BR112019016309A2 - Vírus da zika atenuado vivo com deleção 3'utr, vacina contendo o mesmo e uso da mesma - Google Patents

Abstract

a presente invenção divulga uma cepa atenuada viva do vírus da zika (zikv) tendo uma deleção na região não traduzida 3? (3?utr) do genoma viral a qual pode afetar a síntese de rna viral e a sensibilidade a inibição de interferon tipo i, mas não pode afetar a tradução de rna viral. a presente invenção também divulga o uso destas cepas de zikv atenuado vivo na preparação de vacina de zikv e para fornecer imunoproteção contra infecção de zikv e síndrome de zikv congênita, particularmente em fêmeas grávidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VÍRUS DA ZIKA ATENUADO VIVO COM DELEÇÃO 3’UTR, VACINA CONTENDO O MESMO E USO DO MESMO.

DECLARAÇÃO RELATIVA À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL [001] A invenção foi financiada pela concessão da NIH Al 120942. PEDIDOS RELACIONADOS [002] Este pedido de PCT reivindica a prioridade para o Pedido Provisório US 62/458.839, depositado em 14 de fevereiro de 2017, cujo conteúdo é incorporado por referência na sua totalidade aqui.

CAMPO DA INVENÇÃO [003] A invenção geralmente se refere ao desenvolvimento de uma cepa viva atenuada do Zika vírus (ZIKV) e composições de vacinas compreendendo esta cepa. A cepa e as vacinas que a compõem podem ser usadas em humanos e animais para tratar ou fornecer imunoproteção contra o ZIKV, que pode causar a síndrome do ZIKV congênita e a síndrome de Guillan-Barré. A invenção divulga especificamente métodos de proteção contra a síndrome do ZIKV congênita, incluindo a microcefalia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [004] O ZIKV, transmitido por mosquitos, recentemente causou uma ameaça global à saúde pública. A doença mais devastadora associada à infecção pelo Zika vírus (ZIKV) é a ampla gama de anomalias congênitas (incluindo a microcefalia), agora coletivamente conhecida como síndrome do ZIKV congênita (Referência 1). A prevenção da síndrome do ZIKV congênita é a tarefa mais urgente para reduzir a carga de epidemias na família e na sociedade (Referência 2). Em particular, as mulheres grávidas sem imunidade ao ZIKV em países endêmicos correm risco de infecção fetal e defeitos congênitos. Como o ZIKV também pode ser transmitido sexualmente, as mulheres que vi

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 5/134

2/95 vem em regiões não endêmicas também podem estar em risco quando expostas a homens que viajaram para países endêmicos.

[005] O ZIKV é transmitido para as pessoas principalmente pela picada de um mosquito da espécie Aedes. Os sintomas mais comuns do ZIKV são febre, erupção cutânea, dor nas articulações e conjuntivite. A doença é geralmente leve, com sintomas aparecendo de 2 a 7 dias após serem picados por um mosquito infectado e durando vários dias a uma semana. No entanto, houve relatos de síndrome do ZIKV congênita, por exemplo, defeitos congênitos sérios, especialmente microcefalia, e outros resultados insatisfatórios da gravidez em bebês de mães que foram infectadas com ZIKV durante a gravidez. Também houve casos de síndrome de Guillain-Barré (GBS) relatados em pacientes após suspeita de infecção por ZIKV. A GBS é um distúrbio raro em que o sistema imunológico de uma pessoa danifica as células nervosas, causando fraqueza muscular e, às vezes, paralisia. Esses sintomas podem durar de algumas semanas a vários meses, embora algumas pessoas tenham danos permanentes e, em casos raros, a GBS pode resultar em morte.

[006] O ZIKV é um membro do gênero Flavivírus (da família Flaviviridae), que também inclui outros importantes patógenos humanos, por exemplo, febre amarela (YFV), Nilo Ocidental (WNV), encefalite Japonesa (JEV), encefalite do carrapato (TBEV) e viroses da Dengue (DENV). Como outros membros do gênero Flavivírus, o Zika contém um RNA genômico de cadeia simples positiva, codificando uma poliproteína que é processada em três proteínas estruturais (proteínas de capsídeo [C], pré-membrana [prM] e de envelope [E]) e sete proteínas não estruturais. (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Proteínas estruturais formam virions, enquanto proteínas não estruturais participam da síntese de RNA viral, montagem de virions e evasão da resposta imune.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 6/134

3/95 [007] Ambas as vacinas inativadas e vivas atenuadas foram desenvolvidas para flavivírus, incluindo YFV, JEV, TBEV e DENV (Referência 3). O progresso rápido e promissor foi feito para o desenvolvimento da vacina do ZIKV (Referências 4 e 5). As vacinas de subunidades e do ZIKV inativadas (expressando proteínas prM/E virais) mostraram eficácia em camundongos e primatas não humanos (Referências 6 a 8). Uma vacina bem-sucedida requer um bom equilíbrio entre imunogenicidade e segurança. Vacinas vivas atenuadas geralmente oferecem imunidade rápida e durável, mas às vezes com o trade-off de segurança reduzido; enquanto s vacinas inativadas e de subunidade fornecem maior segurança ao custo da imunogenicidade reduzida, e geralmente requerem doses múltiplas e reforços periódicos.

[008] A presente invenção aborda a necessidade de novas vacinas do ZIKV que servem populações em risco, a fim de tratar e/ou fornecer imunoproteção contra infecções provocadas pelo ZIKV e prevenir a síndrome do ZIKV congênita, especialmente microcefalia.

[009] A invenção, em geral, se refere a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV), que compreende uma deleção na região não traduzida 3’ (3’UTR) do genoma do ZIKV.

[0010] O invenção se refere mais especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV), em que a deleção 3'UTR varia de uma deleção de 10 nucleotídeos a uma deleção de 50 nucleotídeos (isto é, deleção 3'UTR Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49 ou Δ50) em modalidades exemplificadoras, a deleção 3'UTR é uma deleção de 10 nucleotídeos, uma deleção de 20 nucleotídeos ou uma deleção de 30 nucleotídeos.

[0011] A invenção se refere mais especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) compreendendo uma 3'UTR tendo

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 7/134

4/95 pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5.

[0012] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como descrito acima, que é incompetente na infecção de mosquitos.

[0013] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito, que exibe uma síntese de RNA viral diminuída em comparação com cepas de ZIKV do tipo selvagem.

[0014] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito, que exibe uma sensibilidade aumentada à inibição do interferon do tipo I em comparação com as cepas de ZIKV do tipo selvagem.

[0015] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito, em que a deleção não afeta a tradução de RNA viral.

[0016] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito que é uma cepa mCherry ZIKV.

[0017] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito que compreende ou consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO:6 em que a sequência CCAGAAGAGG (3'UTR deleção de 10 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 8) é deletada da mesma.

[0018] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito que compreende ou consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO:6 em que a sequência CTGTGGATCTCCAGAAGAGG (3'UTR deleção de 20 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 9) é deletada da mesma.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 8/134

5/95 [0019] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito que compreende ou consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO:7 em que a sequência CCAGAAGAGG (3'UTR deleção de 10 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 8) é deletada da mesma.

[0020] A invenção também se refere especificamente a uma cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV) como acima descrito que compreende ou consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO:7 em que a sequência CTGTGGATCTCCAGAAGAGG (3'UTR deleção de 20 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 9) é deletada da mesma.

[0021] A invenção também se refere especificamente a uma composição imunogênica compreendendo uma cepa do ZIKV atenuado vivo como acima descrito, que compreende ainda pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0022] A invenção também se refere especificamente a uma composição imunogênica compreendendo uma cepa do ZIKV atenuado vivo como acima descrito, que é adequada para administração parentérica ou entérica.

[0023] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma cepa do ZIKV atenuado vivo ou composição imunogênica como descrito acima.

[0024] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma cepa do ZIKV atenuado vivo ou composição imunogênica como descrito acima, que induz uma resposta de células T CD8⁺, uma resposta de anticorpo e/ou uma resposta imune celular contra o ZIKV.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 9/134

6/95 [0025] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou cepa do ZIKV atenuado vivo como descrito acima, que produz uma titulação de anticorpo de neutralização equivalente ao da infecção por ZIKV do tipo selvagem.

[0026] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou cepa do ZIKV atenuado vivo como descrito acima, em que o sujeito é uma fêmea grávida.

[0027] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma cepa viva atenuada de ZIKV ou composição imunogênica como descrito acima, de modo a prevenir a síndrome do ZIKV congênito.

[0028] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma cepa viva atenuada de ZIKV ou composição imunogênica como descrito acima, de modo a prevenir a microcefalia.

[0029] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou cepa do ZIKV atenuado vivo como descrito acima, em que pelo

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 10/134

7/95 menos 1,0 x 10¹, 1,0 x 10² 1,0 x 10³, 1,0 x 10⁴, 1,0 x 10⁵, ou 1,0 x 10⁶ IFUs da cepa do ZIKV atenuado vivo são administradas ao sujeito.

[0030] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou cepa do ZIKV atenuado vivo como descrito acima, em que a administração da referida composição previne viremia no referido sujeito após o desafio subsequente com uma cepa ZIKV do tipo selvagem.

[0031] A invenção também se refere especificamente a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou cepa do ZIKV atenuado vivo como descrito acima, em que o sujeito é um humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS [0032] As FIGURAS 1A-1F contêm caracterizações dos mutantes de deleção 3'UTR em cultura de células. A FIG. 1A fornece sequências das eliminações do ZIKV 3'UTR. A FIG. 1B mostra um ensaio de foco de imunocoloração de vírus mutantes. Quantidades iguais de RNAs (10 pg) transcritos de seus clones de cDNA infecciosos correspondentes foram eletroporadas em células Vero. No dia ou 5 dias póstransfecção, os fluidos de cultura das células transfectadas foram coletados e quantificados para vírus infecciosos (definidos como vírus P0) usando um ensaio de foco de imunocoloração em células Vero. A FIG. 1C demonstra a cinética de replicação dos vírus WT e mutante. As células Vero em placas de 24 poços (2x10⁵ células por poço) foram infectadas com vírus WT e mutantes a uma MOI de 0,01. Os fluidos de cultura foram quantificados para vírus infecciosos nos dias 1 a 5 usando o ensaio de foco de imunocoloração. Da esquerda para a direita para

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 11/134

8/95 cada dia, as barras correspondem a: WT, 10-del, 20-del, 30-del-a e 30del-b. A FIG. 1D ilustra um construto de replicon de repórter de Renilla luciferase. A FIG. 1E contém uma análise replicon das deleções 3'UTR. Um replicon de repórter de Renilla luciferase do ZIKV (FIG. 1D) foi projetado com várias deleções 3'UTR. Quantidades iguais de replicon WT e RNAs mutantes (10 pg) foram eletroporadas em células Vero. Os sinais de luciferase foram medidos nos pontos de tempo indicados. Um replicon não replicativo contendo uma mutação de GDD inativa da polimerase NS5 foi incluído como um controle negativo. As médias de três repetições são apresentadas. Barras de erro representam desvios padrão. RLU, unidades de luz relativas. A curva superior corresponde a WT e a curva inferior corresponde ao controle de GDD. A FIG. 1F mostra a inibição do interferon-β de ZIKVs mutantes e WT. As células Vero foram semeadas em placa de 96 poços (1,5x10⁴ células por poço) um dia antes do tratamento com interferon e infecção viral. As células foram infectadas a um MOI 0,05 na presença de IFN-β (55, 167, 500 ou 1.500 lU/ml). A infecção viral e o tratamento com interferon foram iniciados ao mesmo tempo. Às 48 h pós-infecção e tratamento com interferons-β, as titulações virais foram quantificadas usando o ensaio de foco de imunocoloração em células Vero. As porcentagens de inibição da titulação viral são apresentadas em escala de log™. As titulações virais sem tratamento com interferons-β estão definidas como 100%. Os resultados médios de três experimentos independentes são mostrados. Barras de erro representam desviospadrão. Os símbolos ** e *** indicam valores de P <0,01 e <0,001, respectivamente. Da esquerda para a direita para cada dia, as barras correspondem a: WT, 10-del, 20-del, 30-del-a e 30-del-b.

[0033] As FIGURAS 2A-2B mostram a informação da sequência de 3'UTR e os mutantes de deleção. A FIG. 2A representa a estrutura secundária de RNA prevista do ZIKV 3'UTR. A estrutura tronco-alça de

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 12/134

9/95

3'UTR do genoma do ZIKV é apresentada como relatado anteriormente (Referências 33, 34). A sequência de nucleotídeos da malha de tronco-alça é mostrada. As sequências deletadas para os mutantes 10-del, 20-del, 30-del-a e 30-del-b são exibidas em azul, magenta, verde e laranja, respectivamente. A FIG. 2B mostra um alinhamento de sequências da região deletada (posição de nucleotídeo 10.63010.674) na 3'UTR. Os nucleotídeos com 10-del são indicados. Dentro da região com 10-del, as variações de sequência são observadas para isolados precoces (P6-740, MR766 e DAK-41525 foram isolados em 1966, 1947 e 1984, respectivamente), enquanto uma sequência idêntica é observada para as cepas isoladas após 2010 (FSS13025, H/PF2013, PRVABC 59, Natal RGN, e ZKV2015).

[0034] A FIG. 3 mostra um ensaio de imunofluorescência (IFA) da expressão de proteína viral em células transfectadas com WT ou RNA de deleção 3'UTR do ZIKV. As células Vero foram eletroporadas com 10 pg de WT genômico ou RNA de deleção 3'UTR do ZIKV. Nos dias 2 e 3 pós-transfecção, o IFA foi realizado para examinar a expressão da proteína E viral usando um mAb de camundongo (4G2) e IgG anticamundongo de cabra Alexa Fluor® 488 como anticorpos primário e secundário, respectivamente. Verde e azul representam proteína E núcleos (corados com DAPI), respectivamente. A coloração da proteína E viral é visível para WT e para todos os grupos mutantes nos dois dias.

[0035] As FIGURAS 4A-4C contêm uma análise de estabilidade das deleções 3'UTR dos ZIKVs em cultura de células. Os vírus P0 (derivados dos fluidos de cultura de células transfectadas com RNA da Fig. 1) foram continuamente cultivados em células Vero durante cinco ciclos (5 dias para cada ciclo de cultura), resultando em vírus P5. Os vírus P5 foram então caracterizados. A FIG. 4A mostra os resultados de um ensaio de foco de imunocoloração. Os vírus mutantes de WT e

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 13/134

10/95

P5 foram analisados usando um ensaio de foco de imunocoloração em células Vero. Para cada vírus mutante, três seleções independentes foram realizadas em células Vero. Imagens representativas de focos infecciosos para cada vírus mutante de P5 são apresentadas. A FIG. 4B mostra cinética de replicação. As células Vero em placas de 24 poços (2 x10⁵ células por poços) foram infectadas com vírus mutantes de WT e P5 a um MOI de 0,01. Os fluidos de cultura foram quantificados para vírus infecciosos nos dias 1 a 5 usando o ensaio de foco de imunocoloração em células Vero. Da esquerda para a direita para cada dia, as barras correspondem a: WT, 10-del, 20-del, 30-del-a e 30-delb. A FIG. 4C mostra mutações adaptativas em vírus mutantes de P5. Os genomas completos dos vírus mutantes de P5 foram sequenciados para cada uma das três seleções independentes. As mutações adaptativas são indicadas pelas suas posições de aminoácidos dos genes indicados com base na cepa ZIKV FSS13025 (número do GenBank KU955593.1).

[0036] As FIGURAS 5A-5G mostram uma caracterização de mutantes 3'UTR no modelo de camundongo A129. A FIG. 5A contém um esquema experimental. Em dois experimentos separados, camundongos A129 com três semanas de idade (n = 8) foram imunizados por via S.C. com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e mutantes. Os camundongos imunizados foram monitorados quanto a perda de peso, sobrevivência e viremia. A FIG. 5B mostra os resultados para perda de peso. A perda de peso é indicada por porcentagem usando o peso no dia antes da imunização como 100%. A curva mais baixa corresponde a WT. A FIG. SC mostra os resultados para sobrevivência. A curva mais baixa corresponde a WT. A FIG. 5D mostra os resultados para viremia. As viremias foram quantificadas por um ensaio de foco de imunocoloração dos dias 2 a 4 pós-infecção. Da esquerda para a direita para cada dia, as barras correspondem a: WT, 10-del, 20-del, 30-del-a e 30-del-b. A

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 14/134

11/95

FIG. 5E mostra as titulações de anticorpos de neutralização prédesafio. No dia 28 pós-imunização, os soros de camundongo foram medidos quanto às titulações de neutralização usando um ensaio de infecção mCherry ZIKV (FIG. 6A-6B). A FIG. 5F mostra a viremia pósdesafio. No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram desafiados com 1x10⁵ vírus parentais de PFU (cepa do ZIKV FSS13025) via rota

I.P. A viremia no dia 2 pós-desafio foi quantificada usando o ensaio de foco de imunocoloração. A FIG. 5G mostra a titulação de anticorpo de neutralização pós-desafio. No dia 28 pós-desafio, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de neutralização usando o ensaio de infecção mCherry ZIKV. LO.D.: limite de detecção.

[0037] As FIGURAS 6A-6B mostram a construção de mCherry ZIKV. A FIG. 6A mostra um genoma esquemático de um mCherry ZIKV. Um fragmento de DNA (que codifica os primeiros 25 aminoácidos do gene C, o gene mCherry e a proteína 2A do vírus da febre aftosa) foi fundido com a estrutura de leitura aberta do genoma do ZIKV. A FIG. 6B mostra a expressão de mCherry em células Vero transfectadas com RNA de mCherry ZIKV. A expressão de mCherry em células Vero transfectadas foi analisada por microscopia de fluorescência nos dias indicados após a transfecção. O mCherry ZIKV foi utilizado para estimar as titulações de neutralização de anticorpos de soros de camundongos, conforme descrito nos Métodos.

[0038] As FIGURAS 7A-7C mostram a eficácia da imunização com 100 IFU de vírus de 10-del. A FIG. 7A mostra a viremia após a imunização com 100 IFU de WT (barra da esquerda) ou ZIKV 10-del (barra da direita). Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 100 IFU WT ou vírus de 10-del por via S.C. A viremia foi quantificada por ensaio de foco de imunocoloração do dia 2 ao dia 6. LOD, limite de detecção. A FIG. 7B mostra as titulações de anticorpos de neutralização pré-desafio. No dia 28 pós-imunização, os

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 15/134

12/95 soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV. A FIG. 7C mostra a viremia após o desafio com ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59). No dia 28 pósimunização, os camundongos foram desafiados com 1 x 10⁶ IFU do ZIKV via rota LP. As viremias foram quantificadas por ensaio de foco de imunocoloração no dia 2 pós-desafio.

[0039] As FIGURAS 8A-8C mostram a eficácia da imunização com 10 IFU de vírus de 10-del. A FIG. 8A mostra a viremia após a imunização com 10 IFU de WT ou ZIKV de 10-del. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 10 IFU de vírus WT ou de 10-del por via S.C.. A viremia foi quantificada por ensaio de foco de imunocoloração do dia 4 ao dia 7. LOD, limite de detecção. A FIG. 8B mostra as titulações de anticorpos de neutralização pré-desafio. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 10 IFU de ZIKV de 10-del e PBS por via S.C. No dia 28 pós-imunização, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV. No mesmo dia, os camundongos foram desafiados com 1 x 10⁶ IFU de ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59) via rota LP. A FIG. 8B mostra a viremia após o desafio com ZIKV epidêmico (cepa de Porto Rico PRVABC59). No dia 2 pós-desafio, as viremias foram quantificadas usando um ensaio de foco de imunocoloração. L.O.D.: limite de detecção.

[0040] As FIGURAS 9A-9D mostram as respostas das células T após infecção primária com ZIKV WT ou mutante de 10-del. Camundongos A129 foram infectados com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e 10-del. No dia 28 pós-infecção, os baços de camundongo foram colhidos. Esplenócitos foram contados, cultivados ex vivo com ZIKV WT por 24, e corados para marcadores (IFN-γ, CD3 e CD4 ou CD8). As células T foram capturadas com base na coloração desses marcadores. A FIG.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 16/134

13/95

9A mostra porcentagens de células CD4⁺IFN-y⁺ e células CD8⁺IFN-y⁺. A FIG. 9B mostra o número total médio de subconjuntos de células T por baço. Os sobrenadantes da cultura ex vivo foram colhidos no dia 2 após a re-estimulação de ZIKV WT e medidos para a produção de IFN-γ e IL-2. A FIG. 9C mostra a produção de IFN-γ. A FIG. 9D mostra a produção de IL-2. Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 2-4 por grupo. Diferença de *P <0,05 ou **P <0,01 entre os camundongos infectados por vírus e simulados.

[0041] As FIGURAS 10A-10C mostram a avaliação de segurança do vírus de 10-del. A FIG. 10A mostra as cargas virais em órgãos de camundongos A129 infectados. Camundongos A129 com três semanas de idade foram imunizados com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e 10-del. Órgãos de camundongos infectados foram coletados e homogeneizados nos dias 6 e 10 pós-infecção. As quantidades de vírus foram quantificadas em células Vero usando um ensaio de foco de imunocoloração. Os resultados médios de três animais são apresentados. Barras denotam erros padrão. não denota vírus detectáveis. Da esquerda para a direita em cada dia, as barras correspondem a: coração, pulmão, fígado, baço, rim, músculo, cérebro, testículo e olho. A FIG. 10B mostra uma comparação da neurovirulência dos vírus WT e 10-del em camundongos CD1 recém-nascidos. Grupos de camundongos CD1 com um dia de idade (n = 7-10) foram injetados via I.C. com 10 a 1x10⁴ IFU de vírus WT ou 10-del. Todas as curvas do vírus de 10-del mostram 100% de sobrevivência, enquanto as curvas de WT mostram menos de 100% de sobrevivência. A FIG. 10C mostra os resultados de um ensaio de infecciosidade do mosquito. Os Aedes aegypti foram alimentados com vírus WT ou de 10-del em refeições de sangue artificial. No dia 7 pós-alimentação, os mosquitos incubados e ingurgitados individuais foram homogeneizados e a infecção foi avaliada por imunocoloração da expressão da proteína viral em células Vero inocula

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 17/134

14/95 das (ver Métodos para detalhes). O número de mosquitos infectados e o número total de mosquitos ingurgitados são indicados.

[0042] As FIGURAS 11A-11C mostram a comparação da viremia e eficácia dos vírus de 10-del P0 e P5. A FIG. 11A mostra a viremia após a imunização com 100 IFU de ZIKV de 10-del P0 ou P5. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 100 IFU vírus de 10-del P0 ou P5por via S.C. A viremia foi quantificada pelo ensaio de concentração por imunocoloração do dia 4 ao dia 6. LOD, limite de detecção. A FIG. 11B mostra as titulações de anticorpos de neutralização pré-desafio. No dia 28 pós-imunização, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV. A FIG. 11C mostra viremia após o desafio com ZIKV do tipo selvagem. No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram desafiados com 1 x 10⁶ IFU de uma cepa epidêmica do ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59) via rota LP. No dia 2 pós-desafio, as viremias foram quantificadas utilizando um ensaio de foco de imunocoloração.

[0043] As FIGURAS 12A-12B mostram uma análise da contagem de espermatozóides de camundongos A129 infectados com vírus mutante WT ou de 10-del. Camundongos machos A129 foram infectados com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e de 10-del (n = 4 por grupo). No dia 16 p.i., o epidídimo foi colhido para análise da contagem de espermatozóides. A FIG. 12A mostra contagens totais de espermatozóides. A FIG. 12B mostra contagem de espermatozóides móveis. O teste ANOVA de via única foi realizado para indicar significância estatística entre os diferentes grupos de infecção, n.s., não significativos; *** muito significativos (valor de p <0,001); **** extremamente significativos (p valor 0,0001).

[0044] As FIGURAS 13A-G mostram que o ZIKV-3'UTR-A10-LAV protege camundongos C57BL/6 prenhes e seus fetos em desenvolvi

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 18/134

15/95 mento. A FIG. 13A mostra o esquema de imunização de camundongos fêmeas C57BL/6 do tipo selvagem (WT) com 10⁵ FFU de ZIKV3'UTR-A10-LAV (Δ10; n = 12) ou simulação de PBS (n = 16). A FIG. 13B mostra experimentos em que o soro foi coletado no dia 28 pósimunização e analisado quanto a atividade de neutralização usando um mCherry ZIKV infeccioso. Curvas representativas de neutralização são mostradas. Barras de erro denotam o desvio padrão (SD) das réplicas técnicas duplicadas. A FIG. 13C mostra os valores de NTsode anticorpos de neutralização que foram medidos para animais individuais. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) do ensaio. As FIGURAS 13D-G mostram que no dia 35 pós-imunização, os camundongos fêmeas vacinados foram acasalados com C57BL/6 WT machos. Um subconjunto dos camundongos fêmeas desenvolveu plugues vaginais. Camundongos prenhes (n = 8 reunidos a partir de dois experimentos independentes) foram administrados 2 mg de anticorpo bloqueador anti-lfnar1 em E5, e um dia depois (E6), desafiados com 10⁵ FFU de uma cepa patogênica, adaptada para camundongos ZIKV Dakar 41519. Em E13, os animais foram eutanisados; baço materno (FIG. 13D), cérebro materno (FIG. 13E), placenta (FIG. 13F) e cabeças fetais (FIG. 13G) foram colhidos e quantificados para os níveis de RNA viral. Níveis medianos de RNA viral são indicados para cada grupo. Os asteriscos indicam diferenças significativas (teste de Mann-Whitney: ****, valor de P <0,0001). Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D. Os resultados na Figura são agrupados a partir de dois experimentos independentes [0045] As FIGURAS 14A-I mostram que ZIKV-3'-UTR-A10-LAV protege camundongos A129 machos jovens contra infecção e lesão do testículo. A FIG. 13A contém o esquema de imunização de camundongos A129 machos de 3 semanas com 10⁴ FFU de ZIKV-3'-UTRΔΙΟ-LAV (Δ10; n = 6) ou simulação de PBS (n = 4 ou 6). No dia 28

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 19/134

16/95 pós-imunização, os camundongos foram medidos quanto às titulações de anticorpos de neutralização. No mesmo dia, os camundongos de um grupo de simulação e os camundongos do grupo imunizado com Δ10 foram desafiados com 10⁶ FFU de ZIKV-PRVABC59 e a viremia foi medida no dia 2 após o desafio (dia 30 pós-imunização). No dia 49 pós-imunização, os camundongos foram analisados quanto à contagem de esperma e à carga viral no testículo. As FIGURAS 14A-B mostram a viremia após imunização com candidato à vacina Δ10. A FIG. 14C contém valores de NT50 de neutralização de anticorpos no dia 28 pós-imunização que foram medidos para animais individuais em cada grupo. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (LOD) do ensaio. A FIG. 14D mostra viremia no dia 2 pós-desafio (dia 30 pósimunização) com ZIKV PRVABC59. A FIG. 14E mostra a carga viral no testículo no dia 21 pós-desafio (dia 49 pós-imunização). As FIGURAS 14F-G mostram a contagem de espermatozóides totais (F) e móveis (G) no dia 21 pós-desafio. (H-l) Peso do testículo (H) e imagens representativas de testículos (i) de animais de grupos de simulação, simulação com desafio e imunizados com Δ10 e desafiados no dia 21 pósdesafio. Barra de escala, 1 mm. Asteriscos indicam diferenças significativas (ANOVA de via única: ****, valor de P <0,0001; ***, valor de P <0,001). Não significativo (n.s.) valor de P > 0,5. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D. Barras de erro representam desvios padrão.

