CN110023325B - 具有提高的生物活性和降低的对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解易感性的来源于纤连蛋白的肽 - Google Patents

Abstract

提出了来源于纤连蛋白的多肽，其具有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性，并且能够结合生长因子和/或增强生长因子活性。这些多肽可用于增强患者中的伤口愈合。

Description

具有提高的生物活性和降低的对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降 解易感性的来源于纤连蛋白的肽

政府支持

本发明是在美国陆军AFIRM 1和JWMRP S14授予的政府支持下分别在授权号W81XWH-08-2-0034和W81XWH-15-C-0043下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明基于来源于纤连蛋白的多肽的发现，所述多肽具有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性，并且能够结合生长因子和/或增强生长因子活性。之前已知的具有增强生长因子活性能力的来源于纤连蛋白的多肽被发现易于被人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解，从而降低了它们在体内使用的有效性。本发明涉及对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的降解具有增加抗性的新型生长因子增强多肽。本发明还涉及此类化合物在美容治疗及伤口和癌症治疗中的用途。

背景

在美国平民中，每年约有500,000名烧伤患者出现在急诊室。在每年40,000例入院中，25,000名烧伤患者被送往专门的烧伤中心。烧伤的逐步扩展会产生破坏性影响。在几天到一周的时间内，深二度烧伤可能变成三度烧伤，这在短期内会导致组织损失增加、愈合时间延长、发病率和死亡率过高。从长期来看，瘢痕形成增加、伤口挛缩和生活质量下降成为主要问题。虽然导致缺血区转变为完全坏死的一个或多个确切机制尚不清楚，但是由炎症以及缺血/再灌注引起的几种过程(包括氧化剂和细胞因子应激)可能起作用。改善血流的疗法，如非甾体抗炎剂(NSAIDS)和抗凝血剂(肝素)在防止烧伤进展方面没有显示出实质性的益处。因此，限制烧伤进展的疗法是未满足的需求。

有证据表明纤连蛋白(FN)参与许多生物过程，包括组织修复、胚胎形成、血液凝固、细胞迁移、伤口修复和细胞粘附。纤连蛋白有两种主要形式。第一种是不溶的糖蛋白二聚体，其在胞外基质(ECM)中用作接头；第二种是存在于血浆中的可溶的二硫键连接的二聚体。纤连蛋白的ECM形式由成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞和某些上皮细胞表达。纤连蛋白的血浆形式由肝细胞表达。纤连蛋白可以通过将细胞锚定至胶原蛋白或蛋白聚糖底物而起一般的细胞粘附分子的作用。纤连蛋白还可以通过结合ECM的组分和细胞表面上的膜结合纤连蛋白受体而在组织细胞相互作用方面起作用。纤连蛋白的形式存在于脊椎动物中，包括哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类和爬行动物。

FN为一种500kDa糖蛋白，在血液中循环，并且在组织形成期间由组织细胞在临时胞外基质(ECM)中产生和沉积。作为临时ECM的关键组分，FN在胚胎形成、形态发生和伤口愈合中起着至关重要的作用，但在烧伤患者的伤口和血液中缺乏。已知FN在烧伤创面液中通过内肽酶嗜中性粒细胞弹性蛋白酶被降解。参见Grinnell等人，Identification of Neutrophil Elastase as the Proteinase in Burn Wound Fluid Responsible for Degradation of Fibronectin,J Invest.Dermatology,1994,103(2):155-61。

先前公开的肽“P12”是在纤连蛋白(FN)第一类型III重复蛋白(FNIII₁)的β-折叠片的免疫球蛋白夹心型内隐蔽的14-残基肽。与FN不同，溶液中的P12与各种生长因子，特别是血小板来源的生长因子-BB(PDGF-BB)固有地且协同地促进间充质细胞生长、增殖和迁移。此外，P12在PDGF-BB存在下保护成年人皮肤成纤维细胞(AHDF)免受氧化和细胞因子应激和/或营养物撤出诱导的细胞死亡。P12还限制了大鼠和猪烧伤模型中的烧伤进展，并减轻了垂直烧伤进展猪模型中的瘢痕形成。参见，如，PCT/US2006/038778；美国专利8,759,300；Lin,等人,Fibronectin peptides that bind PDGF-BB enhance survival of cells and tissue under stress,J Invest Dermatol.2014年4月；134(4):1119–1127；和Asif,等人,Blood Vessel Occlusion in Peri-burn Tissue is Secondary to Erythrocyte Aggregation and Mitigated by a Fibronectin-derived Peptide that Limits Burn Injury Progression,Wound Rep Reg(2016)24 501-513。特别地，纤连蛋白的片段PSHISKYILRWRPK，或“P12”在Lin等人和Asif等人中均被公开为可用于治疗伤口，特别是治疗烧伤。

概要

我们提出了用于治疗伤口的来源于纤连蛋白片段的嗜中性粒细胞弹性蛋白抗性肽。特别地，我们发现先前公开的纤连蛋白的生物活性肽片段如P12易于在体外被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解，并且在局部应用至伤口时不会促进愈合。甚至先前公开的纤连蛋白的生物活性肽片段的环化形式如环状P12仍然对该内肽酶敏感。我们提出了纤连蛋白的片段和/或片段衍生物的肽，其维持它们结合生长因子如血小板来源的生长因子-BB(PDGF-BB)以及增强成纤维细胞存活的生物活性，并且还被修饰以提高它们在体外和体内被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解的抗性。

在本发明的一些实施方案中，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽是根据式I的直链或环状多肽：

(I)：H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇

其中X₁是I或G或L，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L或G，

X₅是N或G，

X₆不存在或是S，且

X₇不存在或是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN。本发明的另外实施方案包括HISKYILRWRPKNSV(P46)、HIGKYGLRWRPKNSV(cNP7)、HIGKYGLRWRPKGSV(cNP8)、HGSKYGLRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKGSV以及它们的环化形式。

我们还提出了使用这些肽进行美容治疗以及伤口和心血管疾病治疗的方法。待治疗的伤口包括患者皮肤、黏膜、结缔组织、筋膜、韧带、肌腱、软骨、神经或肌肉的手术切口或摘除、创伤性损伤、热烧伤、化学烧伤、病变或溃疡及患者骨骼的伤口。治疗的伤口可以是感染的或未感染的。待治疗的心血管事件包括血管被红细胞和/或纤维蛋白原和/或纤维蛋白的聚集体堵塞，如可发生在烧伤创面；心肌梗死；多器官衰竭；糖尿病；镰状细胞贫血；真性红细胞增多症；和血纤维蛋白原过多。在一个具体的实施方案中，本发明的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽用于治疗热烧伤和/或化学烧伤。

本发明的特征还在于包含本发明的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽的组合物(如，生理上可接受的组合物)。生理上可接受的组合物可以是促进治疗反应的药物组合物。如上所述，美容组合物也是特征性的，并且可包含本文所述的肽。本发明的组合物也可以在这样的意义中是非药物性的：它们可以包含浓缩肽和/或其他成分，其应当在使用前被稀释或以其他方式修饰(如，与其他活性或非活性成分混合)(如，在细胞培养物中或者作为美容或治疗制剂)。

附图简述

图1是cP12对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的易感性的图解。图1A：将cP12与纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:200的酶：底物摩尔比一起孵育，在24小时保留最小完整肽(MW＝1789)。图1B：由人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶切割的cP12的弹性蛋白酶敏感位点，并通过MS分析。

图2显示P12、P45和P46的生物活性。将成年人皮肤成纤维细胞CF31细胞以1000个细胞/孔接种于胶原蛋白包被的96孔板中的DMEM内过夜，然后加入1nM PDGF-BB和指定剂量的肽，并将细胞在37℃下孵育6天。然后通过XTT测定，读取450nm处的OD来测量细胞代谢。每个点代表6次重复的平均值，其典型的SD＝平均值±5-10％(未显示移植物清晰度)。

图3显示嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在4小时和24小时消化P46。将P46与纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:100的酶：底物摩尔比在37℃下一起孵育4小时(A)或24小时(B)。通过MALDI-TOF分析确定肽的稳定性。P46的分子量是1898。

图4显示P12、P46、cNP7和cNP8的生物活性。在37℃下，将成年人皮肤成纤维细胞CF31以1000个细胞/孔在胶原包被的96孔板中与DMEM、1nM PDGF-BB和指定剂量的肽一起孵育6天，然后通过XTT测定，读取450nm处的OD来测量细胞代谢。数据代表6次重复的平均值。

图5显示来源于P46的cNP8对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的消化具有抗性。将cNP8与纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:100的酶：底物摩尔比在37℃下一起孵育4小时(A)或24小时(B)。通过MALDI-TOF分析确定肽的稳定性。cNP8的分子量为1736。在24小时保留完整肽(MW＝1736)。

图6显示在猪模型中cP12和cNP8肽在局部治疗的情况下促进烧伤创面再上皮化的有效性的比较。

图7显示在猪烧伤模型中用静脉内cNP8治疗的伤口位点在第10天时再上皮化的增加。

图8显示在猪烧伤模型中用静脉内cNP8治疗的伤口位点在第14天时再上皮化的增加。

详述

在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。

具有提高的生物活性和对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶消化具有抗性的来源于纤连蛋白的肽的测定：

先前公开的肽P12被存在于伤口液中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解：

为了确定环状P12(“cP12”)是否对内肽酶敏感，用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶消化cP12。用甲酸终止反应，并通过质谱分析反应混合物。结果分析表明，cP12具有五个弹性蛋白酶切割位点(图1B)。此外，几乎所有完整的cP12底物(1789mw)都被消除(图1A)。

用人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶消化纤连蛋白产生的片段及其生物活性的测定：

为了找到具有cP12等效生物活性的弹性蛋白酶抗性的cP12-衍生物，我们用纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:100的酶：底物摩尔比在37℃下消化纤连蛋白III₁-C(FNIII₁-C)(于其中发现了P12肽)4小时或24小时。用MS分析消化的样品。两个时间点的结果均表明FN III₁-C的弹性蛋白酶消化产生来自纤连蛋白的与P12相同区域的两条肽，P45(SKYILRWRPKNSV)和P46(HISKYILRWRPKNSV)。生物活性测定表明，如通过成纤维细胞代谢测定确定的，P46显示出比P12更高的生物活性(图2)。另一方面，P45几乎没有显示生物活性(图2)。

P46对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶消化的敏感性的测定：

为了测定P46对弹性蛋白酶消化的敏感性，合成了P46并将其用弹性蛋白酶消化。MS分析结果显示P46保留了对弹性蛋白酶消化的一些敏感性(图3)。将P46与纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:100的酶：底物摩尔比在37℃下一起孵育4小时(图3A)或24小时(图3B)。通过MALDI-TOF分析测定弹性蛋白酶生成的较小肽。P46的分子量为1898。

