WO2008007021A1 - Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue - Google Patents

Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue Download PDF

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WO2008007021A1
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den
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Bruno Guy
Véronique BARBAN
Rémi FORRAT
Jean Lang
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Sanofi Pasteur
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the subject of the invention is a method for inducing homologous protection against the four serotypes of dengue in a patient, comprising sequentially administering to said patient (i) a dose of a dengue vaccine virus. a first serotype and a dose of a vaccine virus dengue a second serotype, and (ii) a dose of a vaccine virus dengue a third serotype and a dose of a dengue vaccine virus of a fourth serotype, in which the dengue vaccine viruses (ii) are administered at least 30 days and at most 1 year after administration of the dengue vaccine viruses (i).
  • Dengue diseases are caused by four closely related, but antigenically distinct, flavivirus-like viruses of the serotype type (G ⁇ bler et al., 1988 In: Epidemiology of arthropod-terminal viral disease.) Monath TPM, editor, Boca Raton (FL) ): CRC Press: 223-60, Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131: 516-524, Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet, 352: 971 -977, Vaughn et al., 1997 J Infect Dis; 176: 322-30). Infection with a dengue serotype can produce a spectrum of clinical illness ranging from nonspecific viral syndrome to fatal severe haemorrhagic disease.
  • the incubation period of dengue fever after mosquito bite is about 4 days (ranging from 3 to 14 days).
  • Dengue fever is characterized by biphasic fever, headache, pain in various parts of the body, prostration, rash, lymphadenopathy and leukopenia (Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131: 516 Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet, 352: 971-977).
  • the viremic period is the same as for febrile diseases (Vaughn et al., 1997, J. Infect Dis, 176: 322-30).
  • the cure of dengue fever is acquired after 7 to 10 days, but prolonged asthenia is usual. Decreases in leukocyte and platelet count are common.
  • Dengue haemorrhagic fever is a severe febrile illness characterized by abnormalities of homeostasis and an increase in vascular permeability that can lead to hypovolemia and hypotension (dengue with shock syndrome) often complicated by internal bleeding. severe.
  • the mortality rate of dengue haemorrhagic fever can reach up to 10% without therapy, but is 1% in most centers with therapeutic experience (WHO technical guide, 1986. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment and control, p1 -2 World Health Organization, Geneva, Switzerland).
  • Routine laboratory diagnosis of dengue fever is based on virus isolation and / or detection of dengue virus specific antibodies.
  • Dengue is the second most important tropical infectious disease after malaria, with more than half of the world's population (2.5 billion) living in areas at risk of epidemic transmission. Each year, dengue cases are estimated at 50-100 million, cases of patients hospitalized for dengue haemorrhagic at 500 000, and the number of deaths at 25 000. Dengue is endemic in Asia, the Pacific, Africa , in Latin America and the Caribbean. More than 100 tropical countries are endemic for dengue virus and dengue haemorrhagic infections have been documented in 60 of these countries (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103, Monath, 1994, Proc Natl Acad Sci 91: 2395-2400).
  • dengue fever A number of well-described factors appear to be involved in dengue fever: population growth; unplanned and uncontrolled urbanization, especially in association with poverty; an increase in air travel; lack of effective mosquito control and deterioration of health and public health infrastructure (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103). Travelers and expatriates are increasingly alerted to dengue fever (Shirtcliffe et al., 1998, J. Roy, Phys Phys., London, 32: 235-237). Dengue fever has been a leading cause of febrile illness in US troops during deployments in tropical areas endemic for dengue fever (DeFraites et al., 1994, MMWR 1994; 43: 845-848). The viruses are kept in a cycle that involves humans and
  • Aedes aegypti a domestic mosquito piquing the day, who prefers to feed on humans. Infection in humans is initiated by injecting the virus during the blood meal of an infected Aedes aegypti mosquito.
  • the virus Salivary is deposited mainly in extravascular tissues.
  • the first class of infected cells after inoculation are the dendritic cells, which then migrate to the lymph nodes (Wu et al., 2000, Nature Med., 7: 816-820). After initial replication in the skin and in the lymph nodes, the virus appears in the blood during the acute febrile phase, usually for 3-5 days.
  • Monocytes and macrophages are, along with dendritic cells, among the first targets of the dengue virus. Protection against homotypic reinfection is complete and probably lasts a lifetime, but cross-protection between different types of dengue lasts less than a few weeks to a few months (Sabin, 1952, Am. J. Trop., Med Hyg .; : 30-50). As a result, a subject may be infected with a different serotype. A second dengue infection is theoretically a risk factor for developing severe dengue fever. However, dengue haemorrhagic fever is multifactorial: these factors include the strain of the virus involved, as well as the age, immune status, and genetic predisposition of the patient.
  • dengue haemorrhagic fever Two factors play a major role in the occurrence of dengue haemorrhagic fever: rapid viral replication with high viremia (the severity of the disease being associated with the level of viremia, Vaughn et al., 2000, J. Dis. 181: 2-9) and a significant inflammatory response with the release of elevated levels of inflammatory mediators (Rothman and Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6).
  • the treatment of dengue fever is symptomatic with bed rest, fever and pain control with antipyretics and analgesics, and adequate drinking.
  • Treatment of dengue haemorrhagic fever requires the balancing of fluid loss, replacement of clotting factors and heparin infusion.
  • Price (1968, Am. J. Epid., 88: 392-397) described a method of sequential immunization against dengue including a series of two infections with dengue serotype 1 and then with dengue serotype 2 which conferred a protection in a challenge test with dengue serotype 3 or 4.
  • the objective is to induce homologous protection against the four serotypes of dengue fever.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to generate an immune response comprising antibodies neutralizing the four serotypes when they are administered sequentially two by two.
  • the inventors have in particular shown that a bivalent immunization
  • DEN-1, 2 followed two months later by a bivalent immunization DEN-3,4 induces high responses against all four serotypes in all immunized monkeys.
  • the immune response thus generated is more important quantitatively and qualitatively (covers all serotypes).
  • the present invention thus relates to vaccine compositions comprising (i) a dose of a vaccine virus of dengue of a first serotype and a dose of a vaccine virus of dengue of a second serotype, and ii) one dose of a third serotype dengue vaccine virus and one dose of a fourth serotype dengue vaccine virus, as a combination dengue combination vaccine composition for sequential administration, wherein vaccine viruses from dengue fever
  • the vaccine viruses (ii) are administered 30 days to 3 months after administration of the vaccine viruses (i)
  • the vaccine viruses (ii) are administered 30 days after administration of the vaccine viruses (i).
  • the dengue vaccine viruses (i) are administered in the form of a bivalent vaccine composition.
  • the dengue vaccine viruses (ii) are administered in the form of a bivalent vaccine composition.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is selected from the group consisting of the VDV1 strain and a ChimeriVax TM DEN-1.
  • said vaccinal dengue serotype 2 virus is selected from the group consisting of the VDV2 strain and a ChimeriVax TM DEN-2.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is the VDV1 strain and said serotype 2 dengue vaccine virus is the VDV2 strain.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-1 and said serotype 2 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-2.
  • said vaccine virus of dengue serotype 3 is a ChimeriVax TM DEN-3.
  • said serotype 4 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-4.
  • the first and second serotypes are respectively CYD DEN1 and CYD DEN2 and the third and fourth serotypes are respectively CYD DEN 3 and CYD DEN 4.
  • the vaccine virus doses of dengue fever Serotypes 1, 2, 3 and 4 are each in a range of from 10 3 to 10 5 CCID 50 .
  • the invention also relates to the use of a dengue vaccine virus of a third serotype and a dengue vaccine virus of a fourth serotype for the manufacture of a dengue vaccine intended to be administered to a patient who received, at least 30 days and not more than 1 year previously, a dose of a dengue vaccine virus of a first serotype and a dose of a vaccine virus of dengue of a second serotype.
  • the third and fourth serotypes are administered in the form of a bivalent vaccine composition.
  • the first and second serotypes are administered in the form of a bivalent vaccine composition.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is selected from the group consisting of the VDV1 strain and a ChimeriVax TM DEN-1.
  • said serotype 2 dengue vaccine virus is selected from the group consisting of the VDV2 strain and a ChimeriVax TM DEN-2.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is the VDV1 strain and said serotype 2 dengue vaccine virus is the VDV2 strain.
  • said serotype 1 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-1 and said serotype 2 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-2.
  • said vaccine virus of dengue serotype 3 is a ChimeriVax TM DEN-3.
  • said serotype 4 dengue vaccine virus is a ChimeriVax TM DEN-4.
  • the first and second serotypes are respectively CYD DEN1 and CYD DEN2 and the third and fourth serotypes are respectively CYD DEN 3 and CYD DEN 4.
  • the third and fourth serotypes are administered 30 days to 3 months after the administration of the first and second serotypes.
  • the third and fourth serotypes are administered 30 days after the administration of the first and second serotypes.
  • the vaccine virus doses of dengue serotype 1, 2, 3 and 4 are each in a range from 10 3 to 10 5 DICC 50 .
  • DEN Single-stranded, positive-strand RNA viruses belonging to the genus Flavivirus of the flaviviridae family.
  • the genomic RNA contains a type I cap at the 5 'end but lacks a poly-A tail at the 3' end.
  • the genomic organization consists of the following: 5 'non-coding region (NCR), structural proteins (capsid (C), pre-membrane / membrane (prM / M), envelope (E)) and non-structural proteins (NS1 - NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) and NCR 3 '.
  • the genomic viral RNA is associated with the capsid proteins to form a nucleocapsid.
  • the DEN viral genome encodes an uninterrupted coding region that is translated into a single polyprotein.
  • VDV or “Vero Dengue Vaccine” refers to a live attenuated viral dengue strain adapted to Vero cells and capable of inducing a response humoral specificity, including the induction of neutralizing antibodies, in primates and in particular in humans.
  • VDV-1 is a strain obtained from a DEN-1 16007 wild-type strain which had undergone 11 passages on PDK cells (DEN-1 16007 / PDK1 1) which was then amplified on Vero cells at 32 ° C, and whose RNA has been purified and transfected into Vero cells.
  • the strain VDV-1 has 14 additional mutations compared to the vaccine strain DEN-1 16007 / PDK13 (13 passages on PDK -Primary Dog Kidney cells).
  • the strain DEN-1 16007 / PDK13 also called “LAV1”
  • LAV1 has been described in the patent application EP1 159968 in the name of Mahidol University and has been deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number I -2480.
  • the complete sequence of the VDV-1 strain is given to the sequence SEQ ID NO: 1. Said strain can be easily reproduced from said sequence.
  • a method of preparation and the characterization of the strain VDV-1 have been described in the international patent application filed in the names of Sanofi Pasteur and the Center for Disease Control and Prevention under the number PCT / IB 2006/001313.
