JP2002538842A

JP2002538842A - 大量のスクリーニングのためのレンチウイルスベクター系

Info

Publication number: JP2002538842A
Application number: JP2000605794A
Authority: JP
Inventors: ウェインエイ．マラスコ，; サンドラオグエタ，
Original assignee: デイナ−ファーバーキャンサーインスティチュート，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2002-11-19
Also published as: AU3893000A; AU4012100A; EP1165842A1; WO2000055378A1; US6830892B2; WO2000055335A9; US20020155430A1; CA2366054A1; WO2000055335A1; EP1165842A4

Abstract

(57)【要約】潜在的な標的分子の群由来の標的分子についてのスクリーニング方法が記載される。本方法は、レンチウイルスベクターのライブラリーの使用を含む。ここでこの群は標的分子の群をコードし、次いで細胞の群を形質導入し、そして所望の表現型について形質導入された細胞をスクリーニングする。所望の表現型を示す細胞を選択し、そして標的分子を同定する。本発明の方法は、複数のレンチウイルスビリオンで複数の細胞を形質導入する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、国立衛生研究所助成金５ＰＯＨＬ５９３１６−０２および５Ｐ３
０ＡＩ２８６９１−１０により一部資金提供された。米国政府は、本発明に対
して一定の権利を有する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、ベクター系に関する。このベクター系では、複数のレンチウイルス
ベクターが、宿主細胞に大量の核酸セグメント（ライブラリー）を移入するため
に使用される。好ましくは、この系は、核酸セグメントを発現するために誘導可
能な発現系を使用し、そしてレンチウイルスベクターは、偽型（ｐｓｅｕｄｏｔ
ｙｐｅｄ）レンチウイルスベクターである。なおより好ましくは、この系は、細
胞内で発現されかつ細胞内でその標的抗原（イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏ
ｄｙ））に結合する抗体をコードする核酸セグメントを使用する。

【０００３】（発明の背景）近年、かなりの試みが遺伝子送達技術の適用に向けられている。この期間、種
々の異なる物質を細胞に送達するために、生物工学的組換え技術を使用する広範
な種々の方法が記載されている。これらの方法としては、例えば、ウイルスベク
ターのようなベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ（ａ
ｄｊｕｖａｎｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄＤＮＡ）、遺伝子銃、カテーテルなどが挙
げられる。使用される種々の技術は、移入される遺伝子およびそれ故の目的に、
一部依存する。従って、例えば、より長い間永続的でさえある遺伝子発現が所望
される状況とは対照的に、わずかに短期間の遺伝子発現が所望される状況が存在
する。

【０００４】探求されていたベクターとしては、ＤＮＡウイルスベクターおよびＲＮＡウイ
ルスベクターの両方が挙げられる。例えば、ＤＮＡベクターとしては、以下が挙
げられる：オルトポックスまたはトリポックスベクター（例えば、米国特許第５
，６５６，４６５号を参照のこと）のような、ポックスベクター；単純ヘルペス
ウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクターのような、ヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌ
ｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：４８７（１９９５）；Ｌｉ
ｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＭａｍｍａｌｉａｎＳｙｓｔｅｍｓ、
Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅ
ｎｇｌａｎｄ（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）］；アデノウイル
スベクター［ＬｅｇａｌＬａｓａｌｌｅら、Ｓｃｉ．２５９−９８８（１９９
３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙ
ａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：２００４（１９９５）］；ならびに、アデ
ノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
８；１４８（１９９４）］。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス
白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）［米国特許
第５，６６５，５７７号を参照のこと］が挙げられる。

【０００５】多くの注目が、特にインビボ治療（例えば、体細胞治療または直接的インビボ
適用における）のためのウイルスベクターの使用に焦点をあててきたが、他の適
用が存在する。

【０００６】例えば、レトロウイルスベクターは、宿主細胞に感染し、そして遺伝物質をそ
の宿主細胞内に高い効率で組み込ませるために使用され得る。このようなベクタ
ーの１つの例が、改変モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であり、これ
は、レトロウイルスゲノム全体のパッケージングを妨げるために、欠失されたそ
のパッケージング配列を有している。しかし、このレトロウイルスは、休止して
いる細胞を形質導入しない。さらに、多くのレトロウイルスは代表的に、特定の
レセプターを介して細胞に進入するので、その特定のレセプターが、細胞上に存
在しないかまたは十分多数では存在しない場合、その感染は可能でないか、また
は非効率的であるかのいずれかである。懸念は、組換えＭＭＬＶ産生細胞株から
の野生型ウイルスの出現の結果（すなわち、復帰変異）としても表される。

【０００７】近年、注目は、霊長類レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））に基づくベクターのような、レン
チウイルスベクターに焦点をあてている。ＨＩＶベクターは、分裂細胞に加えて
休止細胞に感染し得る。さらに、偽型ベクター（すなわち、異なる種由来のエン
ベロープタンパク質を使用するベクター）を使用することにより、広範な細胞型
に感染する際に遭遇する問題は、感染することが所望される細胞に基づいた特定
のエンベロープタンパク質を選択することによって克服され得る。さらに、レン
チウイルス（例えば、ＨＩＶ）において見られる複雑な遺伝子スプライシングパ
ターンを考慮すると、レンチウイルスコア（例えば、ＨＩＶコア）を有する多価
ベクター（すなわち、複数遺伝子を発現するベクター）は、より効率的であると
予期される。ＨＩＶに基づくベクターが提供するこの利点にも関わらす、ＨＩＶ
感染の重篤度の観点から、ＨＩＶベクターの使用に伴う懸念がなお存在する。従
って、野生型ウイルスへの復帰の可能性が低い、さらなる弱毒化形態を提供する
ための手段が所望される。

【０００８】複数の改変をなすバリエーション（例えば、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、および
ｖｐｒ遺伝子の欠失）が、作製され得る。１つには、３’および５’のＵ３欠失
ＬＴＲもまた有し得る。

【０００９】しかし、このような場合、ベクターは、単一の異種遺伝子または少群の遺伝子
を送達することが意図される。

【００１０】近年では、発現配列タグ（ＥＳＴ）の使用のような進歩が、多数の遺伝子、推
定遺伝子およびそれらの発現産物の同定へと導いた。ヌクレオチド配列とアミノ
酸の比較は、これらの遺伝子、推定遺伝子、および発現産物の分類へと導き得る
が、しばしば、この遺伝子産物の特定機能は未知なままである。このような遺伝
子および遺伝子産物の機能を同定するための迅速な手段を有することが所望され
る。

【００１１】Ｍａｒａｓｃｏらは、細胞内で抗体を発現させ得、そしてその抗体をその細胞
内の標的に結合させ得る方法を発見した［ＭａｒａｓｃｏおよびＨａｓｅｌｔｉ
ｎｅに対する米国特許第５，８５１，８２９号を参照のこと］。これらの細胞内
で発現される抗体（イントラボディー）は、機能ゲノム学（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌｇｅｎｏｍｉｃｓ）の方法において使用され得る。この方法では、遺伝子産
物を発現する特定の未知の遺伝子を採取し得、この遺伝子産物を使用してこの遺
伝子産物に対する抗体を生成し得、そして細胞内でこの抗体を使用して細胞内の
推定タンパク質を「ノックアウト」し得る。従って、インビボ系およびインビト
ロ系の両方において、その遺伝子産物の欠損が細胞に対して有する影響を決定す
るために、その細胞をコントロールと比較し得る。この方法は、特異的抗原およ
びその抗原に対する抗体の生成を必要とする。特定の群の多数のメンバーを用い
て、このアプローチの効率を利用する方法を有することが所望される。

【００１２】近年では、関連した群の複数のメンバーからなる大きなライブラリーを開発す
ることに関心が寄せられている。例えば、抗体（代表的には、モノクローナル抗
体）のライブラリー。例えば、抗原結合抗体フラグメントが、糸状ファージの表
面において発現され［Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５
（１９８５）］、そしてこのような抗体の大きなライブラリー（例えば、１０⁷
以上のメンバー）（ファージディスプレイライブラリーと呼ばれる）を作製する
ために使用されている。

【００１３】ファージディスプレイライブラリーでは、ＦｄまたはＦｖ領域のカルボキシル
末端末を、ファージコートタンパク質のフラグメントに固着し、このフラグメン
トが、例えば、Ｆａｂフラグメントをファージ表面に固定する。抗原結合部位は
、Ｖ_H−ドメインおよびＶ_L−ドメインの組み合わせから形成される。ファージデ
ィスプレイライブラリーは、アフィニティークロマトグラフィーによって［Ｒ．
Ｐ．Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９（１９９２）］
または抗原をコーティングした表面に対してファージをパニングすることによっ
て［Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４３６３（１９９１）］、特異的抗原への結合について選択され得る。
抗体は、特異的タンパク質へのアフィニティー結合によって選択される。しかし
、抗原が未知の機能を有する場合、この方法論は、このタンパク質の機能の決定
を可能としない。

【００１４】特定の機能を生じる任意の分子を探索し得、そしてその分子（例えば、タンパ
ク質）を迅速に決定し得る方法を有することが、非常に所望される。上記のこと
を、所望の分子の迅速な同定を可能にする自動化された様式で実施し得ることが
、非常に所望される。

【００１５】（発明の要旨）本発明者らはここに、分子の大きなプールの中から、所望の機能を生じる分子
を同定および獲得するための方法を発見した。本方法は、複数のベクターを使用
することを包含し、ここでこのベクターの群は、複数の異なる標的分子を含む。
この標的分子は、多様性（例えば、遺伝的多様性）を有する任意の分子であり得
る。この分子は、抗体のようなタンパク質、増殖因子、レセプター、サイトカイ
ン、ペプチド、リボザイム、およびアンチセンス分子であり得る。好ましくは、
標的分子は、抗体のようなタンパク質をコードする遺伝子である。より好ましく
は、核酸配列が、誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。このベクタ
ーは、複数の細胞を形質導入するために使用され得る。好ましくは、ベクターは
、迅速な同定および形質転換細胞の選択を可能にするためのマーカー遺伝子を含
む。その後、これらの細胞は、所望の表現型を示す細胞を同定するためにスクリ
ーニングされる。所望の表現型を示す細胞が選択され、そしてこの表現型を生じ
る特定の標的分子が同定される。

【００１６】１つの好ましい実施形態では、複数のベクターは、レンチウイルスベクターで
ある。これらのレンチウイルスベクターは、好ましくは選択可能マーカーを含む
。

【００１７】レンチウイルスベクターとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、
またはビスナウイルスが挙げられる。このようなレンチウイルスコア（例えば、
ｇａｇ）を含むベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入し得る
。

【００１８】レンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を生成するた
めに必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。好
ましくは、プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組み込みに必要
とされるレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくと
も１つのベクターが存在する。好ましくは、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクタ
ーによって発現される。プライマーに作動可能に連結された、ウイルスカプシド
形成に必要とされるレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含
むベクターもまた存在する。１つの実施形態では、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、同
一ベクター上にある。好ましくは、ｇａｇ核酸配列は、少なくともいくつかのｐ
ｏｌ核酸配列とは別個のベクターにあり、なおより好ましくは、ｐｏｌタンパク
質をコードするすべてのｐｏｌ核酸配列とは別個のベクターにある。

【００１９】１つの実施形態では、ｇａｇ配列は、機能的ＭＡタンパク質を発現しない（す
なわち、ミリスチル化アンカーが提供される場合に、このベクターはなお、ＭＡ
全体またはその部分の非存在下において細胞を形質導入し得る）。これは、ＭＡ
をコードする領域の付加、置換、または欠失によって、ＭＡをコードする「遺伝
子」を不活化することによって達成され得る。好ましくは、これは欠失によって
実施される。好ましくは、少なくとも２５％のＭＡコード領域が欠失され、より
好ましくは、少なくとも５０％が欠失され、なおより好ましくは、少なくとも６
０％、さらにより好ましくは、少なくとも７５％、なおより好ましくは、少なく
とも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９５％、そして最も好ましくはコ
ード領域全体が欠失される。しかし、この実施形態において、ミリスチル化アン
カー（配列）はなお必要とされる。好ましくは、ミリスチル化配列は、異種（す
なわち、非レンチウイルス）配列である。

【００２０】別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、３’長末端反復領域（ＬＴＲ
）における欠失の結果として、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターのアンカー形態で
ある。好ましくは、このベクターは、ウイルスプロモーターにおいて欠失を含む
。レンチウイルスのＬＴＲ（例えば、ＨＩＶＬＴＲ）は、ウイルスプロモータ
ーを含む。このプロモーターは比較的非効率的であるが、例えば、ｔａｔによっ
てトランス活性化される場合には、このプロモーターは効率的である。なぜなら
、ｔａｔ−媒介トランス活性化が、約１００倍転写率を増加させるからである。
しかし、ウイルスプロモーターの存在は、導入遺伝子に作動可能に連結された異
種プロモーターを干渉し得る。このような干渉を最小化するため、そして導入遺
伝子の発現をより良好に調節するために、レンチウイルスプロモーターは、好ま
しくは欠失される。

【００２１】好ましくは、このベクターは、ウイルスプロモーター内に欠失を含む。そのウ
イルスプロモーターは、３’ＬＴＲのＵ３領域に存在する。好ましい欠失は、Ｓ
ｃａＩ部位とＰｖｕＩ部位との間の１２０塩基対である欠失である（例えば、Ｈ
ＩＶ−１プロウイルスクローンＨＸＢ２のヌクレオチド９３９８−９５１８に対
応し、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーターの必須コアエレメント（ＴＡＴＡボックス
、ＳＰ１およびＮＦ−κＢ結合部位）を含む）。逆転写後、この欠失は、５’Ｌ
ＴＲへ転移されて、複製の次の回転（ｒｏｕｎｄ）において５’ＬＴＲからのベ
クター転写物を合成し得るベクター／プロウイルスを得る。従って、本発明のベ
クターはウイルスタンパク質を発現し得ないので、そのベクターは、ウイルスが
複製し得る機構を含まない。

【００２２】別の実施形態において、このベクターは、ｔａｔ欠失ベクターである。これは
、公知の技術（例えば、ｔａｔの少なくとも第１エキソンを欠失させること）に
よって、ｔａｔの少なくとも第１エキソンを不活化することによって達成され得
る。あるいは、ＴＡＲエレメントを除去するために、Ｕ３ＬＴＲ欠失をＲ領域へ
伸長し得る。

【００２３】レンチウイルスベクターが、野生型レンチウイルスと比較して複数の改変を有
する場合、バリエーションが作製され得る。例えば、ＨＩＶについては、ｎｅｆ
−、ｒｅｖ−、ｖｐｕ−、ｖｉｆ−およびｖｐｒ−である。さらに、ＭＡ−ｇａ
ｇ、３’および５’Ｕ３欠失ＬＴＲならびにそれらのバリエーションを有し得る
。

【００２４】このベクターは、レンチウイルスＲＮＡをパッケージするレンチウイルスゲノ
ム（レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる）に由来するヌクレオチドを
含まない。ＨＩＶにおいて、この領域は、５’主要スプライスドナーとｇａｇ遺
伝子開始コドン（ヌクレオチド３０１〜３１９）との間の領域に対応する。

【００２５】粒子を形成するｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌベクターは、エンベロープタンパ
ク質を発現するレンチウイルスゲノムに由来する核酸配列を好ましくは含まない
。好ましくは、個々のベクターは、使用されるプロモーターと作動可能に連結さ
れるエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。このｅｎｖベクター
はまた、レンチウイルスパッケージング配列を含まない。一つの実施形態におい
て、このｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードす
る。

【００２６】別の実施形態において、このエンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来
ではないが、異なるウイルスに由来する。結果として生じる粒子は、偽型粒子と
呼ばれる。エンベロープの適切な選択によって、実質的に任意の細胞に「感染」
させ得る。従って、そのベクターは、特定の細胞に対して容易に標的化され得る
。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、αウイルス（セムリキ森林ウ
イルス、シンドビスウイルス）アレナウイルス（リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）
、フラビウイルス（ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス）、ラブドウイル
ス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、およびオルトミクソウイルス（
インフルエンザウイルス）の例えばエンドサイトーシス画分を標的とするエンベ
ロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用し得る。

【００２７】好ましいレンチウイルスは、霊長類のレンチウイルス［米国特許第５，６６５
，５７７号］またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）［Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｅ．
Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：３５４−３５７（１９９８）］である
。ｐｏｌ／ｇａｇ核酸セグメントおよびｅｎｖ核酸セグメントは、発現された場
合に、空のレンチウイルス粒子を産生する。上記の改変（例えば、ｔａｔコード
領域、ＭＡコード領域、またはＬＴＲのＵ３領域を欠失させること）をすること
によって、野生型ウイルスへの先祖返りの可能性が減少される。

