JP5295956B2 - ４種のデング熱血清型に対する免疫付与の方法 - Google Patents

Description

本発明は患者における４種の血清型に対する相同的な防御を誘導するための方法に関し、（ｉ）第１血清型デング熱ウイルスワクチンの投与量および第２血清型デング熱ウイルスワクチンの投与量の、および（ｉｉ）第３血清型デング熱ウイルスワクチンの投与量および第４血清型デング熱ウイルスワクチンの投与量を患者へ逐次投与することを含み、ここで、ワクチンデングウイルス（ｉ）の投与の後に、ワクチンデングウイルス（ｉｉ）が少なくとも３０日以上および最大で１年以内に投与される方法に関する。

デングウイルス疾患は、フラビウイルス属の４種の血清型ウイルスによって引き起こされ、この血清型は似ているけれども抗原性の観点で異なる（Ｇｕｂｌｅｒら．，１９８８：節足動物媒介性ウイルス疾患の疫学．Ｍｏｎａｔｈ ＴＰＭ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：２２３−６０；Ｋａｕｔｎｅｒら．，１９９７，Ｊ．ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら．，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７；Ｖａｕｇｈｎら．，１９９７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ；１７６：３２２−３０）。デング熱血清型の感染により非特異性ウイルス症候群から致死的であり重篤な出血性疾患までさまざまな臨床疾患が引き起こされ得る。蚊に刺されてからデング熱の潜伏期間は、およそ４日（３日から１４日の範囲）である。デング熱は二相性の熱、頭痛、身体中の痛み、衰弱、発疹、リンパ節腫大および白血球減少症（Ｋａｕｔｎｅｒら．，１９９７，Ｊ．ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら．，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７）によって特徴付けられる。ウイルス血症期間は熱性疾患期間と同じである（Ｖａｕｇｈｎら．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．；１７６：３２２−３０）。デング熱からの回復は７ないし１０日間であるが、通常蔓延性の無力症が生じる。白血球数および血小板数の減少は共通に起こる。

出血性デング熱は、恒常性異常および血管透過性の増加によって特徴付けられる重篤な熱性疾患であり、多くの場合、重篤な内出血と合併して血液量減少および低血圧症（ショック症状を伴うデング熱）に至る恐れがある。出血性デング熱の致死率は、治療が行なわれないと１０％までにのぼるが、経験を伴う治療を行なえば、多くの場合１％となる（ＷＨＯ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８６．デング出血熱：診断，治療および制御，ｐ１−２．世界保健機関，ジュネーブ，スイス）。

通常行なわれるデング熱の検査室診断はウイルスの単離および／またはデング熱ウイルスに特異的な抗体の検出に基づくものである。

デング熱はマラリアに次いで二番目によく見られる熱帯伝染病であり、流行性伝播の危険性がある地域に住む世界人口（２０億５千万人）の半分以上にのぼる。毎年、デング熱の件数は５億から１０億と見積もられ、出血性デング熱で５０万人の患者が入院し、２万５千人が命を落としている。デング熱はアジア、太平洋領域、アフリカ、ラテンアメリカ、およびカリブ海における風土病である。１００以上の熱帯国はデング熱ウイルス感染が多く発生し、出血性デング熱はこれらの国のうち６０カ国で報告されている（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３；Ｍｏｎａｔｈ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；９１：２３９５−２４００）。よく記載される因子のいくつかはデング熱に関連しているように思われる：人口増加；特に貧困を伴う、無計画および無制御の都市化；飛行機旅行の増加；蚊の効果的な制御手段がないことおよび衛生社会基盤および公衆衛生の悪化（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３）。旅行者および国外居住者はデング熱について警告されることが多くなっている（Ｓｈｉｒｔｃｌｉｆｆｅら．，１９９８，Ｊ．Ｒｏｙ．Ｃｏｌｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｏｎｄ．；３２：２３５−２３７）。デング熱が発生する熱帯に配置された米軍の間で、デング熱は熱性疾患の主要因の一つである（ＤｅＦｒａｉｔｅｓら．，１９９４，ＭＭＷＲ １９９４；４３：８４５−８４８）。

ウイルスはヒトおよびヒトを好んで日中刺咬する国内の蚊であるネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）を含むサイクルにおいて維持される。ヒトへの感染は、感染したネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）が血液を摂取している間に、ウイルスの注入により為される。唾液中のウイルスは主に血管外組織に沈着している。接種後に感染した細胞の第１分類は樹状細胞であり、その後リンパ節に移動する（Ｗｕら．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．；７：８１６−８２０）。皮膚およびリンパ節での最初の複製の後、ウイルスは急性の発熱期間、一般的に３から５日間、血中に現れる。

単球およびマクロファージは、樹状細胞とともに、デング熱ウイルスの最初の標的である。相同タイプの再感染に対する防御は完全であり、おそらく生涯維持されるが、多種のデング熱型での交差防御は数週間から数ヶ月しか続かない（Ｓａｂｉｎ，１９５２，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．；１：３０−５０）。したがって、患者は異なる血清型に感染し得る。二度目のデング熱感染は、理論上、重篤なデング熱疾患に発展する危険因子である。しかしながら、出血性デング熱は多因性である：これらの因子は患者の免疫状態および遺伝的素因を含むウイルス株および患者の年齢を含む。２つの因子が出血性デング熱の発症に大きな影響を与える：高ウイルス血症を伴う急速なウイルス複製（ウイルス血症のレベルに関係する疾患の重症度；Ｖａｕｇｈｎら．，２０００，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．；１８１：２−９）および炎症メディエータの高レベル放出を伴う多大な免疫反応（ＲｏｔｈｍａｎおよびＥｎｎｉｓ，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２５７：１−６）。デング熱に対する具体的な治療はない。デング熱の治療は、ベッドでの拘束、解熱剤と鎮痛剤による熱と痛みの制御、および適切な水分摂取といった対症的なものである。出血性デング熱の治療には水分の喪失に対する均衡状態を保つこと、凝固因子の交換およびヘパリン注入が必要である。

