿主中给予免受ZIKV感染的预防性或治疗性保护，例如，用于治疗或预防ZIKV感染和/或预防先天性ZIKV综合征或GBS。可使用用于配制减毒病毒疫苗或病毒疫苗的免疫原性组合物的已知技术来配制减毒ZIKV毒株。
在一个实施方案中，本发明的ZIKV毒株的3’UTR包含10个核苷酸缺失突变体ZIKV毒株的3’UTR的核酸序列，SEQ ID NO:2。
在一个实施方案中，本发明的ZIKV毒株的3’UTR包含20个核苷酸缺失突变体ZIKV毒株的3’UTR的核酸序列，SEQ ID NO:3。
在一个实施方案中，本发明的ZIKV毒株的3’UTR包含30个核苷酸缺失-a突变体ZIKV毒株的3’UTR的核酸序列，SEQ ID NO:4。
在一个实施方案中，本发明的ZIKV毒株的3’UTR包含30个核苷酸缺失-b突变体ZIKV毒株的3’UTR的核酸序列，SEQ ID NO:5。
在一些示例性实施方案中，本发明的ZIKV毒株包含如附录B所述修饰的附录A中所述的序列或由其组成。
在一些示例性实施方案中，提供了含有治疗或预防有效量的ZIKV毒株的免疫原性组合物，所述ZIKV毒株包含如附录B所述修饰的附录A中所述的序列或由其组成。
在一些示例性实施方案中，向有需要的个体施用治疗或预防有效量的ZIKV毒株，所述ZIKV毒株包含如附录B所述修饰的附录A中所述的序列或由其组成。
施用
本发明的免疫原性组合物可以多种方式施用，这取决于是否希望局部(local)或全身治疗。在一些示例性实施方案中，施用可为外用的、胃肠外的或肠内的。
本发明的药物组合物通常适用于胃肠外施用。如本文所用，药物组合物的“胃肠外施用”包括其特征在于物理破坏受试者的组织，并通过组织中的破口施用药物组合物，因此通常导致直接施用进入血流中、进入肌肉中或进入内脏器官中的任何施用途径。因此，胃肠外施用包括，但不限于通过注射组合物，通过手术切口施加组合物，通过组织穿透的非手术伤口施加组合物等进行的药物组合物施用。具体地说，预期胃肠外施用包括，但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内的注射或输注；和肾透析输注技术。
适用于胃肠外施用的药物组合物的制剂通常包含与药学上可接受的载体(诸如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类制剂可以适用于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以单位剂量制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于胃肠外施用的制剂包括，但不限于混悬液、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、膏剂等。此类制剂还可包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉剂或颗粒剂)形式提供，以用于使用合适的媒介物(例如无菌无热原水)复原，之后胃肠外施用复原的组合物。胃肠外制剂还包括水溶液，其可含有赋形剂，诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地达到pH为3至9)，但是，针对一些应用，它们可更合适地配制成无菌非水溶液或作为干燥的形式有待与合适的媒介物诸如无菌无热原水一起使用。示例性胃肠外施用形式包括在无菌水溶液中的溶液或混悬液，例如丙二醇水溶液或右旋糖溶液。如果希望，此类剂型可以是合适缓冲的。有用的其他胃肠外可施用的制剂包括包含以微晶形式的活性成分或以脂质体制剂形式的那些制剂。用于胃肠外施用的制剂可被配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
术语“口服的”、“肠内的”、“肠内地”、“口服地”、“非胃肠外的”、“非胃肠外地”等是指通过沿着消化道的途径或方式向个体施用化合物或组合物。疫苗组合物的“口服”施用途径的实例包括，但不限于从口腔吞咽液体或固体形式的疫苗组合物，通过鼻空肠管或胃造口术管施用疫苗组合物，十二指肠内施用疫苗组合物，以及例如使用消化道的下肠道的栓剂进行的直肠施用。
优选地，配制的含病毒组合物适用于鼻内、注射、外用或口服施用，例如作为干燥的稳定粉剂以用于在施用之前在合适的缓冲液中复原，或以气溶胶组合物形式。在优选实施方案中，组合物为鼻内施用的。
用于外用施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、半固体、单相组合物、多相组合物(例如，水包油型、油包水型)、泡沫、微粒海绵、脂质体、纳米乳剂、气溶胶泡沫、聚合物、富勒烯和粉剂(参见，例如参考文献35，Taglietti等人(2008)Skin Ther.Lett.13:6-8)。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等可以是必要的或希望的。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是希望的。
用于胃肠外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，诸如但不限于渗透促进剂、carder化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可从各种组分中生成，所述组分包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。
可方便地以单位剂型给出的本发明的药物制剂可根据制药工业中熟知的常规技术来制备。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且密切地结合，并且然后，如果必要，使产物成形来制备制剂。
本发明的组合物可被配制成许多可能的剂型中的任何一种，诸如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂、气溶胶和灌肠剂。本发明的组合物还可被配制成水性、非水性或混合介质中的混悬液。水性混悬液还可包含增加混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬液还可包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可被配制为泡沫并作为泡沫使用。药物泡沫包括诸如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、果冻和脂质体的制剂。虽然本质上基本类似，但这些制剂的组分和最终产品的稠度有所不同。在细胞水平上增强寡核苷酸摄取的试剂也可加入到本发明的药物组合物和其他组合物中。例如，阳离子脂质(诸如lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(诸如聚赖氨酸)也增强了寡核苷酸的细胞摄取。
本发明的组合物可另外地包含药物组合物中常规存在的其他辅料组分。因此，例如，组合物可包含另外的、相容的药学活性材料，诸如例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可包含有用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的另外材料，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在加入时不应该过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以是灭菌的，并且如果希望，与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，所述助剂不会与制剂的核酸有害地相互作用。
本发明的组合物可包含本领域已知的赋形剂。用于疫苗制剂的赋形剂的实例诸如佐剂、稳定剂、防腐剂和来自疫苗制造方法的痕量产品包括但不限于：氢氧化铝、氨基酸、苄索氯铵、甲醛或福尔马林、无机盐和糖、维生素、天冬酰胺、柠檬酸、乳糖、甘油、柠檬酸铁铵、硫酸镁、磷酸钾、磷酸铝、硫酸铵、酪蛋白氨基酸、二甲基-β环糊精、2-苯氧基乙醇、牛提取物、聚山梨醇酯80、硫酸铝钾、明胶、磷酸钠、硫柳汞、蔗糖、牛蛋白、乳清蛋白水解产物、甲醛或福尔马林、猴肾脏组织、新霉素、多粘菌素B、酵母蛋白、羟基磷酸铝硫酸盐、右旋糖、矿物盐、硼酸钠、大豆蛋白胨、MRC-5细胞蛋白、硫酸新霉素、磷酸盐缓冲液、聚山梨醇酯、牛白蛋白或血清、DNA、硫酸铝钾、无定形羟基磷酸铝硫酸盐、碳水化合物、L-组氨酸、β-丙内酯、氯化钙、新霉素、卵清蛋白、氯化钾、磷酸钾、磷酸钠、牛磺酸脱氧胆酸钠、卵蛋白、庆大霉素、氢化可的松、辛基酚聚醚(Octoxynol)-10、α-生育酚琥珀酸酯、脱氧胆酸钠、磷酸钠、β-丙内酯、聚氧乙烯910、壬基酚(Triton N-101、辛基酚聚醚9)、辛基酚聚醚-9(Triton X-100)、鸡肾脏细胞、卵蛋白、硫酸庆大霉素、谷氨酸一钠、蔗糖磷酸谷氨酸缓冲液、小牛血清蛋白、链霉素、小鼠血清蛋白、鸡胚胎成纤维细胞、人血白蛋白、山梨糖醇、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、山梨糖醇、蔗糖、磷酸二氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、苯酚、酚红(苯酚磺酞)、两性霉素B、鸡蛋白、氯四环素、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、谷氨酸钾、细胞培养基、柠檬酸钠、磷酸二氢钠一水合物、氢氧化钠、碳酸钙、D-葡萄糖、葡聚糖、硝酸铁(III)、L-胱氨酸、L-酪氨酸、硫酸镁、碳酸氢钠、丙酮酸钠、黄原胶、蛋白胨、磷酸二钠、磷酸二氢钠、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsilozone)、十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸、酪蛋白、半乳糖、硬脂酸镁、甘露醇、水解猪明胶、弗氏乳化油佐剂(完全和不完全)、Arlacel A、矿物油、乳化花生油佐剂(佐剂65)、肉芽肿棒状杆菌来源的P40组分、脂多糖、分枝杆菌及其组分、霍乱毒素、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)、角鲨烯和氯化钠。
疫苗或免疫原性组合物可用于给哺乳动物宿主，具体是人、非人灵长类动物、猿、猴、马、牛、水牛、山羊、鸭、蝙蝠或其他合适的非人宿主进行疫苗接种。剂量可包括至少10IFU、101IFU、102IFU、103IFU、104IFU、5x104 IFU、105IFU、5x105IFU、106IFU、5x106IFU、107IFU、5x107 IFU、108IFU或5x108 IFU的所述活减毒ZIKV毒株。在一些例子中，受试者可为免疫力低的或可具有另一种状况，例如可以是妊娠的。
定义
ZIKV基因组的“3’UTR”或“3’非翻译区”或“3’端非翻译区”对应于紧接在基因组多蛋白的翻译终止密码子之后的RNA区段。
“佐剂”是指增强免疫应答的物质，例如针对特定试剂(例如抗原或感染因子)的抗体或细胞介导的免疫应答。
“减毒”或“活减毒”病毒株是指具有降低或没有毒力或对引起通常与“野生型”或“未修饰的”(或在这种情况下“非突变的”)病毒相关的疾病或感染的倾向性降低或没有倾向性的突变或修饰或重组的病毒。
“减毒”或“活减毒”ZIKV毒株，具体是指经过修饰以具有降低或没有毒力或对引起通常与“野生型”或“未修饰的”或“非突变的”病毒相关的疾病或感染的倾向性降低或没有倾向性的ZIKV毒株，所述疾病或感染具体是先天性ZIKV综合征或GBS。更具体地，这包括“减毒的”ZIKV毒株，所述毒株被“修饰”或“改变”或“突变”以具有ZIKV基因组的3’UTR的一个或多个缺失，例如3’UTR的10个核苷酸、20个核苷酸或30个核苷酸缺失，优选地10个核苷酸缺失。缺失可不破坏RNA翻译。缺失可减缓RNA产生并增加干扰素-β易感性。此类活减毒ZIKV毒株引发针对病毒的免疫保护，即维持重要的免疫原性表位。
“异源”意指来自与其进行比较的实体的其余部分在遗传上相异的实体。例如，可通过基因工程技术将多核苷酸置于来自不同来源的质粒或载体中，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中去除并与除天然序列以外的编码序列可操作地连接的启动子为异源启动子。本发明的多核苷酸可包含另外的序列，诸如相同转录单元内的另外编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点、受相同或不同启动子控制的另外转录单位、允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列、以及可希望提供本发明实施方案的任何此类构建体。
本文的“免疫原性组合物”是指含有根据本发明的活减毒ZIKV毒株的组合物，所述组合物在易感宿主中引发免疫应答，例如抗体、Th1或细胞(例如，T细胞介导的)免疫应答。
“分离的”生物组分(诸如分离的细菌或核酸)是指基本上与其环境或天然存在组分的生物体细胞中的其他生物组分分离或纯化的组分，所述其他生物组分例如，其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂合体。所述术语还包括RNA/DNA杂合体。以下内容为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团诸如氟代核糖和硫醇盐，以及核苷酸分支。核苷酸的序列可在聚合后，诸如通过缀合，用标记组分来进一步修饰。在本定义中包括的其他类型的修饰是加帽(cap)、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入将多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的方式。多核苷酸可以通过化学合成获得或来自微生物。术语“基因”广泛用于指与生物功能相关的任何多核苷酸段。因此，基因包括如在基因组序列中的内含子和外显子，或仅包括如在cDNA中的编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，并且所述核酸片段包括调节序列。
“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是指在配制期间和/或允许储存期间常规用于免疫原性组合物或疫苗组合物中的化合物或材料。
根据本发明的活减毒ZIKV毒株的“预防有效量”是指足以预防或降低易感宿主中感染发生率的量。
术语“重组”意指具有半合成或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸在天然界中不存在或以天然界中未发现的排列与另一种多核苷酸连接。
本文的“易感宿主”是指可被ZIKV感染的宿主或动物。此类宿主包括人或动物，例如人、非人灵长类动物、猿、猴、马、牛、水牛、山羊、鸭、蝙蝠或其他合适的非人宿主。
根据本发明的活减毒ZIKV毒株的“治疗有效量”是指足以治疗易感宿主中与其相关的ZIKV感染或疾病的量。
本文的“疫苗”组合物是指含有根据本发明的活减毒ZIKV毒株的组合物，所述组合物引发针对ZIKV的治疗性或预防性免疫应答。
本文的“ZIKV感染”或“由ZIKV引发的感染”是指用ZIKV和与其相关的疾病感染易感宿主，所述疾病包括先天性ZIKV综合征和格林-巴利综合征(GBS)。
提供以下实施例来说明，但不限制要求保护的发明。
实施例
实施例1：产生具有3’UTR缺失的活减毒ZIKV毒株
材料和方法：
病毒：如先前所述，从感染性cDNA克隆物pFLZIKV生成ZIKV柬埔寨毒株FSS13025(GenBank号KU955593.1)(参考文献10)。所有细胞系均检测为支原体阴性。
质粒构建。针对所有质粒构建，进行标准分子生物学程序。进行标准重叠PCR以使用对应的引物对扩增独特限制酶位点EcoRI与ClaI之间的DNA片段。通过EcoRI和ClaI，将含有3’UTR缺失突变的DNA片段单独引入pFLZIKV和pZIKV Rep中(复制子cDNA质粒，参考文献11)。通过DNA测序证实所有的构建体。根据要求可获得引物序列。所有限制酶均购自NewEngland BioLabs(Ipswitch,MA)。
结果：
我们选择追求活减毒疫苗，以利用其单剂量免疫、快速强烈的免疫应答以及长期保护的优势。我们通过使病毒基因组的3’非翻译区(3’UTR)的一部分缺失来减弱野生型(WT)ZIKV，因为这种方法已成功用于开发目前处于III期临床试验的DENV疫苗(参考文献9)。使用ZIKV柬埔寨毒株FSS13025的感染性cDNA克隆物(参考文献10)(与现在在美洲流行的毒株密切相关)，我们制备了一组含有相异3’UTR缺失的重组病毒(图1A)。突变体10个核苷酸缺失、20个核苷酸缺失、30个核苷酸缺失-a和30个核苷酸缺失-b包含重叠的10至30个核苷酸缺失，这预计会改变病毒3’UTR的局部二级结构(图2)。
实施例2：ZIKV 3’UTR缺失突变体的复制和IFN-β抑制分析
材料和方法：
细胞和抗体。Vero细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC,Bethesda,MD)，并维持在37℃、5％CO2下补充有10％胎牛血清(FBS)(HyClone Laboratories,Logan,UT)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的高葡萄糖杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。本研究使用了以下抗体：与黄病毒E蛋白(ATCC)交叉反应的小鼠单克隆抗体(mAb)4G2；ZIKV特异性HMAF(超免疫腹水)，位于德克萨斯大学医学分部的新兴病毒和虫媒病毒世界参考中心(World Reference Center of Emerging Viruses andArboviruses)(WRCEVA)；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体(KPL,Gaithersburg,MD)和与Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific)。
RNA转录和转染。使用来自ClaI预线性化的cDNA质粒的T7 mMessage mMachine试剂盒(Ambion,Austin,TX)体外转录全基因组ZIKV、mCherry ZIKV和复制子RNA。用氯化锂沉淀RNA，用70％乙醇洗涤，重新悬浮于无RNA酶的水中，通过分光光度法进行定量，并以等分试样储存在-80℃下。按照先前描述的方案将RNA转录物(10μg)电穿孔到Vero细胞中(参考文献31)。
间接免疫荧光测定(IFA)。用10μg ZIKV的基因组野生型或3’UTR缺失RNA电穿孔Vero细胞，并在8孔Lab-Tek室载玻片(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中生长。在转染后第2天和第3天，将细胞在-20℃下在100％甲醇中固定15分钟。在含有1％FBS和0.05％吐温-20的PBS封闭缓冲液中孵育1小时后，用小鼠单克隆抗体4G2处理细胞1小时，并用PBS洗涤三次(每次洗涤5分钟)。然后将细胞与Alexa 488山羊抗小鼠IgG在封闭缓冲液中一起孵育1小时，之后用PBS洗涤细胞三次。将细胞封固在具有DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；Vector Laboratories,Inc.)的封固剂(mounting medium)中。在配备有视频记录系统(Olympus)的荧光显微镜下观察荧光图像。
突变病毒的免疫染色集落测定。将从其对应的感染性cDNA克隆物转录的等量RNA(10μg)电穿孔到Vero细胞中。在转染后的第4天或第5天，收获来自转染细胞的培养液，并使用免疫染色集落测定在Vero细胞上定量感染性病毒(定义为P0病毒)。
免疫染色集落测定和免疫染色。将病毒样品在DMEM中连续稀释10倍6次。对于每次稀释，将100μl样品加入到含有Vero细胞的24孔板中，汇合度为约90％。将感染的细胞孵育1小时，并每15分钟旋转以确保完全覆盖单层以用于均匀感染。在1小时孵育后，将0.5ml的含有2％FBS 1％青霉素/链霉素的甲基纤维素覆盖层加入到每个孔中。在37℃下孵育所述板，持续4天。孵育后，去除甲基纤维素覆盖层，并将0.5ml甲醇-丙酮(1:1)溶液加入到每个孔中，并在室温下孵育15分钟。吸出固定溶液并使所述板风干，然后用PBS洗涤三次，并在封闭缓冲液(补充有3％FBS的PBS)中孵育，接着与ZIKV特异性HMAF一起孵育1小时。用PBS洗涤板三次，接着与缀合辣根过氧化物酶的二抗(KPL,Gaithersburg,MD)一起孵育一小时。加入根据供应商的说明书制备的氨基乙基咔唑底物(ENZO Life sciences,Farmingdale,MA)进行检测。
荧光素酶测定。如先前所报道进行荧光素酶测定(参考文献11)。简单地说，将用野生型或突变ZIKV复制子RNA(10μg)转染的Vero细胞种在12孔板中。在各种时间点下，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞一次，并使用细胞裂解缓冲液(Promega,Madison,WI)裂解。从板上刮下细胞并储存在-80℃下。根据制造商的说明，通过Cytation 5(Biotek)测量荧光素酶信号。
