BRPI0613127A2

BRPI0613127A2 - uso de um agente que possui atividade tgf-b3

Info

Publication number: BRPI0613127A2
Application number: BRPI0613127-1A
Authority: BR
Inventors: Mark Ferguson; Sharon O'kane; Hugh Laverty; Nick Occleston
Original assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2010-12-21
Also published as: JP2009501201A; ZA200800125B; CN101252949A; WO2007007098A2; AU2006268091C1; US20080207515A1; IL188351A0; WO2007007098A3; EP2298336A3; GB0514262D0; AU2006268091B2; EP1904089A2; EP2298336A2; CA2614758A1; EP2298336A9; KR20080031405A; AU2006268091A1

Abstract

USO DE UM AGENTE QUE POSSUI ATIVIDADE TGF-B~3~. A presente invenção refere-se ao uso de TGF-<225>~3~, ou agentes que possuem atividade TGF-<225>~3~, para promover regeneração epitelial. Métodos para fabricar medicamentos, e métodos para promover regeneração epitelial são proporcionados. Em particular, os medicamentos e métodos de tratamento da invenção são aplicáveis para a promoção de regeneração epitelial em pacientes saudáveis, e/ou em ferimentos agudos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE UM AGENTE QUE POSSUI ATIVIDADE TGF-B3".

A presente invenção refere-se à fabricação de medicamentospara a promoção de regeneração epitelial. Esta também proporciona um mé-todo para promover regeneração epitelial em um indivíduo necessitado de talpromoção.

O corpo compreende diversos tipos diferentes de epitélios, ascujas estruturas e complexidade variam dependendo de sua localização,papel e função.

A forma mais básica de epitélio é o epitélio simples, que com-preende uma única camada de células epiteliais. Um exemplo de uma formade epitélio simples é epitélio escamoso simples, que compreende uma únicacamada de células tipo escala achatadas. Exemplos de epitélios escamosossimples no corpo incluem mesotélio, endotélio, e revestimento de alvéolospulmonares.

Outra forma comum de epitélio é o epitélio estratificado. Estacompreende uma série de camadas, e as células de camadas diferentes po-dem variar em tamanho, formato e função. Os epitélios estratificados podemser adicionalmente caracterizados com referência ao tipo de células Iocali-zadas em sua superfície.

A guisa de exemplo, os epitélios escamosos estratificados pos-suem células tipo escala (escamosas) localizadas em sua superfície. O for-mato das células que compreendem epitélios escamosos estratificados podevariar com locais diferentes dentro do epitélio. Enquanto as células Iocaliza-das na superfície superior do epitélio geralmente possuem uma conformaçãotipo escala achatada, aquelas em direção à base do epitélio podem ter umatendência a possuir um formato poliédrico. As células epiteliais podem serestruturalmente fortificadas pela presença de queratina, e a quantidade des-ta molécula presente tende a aumentar com a altura crescente dentro dosepitélios. Os epitélios escamosos estratificados compreendem tipicamentediversas camadas de células dotadas de queratina. Os tipos de molécula dequeratina presentes podem variar tanto por camada celular como sítio docorpo.

O mais proeminente dos epitélios do corpo é a epiderme, a ca-mada epitelial escamosa estratificada que cobre a pele. A epiderme, devidoà sua localização, é o tecido que está mais freqüentemente em contato como ambiente externo, e como um resultado é o tecido mais freqüentementeexposto a dano ambiental e outros.

Exemplos adicionais de epitélios estratificados incluem epitélioscolunares estratificados, e epitélios colunares ciliados, onde a camada maiselevada de células possui formato colunar, e proporcionada com cílios mó-veis.

Os epitélios em todo o corpo são submetidos a diversas formasdiferentes de ferimento. Tal ferimento pode prejudicar ou destruir completa-mente a função dos epitélios danificados, e a conseqüência de tal ferimentodepende da natureza e função do epitélio afetado. Conseqüentemente, apromoção de regeneração epitelial é vantajosa em diversos contextos dife-rentes. Entretanto, apesar da necessidade da promoção de regeneraçãoepitelial, ainda há uma exigência de medicamentos e métodos adicionais emais eficazes, através dos quais tal regeneração promovida pode ser obtida.

Há uma variação significativa na faixa de terapias atualmenteusadas para promover regeneração epitelial. Por exemplo, a administraçãode sítios doadores de enxerto de pele de espessura parcial (como analisadoem Rakel et at. 1998) pode envolver simplesmente deixar o sítio doador deenxerto exposto e não-tratado, ou pode fazer uso alternativamente de trata-mentos tais como a aplicação de curativos (tipicamente compressas de ga-ze, que podem ser usadas separadamente ou impregnadas com uma varie-dade de agentes anti-infectivos, alginatos, hidrocolóides, membrana decompósito sintético, películas transparentes ou mel), aplicação de pele artifi-cial (que pode ser gerada a partir da epiderme do próprio indivíduo), aplica-ção de aloenxertos (tipicamente aloenxertos bovinos e suínos) ou aplicaçãode pomadas (tipicamente pomadas que contém compostos baseados emprata como agentes anti-infectivos).

Esta ausência de uma terapia única universalmente aceita é in-dicativa da necessidade de métodos novos através dos quais a regeneraçãoepitelial pode ser promovida. Ademais, é bem reconhecido que há muitasfalhas e desvantagens associadas com terapias atuais.

Os efeitos colaterais associados com tratamentos atuais incluemtempos de cura demorados nos sítios receptores e/ou doadores de enxerto,o desenvolvimento de epitélio de substituição que pode ser mais grosso e/oumais duro do que o originalmente presente, taxas aumentadas de infecção,edema e eritema, cicatrização hipertrófica em torno do local de tratamento,risco de infecção por príon ou viral de material de aloenxerto, o período detempo que leva para gerar o tratamento (no caso de geração de pele artificialdas células dos próprios pacientes) e dor associada tanto com sítios recepto-res como doadores.

Um objetivo da presente invenção é proporcionar medicamentosnovos para a promoção de regeneração epitelial que superam pelo menosalgumas desvantagens associadas com a técnica anterior.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção pro-porciona-se o uso de um agente que possui atividade de TGF-P3 na fabrica-ção de um medicamento para a promoção de regeneração epitelial.

O agente que possui atividade de TGF-p3 pode ser, de preferên-cia, selecionado do grupo que compreende TGF-p3, fragmentos biologica-mente ativos, variantes e derivados de TGF-p3, e substâncias capazes depromover e/ou imitar a atividade biológica de TGF-p3.

A promoção de regeneração epitelial dentro do contexto da pre-sente invenção pode ser entendida abrangendo qualquer aumento na taxade regeneração epitelial como comparado com a regeneração que ocorreem um epitélio tratado por controle ou não-tratado.

A taxa de regeneração epitelial obtida de acordo com a invençãopode ser facilmente comparada com aquela que ocorre em epitélios tratadospor controle ou não-tratados utilizando qualquer modelo adequado de rege-neração epitelial conhecido na técnica. Por exemplo, a taxa em tais sítios dedano epitelial experimentais que regeneraram áreas conhecidas pode sercomparada utilizando modelos in vivo bem-conhecidos em camundongos,ratos, coelhos ou porcos, tais como, aqueles descritos em Tomlinson andFerguson (2003), Davidson et al. (1991) e Paddock et al (2003).

De acordo com um segundo aspecto da invenção proporciona-se um método para promover a regeneração epitelial, sendo que o métodocompreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um a-gente que possui atividade de TGF-p3 em um indivíduo necessitado de talpromoção.

Com relação a este aspecto da invenção, uma "quantidade tera-peuticamente eficaz de um agente que possui atividade de TGF-p3" é umaquantidade de um agente, que possui atividade de TGF-p3, que é suficientepara promover regeneração epitelial no indivíduo no qual a quantidade éadministrada.

Conforme observado acima, os epitélios, e particularmente aepiderme, sofrem mais encontros diretos, freqüentes, e prejudiciais com oambiente externo do que qualquer outro tecido no corpo. É, portanto, alta-mente desejado que o reparo e restauração de tecidos epiteliais, tal como, aepiderme, sejam capazes de ser influenciados para garantir sua máxima efi-cácia funcional. De fato, embora os métodos e medicamentos da invençãosejam adequados para a promoção de regeneração epitelial em todos ostipos de epitélios, e tenham sido eficazes em todos os epitélios testados, apromoção de regeneração epidérmica constitui uma aplicação particularmen-te preferida da invenção. Outras modalidades preferidas da invenção inclu-em a promoção de regeneração epitelial escamosa, e/ou a promoção de re-generação epitelial queratinizada. Será avaliado que os métodos e medica-mentos da invenção podem ser benéficos à epiderme que cobre o escalpo.

A promoção de regeneração epitelial de acordo com a invençãoé capaz de ocasionar a formação de uma barreira epitelial de funcionamentosobre áreas desnudas ou anteriormente feridas. A barreira epitelial formadaé capaz de impedir o ingresso, e colonização, no tecido subjacente por ele-mentos patogênicos tais como bactérias, fungos e vírus. Desta maneira, apromoção de regeneração epitelial pode proporcionar benefícios em contex-tos onde se deseja impedir ou reduzir a infecção em sítios onde a camadaepitelial foi rompida.

A presença de uma camada epitelial intacta também atua comouma barreira para movimento de fluido, e é, portanto, capaz de impedir adessecação de tecido subjacente. Desta maneira, a promoção de regenera-ção epitelial é capaz de impedir ou reduzir a dessecação do tecido que surgecomo um resultado de perda de fluido através de uma camada epitelial dani-ficada ou de outra maneira rompida.

A presente invenção se baseia na descoberta surpreendenteque a regeneração epitelial pode ser estimulada pelo fornecimento da citoci-na TGF^3 ou um agente que partilha a atividade biológica característica deTGF-p3. TGF-ps (que existe em três isoformas em mamífero, TGF-βι, β2 eTGF-p3) foi anteriormente considerada por inibir regeneração epitelial.

Os efeitos inibidores de TGF-β sobre a regeneração epitelial fo-ram relatados baseados tanto em ensaios in vitro e in vivo. Os estudos dosefeitos de isoformas de TGF-β sobre ceratinócitos cultivados (células epiteli-ais cutâneas) sugeriram que, embora o tratamento com TGF-β aumente aexpressão de ceratinócitos de integrinas associadas com migração, a taxade proliferação de ceratinócitos, que é necessária para regeneração epidér-mica, é consideravelmente reduzida. A inibição mediada por TGF-β de proli-feração de célula epitelial requerida para regeneração epitelial também foirelatada utilizando estudos in vivo.

Embora os efeitos inibidores relatados de TGF-β sejam apresen-tados por todas as isoformas há diferenças nas potências relativas das iso-formas diferentes. Os estudos mostraram que TGF^3 é a mais potente dasisoformas em sua capacidade de inibir a síntese de DNA e proliferação emculturas primarias de ceratinócitos humanos, causando inibição mais forte doque tanto TGF-βι como TGF^2.

Além de estudos que utilizam células cultivadas, inúmeros estu-dos in vivo foram recentemente realizados, utilizando compostos específicosou tecnologias genéticas para interromper a via de sinalização de TGF-β.Estes estudos sugeriram adicionalmente que TGF-ps, e particularmenteTGF^3 inibem a regeneração epitelial.Ao contrário dos relatórios anteriormente publicados, os invento-res do presente pedido descobriram no momento que a aplicação de um a-gente, que possui atividade de TGF-p3 a um tecido epitelial antes ou depoisdo ferimento àquele tecido, é capaz de promover a regeneração da camadaepitelial, em vez de inibir tal regeneração. Sem se ater a qualquer hipóteseos inventores acreditam que a promoção de regeneração epitelial é obtidapor promoção mediada por TGF-P3 de migração de célula epitelial. As célu-las epiteliais (cuja migração foi promovida) são, desta forma, capazes derepopular e regenerar o epitélio danificado mais rapidamente do que ocorrena ausência de agentes que possuem atividade de TGF-P3.

Será avaliado que a promoção de regeneração epitelial de acor-do com a invenção pode ser de uso para induzir reepitelialização eficaz emcontextos onde a invenção pode ser benéfica em casos onde a resposta dereepitelialização é comprometida, inibida, retardada ou, de outra maneira,imperfeita. Entretanto, é particularmente preferido que os métodos e medi-camentos da invenção que são usados na promoção de regeneração epiteli-al também possam ser efetuados para acelerar a taxa de respostas de rege-neração epitelial normal em pacientes que sofrem de dano epitelial.

Há diversos contextos onde a resposta de reepitelialização docorpo pode ser imperfeita. Por exemplo, a reepitelialização imperfeita na pe-le está associada com condições tais como, pênfigo, doença de Hailey-Hailey (pênfigo familiar benigno), necrólise epidérmica tóxica(TEN)/síndrome de Lyell, epidermólise bolhosa, Ieishmaniose cutânea e ce-ratose actínica. A reepitelialização imperfeita dos pulmões pode estar asso-ciada com fibrose pulmonar idiopática (IPF) ou doença pulmonar intersticial.A reepitelialização imperfeita do olho pode estar associada com condições,tais como, deficiência de células-tronco do limbo parcial ou erosões cornea-nas. A reepitelialização imperfeita do trato gastrointestinal ou cólon pode es-tar associada com condições, tais como, fissuras anais crônicas (fissura noânus), colite ulcerativa ou doença de Crohn, e outros distúrbios intestinaisinflamatórios.