【００２８】異種核酸セグメントの所望のファミリー（しばしば、標的分子として言及され
る）は、各々が目的の核酸セグメントおよびレンチウイルス粒子内へレンチウイ
ルスＲＮＡをパッケージするために必要なレンチウイルスパッケージング配列を
含む、複数のベクター（パッケージングベクター）の使用によって、空のレンチ
ウイルス粒子内へ挿入され得る。好ましくは、パッケージングベクターは、５’
および３’レンチウイルスＬＴＲの間に挿入される所望の核酸セグメントを有す
る５’および３’レンチウイルスＬＴＲを含む。核酸セグメントは、アンチセン
ス分子であり得るか、またはより好ましくは、抗体のようなタンパク質をコード
する。パッケージングベクターは、好ましくは選択マーカーを含む。これらは、
当該分野において周知であり、そして例えば、栄養分、抗生物質などのような刺
激物に対する細胞の感受性を変える遺伝子を含む。遺伝子は、ｎｅｏ、ｐｕｒｏ
、ｔｋ、多重薬物耐性（ＭＤＲ）などに対する遺伝子を含む。他の遺伝子は、例
えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ルシフェ
ラーゼ、ＬａｃＺ、神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）などについて容易にス
クリーニングされ得るタンパク質を発現する。

【００２９】誘導性プロモーターが標的分子と共に使用される場合、標的分子が「沈黙」さ
せられる形質転換細胞に対して最少の選択圧が用いられる。従って、マーカーを
表示する細胞の同定はまた、標的分子を発現し得る細胞を同定する。誘導性プロ
モーターが使用されない場合、「強制的発現」系を使用することが好ましく、こ
こで標的分子は、内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）［Ｍａｒａｓｃｏら
、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと］の使用によって選択マーカーと
連結される。

【００３０】ＩＲＥＳ配列は、当該分野において公知であり、そして脳心筋炎（ｅｎｃｅｐ
ｈａｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するＩＲＥＳ配列
［Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１：５８４
８−５８４９（１９９１）］；ＢｉＰタンパク質［ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒ
ｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９１（１９９１）］；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの
Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エキソンｄおよびｅ）［Ｏｈら、Ｇｅｎｅ＆
Ｄｅｖ．，６：１６４３−１６５３（１９９２）］；ポリオウイルスにおけるＩ
ＲＥＳ配列［ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ３
３４：３２０３２５（１９８８）；またＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，
ＴＩＧ，１１：１７９−１８４（１９８５）を参照のこと］を含む。好ましくは
、その標的分子は、誘導性プロモーターと作動可能に連結される。そのような系
は、遺伝子発現の慎重な調節を可能にする。Ｍｉｌｌｅｒ，ＮおよびＷｈｅｌａ
ｎ，Ｊ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，８；８０３−８１５（１９
９７）を参照のこと。そのような系としては、ｌａｃオペレーター保有哺乳動物
細胞プロモーターに由来する転写を調節するための転写モジュレーターとしてＥ
．ｃｏｌｉに由来するｌａｃリプレッサーを使用する系［Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．ら、
Ｃｅｌｌ，４９：６０３−６１２（１９８７）］およびテトラサイクリンリプレ
ッサー（ｔｅｔＲ）を使用する系［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ
．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５
１（１９９２）；Ｙａｏ，Ｆら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，９：
１９３９−１９５０（１９９８）；Ｓｈｏｃｋｅｌｔ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６５２２−６５２６（１９９５）］が
挙げられる。他の系としては、エストラジオール、ＲＵ４８６、ジフェノールム
リスレロン（ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）またはラパマイシン［Ｍｉｌｌｅｒおよ
びＷｈｅｌａｎ、図２にて前出］を使用するＦＫ５０６ダイマー、ＶＰ１６また
はｐ６５が挙げられる。誘導性系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
およびＡｒｉａｄから入手可能である。オペロンを有するリプレッサーを使用す
る系が好ましい。標的細胞における導入遺伝子発現の調節は、遺伝子治療の重要
な局面を表わす。例えば、転写活性化因子（ＶＰ１６）を有するテトラサイクリ
ンリプレッサー（ｔｅｔＲ）と結合したｌａｃリプレッサーを使用して、哺乳動
物細胞における遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を
作成するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要（ｍａｊｏｒ）即時性−初
期プロモーターに由来するｔｅｔＯ−保有最少プロモーターを用いて、ｔｅｔＲ
−哺乳動物細胞転写活性化因子融合タンパク質、ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６）
を作成し得る。最近、Ｙａｏおよびその仲間［Ｆ．Ｙａｏら、ＨｕｍａｎＧｅ
ｎｅＴｈｅｒａｐｙ、前出］は、ｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写因子融合誘導体
よりもむしろテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）単独が、テトラサイク
リンオペレーターがＣＭＶＩＥプロモーターのＴＡＴＡエレメントに対して下流
に適切に配置される場合、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するための強
力なトランス−モジュレーターとして機能し得ることを実証した。このテトラサ
イクリン誘導スイッチの一つの特定の利点は、それが、その調節可能な効果を達
成するためにテトラサイクリンリプレッサー−哺乳動物細胞トランス活性化因子
またはリプレッサー融合タンパク質（これはいくつかの場合において細胞に対し
て毒性であり得る）の使用を必要としないということである［Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５
１（１９９２）；Ｐ．Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，９２：６５２２−６５２６（１９９５）］。好ましくは、このリ
プレッサーは、ＩＲＥＳ配列によって標的分子を連結される。好ましくは、誘導
系は、ｔｅｔＲ系である。より好ましくは、この系は、例えばＣＭＶＩＥプロモ
ーターを有するプロモーターのＴＡＴＡエレメントの下流にテトラサイクリンオ
ペレーターを有する。図４を参照のこと。

【００３１】使用される標的分子は、好ましくは、細胞内に発現されることが意図される抗
体をコードする遺伝子を有する。抗体は、標的抗原の同定操作、精製操作および
機能的操作のためのインビトロ手段として、生物医学科学において長い間使用さ
れてきた。その上、抗体は、診断用途および治療用途のためにインビボで開発さ
れてきた。抗体工学における最近の進歩は、現在、抗体をコードする遺伝子を操
作することを可能にし、その結果、抗原結合ドメインが細胞内に発現され得る。
ラージ（ｌａｒｇｅ）ヒト免疫グロブリンライブラリーの産物と結合される、抗
体の特異的かつ高親和性結合特性および哺乳動物細胞内の正確な細胞内位置で安
定に発現されるそれらの能力は、遺伝子治療用途のための強力な新しいファミリ
ーの分子を提供してきた。これらの細胞内抗体は、「内抗体」と呼ばれる［Ｗ．
Ｍａｒａｓｃｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：１１−１５（１９９７）］
。好ましくは、この遺伝子は、単鎖抗体をコードする。この分子は、好ましくは
タグ（例えばＨＡ）を含み、それゆえその分子は、後で同定され得る。

【００３２】この抗体は、好ましくは抗体のラリブラリー（例えば、ファージディスプレイ
ライブラリー）から得られる。

【００３３】その後、レンチウイルスベクターを使用して、宿主細胞を形質導入する。マー
カーについてスクリーニングすることによって、形質導入された細胞を迅速に選
択し得る。その後、形質導入された細胞を取得し得、そしてそれらを適切な条件
下で増殖させるか、またはそれらの細胞（例えば、脾臓細胞または生殖細胞）を
宿主動物へ挿入し得る。

【００３４】プロモーターが誘導されて、次いで特定の表現型を表示する細胞および／また
は動物についてスクリーニングする。その分子上に含まれるタグを使用して（例
えば、抗体）、その分子（例えば、所望の表現型において生じた抗体）を獲得し
得る。次いで、一つの例において、その抗体を使用してそれが結合する抗原を同
定し得る（所望される場合）。

【００３５】この方法は、多数の分子を使用して任意のメンバーの特定の同一性を知るため
の第１の必要性（ｎｅｅｄｉｎｇ）を伴わずに、分子の多数の基に由来する所望
の機能を提供する特定分子を同定し得る。

【００３６】（発明の詳細な説明）本発明者らは、今や、分子の大きなプールから所望の機能を生じる分子を同定
および得るための方法を見出した。この方法は、複数のベクターを使用する工程
を包含し、ここでベクターの群は、複数の異なる標的分子を含む。標的分子は、
多様性（例えば、遺伝的多様性）を有する任意の分子であり得る。これらの分子
は、タンパク質（例えば、抗体、成長因子、レセプターおよびサイトカイン、ペ
プチドならびにアンチセンス分子）であり得る。好ましくは、標的分子は、タン
パク質（例えば、抗体）をコードする遺伝子である。より好ましくは、タンパク
質は、誘導プロモーターに作動可能に連結されている。このベクターは、複数の
細胞を形質導入するために使用され得る。好ましくは、ベクターは、形質転換さ
れた細胞の迅速な同定および選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。従って、
これらの細胞は、所望の表現型を示す細胞を同定するために、スクリーニングさ
れる。所望の表現型を示す細胞を選択し、そしてその表現型において生じる特定
の標的分子を同定する。

【００３７】１つの好ましい実施形態において、複数のベクターは、レンチウイルスベクタ
ーである。これらのレンチウイルスベクターは好ましくは、選択マーカーを含む
。

【００３８】これらのレンチウイルスベクターとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、またはビスナウイルスが挙げれら
る。このようなレンチウイルスコア（例えば、ｇａｇ遺伝子）を含むベクターは
、分裂および非分裂細胞の両方を形質導入し得る。

【００３９】レンチウイルスのプレ統合（ｐｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）複合体、レンチ
ウイルスのファミリー（ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を含む）は、
核標的シグナルを保有することを示した。この核保有シグナルは、これらのウイ
ルスがマクロファージを含む非分裂細胞を感染することを可能にする。非分裂細
胞を安定に形質導入するＨＩＶ−１ベクターの能力［Ｐ．Ｌｅｗｉｓら、ＥＭＢ
ＯＪ．，１１：３０５３〜３０５８（１９９２）；Ｍ．Ｂｕｒｉｎｓｋｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６５８０〜６５８４（
１９９２）］は、インビトロ［Ｊ．Ｒｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１５２６６〜１５２７１（１９９６）］、またイ
ンビボ［Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３〜２６７（１
９９６）］で示された。従って、これらのベクターは、長期間の発現が可能であ
る。

【００４０】ＨＩＶ−１に基づくベクターの第２の特徴は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タン
パク質、ｇｐ１６０を、他のウイルス（広がった宿主範囲を与え、その宿主範囲
は、特的に標的化され得る）由来のエンベロープタンパク質で置換することによ
って標的細胞の範囲を操作する能力である。例えば、小胞口のウイルス（ＶＳＶ
）−Ｇタンパク質のＧタンパク質とＨＩＶ−１ビリオンコアとの間の強い関連は
、感染力の損失なしにウイルス粒子が濃縮されることを可能にし、そしてＨＩＶ
−１ベクターストック（約１０⁹／ｍｌの力価を有する）の産生を可能にした［
Ｊ．Ｒｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：
１５２６６〜１５２７１（１９９６）；Ｒ．Ａｋｋｉｎａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，７０；２５８１〜２５８５（１９９６）；Ｊ．Ｙｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９５６４〜９５６８（１９９４）］。従っ
て、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１ベクター）を、臨床的に有用
な程度まで開発し、そして分裂および非分裂細胞の両方の操作のためのインビボ
ツールとしての注目に値する可能性を提供する。

【００４１】レンチウイルスビリオン（粒子）を、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するた
めに必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現する。好ま
しくは、逆転写および統合に必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードす
る核酸配列（プロモーターに作動可能に連結された）を含む少なくとも１つのベ
クターが存在する。好ましくは、このｐｏｌタンパク質は、多重ベクターによっ
て発現される。ウイルスカプシドの形成に必要なレンチウイルスｇａｇタンパク
質をコードする核酸配列（プロモーターに作動可能に連結された）を含むベクタ
ーがまた存在する。好ましくは、このｇａｇ核酸配列は、少なくともいくつかの
ｐｏｌ核酸配列とは、別のベクター上にあり、さらにより好ましくは、それはｐ
ｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別のベクター上にある。

【００４２】多数の改変が、ベクターになされ、それらは野生型復帰突然変異体を得る機会
をさらに最小化する粒子を作製するために使用され得る。これらは、ＬＴＲのＵ
３領域の欠損、ｔａｔ欠損およびマトリックス（ＭＡ）欠損を含む。

【００４３】ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖベクターは、レンチウイルスゲノム由来のヌクレ
オチドを含まない。レンチウイルスゲノムは、レンチウイルスパッケージング配
列と称されるレンチウイルスＲＮＡをパッケージする。ＨＩＶにおいて、この領
域は、５’主要スプライスライスドナーとｇａｇ遺伝子開始コドンとの間の領域
（ヌクレオチド３０１〜３１９）に一致する。

【００４４】粒子を形成するベクターは、好ましくは、レンチウイルスゲノム由来の核酸配
列を含まない。このレンチウイルスゲノムは、エンベロープタンパク質を発現す
る。好ましくは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列（プロモーター
に作動可能に連結された）を含む別のベクターが、使用される。このｅｎｖベク
ターはまた、レンチウイルスパッケージング配列を含まない。１つの実施形態に
おいて、このｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコー
ドする。

【００４５】別の実施形態において、このエンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来
ではなく、異なるウイルス由来である。結果として起こる粒子は、偽型粒子と称
される。エンベロープの適切な選択によって、実質的に全ての細胞を「感染」し
得る。例えば、エンドサイトーシス区画（例えば、インフルエンザウイルス、Ｖ
ＳＶ−Ｇ、αウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉｆｏｒｅｓｔウイルス、Ｓｉｎｄｂｉ
ｓウイルス）、アレナウイルス（リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイル
ス（ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内
炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、およびオルトミクソウイルス（インフルエンザ
ウイルス）のエンドサイトーシス区画）を標的化するエンベロープタンパク質を
コードするｅｎｖ遺伝子を使用し得る。好ましく使用され得る他のエンベロープ
としては、ＭｏｌｏｎｅｙＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ（例えば、ＭＬＶ−
Ｅ、ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶ由来のエンベロープ）が挙げられる。これらの後
者のエンベロープは、宿主細胞が始原細胞である場合、特に好ましい。他のエン
ベロープタンパク質は、所望の宿主細胞に依存して選択され得る。例えば、標的
特異的レセプター（例えば、脳の送達についてのドパミンレセプター）。別の標
的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使
用して標的化され得る。例えば、エボラのＧＰ（転写後修飾によってＧＰ₁およ
びＧＰ₂糖タンパク質となる）。別の実施形態において、偽型エンベロープを有
する異なるレンチウイルスカプシドを使用し得る。例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩ
Ｖ［米国特許第５，６５４，１９５号］。ＳＨＩＶ偽型ベクターは、動物モデル
（例えば、サル）において容易に使用され得る。

【００４６】好ましいレンチウイルスは、始原レンチウイルス［米国特許第５，６６５，５
７７号］またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）［Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｅ．Ｍ．
，ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：３５４−３５７（１９９８）］である。
ｐｏｌ／ｇａｇ核酸セグメントおよびｅｎｖ核酸セグメントは、発現された際に
、空のレンチウイルス粒子を産生する。上記の改変（例えば、ＬＴＲのｔａｔコ
ード領域の欠損、ＭＡコード領域の欠損、またはＵ３領域の欠損）を作製するこ
とによって、野生型ウイルスへの復帰突然変異の可能性は、実質的にゼロまで減
少した。

【００４７】異種核酸セグメントの所望のファミリー（ときどき標的分子と称される）は、
空のレンチウイルス粒子に挿入され得る。各々が目的の核酸セグメントおよびレ
ンチウイルスパッケージング配列（レンチウイルスＲＮＡをパッケージングする
ために必要である）を含む複数のベクターの使用によってレンチウイルス粒子（
パッケージングベクター）に挿入され得る。好ましくは、５’および３’レンチ
ウイルスＬＴＲを含むベクター（所望の核酸セグメントを含む）をそれらの間に
挿入した。核酸セグメントは、アンチセンス分子であり得、より好ましくは、タ
ンパク質（例えば、抗体）をコードする。このパッケージングベクターは、好ま
しくは選択マーカーを含む。これらは当該分野で周知であり、そして刺激（例え
ば、栄養物、抗生物質など）に対する細胞の感受性を変化する遺伝子を含む。遺
伝子としては、ｎｅｏ、ｐｕｒｏ、ｔｋ、多重薬剤耐性（ＭＤＲ）などについて
の遺伝子が挙げられる。他の遺伝子は、容易にスクリーニングされ得るタンパク
質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＦＧＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、
ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）など）を発現
する。

【００４８】本明細書中に使用されるように、ＤＮＡの宿主細胞への導入は、形質導入と称
され、ときどきトランスフェクションまたは感染としてもまた公知である。

【００４９】自動的にマーカーについて細胞をスクリーニングするための系を構築し得る。
この方法において、形質導入されていない細胞から形質導入された細胞を容易に
選択し得る。例えば、結果として生じる粒子を、約１００万の細胞と接触させ得
る。１０〜１５％の形質導入効率でさえ、１００〜１５０，０００の細胞を得る
。マーカー（例えば、ＧＦＰ）を示す細胞をスクリーニングし、そして選択する
自動選別機を、本発明の方法において使用し得る。