复制曲线。用感染复数(MOI)为0.01的野生型或突变P0 ZIKV感染24孔板(每孔2×105个细胞)中的近汇合Vero细胞，在三个孔中重复进行。将病毒原种在含有2％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中稀释。将100微升病毒加入到12孔板的每个孔中。在附着1小时(在37℃下5％CO2)后，去除接种物，用PBS洗涤单层三次，并将含有2％FBS和1％青霉素/链霉素的1ml DMEM培养基加入到每个孔中。使用免疫染色集落测定，在第1至5天定量培养液的感染性病毒。
3’UTR缺失的复制子分析。用各种3’UTR缺失工程化ZIKV的海肾荧光素酶报告基因复制子。将等量的复制子野生型RNA和突变RNA(10μg)电穿孔到Vero细胞中。在数个时间点测量荧光素酶信号。包括含有NS5聚合酶失活的GDD突变的非复制性复制子作为阴性对照。
野生型ZIKV和突变ZIKV的干扰素-β抑制。在干扰素治疗和病毒感染前一天，将Vero细胞种在96孔板(每孔1.5×104个细胞)中。在IFN-β(55、167、500或1,500IU/ml)存在下，以MOI 0.05感染细胞。同时开始病毒感染和干扰素治疗。在感染和干扰素-β治疗后48小时，使用免疫染色集落测定在Vero细胞上定量病毒滴度。
结果：
转染到Vero细胞中之后，所有突变基因组RNA产生病毒E蛋白表达细胞(图3)和感染性病毒(定义为P0病毒)。与野生型比较，所有突变体表现出更小的感染性病灶(图1B)、更慢的复制动力学以及更低的峰值滴度(图1C)。为了检查对病毒复制的突变作用，我们将缺失工程化到荧光素酶ZIKV复制子中(参考文献11)。复制子结果表明，3’UTR缺失不影响病毒RNA翻译(由转染后2-6小时荧光素酶信号指示)，但RNA合成减少(由转染后24-48小时荧光素酶活性指示；图1D和图1E)；先前报道了西尼罗河病毒(一种密切相关的黄病毒)的类似观察结果(参考文献12)。由于黄病毒的3’UTR也可调节宿主先天免疫应答(参考文献13,14)，我们比较了野生型病和突变病毒对干扰素抑制的易感性。与野生型病毒相比，所有四种突变病毒对干扰素-β抑制更敏感，其中突变体10个核苷酸缺失表现出最大的抑制(图1F)。总体来说，这些结果表明3’UTR缺失通过减少病毒RNA合成并增加对I型干扰素抑制的易感性来减弱ZIKV复制。
实施例3：突变病毒的稳定性
材料和方法：
3’UTR突变体的稳定性、RNA提取以及RT-PCR。为了检查3’UTR突变体的稳定性，我们将它们在Vero细胞上传代5轮(每轮培养5天)。简单地说，将1.5×106个Vero细胞种到T-25烧瓶中。来自RNA转染的病毒(定义为P0)用于感染Vero细胞。在感染后的第5天，将培养液(100μl)转移到含有5ml培养基中的Vero细胞的新T-25烧瓶中。在五轮这种传代(P5)后，使用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)从P5培养液中提取病毒RNA。使用SuperScript III一步法RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，通过RT-PCR扩增病毒RNA。对P5病毒进行完整的基因组长度测序。针对每种突变病毒进行三次独立传代。
免疫染色集落测定。使用免疫染色集落测定，在Vero细胞上分析野生型病毒和P5突变病毒。针对每种突变病毒，在Vero细胞上进行三次独立选择。
复制动力学。用感染复数(MOI)为0.01的野生型病毒和P5突变病毒感染24孔板(每孔2×105个细胞)中的近汇合Vero细胞，在三个孔中重复进行。将病毒原种在含有2％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中稀释。将100微升病毒加入到12孔板的每个孔中。在附着1小时(在37℃下5％CO2)后，去除接种物，用PBS洗涤单层三次，并将含有2％FBS和1％青霉素/链霉素的1ml DMEM培养基加入到每个孔中。使用免疫染色集落测定，在第1至5天在Vero细胞上定量培养液的感染性病毒。
结果：
为了测试突变病毒的稳定性，我们将它们在Vero细胞(用于疫苗生产的批准的细胞系，参见参考文献15)上传代5次。与对应的P0病毒相比，第5代(P5)病毒在Vero细胞上出现更大的感染性病灶(图4A)和更快的复制动力学(比较图4B与图1C)。P0病毒和P5病毒的完整基因组测序表明，所有突变体保留了原始缺失，但P5病毒在E基因和/或NS1基因中积累了另外的突变，这可能是Vero细胞适应性突变和/或3’UTR缺失补偿性突变(图4C)。在一些实施方案中，可将这些突变引入感染性cDNA克隆物中用于疫苗生产。无论哪种方式，结果表明，当在Vero细胞上繁殖时，工程化的缺失是稳定的，并且突变病毒在Vero细胞上进一步传代至P20不会改变工程化的3’UTR缺失。
实施例4：A129小鼠模型中3’UTR突变体的表征。
材料和方法：
小鼠的疫苗接种和攻击。通过皮下(subcutaneous)(皮下(S.C.))途径用1×104IFU野生型病毒和突变病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝8)。通过相同途径给予模拟感染的小鼠PBS。称重小鼠并每天监测疾病的进展。将小鼠麻醉并每两天通过眶后窦(retroorbital sinus)(眶后(R.O.))放血。从感染后第2天至第4天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。在免疫后第28天，将小鼠麻醉并放血以使用mCherry ZIKV感染测定来测量中和抗体滴度。然后通过腹膜内(intraperitoneal)(腹膜内(I.P.))途径，用1×105PFU亲代病毒(ZIKV毒株FSS13025)攻击接种疫苗的小鼠。在攻击后第2天，将小鼠放血以测量病毒血症。收集后，通过在3,380×g下离心5分钟使血液澄清，并立即储存在-80℃下。如上所述，通过在Vero细胞上进行的免疫染色集落测定来确定血清和接种物的病毒滴度。所有动物测试均根据UTMB IACUC批准的UTMB政策进行。
mCherry ZIKV的构建。将编码C基因、mCherry基因和口蹄疫病毒2A蛋白的前25个氨基酸的DNA片段与ZIKV基因组的开放阅读框框内融合。在转染后第2-6天，通过荧光显微镜分析转染的Vero细胞中mCherry的表达。mCherry ZIKV用于估计小鼠血清的抗体中和滴度。
抗体中和测定。使用新建立的mCherry ZIKV评价小鼠血清的中和活性。在具有2％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中，以1:100开始对血清进行2倍地连续稀释。将小鼠血清的系列稀释液与mCherry ZIKV在37℃下一起孵育2小时。将抗体-病毒复合物加入96孔板中的预种Vero细胞中。感染后48小时，使用Cytation 5细胞成像多模式读数器(Biotek)通过荧光显微镜对细胞进行可视化，以定量mCherry荧光阳性细胞。非处理对照中的荧光阳性细胞的百分比设定为100％。将来自血清处理的孔的荧光阳性细胞归一化为非处理对照的那些。使用软件GraphPad Prism 7中的四参数S形(逻辑)模型来计算中和滴度(NT50)。
结果：
我们评估了突变病毒在A129(干扰素α/β受体缺陷型)小鼠模型中的免疫原性和功效(参考文献16)(图5A)。用1×104IFU病毒皮下(S.C.)接种后，用野生型病毒感染的小鼠比用突变病毒感染的小鼠具有更显著的体重减轻；而四种突变病毒感染组之间平均体重减轻的差异并不是统计学显著的(图5B)。约50％的小鼠死于野生型病毒感染，而在突变病毒感染的小鼠中未观察到死亡(图5C)。野生型病毒比突变病毒产生显著更高的峰值病毒血症，其中10个核苷酸缺失病毒具有最低的病毒血症特性(图5D)。在感染后第5天、第6天和第7天，10个核苷酸缺失突变体的病毒血症分别降至700IFU、350IFU和不可检测。测序分析证实，在从小鼠血清中回收的突变病毒中保留了工程化的缺失而没有其他突变。在感染后第28天，取得小鼠血清并使用mCherry ZIKV定量攻击前中和滴度(图6)。在野生型和突变病毒感染的小鼠中观察到可比较的攻击前中和滴度(1.8±1.1)×103至(8.6±1.5)×103(图5E)。在免疫后第28天用1×105IFU的野生型ZIKV(柬埔寨毒株FSS13025)攻击后，免疫小鼠具有不可检测的外周病毒血症，而在攻击后第2天模拟免疫组产生(8.5±1.5)×106IFU/ml的平均病毒血症(图5F)。在攻击后第28天，我们再次测量了小鼠血清的中和滴度；值得注意的是，攻击后中和滴度相当于攻击前中和滴度(比较图5E和图5G)，这表明通过单次疫苗接种已实现了消除性抗体应答。总之，结果证明了突变病毒在A129小鼠中为高度减毒的、免疫原性的和保护性的。
实施例5：10个核苷酸缺失突变ZIKV的进一步表征
材料和方法：
病毒。Puerto Rico毒株PRVABC59(GenBank号KU501215)获自WRCEVA。所有细胞系均检测为支原体阴性。
用100IFU 10个核苷酸缺失病毒免疫。通过皮下途径，用100IFU的野生型或10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。从第2天至第6天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。同样在免疫后第28天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击小鼠。在攻击后第2天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。
用10IFU 10个核苷酸缺失病毒免疫。通过皮下途径，用10IFU的野生型或10个核苷酸缺失ZIKV免疫三周龄A129小鼠(针对每种病毒n＝2)。在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。在同一天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击小鼠。在攻击后第2天，使用免疫染色集落测定定量病毒血症。
结果：
由于10个核苷酸缺失病毒在小鼠中产生了最低的病毒血症(图5D)，但也诱导了与野生型和其他突变体可比较的中和抗体应答(图5E-5G)，我们优先考虑这种突变体用于进一步表征。在100IFU的剂量下，10个核苷酸缺失病毒感染的小鼠示出延迟的峰值病毒血症，其比野生型病毒低>100倍(图7A)。野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒诱导相当水平的攻击前中和滴度(图7B)，在用1×106IFU的Puerto Rico ZIKV毒株PRVABC59攻击后导致完全防止病毒血症(图7C)。此外，即使当仅以10IFU的剂量免疫时，10个核苷酸缺失病毒感染的小鼠产生(9.7+6.8)×103的中和滴度，并且在攻击后完全防止病毒血症(图8)。
值得注意的是，用不同剂量的10个核苷酸缺失突变体(10、102和104IFU)免疫的小鼠诱导类似的中和抗体滴度并在攻击后完全预防病毒血症(比较图5与图7和图8)。
总体来说，这些结果证明10个核苷酸缺失病毒是一种有效的候选疫苗。
实施例6：P0和P5 10个核苷酸缺失病毒的比较
材料和方法：
用P0或P5 10个核苷酸缺失病毒免疫：通过皮下途径，用100IFU的P0或P5 10个核苷酸缺失病毒免疫三周龄A129小鼠(n＝5)。从第4天至第6天，通过免疫染色集落测定定量病毒血症。
攻击前中和抗体滴度：在免疫后第28天，定量小鼠血清的ZIKV中和抗体滴度。
用野生型ZIKV攻击后的病毒血症：在免疫后第28天，通过腹膜内途径用1×106IFU的ZIKV流行病毒株(Puerto Rico毒株PRVABC59)攻击小鼠。在攻击后第2天，使用免疫染色集落测定定量病毒血症。
结果：
由于P5病毒累积了Vero细胞适应性突变(图4C)，我们比较了A129小鼠中P0和P510个核苷酸缺失病毒之间的毒力和免疫原性。在通过皮下途径用100IFU病毒免疫后，P0和P5病毒产生可比较的病毒血症并诱导相当的中和滴度(图11A和图11B)。通过腹膜内途径用1×106IFU的Puerto Rico毒株PRVABC59 ZIKV攻击后，在P0或P5病毒疫苗接种的小鼠中未检测到病毒血症；相反，在假对照组中检测到强烈的病毒血症(图11C)。这些结果表明，从P5病毒中回收的Vero细胞适应性突变不会显著影响10个核苷酸缺失病毒的毒力和免疫原性。
实施例7：用10个核苷酸缺失ZIKV免疫的A129小鼠中的T细胞应答
材料和方法：
测量A129小鼠中的T细胞应答。用1×104IFU野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒感染A129小鼠。在感染后第28天，收获小鼠脾脏。计数脾细胞，用野生型ZIKV离体培养24小时，并且对标志物(IFN-γ、CD3和CD4或CD8)染色。基于这些标志物的染色对T细胞进行门控，计数CD4+IFN-γ+细胞和CD8+IFN-γ+细胞的百分比，并记录每个脾脏的T细胞亚群的平均总数。在野生型ZIKV再刺激后第2天收获来自离体培养物的上清液，并且测量IFN-γ和IL-2的产生。
Bio-Plex免疫测定。将大约3×105个脾细胞置于96孔板中，并用1.25×104IFUZIKV毒株FSS13025刺激48小时。收获培养物上清液并使用Bio-Plex Pro小鼠细胞因子测定(Bio-Rad,Hercules,CA)来测量细胞因子产生。
细胞内细胞因子染色(ICS)。用1×105IFU活ZIKV(毒株FSS13025)刺激大约2.5×106个脾细胞24小时。在刺激的最后5小时期间，加入BD GolgiPlug(BD Bioscience)以阻断蛋白质运输。用针对CD3、CD4或CD8的抗体染色细胞；固定在2％多聚甲醛中，并在加入抗IFN-γ或对照大鼠IgG1(e-Biosciences)之前用0.5％皂苷渗透化。用C6流式细胞仪仪器处理样品。基于前散射和侧散射排除死细胞。用CFlow Plus流式细胞仪(BD Biosciences)分析数据。
结果：
我们分析了用1×104IFU的野生型病毒和10个核苷酸缺失病毒免疫的A129小鼠中的T细胞应答。在免疫后第28天，在体外用活野生型病毒再刺激ZIKV特异性T细胞，并使用细胞内细胞因子染色(ICS)测定和Bio-Plex免疫测定进行分析。结果表明，与模拟免疫组相比，野生型和突变病毒免疫CD4+和CD8+ T细胞均具有更高的IFN-γ应答(图9A和图9B)。此外，这些免疫T细胞比模拟组诱导更多的IFN-γ(图9C)和IL2(图9D)；具体地说，10个核苷酸缺失突变体免疫T细胞产生比野生型病毒免疫组高4倍的IFN-γ。这些结果表明，10个核苷酸缺失候选疫苗诱导强烈的T细胞应答。
实施例8：10个核苷酸缺失候选疫苗的安全性
材料和方法：
器官病毒滴度。通过皮下途径进行1×104IFU的野生型和10个核苷酸缺失病毒疫苗接种后，在感染后第6天和第10天收获心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、脑、睾丸和眼睛。使用如上所述的免疫染色集落测定进行器官滴定。简单地说，将500μl具有2％FBS和青霉素/链霉素的DMEM连同钢滚珠一起置于2ml微量离心管(Eppendorf tube)中。器官(全部或部分)置于管中。称重管，并通过减去管重量来确定器官重量。将组织在QiagenTissueLyser II中以26p/秒振荡5分钟进行均质化。通过在12,000rpm下离心5分钟来澄清均质物，并使用免疫染色集落测定在Vero单层上滴定。然后针对体积和器官重量调整滴度，以IFU/g报道器官载量(参考文献16)。
新生CD1小鼠上的神经毒力。将1日龄远交CD1小鼠组(n＝7–10)用野生型或10个核苷酸缺失从10,000IFU至10IFU的连续10倍稀释液颅内(I.C.)注射。每天监测小鼠的发病率和死亡率。
用ZIKV对蚊子进行的实验性感染。将来自德克萨斯州加尔维斯顿居住地的埃及伊蚊暴露于覆盖有小鼠皮肤的血餐中45分钟，所述血餐由1％(重量/体积)蔗糖、20％(体积/体积)FBS、5mM ATP、33％(体积/体积)PBS洗涤的人血细胞(UTMB血库)和33％(体积/体积)DMEM培养基组成并组合Hemotek 2ml加热储液囊(reservoir)(Discovery Workshops)中提供的1ml病毒。血餐中的病毒滴度为1×106IFU/ml。将感染性血餐装在含有埃及伊蚊的纸箱上。将完全饱血的蚊子在28℃、80％相对湿度下，在12:12小时光照：黑暗循环中孵育，随意接触10％蔗糖溶液7天，并通过在-20℃下冷冻3小时收获。将全部的蚊子在具有20％FBS和250μg/ml两性霉素B的DMEM中单独均质化(Retsch MM300均质机，Retsch Inc.，Newton，PA)并储存在-80℃下。将样品在5,000rpm下离心10分钟，并当75μl每种样品上清液用冰冷的丙酮和甲醇(1:1)溶液的混合物固定并如上所述进行免疫染色时，将它们在37℃和5％CO2下接种到含有Vero细胞的96孔板中3天。通过检测均质蚊子中的病毒来确定感染。将感染率记录为阳性蚊子除以饱血孵育蚊子总数的分数。
睾丸和精子计数分析：用1×104IFU的野生型病毒或10个核苷酸缺失突变病毒感染A129小鼠。包括具有PBS的模拟感染组作为阴性对照。在感染后第16天，使小鼠安乐死并进行尸体剖检；如先前所述立即收获附睾和睾丸(参考文献32)。简单地说，将附睾置于37℃下的1ml预温热的M2培养基中。为了释放精子，将附睾纵向切割六次并孵育10分钟，在37℃下每2分钟进行搅拌。孵育后，将含有精子的培养基立即以1:50稀释到预温热的M2培养基中，并在血细胞计数器上计数。活动精子分为前向运动的和非前向运动的。前向运动的活动精子被描述为通过鞭毛运动进行头部连续移位。非前向运动的活动精子被描述为几乎没有通过鞭毛运动进行头部移位。在非活动精子中，观察不到鞭毛运动。
结果：
进行三组实验以分析10个核苷酸缺失候选疫苗的安全性。首先，我们用1×104IFU的野生型病毒或10个核苷酸缺失病毒皮下接种A129小鼠后测量了不同器官中的病毒载量(图10A)。在感染后第6天，野生型感染的小鼠在所测试的所有器官中均具有高病毒载量，而10个核苷酸缺失感染的小鼠在肌肉或脑中不具有病毒，并且在心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和眼睛中具有较低的病毒载量。在感染后第10天，野生型病毒感染的小鼠在肾脏、脑、睾丸和眼睛中保留了病毒载量，其中睾丸具有最高的平均滴度；相反，在来自10个核苷酸缺失感染的小鼠的任何器官中均没有检测到病毒(<102IFU/mL)。由于报道了ZIKV感染会损害小鼠的睾丸(参考文献17、18)，我们检查了免疫对A129小鼠中睾丸功能的作用。在免疫后第16天，从模拟感染、野生型病毒感染和10个核苷酸缺失突变体感染的小鼠中回收类似重量和大小的睾丸。然而，当与模拟组相比时，野生型病毒感染的小鼠中运动精子计数和总精子计数减少，而10个核苷酸缺失病毒感染的小鼠并没有显著损害精子计数(图12)。
第二，我们通过颅内(I.C.)注射一日龄CD1小鼠来检查10个核苷酸缺失病毒的神经毒力(图10B)。新生小鼠以剂量反应方式死于野生型病毒感染；甚至10IFU的剂量也导致25％死亡率。值得注意的是，用10个核苷酸缺失病毒感染的小鼠即使在1×104IFU的剂量下也没有显示出任何明显的疾病或死亡。最后，我们确定10个核苷酸缺失病毒是否可以感染埃及伊蚊，这是美洲ZIKV的主要传播载体(参考文献19、20)。在暴露于含有1×106IFU/ml的野生型或10个核苷酸缺失病毒的人造血餐并孵育7天后，56％的饱血蚊子被野生型病毒感染，而没有蚊子被10个核苷酸缺失突变体感染。此外，对蚊子进行的胸内(intrathorax)注射10个核苷酸缺失病毒在注射后第7天并没有产生任何感染性病毒。总体来说，我们的结果证明，10个核苷酸缺失病毒显著减少或消除了小鼠器官中的病毒载量，使神经毒力降低>1,000倍，并且减弱了其感染主要城市蚊子载体的能力，所有这些均表明了优良的安全特性。
我们的数据表明，3’UTR 10个核苷酸缺失ZIKV是一种有前途的活减毒候选疫苗，其在免疫原性与安全性之间取得了良好的平衡。单次免疫引发强烈的抗体应答和T细胞应答，并且显著地与迄今公布的亚单位和灭活的ZIKV疫苗不同，可能诱导消除性免疫力(sterilizing immunity)并提供针对ZIKV亲代株和流行株的完全保护。疫苗诱导的消除性免疫力对于成功的ZIKV疫苗预防病毒血症和先天性异常可能是至关重要的。这种候选疫苗的安全特性突出显示在以下方面：在严重A129小鼠模型中的低病毒血症、器官中的少量和短暂的病毒载量以及有限的体重减轻，以及接受颅内(I.C.)注射后1日龄小鼠中完全缺乏发病率和死亡率。后者的安全性结果令人印象深刻，因为用YFV 17D和JEV SA14-14-2(两种获得许可的活减毒黄病毒疫苗)颅内接种导致1日龄新生小鼠致死性疾病(参考文献21、22)。虽然野生型ZIKV与疫苗ZIKV之间潜在的同源重组可对10个核苷酸缺失候选疫苗构成安全性责任，但应注意重组事件很少见，并且在细胞培养中没有检测到(参考文献23-27)。与嵌合的活减毒ZIKV疫苗(例如，表达ZIKV prM-E的YFV 17D或表达ZIKV prM-E的DENV(参考文献28))相比，我们的3’UTR突变疫苗具有保留所有ZIKV结构基因和非结构基因的优势，这可有助于抗病毒保护，如登革热疫苗研究(参考文献29、30)所表明。
与嵌合的活减毒ZIKV疫苗(例如，表达ZIKV prM-E的YFV17D)相比，我们的3’UTR突变疫苗具有保留所有ZIKV结构基因和非结构基因的优势，这可有助于抗病毒保护，如登革热疫苗研究(参考文献29、30)所表明。从机理上来说，3’UTR突变病毒似乎通过减少的病毒RNA合成和增加的对I型干扰素抑制的敏感性来减弱。后一种机理与最近的报道一致，即DENV 3’UTR的遗传多样性有助于流行潜力(参考文献14)。总之，我们的结果表明3’UTR突变ZIKV是一种有吸引力的候选疫苗，其应该进入非人灵长类动物以进一步开发。