O processo da reepitelialização em resposta a lesões dérmicastambém pode ser observado em muitos indivíduos. Por exemplo, é bem-conhecido que lesões dérmicas em idosos apresentam regeneração epitelialmenos vigorosas do que aquelas de indivíduos mais jovens. Também hámuitas outras condições ou distúrbios que estão associados com regenera-ção epitelial retardada ou, de outra maneira, prejudicada em resposta à le-são. Por exemplo, os pacientes com diabetes, pacientes com polifarmácia(por exemplo, como um resultado da velhice), mulheres na pós-menopausa,pacientes suscetíveis a lesões por pressão (por exemplo, paraplégicos), pa-cientes com doença venosa, pacientes clinicamente obesos, pacientes querecebem quimioterapia, pacientes que recebem radioterapia, pacientes querecebem tratamento com esteróide ou pacientes imunocomprometidos po-dem sofrer de regeneração epitelial comprometida. Em muitos casos a faltade uma resposta de regeneração epitelial apropriada contribui para o desen-volvimento de infecções no local do ferimento, e para retardamento da res-posta de cura do ferimento normal que pode resultar na formação de feridascrônicas, tais como, úlceras. Conseqüentemente, será avaliado que a pro-moção epitelial através dos métodos ou medicamentos da invenção serãobenéficos a tais pacientes.

Sem depreciar a descrição acima, pode ser geralmente preferidoque a promoção de regeneração epitelial de acordo com a invenção podeser efetuada para aumentar uma resposta de reepitelialização avançada (ouseja, para produzir uma resposta máxima de regeneração epitelial maior doque a que poderia ser normalmente obtida sem promoção). Será avaliadoque desta maneira sítios de dano epitelial que ocorre em indivíduos em ou-tros casos saudáveis podem ser induzidos a se regenerar mais rapidamente.

Muito esforço experimental e pesquisa foram empenhados naidentificação e desenvolvimento de agentes terapêuticos e técnicas que po-dem ser usadas para promover a regeneração epitelial naqueles onde a res-posta de reepitelialização é comprometida. Entretanto, o grupo de pacientesque não sofrem de reepitelialização comprometida constitui um grande nú-mero da população total coberta pelos serviços de assistência médica, euma proporção ainda maior da massa trabalhadora. O versado na técnica iráavaliar imediatamente, portanto, que é um grande benefício que a sociedadeseja beneficiada pelo desenvolvimento de agentes terapêuticos e técnicasque possam se dirigir à necessidades destes pacientes em outros contextossaudáveis. Conseqüentemente, a promoção de regeneração epitelial empacientes saudáveis é uma modalidade preferida de todos os aspectos dapresente invenção. A promoção de reepitelialização de feridas agudas (o-postas às feridas crônicas) também é uma modalidade preferida de todos osaspectos da invenção.

Para os propósitos da presente invenção, uma ferida crônicapode ser definida como qualquer ferida que não mostra nenhuma tendênciaà cura dentro de oito semanas de formação quando submetida a tratamentoterapêutico apropriado (convencional). As feridas agudas podem ser qual-quer ferida que não uma ferida crônica. As feridas agudas preferidas podemser feridas incisionais, destas as feridas incisionais cirúrgicas podem ser umgrupo particularmente preferido.

Os epitélios, tal como, a epiderme ou epitélio corneano, podemser submetidos a ferimento como um resultado de muitos tipos diferentes deinsulto. Os epitélios podem, por exemplo, ser Iesionados como um resultadode insultos físicos ou lesões, que incluem escoriações, abrasões, feridas(tanto feridas penetrantes como feridas não-penetrantes), incisões cirúrgi-cas, e outros procedimentos cirúrgicos (particularmente enxertos de espes-sura parcial de tecidos tal como a pele), "queimaduras" (que, exceto onde ocontexto requer o contrário, podem ser considerados para incluir ferimentodo tecido resultante de exposição tanto a alta como baixa temperatura, a-gentes químicos ou radiação), e outras formas de trauma.

Os inventores descobriram que os medicamentos e métodos dainvenção são particularmente eficazes na promoção de regeneração epitelialem resposta a lesões. Estes são exemplificados, particularmente de benefí-cio, lesões na pele, onde a epiderme está ferida. Será avaliado, entretanto,que os métodos da invenção também podem ser aplicáveis a outros tipos delesão e feridas inclusive lesão, ferimento ou trama a epitélios tais como, epi-télios respiratórios, ou aqueles que cercam tecidos ou órgãos internos. Aregeneração do epitélio deve ser promovida por um epitélio que não um epi-télio digestivo. Por exemplo, o epitélio pode ser qualquer um exceto o epité-lio intestinal ou gastrointestinal.

É reconhecido que o dano epitelial, e particularmente ferimentoepidérmico, resultante de queimaduras pode se estender para grandes áreasde um indivíduo afligido. Como um resultado as lesões por queimadura sãoparticularmente suscetíveis a complicações tais como infecção e desseca-ção que surgem devido à falta de uma camada epitelial funcional. Conse-qüentemente, a promoção de regeneração epitelial em resposta a ferimentopor queimadura representa uma aplicação preferida da invenção.

A promoção de regeneração epitelial, por exemplo, no local delesões dérmicas, causa um aperfeiçoamento rápido na aparência cosméticada área lesionada. As considerações cosméticas são importantes em inúme-ros contextos clínicos, particularmente quando ocorre dano epitelial em Ιο-cais proeminentes do corpo, tais como, face, pescoço e mãos. Conseqüen-temente, a promoção de regeneração epitelial em locais onde se deseja a-perfeiçoar a aparência cosmética da área danificada representa uma moda-lidade preferida da invenção.

O ferimento aos epitélios também pode surgir como um resulta-do da ação de elementos patogênicos (tais como, bactérias, fungos, ou ví-rus), insultos químicos (tais como, queimadura químicas causadas por agen-tes cáusticos, ou através do efeito de fármacos citotóxicos, tais como, aque-les empregados em quimioterapia) ou como um resultado de ferimento porradiação (tanto através de radiação de particulado ou radiação eletromagné-tica tal como, radiação gama, radiação ultravioleta ou similares) tal comoaquele que ocorre em queimadura de sol. A promoção de regeneração epite-lial utilizando métodos e medicamentos de acordo com a invenção pode serutilizada de forma eficaz em todos os contextos mencionados acima.

Será avaliado que muitas das mesmas considerações que sur-gem com relação a dano epitelial em seres humanos também podem serproblemáticas em outros animais, particularmente animais em geral ou do-mésticos (por exemplo, cavalos, gado, cães, gatos, etc). Desta maneira, osmétodos da invenção também podem ser aplicáveis em animais não-humanos.

O uso de agentes que possuem atividade de TGF-p3 para pro-mover a regeneração epitelial em resposta ao ferimento associado com pro-cedimentos de enxerto epitelial representa uma modalidade preferida da in-venção. O dano epitelial que ocorre como um resultado de enxertos de pelepode ser clinicamente problemático, além de considerações cosméticas. Aregeneração epitelial é benéfica tanto no sítio doador de enxerto epitelial,onde esta ajuda no reestabelecimento de uma camada epitelial funcional,como também no sítio receptor onde a regeneração é capaz de aperfeiçoare acelerar a integração do tecido enxertado. A regeneração epitelial em sí-tios receptores de enxerto também é vantajosa no caso de enxertos que uti-lizam pele, pele artificial ou substitutos de pele.

A promoção de regeneração epitelial em sítios doadores de en-xerto epitelial reduz o tempo gasto para rearmazenar uma camada epitelialfuncional, e conseqüentemente reduz o potencial de infecção de sítio doa-dor. A promoção de regeneração epitelial também reduz as incidências devesiculação blistering e ruptura de tecido que podem ocorrer no sítio doador.

É preferido que os enxertos epiteliais sejam enxertos epidérmi-cos (pele). Os métodos e medicamentos da invenção possuem utilidade napromoção de regeneração epitelial nos contextos tanto de enxertos de pelede espessura total como parcial. Tais enxertos de pele (ou seja, tanto enxer-tos de espessura total como parcial) podem ser tanto em malha como não-malha.

Os inventores descobriram que a presença ou ausência de umacamada epitelial intacta também é um fator para determinar o grau de dorassociada com sítios onde o epitélio foi danificado ou removido, tais como,sítios doadores de pele. Desta maneira, a promoção da regeneração epitelialem tais sítios pode reduzir a dor associada com, por exemplo, a retirada deenxertos de pele.

Uma vantagem adicional de promoção de regeneração epitelialem sítios doadores epiteliais é que esta reduz o tempo requerido até que are-colheita de tecido do sítio doador possa ocorrer. Por re-colheita entende-se a remoção subseqüente de tecido epitelial adicional de um sítio doadoranteriormente usado. Isto é particularmente vantajoso em situações onde apele disponível para colheita é limitada e/ou a área da pele requerida paraser colhida é grande. Exemplos de tais situações incluem ocasiões quandose necessita remover enxertos de crianças e/ou pacientes que sofrem dequeimaduras que cobrem uma grande porcentagem da superfície do corpo.

Conseqüentemente, em um terceiro aspecto da invenção pro-porciona-se um método para preparar um sítio doador de enxerto epitelialpara re-colheita, sendo que o método compreende administrar em um sítiodoador epitelial necessitado de tal preparação, uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um agente que possui atividade de TGF-p3. No contextodeste aspecto da invenção uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é umaquantidade de um agente que possui atividade de TGF-p3 suficiente parapromover a regeneração epitelial em tal extensão que enxertos epiteliais a-dicionais podem ser retirados do sítio doador. Será avaliado que a decisãose um sítio doador é suficientemente regenerado para permitir a re-colheitaserá normalmente tomada por um médico competente, e que tal pessoa teráacesso a uma diversidade de orientação, tanto por meio de textos relativoscomo por sua própria experiência, para indicar quando tal re-colheita podeser normalmente realizada sem o benefício de preparação de acordo com ainvenção.

Os inventores descobriram que a promoção de regeneração epi-telial causada por agentes que possuem atividade de TGF-P3 pode ser efe-tuada utilizando o próprio TGF-p3, fragmentos biologicamente ativos, varian-tes e derivados de TGF-P3, e substâncias capazes de promover ou imitar aatividade biológica de TGF-p3. Os fragmentos biologicamente adequados,variantes e derivados de TGF-P3 podem ser facilmente identificados por suacapacidade de replicar os efeitos de TGF-p3 in vivo ou in vitro. A atividade deTGF-p3 pode ser avaliada in vivo utilizando modelos de animal adequadosonde a taxa de regeneração epitelial ocorrente em áreas de dano epitelialtratado com compostos de teste pode ser comparada com a taxa de regene-ração epitelial ocorrente em áreas de controle de dano epitelial. Os modelosde animais adequados podem incluir feridas de espessura parcial ou espes-sura total de tecidos que contêm uma camada epitelial (tal como, a epidermeda pele).

O versado na técnica irá avaliar que quando se estima a taxa deregeneração epitelial (por exemplo, para identificar se a regeneração foi ounão promovida) o parâmetro relativo que será considerado é a extensão decobertura epitelial atingida. Deve-se tomar cuidado ao diferenciar tal cobertu-ra epitelial de outros fatores, tal como, a quantidade de tecido de granulação(ou outros materiais, tal como, matriz associada com formação de coágulo)presente em uma ferida. O tecido de granulação deste tipo pode contribuirpara o fechamento da ferida, ao preencher uma parte oca da ferida ou o leitode uma ferida, não contribui para a regeneração epitelial, uma vez que esteé essencialmente composto de tipos de célula não-epitelial. No caso de aná-lises de feridas (tais como, feridas na pele), as células epiteliais podem sertipicamente identificadas devido à sua morfologia achatada (oposta a fibro-blastos em formato de "fuso", ou células arredondadas da resposta inflama-tória).

A seqüência aminoácido de TGF-p3 humano nativo é proporcio-nada como Seqüência ID No. 1 abaixo:

ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGWKWVHEPKGYY. ANFCSGPCPY LRSADTTHSTVLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILYYVGRTPKVEQ LSNMWKSCK CS(seqüência ID N° 1)

A técnica anterior contém inúmeras formas variantes de TGF-P3que são adequadas para uso nos métodos e medicamentos da invenção.Por exemplo, EP-A-O 684 260 descreve um polipeptídeo que compreendeuma forma modificada de TGF-p3 que possui atividade biológica adequadapara uso de acordo com a presente invenção, bem como ácidos nucléicosque codificam o mesmo. As descrições de EP-A-O 684 260 representampolipeptídeos e ácidos nucléicos preferidos para uso de acordo com a pre-sente invenção.As variantes de TGF-p3 que podem ser usadas de acordo com ainvenção incluem proteínas que contêm substituições de aminoácido con-servadas que mantêm a atividade biológica de TGF-p3 como caracterizadopor sua capacidade de promover regeneração epitelial. É preferido que assubstituições conservadas possam ser substituições projetadas para remo-ver sítios de clivagem da protease, ou outras estruturas de peptídeo quepossam estar envolvidas na degradação ou depuração de TGF-p3. Detalhesadicionais de variantes e derivados de TGF-fo que podem ser empregadosnos medicamentos e métodos da invenção são proporcionados abaixo.