【００５０】誘導プロモーターが標的分子と共に使用される場合、最小の選択圧力が、形質
転換された細胞に対して、標的分子が「沈黙（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）」細胞のため
に発揮される。従って、マーカーを示す細胞の同定はまた、標的分子を発現し得
る細胞を同定する。誘導プロモーターが使用されない場合、「強制的発現」系を
使用することが望ましい。強制的発現系において、標的分子は、内部リボソーム
侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって選択マーカーに連結される（Ｍａｒａｓｃ
ｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと）。この様式において、マー
カーに基づいて選択された実質的に全ての細胞はまた、標的分子を含み、そして
標的分子を発現し得る。

【００５１】ＩＲＥＳ配列は当該分野で公知であり、そしてｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｃａｒ
ｄｉｔｉｓウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ配列［Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４９〜５８４９（１９９１）］；
ＢｉＰタンパク質［ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ、３５３
：９１（１９９１）］；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝
子（エキソンおよびｅ）［Ｏｈら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、６１
：１６４３〜１６５３（１９９２）］；ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列［Ｐｅｌ
ｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：３２０〜３２
５（１９８８）；またＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ、ＴＩＧ、１１：１
７９〜１８４（１９８５）を参照のこと］を含む。

【００５２】好ましくは、標的分子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。この
ような系は、遺伝子発現の注意深い調節を可能にする。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．およ
びＷｈｅｌａｎ，Ｊ．、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、８：８０３−
８１５（１９９７）を参照のこと。このような系には、ｌａｃオペレーターを有
する哺乳動物細胞のプロモーターからの転写を調節するための転写モジュレータ
ーとして、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃリプレッサーを用いる系［Ｂｒｏｗｎ，Ｍ
．ら、Ｃｅｌｌ、４９：６０３−６１２（１９８７）］、およびテトラサイクリ
ンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用する系［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａ
ｒｄＨ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５−５４
７−５５５１（１９９２）；Ｙａｏ，Ｆ．ら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ
ａｐｙ，９：１９３９−１９５０（１９９８）；Ｓｈｏｃｋｅｌｔ，Ｐ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６５２２−６５２６（１
９９５）］が含まれる。他の系には、ＦＫ５０６ダイマー、エステラジオールを
使用するＶＰｌ６またはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（ｍ
ｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）またはラパマイシン［図２のＭｉｌｌｅｒおよびＷｈｅ
ｌａｎ、前出を参照のこと］が含まれる。誘導性の系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄから入手可能である。オペロンとともに
リプレッサーを使用する系が好ましい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ由来のｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーターを伴う哺乳動物細胞のプ
ロモーターからの転写を調節するための転写モジュレーターとして機能し得る［
Ｍ．Ｂｒｏｗｎら、Ｃｅｌｌ、４９：６０３−６１２（１９８７）］。Ｍ．Ｇｏ
ｓｓｅｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７
−５５５１（１９９２）］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を転
写アクチベーター（ＶＰ１６）と合わせて、ｔｅｔＲ哺乳動物細胞転写アクチベ
ーター融合タンパク質、ｔＴａ（ｔａｔＲ−ＶＰ１６）を作製し、ヒトサイトメ
ガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期プロモーターに由来する、ｔｅｔＯを伴う
最小のプロモーターと合わせて、哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御するた
めのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を作製した。Ｙａｏおよび共同研究者（Ｆ
．Ｙａｏら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、前出；Ｏｈｋａｗａ，Ｊ
．、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１１：５７７−５８５（２０００
））は、テトラサイクリンオペレーターが、プロモーター（例えば、ＣＭＶＩＥ
プロモーター）のＴＡＴＡエレメントの下流に適切に配置される場合に、ｔｅｔ
Ｒ哺乳動物細胞転写因子融合誘導体よりもむしろ、テトラサイクリンリプレッサ
ー（ｔｅｔＲ）単独が、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するための強力
なトランス調節因子として機能し得ることを実証した。このテトラサイクリンの
誘導性スイッチの１つの特定の利点は、これが、その調節可能な効果を達成する
ために、いくつかの例においては細胞に対して毒性であり得るテトラサイクリン
リプレッサー−哺乳動物細胞トランス活性化因子またはリプレッサー融合タンパ
ク質の使用を必要としないことである［Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｐ．
Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：
６５２２−６５２６（１９９５）］。好ましくは、このリプレッサーは、ＩＲＥ
Ｓ配列によって標的分子に連結される。好ましくは、誘導性の系はｔｅｔＲ系で
ある。より好ましくは、この系は、プロモーターのＴＡＴＡエレメント（例えば
、ＣＭＶＩＥプロモーターを用いる）の下流のテトラサイクリンオペレーターを
有する。図４を参照のこと。

【００５３】いくつかの誘導性プロモーターの有効性は、時間とともに増大する。いくつか
の場合において、複数のレプレッサーを直列に挿入すること（例えば、ＩＲＥＳ
によってＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲ）によって、このような系の有効性を増
強し得る。あるいは、所望の機能についてのスクリーニングの少なくとも３日前
に、待機し得る。好ましくは、１×１０⁴、より好ましくは少なくとも１×１０⁵ 、なおより好ましくは、少なくとも１×１０⁶、そしてさらにより好ましくは、
少なくとも１×１０⁷の多くの細胞が使用される場合、いくつかのサイレンシン
グが発生し得るが、サイレンシングの効果は最小である。系の有効性を増大させ
るための公知の手段によって所望のタンパク質の発現を増大させ得る。例えば、
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後（ｐｏｒｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ）調節エレメント（ＷＰＲＣ）を使用する。Ｌｏｅｂ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｈｕｍａ
ｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１０：２９５−２３０５（１９９９）；Ｚｕｆ
ｆｅｒｅｙ，Ｒ．ら、Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．、７３：２８８６−２８９２（１
９９９９）；Ｄｏｎｅｌｌｏ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．７２：５０
８５−５０９２（１９９８）を参照のこと。

【００５４】使用される標的分子は、好ましくは細胞内で発現されることが意図される抗体
をコードする遺伝子を有する。抗体は、標的抗原の同定、精製、および機能的操
作のためのインビトロツールとして生物医科学において長く使用されてきた。抗
体は、診断的適用および治療的適用のためにインビボで同様に利用されてきた。
抗体工学における最近の進歩は、今や抗体をコードする遺伝子を操作することを
可能にし、その結果、抗原結合ドメインが細胞内で発現し得る。抗体の特異的か
つ高親和性の結合特性は、大きなヒト免疫グロブリンライブラリーを作製する能
力、および哺乳動物細胞内部で正確な細胞内位置で安定に発現するそれらの能力
と組み合わせて、遺伝子治療適用のための強力な新規な分子のファミリーが提供
された。これらの細胞内抗体は、「イントラボディー」と呼ばれる［Ｗ．Ｍａｒ
ａｓｃｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、４：１１−１５（１９９７）］。好ま
しくは、これらの遺伝子は、単鎖抗体をコードする。これらの分子は、好ましく
は、ＨＡのようなタグを含み、その結果、その分子は後で同定され得る。

【００５５】これらの抗体は、好ましくは、抗体のライブラリー（例えば、ファージディス
プレイライブラリー）から得られ得る。図６は、抗体を得、そしてそれをパッケ
ージングベクターに挿入するための単純な方法を示す。

【００５６】その後、レンチウイルスベクターを使用して、宿主細胞に形質導入する。マー
カーをスクリーニングすることによって、形質導入された細胞を迅速に選択し得
る。その後、形質導入された細胞を取り、これらを適切な条件下で贈与させ得る
か、またはこれらの細胞（例えば、脾臓細胞もしくは生殖細胞）を宿主細胞に挿
入し得る。

【００５７】誘導性プロモーターが作動され、そして、特定の表現型を示す細胞および／ま
たは動物についてクリーニングする。例えば、特定のレセプターの増強された発
現または発現の欠如、異常細胞の選択的殺傷など。所望の表現型を示す細胞は、
表現型について、または表現型に依存して選択され、その選択は、高処理能力自
動化スクリーニングによってなされ得る。ＦＡＣＳ分析が使用されて、特定のレ
セプターの発現の変化を同定し得る。他の系は容易に同定され得る。分子（例え
ば、抗体）に含まれるタグを使用して、分子（例えば、所望の表現型を生じる抗
体）を入手し得る。１つの例において、次いで、抗体は、所望される場合、それ
が結合する抗原を同定するために使用され得る。

【００５８】この方法は、任意のメンバーの特定の素性を最初に知る必要なしに、所望の機
能を提供する特定の分子を分子の大きな群から同定するために、多数の分子を使
用することを可能にする。

【００５９】好ましい構築物は、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶ−１ベクター系を使用する。この系
では、標的分子は、クローニングされそして誘導性プロモーター（例えば、Ｙａ
ｏ、前出のテトラサイクリン誘導性プロモーター系）の制御下で発現される、非
常に大きな（１×１０¹⁰メンバー）ヒトＥＲを指向するｓＦｖイントラボディー
ライブラリーを含む。例えば、ＥＲの内腔に標的化されるイントラボディーは、
細胞表面への原形質膜または分泌タンパク質の輸送を阻害するための単純かつ有
効な機構を提供する；非常に大量の細胞表面レセプターが、この方法を使用して
検出不可能なレベルに減少する。このベクター系は、所望の機能を生じる「表現
型」ノックアウトを生じ得るｓＦｖイントラボディーを同定するために使用され
得る。例えば、悪性細胞（対応する正常細胞ではなく）を殺傷すること、あらか
じめ選択された細胞表面分子の除去、病理生物学的プロセスの改変など［Ｗ．Ｍ
ａｒａｓｃｏ．ら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：１１−１５（１９９７）］
。さらに、標的分子（例えば、ｓＦｖイントラボディー）がタグ化、ＨＡタグ化
されるので、ｓＦｖイントラボディーによってノックアウトされた遺伝子産物の
発見および同定は、標準的な研究室における手順を通して容易に達成され得る。

【００６０】ＥＲにおける局在化について意図されるイントラボディーは、好ましくは、リ
ーダーペプチドおよびＣ末端ＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）［Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、ＧｅｎｅＴ
ｈｅｒａｐｙ、６：６３５−６４４（１９９８）；Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら
、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３７：２０９−２１６（１９９７）］を備えるが、他の
構築物は容易に作製され得る。中間体クローンニングベクターは、ｓＦＶライブ
ラリーが、ｓＦｖカセットと同様に、免疫グロブリンリーダー配列、ｓＦｖｓに
ついてのインフレームのクローニング部位、続いてＨＡタグ配列およびＥＲ保持
配列ＳＥＫＤＥＬを含むベクターに、（例えば、同一のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限
部位を介して）直接クローニングされることを可能にする（図４）。エレクトロ
ポレーションコンピテントなＴＧＩ細胞を使用して、ｓＦｖ遺伝子カセットをク
ローニングし得、そしてこの中間体ベクター中の約１×１０¹⁰形質転換体を入手
し得る。これらの形質転換体から、適切なフラグメント（例えば、ＢａｍＨＩ／
ＸｂａＩフラグメント）が単離され、これは、誘導性カセット（例えば、ＣＭＶ
ｔｅｔＯプロモーター、ＥＲを指向するｓＦＶイントラボディーライブラリー、
ＩＲＥＳ、およびｔｅｔＲ）を含み得る。また、エレクトロポレーションコンピ
テントなＴＧＩ細胞を、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをレンチウイルスベ
クター（例えば、ＨＩＶＮｔｅｔＯＩＲ（図５）によって表される誘導性系）に
クローニングするために使用して、約１×１０¹⁰形質転換体を入手する。

【００６１】例えば、ＥＲ指向性イントラボディーライブラリーを発現するＨＩＶ−１ベク
ターは、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｏｌａｇｅｎ）を使用して、例えば、ベクターｐ
ＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ、ｐＲｅｖおよびｐＶＳＶ−ＧｃＤＮＡの、２９３Ｔ細
胞への同時トランスフェクションによって産生される［Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、６：６３５−６４４（１９９８）］。細胞培
養上清を、４８〜７２時間後に収集する。超遠心分離を用いて、ＶＳＶ−Ｇ偽型
ベクターの力価を増加させ、そして１ｍｌあたり１０⁶〜１０⁸感染性粒子の力価
の獲得を生じる。このベクターを、逆転写酵素活性について正規化する。形質導
入効率は、形質導入４８時間後にＮＧＦＲ表面発現のＦＡＣＳ分析によって、Ｃ
Ｄ４＋ＳｕｐＴ細胞および２９３細胞で測定され得る。例えば、２９３Ｔ細胞が
好ましい。なぜなら、この細胞は、より高い力価のベクターを与える点において
ＣＤＳよりもより効率的であるからである。

【００６２】例えば、上記で産生された得られたＨＩＶＮｔｅｔＯＩＲベクターは、ＥＲ（
細胞表面を含む）を通して移行する分子および分泌分子の細胞内保持／分解に起
因して、「表現型」および／または「機能的」ノックアウトを引き起こす能力を
有するＥＲを指向するｓＦｖイントラボディーのライブラリーを含む。これらの
ベクターは、ｓＦｖイントラボディーのライブラリーをＣＤ４＋ＳｕｐＴ細胞に
形質導入するために使用して、これらの細胞の表面上で発現されることが知られ
る特定の分子の表現型ノックアウトを引き起こすｓＦｖイントラボディーを単離
し得る。例えば、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、およびＭＨＣＩは、ＳｕｐＴ細胞の表面
上に高いレベルで発現される。他のレセプターは、容易に選択され得る。これら
の抗体もまた、削除されたリーダー配列を有することによって、ＥＲ−ゴルジ装
置以外の細胞の区画にある抗原を標的するために使用され得る。さらに、例えば
、核、ミトコンドリアなどについての標的配列は、容易に選択され得、そして標
的分子を含むカセット中で使用され得る。

【００６３】その後、宿主細胞は形質導入され得る。例えば、ＳｕｐＴ細胞は、最適に形質
導入され、そしてマーカー（例えば、ＮＧＦＲ発現）について選択される。好ま
しくは、少なくとも１０⁷の形質転換された細胞は、公知の手段によって単離（
例えば、ビーズ、アフィニティークロマトグラフィーなど）される。細胞を、イ
ンデューサー（例えば、１μｇ／ｍｌテトラサイクリン）で処理し、そして２〜
４のさらなる倍加を経て、その結果、各ｓＦｖイントラボディー遺伝子の１より
多いコピーが安定に形質導入された細胞のプール中に存在する。１〜２ｍｌ中約
５×１０⁷〜１×１０⁸細胞を、所望の表現型の同定のために染色する（例えば、
適切な抗ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、またはＭＨＣＩＭａｂ、続いてＦＩＴＣ標識し
た抗マウスＩｇＧを用いて）。細胞を、例えば、ＭｏＦｌｏフローサイトメータ
ー（これは、高処理能力を有する（＞５×１０⁷細胞／ｍｌ／時間））で分別す
る。死滅した細胞、乏しく染色された細胞および表現型ノックアウト細胞を含む
、最も低いＦＩＴＣ標識細胞の１０％を収集し、そして組織培養において拡大す
る。この手順は、適切な表面分子の表面発現について少なくとも５０％ネガティ
ブである、細胞の集団が回収されるまで反復される。

【００６４】上記で言及した５０％ネガティブプールからの細胞表面ネガティブ細胞は、限
界希釈によってサブクローニングされ、そしてさらに生化学的および遺伝的分析
のために使用される。抗ＨＡＭａｂを用いる放射免疫沈降実験を使用して、標
的分子を同時免疫沈降させる。パルス−チェイス分析を使用して、ｓＦｖ／標的
タンパク質複合体の半減期を決定し得る。免疫蛍光を使用して、標的分子の細胞
内局在化が変化したか否かを決定し得る。

【００６５】標的分子（例えば、ｓＦｖ遺伝子）は、例えば、ＩｇＧリーダー領域およびＳ
ＥＮＤＥＬ領域に位置するプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅またはＲＴ−ＰＣ
Ｒ増幅によって容易に回収され得る。この分子は、最終的な標的（すなわち、抗
体が結合するタンパク質）を同定するために使用され得る。これらのｓＦｖ遺伝
子は、例えば、ｐｅｌＢリーダー配列を含むｐＳＹＮ細菌発現プラスミドにクロ
ーニングされ、このプラスミドは、ペリプラズムにｓＦｖを指向させるためのリ
ーダー配列、ｓＦｖの直接的なクローニングのためのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限部
位、続いてｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓ６配列を含む。ＩＭＡＣカラム上で実質
的に精製されるＥ．ｃｏｌｉのＴＧ１株のペリプラズム画分から回収されたｓＦ
ｖの代表的な収率は、振盪フラスコからの１リットルあたり１６０μｇ〜２ｍｇ
の間の範囲である。次いで、これらのｓＦｖは、目的の細胞表面標的分子のｓＦ
ｖ結合の直接的な染色（ｃ−ｍｙｃに対するＭａｂを使用する）のために、また
は細胞抽出物のウェスタンブロット分析のために使用され得る。