作为具有生物活性的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽的cNP7和cNP8：

基于P46的氨基酸序列和弹性蛋白酶的酶促切割性质，我们设计并合成了五条工程化的肽：-HIGKYGLRWRPKNSV-(NP7)和-HIGKYGLRWRPKGSV-(NP8)、HISKYILGWRPKNSV(NP9)、HISKYILRGRPKNSV(NP10)、HISKYILRWGPKNSV(NP11)，和用于对弹性蛋白酶消化的抗性。在这些中，在孵育6天后，NP8在无血清但具有1nM PDGF-BB的培养基中的成年人皮肤成纤维细胞存活的筛选实验中表现出最佳的生物活性。NP9、NP10和NP11在该筛选中显示出最小的生物活性。

比较P12、P46、cNP7和cNP8在PDGF-BB存在下促进成年人皮肤成纤维细胞存活的能力。将成年人皮肤成纤维细胞以1000个细胞/孔在胶原蛋白包被的96孔板中与DMEM，1nMPDGF-BB和指定剂量的肽一起孵育6天，然后通过XTT测定测量细胞代谢。数据代表6次重复的平均值(图4)。该生物活性测定表明，所有四条肽均促进成年人皮肤成纤维细胞的存活，并且与P46和cNP7相比，cNP8显示出相当或更好的生物活性，这取决于浓度。

肽与弹性蛋白酶的孵育结果显示cNP8对弹性蛋白酶消化具有抗性。将来源于P46的cNP8与纯化的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:100的酶：底物摩尔比在37℃下孵育4小时(图5A)或24小时(图5B)。由MALDI-TOF分析来确定肽的稳定性。cNP8的分子量为1736。在24小时保留大部分完整肽。因此，cNP8是具有生物活性和对弹性蛋白酶消化的抗性的肽。

p46和从P46工程化的cNP8具有结合生长因子的能力：

之前的研究显示，纤连蛋白来源的生物活性肽P12与血小板来源的生长因子BB相互作用，并增强其活性以支持成纤维细胞存活。我们在上文表明，纤连蛋白来源的肽P46和具有弹性蛋白酶抗性的经工程化的肽cNP8均显示出比P12的生物活性高得多的生物活性。为了研究这些肽的结合活性，通过表面等离子体共振(Biacore T200)测定P12、P46和cNP8与生长因子的实时相互作用。结果表明P46和cNP8均显示出与P12相似的结合活性。它们结合PDGF-BB和转化生长因子-β1(TGF-β1)，但不结合表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。

表面等离子体共振：

在Biacore2000系统中，经过使不同浓度的FN肽(分析物)分别通过与PDGF-BB(配体)偶联的芯片表面上方来确定来自动力学数据的结合常数。所有动力学实验均在20℃下以20μl/min的流速进行。对于质量传递实验，每种分析物以固定的浓度注射并以5至75μl/min范围内的流速运行。将所有分析物注射到PDGF-BB配体表面上方，以及注射在对照表面上方保持120秒，然后在运行缓冲液中解离300秒。用于后续注射的传感器芯片的再生通过0.1％SDS的脉冲完成。质量传递实验几乎检测不到不同流速下的响应的差异，因此验证了来自动力学实验的数据。使用用Biacore Bioevaluation软件进行的非线性最小二乘分析和微分速率方程的数值积分来制作并全局拟合传感图。使用对照表面生成的每个传感图从相应的实验传感图中减去，并且使用注入物质的分子质量、每1ng/mm2的1000个共振单位(RU)的等效值和100nm的基质厚度，将得到的曲线转换为浓度单位。使用来自Bioevaluation软件的动力学模型分析每个数据集，所述数据集由来自同一表面上方的不同浓度的分析物注射的一系列传感图组成。

用于伤口愈合的新型肽：

根据式I的直链肽或环状肽可用于治疗伤口：

(I):H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇

其中X₁是I或G或L，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L或G，

X₅是N或G，

X₆不存在或是S，且

X₇不存在或是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN。

这些肽促进人成年皮肤成纤维细胞和人成年心肌细胞的存活、迁移或生长，并且对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(一种在伤口液中存在的内肽酶)具有抗性。

每条直链肽或环状肽促进人成年皮肤成纤维细胞和/或人成年心肌细胞的存活、迁移或生长，对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性，并且可用于治疗伤口和/或心血管疾病，所述肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HISKYILRWRPKNS、HISKYILRWRPKN、HISKYILRWRPKGSV、HISKYILRWRPKGS、HISKYILRWRPKG、HGSKYILRWRPKNSV、HGSKYILRWRPKNS、HGSKYILRWRPKN、HGSKYILRWRPKGSV、HGSKYILRWRPKGS、HGSKYILRWRPKG、HLSKYILRWRPKNSV、HLSKYILRWRPKNS、HLSKYILRWRPKN、HLSKYILRWRPKGSV、HLSKYILRWRPKGS、HLSKYILRWRPKG、HIGKYILRWRPKNSV、HIGKYILRWRPKNS、HIGKYILRWRPKN、HIGKYILRWRPKGSV、HIGKYILRWRPKGS、HIGKYILRWRPKG、HISKYGLRWRPKNSV、HISKYGLRWRPKNS、HISKYGLRWRPKN、HISKYGLRWRPKGSV、HISKYGLRWRPKGS、HISKYGLRWRPKG、HGSKYGLRWRPKNSV、HGSKYGLRWRPKNS、HGSKYGLRWRPKN、HGSKYGLRWRPKGSV、HGSKYGLRWRPKGS、HGSKYGLRWRPKG、HLSKYGLRWRPKNSV、HLSKYGLRWRPKNS、HLSKYGLRWRPKN、HLSKYGLRWRPKGSV、HLSKYGLRWRPKGS、HLSKYGLRWRPKG、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNS、HIGKYGLRWRPKN、HIGKYGLRWRPKGSV、HIGKYGLRWRPKGS、HIGKYGLRWRPKG、HISKYLLRWRPKNSV、HISKYLLRWRPKNS、HISKYLLRWRPKN、HISKYLLRWRPKGSV、HISKYLLRWRPKGS、HISKYLLRWRPKG、HGSKYLLRWRPKNSV、HGSKYLLRWRPKNS、HGSKYLLRWRPKN、HGSKYLLRWRPKGSV、HGSKYLLRWRPKGS、HGSKYLLRWRPKG、HLSKYLLRWRPKNSV、HLSKYLLRWRPKNS、HLSKYLLRWRPKN、HLSKYLLRWRPKGSV、HLSKYLLRWRPKGS、HLSKYLLRWRPKG、HIGKYLLRWRPKNSV、HIGKYLLRWRPKNS、HIGKYLLRWRPKN、HIGKYLLRWRPKGSV、HIGKYLLRWRPKGS、HIGKYLLRWRPKG、HISKYIGRWRPKNSV、HISKYIGRWRPKNS、HISKYIGRWRPKN、HISKYIGRWRPKGSV、HISKYIGRWRPKGS、HISKYIGRWRPKG、HGSKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNS、HGSKYIGRWRPKN、HGSKYIGRWRPKGSV、HGSKYIGRWRPKGS、HGSKYIGRWRPKG、HLSKYIGRWRPKNSV、HLSKYIGRWRPKNS、HLSKYIGRWRPKN、HLSKYIGRWRPKGSV、HLSKYIGRWRPKGS、HLSKYIGRWRPKG、HIGKYIGRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNS、HIGKYIGRWRPKN、HIGKYIGRWRPKGSV、HIGKYIGRWRPKGS或HIGKYIGRWRPKG。

在一个具体的实施方案中，每条直链肽或环状肽：HISKYILRWRPKNSV(P46)、HIGKYGLRWRPKNSV(NP7)、HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)、HGSKYGLRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNSV或HGSKYIGRWRPKGSV促进人成年皮肤成纤维细胞和/或人成年心肌细胞的存活、迁移或生长，对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性，并且可用于治疗伤口和/或心血管疾病。

在另一个特定的实施方案中，环状HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)促进人成年皮肤成纤维细胞和/或人成年心肌细胞的存活、迁移或生长，对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性，并且可用于治疗伤口和/或心血管疾病。

本文所述的所有肽均以标准的单字母氨基酸代码的直链形式呈现，从左侧的N末端读取到右侧的C末端。“环状”或“环化”肽可以以直链形式表示，但具有通过如下所述的一种或多种标准方法与C末端氨基酸结合的N末端氨基酸。

本文描述的生物活性纤连蛋白片段或FN片段变体是这样的生物活性纤连蛋白片段或FN片段变体，其作为PDGF-BB结合肽发挥作用，对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性，并且在有用程度上且以与相应的FN片段基本上相同的方式起作用。例如，当具有天然存在的序列的FN片段以特定的亲和力结合GF并且在施用给患者后有效地增强或改变需要GF的位点处的GF活性时，此FN片段的生物活性变体将是这样的变体：尽管与FN片段不相同，但将以足够有用的亲和力结合一个或多个相同的GF，并且类似地增强或改变需要的位点处的一个或多个GF。为了便于阅读，在每次提及FN片段或其他蛋白或肽后，我们不再重复术语“或其生物活性变体”。应理解，当具有天然存在的序列的FN片段是有用的时，那些片段的生物活性变体也是有用的。

关于功能，片段可以以至少或约1×10-7M(如，至少1×10-8M；1×10-9M；或更大)的亲和力结合多肽生长因子。可选地或此外，片段可以支持无FN的细胞存活和/或增殖。

可选地或此外，片段还可以包含氨基末端或羧基末端处的取代基。取代基可以是酰基或者取代或未取代的胺基团(如，N-末端处的取代基可以是酰基，C-末端可以被取代或未取代的胺基团(如，具有一个、两个或三个取代基的氨基，所述取代基可以相同或不同))酰胺化。胺基团可以是低级烷基(如，具有1-4个碳的烷基)。酰基可以是低级酰基(如，具有多达四个碳原子的酰基)，尤其是乙酰基。

纤连蛋白的片段，包括上述修饰的片段，可以具有蛋白酶抗性，并且可以包含一种或多种类型的保护基团，如酰基、酰胺基团、苄基或苯甲酰基或聚乙二醇。更具体地，纤连蛋白的片段，包括上述修饰的片段，可以是N-末端乙酰化的和/或C-末端酰胺化的。

还可以修饰纤连蛋白的片段以改善吸收，包括例如添加糖残基以增强穿过血脑屏障的转运。

片段中的任一个都可以包含至少一个呈D-形式的氨基酸残基。

片段中的任一个都可以包含至少一个非天然存在的或修饰的氨基酸残基(如，4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、o-磷酸丝氨酸、o-磷酸酪氨酸或δ-羟基赖氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是除了20种天然存在的、遗传编码的氨基酸之外的氨基酸残基。其他实例包括可取代色氨酸以促进合成的萘基丙氨酸、L-羟丙基、L-3,4-二羟基苯丙氨酰、α-氨基酸如L-α-羟赖氨酰和D-α-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰、β-氨基酸和异喹啉基。具有非天然存在的氨基酸残基的片段可以称为合成片段，并且构成如本文所述的一种类型的变体。其他变体包括纤连蛋白的片段，其中氨基酸残基的天然存在的侧链被非天然存在的侧链(呈L-或D-形式)取代。另一方面，本发明的特征在于包含相对于天然存在于纤连蛋白多肽或其生物活性变体中的序列的N-和C-末端呈反向的序列的多肽。