[0046] As FIGURAS 15A-D mostram que o ZIKV-3'UTR-A10-LAV e o ZIKV-3'UTR-A20-LAV protegem os macacos rhesus (RM) da infecção pelo ZIKV. A FIG. 15A mostra o esquema de imunização do RM com 10³ FFU da cepa FSS13025 de ZIKV WT (n = 4), ZIKV-3'UTRΔΙΟ-LAV (Δ10; n = 4), ZIKV-3'UTR-A20-LAV (Δ20; n = 3), ou simulação de PBS ( n = 2) via rota subcutânea. A FIG. 15B mostra viremia medida nos dias 2, 3, 4, 5, 7 e 10 pós-imunização por qRT-PCR. Cada

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 20/134

17/95 linha colorida representa dados de diferentes animais em cada grupo. A linha tracejada indica o limite de detecção (L.O.D.) do ensaio. A FIG. 15C mostra as titulações de neutralização de anticorpos pré-desafio e pós-desafio. Em vários dias pós-imunização, os soros foram medidos para titulações de neutralização usando um ensaio de infecção de mCherry ZIKV. As setas vermelhas indicam desafio com 10³ FFU da cepa PRVABC59 de ZIKV epidêmica via rota subcutânea no dia 56 pós-imunização. O número de animais cujas titulações de neutralização de anticorpos aumentaram por 4 vezes após o desafio é indicado pelo símbolo f para cada grupo experimental. A FIG. 15D mostra viremia pós-desafio. A viremia foi medida por qRT-PCR nos dias 2, 3, 4, 5, 7 e 10 pós-desafio. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D. Barras de erro representam desvios padrão.

[0047] As FIGURAS 16A-H mostram uma avaliação de segurança do candidato à vacina ZIKV-3'-UTR-A20-LAV (Δ20). A FIG. 16A mostra cargas virais em órgãos de camundongos A129 infectados. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 7) foram imunizados por via subcutânea com 10³ FFU de ZIKV WT FSS13025 (painel da esquerda) e seu candidato à vacina Δ20 derivado (painel da direita). Órgãos de camundongos infectados foram coletados e homogeneizados nos dias 6 e 10 pós-infecção. As quantidades de vírus foram quantificadas em células Vero usando um ensaio de formação de foco. Os resultados médios de sete animais são apresentados. Barras denotam erros padrão. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) do ensaio. As FIGURAS 16D-F mostram o efeito da vacinação Δ20 no testículo. Camundongos A129 de três semanas de idade (n = 5) foram infectados por via subcutânea com 1 x 10³ FFU de ZIKV WT FSS 13025 ou candidato à vacina Δ20. No dia 28 pós-infecção, os animais de cada grupo foram analisados quanto ao peso dos testículos

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 21/134

18/95 (FIG. 16B), tamanho do testículo (FIG. 16C), contagens de espermatozóides totais (FIG. 16D), contagens de espermatozóides móveis (FIG. 16E) e carga de RNA viral (FIG. 16F). Barra de escala, 1 mm. (FIG. 16G). Comparação da neurovirulência de ZIKV WT FSS 13025 e candidato à vacina Δ20 em camundongos CD-I não consanguíneos. Camundongos CD-I de um dia de idade (n = 7-8 por grupo) foram injetados intracranealmente com 10 a 10⁴FFU de ZIKV WT ou 10³ a 10⁴ FFU do candidato à vacina Δ20. Os camundongos sobreviventes e os animais infectados totais são indicados. (FIG. 16H) Análise da competência vetorial. Os Aedes aegypti foram alimentados com refeições de sangue artificial enriquecido com 10⁶ FFU/ml de ZIKV WT FSS 13025 ou vírus da vacina Δ20. No dia 7 pós-alimentação, os mosquitos ingurgitados foram ensaiados quanto à infecção por imunocoloração da expressão da proteína viral em células Vero inoculadas. O número de mosquitos infectados e o número total de mosquitos ingurgitados são indicados. Os asteriscos indicam diferenças significativas (ANOVA de via única: ***, valor de P <0,001; **, valor de P <0,01; *, Valor de P <0,05). Não significativo (n.s.) com valor de P> 0,5. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D. Barras de erro representam desvios padrão.

[0048] As FIGURAS 17A-C mostram a carga infecciosa de ZIKV em placentas e cabeças fetais de fêmeas com cria simuladas ou imunizadas com ZIKV-3'UTR-A10-LAV. No experimento de proteção da gravidez (ver detalhes na FIG. 13), no dia 7 pós-desafio (equivalente a E13), a placenta (FIG. 17A) e as cabeças fetais (FIG. 17B) foram coletadas de simulação de PBS e fêmeas com cria imunizadas com ZIKV3'UTR-A10-LAV, e quantificadas para ZIKV infeccioso usando um ensaio de formação de foco. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) dos ensaios. Os resultados são agrupados a partir de dois experimentos biológicos independentes, e cada símbolo represen

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 22/134

19/95 ta dados de uma placenta individual (n = 23) ou feto (n = 30). (FIG. 17C) Correlação da carga viral da placenta E13 com valores de NT50 de neutralização de anticorpo do ZIKV-3'UTR-A10-LAV. Os valores de Pe R² refletem os testes de correlação de Pearson. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D.. Barras de erro representam desvios padrão.

[0049] As FIGURAS 18 A-l contêm experimentos que mostram que o ZIKV-3'UTR-A10-LAV protege camundongos A129 machos adultos contra infecção e lesão do testículo. (A) Esquema de imunização de camundongos A129 machos de 15 semanas de idade com 1 x 10⁴ FFU de ZIKV-3'UTR-A10-LAV (Δ10; n = 5) ou simulação de PBS (n = 5). No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram medidos quanto às titulações de anticorpos de neutralização. No mesmo dia, os camundongos foram desafiados com 10⁶ FFU do ZIKV-PRVABC59. O pico de viremia foi medido no dia 2 pós-desafio (dia 30 pósimunização). No dia 49 pós-imunização, os camundongos foram sacrificados e medidos quanto às contagens de espermatozóides totais e móveis e cargas virais nos testículos. A FIG. 18B mostra viremia após imunização com ZIKV-3'UTR-A10-LAV. A FIG. 18C mostra valores de NT50 de neutralização de anticorpos no dia 28 pós-imunização. As titulações de neutralização de anticorpos foram medidas para animais individuais em cada grupo por um mCherry ZIKV. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) do ensaio. A FIG. 18D mostra viremia no dia 2 pós-desafio (dia 30 pós-imunização). No dia 21 pósdesafio, os animais de cada grupo foram analisados quanto à carga viral dos testículos. A FIG. 18E mostra a carga viral do testículo, a FIG. 18F mostra contagens de espermatozóides totais, a FIG. 18G mostra contagens de espermatozóides móveis, a FIG. 18H mostra o peso do testículo e a FIG. 181 mostra o tamanho do testículo. Imagens representativas do testículo são apresentadas em (i). Barra de escala, 1

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 23/134

20/95 mm. Os asteriscos indicam diferenças significativas (ANOVA de via única: *, valor de P <0,05; **, valor de P <0,01; ****, valor de P <0,0001). Não significativo (n.s.), valor de P > 0,5. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D.. Barras de erro representam desvios padrão.

[0050] As FIGURAS 19A-B mostram vírus infecciosos no soro de macaco rhesus desafiado. O vírus infeccioso no soro de RM (viremia) foi coletado nos dias 2, 3, 4, 5, 7 e 10 pós-imunização (FIG. 19A) ou pós-desafio (FIG. 19B) foi quantificado por um ensaio de formação de foco. (Ver esquema experimental detalhado nas FIGURAS 15A-D). As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) dos ensaios. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D..

[0051] As FIGURAS 20A-I mostram que o ZIKV-3'-UTR-A20-LAV protege camundongos A129 machos jovens contra infecção e lesão do testículo. A FIG. 20A mostra o esquema de imunização de camundongos A129 machos de 3 semanas com 10³ FFU de ZIKV-3'-UTR-A20LAV (A20; n = 6) ou simulação de PBS (n = 4 ou 6). A FIG. 20B mostra viremia pós-imunização. No dia 28 pós-imunização, os camundongos imunizados foram medidos quanto às titulações de anticorpos de neutralização. No mesmo dia, os camundongos de um grupo de simulação e camundongos do grupo imunizado com A20 foram desafiados com 10⁶ FFU de ZIKV-PRVABC59. A FIG. 20D mostra viremia medida no dia 2 pós-desafio (dia 30 pós-imunização). As FIGURAS 20E&F mostram que no dia 49 pós-imunização, os camundongos foram analisados quanto às contagens de espermatozóides e cargas virais no testículo. A FIG. 20C mostra os valores de NTsode neutralização de anticorpos no dia 28 pós-imunização que foram medidos para animais individuais em cada grupo. As linhas tracejadas indicam o limite de detecção (L.O.D.) do ensaio. A FIG. 20D mostra a viremia no dia 2 pós

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 24/134

21/95 desafio (dia 30 pós-imunização). As FIGURAS 20E&F mostram respectivamente as contagens de espermatozóides totais (E) e móveis (F) no dia 21 pós-desafio (equivalente ao dia 49 pós-imunização). A FIG. 20G mostra o peso dos testículos dos animais de grupos de simulação, simulação com desafio e imunizados com Δ20 e desafiados no dia 21 pós-desafio. A FIG. 20H mostra a carga viral no testículo no dia 21 pós-desafio. A FIG. 20I contém imagens representativas dos testículos colhidos no dia 21 pós-desafio. Barra de escala, 1 mm. Asteriscos indicam diferenças significativas (ANOVA de via única: ****, valor de P <0,0001). Não significativo (n.s.) com valor de P> 0,5. Todas as amostras negativas são plotadas ao valor da metade de L.O.D. Barras de erro representam desvios padrão.

[0052] A FIG 21 contém um resumo dos experimentos que avaliaram a estabilidade do ZIKV-3'UTR-A20-LAV em cultura de células. Os vírus P0 (derivados dos fluidos de cultura de células transfectadas com RNA) foram continuamente cultivados em células Vero durante cinco ciclos (5 dias para cada ciclo de cultura), resultando em vírus P5. Os genomas completos dos vírus mutantes P5 foram sequenciados. Todos os vírus P5 retiveram a deleção de 20 nucleotídeos em 3'UTR. Além disso, várias mutações adaptativas são recuperadas; estas mutações são apresentadas pelas suas posições de aminoácidos dos genes indicados com base na cepa ZIKV FSS13025 (número do GenBank KU955593.1). Os resultados de três passagens independentes são apresentados.

[0053] A FIG 22 descreve os resultados de experimentos em que 5 microgramas de um plasmídeo de DNA de Zika de acordo com a invenção foram transfectados em células Vero através de eletroporação. Os fluidos de cultura foram coletados do dia 1 ao dia 5. As titulações virais infecciosas foram medidas por ensaio de placa em células Vero.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 25/134

22/95 [0054] A FIG 23 mostra o rendimento de candidatos a vacinas com DNA de ZIKV em células Vero. Cinco microgramas de plasmídeo de DNA indicado foram transfectados em células Vero através de eletroporação. Os fluidos de cultura foram recolhidos do dia 1 ao dia 5. As titulações virais infecciosas foram medidas por ensaio de placa em células Vero.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0055] A presente invenção se refere em geral à construção e caracterização de uma nova cepa de Zika vírus atenuado vivo (ZIKV) tendo uma ou mais deleções na região 3’ não traduzida (3'UTR). Esses mutantes de deleção do ZIKV podem ter a produção de RNA reduzida e a suscetibilidade à inibição do interferon-β aumentada e, portanto, podem ser utilizados como vacinas contra o ZIKV atenuado vivo eficazes. Particularmente mostramos aqui que candidatos a vacinas do ZIKV vivo atenuado contendo deleções na região 3’ não traduzida do genoma do ZIKV (ZIKV-3'UTR-LAV) previnem a transmissão viral durante a gravidez e o dano do testículo em camundongos, bem como inibem a infecção em primatas humanos. Também demonstrou-se um perfil de segurança desejável dos candidatos a vacina. Nossos resultados sugerem que o ZIKV-3'UTR-LAV pode potencialmente ser usado para vacinar humanos contra a infecção pelo Zika vírus.

[0056] Além disso, como evidenciado pelos resultados aqui divulgados, as cepas do vírus da Zika atenuado vivo e mutadas de acordo com a invenção e composições contendo as mesmas podem ser utilizadas no tratamento ou imunoproteção contra infecções provocadas pelo ZIKV, incluindo síndrome do ZIKV congênita, microcefalia e síndrome de Guillan-Barre (GBS).

[0057] A presente invenção fornece uma vacina que pode ser usada para prevenir a viremia em mulheres grávidas e viajantes em regiões epidêmicas/endêmicas para evitar a síndrome do ZIKV congênita

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 26/134

23/95 e que também pode ser útil para suprimir a transmissão epidêmica. A cepa do ZIKV da invenção é um candidato à vacina vivo atenuado que contém uma deleção ou Δ na região 3' não traduzida do genoma do ZIKV, de preferência, uma deleção de 10 nucleotídeos (ZIKV de10-del) ou uma deleção de 20 nucleotídeos (ZIKV de 20-del) e, com mais preferência, compreendendo ou consistindo em cepas de Zika tendo as sequências no Apêndice A modificadas conforme estabelecido no Apêndice B. O ZIKV de 10-del é altamente atenuado, imunogênico e protetor no modelo de camundongo A129. Uma dose única de 10 IFU de ZIKV de 10-del induziu um alto nível de anticorpos de neutralização e preveniu completamente a viremia após o desafio. Além da resposta de anticorpos, os camundongos imunizados também desenvolveram uma resposta robusta de células T. A inoculação intracraniana de camundongos CD1 de um dia de idade com 1 x 10⁴ IFU de ZIKV de 10del não causou nenhuma doença detectável, enquanto as infecções com 10 IFU de ZIKV do tipo selvagem foram letais. Mecanisticamente, o ZIKV de 10-del atenuou a sua virulência através da diminuição da síntese de RNA viral e aumento da sensibilidade à inibição do interferon do tipo I. O ZIKV de 10-del atenuado foi incompetente em infectar mosquitos, representando um recurso de segurança adicional para uso em regiões não endêmicas. Coletivamente, os resultados de segurança e eficácia garantem um maior desenvolvimento deste promissor candidato à vacina de ZIKV vivo e atenuado.

[0058] As cepas de ZIKV atenuado vivo da invenção podem ainda compreender mutações adicionais ao genoma de ZIKV. Uma mutação pode ser, mas não se limita a, uma deleção de nucleotídeos não codificantes ou codificantes, uma deleção de um ou mais aminoácidos, uma adição de um ou mais aminoácidos, uma substituição (conservada ou não conservada) de um ou mais aminoácidos ou uma combinação dos mesmos. O ZIKV pode ser mutado, por exemplo, usando de

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 27/134

24/95 leções para a 3'UTR, de tal forma que a infecciosidade do ZIKV é reduzida. Em certas modalidades, a infecciosidade do ZIKV é reduzida por um fator de pelo menos 5, 10, 50, 100, 500, 10, 5 x IO³, 10⁴, 5 x IO⁴, 10⁵, 5 x IO⁵, ou pelo menos 10⁶.

[0059] Adicionalmente, o ZIKV pode ser mutado, por exemplo, tendo deleções para a 3'UTR e/ou usando mutações pontuais, de tal modo que a taxa de replicação do vírus recombinante é reduzida ou aumentada. A taxa de replicação pode ser determinada por qualquer técnica padrão conhecida do versado na técnica. A taxa de replicação é representada pela taxa de crescimento do vírus e pode ser determinada pela plotagem da titulação viral ao longo do tempo pós-infecção. A titulação viral pode ser medida por qualquer técnica conhecida do versado na técnica. Em certas modalidades, uma suspensão contendo o vírus é incubada com células que são suscetíveis à infecção pelo vírus incluindo, mas não se limitando a células Vero, células LLC-MK2, células Hep-2, células LF 1043 (HEL), células MRC-5, células Wl38, células tMK, células T 293, células QT 6, células QT 35 ou fibroblastos de embrião de galinha (CEF). Após a incubação do vírus com as células, o número de células infectadas é determinado. Em certas modalidades específicas, o vírus compreende um gene repórter. Assim, o número de células que expressam o gene repórter é representativo do número de células infectadas. Em uma modalidade específica, o vírus compreende uma sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica mCherry, e o número de células que expressam mCherry, isto é, o número de células infectadas com o vírus, é determinado usando FACS.

[0060] Os ensaios aqui descritos podem ser utilizados para ensaiar a titulação viral ao longo do tempo para determinar as características de crescimento do vírus. Em uma modalidade específica, a titulação viral é determinada pela obtenção de uma amostra das células

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 28/134

25/95 infectadas ou do sujeito infectado, preparando uma diluição em série da amostra e infectando uma monocamada de células que são suscetíveis à infecção com o vírus em uma diluição do vírus que permite o surgimento de placas únicas. As placas podem então ser contadas e a titulação viral expressa como unidades formadoras de placa por mililitro de amostra. Em uma modalidade específica da invenção, a taxa de crescimento de um vírus da invenção em um sujeito é estimada pela titulação de anticorpos contra o vírus no sujeito. Sem estar limitado pela teoria, a titulação de anticorpo no sujeito reflete não apenas a titulação viral no sujeito, mas também a antigenicidade. Se a antigenicidade do vírus for constante, o aumento da titulação de anticorpo no sujeito pode ser utilizado para determinar a curva de crescimento do vírus no sujeito. Em uma modalidade preferida, a taxa de crescimento do vírus em animais ou seres humanos é melhor testada por amostragem de fluidos biológicos de um hospedeiro em vários momentos após a infecção e medindo a titulação viral.

[0061] A expressão de sequências gênicas heterólogas em um sistema de cultura de células ou em um sujeito pode ser determinada por qualquer técnica conhecida do versado na técnica. Em certas modalidades, a expressão do gene heterólogo é medida quantificando o nível do transcrito. O nível do transcrito pode ser medido por análise de Northern blot ou por RT-PCR usando sondas ou iniciadores, respectivamente, que são específicos para o transcrito. A transcrição pode ser distinguida do genoma do vírus porque o vírus está na orientação antissenso, enquanto o transcrito está na orientação senso. Em certas modalidades, a expressão do gene heterólogo é medida quantificando o nível do produto de proteína do gene heterólogo. O nível da proteína pode ser medido por análise de Western blot usando anticorpos que são específicos para a proteína.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 29/134

26/95 [0062] A invenção fornece uma cepa do ZIKV atenuado vivo com preendendo uma deleção de um ou mais nucleotídeos na 3'UTR do genoma do ZIKV. Em algumas modalidades, a cepa ZIKV da invenção pode compreender uma deleção de 1-nucleotídeo, uma deleção de 2 nucleotídeos, uma deleção de 3 nucleotídeos, uma deleção de 4 nucleotídeos, uma deleção de 5 nucleotídeos, uma deleção de 6 nucleo tídeos, uma deleção de 7 nucleotídeos, uma deleção de 8 nucleotídeos, uma deleção de 9 nucleotídeos, uma deleção de 10 nucleotídeos, uma deleção de 11 nucleotídeos, uma deleção de 12 nucleotídeos, uma deleção de 13 nucleotídeos, uma deleção de 14 nucleotídeos, uma deleção de 15 nucleotídeos, uma deleção de 16 nucleotídeos, uma deleção de 17 nucleotídeos, uma deleção de 18 nucleotídeos, uma deleção de 19 nucleotídeos, uma deleção de 20 nucleotídeos, uma deleção de 21 nucleotídeos, uma deleção de 22 nucleotídeos, uma deleção de 23 nucleotídeos, uma deleção de 24 nucleotídeos, uma deleção de 25 nucleotídeos, uma deleção de 26 nucleotídeos, uma deleção de 27 nucleotídeos, uma deleção de 28 nucleotídeos, uma deleção de 29 nucleotídeos, uma deleção de 30 nucleotídeos, uma deleção de 31 nucleotídeos, uma deleção de nucleotídeos

32, uma deleção de 33 nucleotídeos, uma deleção de 34 nucleotídeos, uma deleção de 35 nucleotídeos, uma deleção de 36 nucleotídeos, uma deleção de 37 nucleotídeos, uma deleção de 38 nucleotídeos, uma deleção de 39 nucleotídeos, uma deleção de 40 nucleotídeos, uma deleção 41 nucleotídeos, uma deleção de 42 nucleotídeos, uma deleção de 43 nucleotídeos, uma deleção de 44 nucleotídeos, uma deleção de 45 nucleotídeos, uma deleção de 46 nucleotídeos, uma deleção de 47 nucleotídeos, uma deleção de 48 nucleotídeos, uma deleção de 49 nucleotídeos ou uma deleção de 50 nucleotídeos na

3'UTR do genoma do ZIKV.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 30/134

27/95 [0063] As cepas de ZIKV atenuado vivo da presente invenção, as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas, os vetores que codificam as mesmas e as células que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as referidas cepas podem ser ainda modificadas, manipuladas, otimizadas ou apensas fornecer ou selecionar várias características. Além das deleções na 3'UTR, o vírus atenuado também pode conter outras mutações incluindo, mas não se limitando a, substituição de um gene do vírus humano pelo gene análogo de um vírus de uma espécie diferente, de um subgrupo diferente, ou de uma variante diferente.

[0064] Em algumas modalidades, outras mutações podem ser introduzidas no vírus (por exemplo, mutações com troca de sentido) podem ser introduzidas nas proteínas C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ou NS5 do vírus recombinante. Além disso, as mutações podem incluir adições, substituições, deleções ou combinações das mesmas. Por exemplo, pode ser introduzida uma mutação de deleção em qualquer uma das proteínas C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ou NS5. Em outras modalidades, uma mutação com troca de sentido pode ser introduzida, o que resulta em uma mutação sensível ao frio ou uma mutação sensível ao calor. Em algumas modalidades, os principais locais de fosforilação da proteína viral podem ser removidos.

[0065] Em outras modalidades, as deleções são introduzidas no genoma do vírus recombinante. Em modalidades mais específicas, pode ser introduzida uma deleção nas proteínas C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ou NS5 do vírus recombinante.

[0066] Em certas modalidades, a região intergênica do vírus recombinante é alterada. Em uma modalidade, o comprimento da região intergênica é alterado. Em outra modalidade, as regiões intergênicas podem ser embaralhadas da extremidade 5’ para 3’ do genoma viral.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 31/134

28/95

Em outras modalidades, a posição do genoma de um gene ou genes do vírus recombinante pode ser alterada.

[0067] Em certas modalidades, a atenuação do vírus é ainda intensificada pela substituição de um gene do vírus do tipo selvagem por um gene de um vírus de uma espécie diferente, de um subgrupo diferente, ou de uma variante diferente.

[0068] Os fenótipos atenuados de um vírus recombinante da invenção podem ser testados por qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Um candidato a vírus pode, por exemplo, ser testado quanto à sua capacidade de infectar um hospedeiro ou para a taxa de replicação em um sistema de cultura de células. Em certas modalidades, as curvas de crescimento a diferentes temperaturas são utilizadas para testar o fenótipo atenuado do vírus. Por exemplo, um vírus atenuado é capaz de crescer a 35°C, mas não a 39°C, ou 40°C. Em certas modalidades, diferentes linhagens de células podem ser utilizadas para avaliar o fenótipo atenuado do vírus. Por exemplo, um vírus atenuado pode apenas ser capaz de crescer em linhagens de células de macaco, mas não em linhagens de células humanas, ou as titulações de vírus alcançáveis em diferentes linhagens de células são diferentes para o vírus atenuado. Em certas modalidades, a replicação viral no trato respiratório de um modelo animal pequeno, incluindo, mas não se limitando a, hamsters, camundongos de algodão, camundongos e porquinhos-da-índia, é utilizada para avaliar os fenótipos atenuados do vírus. Em outras modalidades, a resposta imune induzida pelo vírus, incluindo, mas não se limitando às titulações de anticorpos (por exemplo, ensaiados por ensaio de neutralização por redução de placas ou ELISA) é utilizada para avaliar os fenótipos atenuados do vírus. Em certas modalidades, a capacidade do vírus recombinante para induzir sintomas patológicos em um modelo animal pode ser testada. Uma capacidade reduzida do vírus para induzir sintomas patológicos em um

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 32/134

29/95 sistema de modelo animal é indicativa do seu fenótipo atenuado. Em uma modalidade específica, os vírus candidatos são testados em um modelo de macaco para infecção nasal, indicado pela produção de muco.

[0069] Vários ensaios podem ser usados para testar a segurança de uma vacina. Por exemplo, gradientes de sacarose e ensaios de neutralização podem ser usados para testar a segurança. Um ensaio de gradiente de sacarose pode ser utilizado para determinar se uma proteína heteróloga é inserida em um vírion. Se a proteína heteróloga é inserida no vírion, o vírion deve ser testado para a sua capacidade de causar sintomas, mesmo que a cepa parental não cause sintomas. Sem estar limitado pela teoria, se a proteína heteróloga é incorporada no vírion, o vírus pode ter adquirido novas propriedades, possivelmente patológicas.

[0070] O vírus atenuado produzido de acordo com a invenção será utilizado para conferir proteção profilática ou terapêutica em hospedeiros suscetíveis contra infecção por ZIKV, por exemplo, para tratar ou prevenir a infecção por ZIKV e/ou para prevenir síndrome de ZIKV congênita ou GBS. A cepa de ZIKV atenuado pode ser formulada usando técnicas conhecidas para formular vacinas virais atenuadas ou composições imunogênicas de vacinas virais.

[0071] Em uma modalidade, a 3'UTR da cepa de ZIKV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico da 3'UTR da cepa de ZIKV mutante de 10-del, SEQ ID NO: 2.

[0072] Em uma modalidade, a 3'UTR da cepa de ZIKV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico da 3'UTR da cepa de ZIKV mutante de 20-del, SEQ ID NO: 3.

[0073] Em uma modalidade, a 3'UTR da cepa de ZIKV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico da 3'UTR da cepa de ZIKV mutante de 30-del-a, SEQ ID NO: 4.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 33/134

30/95 [0074] Em uma modalidade, a 3'UTR da cepa de ZIKV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico da 3'UTR da cepa de ZIKV mutante de 30-del-b, SEQ ID NO: 5.

[0075] Em algumas modalidades exemplificadoras, a cepa de ZIKV da invenção compreende ou consiste nas sequências estabelecidas no Apêndice A modificada conforme estabelecido no Apêndice

B.

[0076] Em algumas modalidades exemplificadoras são fornecidas composições imunogênicas contendo uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma cepa de ZIKV que compreende ou consiste nas sequências estabelecidas no Apêndice A modificada conforme estabelecido no Apêndice B.

[0077] Em algumas modalidades exemplificadoras, os sujeitos com necessidade dos mesmos são administrados de uma forma terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma cepa de ZIKV que compreende ou consiste nas sequências estabelecidas no Apêndice A modificado conforme estabelecido no Apêndice B.

Administração [0078] As composições imunogênicas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico é desejado. Em modalidades exemplificadoras, a administração pode ser tópica, parenteral ou enteral.

[0079] As composições farmacêuticas da invenção são tipicamente adequadas para administração parentérica. Como usado aqui, a administração parentérica de uma composição farmacêutica inclui qualquer via de administração caracterizada por ruptura física de um tecido de um sujeito e administração da composição farmacêutica através da quebra no tecido, resultando assim geralmente na administração direta na corrente sanguínea, no músculo, ou em um órgão interno. A administração parentérica inclui assim, mas não está limitada

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 34/134

31/95 a, administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de uma ferida não cirúrgica penetrante no tecido, e semelhantes. Em particular, a administração parentérica inclui, mas não está limitada a, injeção ou infusões subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraniana, intrassinovial; e técnicas de infusão dialítica renal.