【００６６】ナノ配列決定（ｎａｎｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）スペクトルまたはＧＣ−質量
スペクトルをまた使用して、ほんの少量の産物のみが存在する、配列またはタン
パク質（例えば、標的）を同定し得る。例えば、Ｊｉｎ，Ｙ．ら、Ｊ．ｏｆＢ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８３０１−２８３０７（１９９９）、２８３０４
−３０５を参照のこと。

【００６７】レンチウイルスビリオン（粒子）は、プロモーターに作動可能に連結する、ウ
イルスタンパク質発現のために必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質およびレ
ンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの
ベクターにより、発現される。好ましくは、複数のベクターが使用される。好ま
しくは、ｐｏｌタンパク質をコードするｐｏｌ配列は、１より多いベクター上に
存在する。逆転写および組込みのために必要なレンチウイルスｇａｇタンパク質
をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結したベクターもまた、存
在する。好ましくは、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列とは別のベクター
上に存在する。別個のベクターを種々の「遺伝子」のために使用することは、野
生型への先祖返りの機会をさらに減少させる。

【００６８】１つの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｇａｇ配列が機能的Ｍ
Ａ、タンパク質を発現しないように、改変される（すなわち、これはＭＡ^-であ
る）。このことは、ＭＡをコードする「遺伝子」を、ＭＡコード領域の付加、置
換または欠失により不活化することによって、達成され得る。ＭＡは、ｇａｇ遺
伝子の一部であり、そして発現される場合に、前駆体タンパク質からプロセスさ
れるので、ＭＡ遺伝子（またはコード領域）を参照する場合に、ｇａｇ遺伝子全
体の、ＭＡサブユニットをコードする部分を参照するのみである。好ましくは、
この不活化は、欠失により達成される。好ましくは、ＭＡコード領域の少なくと
も２５％が欠失され、より好ましくは、少なくとも５０％が欠失され、さらによ
り好ましくは、少なくとも６０％、なおより好ましくは、少なくとも７５％、さ
らにより好ましくは、少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９５
％、そして最も好ましくは、コード領域全体が欠失される。

【００６９】ＭＡは、ミリスチル化アンカーを有し、そしてこのミリスチル化アンカー（配
列）は、必要とされる。好ましくは、ミリスチル化配列は、異種の（すなわち、
非レンチウイルス）配列である。Ｓｒｃ、ＭＡＲＣＫＳ（ミリストイル化アラニ
ン富化Ｃキナーゼ基質）、ＡＲＦ（ＡＤＰ−リボシル化因子）、回収および関連
する（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇａｎｄｒｅｌａｔｅｄ）ＥＦ−ハンドカルシウ
ム結合タンパク質（ビシニン神経カルシウム（ｖｉｓｉｎｉｎｎｅｕｒｏｃａ
ｌｃｉｕｍ）およびその他）ならびに非レンチウイルスｇａｇタンパク質（例え
ば、モロニーマウス白血病ウイルス、マソン−ファイザーサルウイルス）。

【００７０】ＭＡ欠失ウイルスは、細胞外ウイルス粒子を放出する増加した能力を一貫して
示し、このことは、安定な膜会合のために、ＭＡの球状ドメインが必要とされな
いことを示す。驚くべきことに、ＭＡの球状ヘッド（これは、推定上のＭＡ核局
在化シグナル（ＮＬＳ）を保有する）の欠失はまた、マクロファージにおけるレ
ンチウイルス複製サイクルの初期の段階を可能にする。

【００７１】１つの実施形態において、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタ
ンパク質をコードする。ＭＡ−ｇａｇベクターを使用する場合には、ｅｎｖ配列
が、短縮型細胞質テイルをコードするように、野生型配列から変更されることが
好ましい。好ましくは、細胞質テイルの５０％が欠失する。より好ましくは、少
なくとも７５％が欠失し、さらにより好ましくは、少なくとも９０％が欠失し、
なおより好ましくは、少なくとも９５％が欠失する。最も好ましくは、このよう
な実施形態において、細胞質テイルの全体が欠失する。

【００７２】別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、３’長い末端反復領域（
ＬＴＲ）の欠失の結果としての、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターの別の形態であ
る。好ましくは、このベクターは、ウイルスプロモーター内に欠失を含む。ＨＩ
ＶＬＴＲのような、レンチウイルスのＬＴＲは、ウイルスプロモーターを含む
。このプロモーターは比較的非効率的であるが、例えばｔａｔによってトランス
活性化される場合には、このプロモーターは効率的である。しかし、ウイルスプ
ロモーターの存在は、導入遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーターと干渉
し得る。このような干渉を最小化し、そして導入遺伝子の発現をより良好に調節
するために、レンチウイルスプロモーターは、好ましくは、欠失される。

【００７３】好ましくは、このベクターは、ウイルスプロモーター内に欠失を含む。このウ
イルスプロモーターは、３’ＬＴＲのＵ３領域に存在する。好ましい欠質は、Ｓ
ｃａＩ部位とＰｖｕＩ部位との間の１２０塩基対（例えば、ＨＩＶ−１ＬＴＲ
プロモーターの本質的なコアエレメント（ＴＡＴＡボックス、ＳＰ１およびＮＦ
−κＢ結合部位）を含む、ＨＩＶ−１ＨＸＢ２のヌクレオチド９３９８−９５
１８に対応する）である欠失である。さらに５’側に進むと、「ＳＩＮ」効果が
より劇的となる。実際に、４００塩基対までの欠失が、効果的であることが示さ
れている。Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｒ．ら、Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．、７２：９８
７３−９８８０（１９９８）。逆転写の後に、この欠質は、５’ＬＴＲに移動さ
れ、ベクター／プロウイルスを与え、これは、複製の次の繰り返しにおいて５’
ＬＴＲからベクター転写物を合成し得ない。従って、本発明のベクターは、ウイ
ルスタンパク質を発現し得ないので、ウイルスが複製され得る機構を何も含まな
い。

【００７４】別の実施形態において、ベクターは、ｔａｔ欠失ベクターである。これは、ｔ
ａｔの少なくとも最初のエキソンを、公知の技術により、これが欠失するように
不活化することによって、達成され得る。あるいは、Ｕ３ＬＴＲ欠失をＲ領域
に伸長して、ＴＡＲエレメントを除去し得る。ｔａｔ欠失ベクターは、より高い
力価のウイルスを生じる。

【００７５】レンチウイルスベクターが、野生型レンチウイルスと比較して、複数の改変を
有する場合には、変形物を作製し得る。例えば、ＨＩＶに関しては、ｎｅｆ−、
ｒｅｖ−、ｖｉｆ−およびｖｐｒ−である。さらに、ＭＡ−ｇａｇ、３’および
５’のＵ３が欠失したＬＴＲならびにその変形物を有し得る。

【００７６】より好ましい実施形態において、ｅｎｖ配列は、レンチウイルスｇａｇおよび
ｐｏｌ遺伝子とは異なるウイルス由来のエンベロープタンパク質をコードする。
得られる粒子は、偽型粒子と呼ばれる。エンベロープタンパク質の適切な選択に
より、事実上任意の細胞を形質転換し得る。好ましくは、エンベロープは、イン
フルエンザウイルスまたはＶＳＶであり、より好ましくはＶＳＶ−Ｇである。

【００７７】ｅｎｖ糖タンパク質は、それ自体で粒子製品に分散可能であるが、これらの組
み込みは、感染性ビリオンの形成のために、所望される。

【００７８】レンチウイルスの大きなゲノムに起因して、ベクター系を使用して、広範にわ
たる所望のヌクレオチドセグメント（好ましくは、ＲＮＡセグメント）を、空の
レンチウイルス粒子にパッケージし得る。さらに、プロモーターおよびエンハン
サーの使用もまた、インサートの長さを有意に追加し得る。好ましくは、この系
は、遺伝多様性のような多様性を示す複数の分子を含む群とともに使用される。
従って、本発明の系は、休止細胞ならびに分割細胞をトランスフェクトするため
に使用され得る多数のプロモーターおよび遺伝子を含み得るインサートを可能に
することによって、現在利用可能なベクターより有意な利点を提供する。

【００７９】ベクターは、使用されるヌクレオチドセグメントがいずれも、機能的パッケー
ジング部位含有配列を含まないように、調製される。（この配列は、パッケージ
ング配列と呼ばれる）。

【００８０】ベクターは、レンチウイルスＲＮＡをパッケージするレンチウイルスゲノム由
来のヌクレオチド（レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる）を含まない
。ＨＩＶにおいて、この領域は、５’大スプライスドナーとｇａｇ遺伝子開始コ
ドンとの間に領域に対応する（例えば、株ＨＸＢ２においてはヌクレオチド３０
１〜３１９）。好ましくは、これらのベクターはまた、ＨＩＶＬＴＲのような
レンチウイルスＬＴＲを有さない。ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、異種
プロモーターに作動可能に連結される（図１を参照のこと）。

【００８１】パッケージング配列は、当業者に周知の種々の技術のいずれかによって、ベク
ターから排除され得る。例えば、配列全体を単に欠失させ得る。あるいは、配列
の相当の部分を欠失して、この配列をパッケージング不可能にし得る。代替のス
トラテジーは、ヌクレオチドをこのような部位に挿入して、これを非機能的にす
ることである。最も好ましくは、この部位を全体的に欠失して、相同組換えを防
止する。

【００８２】従って、レンチウイルスは、所望のウイルスタンパク質を発現し得るが、パッ
ケージング部位が移動し、そしてレンチウイルスＬＴＲが作動可能ではないので
、これらのｍＲＮＡは、レンチウイルス粒子内に効果的にはパッケージされず、
そして組換えウイルスは、他の細胞を複製および感染し得ない。

【００８３】レンチウイルスベクターはまた、Ｔａｔ、Ｒｅｖなどのような所望のレンチウ
イルス調節タンパク質をコードする配列を含み得る。しかし、多くの実施形態に
おいて、このような調節遺伝子を含まないことが好ましい。ＲＲＥ配列およびＣ
ＡＲ配列が遺伝子内に含まれる場合には、ウイルスが細胞質において発現されな
い限り、ＲＥＶをコードする配列を含むことが必須である。これらの調節配列は
、他のレンチウイルスベクター上（例えば、ｇａｇベクター、ｐｏｌベクター、
ｇａｇ−ｐｏｌベクター、もしくはｅｎｖベクター）または他のその独自のレン
チウイルスベクター上に、存在し得る。あるいは、ＲＲＥの代わりに構造的移送
エレメント（ＣＴＥ）を使用して、このベクターをＲＥＶ非依存性にし得る。ま
た、より小さな配列相同性が存在する。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒ，Ｓ．ら
、Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．、７３：９５８９−９５９８（１９９９）：Ｓｒｉｎ
ｉｖａｓａｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．、７１：５８４１−５
８４８（１９９７）。

【００８４】所望の異種核酸セグメントは、目的の核酸セグメント、およびレンチウイルス
ベクターが使用される時点でレンチウイルスＲＮＡをレンチウイルス粒子内にパ
ッケージするために必要なレンチウイルスパッケージング配列を含むベクターの
使用により、空のレンチウイルス粒子内にカプセル化され得る。好ましくは、こ
のベクターは、５’および３’レンチウイルスＬＴＲを含み、所望の核酸セグメ
ントが、これらの間に挿入されている。この核酸セグメントは、好ましくは、タ
ンパク質をコードする。

【００８５】従って、本明細書中において使用される場合に、パッケージングベクターとは
、レンチウイルスＬＴＲにより隣接されるプロモーター（例えば、内部、組織特
異的、または誘導的）の制御下で移入されるべき異種遺伝子、ならびにカプセル
化（すなわち、パッケージング）のために必要なパッケージングおよびリーダー
配列を含む、ベクターをいう。このベクターは、時々、文献において、移入ベク
ターと呼ばれ、そしてカプセル化のために必要とされるタンパク質および酵素を
コードする構築物は、パッケージング構築物と呼ばれる。

【００８６】ウイルス複製タンパク質および酵素により認識される、ＤＮＡ複製の起源（ｏ
ｒｉ）もまた、存在し得る。このベクターは、所望のヌクレオチドインサートの
、偽型粒子内へのパッケージングを可能にする。このベクターは、時々、パッケ
ージングベクターと呼ばれる。このパッケージングベクターを使用して、所望の
異種核酸配列の任意の群（好ましくは、ＲＮＡ配列）を、粒子内にパッケージす
る。好ましくは、パッケージングベクターは、（ａ）少なくとも１つの異種核酸
配列に作動可能に連結する、プロモーター配列、および（ｂ）ｍＲＮＡ（これの
転写は、発現されたタンパク質を生じる）の転写およびプロセシングを可能にす
るに十分な、少なくとも１つの配列を含む。好ましくは、プロセシング配列は、
ポリアデニル化配列である。好ましくは、プロモーターは、誘導的系の一部であ
る。なおより好ましくは、このベクターは、プロモーター配列に続く介在配列を
含む。好ましくは、この配列は、プロモーター、標的分子を含み、そして必要に
応じて、抑制配列はまた、ＨＡのようなタグを含み、標的分子の手早い同定を可
能にする。エレメントのこのグループ化は、時々、カセットとも呼ばれる。例え
ば、異種配列は、任意の所望のタンパク質（好ましくは、治療的タンパク質また
は抗体）をコードし得る。これはまた、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡまたは所望
の免疫原（例えば、抗原タンパク質）をコードし得る。これは、免疫原性反応を
生じる特定のペプチド配列をコードし得る。このようなペプチド配列は、代表的
に、少なくとも約６アミノ酸長である。

【００８７】異種ヌクレオチド配列は、治療的タンパク質（すなわち、遺伝したかまたは後
天性の欠損を補償するもの）のような、広範な種々のタンパク質をコードし得る
。治療的タンパク質の例としては、神経伝達性生合成酵素（例えば、パーキンソ
ン病の処置のためのチロシンヒドロキシラーゼ）；ニューロトロフィンを含む神
経栄養因子（例えば、アルツハイマー病の処置のための神経増殖因子であり、神
経増殖因子レセプターおよびｔｒｋレセプターもまた使用し得る）；レッシュ−
ナイハン病の処置のための、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅｐｏｒｐｈｏｒｉｂ
ｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＧＰＲＴ）；テイ−サックス病の処置
のための、β−ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎａｄａｓｅ）ａ鎖；糖
尿病の処置のためのインスリンが挙げられる。レセプター（例えば、神経増殖因
子レセプター、ｔｒｋレセプターなど）もまた調製され得る。インサートは大き
くあり得るので、一連の異なるタンパク質をコードすることが可能である。例え
ば、レセプター−リガンド複合体を形成する一連のタンパク質を、コードし得る
。

【００８８】他のタンパク質としては、例えば、シグナル伝達酵素（例えば、タンパク質キ
ナーゼｃ）；転写因子（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ＮＦ−κＢ）；オンコジーン（例
えば、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、ｒａｓ）；神経伝達物質レセプター（
例えば、グルタメートレセプター、ドパミンレセプター）などが挙げられる。

【００８９】タンパク質の１つの好ましいグループは、抗体である。ｄＡｂ、単鎖抗体、Ｆ
ａｂが、含まれる。単鎖抗体が好ましい。抗体のライブラリーは公知であり、そ
して本発明において使用され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリー
を使用して、一般化されたライブラリーおよび特殊化されたライブラリーの両方
が、使用され得る。特殊化されたライブラリーは、そのメンバーの抗体が、特定
のグループの抗原（例えば、特定の腫瘍）に対して産生されているライブラリー
である。特殊化されたライブラリーのメンバーの多様性は、一般化されたライブ
ラリーの多様性に満たない。

【００９０】異種ヌクレオチド配列もまた、アンチセンス分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をコ
ードし得る。これらの分子は、特定の疾患と関係がある遺伝子の発現を調節する
ために使用され得る。このアンチセンス分子は、プロモーターに対してコード領
域の方向を反対にすることによって、ヌクレオチド配列から得られる。従って、
このアンチセンスＲＮＡは、対応するｍＲＮＡと相補的である。アンチセンス科
学の概説について、Ｇｒｅｅｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５
６９〜５９７（１９８６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと
。このアンチセンス配列は、改変された糖リン酸骨格を含んで、安定性が増加さ
れ得、かつＲＮＡ感受性に対してより敏感でないようにされ得る。この改変の例
は、Ｒｏｓｓｉら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５０（２）：２４５〜３５
４（１９９１）により記載される。別の種類の分子としては、リボザイムが挙げ
られる。トランススプライシングに関与するリボザイムおよびアンチセンス分子
、ならびにトランススプライシングを示さないリボザイムおよびアンチセンス分
子が、使用され得る。