本发明组合物中的任何片段都可以是存在的多个片段之一。这些片段可以通过本文描述的方法连接在一起。如所述，纤连蛋白的片段，包括本文所述的变体形式，还可以包括异源多肽(即，具有不出现在纤连蛋白中的序列的多肽)。异源多肽可以是增加其所连接的片段的循环半衰期、细胞渗透或透皮渗透的多肽。

片段可以包含在生理上可接受的组合物中，或者它们可以包含在不适合于施用至生物的组合物(如，浓缩储液或者冷冻或冻干的组合物)中。

生理上可接受的组合物可以是药物组合物，并且治疗患者的方法在下面进一步描述。生理上可接受的组合物也可以是非药物组合物或是可以在没有医师处方的情况下处置的药物组合物。例如，它们可以出售给分销商或以“非处方”出售以用于美容目的(如，以降低皮肤损伤的风险或者使对皮肤的损伤最小化或修复对皮肤的损伤)。例如，纤连蛋白的片段和包含它们或它们的组合的组合物(如，FN-生长因子复合物)可以掺入作为化妆品、润肤霜等、防晒剂、洗发剂或护发素、肥皂或其他泡沫清洁剂、或润唇膏出售的局部制剂中。

本发明还涵盖了编码本文所述的多肽的核酸分子。下面进一步描述特定的核酸分子、载体(如，质粒载体或病毒载体)和含有它们的宿主细胞，正如含有它们的生理上可接受的组合物一样。

本发明的其他组合物是组织工程化的产品，其包含纤连蛋白的片段或其生物活性变体。如在其他组合物中一样，片段或其变体能够结合多肽生长因子或增强生长因子活性(如上文和下文进一步描述的)，所述因子可以随后保留生物活性并且可以施用给患者。

本发明的其他组合物包含与本文所述的纤连蛋白的一个或多个片段或其生物活性变体相缔合(如，与其结合或用其浸渍)的固体支持物。支持物可以是例如组织培养容器(如，板或烧瓶)或设备(如，医疗设备，如用于伤口敷料的一种医疗设备，如绷带或纱布)、伤口修复(如，缝合或“免缝胶带”)、手术修复(如，手术网)，或组织植入物(如，支架)。纤连蛋白的片段或其生物活性变体能够结合活性生长因子，包括上述那些中的任一种。

本发明的方法包括用于促进伤口愈合的方法。这些方法包括向患者施用治疗性有效量的本文所述的包含纤连蛋白的片段或其生物活性变体的药物组合物的步骤。纤连蛋白的片段或其生物活性变体可以与一种或多种生长因子一起存在于复合物中。该方法可任选地包括鉴定需要治疗的患者的步骤。此类患者包括具有皮肤、黏膜、下层结缔组织、筋膜、韧带、肌腱、软骨、骨骼、神经或肌肉的手术摘除或切口的患者；具有皮肤、黏膜、下层结缔组织、筋膜、神经或肌肉的创伤性裂伤或组织损伤的患者；和具有皮肤、粘膜、下层结缔组织、筋膜、神经或肌肉的热烧伤、化学烧伤或溃疡的患者。

如本文所用，“烧伤”是由于暴露于热或腐蚀性化学物质导致的组织损伤。“热烧伤”是由于暴露于热而导致的组织损伤。“化学烧伤”是由于暴露于腐蚀性化学物质(通常是强碱或强酸)而导致的组织损伤。用本发明定义的肽治疗的化学烧伤的试剂包括但不限于苯酚、甲氧甲酚、芥子气、磷、氮芥、砷化合物、氨、苛性钾、石灰、氢氧化钠、盐酸和硫酸。

本发明的方法包括用于治疗心血管疾病的方法，包括减少如可能在烧伤创面中发生的红细胞和/或纤维蛋白原和/或纤维蛋白的聚集体导致的血管堵塞；心肌梗死；多器官衰竭；糖尿病；镰状细胞贫血；真性红细胞增多症；和血纤维蛋白原过多。这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的包含纤连蛋白片段或其生物活性变体的药物组合物的步骤。纤连蛋白的片段或其生物活性变体可以与一种或多种生长因子一起存在于复合物中。该方法可任选地包括鉴定需要治疗的患者的步骤。

合适的制剂在下面进一步描述，并且通常采用溶液、洗剂、软膏剂、凝胶剂、乳膏剂或药膏的形式。纤连蛋白的片段，无论是否与生长因子复合，也可以通过将它们包含在胞外基质(ECM；如，天然或工程化的ECM)、绷带、敷料、敷布等来施用。

通过本发明的其他方法，可以将内源性生长因子定位至患者的组织。这些方法可以通过向患者施用治疗有效量的本文所述的包含纤连蛋白的片段或其生物活性变体的组合物来进行。如在上述更具体的治疗方法中一样，可以通过局部应用药物组合物、工程化的ECM或固体支持物来施用这些组合物。这些方法可以被描述为将一种或多种生长因子递送至患者的方法。该方法可任选地包括鉴定需要治疗的患者的步骤。此类患者包括患有组织损伤、组织损失，或者导致组织缺陷或功能障碍的病症的患者。更具体地，患者可能患有脑、脊髓或神经的损伤或损失，或者导致脑、脊髓或神经功能障碍的病症；心脏或血管的损伤或损失，或者导致心脏或血管功能障碍的病症；肺、鼻咽道、鼻窦、气管或气道的损伤或损失，或者导致肺、鼻咽道、鼻窦、气管或气道功能障碍的病症；胃肠道、肝脏或胰腺的损伤或损失，或者导致胃肠道、肝脏或胰腺功能障碍的病症；肾脏、输尿管、膀胱或尿道的损伤或损失，或者导致肾脏、输尿管、膀胱或尿道功能障碍的病症；骨骼、软骨、滑膜、半月板、韧带、肌腱或髓核的损伤或损失，或者导致骨骼、软骨、滑膜、半月板、韧带、肌腱或髓核功能障碍的病症；嘴唇、舌头或牙龈的损伤或损失，或者导致唇、舌头或牙龈功能障碍的病症；皮下组织的损伤或损失，或者导致皮下组织功能障碍的病症。

本发明还可以按照“用途”来描述，在这种情况下它涵盖了以下物质用于促进组织再生和/或组织修复的用途：本文所述的组合物，包含FN片段、FN片段的肽衍生物、含有FN片段和/或FN片段的肽衍生物中的一种或多种的复合物，包括具有结合的GF的那些，编码本发明的FN片段和/或FN片段的肽衍生物的核酸，表达载体，宿主细胞和组织工程化的产物，包括含有生物材料的那些。例如，本发明的组合物可用于促进伤口愈合，或用于制备促进组织再生或伤口愈合的药物。与通常的成人伤口愈合不同，组织再生或修复可导致愈合且几乎没有瘢痕形成。

如本文所用，“生长因子结合肽”(或“GFBP”)和“生长因子增强肽”(或“GFEP”)可同义使用。

如本文所用，“美容治疗”指使用生理上可接受的组合物来改善或保持个体的外观。

如上所详述，我们尤其发现纤连蛋白的特定片段和来源于纤连蛋白的肽能够结合各种生长因子(如，IGF-1、HGF、TGF-β1、TGF-β2、bFGF、FGF-7、PDGF-BB、VEGF-A或NGF)，并且结合的生长因子可以保留或显示增强/降低的生物活性。本发明的特征在于在各种制剂和构型中的包含此类片段和肽且具有或不具有结合的在所示家族中(即在IGF、TGF、FGF、PDGF、VEGF和NGF家族中)的生长因子的组合物。所述片段和肽可以促进与FN片段或肽不结合的GF的协同作用。在一种构型中，FN片段或肽，或者含FN片段或肽/GF的复合物可以掺入工程化的二维或三维胞外基质(在本文中我们可将其缩写为engECM或称为合成的基质)中，并且这些可以包括本文所述的肽(如，符合式I的肽)或其生物活性变体中的任一种；或其任何组合。所掺入的一种或多种生长因子可以是例如IGF-1、TGF-β1、TGF-β2、bFGF、FGF-7、PDGF-BB、VEGF-A或NGF；它们的任何组合或子组合；或与所列那些相同的家族中的另外特定生长因子。可以外源添加生长因子至含肽的制剂(如，含FN片段的基质)中，或者可以在没有生长因子的情况下生成制剂(如，基质)。在后一种情况下，当放置在内源性供应的生长因子附近时，生长因子可以由基质募集。基质还可以募集细胞并诱导它们分化，产生组织或增殖(可能是由于生长因子的包含或募集，但是本发明不限于通过任何特定机制起作用的组合物)。

基质可包含任何类型的生物材料(如，生物聚合物)。例如，基质可以是或可以包含水凝胶(如，分子内交联的水凝胶)。本发明的肽和GF可以掺入许多不同类型的材料(如，透明质酸)中或与其缔合。基质可具有例如聚碳酸酯主链，或包含可生物降解的聚氨酯。合适的生物聚合物的其他实例是：蛋白质(如，胶原蛋白)、含蛋白质的大分子(如蛋白聚糖)、丝(如，衍生的丝)、藻酸盐、甲壳素和壳聚糖。

对于制备含有本发明的一种或多种肽的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗，活性成分(如，单独的肽或与一种或多种GF结合的肽)可以单独或与其他活性剂组合掺入适用于向患者施用的组合物中。可以使用本领域常规方法制备制剂，并且可以通过基于蛋白质的治疗剂的先前制剂提供特定指导。组合物将是生理上可接受的(即基本上无毒的)，并且可以被配制为处方药或非处方产品。药物或药学上可接受的组合物含有化合物(如，多肽)、其他材料(如，稀释剂)和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而没有过多的毒性、刺激、过敏性反应或其他问题或并发症，与合理的受益/风险比相称。

编码本文所述肽的核酸分子也可以被配制以用于细胞培养或施用至患者或对象。此类组合物通常包含药学上可接受的载体，并且在本发明的制剂中考虑了载体。与活性成分相容的任何常规介质或试剂都可用于本发明的组合物中。虽然下面进一步描述了制剂和使用方法，但我们在此指出，意在应用于人患者，如同应用于动物(如，驯化动物、农场动物或表演动物)一样。本发明扩展到非生理上可接受的组合物，在这方面它扩展到制备组合物和适用于储存的组合物(如，浓缩储液和冷冻或冻干制剂)。