As formas variantes adequadas de TGF-p3 podem ser aquelasonde certos aminoácidos nativos são substituídos por aminoácidos que pos-suem uma cadeia lateral de propriedades biofísicas similares às do aminoá-cido que é substituído, para produzir uma alteração conservativa. Por exem-plo pequenos aminoácidos não-polares, hidrofóbicos incluem glicina, alani-na, leucina, isoleucina, valina, prolina e metionina. Grandes aminoácidosnão-polares, hidrofóbicos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina. Os ami-noácidos neutros polares incluem serina, treonina, cisteína, asparagina eglutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem Iisi-na, arginina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (acídi-cos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Outras modificações em seqüências protéicas tais como aquelasque ocorrem durante ou após a tradução, por exemplo, por acetilação, ami-dação, carboxilação, fosforilação, clivagem proteolítica ou ligação a um Ii-gante podem proporcionar formas variantes adicionais de TGF-P3 adequa-das para uso nos medicamentos e métodos da invenção.

Os derivados de TGF-p3 adequados para uso nos métodos emedicamentos da invenção podem incluir derivados que aumentam ou dimi-nuem a meia-vida de TGF-p3 in vivo. Exemplos de derivados capazes deaumentar a meia-vida de TGF-p3 incluem derivados de peptóide de TGF-p3,derivados de D-aminoácido de TGF-p3, e híbridos peptídeo-peptóide.

Será avaliado que, uma vez que TGF-p3 e seus fragmentos (bemcomo muitas das variantes possíveis e derivados destas) são proteínas oupodem conter componentes de peptidil, estes podem ser submetidos à de-gradação através de inúmeros meios (tal como atividade da protease emsistemas biológicos). Tal degradação pode limitar a biodisponibilidade dospolipeptídeos e, conseqüentemente a capacidade de os polipeptídeos atingi-rem sua função biológica. Há grandes faixas de técnicas bem estabelecidaspor meio das quais os derivados de peptídeo que tiveram a estabilidade au-mentada em contextos biológicos podem ser projetados e produzidos. Taisderivados de peptídeo podem ter a biodisponibilidade aperfeiçoada como umresultado de resistência aumentada à degradação mediada por protease. Depreferência, um derivado de peptídeo ou análogo adequado para uso de a-cordo com a invenção é mais resistente à protease do que o peptídeo a par-tir do qual este é derivado.

De preferência, TGF-p3, suas variantes ou fragmentos, podemser tornar mais resistentes à protease ao proteger o terminal N e/ou C. Porexemplo, o terminal N pode ser protegido por um grupo acetila. O terminal Cpode ser protegido por um grupo amida.

A resistência à protease de um derivado de TGF-p3 pode sercomparada com a resistência à protease do próprio TGF-p3 por meio de aná-lises de degradação de proteína bem-conhecidas descritas na técnica ante-rior.

Os derivados de peptóide de TGF-p3 podem ser facilmente pro-jetados a partir do conhecimento da estrutura de TGF-p3. O software comer-cialmente disponível pode ser usado para desenvolver derivados de peptói-de de acordo com protocolos bem estabelecidos.

Os retropeptóides, (onde todos os aminoácidos são substituídospor resíduos de peptóide em ordem inversa) também são capazes de imitaras propriedades promotoras de regeneração epitelial de TGF-p3. Espera-seque um retropeptóide seja ligado na direção oposta no sulco de ligação aoligante, como comparado com um peptídeo ou híbrido peptóide-peptídeo quecontém um resíduo de peptóide. Como um resultado, as cadeias laterais dosresíduos de peptóide são capazes de apontar na mesma direção que as ca-deias laterais no peptídeo original.As formas de D-aminoácido de TGF-p3 constituem uma modali-dade adicional de um derivado de TGF-P3 adequado para uso de acordocom os métodos e medicamentos da invenção. Neste caso, a ordem dosresíduos de aminoácido que compreendem o derivado é invertida comocomparado com TGF-p3 original. A preparação de derivados que utilizam D-aminoácidos em vez de L-aminoácidos reduz bastante qualquer ruptura in-desejada de tal agente por meio de processos metabólicos normais, redu-zindo as quantidades de agentes que precisam ser administradas, juntamen-te com a freqüência de sua administração.

Será avaliado que, para constituir um fragmento biologicamenteativo, variante, ou derivado de TGF-p3 adequado para uso de acordo com osmétodos e medicamentos da invenção, um fragmento, variante, ou derivadodeve manter a atividade promotora de regeneração epitelial de TGF-p3.

TGF-P3 (ou fragmentos biologicamente ativos, variantes, ou deri-vados destes) pode ser proporcionado para uso nos métodos ou medica-mentos da invenção em uma forma ativa ou inativa. TGF-P3 pode ser inati-vado por meio de inúmeros mecanismos, por exemplo, por encapsulação. Ascápsulas podem ser degradáveis por um estímulo externo para liberar o a-gente ativo quando requerido. Os estímulos externos adequados para usodesta maneira incluem luz UV, ultrassom, enzimas in vivo ou calor.

TGF-P3 também pode ser proporcionado como um precursor ina-tivo, que pode ser ativado mediante contato com o tecido que contém as en-zimas de clivagem natural requeridas para converter o precursor para suaforma ativa. A seqüência de aminoácido de um precursor naturalmente ocor-rente de TGF-p3 humano é proporcionada como Seqüência ID No. 2 abaixo:

MKMHLQRALV VLALLNFATV SLSLSTCTTLDFGHIKKKRV EAIRGQILSK LRLTSPPEPTVMTHVPYQVL ALYNSTRELL EEMHGEREEGCTQENTESEY YAKEIHKFDM IQGLAEHNELAVCPKGITSK VFRFNYS SVE KNRTNLFRAEFRVLRVPNPS SKRNEQRIEL FQILRPDEHILPTRGTAEWLLEISIHCPCHKGVDNEDDHGMMIPPHRLDNLEENCCVRPLANFCSGPCPYEAS ASPCCVPLSNMWKSCK

SFD VTDTVRE

TFQPNGDILE

RGDLGRLKKQ

PGQGGQRKKR

YIDFRQDLGW

LRSADTTHST

QDLEPLTILY

CS

AKQRYIGGKNWLLRRESNLGNIHEVMEIKFKDHHNPHLILALDTNYCFRNICWVHEPKGYYVLGLYNTLNPYVGRTPKVEQ(seqüência ID N° 2)

A inativação pode ser, alternativamente atingida pela adição mo-lecular de uma molécula de ligação. A molécula de ligação pode ser separá-vel quando requerida por um estímulo externo tal como luz UV1 ultrassom,enzimas in vivo ou calor.

Os peptídeos adequados para uso na produção de TGF-p3 inati-vo são bem-conhecidos na técnica, uma vez que TGF-P3 são geralmentesecretados de células em uma forma inativa conhecida como TGF-p3 latente.

O TGF-p3 latente consiste em um Peptídeo Associado à Latência de N ter-minal e o TGF-p3 e também é referido como o Complexo Latente Pequeno.Adicionalmente, o Complexo Latente Pequeno pode se ligar a outro peptídeo(derivado de um gene diferente) de tamanho variável que se chama Proteínade Ligação de TGF-p3 (LTBP) em tal caso todo o complexo é conhecido co-mo o Grande Complexo de TGF-p3 Latente.

O TGF-P3 latente é ativado quando o TGF-p3 for motivado a serdissociado do LAP. Esta dissociação pode ser coordenada em um manose-6-fosfato/receptor de Fator de Crescimento Tipo Insulina Il (M6P-R) e envol-ve proteases tais como plasmina, sendo que os substratos estão associadosna superfície celular por transglutaminase de tecido. Os radicais livres e es-pécies de oxigênio reativo também podem ativar TGF-p3 motivando a disso-ciação do LAP.

A invenção também abrange o uso de substâncias capazes depromover ou imitar a atividade biológica de TGF-p3 para a fabricação de ummedicamento para promover a regeneração epitelial.

As substâncias capazes de promover ou imitar a atividade bioló-gica de TGF-P3 podem atingir seu efeito através de inúmeros meios. Por e-xemplo, tais substâncias podem aumentar a expressão de TGF-p3 ou estaspodem aumentar a meia-vida de TGF-p3, por exemplo reduzindo a renova-ção de TGF-p3. Exemplos de substâncias capazes de promover ou imitar aatividade biológica de TGF-p3 incluem tanto substâncias proteináceas comonão-proteináceas. Por exemplo, tais substâncias capazes de promover ouimitar a atividade biológica de TGF-p3 incluem fatores de transcrição regula-dores de atividade de TGF-p3, anticorpos de ativação capazes de imitar aatividade biológica de TGF-p3, pequenas moléculas inorgânicas que repli-cam os efeitos de ligação a receptor de TGF-p3, bem como substâncias ca-pazes de induzir as cascatas de sinalização intracelular que retêm as carac-terísticas daquelas geradas mediante ligação de receptor de TGF-P3.

De preferência, a promoção de regeneração epitelial pode origi-nar uma taxa de regeneração epitelial que é pelo menos 5%, 10%, 20% ou30% maior do que a regeneração que ocorre em um epitélio tratado por con-trole ou não-tratado. Mais preferivelmente, a regeneração epitelial promovidapode dar origem a uma taxa de regeneração epitelial que é pelo menos 40%,50% ou 60% maior do que a regeneração que ocorre em um epitélio tratadopor controle ou não-tratado. É ainda mais preferido que a regeneração epite-liai promovida possa dar origem a uma taxa de regeneração epitelial queseja pelo menos 70%, 80%, ou 90% maior do que a regeneração que ocorreem um epitélio tratado por controle ou não-tratado, e mais preferivelmente, aregeneração epitelial promovida pode dar origem a uma taxa de regenera-ção epitelial que é pelo menos 100% maior do que a regeneração que ocorreem um epitélio tratado por controle ou não-tratado.

De preferência, a promoção de regeneração epitelial pode darorigem a um tempo para se reepitelializar 1 dia, 2 dias, ou 3 dias mais rápidodo que ocorre em um epitélio tratado por controle ou não-tratado. Mais prefe-rivelmente, a regeneração epitelial promovida pode dar origem a um tempopara se reepitelializar que é pelo menos 4 dias, 5 dias ou 6 dias mais rápidodo que ocorre em um epitélio tratado por controle ou não-tratado. É aindamais preferido que a regeneração epitelial promovida possa dar origem a umtempo para se reepitelializar que seja pelo menos 7 dias, 8 dias ou 9 diasmais rápido do que ocorre em um epitélio tratado por controle ou não-tratado, e mais preferivelmente, a regeneração epitelial promovida pode darorigem a um tempo para se reepitelializar que é pelo menos 10 dias ou maisdo que ocorre em um epitélio tratado por controle ou não-tratado.

Com relação ao tempo para re-colheita de epitélio, por exemplo,de sítios doadores para enxertos de pele de espessura dividida, de preferên-cia, a promoção de regeneração epitelial pode dar origem a um tempo parare-colheita que é 1 dia, 2 dias, ou 3 dias mais rápido do que ocorre em umepitélio tratado por controle ou não-tratado. Mais preferivelmente, a regene-ração epitelial promovida pode dar origem a um tempo para re-colheita que épelo menos 4 dias, 5 dias ou 6 dias mais rápido do que ocorre em um epité-lio tratado por controle ou não-tratado. É ainda mais preferido que a regene-ração epitelial promovida possa dar origem a um tempo para re-colheita queé pelo menos 7 dias, 8 dias ou 9 dias mais rápido do que ocorre em um epi-télio tratado por controle ou não-tratado, e mais preferivelmente, e mais pre-ferivelmente, a regeneração epitelial promovida pode dar origem a um tempopara re-colheita que é pelo menos 10 dias ou mais do que ocorre em umepitélio tratado por controle ou não-tratado.

Os medicamentos de acordo com a invenção podem proporcio-nar quantidades terapeuticamente eficazes de agentes, de acordo com ainvenção, adequadas para promover a regeneração epitelial. Os inventoresdescobriram que tais medicamentos são capazes de promover regeneraçãoepitelial quando administrados tanto antes do dano epitelial, como uma vezque o ferimento já ocorreu.

O uso profilático de agentes de acordo com a invenção parapromover regeneração epitelial é um modo preferido de uso de acordo coma invenção. Será avaliado que tal uso é mais adequado no caso onde o tem-po e localização de possível dano epitelial são conhecidos, por exemplo,ferimento ocorrente como um resultado de procedimentos eletivos, porém opré-tratamento com agentes de acordo com a invenção também é conside-rado em situações onde há uma probabilidade de surgir dano epitelial. Osinventores descobriram que a administração de agentes de acordo com ainvenção imediatamente antes do dano epitelial (ou seja, na hora, ou de pre-ferência meia hora, antes da ocorrência de ferimento) é altamente eficaz,apesar de a administração em momentos anteriores (por exemplo, até 24 ou48 horas antes do dano epitelial) também ser eficaz. O uso profilático de u-sos, métodos e medicamentos de acordo com a invenção é uma modalidadepreferida da invenção, e é particularmente preferido na preparação de sítiosdoadores e/ou receptores de enxerto de pele.