予防対策としては、現在のところベクターを制御することおよび高価で実施が困難である個人的防御策を講じることに基づいている。デング熱に対するワクチンは現時点で開発されていない。４種のデング血清型が世界中で流行することを考慮し、そして、それらが出血性デング熱を発症するものであると報告されていることから、ワクチン接種によりデング熱ウイルスの４種の血清型を防御することが理想とされる。

多種のデング熱血清型のうち異種間防御を誘導させることを目的として、逐次免疫付与戦略が以前より実施されている。

したがって、Ｐｒｉｃｅ（１９６８，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄ．，８８：３９２−３９７）は、デング熱血清型１の感染とその後に感染するデング熱血清型２の一連の２回の感染を含むデング熱に対する逐次免疫付与の方法を開示しており、これは試験においてデング熱血清型３または４を用いて防御するものであった。

Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら（１９７０，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９：９４−１０２）は、異種間免疫付与において、４種のデング熱血清型のうち２種または３種に対する連続単価感染の影響を決定しようとした。そこで、テナガザルにデング熱ウイルス血清型１、２、３、または４を感染させた。次いで異種血清型の第二感染の後に、変化しやすいウイルス血症が検出され、それは一連の感染、特に、１回目に感染した血清型に依存した。すなわち、最初に血清型２，３または４に感染したテナガザルにおいて２回目のウイルス血症が現れ、そしてその後血清型１、２または４に感染した。

Ｓｃｈｅｒｅｒら（１９７２，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄ．，９５：６７−７９）は４種のデング熱血清型のうち１種に対する第１次感染、その後に同種または異種血清型に対して続く第２次感染、さらに第３次感染を含む連続単価感染について記載した。提案されたスキームでは異種血清型の攻撃に対する完全な防御を得ることはできなかった。

Ｈａｌｓｔｅａｄら（１９７３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２２：３６５−３７４）は、サルにおける、異種デング熱血清型１ないし４による一連の２，３または４単価感染を含むデング熱に対する免疫付与の方法を評価した。連続感染に対する防御は、血清型１，２、次いで４、その後血清型３に対する防御を含む免疫付与の順番により得られると著者は結論付けた。二価免疫付与については開示も示唆もない。さらに著者は、逐次免疫付与はその複雑な性質および生じた結果のランダム性に起因すると忠告している。

Ｈａｌｓｔｅａｄら（１９７３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２２：３７５−３８１）もまた２種の異種デング熱血清型を伴う二価免疫付与は、第３デング熱血清型の感染に対して防御しないか、または部分的な防御にとどまることを発見した。

本発明において、その目的は４種のデング熱血清型に対して相同的な防御を誘導することである。二つ一組で連続して投与され、その２回目が投与されるとき、４種の血清型を中和する抗体を含む免疫応答反応を生じさせ得ることを、発明者らは実証した。

発明者らは特に、ＤＥＮ−１，２二価免疫付与の２ヶ月後に続くＤＥＮ−３，４二価免疫付与により、免疫付与されたすべてのサルにおいて、４種の血清型に対する高い応答反応が誘導されたことを示した。生じた免疫応答反応は量的そして質的に優れている（すべての血清型を網羅する）。

したがって、第1の主題によれば、本発明は、デング熱に対する逐次投与のためのワクチン組成物の組み合わせとして、（ｉ）第１血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量、および（ｉｉ）第３血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第４血清型のワクチンのデング熱ウイルスの投与量を含むワクチン組成物に関するものであり、デング熱ウイルスワクチン（ｉｉ）は、デング熱ウイルスワクチン（ｉ）の投与後、少なくとも３０日以上長くとも１年以内に投与される。

本発明に係るワクチン組成物の一つの実施態様によれば、ワクチンウイルス（ｉｉ）はワクチンウイルス（ｉ）の投与後、３０日以上３ヶ月以内に投与される。

本発明に係るワクチン組成物の他の実施態様によれば、ワクチンウイルス（ｉｉ）はワクチンウイルス（ｉ）の投与後、３０日目に投与される。

本発明に係るワクチンの組成物の他の実施態様によれば、デング熱ウイルスワクチン（ｉ）は二価ワクチン組成物の形態で投与される。

本発明に係るワクチン組成物の他の実施態様によれば、デング熱ウイルスワクチン（ｉｉ）は二価ワクチン組成物の形態で投与される。

本発明に係るワクチン組成物の一つの具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＶＤＶ１株およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ^ＴＭＤＥＮ−１からなる群より選択される。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＶＤＶ２株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭＤＥＮ−２からなる群より選択される。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＶＤＶ１株であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＶＤＶ２株である。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ^ＴＭＤＥＮ−１であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ^ＴＭＤＥＮ−２である。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型３ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ^ＴＭＤＥＮ−３である。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型４ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ^ＴＭＤＥＮ−４である。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、第１および第２血清型は、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ１およびＣＹＤ ＤＥＮ２であり、そして第３および第４血清型は、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ３およびＣＹＤ ＤＥＮ４である。

本発明に係るワクチン組成物の他の具体的な実施態様によれば、デング熱ウイルス血清型１ワクチン，２，３および４の投与量はそれぞれ１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０の範囲内である。

本発明の目的は、第１の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量を少なくとも３０日、長くても１年前に予め接種した患者に投与されるデング熱ワクチンの製造のための、第３の血清型のデング熱ウイルスワクチンと第４の血清型のデング熱ウイルスワクチンの使用である。

本発明に係る使用における他の具体的な実施態様によれば、第３および第４の血清型は二価ワクチン組成物の形態で投与される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、第１および第２の血清型は二価ワクチン組成物の形態で投与される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＶＤＶ１株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−１からなる群より選択される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＶＤＶ２株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−２からなる群より選択される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＶＤＶ１株であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＶＤＶ２株である。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型１ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−１であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−２である。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型３ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−３である。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、該デング熱ウイルス血清型４ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ ＤＥＮ−４である。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、第１および２血清型は、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ１およびＣＹＤ ＤＥＮ２であり、第３および４血清型は、それぞれ、ＣＹＤ ＤＥＮ３およびＣＹＤ ＤＥＮ４である。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、第３および４血清型は第１および２血清型の投与後３０日ないし３ヶ月までに投与される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、第３および４血清型は第１および２血清型の投与後３０日目に投与される。

