TWI406673B - 對抗４種登革熱血清型之免疫方法 - Google Patents

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Description

對抗4種登革熱血清型之免疫方法
本發明係關於在患者中誘發對抗4種登革熱血清型保護力的方法，包括(a)第一系列投予(i)一劑第一種血清型之疫苗用登革熱病毒及一劑第二種血清型之疫苗用登革熱病毒；及(ii)一劑第三種血清型之疫苗用登革熱病毒及一劑第四種血清型之疫苗用登革熱病毒，及(b)第二系列投予(i)及(ii)劑，其中(i)及(ii)劑係在不同解剖部位同時投予，且其中該第二系列(b)係在第一系列(a)之後至少30天至最多12個月時實施。
登革熱疾病係由黃病毒屬的四種病毒所引起，該四種病毒之血清型類似，但在抗原性方面不同(Gbler等人，1988年於：Epidemiology of arthropod－borne viral disease.Monath TPM，編輯，Boca Raton(FL)：CRC Press：223－60；Kautner等人，1997,J.of Pediatrics,131：516－524；Rigau－Prez等人，1998,Lancet；352：971－977；Vaughn等人，1997,J Infect Dis；176：322－30)。感染登革熱血清型可產生非特異性病毒症候群至致死性嚴重出血熱疾病之臨床疾病譜。蚊子叮咬後登革熱之潛伏期大約為4天(在3至14天範圍內)。登革熱特徵為雙相熱、頭痛、身體多個部位疼痛、衰竭、出疹、淋巴結病及白血球減少(Kautner等人，1997,J.of Pediatrics,131：516－524；Rigau－Prez等人，1998,Lancet；352：971－977)。病毒血症期與發熱期相同(Vaughn等人，1997,J.Infect.Dis；176：322－30)。自登革熱恢復發生於7至10天之後，但常會有後遺虛弱。常見白細胞及血小板數降低。
出血性登革熱係嚴重的發熱疾病，其特徵為內環境穩定異常及血管滲透性增加，此可導致血容量不足及高血壓(登革熱伴隨休克症候群)，並常因嚴重內出血而複雜化。若不治療，出血性登革熱之死亡率可達到10%，但在有治療經驗之大部分中心死亡率為1%(WHO technical Guide,1986.Dengue haemorrhagic fever：diagnosis,treatment and control,p1－2.World Health Organization,Geneva,Switzerland)。
登革熱常規實驗室診斷係基於分離病毒及/或檢測登革熱病毒特異性抗體。
登革熱係瘧疾之後的第二最常見的熱帶感染性疾病，有超過一半的世界人口居住於有傳染病傳播風險之地區。每年，估計登革熱病例為5千萬－1億，出血性登革熱住院患者病例為50萬，且死亡數為2.5萬。登革熱係亞洲、太平洋地區、非洲、拉丁美洲及加勒比海的地方病。超過100個熱帶國家有地方性登革熱病毒感染，且在該等國家中有60個具有出血性登革熱記錄(Gubler,2002,TRENDS in Microbiology.10：100－103；Monath,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.；91：2395－2400)。一些詳細闡釋的因素顯示與登革熱有關：人口增長；無計劃及無控制的城市化，尤其與貧窮伴隨；空中旅行增加；對蚊子缺乏有效控制及衛生基礎設施與公共健康惡化(Gubler,2002,TRENDS in Microbiology.10：100－103)。越來越多旅行及移居國外的個人被警告患有登革熱(Shirtcliffe等人，1998,J.Roy.Coll.Phys.Lond.；32：235－237)。在美國部隊部署於有地方性登革熱之熱帶地區期間登革熱已成為美國部隊中發熱性疾病的一個主要原因(DeFraites等人，1994,MMWR 1994；43：845－848)。
病毒維持於涉及人類與埃及伊蚊(一種在白天咬人的家蚊，且其喜歡依靠人類維持生命)之循環中。當受感染之埃及伊蚊吸食血液時，藉由注射病毒開始感染人類。唾液中之病毒主要停留於血管外組織中。接種後首先被感染之細胞種類係樹突細胞，其隨後轉移至淋巴結(Wu等人，2000,Nature Med.；7：816－820)。在皮膚及淋巴結中起始複製後，在急性發熱期間病毒在血液中一般出現3至5天。
單核細胞及巨噬細胞連同樹突細胞皆屬於登革熱病毒之首選靶標。對抗同型再感染之保護係完全的且可能持續一生，但各種登革熱類型間之交叉保護持續時間少於數周至數月(Sabin,1952,Am.J.Trop.Med.Hyg.；1：30－50)。因此，個體可能受不同血清型之感染。理論上，二次感染登革熱係發生嚴重登革熱疾病之風險因素。然而，出血性登革熱與多種因素相關：該等因素包括所涉及之病毒株，亦及患者之年齡、免疫狀態及遺傳性素因。兩種因素在出血性登革熱發生中起主要作用：病毒快速複製併發高病毒血症(疾病之嚴重程度與病毒血症之水平相關；Vaughn等人，2000,J.Inf.Dis.；181：2－9)及大量炎症性反應並釋放高水平炎性介質(Rothman and Ennis,1999,Virology；257：1－6)。對抗登革熱無專一療法。用於登革熱之治療係針對症狀之強制臥床、以退熱劑及止痛劑控制發燒及疼痛、及攝入足夠流體。用於出血性登革熱之治療需平衡流體流失、置換凝血因子並輸注肝素。
目前之預防措施係基於控制載體並採取個體預防步驟，此不易實施且花費昂貴。當前尚無對抗登革熱之疫苗獲得批准。鑒於此四種登革熱血清型在世界上之傳播且因為己報道其與登革熱出血性發燒病例相關，因此免疫應能理想地賦予對抗登革熱病毒之四種血清型之保護作用。
用於投予登革熱病毒之不同解剖部位之用途已在文獻中得以闡述。
因此，Halstead等人(1973,Am.J.Trop.Med.Hyg.,22：375－381)已展示在2個或4個不同的解剖部位針對4種不同血清型投予野生型登革熱病毒可誘發對抗後續感染之保護。然而，作者觀察到與在單一部位實施免疫相比，此類分離免疫並無優越性。