表征具有3’UTR缺失的活减毒ZIKV毒株的安全性和功效的另外体内实验
材料和方法：
使用材料和方法以及以下实施例的另外体内系统也用于表征候选疫苗的安全性和功效，包括C57BL/6J小鼠妊娠、A129小鼠睾丸保护、A129小鼠器官中的病毒载量、CD-1小鼠神经毒力以及恒河猴功效(参见下文详述)。先前已经建立了这些实验系统中的每一个的方案(例如，接种物剂量、感染途径、攻击剂量和终点测量)，并且在评估这些候选疫苗时没有改变。因此，根据建立的方案，在不同的体内系统中使用不同的接种物剂量、攻击剂量和终点测量(例如，用于测量病毒RNA的qRT-PCR和用于测量感染病毒的集落形成测定)。详细信息如下所述，并在以下实施例中指示。
小鼠研究：使用小鼠的所有体内实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。方案由华盛顿大学医学院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)(保障号A3381-01)和德克萨斯大学医学分院的IACUC(UTMB；方案号0209068B)批准。在麻醉下进行解剖和爪垫注射，所述麻醉用华盛顿大学的氯胺酮盐酸盐和甲苯噻嗪或UTMB的异氟烷诱导和维持。所有努力都是为了尽量减少动物的痛苦。恒河猴实验由美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的疫苗研究中心动物护理和使用委员会审查和批准。非人灵长类动物实验根据美国国立卫生研究院的相关法规和政策进行。
病毒和细胞：从感染性cDNA克隆物产生ZIKV柬埔寨毒株FSS13025(GenBank号KU955593.1)(参考文献35)。如所描述，生成了ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV和ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV毒株。寨卡Puerto Rico毒株PRVABC59(GenBank号KU501215)和Dakar 41519毒株(GenBank号HQ234501.1)最初获自UTMB的新兴病毒和虫媒病毒世界参考中心(WRCEVA)的Robert Tesh博士。小鼠适应性ZIKV-Dakar 41519毒株在Rag1-/-小鼠(JacksonLaboratories)中传代两次并在先前描述(参考文献29)。Vero细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC CCL-81；Bethesda,MD)，并维持在37℃、5％CO2下具有10％胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories,Logan,UT)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的高葡萄糖杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)中。所有细胞系均检测为支原体阴性。
抗体：在本研究中使用以下抗体：抗小鼠IFNα/β受体1(Ifnar1)单克隆抗体(克隆MAR1-5A3；Leinco Technologies,Inc.，St.Louis,Missouri)；ZIKV特异性HMAF(超免疫腹水；获自WRCEVA)、用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(KPL,Gaithersburg,MD)和与Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific,Providence,RI)。
A129小鼠实验：在UTMB的动物设施中饲养A129小鼠。将所有小鼠均圈养在无病原体的小鼠设施中。用PBS(两个假对照组)、104FFU的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV(Δ10)或103FFU的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV(Δ20)感染三周或15周龄雄性A129小鼠。将小鼠麻醉并通过眶后窦(眶后)放血，以用于病毒血症测试。在免疫后第28天，使用mCherry ZIKV感染测定来测量小鼠的中和抗体滴度(参考文献36)。在同一天，用106FFU的ZIKV PRVABC59攻击PBS免疫小鼠以及Δ10免疫小和Δ20免疫小鼠的一个假对照组。另一个小鼠假对照组用作未受攻击的阴性对照。在免疫后第49天，使小鼠安乐死并进行尸体剖检。如先前所述立即收获附睾和睾丸(参考文献32)。通过显微镜在血细胞计数器上手动计数活动精子和非活动精子。总精子计数等于活动精子和非活动精子的总和。为了定量病毒载量，将睾丸均质化并通过集落形成测定或定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)来测量感染性病毒水平(参考文献36)。
qRT-PCT引物/探针组包括正向引物(1193F：5’-CCGCTGCCCAACACAAG-3’)、反向引物(1269R：5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’)和探针(5’-FAM/AGCCTACCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ-3’)。探针包含5’-FAM报告染料、3’IBFQ猝灭剂和内部ZEN猝灭剂。
小鼠妊娠实验：将C57BL/6J小鼠饲养并圈养在华盛顿大学医学院的无病原体小鼠设施中。免疫前一天，通过腹膜内途径，用0.5mg抗Ifnar1抗体对八周龄雌性C57BL/6J小鼠进行给药。随后，用105FFU的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV或PBS假对照在爪垫中对小鼠进行皮下接种。将免疫的野生型(WT)C57BL/6雌性小鼠与天然野生型雄性小鼠交配。在胚胎第5天(E5)，用2mg的抗Ifnar1抗体腹膜内注射妊娠的母兽。在E6，通过爪垫注射用105FFU的小鼠适应性ZIKV Dakar 41519皮下接种小鼠。在E13处死所有动物并分析胎盘、胎仔和母体组织中的病毒载量。简单地说，收集母体血液、来自母兽的器官(脑和脾脏)和胎仔(胎盘和胎头)。在凝固和离心后制备血清。称重器官并使用珠磨器装置(MagNA Lyser,Roche)均质化。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从血清和组织样品中提取病毒RNA。使用标准循环条件，在ABI 7500快速仪器上通过TaqMan一步法qRT-PCR确定病毒RNA水平。与使用来自已知量的感染性病毒的ZIKV RNA的连续5倍稀释液产生的标准曲线比较后，病毒负担以log10标度表示为每克或每毫升病毒RNA当量。以下引物/探针组用于ZIKV qRT-PCR：正向引物(1183F：5’-CCACCAATGTTCTCTTGCAGACATATTG-3’)、反向引物(1268R：5’-TTCGGACAGCCGTTGTCCAACACAAG-3’)和探针(1213F：5’-56-FAM/AGCCTACCT TGACAAGCAGTC/3IABkFQ-3’)。无论在何处指示，通过在Vero细胞上进行集落形成测定来确定一些样品的病毒负担(参考文献28)。
定量来自A129小鼠的器官中的病毒载量：感染A129小鼠，并使用集落形成测定来定量器官的病毒载量(参考文献28)。睾丸中的病毒RNA也通过qRT-PCR来定量。简单地说，收获睾丸并将其置于具有珠粒的DMEM中用于均质化。均质化后，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)将上清液用于提取病毒RNA。用40μl不含RNA酶的水洗脱提取的RNA。按照制造商的方案，通过使用QuantiTect探针RT-PCR试剂盒(QIAGEN)和10μl RNA模板的50μl反应，在480系统(Roche)上进行qRT-PCR测定。基于使用来自已知量的感染性病毒的ZIKV RNA的连续10倍稀释液产生的标准曲线计算病毒载量。qRT-PCT引物/探针组包括正向引物(1193F：5’-CCGCTGCCCAACACAAG-3’)、反向引物(1269R：5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’)和探针(5’-FAM/AGCCTACCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ-3’)。探针包含5’-FAM报告染料、3’IBFQ猝灭剂和内部ZEN猝灭剂。
疫苗接种非人灵长类动物：在Bioqual,Inc.(Rockville,MD)进行恒河猴(猕猴(Macaca mulatta))实验。所有动物实验均由美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的疫苗研究中心动物护理和使用委员会审查和批准。根据美国实验动物管理认证协会当地、州、联邦和机构政策，在Bioqual Inc的认可的设施中饲养和照顾动物。恒河猴(3-4/组)按体重、性别和年龄随机分组，并用103FFU的亲代野生型ZIKV毒株FSS13025、ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV、ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV或PBS假对照在第0天进行皮下施用。在第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第10天收集血液用于病毒血症测试，并且每周通过mCherry ZIKV中和测定分析抗体应答(参考文献36、38)。在第8周，用103FFU的ZIKV毒株PRVABC59皮下攻击免疫的动物。收集血液样品用于在第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第10天确定病毒载量，并在攻击后第2周、第4周和第6周确定中和抗体。
如前文部分所述，来自恒河猴的病毒血症通过qRT-PCR测定和集落形成测定来定量。针对qRT-PCR定量，按照制造说明书使用QIAamp病毒RNA试剂盒(QIAGEN)从恒河猴血清中提取病毒RNA。用40μl不含RNA酶的水洗脱提取的RNA。如上所述进行qRT-PCR测定。体外转录的全长ZIKV RNA用作qRT-PCR定量的标准。引物/探针组在前文部分中描述。
中和测定和神经毒力：如先前所报道，使用mCherry ZIKV确定所有抗体中和滴度(参考文献36)。给出了中和50％的mCherry ZIKV感染(NT50)的稀释倍数。为了测量神经毒力，用指定量的病毒颅内注射1日龄远交CD-1小鼠(查尔斯河)。如先前所报道，监测感染的小鼠的发病率和死亡率(参考文献36)。
蚊子感染：为了测量蚊子感染，使用掺有106FFU/ml的指定病毒的人造血餐来喂食埃及伊蚊(来自德克萨斯州加尔维斯顿)，并将饱血的蚊子在28℃、80％相对湿度下，在12:12小时光照:黑暗循环中孵育，随意接触10％蔗糖。如先前所报道，在喂食后第7天确定感染率(参考文献10)。
数据分析：来自这些实验的所有数据，其结果在随后的实施例中描述并包含在其中引用的附图中，用GraphPad Prism v7.02软件进行分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用曼-惠特尼检验或具有多重比较校正的单向ANOVA进行组的比较。P值<0.05指示统计学显著的。
实施例9：预防妊娠小鼠的垂直传播。
测试本文描述的包含ZIKV基因组的3’UTR的10个核苷酸缺失的活减毒候选疫苗(ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV)的预防在子宫内传播的能力。在这些实验中，我们将105个病灶形成单位(focus-forming unit)(FFU)的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV或PBS假对照皮下接种到8周龄野生型C57BL/6雌性小鼠中(图13A)。因为小鼠不是ZIKV的天然宿主，部分原因是物种依赖性缺乏I型IFN信号传导的拮抗作用(参考文献39、40)，我们在疫苗接种前一天给雌性小鼠施用0.5mg的抗Ifnar1封闭抗体，以促进ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的瞬时复制并试图产生疾病(参考文献41)。在疫苗接种后第28天，对动物进行静脉切开术并分析血清的中和抗体(图13B)；所有ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的小鼠均出现18,900±5,900(平均值±标准偏差；n＝13)高的中和抗体滴度，而正如所预期的，PBS免疫的动物未出现可检测的中和抗体(图13C)。在疫苗接种后第35天，将免疫的雌性与12周龄野生型(WT)C57BL/6雄性小鼠交配并监测阴道栓(图13A)。在胚胎第6天(E6)，用105FFU的小鼠适应性病原性ZIKV非洲毒株Dakar41519(参考文献42)皮下攻击妊娠小鼠；为了促进ZIKV-Dakar向母体蜕膜和胎仔胎盘的传播，在攻击前一天，在E5给妊娠小鼠施用2mg的抗Ifnar1抗体。在E13，收获母体器官和胎仔器官并测量病毒载量。
单次免疫后，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV分别使母体脾脏和脑的中值病毒载量减少大约49,000倍和大约120倍(图13D-E)。与PBS免疫的母兽相比时，来自接种疫苗的母兽的胎盘和胎头分别示出病毒RNA载量减少138,000倍和260倍(图13F-G)。值得注意的是，来自ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的母兽的30个胎盘中有21个(70％)和30个胎头中有21个(70％)具有等于或低于检测限的病毒RNA载量；通过来自接种疫苗的母兽的胎盘或胎头的集落形成测定没有回收到感染性病毒(图17A-B)。此外，EC50值与胎盘中回收的感染性病毒水平之间的免疫相关性揭示了中和滴度与胎盘中ZIKV颗粒水平之间的预期反比关系(图17C)。总体来说，数据表明ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV保护母体器官免受感染，部分预防病毒在妊娠早期传播给胎仔，并限制胎仔复制。
实施例10：防止ZIKV诱导的睾丸损伤。
我们检查了ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV预防Ifnar1-/-A129小鼠中睾丸感染和损伤的能力(图14A)。由于雄性小鼠在8周龄时达到性成熟，我们在两个年龄组的小鼠中测试了疫苗功效：3周龄的年轻雄性和15周龄的成年雄性。用单剂量的104FFU的ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV或PBS假对照疫苗接种三周龄的年轻A129雄性小鼠。在疫苗接种后第4天，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV产生1.2±0.34×104FFU(n＝6)的峰值病毒血症(图14B)。在疫苗接种第28天，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV诱导7,700±2,600(n＝6)的强烈中和抗体滴度(图14C)。在同一天，用106FFU的来自Puerto Rico(PRVABC59)的流行病ZIKV毒株腹膜内攻击动物。攻击后，从ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV疫苗接种的小鼠未检测到病毒血症，而假对照疫苗接种的动物在攻击后第2天持续平均峰值病毒血症为7.1±5.9×106FFU/ml(n＝6)(图14D)。在攻击后第21天，PBS免疫小鼠的睾丸中的病毒负担达到5.8±8.4×106FFU/g(n＝6)，而在ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫小鼠的睾丸中未检测到感染性病毒(图14E)。来自ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的小鼠的总精子计数和活动精子计数与来自年龄匹配的未疫苗接种、未受攻击的健康雄性小鼠的那些相当。相比之下，在感染后第21天，PBS免疫的、ZIKV攻击的小鼠分别示出总精子计数和活动精子计数减少85％和90％(图14F和图14G)。与这些数据一致，来自PBS免疫的、ZIKV攻击的小鼠的睾丸重量和大小有所减少，而在ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的、ZIKV攻击的动物中没有观察到这种减少(图14H和图14I)。
在15周龄的成年A129雄性小鼠中，用ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV疫苗接种也保护免受睾丸感染、损伤和少精子症(图17A-G)。然而，用ZIKV PRVABC59对PBS疫苗接种的成年雄性的攻击没有像在对应的假对照疫苗接种的年轻雄性(图17H和图17I)中观察到的那样减少睾丸重量和大小(图17H和图17I)，从而表明了年龄依赖性睾丸病理学。总体来说，结果表明ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的单剂量免疫在雄性小鼠中保护睾丸免受感染和损伤。
实施例11：在非人灵长类动物中的功效。
为了确定在小鼠中的功效是否延伸至非人灵长类动物(NHP)，我们评估了恒河猴中ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的病毒血症、免疫原性和效力(RM；图15A)。首先，我们通过比较亲代野生型病毒的病毒血症来评价RM中ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的减毒水平。在用103FFU野生型ZIKV(2010柬埔寨毒株FSS 13025)皮下接种后，在四个接种RM中的每一个中产生高水平的病毒血症，其中感染后第4天和第5天的平均峰值病毒血症分别为9.6和28.8×104个基因组拷贝/ml(图15B，上图)。相比之下，四种ZIKV-3'UTR-Δ10-LAV接种的RM中仅一种表现出病毒血症，并且这个水平刚好高于我们qRT-PCR测定的检测限(图15B，第二行图)；因此，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV在RM中为高度减毒的。
我们接下来通过在免疫后第5-98天测量来自血清的中和抗体来评估ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的免疫原性。野生型ZIKV引发的中和抗体在第7-10天可检测到，在第14天达到峰值1/1,000至1/10,000，之后达到稳定水平(图15C，上图)。与野生型ZIKV感染相比，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV接种的动物示出稍微延迟的产生和较低水平的中和抗体，在第21-56天的滴度为约1/100(图15C，第二行图)。在免疫后第56天，用103FFU的流行病ZIKV毒株PRVABC59攻击所有RM。值得注意的是，在任何预先感染野生型ZIKV或疫苗接种ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的RM中，攻击后未检测到病毒血症(图15D，上两幅图)。作为对照，平行攻击两个PBS接种的RM并测量高水平的病毒血症(图15D下图)。除了通过qRT-PCR分析病毒RNA外，我们还进行了集落形成测定以测量感染性病毒；仅在用野生型ZIKV攻击的天然RM中检测到感染性ZIKV(图19)。
为了检查ZIKV攻击是否导致增强的免疫应答，我们测量了攻击后的中和活性。在攻击后，野生型ZIKV疫苗接种的RM中未观察到中和活性的增加(图15C，上图)，从而表明初始感染可能赋予消除性免疫力。相比之下，在ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV免疫的动物中，中和抗体滴度在攻击后从约1/100升高至1/1,000-1/10,000(图15C，第二行图)，从而证明回忆应答并表明攻击后通过血清的qRT-PCR检测不到的低水平感染。如所预期的，PBS接种的对照RM在攻击后，它们的中和滴度增加至大约1/10,000(图15C，下图)。
由于ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV未在RM中引发消除性免疫力，我们评估了含有3’UTR的20个核苷酸缺失的第二种活减毒候选疫苗ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV(参考文献36)是否可以诱导更强的免疫应答。先前并自相矛盾地示出了ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV在A129小鼠中比ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的减毒效果更低，这很可能是因为与ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV相比，它对I型IFN抑制的敏感性较低(参考文献36)。皮下接种103FFU的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV后，三个RM中有两个具有低但可检测的病毒血症(图15B，第三行图)。免疫的动物在达到第10天前迅速产生中和抗体，其中在第14-21天前抑制性滴度稳定在1/1,000至1/10,000(图15C，第三行图)。在ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV免疫的动物中，在第56天用103FFU的ZIKV PRVABC59攻击后，通过qRT-PCR未检测到病毒血症(图15D，第三行图)并且未观察到中和抗体滴度升高(图15C，第三行图)。尽管针对每种候选疫苗使用较少的动物数量，但结果表明ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的单剂量疫苗接种可诱导NHP中的消除性免疫力(即，在攻击后没有可检测的病毒血症并且没有中和抗体滴度增加)。