  • VDV-2 is a strain obtained from a wild-type strain DEN-2 16681 which has undergone 50 passages on PDK cells (DEN-2 16681 / PDK50), purified by plate and whose RNA has been extracted and purified before to be transfected into Vero cells. The VDV-2 strain was then obtained by plaque purification and amplification on Vero cells. The strain VDV-2 has 10 additional mutations compared to the DEN-2 16681 / PDK53 vaccine strain (53 passages on PDK cells), including 4 silent mutations.
  • the strain DEN-2 16681 / PDK53 also called “LAV2”
  • LAV2 has been described in patent application EP1 159968 in the name of Mahidol University and has been filed with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1 -2481.
  • the complete sequence of the VDV-2 strain is shown in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the VDV-2 strain can be easily reproduced from said sequence.
  • a method of preparation and characterization of the VDV-2 strain has been described in the international patent application filed in the names of Sanofi Pasteur and the Center for Disease Control and Prevention under the number PCT / IB 2006/001513.
  • CYD ChimeriVax TM Dengue
  • CYD refers to a chimeric yellow fever (YF) virus that comprises the backbone of a YF virus in which the coding sequences for the pre-membrane and envelope proteins have been replaced. by those of a DEN virus.
  • CYD-1 or CYD DEN1 is a chimeric YF virus containing the prM and E sequences of a dengue serotype 1 (DEN-I) strain.
  • CYD-2 or CYD DEN2 refers to a chimeric YF virus containing the prM and E sequences of a DEN-2 strain.
  • CYD-3 or CYD DEN3 is a chimeric YF virus containing the prM and E sequences of a DEN-3 strain.
  • CYD-4 or CYD DEN4 refers to a chimeric YF virus containing the prM and E sequences of a DEN-4 strain.
  • the preparation of these dengue ChimeriVax TM has been described in detail in international patent applications WO 98/3791 1 and WO 03/101397 to which reference can be made for a precise description of their preparation process.
  • chimeras described in the examples were generated using the prM and E sequences derived from the DEN 1 PUO359, DEN2 PR159, DEN3 PaH881 and DEN4 TVP980 strains. Any strain of the dengue virus could be used as part of the present invention for the construction of chimeras.
  • the chimeric YF virus comprises the backbone of an attenuated yellow fever strain YF17D (Theiler M, and Smith HH (1937) J Exp. Med 65, p767-786.) (YF17D / DEN-1 virus, YF17D / DEN-2, YF17D / DEN-3, YF17D / DEN-4).
  • YF17D strains that may be used include YF17D204 (YF-Vax®, Sanofi Pasteur, Swifwater, PA, USA, Stamaril®, Sanofi Pasteur, Marcy Star, France, ARILVAX TM, Chiron, Speke, Liverpool, UK).
  • a “monovalent” vaccine contains a single serotype of dengue virus.
  • a “bivalent” vaccine contains two different serotypes of dengue virus.
  • a “trivalent” vaccine contains three different serotypes of dengue virus.
  • a “tetravalent” vaccine contains four different dengue virus serotypes.
  • Patient refers to a person (child or adult) who may be infected with dengue fever, particularly a person at risk of infection, such as a person traveling to areas where dengue fever is present or an inhabitant of dengue fever. these regions.
  • the inventors therefore propose a method for inducing a neutralizing antibody response against the four dengue serotypes in a patient, comprising sequentially administering to said patient (i) a dose of a dengue vaccine virus of a first serotype. and a dose of a dengue vaccine virus of a second serotype, and (ii) a dose of a dengue vaccine virus of a third serotype and a dose of a vaccine virus dengue fever of a fourth serotype, in which the dengue vaccine viruses (ii) are administered at least 30 days and at most 3 months after administration of the dengue vaccine viruses (i).
  • dengue vaccine virus in the context of the present invention, any viral form of the dengue virus which is capable of inducing a specific hommologue response.
  • the dengue vaccine virus can be used as part of an immunization program in humans against dengue virus infection.
  • dengue vaccine virus is therefore meant an inactivated virus, an attenuated virus as well as recombinant proteins such as dengue virus envelope protein.
  • a vaccine virus is "inactivated” if it can no longer replicate on permissive cells.
  • a vaccine virus is "attenuated” if after growth at 37 ° C or 39 ° C on Huh-7, VERO and / or C6 / C36 cells, such a virus has a titre that is at least 10 times lower than the maximum titre of wild type, as determined under the same culture conditions and using the same method of titration.
  • a vaccine virus exhibiting decreased growth on at least one of these three cell types identified above is considered to be attenuated within the scope of the present invention.
  • a vaccine virus that can be used in humans has a positive risk / benefit ratio that meets the regulatory requirements for placing on the market.
  • a dengue vaccine virus used in the context of the present invention is preferably attenuated so that it does not induce disease in humans.
  • such a vaccine virus leads only to side effects which are at most of moderate intensity (i.e. average to low or even zero) in the majority of vaccinated subjects, while maintaining its ability to induce a homologous response comprising neutralizing antibodies.
  • Non-limiting examples of vaccinal dengue viruses that may be used in the context of the present invention include inactivated dengue viruses, attenuated dengue viruses, such as attenuated VDV-1 strains, VDV-2, the strains described for example in the applications WO02 / 66621, WO00 / 57904, WO00 / 57908, WO00 / 507909, WO00 / 57910, WO02 / 0950075 and the chimeras.
  • the chimeric viruses have the characteristics of the attenuated viruses as defined above.
  • Any chimeric virus expressing an envelope protein of a dengue virus and inducing an immune response comprising antibodies neutralizing the serotype from which the protein is derived can be used within the scope of the present invention.
  • Nonlimiting examples include ChimeriVaxTM dengue as described for example in WO98 / 3791 1, as well as dengue / dengue chimeras as described for example in patent applications WO96 / 40933 and WO01 / 60847.
  • the vaccinal dengue serotype 1 virus may be, for example, the vaccine strain VDV1 or a ChimeriVax TM DEN-1, in particular a YF17D / DEN-1 virus, or a DEN-1 16007 / PDK13 strain.
  • the vaccine virus of dengue serotype 2 can be for example the vaccine strain VDV2 or a ChimeriVax TM DEN-2, in particular a YF17D / DEN-2 virus, or a DEN-2 16681 / PDK53 strain.
  • the vaccine virus of serotype 3 dengue fever may be a ChimeriVax TM DEN-3, particularly a YF17D / DEN-3 virus.
  • the vaccine virus of dengue serotype 4 may be a ChimeriVax TM DEN-4, in particular a YF17D / DEN-4 virus. It may also be a strain "LAV4" or "DEN-4 1036 / PDK48" that is to say a strain DEN-4 1036 attenuated by 48 passages on PDK cells. This strain has been described in patent application EP1 159968 in the name of Mahidol University and has been filed with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1-2483.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • Each ChimeriVax TM monovalent dengue vaccine virus (serotypes 1, 2, 3 and 4) was prepared by amplification of each serotype on Vero cells. More specifically, the four viruses are produced separately on adherent Vero cells in serum-free medium. The viral harvest, clarified from cell debris by filtration, is then concentrated and purified by ultrafiltration and chromatography to remove DNA from the host cells. After addition of a stabilizer, the vaccine strains are stored frozen or lyophilized before use and then reconstituted extemporaneously. The same process is applied for the four chimeras. Strains VDV 1 and 2 are prepared by amplification on cells
  • Vero Viruses produced are harvested and clarified from cellular debris by filtration.
  • the DNA is digested by enzymatic treatment.
  • the impurities are removed by ultrafiltration.
  • Infectious titres may be increased by a concentration method.
  • the strains are stored in freeze-dried or frozen form before use and then reconstituted extemporaneously.
  • the multivalent compositions are obtained by simple mixing of the monovalent compositions.
  • the four serotypes of dengue fever can be administered in any order provided they are administered two by two sequentially within a period of 30 days to 1 year, such as 30 days, 45 days, 60 days, 3 months, 6 months, 9 months and 1 years, advantageously a period of 30 days to 3 months, in particular a period of 1 to 2 months, between the two series of administration.
  • the method according to the present invention can therefore be implemented with the embodiments described below: - (i): serotypes 1 and 2; (ii) serotypes 3 and 4; or
  • the present invention therefore covers the following diagrams:
  • VDV-1 and CYD DEN-4 (i) VDV-1 and CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-2 and CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-2 and CYD DEN-3; (ii) VDV-1 and CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-2 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-3 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and CYD DEN-2 - (i) CYD DEN-1 and VDV-2; (ii) CYD DEN-3 and CYD DEN-4
  • VDV-1 and VDV-2 (i) CYD DEN-3 and CYD DEN-4 - (i) VDV-1 and CYD DEN-3; (ii) VDV-2 and CYD DEN-4 - (i) VDV-1 and CYD DEN-4; (ii) VDV-2 and CYD DEN-3 - (i) VDV-2 and CYD DEN-3; (ii) VDV-1 and CYD DEN-4 - (i) VDV-2 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and CYD DEN-3 and - (i) CYD DEN-3 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and VDV-2 and VDV-2 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and CYD DEN-3 and - (i) CYD DEN-3 and CYD DEN-4; (ii) VDV-1 and VDV-2 and VDV-2; (ii) VDV-1 and CYD DEN-3 and - (
  • the term "vaccine virus dose” is intended to mean a composition comprising an "immunoefficient amount" of the vaccinia virus, that is to say a sufficient quantity of virus to induce a homologous neutralizing antibody response, which can be demonstrated for example by the seroneutralization test as described below in Examplei.
  • a serum is considered positive for the presence of neutralizing antibodies when the neutralizing antibody titer thus determined is greater than or equal to 1: 10.
  • Vaccine strain amounts are commonly expressed in terms of plaque forming unit (PFU) or infective dose 50% of tissue culture (TCID 50 ), or of infective dose 50% of cell culture (DICC50).
  • PFU plaque forming unit
  • TCID 50 tissue culture
  • DICC50 infective dose 50% of cell culture
  • the compositions according to the invention may contain from 10 to 10 6 DICC 50 , in particular from 10 3 to 10 5 DICC 50 dengue vaccine virus of serotype 1, 2, 3 or 4 for a monovalent or bivalent composition.
  • the vaccine virus doses of dengue serotype 1, 2, 3 and 4 are preferably each in a range from 10 to 10 6 DICC 50 , such as 10, 10 1 , 2 2 , 3 , 10 4 , 10 5 or 10 6 DICC 50, in particular in a range from 10 3 to 10 5 DICC 50 .
  • the vaccine viruses can be used in identical or different doses, which can be adjusted in depending on the nature of the vaccine virus used and the intensity of the immune response obtained.