[0080] As formulações de uma composição farmacêutica adequadas para administração parentérica tipicamente compreendem geralmente o ingrediente ativo combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como água esterilizada ou solução salina isotônica estéril. Tais formulações podem ser preparadas, embaladas ou vendidas em uma forma adequada para administração em bolus ou para administração contínua. As formulações injetáveis podem ser preparadas, embaladas ou vendidas em forma de dosagem unitária, tal como em ampolas ou em recipientes multidose contendo um conservante. As formulações para administração parentérica incluem, mas não estão limitadas a, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e semelhantes. Tais formulações podem ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais incluindo, mas não limitados a, agentes de suspensão, estabilização ou dispersão. Em uma modalidade de uma formulação para administração parentérica, o ingrediente ativo é fornecido na forma seca (isto é, em pó ou granular) para reconstituição com um veículo adequado (por exemplo, água isenta de pirogênios estéril) antes da administração parentérica da composição reconstituída. As formulações parentéricas também incluem soluções aquosas que podem conter excipientes, tais como sais, carboidratos e agentes tamponantes (de preferência, a um pH de 3 a 9), mas, para algumas aplicações, podem ser formuladas mais apro

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 35/134

32/95 priadamente como uma solução estéril não aquosa ou como uma forma seca a ser utilizada em conjunto com um veículo adequado tal como água estéril isenta de pirogênio. As formas de administração parentérica exemplificadoras incluem soluções ou suspensões em soluções aquosas estéreis, por exemplo, soluções aquosas de propileno glicol ou dextrose. Tais formas de dosagem podem ser adequadamente tamponadas, se desejado. Outras formulações administráveis parenteralmente que são úteis incluem aquelas que compreendem o ingrediente ativo na forma microcristalina, ou em uma preparação lipossomal. As formulações para administração parentérica podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.

[0081] Os termos oral, entérica, entericamente, oralmente, não parenteral, não parenteralmente e semelhantes, se referem à administração de um composto ou composição a um sujeito por uma rota ou modo ao longo do canal alimentar. Exemplos de rotas orais de administração de uma composição de vacina incluem, sem limitação, engolir formas líquidas ou sólidas de uma composição de vacina da boca, administração de uma composição de vacina através de um tubo nasojejunal ou de gastrostomia, administração intraduodenal de uma composição de vacina e administração retal, por exemplo, usando supositórios para o trato intestinal inferior do canal alimentar.

[0082] De preferência, a composição contendo o vírus formulado adequada para administração intranasal, por injeção, tópica ou oral, por exemplo, como um pó estabilizado seco para reconstituição em um tampão adequado antes da administração ou em uma composição de aerossol. Em uma modalidade preferida, a composição é administrada por via intranasal.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 36/134

33/95 [0083] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos, semissólidos, composições monofásicas, composições multifásicas (por exemplo, de óleo-em-água, de água-em-óleo), espumas, microesponjas, lipossomas, nanoemulsões, espumas de aerossol, polímeros, fulerenos e pós (ver, por exemplo, Referência 35, Taglietti et al. (2008) Skin Ther. Lett. 13:6-8). Podem ser necessários ou desejáveis transportadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes.

[0084] As composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, sachês ou comprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou ligantes podem ser desejáveis.

[0085] Composições e formulações para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas esterilizadas que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, mas não limitados a potenciadores de penetração, compostos cardadores e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0086] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsionantes e semissólidos autoemulsionantes.

[0087] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 37/134

34/95 bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação os ingredientes ativos com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas associando uniformemente e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto.

[0088] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis, tais como, mas não limitadas a, comprimidos, cápsulas, xaropes líquidos, géis moles, supositórios, aerossóis e enemas. As composições da presente invenção podem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes.

[0089] Em uma modalidade da presente invenção, as composições farmacêuticas podem ser formuladas e utilizadas como espumas. Espumas farmacêuticas incluem formulações tais como, mas não limitadas a, emulsões, microemulsões, cremes, geleias e lipossomas. Embora basicamente similares por natureza, essas formulações variam nos componentes e na consistência do produto final. Agentes que aumentam a captação de oligonucleotídeos a nível celular podem também ser adicionados às composições farmacêuticas e outras composições da presente invenção. Por exemplo, os lipídeos catiônicos, tais como lipofectina, derivados de glicerol catiônicos e moléculas policatiônicas, tais como polilisina, também aumentam a absorção celular de oligonucleotídeos.

[0090] As composições da presente invenção podem conter adicionalmente outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas. Assim, por exemplo, as com

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 38/134

35/95 posições podem conter materiais farmaceuticamente ativos adicionais, compatíveis, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. Contudo, esses materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interagem de modo deletérios com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.

[0091] As composições da presente invenção podem incluir excipientes conhecidos na técnica. Exemplos de excipientes utilizados para formulação de vacinas, tais como adjuvantes, estabilizantes, conservantes e vestígios derivados de processos de fabricação de vacinas incluem, mas não estão limitados a: Hidróxido de alumínio, aminoácidos, cloreto de benzetônio, formaldeído ou formalina, sais inorgânicos e açúcares, vitaminas, asparagina, ácido cítrico, lactose, glicerina, ferro citrato de amônio, sulfato de magnésio, fosfato de potássio, fosfato de alumínio, sulfato de amônio, ácido casamino, dimetil- betaciclodextrina, 2-Fenoxietanol, Extrato de Bovino, Polissorbato 80, Sulfato de Potássio de Alumínio, Gelatina, Fosfato de Sódio, Timerosal, Sacarose, Proteína Bovina, Hidrolisado de Lactalbumina, Formaldeído ou Formalina, Tecido Rim de Macaco, Neomicina, Polimixina B, Proteína de Levedura, Sulfato de Alumínio Hidroxifosfato Dextrose, Sais Minerais, Borato de Sódio, Peptona de Soja, Proteína Celular MRC-5, Sul

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 39/134

36/95 fato de Neomicina, Tampões de Fosfato, Polissorbato, Albumina ou Soro de Bovino, DNA, Sulfato de Alumínio e Potássio, Sulfato de Hidroxifosfato de Alumínio Amorfo, Carboidratos, L-histidina, BetaPropiolactona, Cloreto de Cálcio, Neomicina, Ovalbumina, Cloreto de Potássio, Fosfato de Potássio, Fosfato de Sódio, Taurodeoxigaloalato de Sódio, e Proteína de ovo, Gentamicina, Hidrocortisona, Octoxinol10, Succinato de Hidrogênio Alfa-Tocoferol, Desoxicolato De Sódio, Fosfato de Sódio, Beta-Propiolactona, polioxietileno 910, Nonil fenol (Triton N-101, Octoxinol 9), Octoxinol-9 (Triton X-100), Células Renais de Pintainho, Proteína de Ovo, Sulfato de Gentamicina, Glutamato Monossódico, Sacarose Fosfato Tampão de Glutamato de Proteína de Soro de Vitelo, Estreptomicina, Proteína de Soro de Camundongo, Fibroblastos de Embrião de Galinha, Albumina Humana, Sorbitol, Fosfato de Sódio Dibásico, Bicarbonato de Sódio, Sorbitol, Sacarose Fosfato de Potássio Monobásico, Cloreto de Potássio, Fosfato de Potássio Dibásico, Fenol, Fenol Vermelho (Fenossulfonftaleína), Anfotericina B, Proteína de Galinha, Clortetraciclina, Ácido Etilenodiamino Tetracético de Sódio (EDTA), Glutamato de Potássio, Meio de Cultura Celular, Citrato de Sódio, Fosfato de Sódio Monobidrato Monobásico, Hidróxido de sódio, carbonato de cálcio, D-glicose, dextrano, nitrato férrico (III), L-cistina, L-tirosina, sulfato de magnésio, hidrogenocarbonato de sódio, piruvina de sódio, Xantana, Peptona, Fosfato Dissódico, Fosfato Monossódico, Polidimetilsilzona, Ácido Ascórbico de Brometo de Hexadeciltrimetilamônio, Caseína, Galactose, Estearato de Magnésio, Manitol, Gelatina Porcina Hidrolisada, adjuvantes de óleo emulsificado de Freund (completo e incompleto), Arlacel A, Óleo mineral, Amendoim Emulsionado adjuvante de óleo (adjuvante 65), componente P40 derivado de Corínebacterium granulosum, Lipopolissacarídeo, Mycobacterium e seus componentes, toxina da cólera, lipossomas, complexos imunoestimulantes (ISCOM), esqualeno e cloreto de sódio.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 40/134

37/95 [0092] A vacina ou composição imunogênica pode ser utilizada na vacinação de um hospedeiro mamífero, particularmente um ser humano, primata não humano, macaca, macaco, cavalo, vaca, carabao, cabra, pato, morcego ou outro hospedeiro não humano adequado. Uma dosagem pode incluir pelo menos 10 IFU, 10¹ IFU, 10² IFU, 10³ IFU, 10⁴ IFU, 5x10⁴ IFU, 10⁵ IFU, 5x10⁵ IFU, 10⁶ IFU, 5x10⁶ IFU, 10⁷ IFU, 5x10⁷ IFU, 10⁸ IFU ou 5x10⁸ IFU da referida cepa de ZIKV atenuada viva. Em alguns casos, o sujeito pode estar imunocomprometido ou ter outra condição, por exemplo, pode estar grávida (ou prenhe). Definições [0093] A região 3'UTR ou 3’ não traduzida ou região tripla não traduzida do genoma do ZIKV corresponde à seção do RN A que segue imediatamente o códon de terminação da tradução da poliproteína genômica.

[0094] Um adjuvante se refere a uma substância que aumenta uma resposta imune, por exemplo, um anticorpo ou resposta imune mediada por células contra um agente específico, por exemplo, um antígeno, ou um agente infeccioso.

[0095] Uma cepa de vírus atenuado ou atenuado vivo se refere a um vírus mutado ou modificado ou recombinante tendo reduzida ou nenhuma virulência ou propensão para causar uma doença ou infecção normalmente associada ao tipo selvagem ou não modificada (ou neste caso vírus não mutado).

[0096] Uma cepa de ZIKV atenuado ou atenuado vivo, em particular, se refere a uma cepa de ZIKV que foi modificada para ter reduzida ou nenhuma virulência ou propensão para causar uma doença ou infecção que está normalmente associada a um vírus do tipo selvagem ou não modificado ou não mutado, em particular, síndrome de ZIKV congênita ou GBS. Mais particularmente, isto inclui cepas de ZIKV atenuado que são modificadas ou alteradas ou mutadas

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 41/134

38/95 para terem uma ou mais deleções na 3'UTR do genoma do ZIKV, por exemplo, uma deleção de 10 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, ou uma deleção de 30 nucleotídeos na 3'UTR, de preferência uma deleção de 10 nucleotídeos. As deleções não podem interromper a tradução de RNA. As deleções podem diminuir a produção de RNA e aumentar a suscetibilidade ao interferon-β. Essa cepa de ZIKV atenuado vivo induz imunoproteção contra o vírus, ou seja, mantém um importante epítopo imunogênico.

[0097] Heterólogo significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do restante da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser colocado por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo. Os polinucleotídeos da invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências de codificação adicionais na mesma unidade de transcrição, elementos de controle tais como promotores, sítios de ligação ao ribossoma, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob controle do mesmo promotor ou de um promotor diferente, sequências que permitem clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira, e qualquer construto tal como pode ser desejável para fornecer as modalidades desta invenção.

[0098] Uma composição imunogênica aqui se refere a uma composição contendo uma cepa do ZIKV atenuado vivo de acordo com a invenção que desencadeia uma resposta imune em um hospedeiro suscetível, por exemplo, uma resposta imune de anticorpo, Th1 ou celular (por exemplo, mediada por células T).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 42/134

39/95 [0099] Um componente biológico isolado (como um ácido nucleico ou bacterium) se refere a um componente que foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, proteínas e organelas. Os ácidos nucleicos e proteínas que foram isolados incluem ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos padrões de purificação. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados por tecnologia recombinante, bem como síntese química.

[00100] O termo ácido nucleico e polinucleotídeo se refere ao RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de cadeia simples ou dupla, ou um híbrido do mesmo. O termo também abrange híbridos de RNA/DNA. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila, outros açúcares e grupos de ligação tais como fluororribose e tiolato e ramificações de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser ainda modificada após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição são terminações (caps), substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo e introdução de meios para ligar o polinucleotídeo a proteínas, íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um micro-organismo. O termo gene é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotí

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 43/134

40/95 deo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem introns e éxons como na sequência genômica, ou apenas as sequências de codificação como nos cDNA e/ou as sequências reguladoras necessárias para a sua expressão. Por exemplo, o gene também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa RNAm ou RNA funcional, ou codifica uma proteína específica, e que inclui sequências reguladoras.

[00101] Um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente se refere a compostos ou materiais convencionalmente utilizados em composições imunogênicas ou de vacina durante a formulação e/ou para permitir o armazenamento.

[00102] Quantidade profilaticamente eficaz de uma cepa do ZIKV atenuado vivo de acordo com a invenção se refere a uma quantidade suficiente para prevenir ou reduzir a incidência de infecção em um hospedeiro suscetível.

[00103] O termo recombinante significa um polinucleotídeo com origem semissintética ou sintética que não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotídeo em um arranjo não encontrado na natureza.

[00104] Um hospedeiro suscetível aqui se refere a um hospedeiro ou animal que pode estar infectado por ZIKV. Tais hospedeiros incluem humanos ou animais, por exemplo, um humano, primata não humano, macaca, macaco, cavalo, vaca, carabao, cabra, pato, morcego ou outro hospedeiro não humano adequado.

[00105] Quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa do ZIKV atenuado vivo de acordo com a invenção se refere a uma quantidade suficiente para tratar a infecção por ZIKV ou uma doença associada com isto num hospedeiro suscetível.

[00106] Uma composição de vacina aqui se refere a uma composição contendo uma cepa do ZIKV atenuado vivo de acordo com a inPetição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 44/134

41/95 venção que desencadeia uma resposta imune terapêutica ou profilática contra o ZIKV.

[00107] Infecção por ZIKV ou infecção por ZIKV se refere aqui à infecção de um hospedeiro suscetível com ZIKV e doenças associadas a ele, incluindo a síndrome de ZIKV congênita e a síndrome de Guillan-Barre (GBS).

[00108] Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, a invenção reivindicada.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de cepas de ZIKV atenuado vivo com deleções de 3'UTR

Materiais e Métodos:

[00109] Vírus: A cepa cambojana do ZIKV FSS13025 (número GenBank KU955593.1) foi gerada a partir de um clone de cDNA infeccioso pFLZIKV como descrito anteriormente (Referência 10). Todas as linhagens de células são testadas negativas para micoplasma.

[00110] Construção de plasmídeo. Procedimentos-padrão de biologia molecular foram realizados para todas as construções de plasmídeo. Foi realizada PCR de sobreposição padrão para amplificar o fragmento de DNA entre os sítios de enzima de restrição únicos EcoRI e Clal usando pares de iniciadores correspondentes. O fragmento de DNA contendo mutações de deleção de 3'UTR foi introduzido individualmente no RepcpFLZIKV e pZIKV (plasmídeo de cDNA de replicon, Referência 11) através de EcoRI e Clal. Todos os construtos foram verificados por sequenciamento de DNA. As sequências de iniciador estão disponíveis mediante solicitação. Todas as enzimas de restrição foram adquiridas junto à New England BioLabs (Ipswitch, MA).

Resultados:

[00111] Buscou-se uma vacina viva atenuada para capitalizar suas vantagens de imunização em dose única, uma resposta imunológica

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 45/134

42/95 rápida e robusta e proteção duradoura. Atenuou-se o ZIKV do tipo selvagem (WT) através da deleção de uma porção da região 3' não traduzida (3'UTR) do genoma viral, como foi usado com sucesso para desenvolver uma vacina de DENV atualmente em um estudo clínico de fase III (Referência 9). Ao usar um clone de cDNA infeccioso da cepa cambojana ZIKV FSS 13025 (Referência 10) (que está intimamente relacionada com as cepas que agora circulam nas Américas), preparou-se um painel de vírus recombinantes contendo distintas deleções 3'UTR (FIG. 1A). Os mutantes 10-del, 20-del, 30-del-a e 30-del-b continham deleções de 10 a 30 nucleotídeos sobrepostos, que se esperava alterassem a estrutura secundária local da 3'UTR viral (FIG. 2).

Exemplo 2: Análise de Replicação e Inibição de IFN-β de mutantes de deleção 3'UTR do ZIKV

Materiais e Métodos:

[00112] Células e Anticorpos. As células Vero foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) e mantidas num meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (HyClone Laboratories, Logan, UT) e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37°C com 5% de CO2. Os seguintes anticorpos foram utilizados neste estudo: um anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) 4G2 reativo de forma cruzada com a proteína flavivírus E (ATCC), HMAF específico para ZIKV (fluido ascítico hiperimune), World Reference Center of Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA) no campo Médico da Universidade do Texas], Anticorpo Anti-IgG de camundongo (H+L) Anticorpo marcado com peroxidase de rábano silvestre (KPL, Gaithersburg, MD) e IgG de cabra anticamundongo conjugado com Alexa Fluor® 488 (Thermo Fisher Scientific).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 46/134

43/95 [00113] Transcrição e transfecção de RNA. O ZIKV de genoma completo, mCherry ZIKV e RNAs de replicon foram transcritos in vitro usando um kit T7 mMessage mMachine (Ambion, Austin, TX) a partir de plasmídeos de cDNA pré-linearizados por Clal. O RNA foi precipitado com cloreto de lio, lavado com etanol a 70%, ressuspenso em água isenta de RNAase, quantificado por espectrofotometria e armazenado a -80°C em alíquotas. Os transcritos de RNA (10 pg) foram eletroporados em células Vero seguindo um protocolo descrito anteriormente (Referência 31).

[00114] Ensaios de imunofluorescência indireta (IFA). As células Vero foram eletroporadas com 10 pg de RNA genômico WT ou deleção 3'UTR do ZIKV e cultivadas numa lâmina de câmara Lab-Tek de 8 poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Nos dias 2 e 3 póstransfecção, as células foram fixadas em 100% de metanol a -20°C durante 15 min. Após 1 h de incubação num tampão de bloqueio contendo 1% de FBS e 0,05% de Tween-20 em PBS, as células foram tratadas com um anticorpo monoclonal de camundongo 4G2 durante 1 h e lavadas três vezes com PBS (5 min para cada lavagem). As células foram então incubadas com IgG anticamundongo de cabra Alexa Fluor® 488 durante 1 h em tampão de bloqueio, após o que as células foram lavadas três vezes com PBS. As células foram montadas em um meio de montagem com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Vector Laboratories, Inc.). Imagens de fluorescência foram observadas sob um microscópio de fluorescência equipado com um sistema de documentação de vídeo (Olympus).

[00115] Ensaio de foco de imunocoloração de vírus mutantes. Quantidades iguais de RNAs (10 pg) transcritos de seus clones de cDNA infecciosos correspondentes foram eletroporados em células Vero. No dia ou 5 dias pós-transfecção, os fluidos de cultura das células transfectadas foram coletados e quantificados para vírus infeccio

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 47/134

44/95 sos (definidos como vírus PO) usando um ensaio de foco de imunocoloração em células Vero.

[00116] Ensaio de foco de imunocoloração e imunocoloração. As amostras virais foram diluídas em série de dez vezes a seis vezes em DMEM. Para cada diluição, foram adicionados 100 μΙ de amostra a uma placa de 24 poços contendo células Vero a cerca de 90% de confluência. As células infectadas foram incubadas durante 1 h e agitadas a cada 15 minutos para assegurar uma cobertura completa da monocamada para infecção uniforme. Após 1 h de incubação, adicionou-se 0,5 ml de revestimento de metilcelulose contendo 2% de FBS a 1% de penicilina/estreptomicina a cada poço. A placa foi incubada a 37°C durante quatro dias. Após a incubação, removeu-se o revestimento de metilcelulose e adicionou-se 0,5 ml de solução de metanolacetona (1:1) a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de fixação foi aspirada e as placas foram deixadas secar ao ar, depois lavadas três vezes com PBS e incubadas em tampão de bloqueio (PBS suplementado com 3% de FBS), seguido por 1 h de incubação com HMAF específico para ZIKV. As placas foram lavadas três vezes com PBS, seguido de uma incubação de uma hora de duração com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre (KPL, Gaithersburg, MD). A detecção prosseguiu com a adição de substrato de aminoetilcarbazol (ENZO Life sciences, Farmingdale, MA) preparado de acordo com as instruções do vendedor.

[00117] Ensaio de luciferase. O ensaio de luciferase foi realizado como relatado anteriormente (Referência 11). Resumidamente, as células Vero transfectadas com WT ou RNAs de replicon ZIKV mutantes (10 pg) foram semeadas em uma placa de 12 poços. Em vários momentos, as células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lisadas usando tampão de lise celular (Promega, Madison, Wl). As células foram raspadas das placas e armaze

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 48/134

45/95 nadas a -80°C. Os sinais de luciferase foram medidos por Cytation 5 (Biotek) de acordo com as instruções do fabricante.

[00118] Curvas de replicação. Células Vero subconfluentes em placas de 24 poços (2 x 10⁵ células por poço) foram infectadas com WT ou P0 ZIKV mutante a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 em poços em triplicata. Estoques de vírus foram diluídos em DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Cem microlitros de vírus foram adicionados a cada poço das placas de 12 poços. Após 1 h de fixação (5% de CO2 a 37°C), os inóculos foram removidos, as monocamadas foram lavadas três vezes com PBS, e 1 ml de meio DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina foi adicionado a cada poço. Os fluidos de cultura foram quantificados para vírus infecciosos nos dias 1 a 5 usando 0 ensaio de foco de imunocoloração.

[00119] Análise de Replicon das deleções de 3'UTR. Um replicon de repórter de Renilla luciferase do ZIKV foi manipulado com várias deleções de 3'UTR. Quantidades iguais de replicon WT e RNAs mutantes (10 pg) foram eletroporadas em células Vero. Os sinais da luciferase foram medidos em vários pontos de tempo. Um replicon não replicativo contendo uma mutação de GDD inativa da polimerase NS5 foi incluído como um controle negativo.

[00120] Inibição do interferon-β de ZIKVs mutantes e WT. As células Vero foram semeadas em placa de 96 poços (1,5 x 10⁴células por poço) um dia antes do tratamento com interferon e infecção viral. As células foram infectadas a um MOI 0,05 na presença de IFN-β (55, 167, 500 ou 1.500 lU/ml). A infecção viral e 0 tratamento com interferon foram iniciados ao mesmo tempo. Às 48 h pós-infecção e tratamento com interferons-β, as titulações virais foram quantificadas usando 0 ensaio de foco de imunocoloração em células Vero.

Resultados:

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 49/134

46/95 [00121] Após a transfecção em células Vero, todos os RNAs genômicos mutantes geraram células de expressão de proteínas E virais (FIG. 3) e vírus infecciosos (definidos como vírus P0). Comparado com o WT, todos os mutantes exibiram focos infecciosos menores (FIG. 1B), cinética de replicação mais lenta e menores titulações de pico (FIG. 1C). Para examinar os efeitos mutacionais na replicação viral, projetamos as deleções em um replicon de ZIKV de luciferase (Referência 11). Os resultados do replicon mostraram que as deleções de 3'UTR não afetaram a tradução do RNA viral (indicado pelos sinais da luciferase às 2-6 h pós-transfecção), mas diminuíram a síntese de RNA (indicada pelas atividades da luciferase 24-48 h pós-transfecção; FIG. 1D e 1E); uma observação semelhante foi relatada anteriormente para o vírus do Nilo Ocidental, um flavivírus intimamente relacionado (Referência 12). Como a 3'UTR de flavivírus também pode modular a resposta imune inata do hospedeiro (Referências 13, 14), nós comparamos a suscetibilidade dos vírus WT e mutantes com a inibição do interferon. Todos os quatro vírus mutantes foram muito mais sensíveis à inibição do interferon-β do que o vírus WT, entre os quais o mutante 10-del exibiu a maior inibição (FIG. 1F). Coletivamente, esses resultados indicam que as deleções de 3'UTR atenuam a replicação do ZIKV através da diminuição da síntese de RNA viral e aumento da vulnerabilidade à inibição do interferon do tipo I.

Exemplo 3: Estabilidade de vírus mutantes

Materiais e Métodos:

[00122] Estabilidade de 3'UTR mutantes, extração de RNA e RTPCR. Para examinar a estabilidade das 3'UTR mutantes, nós as passamos em células Vero por cinco rodadas (5 dias para cada rodada de cultura). Resumidamente, 1,5 x 10⁶ células Vero foram semeadas em frasco T-25. O vírus derivado da transfecção de RNA, definido como P0, foi usado para infectar as células Vero. Aos 5 d p.i., o fluido de cul

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 50/134

47/95 tura (100 μΙ) foi transferido para um novo frasco T-25 contendo células Vero em 5 ml de meio de cultura. Após cinco ciclos de tal passagem (P5), os RNAs virais foram extraídos dos fluidos da cultura P5 usando o kit de RNA QIAamp Viral (Qiagen). Os RNA virais foram amplificados por RT-PCR usando kits de RT-PCR de uma etapa Superscript III (Invitrogen). Os vírus P5 foram submetidos a sequenciamento completo do comprimento do genoma. Três passagens independentes foram realizadas para cada vírus mutante.

[00123] Ensaio de foco de imunocoloração. Os vírus mutantes WT e P5 foram analisados usando um ensaio de foco de imunocoloração em células Vero. Para cada vírus mutante, três seleções independentes foram realizadas em células Vero.

[00124] Cinética de replicação. Células Vero subconfluentes em placas de 24 poços (2 x 10⁵ células por poço) foram infectadas com vírus mutantes WT e P5 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 em poços em triplicata. Estoques de vírus foram diluídos em DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Cem microlitros de vírus foram adicionados a cada poço das placas de 12 poços. Após 1 h de fixação (5% de CO2 a 37°C), os inóculos foram removidos, as monocamadas foram lavadas três vezes com PBS, e 1 ml de meio DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina foi adicionado a cada poço. Os fluidos de cultura foram quantificados para vírus infecciosos nos dias 1 a 5 usando 0 ensaio de foco de imunocoloração em células Vero.

Resultados:

[00125] Para testar a estabilidade dos vírus mutantes, nós os passamos cinco vezes em células Vero (uma linhagem de células aprovada para a produção de vacinas, ver Referência 15). Os vírus da passagem 5 (P5) desenvolveram focos infecciosos maiores (FIG. 4A) e cinética de replicação mais rápida que os vírus PO correspondentes

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 51/134

48/95 em células Vero (compare FIG. 4B com FIG. 1C). O sequenciamento completo do genoma dos vírus PO e P5 mostrou que todos os mutantes retiveram as deleções originais, mas os vírus P5 acumularam mutações adicionais nos genes E e/ou NSI, que presumivelmente eram mutações adaptativas de células Vero e/ou mutação(ões) compensatória(s) para deleções de 3'UTR (FIG. 4C). Em algumas modalidades, estas mutações podem ser introduzidas no clone de cDNA infeccioso para a produção de vacina. De qualquer maneira, os resultados indicaram que as deleções manipuladas são estáveis quando propagadas em células Vero, e a passagem adicional dos vírus mutantes em células Vero para P20 não alterou as deleções de 3'UTR manipuladas.

Exemplo 4: Caracterização de 3'UTR mutantes no modelo de camundongo A129.

Materiais e Métodos:

[00126] Vacinação e desafio de camundongos. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 8) foram imunizados pela via subcutânea (S.C.) com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e mutantes. Os camundongos infectados por simulação receberam PBS pela mesma via. Os camundongos foram pesados e monitorados diariamente quanto à progressão da doença. Os camundongos foram anestesiados e sangrados através do seio retro-orbital (R.O.) a cada dois dias. As viremias foram quantificadas por um ensaio de foco de imunocoloração dos dias 2 a 4 pós-infecção. No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram anestesiados e sangrados para medir as titulações de anticorpos de neutralização usando um ensaio de infecção mCherry ZIKV. Os camundongos vacinados foram então desafiados através da rota intraperitoneal (LP) com 1 x 10⁵ PFU de vírus parental (cepa de ZIKV FSS 13025). No dia 2 pós-desafio, os camundongos foram sangrados para medir a viremia. O sangue foi clarificado após a coleta por centrifugação a 3.380 x g por 5 minutos e imediatamente armazenado a -80°C

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 52/134

49/95 para armazenamento. As titulações virais de soros e inóculos foram determinadas por um ensaio de foco de imunocoloração em células Vero, como descrito acima. Todos os testes em animais foram realizados de acordo com a política de UTMB, conforme aprovado pelo UTMB IACUC.