我们还评估了在RM中编码NS1而没有糖基化的另一种活减毒ZIKV候选疫苗(ZIKV-NS1-LAV)。最近示出ZIKV-NS1-LAV在小鼠妊娠模型中预防子宫内传播(参考文献43)。用103FFU的ZIKV-NS1-LAV皮下免疫4只RM后，没有任何动物显示任何可检测的病毒RNA(图15B，第四行图)。使用集落形成测定对ZIKV-NS1-LAV接种物进行反向滴定，证实了具有预期感染滴度的病毒原种的感染性。出乎意料的是，免疫没有引发任何中和活性(图15C，第四行图)。在第56天用103FFU的ZIKV PRVABC59攻击后，所有四只动物均表现出强烈的病毒血症(图15D，第四行图)并产生中和抗体滴度(图15C，第四行图)。这些结果表明ZIKV-NS1-LAV不能够在RM中复制和触发抗体应答。
实施例12：ZIKV-3'UTR-Δ20-LAV的睾丸保护和安全性分析。
由于ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV在RM中诱导的高度希望的消除性免疫力，我们进一步测试了其功效和安全性。与ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV类似，用103FFU的ZIKV-3'UTR-Δ20-LAV免疫雄性A129小鼠，在用ZIKV PRVABC59攻击后完全预防病毒感染和睾丸损伤，如通过攻击后缺乏可检测的病毒血症、不存在少精子症并且睾丸重量和大小没有减少所确定(图20)。接下来，进行五组实验以表征ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的安全性。
首先，我们测量了在用103FFU的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV或亲代野生型ZIKV皮下接种A129小鼠后的器官病毒载量(图16A)。在感染后第6天，野生型ZIKV感染的小鼠在所有测试的器官中均表现出高病毒载量，而在来自ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV感染的肝脏或脑中没有检测到病毒(≤102FFU/ml)，其他器官(脾脏除外)表现出比野生型感染动物更低水平的疫苗病毒。在感染后第10天，野生型ZIKV感染的小鼠在心脏、脾脏、肾脏、睾丸、眼睛和脑中保留病毒载量，而来自ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV感染的小鼠的器官不具有任何可检测的病毒。
第二，我们检查了ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV对3周龄A129小鼠睾丸的潜在副作用。如所预期的，在感染后第21天，野生型ZIKV感染减少了睾丸重量和大小(图16A-C)、降低了总精子计数和活动精子计数(图16D-E)，并且在萎缩的睾丸中产生病毒RNA(图16F)。相比之下，ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV不影响精子计数或睾丸重量和大小(图16B-E)，在睾丸中没有可检测的病毒RNA(图16F)。
第三，我们通过颅内接种1日龄CD-1小鼠评估了ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的神经毒力(图16G)。如先前所报道的(参考文献36)，新生儿死于野生型ZIKV感染；甚至仅10FFU的剂量也导致13％的死亡率(图16G)。相比之下，在用103FFU的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV接种的小鼠中未观察到死亡；然而，用104FFU的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV感染导致29％的死亡率。
第四，我们测试了候选疫苗是否可以感染埃及伊蚊，ZIKV的主要载体(参考文献19、20)。喂食含有106FFU/ml的ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV或野生型ZIKV的人造血餐后，50％的饱血蚊子被野生型ZIKV感染，而没有蚊子被ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV感染(图16H)。
最后，我们测试了ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV在细胞培养中的稳定性。在Vero细胞(用于疫苗生产的批准的细胞系(参考文献44))上连续培养ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV五轮后，所有回收的P5病毒(来自三次独立实验)保留了20个核苷酸缺失。然而，P5病毒在E编码基因和NS1编码基因中积累了另外的突变(图21)，这可表示Vero细胞适应性突变或3’UTR缺失补偿性突变。病毒进一步传代至P10没有改变20个核苷酸缺失，从而表明缺失在细胞培养中是稳定的。此外，我们在A129小鼠中传代ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV三轮(每轮3天)；所有回收的病毒均保留了20个核苷酸缺失，进一步表明了突变病毒的稳定性。总之，这些结果证明了ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的优异安全特性，包括在小鼠器官中有限、瞬时的病毒载量，对睾丸功能没有副作用，神经毒力降低，无法感染蚊子以及良好的稳定性。
结论
在本文中我们证明了，含有ZIKV基因组的3’非翻译区缺失的活减毒ZIKV候选疫苗(ZIKV-3’UTR-LAV)，即10个核苷酸缺失和20个核苷酸缺失，在小鼠妊娠和睾丸损害期间预防病毒传播以及感染非人灵长类动物。在单剂量的疫苗接种后，在胚胎第6天(E6)用ZIKV攻击并在E13评估的妊娠小鼠示出母体、胎盘和胎仔组织中的病毒RNA水平显著降低。用ZIKV攻击的接种疫苗的雄性小鼠受到保护免受睾丸感染、损伤和少精子症。恒河猴的单次免疫引发快速且强烈的抗体应答，从而在攻击后赋予完全保护。此外，ZIKV-3’UTR-LAV候选疫苗具有希望的安全特性。这些结果表明，针对人进行ZIKV-3’UTR-LAV的进一步开发是有保证的。
特别是我们的结果示出，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV的单次免疫在C57BL/6小鼠中在妊娠早期预防母体到胎仔的传播。虽然没有检测到感染性攻击病毒，但是在攻击后从疫苗接种的母兽中约30％的胎盘和胎头回收了非常低水平的病毒RNA；这些突破性的病毒RNA可能来自稳定的抗体-病毒复合物，其可在体内持续数天(参考文献47)。
基于这些结果，这种突破性非感染性病毒RNA的临床意义将在其他物种中确定，特别是将在非人灵长类动物(NHPs)中进行评估，并且如果在人中成功则在人中进行评估。在雄性A129小鼠中，ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV或ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV的单剂量免疫预防攻击后的睾丸感染和损伤，从而表明接种疫苗以保护雄性生殖系统的另外益处。值得注意的是，用ZIKV感染的未受保护的年轻A129小鼠(3周龄或7周龄)出现较小的睾丸，而成年小鼠(受感染时为19周龄)则没有，从而表明ZIKV感染可导致更年轻的雄性中更严重的生殖损害。如上所述，这个观察结果的临床相关性将在NHP和人中进行证实。
在NHP中，用ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV或ZIKV-3’UTR-Δ20-LAV单剂量疫苗接种诱导足够的免疫应答以预防病毒血症，其中用ZIKV-3’UTR-Δ10-LAV引发更强的免疫原性，如通过其诱导针对攻击的消除性免疫力的能力所反映。当前非人灵长类动物结果的一个限制是用于每种候选疫苗的动物数量较少(n＝3-4)。ZIKV疫苗诱导的消除性免疫力对于保护人的先天性异常可能是至关重要的。
活减毒疫苗通常具有单剂量、快速诱导持久免疫力的优势。由于ZIKV主要在低收入国家流行，因此具有单剂量功效的疫苗具有实际重要性，特别是在控制爆炸性爆发或在多剂量和定期加强将具有挑战性的偏远地区对人群进行免疫时(参考文献45)。因此，活减毒疫苗可有用于免疫ZIKV流行地区和前往ZIKV流行地区的人群。除了我们的ZIKV-3’UTR-LAV，用表达ZIKV prM-E(50μg)的核苷修饰的mRNA(参考文献46)或表达ZIKV prM-E的重组恒河猴腺病毒血清型52载体(1011个病毒颗粒)(参考文献8)进行单剂量免疫，也示出快速引发抗体应答并预防NHP中的病毒血症；无论是否确定这两种疫苗可达到消除性免疫力。所有其他疫苗平台，包括灭活疫苗和prM-E DNA疫苗，需要两次注射才能在NHP中引发强烈的抗病毒血症的抗体应答(参考文献7、8)。
可以想象，在免疫力低的个体和孕妇中，可能禁止用活减毒病毒进行疫苗接种以避免潜在的不利风险。然而，这些个体可以使用灭活的、亚单位或基于基因的复制缺陷型疫苗来保护。因此，希望与本文所述的那些平行开发多种疫苗平台，以提供用于预防和控制ZIKV感染和疾病的补充选择。
实施例13：DNA质粒启动的野生型寨卡病毒和疫苗
为了促进用于预防和控制ZIKV感染和疾病的疫苗开发，本发明人开发了一种DNA质粒，其可以直接转染到细胞中以产生寨卡病毒(ZIKV)。将新的DNA启动的ZIKV全长(FL)克隆物组装在pCC1载体的骨架中。除pCC1载体序列外，它还包含真核启动子CMV或SV40、ZIKV毒株FSS13025的全基因组、HDVr序列和poly-A尾。根据用于转录病毒RNA的启动子类型，将克隆物命名为CMV ZIKV FL和SV40 ZIKV FL。用于构建活减毒ZIKV候选疫苗的DNA启动的ZIKV全长克隆物列于附录A中。
如图22所示，pCC1-CMV ZIKV FL和pCC1-SV40 ZIKV FL均可以通过将DNA质粒转染到Vero细胞中来有效地启动野生型ZIKV。在实验中，通过电穿孔将5微克指定的DNA质粒转染到Vero细胞中。从第1天至第5天收集培养液。通过噬斑测定，在Vero细胞上测量感染性病毒滴度。
使用DNA启动的ZIKV FL克隆物(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)，我们制备了DNA启动的活减毒ZIKV候选疫苗。确切地说，我们将3’UTR 10个核苷酸缺失或20个核苷酸缺失突变(参考文献19、48)工程化到DNA启动的ZIKV FL克隆物中，分别产生ZIKV Del 10和ZIKVDel 20。根据启动子类型，这些候选DNA疫苗命名为CMV ZIKV Del 10、CMV ZIKV Del 20、SV40 ZIKV Del 10和SV40 ZIKV Del 20。这些具体候选DNA疫苗的序列的详细描述总结在附录B中。如图23所示，四种DNA启动的活减毒ZIKV疫苗质粒还可在将DNA转染到Vero细胞中后产生强烈水平的疫苗。
附录A：用于构建活减毒ZIKV候选疫苗的ZIKV全长克隆物
1.CMV ZIKV全长(FL)序列：序列表中的SEQ ID NO:6
2.SV40 ZIKV全长(FL)序列：序列表中的SEQ ID NO:7
附录B：示例性活减毒ZIKV候选疫苗的序列的详细描述
·CMVZIKV Del 10：由SEQ ID NO:6的缺失变体组成，其中缺失了序列“CCAGAAGAGG”(序列表中的SEQ ID NO:8)。
·CMV ZIKV Del 20：由SEQ ID NO:6的缺失变体组成，其中缺失了序列“CTGTGGATCTCCAGAAGAGG”(序列表中的SEQ ID NO:9)。
·SV40 ZIKV Del 10：由SEQ ID NO:7的缺失变体组成，其中缺失了序列“CCAGAAGAGG”(序列表中的SEQ ID NO:8)。
·SV40 ZIKV Del 10：由SEQ ID NO:7的缺失变体组成，其中缺失了序列“CTGTGGATCTCCAGAAGAGG”(序列表中的SEQ ID NO:9)。
本领域技术人员将容易理解，本发明适用于实现所提及的目的并获得所提及的结果和优势以及本文中固有的那些目的、结果和优势。先前实施例连同本文描述的方法、程序、处理、分子和特定化合物目前表示优选的实施方案，是实施例，并不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途，这些变化和用途包含在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。
序列
SEQ ID NO:1
3’UTR-野生型
SEQ ID NO:2
3’UTR-10个核苷酸缺失
SEQ ID NO:3
3’UTR-20个核苷酸缺失
SEQ ID NO:4
3’UTR-30个核苷酸缺失-a
SEQ ID NO:5
3’UTR-30个核苷酸缺失-b
SEQ ID NO:6
CMV ZIKV FL序列：
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SEQ ID NO:7
SV40 ZIKV FL序列：
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SEQ ID NO:8
3’UTR寨卡10个核苷酸缺失
CCAGAAGAGG
SEQ ID NO:9
3’UTR寨卡20个核苷酸缺失
CTGTGGATCTCCAGAAGAGG
以下参考文献的内容和本申请中引用的所有其他参考文献以引用的方式整体并入。
参考文献
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<151> 2017-02-14
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'UTR-野生型
<400> 1
gcaccaatct tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gcttggggaa agctgtgcag 60
cctgtgaccc ccccaggaga agctgggaaa ccaagcccat agtcaggccg agaacgccat 120
ggcacggaag aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc 180
acgcgcttgg aggcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc ctttaatctg 240
gggcctgaac tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagaggagac 300
cccccggaaa acgcaaaaca gcatattgac gctgggaaag accagagact ccatgagttt 360
ccaccacgct ggccgccagg cacagatcgc cgaatagcgg cggccggtgt ggggaaatcc 420
atggtttct 429
<210> 2
<211> 419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'UTR-10个核苷酸缺失
<400> 2
gcaccaatct tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gcttggggaa agctgtgcag 60
cctgtgaccc ccccaggaga agctgggaaa ccaagcccat agtcaggccg agaacgccat 120
ggcacggaag aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc 180
acgcgcttgg aggcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc ctttaatctg 240
gggcctgaac tggagatcag ctgtggatct gactagtggt tagaggagac cccccggaaa 300
acgcaaaaca gcatattgac gctgggaaag accagagact ccatgagttt ccaccacgct 360
ggccgccagg cacagatcgc cgaatagcgg cggccggtgt ggggaaatcc atggtttct 419
<210> 3
<211> 409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'UTR-20个核苷酸缺失
<400> 3
gcaccaatct tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gcttggggaa agctgtgcag 60
cctgtgaccc ccccaggaga agctgggaaa ccaagcccat agtcaggccg agaacgccat 120
ggcacggaag aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc 180
acgcgcttgg aggcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc ctttaatctg 240
gggcctgaac tggagatcag gactagtggt tagaggagac cccccggaaa acgcaaaaca 300
gcatattgac gctgggaaag accagagact ccatgagttt ccaccacgct ggccgccagg 360
cacagatcgc cgaatagcgg cggccggtgt ggggaaatcc atggtttct 409
<210> 4
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'UTR-30个核苷酸缺失-a
<400> 4
gcaccaatct tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gcttggggaa agctgtgcag 60
cctgtgaccc ccccaggaga agctgggaaa ccaagcccat agtcaggccg agaacgccat 120
ggcacggaag aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc 180
acgcgcttgg aggcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc ctttaatctg 240
gggcctgaac gactagtggt tagaggagac cccccggaaa acgcaaaaca gcatattgac 300
gctgggaaag accagagact ccatgagttt ccaccacgct ggccgccagg cacagatcgc 360
cgaatagcgg cggccggtgt ggggaaatcc atggtttct 399
<210> 5
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'UTR-30个核苷酸缺失-b
<400> 5
gcaccaatct tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gcttggggaa agctgtgcag 60
cctgtgaccc ccccaggaga agctgggaaa ccaagcccat agtcaggccg agaacgccat 120
ggcacggaag aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc 180
acgcgcttgg aggcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc ctttaatctg 240
gggcctgaac tggagatcag ctgtggagac cccccggaaa acgcaaaaca gcatattgac 300
gctgggaaag accagagact ccatgagttt ccaccacgct ggccgccagg cacagatcgc 360
cgaatagcgg cggccggtgt ggggaaatcc atggtttct 399
<210> 6
<211> 18611
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CMV ZIKV FL序列