當以四價疫苗形式投予時，登革熱病毒之減毒病毒形式在人體內可導致干擾。此現象具體闡述於以下公開案中：Gubler D.J.Clin.Microbiol.Rev.1998；11(3)：480－96；Rothman A.L.等人，Vaccine 2001；19：4694－9。
Zhou H與Deem MW.(Vaccine.2006 Mar 24；24(14)：2451－9)已開發一種僅基於使用CD8抗原決定部位之數學模型且目的在於模擬在4種登革熱血清型之CD8抗原決定部位間之干擾。根據該理論模型，避免干擾之最佳途徑係使用次要CD8抗原決定部位實施首次免疫，然後藉由在不同解剖部位投予4種血清型中每一種之相同的CD8抗原決定部位加強免疫。
因此，需要一種用於減少各種血清型間之干擾並用於誘導對抗此4種登革熱血清型之中和抗體的方法。
發明人已證明可能產生可中和4種血清型之抗體的同源免疫反應，其中該等4種血清型係分別成對地在不同解剖部位投予第一系列，並隨後在第一次投予4種血清型後30天至12個月實施之第二系列投予。
發明人已特別證明，在兩個不同解剖部位同時進行DEN－1,2二價免疫與DEN－3,4二價免疫，且隨後在相同條件下以相同疫苗劑進行加強免疫，可在經免疫之所有猴中誘發對抗此四種血清型之高度反應(除在一隻動物中之一種血清型外)。相反地，在單一部位實施四價免疫可能僅可對4種血清型中之兩種誘發令人滿意的反應。
因此，根據本發明方法產生之免疫反應在量及質上更強(涵蓋所有血清型)。
根據第一個目標，因此本發明係關於一種用於在患者中誘發對抗4種登革熱血清型之同源保護力的方法，其包括(a)第一系列投予(i)一次劑量之第一種血清型之疫苗用登革熱病毒及一劑第二種血清型之疫苗用登革熱病毒；及(ii)一劑第三種血清型之疫苗用登革熱病毒及一劑第四種血清型之疫苗用登革熱病毒，及(b)第二系列投予(i)及(ii)劑，其中(i)及(ii)劑係在不同解剖部位同時投予，且其中第二系列係在第一系列之後至少30天至最多12個月實施。
根據本發明方法之另一實施例，疫苗用登革熱病毒(i)係以單一的二價疫苗劑量形式投予。
根據本發明方法之另一實施例，疫苗用登革熱病毒(ii)係以單一的二價疫苗劑量形式投予。
根據本發明免疫方法之一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型1係選自由VDV1株與ChimerivaxTM DEN－1組成之群。
根據本發明方法之另一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型2係選自由VDV2株與ChimerivaxTM DEN－2組成之群。
根據本發明方法之另一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型1係VDV1株，且該疫苗用登革熱病毒血清型2係VDV2株。
根據本發明方法之另一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型1係ChimerivaxTM DEN－1，且該疫苗用登革熱病毒血清型2係ChimerivaxTM DEN－2。
根據本發明方法之另一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型3係ChimerivaxTM DEN－3。
根據本發明方法之另一特定實施例，該疫苗用登革熱病毒血清型4係ChimerivaxTM DEN－4。
根據本發明方法之另一特定實施例，第一及第二種血清型分別係CYD DEN－1及CYD DEN－2，且第三及第四種血清型分別係CYD DEN－3及CYD DEN－4。
根據本發明方法之另一特定實施例，第一及第二種血清型分別係CYD DEN－1及CYD DEN－3，且第三及第四種血清型分別係CYD DEN－2及CYD DEN－4。
根據本發明方法之另一特定實施例，疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3及4之量為103 至106 CCID50 之範圍。
根據本發明方法之另一特定實施例，用於第二系列投予之疫苗用病毒與用於第一系列投予之彼等相同。
根據本發明方法之另一特定實施例，第二系列投予係在第一系列投予之後30至60天實施。
本發明之標的亦係用於對抗登革熱病毒之免疫套組，其包括一盒，該盒至少包含疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3及4，該盒係：(a)呈包含單價組合物之4個分離容器之形式，或(b)呈包含兩種二價組合物之2個分離容器之形式。
根據一實施例，本發明之套組至少包括：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－2)之第一容器，及(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－3及ChimerivaxTM DEN－4)之第二容器。
根據另一實施例，本發明之套組包括至少：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－3)之第一容器，及(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－2及ChimerivaxTM DEN－4)之第二容器。
本發明之一標的亦係用於對抗登革熱病毒之免疫套組，其包括一盒，該盒至少包含第一種血清型及第二種血清型之疫苗用登革熱病毒，其係：(a)呈包含於2個分離容器中之2種單價組合物之形式，或(b)呈包含於1個單一容器中之二價組合物形式。
根據另一實施例，該套組包括至少：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－3)之容器，或(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－2及ChimerivaxTM DEN－4)之容器，或(c)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－2)之容器，或(d)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－3及ChimerivaxTM DEN－4)之容器。