本発明に係る使用の他の具体的な実施態様によれば、デング熱ウイルス血清型１ワクチン，２，３および４の投与量はそれぞれ１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０の範囲内である。

本発明を以下において詳述する。

定義
「デング熱ウイルス」または「ＤＥＮ」は陽性であり、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは５’末端にＩ型キャップを含み、３’末端にポリ−Ａテールを欠く。ゲノム構成は以下の要素を構成する：５’非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、外皮（Ｅ））および非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）、および３’ＮＣＲ。ウイルス性のゲノムＲＮＡはカプシドタンパク質と結合してヌクレオカプシドを形成する。他のフラビウイルスに関しては、ＤＥＮウイルス性ゲノムは、一つのポリタンパク質に翻訳される連続したコード領域をコードしている。

「ＶＤＶ」または「ベロデング熱ワクチン」は、霊長類および特にヒトにおける抗体の中和を誘導することを含む、特定の液性応答反応を誘導することができ、ベロ細胞に適応する弱毒化生デング熱ウイルス株を意味する。

「ＶＤＶ−１」は、ＰＤＫ細胞（ＤＥＮ−１ １６００７／ＰＤＫ１１）上で１１回継代された、野生型株ＤＥＮ−１ １６００７から得られる株であり、その後ベロ細胞で３２℃にて増幅され、そのＲＮＡを精製して、ベロ細胞にトランスフェクトされた。ＶＤＶ−１株はワクチン株ＤＥＮ−１ １６００７／ＰＤＫ１３（ＰＤＫ−プライマリードッグの腎臓細胞の１３継代）と比較して１４の追加的変異を有する。「ＬＡＶ１」とも呼ばれるＤＥＮ−１ １６００７／ＰＤＫ１３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８に記載されており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に番号Ｉ−２４８０として寄託された。ＶＤＶ−１株の完全な配列は配列番号：１に記載されている。該株は該配列から容易に再生することができる。調製方法およびＶＤＶ−１株の特徴づけは、サノフィパスツールおよびｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ および Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１３１３号に記載されている。

「ＶＤＶ−２」は、ＰＤＫ細胞（ＤＥＮ−２ １６６８１／ＰＤＫ５０）上で５０回継代された、野生型株ＤＥＮ−２ １６６８１から得られるものであり、プラーク精製され、そのＲＮＡが抽出され、精製された後、ベロ細胞にトランスフェクトされた。その後ＶＤＶ−２株は、プラーク精製およびベロ細胞上の増幅によって得られた。ＶＤＶ−２株はワクチン株ＤＥＮ−２ １６６８１／ＰＤＫ５３（ＰＤＫ細胞上の５３回継代）と比較して１０個の追加的変異と、サイレントである４つの変異を有する。「ＬＡＶ２」と呼ばれるＤＥＮ−２ １６６８１／ＰＤＫ５３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８に記載されており、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ （ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８１として寄託された。ＶＤＶ−２株の完全な配列は配列番号：２に示される。ＶＤＶ−２株は該配列から容易に再生され得る。ＶＤＶ−２の調製方法および特徴づけはサノフィパスツールおよびｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ および Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの国際出願ＰＣＴ／ＩＢ ２００６／００１５１３に記載されている。

「ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭデング熱」または「ＣＹＤ」という用語は、黄熱（ＹＦ）ウイルスの骨格からなるキメラ黄熱（ＹＦ）ウイルスを意味し、その前膜および外皮タンパク質をコードしている配列がＤＥＮウイルスの配列に置換されている。それゆえ、「ＣＹＤ−１またはＣＹＤ ＤＥＮ１」という用語は、デング熱血清型１株（ＤＥＮ−１）のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦウイルスを表すために用いられる。「ＣＹＤ−２またはＣＹＤ ＤＥＮ２」という用語はＤＥＮ−２株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦウイルスを表すために使われる。「ＣＹＤ−３またはＣＹＤ ＤＥＮ３」という用語はＤＥＮ−３株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦウイルスを表すために使われる。「ＣＹＤ−４またはＣＹＤ ＤＥＮ４」という用語はＤＥＮ−４株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦウイルスを表すために使われる。これらのＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭデング熱の調製は国際特許出願ＷＯ９８／３７９１１およびＷＯ０３／１０１３９７に詳述されており、それらはこれらを調製する方法の正確な記載のために参照される。実施例に記載されたキメラは、ＤＥＮ１ ＰＵＯ３５９、ＤＥＮ２ ＰＲ １５９、ＤＥＮ３ ＰａＨ８８１およびＤＥＮ４ ＴＶＰ ９８０株由来のｐｒＭおよびＥを用いて生成された。いずれのデング熱ウイルスも、本発明に照らしてキメラ構築のために用いられる。

好ましくは、キメラＹＦウイルスは弱毒化黄熱株ＹＦ１７Ｄ（Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｍ，およびＳｍｉｔｈ ＨＨ（１９３７）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ６５，ｐ７６７−７８６．）（ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルス）の骨格を含む。使用され得るＹＦ１７Ｄ株の例は、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−Ｖａｘ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｗｉｆｗａｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ；ＡＲＩＬＶＡＸ（商標），Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓｐｅｋｅ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標），Ｂｅｒｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＹＦ１７Ｄ−２０４ Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７，Ｘ１５０６２）；ＹＦ１７Ｄ−２０４，２３４ ＵＳ（Ｒｉｃｅら．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：７２６−７３３）、または関連株ＹＦ１７ＤＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ１７０６６），ＹＦ１７Ｄ−２１３（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ１７０６７）およびＧａｌｌｅｒら．（１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅｓ １６（９／１０）：１０２４−１０２８）によって記載されたＹＦ１７ＤＤ株を含む。ヒトに使用するために十分に弱毒化された他のいずれの黄熱ウイルス株も使用され得る。

「一価」のワクチンは単一のデングウイルス血清型を含む。「二価」のワクチンは２つの異なるデング熱ウイルス血清型を含む。「三価」のワクチンは３つの異なるデング熱ウイルス血清型を含む。「四価」のワクチンは４つの異なるデング熱ウイルス血清型を含む。