<400> 6
agttgttgat ctgtgtgaat cagactgcga cagttcgagt ttgaagcgaa agctagcaac 60
agtatcaaca ggttttattt tggatttgga aacgagagtt tctggtcatg aaaaacccaa 120
agaagaaatc cggaggattc cggattgtca atatgctaaa acgcggagta gcccgtgtga 180
gcccctttgg gggcttgaag aggctgccag ccggacttct gctgggtcat gggcccatca 240
ggatggtctt ggcgattcta gcctttttga gattcacggc aatcaagcca tcactgggtc 300
tcatcaatag atggggttca gtggggaaaa aagaggctat ggaaataata aagaagttta 360
agaaagatct ggctgccatg ctgagaataa tcaatgctag gaaggagaag aagagacgag 420
gcacagatac tagtgtcgga attgttggcc tcctgctgac cacagccatg gcagtggagg 480
tcactagacg tgggaatgca tactatatgt acttggacag aagcgatgct ggggaggcca 540
tatcttttcc aaccacaatg gggatgaata agtgttatat acagatcatg gatcttggac 600
acatgtgtga tgccaccatg agctatgaat gccctatgct ggatgagggg gtagaaccag 660
atgacgtcga ttgttggtgc aacacgacgt caacttgggt tgtgtacgga acctgccacc 720
acaaaaaagg tgaagcacgg agatctagaa gagctgtgac gctcccctcc cattccacta 780
ggaagctgca aacgcggtcg cagacctggt tggaatcaag agaatacaca aagcacctga 840
ttagagtcga aaattggata ttcaggaacc ctggcttcgc gttagcagca gctgccatcg 900
cttggctttt gggaagctca acgagccaaa aagtcatata cttggtcatg atactgctga 960
ttgccccggc atacagcatc aggtgcatag gagtcagcaa tagggacttt gtggaaggta 1020
tgtcaggtgg gacttgggtt gatgttgtct tggaacatgg aggttgtgtt accgtaatgg 1080
cacaggacaa accgactgtc gacatagagc tggttacaac aacagtcagc aacatggcgg 1140
aggtaagatc ctactgctat gaggcatcaa tatcggacat ggcttcggac agccgctgcc 1200
caacacaagg tgaagcctac cttgacaagc aatcagacac tcaatatgtc tgcaaaagaa 1260
cgttagtgga cagaggctgg ggaaatggat gtggactttt tggcaaaggg agcctggtga 1320
catgcgctaa gtttgcttgc tctaagaaaa tgaccgggaa gagcatccag ccagagaatc 1380
tggagtaccg gataatgctg tcagttcatg gctcccagca cagtgggatg atcgttaatg 1440
atacaggaca tgaaactgat gagaatagag cgaaggttga gataacgccc aattcaccaa 1500
gagccgaagc caccctgggg ggttttggaa gcctaggact tgattgtgaa ccgaggacag 1560
gccttgactt ttcagatttg tattacttga ctatgaataa caagcactgg ttggttcaca 1620
aggagtggtt ccacgacatt ccattacctt ggcacgctgg ggcagacacc ggaactccac 1680
actggaacaa caaagaagca ctggtagagt tcaaggacgc acatgccaaa aggcagactg 1740
tcgtggttct agggagtcaa gaaggagcag ttcacacggc ccttgctgga gctctggagg 1800
ctgagatgga tggtgcaaag ggaaggctgt cctctggcca cttgaaatgt cgcctgaaaa 1860
tggacaaact tagattgaag ggcgtgtcat actccttgtg taccgcagcg ttcacattca 1920
ctaagatccc ggctgaaaca ctgcacggga cagtcacagt ggaggtacag tacgcaggga 1980
cagatggacc ttgcaaggtt ccagctcaga tggcggtgga catgcaaact ctgaccccag 2040
ttgggaggtt gataaccgct aaccctgtaa tcactgaaag cactgagaac tccaagatga 2100
tgctggaact ggatccacca tttggggact cttacattgt cataggagtc ggggaaaaga 2160
agatcaccca ccactggcac aggagtggca gcaccattgg aaaagcattt gaagccactg 2220
tgagaggtgc caagagaatg gcagtcttgg gagacacagc ctgggacttt ggatcagttg 2280
ggggtgctct caactcactg ggcaagggca tccatcaaat ttttggagca gctttcaaat 2340
cattgtttgg aggaatgtcc tggttctcac aaattctcat tggaacgttg ctggtgtggt 2400
tgggtctgaa tacaaagaat ggatctattt cccttatgtg cttggcctta gggggagtgt 2460
tgatcttctt atccacagcc gtctctgctg atgtggggtg ctcggtggac ttctcaaaga 2520
aggaaacgag atgcggtaca ggggtgttcg tctataacga cgttgaagct tggagggaca 2580
ggtacaagta ccatcctgac tcccctcgta gattggcagc agcagtcaag caagcctggg 2640
aagatgggat ctgtgggatc tcctctgttt caagaatgga aaacatcatg tggagatcag 2700
tagaagggga gctcaacgca atcctggaag agaatggagt tcaactgacg gtcgttgtgg 2760
gatctgtaaa aaaccccatg tggagaggtc cacagagatt gcccgtgcct gtgaacgagc 2820
tgccccatgg ctggaaggct tgggggaaat cgtacttcgt cagggcagca aagacaaata 2880
acagctttgt cgtggatggt gacacactga aggaatgccc actcaaacat agagcatgga 2940
acagctttct tgtggaggat catgggttcg gggtatttca cactagtgtc tggctcaagg 3000
ttagagaaga ttattcactc gagtgtgatc cagccgtcat tggaacagcc gctaagggaa 3060
aggaggctgt gcacagtgat ctaggctact ggattgagag tgagaagaac gacacatgga 3120
ggctgaagag ggcccacctg atcgagatga aaacatgtga atggccaaag tcccacacat 3180
tgtggacaga tggaatagaa gaaagtgatc tgatcatacc caagtcttta gctgggccac 3240
tcagccatca caacaccaga gagggctaca ggacccaaat gaaagggcca tggcatagtg 3300
aagagcttga aattcggttt gaggaatgcc caggcactaa ggtccacgtg gaggaaacat 3360
gtggaacaag aggaccatct ctgagatcaa ccactgcaag cggaagggtg atcgaggaat 3420
ggtgctgcag ggagtgcaca atgcccccac tgtcgttccg ggctaaagat ggttgttggt 3480
atggaatgga gataaggccc aggaaagaac cagaaagtaa cttagtaagg tcaatggtga 3540
ctgcaggatc aactgatcac atggatcact tctcccttgg agtgcttgtg attctgctca 3600
tggtacagga agggctaaag aagagaatga ccacaaagat catcataagc acatcaatgg 3660
cagtgctggt agctatgatc ctgggaggat tttcaatgag tgacctggct aagcttgcaa 3720
ttttgatggg tgccaccttc gcggaaatga acactggagg agatgttgct catctggcgc 3780
tgatagcggc attcaaagtc agacctgcgt tgctggtatc tttcattttc agagctaatt 3840
ggacaccccg tgagagcatg ctgctggcct tggcctcgtg tcttctgcaa actgcgatct 3900
ccgccttgga aggcgacctg atggttccca tcaatggttt tgctttggcc tggttggcaa 3960
tacgagcgat ggttgttcca cgcactgaca acatcacctt ggcaatcctg gctgctctga 4020
caccactggc ccggggcaca ctgcttgtgg cgtggagagc aggccttgct acttgcgggg 4080
ggttcatgct cctttctctg aaggggaaag gcagtgtgaa gaagaactta ccatttgtca 4140
tggccctggg actaaccgct gtgaggctgg tcgaccccat caacgtggtg ggactgctgt 4200
tgctcacaag gagtgggaag cggagctggc cccctagtga agtactcaca gctgttggcc 4260
tgatatgcgc attggctgga gggttcgcca aggcggatat agagatggct gggcccatgg 4320
ccgcggtcgg tctgctaatt gtcagttacg tggtctcagg aaagagtgtg gacatgtaca 4380
ttgaaagagc aggtgacatc acatgggaaa aagatgcgga agtcactgga aacagtcccc 4440
ggctcgatgt ggcactagat gagagtggtg atttctccct agtggaggat gatggtcccc 4500
ccatgagaga gatcatactc aaagtggtcc tgatggccat ctgtggcatg aacccaatag 4560
ccataccctt tgcagctgga gcgtggtacg tgtatgtgaa gactggaaaa aggagtggtg 4620
ctctatggga tgtgcctgct cccaaggaag taaaaaaggg ggagaccaca gatggagtgt 4680
acagagtaat gactcgtaga ctgctaggtt caacacaagt tggagtggga gtcatgcaag 4740
agggggtctt ccacactatg tggcacgtca caaaaggatc cgcgctgaga agcggtgaag 4800
ggagacttga tccatactgg ggagatgtca agcaggatct ggtgtcatac tgtggtccat 4860
ggaagctaga tgccgcctgg gacgggcaca gcgaggtgca gctcttggcc gtgccccccg 4920
gagagagagc gaggaacatc cagactctgc ccggaatatt taagacaaag gatggggaca 4980
ttggagcagt tgcgctggac tacccagcag gtacctcagg atctccaatc ctagataagt 5040
gtgggagagt gataggactc tatggtaatg gggtcgtgat caaaaatggg agttacgtta 5100
gtgccatcac ccaagggagg agggaggaag agactcctgt tgagtgcttc gagccttcga 5160
tgctgaagaa gaagcagcta actgtcttag acttgcatcc tggagctggg aaaaccagga 5220
gagttcttcc tgaaatagtc cgtgaagcca taaaaacaag actccgcact gtgatcttag 5280
ctccaaccag ggttgtcgct gctgaaatgg aggaagccct tagagggctt ccagtgcgtt 5340
atatgacaac agcagtcaat gtcacccatt ctgggacaga aatcgttgac ttaatgtgcc 5400
atgccacctt cacttcacgt ctactacagc caatcagagt ccccaactat aatctgtata 5460
ttatggatga ggcccacttc acagatccct caagtatagc agcaagagga tacatttcaa 5520
caagggttga gatgggcgag gcggctgcca tcttcatgac tgccacgcca ccaggaaccc 5580
gtgacgcatt cccggactcc aactcaccaa ttatggacac cgaagtggaa gtcccagaga 5640
gagcctggag ctcaggcttt gattgggtga cggatcattc tggaaaaaca gtttggtttg 5700
ttccaagcgt gaggaatggc aatgagatcg cagcttgtct gacaaaggct ggaaaacggg 5760
tcatacagct cagcagaaag acttttgaga cagagttcca gaaaacaaaa catcaagagt 5820
gggacttcgt cgtgacaact gacatttcag agatgggcgc caactttaaa gctgaccgtg 5880
tcatagattc caggagatgc ctaaagccgg tcatacttga tggcgagaga gtcattctgg 5940
ctggacccat gcctgtcaca catgccagcg ctgcccagag gagggggcgc ataggcagga 6000
accccaacaa acctggagat gagtatctgt atggaggtgg gtgcgcagag actgatgaag 6060
accatgcaca ctggcttgaa gcaagaatgc ttcttgacaa catttacctc caagatggcc 6120
tcatagcctc gctctatcga cctgaggccg acaaagtagc agctattgag ggagagttca 6180
agcttaggac ggagcaaagg aagacctttg tggaactcat gaaaagagga gatcttcctg 6240
tttggctggc ctatcaggtt gcatctgccg gaataaccta cacagataga agatggtgct 6300
ttgatggcac gaccaacaac accataatgg aagacagtgt gccggcagag gtgtggacca 6360
gatacggaga gaaaagagtg ctcaaaccga ggtggatgga cgccagagtt tgttcagatc 6420
atgcggccct gaagtcattc aaagagtttg ccgctgggaa aagaggagcg gcctttggag 6480
tgatggaagc cctgggaaca ctgccaggac atatgacaga gagattccag gaggccattg 6540
acaacctcgc tgtgctcatg cgggcagaga ctggaagcag gccctacaaa gccgcggcgg 6600
cccaattacc ggagacccta gagactatca tgcttttggg gttgctggga acagtctcgc 6660
tgggaatctt tttcgtcttg atgcggaaca agggcatagg gaagatgggc tttggaatgg 6720
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gcttgattac cgccaatgaa ctcggatggt tggagagaac aaagagtgac ctaagccatc 6960
taatgggaag gagagaggag ggggcaacta taggattctc aatggacatt gacctgcggc 7020
cagcctcagc ttgggctatc tatgctgctc tgacaacttt cattacccca gccgtccaac 7080
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tgttgttcgg tatgggtaaa gggatgccat tctatgcatg ggactttgga gtcccgctgc 7200
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tcgtggcgca ctacatgtac ttgatcccag ggctgcaggc agcagctgcg cgtgctgccc 7320
agaagagaac ggcagctggc atcatgaaga accctgttgt ggatggaata gtggtgactg 7380
acattgacac aatgacaatt gacccccaag tggagaaaaa gatgggacag gtgctactca 7440
tagcagtagc tgtctccagc gccatactgt cgcggaccgc ctgggggtgg ggtgaggctg 7500
gggccctgat cacagctgca acttccactt tgtgggaggg ctctccgaac aagtactgga 7560
actcctccac agccacctca ctgtgtaaca tttttagggg aagctacttg gctggagctt 7620
ctctaatcta cacagtaaca agaaacgctg gcttggtcaa gagacgtggg ggtggaacgg 7680
gagagaccct gggagagaaa tggaaggccc gcctgaacca gatgtcggcc ctggagttct 7740
actcctacaa aaagtcaggc atcaccgagg tgtgcagaga agaggcccgc cgcgccctca 7800
aggacggtgt ggcaacggga ggccacgctg tgtcccgagg aagtgcaaag ctgagatggt 7860
tggtggagag gggatacctg cagccctatg gaaaggtcat tgatcttgga tgtggcagag 7920
ggggctggag ttactatgcc gccaccatcc gcaaagttca agaagtgaaa ggatacacaa 7980
aaggaggccc tggtcatgaa gaacccatgt tggtgcaaag ctatgggtgg aacatagtcc 8040
gtcttaagag tggggtggac gtctttcata tggcggctga gccgtgtgac acgttgctgt 8100
gtgatatagg tgagtcatca tctagtcctg aagtggaaga agcacggacg ctcagagtcc 8160
tctccatggt gggggattgg cttgaaaaaa gaccaggagc cttttgtata aaagtgttgt 8220