  • the homologous neutralizing antibody response is durable, i.e., it can be detected in the serum at least 6 months after the administration of the dengue serotypes (ii)
  • the third and fourth serovar dengue vaccine viruses are administered at least 30 days and at most 12 months after administration of the first and second serovar dengue vaccine viruses.
  • the dengue vaccine viruses of the third and fourth serotypes may for example be administered 30 days to 1 year, for example 30 days, 45 days, 60 days, 3 months, 6 months, 9 months or 1 year, advantageously 30 days to 3 months, in particular 1 to 2 months, after administration of the dengue vaccine viruses of the first and second serotypes.
  • the dose of a vaccine virus of the dengue of a first serotype and the dose of a vaccine virus of the dengue of a second serotype are administered simultaneously in the form of two monovalent compositions, or in the form of a single composition bivalent.
  • the dose of a third serotype dengue vaccine virus and the dose of a fourth serotype dengue vaccine virus are administered simultaneously.
  • the third and fourth serotypes can be administered simultaneously as two monovalent vaccine compositions, or as a single, bivalent vaccine composition.
  • the vaccine viruses are administered in the form of vaccine compositions which can be prepared according to any method known to those skilled in the art.
  • viruses generally in freeze-dried form, are mixed with a pharmaceutically acceptable excipient, such as water or phosphate buffered saline, wetting or stabilizing agents.
  • pharmaceutically acceptable excipient is meant any solvent, dispersion medium, charge etc, which does not produce a side reaction, for example allergic, in humans or animals.
  • the excipient is selected according to the chosen dosage form, method and route of administration. Suitable excipients, as well as pharmaceutical formulation requirements, are described in "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", which is a reference work in the field.
  • the vaccine compositions are prepared in injectable form, and may correspond to liquid solutions, suspensions or emulsions.
  • the compositions may in particular comprise a aqueous solution buffered to maintain a pH of between about 6 and 9 (as determined with a pH meter at room temperature).
  • compositions may nevertheless comprise such a compound, that is to say a substance that increases, stimulates or strengthens the cellular or humoral immune response induced by the vaccine strain. administered simultaneously.
  • a compound that is to say a substance that increases, stimulates or strengthens the cellular or humoral immune response induced by the vaccine strain. administered simultaneously.
  • the vaccine compositions according to the invention may be administered according to any route usually used for vaccination, for example the parenteral route (especially intradermal, subcutaneous, or intramuscular).
  • the vaccine compositions are injectable compositions administered subcutaneously in the deltoid region.
  • the volume of composition administered depends on the route of administration. For subcutaneous injections, the volume is generally between 0.1 and 1.0 ml, preferably about 0.5 ml.
  • the optimal period for administering the first and second serotypes, or preferably all serotypes 1 to 4 is approximately 1 to 3 months before exposure to the dengue virus.
  • the vaccines can be administered as a prophylactic treatment for dengue virus infection in adults and children.
  • Target populations therefore include individuals who may be naive (ie, not previously immunized) or non-naive with respect to the dengue virus.
  • Dengue vaccine serovar vaccine administrations of serotypes 1 to 4 can also be implemented for example between 6 months and 10 years, for example 6 months, 1 year, 3 years, 5 years or 10 years after the administration. third and fourth serotypes.
  • the present invention also provides an immunization kit comprising 4 dengue vaccine viruses of 4 different serotypes in which each serotype is present in the form of a vaccine dose, or wherein at least 2 or even 4 serotypes are present as a bivalent composition.
  • Viremia and immunogenicity were therefore tested in a monkey model.
  • Viremia in particular, has been identified as one of the factors associated with virulence and severity of illness in men and is therefore an important parameter to consider. Immunogenicity is a key parameter in the assessment of protection conferred.
  • the monkeys were immunized subcutaneously in the arm (s) with 0.5 ml of vaccine composition. After mild anesthesia with ketamine (Imalgene, Merial), blood was collected by puncture at the inguinal or saphenous veins. At days 0 and 28, 5 ml of blood was sampled to evaluate antibody responses, while between days 2 and 10, 1 ml of blood was sampled to assess viremia. Blood was collected on ice and kept on ice until serum was separated. For this, the blood was centrifuged for 20 minutes at 4 ° C and the collected serum stored at -80 ° C until testing.
  • ketamine Intra, Merial
  • RNAs Seven plasmids containing, under the control of the T7 promoter, the region targeted by each PCR, were transcribed in vitro to generate a series of synthetic RNAs that were included as internal reference in each RT-PCT assay. These synthetic RNAs were assayed by spectrophotometry, the amount of RNA obtained was converted into RNA copy number and expressed in GEQ (genomic equivalents).
  • RNA 0.140 ml of monkey serum was extracted using Macherey Nagel's "Nucleospin 96 virus TM" RNA extraction kit, according to the manufacturer's instructions, and the purified RNA was eluted with 0.140 ml (0.090 ml). ml, then 0.05 ml) of RNase free water. To avoid repeated freeze / thaw cycles, a first quantification was performed immediately after the extraction of 5 ⁇ l of said RNA preparation. The remaining volume was frozen at 70 ° C.
  • the reaction mixtures contained, in addition to the components of the Qiagen Qauntitect TM probes RT-PCR kit (Qiagen), 10 picomoles of each primer, 4 picomoles of each probe and 5 ⁇ l of RNA, in a total volume of 25. .mu.l.
  • Qiagen Qauntitect TM probes RT-PCR kit
  • 10 picomoles of each primer 4 picomoles of each probe and 5 ⁇ l of RNA, in a total volume of 25. .mu.l.
  • 5 .mu.l of the purified preparation was directly introduced into the reaction mixture, without a prior dilution step.
  • Synthetic RNAs were diluted 1:10 in RNAse-free water, and 7 dilutions containing approximately 10 to 10 6 GEQ in 5 ⁇ l were quantified in parallel to generate the standard curve.
  • Quantification reactions were performed by the Applied Biosystem ABIPrism 700 TM instrument, using the following program: 50 ° C / 30 min, 95 ° C / 15 min, followed by 40 cycles of 95 ° C / 15 sec. 60 ° C / 60 sec.
  • the limit of quantification of the viral RNA in this test is 2.9 to 3.3 logioGEQ / ml (800 to 2000 GEQ / ml, 4 to 10 GEQ / reaction), according to the PCR targets (standard deviation: + / -0.3 log-m)
  • the correlation between the infectious titer and the quantification of viral RNA was established in parallel with the assays by analysis of 0.140 ml of negative monkey (OD) sera samples into which a known amount of infectious particles of the viruses served for immunization (CYD or VDV). Said control sera were prepared at two dilutions containing about 1 PFU and about 100 PFU in 5 ⁇ l (2.3 and 4.3 log 10 PFU / ml, respectively).
  • YF-NS5 sense 5 1 GCACGGATGTAACAGACTGAAGA (23 bases)
  • PRNT50 test 50% reduction in the number of PFUs. This test is heavy and material consuming, we developed the SN50 test, based on the reduction to 50% of the number of units measured in DICC50 test.
  • a 96-well plate 0.120 ml of each decomplemented serum is added to 0.480 ml of diluent (ISCOVE 4% FCS) per well. Serial dilutions of a factor of 6 are carried out by transfer of 0.150 ml of serum into 0.450 ml of diluent. 450 ⁇ l of viral dilution at 2.7 log-m DICC50 / ml are added to each well to obtain 25 CCID50 / well. The plate is incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • 100 ⁇ l of each dilution are then distributed in 6 wells of a 96-well plate in which VERO cells were seeded 3 days before the start of the experiment at a density of 8000 cells / well, in 100 ⁇ l of ISCOVE medium. 4% SVF.
  • the cells After 6 days of incubation at 37 ° C., in the presence of 5% of CO 2 , the cells are fixed with ethanol / acetone (70/30) at 4 ° C. for 15 minutes and then washed. 3 times in PBS and incubated for 1 h at 37 ° C. in the presence of 50 ⁇ l of a 1/2000 dilution of an anti-flavivirus monoclonal antibody (mAb 4G2).
  • mAb 4G2 an anti-flavivirus monoclonal antibody
  • the plates are then washed twice and incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of 50 ⁇ l of a 1/1000 dilution of an anti-mouse IgG conjugated with alkaline phosphatase.
  • the lysis ranges are revealed by adding 50 ⁇ l of a colored substrate: BCIP / NBT.
  • Neutralizing antibody titers are calculated using the Karber formula as defined below:
  • d represents the dilution leading to 100% neutralization (ie 6 negative replicates that is to say having no sign of infection)
  • the viral detection limit is 10 SN50 (i.e 1.0 Iog- 0 SN50).
  • Viral strains that have been used for the neutralization are the strains
  • the average title is established by calculating the geometric mean of the titles expressed in linear value, the samples whose title is lower than the detection threshold are assigned, by convention, a value equal to half of this threshold.
  • Immunization was performed subcutaneously in the arm with a 23G1 needle at a dose of 10 5 DICC 50 for each serotype for CYD DEN vaccines 1 to 4.
  • VDV-1 and VDV-2 were injected a dose of 3.96 log-m and 4.84 log-m respectively.
  • the administration scheme according to the present invention makes it possible to increase qualitatively and quantitatively the homologous neutralizing antibody response which is obtained with the tetravalent vaccination.
  • - Viremia (Table 4) is predominantly CYD-4 caused by CYD vaccines and no difference is observed between two sequential bivalent administrations and tetravalent administration (Group 2 vs. Group 3). Thus, no difference in safety after two bivalent immunizations or tetravalent immunization is expected. There is even a tendency towards lower viremia with the vaccine regimen according to the invention, see for example group 2 with respect to group 3.
  • Example 2 Sequential immunization in the monkey conducted at 1 month interval. Comparison of CYD-1, 2 followed by CYD-3,4 versus CYD-2,3 followed by CYD-1, 4
  • Viremia and immunogenicity were tested in a monkey model as in the previous example. In this example, an interval of one month was used between the two immunizations versus two months in the previous example.
  • Primary immunization with the two most immunogenic vaccine viruses in the monkey (CYD-2,3) is followed by administration with the two immunodominant vaccine viruses (CYD-1,4).
  • Immunization was performed subcutaneously in the arm with a 23G1 needle at a dose of 5 DICC 5 O for each serotype for CYD DEN vaccine viruses 1 to 4 as previously.
  • the administration scheme according to the present invention makes it possible to increase qualitatively and quantitatively the homologous neutralizing antibody response which is obtained with the tetravalent vaccination when the two immunizations are carried out at 1 month intervals.
  • the booster effect on serotypes 1 and 2 is less marked when the second administration is made after one month than when it is made after 2 months as in Example 1
  • Example 1 shows that immunization done sequentially with two bivalents is effective in inducing a response against all serotypes in all animals, even when the booster is carried out only 1 month after primary immunization.