「患者」という用語は、デング熱に感染するかもしれない個人（子どもまたは大人）、特にデング熱が存在する地域に旅行に行く個人またはデング熱が存在する地域の住民など、感染の危険性がある個人を意味する。

逐次免疫付与
本発明は、２回逐次投与される二価の投与物の形態の、４種の血清型の投与により、４種の血清型に対して効果のある相同的防御を得ることを可能にすることを示す。したがって、本発明に係る方法はデング熱に対する免疫付与戦略に関してとりわけ価値がある。

したがって、本発明者は患者における４種の血清型に対する抗体応答反応の中和を誘導するための方法を提案しており、その方法は（ｉ）第１血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量、および（ｉｉ）第３血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第４血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量を該患者に逐次投与することを含み、この方法におけるデング熱ウイルスワクチン（ｉｉ）はデング熱ウイルスワクチン（ｉ）の投与後少なくとも３０日以上および長くとも３ヶ月以内に投与される。

本発明に関して、「デング熱ウイルスワクチン」という用語は、特定の相同応答反応を誘導することができるデング熱ウイルスのいずれかのウイルス形態を意味する。デング熱ウイルスワクチンは、好ましくは、デング熱ウイルスの感染に対するヒトの免疫付与プログラムに関して使われる。

したがって、「デング熱ウイルスワクチン」という用語は、不活性化されたウイルス、弱毒化ウイルス、およびデング熱ウイルスの外皮タンパク質など組換えタンパク質を意味する。ワクチンウイルスが許容細胞においてもはや複製することができない場合、それは「不活性化」されている。ワクチンウイルスをＨｕｈ−７、ベロおよび／またはＣ６／Ｃ３６細胞上で３７℃または３９℃で成長させた後、同じ培養条件下で、同じ滴定方法を用いて測定したとき、それらのウイルスが野生型の最大力価より少なくとも１０倍低ければ、ワクチンウイルスは「弱毒化」されている。

上記に示された３つの細胞型のうち少なくとも１つで成長が抑制されたことを示すワクチンウイルスは本発明に関して弱毒化されたものとみなされる。

ヒトに使用できるワクチンウイルスは市場に出すための規制要件に合致したプラスの損益比を有する。本発明に関して使用されるデング熱ウイルスワクチンはヒトに疾病を引き起こさないように好ましくは弱毒化される。有利なことに、この種のワクチンウイルスは、ワクチン接種された個人の大多数においてせいぜい中程度（すなわち、程度が中より低く、またはゼロに近い）の副作用をもたらすだけであり、同時に抗体を中和することを含む相同的な応答反応を誘導する能力が維持されている。

本発明に関して使用され得るデング熱ウイルスワクチンの限定されない例として、弱毒化株ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２、たとえば、特許出願のＷＯ０２／６６６２１、ＷＯ００／５７９０４、ＷＯ００／５７９０８、ＷＯ００／５０７９０９、ＷＯ００／５７９１０およびＷＯ０２／０９５００７５に記載された株、およびキメラなどの不活性化デング熱ウイルス、弱毒化デング熱ウイルスが言及されてもよい。キメラウイルスは以上に明記されたような弱毒化ウイルスの性質を示す。

デング熱ウイルスの外皮タンパク質を発現し、該タンパク質に由来する血清型を中和する抗体を含む免疫応答反応を誘導するいずれかのキメラウイルスが本発明に使用されてもよい。制限されない例として、たとえばＷＯ９８／３７９１１に記載されたようなＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭデング熱、そして特許出願のＷＯ９６／４０９３３およびＷＯ０１／６０８４７に記載されたデング熱／デング熱キメラの言及が為されてもよい。

デング熱ウイルス血清型１ワクチンは、たとえば、ワクチン株ＶＤＶ１またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭＤＥＮ−１、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、またはＤＥＮ−１ １６００７／ＰＤＫ１３株であり得る。デング熱ウイルス血清型２ワクチンは、たとえば、ワクチン株ＶＤＶ２またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭＤＥＮ−２、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、またはＤＥＮ−２ １６６８１／ＰＤＫ５３株であり得る。デング熱ウイルス血清型３ワクチンは、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭＤＥＮ−３、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３ウイルスであり得る。デング熱ウイルス血清型４ワクチンは、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルスであり得る。それは、「ＬＡＶ４」または「ＤＥＮ−４ １０３６／ＰＤＫ４８」株、すなわちＰＤＫ細胞上で４８回継代することによって弱毒化されたＤＥＮ−４ １０３６株であってもよい。この株はマヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８に記載され、そしてｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８３として寄託された。

各ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^ＴＭ一価デング熱ウイルスワクチン（血清型１，２，３および４）はベロ細胞上で各血清型を増幅することによって調製された。より具体的に言うと、４種ウイルスは無血清培地中の接着性ベロ細胞上で別々に生成される。濾過により細胞残屑を除去され、採取されたウイルスは、その後濃縮され、ホスト細胞のＤＮＡを除去するために限外濾過およびクロマトグラフィにより精製される。安定剤が添加された後、ワクチン株は使用するまで冷凍保蔵または凍結乾燥され、その後即座に再構築される。４種のキメラにも同じ方法が施される。

ＶＤＶ１および２株はベロ細胞上で増幅されることにより調製される。生成されたウイルスを採取し、濾過によって細胞残屑を除去して精製する。ＤＮＡは酵素処理によって消化される。不純物は限外濾過によって除去される。感染力価は濃縮方法を用いることによって上昇させることができる。安定剤添加後、株は使用するまで凍結乾燥または冷凍にて保存され、その後即座に再構築される。

多価組成物は一価の組成物を単純に混合することによって得られる。

本発明によれば、４種のデング熱血清型は、それらが二つ一組で逐次投与され、逐次投与の間隔は、３０日、４５日、６０日、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月および１年など３０日から１年までであり、有利には３０日以上３ヶ月以内、特に１から２ヶ月の期間で、任意の順序で投与され得る。したがって、本発明による方法は以下に記載された具体例にならって実施され得る：
−（ｉ）血清型１および２；（ｉｉ）血清型３および４；または
−（ｉ）血清型１および３；（ｉｉ）血清型２および４；または
−（ｉ）血清型１および４；（ｉｉ）血清型２および３；または
−（ｉ）血清型２および３；（ｉｉ）血清型１および４；または
−（ｉ）血清型２および４；（ｉｉ）血清型１および３；または
−（ｉ）血清型３および４；（ｉｉ）血清型１および２。