gcccatacac cagcactatg atggaaaccc tggagcgact gcagcgtagg tatgggggag 8280
gactggtcag agtgccactc tcccgcaact ctacacatga gatgtactgg gtctctggag 8340
cgaaaagcaa caccataaaa agtgtgtcca ccacgagcca gctccttttg gggcgcatgg 8400
acgggcccag gaggccagtg aaatatgaag aggatgtgaa tctcggctct ggcacgcggg 8460
ctgtggtaag ctgcgctgaa gctcccaaca tgaagatcat tggtaaccgc attgagagga 8520
tccgcagtga gcacgcggaa acgtggttct ttgacgagaa ccacccatat aggacatggg 8580
cttaccatgg aagctacgag gcccccacac aagggtcagc gtcctctcta ataaacgggg 8640
ttgtcaggct cctgtcaaaa ccctgggatg tggtgactgg agtcacagga atagccatga 8700
ccgacaccac accgtatggt cagcaaagag ttttcaagga aaaagtggac actagggtgc 8760
cagaccccca agaaggcact cgtcaggtta tgagcatggt ctcttcctgg ttgtggaaag 8820
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gtagcaacgc agcattaggg gcaatatttg aagaggaaaa agagtggaag actgcagtgg 8940
aagctgtgaa cgatccaagg ttctgggctc tagtggacaa ggaaagagag caccacctga 9000
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aatttggaaa ggccaagggc agccgcgcca tctggtacat gtggctaggg gctagatttc 9120
tagagttcga agcccttgga ttcttgaacg aggatcactg gatggggaga gagaattcag 9180
gaggtggtgt tgaagggcta ggattacaaa gactcggata tgtcttagaa gagatgagtc 9240
gcataccagg aggaaggatg tatgcagatg atactgctgg ctgggacacc cgcatcagca 9300
ggtttgatct ggagaatgaa gctctaatca ccaaccaaat ggagaaaggg cacagggcct 9360
tggcattggc cataatcaag tacacatacc aaaacaaagt ggtaaaggtc cttagaccag 9420
ctgaaaaagg gaagacagtt atggacatta tttcaagaca agaccaaagg gggagcggac 9480
aagttgtcac ttacgctctt aatacattta ccaacctagt ggtgcagctc attcggaata 9540
tggaggctga ggaagttcta gagatgcaag acttgtggct gctgcggagg tcagagaaag 9600
tgaccaactg gttgcagagc aatggatggg ataggctcaa acgaatggca gtcagtggag 9660
atgattgcgt tgtgaaacca attgatgata ggtttgcaca tgctctcagg ttcttgaatg 9720
atatgggaaa agttaggaag gacacacaag agtggaagcc ctcaactgga tgggacaact 9780
gggaagaagt tccgttttgc tcccaccact tcaacaagct ccatctcaag gacgggaggt 9840
ccattgtggt tccctgccgc caccaagatg aactgattgg ccgagctcgc gtctcaccgg 9900
gggcgggatg gagcatccgg gagactgctt gcctagcaaa atcatatgcg caaatgtggc 9960
agctccttta tttccacaga agggacctcc gactgatggc caatgccatt tgttcatctg 10020
tgccagttga ctgggttcca actgggagaa ctacctggtc aatccatgga aagggagaat 10080
ggatgaccac tgaagacatg cttgtggtgt ggaacagagt gtggattgag gagaacgacc 10140
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ttaaaaacac agtcaacatg atgcgtagga tcataggtga tgaagaaaag tacgtggact 10320
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gcacggaaga agccatgctg cctgtgagcc cctcagagga cactgagtca aaaaacccca 10560
cgcgcttgga ggcgcaggat gggaaaagaa ggtggcgacc ttccccaccc tttaatctgg 10620
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tgggtctggg tcggcatggc atctccacct cctcgcggtc cgacctgggc tacttcggta 10860
ggctaaggga gaagaatcga tgctgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 10920
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cattcatccg cttattatca cttattcagg cgtagcaacc aggcgtttaa gggcaccaat 11220
aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat 11280
taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg 11340
gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga 11400
agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg 11460
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acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc 11580
agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat 11640
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ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct 11760
ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact 11820
gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag 11880
tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata 11940
cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa 12000
cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat 12060
ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcgcgataa gctcatggag 12120
cggcgtaacc gtcgcacagg aaggacagag aaagcgcgga tctgggaagt gacggacaga 12180
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ggtataccgc tgaaagttct gcaaagcctg atgggacata agtccatcag ttcaacggaa 12360
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gctgttatcc actgagaagc gaacgaaaca gtcgggaaaa tctcccatta tcgtagagat 12600
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cggaaacagc ggttatcaat cacaagaaac gtaaaaatag cccgcgaatc gtccagtcaa 13920
acgacctcac tgaggcggca tatagtctct cccgggatca aaaacgtatg ctgtatctgt 13980
tcgttgacca gatcagaaaa tctgatggca ccctacagga acatgacggt atctgcgaga 14040
tccatgttgc taaatatgct gaaatattcg gattgacctc tgcggaagcc agtaaggata 14100
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tacagaaccg gtttacgcag tttcggctta gtgaaacaaa agaaatcacc aatccgtatg 14340
ccatgcgttt atacgaatcc ctgtgtcagt atcgtaagcc ggatggctca ggcatcgtct 14400
ctctgaaaat cgactggatc atagagcgtt accagctgcc tcaaagttac cagcgtatgc 14460
ctgacttccg ccgccgcttc ctgcaggtct gtgttaatga gatcaacagc agaactccaa 14520
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gggggttagt tcgtcatcat tgatgagggt tgattatcac agtttattac tctgaattgg 14880
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tgattaaagg atgttcagaa tgaaactcat ggaaacactt aaccagtgca taaacgctgg 15240
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ggggctacgt gttttgctcg tggaaggtaa cgacccccag ggaacagcct caatgtatca 15660
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ggaaaaggac gatgtcactt atgcaataaa gcccacttgc tggccggggc ttgacattat 15780
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gatggaggag caaattcggg atgcctgggg aagcatggtt ctaaaaaatg ttgtacgtga 16200
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tcaacgctct tcaactggtg cctggagaaa tgctctttct atttgggaac ctgtctgcaa 16320
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ctgggaccat ggtcccactc gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca 17700
ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg aaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg 17760
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ggattgctgc tgtgtcctgc ttatccacaa cattttgcgc acggttatgt ggacaaaata 18060
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cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 18300
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cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 18420
aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 18480
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gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 18600
ctctggctaa c 18611
<210> 7
<211> 18258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SV40 ZIKV FL序列
<400> 7
agttgttgat ctgtgtgaat cagactgcga cagttcgagt ttgaagcgaa agctagcaac 60
agtatcaaca ggttttattt tggatttgga aacgagagtt tctggtcatg aaaaacccaa 120
agaagaaatc cggaggattc cggattgtca atatgctaaa acgcggagta gcccgtgtga 180
gcccctttgg gggcttgaag aggctgccag ccggacttct gctgggtcat gggcccatca 240
ggatggtctt ggcgattcta gcctttttga gattcacggc aatcaagcca tcactgggtc 300
tcatcaatag atggggttca gtggggaaaa aagaggctat ggaaataata aagaagttta 360
agaaagatct ggctgccatg ctgagaataa tcaatgctag gaaggagaag aagagacgag 420
gcacagatac tagtgtcgga attgttggcc tcctgctgac cacagccatg gcagtggagg 480
tcactagacg tgggaatgca tactatatgt acttggacag aagcgatgct ggggaggcca 540
tatcttttcc aaccacaatg gggatgaata agtgttatat acagatcatg gatcttggac 600
acatgtgtga tgccaccatg agctatgaat gccctatgct ggatgagggg gtagaaccag 660
atgacgtcga ttgttggtgc aacacgacgt caacttgggt tgtgtacgga acctgccacc 720
acaaaaaagg tgaagcacgg agatctagaa gagctgtgac gctcccctcc cattccacta 780
ggaagctgca aacgcggtcg cagacctggt tggaatcaag agaatacaca aagcacctga 840
ttagagtcga aaattggata ttcaggaacc ctggcttcgc gttagcagca gctgccatcg 900
cttggctttt gggaagctca acgagccaaa aagtcatata cttggtcatg atactgctga 960
ttgccccggc atacagcatc aggtgcatag gagtcagcaa tagggacttt gtggaaggta 1020
tgtcaggtgg gacttgggtt gatgttgtct tggaacatgg aggttgtgtt accgtaatgg 1080
cacaggacaa accgactgtc gacatagagc tggttacaac aacagtcagc aacatggcgg 1140
aggtaagatc ctactgctat gaggcatcaa tatcggacat ggcttcggac agccgctgcc 1200
caacacaagg tgaagcctac cttgacaagc aatcagacac tcaatatgtc tgcaaaagaa 1260
cgttagtgga cagaggctgg ggaaatggat gtggactttt tggcaaaggg agcctggtga 1320
catgcgctaa gtttgcttgc tctaagaaaa tgaccgggaa gagcatccag ccagagaatc 1380
tggagtaccg gataatgctg tcagttcatg gctcccagca cagtgggatg atcgttaatg 1440
atacaggaca tgaaactgat gagaatagag cgaaggttga gataacgccc aattcaccaa 1500
gagccgaagc caccctgggg ggttttggaa gcctaggact tgattgtgaa ccgaggacag 1560
gccttgactt ttcagatttg tattacttga ctatgaataa caagcactgg ttggttcaca 1620
aggagtggtt ccacgacatt ccattacctt ggcacgctgg ggcagacacc ggaactccac 1680
actggaacaa caaagaagca ctggtagagt tcaaggacgc acatgccaaa aggcagactg 1740
tcgtggttct agggagtcaa gaaggagcag ttcacacggc ccttgctgga gctctggagg 1800
ctgagatgga tggtgcaaag ggaaggctgt cctctggcca cttgaaatgt cgcctgaaaa 1860
tggacaaact tagattgaag ggcgtgtcat actccttgtg taccgcagcg ttcacattca 1920
ctaagatccc ggctgaaaca ctgcacggga cagtcacagt ggaggtacag tacgcaggga 1980
cagatggacc ttgcaaggtt ccagctcaga tggcggtgga catgcaaact ctgaccccag 2040
ttgggaggtt gataaccgct aaccctgtaa tcactgaaag cactgagaac tccaagatga 2100
tgctggaact ggatccacca tttggggact cttacattgt cataggagtc ggggaaaaga 2160
agatcaccca ccactggcac aggagtggca gcaccattgg aaaagcattt gaagccactg 2220
tgagaggtgc caagagaatg gcagtcttgg gagacacagc ctgggacttt ggatcagttg 2280
ggggtgctct caactcactg ggcaagggca tccatcaaat ttttggagca gctttcaaat 2340
cattgtttgg aggaatgtcc tggttctcac aaattctcat tggaacgttg ctggtgtggt 2400
tgggtctgaa tacaaagaat ggatctattt cccttatgtg cttggcctta gggggagtgt 2460
tgatcttctt atccacagcc gtctctgctg atgtggggtg ctcggtggac ttctcaaaga 2520
aggaaacgag atgcggtaca ggggtgttcg tctataacga cgttgaagct tggagggaca 2580