[00127] Construção de mCherry ZIKV. Um fragmento de DNA que codifica os primeiros 25 aminoácidos do gene C, o gene mCherry e a proteína 2A do vírus da febre aftosa foi fundido com a estrutura de leitura aberta do genoma do ZIKV. A expressão de mCherry em células Vero transfectadas foi analisada por microscopia de fluorescência nos dias 2-6 pós-transfecção. O mCherry ZIKV foi utilizado para estimar as titulações de neutralização de anticorpos de soros de camundongos.

[00128] Ensaio de neutralização de anticorpos. A atividade de neutralização dos soros de camundongos foi avaliada usando um mCherry ZIKV recém-estabelecido. Os soros foram diluídos em série de duas vezes a partir de 1: 100 em DMEM com 2% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. A diluição em série de camundongos foi incubada com mCherry ZIKV a 37°C durante 2 h. Complexos de vírus de anticorpos foram adicionados a células Vero pré-semeadas em placas de 96 poços. Após 48 h pós-infecção, as células foram visualizadas por microscopia de fluorescência usando o Cytation 5 Cell Imaging MultiMode Reader (Biotek) para quantificar as células positivas para fluorescência mCherry. A porcentagem de células positivas para fluorescência nos controles sem tratamento foi estabelecida em 100%. As células positivas para fluorescência dos poços tratados com soro foram normalizadas para as dos controles sem tratamento. Um modelo sigmoidal (logístico) de quatro parâmetros no software GraphPad Prism 7 foi usado para calcular as titulações de neutralização (NT50). Resultados:

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 53/134

50/95 [00129] Avaliamos a imunogenicidade e a eficácia dos vírus mutantes em um modelo de camundongo A129 (deficiente de receptor de interferon α/β) (Referência 16) (FIG. 5A). Após a inoculação subcutânea (S.C.) com 1 x 10⁴ IFU de vírus, os camundongos infectados com o vírus WT tiveram significativamente mais perda de peso do que os infectados com vírus mutantes; considerando que as diferenças na perda de peso média entre os quatro grupos infectados com vírus mutantes não foram estatisticamente significativas (FIG. 5B). Cerca de 50% dos camundongos sucumbiram à infecção pelo vírus WT, enquanto que nenhuma mortalidade foi observada nos camundongos infectados com o vírus mutante (FIG. 5C). O vírus WT produziu viremia de pico significativamente maior que os vírus mutantes, entre os quais o vírus de 10-del teve o menor perfil virêmico (FIG. 5D). A viremia para o mutante de 10-del caiu para 700 IFU, 350 IFU, e indetectável nos dias 5, 6 e 7 pós-infecção, respectivamente. A análise de sequenciamento confirmou que as deleções manipuladas foram retidas sem outras mutações nos vírus mutantes recuperados dos soros de camundongo. No dia 28 pós-infecção, os soros de camundongo foram colhidos e quantificados para as titulações de neutralização pré-desafio usando um mCherry ZIKV (FIG. 6). Titulações de neutralização prédesafio comparáveis de (1,8 ± 1,1) x 10³ para (8,6 ± 1,5) x 10³ foram observadas entre os camundongos infectados com WT e com o vírus mutante (FIG. 5E). Após o desafio com 1 x 10⁵ IFU de ZIKV WT (cepa cambojana FSS 13025) no dia 28 pós-imunização, os camundongos imunizados não apresentaram viremia periférica detectável, enquanto o grupo simulado-imunizado produziu uma viremia média de (8,5 ± 1,5) x IO⁶ de IFU/ml no dia 2 pós-desafio (FIG. 5F). No dia 28 pós-desafio, medimos as titulações de neutralização dos soros de camundongo novamente; notavelmente, as titulações de neutralização pós-desafio foram equivalentes às titulações de neutralização pré-desafio (comparar

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 54/134

51/95

FIG. 5E e 5G), sugerindo que uma resposta de anticorpos esterilizantes foi alcançada por uma única vacinação. No total, os resultados demonstram que os vírus mutantes são altamente atenuados, imunogênicos e protetores em camundongos A129.

Exemplo 5: Caracterização adicional de ZIKV mutante de 10-del

Materiais e Métodos:

[00130] Vírus. A cepa PRVABC59 de Porto Rico (número GenBank KU501215) foi obtida junto à WRCEVA. Todas as linhagens de células são testadas negativas para micoplasma.

[00131] Imunização com 100 IFU de vírus de 10-del. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 100 IFU de vírus WT ou de 10-del por via S.C. A viremia foi quantificada por ensaio de foco de imunocoloração do dia 2 ao dia 6. No dia 28 pós-imunização, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV. Além disso, no dia 28 pós-imunização, os camundongos foram desafiados com 1 x 10⁶ IFU do ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59) por via LP. As viremias foram quantificadas por ensaio de foco de imunocoloração no dia 2 pós-desafio.

[00132] Imunização com 10 IFU de vírus de 10-del. Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 2 para cada vírus) foram imunizados com 10 IFU de ZIKV WT ou de 10-del por via S.C. No dia 28 após a imunização, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV. No mesmo dia, os camundongos foram desafiados com 1 x IO⁶ IFU do ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59) por via LP. No dia 2 pós-desafio, as viremias foram quantificadas usando um ensaio de foco de imunocoloração. Resultados:

[00133] Como o vírus de 10-del produziu a menor viremia em camundongos (FIG. 5D), mas induziu uma resposta de anticorpos de

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 55/134

52/95 neutralização comparável a do WT e de outros mutantes (FIG. 5E 5G), priorizou-se este mutante para posterior caracterização. A uma dose de 100 IFU, os camundongos infectados pelo vírus de 10-del apresentaram um pico de viremia atrasado > 100 vezes menor do que o do vírus WT (FIG. 7A). Níveis equivalentes de titulações de neutralização pré-desafio foram induzidos pelos vírus WT e de 10-del (FIG. 7B), levando a proteção completa contra viremia após desafio com 1 x 10⁶ IFU da cepa PRVABC59 de ZIKV de Porto Rico (FIG. 7C). Além disso, mesmo quando imunizados em uma dose de apenas 10 IFU, os camundongos infectados por vírus de 10-del geraram uma titulação de neutralização de (9,7 + 6,8) x 10³e estavam totalmente protegidos da viremia após o desafio (FIG. 8).

[00134] Vale ressaltar que camundongos imunizados com diferentes doses de 10-del mutante (10, 10² e 10⁴ IFU) induziram titulações de anticorpos de neutralização semelhantes e preveniram completamente a viremia por desafio ( comprar FIG. 5 e as FIGURAS (7&8).

[00135] Coletivamente, esses resultados demonstram que o vírus de 10-del é um potente candidato à vacina.

Exemplo 6: Comparação dos vírus de 10-del PO e P5

Materiais e Métodos:

[00136] Imunização com o vírus de 10-del PO ou P5: Camundongos A129 com três semanas de idade (n = 5) foram imunizados com 100 IFU de vírus de 10-del P0 ou P5 por via S.C. A viremia foi quantificada por ensaio de foco de imunocoloração do dia 4 ao dia 6.

[00137] Titulações de anticorpos de neutralização pré-desafio: No dia 28 pós-imunização, os soros de camundongo foram quantificados para as titulações de anticorpos de neutralização do ZIKV.

[00138] Viremia após desafio com ZIKV do tipo selvagem: No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram desafiados com 1 x 10⁶ IFU de uma cepa epidêmica do ZIKV (cepa de Porto Rico PRVABC59) via

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 56/134

53/95 rota LP. No dia 2 pós-desafio, as viremias foram quantificadas usando um ensaio de foco de imunocoloração.

Resultados:

[00139] Como o vírus P5 acumulou mutações adaptativas de células Vero (FIG. 4C), comparamos a virulência e a imunogenicidade entre os vírus de 10-del PO e P5 nos camundongos A129. Após a imunização com 100 IFU por via SC, os vírus PO e P5 geraram viremia comparável e induziram titulações de neutralização equivalentes (As FIGURAS 11A e 11B). Depois de desafiar com 1 x 10⁶ IFU da cepa de Porto Rico PRVABC59 do ZIKV por via LP, nenhuma viremia foi detectada nos camundongos vacinados com o vírus PO ou P5; em contraste, a viremia robusta foi detectada no grupo de simulação (FIG. 11C). Estes resultados indicam que as mutações adaptativas de células Vero recuperadas do vírus P5 não afetam significativamente a virulência e imunogenicidade do vírus de 10-del.

Exemplo 7: Respostas de células T em camundongos A129 imunizados com ZIKV de 10-del

Materiais e Métodos:

[00140] Medição de respostas de células T em camundongos A129. Camundongos A129 foram infectados com 1 x 10⁴ IFU de Vírus WT e de 10-del. No dia 28 pós-infecção, os baços de camundongo foram colhidos. Esplenócitos foram contados, cultivados ex vivo com ZIKV WT por 24, e corados para marcadores (IFN-γ, CD3 e CD4 ou CD8). As células T foram capturadas com base na coloração desses marcadores, as porcentagens de células CD4⁺IFN-y⁺ e células CD8⁺IFN-y⁺ foram contadas e o número total médio de subconjuntos de células T por baço foi registrado. Os sobrenadantes da cultura ex vivo foram colhidos no dia 2 após a reestimulação de ZIKV WT e medidos para a produção de IFN-γ e IL-2.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 57/134

54/95 [00141] Imunoensaio de Bio-Plex. Aproximadamente 3 x 10⁵ esplenócitos foram plaqueados em placas de 96 poços e estimulados com 1,25x10⁴ IFU de cepa FSS13025 de ZIKV por 48 h. Os sobrenadantes da cultura foram coletados e a produção de citocinas foi medida usando um Ensaio de Citocina de Camundongo Bio-Plex Pro (Bio-Rad, Hercules, CA).

[00142] Coloração de citocinas intracelulares (ICS). Aproximadamente 2,5 x 10⁶ esplenócitos foram estimulados com 1 x IO⁵ IFU de ZIKV vivo (cepa FSS 13025) por 24 h. Durante as 5 horas finais de estimulação, BD GolgiPlug (BD Bioscience) foi adicionado para bloquear o transporte de proteínas. As células foram coradas com anticorpos para CD3, CD4 ou CD8; fixadas em paraformaldeído a 2% e permeabilizado com saponina a 0,5% antes da adição de anti-IFN-γ, ou lgG1 de rato de controle (e-Biosciences). As amostras foram processadas com um instrumento Citômetro de Fluxo C6. As células mortas foram excluídas com base na dispersão de luz frontal e lateral. Os dados foram analisados com um Citômetro de Fluxo CFIow Plus (BD Biosciences).

Resultados:

[00143] Analisamos as respostas de células T em camundongos A129 imunizados com 1 < 10⁴ IFU de vírus WT e de 10-del. No dia 28 pós-imunização, as células T específicas de ZIKV foram re-estimuladas com vírus WT vivo in vitro e analisadas usando um ensaio de coloração de citocina intracelular (ICS) e um imunoensaio Bio-Plex. Os resultados mostraram que tanto as células T CD4+ e CD8⁺ imunes ao vírus mutante quanto WT tinham respostas de IFN-γ mais elevadas do que o grupo simulado imunizado (As FIGURAS 9A e 9B). Além disso, estas células T imunes induziram mais IFN-γ (FIG. 9C) e IL2 (FIG. 9D) do que o grupo simulado; particularmente, as células T imunes mutantes de 10-del produziram IFN-y 4 vezes mais do que o grupo imune ao

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 58/134

55/95 vírus WT. Estes resultados indicam que o candidato à vacina de 10-del induz uma resposta robusta de células T.

Exemplo 8: Segurança do candidato à vacina de 10-del

Materiais e Métodos:

[00144] Titulações de vírus de órgãos. O coração, pulmão, fígado, baço, rim, músculo, cérebro, testículos e olhos foram colhidos no dia 6 e 10 após infecção depois de 1 x 10⁴ IFU de WT e vacinação com vírus 10-del via S.C. As titulações de órgãos foram realizadas usando um ensaio de foco de imunocoloração como descrito acima. Em resumo, 500 μΙ de DMEM com 2% de FBS e penicilina/estreptomicina juntamente com um rolamento de esferas de aço foram colocados em um tubo Eppendorf de 2 mL. O órgão (todo ou parte) foi colocado no tubo. Os tubos foram pesados e o peso dos órgãos foi determinado subtraindo-se o peso do tubo. Os tecidos foram homogeneizados em um Qiagen TissueLyser II, agitando a 26 p/segundo durante 5 minutos. O homogenato foi clarificado por centrifugação durante 5 minutos a 12.000 rpm e titulado em monocamada Vero usando um ensaio de foco de imunocoloração. A titulação foi então ajustada para volume e peso de órgão para relatar as cargas orgânicas como IFU/g (Referência 16).

[00145] Neurovirulência em camundongos CD1 recém-nascidos. Grupos de camundongos CD1 não consanguíneos de 1 dia de idade (n = 7-10) foram injetados intracranianamente (I.C.) com WT ou 10-del com diluições de dez vezes em série de 10.000 IFU para 10 IFU. Os camundongos foram monitorados diariamente para morbidade e mortalidade.

[00146] Infecção experimental de mosquitos com ZIKV. Os mosquitos Aedes aegypti derivados de uma colônia de Texas, Galveston, foram expostos por 45 min a refeições de sangue consistindo em 1% (peso/volume) de sacarose, 20% (volume/volume) de FBS, 5 mM de

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 59/134

56/95

ATP, 33% (volume/volume) de células sanguíneas humanas-PBS lavadas (Banco de Sangue UTMB) e meio DMEM a 33% (volume/volume) e combinadas com virus de 1 ml oferecidas em reservatórios aquecidos de 2 ml de Hemotek (Discovery Workshops) cobertos com uma pele de camundongo. As titulações de vírus nas refeições de sangue foram 1 x IO⁶ IFU/ml. As refeições de sangue infeccioso foram carregadas em caixas contendo Ae. aegypti. Os mosquitos totalmente ingurgitados foram incubados a 28°C, 80% de umidade relativa em um ciclo de 12: 12 h de claro e escuro com acesso ad lib a 10% de solução de sacarose por 7 dias e colhidos por congelamento a -20°C por 3 h. Os mosquitos inteiros foram homogeneizados individualmente (homogeneizador Retsch MM300, Retsch Inc., Newton, PA) em DMEM com 20% de FBS e 250 pg/ml de anfotericina B e armazenados a 80°C. As amostras foram centrifugadas por 10 min a 5.000 rpm e 75 pl de cada sobrenadante da amostra foram inoculados em placas de 96 poços contendo células Vero a 37°C e 5% CO2durante 3 dias, quando foram fixados com uma mistura de solução gelada de acetona e metanol (1:1) e imunocorados como descrito acima. A infecção foi determinada pela detecção do vírus no mosquito homogeneizado. A taxa de infecção foi registrada como a fração de mosquitos positivos dividida pelo número total de mosquitos ingurgitados e incubados.

[00147] Análises de contagens de espermatozóides e testículos: Camundongos A129 foram infectados com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT e mutante de 10-del. Um grupo infectado com simulação com PBS foi incluído como um controle negativo. No dia 16 p.i., os camundongos foram eutanisados e necropsiados; 0 epidídimo e os testículos foram colhidos imediatamente como descrito anteriormente (Referência 32). Resumidamente, 0 epidídimo foi colocado em 1 ml de meio M2 préaquecido a 37°C. Para liberar 0 espermatozóide, 0 epidídimo foi cortado longitudinalmente seis vezes e incubado por 10 min, agitando a ca

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 60/134

57/95 da 2 min a 37°C. Após a incubação, o meio contendo o esperma foi imediatamente diluído a 1:50 em meio M2 pré-aquecido e contado em um hemocitômetro. Os espermatozóides móveis foram categorizados em progressivos e não progressivos. Os espermatozóides progressivamente móveis são descritos como deslocamento contínuo da cabeça pelo movimento flagelar. Os espermatozóides não progressivamente móveis são descritos como pouco ou nenhum deslocamento da cabeça pelo movimento flagelar. Nos espermatozóides não móveis, nenhum movimento flagelar foi observado.

Resultados:

[00148] Três conjuntos de experimentos foram realizados para analisar a segurança do candidato à vacina de 10-del. Primeiramente, medimos as cargas virais em diferentes órgãos após a inoculação via S.C. de camundongos A129 com 1 x 10⁴ IFU de vírus WT ou de 10-del (FIG. 10A). No dia 6 pós-infecção, os camundongos infectados por WT tinham altas cargas virais em todos os órgãos testados, enquanto os infectados de 10-del não tinham vírus no músculo ou cérebro, e menores cargas virais no coração, pulmão, fígado, baço, rim, testículos e olhos. No dia 10 pós-infecção, os camundongos infectados pelo vírus WT retiveram cargas virais nos rins, cérebro, testículos e olhos, dentre os quais os testículos tiveram a maior titulação média; em contraste, nenhum vírus pode ser detectado (< 10² IFU/mL) em quaisquer órgãos dos camundongos infectados de 10-del. Como foi relatado que a infecção por ZIKV danifica os testículos em camundongos (Referências 17, 18), examinamos o efeito da imunização sobre a função dos testículos nos camundongos A129. No dia 16 pós-imunização, o peso e o tamanho semelhantes dos testículos foram recuperados dos camundongos infectados com o modelo simulado, vírus WT e de 10-del mutante. No entanto, as contagens de espermatozóides móveis e totais foram reduzidas nos camundongos infectados pelo vírus WT, enquanto os ca

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 61/134

58/95 mundongos infectados pelo vírus de 10-del não comprometeram significativamente a contagem de espermatozóides quando comparados com o grupo simulado (FIG. 12).

[00149] Em segundo lugar, examinamos a neurovirulência do vírus de 10-del pela injeção intracraniana (I.C.) de camundongos CD1 com um dia de idade (FIG. 10B). Os camundongos recém-nascidos sucumbiram à infecção pelo vírus WT de uma maneira responsiva à dose; até uma dose de 10 IFU resultou em 25% de mortalidade. Notavelmente, os camundongos infectados com vírus de 10-del não apresentaram nenhuma doença ou morte aparente, mesmo em uma dose de 1 x 10⁴ IFU. Finalmente, determinamos se o vírus de 10-del poderíam infectar os mosquitos Aedes aegypti, o principal vetor de transmissão do ZIKV nas Américas (Referências 19, 20). Após exposição a alimentos artificiais contendo 1 x 10⁶ IFU/ml de vírus WT ou de 10-del e incubação por 7 dias, 56% dos mosquitos ingurgitados foram infectados pelo vírus WT, enquanto nenhum mosquito foi infectado pelo mutante de 10-del. Além disso, a injeção intratórax do vírus de 10-del em mosquitos não produziu nenhum vírus infeccioso no dia 7 após a injeção. Coletivamente, nossos resultados demonstraram que o vírus de 10-del reduziu ou eliminou significativamente as cargas virais nos órgãos do camundongo, diminuiu a neurovirulência em > 1.000 vezes e atenuou sua capacidade de infectar o principal vetor de mosquito urbano, todos sugestivos de um excelente perfil de segurança.

[00150] Nossos dados indicam que a 3'UTR de ZIKV de 10-del é um candidato à vacina vivo atenuado promissor com um bom equilíbrio entre imunogenicidade e segurança. Uma única imunização induziu respostas robustas de anticorpos e células T e, significativamente, ao contrário da subunidade e das vacinas inativadas do ZIKV publicadas até o momento, provavelmente induz a imunidade esterilizante e fornece proteção completa contra cepas parentais e epidêmicas do ZIKV.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 62/134

59/95

A imunidade esterilizante induzida por vacina é provavelmente crítica para uma vacina bem-sucedida contra o ZIKV para prevenir viremia e anomalias congênitas. O perfil de segurança deste candidato à vacina é destacado pela baixa viremia, pouca carga viral e carga viral transitória nos órgãos, e perda de peso limitada no modelo de camundongos A129, bem como uma completa falta de morbidade e mortalidade em um camundongo de um dia de idade após receberem uma injeção intracraniana (I.C.). O último resultado de segurança é impressionante porque a inoculação I.C. com YFV 17D e JEV SA14-14-2 (duas vacinas de flavivírus vivos atenuados licenciadas) resulta em doença letal em camundongos recém-nascidos de um dia de idade (Referências 21, 22). Embora a potencial recombinação homóloga entre o WT e a vacina ZIKVs possa representar um risco de segurança para o candidato à vacina de 10-del, deve-se observar que os eventos de recombinação são raros e não puderam ser detectados em cultura de células (Referências 23-27). Em comparação com a vacina de ZIKV quimérico, vivo-atenuado (por exemplo, ZIKV prM-E expressando YFV 17D ou ZIKV prM-E expressando DENV (Referência 28)), nossa vacina de 3'UTR mutante tem a vantagem de reter todos os genes estruturais e não estruturais do ZIKV que podem contribuir para a proteção antiviral, conforme indicado pelos estudos da vacina contra a dengue (Referências 29, 30).

[00151] Em comparação com a vacina de ZIKV quimérico, vivoatenuado (por exemplo, ZIKV prM-E expressando YFV 17D), nossa vacina de 3'UTR mutante tem a vantagem de reter todos os genes estruturais e não estruturais do ZIKV que podem contribuir para a proteção antiviral, conforme indicado pelos estudos de vacinas de dengue (Referências 29, 30). Mecanisticamente, os vírus de 3'UTR mutantes pareceram ser atenuados através da diminuição da replicação do RNA viral e do aumento da sensibilidade à inibição do interferon do tipo I.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 63/134

60/95

Este último mecanismo está de acordo com um relatório recente de que a diversidade genética na 3'UTR do DENV contribui para o potencial epidêmico (Referência 14). Em conjunto, nossos resultados indicam que o ZIKV 3'UTR mutante é um candidato à vacina atraente que deve ser promovido a primatas não humanos para desenvolvimento posterior.

Experimentos in vivo adicionais para caracterizar a segurança e a eficácia de cepas do ZIKV atenuado vivo com deleção de 3'UTR Materiais e Métodos:

[00152] Sistemas in vivo adicionais usando os Materiais e Métodos e os exemplos que seguem também foram empregados para caracterizar a segurança e eficácia de candidatos a vacinas, incluindo prenhez de camundongo C57BL/6J, proteção de testículo de camundongo A129, carga viral em órgão de camundongo A129, neurovirulência de camundongo CD-1 e eficácia do macaco rhesus (ver detalhes abaixo). Os protocolos para cada um destes sistemas experimentais foram previamente estabelecidos (por exemplo, dose de inóculo, via de infecção, dose de desafio e medição do ponto final), e não foram alterados na avaliação desses candidatos a vacinas. Portanto, diferentes doses de inóculo, doses de desafio e medidas de ponto final (por exemplo, qRT-PCR para medir o RNA viral e ensaio de formação de foco para medir o vírus da infecção) foram usadas em diferentes sistemas in vivo de acordo com os protocolos estabelecidos. A informação detalhada é descrita abaixo e indicada nos Exemplos que seguem.

[00153] Estudos de camundongos: Todos os experimentos in vivo usando camundongos foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Os protocolos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Washington (Número de Garantia

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 64/134

61/95

A3381-01) e pelo IACUC da Divisão Médica da Universidade do Texas (UTMB; Número de Protocolo 0209068B). Dissecções e injeções na pata foram realizadas sob anestesia que foi induzida e mantida com cloridrato de cetamina e xilazina na Universidade de Washington ou isoflurano na UTMB. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais. Os experimentos com macacos rhesus foram revisados e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais do Centro de Pesquisa para Vacina no Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, o National Institutes of Health. Os experimentos de primatas não humanos foram realizados em conformidade com os regulamentos e políticas pertinentes do National Institutes of Health. [00154] Vírus e Células: A cepa cambojana ZIKV FSS13025 (número GenBank KU955593.1) foi produzida a partir de um clone de cDNA infeccioso (Referência 35). As cepas ZIKV- 3'UTR-A10-LAV e ZIKV3'UTR-A20-LAV foram geradas como descrito. A cepa de Zika de Porto Rico PRVABC59 (número GenBank KU501215) e a cepa Dakar 41519 (número GenBank HQ234501.1) foram obtidas originalmente do Dr. Robert Tesh do World Reference Center of Emerging Virus and Arboviruses (WRCEVA) em UTMB na UTMB. A cepa ZIKV-Dakar 41519 adaptada ao camundongo foi passada duas vezes em camundongos Ragl -/- (Jackson Laboratories) e descrita anteriormente (Referência 29). As células Vero foram adquiridas junto à American Type Culture Collection (ATCC CCL-81; Bethesda, MD), e mantidas a 37°C com 5% de CO2 em um meio de Eagle modificado com Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) com 10% de soro fetal de bovino (FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT) e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas as linhagens de células apresentaram resultados negativos para micoplasma.

[00155] Anticorpos: Os seguintes anticorpos foram utilizados neste estudo: anticorpo monoclonal de receptor 1 anticamundongo IFN al

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 65/134

62/95 fa/beta (Ifnarl) (clone MAR1-5A3; Leinco Technologies, Inc., St. Louis, Missouri); HMAF específico para ZIKV (fluidos de ascite hiperimune; obtido junto à WRCEVA), anticorpo IgG anticamundongo marcado com peroxidase de raiz forte (KPL, Gaithersburg, MD) e IgG anticamundongo de cabra conjugado com Alexa Fluor® 488 (Thermo Fisher Scientific, Providence, Rl).

[00156] Experimentos com camundongos A129·. Camundongos A129 foram criados nas instalações de animais na UTMB. Todos os camundongos foram alojados em instalações de camundongos livres de patógenos. Camundongos A129 machos de três semanas ou 15 semanas de idade foram infectados com PBS (dois grupos de simulação), 10⁴FFU de ZIKV-3'UTR-A10-LAV (Δ10), ou 10³ FFU de ZIKV3'UTR-A20-LAV (Δ20). Os camundongos foram anestesiados e sangrados através do seio retro-orbital (R.O.) para testes de viremia. No dia 28 pós-imunização, os camundongos foram medidos para titulações de anticorpos de neutralização usando um ensaio de infecção mCherry ZIKV (Referência 36). No mesmo dia, um grupo de camundongos imunizados com PBS e camundongos imunizados com Δ10- e Δ20 foram desafiados com 10⁶ FFU de ZIKV PRVABC59. Outro grupo de simulação de camundongos foi usado como um controle negativo não desafiado. No dia 49 pós-imunização, os camundongos foram eutanaziados e necropsiados. O epidídimo e os testículos foram colhidos imediatamente como descrito anteriormente (Referência 32). Os espermatozóides móveis e não móveis foram contados manualmente em um emocitômetro por microscopia. A contagem de espermatozóides totais é igual à soma dos espermatozóides móveis e não móveis. Para a quantificação das cargas virais, os testículos foram homogeneizados e os níveis virais infecciosos foram medidos por um ensaio de formação de foco ou PCR de transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) (Referência 36).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 66/134

63/95 [00157] O conjunto de iniciador/sonda qRT-PCT inclui iniciador direto (1193F: 5'-CCGCTGCCCAACACAAG-3'), iniciador reverso (1269R: 5-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3'), e sonda (5'- FAM/AGCCTA CCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ-3'). A sonda contém um corante repórter 5-FAM, um extintor 3 'IBFQ e um extintor ZEN interno.