Os agentes de acordo com a invenção também são eficazes napromoção de regeneração epitelial quando administrados após ocorrer odano epitelial. É preferido que tal administração ocorra o quanto antes apósa iniciação do ferimento, porém os agentes de acordo com a invenção sãocapazes de promover regeneração epitelial em qualquer momento até ocor-rer a restauração total do epitélio danificado. Será avaliado que a "janela"onde os agentes de acordo com a invenção podem ser administrados deforma eficaz de modo que estes sejam capazes de promover a regeneraçãoepitelial é dependente de inúmeros fatores, inclusive a natureza do epitélioem questão (inclusive a taxa de reparo natural do epitélio), o grau de feri-mento que ocorreu, e o tamanho da área danificada. Desta maneira, no casode uma grande área de dano epitelial, ou no caso de ferimento a um epitélioque é naturalmente mais lento de se regenerar, os agentes de acordo com ainvenção ainda podem ser administrados de forma eficaz relativamente atra-sados na resposta de regeneração. Os agentes de acordo com a invençãopodem ser, por exemplo, de preferência administrados dentro da primeira a24 horas após ocorrer o dano epitelial, porém ainda podem atingir a promo-ção beneficiai de regeneração epitelial se administrados até dez, ou maisdias após a iniciação do ferimento.

A promoção de regeneração epitelial pode ser atingida por ad-ministração repetida de agentes de acordo com a invenção em sítios de da-no epitelial. Por exemplo, as quantidades terapeuticamente eficazes de a-gentes de acordo com a invenção podem ser administradas em epitélios da-nificados como requerido até atingir a regeneração epitelial total. A guisa deexemplo os agentes de acordo com a invenção podem ser administradosdiariamente ou duas vezes ao dia em um sítio de dano epitelial durante pelomenos os primeiros três dias após a ocorrência do dano.

Mais preferivelmente, os agentes de acordo com a invenção sãoadministrados tanto antes como depois de incidências de dano epitelial. Osinventores descobriram que a administração de agentes de acordo com ainvenção imediatamente antes do dano epitelial, seguida por administraçãodiária de tais agentes durante os três dias após o dano epitelial, é particu-larmente eficaz na promoção de regeneração epitelial.

Será avaliado que a quantidade de um agente de acordo com ainvenção que será aplicada em um sítio de dano epitelial depende de inúme-ros fatores tais como a atividade biológica e biodisponibilidade do agente,que sucessivamente depende do modo de administração e das propriedadesfisico-químicas do agente. Outros fatores podem incluir:

A) A meia vida do agente no indivíduo que será tratado.

Β) A condição específica que será tratada.

C) A idade do indivíduo.

A freqüência de administração também será influenciada pelosfatores mencionados acima e particularmente a meia-vida do agente sele-cionado de acordo com a invenção no indivíduo que será tratado.

Geralmente quando os indivíduos de acordo com a invençãoforem usados para tratar sítios existentes de dano epitelial o agente deveriaser administrado assim que o dano epitelial ocorreu ou foi diagnosticado. Aterapia com agentes de acordo com a invenção deveria continuar até o epi-télio danificado ser regenerado até a satisfação do médico.

A freqüência de administração irá depender da meia-vida bioló-gica do agente usado de acordo com a invenção. Tipicamente, um creme oupomada que contém um agente de acordo com a invenção deveria ser ad-ministrado em um tecido alvo de modo que a concentração do agente nosítio de dano epitelial seja mantida em um nível adequado para obter umefeito terapêutico. Este pode requerer administração diária ou ainda diversasvezes ao dia.As quantidades terapeuticamente eficazes de agentes de acordocom a invenção, por exemplo, na forma de medicamentos de acordo com ainvenção, podem ser administradas por qualquer rota adequada capaz deobter o efeito desejado para promover a regeneração epitelial, porém podemser, de preferência, administradas localmente em sítios de dano epitelial.

Os inventores descobriram que a regeneração epitelial pode serpromovida de forma eficaz através da administração de um agente de acor-do com a invenção (particularmente TGF-p3) na forma de injeções em sítiosde dano epitelial. Por exemplo, no caso de dano à epiderme, o agente deacordo com a invenção pode ser administrado por meio de injeção intradér-mica. Desta maneira, uma composição preferida da invenção compreendeuma solução injetável de um agente de acordo com a invenção (por exem-plo, para injeção em torno das margens de um sítio de dano epitelial ou umsítio que provavelmente será danificado). As formulações adequadas parauso nesta modalidade da invenção são consideradas no Apêndice abaixo.

Alternativa ou adicionalmente, um agente de acordo com a in-venção também pode ser administrado em uma forma tópica para promovera regeneração epitelial. Tal administração pode ser efetuada como parte dotratamento inicial e/ou acompanhamento da área danificada. Os detalhes deformulações adequadas para administração tópica estão estabelecidos adi-ante. As formulações tópicas podem ser aplicadas por injeção sobre a super-fície da ferida, por pulverização de aerossol e também por aplicação sobre asuperfície da ferida sob um curativo oclusivo ou semi-oclusivo, por exemplo,Opsite, Bioclusive, Tegaderm ou similares.

Os inventores descobriram que a promoção de regeneração epi-telial de acordo com a presente invenção é particularmente aperfeiçoada poraplicação tópica de um agente de acordo com a invenção a epitélios danifi-cados (ou no caso de aplicação profilática, a epitélios que serão danifica-dos).

É preferido que as composições que contêm agentes de acordocom a invenção sejam formuladas de modo que estas compreendam adicio-nalmente um açúcar. O açúcar pode ser, de preferência, selecionado dogrupo que compreende maltose, manose, sacarose e glicose. E particular-mente preferido que o açúcar seja maltose. O açúcar, tal como maltose, po-de estar presente em quantidade suficiente onde a composição é substanci-almente isotônica com relação ao sítio onde a composição será administrada.

Os inventores descobriram que o uso de açúcares tal como mal-tose em formulações proporciona um aperfeiçoamento notável e surpreen-dente em termos tanto da quantidade de material ativo que pode ser recupe-rada de frascos que contêm TGF-p3 (por exemplo, seringas pré-carregadas)como da atividade biológica da molécula de TGF-P3. Com relação à recupe-ração do material de TGF-p3, a formulação em maltose resultou em um au-mento de 4 dobras em material recuperável (como medido por ELISA) com-parada com uma formulação baseada em manitol. Com relação à atividadebiológica inerente de TGF-p3, a formulação em maltose resultou em um au-mento de 4 dobras em atividade (IC5o na análise de Mink Lung Epitelial Cellde 7,309 [± 1,044] pg/mL) comparada com a formulação de manitol (IC5o naanálise de Mink Lung Epitelial Cell de 30,104 [±-7,093] pg/mL).

O uso de composições onde os agentes de acordo com a inven-ção são formulados na presença de açúcares, tal como, maltose são particu-larmente preferidos em contextos onde as composições serão administradaspor meio de injeção. Os inventores descobriram surpreendentemente que ouso de açúcares, tal como, maltose em tais formulações proporciona vanta-gens notáveis em termos de níveis reduzidos de dor experimentada por a-queles que recebem injeções das composições, como comparada com for-mulações onde outros agentes de tamponamento de tonicidade (tal comomanitol) são usados.

De fato, as composições benéficas são as que compreendemagentes ativos de acordo com a invenção e açúcares, tal como, maltose queconstituem um aspecto separado da invenção. Conseqüentemente, em umquarto aspecto da invenção proporciona-se uma composição que compre-ende um agente que possui atividade de TGF-p3 formulada na presença deum açúcar selecionado do grupo que compreende maltose, manose, sacaro-se e glicose. É preferido que o açúcar compreenda maltose.

As composições adequadas para uso de acordo com qualquerum dos aspectos anteriores da invenção podem compreender agentes ativosformulados na presença de um açúcar, tal como, maltose em uma concen-tração entre 0,1 M e 0,4 M do açúcar. Mais preferivelmente, as formulaçõesadequadas podem compreender os agentes ativos formulados na presençade 0,25M de açúcar.

As composições que compreende agentes ativos de acordo coma invenção podem tomar inúmeras formas diferentes dependendo, em parti-cular, da maneira na qual estas serão usadas. Desta maneira, por exemplo,estas podem estar na forma de um líquido, pomada, creme, gel, hidrogel, póou aerossol. Todas tais composições são adequadas para aplicação tópica aum epitélio danificado, que é um meio preferido de administrar agentes deacordo com a invenção em um indivíduo (pessoa ou animal) necessitado detratamento.

Em uma modalidade preferida, as formulações terapêuticas dosagentes da invenção adequadas para administração parenteral localizada(por exemplo, intradérmica e subcutânea) podem ser preparadas ao misturaro agente (que possui o grau desejado de pureza) com transportadores fisio-logicamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizantes na forma deformulações em pó Iiofilizados e não-liofilizados para reconstituição, solu-ções não-aquosas e aquosas, dispersões/suspensões não-aquosas e aquo-sas inclusive emulsões e formulações semi-sólidas. Os transportadores acei-táveis, inclusive excipientes, são não-tóxicos a receptores nas dosagens econcentrações empregadas, e incluem, porém sem caráter limitativo, tam-pões tais como fosfatos, citratos, e outros ácidos orgânicos; antioxidantesinclusive ácido ascórbico e metionina; modificadores de tonicidade, tais co-mo, cloreto de sódio, glicose, glicerol, e similares; conservantes tais como,cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto debenazalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou álcool benzilico; alquilparabenos, tais como metila/ou propila e/ou butil parabenos; catecol; resor-cinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol; polipeptídeos de baixo peso mole-cular (menor que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina dosoro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como, polivinil-pirrolidona; aminoácidos tais como, glicina, glutamina, asparagina, histidina,arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratosinclusive glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tal como, EDTA;outros açúcares, tais como, sacarose, manitol, maltose, trealose ou sorbitol;contraíons formadores de sal, tal como, sódio; complexos de metal (por e-xemplo, complexos de proteína-Zn); tensoativos aniônicos, tais como, sa-bões de ácido graxo, sulfatos de acila, ou sulfossuccinatos de acila; tensoa-tivos catiônicos, tais como, alquilaminas primárias, secundárias, terciárias,ou quaternárias; tensoativos não-iônicos, por exemplo, ésteres de sorbitanoou ésteres polietoxilados de ácidos de acila, copolímeros de oxido de polieti-leno e oxido de polipropileno.

Um exemplo de formulação farmacêutica de uma solução estérilpara administração parenteral localizada da presente invenção, além dosagentes ativos, podem incluir opcional ou adicionalmente os seguintes:

0,01 M a 0,1 M de tampão fosfato, e

Cloreto de sódio até 0,9% p/v (para atingir a iso-tonicidade comsangue, 290-300 mOsm/L))

1 a 10% p/v % de maltose (embora outro açúcar possa ser usa-do na alternativa), e

0,1 mg/ml de monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween(TM) 80).

Será avaliado pelo versado na técnica que uma massa em póliofilizada (secada por congelamento) pode ser preparada baseada na solu-ção acima.

As modalidades preferidas da invenção podem ser apresentadasna forma de um frasco, uma ampola, ou uma seringa pré-carregada tantocom; uma solução estéril; um pó Iiofilizado estéril (seco por congelamento)adequado para reconstituição; uma suspensão estéril ou qualquer outra for-ma farmaceuticamente aceitável de apresentação adequada para entrega defármaco parenteral localizada.Em uma modalidade preferida adicional da invenção, formula-ções terapêuticas dos agentes da invenção adequadas para administraçãotópica podem ser preparadas ao misturar a substância que possui o graudesejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizantes fisio-logicamente aceitáveis opcionais na forma de formulações em póliofilizadasou não-liofilizadas, soluções não-aquosas ou aquosas, disper-sões/suspensões não-aquosas ou aquosas, inclusive emulsões e formula-ções semi-sólidas. Os transportadores aceitáveis, inclusive excipientes, sãonão-tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e in-cluem, porém sem caráter limitativo, água purificada, salina, salina tampona-da com fosfato (PBS), solução de Ringer, solução de Iactato de Ringer, solu-ções de dextrose, solução de dextrose/salina, soluções hidroalcoólicas, gli-cose, sacarose, dextrano, manose, manitol, maltose, sorbitol, polietileno gli-col (PEG), propileno glicol (PG), fosfatos, acetatos, gelatina, colágenos, Car-bopol 934® (BF Goodrich Corp.), óleos vegetais e sintéticos e ceras, tensoa-tivos aniônicos, tais como, sabões de ácido graxo, sulfatos de acila, ou sul-fosuccinatos de acila; tensoativos catiônicos, tais como, alquilaminas primá-rias, secundárias, terciárias ou quaternárias; tensoativos não-iônicos, porexemplo, ésteres de sorbitano ou ésteres polietoxilados de ácidos de acila,copolímeros de óxido de polietileno e óxido de polipropileno, e similares.Uma pessoa pode incluir adicionalmente agentes conservantes, estabilizan-tes, antioxidantes, antimicrobianos e de tamponamento adequados, por e-xemplo, metila e/ou propila e/ou butilparabenos, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), ácido cítrico, ácido ascórbico e, similares. Asbases de emulsão, creme ou pomada úteis na formulação pode incluir cre-mes e emulsões de base aquosa (óleo-em-água), cremes e emulsões à ba-se de óleo (água-em-óleo), pomadas (hidrocarboneto emulsificante e não-emulsificante), géis, hidrogéis, e similares. Outras formulações para entregatópica podem incluir aerossóis, bandagens, e outros curativos para ferida.Alternativamente, uma pessoa pode incorporar ou encapsular o compostoterapêutico da invenção em uma matriz ou membrana polimérica adequada,proporcionando, desta maneira, um dispositivo de entrega de liberação cons-tante adequado para posicionamento, ou implantação próximo ao local queserá tratado.