本發明亦提供包括免疫有效量之第一種血清型與第二種血清型之登革熱疫苗用病毒及醫藥上可接受之賦形劑的二價組合物或二價疫苗。
根據一具體實施例，該二價組合物或疫苗包含選自由以下組成之群的疫苗用病毒：ChimerivaxTM DEN－1與ChimerivaxTM DEN－3；或ChimerivaxTM DEN－2與ChimerivaxTM DEN－4；或ChimerivaxTM DEN－1與ChimerivaxTM DEN－2；或ChimerivaxTM DEN－3與ChimerivaxTM DEN－4。
隨後敍述將對本發明進行更詳細地闡述。
定義
在本發明上下文中，若兩個解剖部位之液體流向不同的淋巴結，則其係"不同的"。舉例而言，認為右臂與左臂是不同的部位。以下不同部位亦作為非限制性實例提及：右臂/右大腿；左臂/左大腿；左臂/右大腿。
在本發明上下文中，術語"同時投予"意欲指在同一天內實施投予(亦即最多24小時)。較佳以至多1小時間隔同時實施投予，通常間隔1－5分鐘。
在本發明上下文中，劑量(i)係以兩種單價劑量之形式或以單獨二價劑量之形式在第一解剖部位投予。劑量(ii)(其部分)係以兩種單價劑量之形式或以單獨二價劑量之形式在第二解剖部位同時投予，且第一及第二部位係上文所定義之不同部位。
"登革熱病毒"或"DEN"係屬於黃病毒科黃病毒屬之正鏈、單鏈RNA病毒。基因組RNA在5'端包含I型帽子結構但在3'端缺少多聚A尾。基因組結構由以下組件組成：5'非編碼區(NCR)、結構蛋白(衣殼蛋白(C)、早期膜/膜(prM/M)、包膜(E))及非結構蛋白(NS1－NS2A－NS2B－NS3－NS4A－NS4B－NS5)、及3' NCR。基因組病毒RNA與衣殼蛋白相連從而形成核衣殼。如同其他黃病毒，DEN病毒基因組編碼被轉譯成單一聚蛋白之不間斷編碼區。
在本發明上下文中，術語"疫苗用登革熱病毒"意欲指可誘發特定同源免疫反應之任一病毒形式的登革熱病毒，較佳係可用於在人類中對抗登革熱病毒感染之免疫程序之上下文中之任一病毒形式的登革熱病毒。因此，術語"疫苗用登革熱病毒"意欲指滅活病毒、減毒病毒、諸如登革熱病毒包膜蛋白等重組蛋白。
若一疫苗病毒在許可細胞內不再複製，則認為該疫苗病毒係"滅活的"。
若一疫苗病毒在37℃或39℃下在Huh－7、VERO及/或C6/36肝細胞中生長後，該疫苗病毒之最大滴度較野生型親代株在相同培養條件下及使用滴度測定方法量測所獲得之最大滴度小至少10倍，則認為該疫苗病毒係"減毒的"。因此，在本發明之上下文中，在上文確定的三種細胞類型之至少一種中展示生長減弱之疫苗病毒被認為係"減毒的"。
可用於人類之疫苗病毒具有正的效益/風險比，該比例一般能滿足用於獲得市場許可之監管要求。用於本發明範圍之疫苗用登革熱病毒較佳係減毒病毒，以使其不會在人類中誘發疾病。較佳地，該疫苗病毒在大部分受免疫個體中僅產生至多為中等強度(亦即中等至較弱、或幾乎為零)之副作用，但同時保留其誘發中和抗體反應之能力。
作為在本發明上下文中可用之疫苗用登革熱病毒之非限制性實例可提及：滅活疫苗病毒、減毒疫苗病毒，例如減毒株VDV－1或VDV－2、闡述於(例如)申請案WO 02/66621、WO 0057904、WO 0057908、WO 0057909；WO 0057910、WO 02/0950075及WO 02/102828中之病毒株或嵌合體。嵌合體病毒具有具上文所定義之減毒病毒特徵之特殊性。因此，任一可表現登革熱病毒包膜蛋白並可誘發包括可中和係包膜蛋白來源之血清型的免疫反應之嵌合體病毒均可於本發明上下文中使用。作為非限制性實例，可提及：如闡述於(例如)專利申請案WO 98/37911中之登革熱ChimerivaxTM 產品，及如闡述於(例如)專利申請案WO 9640933及WO 0160847中之登革熱/登革熱嵌合體。疫苗用登革熱病毒血清型1可係(例如)VDV1疫苗株或ChimerivaxTM DEN－1，具體而言係YF17D/DEN－1病毒，或16007/PDK13 DEN－1株。疫苗用登革熱病毒血清型2可係(例如)VDV2疫苗株或ChimerivaxTM DEN－2，具體而言係YF17D/DEN－2病毒，或16681/PDK53 DEN－2株。疫苗用登革熱病毒血清型3可係ChimerivaxTM DEN－3，具體而言係YF17D/DEN－3病毒。疫苗用登革熱病毒血清型4可係ChimerivaxTM DEN－4，具體而言係YF17D/DEN－4病毒。該株以Mahidol大學之名義闡述於專利申請案EP 1159968中且以編號I－2483保存於Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)[國家微生物培養物保存中心]。
"VDV"或"Vero登革熱疫苗"表示在Vero細胞中生長的且能誘發特定體液反應(包括在哺乳動物且尤其在人類中誘發中和抗體)之活減毒登革熱病毒株。
"VDV－1"係獲自野生型株DEN－1 16007的病毒株(DEN－1 16007/PDK11)，其在PDK細胞中經歷11次傳代，然後於32℃下在Vero細胞中對其實施擴增，純化其RNA並轉染入Vero細胞。VDV－1株與疫苗株DEN－1 16007/PDK13(在PDK－原代狗腎(Primary Dog Kidney)－細胞中經13次傳代)相比具有14個額外的突變。DEN－1 16007/PDK13株(亦稱為"LAV1")以Mahidol大學之名義闡述於專利申請案EP 1159968中並以編號I－2480保存於Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)。VDV－1株之完整序列在序列SEQ ID NO：1中給出。該病毒株可容易地自該序列複製。VDV－1株之製備方法及鑒定已闡述於以Sanofi－Pasteur及以疾病預防與控制中心之名義申請的國際專利申請案(編號PCT/IB 2006/001313)中。