したがって、具体的な実施例によれば、本発明は以下のスキームを網羅する：
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−２
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−２
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＶＤＶ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−１およびＶＤＶ−２
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３
−（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−４
−（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ ＤＥＮ−２ ならびに
−（ｉ）ＣＹＤ ＤＥＮ−３およびＣＹＤ ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２。

本発明に関して、「ワクチンの投与量」という用語は、ワクチンウイルスの「免疫効果のある量」を含む組成物を意味する、すなわち、相同的に中和されている抗体応答反応を誘導するのに十分な量のウイルスの意であり、たとえば、それは実施例１に記載されるように血清中和の方法によって実証され得る。このように決定される中和抗体力価が１：１０以上またはそれに等しいとき、血清は中和抗体の存在が陽性であると考えられる。

ワクチン株の量はウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）または５０％組織培養感染投与量（ＴＣＩＤ_５０）、または５０％細胞培養感染投与量（ＣＣＩＤ_５０）の観点で一般的に表される。たとえば、本発明に係る組成物は１０から１０^６ ＣＣＩＤ_５０を含み得、特に一価または二価の組成物については、１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０のワクチンデング熱血清型１，２，３または４を含み得る。したがって、本発明に係る組成物または使用において、デング熱ウイルス血清型１ワクチン，２，３および４の投与量は、それぞれ、１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５または１０^６ＣＣＩＤ_５０など、１０から１０^６ＣＣＩＤ_５０までの範囲内が好ましく、特に、１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０までの範囲にある。ワクチンウイルスは同一または異なる投与量で使用することができ、使用されるワクチンウイルスの性質により、また得られる免疫応答反応の強度によって調節することができる。

好ましくは、相同的な中和抗体反応は長続きする、すなわち、デング熱血清型（ｉｉ）の投与から少なくとも６ヶ月後に血清中で検出することができる。

本発明に係る逐次投与において、第３と第４血清型のデング熱ウイルスワクチンは第１番目および第２血清型のデング熱ウイルスワクチン投与の後、少なくとも３０日以上およびせいぜい１２ヶ月までに投与される。

本発明によれば、たとえば、第３および第４血清型のデング熱ウイルスワクチンは、第１および第２血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与後、たとえば、３０日、４５日、６０日、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月または１年など、３０日から１年までに投与され、有利には、３０日から３ヶ月まで、特に１から２ヶ月後に投与される。

第１血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量は、２つの一価組成物の形態で、あるいは単一の二価組成物の形態で、同時に投与される。

同様に、第３血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第４血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量は同時に投与される。たとえば、第３および第４血清型は、２つの一価ワクチン組成物の形態、あるいは単一の二価ワクチン組成物を単一の形態で、同時に投与され得る。

ワクチンウイルスは当該技術分野の当業者に知られたいずれかの方法に従って調製され得るワクチン組成物の形態で投与される。通常、一般的に凍結乾燥された形態のウイルスは、水またはリン酸緩衝生理食塩水などの医薬上許容され得る賦形剤、湿潤剤または安定剤と混合される。「医薬上許容され得る賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物においてたとえばアレルギー反応など副反応を誘発しない、溶媒、分散媒、充填剤などを意味する。賦形剤は選択された医薬上の形態、ならびに方法および投与経路によって選択される。適切な賦形剤および医薬上の形態の観点からの必要事項は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」に記載されており、これは当該分野の参考文献を代表する。

好ましくは、ワクチン組成物は注射可能な形態で調製され、溶液、懸濁液、エマルジョンに対応することができる。該組成物は特にｐＨをおよそ６および９（大気温度にてｐＨメーターを用いて決定する）に維持するために緩衝水溶液を含むことができる。

免疫賦活剤を必ず添加するべきであるわけではないけれども、この組成物は、ワクチン株を同時に投与することにより誘導される細胞性またはヒトの免疫応答反応を上昇させ、刺激し、強化するような組成物を含むことができる。当該分野の当業者は本発明に関して適当と思われる賦形剤をワクチン分野で従来使用されている賦形剤から選択することができる。

本発明によるワクチン組成物は、たとえば、非経口（特に内皮に、皮下に、筋肉内に）など、通常のいかなる経路で投与することができる。好ましくは、ワクチン組成物は三角筋部の皮下に投与される注射可能な組成物である。

投与される組成物の量は投与される経路に依存する。皮下注射では、その量は一般的に０．１から１．０ｍｌの間、好ましくはおよそ０．５ｍｌである。

第１および第２血清型、または血清型１から４のすべての最適投与期間は、デング熱ウイルスへの暴露前およそ１から３ヶ月である。ワクチンは大人および子どものデング熱ウイルスに対する感染の予防措置として投与され得る。したがって、対象に投薬を受けていない（すなわち以前に免疫されていない）人またはデング熱ウイルスに感染した人を含む。

デング熱ウイルス血清型１から４のワクチンの追加免疫投与は、第３および第４血清型投与後、たとえば、６ヶ月から１０年の間、つまり、６ヶ月、１年、３年、５年または１０年の間をあけて行なわれる。

本発明は、４種の異なる血清型の４つのデング熱ウイルスワクチンを含む免疫付与キットを提供し、該キットにおいて、各血清型がワクチン投与量の形態で存在する、または少なくとも２種または４種の血清型が二価組成物の形態で存在する。

好ましいワクチン投与量あるいは一価または二価組成物あるいは具体例の説明に関して、本発明による免疫方法に関する記載の一節を参照してもよい。

本発明を以下の実施例により説明する。

実施例

サルにおける逐次免疫付与
ウイルス血症および免疫原性についてサルをモデルとして試験した。特にウイルス血症はヒトにおける毒性および疾患の重症度に関する要因の一つとして認識されるため、それを考慮して重要なパラメーターとした。一方、免疫原性は防御評価に関して鍵となるパラメーターである。