Um exemplo de formulação farmacêutica de uma formulação dehidrogel semi-sólido para administração tópica da presente invenção, alémdo(s) ingrediente(s) ativo(s), pode incluir os seguintes:

0,1% p/v a 2,0% p/v de hidroxicelulose, e

0,1% p/v a 1,0% p/v de Carbopol 934® (BF Goodrich Corp.), e

a 20% p/v de propileno glicol, e

0,005% p/v a 0,020% p/v de metilparabeno, e 0,005% p/v a0,020% p/v de propilparabeno, e

Hidróxido de sódio ou ácido clorídrico q.s. ad pH 4 - 10

Água purificada, q.s. ad 100% p/v

As composições adequadas para aplicação tópica de acordocom a invenção (inclusive aquelas composições onde os agentes ativos deacordo com a invenção são formulados na presença de maltose) podem serapresentadas na forma de uma garrafa, a jarra, um tubo, um pulverizador,tanto de; uma solução estéril; um pó estéril Iiofilizado (seco por congelamen-to) ou não-liofilizado para reconstituição, uma dispersão/suspensão estéril,um semi-sólido estéril, ou qualquer outra forma farmaceuticamente aceitávelde apresentação adequada para entrega de tópica de fármaco.

Os agentes de acordo com a invenção podem ser proporciona-dos sobre um curativo ou adesivo estéril, que podem ser usados para cobrirum sítio de dano epitelial que será tratado.

Será avaliado que o veículo da composição que compreendeagentes de acordo com a invenção deve ser um que seja bem tolerado pelopaciente e permita a liberação do agente no sítio de dano epitelial. Tal veícu-lo é, de preferência biocompatível, biodegradável, biorreabsorvível e/ou não-inflamatório.

As composições que compreendem agentes de acordo com ainvenção podem ser usadas de numerosas maneiras. Desta maneira, porexemplo, uma composição pode ser aplicada em e/ou em torno de um sítiode dano epitelial para regular a regeneração epitelial. Se a composição foraplicada em um sítio "existente" de dano epitelial, então o veículo farmaceu-ticamente aceitável será um que é relativamente "suave", ou seja, um veícu-lo que é biocompatível, biodegradável, biorreabsorvível e não-inflamatório.

Um agente de acordo com a invenção, ou um ácido nucléico quecodifica tal agente, pode ser incorporado dentro de um dispositivo de libera-ção lenta ou atrasada. Tais dispositivos podem ser, por exemplo, colocadosou inseridos sob a pele e o agente ou ácido nucléico pode ser liberado du-rante dias, semanas ou ainda meses. Tal dispositivo pode ser particularmen-te útil para pacientes que requerem promoção em longo prazo de regenera-ção epitelial. Os dispositivos podem ser particularmente vantajosos quandousados para a administração de um agente ou ácido nucléico que poderiarequerer normalmente administração freqüente (por exemplo, pelo menosadministração diária por outras rotas).

As doses diárias de um agente de acordo com a invenção po-dem ser dadas como uma única administração (por exemplo, uma aplicaçãodiária de uma formulação tópica ou uma injeção diária). Alternativamente, oagente de acordo com a invenção pode requerer administração duas vezesou mais vezes durante um dia. Em uma modalidade alternativa, um disposi-tivo de liberação lenta pode ser usado para proporcionar doses ótimas deum agente de acordo com a invenção em um paciente sem a necessidadede administrar doses repetidas.

Em uma modalidade, um veículo farmacêutico para administra-ção de um agente de acordo com a invenção pode ser um líquido e umacomposição farmacêutica adequada poderia estar na forma de uma solução.Em outra modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é um sólido euma composição adequada está na forma de um pó ou comprimido. Em umamodalidade adicional, o agente de acordo com a invenção pode ser formula-do como uma parte de um adesivo transdérmico farmaceuticamente aceitável.

Um veículo sólido pode incluir uma ou mais substâncias quetambém podem atuar como agentes aromatizantes, lubrificantes, solubilizan-tes, agentes de suspensão, cargas, fluidificantes, auxiliares de compressão,aglutinantes ou agentes desintegrantes de comprimido; este também podeser um material de encapsulamento. Em pós, o veículo é um sólido finamen-te dividido que é misturado com o agente finamente dividido de acordo coma invenção. Em comprimidos, o agente de acordo com a invenção é mistura-do com um veículo que possui as propriedades de compressão necessáriasem proporções adequadas e compactado no formato e tamanho desejado.Os pós e comprimidos contêm, de preferência, até 99% do agente de acordocom a invenção. Os veículos sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfa-to de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, ami-do, gelatina, celulose, polivinilpirrolidina, ceras de baixa fusão e resinas detroca iônica.

Os veículos líquidos podem ser usados para preparar soluções,suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. Oagente de acordo com a invenção pode ser dissolvido ou suspenso em umveículo líquido farmaceuticamente aceitável tal como água, um solvente or-gânico, uma mistura tanto de óleos como gorduras farmaceuticamente acei-táveis. O veículo líquido pode conter outros aditivos farmacêuticos adequa-dos tais como, solubilizantes, emulsificantes, tampões, conservantes, ado-çantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensão, agentes espessan-tes, corantes, reguladores de viscosidade, estabilizantes ou osmorregulado-res. Exemplos adequados de veículos líquidos para administração oral e pa-renteral incluem água (que contém parcialmente aditivos como acima, porexemplo, derivados de celulose, de preferência, solução de celulose de car-boximetil de sódio), álcoois (inclusive álcoois monoídricos e álcoois poliídri-cos, por exemplo, glicóis) e seus derivados, e óleos (por exemplo, óleo decoco fracionado e óleo de amendoim). Para administração parenteral, o veí-culo também pode ser um éster oleoso tal como oleato de etila e miristato deisopropila. Os veículos líquidos estéreis são úteis em composições em formalíquida estéril para administração parenteral. O veículo líquido para composi-ções pressurizadas pode ser um hidrocarboneto halogenado ou outro prope-lente farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas líquidas são soluções estéreis oususpensões que podem ser utilizadas, por exemplo, por injeção intramuscu-lar, intratecal, epidural, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea. As solu-ções estéreis também podem ser administradas de forma intravenosa e tópi-ca por pulverização de aerossol ou aplicação sob um curativo oclusivo ousemi-oclusivo. O agente de acordo com a invenção pode ser preparado co-mo uma composição sólida estéril, por exemplo, por secagem por congela-mento ou liofilização que pode ser dissolvida ou suspensa no momento daadministração utilizando água estéril, salina, ou outro meio injetável estérilapropriado. Os veículos são projetados para incluir aglutinantes inertes, a-gentes de suspensão, lubrificantes, aromatizantes, adoçantes, conservantes,corantes e coberturas.

Na situação onde se deseja administrar um agente de acordocom a invenção por meio de ingestão oral, será avaliado que o agente sele-cionado será, de preferência, um agente que possui um grau elevado de re-sistência à degradação. Por exemplo, o agente de acordo com a invençãonão pode ser, de preferência, um peptídeo, ou pode não possuir componen-tes peptídicos.

As composições de agentes de acordo com a invenção são ade-quadas para serem usadas para reduzir ou controlar dano ao epitélio corne-ano (células situadas sobre as células estromais da córnea). Tal dano poderesultar de trauma no olho que surge como um resultado de lesão acidental(como considerado acima) ou como um resultado de operações cirúrgicas(por exemplo, cirurgia a laser sobre a córnea). Neste caso a composição oumedicamento de acordo com a invenção pode estar na forma de um colírio.Embora as composições possam ser usadas na córnea, os inventores acre-ditam que os métodos da invenção podem ser usados, de preferência, emtecidos, tal como, a pele ou escalpo, sem células estromais.

Os agentes de acordo com a invenção podem ser usados emuma faixa de sítios "internos" de dano epitelial (ou seja/ aqueles sítios dedano epitelial ocorrente dentro do corpo, em vez de uma superfície externa).Desta maneira, por exemplo, os medicamentos que compreendem agentesde acordo com a invenção podem ser formulados para inalação para uso emsítios de dano epitelial que surge nos pulmões ou outros epitélios respirató-rios.

Os procedimentos conhecidos, tais como aqueles convencio-nalmente empregados pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimen-tação in vivo, exames clínicos, etc.), podem ser usados para estabelecerformulações específicas de composições que compreendem agentes de a-cordo com a invenção e regimes terapêuticos precisos para administraçãode tais composições (tais como, doses diárias do agente ativo e a freqüênciade administração).

Geralmente, as composições que compreendem agentes de a-cordo com a invenção deveriam ser formuladas de modo que quando admi-nistradas em um sítio de dano epitelial uma concentração de um agente en-tre 0,01 nM e 10 mM por cm2 ou cm linear seja atingida no sítio. De prefe-rência, as composições que compreendem agentes de acordo com a inven-ção deveriam ser formuladas de modo que quando administradas em umsítio de dano epitelial uma concentração do agente entre 0,1 nM e 1 mM porcm2 ou cm linear seja atingida no sítio. Mais preferivelmente, as composi-ções que compreende agentes de acordo com a invenção deveriam ser for-muladas de modo que quando administradas em um sítio de dano epitelialuma concentração do agente entre 0,1 nM e 400 μΜ por cm2 ou cm linearseja atingida no sítio.

Simplesmente a guisa de exemplo uma solução injetável quecontém entre 50ng/100μΙ e 500ng/100μΙ de um agente de acordo com a in-venção (tal como TGF-P3) é adequada para aplicação em um sítio de danoepidérmico de espessura parcial.

Uma dose diária adequada de um agente de acordo com a in-venção capaz de promover regeneração epitelial depende dos fatores discu-tidos acima bem como do tamanho do sítio de dano epitelial que será trata-do. Tipicamente a quantidade de um agente de acordo com a invenção re-querida para o tratamento de sítio de dano epitelial estará dentro da faixa de0,01nM a 10mM do agente por cm2 ou cm linear por 24 horas, dependendoda área do sítio de dano epitelial entre diversos outros fatores.Os agentes de acordo com a invenção podem ser usados parapromover regeneração epitelial como uma monoterapia (ou seja, uso do a-gente separadamente). Alternativamente os usos, métodos ou medicamen-tos da invenção podem ser usados em combinação com outros compostosou tratamentos capazes de promover regeneração epitelial. Por exemplo, osusos, métodos ou medicamentos da invenção podem ser usados em combi-nação com curativos (que podem incluir gazes, membranas de compósitosintético e/ou películas transparentes, sendo que qualquer um destes podeser opcionalmente impregnado com agentes anti-infectivos, alginatos, hidro-colóides ou mel), pele artificial (tal como pele artificial gerada da própria epi-derme de um indivíduo, ou equivalentes comercialmente disponíveis) oupomadas (tais como aquelas que compreendem compostos antiinfectivos abase de prata). Dois exemplos de peles comercialmente disponíveis ade-quadas para uso em combinação com os métodos, usos ou medicamentosda invenção estão disponíveis sob os nomes Apligraf (Graftskin) e Derma-graft.

Os usos, métodos ou medicamentos da invenção também sãoadequados para uso em combinação com outras terapias convencionais oudo desenvolvimento. Os seguintes parágrafos contemplam exemplos de taisterapias, e fazem referência às indicações onde o uso de terapias de combi-nação pode ser preferido.

Quando se promove regeneração epitelial no contexto de curade ferida (e particularmente a cura de queimaduras e úlceras de pele) podeser preferido combinar os usos, métodos ou medicamentos da invenção comagentes de desbridamento. Exemplos adequados de tais agentes podemincluir agentes enzimáticos tais como colagenase (Smith & Nephew), agen-tes químicos, agentes cirúrgicos/mecânicos ou agentes biológicos, por e-xemplo, larvoterapia.

Alternativa ou adicionalmente, quando se promove regeneraçãoepitelial em cura de feridas pode ser preferido combinar os usos, métodos oumedicamentos da invenção com peptídeos líticos tais como, citoporinas. Es-tes peptídeos podem se incorporar em membranas celulares biológicas cau-sando, desse modo, a Iise das células. Um exemplo de uma citoporina ade-quada para uso em terapia de combinação é HB-107 (produzida por HelixBioMedix, Inc.).

A regeneração epitelial em cura de feridas (particularmente dediabéticos), epidermólise bolhosa e doenças oculares (inclusive cura de feri-da corneana) pode ser promovida pelo uso de timosina beta-4 em combina-ção com usos, métodos e medicamentos da invenção. Uma forma recombi-nante de timosina beta-4 adequada para tal uso é produzida por RegeneRxBiopharmaceuticals Inc.