"VDV－2"係獲自野生型株DEN－2 16681之病毒株(DEN－2 16681/PDK50)，其在PDK細胞中經過50次傳代、及噬斑純化、及對其RNA實施提取及純化、隨後轉染入Vero細胞中。隨後在Vero細胞中藉由噬菌斑純化及擴增獲得VDV－2。VDV－2株與疫苗株DEN－2 16681/PDK53(在PDK細胞中經過53次傳代)相比具有10個額外突變，其中4個係沉默突變。DEN－2 16681/PDK53株(亦稱為"LAV2")以Mahidol大學之名義闡述於專利申請案EP 1159968中並以編號I－2481保存於Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)。VDV－2株之完整序列展示於序列SEQ ID NO：2中。VDV－2株可容易地自該序列複製。VDV－2株之製備及鑒定方法已闡述於以Sanofi－Pasteur及以疾病預防與控制中心之名義申請的國際專利申請案(編號PCT/IB 2006/001513)中。
VDV 1及2株係藉由在Vero細胞中擴增製備。收穫所產生之病毒並針對細胞碎屑藉由過濾對其實施純化。藉由酵素處理對DNA實施消化。藉由超濾移除雜質。感染滴度可藉由濃縮法提高。添加穩定劑後，在使用前以凍乾或冷凍形式保存該等病毒株，在使用時就地實施再構成。
術語"ChimeriVaxTM 登革熱"或"CYD"表示包含YF病毒主鏈之嵌合體黃熱(YF)病毒，其中YF病毒主鏈中編碼早期膜及包膜蛋白之序列已由DEN病毒之彼等所取代。因此，術語"CYD－1或CYD DEN1"用於闡述包含登革熱血清型1株(DEN－1)之prM及E序列之嵌合體YF病毒。術語"CYD－2或CYD DEN2"用於闡述包含DEN－2株之prM及E序列之嵌合體YF病毒。術語"CYD－3或CYD DEN3"用於闡述包含DEN－3株之prM及E序列之嵌合體YF病毒。術語"CYD－4或CYD DEN4"用於闡述包含DEN－4株之prM及E序列之嵌合體YF病毒。該等ChimeriVaxTM 登革熱病毒之製備已詳細闡述於國際專利申請案WO 98/37911及WO 03/101397中，對其製備方法之明確闡述可參考該等文獻。闡述於該等實例中之嵌合體係使用源自DEN1 PUO359(TYP1140)、DEN2 PU0218、DEN3 PaH881/88及DEN4 1288(TVP 980)株之prM及E序列所產生。在本發明上下文中可用登革熱病毒之任一株來構建嵌合體。
較佳地，嵌合YF病毒包括減毒黃熱株YF17D(Theiler M，及Smith HH(1937)J Exp.Med 65,第767－786頁)(YF17D/DEN－1、YF17D/DEN－2、YF17D/DEN－3、YF17D/DEN－4病毒)之主鏈。可使用之YF17D株之實例包括YF17D204(YF－Vax,Sanofi－Pasteur,Swifwater,PA,USA；Stamaril,Sanofi－Pasteur,Marcy l'Etoile,France；ARILVAXTM ,Chiron,Speke,Liverpool,UK；FLAVIMUN,Berna Biotech,Bern,Switzerland)；YF17D－204 France(X15067,X15062)；YF17D－204,234 US(Rice等人，1985,Science,229：726－733)，或其他相關病毒株YF17DD(Genbank登錄號U17066)、YF17D－213(Genbank登錄號U17067)及由Galler等人闡述之YF17DD株(1998,Vaccines 16(9/10)：1024－1028)。於本發明上下文中可使用經減毒用於人類中之任一其他黃熱病毒株來構建嵌合體。
因此，本發明之目標亦係一種二價組合物或疫苗，其包含免疫有效量之第一種血清型疫苗用登革熱病毒及第二種血清型疫苗用登革熱病毒及醫藥上可接受之賦形劑。
對於可用於本發明疫苗中之疫苗病毒之闡述，可參考本發明免疫方法之上下文中所給出之闡述。
根據特定實施例，本發明之二價組合物或疫苗包含CYD DEN－1及CYD DEN－2、或CYD DEN－3及CYD DEN－4、或CYD DEN－1及CYD DEN－3或CYD DEN－2及CYD DEN－4；較佳地，疫苗病毒在疫苗中以105 CCID50 之量存在。
各ChimeriVaxTM 單價疫苗用登革熱病毒(血清型1、2、3及4)係藉由在Vero細胞中擴增各血清型而製備。更具體而言，該等四種病毒係在無血清培養基中於黏附性Vero細胞上分別產生。收穫病毒並藉由過濾實施淨化去除細胞碎屑，且隨後藉由超濾與層析法實施濃縮及純化以去除宿主細胞DNA。添加穩定劑後，在使用前以冷凍或凍乾形式保存該等疫苗株，在使用時就地實施再構成。相同的方法對於四種嵌合體皆適用。
若劑型、組合物或疫苗除醫藥上可接受之賦形劑外包含單一登革熱病毒血清型，則其係"單價的"。若劑型、組合物或疫苗包含兩種不同的登革熱病毒血清型，則其係"二價的"。若劑型、組合物或疫苗包含三種不同的登革熱病毒血清型，則其係"三價的"。若劑型、組合物或疫苗包含四種不同的登革熱病毒血清型，則其係"四價的"。藉由簡單混合單價組合物可獲得多價組合物。
術語"患者"表示可能受登革熱感染之個體(兒童或成年人)，尤其係有感染風險之個體，例如，在登革熱流行地區旅行之個體或該等地區之居民。因此該術語涵蓋初次感染登革熱病毒之個體且亦涵蓋非初次感染登革熱病毒之個體。
在不同的解剖部位之順次免疫
發明者已特別展示，在不同的解剖部位以同時投予兩種二價疫苗之形式投予4種血清型，隨後在第一系列投予之後30天至12個月時加強免疫可獲得對抗4種血清型之有效的同源保護。因此，本發明之方法在對抗登革熱之免疫策略之上下文中極有價值。
根據本發明，該4種登革熱血清型可以任何順序投予，只要其係同時在不同的部位成對投予(亦即，劑量(i)與(ii)，以兩種單價劑量形式或以單獨二價劑量形式分別投予)。
因此，本發明之方法可以下文闡述之實施例實現：－(i)血清型1與2；(ii)血清型3與4；或－(i)血清型1與3；(ii)血清型2與4；或－(i)血清型1與4；(ii)血清型2與3；或－(i)血清型2與3；(ii)血清型1與4；或－(i)血清型2與4；(ii)血清型1與3；或－(i)血清型3與4；(ii)血清型1與2。