本文所述的特定序列来源于人血浆纤连蛋白。此外，可以使用相应的序列(如，具有来自任何物种的任何纤连蛋白同种型的相应序列的片段)。

关于功能，特征性肽可以以约或至少约1×10-6-1×10-7(如，约或至少约5×10-7；1×10-8；5×10-8；1×10-9；或5×10-9)的亲和力结合多肽生长因子，例如PDGF-BB。可选地或此外，该肽仅次于固有生长因子活性和/或生长因子增强活性，支持无FN的细胞存活和/或增殖。

尽管申请人不希望受理论束缚，但本文所述的肽可用于治疗皮肤老化或光老化(如，用于治疗皱纹)和可用于其他美容治疗中，这是因为来源于纤连蛋白的某些片段已被证明可促进成纤维细胞存活和增殖。此外，本文所述的肽可用于将促进成纤维细胞存活和增殖的生长因子递送至需要美容治疗的位点。例如，肽可以掺入透皮贴剂或任何其他设备中以促进它们与生长因子一起或在没有生长因子的情况下的递送。

尽管申请人不希望受理论束缚，但本文所述的肽可用于治疗伤口，只要它们刺激成纤维细胞存活、增殖和/或迁移即可。另外，本文所述的肽可用作例如生长因子递送设备，如工程化的三维胞外基质的组件。

肽的修饰：

特征性片段及其生物活性变体可以以多种方式修饰。例如，可以将试剂，包括另外的氨基酸残基、其他取代基和保护基团添加至氨基末端、羧基末端或两者。可以进行修饰以改变片段形式或改变片段彼此、与不相同的片段或与其他多肽结合或相互作用的方式。虽然本发明的肽可以是直链或环状的，但环状肽通常优于直链肽，这是因为它们的环状结构更加刚性，因此它们的生物活性可能高于相应的直链肽的生物活性(通常参见，Camarero和Muir,J.Am.Chem.Soc.121:5597-5598,1999)。

已经描述了用于从直链前体制备环状多肽的策略，并且其可以与本发明的片段一起使用。例如，化学交联方法可用于制备肽的主链环化形式(Goldenburg和Creighton，J.Mol.Biol.,165:407-413,1983)。其他方法包括化学分子内连接方法(参见，如，Camarero等人,Angew.Chem.Int.Ed.,37:347-349,1998；Tam和Lu,Prot.Sci.,7:1583-1592,1998；Camarero和Muir,Chem.Commun.,1997:1369-1370,1997；以及Zhang和Tam,J.Am.Chem.Soc.119:2363-2370,1997)和酶促分子内连接方法(Jackson等人,J.Am.Chem.Soc.,117:819-820,1995)，其允许直链合成肽在水性条件下有效环化。还参见美国专利第7,105,341号。

可选地或此外，本发明片段中的任一种还可以包含一个或多个取代基。例如，片段可包含在氨基-末端处、羧基-末端处和/或反应性氨基酸残基侧链上的取代基。取代基可以是酰基或者取代或未取代的胺基团(如，在N-末端的取代基可以是酰基，C-末端可以用取代或未取代的胺基团(如，具有可以相同或不同的一个、两个或三个取代基的氨基))酰胺化。胺基团可以是低级烷基(如，具有1-4个碳的烷基)、烯基、炔基或或卤代烷基。酰基可以是低级酰基(如，具有多达四个碳原子的酰基)，尤其是乙酰基。取代基可以是非蛋白聚合物，例如聚醚、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯、聚亚烷基二醇(例如，聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)，或PPG-PEG嵌段/无规聚合物。可以通过本领域已知的方法并以美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号中示出的方式用非蛋白聚合物修饰肽。修饰(如，聚乙二醇化)可以使肽稳定、降低其抗原性、降低所需剂量和/或增强其靶向能力。

非蛋白聚合物的大小和形状可以变化。例如，上面列出的任何非蛋白聚合物(如PEG)可以是直链、支链或梳形的。关于大小，分子量可以变化。例如，PEG可以具有例如约300kDa、约1,000kDa、约2,000kDa、约3,000kDa、约4,000kDa、约5,000kDa、约6,000kDa、约7,000kDa、约8,000kDa、约9,000kDa、约10,000kDa、约11,000kDa、约12,000kDa、约13,000kDa、约14,000kDa、约15,000kDa、约20,000kDa、约30,000kDa、约40,000kDa或约50,000kDa的分子量。例如，PEG可具有300kDA至2000kDA、300kDA至3000kDA、1000kDA至2000kDA及1000至3000kDA的任何分子量。

非蛋白聚合物(如，PEG)可通过任何数量的官能团化学物质(如，羧化-mPEG、对硝基苯基-PEG、醛-PEG、氨基-PEG、硫醇-PEG、马来酰亚胺-PEG、氨基氧基-PEG、肼-PEG、甲苯磺酰基-PEG、碘乙酰胺-PEG、琥珀酰亚胺基琥珀酸-PEG、琥珀酰亚胺基戊二酸-PEG、琥珀酰亚胺基羧基戊基-PEG、对硝基苯基碳酸-PEG或乙硫醇-PEG)与片段连接。非蛋白聚合物(如，PEG)可通过任何数量的化学基团与片段连接，所述化学基团包括但不限于氨基-末端氨基酸、羧基-末端氨基酸、游离胺和游离巯基。

非蛋白聚合物(如，PEG)可以是功能化的(例如，单功能活化的直链PEG，同双功能活化的直链PEG，异双功能活化的直链PEG，多臂活化的PEG)(如2臂、4臂、8臂等)、分支活化的PEG和梳形活化的PEG)。

如本文所用，术语“烷基”意指直链或支链的饱和烃基。示例性烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(如，正丙基和异丙基)、丁基(如，正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(如，正戊基、异戊基、新戊基)等。烷基可含有1至约20、2至约20、1至约10、1至约8、1至约6、1至约4或1至约3个碳原子。

如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的烃基。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基等。“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的烃基。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基等。“卤代烷基”是指具有一个或多个卤素取代基的烷基。示例性卤代烷基包括CF3、C2F5、CHF2、CCl3、CHCl2、C2Cl5等。

如本文所用，“聚醚”是指含有醚键的聚合物。实例包括聚乙二醇。

片段，包括上文所述修饰的片段，可以是蛋白酶抗性的，并且可以包含一种或多种类型的保护基团，如酰基、酰胺基、苄基或苯甲酰基，或聚乙二醇。更具体地，片段，包括上文所述修饰的片段，可以是N-末端乙酰化和/或C-末端酰胺化的。

在包括非天然存在的或修饰的氨基酸残基的情况下，它们可以选自以下或本领域可获得的许多其它物质：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、邻磷酸丝氨酸、邻磷酸酪氨酸或δ-羟赖氨酸。其他实例包括可取代色氨酸以促进合成的萘基丙氨酸、L-羟丙基、L-3,4-二羟基苯丙氨酰、α-氨基酸如L-α-羟赖氨酰和D-α-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰、β-氨基酸和异喹啉基。具有非天然存在的氨基酸残基的片段可以称为合成片段，并且构成本文所述的一种类型的变体。其他变体包括其中氨基酸残基的天然存在的侧链(呈L-或D-形式)被非天然存在的侧链取代的片段。

在一个实施方案中，片段可以在任一末端(或两个末端)(如，在N-末端)具有三个额外的氨基酸(MetGlySer)和在任一末端(或两个末端)(如，在C-末端)具有七至八个额外的氨基酸(ThrSerHisHisHisHisHisHisCys)。

关于通过还原/烷基化和/或酰化进行片段修饰的指导，可以参考Tarr,Methodsof Protein Microcharacterization,J.E.Silver编辑,Humana Press,Clifton N.J.155-194,1986；关于与适当载体的化学偶联的指导，可以参考Mishell和Shiigi,编辑,SelectedMethods in Cellular Immunology,WH Freeman,San Francisco,Calif.(1980)和美国专利第4,939,239号；以及关于温和福尔马林处理的指导，可以参考Marsh,Int.Arch.ofAllergy and Appl.Immunol.,41:199-215,1971。

特征性组合物中的任何肽可以是以多聚体形式(如，二聚体)存在的多种中的一种。这些多聚体可以是直链或支链的。多聚体形式还可包括一种或多种类型的片段和主链结构。当存在两个或更多个片段时，它们可以是相同的或不同的。称为接头的较小结构也可以存在，并且可以介导片段与主链的连接。通常，接头小于主链。主链结构的性质并不是关键的，可以使用许多不同类型的分子。接头结构的一个实例是具有例如两个或更多个赖氨酸残基(如，2、3、4或更多个赖氨酸残基)的寡聚赖氨酸分子。本发明的两个或更多个片段(如，两个、三个或四个多肽)可通过例如肽键与赖氨酸残基连接。这些具有聚赖氨酸接头的片段可以连接至主链结构。例如，本发明涵盖：

主链-KKK HIGKYGLRWRPKGSV

和

HIGKYGLRWRPKGSVKKK-主链。

主链结构，例如，寡聚赖氨酸分子，可以是直链或支链的。在支链的主链分子上的本发明的多聚体肽在本文中可称为“树枝状”肽。

本文所述的任何片段，包括本文所述的变体形式，还可包括异源多肽(即，具有不出现在纤连蛋白中的序列的多肽)。异源多肽可以是增加其所连接(如，融合，如在融合蛋白中)的片段的循环半衰期的多肽。异源多肽可以是白蛋白(如，人血清白蛋白或其部分)或免疫球蛋白的一部分(如，IgG的Fc区)。

可以被本文所述的FN结合的多肽生长因子可以在胰岛素样生长因子(IGF)家族(如，IGF-1)内，在转化生长因子(TGF)家族(如，TGF-β1或TGF-β2)内，在成纤维细胞生长因子(FGF)家族(如bFGF或FGF-7)内，在血小板来源的生长因子(PDGF)家族(如，PDGF-BB)内，在血管内皮生长因子(VEGF)亚家族(如，VEGF-A)内，或在神经生长因子(NGF)家族内。为了确定纤连蛋白片段是否结合具有保留的生物活性的生长因子，可以进行标准生物测定。例如，如下面的实施例中所概述的，可以进行对通常刺激迁移的结合生长因子的迁移响应。例如，可以比较结合和未结合的生长因子对成纤维细胞迁移或肉芽组织形成的影响。具体地，如果生长因子是PDGF(如，PDGF-BB)，则可以分析AHDF细胞的迁移。

模拟本文所述的纤连蛋白片段的必要构象的化合物被考虑在本发明的范围内。此类模拟物的各种设计都是可能的。美国专利第5,192,746号；美国专利第5,169,862号；美国专利第5,539,085号；美国专利第.5,576,423号；美国专利第5,051,448号；和美国专利第5,559,103号(全部在此通过引用并入)描述了用于产生此类化合物的多种方法。

生理上可接受的组合物：

本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径，例如口服或肠胃外(如，静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肌内、通过吸入、透皮(局部)和透粘膜施用)相容。鉴于本发明的FN片段和携带有这些片段的含GF的复合物促进伤口愈合的能力，特别设想了局部制剂。