[00158] Experimentos de prenhez no camundongo: Camundongos C57BL/6J foram criados e alojados em instalações de camundongos livres de patógenos na Escola de Medicina da Universidade de Washington. Um dia antes da imunização, os camundongos C57BL/6J fêmeas com oito semanas de idade foram dosados com 0,5 mg de anticorpo anti-lfnarl por via intraperitoneal. Subsequentemente, os camundongos foram inoculados subcutaneamente na pata com 10⁵ FFU de ZIKV-3'UTR-A10-LAV ou simulação de PBS. Camundongos fêmeas C57BL/6 imunizados do tipo selvagem (WT) foram acasalados com camundongos WT machos naive. No dia embriônico 5 (E5), as mães prenhas foram injetadas intraperitonealmente com 2 mg de anticorpo anti-lfnarl. Em E6, os camundongos foram inoculados subcutaneamente com 10⁵ FFU de ZIKV Dakar 41519 adaptado ao camundongo via injeção na pata. Todos os animais foram sacrificados em E13 e analisados quanto a cargas virais em placentas, fetos e tecidos maternos. Resumidamente, o sangue materno, os órgãos das mães (cérebro e baço) e fetos (placenta e cabeça fetal) foram coletados. O soro foi preparado após coagulação e centrifugação. Os órgãos foram pesados e homogeneizados usando um aparelho batedor de esferas (MagNA Lyser, Roche). O RNA viral foi extraído de amostras de soro e tecido usando o kit RNeasy Mini (Qiagen). Os níveis de RNA viral foram determinados por qRT-PCR de uma etapa TaqMan em um ABI 7500 Fast Instrument usando condições padrões de ciclagem. A carga viral é expressa em uma escala de log™ como equivalentes de RNA viral por

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 67/134

64/95 grama ou por mililitro após comparação com uma curva padrão produzida usando diluições em série de 5 vezes de RNA do ZIKV a partir de quantidades conhecidas de vírus infecciosos. O seguinte conjunto de iniciador/sonda foi utilizado para o ZIKV qRT-PCR: iniciador direto (1183F: 5’-CC ACCAATGTTCTCTTGCAGAC ATATTG-3'), iniciador reverso (1268R: 5'-TTCGGACAGCCGTTGTCCAACACAAG-3'), e sonda (1213F: 5'-56-FAM/AGCCTACCT TGAC AAGC AGTC/3 IABkFQ-3'). Sempre que indicado, a carga viral para algumas amostras foi determinada por ensaio de formação de foco em células Vero (Referência 28).

[00159] Quantificação da carga viral em órgãos de camundongos A129: Os camundongos A129 foram infectados e os órgãos foram quantificados para carga viral usando um ensaio de formação de foco (Referência 28). O RNA viral nos testículos também foi quantificado por qRT-PCR. Resumidamente, os testículos foram colhidos e colocados em DMEM com microesferas para homogeneização. Após a homogeneização, o sobrenadante foi usado para extrair RNA viral usando o kit RNeasy Mini (Qiagen). O RNA extraído foi eluído em 40 pl de água livre de RNase. Os ensaios de qRT-PCR foram realizados no Sistema LightCycler® 480 (Roche) seguindo o protocolo do fabricante, usando uma reação de 50 pl do kit QuantiTect Probe RT-PCR (QIAGEN) e um modelo de RNA de 10 μΙ. A carga viral foi calculada com base em uma curva padrão produzida usando diluições em série de 10 vezes de RNA do ZIKV a partir de quantidades conhecidas de vírus infecciosos. O conjunto de iniciador/sonda qRT-PCT inclui iniciador direto (1193F: 5-CCGCTGCCCAACACAAG-3'), iniciador reverso (1269R: 5'- CC ACTAACGTTCTTTTGC AGAC AT-3'), e sonda (5'FAM/AGCCTACCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ3'). A sonda contém um corante repórter 5-FAM, um extintor 3 'IBFQ e um extintor ZEN interno.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 68/134

65/95 [00160] Vacinação de primatas não humanos'. Os experimentos de macaco Rhesus (Macaca mulato) foram realizados na Bioqual, Inc. (Rockville, MD). Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Pesquisa de Vacina, o Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, o National Institutes of Health. Os animais foram alojados e cuidados de acordo com as políticas locais, estaduais, federais e institucionais em uma Associação Americana para Acreditação de Instalações Acreditadas para Cuidados de Animais de Laboratório no Bioqual Inc. Os macacos Rhesus (3-4/grupo) foram randomizados por peso corporal, sexo, e idade, e administrados subcutaneamente com 10³ FFU da cepa parental ZIKV WT FSS 13025, ZIKV-3'UTR-A10-LAV, ZIKV-3'UTR-A20-LAV, ou simulação de PBS no dia 0. O sangue foi colhido nos dias 2, 3, 4, 5, 7 e 10 para testes de viremia e semanalmente para análise de respostas de anticorpos por um ensaio de neutralização mCherry ZIKV (Referências 36, 38). Os animais imunizados foram desafiados por via subcutânea com 10³ FFU da cepa PRVABC59 de ZIKV na semana 8. As amostras de sangue foram coletadas para determinação da carga viral no dia 2, 3, 4, 5, 7 e 10 e anticorpo de neutralização nas semanas 2, 4 e 6 pós-desafio.

[00161] A viremia de macacos rhesus foi quantificada por um ensaio de qRT-PCR e o ensaio de formação de foco foi como descrito na seção anterior. Para a quantificação de qRT-PCR, o RNA viral foi extraído do soro rhesus usando Kits de RNA Viral QIAamp (QIAGEN) seguindo as instruções de fabricação. O RNA extraído foi eluído em 40 pL de água livre de RNase. O ensaio qRT-PCR foi realizado como descrito acima. O RNA de ZIKV de comprimento completo transcrito in vitro foi usado como um padrão para quantificação qRT-PCR. O conjunto de iniciador/sonda é descrito na seção anterior.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 69/134

66/95 [00162] Ensaio de neutralização e neurovirulência: Todos as titulações de neutralização de anticorpos foram determinados usando um mCherry ZIKV como relatado anteriormente (Referência 36). As dobras de diluição que neutralizaram 50% da infecção por mCherry ZIKV (NT50) foram apresentadas. Para medição da neurovirulência, camundongos CD-I de 1 dia de idade (Charles River) foram injetados intracranialmente com quantidades indicadas de vírus. Os camundongos infectados foram monitorados quanto à morbidade e mortalidade, conforme relatado anteriormente (Referência 36).

[00163] Infecção por mosquito: Para medir a infecção do mosquito, foi utilizada farinha de sangue artificial enriquecida com 10⁶ FFU/ml de vírus indicados para alimentar mosquitos Aedes aegypti (derivados de Galveston, Texas) e os mosquitos ingurgitados foram incubados a 28°C, 80% de umidade relativa em ciclos de 12: 12 h de claro e escuro com acesso ad libitum a 10% de sacarose. As taxas de infecção foram determinadas no dia 7 pós-alimentação, conforme relatado anteriormente (Referência 10).

[00164] Análise de dados: Todos os dados destes experimentos cujos resultados são descritos nos exemplos que seguem e estão contidos nas figuras aqui referenciadas foram analisados com o software GraphPad Prism v7.02. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (SD). As comparações dos grupos foram realizadas por meio do teste de Mann-Whitney ou ANOVA de via única com correção de comparações múltiplas. Um valor de P <0,05 indica estatisticamente significativo.

Exemplo 9: Prevenção da transmissão vertical em camundongos prenhes.

[00165] O candidato à vacina vivo atenuado aqui descrito que contém uma deleção de 10 nucleotídeos na 3'UTR do genoma do ZIKV (ZIKV-3'UTR-A10-LAV) foi testado quanto à sua capacidade para pre

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 70/134

67/95 venir a transmissão no útero. Nestes experimentos, inoculamos subcutaneamente 10⁵ unidades formadoras de foco (FFU) de ZIKV-3'UTRΔΙΟ-LAV ou simulação de PBS em camundongos fêmeas C57BL/6 de 8 semanas de idade (FIG. 13A). Como os camundongos não são hospedeiros nativos para o ZIKV, devido em parte à falta de antagonismo dependente da espécie da sinalização de IFN do tipo I (Referências 39, 40), nós administramos 0,5 mg de anticorpo anti-lfnarl bloqueador a camundongos fêmeas um dia antes da vacinação para facilitar a replicação transiente do ZIKV-3'UTR-A10-LAV e tentar produzir a doença (Referência 41). No dia 28 pós-vacinação, os animais foram flebotomizados e o soro foi analisado quanto ao anticorpo de neutralização (FIG. 13B); todos os camundongos imunizados com ZIKV-3'UTR-A10LAV desenvolveram titulações elevadas de anticorpos de neutralização de 18.900 ± 5.900 (média ± desvio-padrão; n = 13), enquanto, como esperado, os animais imunizados com PBS não desenvolveram anticorpos de neutralização detectáveis (FIG. 13C). No dia 35 após a vacinação, as fêmeas imunizadas foram acasaladas com camundongos C57BL/6 machos do tipo selvagem (WT) com 12 semanas de idade e monitoradas quanto a obstruções vaginais (FIG. 13A). No dia embriônico 6 (E6), os camundongos prenhes foram desafiados por via subcutânea com 10⁵ FFU de uma cepa africana ZIKV patogênica adaptada ao camundongo Dakar 41519 (Referência 42); para facilitar a disseminação do ZIKV-Dakar para a placenta materna e a placenta fetal, os camundongos prenhes receberam 2 mg de anticorpo antilfnarl em E5, um dia antes do desafio. Em E13, órgãos maternos e fetais foram colhidos e medidos para carga viral.

[00166] Após uma única imunização, o ZIKV-3'UTR-A10-LAV reduziu as cargas virais médias no baço e cérebro materno em -49.000 vezes e ~ 120 vezes, respectivamente (FIGURAS 13D-E). As placentas e cabeças fetais das fêmeas com cria vacinadas mostraram reduções

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 71/134

68/95 de 138.000 vezes e 260 vezes nas cargas de RNA viral, respectivamente, quando comparadas com as fêmeas com cria imunizadas com PBS (FIGURAS 13F-G). Notavelmente, 21 de 30 (70%) placentas e 21 de 30 (70%) cabeças fetais de fêmeas com cria imunizadas com ZIKV3'UTR-A10-LAV tinham cargas de RNA viral no limite de detecção ou abaixo dele; nenhum vírus infeccioso foi recuperado por ensaio de formação de foco das placentas ou cabeças fetais das fêmeas com cria vacinadas (FIGURAS 17A-B). Além disso, o correlato imune entre os valores de ECso e os níveis de vírus infecciosos recuperados na placenta revelaram uma relação inversa esperada entre as titulações de neutralização e os níveis de partículas do ZIKV na placenta (FIG 17C). Coletivamente, os dados sugerem que o ZIKV-3'UTR-A10-LAV protege os órgãos maternos da infecção, impede parcialmente a transmissão viral para o feto durante um estágio inicial da prenhez e limita a replicação fetal.

Exemplo 10: Proteção dos danos induzidos pelo ZIKV nos testículos.

[00167] Examinou-se a capacidade do ZIKV-3'UTR-A10-LAV para prevenir infecção do testículo e lesão em camundongos A129 Ifnarl⁷' (FIG. 14A). Como os camundongos machos atingem a maturidade sexual com 8 semanas de idade, testou-se a eficácia da vacina em dois grupos etários de camundongos: machos jovens de 3 semanas de idade e machos adultos de 15 semanas de idade. Três camundongos machos jovens A129 de três semanas foram vacinados com uma dose única de 10⁴FFU do ZIKV-3'UTR-A10-LAV ou simulação de PBS. O ZIKV-3'UTR-A10-LAV gerou um pico de viremia de 1,2 ± 0,34 x 10⁴ FFU (n = 6) no dia 4 pós-vacinação (FIG. 14B). No dia 28 pósvacinação, o ZIKV-3'UTR-A10-LAV induziu titulações de anticorpos de neutralização robustos de 7.700 ± 2.600 (n = 6) (FIG. 14C). No mesmo dia, os animais foram desafiados intraperitonealmente com 10⁶ FFU de

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 72/134

69/95 uma cepa ZIKV epidêmica de Porto Rico (PRVABC59). Não foi detectada viremia nos camundongos vacinados com ZIKV-3 JTR-A10-LAVapós o desafio, enquanto os animais vacinados com simulação apresentaram um pico médio de viremia de 7,1 ± 5,9 x10⁶ FFU/ml (n = 6) no dia 2 após o desafio. (FIG. 14D). No dia 21 após o desafio, a carga viral no testículo de camundongos imunizados com PBS atingiu 5,8 ± 8,4 x 10⁶ FFU/g (n = 6), enquanto nenhum vírus infeccioso foi detectado nos testículos de camundongos imunizados com ZIKV-3'UTR-A10LAV (FIG. 14E). Tanto a contagem de espermatozóides totais como móveis dos camundongos imunizados com ZIKV-3'UTR-A10-LAV foram equivalentes àqueles de camundongos machos saudáveis, não desafiados, não vacinados pareados por idade. Em contraste, os camundongos imunizados com PBSie desafiados com ZIKV mostraram 85% e 90% de redução para as contagens totais e móveis de espermatozóides, respectivamente, no dia 21 pós-infecção (FIG. 14F&G). Consistente com esses dados, o peso dos testículos e o tamanho dos camundongos desafiados com ZIKV imunizados com PBS foram reduzidos, enquanto que nenhuma redução foi observada nos animais imunizados com ZIKV-3'UTR-A10-LAV e desafiados com ZIKV (FIG. 14H&I).

[00168] Em camundongos machos A129 adultos de 15 semanas de idade, a vacinação com ZIKV-3'UTR-A10-LAV também protegeu contra infecção do testículo, lesão e oligospermia (FIG. 17A-G). No entanto, o desafio dos machos adultos vacinados com PBS com ZIKV PRVABC59 não reduziu o peso e tamanho dos testículos (FIG. 17H&I) tanto quanto os observados nos machos jovens vacinados com placebo (FIG. 17H&I), sugerindo uma patologia do testículo dependente da idade. Coletivamente, os resultados indicam que uma imunização de dose única de ZIKV-3'UTR-A10-LAV protege os testículos contra infecções e lesões em camundongos machos.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 73/134

70/95

Exemplo 11: Eficácia em primatas não humanos.

[00169] Para determinar se a eficácia em camundongos se estende a primatas não humanos (NHPs), avaliamos a viremia, imunogenicidade e potência do ZIKV-3'UTR-A10-LAV em macacos rhesus (RM; FIG. 15A). Primeiro, avaliou-se o nível de atenuação do ZIKV-3'UTR-A10LAV em RM, comparando a viremia ao vírus WT parental. Após a inoculação subcutânea com 10³ FFU, o ZIKV WT (cepa cambojana 2010 FSS 13025) produziu altos níveis de viremia em cada um dos quatro RM inoculados, com um pico médio de viremia de 9,6 e 28,8 x 10⁴ cópias/ml nos dias 4 e 5 pós-infecção, respectivamente (FIG. 15B, painel superior). Em contraste, apenas um dos quatro RM inoculados com ZIKV-3'UTR-A10-LAV exibiram viremia, e este nível estava imediatamente acima do limite de detecção do nosso ensaio de qRT-PCR (FIG. 15B, segundo painel); assim, o ZIKV-3'UTR-A10-LAV é altamente atenuado em RM.

[00170] Em seguida, avaliou-se a imunogenicidade do ZIKV-3'UTRA10-LAV medindo anticorpos de neutralização do soro nos dias 5-98 pós-imunização. Os anticorpos de neutralização provocados por ZIKV WT foram detectáveis no dia 7-10, atingiram o pico de 1/1.000 a 1/10.000 no dia 14 e estabilizaram em seguida (FIG. 15C, painel superior). Em comparação com a infecção por ZIKV WT, os animais inoculados com ZIKV-3'UTR-A10-LAV mostraram uma produção ligeiramente retardada e níveis mais baixos de anticorpo de neutralização, com titulações de -1/100 nos dias 21-56 (FIG. 15C, segundo painel). No dia 56 pós-imunização, todos os RM foram desafiados com 10³ FFU da cepa ZIKV epidêmico PRVABC59. Notavelmente, nenhuma viremia foi detectada após o desafio em qualquer um dos RM que foram préinfectados com ZIKV WT ou vacinados com o ZIKV-3'UTR-A10-LAV (FIG. 15D, dois painéis superiores). Como controles, dois RM inoculados com PBS foram desafiados em paralelo e foram medidos altos ní

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 74/134

71/95 veis de viremia (FIG. 15D, Painel inferior). Além da análise do RNA viral por qRT-PCR, também realizamos ensaios de formação de foco para medir o vírus infeccioso; o ZIKV infeccioso foi detectado apenas em RM puro desafiado com ZIKV WT (FIG. 19).

[00171] Para examinar se o desafio com ZIKV resultou em resposta imune reforçada, mediu-se a atividade de neutralização pós-desafio. Não foi observado aumento na atividade de neutralização na RM vacinada com ZIKV após o desafio (FIG. 15C, painel superior), indicando que a infecção inicial provavelmente conferiu imunidade esterilizante. Em contraste, as titulações de anticorpos de neutralização aumentaram após o desafio de aproximadamente 1/100 a 1/1.000-1/10.000 nos animais imunizados com ZIKV-3'UTR-A10-LAV (FIG. 15C, segundo painel), demonstrando uma resposta anamnéstica e sugerindo um baixo nível de infecção após o desafio que não foi detectável por qRTPCR do soro. Como esperado, o RM de controle inoculado com PBS aumentou suas titulações de neutralização para -1/10.000 após o desafio (FIG. 15C, painel inferior).

[00172] Como o ZIKV-3'UTR-A10-LAV não estimulou a imunidade esterilizante em RM, avaliamos se um segundo candidato à vacina vivo atenuado ZIKV-3'UTR-A20-LAV (Referência 36), que contém uma deleção de 20 nucleotídeos em a 3'UTR, podería induzir uma resposta imune mais forte. O ZIKV-3'UTR-A20-LAV mostrou-se anteriormente, e paradoxalmente, ser menos atenuado que o ZIKV-3'UTR-A10-LAV em camundongos A129, provavelmente porque é menos sensível à inibição do IFN do tipo I em comparação ao ZIKV -3'UTR-A10-LAV (Referência 36). Após inoculação subcutânea de 10³ FFU de ZIKV-3'UTRA20-LAV, dois dos três RM tinham viremia baixa, mas detectável (FIG. 15B, terceiro painel). Os animais imunizados produziram rapidamente anticorpos de neutralização ao dia 10, com as titulações inibidoras estabilizadas entre 1/1.000 e 1/10.000 nos dias 14-21 (FIG. 15C, terceiro

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 75/134

72/95 painel). Após o desafio com 10³ FFU de ZIKV PRVABC59 no dia 56, a viremia não foi detectada por qRT-PCR (FIG. 15D, terceiro painel) e não se observou qualquer aumento nas titulações de anticorpos de neutralização (FIG. 15C, terceiro painel) nos animais imunizados com ZIKV-3'UTR-A20-LAV. Embora tenha sido utilizado um baixo número de animais para cada candidato à vacina, os resultados sugerem que uma vacina de dose única de ZIKV-3'UTR-A20-LAV induz a imunidade esterilizante em NHPs (isto é, sem viremia detectável e sem aumento da titulação de anticorpos de neutralização após o desafio).

[00173] Também avaliou-se outra vacina de ZIKV atenuado vivo codificando uma NSI sem glicosilação (ZIKV-NS1-LAV) em RM. Demonstrou-se recentemente que o ZIKV-NS1-LAV previne a transmissão no útero em um modelo de prenhez em camundongos (Referência 43). Após a imunização subcutânea de quatro RMs com 10³ FFU de ZIKV-NSI-LAV, nenhum dos animais apresentou qualquer RNA viral detectável (FIG. 15B, quarto painel). A titulação de retorno do inóculo de ZIKV-NS1-LAV usando ensaio de formação de foco confirmou a infectividade do estoque viral com a titulação infecciosa esperada. Inesperadamente, a imunização não provocou qualquer atividade neutralizadora (FIG. 15C, quarto painel). Após o desafio com 10³ FFU de ZIKV PRVABC59 no dia 56, todos os quatro animais apresentaram viremia robusta (FIG. 15D, quarto painel) e geraram titulações de anticorpos de neutralização (FIG. 15C, quarto painel). Estes resultados indicam que o ZIKV-NS1 -LAV é incapaz de replicar e desencadear respostas de anticorpos em RM.

Exemplo 12: Proteção do testículo e análise de segurança do ZIKV-3'UTR-A20-LAV.

[00174] Devido à imunidade esterilizante altamente desejável induzida pelo ZIKV-3'UTR-A20-LAV em RM, testaram-se ainda a sua eficácia e segurança. Semelhante ao ZIKV-3'UTR-A10-LAV, a imunizaPetição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 76/134

73/95 ção de camundongos A129 machos com 10³ FFU do ZIKV-3'UTR-A20LAV preveniu completamente a infecção viral e a lesão do testículo pós-desafio com ZIKV PRVABC59, como determinado por uma ausência de viremia detectável pós-desafio, a ausência de oligospermia e nenhuma diminuição no peso e tamanho dos testículos (FIG. 20). Em seguida, cinco conjuntos de experimentos foram realizados para caracterizar a segurança do ZIKV-3'UTR-A20-LAV.

[00175] Primeiramente, mediram-se as cargas virais de órgãos após inoculação subcutânea de camundongos A129 com 10³ FFU do ZIKV-3'UTR-A20-LAV ou parental ZIKV WT (FIG. 16A). No dia 6 pósinfecção, os camundongos infectados com ZIKV WT exibiram altas cargas virais em todos os órgãos testados, enquanto nenhum vírus foi detectado (<10² FFU/ml) no fígado ou cérebro dos camundongos infectados pelo ZIKV-3'UTR-A20-LAV, com outros órgãos (exceto baço) exibindo níveis mais baixos do vírus da vacina do que aqueles dos animais infectados pelo WT. No dia 10 pós-infecção, os camundongos infectados com ZIKV WT retiveram cargas virais no coração, baço, rim, testículo, olho e cérebro, enquanto nenhum órgão dos camundongos infectados com ZIKV-3'UTR-A20-LAV tinha qualquer vírus.

[00176] Em segundo lugar, examinou-se o potencial efeito adverso do ZIKV-3'UTR-A20-LAV no testículo em camundongos A129 de 3 semanas de idade. Como esperado, no dia 21 pós-infecção, a infecção por ZIKV WT reduziu o peso e o tamanho dos testículos (FIGURAS 16A-C), reduziu as contagens de espermatozóides totais e móveis (FIGURAS 16D-E), e resultou em RNA viral no testículo encolhido (FIG. 16F). Em contraste, o ZIKV-3'UTR-A20-LAV não afetou a contagem de espermatozóides ou o peso e o tamanho dos testículos (FIGURAS 16B-E), sem RNA viral detectável nos testículos (FIG. 16F).

[00177] Em terceiro lugar, avaliamos a neurovirulência do ZIKV3'UTR-A20-LAV através da inoculação intracraniana de camundongos

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 77/134

74/95

CD-I com 1 dia de idade (FIG. 16G). Conforme relatado anteriormente (Referência 36), os neonatos sucumbiram à infecção pelo ZIKV WT; mesmo uma dose de apenas 10 FFU resultou em 13% de mortalidade (FIG. 16G). Em contraste, não foi observada nenhuma mortalidade em camundongos que foram inoculados com 10³ FFU de ZIKV-3'UTRA20-LAV; no entanto, a infecção com 10⁴ FFU de ZIKV-3'UTR-A20LAV resultou em uma taxa de mortalidade de 29%.

[00178] Em quarto lugar, testou-se se o candidato à vacina poderia infectar os mosquitos Aedes aegypti, o principal vetor do ZIKV (Referências 19, 20). Depois de se alimentar de refeições artificiais contendo 10⁶ FFU/ml de ZIKV-3'UTR-A20-LAV ou ZIKV WT, 50% dos mosquitos ingurgitados foram infectados pelo ZIKV WT, enquanto nenhum mosquito foi infectado pelo ZIKV-3'UTR-, A20-LAV (FIG. 16H).

[00179] Finalmente, testou-se a estabilidade do ZIKV-3'UTR-A20LAV em cultura de células. Após cultura contínua de ZIKV-3'UTR-A20LAV em células Vero (uma linhagem de células aprovada para produção de vacina (Referência 44) durante cinco rodadas, todos os vírus P5 recuperados (derivados de três experimentos independentes) retiveram a deleção de 20 nucleotídeos. No entanto, os vírus P5 acumularam mutações adicionais nos genes codificantes de E NS1 (FIG. 21), que pode representar mutação(ões) adaptativa(s) de células Vero ou mutação (ões) compensatória(s) à deleção 3'UTR. A passagem adicional dos vírus para P10 não alterou a deleção de 20 nucleotídeos, indicando que a deleção é estável em cultura de células. Além disso, passamos o ZIKV-3'UTR-A20-LAV em camundongos A129 por três rodadas (3 dias por rodada); todos os vírus recuperados retiveram a deleção de 20 nucleotídeos, sugerindo ainda a estabilidade do vírus mutante. Em conjunto, esses resultados demonstram um excelente perfil de segurança do ZIKV-3'UTR-A20-LAV, incluindo cargas virais transitórias limitadas em órgãos de camundongos, sem efeito adverso

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 78/134

75/95 na função do testículo, diminuição da neurovirulência, incompetência para infectar mosquitos e boa estabilidade.

Conclusões [00180] Aqui demonstrou-se que candidatos a vacinas do ZIKV vivo atenuado contendo deleções na região 3' não traduzida do genoma do ZIKV (ZIKV-3'UTR-LAV), ou seja, deleções de 10 e 20 nucleotídeos, previnem a transmissão viral durante a prenhez e danos nos testículos em camundongos, bem como a infecção de primatas não humanos. Após uma vacinação de dose única, camundongos prenhes desafiados com ZIKV no dia embriônico 6 (E6) e avaliados em E13 mostram níveis acentuadamente diminuídos de RNA viral em tecidos maternos, placentários e fetais. Camundongos machos vacinados desafiados com ZIKV são protegidos contra infecção do testículo, lesão e oligospermia. Uma única imunização de macacos rhesus provocou uma resposta de anticorpos rápida e robusta, conferindo proteção completa após o desafio. Além disso, os candidatos à vacina ZIKV-3'UTR-LAV têm um perfil de segurança desejável. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento adicional do ZIKV-3'UTR-LAV é garantido para os seres humanos.

[00181] Particularmente, os resultados mostraram que uma única imunização do ZIKV-3'UTR-A10-LAV preveniu a transmissão maternofetal no início da gestação em camundongos C57BL/6. Embora nenhum vírus de desafio infeccioso tenha sido detectado, níveis muito baixos de RNA viral foram recuperados de -30% da placenta e cabeças fetais das mães vacinadas após o desafio; esses RNAs virais avançados podem derivar de complexos de vírus-anticorpo estáveis, que podem durar vários dias in vivo (Referência 47).

[00182] Com base nestes resultados, as implicações clínicas desse RNA viral não infeccioso revelador serão determinadas em outras espécies e, em particular, serão avaliadas em primatas não humanos

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 79/134

76/95 (PNHs) e, se bem-sucedidas, em humanos. Em camundongos A129 machos, uma imunização de dose única de ZIKV-3'UTR-A10-LAV ou ZIKV-3'UTR-A20-LAV preveniu a infecção do testículo e a lesão após o desafio, indicando um benefício adicional da vacinação para proteger o sistema reprodutor do macho. Notavelmente, os camundongos A129 jovens não infectados (3 ou 7 semanas de idade) infectados com ZIKV desenvolveram testículos menores, enquanto os camundongos adultos (19 semanas de idade quando infectados) não desenvolveram, sugerindo que a infecção por ZIKV poderia causar danos reprodutivos mais severos em machos mais jovens. Como observado acima, a relevância clínica desta observação será confirmada em NHPs e seres humanos. [00183] Em NHPs, uma vacinação de dose única com ZIKV-3'UTRΔΙΟ-LAV ou ZIKV-3'UTR-A20-LAV induziu respostas imunes suficientes para prevenir a viremia, com o ZIKV-3'UTR-A10-LAV provocando maior imunogenicidade, como refletido por sua capacidade de induzir imunidade esterilizante contra o desafio. Uma limitação dos atuais resultados de primatas não humanos é o baixo número de animais utilizados para cada candidato à vacina (n = 3-4). A imunidade esterilizante induzida pela vacina do ZIKV pode ser crítica para a proteção de anomalias congênitas em humanos.

