ES2890623T3 - Uso del análogo de APC para curar heridas - Google Patents

Abstract

APC-3K3A para uso en el tratamiento de una herida dérmica, en donde el tratamiento comprende la etapa de puesta en contacto de una herida dérmica con una cantidad efectiva de APC-3K3A.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso del análogo de APC para curar heridas

Campo de la invención

La invención se refiere a la reparación y curación de heridas, particularmente a heridas dérmicas o cutáneas que incluyen, pero no se limitan a, heridas agudas y crónicas, quemaduras y úlceras.

Antecedentes de la invención

La referencia a cualquier estado de la técnica en la memoria descriptiva no es un reconocimiento o sugerencia de que este estado de la técnica forma parte del conocimiento general común en cualquier jurisdicción o que se pueda esperar razonablemente que este estado de la técnica se entienda, considere relevante y/o sea combinado con otras piezas de la técnica anterior por un experto en la materia.

En el adulto, la respuesta normal a una lesión suele ser la reparación de la herida. La reparación de heridas se ha descrito clásicamente como que sigue tres fases distintas que consisten en una fase inicial en la que se forma un coágulo de fibrina, una fase intermedia en la que se lisa el coágulo de fibrina y se deposita una matriz temporal que consiste en proteoglicano, glucoproteína y colágeno de tipo III, y una fase final en la que la fase temporal se digiere y se sustituye por una matriz rica en colágeno de tipo I.

Factores locales como el tipo, el tamaño y localización de la herida, suministro vascular a la herida, presencia de infección, movimiento local y exposición a radiación y luz UV influyen en la reparación de la herida, al igual que los factores sistémicos, incluido el estado del rendimiento cardiovascular, infección, estado metabólico y hormonas.

Se acepta generalmente que una respuesta fisiológica normal a una lesión es un proceso de reparación de la herida que se completa con evidencia de depósito de colágeno tipo I aproximadamente a las 3 a 4 semanas de la lesión. Una prolongación del proceso de reparación de la herida más allá de este tiempo aumenta la probabilidad de formación de una herida crónica.

Si bien se debate el papel de la inflamación en la cicatrización de heridas, en general se reconoce que es importante contener la inflamación durante la curación de heridas en términos de la gravedad y duración de la inflamación. En particular, se ha observado que una ausencia de inflamación en la curación de heridas está relacionada con la regeneración, mientras que la presencia de inflamación da como resultado cierto grado de fibrosis y formación de cicatriz. Además, la inflamación prolongada puede conducir a una inflamación crónica y, en lo que respecta a las heridas cutáneas, la falta de cierre adecuado de una herida y la ulceración.

Se ha demostrado que la aplicación tópica de proteína C activada (APC) proporciona mejoras en heridas cutáneas, incluidas úlceras dérmicas, quemaduras, heridas de la boca, daños en los huesos y cartílagos, heridas de los ojos y necrosis cutánea relacionada con la warfarina. De acuerdo con el documento WO2002/100445, son las funciones anticoagulantes y antiinflamatorias de la APC las que indican claramente que la APC es útil para el tratamiento de heridas dérmicas y, en particular, para el tratamiento de heridas de curación lenta. El documento WO2002/100445 también analiza que las funciones de activación de gelatinasa A mediadas por APC son importantes para la reparación de heridas mediada por APC.

Además de las funciones anticoagulantes y antiinflamatorias, también se sabe que la APC tiene una función antiapoptótica. Se sabe que la función antiapoptótica es independiente de la función anticoagulante y, en particular, se sabe que al menos 3 restos de lisina en el bucle 37 de APC son esenciales para la escisión del factor Va mediada por APC, mientras que estos restos no son requeridos para la actividad citoprotectora antiapoptótica que surge de la activación de PAR-1 mediada por APC Mosnier y Griffin 2006 Frontiers in Bioscience 112381-2399.