１．１ 材料および方法：
サルの実験は欧州指針にしたがって行なわれた。モーリタニア由来のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を用いて免疫付与を行なった。サルは免疫付与の前に６週間隔離された。

サルの腕の皮下にワクチン組成物０．５ｍｌを接種して、免疫を付与した。ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ，Ｍｅｒｉａｌ）で浅麻酔させた後、鼠径部または伏在静脈から穿刺して血液を採取した。０日目と２８日目に抗体応答反応を評価するために血液５ｍｌを採取し、一方２日目から１０日目の間、ウイルス血症を評価するために血液１ｍｌを採取した。血清が分離するまで血液を氷上に集めて、氷上で保管した。実施するために、血液を４℃で２０分間遠心分離し、回収した血清を試験まで−８０℃で保管した。

ウイルス血症の測定
ワクチン接種後のウイルス血症を定量リアルタイウムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりモニターした。ＤＥＮ１およびＤＥＮ２のＮＳ５遺伝子に位置するプライマーおよびプローブの２組のセットをＶＤＶ−１ ＲＮＡおよびＶＤＶ−２ ＲＮＡの定量にそれぞれ用いた。ＹＦウイルスのＮＳ５遺伝子に位置するプライマーおよびプローブの第３セットをＣＹＤ ＲＮＡを定量するために用いた。最後に、ＹＦ ＮＳ５ ＲＮＡ陽性サンプルにおける血清型を同定するために、Ｅ（ＤＥＮ）／ＮＳ１（ＹＦ）遺伝子の接合点に位置する各種血清型に特異的なプライマーおよびプローブの４つのセットを使用した（表１参照）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイの内部基準として含まれる一連の合成ＲＮＡを産生するために、各ＰＣＲによって標的とされた領域を含む７つのプラスミドを、Ｔ７プロモーターの制御下でインビトロにおいて転写した。これらの合成ＲＮＡを分光分析により測定し、得られたＲＮＡ量をＲＮＡコピー数に変換し、ＧＥＱ（ゲノム等量）として表した。

Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ“Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６ウイルス^ＴＭ”ＲＮＡ抽出キットを用いて、手順にしたがってサル血清０．１４０ｍｌを抽出し、その後生成されたＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含まない自由水（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）０．１４０ｍｌ（０．０９０ｍｌ、次いで０．０５ｍｌ）にて溶出した。冷凍と解凍の繰り返しを避けるために、抽出後即座に、ＲＮＡ調合液５μｌで最初の定量をおこなった。残りは７０℃で冷凍した。

反応混合物は、“Ｑｉａｇｅｎ Ｑａｕｎｔｉｔｅｃｔ^ＴＭプローブ”ＲＴ−ＰＣＲ定量キット（Ｑｉａｇｅｎ）の成分に加えて、各プライマー１０ピコモル、各プローブ４ピコモルおよびＲＮＡ５μｌを含んで、合計２５μｌとした。試験されるＲＮＡにおいて、生成された調合液５μｌを、予め希釈することなく反応混合物に直接入れた。リボヌクレアーゼを含まない自由水で合成ＲＮＡを１／１０に希釈し、５μｌ中およそ１０から１０６ＧＥＱを含む７つの希釈液を、検量線を書くために平行して定量した。

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＡＢＩＰｒｉｓｍ ７００^ＴＭ を用いて、以下のプログラムにて定量化反応を行なった：５０℃／３０分、９５℃／１５分、次いで９５℃／１５秒−６０℃／６０秒を４０サイクル。

試験におけるウイルス性ＲＮＡの定量限界はＰＣＲ対象（標準偏差：＋／−０．３ｌｏｇ_１０）によって２．９から３．３ｌｏｇ_１０ＧＥＱ／ｍｌ（８００から２０００ＧＥＱ／ｍｌ；４から１０ＧＥＱ／反応）である。

感染力価とウイルス性ＲＮＡ定量化との相関関係を、免疫付与（ＣＹＤまたはＶＤＶ）に使用される既知量のウイルスの感染粒子が添加された、０．１４０ｍｌのネガティブなサルの血清試料（ＤＯ）を分析することにより、アッセイと平行して確立した。前記対照血清を、５μｌ中およそ１ＰＦＵと１００ＰＦＵ（それぞれ２．３および４．３ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ）を含む２つの希釈率にて調製した。

使用されるプライマーとプローブを以下の表１に示す。表中、センスおよびアンチセンスプライマーならびにプローブを、各アッセイにつき順に示す。

中和抗体測定（血清中和反応試験）（ＳＮ５０）。

慣用的に、デング熱抗体測定はＰＲＮＴ_５０（５０％ＰＦＵ数減少中和試験）試験を用いて確立される。この試験は多くの時間と労力を費やし、多くの試料を使用することから、我々はＣＣＩＤ_５０試験により測定されたユニットの数値の５０％減少に基づいてＳＮ５０試験を開発した。

９６ウェルプレートにおいて、補体除去された血清０．１２０ｍｌを各ウェルの希釈液（ＩＳＣＯＶＥ ４％ ＦＣＳ）０．４８０ｍｌに加える。血清０．１５０ｍｌを希釈液０．４５０ｍｌに入れることで６倍連続希釈液を調製する。２５ＣＣＩＤ_５０／ウェルを得るために各ウェルに２．７ｌｏｇ_１０ＣＣＩＤ_５０／ｍｌでのウイルス希釈液４５０μｌを加える。プレートは３７℃にて１時間インキュベートする。次いで各希釈液１００μｌを、実験開始３日前に４％ＦＣＳを含むＩＳＣＯＶＥ１００μｌ中８０００細胞／ウェルの濃度でベロ細胞が播種されている９６ウェルプレート中の６ウェルに分配する。６日間、３７℃でインキュベートした後、５％ＣＯ_２存在中、エタノール／アセトン（７０／３０）混合液を用いて４℃、１５分にて細胞を固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄して、抗フラビウイルスモノクローナル抗体（ｍＡｂ４Ｇ２）の１／２０００希釈液５０μｌ中で３７℃にて１時間インキュベートする。その後、プレートを２回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼが接合された抗マウスＩｇＧの１／１０００希釈液５０μｌの存在下で３７℃、１時間でインキュベートする。着色された基質５０μｌを加えることで溶菌プラークを視覚化する：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ。抗体力価の中和を以下に示されるカルバーの公式（Ｋａｒｂｅｒ ｆｏｒｍｕｌａ）を用いて算出する：
式
ｌｏｇ_１０ＳＮ５０＝ｄ＋ｆ／Ｎ（Ｘ＋Ｎ／２），
式中、
ｄは１００％中和（すなわち６つの陰性複製物、すなわち感染の徴候を示さない複製物）を生じさせる希釈率であり、
ｆはｌｏｇ１０で示される希釈率であり（たとえば、１：４の希釈率なら、ｆ＝０．６）、
Ｎは複製物／希釈率の数であり（Ｎ＝６）、
Ｘは感染の徴候を示さないウェルの合計数、ただし希釈率ｄを除く、
ウイルス検出限界は１０ＳＮ５０（すなわち１．０ｌｏｇ_１０ＳＮ５０）である。