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Abstract

L'invention concerne une méthode pour induire une protection homologue contre les 4 sérotypes de la dengue chez un patient, comprenant l'administration séquentielle audit patient (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype, dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés au moins 30 jours et au plus 1 ans après administration des virus vaccinaux (i).

Description

Méthode d'immunisation contre les 4 sérotypes de la dengue
L'invention a pour objet une méthode permettant d'induire une protection homologue contre les 4 sérotypes de la dengue chez un patient, comprenant l'administration séquentielle audit patient (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype, dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés au moins 30 jours et au plus 1 ans après administration des virus vaccinaux de la dengue (i).
Les maladies dengue sont causées par quatre virus du genre flavivirus de type sérologique proches mais distincts d'un point de vue antigénique (Gϋbler et al., 1988 In: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60 ; Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 :516-524; Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet; 352: 971 -977 ; Vaughn et al., 1997, J Infect Dis; 176: 322-30). L'infection avec un sérotype de la dengue peut produire un spectre de maladie clinique allant d'un syndrome viral non spécifique jusqu'à une maladie sévère hémorragique fatale. La période d'incubation de la fièvre dengue après piqûre du moustique est d'environ 4 jours (allant de 3 à 14 jours). La fièvre dengue est caractérisée par une fièvre biphasique, des maux de tête, des douleurs dans différentes parties du corps, une prostration, des éruptions, une lymphadénopathie et une leucopénie (Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 :516-524 ; Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet; 352: 971 -977). La période virémique est la même que pour des maladies fébriles (Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis.; 176: 322-30). La guérison de la fièvre dengue est acquise au bout de 7 à 10 jours, mais une asthénie prolongée est usuelle. Des baisses de la numération des leucocytes et des plaquettes sont fréquentes. La dengue hémorragique est une maladie fébrile sévère caractérisée par des anomalies de l'homéostasie et une augmentation de la perméabilité vasculaire qui peut conduire à une hypovolémie et à une hypotension (dengue avec syndrome de choc) souvent compliquée par des hémorragies internes sévères. Le taux de mortalité de la dengue hémorragique peut atteindre jusqu'à 10 % sans thérapie, mais est de 1 % dans la plupart des centres ayant une expérience thérapeutique (WHO technical Guide, 1986. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment and control, p1 -2. World Health Organization, Geneva, Switzerland).
Le diagnostic de routine en laboratoire de la dengue est basé sur l'isolation du virus et/ou la détection d'anticorps spécifiques du virus de la dengue.
La dengue est la deuxième maladie infectieuse tropicale la plus importante après la malaria, plus de la moitié de la population mondiale (2,5 milliards) vivant dans des zones à risque de transmission épidémique. Chaque année, les cas de dengue sont estimés à 50-100 millions, les cas de patients hospitalisés pour une dengue hémorragique à 500 000, et le nombre de morts à 25 000. La dengue est endémique en Asie, dans le Pacifique, en Afrique, en Amérique latine et dans les Caraïbes. Plus de 100 pays tropicaux sont endémiques pour les infections par le virus de la dengue et la dengue hémorragique a été documentée dans 60 de ces pays (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology. 10:100-103 ; Monath, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.; 91 : 2395- 2400). Un certain nombre de facteurs bien décrits semblent être impliqués dans la dengue : la croissance de la population ; une urbanisation non planifiée et non contrôlée, en particulier en association avec la pauvreté ; une augmentation des voyages aériens ; le manque de contrôle effectif des moustiques et la détérioration des infrastructures sanitaires et de santé publique (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology. 10:100-103). Les voyageurs et expatriés sont de plus en plus alertés contre la dengue (Shirtcliffe et al., 1998, J. Roy. Coll. Phys. Lond..; 32: 235-237). La dengue a constitué une des principales causes de maladies fébriles au sein les troupes américaines au cours de déploiements dans des zones tropicales endémiques pour la dengue (DeFraites et al., 1994, MMWR 1994; 43: 845-848). Les virus sont maintenus dans un cycle qui implique les humains et
Aedes aegypti, un moustique domestique piquant le jour, qui préfère s'alimenter sur l'homme. L'infection chez l'homme est initiée par l'injection du virus au cours du repas de sang d'un moustique Aedes aegypti infecté. Le virus salivaire est déposé principalement dans les tissus extravasculaires. La première catégorie de cellules infectées après inoculation sont les cellules dendritiques, qui migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques (Wu et al., 2000, Nature Med.; 7:816-820). Après une réplication initiale dans la peau et dans les ganglions lymphatiques, le virus apparaît dans le sang au cours de la phase fébrile aiguë, généralement pendant 3 à 5 jours.
Les monocytes et les macrophages sont, avec les cellules dendritiques, parmi les premières cibles du virus de la dengue. La protection contre une réinfection homotypique est complète et dure probablement toute la vie, mais une protection croisée entre les différents types de dengue dure moins de quelques semaines à quelques mois (Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg.; 1 : 30-50). En conséquence, un sujet peut subir une infection avec un sérotype différent. Une seconde infection par la dengue est en théorie un facteur de risque de développer une maladie dengue sévère. Cependant, la dengue hémorragique est multifactorielle : ces facteurs incluent la souche du virus impliqué, ainsi que l'âge, le statut immun et la prédisposition génétique du patient. Deux facteurs jouent un rôle majeur dans la survenue de la dengue hémorragique: une réplication virale rapide avec une virémie élevée (la sévérité de la maladie étant associée au niveau de la virémie ; Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis.; 181 : 2-9) et une réponse inflammatoire importante avec la libération de niveaux élevés de médiateurs inflammatoires (Rothman and Ennis, 1999, Virology; 257: 1 -6). Il n'y a aucun traitement spécifique contre la dengue. Le traitement de la fièvre dengue est symptomatique avec un alitement, un contrôle de la fièvre et de la douleur avec des antipyrétiques et des analgésiques, et une prise de boisson adéquate. Le traitement de la dengue hémorragique nécessite l'équilibrage des pertes de liquide, le remplacement des facteurs de coagulation et la perfusion d'héparine.
Les mesures de prévention reposent actuellement sur le contrôle du vecteur et des mesures de protection personnelle qui sont difficiles à mettre en œuvre et coûteuses. Aucun vaccin contre la dengue n'est approuvé pour le moment. Etant donné que les quatre sérotypes de la dengue sont en circulation dans le monde et comme ils ont été rapportés comme étant impliqués dans des cas de fièvre hémorragique dengue, la vaccination devrait idéalement conférer une protection contre les quatre sérotypes du virus de la dengue.
Des stratégies d'immunisations séquentielles ont été précédemment mises en œuvre dans le but d'induire une protection hétérologue entre les différents sérotypes de la dengue.
Ainsi, Price (1968, Am. J. Epid., 88 :392-397) a décrit une méthode d'immunisation séquentielle contre la dengue comprenant une série de deux infections avec la dengue sérotype 1 puis avec la dengue sérotype 2 qui conférait une protection dans un test d'épreuve avec la dengue sérotype 3 ou 4.
Whitehead et al. (1970, Am. J. Trop. Med. Hyg., 19:94-102) ont cherché à déterminer l'influence d'une infection monovalente séquentielle avec deux ou trois des quatre sérotypes de la dengue sur l'immunité hétérologue conférée. Des gibbons ont ainsi été infectés initialement avec un virus dengue de sérotype 1 , 2, 3 ou 4. Suite à une deuxième infection avec un sérotype hétérologue, une virémie variable a été détectée qui était dépendante de la séquence d'infection et en particulier du sérotype utilisé pour la première infection. Plus spécifiquement, une seconde virémie apparaissait chez des gibbons infectés initialement avec le sérotype 2, 3 ou 4 puis provoqués avec le sérotype 1 , 2 ou 4.
Scherer et al. (1972, Am. J. Epid., 95 :67-79) ont décrit une infection monovalente séquentielle comprenant une première infection avec un des quatre sérotypes de la dengue suivie d'une deuxième infection, voire d'une troisième infection, avec un sérotype homologue ou hétérologue. Les schémas proposés n'ont pas permis d'obtenir une protection satisfaisante contre une épreuve par un sérotype hétérologue
Halstead et al. (1973, Am. J. Trop. Med. Hyg., 22 :365-374) ont évalué chez le singe une méthode d'immunisation séquentielle contre la dengue comprenant une série de deux, trois ou quatre infections monovalentes avec des sérotypes hétérologues 1 à 4 de la dengue. Les auteurs ont conclu qu'une protection contre une infection ultérieure pouvait être obtenue avec la séquence d'immunisation sérotypes 1 , 2 puis 4 suivie d'une épreuve avec le sérotype 3. L'immunisation bivalente n'est ni décrite ni suggérée. De plus les auteurs déconseillent les immunisations séquentielles du fait de leur lourdeur et du caractère aléatoire des résultats générés.
Halstead et al. (1973, Am. J. Trop. Med. Hyg., 22 :375-381 ) ont également montré qu'une immunisation bivalente avec deux sérotypes hétérologues de la dengue ne protégeait pas, ou seulement partiellement, d'une infection par un troisième sérotype de la dengue.
Dans le cadre de la présente invention, l'objectif est d'induire une protection homologue contre les 4 sérotypes de la dengue. Les inventeurs ont mis en évidence qu'il est possible de générer une réponse immune comprenant des anticorps neutralisant les 4 sérotypes lorsque ces derniers sont administrés séquentiellement deux par deux.
Les inventeurs ont en particulier montré qu'une immunisation bivalente
DEN-1 ,2 suivie deux mois plus tard par une immunisation bivalente DEN-3,4 induit des réponses élevées contre les quatre sérotypes chez tous les singes immunisés. La réponse immune ainsi générée est plus importante quantitativement et qualitativement (couvre tous les sérotypes).
Selon un premier objet la présente invention concerne donc des compositions vaccinales comprenant (i) une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype, comme composition vaccinale de combinaison contre la dengue pour une administration séquentielle, dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue
(ii) sont administrés au moins 30 jours et au plus 1 ans après l'administration des virus vaccinaux de la dengue (i).
Selon un mode de réalisation des compositions vaccinales selon l'invention, les virus vaccinaux (ii) sont administrés 30 jours à 3 mois après l'administration des virus vaccinaux (i)
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, les virus vaccinaux (ii) sont administrés 30 jours après l'administration des virus vaccinaux (i). Selon un autre mode de réalisation des compositions vaccinales selon l'invention, les virus vaccinaux de la dengue (i) sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
Selon un autre mode de réalisation des compositions vaccinales selon l'invention, les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
Selon un mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et d'un ChimeriVax™ DEN-1. Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimeriVax™ DEN-2.