[00184] As vacinas vivas atenuadas geralmente têm a vantagem da indução rápida da imunidade durável de dose única. Como o ZIKV é endêmico principalmente em países de baixa renda, uma vacina com eficácia de dose única é de importância prática, particularmente ao controlar uma população de imunização ou em surto em áreas remotas onde doses múltiplas e reforços periódicos serão desafiadores (Referência 45). Assim, as vacinas vivas atenuadas podem ser úteis para imunizar as populações que vivem e viajam para áreas endêmicas com ZIKV. Além de nosso ZIKV-3'UTR-LAV, uma imunização de dose única com RNAm modificado por nucleosídeo expressando ZIKV prMPetição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 80/134

77/95

E (50 pg) (Referência 46) ou um vetor de sorotipo adenovirus recombinante de rhesus 52 expressando ZIKV prM-E (10¹¹ partículas virais) (Referência 8) também mostrou provocar rapidamente a resposta de anticorpos e prevenir a viremia em NHPs; mas se estas duas vacinas atingiram a imunidade esterilizante não foi determinado. Todas as outras plataformas de vacina, incluindo a vacina inativada e a vacina de DNA prM-E, precisam de duas injeções para provocar uma resposta robusta de anticorpos para proteção contra viremia em NHPs (Referências 7, 8).

[00185] É concebível que em sujeitos imunocomprometidos e mulheres grávidas, a vacinação com vírus vivos atenuados possa ser contraindicada para evitar riscos adversos potenciais. No entanto, esses indivíduos podem ser protegidos usando vacinas inativadas, de subunidade ou deficientes com replicação baseada em genes. Portanto, é desejável que várias plataformas de vacina sejam desenvolvidas em paralelo com as descritas aqui, a fim de fornecer opções complementares para prevenir e controlar a infecção e a doença pelo ZIKV.

Exemplo 13: Vírus Zika do tipo selvagem lançado por plasmídeo de DNA e vacinas [00186] De modo a facilitar o desenvolvimento de vacinas para prevenir e controlar a infecção e doença do ZIKV, os inventores desenvolveram um plasmídeo de DNA que pode ser diretamente transfectado em células para gerar o ZikaVírus (ZIKV). O novo clone de comprimento completo (FL) do ZIKV lançado por DNA é montado na cadeia principal do vetor pCCI. Além da sequência do vetor pCCI, o mesmo contém um promotor CMV ou SV40 eucariótico, o genoma completo da cepa FSS13025 de ZIKV, sequência HDVr e cauda poli-A. Os clones são denominados CMV ZIKV FL e SV40 ZIKV FL dependendo dos tipos de promotores usados para transcrever o RNA viral. Os clones de comprimento completo ZIKV lançados com DNA utilizados para a

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 81/134

78/95 construção de vacinas do ZIKV vivo atenuado estão listados no Apêndice A.

[00187] Como mostrado na FIG. 22, tanto o pCCI-CMV ZIKV FL como o pCCI-SV40 ZIKV FL podem lançar eficientemente o ZIKV do tipo selvagem por meio da transfecção do plasmídeo de DNA em células Vero. Nos experimentos, 5 microgramas do plasmídeo de DNA indicado foram transfectados em células Vero através de eletroporação. Os fluidos de cultura foram coletados do dia 1 ao dia 5. As titulações virais infecciosas foram medidas por ensaio de placa em células Vero. [00188] Ao usar os clones de ZIKV FL lançados com DNA (SEQ ID NO: 6 e 7), criamos candidatos a vacinas do ZIKV atenuado vivo. Especificamente, projetamos as mutações 3'UTR de 10-del ou 20-del (Referências 19, 48) nos clones de ZIKV FL lançados com DNA, resultando em ZIKV Del 10 e ZIKV Del 20, respectivamente. Dependendo dos tipos de promotores, esses candidatos à vacina de DNA são nomeados como CMV ZIKV Del 10, CMV ZIKV Del 20, SV40 ZIKV Del 10 e SV40 ZIKV Del 20. A descrição detalhada das sequências destes candidatos a vacinas de DNA específicos é resumida no Apêndice B. Como mostrado na FIG. 23, os quatro plasmídeos da vacina do ZIKV atenuado vivo lançados por DNA também podem produzir níveis robustos de vacinas após a transfecção do DNA em células Vero.

[00189] Apêndice A: Clones de comprimento completo de ZIKV usados para construir candidatos a vacinas de ZIKV vivos atenuados Sequência de Comprimento Completo (FL) CMV ZIKV: SEQ IP NO: 6 na Listagem de Sequências

Sequência de Comprimento Completo (FL) SV40 ZIKV: SEQ IP NO: 7 na Listagem de Sequências [00190] Apêndice B: Descrição detalhada de sequências de candidatos de vacinas ZIKV atenuadas vivas exemplificadoras

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 82/134

79/95 [00191 ] CMV ZIKV Del 10: Consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO: 6 em que a sequência CCAGAAGAGG (SEQ ID NO: 8 na listagem de sequências) é deletada.

[00192] CMV ZIKV Del 20: Consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO: 6 em que a sequência CTGTGGATCTCCAGAAGAGG (SEQ ID NO: 9 na listagem de sequências) é deletada.

[00193] SV40 ZIKV Del 10: Consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO: 7 em que a sequência CCAGAAGAGG (SEQ ID NO: 8 na listagem de sequências) é deletada.

[00194] SV40 ZIKV Del 10: Consiste em uma variante de deleção da SEQ ID NO: 7 em que a sequência CTGTGGATCTCCAGAAGAGG (SEQ ID NO: 9 na listagem de sequências) é deletada.

[00195] Um versado na técnica reconhecerá prontamente que a presente invenção está adaptada para realizar os objetos e obter as extremidades e vantagens mencionadas, bem como aquelas inerentes a eles. Os exemplos anteriores, juntamente com os métodos, procedimentos, tratamentos, moléculas e compostos específicos aqui descritos, são presentemente representativos de modalidades preferidas, são exemplos e não pretendem limitar o escopo da invenção. Mudanças e outros usos ocorrerão aos versados na técnica que estão englobados dentro do espírito da invenção como definido pelo escopo das reivindicações.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 83/134

80/95

SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1

3’UTR-WT

GCACCAATCTTAGTGTTGTCAGGCCTGCl'AGTCAGCCACAGCTTGGGGAAAGCTG

TGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAGGCC GAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCC TCAGAGGACA CTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGG CGACCTTCCCCACCCTTTAATCTGGGGCCTGAACTGGAGATCAGCTGTGGATCTC CAGAAGAGGGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCCCGGAAAACGCAAAACAGCAT ATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGACrCCATGAGTITCCACCACOCTGGCCGCCA

GGCACAGATCGCCGAATAGCGGCGGCCGGTGTGGGGaAATCCATGGTTTCT

SEQ ID NO: 2

3’UTR-10-del

GCACCAATCTTAGTGTIOTCAGGCCTGCTAGTCAGCCACAGCTTGGGGAAAGCTG

TGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAGGCC

GAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACA

CTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGG

CGACCTTCCCCACCCTrTAATCTGGGGCCTGAACTGGAGATCAGCTGTGGATCTG

ACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCCCGGAAAACGCAAAACAGCATATTGACGCTGG

GAAAGACCAGAGACTCCATGAGTTTCCACCACGCTGGCCGCCAGGCACAGATCG

CCGAATAGCGGCGGCCGGTGTGGGGAAATCCATGGTTTCT

SEQ ID NO: 3

3’UTR-20-dei

GCACCAATCTTAGTGTTGTCAGGCCTGCTAGTCAGCCACAGCTTGGGGAAAGCTG

TGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAGGCC

GAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACA

CTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGG

CGACCTTCCCCACCCTTTAATCTGGGGCCTGAA.CTGGAGATCAGGACTAGTGGTT

AGAGGAGACCCCCCGGAAAACGCAAAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCA

GAGACTCCATGAGTTTCCACCACGCTGGCCGCCAGGCACAGATCGCCGAATAGC

GGCGGCCGGTGTGGGGAAATCCATGGTTTCT

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 84/134

81/95

SEQ ID NO: 4

3’UTR-30-del-a

GCACCAATCTTAGTGTTGTCAGGCCTGCTAGTCAGCCACAGCTTGGGGAAAGCTG

TGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAGGCC

GAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACA

CTGAGTCAAAAAACCCCACGCGC1TGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGG

CGACCTTCCCCACCCTTTAATCTGGGGCCTGAACGACTAGTGGTTAGAGGAGACC

CCCCGGAAAACGCAAAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGACTCCATG

AGTTTCCACCA.CGCTGGCCGCCAGGCACA.GATCGCCGAATAGCGGCGGCCGGTG

TGGGGAAATCCATGGTTTCT

SEQ ID NO: 5

3’UTR-30-del-b

GCACCAATCTTAGTGTTGTCAGGCCTGCTAGTCAGCCACAGGn’GGGGAAAGCTG

TGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAGGCC

GAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACA

CTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGG

CGACCTTCCCCACCCTTTAATCTGGGGCCTGAACTGGAGATCAGCTGTGGAGACC

CCCCGGAAAACGCAAAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGACTCCATG

AGTTTCCACCACGCTGGCCGCCAGGCACAGATCGCCGAATAGCGGCGGCCGGTG

TGGGGAAATCCATGGTTTCT

Sequência CMV ZIKV FL:

SEQ ID NO; 6

CMV ZIKV FL sequence:

AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGACTGCGACAGTTCGAGTTTGAAGCGAAAGCTA

GCAACAGTATCAACAGGTTTTATTTTGGATTTGGAAACGAGAGTTTCTGGTCATG

AAAAACCCAAAGAAGAAATCCGGAGGATTCCGGATTGTCAATATGCTAAAACGC

GGAGTAGCCCGTGTGAGCCCCTTTGGGGGCTTGAAGAGGCTGCCAGCCGGACTT

CTGCTGGGTCATGGGCCCATCAGGATGGTCTTGGCGATTCTAGCCTTTTTGAGAT

TCACGGCAATCAAGCCATCACTGGGTCTCATCAATAGATGGGGTTCAGTGGGGA

AAAAAGAGGCTATGGAAATAATAAAGAAGTTTAAGAAAGATCTGGCTGCCATGC

TGAGAATAATCAATGCTAGGAAGGAGAAGAAGAGACGAGGCACAGATACTAGT

GTCGGAATTGTTGGCCTCCTGCTGACCACAGCCATGGCAGTGGAGGTCACTAGAC

GTGGGAATGCATACTATATGTACTTGGACAGAAGCGATGCTGGGGAGGCCATAT

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 85/134

82/95

C'rTTTCCAACCACAATGGGGATGAATAAGTGTTATATACAGATCATGGATCTTGG

ACACATGTGTGATGCCACCATGAGCTATOAATGCCCTATGCTGGATGAGGGGGT

AGAACCAGATGACGTCGATTGTTGGTGCAACACGACGTCAACTTGGGTTGTGTAC

GGAACCTGCCACCACAAAAAAGGTGAAGCACGGAGATCTAGAAGAGCTGTGAC

GCTCCCCTCCCATTCCACTAGGAAGCTOCAAACGCGGtCGCAGACCTGGTTGGAA

TCAAGAGAATACACAAAGCACCTGATTAGAGTCGAAAATTGGATATTCAGGAAC

CCTGGCTTCGCGTTAGCAGCAGCTGCCATCGCTTGGCTTTTGGGAAGCTCAACGA

GCCAAAAAGTCATATACTTGGTCATGATACTGCTGATTGCCCCGGCATACAGCAT

CAGGTGCATAGGAGTCAGCAA.TAGGGACTTTGTGGAAGGTATGTCAGGTGGGAC

TTGGGTTGATGTTGTCTTGGAACATGGAGGTTGTGTTACCGTAATGGCACAGGAC

AAACCGACTGTCGACATAGAGCTGGTTACAACAACAGTCAGCAACATGGCGGAG

GTAAGATCCTACTGCTATGAGGCATCAATATCGGACATGGCTTCGGACAGCCGCT

GCCCAACACAAGGTGAAGCCTACCTTGACAAGCAATCAGACACTCAATATGTCT

GCAAAAGAACGTTAGTGGACAGAGGCTGGGGAAATGGATGTGGACTTTTTGGCA

AAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCTTGCTCTAAGAAAATGACCGGGA

AGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCT

CCCAGCACAGTGGGATGATCGTTAATGATACAGGACATGAAACTGATGAGAATA

GAGCGAAGGTTGAGATAACGCCCAATTCACCAAGAGCCGAAGCCACCCFGGGGG

G1TITGGAAGCCTAGGACTTGATTGTGAACCGAGGACAGGCCTTGACTTTTCAGA

TTTGTATrACTTGACTATGAATAACAAGCACTGGTTGGTTCACAAGGAGTGGTTC

CACGACAITCCATTACCTTGGCAcGCTGGGGCAGACACCGGAACTCCACACTGGA

ACAACAAAGAAGCACTGGTAGAGTTCAAGGACGCACATGCCAAAAGGCAGACT

GTCGTGGTTCTAGGGAGTCAAGAAGGAGCAGITCACACGGCCCTTGCTGGAGCT

CTGGAGGCTGAGATGGATGGTGCAAAGGGAAGGCTGTCCTCTGGCCACTTGAAA

TGTCGCCTGAAAATGGAcAAACTTAGATTGAAGGGCGTGTCATACTCCTIOTGTA

CCGCAGCGTTCACATTCACTAAGATCCCGGCTGAAACACTGCACGGGACAGTCA

CAGTGGAGGTACAGTACGCAGGGACAGATGGACCTTGCAAGGTTCCAGCTCAGA

TGGCGGTGGACATGCAAACTCTGACCCCAGTTGGGAGGTTGATAACCGCTAACC

CTGTAATCACTGAAAGCACTGAGAACTCCAAGATGATGCTGGAACTGGATCCAC

CATTTGGGGACTCTTACATTGTCATAGGAGTCGGGGAAAAGAAGATCACCCACC

ACTGGCACAGGAGTGGCAGCACCATTGGAAAAGCATTTGAAGCCACTGTGAGAG

GTGCCAAGAGAATGGCAGTCTTGGGAGACACAGCCTGGGACTTTGGATCAGTTG

GGGGTGCTCTCAACTCACTGGGCAAGGGCATCCATCAAArrTTTGGAGCAGCTTT

CAAATCATrGnTGGAGGAATGTCCTGGTTCTCACAAATTCTCATTGGAACGTTG

CTGGTOTGGTTGGGTCTOAATACAAAGAATGGATCTATTTCCCTTATGTGCnOG

CCTTAGGGGGAGTGTTGATCTTCTTATCCACAGCCGTCTCTGCTGATGTGGGGTG

CTCGGTGGACTTCTCAAAGAAGGAAACGAGATGCGGTACAGGGGTGrrCGTCTA

TAACGACGTTGAAGCTTGGAGGGACAGGTACAAGTACCATCCTGACTCCCCTCGT

AGATTGGCAGCAGCAGTCAAGCAAGCCTGGGAAGATGGGATCTGTGGGATCTCC

TCTGTTTCAAGAATGGAAAACATCATGTGGAGATCAGTAGAAGGGGAGCTCAAC

GCAATCCTGGAAGAGAATGGAGITCAACTGACGGTCGTTGTGGGATCTGTAAAA

AACCCCATGTGGAGAGGTCCACAGAGATrGCCCGTGCCTGTGAACGAGCTGCCC

CATGGCTGGAAGGCTTGGGGGAAATCGTACTTCGTCAGGGCAGCAAAGACAAAT

AACAGCTTTGTCGTGGATGGTGACACACTGAAGGAATGCCCACTCAAACATAGA

GCATGGAACAGCTTTCTTGTGGAGGATCATGGGTTCGGGGTATTTCACACTAGTG

TCTGGCTCAAGGTTAGAGAAGATTATTCACTCGAGTGTGATCCAGCCGTCA'rTGG

AACAGCCGCTAAGGGAAAGGAGGCTGTGCACAGTGATCTAGGCTACTGGATTGA

GAGTGAGAAGAACGACA.CATGGAGGCTGAAGAGGGCCCACCTGATCGAGATGA

AAACATGTGAATGGCCAAAGTCCCACACATTGTGGACAGATGGAATAGAAGAAA

GTGATCTGATCATACCCAAGTCTTTAGCTGGGCCACTCAGCCATCACAACACCAG

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 86/134

83/95

AGAGGGCTACAGGACCCAAATGAAAGGGCCATGGCATAGTGAAGAGCTTGAAAT

TCGGHTGAGGAATGCCCAGGCACTAAGGTCCACGTGGAGGAAACATGTGGAAC

AAGAGGACCATCTCTGAGATCAACCACTGCAAGCGGAAGGGTGATCGAGGAATG

GTGCTGCAGGGAGTGCACAATGCCCCCACTGTCGTTCCGGGCTAAAGATGGTTGT

TGGTATGGAATGGAGATAAGGCCCAGGAAAGAACCAGAAAGTAACTTAGTAAG

GTCAATGGTGACTGCAGGA1OAACTGATCACATGGATCACTTCTCCCTTGGAGTG

CTTGTGATTCTGCTCATGGTACAGGAAGGGCTAAAGAAGAGAATGACCACAAAG

ATCATCATAAGCACATCAATGGCAGTGCTGGTAGCTATGATCCTGGGAGGATTTT

CAATGAGTGACCTGGCTAAGCTTGCAATTTTGATGGGTGCCACCTTCGCGGAAAT

GAACACTGGAGGAGATGTTGCTCATCTGGCGCTGATAGCGGCATTCAAAGTCAG

ACCTGCGTTGCTGGTATCTTTCATTTTCAGAGCTAATTGGACACCCCGTGAGAGC

ATGCTGCTGGCCTTGGCCTCGTGTCTTCTGCAAACTGCGATCTCCGCCTTGGAAG

GCGACCTGATGGTTCCCATCAATGGTTTTGCTTTGGCCTGGTTGGCAATACGAGC

GATGGTTGTTCCACGCACTGACAACATCACCTTGGCAATCCTGGCTGCTCTGACA

CCACTGGCCCGGGGCACACTGCTTGTGGCGTGGAGAGCAGGCCTTGCTACTTGCG

GGGGGTTCATGCTCCTTTCTCTGAAGGGGAAAGGCAGTGTGAAGAAGAACTTAC

CA'm'GTCATGGCCCTGGGACTAACCGCTGTGAGGCrGGTCGACCCCATCAACGT

GGTGGGACTGCTGTTGCTCACAAGGAGTGGGAAGCGGAGCTGGCCCCCTAGTGA agtactcacagctgttggcctgatatgcgcattggctggagggttcgccaaggcg

GATATAGAGATGGGTGGGCCCATGGCCGCGGTCGGTCTGCTAATTGTCAGTTACG

TGGTCTCAGGAAAGAGTGTGGACATGTACA1TGAAAGAGCAGGTGACATCACAT

GGGAAAAAGATGCGGAAGTCACTGGAAACAGTCCCCGGCTCGATGTGGCACTAG

ATGAGAGTGGTGATTTCTCCCTAGTGGAGGATGATGGTCCCCCCATGAGAGAGAT

CATACTCAAAGTGGTCCTGATGGCCATCTGTGGCATGAACCCAATAGCCATACCC

TTTGCAGCTGGAGCGTGGTACGTGTATGTGAAGACTGGAAAAAGGAGTGGTGCT

CTATGGGATGTGCCTGCTCCCAAGGAAGTAAAAAAGGGGGAGACCACAGATGGA

GTGTACAGAGTAATGACTCGTAGACTGCTAGGTTCAACACAAGTTGGAGTGGGA

GTCATGCAAGAGGGGGTCTTCCACACTATGTGGCACGTCACAAAAGGATCCGCG

CTGAGAAGCGGTGAAGGGAGACTTGATCCATACTGGGGAGATGTCAAGCAGGAT

CTGGTGTCATACTGTGGTCCATGGAAGCTAGATGCCGCCTGGGACGGGCACAGC

GAGGTGCAGCTCTTGGCCGTGCCCCCCGGAGAGAGAGCGAGGAACATCCAGACT

CTGCCCGGAATATTrAAGACAAAGGATGGGGACATTGGAGCAGTTGCGCTGGAC

TACCCAGCAGGTACCTCAGGATCTCCAATCCTAGATAAGTGTGGGAGAGTGATA

GGACTCTATGGTAATGGGGTCGTGATCAAAAATGGGAGTTACGTTAGTGCCATCA

CCCAAGGGAGGAGGGAGGAAGAGACTCCTGTTGAGTGCTTCGAGCCTTCGATGC

TGAAGAAGAAGCAGCTAACTGTCITAGACITGCATCCTGGAGCTGGGAAAACCA

GGAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGAAGCCATAAAAACAAGACTCCGCACTG

TGATCTTAGCTCCAACCAGGGTTGTCGCTGCTGAAATGGAGGAAGCCCTTAGAGG

GCTrCCAGTGCGTTATATGACAACAGCAGTCAATGTCACCCATTCTGGGACAGAA

ATCGTTGACTTAATGTGCCATGCCACCTTCACTTCACGTCTACTACAGCCAATCA

GAGTCCCCAACiATAATCTGTATATTATGGATGAGGCCCACITCACAGATCCCTC

AAG1ATAGCAGCAAGAGGATACATTTCAACAAGGGTTGAGATGGGCGAGGCGGC

TGCCATCTTCATGACTGCCACGCCACCAGGAACCCGTGACGCATTCCCGGACTCC

AACTCACCAATTATGGACACCGAAGTGGAAGTCCCAGAGAGAGCCTGGAGCTCA

GGCTTTGATTGGGTGACGGATCATrCTGGAAAAACAGTTTGGTTTGTTCCAAGCG

TGAGGAATGGCAATGAGATCGCAGCTTGTCTGACAAAGGCTGGAAAACGGGTCA

TACAGCTCAGCAGAAAGACTTTTGAGACAGAGTTCCAGAAAACAAAACATCAAG

AGTGGGACTTCGTCGTGACAACTGACATTTCAGAGATGGGCGCCAACTTTAAAGC

TGACCGTGTCATAGATTCCAGGAGATGCCTAAAGCCGGTCATACTTGATGGCGAG

AGAGTCATTCTGGCTGGACCCATGCCTGTCACACATGCCAGCGCTGCCCAGAGG

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 87/134

84/95

AGGGGGCGCATAGGCAGGAACCCCAACAAACCTGGAGATGAGTATCTGTATGGA

GGTGGGTGCGCAGAGACTGATGAAGACCATGCACACrGGCITOAAGCAAGAATG

CTTCTTGACAACATTTACCTCCAAGATGGCCTCATAGCCTCGCTCTATCGACCTGA

GGCCGACAAAGTAGCAGCTATTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAAAG

GAAGACCITrGTGGAACTCATGAAAAGAGGAGATCTTCCTGTTTGGCTGGCCTAT

CAGGTTGCATCTGCCGGAATAACCTACACAGATAGAAGATGGTGCTTTGATGGC

ACGACCAACAACACCATAATGGAAGACAGTGTGCCGGCAGAGGTGTGGACCAGA

TACGGAGAGAAAAGAGTGCTCAAACCGAGGTGGATGGACGCCAGAGTTTGTTCA

GATCATGCGGCCCTGAAGTCATTCAAAGAGTTTGCCGCTGGGAAAAGAGGAGCG

GCCTTTGGAGTGATGGAAGCCCTGGGAACACTGCCAGGACATATGACAGAGAGA

TTCCAGGAGGCCATTGACAACCTCGCTGTGCTCATGCGGGCAGAGACTGGAAGC

AGGCCCTACAAAGCCGCGGCGGCCCAATTACCGGAGACCCTAGAGACTATCATG

CTTTTGGGGTTGCTGGGAACAGTCTCGCTGGGAATCTTTTTCGTCTTGATGCGGA

ACAAGGGCATAGGGAAGATGGGCTTTGGAATGGTGACTCTTGGGGCCAGCGCAT

GGCTTATGTGGCTCTCGGAAATTGAGCCAGCCAGAATTGCATGTGTCCTCATTGT

TGTGTrCCTATOCTGGTGGTGCTCATACCTGAGCCAGAAAAGCAAAGATCTCCC

CAGGACAACCAAATGGCAATCATCATCATGGTAGCAGTGGGTCTTCTGGGCTTGA irACCGCCAATGAACTCGGATGGITGGAGAGAACAAAGAGTGACCTAAGCCATC TAATGGGAAGGAGAGAGGAGGGGGCAACTATAGGATTCTCAATGGACATTGACC

TGCGGCCAGCCTCAGCTTGGGCTATCTATGCTGCTCTGACAACTTTCATTACCCCA

GCCGTCCAACATGCAGTGACCACTTCATACAACAACTACTCCTTAATGGCGATGG

CCACGCAAGCTGGAGTGTTGTTCGGTATGGGTAAAGGGATGCCATTCTATGCATG

GGACTTTGGAGTCCCGCTGCTAATGATAGGTTGCTACTCACAATTAACACCCCTG

ACCCTAATAGTGGCCATCAITTTGCTCGTGGCGCACTACATGTACTTGATCCCAG

GGCTGCAGGCAGCAGCTGCGCGTGCTGCCCAGAAGAGAACGGCAGCTGGCATCA

TGAAGAACCCTGTTGTGGATGGAATAGTGGTGACTGACATTGACACAATGACAA

TTGACCCCCAAGTGGAGAAAAAGATGGGACAGGTGCTACTCATAGCAGTAGCTG

TCTCCAGCGCCATACTGTCGCGGACCGCCTGGGGGTGGGGTGAGGCTGGGGCCC

TGATCACAGCTGCAACTi'CCACmGTGGGAGGGCrCTCCGAACAAGTACTGGAA

CTCCTCCACAGCCACCTCACTGTGTAACATTTTTAGGGGAAGCTACTTGGCTGGA

GCTTCTCTAATCTACACAGTAACAAGAAACGCTGGCTTGGTCAAGAGACGTGGG

GGTGGAACGGGAGAGACCCTGGGAGAGAAATGGAAGGCCCGCCTGAACCAGAT

GTCGGCCCTGGAGTTCTACTCCTACAAAAAGTCAGGCATCACCGAGGTGTGCAG

AGAAGAGGCCCGCCGCGCCCTCAAGGACGGTGTGGCAACGGGAGGCCACGCTGT

GTCCCGAGGAAGTGCAAAGCTGAGATGGTrGGTGGAGAGGGGATACCTGCAGCC

CTATGGAAAGGTCATTGATCTTGGATGTGGCAGAGGGGGCTGGAGTTACTATGCC GCCAC CATCCGCAAAG TTCAAGAAGTG AAAGG ATACACAAAAGGAGGCCCTGGT CATGAAGAACCCATGTTGGTGCAAAGCTATGGGTGGAACATAGTCCGTCTTAAG

AGTGGGGTGGACGTCTTTCATATGGCGGCTGAGCCGTGTGACACGTTGCTGTGTG

ATATAGGTGAGTCATCATCTAGTCCTGAAGTGGAAGAAGCACGGACGCTCAGAG TCCTC-TCCATGGTGGGGGA'n GGCTTGA A A AAAGACC AGGAGCCTTITGTATAAA AGTGrTGTGCCCA'IACACCAGCACIATGATGGAAACCCTGGAGCGACTGCAGCG