ggtacaagta ccatcctgac tcccctcgta gattggcagc agcagtcaag caagcctggg 2640
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tagaagggga gctcaacgca atcctggaag agaatggagt tcaactgacg gtcgttgtgg 2760
gatctgtaaa aaaccccatg tggagaggtc cacagagatt gcccgtgcct gtgaacgagc 2820
tgccccatgg ctggaaggct tgggggaaat cgtacttcgt cagggcagca aagacaaata 2880
acagctttgt cgtggatggt gacacactga aggaatgccc actcaaacat agagcatgga 2940
acagctttct tgtggaggat catgggttcg gggtatttca cactagtgtc tggctcaagg 3000
ttagagaaga ttattcactc gagtgtgatc cagccgtcat tggaacagcc gctaagggaa 3060
aggaggctgt gcacagtgat ctaggctact ggattgagag tgagaagaac gacacatgga 3120
ggctgaagag ggcccacctg atcgagatga aaacatgtga atggccaaag tcccacacat 3180
tgtggacaga tggaatagaa gaaagtgatc tgatcatacc caagtcttta gctgggccac 3240
tcagccatca caacaccaga gagggctaca ggacccaaat gaaagggcca tggcatagtg 3300
aagagcttga aattcggttt gaggaatgcc caggcactaa ggtccacgtg gaggaaacat 3360
gtggaacaag aggaccatct ctgagatcaa ccactgcaag cggaagggtg atcgaggaat 3420
ggtgctgcag ggagtgcaca atgcccccac tgtcgttccg ggctaaagat ggttgttggt 3480
atggaatgga gataaggccc aggaaagaac cagaaagtaa cttagtaagg tcaatggtga 3540
ctgcaggatc aactgatcac atggatcact tctcccttgg agtgcttgtg attctgctca 3600
tggtacagga agggctaaag aagagaatga ccacaaagat catcataagc acatcaatgg 3660
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ttttgatggg tgccaccttc gcggaaatga acactggagg agatgttgct catctggcgc 3780
tgatagcggc attcaaagtc agacctgcgt tgctggtatc tttcattttc agagctaatt 3840
ggacaccccg tgagagcatg ctgctggcct tggcctcgtg tcttctgcaa actgcgatct 3900
ccgccttgga aggcgacctg atggttccca tcaatggttt tgctttggcc tggttggcaa 3960
tacgagcgat ggttgttcca cgcactgaca acatcacctt ggcaatcctg gctgctctga 4020
caccactggc ccggggcaca ctgcttgtgg cgtggagagc aggccttgct acttgcgggg 4080
ggttcatgct cctttctctg aaggggaaag gcagtgtgaa gaagaactta ccatttgtca 4140
tggccctggg actaaccgct gtgaggctgg tcgaccccat caacgtggtg ggactgctgt 4200
tgctcacaag gagtgggaag cggagctggc cccctagtga agtactcaca gctgttggcc 4260
tgatatgcgc attggctgga gggttcgcca aggcggatat agagatggct gggcccatgg 4320
ccgcggtcgg tctgctaatt gtcagttacg tggtctcagg aaagagtgtg gacatgtaca 4380
ttgaaagagc aggtgacatc acatgggaaa aagatgcgga agtcactgga aacagtcccc 4440
ggctcgatgt ggcactagat gagagtggtg atttctccct agtggaggat gatggtcccc 4500
ccatgagaga gatcatactc aaagtggtcc tgatggccat ctgtggcatg aacccaatag 4560
ccataccctt tgcagctgga gcgtggtacg tgtatgtgaa gactggaaaa aggagtggtg 4620
ctctatggga tgtgcctgct cccaaggaag taaaaaaggg ggagaccaca gatggagtgt 4680
acagagtaat gactcgtaga ctgctaggtt caacacaagt tggagtggga gtcatgcaag 4740
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ggagacttga tccatactgg ggagatgtca agcaggatct ggtgtcatac tgtggtccat 4860
ggaagctaga tgccgcctgg gacgggcaca gcgaggtgca gctcttggcc gtgccccccg 4920
gagagagagc gaggaacatc cagactctgc ccggaatatt taagacaaag gatggggaca 4980
ttggagcagt tgcgctggac tacccagcag gtacctcagg atctccaatc ctagataagt 5040
gtgggagagt gataggactc tatggtaatg gggtcgtgat caaaaatggg agttacgtta 5100
gtgccatcac ccaagggagg agggaggaag agactcctgt tgagtgcttc gagccttcga 5160
tgctgaagaa gaagcagcta actgtcttag acttgcatcc tggagctggg aaaaccagga 5220
gagttcttcc tgaaatagtc cgtgaagcca taaaaacaag actccgcact gtgatcttag 5280
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atatgacaac agcagtcaat gtcacccatt ctgggacaga aatcgttgac ttaatgtgcc 5400
atgccacctt cacttcacgt ctactacagc caatcagagt ccccaactat aatctgtata 5460
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tcatacagct cagcagaaag acttttgaga cagagttcca gaaaacaaaa catcaagagt 5820
gggacttcgt cgtgacaact gacatttcag agatgggcgc caactttaaa gctgaccgtg 5880
tcatagattc caggagatgc ctaaagccgg tcatacttga tggcgagaga gtcattctgg 5940
ctggacccat gcctgtcaca catgccagcg ctgcccagag gagggggcgc ataggcagga 6000
accccaacaa acctggagat gagtatctgt atggaggtgg gtgcgcagag actgatgaag 6060
accatgcaca ctggcttgaa gcaagaatgc ttcttgacaa catttacctc caagatggcc 6120
tcatagcctc gctctatcga cctgaggccg acaaagtagc agctattgag ggagagttca 6180
agcttaggac ggagcaaagg aagacctttg tggaactcat gaaaagagga gatcttcctg 6240
tttggctggc ctatcaggtt gcatctgccg gaataaccta cacagataga agatggtgct 6300
ttgatggcac gaccaacaac accataatgg aagacagtgt gccggcagag gtgtggacca 6360
gatacggaga gaaaagagtg ctcaaaccga ggtggatgga cgccagagtt tgttcagatc 6420
atgcggccct gaagtcattc aaagagtttg ccgctgggaa aagaggagcg gcctttggag 6480
tgatggaagc cctgggaaca ctgccaggac atatgacaga gagattccag gaggccattg 6540
acaacctcgc tgtgctcatg cgggcagaga ctggaagcag gccctacaaa gccgcggcgg 6600
cccaattacc ggagacccta gagactatca tgcttttggg gttgctggga acagtctcgc 6660
tgggaatctt tttcgtcttg atgcggaaca agggcatagg gaagatgggc tttggaatgg 6720
tgactcttgg ggccagcgca tggcttatgt ggctctcgga aattgagcca gccagaattg 6780
catgtgtcct cattgttgtg ttcctattgc tggtggtgct catacctgag ccagaaaagc 6840
aaagatctcc ccaggacaac caaatggcaa tcatcatcat ggtagcagtg ggtcttctgg 6900
gcttgattac cgccaatgaa ctcggatggt tggagagaac aaagagtgac ctaagccatc 6960
taatgggaag gagagaggag ggggcaacta taggattctc aatggacatt gacctgcggc 7020
cagcctcagc ttgggctatc tatgctgctc tgacaacttt cattacccca gccgtccaac 7080
atgcagtgac cacttcatac aacaactact ccttaatggc gatggccacg caagctggag 7140
tgttgttcgg tatgggtaaa gggatgccat tctatgcatg ggactttgga gtcccgctgc 7200
taatgatagg ttgctactca caattaacac ccctgaccct aatagtggcc atcattttgc 7260
tcgtggcgca ctacatgtac ttgatcccag ggctgcaggc agcagctgcg cgtgctgccc 7320
agaagagaac ggcagctggc atcatgaaga accctgttgt ggatggaata gtggtgactg 7380
acattgacac aatgacaatt gacccccaag tggagaaaaa gatgggacag gtgctactca 7440
tagcagtagc tgtctccagc gccatactgt cgcggaccgc ctgggggtgg ggtgaggctg 7500
gggccctgat cacagctgca acttccactt tgtgggaggg ctctccgaac aagtactgga 7560
actcctccac agccacctca ctgtgtaaca tttttagggg aagctacttg gctggagctt 7620
ctctaatcta cacagtaaca agaaacgctg gcttggtcaa gagacgtggg ggtggaacgg 7680
gagagaccct gggagagaaa tggaaggccc gcctgaacca gatgtcggcc ctggagttct 7740
actcctacaa aaagtcaggc atcaccgagg tgtgcagaga agaggcccgc cgcgccctca 7800
aggacggtgt ggcaacggga ggccacgctg tgtcccgagg aagtgcaaag ctgagatggt 7860
tggtggagag gggatacctg cagccctatg gaaaggtcat tgatcttgga tgtggcagag 7920
ggggctggag ttactatgcc gccaccatcc gcaaagttca agaagtgaaa ggatacacaa 7980
aaggaggccc tggtcatgaa gaacccatgt tggtgcaaag ctatgggtgg aacatagtcc 8040
gtcttaagag tggggtggac gtctttcata tggcggctga gccgtgtgac acgttgctgt 8100
gtgatatagg tgagtcatca tctagtcctg aagtggaaga agcacggacg ctcagagtcc 8160
tctccatggt gggggattgg cttgaaaaaa gaccaggagc cttttgtata aaagtgttgt 8220
gcccatacac cagcactatg atggaaaccc tggagcgact gcagcgtagg tatgggggag 8280
gactggtcag agtgccactc tcccgcaact ctacacatga gatgtactgg gtctctggag 8340
cgaaaagcaa caccataaaa agtgtgtcca ccacgagcca gctccttttg gggcgcatgg 8400
acgggcccag gaggccagtg aaatatgaag aggatgtgaa tctcggctct ggcacgcggg 8460
ctgtggtaag ctgcgctgaa gctcccaaca tgaagatcat tggtaaccgc attgagagga 8520
tccgcagtga gcacgcggaa acgtggttct ttgacgagaa ccacccatat aggacatggg 8580
cttaccatgg aagctacgag gcccccacac aagggtcagc gtcctctcta ataaacgggg 8640
ttgtcaggct cctgtcaaaa ccctgggatg tggtgactgg agtcacagga atagccatga 8700
ccgacaccac accgtatggt cagcaaagag ttttcaagga aaaagtggac actagggtgc 8760
cagaccccca agaaggcact cgtcaggtta tgagcatggt ctcttcctgg ttgtggaaag 8820
agttaggcaa acacaaacgg ccacgagtct gtaccaaaga agagttcatc aacaaggttc 8880
gtagcaacgc agcattaggg gcaatatttg aagaggaaaa agagtggaag actgcagtgg 8940
aagctgtgaa cgatccaagg ttctgggctc tagtggacaa ggaaagagag caccacctga 9000
gaggagagtg ccagagctgt gtgtacaaca tgatgggaaa aagagaaaag aaacaagggg 9060
aatttggaaa ggccaagggc agccgcgcca tctggtacat gtggctaggg gctagatttc 9120
tagagttcga agcccttgga ttcttgaacg aggatcactg gatggggaga gagaattcag 9180
gaggtggtgt tgaagggcta ggattacaaa gactcggata tgtcttagaa gagatgagtc 9240
gcataccagg aggaaggatg tatgcagatg atactgctgg ctgggacacc cgcatcagca 9300
ggtttgatct ggagaatgaa gctctaatca ccaaccaaat ggagaaaggg cacagggcct 9360
tggcattggc cataatcaag tacacatacc aaaacaaagt ggtaaaggtc cttagaccag 9420
ctgaaaaagg gaagacagtt atggacatta tttcaagaca agaccaaagg gggagcggac 9480
aagttgtcac ttacgctctt aatacattta ccaacctagt ggtgcagctc attcggaata 9540
tggaggctga ggaagttcta gagatgcaag acttgtggct gctgcggagg tcagagaaag 9600
tgaccaactg gttgcagagc aatggatggg ataggctcaa acgaatggca gtcagtggag 9660
atgattgcgt tgtgaaacca attgatgata ggtttgcaca tgctctcagg ttcttgaatg 9720
atatgggaaa agttaggaag gacacacaag agtggaagcc ctcaactgga tgggacaact 9780
gggaagaagt tccgttttgc tcccaccact tcaacaagct ccatctcaag gacgggaggt 9840
ccattgtggt tccctgccgc caccaagatg aactgattgg ccgagctcgc gtctcaccgg 9900
gggcgggatg gagcatccgg gagactgctt gcctagcaaa atcatatgcg caaatgtggc 9960
agctccttta tttccacaga agggacctcc gactgatggc caatgccatt tgttcatctg 10020
tgccagttga ctgggttcca actgggagaa ctacctggtc aatccatgga aagggagaat 10080
ggatgaccac tgaagacatg cttgtggtgt ggaacagagt gtggattgag gagaacgacc 10140
acatggaaga caagacccca gttacgaaat ggacagacat tccctatttg ggaaaaaggg 10200
aagacttgtg gtgtgggtct ctcatagggc acagaccgcg caccacctgg gctgagaaca 10260
ttaaaaacac agtcaacatg atgcgtagga tcataggtga tgaagaaaag tacgtggact 10320
acctatccac ccaagttcgc tacttgggcg aagaagggtc cacacctgga gtgctataag 10380
caccaatctt agtgttgtca ggcctgctag tcagccacag cttggggaaa gctgtgcagc 10440
ctgtgacccc cccaggagaa gctgggaaac caagcccata gtcaggccga gaacgccatg 10500
gcacggaaga agccatgctg cctgtgagcc cctcagagga cactgagtca aaaaacccca 10560
cgcgcttgga ggcgcaggat gggaaaagaa ggtggcgacc ttccccaccc tttaatctgg 10620
ggcctgaact ggagatcagc tgtggatctc cagaagaggg actagtggtt agaggagacc 10680
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gctgacggtg tgacgttctc tgttccggtc acaccacata cgttccgcca ttcctatgcg 12180
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gtagtgttct gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg 12600