用于肠胃外施用的溶液或悬浮液可包括：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。组合物可以等分或包装在安瓿、一次性注射器、由玻璃或塑料制成的单剂量或多剂量小瓶、瓶子等中，此类包装形式和使用说明都在本发明的范围内。优选地，鉴于预期的施用途径，组合物在医学可接受的水平上是无菌的。

适用于注射的药物组合物包括，例如无菌水溶液(在溶于水的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括例如生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，制备用于施用的组合物应该是无菌的，并且应该是流体或可转化成至少足以容易注射的流体。组合物和/或核酸构建体应在制备和储存条件下是稳定的，并应防止受到微生物如细菌和真菌的污染作用。对抗微生物的防腐剂可包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。

载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持流动性。

在许多情况下，组合物与血液等渗是理想的。这可以在组合物中使用各种等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠来实现。

可注射组合物的延迟或延长吸收可以是期望的，可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)或通过在组合物中用延迟或延长组分释放的材料包覆活性剂的微米或纳米颗粒来实现。

例如，通过将活性化合物以所需的量溶解或悬浮在含有另外成分中的一种或组合的适当溶剂中，可以制备无菌可注射溶液。通常，产生此类溶液或悬浮液之后进行无菌过滤。通常，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和其它期望成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，如通过真空干燥和/或冷冻干燥来干燥制剂。

适用于局部施用的药物组合物可包括但不限于呈皮肤护理、皮肤清洁或抗皱产品、洗发水、化妆品、护发素、乳液、气雾剂、凝胶、摩丝、染料或漂白剂形式的组合物。这些组合物可含有一种或多种常规化妆品或皮肤病学的添加剂或佐剂，包括但不限于填充剂、表面活性剂、触变剂、抗氧化剂、防腐剂、染料、颜料、香料、增稠剂、维生素、激素、保湿剂、紫外线吸收有机防晒剂、紫外线散射无机防晒剂、润湿剂、阳离子聚合物、阴离子聚合物、非离子聚合物或两性聚合物，以及染发活性物质。这些佐剂在化妆品领域是众所周知的，并且描述在许多出版物中，例如参见Harry's Book of Cosmeticology,8.sup.th edition,MartinRieger编辑,Chemical Publishing,New York(2000)。示例性组合物描述于例如美国专利申请2005008604、美国专利申请20050025725和美国专利申请20040120918中，将其通过引用并入本文。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物可包含一种或多种化学渗透增强剂(如国际公开号WO2005009510中所述)。

示例性的化学渗透增强剂包括但不限于1-十二烷基吡咯烷酮、苄基二甲基十二烷基氯化铵、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、油基甜菜碱、桉叶素、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷胺、十二烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基氨基丙磺酸盐、肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸、柠檬烯、亚油酸、亚麻酸、薄荷醇(萜烯)、月桂酸甲酯、1-甲基-2-吡咯烷酮、N-月桂基肌氨酸(CAS号137-16-6，也称为月桂酰肌氨酸钠)、硫酸烟碱、油酸、辛基三甲基溴化铵、聚乙二醇十二烷基醚、1-苯基哌嗪、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、十二烷基醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油酸钠、辛基硫酸钠、丁卡因和Tween-20^TM。

化学渗透增强剂增加皮肤渗透性并且是本领域已知的(参见，例如，Shah等人“Skin Penetration Enhancement:Clinical pharmacological and regulatoryconsiderations.”Pharmaceutical Skin Penetration Enhancement,K.Walters.编辑1993,New York,Basel,Hong Kong:Marcel Dekker.417-427)。

本发明的肽可以以肽本身或在合适的赋形剂中以预混物的形式用于美容组合物中，并且它们可以以溶液、分散液、乳液、糊剂或粉末的形式使用。它们可以单独地或与其他活性物质(包括但不限于本文具体描述的那些)一起由美容载体，如大胶囊、微胶囊或纳米胶囊、脂质体或乳糜微粒、大颗粒、微粒或纳米颗粒或微海绵携带。它们也可以吸附在粉状有机聚合物、滑石、膨润土和其他无机载体上。

肽可以以任何形式或以结合、掺入、吸收或吸附在大颗粒、微粒和纳米颗粒、大胶囊、微胶囊和纳米胶囊上的形式使用，用于处理纺织品、合成或天然纤维、羊毛及所有可能用于制造意在接触皮肤的白天或晚上用的衣物或内衣(如连裤袜、内衣、手帕和擦拭巾)的材料，以通过纺织品和皮肤之间的接触发挥美容效果并使得能够进行持续的局部递送。

肽可以以0.00001％(w/w)(“w/w”是重量/重量)至10％(w/w)(如，约0.0001％(w/w)至1％(w/w))范围内的浓度用于局部组合物(如，治疗或美容组合物)中。另一个有用的范围是约0.001％至约5％(w/w)。肽也可以在约1ppm至约500ppm的范围内(如，约100至约400ppm)使用。

用于口服施用的组合物通常包含惰性或可食用的稀释剂或可食用的载体。此类组合物可以以各种方式配制，如液体、胶囊或片剂形式。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任何一种或多种：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

对于吸入施用(如，用于应用至鼻道、鼻咽、气管或肺或内的受伤组织，如粘膜)，本发明的组合物以湿气雾剂喷雾或干气雾剂喷雾的形式如从含有合适的推进剂如诸如二氧化碳的气体的加压容器或分配器，或喷雾器进行递送。

全身施用也可以通过透粘膜或透皮途径。对于透粘膜或透皮施用，通常在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。许多这样的渗透剂在本领域中通常是已知的，并且例如对于透粘膜施用，其包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。也可以通过离子电渗疗法、微针和其他经设计以增强透皮渗透的设备促进施用。

透粘膜施用可以通过使用鼻用喷雾或栓剂来实现(如，使用常规的栓剂基料如可可脂和其他甘油酯)。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域公知的软膏剂、药膏、凝胶剂或乳膏剂。

此类组合物也可以用将保护组合物免于从身体快速消除的载体来配制，如控制释放制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚碳酸酯和聚乳酸。该材料也可以如从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。脂质体混悬液(包含用单克隆抗体靶向特定细胞(如，靶向感染细胞)的脂质体)也可以用于制备药物组合物。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利第4,522,811号中所述制备。

以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物对于方便施用和剂量的均匀性是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格决定于并且直接取决于活性化合物的独特特征和将要实现的特定治疗效果，以及混配此类活性化合物用于治疗个体的领域中固有的局限性。在本发明的纤连蛋白片段和纤连蛋白片段的肽衍生物的一个实施方案中，剂量单位形式是约0.1至5mg的冻干肽或肽衍生物。在本发明的纤连蛋白片段和纤连蛋白片段的肽衍生物的另一个实施方案中，剂量单位形式是约1mg的冻干肽或肽衍生物。

活性化合物和药物组合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定。例如，此类程序通常用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗效果的剂量比为治疗指数，并且其可表示为LD50/ED50的比值。通常优选表现出大的治疗指数的化合物。从细胞培养物测定和动物研究(包括下面实施例中描述的那些)获得的数据可用于配制用于人类或其他预期对象的剂量范围。通常选择此类化合物的剂量以产生包括ED50同时具有很小毒性或无毒性的循环浓度范围。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以最初从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。因此，例如，可以最初在动物模型中建立剂量以达到包括如在细胞培养中测定的EC50(即，实现半数最大响应的测试化合物的浓度)的血浆循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液体色谱法或通过适合于目标合成物的其他合适的分析方法来测量。

如所述，具有生长因子-结合和/或-增强/抑制活性的肽(如，合成肽或重组产生的肽)可以掺入组织工程化的产物中。也可以包含促进成纤维细胞迁移的FN结构域。优选地，产物是稳健的(即，对快速降解有相对抗性)。它们可以用于例如治疗伤口，包括急性或不愈合的伤口(如，慢性溃疡)。适合治疗的患者在下面进一步描述。可选地或此外，生长因子-结合和/或增强肽可以拴系至生物相容性聚合物以用于将一种或多种生长因子递送至需要治疗的细胞、组织或器官或者用于生长因子的内源性定位。可选地或此外，生长因子-结合和/或增强肽可以掺入聚合物或非聚合物生物材料中，以用于控制释放至急性或不愈合的伤口。

我们开发了一种工程化的ECM，它指导和诱导了利用拴系至分子内交联的透明质酸(HA)水凝胶的血液蛋白纤连蛋白(FN)的分子结构域C、H和HV或细胞粘附肽进行的猪皮肤伤口中新组织形成。因此，在一个实施方式中，本发明包括工程化的ECM，其包含纤连蛋白(如，血浆纤连蛋白)的片段或其生物活性变体。片段可以拴系至(如，共价或非共价结合至)水凝胶(如，HA水凝胶)，并且可以是结合和/或增强多肽生长因子的片段。片段可以根据美国专利申请20050282747中论述的连接方法进行拴系，其内容以其整体并入本文。

天然存在的ECM包含多种成分，如糖蛋白、蛋白聚糖、复合碳水化合物和其他分子。ECM的主要功能包括但不限于提供结构支持、抗拉强度或缓冲；为细胞粘附和细胞迁移提供基质和途径；以及调节细胞分化和代谢功能。ECM蛋白包括例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白、血小板反应蛋白、腱生蛋白(细胞激动蛋白(cytoactin))、巢蛋白(entactin)(巢蛋白)nidogen)、骨粘连蛋白(SPARC)、锚定蛋白CII、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨钙蛋白、骨唾液蛋白、骨桥蛋白、epinectin、透明质蛋白(hyaluronectin)、淀粉样蛋白P组分、原纤蛋白、嗅觉蛋白、s-层粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整联配体蛋白和缰蛋白。

特征性组织工程化的产物(如，工程化的ECM)可包括生物和/或合成的组分。它可以包括生物聚合物(如，透明质酸(HA)、糖胺聚糖(GAG)、纤维蛋白原、层粘连蛋白或胶原蛋白)。生物相容性聚合物可以是合成的可生物降解的聚合物，其中许多是本领域已知的。例如，可生物降解的聚合物可以是聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚(醚酯)、聚(乙二醇)和聚(原酸酯)的共聚物、聚(二噁烷酮)、聚(亚烷基烷基化物)、可生物降解的聚氨酯或者它们的任何共混物或共聚物。其它有用的聚合物包括藻酸盐聚合物和羧基-乙烯基聚合物(如，包含至少90％丙烯酸单体和约0.1％至约5.0％双功能交联剂的聚合物)。

在最佳伤口修复所需的适当ECM的上下文中，分别可以指导和诱导由伤口位点的组织细胞再增殖和新组织的发育的组织工程化的“智能”基质可由GF或其活性片段组成。另外，一个或多个FN GF-结合结构域可以为工程化许多其他GF定位(来自内源或外源来源)提供有用工具和/或为软或硬组织修复、增强和再生提供递送系统。此外，生长因子FN/VN-结合肽或FN和VN GF-结合结构域的分子工程化的衍生物可强烈抑制GF活性，因此可用于增殖性或纤维化病症，如癌症、肺纤维化、GI或GU狭窄、烧伤挛缩和自身免疫生成的硬化。