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2.
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimeriVax™ DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimeriVax™ DEN-2.
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimeriVax™ DEN-3. Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimeriVax™ DEN-4.
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD DEN1 et CYD DEN2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN 3 et CYD DEN 4.
Selon un autre mode de réalisation particulier des compositions vaccinales selon l'invention, les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotypes 1 , 2, 3 et 4 sont chacune comprise dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype pour la fabrication d'un vaccin contre la dengue destiné à être administré à un patient ayant reçu, au moins 30 jours et au plus 1 ans auparavant, une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les troisième et quatrième sérotypes sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les premier et deuxième sérotypes sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et un ChimeriVax™ DEN-1.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimeriVax™ DEN-2.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimeriVax™ DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimeriVax™ DEN-2.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimeriVax™ DEN-3. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimeriVax™ DEN-4.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD DEN1 et CYD DEN2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN 3 et CYD DEN 4.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les troisième et quatrième sérotypes sont administrés 30 jours à 3 mois après l'administration des premier et deuxième sérotypes.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les troisième et quatrième sérotypes sont administrés 30 jours après l'administration des premier et deuxième sérotypes. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'utilisation selon l'invention, les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotype 1 , 2, 3 et 4 sont chacune comprise dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50.
L'invention va être décrite plus en détails dans la description qui suit.
Définitions Les « virus de la dengue » ou « DEN » sont des virus à ARN simple- brin, positif, appartenant au genre Flavivirus de la famille des flaviviridae. L'ARN génomique contient une coiffe de type I à l'extrémité 5' mais est dépourvu de queue poly-A à l'extrémité 3'. L'organisation génomique est constituée des éléments suivants : région non codante (NCR) 5', protéines structurales (capside (C), pré-membrane/membrane (prM/M), enveloppe (E)) et protéines non structurales (NS1 -NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) et NCR 3'. L'ARN viral génomique est associé aux protéines de la capside pour former une nucléocapside. Comme pour les autres flavivirus, le génome viral DEN code une région codante ininterrompue qui est traduite en une polyprotéine unique.
« VDV » ou « vaccin dengue Vero» désigne une souche virale dengue vivante atténuée adaptée sur cellule Vero et capable d'induire une réponse humorale spécifique, y compris l'induction d'anticorps neutralisants, chez les primates et en particulier chez l'homme.
« VDV-1 » est une souche obtenue à partir d'une souche sauvage DEN-1 16007 ayant subi 1 1 passages sur cellules PDK (DEN-1 16007/PDK1 1 ) qui a ensuite été amplifiée sur cellules Vero à 32°C, et dont l'ARN a été purifié et transfecté dans des cellules Vero. La souche VDV-1 présente 14 mutations supplémentaires par rapport à la souche vaccinale DEN-1 16007/PDK13 (13 passages sur cellules PDK -Primary Dog Kidney). La souche DEN-1 16007/PDK13, aussi appelée « LAV1 », a été décrite dans la demande de brevet EP1 159968 au nom de Mahidol University et a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-2480. La séquence complète de la souche VDV-1 est donnée à la séquence SEQ ID NO :1. Ladite souche peut être facilement reproduite à partir de ladite séquence. Un procédé de préparation et la caractérisation de la souche VDV-1 ont été décrits dans la demande de brevet internationale déposée aux noms de Sanofi Pasteur et du Center for Disease Control and Prévention sous le numéro PCT/IB 2006/001313.
« VDV-2 » est une souche obtenue à partir d'une souche sauvage DEN-2 16681 ayant subi 50 passages sur cellules PDK (DEN-2 16681/PDK50), purifiée par plaque et dont l'ARN a été extrait et purifié avant d'être transfecté dans des cellules Vero. La souche VDV-2 a ensuite été obtenue par purification par plaque et amplification sur cellules Vero. La souche VDV-2 présente 10 mutations supplémentaires par rapport à la souche vaccinale DEN-2 16681/PDK53 (53 passages sur cellules PDK), dont 4 mutations silencieuses. La souche DEN-2 16681/PDK53, aussi appelée « LAV2 », a été décrite dans la demande de brevet EP1 159968 au nom de Mahidol University et a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-2481. La séquence complète de la souche VDV-2 est montrée dans la séquence SEQ ID NO :2. La souche VDV-2 peut être facilement reproduite à partir de ladite séquence. Un procédé de préparation et la caractérisation de la souche VDV-2 a été décrit dans la demande de brevet internationale déposée aux noms de Sanofi Pasteur et du Center for Disease Control and Prévention sous le numéro PCT/IB 2006/001513. Par « ChimeriVax™ dengue» ou « CYD » on désigne un virus de la fièvre jaune (YF) chimère qui comprend le squelette d'un virus YF dans lequel les séquences codant pour les protéines de pré-membrane et d'enveloppe ont été remplacées par celles d'un virus DEN. On appelle ainsi « CYD-1 ou CYD DEN1 » un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche dengue sérotype 1 (DEN-I ). On appelle « CYD-2 ou CYD DEN2» un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-2. On appelle « CYD-3 ou CYD DEN3» un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-3. On appelle « CYD-4 ou CYD DEN4» un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-4. La préparation de ces ChimeriVax™ dengue a été décrite en détail dans les demandes de brevet internationales WO 98/3791 1 et WO 03/101397 auxquelles on peut se reporter pour un descriptif précis de leur procédé de préparation. Les chimères décrits dans les exemples ont été générés par utilisation des séquences prM et E issues des souches DEN 1 PUO359, DEN2 PR 159, DEN3 PaH881 et DEN 4 TVP 980. Toute souche du virus de la dengue pourrait être utilisée dans le cadre de la présente invention pour la construction des chimères.
De préférence, le virus YF chimère comprend le squelette d'une souche de la fièvre jaune atténuée YF17D (Theiler M, and Smith HH (1937) J Exp. Med 65, p767-786.) (virus YF17D/DEN-1 , YF17D/DEN-2, YF17D/DEN-3, YF17D/DEN-4). Des exemples de souches YF17D susceptibles d'être utilisées incluent YF17D204 (YF-Vax®, Sanofi Pasteur, Swifwater, PA, USA ; Stamaril®, Sanofi Pasteur, Marcy l'Etoile, France ; ARILVAX™, Chiron, Speke, Liverpool, UK ; FLAVIMUN®, Berna Biotech, Bern, Switzerland ; YF17D-204 France (X15067,X15062) ; YF17D-204,234 US (Rice et al., 1985, Science, 229 :726-733), ou encore des souches apparentées YF17DD (Genbank numéro d'accès U17066), YF17D-213 (Genbank numéro d'accès U17067) et les souches YF17DD décrites par Galler et al. (1998, Vaccines 16(9/10) :1024- 1028). Toute autre souche de virus de la fièvre jaune suffisamment atténuée pour une utilisation chez l'homme est susceptible d'être employée.
Un vaccin « monovalent » contient un seul sérotype de virus dengue. Un vaccin « bivalent » contient deux sérotypes différents de virus dengue. Un vaccin « trivalent » contient trois sérotypes différents de virus dengue. Un vaccin « tétravalent » contient quatre sérotypes différents de virus dengue.
Par « patient », on désigne une personne (enfant ou adulte) susceptible d'être infectée par la dengue, en particulier une personne à risque d'infection comme par exemple une personne voyageant dans des régions où la dengue est présente ou un habitant de ces régions.
Immunisation séquentielle Les inventeurs ont montré que l'administration des 4 sérotypes sous la forme de deux administrations bivalentes séquentielles permet d'obtenir une protection homologue efficace contre les 4 sérotypes. La méthode selon la présente invention présente donc un intérêt tout particulier dans le cadre d'une stratégie d'immunisation contre la dengue.
Les inventeurs proposent donc une méthode pour induire une réponse anticorps neutralisante contre les 4 sérotypes de la dengue chez un patient, comprenant l'administration séquentielle audit patient (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype, dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés au moins 30 jours et au plus 3 mois après administration des virus vaccinaux de la dengue (i).
Par "virus vaccinal de la dengue" on entend dans le cadre de la présente invention, toute forme virale du virus de la dengue qui est capable d'induire une réponse hommologue spécifique. De préférence le virus vaccinal de la dengue peut être utilisé dans le cadre d'un programme d'immunisation chez l'homme contre une infection par un virus de la dengue.
Par virus vaccinal de la dengue on entend donc un virus inactivé, un virus atténué ainsi que des protéines recombinantes telles que la protéine d'enveloppe du virus de la dengue. Un virus vaccinal est "inactivé" si il ne peut plus se répliquer sur des cellules permissives. Un virus vaccinal est "atténué" si après croissance à 37°C ou 39 °C sur cellules Huh-7, VERO et/ou C6/C36, un tel virus présente un titre qui est au moins 10 fois inférieur au titre maximal du type sauvage, tel que déterminé dans les mêmes conditions de culture et en utilisant la même méthode de titration.
Un virus vaccinal présentant une croissance diminuée sur au moins l'un de ces trois types cellulaires identifiés ci-dessus est considéré comme atténué dans le cadre de la présente invention.
Un virus vaccinal utilisable chez l'homme présente un rapport bénéfice/risque positif satisfaisant aux exigences réglementaires pour une mise sur le marché. Un virus vaccinal de la dengue utilisé dans le cadre de la présente invention est de préférence atténué de sorte qu'il n'induise pas la maladie chez l'homme. Avantageusement, un tel virus vaccinal conduit seulement à des effets secondaires qui sont au plus d'intensité modérée (i.e. moyenne à faible voire nulle) chez la majorité des sujets vaccinés, tout en conservant sa capacité à induire une réponse homologue comprenant des anticorps neutralisants. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs de virus vaccinal de la dengue pouvant être utilisé dans le cadre de la présente invention, les virus de la dengue inactivés, les virus de la dengue atténués, tels que les souches atténuées VDV-1 , VDV-2, les souches décrites par exemple dans les demandes WO02/66621 , WO00/57904, WO00/57908, WO00/507909, WO00/57910, WO02/0950075 ainsi que les chimères. Les virus chimères présentent les caractéristiques des virus atténués telles que définies ci-dessus.
Tout virus chimère exprimant une protéine d'enveloppe d'un virus de la dengue et induisant une réponse immunitaire comprenant des anticorps neutralisant le sérotype dont est issue la protéine peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs, les ChimeriVaxTM dengue tels que décrits par exemple WO98/3791 1 , ainsi que les chimères dengue/dengue tels que décrits par exemple dans les demandes de brevet WO96/40933 et WO01 /60847.
Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 peut être par exemple la souche vaccinale VDV1 ou un ChimeriVax™ DEN-1 , en particulier un virus YF17D/DEN-1 , ou encore une souche DEN-1 16007/PDK13. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 peut être par exemple la souche vaccinale VDV2 ou un ChimeriVax™ DEN-2, en particulier un virus YF17D/DEN-2, ou encore une souche DEN-2 16681/PDK53. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 peut être un ChimeriVax™ DEN-3, en particulier un virus YF17D/DEN-3. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 peut être un ChimeriVax™ DEN-4, en particulier un virus YF17D/DEN-4. Il peut également s'agir d'une souche « LAV4 » ou « DEN-4 1036/PDK48 » c'est-à-dire une souche DEN-4 1036 atténuée par 48 passages sur cellules PDK. Cette souche a été décrite dans la demande de brevet EP1 159968 au nom de Mahidol University et a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-2483.
Chaque virus vaccinal dengue monovalent ChimeriVax™ (sérotypes 1 , 2, 3 et 4) a été préparé par amplification de chaque sérotype sur cellules Vero. Plus spécifiquement, les quatre virus sont produits séparément sur des cellules Vero adhérentes en milieu sans sérum. La récolte virale, clarifiée des débris cellulaires par filtration, est alors concentrée et purifiée par ultrafiltration et chromatographie pour enlever l'ADN des cellules hôtes. Après ajout d'un stabilisant, les souches vaccinales sont stockées sous forme congelée ou lyophilisée avant utilisation puis reconstituées extemporanément. Le même procédé est appliqué pour les quatre chimères. Les souches VDV 1 et 2 sont préparées par amplification sur cellules
Vero. Les virus produits sont récoltés et clarifiés des débris cellulaires par filtration. L'ADN est digéré par traitement enzymatique. Les impuretés sont éliminées par ultrafiltration. Les titres infectieux peuvent être augmentés par une méthode de concentration. Après ajout d'un stabilisant, les souches sont stockées sous forme lyophilisée ou congelée avant utilisation puis reconstituées extemporanément.
Les compositions multivalentes sont obtenues par simple mélange des compositions monovalentes.
Selon la présente invention, les 4 sérotypes de la dengue peuvent être administrés dans un ordre quelconque pour autant qu'ils soient administrés deux par deux de façon séquentielle en respectant une période de 30 jours à 1 an, telle que 30 jours, 45 jours, 60 jours, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 1 ans, avantageusement une période de 30 jours à 3 mois, en particulier une période de 1 à 2 mois, entre les deux séries d'administration.
La méthode selon la présente invention peut donc être mise en œuvre avec les les modes de réalisation décrits ci-dessous : -(i) : sérotypes 1 et 2 ; (ii) sérotypes 3 et 4 ; ou
-(i) sérotypes 1 et 3 ; (ii) sérotypes 2 et 4 ; ou -(i) sérotypes 1 et 4 ; (ii) sérotypes 2 et 3 ; ou -(i) sérotypes 2 et 3 ; (ii) sérotypes 1 et 4 ; ou -(i) sérotypes 2 et 4 ; (ii) sérotypes 1 et 3 ; ou -(i) sérotypes 3 et 4 ; (ii) sérotypes 1 et 2.
Selon des modes de réalisation particuliers, la présente invention couvre donc les schémas suivants :
-(i) CYD DEN-1 et CYD DEN-2; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 -(i) CYD DEN-1 et CYD DEN-3; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-4 -(i) CYD DEN-1 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-3
-(i) CYD DEN-2 et CYD DEN-3; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 -(i) CYD DEN-2 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 -(i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-2 -(i) VDV-1 et CYD DEN-2; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 -(i) VDV-1 et CYD DEN-3; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-4
-(i) VDV-1 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-3 -(i) CYD DEN-2 et CYD DEN-3; (ii) VDV-1 et CYD DEN-4 -(i) CYD DEN-2 et CYD DEN-4; (ii) VDV-1 et CYD DEN-3 -(i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4; (ii) VDV-1 et CYD DEN-2 -(i) CYD DEN-1 et VDV-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4
-(i) CYD DEN-1 et CYD DEN-3; (ii) VDV-2 et CYD DEN-4 -(i) CYD DEN-1 et CYD DEN-4; (ii) VDV-2 et CYD DEN-3 -(i) VDV-2 et CYD DEN-3; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 -(i) VDV-2 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 -(i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4; (ii) CYD DEN-1 et VDV-2
-(i) VDV-1 et VDV-2; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 -(i) VDV-1 et CYD DEN-3; (ii) VDV-2 et CYD DEN-4 -(i) VDV-1 et CYD DEN-4; (ii) VDV-2 et CYD DEN-3 -(i) VDV-2 et CYD DEN-3; (ii) VDV-1 et CYD DEN-4 -(i) VDV-2 et CYD DEN-4; (ii) VDV-1 et CYD DEN-3 et -(i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-1 et VDV-2
On entend par « dose de virus vaccinal » dans le cadre de la présente invention une composition comprenant une « quantité immunoefficace » du virus vaccinal, c'est-à-dire une quantité suffisante de virus pour induire une réponse anticorps neutralisante homologue, qui peut être mise en évidence par exemple par le test de seroneutralisation tel que décrit ci- dessous dans l'exemplei . Un sérum est considéré comme positif pour la présence d'anticorps neutralisants lorsque le titre d'anticorps neutralisants ainsi déterminé est supérieur ou égal à 1 :10.
Les quantités de souche vaccinales sont exprimées communément en termes d'unité formant des plages virales (PFU) ou de dose infectant 50% de la culture tissulaire (TCID50), ou encore de dose infectant 50% de la culture cellulaire (DICC50). Par exemple, les compositions selon l'invention peuvent contenir de 10 à 106 DICC50, en particulier de 103 à 105 DICC50 de virus vaccinal dengue de sérotype 1 , 2, 3 ou 4 pour une composition monovalente ou bivalente. Ainsi dans les compositions ou utilisation selon l'invention, les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotype 1 , 2, 3 et 4 sont préférentiellement comprises chacune dans une gamme allant de 10 à 106 DICC50, tels que 10, 101,102,103,104,105 ou 106 DICC50 en particulier dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50, Les virus vaccinaux peuvent être utilisés à des doses identiques ou différentes, qui peuvent être ajustées en fonction de la nature du virus vaccinal utilisé et de l'intensité de la réponse immunitaire obtenue.
De préférence, la réponse anticorps neutralisante homologue est durable, c'est-à-dire qu'elle peut être détectée dans le sérum au moins 6 mois, après l'administration des sérotypes dengue (ii) Dans l'administration séquentielle selon l'invention les virus vaccinaux de la dengue des troisième et quatrième sérotypes sont administrés au moins 30 jours et au plus 12 mois après l'administration des virus vaccinaux de la dengue des premiers et deuxième sérotypes. Dans le cadre de la présente invention, les virus vaccinaux de la dengue des troisième et quatrième sérotypes peuvent être par exemple administrés 30 jours à 1 an, par exemple 30 jours, 45 jours, 60 jours, 3 mois, 6 mois, 9 mois ou 1 an, avantageusement 30 jours à 3 mois, en particulier 1 à 2 mois, après l'administration des virus vaccinaux de la dengue des premier et deuxième sérotypes.
La dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et la dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype sont administrées simultanément sous forme de deux compositions monovalentes, ou sous la forme d'une seule composition bivalente.
De la même manière, la dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et la dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype sont administrées simultanément. Par exemple, les troisième et quatrième sérotypes peuvent être administrés simultanément sous forme de deux compositions vaccinales monovalentes, ou sous la forme d'une unique composition vaccinale bivalente.
Les virus vaccinaux sont administrés sous forme de compositions vaccinales qui peuvent être préparées selon n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. Habituellement, les virus, généralement sous forme lyophilisée, sont mélangés avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, tel que de l'eau ou une solution saline tamponnée au phosphate, des agents mouillants ou stabilisants. Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend tout solvant, milieu de dispersion, charge etc, qui ne produit pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. L'excipient est sélectionné en fonction de la forme pharmaceutique choisie, de la méthode et de la voie d'administration. Des excipients appropriés, ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique, sont décrites dans « Remington : The Science & Practice of Pharmacy », qui représente un ouvrage de référence dans le domaine. De préférence, les compositions vaccinales sont préparées sous forme injectable, et peuvent correspondre à des solutions liquides, des suspensions ou des émulsions. Les compositions peuvent en particulier comprendre une solution aqueuse tamponnée de manière à maintenir un pH compris entre environ 6 et 9 (comme déterminé avec un pHmètre à température ambiante).
Bien qu'il ne soit pas nécessaire de rajouter un adjuvant, Les compositions peuvent néanmoins comprendre un tel composé, c'est-à-dire une substance qui augmente, stimule, ou renforce, la réponse immunitaire cellulaire ou humorale induite par la souche vaccinale administrée simultanément. L'homme de l'art est à même de sélectionner parmi les adjuvants classiquement utilisés dans le domaine vaccinal, un adjuvant qui puisse être approprié dans le cadre de la présente invention. Les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être administrées selon n'importe quelle voie utilisée habituellement en vaccination, par exemple la voie parentérale (notamment intradermique, sous-cutanée, ou intramusculaire). De préférence, les compositions vaccinales sont des compositions injectables administrées par voie sous-cutanée au niveau de la région deltoïde.
Le volume de composition administré dépend de la voie d'administration. Pour des injections sous-cutanées, le volume est généralement compris entre 0,1 et 1 ,0 ml, de préférence environ 0,5 ml.
La période optimale pour l'administration des premier et deuxième sérotypes, ou préférentiellement de la totalité des sérotypes 1 à 4, est d'environ 1 à 3 mois avant l'exposition au virus de la dengue. Les vaccins peuvent être administrés en tant que traitement prophylactique d'une infection par un virus de la dengue chez les adultes et les enfants. Les populations cibles incluent donc des personnes qui peuvent être naïves (i.e. non préalablement immunisés) ou non-naïves vis-à-vis du virus de la dengue.
Des administrations de rappel virus vaccinaux de la dengue de sérotypes 1 à 4 peuvent en outre être mises en œuvre par exemple entre 6 mois et 10 ans, par exemple 6 mois, 1 an, 3 ans, 5 ans ou 10 ans après l'administration des troisième et quatrième sérotypes.
La présente invention fournit également un kit d'immunisation comprenant 4 virus vaccinaux de la dengue de 4 sérotypes différents dans lequel, chaque sérotype est présent sous la forme d'une dose vaccinale, ou dans lequel au moins 2, voire 4 sérotypes sont présents sous la forme d'une composition bivalente.