【００９１】異種ヌクレオチド配列は、好ましくは、所望の標的細胞においてその配列の転
写を指示し得るプロモーター配列に、作動可能に連結される。霊長類レンチウイ
ルスのようなレンチウイルスは、Ｔａｔ調節タンパク質を含む。このタンパク質
は、ＴＡＲエレメントに作動可能に連結されたタンパク質を、トランス活性化す
る。このＴＡＲエレメントは、霊長類レンチウイルスの５’ ＬＴＲ中に存在す
る。従って、異種タンパク質の発現は、トランス活性化により増強され得る。こ
のＬＴＲはまた、プロモーターを含む。しかし、このプロモーターは、トランス
活性化の不在下で、比較的効果がない。従って、他のプロモーターおよびエンハ
ンサーの使用が、代表的には、好ましい。このプロモーターは、ＳＶ４０プロモ
ーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−１１Ｅプロモーター、１Ｅ４／５プ
ロモーターまたはＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーターのような、プロモ
ーターである。他としては、Ｓｒα−プロモーター（ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲ由来
のＲ／Ｕ５配列に融合されたＳＶ４０初期プロモーターから構成される、非常に
強力なハイブリッドプロモーター）、テトラサイクリンで調節可能なプロモータ
ー、組織特異的プロモーター（例えば、α−フェトプロテインプロモーター；お
よび光受容体を標的とした発現のためのロドプシンプロモーター）が、挙げられ
る。特定の標的細胞にて異種配列の転写を指示し得る他のプロモーターもまた、
その異種遺伝子の発現を所望の標的（宿主）細胞へとより特異的に向けるために
使用され得る。実際、組織特異的プロモーターと、その誘導性プロモーター構築
物を連結し得る。例えば、その標的細胞がニューロン細胞である場合、ニューロ
ン特異的エノラーゼプロモーター［Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１６：１４１〜５６（１９８６）］のようなプロモーターが
、使用され得る。ラットチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーターは、中
脳における細胞型特異的発現を支持し得る［Ｓ．Ｓｏｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ．６８：１７９２〜８０３（１９９７）］。さらに、当該分野で周知であ
る、誘導性プロモーターまたは他の誘導性調節配列の使用が、いくつかの実施形
態において好ましい。例えば、ｔｅｔＲ−ｔｅｔＯ系である。考察されたように
、ＬＴＲ中のプロモーターは、もう１つのプロモーターを妨害し得る。従って、
特定の実施形態において、このウイルスＬＴＲプロモーターを不活化することが
、好ましい。

【００９２】所望の異種遺伝子を移入させるパッケージングベクターと、野生型レンチウイ
ルスを生成するレンチウイルスベクターとの間の組換え事象の可能性を最小にす
るために、このパッケージングベクターは、このパッケージングベクターをコー
ドするヌクレオチドセグメントと最小の程度の相同性を有することが望ましい。
好ましくは、これらの異なるベクター中で異なるプロモーターを使用する。これ
らの目的は、本開示に基づいて、当該分野で公知の種々の手段によって達成され
得る。例えば、いかなる組換えの機会をも最小にするために、複数のベクターを
使用することが好ましい。さらに、配列の重複を最小にすることによって、相同
組換えの機会を低減することが、好ましい。例えば、不必要なレンチウイルスを
削除し得る。あるいは、またはさらに、そのベクターのヌクレオチド配列を変化
させるために公知技術を使用し得る。このことを達成する１つの方法は、ヌクレ
オチド（例えば、ＤＮＡ）シャッフリングと呼ばれる。コドンのヌクレオチドを
、例えば、１つのベクターのレンチウイルス構築物内の各コドンの３番目の塩基
を、変化させる。従って、ここで、第２のベクター中の同じコード配列が異なり
、そして相同組換えを受けない。種々のベクターのコドンの変更が、ヌクレオチ
ドの差異を最適にするためになされ得る。

【００９３】あるいは、または相同性を低減する上記のアプローチと組み合わせて、レンチ
ウイルスセグメント由来の遺伝子の配列を、その配列が機能性タンパク質をコー
ドしないように変更し得る。本明細書中で使用される場合、「機能性」とは、野
生型の活性を有するタンパク質を意味する。

【００９４】その粒子についての特定の目的に依存して、粒子中に存在するタンパク質をコ
ードする特定の効果を引き起こす遺伝子を不活化するように、そのレンチウイル
スセグメントを変更するために、公知技術を使用し得る。例えば、複製を増強す
るタンパク質（例えば、ｒｅｖおよび／またはｔａｔ）を不活化すること。ｖｐ
ｕは、感染性に影響する。ｎｅｆもまた、そのウイルスに影響する。ｎｅｆは、
インビボで有効な複製に必要なようであると報告されている。

【００９５】細胞は、ウイルス粒子を調製するために、ベクターによりトランスフェクトさ
れ得る。当該分野で周知の手段によって、インビトロでそれらのベクターを調製
し得、次いで、その粒子を収集し、それを精製し、そしてその粒子を注入する。
より好ましくは、その粒子を精製し、次いで所望の細胞を感染させるためにそれ
らを使用する。

【００９６】ビリオンを発現するプロデューサー細胞株を作製し得、そしてそのような細胞
をパッケージングベクターで形質転換し得る。そのプロデューサー細胞株または
任意の細胞を、標準技術によって形質転換し得る。１つの好ましい方法は、濃縮
ポリカチオン（例えば、ポリリジンまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））によ
り、そのパッケージングベクターに連結された不活化アデノウイルスベクターを
使用することである［Ｂａｋｅｒ，Ａ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．２５（１０）：１９５０〜１９５６（１９９７）；Ｂａｋｅｒ，Ａ．ら、Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒ．，４（８）：７７３〜７８２（１９９７）；Ｓｃａｒｉａ，
Ａ．ら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２９５〜２９８（１９９５）を参照のこと］
。ＰＥＩ（濃縮ポリカチオン）の使用が、好ましい。

【００９７】これらのベクターは、アセンブルして粒子になるタンパク質およびｍＲＮＡを
発現し、従って、大量のウイルス粒子を発現するために使用され得る。このこと
には、本明細書中で記載される粒子ベクター系（パッケージングベクター）で細
胞をトランスフェクトすること、そしてそのウイルスタンパク質を発現するに十
分な条件および時間の下でその細胞株を培養することが必要であり、次いでこの
ウイルスタンパク質は、粒子を形成する。その後、その粒子は、その粒子の構造
が破壊されないことを確実にするように注意を払って、公知技術により精製され
得る。この粒子は、種々の領域で使用され得る。例えば、この粒子は、所望の免
疫反応を生成するため、異種核酸配列で細胞を形質転換するため、そして／また
は所望の宿主細胞に核酸配列を送達するために、使用され得る。

【００９８】本教示に基づいて、標準技術により、レンチウイルス粒子を発現する一過性細
胞株または安定な細胞株を調製し得る。

【００９９】その後、安定な細胞株が所望される場合、標準技術によって安定にトランスフ
ェクトされた細胞について、スクリーニングし得る。

【０１００】このような安定なプロデューサー細胞株が、パッケージングされた粒子を得る
ために好ましい供給源である。

【０１０１】本発明の粒子は、異種ＤＮＡを標的細胞に送達するために使用し得る。標的細
胞は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボにあり得る。標的細胞は、分裂
中の細胞であっても、または好ましくは静止細胞であってもよい。静止細胞は、
非有糸分裂細胞または有糸分裂後の細胞を含む。好ましい非有糸分裂細胞は、マ
クロファージである。標的細胞はまた、神経系の細胞（例えば、神経細胞または
ニューロン細胞）を含み得る。好ましい静止標的細胞またはゆっくり分裂する標
的細胞は、グリア細胞、筋細胞、肝細胞、肺胞細胞、網膜細胞、および造血幹細
胞を含む。ランゲルハンス島細胞もまた、好ましい標的である。

【０１０２】本方法において、インビボでの細胞の使用が、現在好ましい。しかし、インビ
ボまたはエキソビボでの投与が望ましい場合が存在する。

【０１０３】標的細胞に送達されるべき異種遺伝子を保有するウイルス粒子の導入は、当業
者に公知の任意の方法によって、達成され得る。例えば、インビボ投与とともに
、以下の技術が好ましい。カテーテル、注入、乱切など。例えば、定位注入が、
脳の所望の位置にウイルス粒子を向けるために使用され得る。定位手術が、標準
的神経外科法を使用して、実施される［ＰｅｌｌｅｇｒｉｎｏおよびＣｌａｐｐ
、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．７：８６３〜８（１９７１）］。さらに、この
粒子は、ミニポンプ注入システム（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄＩｎｆｕｓ
ｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）を使用して、脳室内（「ｉｃｖ」）注入によって送達さ
れ得る。バルクフローに基づく最近の方法（対流と称する）もまた、脳の広範な
領域に大きな分子を送達するのに有効であることが示されており、そして標的細
胞にウイルス粒子を送達する際に有用であり得る［Ｒ．Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２０７６〜８０（１９９４）；Ｐ
．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：Ｒ２９２〜３０５
（１９９４）］。他の方法（カテーテル注入、静脈内注入、非経口注入、腹腔内
注入および皮下注入、経口経路または他の公知の投与経路を含む）が、使用され
得る。

【０１０４】いくつかの場合において、これらのベクターを使用して、生存系における特定
の遺伝子の効果を探るために、インビボで宿主を形質転換する。別個のベクター
または好ましくはパッケージされたウイルス粒子の十分な量を注入して、その標
的細胞を含む組織において約１ｐｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの間の範囲の治療タ
ンパク質の血清濃度を得る。例えば、特定のタンパク質を発現することによって
か、あるいは特定の配列に対する抗体を細胞内発現することなどによって、タン
パク質の機能を停止することによる。より好ましくは、約０．１μｇ／ｍｌ〜１
０μｇ／ｍｌの間である。なおより好ましくは、約０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ
／ｍｌである。

【０１０５】例えば、経口投与に使用され得る固形用量形態としては、カプセル、錠剤、丸
剤、散剤、および顆粒剤が、挙げられる。このような固形用量形態において、そ
の活性成分（すなわち、空のウイルス粒子）が、スクロース、ラクトースまたは
スターチのような、少なくとも１つの不活性キャリアと混合される。このような
用量形態はまた、不活性希釈剤以外のさらなる物質（例えば、潤滑剤（例えば、
ステアリン酸マグネシウム））を含み得る。さらに、カプセル、錠剤および丸剤
の場合の容量形態はまた、緩衝剤も含み得る。この錠剤、カプセル、および丸剤
はまた、所定の時間の間ずっとその粒子を放出するための、徐放性コーティング
を含み得る。

【０１０６】非経口投与のために、代表的には、滅菌した、水性または非水性の、溶液、懸
濁液、または乳濁液を、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルとともに含む。非水
性の溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、植物油（例えば、オリーブ油およびトウモロコシ油）、ゼラチンおよび注入
可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。これらの用量形態は
また、アジュバント（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤）を含み
得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過、組成物へと滅菌剤を
組み込むこと、組成物を照射することなど、によって、ウイルス粒子を不活化し
ないように注意が払われる限り、滅菌され得る。それらはまた、滅菌水という媒
体、または使用前の他のいくつかの注射可能な滅菌媒体中で、製造され得る。こ
れらのビヒクルのさらなる例としては、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロ
ース溶液および５％ヒト血清アルブミンが、挙げられる。リポソームもまた、キ
ャリアとして使用され得る。添加剤（例えば、等張性および化学的安定性を増加
させる物質（例えば、緩衝液および保存剤））もまた、使用され得る。

【０１０７】このようなビヒクル中の活性成分の好ましい範囲は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０
ｍｇ／ｍｌの濃度である。より好ましくは、約３ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ
である。

【０１０８】（実施例）（単一プラスミドテトラサイクリン誘導系の構築）（基本的な１プラスミド系）本発明者らの単一誘導性カセット（図１Ａに概説）を、脳心筋炎ウイルス（Ｅ
ＭＣＶ）由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびｐｃＤＮＡ３ｔｅｔ
Ｒから取り出したｔｅｔＲフラグメントを、ｐＣＭＶｔｅｔＯｈＥＧＦのＮｏｔ
Ｉ／ＣｌａＩ部位へ３部分連結（ｔｈｒｅｅｐｉｅｃｅｌｉｇａｔｉｏｎ）
することにより構築した［Ｆ．Ｙａｏら，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９
：１９３９−１９５０（１９９８）］。プラスミドｐＣＭＶｔｅｔＯｈＥＧＦ（
本発明者らの構築物全ての親ベクターとして使用した）は、ヒト表皮増殖因子（
ｈＥＧＦ）遺伝子を含む。この遺伝子は、約６５０ｂｐの前初期エンハンサーサ
イトメガロウイルスプロモーター（ｉｅＣＭＶ）およびＴＡＴＡボックスの１０
ｂｐ下流に配置されたテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）の２つの直列
反復を含むキメラプロモーターにより駆動される。ＩＲＥＳ配列をコードするＮ
ｏｔＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、上記ベクターｐＣＭＶ−Ｆａｂ１０５／２
１Ｈ（Ｒ．Ｌｅｖｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：９６−１１０（１９９７）によ
り以前に調製された）から除去した。サブクローニング工程（中間ｐＧｅｍ７Ｚ
ｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用する）は、
ｐｃＤＮＡ３ｔｅｔＲ由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩｔｅｔＲ含有フラグメント
をクローニングするために必要であった。このことは、最終クローニング工程に
必要な隣接制限部位（ＮｈｅＩ−ＣｌａＩ）の導入および最初のＡＴＧの前にあ
るＫｏｚａｋ配列［Ｍ．Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−
９５０（１９８７）］の挿入を可能にする。この工程の前に、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（
＋）ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ−Ｋｏｚａｋ（ＣＣＡＣＣ）−ＡＴ
Ｇ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｓｔｏｐ（ＴＡＴＴＡＡ）−ＳｐｅＩ−ＣｌａＩ−
ＳｐｈＩ制限部位を含有する合成リンカーを組み込むことにより改変した。対応
する配列を有するオリゴヌクレオチドの対を合成し、そして各当量（１０μｇ）
をハイブリダイズした後、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓ
ｐｈＩ部位に最終的に連結した。得られた０．６５ＫｂのＮｈｅＩ−ＣｌａＩ−
ｔｅｔＲフラグメントをＩＲＥＳ配列の下流、かつｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦベク
ターのポリアデニル化部位の前に挿入した。この位置は、単一ｍＲＮＡ転写物か
らのｔｅｔＲのキャップ非依存性翻訳（ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ）を可能にする。最終的な３部分連結工程を、Ｔａｋａｒａ
のＤＮＡ連結キットを使用して、製造業者の手順に従って行った。同様に、ｔｅ
ｔＯを欠くｐＣＭＶｈＥＧＦプラスミドを改変して、ＩＲＥＳ配列および調節可
能でないコントロールプラスミドとして使用するためのｔｅｔＲ遺伝子を組み込
んだ。

【０１０９】（核局在化シグナルの導入）シミアンウイルスラージＴ抗原由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に対応する
３つの直列反復配列（配列番号１ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡ
ＧＧＴＡ）をｓｔｏｐの前にあるｔｅｔＲの３’末端に組み込んだ。ｎｌｓ配列
を含む相補的オリゴヌクレオチドの対を合成して調製し、そしてハイブリダイゼ
ーション後に、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）−ｔｅｔＲのＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ部
位の間にインフレームでクローニングした。次いで、以前に記載した構築物をｔ
ｅｔＲ遺伝子をｔｅｔＲ．ＮＬＳフラグメントに代わって置き換えることにより
改変した。

【０１１０】（ｅＧＦＰ遺伝子によるｈＥＧＦレポーター遺伝子の置換）ｈＥＧＦ遺伝子を含むＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、基本的な誘導系
から切り出し、そして増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子により置換し
た。ｅＧＦＰをコードする７００ｂｐフラグメントをｐｅＧＦＰ．ＩＲＥＳ．ｎ
ｅｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から取り出し、
そして親構築物に直接連結した。

【０１１１】最終的なプラスミドを、ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）
のＥｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅＭａｘｉＫｉｔを用いて精製した。

【０１１２】（元来の２成分誘導系に対する本発明者らの単一プラスミド系のインビトロ機
能性）（細胞培養およびトランスフェクション）アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｖｅｒｏ、Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７細胞株
ならびにヒト腎臓２９３−Ｔ細胞を増殖させ、そして１０％ウシ胎仔血清（Ｔｉ
ｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｔｕｌａｒｅ，ＣＡ）お
よび抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。１０％のＴｅｔＳｙｓｔｅｍ承認ウシ胎仔血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃ
Ａ）を含むＤ−ＭＥＭ培地を本発明者らの誘導系の機能的試験に使用した。