EngECM可以在含有或不含生长因子或其活性片段(如，本文所述的生长因子和片段)的情况下生成＝。在前一种情况下，engECM中生长因子的剂量可以变化，例如，如下所述，100ng/ml(每个伤口总共15ng)PDGF-BB添加至2:1工程化的ECM在损伤和应用材料之后4天增强了颗粒形成。在后一种情况下，当放置在内源供应生长因子附近时，生长因子可以由基质募集。

本发明还涵盖了编码本文所述的多肽的核酸分子，包括DNA和RNA分子。核酸分子可以配制在生理上可接受的组合物中用于施用。本发明的特征还在于包含本发明核酸构建体的载体。表达载体特别有益，尤其是用于在真核细胞中表达的表达载体。此类载体可以是例如病毒、质粒、粘粒或人工染色体(如，酵母人工染色体)载体。通常，质粒是环状的dsDNA元件，其包括用于插入所选择的DNA序列，如编码序列的一个或多个克隆位点。此类质粒可以包括功能性复制起点，因此是有复制能力的，或者可以是复制缺陷的。

除了质粒之外，也可以有利地使用病毒载体(如，复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)。已经开发了大量此类病毒载体，其具有多种不同的性质。例如，此类病毒载体可以是复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。用于产生重组逆转录病毒和在体外或体内用此类病毒感染细胞的技术和程序提供在Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel,F.M.等人(编辑)Greene Publishing Associates,(1989),章节9.10-9.14和其他标准实验室手册中。合适的逆转录病毒的实例包括本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒系的实例包括psi.Crip、psi.Cre、psi.2和psi.Am。腺病毒的基因组可以被操作使得其编码并表达如本文所述的核酸构建体，但就其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力方面是失活的。(参见，如，Berkner等人,BioTechniques 6:616,1988；Rosenfeld等人,Science 252:431-434,1991；和Rosenfeld等人,Cell 68:143-155,1992)。来源于腺病毒毒株Ad 5型d1324或其它腺病毒毒株(如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域技术人员熟知的。可选地，腺相关病毒载体，如在Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260,1985)中描述的腺相关病毒载体可用于表达反式激活融合蛋白。其他病毒载体替代物包括慢病毒载体。此类载体及其制备和使用描述于例如美国专利第6,924,123号；第6,863,884号；第6,830,892号；第6,818,209号；第6,808,923号；第6,799,657号，所有这些都以其整体并入本文。

本发明的载体可有利地包括本文所述的多肽片段。特定表达载体的设计中包括的其他元件可取决于诸如以下的因素：待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平等。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，由此产生蛋白质或肽，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽。

本文所述的载体可以通过本领域的各种已知方法中的任一种引入细胞或组织中。此类方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York(1992)中，其在此通过引用并入。还参见，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,Md.(1989)；Hitt等人,“Construction and Propagation of Human Adenovirus Vectors,”inCell Biology:A Laboratory Handbook,J.E.Celis.编辑,Academic Press.第2版,第1卷,第500-512页,1998；和Hitt等人,“Techniques for Human Adenovirus VectorConstruction and Characterization,”in Methods in Molecular Genetics,K.W.Adolph编辑,Academic Press,Orlando,Fla.,第7B卷,第12-30页,1995。方法包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和重组病毒载体感染。术语“转染(transfecting)”或“转染(transfection)”旨在涵盖将核酸引入宿主细胞的所有常规技术，包括磷酸钙共沉淀、DEAF-右旋糖酐-介导的转染、脂质体转染、电穿孔和微注射。用于转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他实验室教科书中。

对于植物细胞，通常使用Ti质粒或病毒载体。例如，此类质粒和病毒载体可用于经由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转染来转染宿主植物细胞(针对根癌土壤杆菌感染易感的植物细胞)，或者可以如使用微注射、粒子轰击或电穿孔直接插入细胞中。在其他方法中，可以由植物细胞制备原生质体，然后进行转染。

用本发明的核酸构建体转化的宿主细胞的数量将至少部分取决于重组表达载体的类型和所用转染技术的类型。核酸可以瞬时引入宿主细胞，或者用于长期表达。对于长期表达，核酸稳定地整合到宿主细胞的基因组中或作为稳定的附加元件保留。

为了将核酸整合到宿主细胞DNA中，通常使用编码可选择标志物(如，抗药性)的基因，其与目标核酸一起引入宿主细胞中。通常使用多种此类可选择标志物，如药物潮霉素和新霉素。可选择标志物可以引入单独的质粒上，或来自目标核酸的其他载体上，或者引入同一载体上。用本发明的核酸构建体(如，重组表达载体)和可选择标志物的基因转染的宿主细胞可通过使用可选择标志物选择细胞来鉴定。

本发明的核酸构建体可以通过常规转染技术(如，磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染、电穿孔和其他方法)引入在体外培养物中生长的真核细胞中。细胞也可以例如通过应用适合体内引入核酸至细胞中的递送机制在体内转染，如病毒载体(参见如，Ferry等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381,1991，和Kay等人,Human Gene Therapy 3:641-647,1992)、腺病毒载体(参见如，Rosenfeld,Cell 68:143-155,1992；以及Herz和Gerard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816,1993)、受体介导的DNA摄取(参见如，Wu和Wu,J.Biol.Chem.263:14621,1988；Wilson等人,J.Biol.Chem.267:963-967,1992；和美国专利第5,166,320号)、直接注射DNA(参见如，Acsadi等人,Nature 332:815-818,1991；和Wolff等人,Science 247:1465-1468,1990)或粒子轰击(参见如，Cheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4455-4459,1993；和Zelenin等人,FEBS Letters 315:29-32,1993)。因此，在本发明中，细胞可以在体外或离体转染，并且可以通过本领域已知的方法从中分离表达的肽。细胞也可以施用给对象，或者可选地，可以在体内直接修饰细胞。在这些情况中任一种下，用于表达肽的核酸构建体可包含信号序列以促进从细胞输出。

本发明的另一方面涉及其中已引入本发明的核酸构建体的宿主细胞，即“重组宿主细胞”。应理解，术语“重组宿主细胞”不仅指特定的对象细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，因此此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，尽管真核细胞是优选的。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)。其他合适的宿主细胞是本领域已知的。

本发明并不意图受限于治疗制剂的特定性质，只要该制剂包含结合多肽生长因子或具有固有存活或生长因子活性的适当的纤连蛋白片段，或者结合纤连蛋白的适当的生长因子片段即可。例如，此类组合物可以与生理上可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂一起提供。

这些治疗制剂可以以类似于其他治疗性药剂的方式施用给哺乳动物用于兽医用途(如用于家养动物)，以及在人体中临床使用。通常，治疗功效所需的剂量将根据使用的类型和施用模式以及个体宿主的具体要求而变化。

此类组合物通常制备成液体溶液或悬浮液，或固体形式。制剂可以包括此类通常采用的添加剂，如粘合剂、填充剂、载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂和赋形剂，例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式，并且通常含有1％-95％的活性成分，优选2％-70％。

组合物也可制备成呈液体溶液或悬浮液的注射剂；也可制备适用于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。

本发明的片段通常与生理上可耐受且相容的稀释剂或赋形剂混合。合适的稀释剂和赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油等，以及它们的组合。此外，如果需要，组合物可含有少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。

适用于其它施用模式，如局部施用的另外制剂包括药膏、酊剂、乳膏剂、洗剂、以及在某些情况下，包括栓剂。对于药膏和乳膏剂，传统粘合剂、载体和赋形剂可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。

使用方法：

本文所述的纤连蛋白片段和纤连蛋白片段的肽衍生物可用于促进组织再生，如伤口愈合，以及用于预防和治疗与例如老化相关的皮肤外观不良的美容和治疗制剂。还描述了在细胞培养中的用途。多肽(或编码它们的核酸或表达载体，或者表达它们的细胞)可以掺入到例如针对本文所述的适应症的治疗制剂中，以及掺入到用于改善例如表现出皮肤老化迹象的皮肤外观和/或皮肤触感的产品和组合物中。

例如，通过将本发明的组合物应用至皮肤后提供皮肤外观的视觉改善，组合物可用于调节由于皱纹和UVB光损伤引起的皮肤外观。一般而言，还含有颗粒材料的本发明的组合物对于提供即时的视觉改善是最有用的。

本发明的特征在于美容治疗，包括用于预防性调节皮肤状况的美容治疗和用于治疗性调节皮肤状况的美容治疗。“皮肤老化的迹象”、“皮肤外观不良”和同样指例如老化的症状等的其他类似短语包括但不限于，由于皮肤老化引起的所有外观明显和触觉可察觉的表现以及任何其他宏观或微观效应。此类迹象可由内在因素和/或外在因素，如，随时间而老化和/或环境损伤(如，UVB光损伤、暴露于污染物和不良饮食)诱导或引起。这些迹象可来自包括但不限于以下的过程：形成纹理不连续性，如皱纹和粗深皱纹，皮线，裂缝，肿块，毛孔粗大(如，与附件结构如汗腺管、皮脂腺或毛囊相关)，或不均匀或粗糙，皮肤弹性丧失(功能性皮肤弹性蛋白的丧失和/或失活)，下垂(包括眼部和下颌浮肿)，皮肤失去弹性，皮肤松弛，皮肤因变形而失去弹性，变色(包括黑眼圈)，斑点，肤色灰黄，色素沉着过度的皮肤区域如老年斑和雀斑，角化病，异常分化，角化过度，弹性组织变性，胶原蛋白分解，以及角质层、真皮、表皮、皮肤血管系统(如，毛细血管扩张或蜘蛛血管)和下层组织(尤其是靠近皮肤的那些)中的其他组织学变化。根据本发明特别优选的是，皮肤老化的迹象是皱纹，并且在某些优选的实施方案中，本发明的组合物可用于对抗、治疗或预防皱纹。

皱纹可能由多种原因引起。例如，皱纹可能是由皮肤的自然老化过程、吸烟以及暴露于紫外线辐射(如长期阳光暴露)引起的。皱纹可以如通过引用并入本文的Kligman等人(Br.J.Derm.113:37-42,1985)中所述进行分类。Kligman将皱纹分为三类：线性皱纹、图形皱纹和细纹(crinkle)，并且这些类型的皱纹中的任一种，无论其形成的原因是什么，都可以如本文所述进行处理。除皱纹本身外，本发明的组合物可用于改善皮肤外观。

本文公开的方法可用于预防或治疗或减少皱纹，包括UV诱导的皱纹，和/或改善对象的皮肤质量和外观。该方法可以通过向对象施用含有纤连蛋白片段或其生物活性变体的组合物来进行。示例性的治疗方法可包括定位皱纹或潜在的起皱位点，以及应用本文所述的组合物。