TAGGTATGGGGGAGGACTGGTCAGAGTGCCACTCTCCCGCAACTCTACACATGA

GATGTACTGGGTCTCTGGAGCGAAAAGCAACACCATAAAAAGTGTGTCCACCAC

G AGCC7ÁGCTC CTTTT GGGCíC G CATGGAC GGGCCC AGG AGGC C AGTG AAAT ATG A

AGAGGATGTGAATCTCGGCTCTGGCACGCGGGCTGTGGTAAGCTGCGCTGAAGC

TCCCAACATGAAGATCATTGGTAACCGCATTGAGAGGATCCGCAGTGAGCACGC

GGAAACGTGGTTCTTTGACGAGAACCACCCATATAGGACATGGGCTTACCATGG

AAGCTACGAGGCCCCCACACAAGGGTCAGCGTCCTCTCTAATAAACGGGGTTGT

CAGGCTCCTGTCAAAACCCTGGGATGTGGTGACTGGAGTCACAGGAATAGCCAT

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 88/134

85/95

GACCGACACCACACCGTATGGTCAGCAAAGAGTTTTCAAGGAAAAAGTGGACAC TAGGGTGCCAGACCCCCAAGAAGGCACTCGTCAGGTTATGAGCATGGTCTCTTCC TGGTTGTGGAAAGAGTTAGGCAAACACAAACGGCCACGAGTCTGTACCAAAGAA GAGTTCATCAACAAGGTTCGTAGCAACGCAGCATTAGGGGCAATATTTGAAGAG GAAAAAGAGTGGAAGACTGCAGTGGAAGCTGTGAACGATCCAAGGTTCTGGGCT CTAGTGGACAAGGAAAGAGAGCACCACCTGAGAGGAGAGTGCCAGAGCTGTGT GTACAACATGATGGGAAAAAGAGAAAAGAAACAAGGGGAATTTGGAAAGGCCA AGGGCAGCCGCGCCATCTGGTACATGTGGCTAGGGGCTAGATTTCTAGAGTTCGA AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGATCACTGGATGGGGAGAGAGAATTCAGGAGG TGGTGTTGAAGGGCTAGGATTACAAAGACTCGGATATGTCTTAGAAGAGATGAG TCGCATACCAGGAGGAAGGATGTATGCAGATGATACTGCTGGCTGGGACACCCG CATCAGCAGGTTTGATCTGGAGAATGAAGCTCTAATCACCAACCAAATGGAGAA AGGGCACAGGGCCTTGGCAITGGCCATAATCAAGTACACATACCAAAACAAAGT GGTAAAGGTCCTTAGACCAGCTGAAAAAGGGAAGACAGTTATGGACATTATTTC AAGACAAGACCAAAGGGGGAGCGGACAAGTTGTCACTTACGCTCTTAATACATT TACCAACCTAGTGGTGCAGCTCATTCGGAATATGGAGGCTGAGGAAGTTCTAGA GATGCAAGACTTGTGGCTGCTGCGGAGGTCAGAGAAAGTGACCAACTGGTTGCA GAGCAATGGATGGGATAGGCTCAAACGAATGGCAGTCAGTGGAGATGATTGCGT TGTGAAACCAATTGATGATAGGTTTGCACATGCTCTCAGGTTCTTGAATGATATG GGAAAAGTTAGGAAGGACACACAAGAGTGGAAGCCCTCAACTGGATGGGACAA CTGGGAAGAAGTTCCGTTTTGCTCCCACCACTTCAACAAGCTCCATCTCAAGGAC GGGAGGTCCATTGTGGTTCCCTGCCGCCACCAAGATGAACTGATTGGCCGAGCTC GGGTCTCACCGGGGGCGGGATGGAGCATCCGGGAGACTGCTTGCCTAGCAAAAT CATATGCGCAAATGTGGCAGCTCCTTTATTTCCACAGAAGGGACCTCCGACTGAT GGCCAATGCCATTTGTTCATCTGTGCCAGTTGACTGGGTTCCAACTGGGAGAACT ACCTGGTCAATCCATGGAAAGGGAGAATGGATGACCACTGAAGACATGCITGTG

GTGTGGAACAGAGTGTGGATTGAGGAGAACGACCACATGGAAGACAAGACCCC AGTTACGAAATGGA.CAGACATTCCCTATTTGGGAAAAAGGGAAGACTTGTGGTG TGGGTCTCTCATAGGGCACAGACCGCGCACCACCTGGGCTGAGAACATTAAAAA CACAGTCAACATOATGCGTAGGATCATAGGTGATGAAGAAAAGTACGTGGACTA CCTATCCACCCAAGTTCGCTACITGGGCGAAGAAGGGTCCACACCTGGAGTGCTA TAAGCACCAATCTTAGTGTTGTCAGGCCTGCTAGTCAGCCACAGCTTGGGGAAAG CTGTGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCCATAGTCAG GCCGAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGG ACACTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAGG TGGCGACCTTCCCCACCCT1TAATCTGGGGCCTGAACTGGAGATCAGCTGTGGAT CTCCAGAAGAGGGACTAGTGG'n'AGAGGAGACCCCCCGGAAAACGCAAAACAG CATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGACTCCATGAGTTTCCACCACGCTGGCCG CCAGGCACAGATCGCCGAATAGCGGCGGCCGGTGTGGGGAAATCCATGGgTCTgg gtcggcatggcatetccacctcctcgcggtccgacctgggctacttcggtaggctaagggagaagaatcgatgctgtgccttctagttg ccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattg catcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggiggggcaggacagcaagggggaggaitgggaagacaatagca ggcatgetggggatgcggtgggctctatgggcccgggccgtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgaatttcigccattcatc cgcttattatcacttattcaggcgiagcaaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgcccigccactcat cgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacotgaatcgccagcggcatcagc acettgtcgccttgcgtataatatttgcccaiggtgaaaacgggggcgaagaagtt.gtccatattggccac.gtttaaatcaaaactggtga aactcacccagggattggctgagacgaaaaacat attctcaataaaccctttagg gaaa {ag gc caggttttcaccgtaacac gc caca icttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcglcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacgg tgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgixatacgaaattccggatgagcattcatcaggcgggcaa gaatgtgaaiaaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttatagg

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 89/134

86/95 tacattgagcaactgactgaaatgcctcíiaaatgttctltacgatgccattgggatatatcaacggtggialatccagtgatttttttctccatt ttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatettatttcattaíggtgaaagttggaacctettacgt gccgatcaacgtcteattttcgccaaaagttggcecagggcttcccggtatoaacagggacaccaggatttatttatíctgcgaagtgatc ttccgtcacaggtatttattcgcgataagctcatggageggcgtaaccgtcgcacaggaaggacagagaaagcgcggatctgggaag tgacggacagaacggtcaggacctggattggggaggcggttgccgccgctgctgctgacggtgtgacgttctctgttccggtcacac cacatacgttccgccattcctatgcgatgcacatgctgtatgccggtatacegctgaaagttctgcaaagcetgatgggacataagteca tcagttcaacggaagtctacacgaaggtwtgcgctggatgtggctgcc.eggcaccggglgcagtttgcgatgccggágtctgatgcg gítgcgatgctgaaacaattatcctgagaataaatgccttggcctttataíggaaatgtggaactgagtggatatgctgtttttgtctgttaaa cagagaagctggctgttatccactgagaagcgaacgaaacagtcgggaaaatclcccattaicgtagagatccgcatiattaatctcag gagcctgtgíagcgtttataggaagtagtgttctgtcatgatgcetgcaagcggtaacgaaaacgatttgaatatgccttcaggaacaata gaaatettcgtgcggtgttacgtígaagtggagcggaítatgtcagcaatggacagaacaaecíaaígaacacagaaccatgatgtggt ctgtccttttacagccagtagtgctegccgcagtcgagcgacagggcgaagccctcggctggttgccctcgccgctgggctggcggc cgtctatggccctgcaaacgcgccagaaacgccgtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggceggccgccggcgttgtggatacct cgcggaaaacttggcçctcactgacagatgaggggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagat gaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcga^itccca cagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggggcgcgactactgacagatgaggggcgcgatc cttgacacttgaggggcagagtgctgacagatgaggggcgcacciattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatecagcat ttgcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtctttíaacctgcttttaaaccaatattíataaaccttgtttttaaccagggct gcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgccgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggtcgagtg^cgaggaagcacc agggaacagcacttatatattctgctíacacacgatgçctgaaaaaacttcccttggggttatccacttatccacggggatatttttataatt attttttttatagíttttagatcttctttttíagagcgccttgtaggcctttatccatgctggttctagagaaggtgttgtgacaaattgccctttca gtgtgacaaatcacccteaaatgacagtecigtctgtgacaaattgcccttaaccctgtgacaaattgccctcagaagaagctgttttttca caaagttatcc.ctgcttattgactcttttttatttagígtgacaatctaaaaacttgtcacactteacatggatctgtcatggcggaaacagcg gttatcaatcacaagaaacgtaaaaatagcccgcgaatcgtccagtcaaacgacctcactgaggcggcatatagtctctcccgggatc aaaaacgtatgctgtatctgttcgttgaccagatcagaaaatctgatggcaccctacaggaacatgacggtatctgcgagatccatgttg ctaaatatgctgaaatattcggattgacctctgcggaagccagtaaggatatacggcaggcattgaagagtttcgcggggaaggaagt ggttttttatcgccctgaagaggatgccggcgatgaaaaaggctatgaatcttttecttggtttatcaaacgtgcgcacagt.ccatccaga gggctttacagtgtacatatcaacccatatetcattcccttctttatcgggttacagaaccggtttacgcagtttcggcttagtgaaacaaaa gaaatcaccaatccgtatgccatgcgtttata.cgaatccctgtgtcaglatcgtaagccggatggctcaggcatcgtcíctctgaaaatcg actggatcatagagcgtiaccagctgcctcaaagttaccagcgtatgcctgacttccgccgccgcttcctgcaggíctgtgttaatgaga tcaacagcagaactccaatgcgcctctcatacattgagaaaaagaaaggccgccagacgactcatatcgtattltccttccgcgatatea cttccatgacgacaggategtctgagggttatctgtçacagatttgagggtggttcgtcacatttgttctgacctactgagggtaatttgtca cagttttgctgíttccticagcctgcatggattttctcatactttttgaactgtaatttttaaggaagccaaatttgagggcagtttgtcacagtt galttccttctctttcccttcgtcatgtgacctgatatcgggggTtagttcgtcateattgatgagggttgattatcacagtttattactcígaatt ggctatccgcgtgtgtacctctecctggagtttttcccacggtggatatttcttcttgcgctgagcgtaagagctetctgacagaacagttct tcmgcttcctcgccagttcgctcgctatgctcggttacacggctgcggcgagcgctagtgataataagtgactgaggtatgtgctcttct tatctccttttgtagtgttgctcttattttaaacaacWgcggttttttgatgactttgcgattttgttgttgctttgcagtaaattgcaagatttaat aaaaaaacgcaaagcaatgattaaaggatgttcagaatgaaactcatggaaacacttaaccagtgcataaacgctggtcatgaaatga cgaaggctatcgccattgcacagtítaatgatgacagcccggaagcgaggaaaataacccggcgctggagaataggtgaagcagcg gatttagttggggtttcttctcaggctatcagagatgccgagaaagcagggcgactaccgcacccggatíitggaaa.ttcgaggacggg ttgagcaacgtgttggttataoaattgaacaaattaatcaíatgcgtgatgtgtttggtacgcgattgcgacgtgctgaagacgtaittccac cggtgatcggggttgctgcccataaaggtggcgtttacaaaacctcagtitctgttcatcttgctcaggatctggctctgaaggggctacg tgttttgctcgtggaaggtaacgacccccagggaacagcctcaatgtaícacggatgggtaccagatcttcatattcaígcagaagaca ctcícctgcctttctatcttggggaaaaggacgatgtcactíatgcaataaagcceacttgctggccggggcttgacattattccttcctgtc tggctetgcaccgíattgaaactgagttaatgggcaaatttgatgasggtaaactgcccaccgatccacacctgatgctccgactggcc attgaaactgttgctcatgactaigaígteatagttattgacagcgcgcctaacctgggtatcggcaegattaaígtogtatgtgctgctgat gtgctgattgttcccacgcctgctgagttgtttgactacacctccgoactgcagtttttcgatatgcttcgtgatctgctcaagaacgttgatc ttaaagggttcgagcctgatgtacgtattttgcttaccaaatacagcaatagtaatggctctcagtecccgtggatggaggagcaaattcg ggatgcetggggaagcatggttctaaaaaatgttgtacgtgaaacggatgaagttggtaaaggtcagatccggatgagaactgtttttga acaggccattgatcaacgctcttcaactggtgcctggagaaatgclctttctatttgggaacctgtcígcaatgaaattttcgatcgtctgat

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 90/134

87/95 taaaccacgctgggagattagataatgaagcgtgcgccigttatfccaaaacaiacgctcaatactcaaccggttgaagatacttogttai cgacaccagctgccccgatggtggattcgttaattgcgcgcgtaggagtaatggctcgcggtaatgccattactttgcctgíatgtggtc gggatgtgaagtttactcttgaagtgctccggggtgatagtgttgagaagacctctcgggtatggtcaggtaatgaacgtgaccaggag ctgcttactgaggacgcactggatgatctcateccttcttttctactgactggtcaacagacaccggcgttcggtcgaagagtatctggtg tcatagaaattgcçgatgggagtcgccgtcgtaaagctgctgcacttaccgaaagtgattatcgtgttctggttggcgagctggaígatg agcagatggctgcattatccagattgggtaacgattatcgcccaacaagtgcttatgaacgtggtcagcgttatgcaagccgattgcag aatgaatttgctggaaatamctgcgctggctgatgcggaaaatatttcacgtaagattattacccgctgtatcaacaccgccaaattgcc taaatoagttgttgctcttttttctcaccccggtgaactatctgcccggtcaggtgatgcacttcaaaaagcctttacagataaagaggaatt acttaagcagcaggcatctaaccttcatgagcagaaaaaagctggggtgatatttgaagctgaagaagttatcactcttttaacttctgíg cítaaaacgtcatctgcatcaagaactagtttaagctcacgacatcagtttgctcctggagcgacagtattgtataagggcgataaaatgg tgctteaixtggacaggtctegtgttccaactgagtgtatagagaaaattgaggccattcttaaggaactígaaaagccagcaccctgat gcgaccacgtttíagtctacgtttatctgtcttíacttaatgtcctttgttacaggccagaaagcataaetggcctgaatattctctcígggcc cactgttccacttgtatcgtcggtctgataatcagactgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacgg tcccactcgtatcgtcggtctgattettagíctgggaccacggtcccactcgtatcgteggtctgataatcagactgggaccacggtccc actcgtategteggtctgattattagtctgggaccatggtcccactcgtatcgtcggtetgattattagictgggaccacggteccaçtcgt atcgtcggtctgattattagtctggaaccaçggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtc ggTctgattattagtctgggaccacgatcecactegtgttgtcggtetgattatoggtctgggaccacggtcccacttgtattgtcgatcag actatcagcgtgagactacgattccatcaatgcctgtcaagggcaagtattgacatgtcgtcgtaaccígtagaacggagíaacctcggt gtgcggttgtatgcctgctgtEgattEctgctgtgícctgcttatccacaacaítttgcgcacggttatgtggacaaaatacctggttaccc aggccgtgccggcacgttaacCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC CCAACGACCCCCGCCCAITGACGTCAATAATGACGTATGTI'CCCATAGTAACGCC AATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCAC TTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATG ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCC TACTTGGCAGTACATCTACGTA'rTAGTCATCGCTAITACCATGGTGATGCGGTTTT GGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCT

CCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTT CCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTA CGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAAC

SEQ ID NO: 7

Sequência SV40 ZIKV FL:

agttgítgatetgígtgsatcagactgcgacagttcgagtttgaagcgaaagctagcaacagtatoaacaggttttattttggatttggaaa egagagtttctggteatgaaaaacccaaagaagaaatccggaggattccggattgtcaatatgctaaaacgcggagtagcccgtgtga gcccctttgggggcttgaagaggctgccagceggacttctgctgggtcatgggcccatcaggatggtcttggcgattctagcctttttga gattcacggcaatcaagccatcactgggtctcatcaatagatggggttcagtggggaaaaaagaggctaíggaaataataaagaagttt aagaaagatctggctgccatgctgagaataatcaatgctaggaaggagaagaagagacgaggcacagatactagtgtcggaaítgtt ggcctcctgctgaecacagccatggcagtggaggtcactagacgtgggaaígcatactatatgtacttggacagaagcgatgctggg gaggccatatcttticcaaccacaatggggatgaataagtgttatatacagatcatggatcttggacacatgtgtgatgçcaccatgagct atgaatgccctatgcíggatgagggggtagaaccagatgacgtcgattgttggtgcaacacgacgtcaacttgggttgtgtacggaac ctgccaccacaaaaaaggtgaagcacggagatctagaagagctgtgacgctcccctcccattccactaggaagctgcaaacgcggt cgcagacctggttggaateaagagaatacacaaagcacctgattagagtcgaaaattggatattcaggaaccctggcttcgcgttagca gcagctgccatcgcttggcttttgggaagctcaacgagccaaaaagteatatacttggtcatgatactgctgattgccccggcatacagc ateaggtgcataggagtcagcaatagggacttigtggaaggtatgtcaggtgggacttgggttgatgttgtcttggaacatggaggttgt gttaccgtaatggcacaggacaaaccgactgtcgacatagagctggttacaacaacagtcagcaacatggcggaggtaagatcctac tgcíatgaggcatcaatatcggacatggcttcggacagccgctgcccaacacaaggtgaagcctaccttgacaagcaatcagacactc

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 91/134

88/95 aatatgtctgcaaaagaacgttagtggacagaggctggggaaatggatgtggactttttggcaaagggagcctggtgacatgcgctaa gtttgcttgctctaagaaaatgaccgggaagagcatccagccagagaatetggagtaccggataatgctgtcagttcatggctcccagc acagtgggatgatcgttaatgatacaggacatgaaactgatgagaatagagcgaaggttgagataacgcccaattcaccaagagccg aagccaccctggggggttttggaagcctaggacltgattglgaaccgaggacaggccttgaettttcagatttgtavtactigactaigaat aacaagcactggttggttcacaaggagtggttccacgacaticcattaccttggcacgctggggcagacaccggaactecacactgga acaacaaagaagcactggtagagttcaaggacgcacatgceaaaaggcagactgtcgiggttctagggagteaagaaggagcagtt cacacggcccttgctggagc.tctggaggctgagatggatggtgcaaagggaaggctgtcctctggccacttgaaatgtcgcctgaaa atggacaaacttagattgaagggcgtgtcatactccttgtgtaccgcagcgttcacattcactaagatcccggctgaaacactgcacgg gacagtcacagtggaggtacagtacgcagggacagatggacc£tgcaaggttccagctcagatggcggtggacaigcaaactctga ccccagttgggaggttgataaccgciaaccctgtaatcactgaaagcactgagaactccaagatgatgctggaactggatccaccattt ggggactcttacattgtcataggagtcggggaaaagaagatcacccaccactggcacaggagtggcagcaccattggaaaagcatti gaagccactgtgagaggtgccaagagaatggcagtctigggagacacagcctgggactttggatcagttgggggtgctctcaactea ctgggcaagggcatccatcaaaittttggagcagctttcaaateattgtttggaggaatgtcctggttctcacaaattctcattggaacgttg ctggtgtggttgggtctgaatacaaagaatggatctatttc(Xttatgtgcttggccttagggggagtgttgatcttcttatccacagccgtc tetgctgatgtggggtgctcggtggacttctcaaagaaggaaacgagatgcggtacaggggtgttcgtctataacgacgttgaagcttg gagggacaggtacaagtaccatcctgactcccctcgtagattggcagcagcagtcaagcaagcctgggaagatgggatctgtgggat ctectctgtttcaagaatggaaaacateatgtggagatcagtagaaggggagcicaacgcaatcctggaagagaatggagttcaactg acggtcgttgtgggatctgtaaaaaaccccatgtggagaggiccacagagattgcccgtgcctgigaacgagctgccccatggctgg aaggcttggg^aaategtacttcgtcagggcagcaaagacaaataacagctttgtcgtggatggtgacacactgaaggaatgccca cteaaacatagagcatggaacagctttcttgtggaggatcatgggttcggggtatttcacactagtgtctggctcaaggttagagaagatt attcactcgagtgtgatccagccgtcattggaacagccgctaagggaaaggaggctgtgcacagtgatctaggctactggattgagag tgagaagaacgacacatggaggctgaagagggcccacctgatcgagatgaaaacatgtgaatggccaaagtcccacacattgtgga cagatggaategaagaaagtgatctgatcatacccaagtctttagcigggccactcagccalcacaacaccagagagggctacagga cccaaatgaaagggccatggcatagtgaagagcttgaaattcggtttgaggaatgcccaggcactaaggtccacgtggaggaaacat gtggaacaagaggaccatctctgagatcaaccactgcaagcggaagggtgatcgaggaatggtgcigcagggagtgcacaatgcc cccactgtcgttccgggctaaagatggttgttggtatggaatggagataaggcccaggaaagaaceagaaagtaacttagtaaggtca atggtgactgcaggatcaactgaicacatggatcacttctcccttggagtgcttgtgattctgctcatggtecaggaagggctaaagaag agaatgaccacaaagaicatcataagcacateaatggcagtgctggtegctatgatcctgggaggattttcaatgagtgacctggctaa gcttgcaattttgatgggtgccaccttcgcggaaatgaacactggaggagatgttgctcatctggcgctgatagcggcattcaaagtca gacctgcgttgctggtatctttcattttcagagctaattggacaccccgigagagcatgctgctggccttggceicgtgtcttctgcaaact gcgatctccgccttggaaggcgacctgatggttcccatcaatggttttgcttiggcctggitggcaatacgagcgatggttgttccacgca ctgacaacatcaccttggcaatcciggctgctetgacaccactggcccggggcacactgcttgtggcgtggagagcaggccttgctac ttgcggggggttcatgctcctttctctgaaggggaaaggcagtgtgaagaagaacttaccatitgtcatggccctgggactaaccgctgt gaggctggtcgaccccatcascgtggtgggactgctgttgctcacaaggagtgggaagcggagctggccccdagtgaagtactca cagctgttggcctgatalgcgcattggctggagggttcgccaaggcggataiagagatggctgggcccatggccgcggtaggtctgc taattgtcagttacgtggtctcaggaaagagtgtggacatgtacattgaaagagcaggtgacatcacatgggaaaaagatgcggaagt cactggaaacagtccccggctcgatgtggcactagatgagagtggtgatitctccctagiggaggatgatggtccccecatgagagag atcatactcaaagtggtcctgalggccatctgtggcatgaacccaatagccataccctttgcagctggagcgtggtacgtgtatgtgaag actggaaaaaggagtggtgctctatgggatgtgcctgctcccaaggaagtaaaaaagggggagaccacagatggagtgtacagagt aatgactcgtagactgctaggttcaacacaagttggagtgggagtoatgcaagagggggtcttccacactatgtggcacgtcacaaaa ggatccgcgctgagaagcggtgaagggagacttgatccatactggggagatgtcaagcaggatctggtgtcatactgtggtccatgg aagctagatgccgcctgggacgggcacagcgaggtgcagctcttggccgtgccccccggagagagagcgaggaacatccagact ctgcccggaatatttaagacaaaggaiggggacattggagcagttgcgctggactacccagcaggtacctcaggatctccaatcctag aíaagtgtgggagagtgataggactctatggtaatggggtogígaícaaaaaígggagttacgttagtgccateacccaagggaggag ggaggaagagactcctgttgagtgettcgagccttcgatgctgaagaagaagcagctaactgtettagacttgcatcctggagctggga aaaccaggagagttcttcctgaaalagtccgtgaagccataaaaacaagactccgcactgtgatcttagctccaaccagggttgtcgct gctgaaatggaggaagcccttagagggcttccagtgcgttatatgacaacagcagtcaatgteacccattctgggacagaaatcgttga cttaatgtgecatgccaccttcacitcacgtctactacagccaatcagagtccccaactataatctgtatattatggatgaggcccacttca cagatccctcaagtatagcagcaagaggataeatticaacaagggttgagatgggcgaggcggcigccatcttcatgaetgccacgcc accaggaacccgtgacgcattcccggactxjcaactcaccaattatggacaccgaagtggaagtcccagagagagccl^agctcag