較佳地，本發明之方法包括投予以下疫苗用登革熱病毒：(i)血清型1與2；(ii)血清型3與4或(i)血清型1與3；(ii)血清型2與4。劑量(i)及(ii)較佳係二價劑量形式。
因此，根據特定實施例，本發明涵蓋以下方案：－(i)CYD DEN－1與CYD DEN－2；(ii)CYD DEN－3與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－1與CYD DEN－3；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－1與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－3－(i)CYD DEN－2與CYD DEN－3；(ii)CYD DEN－1與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－2與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－3－(i)CYD DEN－3與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－1與CYD DEN－2－(i)VDV－1與CYD DEN－2；(ii)CYD DEN－3與CYD DEN－4－(i)VDV－1與CYD DEN－3；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－4－(i)VDV－1與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－3－(i)CYD DEN－2與CYD DEN－3；(ii)VDV－1與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－2與CYD DEN－4；(ii)VDV－1與CYD DEN－3－(i)CYD DEN－3與CYD DEN－4；(ii)VDV－1與CYD DEN－2－(i)CYD DEN－1與VDV－2；(ii)CYD DEN－3與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－1與CYD DEN－3；(ii)VDV－2與CYD DEN－4－(i)CYD DEN－1與CYD DEN－4；(ii)VDV－2與CYD DEN－3－(i)VDV－2與CYD DEN－3；(ii)CYD DEN－1與CYD DEN－4－(i)VDV－2與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－1與CYD DEN－3－(i)CYD DEN－3與CYD DEN－4；(ii)CYD DEN－1與VDV－2－(i)VDV－1與VDV－2；(ii)CYD DEN－3與CYD DEN－4－(i)VDV－1與CYD DEN－3；(ii)VDV－2與CYD DEN－4－(i)VDV－1與CYD DEN－4；(ii)VDV－2與CYD DEN－3－(i)VDV－2與CYD DEN－3；(ii)VDV－1與CYD DEN－4－(i)VDV－2與CYD DEN－4；(ii)VDV－1與CYD DEN－3及－(i)CYD DEN－3與CYD DEN－4；(ii)VDV－1與VDV－2。
較佳地，本發明之免疫方法包括投予以下疫苗用登革熱病毒：(i)CYD DEN－1與CYD DEN 2；(ii)CYD DEN－3與CYD DEN－4；或(i)CYD DEN－1與CYD DEN－3；(ii)CYD DEN－2與CYD DEN－4。劑量(i)及(ii)較佳係二價劑量形式。
本發明之免疫方法包括在第一系列投予(i及ii)之後自30天至12個月、較佳地30天至3個月、較佳地30天、45天或60天時實施第二系列投予，且第二系列投予較佳地包括投予與用於第一系列中之彼等相同的組合物，且較佳地在相同條件下投予。
在本發明範圍內，術語"疫苗病毒劑量"意欲指包括"免疫有效量"(亦即足以誘發同源中和抗體反應之登革熱病毒之量，其可(例如)藉由下文闡述於實例1中之血清中和測試加以證明)之疫苗用登革熱病毒之組合物。當以此種方法檢測之中和抗體滴度大於或等於1：10(單位：1/稀釋度)時，則認為血清存在中和抗體為陽性。
疫苗株數量通常以病毒噬菌斑形成單位(PFU)或以50%組織培養物感染劑量，或以50%細胞培養物感染劑量(CCID50 )來表述。舉例而言，對於單價或二價組合物，本發明之組合物可包含10至106 CCID50 、具體而言103 至105 CCID50 之疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3或4。因此，在本發明之組合物或用途中，疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3及4之劑量較佳各處於10至106 CCID50 之範圍內，例如10、101 、102 、103 、104 、105 或106 CCID50 ，尤其處於103 至105 CCID50 之範圍內。可用相同或不同劑量使用疫苗病毒，其可根據所用疫苗病毒之性質及欲獲得免疫反應之強度而進行調節。
根據本發明方法之特定實施例，單價或二價劑量之疫苗病毒分別包括105 CCID50 之CYD DEN－1、CYD DEN－2、CYD DEN－3及CYD DEN－4。
中和抗體反應較佳係持續反應，亦即在第二系列投予(i)及(ii)之後至少6個月時可在血清中檢測到中和抗體。
第一種血清型疫苗用登革熱病毒劑量及第二種血清型疫苗用登革熱病毒劑量(亦即劑量(i))係以兩種單價組合物之形式、或較佳地以單獨二價組合物之形式或劑量同時投予。
同樣，第三種血清型疫苗用登革熱病毒劑量及第四種血清型疫苗用登革熱病毒劑量(亦即劑量(ii))係以兩種單價組合物之形式、或較佳以單獨二價疫苗組合物之形式同時投予。