如本文所用，预防性调节皮肤状况包括延迟、最小化和/或预防皮肤中的可见和/或触觉不连续(如，皮肤中的纹理不规则，其可以通过视觉或通过触摸检测)，包括皮肤老化的迹象。

如本文所用，治疗性调节皮肤状况包括改善，如，减少、最小化和/或消除皮肤的不连续性，包括皮肤老化的迹象。使用本发明的组合物生产的一些产品以及甚至组合物本身可用于预防性或治疗性地调节皮肤状况。

在某些优选的方面，本发明可用于改善人皮肤的生理状态和/或物理外观，特别是用于减少由日晒(如，UVB光损伤)、身体和激素应激、磨损、营养作用和其他类似的原因产生的皮肤老化迹象。组合物通常可用于防止老化的迹象和/或对其进行治疗以便为使用它们的消费者提供更年轻的外貌。

所有术语，如“皮肤老化”、“皮肤老化迹象”、“皮肤外观不良”、“局部应用”等都以这样的含义使用：它们通常且广泛用于开发、测试和营销美容和个人护理产品领域。“皱纹”意指肉眼可见的原本光滑的面部皮肤表面中的沟纹，平均深度为50至大于200μm并且基本上随着年龄的增长而出现。根据本发明的术语“美容组合物”涉及可用于美容目的、卫生目的或作为递送一种或多种药物成分的基础的制剂。这包括化妆品、个人护理产品和药物制剂。这些制剂也可以同时用于这些相同目的中的两种或更多种。例如，一种含药头皮屑洗发水具有药理学性质，并且可用作个人护理产品以提供清洁头发。这些组合物还可以包含另外的成分，如皮肤病学上可接受的载体。

如本文所用的“化妆品”包括但不限于唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红、眼线笔、唇线笔、唇彩、扑面粉或身体粉、防晒霜和隔离霜(blocks)、指甲油、摩丝、喷雾剂、定型凝胶、指甲修复霜，无论是乳膏剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、乳液、胶体、溶液、悬浮液、压块、固体、铅笔、喷涂制剂、刷涂制剂等形式。“个人护理产品”包括但不限于沐浴露、洗发水、护发素、营养发水、染发剂和着色产品、免洗护发素、防晒霜和防晒隔离霜、润唇膏、化妆水、冷霜、润肤霜、发胶、肥皂、身体磨砂膏、去角质膏、收敛剂、脱毛剂和烫发液、去头屑制剂、防汗止汗组合物、剃须产品、剃须前产品和剃须后产品、润肤霜、除臭剂、冷霜、清洁剂、皮肤凝胶、冲洗液，无论是固体、粉剂、液体、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、洗剂、乳液、胶体、溶液、悬浮液或其他形式。根据本发明的“药物制剂”包括但不限于用于皮肤病学目的的载体，包括药学活性成分的局部和透皮应用。这些可以呈凝胶剂、贴剂、乳膏剂、鼻喷雾剂、软膏剂、洗剂、乳液、胶体、溶液、悬浮液、粉剂等形式。根据本发明的组合物包括化妆品、个人护理产品和药物制剂。

本发明的特征在于用于促进组织再生，包括例如伤口愈合的方法。如本文所用，组织再生可用于指通过细胞的增殖和分化至组织中来替换受损组织。组织损伤可以通过任何方式发生，包括身体损伤、疾病和感染。如本文所述，“伤口愈合”用作组织再生的非限制性实例。

治疗伤口的主要目的是实现伤口闭合。开放性皮肤伤口代表一种主要类别的伤口，并且包括热和/或化学烧伤伤口、神经性溃疡、压疮、静脉瘀血性溃疡和糖尿病性溃疡。开放性皮肤伤口通过包括六个主要组成的过程常规愈合：i)炎症，ii)成纤维细胞增殖，iii)血管增殖，iv)结缔组织合成v)上皮形成和vi)伤口收缩。当这些组成单独或作为一个整体不能正常起作用时，伤口愈合受损。许多因素都可影响伤口愈合，包括营养不良、感染、药理学药剂(如，放线菌素和类固醇)、糖尿病和高龄(参见Hunt和Goodson，CurrentSurgical Diagnosis&Treatment(Way；Appleton&Lange),第86-98页,1988)。

术语“伤口”泛指以不同方式引发(如，来自长期卧床的压疮和由创伤引起的伤口)并且具有不同特征的皮肤和皮下组织的损伤，以及其他组织和骨骼(包括在原始伤口位点中或附近的组织和骨骼)的损伤。当然，伤口也可以通过手术或疾病(如癌症)产生。根据伤口的深度，伤口可分为下述四个等级中的一个：i)I级：仅限于上皮的伤口；ii)II级：延伸至真皮中的伤口；iii)III级：延伸至皮下组织中的伤口；以及iv)IV级(或全层伤口)：其中暴露骨头(如，骨压点，如大转子或骶骨)的伤口。术语“部分皮层伤口”是指涵盖I-III级的伤口；部分皮层伤口的实例包括热烧伤伤口或化学烧伤伤口、压疮、静脉瘀血性溃疡和糖尿病性溃疡。术语“深度伤口”意在包括III级和IV级伤口。本发明考虑了治疗所有伤口类型，包括深度伤口和慢性伤口。

短语“促进伤口愈合”、“增强/改善伤口愈合”等是指诱导肉芽组织形成和/或诱导上皮形成(即上皮中新细胞的产生)，和/或减少瘢痕形成。通过减少伤口面积可方便地测量伤口愈合。但并不意味着诸如“促伤口愈合”或“增强/改善伤口愈合”的短语需要与对照进行定量比较。在治疗慢性伤口的情况下，治疗后有伤口愈合开始的证据就足够了。许多创伤性伤口和癌症摘除必须保持开放以按次要意图治愈，并且具有此类伤口和摘除的患者可以用本文所述的促进伤口愈合的组合物治疗。

本发明的纤连蛋白片段或纤连蛋白片段的肽衍生物的短语“治疗有效量”，在指代伤口愈合、促进伤口愈合或增强伤口愈合时，是促进诱导肉芽组织形成和/或诱导上皮形成和/或减少瘢痕形成的量。例如，在静脉内制剂中以下量的本发明的纤连蛋白片段或纤连蛋白片段的肽衍生物可用于促进伤口愈合：约0.1μg/kg至约1mg/kg的患者体重；在一些实施方案中，约1μg/kg至约1mg/kg的患者体重；在一些实施方案中，约1μg/kg至约0.1mg/kg的患者体重；在一些实施方案中，约0.01mg/kg至约1mg/kg的患者体重；和在一些实施方案中，约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的患者体重。

有时被称为不愈合伤口的慢性伤口的发生率由于诸如以下的事件而上升：人口老龄化；那些人群中与年龄有关的疾病增加；AIDS发病率增加；糖尿病发病率增加以及继发于癌症干预的放射性伤口增加。具有慢性伤口的患者，包括与刚刚描述的事件相关的患者，可以用本文所述的促进伤口愈合的组合物治疗。

本发明的组合物可用于代替或补充现有的伤口护理程序，如皮肤移植和组织瓣、清创术以及施用抗炎、抗菌和/或抗痛药物。适合治疗的患者包括患有慢性皮肤溃疡的患者，其可能与糖尿病关联发生。然而，糖尿病性溃疡只是慢性伤口图片的一部分。据估计，美国有550万人患有慢性不愈合伤口。

本发明的方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的包含纤连蛋白的肽片段或其生物活性变体的药物组合物的步骤。纤连蛋白的肽片段或其生物活性变体可以与一种或多种生长因子一起存在于复合物中。该方法可任选地包括鉴定需要治疗的患者的步骤。此类患者包括具有皮肤、黏膜、下层结缔组织、筋膜、神经或肌肉的手术摘除或切口的患者；具有皮肤、黏膜、下层结缔组织、筋膜、神经、肌肉或骨骼的创伤性裂伤或组织损伤的患者；和具有皮肤、粘膜、下层结缔组织、筋膜、神经或肌肉的热烧伤或化学烧伤或溃疡的患者。

合适的制剂在本文中描述，并且通常采用溶液、软膏剂或药膏的形式。无论是否与生长因子复合，纤连蛋白的片段均可以通过将它们包含在生物材料，如合成聚合物、工程化的ECM、绷带、敷料、敷布等中来施用。

通过本发明的其他方法，可以将内源性生长因子定位至患者的组织。这些方法可以通过向患者施用治疗有效量的本文所述的包含纤连蛋白片段或其生物活性变体的组合物来进行。如在本文所述的更具体的治疗方法中一样，可以通过局部应用药物组合物、生物材料或固体支持物，或通过其他局部和全身途径(如，口服、静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮或透粘膜)来施用这些组合物。这些方法可以被描述为将一种或多种生长因子递送至患者的方法。该方法可任选地包括鉴定需要治疗的患者的步骤。此类患者包括患有组织损伤、组织损失或导致组织缺陷或功能障碍的病症的患者。更具体地，患者可能患有脑、脊髓或神经的损伤或损失，或者导致脑、脊髓或神经功能障碍的病症；心脏或血管的损伤或损失，或者导致心脏或血管功能障碍的病症；肺、鼻咽道、鼻窦、气管或气道的损伤或损失，或者导致肺、鼻咽道、鼻窦、气管或气道功能障碍的病症；胃肠道、肝脏或胰腺的损伤或损失，或者导致胃肠道、肝脏或胰腺功能障碍的病症；肾脏、输尿管、膀胱或尿道的损伤或损失，或者导致肾脏、输尿管、膀胱或尿道功能障碍的病症；软骨、滑膜、半月板、韧带、肌腱或髓核的损伤或损失，或者导致软骨、滑膜、半月板、韧带、肌腱或髓核功能障碍的病症；骨骼的损失或损伤；嘴唇、舌头或牙龈的损伤或损失，或者导致唇、舌头或牙龈功能障碍的病症；皮下组织的损伤或损失，或者导致皮下组织功能障碍的病症。

体外和体内模型系统：

可以在体外和体内模型系统中进一步表征测试化合物。例如，可以使用成人皮肤成纤维细胞(ADHF)、人微血管内皮细胞(HEDMC)或其他细胞类型来测试测试化合物对细胞迁移的影响。例如，可以使用猪再损伤模型、猪或小鼠的切除伤口模型、猪或大鼠的热梳烧伤创面模型、猪的垂直损伤进展烧伤模型、猪的化学烧伤来测试测试化合物对伤口愈合的影响。

实施例

以下实施例进一步描述和证明了本发明范围内的实施方案。给出的实施例仅用于说明的目的，并不应被解释为对本发明的限制，这是因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行许多变化。

用PDGF-BB和式I肽制剂局部治疗猪烧伤的研究：

4只雌性，20-30kg家猪用于皮肤伤口程序。

研究方案：动物用Talazine(替来他明(Tiletamine)和唑拉西泮(Zolazepam)，Fort Dodge Lab,Fort Dodge,Iowa)(5mg/kg IM)镇静。然后将猪气管内插管，并在室内空气中用0.5-2.5％的异氟烷维持在麻醉手术平面中。将侧腹和背部的毛发用电动理发剪夹住，并用聚维酮碘溶液擦洗皮肤。