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cggccggccg ccggcgttgt ggatacctcg cggaaaactt ggccctcact gacagatgag 12900
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aggctcgatt tcggccggcg acgtggagct ggccagcctc gcaaatcggc gaaaacgcct 13020
gattttacgc gagtttccca cagatgatgt ggacaagcct ggggataagt gccctgcggt 13080
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gaaaatccag catttgcaag ggtttccgcc cgtttttcgg ccaccgctaa cctgtctttt 13260
aacctgcttt taaaccaata tttataaacc ttgtttttaa ccagggctgc gccctgtgcg 13320
cgtgaccgcg cacgccgaag gggggtgccc ccccttctcg aaccctcccg gtcgagtgag 13380
cgaggaagca ccagggaaca gcacttatat attctgctta cacacgatgc ctgaaaaaac 13440
ttcccttggg gttatccact tatccacggg gatattttta taattatttt ttttatagtt 13500
tttagatctt cttttttaga gcgccttgta ggcctttatc catgctggtt ctagagaagg 13560
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cgcgaatcgt ccagtcaaac gacctcactg aggcggcata tagtctctcc cgggatcaaa 13860
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ttcccttctt tatcgggtta cagaaccggt ttacgcagtt tcggcttagt gaaacaaaag 14220
aaatcaccaa tccgtatgcc atgcgtttat acgaatccct gtgtcagtat cgtaagccgg 14280
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ctcatatcgt attttccttc cgcgatatca cttccatgac gacaggatag tctgagggtt 14520
atctgtcaca gatttgaggg tggttcgtca catttgttct gacctactga gggtaatttg 14580
tcacagtttt gctgtttcct tcagcctgca tggattttct catacttttt gaactgtaat 14640
ttttaaggaa gccaaatttg agggcagttt gtcacagttg atttccttct ctttcccttc 14700
gtcatgtgac ctgatatcgg gggttagttc gtcatcattg atgagggttg attatcacag 14760
tttattactc tgaattggct atccgcgtgt gtacctctac ctggagtttt tcccacggtg 14820
gatatttctt cttgcgctga gcgtaagagc tatctgacag aacagttctt ctttgcttcc 14880
tcgccagttc gctcgctatg ctcggttaca cggctgcggc gagcgctagt gataataagt 14940
gactgaggta tgtgctcttc ttatctcctt ttgtagtgtt gctcttattt taaacaactt 15000
tgcggttttt tgatgacttt gcgattttgt tgttgctttg cagtaaattg caagatttaa 15060
taaaaaaacg caaagcaatg attaaaggat gttcagaatg aaactcatgg aaacacttaa 15120
ccagtgcata aacgctggtc atgaaatgac gaaggctatc gccattgcac agtttaatga 15180
tgacagcccg gaagcgagga aaataacccg gcgctggaga ataggtgaag cagcggattt 15240
agttggggtt tcttctcagg ctatcagaga tgccgagaaa gcagggcgac taccgcaccc 15300
ggatatggaa attcgaggac gggttgagca acgtgttggt tatacaattg aacaaattaa 15360
tcatatgcgt gatgtgtttg gtacgcgatt gcgacgtgct gaagacgtat ttccaccggt 15420
gatcggggtt gctgcccata aaggtggcgt ttacaaaacc tcagtttctg ttcatcttgc 15480
tcaggatctg gctctgaagg ggctacgtgt tttgctcgtg gaaggtaacg acccccaggg 15540
aacagcctca atgtatcacg gatgggtacc agatcttcat attcatgcag aagacactct 15600
cctgcctttc tatcttgggg aaaaggacga tgtcacttat gcaataaagc ccacttgctg 15660
gccggggctt gacattattc cttcctgtct ggctctgcac cgtattgaaa ctgagttaat 15720
gggcaaattt gatgaaggta aactgcccac cgatccacac ctgatgctcc gactggccat 15780
tgaaactgtt gctcatgact atgatgtcat agttattgac agcgcgccta acctgggtat 15840
cggcacgatt aatgtcgtat gtgctgctga tgtgctgatt gttcccacgc ctgctgagtt 15900
gtttgactac acctccgcac tgcagttttt cgatatgctt cgtgatctgc tcaagaacgt 15960
tgatcttaaa gggttcgagc ctgatgtacg tattttgctt accaaataca gcaatagtaa 16020
tggctctcag tccccgtgga tggaggagca aattcgggat gcctggggaa gcatggttct 16080
aaaaaatgtt gtacgtgaaa cggatgaagt tggtaaaggt cagatccgga tgagaactgt 16140
ttttgaacag gccattgatc aacgctcttc aactggtgcc tggagaaatg ctctttctat 16200
ttgggaacct gtctgcaatg aaattttcga tcgtctgatt aaaccacgct gggagattag 16260
ataatgaagc gtgcgcctgt tattccaaaa catacgctca atactcaacc ggttgaagat 16320
acttcgttat cgacaccagc tgccccgatg gtggattcgt taattgcgcg cgtaggagta 16380
atggctcgcg gtaatgccat tactttgcct gtatgtggtc gggatgtgaa gtttactctt 16440
gaagtgctcc ggggtgatag tgttgagaag acctctcggg tatggtcagg taatgaacgt 16500
gaccaggagc tgcttactga ggacgcactg gatgatctca tcccttcttt tctactgact 16560
ggtcaacaga caccggcgtt cggtcgaaga gtatctggtg tcatagaaat tgccgatggg 16620
agtcgccgtc gtaaagctgc tgcacttacc gaaagtgatt atcgtgttct ggttggcgag 16680
ctggatgatg agcagatggc tgcattatcc agattgggta acgattatcg cccaacaagt 16740
gcttatgaac gtggtcagcg ttatgcaagc cgattgcaga atgaatttgc tggaaatatt 16800
tctgcgctgg ctgatgcgga aaatatttca cgtaagatta ttacccgctg tatcaacacc 16860
gccaaattgc ctaaatcagt tgttgctctt ttttctcacc ccggtgaact atctgcccgg 16920
tcaggtgatg cacttcaaaa agcctttaca gataaagagg aattacttaa gcagcaggca 16980
tctaaccttc atgagcagaa aaaagctggg gtgatatttg aagctgaaga agttatcact 17040
cttttaactt ctgtgcttaa aacgtcatct gcatcaagaa ctagtttaag ctcacgacat 17100
cagtttgctc ctggagcgac agtattgtat aagggcgata aaatggtgct taacctggac 17160
aggtctcgtg ttccaactga gtgtatagag aaaattgagg ccattcttaa ggaacttgaa 17220
aagccagcac cctgatgcga ccacgtttta gtctacgttt atctgtcttt acttaatgtc 17280
ctttgttaca ggccagaaag cataactggc ctgaatattc tctctgggcc cactgttcca 17340
cttgtatcgt cggtctgata atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg 17400
attattagtc tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc 17460
acggtcccac tcgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg accacggtcc cactcgtatc 17520
gtcggtctga ttattagtct gggaccatgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag 17580
tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggaa ccacggtccc 17640
actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct 17700
gattattagt ctgggaccac gatcccactc gtgttgtcgg tctgattatc ggtctgggac 17760
cacggtccca cttgtattgt cgatcagact atcagcgtga gactacgatt ccatcaatgc 17820
ctgtcaaggg caagtattga catgtcgtcg taacctgtag aacggagtaa cctcggtgtg 17880
cggttgtatg cctgctgtgg attgctgctg tgtcctgctt atccacaaca ttttgcgcac 17940
ggttatgtgg acaaaatacc tggttaccca ggccgtgccg gcacgttaac tgtgtcagtt 18000
agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 18060
ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 18120
catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 18180
aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 18240
agaggccgag gccgcctc 18258
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3' UTR寨卡10个核苷酸缺失
<400> 8
ccagaagagg 10
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3' UTR寨卡20个核苷酸缺失
<400> 9
ctgtggatct ccagaagagg 20
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物 - 1193F
<400> 10
ccgctgccca acacaag 17
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物 - 1269R
<400> 11
ccactaacgt tcttttgcag acat 24
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 连接至FAM
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 连接至Zen
<400> 12
agcctacctt gacaagcaat cagacactca a 31
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物 - 1183F
<400> 13
ccaccaatgt tctcttgcag acatattg 28
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物 - 1268R
<400> 14
ttcggacagc cgttgtccaa cacaag 26
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 连接至FAM
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 连接至Zen
<400> 15
agcctacctt gacaagcagt c 21
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物 - 1193F
<400> 16
ccgctgccca acacaag 17
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物 - 1269R
<400> 17
ccactaacgt tcttttgcag acat 24
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 连接至FAM
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 连接至Zen
<400> 18
agcctacctt gacaagcaat cagacactca a 31
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针 - 3IABkFQ-3'
<400> 19
tgacaagcaa tcagacactc aa 22
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 野生型
<400> 20
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 10个核苷酸缺失
<400> 21
tggagatcag ctgtggatcg actagtggtt agag 34
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 20个核苷酸缺失
<400> 22
tggagatcag gactagtggt tagag 25
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 30个核苷酸缺失-a
<400> 23
gactagtggt tagag 15
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 30个核苷酸缺失-b
<400> 24
tggagatcag ctgtg 15
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FSS13025/KU955593
<400> 25
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H/PF2013/KJ776791
<400> 26
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PRVABC 59/KU501215
<400> 27
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Natal RGN/KU527068
<400> 28
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZKV2015/KU497555
<400> 29
tggagatcag ctgtggatct ccagaagagg gactagtggt tagag 45
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P6-740/KX377336
<400> 30
tggagatcag ctgtggatct ccaggagagg gactagcggt tagag 45
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MR 766/ AY632535
<400> 31
tggagactag ctgtgaatct ccagcagagg gactagtggt tagag 45
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DAK-41525/KU955591
<400> 32
tggagattag ctgtgaatct ccggcagaag gactagtggt tagag 45

Claims (13)

1.一种活减毒寨卡病毒(ZIKV)毒株，所述毒株的ZIKV基因组在3’非翻译区(3’UTR)中存在缺失，所述缺失相应于SEQ ID NO:1的核苷酸271-280即CCAGAAGAGG(SEQ ID NO:8)的缺失。
2.如权利要求1所述的活减毒ZIKV毒株，其中在ZIKV基因组中的3’UTR由SEQ ID NO:2或3的核酸序列组成。
3.如权利要求1所述的活减毒ZIKV毒株，其为mCherry ZIKV毒株。
4.如权利要求1所述的活减毒ZIKV毒株，其中所述ZIKV基因组的核酸序列为在SEQ IDNO:6的核苷酸1-10807经历3’UTR缺失后获得的核酸序列，所述3’UTR缺失相应于SEQ IDNO:1的核苷酸271-280即CCAGAAGAGG(SEQ ID NO:8)的缺失。
5.如权利要求1所述的活减毒ZIKV毒株，其中所述3’UTR缺失相应于SEQ ID NO:1的核苷酸261-280即CTGTGGATCTCCAGAAGAGG(SEQ ID NO:9)的缺失。
6.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的活减毒ZIKV毒株，所述免疫原性组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其适用于胃肠外或肠内施用。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的活减毒ZIKV毒株在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于在有需要的受试者中引发免疫应答，其中所述免疫应答为针对ZIKV的CD8+T细胞应答、抗体应答和/或细胞免疫应答。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述受试者为妊娠女性。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述免疫原性组合物用于预防先天性ZIKV综合征。
11.如权利要求8所述的用途，其中所述免疫原性组合物用于预防小头畸形。
12.如权利要求8所述的用途，其中所述免疫原性组合物在随后用野生型ZIKV毒株攻击后预防所述受试者中的病毒血症。
13.如权利要求8所述的用途，其中所述受试者为人。
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