Pour un descriptif des doses vaccinales ou compositions monovalentes ou bivalentes et des modes de réalisations préférés, on peut se reporter aux passages de la description relatifs à la méthode d'immunisation selon la présente invention.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Immunisation séquentielle chez le singe
La virémie et l'immunogénicité ont donc été testées dans un modèle singe. La virémie, en particulier, a été identifiée comme l'un des facteurs associés avec la virulence et la sévérité de la maladie chez les hommes et constitue donc un paramètre important à prendre en considération. L'immunogénicité est quant à elle un paramètre clé dans le cadre de l'évaluation de la protection conférée.
1.1 Matériels et méthodes :
Les expériences chez les singes ont été menées selon les Directives européennes relatives à l'expérimentation animale. Les immunisations ont été effectuées chez des singes cynomolgus (Macaca fascicularis) originaires de Mauritanie. Les singes ont été mis en quarantaine pendant six semaines avant immunisation.
Les singes ont été immunisés par voie sous-cutanée dans le(s) bras avec 0,5 ml de composition vaccinale. Après une légère anesthésie avec de la kétamine (Imalgene, Merial), du sang a été collecté par ponction au niveau des veines inguinale ou saphène. Aux jours 0 et 28, 5 ml de sang ont été échantillonnés pour évaluer les réponses anticorps, alors qu'entre les jours 2 et 10, 1 ml de sang était échantillonné pour évaluer la virémie. Le sang était collecté sur la glace et conservé sur la glace jusqu'à séparation du sérum. Pour ce faire, le sang a été centrifugé pendant 20 minutes à 4°C et le sérum collecté stocké à -80 °C jusqu'au moment des tests.
Mesure de la virémie Les virémies post vaccinales ont été suivies par RT-PCT quantitative en temps réel (qRT-PCR). Deux jeux d'amorces et de sondes localisées dans le gène NS5 de des souches DEN1 et DEN2 ont été utilisés pour quantifier l'ARN de VDV-1 et VDV-2 respectivement. Un troisième jeu d'amorces et de sonde localisées dans le gène NS5 du virus YF a été utilisé pour quantifier l'ARN du CYD. Enfin, 4 jeux d'amorces et de sondes spécifiques des différents sérotypes, localisées à la jonction des gènes E (DEN) / NS1 (YF) ont été utilisés pour identifier le sérotype dans les échantillons positifs pour l'ARN NS5 YF (voir aussi tableau I). 7 plasmides contenant, sous le contrôle du promoteur T7, la région ciblée par chaque PCR, ont été transcrits in vitro pour générer une série d'ARN synthétiques qui ont été inclus comme référence interne dans chaque essai de RT-PCT. Ces ARN synthétiques ont été dosés par spectrophotométhe, la quantité d'ARN obtenue a été convertie en nombre de copies d'ARN et exprimée en GEQ (équivalents génomiques).
0,140 ml de sérum de singe a été extrait à l'aide du kit d'extraction d'ARN « Nucleospin 96 virus™ » de Macherey Nagel, selon les instructions du fabriquant, puis l'ARN purifié a été élue avec 0,140 ml (0,090 ml, puis 0,05 ml) d'eau exempte de RNase. Pour éviter des cycles répétés de congélation/décongélation, une première quantification a été réalisée immédiatement après l'extraction sur 5 μl de ladite préparation d'ARN. Le volume restant a été congelé à 70°C.
Les mélanges réactionnels contenaient, en plus des composants du kit de quantification RT-PCR « Qiagen Qauntitect™probes » (Qiagen), 10 picomoles de chaque amorce, 4 picomoles de chaque sonde et 5 μl d'ARN, dans un volume total de 25 μl. Dans le cas des ARN à tester, 5 μl de la préparation purifiée ont été directement introduits dans le mélange réactionnel, sans étape de dilution préalable. Les ARN synthétiques ont été dilués au 1/10 dans de l'eau exempte de RNAse, et 7 dilutions contenant approximativement 10 à 106 GEQ dans 5 μl ont été quantifiées en parallèle afin de générer la courbe étalon.
Les réactions de quantification ont été réalisées par l'appareil ABIPrism 700™ d'Applied Biosystem, en utilisant le programme suivant : 50°C/30 min, 95°C/15 min, puis 40 cycles de 95 °C/15 sec-60 °C/60 sec. La limite de quantification de l'ARN viral dans ce test est de 2,9 à 3,3 logioGEQ/ml (800 à 2000 GEQ/ml; 4 à 10 GEQ/réaction), selon les cibles PCR (déviation standard: +/-0,3 log-m)
La corrélation entre le titre infectieux et la quantification d'ARN viral a été établie parallèlement aux essais, par analyse de 0,140 ml d'échantillons de sérums de singe négatifs (DO) dans lesquels on a ajouté une quantité connue de particules infectieuses des virus ayant servi à l'immunisation (CYD ou VDV). Lesdits sérums contrôles ont été préparés à deux dilutions contenant environ 1 PFU et environ 100 PFU dans 5 μl (2.3 and 4.3 logi0PFU/ml, respectivement).
Les amorces et sondes utilisées sont données dans le tableau 1 ci-dessous dans lequel sont listés dans l'ordre pour chaque essai les amorces sens et antisens et la sonde. Tableau 1 séquence
YF-NS5 sens 5 1 GCACGGATGTAACAGACTGAAGA (23 bases)
YF NS5 anti 1 CCAGGCCGAACCTGTCAT (1 8 bases)
>-
YF-NS5 1 Fan> CGACTGTGTGGTCCGGCCCATC -Tamra (22 bases) τ CYD1- sens 5 1 CAT TGC AGT TG G CCT G GT AA (20 b)
Q >- CYD1- antis 1 CTT TGG CAA GAG AGA GCT CAA GT (23 b)
O
CYD1- 5 1 FaiThCCG ATC AAO GAT OCG CCA TCA-Tamra (21 b)
CY D 2- sens 1 GTG GGA GTC GTG ACG CTG TA (20 b)
Q
CY D 2- anti 1 GTT GAT GG C GCA TCC TTG ATC (21 b) ϋ
CY D 1 5 1 Fan>TGG GAG TTA TGG TGG GCG C CG -Tamra (21 b)
CYD3- sens1 5 1 AAA ACA CTT CCA TGT CAT TTT CAT G (25b)
Q
>- CY D 3- anti1 5 1 GTT GAT GG C GCA TCC TTG ATC (21 b)
CYD3- 5 'Fam-TG CGATAG GAATTATCA CA CT CTATCTG GGAG C-T amra (33b)
CY D 4- sens 5 ' CTT A GT ATT GTG GAT TGG CAC GAA (24 b) û >- CYD4- anti1 5 1 GCG CCA ACT GTG AAA CCT AGA (21 b)
O
CYD4- 5 '-Fam-AGAA ACACTT CAATOG CAA TGA C GT G CAT-Ta mra (29 b)
__ V DV1 -NS5 sens 1 TCG CAA CAG CCT TAA CAG C (12 b)
Q V DV 1 -NS5 antι 5 1 ACT ATC TCC CTC CCA TCC TTC (21 b)
>
V DV1 -NΞ5 5 1 Fam-TTC ACA CCA CTT C CA C-M GB/NFQ (1 6 b)
V DV2-NS5 sens 5' AAT GAC AGA CAC GAC TCC (1 S b) û V DV2-NS5 anti1 5' CCC AAA ACC TAC TAT CTT CAA C (22 b)
V DV2-NS5 5' Farn-TGG AAG TCG GCA CGT GA-M GB/NFO (1 7 b) Mesure des anticorps neutralisants (test de seroneutralisation) (SN50)). Classiquement, la mesure des anticorps Dengue est établie à l'aide du test PRNT50 (test de neutralisation par réduction à 50% du nombre de PFU). Ce test étant lourd et consommateur de matériel, nous avons développé le test SN50, basé sur la réduction à 50 % du nombre d'unités mesurées en test DICC50.
Dans une plaque de 96 puits, 0,120 ml de chaque sérum décomplémenté est ajouté à 0,480 ml de diluant (ISCOVE 4% SVF) par puits. Des dilutions en série d'un facteur 6 sont réalisées par transfert de 0,150 ml de sérum dans 0,450 ml de diluant. 450 μl de dilution virale à 2,7 log-m DICC50/ml sont ajoutés dans chaque puits de façon à obtenir 25 DICC50/puits. La plaque est incubée à 37°C pendant 1 heure. 100 μl de chaque dilution sont ensuite distribués dans 6 puits d'une plaque de 96 puits dans laquelle des cellules VERO ont été ensemencées 3 jours avant le début de l'expérience à une densité de 8000 cellules/puits, dans 100 μl de milieu ISCOVE 4% SVF. Après 6 jours d'incubation à 37°C, en présence de 5% de CO2, les cellules sont fixées à l'aide d'un mélange éthanol/acétone (70/30) à 4°C pendant 15 minutes, puis lavées à 3 reprises dans du PBS et incubées pendant 1 h à 37°C en présence de 50 μl d'une dilution au 1/2000 d'un anticorps monoclonal anti-flavivirus (mAb 4G2). Les plaques sont ensuite lavées à 2 reprises et incubées 1 H à 37°C en présence de 50 μl d'une dilution au 1/1000 d'une IgG anti-souris conjuguée à la phosphatase alcaline. Les plages de lyse sont révélées par addition de 50 μl d'un substrat coloré : BCIP/NBT. Les titres en anticorps neutralisants sont calculés en utilisant la formule de Karber telle que définie ci-dessous :
logi0SN50 = d + f/N (X + N/2),
Dans laquelle: d représente la dilution conduisant à 100% de neutralisation (soit 6 réplicats négatifs c'est-à-dire ne présentant pas de signe d'infection) f représente le facteur de dilution en Iog10 (e.g. facteur de dilution de 1 :4, f = 0,6) N représente le nombre de réplicats / dilution (N=6)
X nombre total de puits ne présentant aucun signe d'infection, à l'exception de la dilution d
La limite de détection virale est de 10 SN50 (i .e. 1.0 Iog-|0SN50). Les souches virales qui ont été utilisées pour la neutralisation sont les souches
DEN1 16007, DEN2 16681 , DEN3 16562 or DEN4 1036.
Pour les contrôles, les dilutions virales initiales ont été re-titrées.
La corrélation entre le titre neutralisant mesuré en test SN50 et le titre neutralisant mesuré classiquement en test PRNT50 est : log10PRNT50 =
Figure imgf000023_0001
Le titre moyen (GMT) est établi en calculant la moyenne géométrique des titres exprimés en valeur linéaire, les échantillons dont le titre est inférieur au seuil de détection se voient attribuer, par convention, une valeur égale à la moitié de ce seuil.
1.2 Evaluation des immunisations séquentielles
3 groupes de 4 singes d'âge et poids équivalents ont été immunisés (voir tableau 2).