通过施加在热水中预热至80℃的2.5-cm×2.5-cm，150克铝棒，在动物的背部和侧腹产生标准化的深二度烧伤。烧伤在前腿和后腿之间的脊柱的任一侧产生。在快要施加之前将加热棒擦干，以防止水滴在皮肤上产生蒸汽烧伤。然后将棒置于垂直于皮肤表面的垂直位置，并在重力提供所有压力的情况下施加20秒的时间。这种烧伤模型导致对真皮的上部30-50％的损伤，并且已经显示出高度可再现性(Singer等人,Acad.Emerg.Med.7:1-6,2000)。将24处烧伤均匀分布在四只猪背部的两侧。由于猪在热损伤后不会形成水疱，因此在损伤后立即对坏死的表皮进行清创，以模拟人中可能形成水疱并随后破裂的烧伤(Singer等人,Acad.Emerg.Med.,7:114-119,2000)。通过用干纱布对烧伤表面轻轻摩擦进行清创，直到坏死的表皮从整个烧伤表面上剥离。干预：在每只猪的背部皮肤上，用6种研究治疗中的一种随机治疗相同组的4处烧伤。将普朗尼克磷脂有机凝胶(“PLO”)凝胶、含有PDGF-BB的PLO凝胶、含有cP12或cNP8的PLO凝胶和含有cP12或cNP8和PDGF-BB的PLO凝胶的每种治疗在烧伤后24小时或烧伤后48小时施加至每只猪的4处烧伤。选择用于测试的肽在GMP学院(American Peptide,Vista,Calif.)合成，并在无菌、无内毒素的PBS中用无菌、无内毒素的2％猪血清(HyClone,Logan,Utah)稀释以避免经由非特异性表面吸附导致的肽损失。无菌、无内毒素的重组PDGF-BB(R&D Systems)也在含有2％猪血清的PBS中稀释。使用无菌、无内毒素的PLO试剂盒(Transderma,Coquitlam,BC,Canada)，在30％普朗尼克卵磷脂凝胶中配混含有和不含PDGF-BB的最终浓度的肽。将在30％普朗尼克凝胶中含有2％猪血清的PBS用作治疗对照。伤口接受第一周每日一次和此后每周两次局部施加的150μl治疗凝胶。然后用干燥的不粘纱布(Telfa,Kendall Company,Mansfield,Mass)覆盖烧伤，并用纱布绷带卷(Conform,Kendall Healthcare Products Company,Mansfield,Mass.)和粘性弹性绷带(Elastoplast,Beiersdorf-Jobst,Inc.,Rutherford College,N.C.)覆盖烧伤区域。为了防止敷料移动，将卡钉施加至敷料的周边。在每次处理施加后如上施加敷料变化。所有的动物都在术后用芬太尼透皮贴剂治疗以用于镇痛管理。

在全身麻醉下进行猪的存活手术和伤口位点收获。在手术程序之前，将猪禁食24小时。阿托品以0.05mg/kg的剂量在术前给予。对于全身麻醉的诱导，IM施用4.4mg/kgTelazol、2.2mg/kg赛拉嗪和0.22mg/kg布托啡诺。然后将动物插管并保持在异氟烷(1-3％)和氧气的手术麻醉阶段。由于覆盖的皮肤伤口对至多需要对乙酰氨基酚的人类造成轻微疼痛，因此在存活手术后以每天两次同样接受10-20mg/kg对乙酰氨基酚来治疗动物。

用静脉内100mg/kg戊巴比妥和2mg/kg赛拉嗪完成安乐死。

如图6所示，与对照或cP12治疗的伤口相比，对于cNP8治疗的伤口，受伤后10天的48小时清创伤口的再上皮化显著增加。

用PDGF-BB和式I肽制剂I.V.治疗猪烧伤的研究：

垂直进展烧伤模型(如上面的局部实验所示)用于在4只猪的每只的背部上产生烧伤。在每只猪的背部进行二十处烧伤(800℃/20秒)-在输注前8小时进行一组烧伤，在输注前4小时进行第二组。将3只猪用0.001、0.01或0.1mg/kg cNP8的输注物处理，将1只猪用缓冲液的输注物处理作为对照。在实验室中，将冻干的cNP8在PBS中复溶(基于75％纯度校正11.6mg/ml)以获得5mM储液，并使用具有0.22um膜的注射过滤器过滤。通过读取OD280测定过滤的cNP8溶液的浓度，并基于OD280＝6.76/mM cNP8计算浓度。必要时将cNP8用PBS稀释至5mM。将过滤的cNP8溶液等分并储存在-80℃。在输注之前，将cNP8进一步稀释：a)用PBS以1:270稀释，得到0.019mM cNP8溶液。注射量为3ml/体重kg的0.019mM cNP8，其等于0.1mg/kg体重。b)用PBS以1:2700稀释，得到0.0019mM cNP8溶液。注射量为3ml/kg体重的0.019mMcNP8，其等于0.1mg/kg体重。c)用PBS以1:27000稀释，得到0.00019mM cNP8溶液。注射量为3ml/kg体重的0.00019mM cNP8，其等于0.001mg/kg体重。将cNP8/缓冲液静脉内施用给每只猪-在每只猪上产生烧伤后4小时或8小时。经30分钟的时间，将室温输注物经由耳静脉施用给猪。在所有程序期间使用全身麻醉。在不同时间点收集损伤后活检组织以进行组织学分析来确定再上皮化百分比。如图7和8所示，在损伤后10天和14天用cNP8显著增加了再上皮形成。

药物和美容组合物：

作为本发明的说明，将引用几种化妆品配方。配方代表但不限制本发明：

凝胶：

1g/100g白色软石蜡1.5环甲硅油6.0Crodacol C90 0.5Lubrajel MS10三乙醇胺0.3棕榈酰-HISKYILRWRPKNSV-OH 0.0005水，防腐剂，香料适量100g

可以通过以下来制备凝胶：将肽溶解在80℃的水中，在80℃下混合前三种组分(石蜡、硅酮和Crodacol)，然后将两相共混，冷却至30℃，加入Lubrajel、防腐剂和香料。该凝胶可用于每日施加至面部皮肤，特别是眼睛周围，以减少水肿性浸润。

乳膏剂：

2g/100g Volpo S2 2.4Volpo S20 2.6Prostearyl 15 8.0蜂蜡0.5硬脂氧基二甲聚硅氧烷3.0丙二醇3.0卡波姆0.25三乙醇胺0.25神经酰胺H03(SEDERMA)0.5乙酰基-HIGKYGLRWRPKNSV-OH 0.001水，防腐剂，香料适量100g

该乳液可用于保湿、重构和舒缓面部皮肤(特别是在脆弱皮肤区域)及治疗皱纹。为了制备乳液，在85℃下，可以将神经酰胺HO3溶解在volpo 52、S20和Prostearyl 15中，加入蜂蜡和硬脂氧基二甲聚硅氧烷；在75-80℃下在水相中混合其它成分，然后将两相共混,冷却并加入香料。神经酰胺HO3是三羟基棕榈酰胺肉豆蔻基醚。

保湿和抗皱粉底：

化合物％(w/w)脱矿质水53.36 10％KOH 1.30聚山梨醇酯80 0.10二氧化钛6.00滑石3.05黄色氧化铁1.80红色氧化铁1.00黑色氧化铁0.15丙二醇6.00硅酸镁铝1.00羧甲基纤维素钠0.12 DiPPG3肉豆蔻基醚己二酸酯12.00异硬脂醇新戊酸酯4.00Crodafos CS20 4.00硬脂醇聚醚-10 2.00鲸蜡醇0.50硬脂醇聚醚-2 0.50神经酰胺2(N-硬脂酰-0.10二氢神经鞘氨醇)HIGKYGLRWRPKGSV-OH 0.0004防腐剂适量

对象可被招募在如上所述的使用粉底霜的研究中。可以通过自我评价/问卷调查和印象法来评价眼睛周围的皱纹。将该产品以每天一次施加至目标区域，持续56天。在第0天和第56天进行测定。作为对照，用不含肽的相同粉底霜治疗位点，并评价位点的皮肤老化症状的改善。

已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案均在所附权利要求的范围内。

Claims (16)

1.根据式I的多肽：

(I)：H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇其中X₁是I，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L，

X₅是N或G，

X₆是S，且

X₇是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，

其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，

其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；

或其环化形式；

其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式。

2.如权利要求1所述的多肽，其不是式I的直链或支链多聚体。

3.如权利要求1所述的多肽，其选自HIGKYGLRWRPKGSV及其环化形式。

4.组合物，其包含：

根据式I的多肽：

(I):H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇

其中X₁是I，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L，

X₅是N或G，

X₆是S，且

X₇是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，

其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，

其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；

或其环化形式；

其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式，和

药学上可接受的载体或稀释剂，

其中所述组合物适用于选自向患者注射、静脉内施用和局部施用的施用途径。

5.组合物，其包含：

根据式I的多肽：

(I):H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇

其中X₁是I，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L，

X₅是N或G，

X₆是S，且

X₇是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，

其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，

其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；

或其环化形式；

其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式，和

药学上可接受的赋形剂，

其中所述组合物适用于选自向患者注射、静脉内施用和局部施用的施用途径。

6.如权利要求4或5所述的组合物，其中所述多肽不是式I的直链或支链多聚体。

7.如权利要求4或5所述的组合物，其中所述多肽选自HIGKYGLRWRPKGSV及其环化形式。

8.包含根据式I的多肽的组合物在制备用于治疗选自患者皮肤、黏膜、结缔组织、筋膜、韧带、肌腱、软骨、神经或肌肉的手术切口或摘除、创伤性损伤、热烧伤、化学烧伤、病变或溃疡的伤口以及患者骨骼的伤口的药物中的用途：

(I)：H–X₁-X₂–K–Y–X₃–X₄–R–W–R–P–K–X₅–X₆–X₇其中X₁是I，

X₂是S或G，

X₃是I或G或L，

X₄是L，

X₅是N或G，

X₆是S，且

X₇是V；并且

其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，

其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，

其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；

或其环化形式；

其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述多肽不是式I的直链或支链多聚体。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述伤口是热烧伤或化学烧伤。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述伤口是热烧伤。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式。

13.如权利要求11所述的用途，其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKNSV、HIGKYGLRWRPKGSV以及它们的环化形式。

14.如权利要求9所述的用途，其中所述多肽选自HIGKYGLRWRPKGSV及其环化形式。

15.如权利要求10所述的用途，其中所述多肽选自HIGKYGLRWRPKGSV及其环化形式。

16.如权利要求11所述的用途，其中所述多肽选自HIGKYGLRWRPKGSV及其环化形式。

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