Outro agente adequado para uso em terapia de combinaçãocom os usos, métodos ou medicamentos da invenção para a promoção deregeneração epitelial associada com cura de feridas e distúrbios da pele taiscomo úlceras é Pimilprost. Este composto é um análogo estável de Prosta-glandina II, e possui atividade biológica tanto como um inibidor de agregaçãode plaquetas como um vasodilatador. Pimilprost adequado para uso emcombinação com os usos, métodos e medicamentos reivindicados pode serobtido junto a Sumitomo Pharmaceuticals Co. Ltd.

A regeneração epitelial na cavidade oral, por exemplo, no trata-mento de feridas ou úlceras na boca, pode ser promovida pela combinaçãode usos, métodos e medicamentos da invenção com inibidores de degranu-lação de mastócitos tal como amlexanox (comercialmente disponível junto aAccess Pharmaceuticals, Inc.).

A regeneração de epitélios danificados em cura de feridas oucomo um resultado de complicações diabéticas também pode ser promovidapela combinação de usos, métodos e medicamentos de acordo com a pre-sente invenção com proteína-70 (HSP-70) de choque térmico o indutores deproteína de choque térmico, Bimoclomal, produzida por Biorex Research andDevelopment Co., representa um exemplo preferido de um indutor de HSPadequado em tal terapia de combinação.

Para promover a regeneração epitelial em tecidos, tal como, amucosa do estômago (por exemplo, no caso de reepitelialização para pro-mover a cura de úlceras do estômago), a epiderme, e epitélio corneano podeser preferido combinar os usos, métodos e medicamentos da presente in-venção com análogos de melanostatina capazes de acelerar a regeneraçãodo tecido. Um exemplo de um análogo adequado deste tipo é Alaptid, queestá comercialmente disponível junto a VUFB.

Outro agente que pode ser vantajosamente usado em combina-ção com os usos, métodos e medicamentos da invenção é a enzima hepari-nase III. Tais combinações podem ser preferivelmente usadas para promo-ver a regeneração epitelial associada com cura de feridas e o tratamento deúlceras externas (particularmente úlceras diabéticas). Uma forma adequadade heparinase Ill para uso em tais combinações é produzida por IBEX Tech-nologies, Inc. sob a designação IBT-9302.

Os usos, métodos e medicamentos da invenção podem ser adi-cional ou alternativamente usados em combinação com o pipetidomiméticoda trombina sintético Chrysalin produzido por Chrysalis BioTechnoIogy, Inc.Tais combinações podem ser preferidas para a promoção de regeneraçãoepitelial associada com cura de feridas e úlceras diabéticas, particularmenteúlceras do pé diabético.

A promoção de regeneração epitelial em sítios de dano porqueimadura pode ser efetuada pelos usos, métodos ou medicamentos dainvenção em combinação com PV-707, fabricado por GroPep Ltd. PV-707 éum agonista do fator de crescimento de peptídeo.

A promoção de regeneração epitelial em feridas, e particular-mente queimaduras, pode ser promovida pelo uso de sulfato de deidroepi-androsterona sintética (DHEAS) em combinação com os usos, métodos emedicamentos da invenção. Uma forma de DHEAS sintética adequada paratal uso é fabricada por Pharmadigm Inc. sob o nome PB-005.

A regeneração epitelial no tratamento de doença dermatológicae cura de feridas pode ser promovida pelos usos, métodos ou medicamentosda invenção em combinação com Iactoferrina recombinante. Uma forma a-dequada de Iactoferrina recombinante humana é fabricada por Agennix Inc.

Outra terapia de combinação adequada para a promoção de re-generação epitelial associada com a resposta de cura de feridas consiste nacombinação dos usos, métodos ou medicamentos da invenção com o forne-cimento de desoxirribonucleosídeos livres. Uma fonte adequada de tais de-soxirribonucleosídeos é fornecida por PN-105, que compreende uma misturade equiponderação destas moléculas em uma base de gel e é fabricada porWellstat Therapeutics Corp.

Há uma faixa de métodos e composições projetada para aperfei-çoar ou aumentar a regeneração epitelial que utiliza fatores de crescimentoem vez de TGF-p3. Será avaliado que os usos, métodos ou medicamentosda invenção também podem ser usados em combinação com estes trata-mentos existentes. Os seguintes parágrafos proporcionam uma orientaçãoadicional de como a presente invenção pode ser usada em combinação comoutros tratamentos baseados em fator de crescimento. Os usos, métodos emedicamentos da invenção podem ser usados em combinação com elemen-tos da família de fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Por exemplo, apresente invenção pode ser usada em combinação com FGF (FGF-2) bási-co. Esta combinação dos usos, métodos ou medicamentos da invenção comFGF-2 pode ser particularmente preferida na promoção de regeneração epi-telial após dano de ferida. Exemplos de sítios de ferida que podem tirar pro-veito de tal combinação incluem queimaduras, sítios doadores de enxerto, eferidas crônicas, tais como, úlceras (inclusive úlceras que não cicatrizam,tais como, úlceras diabéticas ou decúbitos). O FGF-2 pode ser, preferência,FGF-2 (rFGF-2) recombinante e mais preferivelmente, FGF-2 (rhFGF-2) hu-mano recombinante. Um exemplo adequado de rFGF-2 adequado para usode acordo com esta modalidade da invenção é aquele produzido por SeiosInc. ou Chiron.

Outro elemento da família de fator de crescimento de fibroblastoque pode ser usado em combinação com os usos, métodos e medicamentosda invenção para promover a regeneração epitelial é FGF-10 (também co-nhecido como fator-2 de crescimento de queratinócito ou KGF-2) para pro-mover a regeneração de epitélios danificados como um resultado de feridas,complicações do processo de cura dérmica (tais como, úlceras de pele), do-enças, tais como, mucosite oral ou colite ulcerativo, ou dano epitelial gastro-intestinal tal como aquele que ocorre em doença de Crohn. Uma forma ade-quada de FGF-10 adequado para uso em combinação com os usos, méto-dos ou medicamentos da invenção é produzida por Human Genome Scien-ces, Inc. sob o nome Repifermin.

Os usos, métodos e medicamentos da invenção também podemser usados em combinação com elementos da família do fator de crescimen-to derivado de plaqueta (PDGF). Por exemplo, a combinação dos usos, mé-todos ou medicamentos da invenção com PDGF-B pode ser de uso na pro-moção de regeneração epitelial em cura de feridas, e particularmente a curade feridas por queimadura ou úlceras do pé diabético. Em uma modalidadepreferida de tais combinações o PDGF-B que será usado pode ser, de prefe-rência, entregue por meio de um vetor adenoviral. Selective Genetics, Inc.produz um exemplo adequado de tal vetor adenoviral sob o nome AdPDGF-B/GAM.

Outra combinação adequada utiliza os usos, métodos ou medi-camentos da invenção em combinação com PDGF-BB. Um exemplo dePDGF-BB que pode ser usado em tal combinação está comercialmente dis-ponível sob o nome Regranex.

A combinação dos usos, métodos ou medicamentos da invençãocom inibidores de citocina também pode ser usada para promover a regene-ração epitelial. Tais combinações podem ser usadas, por exemplo, na pro-moção de regeneração epitelial em resposta à lesão, ou para tratar danoepitelial ocorrente como um resultado de doenças, tal como, doença do in-testino irritável (IBD) ou doença de Crohn. Um exemplo adequado de tal ini-bidor é Semapimod (CNI- 1493) um inibidor de MPK guanilidrazona sintéticoproduzido por Picower Institute para Pesquisa Médica.

Os agentes de acordo com a invenção podem ser alternativa ouadicionalmente proporcionados em combinação com compostos capazes deinibir a atividade da protease. Os inibidores da protease podem ser selecio-nados na base de um amplo espectro de atividade inibidora, ou para a capa-cidade de inibir seletivamente proteases (ou famílias de protease) presentesem sítios de dano epitelial. As proteases que serão inibidas podem incluirelastase de neutrófilo, metaloproteinases da matriz, ativadores de plasmino-gênio (por exemplo, ativador de plasminogênio uroquinase ou ativador deplasminogênio de tecido), plasmina, catepsinas, furina, e elementos da famí-lia "uma desintegrina e uma metaloproteinase" tal como ADAM ou ADAM-TS. Os inibidores da protease adequados podem incluir peptídeo, proteína,ou inibidores de molécula pequena.

Será avaliado que TGF-β3, seus fragmentos, derivados e varian-tes, bem como agentes capazes de aumentar a atividade biológica de TGF-β3 podem representar agentes favoráveis que serão administrados por técni-cas que envolvem expressão celular de seqüências de ácido nucléico quecodificam tais moléculas. Tais métodos de expressão celular são particular-mente adequados para uso médico com os efeitos terapêuticos dos polipep-tídeos, derivados e análogos são requeridos durante um período prolongado,por exemplo, em contextos onde se deseja aumentar, durante um período detempo, uma resposta de outra forma imperfeita.

Muitos métodos conhecidos de administrar agentes de acordocom a invenção em um tecido epitelial danificado relativo possuem a des-vantagem que pode ser difícil de atingir níveis constantes do agente no sítiode dano epitelial durante poucos dias, pois muitos agentes adequados po-dem possuir meias-vidas curtas in vivo. As meias-vidas dos agentes podemser curtas devido a numerosas razões que incluem:

(i) Degradação por proteases e similares.

(ii) Depuração por proteínas de ligação.

(iii) Ligação e inibição de atividade de agente por moléculas dematriz extracelular, tais como, decorina e fibronectina.

Ademais, os agentes usados para tratar sítios de cura de danoepitelial precisam ser administrados em um veículo adequado e são geral-mente proporcionados como uma composição que compreende o agenteativo e o veículo. Como discutido adicionalmente abaixo, tais veículos são,de preferência, não-inflamatórios, biocompatíveis, biorreabsorvíveis e nãodevem degradar ou inativar o agente (em armazenamento ou em uso). En-tretanto, pode ser geralmente difícil proporcionar um veículo satisfatório paraentrega de agentes em um tecido que será tratado.

Uma maneira conveniente em que estes problemas podem serprevenidos ou mitigados é proporcionar uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente de acordo com a invenção em um sítio de dano epitelialpor meio de terapia genética.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção propor-ciona-se um sistema de entrega para uso em uma técnica de terapia genéti-ca, sendo que o sistema de entrega compreende uma molécula de DNA quecodifica um agente de acordo com a invenção, sendo que a dita molécula deDNA é capaz de ser transcrita para resultar na expressão do agente selecio-nado.

De acordo com um sexto aspecto da presente invenção propor-ciona-se o uso de um sistema de entrega conforme definido no parágrafoanterior para uso na fabricação de um medicamento para uso na promoçãode regeneração epitelial.

De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção pro-porciona-se um método para promover a regeneração epitelial, sendo que ométodo compreende administrar em um paciente, necessitado de tratamen-to, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sistema de entrega con-forme definido no quinto aspecto da invenção.

Devido à degeneração do código genético, é claro que as se-qüências de ácido nucléico que codificam agentes adequados para uso deacordo com a invenção podem ser variadas ou alteradas sem afetar subs-tancialmente a seqüência do produto codificado pelas mesmas, para propor-cionar uma variante funcional destas. Conforme observado acima, um agen-te adequado para uso de acordo com a invenção deve manter a atividade depromoção de epitelial de TGF-P3.

As variantes codificadoras de nucleotídeos de TGF-p3 incluemaquelas que possuem uma seqüência alterada pela substituição de códonsdiferentes que codificam o mesmo aminoácido dentro da seqüência, destamaneira, produzindo uma alteração silenciosa. Outras variantes adequadassão aquelas que possuem seqüências de nucleotídeo homólogas, porémque compreende todas, ou partes de, seqüências que são alteradas pelasubstituição de códons diferentes que codificam um aminoácido com umacadeia lateral de propriedades biofísicas similares ao aminoácido que estassubstituem, para produzir uma alteração conservadora. Por exemplo, pe-quenos aminoácidos hidrofóbicos não-polares incluem glicina, alanina, Ieuci-na, isoleucina, valina, prolina e metionina. Grandes aminoácidos hidrofóbicosnão-polares incluem fenilalanina, triptofano e tirosina. Os aminoácidos neu-tros polares incluem serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina. Osaminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem lisina, arginina ehistidina. Os aminoácidos negativamente carregados (acídicos) incluem áci-do aspártico e ácido glutâmico.

Os sistemas de entrega de acordo com a invenção são altamen-te adequados para atingir níveis constantes de um agente de acordo com ainvenção em um sítio de dano epitelial durante um período mais longo detempo do que é possível com a maioria dos sistemas de entrega convencio-nais. Os agentes de acordo com a invenção adequados para promover aregeneração epitelial podem ser continuamente expressos de células no sítiode dano epitelial que foi transformado com a molécula de DNA descrita noquinto aspecto da invenção. Portanto, mesmo que o agente de acordo com ainvenção possua uma meia-vida muito curta in vivo, a quantidade terapeuti-camente eficaz do agente pode ser continuamente expressa a partir do teci-do tratado.