該等疫苗病毒係以疫苗組合物或疫苗病毒劑量之形式投予，該形式可根據彼等熟習此項技術者所瞭解之任一方法製備。通常，將一般呈凍乾形式之病毒與醫藥上可接受之賦形劑(例如水或經磷酸鹽緩衝之鹽溶液、濕潤劑或穩定劑)混合。術語"醫藥上可接受之賦形劑"意欲指不會在人類或動物中產生副反應(例如過敏反應)之任一溶劑、分散介質、填料等。根據所選醫藥形式、及投予方法與路徑來選擇賦形劑。關於醫藥調配物之適宜的賦形劑及要求闡述於"Remington：The Science & Practice of Pharmacy"中，其係本領域的參考著作。
較佳地，該疫苗組合物以可注射形式製備，且可對應於液態溶液、懸浮液或乳液。該等組合物具體而言可包括經緩衝之水性溶液以保持介於約6與9之間之pH值(在環境溫度下以pH儀測定)。
雖然不必添加佐劑，但該等組合物仍不能包含此類化合物：即可提高、激發或加強同時投予之疫苗株所誘發之細胞或體液免疫反應的物質。熟習此項技術者能自疫苗領域內之習用佐劑中選擇可適用於本發明上下文中之佐劑。
本發明之疫苗組合物可根據通常用於免疫中之任一途徑投予，例如非經腸(具體而言係皮內、皮下或肌內)投予，較佳經皮下投予。較佳地，疫苗組合物係可在左三角肌及右三角肌區域經皮下投予之可注射的組合物。
投予組合物之體積端視投予途徑而定。對於經皮下注射，體積一般介於0.1與1.0毫升之間，較佳大約0.5毫升。
投予所有血清型1至4之最佳時期係在暴露於登革熱病毒前大約1至3個月。該等疫苗可在成年人及兒童中作為登革熱病毒感染之預防治療投予。因此目標人群包括對登革熱病毒初次感染(亦即先前未經免疫)或非初次感染之個體。
亦可(例如)在給予根據本發明第二系列投予後介於6個月與10年之間，例如6個月、1年、3年、5年或10年時實施疫苗用登革熱病毒血清型1至4之加強投予。加強投予較佳使用與第1及第2系列投予所用之彼等相同的疫苗組合物(亦即相同疫苗病毒)且較佳地在相同投予條件下(解剖部位及投予途徑)實施。
干擾現象可藉由一種或多種血清型相對於其他血清型之優勢進行解釋，且因此不依賴於用於製造候選疫苗(例如VDV或chimerivax)之技術。因此，本發明之方法一般可施用於任一疫苗用登革熱病毒。
因此，本發明之一目標亦係疫苗用登革熱病毒之劑量於製備用於誘發對抗該4種登革熱血清型之保護作用之疫苗中之用途，其包括：(a)第一系列投予(i)一次劑量之第一種血清型之疫苗用登革熱病毒及一次劑量之第二種血清型之疫苗用登革熱病毒；及(ii)一次劑量之第三種血清型之疫苗用登革熱病毒及一次劑量之第四種血清型之疫苗用登革熱病毒，及(b)第二系列投予劑量(i)及(ii)，其中劑量(i)及(ii)係在不同的解剖部位同時投予，且其中該第二系列係在第一系列之後至少30天至至多12個月時實施。
對於可用於本發明上下文中之疫苗用登革熱病毒之闡述，可參照關於本發明免疫方法所給出之闡述。
本發明之一目標亦係一用於對抗四種登革熱病毒血清型之套組。本發明套組包括上文關於所建議之免疫方法所定義的劑量。因此，本發明之套組包括一盒，其含有各種包含疫苗劑之容器且較佳含有包含用於投予該等疫苗之信息的用法說明頁。
根據一實施例，本發明套組包括一盒，該盒至少包含疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3及4：(a)呈包含於4個分離容器中之單價組合物形式，或(b)以包含於2分離容器中之兩種二價組合物形式。
根據另一實施例，本發明之套組包括一盒，該盒至少包含第一種血清型及第二種血清型之疫苗用登革熱病毒：(a)呈包含於2個分離容器中之2種單價組合物之形式，或(b)呈包含於1單容器中之二價組合物形式。
對可用於本發明套組中之疫苗用登革熱病毒之闡述，可參照上文關於本發明免疫方法所給出之對疫苗病毒的闡述。
因此，根據一特定實施例，本發明之套組至少包括：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－2)之第一容器，及(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－3及ChimerivaxTM DEN－4)之第二容器。
根據另一實施例，本發明之套組包括至少：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－3)之第一容器，及(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－2及ChimerivaxTM DEN－4)之第二容器。
根據另一實施例，本發明之套組包括至少：(a)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－3)之容器，或(b)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－2及ChimerivaxTM DEN－4)之容器，或(c)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－1及ChimerivaxTM DEN－2)之容器，或(d)包含二價疫苗(包括ChimerivaxTM DEN－3及ChimerivaxTM DEN－4)之容器。
本發明之套組可包含上述容器之單一實例或數個實例。
若所用疫苗係凍乾形式，則該套組較佳包含至少一個含有用於對可注射疫苗劑量進行再構成之稀釋劑的附加容器。可使用任一醫藥上可接受之稀釋劑達此目的，通常係用水或經磷酸鹽緩衝之水性溶液。
藉由下列實例闡明本發明。
實例 實例1：藉由在不同的解剖部位同時注射兩種二價組合物在猴中免疫
在猴模型中測試病毒血症及免疫原性。尤其認為病毒血症係在人類中與毒力及疾病嚴重程度相關的因素之一，且因此成為擬加以考慮之重要參數。免疫原性(對於其部分)在對所賦予保護作用進行評估之上下文中係主要參數。
1.1材料及方法： 在猴中之實驗係根據歐洲關於動物實驗導則實施。在來源於毛利塔尼亞之獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis ))中實施免疫。在免疫前對猴實施六周防疫隔離。