【０１１３】トランスフェクションの前日、細胞を、２×１０⁵細胞／ウェルの密度で６ウ
ェルプレート（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋ
ｅｓ，ＮＪ）にサブクローニングした。一過性トランスフェクションアッセイを
Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製
造業者が記載するように行った。ＤＮＡ複合体を、２．５μｇのプラスミドおよ
びＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（ＤＮＡ対濃縮薬剤が１：２の比）を用いて調製
し、次いで、１０分間室温でインキュベートし、最終的に、細胞にこの複合体を
添加した。２プラスミド系との比較を、０．５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯｈＥＧＦ
またはｐＣＭＶｈＥＧＦを用いて行った。この各々の場合において、単独または
２μｇのｐｃＤＮＡ３ｔｅｔＲまたは空のベクターＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１（
−））との組み合わせで行った。５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中で３７℃で１８時
間インキュベートした後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてテトラサイクリン（
１μｇ／ｍｌ）を含有するかまたは含有しない新鮮培地を再供給した。レセプタ
ー遺伝子発現を、別の節で本発明者らが詳述したように、形質転換後の時間の関
数として測定した。

【０１１４】（レポーター遺伝子発現の評価）培養培地におけるｈＥＧＦの発現を、ＥＬＩＳＡ技術により行った。簡潔には
、９６ウェルプレートを抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体（ＭＡＢ２３６；Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（１００ｎｇ／ウェル）で
室温（ＲＴ）で５時間コーティングし、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中の３％脱脂乳を使用してブロックした。９．７〜５，０００ｐｇ／ｍｌの
範囲の二倍段階希釈中で調製したサンプル、細胞外培地および組換えｈＥＧＦ標
準物質（２３４−ＥＧ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を、４℃で一晩インキュベー
トした。次いで、ｈＥＧＦに対して特異的な二次ポリクローナル抗体（ｓｃ２７
５；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣ
ｒｕｚ，ＣＡ）を添加し（１００ｎｇ／ウェル）、そしてＲＴで２時間インキュ
ベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ウサギ
ポリクローナル抗体（ｓｃ２００４；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）は、三次抗体であ
った（３．３３ｎｇ／ウェル）。最終的に、ペルオキシダーゼアッセイを、製造
業者の手順に従って行い（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、そして
反応物をマイクロプレートリーダーで分析した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉ
ｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。

【０１１５】ｅＧＦＰ遺伝子を有する構築物からの緑色蛍光タンパク質の生成を、ＦＡＣＳ
分析および組織化学により検出した。

【０１１６】（ＲＮＡ抽出およびノザンブロット分析）総細胞質ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して製造業
者の手順に従って、トランスフェクト細胞から抽出した。ＲＮＡ（２０μｇ）を
１．２％ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンＨｙｂ
ｏｎｄ−Ｎフィルター膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈ
ｔｓ，ＩＬ）にプレッシャーブロッティング（ｐｒｅｓｓｕｒｅｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ）により転写した。ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ
）および［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて標識した
ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩｔｅｔＲＤＮＡフラグメント（２５ｎｇ）でブロット
をプローブした。０．５％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ、５×デンハルト溶液［０．１％
ＢＳＡ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ＰＶＰ］および５×ＳＳＰＥ［０
．９ＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．
７］を含有する溶液中の４×１０⁷ｃｐｍの標識プローブを使用して、４２℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。０．１％ＳＤＳ、０．１％ＳＳＰＥ
、６０℃の最終的なストリンジェンシーでブロットを洗浄し、次いで、−８０℃
に曝した後にオートラジオグラフィーにより可視化した。

【０１１７】（トランスフェクト細胞におけるｔｅｔＲの免疫学的位置決定（ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ））Ｖｅｒｏ細胞（５ｘ１０⁴／ウェル）をチャンバーガラススライド上でのトラ
ンスフェクションの前日にプレートした。構築物のトランスフェクションを上記
のように行った。処理（１μｇ／ｍｌｔｅｔありまたはなし）の４８時間後、
細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドでＲＴで２０分間固定した。固定の際に
、細胞を０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いてＲＴで５分間透過性にし、
そして１０％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで３０分間ブロックした。
ｔｅｔＲに対して惹起されたモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１：１
００希釈で添加し、そして１〜２時間インキュベートした。ＦＩＴＣをカップリ
ングしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＰ
Ｅで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
）を、１：２５０希釈で細胞に添加し、そして１時間インキュベーションを続け
た。ＰＢＳで洗浄した後、カバースリップをＳｉｇｍａ培地中でマウントし、そ
してＵＶ光下でＦＩＴＣおよびローダミン交換フィルターを備えた蛍光顕微鏡（
ＮｉｋｏｎＤｉａｐｈｏｔ３００）を用いて検鏡した。スポット冷却（ｓｐ
ｏｔｃｏｏｌｅｄ）カラーデジタルカメラ中に記録した画像を、Ｏｎｃｏｒ
Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて分析し、そしてＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏ
ｐ，Ｖ３．０ｆｏｒＭａｃｉｎｔｏｓｈから印刷した。

【０１１８】（ＨＩＶ−１ベースのベクターの調製および評価）使用したベクターは、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンＨＸＢ２（図１）に基
づく。本発明者らのウイルスベクター構築物についての基礎のさらなる詳細は、
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５：６３５−６４４（１９９
８）で既に報告した。

【０１１９】オリジナルの複数減弱ベクター（ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｖｉｆおよびｖｐｒ遺伝子
が欠失している。ＨＶＰΔＥＢ）を、ウイルスプロモーター領域からのサイレン
ス転写活性化に改変した（そうでなければ、内部プロモーターを使用した場合に
トランスジーン発現の干渉を引き起こし得る（プロモーター干渉））。得られた
自己不活化（ＳＩＮ）移入ベクターまたはＨＰＶΔＥＢΔＬＴＲを、単一のＳｃ
ａＩ／部分的ＰｖｕＩＩ消化およびＰａｃＩリンカーの挿入により生成し、従っ
て、３’ＬＴＲ上にＴＡＴＡボックス、ＳＰ１およびＮＦ−κＢ部位を含む１２
０ｂｐフラグメント（ヌクレオチド９３９８〜９５１８）を排除する。移入プラ
スミド中の改変Ｕ３領域の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１２０】新規な改変バーションのオリジナルベクターを、残りのｇａｇ領域ならびにｔ
ａｔおよびｒｅｖ遺伝子の最初のエキソンへの２．５Ｋｂ欠失（ヌクレオチド８
３０〜２０９６および５７４３〜７０４１）により作製した（ＮＶＰΔＥＢΔｔ
ａｔ）。このフラグメントを、ＣｌａＩＩ／ＣｌａＩ消化および引き続く再連結
により除去し、ｔａｔベクターを得た。

【０１２１】３つの開発したベクターの形質導入効率を決定するために、ＣＭＶプロモータ
ーの制御下またはいずれの内部プロモーターもない条件下のいずれかで増強緑色
蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を移入ベクターに導入した。ＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ
−ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位を含む合成リンカーをプラスミドベクター
に導入して適切なクローニング部位を組み込み、次いで、ＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ
ＣＭＶＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）またはＢａ
ｍＨＩ−ＮｏｔＩＥＧＦＰフラグメントをベクターに移動させた。

【０１２２】（ウイルスベクターパッケージングおよび形質導入）偽型ＨＩＶベクター粒子を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用い
て製造業者の説明書に従って、移入ベクター（５μｇ）、パッケージングプラス
ミド（２．５μｇ）、ＶＳＶ−Ｇエクスプレッサープラスミド（ｅｘｐｒｅｓｓ
ｏｒｐｌａｓｍｉｄ）（１μｇ）およびｒｅｖエクスプレッサープラスミドの
一過性同時トランスフェクションにより、ＣＯＳ−１細胞（約１．５×１０⁶細
胞／１０ｍｍディッシュ）で生成した。２４時間後に培地を交換し、そしてウイ
ルスを３６〜４８時間後に採取した。馴化培地を逆転写酵素活性についてスクリ
ーニングし、そして１ｍｌを用いて１×１０⁶Ｈｅｌａ細胞を形質導入した。形
質導入効率を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析により決定した。

【０１２３】（誘導性ＨＩＶ−１ベースのベクターの構築）複製欠損ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶ−１ベクターを、３つのプラスミドの組合わせ
を用いて２９３Ｔヒト腎臓細胞の一過性同時トランスフェクションにより作製し
た。それらは、レンチウイルス生成、エンベロープエクスプレッサーおよび移入
ベクターに必要なタンパク質および酵素をコードするヘルパー構築物からなる。

【０１２４】トランスファーベクタープラスミドは、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびエンベロ
ープ遺伝子のほとんどを欠いているが、被包、逆転写および組込みに必要なシス
エレメントを維持する。ｐＨｌｉｂＣＭＶｅＧＦＰ（野生型）ベクターは、異種
遺伝子の挿入を可能にし、ならびにウイルス非複製をもたらす、３．１Ｋｂの欠
失をｇａｇ−ｐｏｌ領域に、および２つの欠失をエンベロープ領域（１．５Ｋｂ
および０．５５Ｋｂ）を含む。感染するレンチウイルスベクターの能力を研究し
て、そして有効な遺伝子発現を提供するために、本発明者らは、マーカー遺伝子
として増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子を使用している。ｈＥ
ＧＦまたは任意の他のマーカーが、代わりに使用され得る。異種最初期ＣＭＶプ
ロモーターまたはウイルス５’ＬＴＲのいずれかの制御下でｅＧＦＰ遺伝子を含
むベクターは、標準的な技術によって調製された。

【０１２５】ベクターのバイオセイフティーにおける改善が、野生型ベクターの、３’ＬＴ
Ｒ領域（９３９８〜９５１８ｂｐ）において１２０ｂｐ欠失を導入することによ
って自己不活性化ベクター（ＳＩＮベクター）を構築することにより、達成され
た。逆転写の間、失われたＤＮＡフラグメントが、５’ＬＴＲ領域に転移され、
得られたプロウイルスＤＮＡにおいてウイルスプロモーターの弱毒化を導く、Ｔ
ＡＴＡボックス、ＳＰ１およびＮＦ−ｋＢシス活性エレメントの欠失を生じる。

【０１２６】本発明者らは、特定部位の突然変異誘発によって、ｔａｔ独立ベクターもまた
精製した。ｔａｔ遺伝子の最初のエキソンの最初の２つのコドン内に３つの塩基
変異が導入され、２つのアミノ酸置換を生じた（１番目のアミノ酸がＭｅｔから
Ｉｌｅへ、および２番目のアミノ酸がＧｌｕから終止シグナルへ）。

【０１２７】ＨＩＶ−１に基づいたベクターを作製するのに必要とされる２つの他のプラス
ミドは、パッケージング構築物（ｐＣＭＶＲ８．２）、およびエンベロープ発
現プラスミドである。これらの２つのプラスミドは、被包および／または組込み
に必要とされるＨＩＶ−１パッケージングエレメント（パッケージングシグナル
およびＬＴＲ）のいずれも含まない。ヘルパーのタンパク質の発現は、最初期Ｃ
ＭＶプロモーターの制御下にあり、そして転写末端は、ＳＶ４０ポリアデニル化
シグナルによって提供される。異なる適用のために、本発明者らは、水疱性口内
炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、あるいはエボラ糖タンパク質（Ｅｂ−
ＧＰ）を含む偽型ウイルスを調製した。３つのプラスミドを同時トランスフェク
トにより生成した組換えウイルスは、逆転写、組込みおよび遺伝子発現のために
必要とされるエレメントを含むが、複製を支持し得ない。

【０１２８】２９３Ｔ細胞の一時的同時トランスフェクションが、従来のリン酸カルシウム
技術により行われた。４８〜６０時間のインキュベーション後に回収された上清
が、０．４５μｍまたは０．２２μｍのフィルターに培養培地を通すことによっ
て精製され、次いでウイルスは、２時間１００，００ｘｇの超遠心によって濃縮
された。代替の濃縮手順は、従来の遠心工程の間に、１００，０００ＭＷのカッ
トオフフィルターの使用を含む。逆トランスクリプターゼ（ＲＴ）レベルが、ウ
イルス濃度のためのパラメーターとして、濃縮前および後で回収されたアリコー
トで試験され、そして平行して、２９３Ｔ細胞上またはＨｅＬａ細胞におけるｅ
ＧＦＰ発現により、最終調製において、実際の形質導入ユニットを確立すること
を決定する。

【０１２９】（ウイルスベクター設計および調製）複製欠陥ＶＳＶ−Ｇ偽型ＳＨＩＶベクターまたはＨＩＶ−１ベクターが、３つ
のプラスミドの組み合わせを用いて２９３Ｔヒト腎細胞の１次的な同時トランス
フェクションによって生成される。

【０１３０】トランスファーベクターである、ｐＨｌｉｂｅＧＦＰ（１０μｇ）は、レポー
ター遺伝子（増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））の挿入を可能にする
、３．１Ｋｂの欠失を、ｇａｇ−ｐｏｌ領域に、および２つの欠失をエンベロー
プ遺伝子領域（１．５Ｋｂおよび０．５５Ｋｂ）中に含む。ＨＩＶ−１ベクター
のためのパッケージング構築物（最初期ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＨＩ
Ｖ−１ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子をコードするｐＣＭＶＲ８．２（５
μｇ））が、ＤｉｄｉｅｒＴｒｏｎｏから、快く贈られた。ＳＨＩＶベクター
の産生のために、エンベロープ領域およびｖｐｒ領域中に欠失を有するＳＩＶｍ
ａｃ１Ａ１１のサブゲノムフラグメントを、ＳＶ４０由来発現ベクター中に含む
ＳＩＶパック（５μｇ）構築物が、ｐＣＭＶＲ８．２の代わりに用いられた（
ＷｈｉｔｅＳＭら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８３２、１９９９）。第３の成
分でエンベロープ発現プラスミドのｐＣＭＶＶＳＶ−Ｇ（２μｇ）は、ＣＭＶ
プロモーターの調節下で水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子を含む。２９
３Ｔの一時的な同時トランスフェクションが、従来のリン酸カルシウム技術によ
り行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９）。トランスフェク
ション後４８〜６０時間後に回収された上清は、０．２２μｍのフィルターに培
養培地を通すことによって精製され、次いで−８０℃でアリコートにおいて維持
した。逆トランスクリプターゼ（ＲＴ）レベルが、調製物の総粒子数を決定する
ために使用された。

【０１３１】（ＨＩＶ−１ベクターまたはＳＨＩＶＧＦＰベクターを用いたＣＤ８−欠失
サルおよびヒトＰＢＭＣ’ｓの感染）細胞が、２０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランの存在下で４時間、ＶＳＶ−
Ｇ偽型ＨＩＶ−１（６７，０００ＲＴ／ｍｌ）またはＳＨＩＶ（６，０００ＲＴ
／ｍｌ）ＧＦＰウイルスを用いて感染された。次いで、細胞を、１×ＰＢＳを用
いて洗浄して、そしてフレッシュ培地によって再培養した。緑色蛍光遺伝子発現
が、ＦＡＣＳ分析によって感染４８時間後に分析された。

【０１３２】（誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）ＨＩＶ−１ベクターの構築）本発明者らの１つのテトラサイクリン誘導カセットおよびコントロールビシス
トロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）カセットが、適切な制限部位を含む真核
生物クローニングベクターから取り除かれ、そしてｔａｔ変異を運ぶＳＩＮベク
ター中にクローン化された。この方法で、Ｔａｔタンパク質の、内部ＣＭＶプロ
モーターによる任意の干渉が避けられた。

【０１３３】（ベリーラージ（ＶｅｒｙＬａｒｇｅ）、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）、ヒトｓ
Ｆｖファージディスプレイラーブラリーの構築）ラージ、ナイーブ、ヒトｓＦｖファージディスプレーライブラリーが、ｐＦＡ
ＲＢＥＲファージミドベクターにおいて、１，６００万個のＶκ遺伝子ＩＩＩ融
合物およびＶλ遺伝子ＩＩＩ融合物の各々とランダムに組み合わされた、２億７
，５００万個を越えるヒトＶ_H遺伝子の８０回のエレクトロポレーションを実施
することによって、構築された。これらの割合は、結合エネルギーの大半が、Ｖ _H ＣＤＲ３により寄与されることから、最大のＶ_H多様性を維持するために選択さ
れた。総計１．６３×１０¹⁰個の形質転換株が単離された。制限酵素消化による
分析は、９２％を越えるｓＦｖ挿入効率を示し、１５０億個のメンバーのライブ
ラリーを生じる。このライブラリーは、ヘルパーファージを用いて容易にレスキ
ューされ、そして感染されたＴＧ１細菌全てが、予期された８００ｂｐのｓＦｖ
挿入物を含んだ。形質転換された細菌のマスターバイアルは、グリセロールスト
ックとして、アリコートされ、そして凍結された。