Ademais, o sistema de entrega da invenção pode ser usado paraproporcionar a molécula de DNA (e dessa forma, o agente de acordo com ainvenção) sem a necessidade de utilizar veículos farmacêuticos, tais como,aqueles requeridos em pomadas ou cremes que são colocados em contatocom o sítio de dano epitelial.

O sistema de entrega da presente invenção é tal que a moléculade DNA é capaz de ser expressa (quando o sistema de entrega for adminis-trado em um paciente) para produzir um agente de acordo com a invençãoque direta ou indiretamente possui atividade para promover a regeneraçãoepitelial. Por "diretamente" entende-se que o produto de expressão genéticaper se possui a atividade requerida para promover a regeneração epitelial.Por "indiretamente" entende-se que o produto de expressão genética sesubmete a ou media (por exemplo, como uma enzima) pelo menos uma rea-ção adicional para proporcionar um agente ativo eficaz para promover a re-generação epitelial.

A molécula de DNA pode estar contida dentro de um vetor ade-quado para formar um vetor recombinante. O vetor pode ser, por exemplo,um plasmídeó, cosmídeo ou fago. Tais vetores recombinantes são altamenteúteis nos sistemas de entrega da invenção para transformar células em umamolécula de DNA.

Os vetores recombinantes também podem incluir outros elemen-tos funcionais Por exemplo, os vetores recombinantes podem ser projetadosde modo que o vetor irá se replicar de forma independente no núcleo da cé-lula. Neste caso, os elementos que induzem a replicação de DNA podem serrequeridos no vetor recombinante. Alternativamente, o vetor recombinantepode ser projetado de modo que o vetor e molécula de DNA recombinantese integre no genoma de uma célula. Neste caso, as seqüências de DNAque auxiliam a integração almejada (por exemplo, por recombinação homó-loga) são desejadas. Os vetores recombinantes também podem possuirDNA que codifica genes que podem ser usados como marcadores selecio-náveis no processo de clonagem.

O vetor recombinante também pode compreender adicionalmen-te um promotor ou regulador para controlar a expressão do gene, como re-querido.

A molécula de DNA pode (porém, não necessariamente) seruma que se incorpora no DNA de células do indivíduo que será tratado. Ascélulas não-diferenciadas podem ser transformadas de forma estável resul-tando na produção de células-filhas geneticamente modificadas. Quandoeste for o caso, a regulação da expressão no indivíduo pode ser requerida,por exemplo, com fatores de transcrição específicos, ativadores genéticos oumais preferivelmente com promotores induzíveis que transcrevem o gene emresposta a um sinal especificamente encontrado em um sítio de dano epiteli-al. Alternativamente, o sistema de entrega pode ser projetado para auxiliar atransformação instável ou transitória de células diferenciadas no indivíduoque será tratado. Neste caso, a regulação de expressão pode ser menosimportante, pois a expressão da molécula de DNA irá parar quando as célu-las transformadas morrerem ou pararem de expressar a proteína (idealmen-te quando o sítio de dano epitelial for regenerado de forma eficaz).

O sistema de entrega pode fornecer a molécula de DNA a umindivíduo sem que esta seja incorporada em um vetor. Por exemplo, a molé-cula de DNA pode ser incorporada dentro de um Iipossoma ou partícula devírus. Alternativamente, a molécula de "nua" pode ser inserida na célula deum indivíduo através de um meio adequado, por exemplo, absorção endoci-tótica direta.

A molécula de DNA pode ser transferida para as células de umindivíduo que será tratado por transfecção, infecção, microinjeção, fusão ce-lular, fusão de protoplasto ou bombardeio balístico. Por exemplo, a transfe-rência pode ser por transfecção balística com partículas de ouro cobertas,lipossomas que contêm a molécula de DNA, vetores virais (por exemplo,adenovírus) e meio para proporcionar absorção de DNA direta (por exemplo,endocitose) por aplicação de DNA do plasmídeo diretamente em um sítio dedano epitelial de forma tópica ou por injeção.

O agente de acordo com a invenção expresso a partir da molé-cula de DNA pode ser um que regula direta ou indiretamente a expressãoe/ou atividade de TGF-P3, promovendo desta forma a regeneração epitelial.

Os métodos da invenção podem ser colocados em prática aoinduzir a expressão celular aumentada de um agente de acordo com a in-venção, podendo então promover a regeneração epitelial. Tal expressão te-rapêutica de um agente de acordo com a invenção pode ser obtida ao au-mentar a expressão naturalmente ocorrente do agente (por exemplo, a ex-pressão natural de um agente naturalmente ocorrente tal como TGF-p3, ouao induzir expressão não-natural do agente (por exemplo, indução de TGF-β3 por células que não expressam TGF-p3) ou induzir a superexpressão doagente.A expressão celular do agente de acordo com a invenção, sejaexpressão natural ou não-natural, pode ser por células epiteliais, que podemser células epiteliais existentes ao redor da área danificada, ou podem seralternativamente células epiteliais terapeuticamente introduzidas na áreadanificada (por exemplo, as células epiteliais endógenas e exógenas cultiva-das). Alternativamente, a expressão celular do agente de acordo com a in-venção pode ser efetuada pela expressão do agente por células em proximi-dade ou contato com o epitélio cuja regeneração será promovida. Por exem-plo, no caso onde se deseja promover a regeneração o agente de acordocom a invenção pode ser expresso por células localizadas na derme subja-cente que envolve o epitélio danificado.

Será avaliado que as células que serão introduzidas de formaterapêutica para promover a regeneração epitelial podem ser manipuladasex vivo tais como aquelas que expressam níveis aumentados de um agentede acordo com a invenção, e então introduzidas na área danificada. Confor-me descrito acima, tais células podem ser por si só células epiteliais, ou po-dem ser células que estão situadas suficientemente próximas ao epitélio da-nificado onde o agente expresso pelas células é capaz de promover a rege-neração epitelial desejada. As células podem ser, de preferência, célulascultivadas ex vivo para uso na preparação ou fabricação de pele artificial ousubstitutos de pele. As células podem ser, mais preferivelmente, células au-tólogas, embora será avaliado que qualquer células pode ser usada.

Conseqüentemente, em um oitava aspecto da invenção, propor-ciona-se um medicamento que compreende qualquer tipo celular relativo(por exemplo, epitelial, macrófago, monócito, fibroblasto, células-tronco ouendoteliais) induzido para expressar um agente de acordo com a presenteinvenção.

A indução de expressão celular de um agente de acordo com ainvenção pode ser efetuada por meio de sinais externos que influenciam ascélulas, ou por meio da incorporação nas células de ácido nucléico causan-do a expressão do agente de acordo com os quarto a seis aspectos da in-venção.A presente invenção será adicionalmente descrita nos seguintesExemplos não-limitativos 1 e 2. O Exemplo 1 ilustra a promoção de regene-ração epitelial por TGF-p3 de feridas de pele humana de espessura total,enquanto o Exemplo 2 mostra que TGF-p3 é capaz de promover regenera-ção epitelial em feridas de pele humana de espessura parcial.

Os Exemplos se refere às figuras em anexo, nos quais:

A figura 1, ilustra:

i) fotografias, tiradas nos pontos de tempo três e sete dias apóssofrer o ferimento, ilustrando a aparência macroscópica das feridas humanasde espessura total durante a regeneração epitelial; e

ii) macrófagos dos mesmos pontos de tempo que ilustram a his-tologia dos sítios danificados durante a regeneração epitelial.

A figura 1 mostra exemplos de imagens macroscópicas e histo-lógicas de feridas tratadas com 50ng/10C^L de TGFp3, Placebo ou tratamen-to padrão. Os resultados são mostrados em 3 e 7 dias após sofrer o ferimento.

Especificamente, os painéis AeB mostram respectivamente a-parência macroscópica e microscópica de feridas tratadas com TGF-p3 trêsdias após sofrer o ferimento. A análise da imagem histológica revela 54% dereepitelialização.

Os painéis CeD mostram, respectivamente, a aparência ma-croscópica e microscópica de feridas tratadas com placebo três dias apóssofrer o ferimento. A análise da imagem histológica revela 20% de reepitelia-lização.

Os painéis EeF mostram, respectivamente, a aparência ma-croscópica e microscópica de feridas tratadas com tratamento padrão trêsdias apos sofrer o ferimento. A análise da imagem histológica revela 19% dereepitelialização.

Os painéis GeH mostram, respectivamente, a aparência ma-croscópica e microscópica de feridas tratadas com TGF-p3 sete dias apóssofrer o ferimento. A análise da imagem histológica revela 100% de reepite-lialização.Os painéis I e J mostram, respectivamente, a aparência macros-cópica e microscópica de feridas tratadas com placebo sete dias após sofrero ferimento. A análise da imagem histológica revela 100% de reepitelialização.

Os painéis KeL mostram, respectivamente, a aparência ma-croscópica e microscópica de feridas tratadas com tratamento padrão setedias após sofrer o ferimento. A análise da imagem histological revela 100%de reepitelialização.

A figura 2, ilustra a comparação entre a porcentagem média dereepitelialização obtida em feridas tratadas com TGF-p3 e não-tratadas/tratadas com placebo em três dias e sete dias após sofrer a lesão.Os resultados mostrados são de reepitelialização de feridas tratadas com50ng/100 μL de TGF-p3, Placebo ou Tratamento Padrão em 3 e 7 dias apóssofrer o ferimento. Os resultados foram produzidos por análise de imagemde cortes histológicos. * Indica um resultado significativo como avaliado port-teste não-emparelhado (p=0,05).

A figura 3, mostra fotografias que ilustram a aparência macros-cópica, e dessa forma, progresso de regeneração epitelial, em feridas depele de espessura parcial durante 21 dias a partir do momento que sofreu alesão.

Os painéis A a I mostram as feridas tratadas com placebo nosdias 0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 15 e 21 respectivamente. Ao contrário dos Painéis J aR que mostram as feridas tratadas com TGF-p3 nos dias 0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 15e 21 respectivamente.

Exemplo 1

Efeitos de TGF-B3 sobre a Reepitelialização de Feridas de Espessura Totalem Humanos

Um estudo de Fase I sob aprovação do Comitê Ético local foirealizado, compreendendo um estudo em escala gradativa de dose primeiro-em-homem (FIM) em casos de dano epidérmico para determinar a dose má-xima tolerada (MTD) de TGF-P3 administrada por injeção intradérmica. Oestudo foi realizado como um estudo duplo cego, placebo (veículo) e trata-mento padrão controlado, randomizado, grupo paralelo para investigar a se-gurança clínica, tolerância, farmacocinética sistêmica e farmacodinâmicalocal de concentrações repetidas, em escala de TGF-β3 intradérmicas emindivíduos voluntários homens Caucasianos saudáveis com idade de 18 a 45anos (Número de Referência de Estudo e Protocolo: RN 1001 -319- 1001-001).

Um total de setenta e dois indivíduos participaram do estudo,com doses planejadas de TGF-p3 (e placebos perfeitamente compatíveis)sendo que 50ng/100μL, 100 ng/100μL, 500ng/100μL, 1000ng/100μί,10μρ/100μίθ ΙΟΟμο/ΙΟΟμί.

Os dados do estudo foram introduzidos em um banco de dadoscomplacente Regulador que foi fechado em 8 de dezembro de 2003 e o es-tudo randomizado não-cego (ou seja, códigos de randomização liberados)em 19 de dezembro de 2003.

Todos os indivíduos no estudo receberam duas biópsias incisio-nais de 3 mm de espessura total em cada braço e tratamento padrão emtodas as feridas. O tratamento padrão proporcionou tratamento ótimo paracura de ferida úmida em todos os casos. Ademais para o par de feridas nosbraços de cada indivíduo, as feridas receberam TGF-p3 versus placebo deTGF-P3, TGF-P3 versus nada (marcadas como tratamento padrão) ou place-bo de TGF-P3 versus nada (tratamento padrão). O desenho do estudo foi talque as comparações dos efeitos de tratamentos sobre feridas poderiam serfeitas no e entre os indivíduos ou seja, indivíduos atuados como seus pró-prios controles.

A substância de fármaco de volume de TGF-p3 usada no estudofoi fabricada em GMP continha ácido e álcoois como excipientes. Este mate-rial foi diluído em série para proporcionar seringas estéreis pré-carregadaspara injeção intradérmica no estudo (novamente fabricado em GMP). Asconcentrações de excipiente de ácido e álcool variaram devido ao processode diluição em série com as doses de injeção de TGF-p3 requeridas da subs-tância de fármaco de volume. Visto que os efeitos destes excipientes emconcentrações diferentes tanto sobre a segurança/tolerância como efeitossobre a cura em homens que não era conhecida, placebos perfeitamentecompatíveis também foram preparados em to GMP da mesma maneira (ouseja, os excipientes continham placebo em concentrações equivalentes, po-rém não proteína TGF-p3). Isto também permitiu a comparação dos placebosperfeitamente compatíveis para tratamento padrão separadamente, parademonstrar se os próprios excipientes apresentavam algum efeito colateralna cura.