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 92/134

89/95 gctttgattgggtgacggatcattctggaaaaacagtttggtttgitccaagcgtgaggaatggcaatgagatcgcagcttgtógacaaa ggctggaaaacgggtcatacagctcagcagaaagacttttgagacagagttccagaaaacaaaacatcaagagtgggacttcgtcgt gacaactgacamcagagatgggcgccaactttaaagctgaccgtgtcaiagattccaggagatgcctaaagccggtcatacttgatg gcgagagagtcattctggctggacccatgcctgteacacmgccagcgtfgcccagaggagggggcgcataggcaggaaccccaa caaacctggagatgagtatetgtatggaggtgggtgcgcagagactgatgaagaccatgcacacíggcttgaagcaagaatgcttctt gacaacatttacctccaagatggcctcatagcctcgctctatcgacctgaggccgacaaagtagcagctattgagggagagítcaagct Éaggacggagcaaaggaagacctttgtggaactcatgaaaagaggagatcttcctgtttggctggcctatcaggltgcatctgccggaa taacctacacagatagaagatggtgctttgatggcacgaccaacaacaccataatggaagacagtgtgccggcagaggtgtggacca gatacggagagaaaagagtgcícaaaccgaggtggatggacgccagagtttgttcagatcatgcggccctgaagtcattcaaagagtt tgccgctgggaaaagaggagcggcctttggagtgatggaagccctgggaacactgccaggaçatatgacagagagattccaggag gccattgacaacctcgctgtgctcatgcgggcagagactggaagcaggccctacaaagccgcggcggcccaattaccggagaccct agagactatcatgcttttggggttgctgggaacagtctcgctgggaatctttttcgtcttgatgcggaacaagggcatagggaagatggg ctttggaatggtgactcttggggccagcgcatggcttatgtggctctcggaaattgagccagccagaattgcatgtgtcctcattgttgtgt tcctattgctggtggtgctcaíacctgagccagaaaagcaaagatctccccaggacaaccaaatggcaatcatcatcatggtagcagtg ggtcttctgggcttgattaccgccaatgaactcggatggttggagagaacaaagagtgacctaagccatctaatgggaaggagagag gagggggcaactataggattctcaatggacattgaccigcggccagcctcagcttgggctatctatgctgctctgacaac-tttcattacc ccagccgtccaacatgcagtgaccactteatacaaeaactactccttaatggcgatggccacgcaagetggagtgttgttcggtatggg taaagggatgccattctaígcatgggactttggagtcccgctgctaatgataggttgctactcacaattaacacccctgaccctaatagíg gccatcattttgctcgtggcgcaciacatgtacttgatcccagggctgcaggcagcagctgcgcgtgctgcccagaagagaacggca gctggcateatgaagaaccctgttgtggatggaatagtggtgactgacaítgacacaatgacaattgacccccaagtggagaaaaaga tgggacaggtgctactcatagcagtagctgtotccagcgccatactgicgcggaccgcctgggggtggggtgaggctggggccctg atcacagctgcaacttccactttgtgggagggctctocgaacaagtactggaactcctccacagccacctcactgtgtaacatttttagg ggaagctacttggctggagcttctctaatetacacagtaacaagaaacgctggcttggtcaagagacgtgggggtggaíujgggagag açcctgggagagaaatggaaggcccgcctgaaccagatgtcggccctggagttctacíccíacaaaaagtcaggcatcaccgaggt gtgcagagaagaggcccgccgcgccctcaaggacggtgtggcaacgggaggccacgctgtgtcccgaggaagtgcaaagctga gatggttggtggagaggggatacctgcagccctatggaaaggtcattgatcttggatgtggcagagggggctggagttactatgccgc caccatecgcaaagttcaagaagtgaaaggatacacaaaaggaggccctggtcatgaagaacccatgttggtgcaaagciaígggtg gaacaíagtccgtcttaagagtggggtggacgtctttcatatggcggctgagccgtgígacacgítgctgtgtgatataggtgagtcatc atctagtcctgaagtggaagaagçacggacgctcagagtcctctccatggtgggggattggcttgaaaaaagaccaggagccttttgt ataaaagtgttgtgcccatacaccagcactatgatggaaaccctggagcgactgcagcgtaggtatgggggaggactggwagagtg ccactctcccgcaactctacacatgagatgtaclgggtctctggagcgaaaagcaacaccataaaaagtgtgtccaccíicgagccagc tccttttggggcgcatggacgggcccaggaggcçagtgaaatatgaagaggatgtgaaíctcggctctggcacgcgggctgtggtaa gctgcgctgaagctcccaacatgaagateattggtaaccgcattgagaggatcçgcagígagcacgcggaaacgtggttctttgacga gaaccacccatauggacatgggcttaccatggaagctacgaggcccccacacaagggtcagcgtcctctctaataaacggggttgt caggctcctgteaaaaccctgggatgtggtgacíggagtcacaggaatagccatgaccgacaccacaccgtatggteagcaaagagt tttcaaggaaaaagtggacactagggtgccagacccccaagaaggcactcgtcaggttatgagcatggtctcttccíggttgtggaaa gagttaggcaaacacaaacggecacgagtctgtaccaaagaagagltcateaacaaggttogtagcaacgcagcattaggggcaata títgaagaggaaaaagagtggaagactgcagtggaagctgtgaacgatccaaggttctgggctctagiggacaaggaaagagagca ccacctgagaggagagtgccagagctgtgtgtacaacatgatgggaaaaagagaaaagaaacaaggggaatttggaaaggccaag ggcagccgcgccatctggtacatgtggctaggggctagatttctagagttogaagcccttggattcttgaacgaggatoactggatggg gagagagaattcaggaggtggtgtígaagggctaggattacaaagacteggatatgtcttagaagagaígagtcgcataccaggagg aaggatgtatgeagatgatactgctggctgggacacccgcatcagcaggtttgatctggagaatgaagctctaatcaccaaccaaatg gagaaagggcacagggccttggcaítggccataatcaagtacacataccaaaacaaagtggiaaaggtcctfâgaccagctgaaaaa gggaagEicagttatggacattatttcaagacaagaecaaagggggagcggacaagttgtcacttacgctettaatacatttaccaaccía gtggigcagctcattcggaat.atggaggctgaggaagttctagagatgcaagacttgtggctgctgcggaggtcagagaaagtgacc aactggttgcagagcaatggatgggataggctcaaacgaatggcagtcagtggagatgattgcgttgtgaaaccaattgatgaíagglt ígcacatgctcteaggttcttgaatgatatgggaaaagttaggaaggacacacaagagtggaagccctcaactggatgggacaactgg gaagaagttccgttttgctcccaccacttcaacaagctccatctcaaggacgggaggtccattgtggttccctgccgccaccaagatga actgattggccgagctcgcgtctcaccgggggcgggatggagcatccgggagactgettgcctagcaaaatcatatgcgcaaatgtg gcagctcctttatttccacagaagggacctccgactgstggccaatgccatttgttca.tctgtgccíigttgãcigggttccaactgggaga

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 93/134

90/95 actaccTggtcaatccatggaaagggagaatggatgaccactgaagacatgcttgtggtgtggaacagagtgtggattgaggagaac gaccacatggaagacaagaccccagítacgaaatggacagacattcccíatttgggaaaaagggaagactígtggtgtgggtctctca tagggcacagaccgcgcaccacctgggctgagaacattaaaaacacagtcaacaigatgcgtaggaicataggtgatgaagaaaagt acgtggactacctatccacccaagttcgctacttgggcgaagaagggtccacacctggagtgctataagcaccaatcttagtgttgtea ggcctgctagteagccacagcttggggaaagctgtgcagcctgtgacccc-cccaggagaagctgggaaaccaagcccatagtcag gccgagaacgccatggcacggaagaagccatgctgcctgtgagcccctcagaggacactgagtcaaaaaaccccacgcgcttgga ggcgcaggatgggaaaagaaggtggcgaccttccccaccctttoatctggggcctgaactggagatcagctgtggatctecagaaga gggactagtggttagaggagaccccccggaaaacgcaaaacagcatattgacgctgggaaagaccagagactccatgagtttecac cacgcíggccgccaggcacagatcgcçgaatagcggcggccggtgtggggaaatccatgggtctgggtcggcatggcatctccac cícctcgcggtccgaçctgggctacttcggtaggctaagggagaagaatcgatgaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaa gcaatagcatcacaaatttca£:aaataaagcatttttttcactgcattctegttgtggtttgtccaaacteatcaal:gtatettatgcccgggc cgtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcategaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaaccaggcgttta agggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatg gaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcateagcaccttgtcgccttgcgtataatattigcccatggtgaaaa cgggggcgaagaagttgtecatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatatt ctoaataaaccctttegggaaataggccaggtttteaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtc gtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgcic-atggaaaacggtgtaacaagggtgaacaciatcecatatcaccagcte accgtctttcatlgccatacgaaattccggatgagcatteatcaggcgggoaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgigcttattt ttctttacggtetttaaaaaggccgtaaiatccagctgaacggtetggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttct ttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaa aaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagítggaacctcttacgtgcegatcaacgtetcaültcgccaaaagttggccc agggchcccggtaicaacagggacaccaggatttatttattetgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgcgataagctcatgga gcggcgtaaccgtcgcacaggaaggacagagaaagcgcggatctgggaagtgacggacagaacggtcaggacctggattgggg aggcggttgccgccgctgcigctgacggtgtgacgttctctgttccggtcacaccacatacgttccgccattcctaigcgatgcacatgc tgtatgccggtataccgctgaEíagttcigcaaagcctgatgggacataagící:atcagttcaacggaagíctacacgaaggttttígcgc tggatgtggcígcccggc.accgggtgcagtttgcgatgccggagtctgatgcggttgcgatgcígaaacaattatcctgagaataaatg ccttggcctttatatggãaatgtggaactgagtggatatgctgtttttgtctgttaaacagagaagctggctgttatccactgagáagcgaa cgaaacagtcgggaaaatctcccattategtagagatecgcattattaatctcaggagcctgtgtagcgtttataggaagtagtgttctgtc atgatgcctgcaagcggtaacgaaaacgatttgaatatgccltcaggaacaatagaaatcttcgtgcggtgttacgttgaagiggagcg gattatgicagcaatggacagaacaacctaatgaacacagaaccatgatgtggtctgiccttttacagccagtagtgctcgcegcagtc gagcgacagggcgaagccctcggctggttgccctcgccgcígggctggcggccgtctatggccctgcaaacgcgccagaaacgcc gtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggccggccgccggcgttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgagg ggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtgg agctggccagcctegcaaateggcgaaaacgcctgattttacgcgagttícccacagatgaígtggacaagcctggggataagtgcc ctgcggíattgacacttgaggggcgcgactacígacagatgaggggcgcgalccttgacacttgaggggcagagtgctgacagatga ggggcgcacctattgacatttgaggggctgtocacaggcagaaaatccagcatttgcaagggtttccgcccgtttttoggccaccgcta aectgtcttttaacctgcttttaaaccaatatttataaaccttgttttraaccagggctgcgccctgtgcgegtgaecgcgcacgccgaagg ggggtgccccccctíctcgaacccícccggí.cgagtgagcgaggaageaccagggaacagcacttatatattot:gcttacacacgatg cctgaaaaaacttcccttggggttatccacttatccacggggatatttttateattattttttttatagtttttagatcttcttttttagagcgccttgt aggcctttatccatgctggttctagagaaggtgttgtgacaaattgcccttteagtgtgacaaateaccctcaaatgaeagtcctgtctgtg acaaattgcccttaaccctgtgacaaattgccctcagaagaagctgttttttcacaaagttatccctgcttattgactctittttatttagtgLga caatetaaaaacttgtcacacttcacatggatctgtcatggcggaaacagcggttalcaatcacaagaaacgtaaaaatagcccgcgaa tcgtcragteaaacgacctcactgaggcggcatatagtctctcccgggatcaaaaacgtatgcigtatctgttcgttgaccagatcagaa aatctgatggcaccctacaggaacatgacggtatetgcgagatccatgttgctaaatatgctgaaataticggattgacctctgcggaag ccagtaaggatatacggcaggcattgaagagtttcgcggggaaggaagtggttttttatcgccctgaagaggatgceggcgatgaaaa aggctatgaatcttttecttggtttatca.aa,cgtgcgcacagiccatccagagggctttacagtgtacatatcaacccatatctcattcccttc tttatcgggttacagaaccggtttacgcagtttcggcttagtgaaacaaaagaaatcaccaatccgtatgccatgcgttiatacgaatccct gtgtcagtaicgtaagccggatggctcaggcatcgtctctctgaaaategactggateatagagcgttaccagctgcctoaaagttacca gcgtaígcctgacttccgccgccgcttcçtgcaggictgtgttaatgagatcaacagcagaactccaatgcgcctctcatocattgagaa aaagaaaggccgccagacgactcatatcgtattttccttccgcgatatcacttccatgacgacaggatagtetgagggttaictgtcaca

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 94/134

91/95 gatttgagggtggttcgtcacatttgttctgaccíactgagggtaatttgtcacagttttgctgtttccttcagcctgcatggattttcteatact tútgaactgtaatttttaaggaagccaaatltgagggcagtttgtcacagttgatttccttctctttcccltcgtcatgtgacctgataicggg ggttagttegtcatcattgatgagggttgattatcacagtttattactctgaattggctatccgcgtgtgtacctctaccrggagtttttcccac ggtggatattícttcttgcgctgagcgtaagagctatctgacagaacagttcttctttgcttcctcgccagtt<^ctcgctatgctcggttac acggctgcggcgagcgctagtgataataagtgactgaggtatgtgctcttcttatctccttttgtagtgttgctcttattttaaacaactttgc ggttttttgatgactttgcgattttgttgttgctttgcagtaaattgcaagatttaataaaaaaacgcaaagcaatgattaaaggatgttcaga atgaaactcatggaaacacttaaccagtgcataaacgctggtcatgaaatgacgaaggctatcgccattgcacagtttaaigatgacag cccggaagcgaggaaaataacccggcgctggagaataggtgaagcagcggatttagttggggtttcttctcaggctatcagagatgc cgagaaagcagggcgactaccgcacccggaiatggaaattcgaggacgggtlgagcaacgígttggttatacaattgaacaaattaat catatgcgtgatgtgtttggtacgcgattgcgacgtgctgaagacgtatttccaccggtgatcggggttgctgcccataaaggtggcgttt acaaaacctcagEttctgttcatcttgctcaggatetggctctgaaggggctaogtgttttgctcgtggaaggtaacgacccccagggaa cagcctcaatgtatcacggatgggtaccagatcttcatattcatgcagaagacactctcctgcctttctatcttggggaaaaggacgatgt cacttatgcaataaagcccacttgctggccggggcttgacattattccttectgtctggctctgcaccgiattgaaactgagttaatgggca aatttgatgaaggtaaactgcccaccgatccacacctgatgctccgactggccattgaaactgttgctcatgactatgatgtcatagttatt gacagcgcgcctaacctgggtatcggcacgattaatgtcgtatgtgctgctgatgtgctgattgttcccacgcctgctgagttgtttgact acacctccgcactgcagtttttcgatatgcttcgtgatctgcícaagaacgttgatcttaaagggttcgagcctgatgtacgtattttgcttac caaatacagcaaEagtaatggctctcagtecccgtggatggaggagcaaattcgggatgcctggggaagcatggttctaaaaaEitgti gtacgtgaaacggatgaagttggtaaaggtcagatocggatgagaactgtttttgaacaggGcattgatcaacgctcttcaactggtgcc tggagaaatgctctttctetttgggaacctgtctgcaatgaaattttegatcgtctgattaaaccacgctgggagattagataatgaagcgt gcgcctgttattccasaacatacgcteaaiactcaaccggttgaagaíacttcgttatcgacaccagctgccccgaiggtggattcgttaa ttgcgcgcgtaggagtaatggctcgcggtaatgccattactttgcctgiatgtggtcgggatgtgaagtttactcttgaagígctccgggg tgatagtgttgagaagacctctcgggtatggtcaggtaatgaacgtgaccaggagctgcttactgaggacgcactggatgaictcatcc cttcEtttctaetgactggtcaacagacapcggçgttcggtcgaagagtatctggtgteatagaaattgccgatgggagtcgccgtcgta aagctgctgcacttaccgaaagtgattatcgtgttctggttggcgagctggatgaígagcagatggctgcattatccagattgggtaacg attatcgcccaacaagtgcttatgaacgtggtcagcgttatgcaagccgattgcagaatgaatttgct^aaatatttctgcgctggctga tgcggaaaataíttcacgtaagatuttacccgctgtatcaacaccgccaaaügcctaaatcagttgttgclcttttttctcaccccggtgaa ctíitotgcccggtcaggtgatgcacttcaaaaagcclttacagataaagaggaattacttaagcagcaggcaíctaaccttcatgagcag aaaaaagctggggtgatatttgaagctgaagaagttatcactcttttaacttctgtgcttaaaacgtcaictgcatcaagaactagtttaagc tcacgacatcagtttgctcctggagcgacagtattgtataagggcgataaaatggtgcttaacctggacaggtetcgtgttccaactgagt gtatagagaaaattgaggccattcttaaggaacttgaaaagccagcaccctgatgcgaccacgttttagtctacgtttatcígtctttactta atgtcctttgttacaggccagaaagcataactggcctgaatattctctctgggcccactgttccacttgtatcgtcggtctgataaicagact gggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggac cacggtcccactcgtategtcggtctgataatcagactgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccatg gtcccactegtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctggaaccac^tccca ctcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacgatcccactcgtg ttgtcggtctgattateggtctgggaccacggtcccacttgtattgtcgatcagactatcagcgtgagactacgattccalcaatgcctgtc aagggcaagíattgacatgtcgtcgtaacctgtagaacggagtaacctcggtgtgcggttgtatgcctgctgtggattgctgctgtgtcct gcttatccacaacattttgcgcacggttatgtggacaaaatacctggttacccaggçcgtgccggcacgttaactgtgtcagttagggígt ggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagíatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaecaggtgíggaaagtccccagg ctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccc.ta actccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgccíc

SEQ ID NO: 8

Deleção de 10 Nucleotídeos de 3’UTRZika

CCAGAAGAGG

SEO ID NO: 9

Deleção de 20 Nucleotídeos de 3 ’UTR Zika

CTGTGGATCTCCAGAAGAGG [00196] O conteúdo das referências seguintes e todas as outras referências que são citadas neste pedido são incorporados por referência na sua totalidade.

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 95/134

92/95

REFERÊNCIAS

Costello, A, et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Buff IFoHd /fea/tâ Organ 94,406-406A, doi:10J471/BLT. 16.176990 ¢2016),

Weaver, S. C. et al. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. MwraliRes 130,69-80, doi:10.1016/3.antivfraL2016.03.010 (2016).

Shan, C. et al. Zika Virus: Diagnosis, Therapeutics, and Vaccine JCSJnfecíàw Ifew 2,170-172 (2016).

Dawes, B. E. et al. .Research and development of Zika virus vaccines. NPJ Fttccmes 1.16007, doi:10.1038/npj vaccines.2016,7 (2016).

Barrett, A. D. T. Zika vaccine candidates progress through nonclinical development and enter clinical trials, Facvmas 1,16023, doi:10.1038/npjvaccines.2016.23 (2016).

Larocca, R. A. et al. Vaccine protection against Zika virus from Brazil. Afe/»re 536, 474-478, doi:10.1038/nature 18952 (2016)..

Dowd, K. A. et al. Rapid development of a DNA vaccine for Zika virus. Sefewce 354, 237-240, doi:10.1 .l26/science.aai9137 (2016).

Abbink, P. et al .Protective efficacy of multiple vaccine platforms against Zika virus challenge in rhesus monkeys. Sdence 3.53,1129-1132, doi:10J 126/science.aah6157 ¢2016).

Whitehead, S.. S. Development of TV003/TV005., a single dose, highly immunogenic live attenuated dengue vaccine; what makes this vaccine different from the SanofiPasteur CYD vaccine? review of vaocfrw 15,509-517, dttolO. 1586/14760584.20.16.1115727 (2016).

Shan, C. et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to· Study Viral Virulence, Mosquito Transmission., end Antiviral Inhibitors. Cefí Host Aftoro&e 19, 891-900, doh 10.i016/j.chom,2016.05.004 (2016)..

Xie, X. et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. .OioMedSeine 12,1.56-160, doi:10.1016/j ebiom.2016.09.013 (2016).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 96/134

93/95

I,o, L., Tilgner, M,, Bernard, K., & Shi, P.-Y. Functional analysis of mosquito-brsme flavivirus conserved sequence elements within .3’ untranslated region of West Nile virus using a reporting replicon that differentiates between viral translation and RNA replication., J. Virol. 77, 10004-10014 (2003).

Pijlman, G. P, et al, A. highly structured, nuclease-resistant, noncoding RNA produced by flavivtruses is required for pathogenicity, CdZffojr Microbe 4, 579-591, doí:: 10.1016/].chom.2008.10.007 (2008).

Manokaran, G. et al. Dengue subgenomic RNA binds TB.IM25 to inhibit interferon expression for epidemiological fitness. Science 350, 217-221, doit 10. 1126/science.aab3369 (2015).

Acceptability of cell substrates for production of biologtcals. Report of a WHO Study Group on Biologicais. World Health Organ Tech Rep Ser 747, 1-29 (1987).

Rossi, S. L. et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. Am J Trap MedHyg 94,1362-1369, doi: 10.4269/ajtah. 16-0111 (2016).

Govern, J. et al. Zika virus infection damages the testes in .mice. Nature 540,438*442, doi:10,1038/nature20556 (2016).

Ma, W. et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice, Cg.t7 167,1511.-1524 ¢1510, doi:10.I016/j.cdL2016.ll.016 (2016).

Guerbois, M, ct al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by rtecfes aegypii Mosquitoes in the Americas,. J Infect Dis, do 1:10.1093Âni'dis/j i w302 (2016).

FetTeira-de-Brite, A, et al. First detection of natural infection of with

Zika virus in Brazil and throughout South America. Mem Inst (Ml» Cruz 111, 655-658, doi:l0.1590/0074-02760160332 (2016).

Yun, S. I. et al. Comparison of the live-attenuated Japanese Encephalitis vaccineSA14-14-2 strain with Its pre-atteiniated virulent parent SAI 4 strain; Similarities and differences in vitro and in vivo, J Gen Virol, doi:10. lD99/jgv.0.000574 (2016).

Barrett, A. D, & Gould, E. A. Comparison of neurovirulence of different strains of yellow fever virus in mice. J Gen Viral 67 ( Pt 4), 631 -637, doi; 10.1099/0022-131767-4-631 (1986).

Khromykh. A. A., Sedlak, P. L. & Westaway, E. G. Trans-Camplementation analysis of the flavivirus Kunj’m ns5 gene reveals an essential rale for translation of its Nterminai half in RNA replication. J. y'irol. 73,9247-9255 (1999).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 97/134

94/95

Khromykh, A„ Kenney, Μ. & Westaway, Ε. tfans-Compfeinentatloxi of flavivirus RNA polymerase gene NS5 by using Kunjin viras repli con-expressing BHK, cells. J. Pirol. 72, 7270-7279 (1998).

Qing, M., Liu, W.,. Yuan, Z.₍ Gu, F. & Shi, P. Y. A high-throughput assay using dengue-1 virus-like particles for drag discovery.Antiviral Rex 86, 163-171 (2010). Xie, X., Zou, J,, Puttikhunt, C., Yuan, Z. & Shi, P. Y. Two distinct sets of NS2A molecules are responsible for dengue virus RNA synthesis and virion assembly. J ffral 89, 1298-1313, dokW.l128/W1,02882-14 (2015).

Pugachev, K. el al. High fidelity of yellow fever virus RNA polymerase. J. F/roL 78, 1032-1038 (2004),

Xie, X. et a/. Understanding Zika Virus Stability and Developing a Chimeric Vaccine through Functional Analysis. JWBfo S, doi:10.1128/m®o,02134-16 (2017).

Yanch, L„ E, et al. A protective role for dengue virus-specillo CD8^J T cells. J Immunol 182, 4865-4873, doi;I0.4049.gimmunoL0801974 (2009), Weiskopf, D. et al. Comprehensive analysis of dengue virus-specific responses supports an HLA-linked protecti ve role for CDS* T cells. Proc Akií/ Acad Sei U S A 110, E2046-2053, doi: 10.1073/pnas. 1305227110 (2013).

Shi, P. Y., Tilgner, M,,_: Lo, Μ. K., Kent, K, A, & Bernard, K. A. Infectious cDNA clone of the epidemic West Nile virus from New York City. J. Virol. 76, 5847-5856 (2002/,.

Hansen, D. A., Esakky, P., Drury, A., Lamb, L. & Mofey, K. H. The aryl hydrocarbon receptor is important for proper seminiferous tubule architecture and sperm development in mice. Biol Reprod90, 8,. -doi: 10,1095/biolreprod. 113.108845 (2014). Ye, Q. et at Genomic characterization and phylogenetic analysis of Zika virus circulating in. the Americas. Infect Genet Evol 43,43-49, doi; 10. 1016/i .meegid.2016.05.004 (2016).

Akiyama, B. M. et al. Zika virus produces noncoding RNAs using a multi-pseudoknot structure that confounds a cellular exonuclease. Science 354, 1148-1152, doi :10.1126(science.aah3963 (2016).

Taglietti et al. Skin Ther. Led. 13:6-8 (2008)

Shan, C. er al. A live-attenuated Zika virus vaccine- candidate induces sterilizing immunity in mouse models. Aürd-íW, doi:10.1038/nm..4322 (2017).

Xie, X. βί al. Understanding Zika Virus Stability and Developing a Chimeric Vaccine through Functional Analysis. MBio 8, dob 10.11287mBio.02134-I6 (2017).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 98/134

95/95

Shan, C. et d. A Rapid Zika Diagnostic Assay to Measure Neutralizing Antibodies in Patients. 17,157-162, doi: 1.0,10.16/j.ebiom.2017.03.006 (2017).

Lazear, H. M. er cil A Mouse Model of Zika. Virus Pathogenesis. CeZZ 19, 720-730, doi:10.10I^.chom.2016.03.010 (2016).

Grant, A. er al. Zika Virus Targets Human STAT2 to Inhibit Type I Interferon Signaling. Ce/Z HostMW>e .19,882-890, doi:10. 10163.chom.20I6.05.009 (2016). Miner, J. J. er al Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. CdZ 165,1081-1091, doi: W.IÔI 6^.cdl.2016.05.008 ¢2016)

Sapparapu, G. er aZ. Neutralizing human antibodies prevent Zika virus replication and fetal disease in mice. Afamre 540,443*447, doi: 10.1038/nawre20564 (2016).

Richner, J... et al Vaccine mediated protection against Zika virus induced congenital disease. Cd/170,273-283 (2017).

Acceptability of cell substrates for production of biologicals. Report of a WHO Study Group on Biologicals. IForfd Organ Ted? Ztep 5ter 747,1-29 (1987),

Organization, W. H. WHO/UNICEF Zika virus vaccine target product protile: Vaccine to protect congenital Zika syndrome for use during an emergence. (2017). Pardi, N. er d. Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-niodifíed .mRNA vaccination. Mrrare, doi: 10.103 8/nature21428 (2017).

Ong, E. Z. er d. Preclmical evaluation of VIS513, a therapeutic antibody against dengue vinis, in non-human primates. ^ní/wd Ztes 144,44-47, doi: 10.1016/j. anti viral, 2017.05.007 (2017).

Shan C, er al A single-dose live-attenuated vaccine prevents Zika virus pregnancy transmission and testis damage. Wiure Comm«»tcd/onnn press (2017).

Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 99/134

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Cepa do vírus da Zika atenuado vivo (ZIKV), caracterizada pelo fato de que compreende uma deleção na região não traduzida 3’ (3’UTR) do genoma do ZIKV.
2. 2. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que a deleção 3’UTR varia de deleção de 10 nucleotídeos a uma deleção de 50 nucleotídeos (isto é, deleção 3’UTR Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18,Δ19,

   Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ2~ Δ29, Δ30, Δ31,Δ32,

   Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ* Δ42, Δ43, Δ44,Δ45,

   Δ46, Δ47, Δ48, Δ49 ou Δ50).
3. 3. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a deleção 3’UTR é uma deleção de 10 nucleotídeos, uma deleção de 20 nucleotídeos ou uma deleção de 30 nucleotídeos.
4. 4. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a deleção 3’UTR é uma deleção de 10 nucleotídeos.
5. 5. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a deleção 3’UTR é uma deleção de 20 nucleotídeos.
6. 6. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende uma 3’UTR tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5.
7. 7. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é incompetente em infectar mosquitos.

   Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 100/134

   2/4
8. 8. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que exibe síntese de RNA viral diminuída em comparação com cepas do ZIKV tipo selvagem.
9. 9. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que exibe sensibilidade elevada a inibição de interferon tipo 1 em comparação com cepas do ZIKV tipo selvagem.
10. 10. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a deleção não afeta a tradução de RNA viral.
11. 11. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é uma cepa do ZIKV mCherry.
12. 12. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma variante de deleção de SEQ ID NO:6, em que a sequência “CCAGAAGAGG” (3’UTR deleção de 10 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 8) é deletada da mesma.
13. 13. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma variante de deleção de SEQ ID NO:6 em que a sequência “CTGTGGATCTCCAGAAGAGG” (3’UTR deleção de 20 nucleotídeos) (SEQ ID NO:9) é deletada da mesma.
14. 14. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma variante de deleção de SEQ ID NO:7 em que a sequência “CCAGAAGAGG” (3’UTR deleção de 10 nucleotídeos) (SEQ ID NO: 8) é deletada da mesma.
15. 15. Cepa do ZIKV atenuado vivo, de acordo com a reivindi

    Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 101/134

    3/4 cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma variante de deleção de SEQ ID NO:7 em que a sequência “CTGTGGATCTCCAGAAGAGG” (3’UTR deleção de 20 nucleotídeos) (SEQ ID NO:9) é deletada da mesma.
16. 16. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa do ZIKV atenuado como definida em qualquer das reivindicações anteriores, a qual ainda compreende pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
17. 17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é adequada para administração parenteral ou enteral.
18. 18. Método para elicitar uma resposta imune em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição compreendendo uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma cepa do ZIKV atenuado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou uma composição imunogênica como definida na reivindicação 16 ou 17.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que induz uma resposta de célula T CD8⁺, uma resposta de anticorpo e/ou uma resposta imune celular contra o ZIKV.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que produz um título de anticorpo de neutralização equivalente àquele da infecção do ZIKV do tipo selvagem.
21. 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito é uma fêmea grávida.
22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é usado para prevenir síndrome do ZIKV congênita.
23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica

    Petição 870190090759, de 12/09/2019, pág. 102/134

    4/4 ções anteriores, caracterizado pelo fato de que é usado para prevenir microcefalia.
24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos 1,0 x 10¹, 1,0 x 10², 1,0 x 10³, 1,0 x 10⁴, 1,0 x 10⁵ ou 1,0 x 10⁶ IFUs da cepa do ZIKV atenuado vivo são administradas ao sujeito.
25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a administração da referida composição previne viremia no referido sujeito após desafio subsequente com cepa do ZIKV tipo selvagem.
26. 26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.