中和に用いられたウイルス性株はＤＥＮ１ １６００７、ＤＥＮ２ １６６８１、ＤＥＮ３ １６５６２またはＤＥＮ４ １０３６株である。

対照に関して、最初のウイルス希釈を再滴定した。

ＳＮ５０試験で測定される中和力価とＰＲＮＴ５０試験で通常測定される中和力価との相関関係は以下である：
式
ｌｏｇ_１０ＰＲＮＴ５０＝ｌｏｇ_１０ＳＮ５０＋０．２

平均力価（ＧＭＴ）は一次数値として表される相乗平均を算出することによって確立される；力価が検出閾値より低い試料は、慣例によりこの閾値の半分の値が割り当てられる。

１．２ 逐次免疫付与の評価
年齢および体重の等しい１群４匹、計３群を免疫付与した（表２参照）。

ＣＹＤ ＤＥＮ１から４までのワクチンに対応する各血清型を１０^５ ＣＣＩＤ_５０ の投与量で、２３Ｇ１針を用いて腕の皮下に接種した。ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２を３．９６ｌｏｇ_１０および４．８４ｌｏｇ_１０の投与量でそれぞれ注射した。

各群の組成物と免疫付与プロトコル

１回免疫付与（Ｄ２８）と２回免疫付与（Ｄ８４）の後に得られた免疫原性の結果を表３に示す。
ウイルス血症の結果を表４に示す。

ＳＮ５０中和力価

ウイルス血症力価

ＧＥＱとＰＦＵとの相関関係
ＹＦまたはＣＹＤについて血清陽性の場合２．７ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝５００ＧＥＱ）のＧＥＱ／ＰＦＵ比
ＶＤＶ１またはＶＤＶ２について血清陽性の場合２．５ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝３２０ＧＥＱ）ＧＥＱ／ＰＦＵ比
定量限界
ＹＦおよびＣＹＤについてｑＲＴ−ＰＣＲの場合 ＜３．３ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜４ＰＦＵ／ｍｌ）
ＶＤＶ１およびＶＤＶ２についてｑＲＴ−ＰＣＲの場合 ＜２．９ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜２．５ＰＦＵ／ｍｌ）

簡単に、結果を以下のようにまとめることができる：
本発明による投与方法により、四価の免疫付与に伴って得られる、相同的に中和する抗体応答反応を、定性的かつ定量的に増加させることができる。
すべてのサルにおいて、二価免疫付与ＣＹＤ−１，２の２ヶ月後に行なわれる免疫付与ＣＹＤ−３，４は、４種の血清型に対して高い相同的応答を誘導する。同様に、同じ応答がＶＤＶ−１，２とそれに続いて行なわれるＣＹＤ−３，４の投与の後にも見られた。
顕著な結果は、最初の免疫付与の後、ＣＹＤ−１，２によって誘導される応答反応に対するＣＹＤ−３，４血清型の強い刺激性の効果である。相同だけでなく異種における中和される抗体応答反応の上昇は注目されるべきものである。この現象は、免疫優性ではなく、抗Ｅ応答反応における抗−ＮＳ−黄熱応答反応の正のヘルパー的効果によって説明することができるであろう。交差反応性を伴うＥエピトープもまた役割を担うかもしれない。逆説的に、最初の免疫付与（ここで、３）の後に誘導される優勢Ｅ応答反応が追加免疫される限りにおいて、この刺激性の効果は四価追加免疫の後に観察されない。
ウイルス血症（表４）はＣＹＤワクチンの場合、ＣＹＤ−４によって優勢的に引き起こされ、２回の二価逐次投与と１回の四価投与との間に差異は見られない（群２対群３）。したがって、２回の二価免疫付与と１回の四価免疫付与後の安全面における差異はないと予想される。低いウイルス血症傾向は本発明によるワクチンスキームにむしろ見られる；たとえば、群２と群３との比較を参照。

サルにおける逐次免疫付与は１ヶ月間隔で行なわれた。ＣＹＤ−１，２に続いて行なわれるＣＹＤ−３，４とＣＹＤ−２，３に続いて行なわれるＣＹＤ−１，４のスキームの比較
ウイルス血症および免疫原性を前記実施例のようにサルをモデルとして試験した。２回の免疫付与の間隔を、前記実施例で２ヶ月間隔としたことに対して、本実施例では１ヶ月間隔とした。少なくともサルにおいて免疫原性（ＣＹＤ−２，３）である、２種のワクチンウイルスを用いて接種される最初の免疫付与に続いて、２種の免疫原性ワクチンウイルス（ＣＹＤ−１，４）の投与が行なわれる。