O desenho de estudo era tal que 9 indivíduos em cada grupo dedose foram submetidos a duas biópsias incisionais em cada braço que foitratado tanto com TGF-p3, placebo como tratamento padrão como descritoacima. Para cada braço do indivíduo os dois sítios de biópsia foram marca-dos sobre o aspecto interno e sob anestesia local com TGF-p3, placebo ounada (tratamento-padrão) injetado de forma intradérmica no sítio. Uma bióp-sia incisional de espessura total de 3 mm foi então obtida de cada sítio mar-cado. Um dia depois de sofrer o ferimento os sítios foram então tratados no-vamente, como acima, com o mesmo tratamento, ou seja, TGF-p3, placeboou nada (tratamento padrão) sob anestesia local. As feridas foram então ex-cisadas tanto 3 como 7 dias após sofrer o ferimento para histologia, parapermitir a análise dos efeitos de tratamento sobre a cura da ferida 3 e 7 diasapós biópsias incisionais iniciais. Os indivíduos foram então acompanhados.Os dados de segurança e tolerância foram coletados durante o estudo.

As feridas foram excisadas, histologicamente processadas emblocos de cera de parafina, tecido cortado e então analisadas para reepitelia-lização utilizando análise de imagem. Um total de 36 feridas foram geradasdesta maneira em cada grupo de dose de modo que um total de 16 feridas16 foram tratadas com TGF-p3, 10 feridas com placebo e 10 feridas com tra-tamento padrão. Isto resultou nos seguintes números de ferida por tratamen-to em dois pontos de tempo diferentes após sofrer o ferimento para análisehistológica:

8 feridas tratadas com TGF-p3, 5 feridas tratadas com placebo e5 feridas tratadas com tratamento padrão excisadas 3 dias após sofrer o fe-rimento.8 feridas tratadas com TGF-p3, 5 feridas tratadas com placebo e5 feridas tratadas com tratamento padrão excisadas 7 dias após sofrer o fe-rimento.

A porcentagem de reepitelialização em sítios de dano epidérmi-co foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

% de reepitelialização = (diâmetro total da ferida - diâmetro de ferida não-epitelializada) χ100 diâmetro total da ferida

Resultados

Aceleração de Reepitelizacão em Feridas de Espessura Total em Humanospor TG F-Ba.

Ilustra-se na figura 1 a progressão da regeneração epidérmicaem feridas de espessura total, que inclui:

iii) Fotografias, tiradas em três pontos de tempo e sete dias pós-ferimento, que ilustra a aparência macroscópica das feridas de espessuratotal durante a regeneração epitelial;e

iv) micrografias dos mesmos pontos de tempo que ilustram ahistologia dos sítios feridos durante a regeneração epitelial.

A análise de cortes histológicos demonstra que a reepitelizaçãoequivalente das feridas ocorreu em placebo e o controle de cuidado-padrãotratou as feridas em ambos os pontos de tempo pós-ferimento e, como tal,estes grupos foram combinados para se compararem com as feridas trata-das com TGF-P3.

Pode-se ver a partir da figura 1 que o tratamento com TGF-p3 deferidas de pele de espessura total é capaz de promover a regeneração epite-liai, levando à reconstituição da epiderme mais cedo do que no caso de feri-das não tratadas ou tratadas com placebo.

Os resultados do Exemplo 1 são mostrados na figura 2, quecomparam a porcentagem reepitelização média em feridas tratadas comTGF-p3 e não tratadas/tratadas com placebo em três e sete dias pós-lesão.

A figura 2 ilustra claramente que o tratamento com TGF-p3 emuma concentração de 50ng/1 00μΙ_ acelerou, de forma significativa, a reepite-lização quando comparada com a reepitelização que ocorre em feridas decontrole. A promoção da regeneração epitelial em feridas tratadas com fár-maco versus controle também foram observada em indivíduos que recebe-ram TG F-P3 até (50ng/100μΙ_).

Exemplo 2

Efeitos de TGF-Bs na Reepitelizacão de Feridas Humanas de EspessuraParcial/Sítios Doadores de Enxerto de Pele

Um estudo-piloto (não cego) foi realizado sob a aprovação doComitê Ético local para investigar os efeitos de aplicações intradérmicas etópicas de TGF-P3 quando aplicadas para dividir os sítios doadores de en-xerto de pelo em dois indivíduos humanos voluntários Caucasianos do sexomasculino com idade entre 18 e 45 anos. A concentração de TGF-p3 usadafoi de 50ng/100μΙ_ e a taxa de regeneração epitelial alcançada foi compara-da com um placebo perfeitamente combinado com TGF-p3 na concentraçãoequivalente. Conforme descrito acima, ou o TGF-p3, ou placebo foram pre-parados em GMP.

Os sítios doadores foram primeiramente identificados e marca-dos em cada lateral da linha intermediária na parte traseira inferior, cada ummedindo 1,5 por 2 cm e, então, infiltrados com anestésico local contendo 1em 200.000 de adrenalina. Cada sítio recebeu depois uma injeção intredér-mica, de modo que uma lateral receba TGF-p3 em uma dose de 50ng/cm2 ea outra lateral receba placebo perfeitamente combinado. Depois, os indiví-duos repousaram de barriga para baixo por 30 minutos antes um enxerto depele de espessura grossa dividida de aproximadamente 0,55 mm foi coleta-do a partir de cada um dos sítios marcados, sendo que a hemostasia é al-cançada com pressão moderada. Seguindo imediatamente a coleta de en-xerto, foi administrado a cada sítio doador uma aplicação tópica, ou de TGF-β3, ou de placebo, depois foram feitos curativos nas feridas e os indivíduosforam liberados. Os indivíduos retornaram no próximo dia e receberam umanova aplicação tópica, ou de TGF-p3, ou de placebo, de modo que em todosos estágios cada ferida receba o mesmo tratamento, isto é, três aplicaçõesde TGF-p3 ou três aplicações de placebo. Os indivíduos então examinadosem uma base diária por um período de duas semanas e depois em 21 dias,com acompanhamento subseqüente.

Resultados:

Aceleração de Reepitelializacão de Feridas de Espessura Parcial/Sítios Do-adores de Enxerto de Pele em Humanos por TGF-Bri.

A análise macroscópica, avaliada utilizando fotografias dos sítiosdanificados, demonstrou que TGF-p3 acelerou notoriamente a promoção deregeneração epidérmica, aumentando a taxa de reepitelialização em sítiosdoadores de enxerto de pele de espessura parcial, como comparada com ataxa ocorrente em controles tratados com placebo, até 8 dias após sofrer oferimento.

A figura 3 mostra fotografias que ilustram a aparência macros-cópica, e dessa forma, o progresso de regeneração epitelial, em feridas depele de espessura parcial durante 21 dias do momento da lesão. As fotogra-fias que mostram a promoção de regeneração epitelial são marcadas comum asterisco (*) na figura 3.

Pode ser observado que 15 dias e 21 dias após sofrer o ferimen-to a diferença entre ferida tratada com TGF-P3 e não-tratada/tratada complacebo é menos visível macroscopicamente. Este efeito é explicado pelofato de que os sítios tratados com TGF-p3 são totalmente reepitelializadosem ou antes de 8 dias, enquanto os sítios tratados com placebo apenas a-tingem o mesmo grau de reepitelialização em torno de 15 dias.

Conclusões (Exemplos 1 & 2).

Os resultados estabelecidos acima mostram surpreendentemen-te que um elemento específico da família TGF-β, TGF-p3, é capaz de pro-mover regeneração epitelial. Esta descoberta está em contraste direto comaquela que o versado na técnica poderia esperar à luz da técnica anterior,uma vez que relatórios anteriores sugeriram que os elementos da família deTGF-p3 inibem a regeneração da epiderme em feridas de pele, com a iso-forma de TGF-p3 sendo o inibidor mais potente deste processo. A promoçãode regeneração epitelial ocorrida por tratamento com TGF-p3 é atingida tantoem feridas de espessura total como feridas de espessura parcial (que po-dem, por exemplo, servir como sítios doadores de enxerto de pele). Os efei-tos terapêuticos em seres humanos são observados em tratamento comTGF-p3 utilizando doses de até 500ng/10(^L do agente ativo.

Apêndice

Formulações.

Detalhes das formulações usadas em estudos clínicos para es-tabelecer a capacidade de agentes que possuem atividade de TGF-p3 parapromover a regeneração epitelial são proporcionados sob os seguintes títulos.

A substância de fármaco TGF-p3 usada nos estudos foi fornecidaem uma concentração de 9,1mg/mL em 20 mM de ácido acético e 20% deálcool de isopropila. Este material foi diluído em série para produzir seringasque contêm TGF-p3 nas concentrações estabelecidas nos dados exempla-res. Será avaliado pelo versado na técnica que, independente dos diluentesadicionais usados para produzir as soluções finais, níveis traço de ácido acé-tico e álcool de isopropila serão conduzidos por diluição serial.

A1. Formulações usadas em tratamento de biópsia incisional (feridas dérmi-cas de espessura total)

Para estudos de biópsia incisional/ferida de espessura total asubstância de fármaco foi diluída em PBS que contém 5% p/v de manitol, eajustada para pH 3,8 utilizando ácido acético. Esta formulação foi considera-da eficaz na promoção de regeneração epitelial. A guisa de uma alternativapara a formulação baseada em manitol descrita acima, uma formulação ba-seada em maltose (descrita de forma mais completa abaixo) também foipreparada. Esta formulação de agentes de acordo com a invenção em com-binação com maltose foi surpreendentemente considerada para reduzir deforma dramática a dor associada com injeção da composição. Os estudosrealizados pelos inventores mostraram clinicamente que a dor associadacom injeção de formulação baseada em manitol no estudo de biópsia incisi-onal foi aliviada quando agentes de acordo com a invenção foram formula-dos na presença de açúcares, e em particular na presença de concentraçõesisotônicas de maltose.

As análises in vitro da eficácia das formulações baseadas emmaltose e baseadas em manitol revelaram uma vantagem surpreendenteadicional das composições que compreendem agentes ativos de acordo coma invenção em combinação com maltose. A investigação utilizando um en-saio ELISA e um ensaio Mink Lung Epitelial Cell para comparar a formulaçãode PBS/manitol com a formulação de 0,25M de maltose mostra que a formu-lação de maltose resulta em um aumento de aproximadamente 4 dobras ematividade de TGF-p3.

A2. Formulações usadas no tratamento de sítios doadores de enxerto depele de espessura dividida:

Para este estudo TGF-p3 foi formulado em 0,25 M de maltose(ou seja, 90 g de maltose por litro de água para injeção, equivalente a 9%(p/v) de maltose em água para injeção.

Esta formulação foi aplicada tanto de forma intradérmica comotópica para promover a regeneração epitelial.

REFERÊNCIAS

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Claims

1. Uso de um agente que possui atividade TGF-P3, caracterizadopelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a promoção de re-generação epitelial.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o agente é TGF-P3.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o agente é um fragmento, derivado ou variante de TGF-p3.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o agente é uma substância capaz de promover e/ou imitar a atividadebiológica de TGF-P3.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a regeneração epitelial está em um local deum ferimento agudo.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a regeneração epitelial é de um paciente jo-vem e/ou saudável.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a regeneração epitelial que será promovida éum epitélio escamoso estratificado.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fatode que o epitélio é a epiderme.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fatode que o epitélio é o epitélio corneano.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que o epitélio é um epitélio respiratório.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que o epitélio é o epitélio da região das cavidadesdo abdômen, torácicas ou pélvicas.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11,caracterizado pelo fato de que o medicamento serve para a promoção deregeneração epitelial após lesão.

13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o medicamento serve para a promoção de regeneração epitelialapós cirurgia.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que a cirurgia compreende enxerto epitelial.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que a cirurgia compreende:i) remoção de enxerto epitelial;ii) opcionalmente emaranhamento do enxerto epitelial; eiii) aplicação do enxerto em um sítio receptor.

16. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que o medicamento serve para administração no sítio doador de en-xerto.

17. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que o medicamento serve para administração no sítio receptor deenxerto.

18. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que o medicamento serve para administração no enxerto.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a-18, caracterizado pelo fato de que a cirurgia compreende enxerto de pele.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelofato de que o enxerto de pele é um enxerto de pele de espessura total.

21. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelofato de que o enxerto de pele é um enxerto de pele de espessura parcial.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21,caracterizado pelo fato de que o medicamento serve para a promoção deregeneração epitelial após lesão por queimadura.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22,caracterizado pelo fato de que o medicamento é para aplicação tópica.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23,caracterizado pelo fato de que o medicamento é para injeção local.

25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23,caracterizado pelo fato de que o medicamento é um creme ou pomada.

26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25,caracterizado pelo fato de que a promoção de regeneração epitelial é pro-moção profilática.

27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,ou 7 a 26, caracterizado pelo fato de ser para a promoção de um medica-mento para promover regeneração epitelial comprometida, inibida, atrasadaou de outra maneira defeituosa.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26,caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento paraacelerar a regeneração epitelial normal.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28,caracterizado pelo fato de ser a preparação de um medicamento para pro-mover regeneração epitelial em idosos.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29,caracterizado pelo fato de que o agente é formulado na presença de maltose.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que a maltose está presente em uma concentração entre 0,1 M e 0,4M de maltose.

32. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que a maltose está presente em uma concentração de 0,25 M demaltose.