L'immunisation a été effectuée par voie sous-cutanée dans le bras avec une aiguille 23G1 , à une dose 105 DICC50 pour chaque sérotype pour les vaccins CYD DEN 1 à 4. Les VDV-1 et VDV-2 ont été injectés à une dose de 3,96 log-m et 4,84 log-m respectivement.
Tableau 2 : Composition des groupes et protocole d'immunisation
Figure imgf000024_0001
Les résultats d'immunogénicité obtenus après une immunisation (J28) et deux immunisations (J84) sont présentés dans le tableau 3. Les résultats de virémie sont donnés dans le tableau 4.
Tableau 3 : titre neutralisant SN50
Figure imgf000025_0001
- = < 10 SN50 correspondant à la limite de sensibilité du test (titre = 5 pour le calcul de la moyenne géométrique)*
Tableau 4 : Titres de virémie
1ère immunisation (DO) 2eme immunisation (D56)
Groupe Singe tγpe D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 type D58 D59 D60 D61 D62 D63 D64 D65 D66
I AM633 VDV1 LYD3
VDV2 3,928 3,54 LYD4 3,613 - 3,075
(ι)VDV 1 ,2 AME34 VDV1 LYD3 (ιι)CYD3,4 VDV2 4,08 4,75 5,14 5,38 2,93 4,42 3,42 CYD4 2,986
AM941 VDV1 CYD3 VDV2 4,191 4,015 4,341 4,897 4,894 4,276 - 2,754 CYD4 3,444
AN045 VDV1 - CYD3 VDV2 3,446 4,108 4,905 4,968 4,749 3,175 2,908 - CYD4 2,97 2,95 3,344 3,509 3,40 -
2 AM637 CYD I 3,32 - - - - - CYD3 - - - CYD2 CYD4 5,209 4,629 3,664 2,985 -
(ι)CYD1 ,2 AN002 CYDI CYD3 (ιι)CYD3,4 CYD2 CYD4 3,559 - - 3,674 3,835 3,573 3,587 3,30
AN013 CYDI CYD3 CYD2 CYD4
AN073 CΎDI »VD3
CΥD2 »VD4 3,73 3,50 3,111 2,8 3,337 3,068 3,284 -
6 AM496 CYD 1 LYDI CYD2 - LYD2 - - - - -
(ι)CYD1-4 CYD3 CYD3 (ιι)CYD1-4 CYD4 4,221 3,363 3,711 4,154 3,145 3,579 LYD4
AM645 CYD 1 3,27 LYDI CYD2 LYD2 CYD3 3,55 LYD3 CYD4 3,66 3,607 2,82 3,514 3,654 3,238 3,475 3,443 CYD4
AM766 CYD 1 CYDI CYD- - - CYD2 - - - - CYD3 CYD3 CYD4 3,966 3,06 3,378 4,193 3,80 3,729 CYD4
AM813 CYD 1 CYDI
CYDi CYD2 CYD 3 - - - CYD3 - - - - CYD4 4,813 4,603 3,173 2,85 CYD4
-5 Corrélation entre GEQ and PFU
Ratio GEQ/PFU de 2.7 log10 (soit : 1 PFU = 500 GEQ) pour les sera positifs en YF ou
CYDs ratio GEQ/PFU de 2.5 log10 (soit : 1 PFU = 320 GEQ) pour les sera positifs en VDVl ou VD V2
10 Limites de quantification : :
< 3.3 logioGEQ/ml (soit : <4 PFU/ml) pour les qRT-PCR YF et CYDs
< 2.9 logioGEQ/ml (soit: < 2.5 PFU/ml) pour les qRT-PCR VDVl et VD V2
15 Brièvement, les résultats peuvent être résumés comme suit :
- Le schéma d'administration selon la présente invention permet d'augmenter qualitativement et quantitativement la réponse anticorps neutralisante homologue qui est obtenue avec la vaccination tétravalente.
- L'immunisation bivalente CYD-1 ,2 suivie deux mois plus tard par une immunisation CYD-3,4 induit des réponses homologues élevées contre les quatre sérotypes chez tous les singes. De la même manière, les mêmes bonnes réponses sont observées après une administration de VDV-1 ,2 suivie de CYD-3,4.
- Un résultat remarquable est le fort effet stimulateur des sérotypes CYD-3,4 sur les réponses induites par CYD-1 ,2 après primo vaccination. On peut noter une augmentation des réponses anticorps neutralisantes homologues mais aussi hétérologues. Ce phénomène pourrait s'expliquer par un effet helpeur positif de la réponse anti-NS- fièvre jaune sur les réponses anti-E, sans immunodominance. Des épitopes E à réactivité croisée peuvent aussi jouer un rôle. Paradoxalement, cet effet stimulant n'est pas observé après un rappel tétravalent, dans la mesure où ne sont rappelées que les réponses dominantes E induites après primo-vaccination (ici 3). - La virémie (tableau 4) est causée de manière prédominante par CYD-4 dans le cas des vaccins CYD et aucune différence n'est observée entre deux administrations bivalentes séquentielles et une administration tétravalente (groupe 2 contre groupe 3). Ainsi, aucune différence en terme de sécurité après deux immunisations bivalentes ou une immunisation tétravalente n'est attendue. On observe même plutôt une tendance à une plus faible virémie avec le schéma vaccinal selon l'invention, voir par exemple le groupe 2 par rapport au groupe 3.
Exemple 2 : Immunisation séquentielle chez le singe conduite à 1 mois d'intervalle. Comparaison des schémas CYD-1 ,2 suivis par CYD-3,4 versus CYD-2,3 suivis par CYD-1 ,4
La virémie et l'immunogénicité ont été testées dans un modèle singe comme dans l'exemple précédent. Dans le présent exemple, un intervalle d'un mois a été utilisé entre les deux immunisations contre deux mois dans l'exemple précédent. La primo-immunisation réalisée avec les deux virus vaccinaux les moins immunogènes chez le singe (CYD-2,3) est suivie par une administration avec les deux virus vaccinaux immunodominants (CYD-1 ,4).
2.1 Matériels et méthodes : identiques à l'exemple 1
2.2 Evaluation des immunisations séquentielles à un mois d'intervalle 3 groupes de 4 singes d'âge et poids équivalents ont été immunisés.
(voir tableau 5)
L'immunisation a été effectuée par voie sous-cutanée dans le bras avec une aiguille 23G1 , à une dose 105 DICC5O pour chaque sérotype pour les virus vaccinaux CYD DEN 1 à 4 comme précédemment
Tableau 5 : Composition des groupes et protocole d'immunisation
Figure imgf000028_0001
Les résultats d'immunogénicité obtenus après une immunisation (J28) et deux immunisations (J56) sont présentés dans le tableau 6.
Les résultats de virémie sont similaires à ceux présentés dans l'exemple 1 , montrant une virémie faible induite par CYD4 et une absence de différence significative entre les différents groupes. Tableau 6 : SN 50
Figure imgf000029_0001
ND : non déterminé
- : = < 10 SN50 correspondant à la limite de sensibilité du test
Brièvement, les résultats complètent ceux obtenus dans l'exemple 1 et peuvent être résumés comme suit :
- Le schéma d'administration selon la présente invention permet d'augmenter qualitativement et quantitativement la réponse anticorps neutralisante homologue qui est obtenue avec la vaccination tétravalente lorsque les deux immunisations sont effectuées à 1 mois d'intervalle.
- L'immunisation bivalente CYD-1 ,2 suivie un mois plus tard par une immunisation CYD-3,4 (groupe 2) induit des réponses homologues élevées contre les quatre sérotypes chez tous les singes, avec une dominance des sérotypes 1 et 4.
- Dans ce groupe, l'effet rappel sur les sérotypes 1 et 2 est moins marqué lorsque la seconde administration est faite après un mois que lorsqu'elle est faite après 2 mois comme dans l'exemple 1
- Lorsque les immunisations débutent par les sérotypes moins immunogènes (CYD-2,3) et que le rappel est fait avec les sérotypes les plus forts (CYD-1 ,4), la réponse obtenue est mieux équilibrée avec une moindre dominance des sérotypes 1 et 4 (groupe 3)
- ces résultats confirment ceux obtenus dans l'exemple 1 qui montrent qu'une immunisation faite de façon séquentielle avec deux bivalents est efficace pour induire une réponse contre tous les sérotypes chez tous les animaux, et ce, même lorsque le rappel est effectué seulement 1 mois après le primo-immunisation.

Claims

Revendications
1. Compositions vaccinales comprenant (i) une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype, comme composition vaccinale de combinaison contre la dengue pour une administration séquentielle, dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés au moins 30 jours et au plus 1 ans après l'administration des virus vaccinaux de la dengue (i).
2. Compositions vaccinales selon la revendication 1 , dans lesquelles les virus vaccinaux (ii) sont administrés 30 jours à 3 mois après l'administration des virus vaccinaux (i).
3. Compositions vaccinales selon la revendication 1 ou 2, dans lesquelles les virus vaccinaux de la dengue (i) sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
4. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lesquelles les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
5. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et d'un ChimeriVax™ DEN-1.
6. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimeriVax™ DEN-2.
7. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2.
8. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimeriVax™ DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimeriVax™ DEN-2.
9. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimeriVax™ DEN-3.
10. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications
1 à 9, dans lesquelles ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimeriVax™ DEN-4.
1 1. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 8 à 10, dans lesquelles les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD DEN1 et CYD DEN2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN 3 et CYD DEN 4.
12. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lesquelles les virus vaccinaux (ii) sont administrés 30 jours après l'administration des virus vaccinaux (i).
13. Compositions vaccinales selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lesquelles les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotype 1 , 2, 3 et 4 sont chacune comprise dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50.
14. Utilisation d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype pour la fabrication d'un vaccin contre la dengue destiné à être administré à un patient ayant reçu, au moins 30 jours et au plus 1 ans auparavant, une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype.
15.- Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle les troisième et quatrième sérotypes sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, dans laquelle les premier et deuxième sérotypes sont administrés sous forme d'une composition vaccinale bivalente.
17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et un ChimeriVax™ DEN-1.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimeriVax™ DEN-2.
19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimeriVax™ DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimeriVax™ DEN-2.
21. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimeriVax™ DEN-3.
22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 21 , dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimeriVax™ DEN-4.
23. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 18 et 20 à 22, dans laquelle les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD
DEN1 et CYD DEN2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN 3 et CYD DEN 4 .
24. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 23, dans laquelle les troisième et quatrième sérotypes sont administrés 30 jours à 3 mois après l'administration des premier et deuxième sérotypes.
25. Utilisation selon la revendication 24, dans laquelle les troisième et quatrième sérotypes sont administrés 30 jours après l'administration des premier et deuxième sérotypes.
26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 24, dans laquelle les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotype 1 , 2, 3 et 4 sont chacune comprise dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50.
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