【０１３４】（ナイーブヒトｓＦｖファージディスプレーライブラリーの遺伝的多様性の分
析）３３個のランダムに選択されたｓＦｖは、Ｖ_H、Ｄ、Ｊ_H、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλお
よびＪλ生殖細胞系列遺伝子セグメントならびにＶ_H ＣＤＲ３の長さを同定し
、そして回復されたｓＦｖ遺伝子のＤＦＣＩデータベースを作製するのに、遺伝
的多様性を分析するために配列決定されたＤＮＡであった。生殖細胞系列遺伝子
セグメントの分析は、「ＶＢａｓｅ：Ａｄａｔａｂａｓｅｏｆｈｕｍａ
ｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｇｅｎ
ｅｓ．ＩａｎＭ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＳａｍｕｅｌＣ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ
，ＳｉｍｏｎＪ．Ｃｏｒｂｅｔｔ，ＪｏｎａｔｈａｎＰ．Ｌ．Ｃｏｘ．ａｎ
ｄＧｒｅｇＷｉｎｔｅｒ．ＭＲＣＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｉｌｌｓＲｏａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ
２２ＱＨ，ＵＫ」による。これらの分析からのデータは、表１〜３において示
される。

【０１３５】表１は、本発明者らが指定（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）し得る３３個のＶ_H遺伝
子のためのヒトＶ_H生殖細胞系列遺伝子の結果を示す。この多様性は、７個のＶ_H ファミリーのうちの５つを示す２０個の異なる生殖細胞系列遺伝子を含む。複製
ＶＨ遺伝子（例えば、ＤＰ−８７５、ＤＰ−７、Ｓ１２−１４など）のうちどれ
も、同じＶ_H生殖細胞系列遺伝子由来の他のメンバーと同一ではない。遺伝的多
様性の別の指標は、Ｖ_HＣＤＲ３の長さである。表２において表されたデータは
、この多様なセグメントの平均的長さが、１０個と１４個のアミノ酸との間の長
さのＣＤＲ３を示している再配置されたＶ_H遺伝子の大部分を含む、６個のアミ
ノ酸〜１８個のアミノ酸の範囲にわたることを示す。これは、天然の抗体による
、公開されたレポートとの優れた一致である。最終的に、２８Ｖ_L遺伝子が、Ｖ
κおよびＶλ系列遺伝子の指定のために分析された。ヒトにおいて、これら２つ
のクラスの軽鎖が、軽鎖の９５％がκファミリーメンバーであるマウスとは異な
り、およそ１：１の頻度で使用される。表３において示され得るように、６つの
異なるＶκファミリーのうちの５つを表す、８個の異なるＶκ生殖細胞系列遺伝
子が同定されて、そして１０個の異なるＶλファミリーのうち８個を表している
、１２個の異なるＶλ生殖細胞系列遺伝子が使用された。再び、複製ＶＬ生殖細
胞系列遺伝子の利用が生じる場合、体の点突然変異は、この遺伝子が同一ではな
いことを確認する。

【０１３６】従って、本発明者らは、このベリーラージ、ナイーブな、ヒトｓＦｖ抗体ファ
ージディスプレーライブラリーにおいて、広い遺伝的多様性が存在すると考える
。この主要な重鎖ファミリーおよび軽鎖ファミリーの各々が表されたが、少数フ
ァミリーの全ては表されていなかった。後者の発見は、ほとんど、本発明者らが
分析した小さいサンプルのサイズに起因しているようである。

【０１３７】（１つのプラスミド誘導系のインビトロの機能性）トランスフェクションアッセイが、方法において記載されたのと同様に実施さ
れた。本発明者らの実験のための内部比較として、本発明者らは、Ｙａｏら、Ｈ
ｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：１９３９−１９５０（１９９８）によって
記載されるツープラスミド（ｔｗｏｐｌａｓｍｉｄ）系を用いたトランスフェ
クションアッセイを含んだ。コントロールベクター、ｐｃＤＮＡ３またはプラス
ミドを用いて同時トランスフェクションしたｐＣＭｔｅｔＯｈＥＧＦを得た結果
は、Ｙａｏの論文において報告されている知見と一致した（データーは示されて
いない）。図３は、種々の濃度でテトラサイクリン誘導プラスミドを用いてトラ
ンスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の上清分析後に得られた結果を示す。２、５ま
たは１０μｇのプラスミドが感染のために使用される場合、本発明者らの系の効
率という点では、有意な相違は存在しない。ツープラスミド系について記載され
るように、ｈＥＦＧ発現は、時間依存様式で減少した。特に、ｈＥＧＦ発現が抑
制されて、そして７２時間維持されて、感染後４６〜７２時間で、約１，３００
分の１にまで抑制された。

【０１３８】３つの遺伝的に改変されたＨＩＶ−Ｉに基づいたベクター（上記）が、インビ
トロにおけるＨｅＬａ細胞に感染するそれらの能力について試験された。ｅＧＦ
Ｐは、レポーター遺伝子として用いられ、そして内部ＣＭＶプロモーターまたウ
イルスプロモーター自体から駆動された遺伝子発現は、ＦＡＣＳ分析によって評
価された。表４は、６つの構築物によって得られた結果を示す。元々のレンチウ
イルスベクターが、自己不活性化された場合、またはｇａｇ遺伝子の有意な部分
およびｔａｔ遺伝子の第１のエキソンが除去された場合、得られる力価の有意な
減少はない。本発明者らの調製物を用いて得られた逆転写酵素の力価は、異なる
構築物間で異ならなかった（データは示されていない）。この事実は、ｔａｔタ
ンパク質の完全性が、ウイルス増殖の間にウイルス相互活性化を増幅するのに基
本的に必要とされることを示したいくつの以前の報告に関連する。本発明者らの
場合において、ｔａｔ遺伝子のエキソン１およびエキソン２の全配列は、トラン
スフェクションの間、パッケージング構築物へのトランスにおいて提供され、必
要量のｔａｔタンパク質を提供してウイルスを産生する。表１において、本発明
者らはまた、ｅＧＦＰの発現が、野生型ウイルスプロモーター（ＨＶＰΔＥＢ）
によって指向され得ることを観察し得る。さらに、自己不活性化のようなプロモ
ーター領域の操作は、ウイルスプロモーターによって駆動された遺伝子発現をわ
ずかに低減するが、強力なトランスアクチベーターである、ｔａｔタンパク質が
存在しない場合、より有意に蛍光の百分率は減少し、いくつかのプロモーターの
減弱化を示し得る。

【０１３９】（ｔｅｔＲによるｍＲＮＡ発現の転写制御）レポーター遺伝子ならびにｔｅｔＲをコードする、約２Ｋｂのポリシストロン
ｍＲＮＡは、誘導性および制御プラスミド両方由来の遺伝子転写の最初の１ラウ
ンドの結果である（図２）。キャップ独立（ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）
翻訳によるｔｅｔＲの最初の産生が、ＩＲＥＳ配列を介して媒介される。ＩＲＥ
Ｓエレメントの５００個以下のヌクレオチドは、ＲＮＡの翻訳の内部の開始（ｉ
ｎｔｅｒｎａｌｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）を促進する小さいリボソームのサブユ
ニットを補充するために必要なシス作用エレメントを含む［Ｅ．Ｍａｒｔｉｎｅ
ｚ−Ｓａｌａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５８−
６４］。ｔｅｔＲ産生と同時に、転写の中断がテトラサイクリンの非存在下にお
いて起こる。このメカニズムは、ｔｅｔＲのダイマーとＴＡＴＡボックスとＣＭ
Ｖプロモーターの転写開始部位との間に位置する２つの縦列のｔｅｔＯ配列との
間の高い親和性および有効な相互作用として説明され得、転写開始の妨害を生じ
る。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）がこの系に添加される場合、ｔｅｔＲは、リプ
レッサーと抗生物質との間のより高い結合定数から、ｔｅｔＯに対する結合を生
じる［Ｗ．Ｈｉｎｒｉｃｈｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：４１８−４２０（１
９９４）］。結果として、高レベルの発現が、キメラＣＭＶプロモーターの活性
化を通して達成され得る。

【０１４０】トランスフェクションの後、４８時間後の形質転換されたＶＥＲＯ細胞中に見
出される転写レベルを、ノーザンブロットによって分析した。放射性標識したｔ
ｅｔＲプローブを使用し、コントロールおよび誘導可能なプラスミドから産生さ
れたｍＲＮＡを可視化した（図２Ａ中の下線）。トランスフェクトされていない
細胞および空のコントロールプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞由
来の総ＲＮＡを、本発明者らのネガティブコントロールとみなした（図２Ｂ、レ
ーン１、２）。並行して、細胞をｐｃＤＮＡｔｅｔＲプラスミドを用いて形質転
換し、そして、そのＲＮＡを、本発明者らの実験のポジティブコントロールとし
て使用した（レーン３）。このプローブは、ｔｅｔＲ遺伝子のｍＲＮＡサイズに
対応する約０．６Ｋｂの転写物を検出し得る。一部分（ｏｎｅ−ｐｉｅｃｅ）の
コントロールプラスミド（１Ｐｃ）を用いて形質転換された細胞は、本発明者ら
の構築物の予想したサイズに一致するより高い分子量のｍＲＮＡの発現を示した
。１ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンの非存在下または存在下における発現の差違は
、示され得なかった（図２Ｂ、レーン４、５）。しかし、一部分の誘導可能なカ
セット（１Ｐｉ）を用いて形質転換された細胞に対応する転写物のレベルは、提
唱されるモデルに従う発現の調節を示した（図２Ｂ、レーン６、７）。抗生物質
の非存在下かつトランスフェクト後４８時間において、転写物は検出され得なか
った。本発明者らが以前に記載したように、二倍シストロンの（ｂｉｃｉｓｔｒ
ｏｎｉｃ）ｍＲＮＡのいくつかの分子は、抑制因子のキャップ非依存性翻訳に関
する型としてはたらくために合成されることが必要である。最初のｍＲＮＡ分子
が、細胞から素早く分解されること、または、低いレベルのｍＲＮＡが、封じら
れている（ｓｉｌｅｎｃｅ）遺伝子転写を保持するために非常に基底レベルで産
生されることは、可能である。別の可能性としては、細胞中のｔｅｔＲの寿命が
、この系の調節解除を保存するに十分な長さであることである。総ＲＮＡレベル
を、図２Ｂの下のパネルに示し、等量のＲＮＡが、ロード（ｌｏａｄ）されたこ
とを示す。

【０１４１】（単一カセット由来のｈＥＧＦ発現の調節）遺伝子発現の厳重な制御は、高い誘導性、誘導因子に対する特定かつ用量依存
的な応答、ならびに誘導因子が除去された後に基底レベルに戻る能力を有する系
が必要である。本発明者らは、インビトロトランスフェクション実験によって単
一カセットのこれら３つの特性を試験した。

【０１４２】有効性。本発明者らは、Ｙａｏおよび共同研究者らによって記載された以前の
系［Ｆ．Ｙａｏら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：１９３９−１９５０
（１９９８）］（ここで、発現制御および調節成分は、２つの別々のプラスミド
に存在する）と比較した、本発明者らの単一カセットの有効性を分析した。この
目的に関して、本発明者らは、両方の系の有効性について並行した機能の研究を
実施し、これは、トランスフェクトされたＶＥＲＯ細胞の培養培地中へ分泌され
たｈＥＧＦの量を測定することによる（図７）。実験条件は、２つのプラスミド
系に関して記載された実験条件［Ｆ．Ｙａｏら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅ
ｒ．９：１９３９−１９５０（１９９８）］と類似であった。レポーター遺伝子
発現を、２４時間毎に、細胞外培地を回収した後に分析し、そしてＥＬＩＳＡに
よって産生されたｈＥＧＦの量を測定した。２つのプラスミド構築物を使用して
得られたデータは、Ｙａｏら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：１９３９
−１９５０（１９９８）によって以前に報告された結果と一致した。コントロー
ルプラスミド由来のｈＥＧＦの発現は、抗生物質投与に対していずれの変化も示
さなかった。ｐＣＭＶｔｅｔＯｈＥＧＦ由来のｈＥＧＦの発現は、ｔｅｔＲが同
時にトランスフェクトされない限り影響されず、テトラサイクリンの非存在下に
おいて、最初の２４時間の間に約３４０倍の抑制を達成し、２つの継続的な時間
点の間、それぞれ、６００倍および９５０倍まで増加する。同様に、本発明者ら
の単一カセットを用いて、本発明者らは、１Ｐｃ構築物のＣＭＶプロモーターか
ら駆動されるｈＥＧＦ発現のレベルにおいて差違を認めなかった。しかし、時間
依存性ｔｅｔＲ抑制が、１Ｐｉ系を用いて明確に観察された。５５倍、１００倍
および９００倍の抑制が、トランスフェクション後０〜２４時間、２４〜４８時
間、および４８〜７２時間において検出された。十分なＩＲＥＳ媒介ｔｅｔＲ合
成が遺伝子活性化をブロックすることを達成するまで、両方の遺伝子が最初の回
の転写の間に二倍シストロンのｍＲＮＡから同時に発現された。結果的に、第１
のシストロンのキャップ媒介翻訳が生じ、これがテトラサイクリンの非存在下に
おける、２つのプラスミド系と比較た１Ｐｉ系からのより高いレベルのｈＥＧＦ
産生に寄与した。本発明者らはまた、単一カセットを用いたｔｅｔＲ媒介抑制が
、２つのプラスミド系を用いて観察された結果と比較して特定の遅延を示すこと
を観察した。これは、必要とされるレベルのｔｅｔＲが、トランスフェクト後４
８時間までに達せず、そして／または最初に合成されたｈＥＧＦの完全なクリア
ランスが時間が経って生じるから、と説明され得る。４８時間後、比較可能なレ
ベルの抑制が、両方の系から得られ、本発明者らの系の有効性を提供する。

【０１４３】用量応答。ｔｅｔＲ媒介抑制の解除が、漸増する濃度のテトラサイクリンを１
Ｐｉ系を用いてトランスフェクトされたＶＥＲＯ細胞の培養培地に添加した後に
観察された（図８）。この系の完全な活性化は、５０ｎｇ／ｍｌのテトラサイク
リンによって得られた。

【０１４４】可逆性。本発明者らは、誘導後のテトラサイクリン除去に応答する１Ｐｉ系の
能力を試験した（図９）。１Ｐｉ構築物を用いてトランスフェクトされたＶｅｒ
ｏ細胞を、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの非存在下または存在下でインキュ
ベーションした。２４時間後、誘導因子に予め曝露された細胞のセットを、テト
ラサイクリンを欠く新鮮な培地で再び飼い、そしてｈＥＧＦの濃度を、培養培地
において分析した。図９に示すように、ｈＥＧＦの分泌は次の２４時間にわたっ
てほとんど影響を与えないままであったが、テトラサイクリンの非存在下におい
て４８時間後、基底レベルまで劇的に低下した。遺伝子発現が前に起こっていた
細胞におけるｈＥＧＦ遺伝子の転写開始が阻害され、少なくとも２日に関して２
，５００倍の抑制を達成した。誘導されていない状態に保持された細胞は、トラ
ンスフェクションの後、３日後に最大１０，０００倍の抑制を示した。

【０１４５】（異なる細胞株における単一プラスミド系由来のｅＧＦＰ発現の調節）ｔｅｔＯ保有ＣＭＶプロモーターがＶＥＲＯ細胞に加えた細胞株中のレポータ
ー遺伝子の発現を制御する能力を測定した。この目的に関して、本発明者らは、
本発明者らの構築物由来のｈＥＧＦ遺伝子を増強された緑色蛍光タンパク質（ｅ
ＧＦＰ）遺伝子と置換し、そしてこのタンパク質の内在性発現に対して多様な細
胞株をスクリーニングし、これには、異なる時間点においてｅＧＦＰの発現を測
定するためにＦＡＣＳ分析を使用した（図１０）。全ての場合において、コント
ロール細胞または空ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞は、いずれの
有意な蛍光バックグラウンドを示さなかった（図１０は、ＶＥＲＯ細胞からのデ
ータを示す）。ＶＥＲＯ、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞は、蛍光強度によっ
て測定した場合、１Ｐｃプラスミドから類似したレベルのｅＧＦＰ発現を示した
。ヒト細胞株２９３ＴにおけるｅＧＦＰ発現は、サル細胞株よりも２倍高かった
。全体的には、テトラサイクリンの非存在下または存在下において重要な蛍光と
いう観点では、変化は観察されなかった。コントロールｔｅｔＯユニットの性能
は、細胞株の間で類似し、テトラサイクリンの非存在下で５倍のｅＧＦＰ強度の
抑制に達した。ｔｅｔＯ保有ＣＭＶプロモーターの活性は、細胞の間で変化する
。特に、テトラサイクリンの非存在下におけるより高い発現レベルおよびバック
グラウンドが、ヒト２９３−Ｔ細胞株において観察され；これはおそらく、アデ
ノウイルス由来のＥ１Ａ／Ｂ遺伝子産物の存在に起因し、この遺伝子産物は、ウ
イルスＣＭＶプロモーターの活性を促進することが示された。同様の結果が、ト
ランスフェクション後、２４時間、４８時間および７２時間で回収された細胞を
分析した後に集められた（データには示さない）。