用0.5毫升疫苗組合物在臂上經皮下對猴進行免疫。以氯胺酮(Imalgene,Merial)輕微麻醉後，藉由穿刺自腹股溝靜脈或隱靜脈收集血液。在每次免疫之後第0天及第28天，取樣5毫升血液以評估抗體反應，但在第2天至第10天之間，取樣1毫升血液以評估病毒血症。在冰上收集血液並保存於冰上直至血清分離。為達此目的，將血液在4℃下離心20分鐘並將收集之血清保存於－80℃下直至進行測試。
病毒血症之量測藉由定量實時RP－PCR(qRT－PCR)監測疫苗接種後病毒血症。使用定位於DEN1與DEN2株之NS5基因中的兩套引物及探針來分別對VDV－1 RNA與VDV－2 RNA進行定量。使用定位於YF病毒之NS5基因中的第三套2引物及1探針來對CYD RNA進行定量。最後，使用定位於E(DEN)/NS1(YF)基因連接處的對各種CYD血清型特異的4套引物及探針來對YF NS5 RNA呈陽性之樣品中的血清型進行鑒定(參見表I)。對7種在T7啟動子控制下並含有各PCR靶向區域的質粒實施體外轉錄以產生一系列可納入各RT－PCR測定法中作為內標之合成的RNA。藉由分光光度測定法測定該等合成的RNA，並將所獲得RNA量轉換成RNA拷貝數並表示為GEQ(基因組同等物)。
使用Macherey Nagel "Nucleospin 96 virusTM " RNA提取套組根據生產商說明書對0.140毫升猴血清實施提取，並隨後用0.140毫升(先0.090毫升，再0.05毫升)不含RNase的水對經純化的RNA實施洗脫。為避免重複冷凍/融化循環，在提取之後立即對5微升該RNA製備物實施第一次定量。剩餘體積於70℃下實施凍結。
除"Qiagen QauntitectTM 探針"RT－PCR定量套組(Qiagen)之組份外，反應混合物亦包含10皮莫耳各引物、4皮莫耳各探針及5微升RNA，總體積為25微升。倘若係待測RNA，則將5微升經純化的製備物不經先前稀釋步驟而直接加入反應混合物中。用不含RNAse的水將合成的RNA稀釋至1/10，並對在5微升中包含大約10至106 GEQ的7份稀釋物進行平行定量以產生標準曲線。
在Applied Biosystem ABIPrism 700TM 裝置中使用以下程序實施定量反應：50℃/30分鐘、95℃/15分鐘，隨後40個95℃/15秒－60℃/60秒循環。
根據PCR之目標(標準偏差：＋/－ 0.3 log10 )，在該測試中病毒RNA之定量限為2.9至3.3 log10 GEQ/毫升(800至2000 GEQ/毫升；4至10 GEQ/反應)。
在測定同時，藉由對添加有已知量用於免疫之病毒感染粒子(CYD或VDV)的0.140毫升陰性猴血清樣品(DO)進行分析建立感染滴度與病毒RNA定量之間的相關性。以在5微升中包含約1 PFU與約100 PFU(分別為2.3與4.3 log10 PFU/毫升)之2種稀釋度製備該等對照血清。
在該等實例所用測試中，GEQ與PFU間之相關性如下：對YF或CYD呈陽性血清之GEQ/PFU比率為2.7 log10 (即：1 PFU＝500 GEQ)。對於VDV1或VDV2呈陽性血清之GEQ/PFU比率為2.5 log10 (即：1 PFU＝320 GEQ)。
對於qRT－PCR YF及CYD，定量限為<3.3 log10 GEQ/毫升(即：<4 PFU/毫升)且對於qRT－PCR VDV1及VDV2，為<2.9 log10 GEQ/毫升(亦即：<2.5 PFU/毫升)。
所使用之引物及探針於下表1中給出，其中按順序列出用於各測定中之正義與反義引物及探針。
中和抗體之量測(血清中和測試)(SN50)通常，使用PRNT50(50% PFU數量減少中和測試法)建立登革熱抗體量測。由於該測試很費力且使用許多材料，因此吾人研發了SN50測試，其係基於在CCID50測試中所量測之單元數50%減少。
在96孔板中，將0.120毫升各去補體血清添加至每孔0.480毫升稀釋劑(ISCOVE 4% FCS)中。藉由將0.150毫升血清轉移至0.450毫升稀釋劑中製備6倍系列稀釋物。將450微升2.7 log10 CCID50/毫升之有效稀釋物添加至各孔中以獲得25 CCID50/孔。將板在37℃下培育1小時。隨後將0.1毫升各稀釋物分散至96孔板的6個孔中，在開始實驗之前3天時已將存於包含4% FCS之ISCOVE培養基中的VERO細胞以密度8000細胞/孔接種於該96孔板中。在37℃下培育6天後，在5% CO2 存在下，將細胞用乙醇/丙酮(70/30)混合物於4℃下固定15分鐘，且隨後以PBS洗滌3次並在0.05毫升1/2000之抗黃病毒單株抗體(mAb 4G2)稀釋物存在下於37℃下培育1小時。然後將板洗滌兩次並在0.05毫升1/1000之鹼性磷酸鹽結合的抗鼠IgG稀釋物存在下於37℃中培育1小時。藉由添加0.05毫升有色基質BCIP/NBT可顯現溶解斑。使用下面所定義之Karber公式計算中和抗體滴度：log10 SN50＝d＋f/N(X＋N/2),其中：d代表導致100%中和(亦即6個陰性複製品，即顯示無感染跡象之複製品)之稀釋度f：代表以log10 表示的稀釋因子(例如稀釋因子為1：4，則f＝0.6)N：代表複製品數/稀釋度(N＝6)X：顯示無感染跡象之總孔數，除稀釋度d外
病毒檢測限為10 SN50(亦即1.0 log10 SN50)。
用於中和的病毒株係DEN1 16007、DEN2 16681、DEN3 16562或DEN4 1036株。
將起始病毒稀釋物重新滴定作為對照。
SN50測試中所量測之中和滴度與在PRNT50測試中通常量測之中和滴度間之相關性為：log10 PRNT50＝log10 SN50＋0.2。
藉由計算以線性值表示的該滴度之幾何平均值來建立平均滴度(GMT)；通常為滴度小於檢測閾之樣品指定一個等於該閾值一半之值。
1.2順序免疫之評估 對2組4只年齡及體重相等之猴實施免疫(參見表2)。
使用23G1針管，在臂上經皮下以一次劑量105 CCID50 之CYD DEN1至4疫苗之各血清型實施免疫。
一次免疫(D28)及兩次免疫(D86)後所得之免疫原性結果於表3中給出。
病毒血癥結果於表4中給出。
簡言之，該等結果可總結如下：－本發明之投予方案能夠定性及定量地增強同源中和抗體反應，該反應以四價免疫獲得。