２．１ 材料および方法：実施例１と同じ

２．２ １ヶ月間隔における逐次免疫付与の評価
年齢および体重の等しい１群４匹、計３群を免疫付与した（表５参照）。

上記のように、ＣＹＤ ＤＥＮ１から４までのワクチンウイルスに対応する各血清型を１０^５ ＣＣＩＤ_５０ の投与量で、２３Ｇ１針を用いて腕の皮下に接種した。

各群の構成と免疫付与プロトコル

１回免疫付与（Ｄ２８）と２回免疫付与（Ｄ５６）の後に得られた免疫原性の結果を表６に示す。

ウイルス血症の結果は実施例１の結果と同じであり、ＣＹＤ４によって誘導されるウイルス血症は弱く、各群間の重大な相違はないことを示した。

ＳＮ５０

簡単に、結果は、実施例１で得られたものを補足し、以下のようにまとめることができる：
本発明による投与方法により、２回の免疫付与が１ヶ月間隔で行なわれるとき、その四価の免疫付与に伴って得られる、相同的に中和する抗体応答反応を、定性的に、定量的に増加させることができる。
すべてのサルにおいて、二価免疫付与ＣＹＤ−１，２の２ヶ月後に行なわれる免疫付与ＣＹＤ−３，４（群２）は、４種の血清型に対して高い相同的応答を誘導し、血清型１および４が優勢である。
この群において、２回目の投与が実施例１に示されるように２ヶ月間隔で行なわれたときより、１ヶ月間隔で行なわれたときのほうが、血清型１および２における追加免疫効果は低かった。
免疫原性の低い血清型（ＣＹＤ−２，３）から免疫付与を開始し、もっとも強い血清型（ＣＹＤ−１，４）にて追加免疫が与えられたとき、応答のバランスはより良いものであり、血清型１および４はあまり優勢でない（群３）。
これらの結果は、実施例１で得られた結果を支持するもので、最初の免疫投与の１ヶ月後に追加免疫されたときのように、２回にわけて二価を逐次投与する免疫付加は、すべての動物におけるすべての血清型に対して応答反応を誘導するのに効果があったことが示される。

Claims (22)

1. 逐次投与のための（ｉ）第１の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量を含む二価組成物、および（ｉｉ）第３の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第４の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量を含む二価組成物を、使用説明書と共に含むデング熱に対する免疫付与キットであって、二価組成物（ｉｉ）は、二価組成物（ｉ）の投与後、少なくとも３０日以上長くとも１年以内に投与され；ここで該第１、第２、第３、および第４の血清型はそれぞれ、
   −血清型１，２，３および４；
   −血清型１，３，２および４；
   −血清型１，４，２および３；
   −血清型２，３，１および４；
   −血清型２，４，１および３；または
   −血清型３，４，１および２；
   である、キット。
2. 二価組成物（ｉｉ）が二価組成物（ｉ）の投与後３０日以上から３ヶ月以内に投与される、請求項１に記載のキット。
3. 該デング熱ウイルス血清型１ワクチンがＶＤＶ１株およびＣＹＤ ＤＥＮ−１からなる群より選択される、請求項１または２に記載のキット。
4. 該デング熱ウイルス血清型２ワクチンがＶＤＶ２株およびＣＹＤ ＤＥＮ−２からなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載のキット。
5. 該デング熱ウイルス血清型１ワクチンがＶＤＶ１株であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンがＶＤＶ２株である、請求項１ないし４のいずれかに記載のキット。
6. 該デング熱ウイルス血清型１ワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−１であり、該デング熱ウイルス血清型２ワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−２である、請求項１ないし４のいずれかに記載のキット。
7. 該デング熱ウイルス血清型３ワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−３である、請求項１ないし６のいずれかに記載のキット。
8. 該デング熱ウイルス血清型４ワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−４である、請求項１ないし７のいずれかに記載のキット。
9. 第１および第２の血清型が、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ１およびＣＹＤ ＤＥＮ２であり、ならびに第３および第４の血清型が、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ３およびＣＹＤ ＤＥＮ４である、請求項１ないし４および６ないし８のいずれかに記載のキット。
10. 二価組成物（ｉｉ）が二価組成物（ｉ）の投与後３０日目に投与される、請求項１ないし９のいずれかに記載のキット。
11. デング熱ウイルス血清型１，２，３および４のワクチンが、それぞれ１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０までの範囲内である、請求項１ないし１０のいずれかに記載のキット。
12. 少なくとも３０日、長くとも１年前に、二価組成物の形態で第１の血清型のデング熱ウイルスワクチンの投与量および第２の血清型の投与量を受けた患者に投与されることを目的とした二価デング熱ワクチンの製造のための、第３の血清型のデング熱ウイルスワクチンおよび第４の血清型のデング熱ウイルスワクチンの使用であって；ここで該第１、第２、第３、および第４の血清型はそれぞれ、
    −血清型１，２，３および４；
    −血清型１，３，２および４；
    −血清型１，４，２および３；
    −血清型２，３，１および４；
    −血清型２，４，１および３；または
    −血清型３，４，１および２；
    である、使用。
13. 該デング熱ウイルス血清型１のワクチンがＶＤＶ１株およびＣＹＤ ＤＥＮ−１からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
14. 該デング熱ウイルス血清型２のワクチンがＶＤＶ２株およびＣＹＤ ＤＥＮ−２からなる群より選択される、請求項１２または１３に記載の使用。
15. 該デング熱ウイルス血清型１のワクチンがＶＤＶ１株であり、該デング熱ウイルス血清型２のワクチンがＶＤＶ２株である、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の使用。
16. デング熱ウイルス血清型１のワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−１であり、デング熱ウイルス血清型２のワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−２である、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の使用。
17. 該デング熱ウイルス血清型３のワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−３である、請求項１２ないし１６のいずれかに記載の使用。
18. 該デング熱ウイルス血清型４のワクチンがＣＹＤ ＤＥＮ−４である、請求項１２ないし１７のいずれかに記載の使用。
19. 第１および第２の血清型が、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ１およびＣＹＤ ＤＥＮ２であり、第３および第４の血清型が、それぞれＣＹＤ ＤＥＮ３およびＣＹＤ ＤＥＮ４である、請求項１２ないし１４および１６ないし１８のいずれかに記載の使用。
20. 二価デング熱ワクチンが第１および第２の血清型の投与後３０日以上３ヶ月以内に投与されるものである、請求項１２ないし１９のいずれかに記載の使用。
21. 二価デング熱ワクチンが第１および第２の血清型の投与後３０日目に投与されるものである、請求項２０に記載の使用。
22. デング熱ウイルス血清型１，２，３および４のワクチンの投与量がそれぞれ１０^３から１０^５ＣＣＩＤ_５０ までの範囲内である、請求項１２ないし１９のいずれかに記載の使用。