【０１４６】実験された全ての細胞株は、テトラサイクリンの非存在下において有意なバッ
クグラウンドレベルの発現を示した。基底レベルの発現が、この系の漏れの結果
であるかまたは単にｅＧＦＰタンパク質のゆっくりとした代謝回転によって引き
起こされたものであるか否かを調べるために、本発明者らは、免疫組織化学を使
用して、テトラサイクリンの添加なしまたは添加ありで形質転換されたＶＥＲＯ
細胞における、ｅＧＦＰ（ＦＩＴＣフィルター）およびｔｅｔＲ（ＰＥフィルタ
ー）の産生を同時に見た（図１１）。１Ｐｃプラスミド由来の、キャップ媒介ｅ
ＧＦＰ（図１１Ａ、１１Ｃ）およびＩＲＥＳ媒介ｔｅｔＲ（図１１Ｂ、１１Ｄ）
産生は、誘導因子の非存在下または存在下において影響されないままであった。
両方のタンパク質の細胞質分布および核分布を、異なる細胞で観察し、ｅＧＦＰ
に関しては主に核であり、そして抑制因子に関しては主に細胞質であった。１Ｐ
ｉ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞は、異なる挙動を示した。テトラ
サイクリンの非存在下にもかかわらず、ｅＧＦＰタンパク質は、視覚化し得（図
１１Ｅ）、ｔｅｔＲの発現が良好に観察された（図１１Ｆ）。さらに、抑制がテ
トラサイクリンの添加によって解除される場合、ｅＧＦＰおよびｔｅｔＲ陽性細
胞が検出された（図１１Ｇ、１１Ｈ）。従って、ｔｅｔＲ媒介抑制は、これらの
細胞において効果的に作用するが、ｅＧＦＰの長い寿命および安定性から、本発
明者らは、短い期間におけるこのマーカー遺伝子を使用する系の活性化および抑
制の程度を正確に決定できなかった。

【０１４７】（核局在化シグナルの導入はｔｅｔＲ媒介抑制を促進する）ｔｅｔＲ分布が主に細胞質で観察されたので、核局在シグナル（ＮＬＳ）をｔ
ｅｔＲ遺伝子の３’末端に導入し、核への導入を促進し、そして結果的にｔｅｔ
Ｒ媒介の転写抑制を強化した。図１２は、ＶＥＲＯ細胞における一過性トランス
フェクション実験の結果を示し、これは、１Ｐｉ系およびＮＬＳ配列を含む改変
された変形を使用した。産生され培地中に分泌されたｈＥＧＦの測定により、２
４時間後、プラスミド間に有意な差違が見出されなかったことが示された。しか
し、より早いｔｅｔＲ媒介抑制が、ＮＬＳ構築物を用いて４８時間後に観察され
、テトラサイクリンの非存在下において、３００倍の抑制または標的化されてい
ないｔｅｔＲよりも３倍高いｔｅｔＲＮＬＳタンパク質の有効性が得られた。４
８時間後、３００倍および５００倍の抑制が、それぞれ、１Ｐｉおよび１ＰｉＮ
ＬＳプラスミドから達成された。この系の導入という点に関しては、構築物の間
に有意な差違は、観察されなかった。野生型ＣＭＶプロモーターを含む全ての構
築物は、実験を通していずれの調節性の効果も示さなかった。

【０１４８】異なる構築物におけるｔｅｔＲの分布を免疫組織化学によって分析し、これは
、細菌ｔｅｔＲに対するモノクローナル抗体を使用し、そしてＦＩＴＣを用いて
標識した２次抗体を用いたけ結合を検出した（図１３）。空ベクターを用いてト
ランスフェクトされた細胞は、染色を示さなかった（図１３Ａ）。予想されたよ
うに、ｐｃＤＮＡｔｅｔＲを用いてトランスフェクトされた細胞は、陽性であっ
た（図１３Ｂ）。ｔｅｔＲ産生を検出するために、細胞を、固定の前に２日間テ
トラサイクリンで処理した。１ＰｉからのｔｅｔＲ発現が、細胞質および核の両
方に存在したが（図１３Ｃ）、ｔｅｔＲＮＬＳタンパク質は、主に核の中に見出
された（図１３Ｄ）。

【０１４９】図１４は、ＨＩＶ−１およびＳＨＩＶ偽型ＶＳＶ−ＧによるＰＰＭＣの感染の
結果を示す。感染されたサル細胞からのＧＦＰ発現は、ヒトＰＢＭＣにおいてＨ
ＩＶ−１ベクターを用いて得られた発現ほど明るくなく、蛍光細胞のより高いパ
ーセンテージが、ＳＨＩＶウイルスを用いて得ることができた（ＳＨＩＶベクタ
ーを用いて約１０％に対し、ＨＩＶベクターを用いて０．２５％）。感染に使用
された総ウイルスの量が、大体１０倍異なることを強調することが重要である。
感染の間の比較可能なウイルスロード（ｌｏａｄ）を使用することにより、サル
由来ＰＢＭＣを用いたインビトロ発現において、ＨＩＶ−１ベクターと比較した
ＳＨＩＶベクターの性能に関するより良い考えが提供される。

【０１５０】

【表１】

【０１５１】

【表２】

【０１５２】

【表３】

【０１５３】

【表４】

【０１５４】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、レンチウイルスベクター系の概略図を提供する。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、転写開始のｔｅｔＲ−媒介性抑制を示す。図２Ａは、単
一誘導性カセットおよび予期される多シストロン性ｍＲＮＡの概要を説明する。
図２Ｂは、ノーザンブロット分析を示す。モック（ｍｏｃｋ）処理されたベロ（
Ｖｅｒｏ）細胞ならびに空のベクター、ｐｃＤＮＡｔｅｔＲプラスミド、ワンピ
ースコントロール（１Ｐｃ）および誘導性ワンピース（１Ｐｉ）で独立にトラン
スフェクトされた細胞を、トランスフェクション後２日後に収集し、そしてＲＮ
Ａ全体をＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して分離し、続いてクロロホルム抽出をして、
そしてイソプロパノールを用いて沈殿させた。ＲＮＡ全体（２０μｇ）を、変性
条件において電気泳動し、そして放射標識されたｔｅｔＲプローブ（２Ａにおい
て示されるＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメント）とハイブリダイズする
特定のｍＲＮＡの存在を検出するためにハイボンド（ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ膜上に
ブロットした。ｔｅｔＲｍＲＮＡに対応する約０．６Ｋｂの転写物が示される
。誘導カセットに由来するビシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡ
発現のテトラサイクリン調節が観察される。

【図３】図３は、種々の濃度（２．５または１０μｇ）におけるテトラサイクリン誘導
性プラスミドを用いるトランスフェクトから得られた結果を表わす。

【図４】図４は、標的分子のライブラリーをトランスフェクトするために使用されるク
ローンニングベクター（ｐＧＥＭ−７２ｆ（ｔ））の概略図である。

【図５】図５Ａおよび５Ｂは、パッケージングベクター（ＨＩＶＮｔｅｔＯＩＲ）を含
むＨＩＶ−Ｉベースのレトロウイルスベクター（図５Ａ）およびパッキング欠損
レンチウイルスベクター（図５Ｂ）の概略図である。

【図６】図６は、ファージディスプレイ技術によって、単鎖抗体（ｓＦｖ）の単離の方
法を示す概略図である。

【図７】図７は、２つの別個のプラスミドまたは単一コントロールカセットを使用する
ｈＥＧＦ発現の調節の比較である。複製中のベロ細胞を、１μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンの非存在下（白棒および縞模様の棒）もしくは存在下（黒棒）のいず
れかにおいて、０．５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯｈＥＧＦ（２Ｐｉ）もしくは非調
節バージョンｐＣＭＶｈＥＧＦ（２Ｐｃ）単独（白棒）を使用するか、あるいは
２μｇのｐｃＤＮＡｔｅｔＲ（縞模様の棒および黒棒）もしくは空のベクターｐ
ｃＤＮＡ３．１（−）を組み合わせて使用して、２つのプラスミド系で独立にト
ランスフェクトした。ワンピースコントロール（１Ｐｃ）および誘導性プラスミ
ド（１Ｐｉ）を試験するために、抗生物質の非存在下（縞模様の棒）または存在
下（黒棒）において、２．５μｇの対応するＤＮＡを用いて、細胞を３連で独立
に試験した。細胞外の培地を、指示された時間においてトランスフェクトされた
細胞から収集し、そしてｈＥＧＦの発現を、ＥＬＩＳＡによって測定した。

【図８】図８は、テトラサイクリンに対する用量−応答効果を示す。１Ｐｉカセットで
トランスフェクトされたベロ細胞を処理し、そして培養培地において増加する濃
度のテトラサイクリンの存在下で増殖させた。４８時間後、培地に放出されたｈ
ＥＧＦの量を、ＥＬＩＳＡによって分析した。

【図９】図９は、ベロ（ＶＥＲＯ）細胞における、本発明者らの単一カセットの可逆的
効果を示す。トランスフェクトされた細胞を、実験全体の間（黒棒）あるいは２
４時間処理の後、テトラサイクリンの非存在下（白棒）または存在下において培
養し、その細胞を、誘発因子を伴わずに培地中に維持した（斜線棒）。培養培地
を、指示された時点におけるｈＥＧＦ産生について分析した。

【図１０】図１０は、異なる細胞株におけるｅＧＦＰ発現の制御を示す。トランスフェク
トされていない細胞、および空のベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（−）または本発
明の１Ｐｃあるいは１Ｐｉプラスミドでトランスフェクトされた細胞のいずれか
を、トランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳ分析によって分析し、異なる
細胞株における内因性ｅＧＦＰ発現を決定した（１μｇ／ｍｌテトラサイクリン
の非存在下（ストライプのバー）または存在下（黒いバー））。

【図１１】図１１Ａ〜Ｈは、トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞においてｅＧＦＰおよ
びｔｅｔＲの共発現を示す。１Ｐｃ（図１１Ａ〜Ｄ）または１Ｐｉ（図１１Ｅ〜
Ｈ）でトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を、分析の前に誘発因子（ｉｎｄｕ
ｃｅｒ）の非存在（１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｆ）または存在（図１１
Ｄ、１１Ｄ、１１Ｇおよび１１Ｈ）下で、２日間増殖させた。ｅＧＦＰ（図１１
Ａ、１１Ｃ、１１Ｅおよび１１Ｇ）およびｔｅｔＲ（図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆ
および１１Ｈ）発現の同時の観察を、ｔｅｔＲに対する第１抗体を使用してｔｅ
ｔＲタンパク質の免疫反応によって行った。そしてＰＥに結合した第２のヤギ抗
マウスＩｇＧは、異なる波長での免疫複合体の検出を可能にする。

【図１２】図１２は、ＮＬＳ配列を挿入することによってｔｅｔＲ媒介性抑制が増強され
ることを示す。コントロール（１ＰＣまたは１Ｐｃ．ＮＬＳ）または本発明の構
築物の誘発性（１Ｐｉまたは１Ｐｉ．ＮＬＳ）型（ｖｅｒｓｉｏｎ）のいずれか
でトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞を、テトラサイクリンの非存在（ストライ
プのバー）または存在下（黒いバー）で増殖させた。収集された上清のアリコー
トを分析し、培養培地に分泌されたｈＥＧＦの量を決定した。

【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、ＮＬＳ配列の添加後のｔｅｔＲの免疫学的局在決定を示す。
異なるプラスミド構築物でのＶＥＲＯ細胞のトランスフェクション後のｔｅｔＲ
タンパク質の局在化を、従来の免疫蛍光によって行った。テトラサイクリンの存
在下でコントロールプラスミド（図１３Ａ）、ｐｃＤＮＡｔｅｔＲプラスミド（
図１３Ｂ）、および１Ｐｉ（図１３Ｃ）または１Ｐｉ．ＮＬＳ（図１３Ｄ）でト
ランスフェクトした細胞を、４％ホルムアミド／ＰＢＳで固定し、そして界面活
性剤で透過化処理し、その後ｔｅｔＲに対するモノクローナル抗体とインキュベ
ートした。第１抗体との２時間のインキュベート後、ＦＩＴＣに結合したヤギ抗
マウスＩｇＧは、蛍光顕微鏡下での可視化を可能にした（最終拡大率は４００倍
）。

【図１４】図１４は、２つの偽型霊長類レンチウイルス（ＨＩＶおよびＳＨＩＶ）によっ
て、感染されたＣＤ８−（ストライプのバー）およびヒトＣＤ８−（ベタの黒い
バー）ＰＢＭＣの感染の比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者オグエタ，サンドラアメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックライン，ビーコンストリート 1440，アパートメント 205 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA03 BA21 BA61 BA63 CA02 CA11 DA02 EA02 FA01 FA02 GA11 HA11 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ13 QQ52 QQ79 QQ91 QQ94 QR31 QR77 QR79 QR80 QS38

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的分子の群から標的分子についてスクリーニングするため
の方法であって、以下：（ａ）複数のレンチウイルスビリオンで複数の細胞を形質導入する工程であっ
て、ここで該レンチウイルスビリオンは、少なくとも以下：（１）レンチウイルスｇａｇタンパク質をコードするレンチウイルスｇａｇ遺
伝子を含む、１つのベクターであって、ここで該レンチウイルスｇａｇ遺伝子は
、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されている、１つの
ベクター；（２）機能的エンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を含
む、第２のベクターであって、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、プロモーターおよびポ
リアデニル化配列に作動可能に連結されている、第２のベクター；および（３）
初めの２つのベクターのうちの１つ、または少なくとも第３のベクター上に、レ
ンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする、レンチウイルスｐｏｌ遺伝子であ
って、ここで該レンチウイルスｐｏｌ遺伝子は、プロモーターおよびポリアデニ
ル化配列に作動可能に連結されている、レンチウイルスｐｏｌ遺伝子であって、ここで該ベクターは、単一のベクター上に、レンチウイルスｇａｇおよびｐｏ
ｌならびにエンベロープタンパク質をコードするのに十分なヌクレオチドを含ま
ず；そしてここで該ベクターは、レンチウイルスＲＮＡを効率的にパッケージングするた
めのパッケージングセグメントと呼ばれるレンチウイルスゲノムのヌクレオチド
を含まず；そしてここで、該レンチウイルスタンパク質およびエンベロープタン
パク質が組み合わされて発現される場合、レンチウイルスカプシドの付近にエン
ベロープタンパク質を含むレンチウイルスビリオンを形成する；ならびに（４）
複数の標的分子より選択される標的分子をコードする核酸配列を含む、パッケー
ジングベクターであって、ここで該核酸配列は、プロモーターおよびレンチウイ
ルスパッケージング配列に作動可能に連結されており、該パッケージング配列は
、該レンチウイルスビリオン内に該レンチウイルスＲＮＡをパッケージングする
ために必要なレンチウイルス長末端繰り返し（ＬＴＲ）配列の部分を含み；ここ
で該ビリオンがさらにマーカー遺伝子を含む、パッケージングベクター、をプロデュサー細胞に同時トランスフェクトすることによって産生される工程；（ｂ）該マーカー遺伝子によって発現されたマーカーの存在についてのスクリ
ーニングによって形質導入された細胞を同定する工程；（ｃ）所望の表現型を示す細胞についてスクリーニングする工程；ならびに（ｄ）所望の表現型を示す細胞内に存在する標的分子を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記ｅｎｖ遺伝子がレンチウイルスゲノムに対して異種であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記標的分子が誘導プロモーターに作動可能に連結されてい
る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記レンチウイルスが、霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不
全ウイルス（ＦＩＶ）、ビスナウイルス、またはウマ伝染性貧血ウイルスである
、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記標的分子が、アンチセンス分子、リボザイム、抗体、レ
セプター、サイトカイン、新脈管形成モジュレーションまたは成長ホルモンであ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記標的分子が細胞内での発現および結合のために適応され
た抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】前記誘導プロモーターがｔｅｔＲ−ｔｅｔＯプロモーターで
ある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記リボザイムまたは前記アンチセンス分子がトランススプ
ライシング可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】前記標的分子が、アンチセンス分子、リボザイム、抗体、
レセプター、サイトカイン、新脈管形成モジュレーションまたは成長ホルモンで
ある、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記標的分子が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記抗体が結合するタンパク質を同定する工程をさらに包
含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記ｅｎｖ遺伝子がエンドサイトーシス画分を標的化する
エンベロープタンパク質をコードする、請求項２、５、６、８、１０、１１、ま
たは１２に記載の方法。
【請求項１４】前記ｅｎｖ遺伝子がＶＳＶ−Ｇｅｎｖ遺伝子である、請
求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記レンチウイルスが霊長類レンチウイルスである、請求
項４に記載の方法。
【請求項１６】前記霊長類レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスとＳ
ＨＩＶと呼ばれるサル免疫不全ウイルスのハイブリッドである、請求項１５に記
載の方法。