－隨CYD－3,4在不同的解剖部位同時實施二價免疫CYD－1,2，經加強免疫後可在所有猴中誘發對抗四種血清型之同源反應，僅在一隻動物中血清型3例外。
－而且，針對血清型1與4之反應在同時進行二價免疫時往往高於在單一部位進行之四價免疫。
－病毒血症(表4)主要係由CYD－4所導致，不論其係同時進行二價投予還是四價投予之後。因此，從中可推斷分離血清型不會促進血清型1、2及3病毒血症發生。
因此，實例展示本發明之免疫方法可改進疫苗用登革熱病毒之免疫原性而不會損害後者之安全性。
實例2在猴中藉由在不同的解剖部位同時注射兩種二價組合物CYD－1,4與CYD－2,3之免疫
如實例1中，在猴模型中測試病毒血症與免疫原性。在本實例中，所測試之二價組合物分別包含最大免疫原性的疫苗病毒(CYD－1,4)及最小免疫原性的疫苗病毒(CYD－2,3)。
2.1材料及方法 ：與實例1相同
2.2同時免疫之評估
對2組4只年齡及體重相等之猴實施免疫(參見表5)。
如實例1所闡述實施免疫。
表5：該等組之組成及免疫方案
一次免疫(D28)及兩次免疫(D86)後所得之免疫原性在表6中給出。
病毒血癥結果與在實例1中所獲得之彼等相似，顯示病毒血症由血清型4誘發且兩組間並無顯著差異。
結果支持實例1中所獲得之彼等並可總結如下：－投予方案能夠定性及定量地增強同源中和抗體反應，該反應以四價免疫獲得。
－隨CYD－2,3在不同的解剖部位同時實施二價免疫CYD－1,4，在加強免疫後可在所有猴中誘發對抗四種血清型之同源反應，如實例1中所見，在習用之四價組中情況並非如此。
－與實例1中已接受兩種二價CYD－1,2與CYD－3,4的猴組之彼等相比，隨免疫CYD－2,3同時實施二價免疫CYD－1,4後所觀察之抗體滴度對血清型1、2及3而言更高且對血清型4而言更低，此顯示反應在4種血清型間得到更好的平衡，而血清型4較不佔優勢。
－在此一免疫方案中，自其他血清型中分離佔優勢之血清型能夠得到4種血清型間之平衡反應。
因此，上述二實例展示本發明之免疫方法可改進疫苗用登革熱病毒之免疫原性而不會損害後者之安全性，如同藉由量測病毒血症所評估的一樣。
<110> 法商賽諾菲巴斯德公司<120> 對抗4種登革熱血清型之免疫方法<140> TW096135167 <141> 2007－09－20 <150> FR0608660 <151> 2006－10－14 <160> 2 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 10735 <212> DNA <213> 登革熱病毒<400> 1 <210> 2 <211> 10735 <212> DNA <213> 登革熱病毒<400> 2

Claims (11)

  1. 一種疫苗用登革熱病毒劑之用途，其係用於製備用以誘發對抗4種登革熱血清型保護力之疫苗，包括：(a)第一系列投予(i)二價劑之第一種血清型疫苗用登革熱病毒及第二種血清型疫苗用登革熱病毒；及(ii)二價劑之第三種血清型疫苗用登革熱病毒及第四種血清型疫苗用登革熱病毒，及(b)第二系列投予(i)及(ii)劑，其中該(a)及(b)二系列之(i)及(ii)劑係在不同解剖部位同時投予，及其中第二系列係在第一系列之後至少30天至最多12個月實施，及其中(i)劑中的第一種及第二種血清型疫苗用登革熱病毒；及(ii)劑中的第三種及第四種血清型疫苗用登革熱病毒係分別如下：-(i)血清型1與2；(ii)血清型3與4；-(i)血清型1與3；(ii)血清型2與4；-(i)血清型1與4；(ii)血清型2與3；-(i)血清型2與3；(ii)血清型1與4；-(i)血清型2與4；(ii)血清型1與3；或-(i)血清型3與4；(ii)血清型1與2。
  2. 如請求項1之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自由Vero衍生之登革熱病毒血清型1(Vero-derived Dengue Virus 1；簡稱VDV1)及ChimerivaxTM DEN-1組成之群的 疫苗用登革熱病毒血清型1。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自由Vero衍生之登革熱病毒血清型2(Vero-derived Dengue Virus 2；簡稱VDV2)及ChimerivaxTM DEN-2組成之群的疫苗用登革熱病毒血清型2。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自VDV1株之疫苗用登革熱病毒血清型1，且該疫苗用登革熱病毒係選自VDV2株之疫苗用登革熱病毒血清型2。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自ChimerivaxTM DEN-1之疫苗用登革熱病毒血清型1及該疫苗用登革熱病毒係選自ChimerivaxTM DEN-2之疫苗用登革熱病毒血清型2。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自ChimerivaxTM DEN-3之疫苗用登革熱病毒血清型3。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該疫苗用登革熱病毒係選自ChimerivaxTM DEN-4之疫苗用登革熱病毒血清型4。
  8. 如請求項1或2之用途，其中第一種及第二種血清型分別係CYD DEN-1及CYD DEN-2，且第三種及第四種血清型分別係CYD DEN-3及CYD DEN-4。
  9. 如請求項1或2之用途，其中該選自由疫苗用登革熱病毒血清型1、2、3及4組成之群的疫苗用登革熱病毒之量為103 至106 CCID50 之範圍。
  10. 如請求項1或2之用途，其中用於第二系列投予之疫苗用登革熱病毒與用於第一系列投予之彼等相同。
  11. 如請求項1或2之用途，其中第二系列投予係在第一系列投予後30天至60天實施。
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