Si bien se cree que la función antiinflamatoria de APC surge de la activación mediada por APC de al menos EPCR y posiblemente pAR-1, posiblemente conduciendo a una activación reducida de leucocitos, liberación disminuida de citocinas inflamatorias, extravasación reducida de células inflamatorias en sitios inflamatorios, se desconoce(n) el(los) mecanismo(s) de la(s) interacción(interacciones) mediada(s) por APC y, en particular, el(los) sitio(s) de conformación relevantes de APC requeridos para la función antiinflamatoria. Mosnier supra. Además de las interacciones mediadas por el receptor de APC, también se ha pensado que la actividad antiinflamatoria de APC bien podría explicarse por su capacidad para regular a la baja la generación de las proteasas de la vía de coagulación, vinculando potencialmente la actividad antiinflamatoria y la actividad anticoagulante.

APC-3K3A es un análogo de APC en el que se han eliminado los 3 restos de lisina en el bucle 37 de APC relevantes para la escisión del Factor Va, lo que permite que el análogo proporcione una función antiapoptótica al tiempo que elimina la función anticoagulante. Este análogo se preparó con el único propósito de proporcionar una actividad citoprotectora completa en afecciones que implican apoptosis (incluidos accidentes cerebrovasculares y trastornos neurodegenerativos) al tiempo que se reduce el riesgo de hemorragia. Mosnier supra.

Sigue existiendo una necesidad de mejoras en la reparación de heridas dérmicas, en particular para mejorar el tiempo de reparación de heridas, para mejorar la velocidad de reparación de heridas en particular acelerando la reparación de heridas, o para mejorar la calidad de un tejido que surge de la reparación de heridas.

Sumario de la invención

La invención busca abordar una o más de las necesidades mencionadas anteriormente y describe un método para el tratamiento de una herida dérmica que incluye la etapa de poner en contacto una herida dérmica con una cantidad efectiva de APC-3K3A, tratando así la herida dérmica.

La invención proporciona APC-3K3A para uso en el tratamiento de una herida dérmica, en donde el tratamiento comprende la etapa de poner en contacto una herida dérmica con una cantidad eficaz de APC-3K3A. También se describe un método para disminuir el área de la herida o el volumen de una herida dérmica que incluye la etapa de poner en contacto una herida dérmica con una cantidad eficaz de APC-3K3A, disminuyendo así el área de la herida o el volumen de la herida dérmica.

También se describe un método para acelerar la velocidad de curación de heridas, o disminuir el tiempo para completar la curación de heridas o el cierre de heridas que incluye la etapa de puesta en contacto de una herida dérmica con una cantidad efectiva de APC-3K3A, acelerando así la velocidad de curación de heridas o disminuyendo el tiempo hasta la finalización de la curación de la herida o el cierre de la herida.

También se describe un método para acelerar la velocidad de curación de heridas durante los primeros 3 a 7 días, preferiblemente los primeros 3 a 5 días, preferiblemente los primeros 3 días después de la formación de la herida, que incluye la etapa de poner en contacto una herida dérmica después de la formación de la herida con un cantidad efectiva de APC-3K3A, acelerando así la velocidad de curación de la herida. La cantidad eficaz de APC-3K3A puede ponerse en contacto con la herida dérmica dentro de las 48 horas, preferiblemente dentro de las 24 horas o dentro de las 12 horas desde la formación de la herida. Típicamente, la velocidad de curación de la herida se acelera en relación con una herida no tratada, o en relación con una herida que ha sido tratada con una cantidad equivalente de APC.

También se describe un método para inducir o promover o iniciar un mecanismo de reparación de heridas en una herida dérmica que incluye la etapa de puesta en contacto una herida dérmica con una cantidad eficaz de APC-3K3A, induciendo o promoviendo o iniciando así un mecanismo de reparación de heridas en una herida dérmica. En esta realización, la herida puede ser una herida crónica que carece de, o que tiene un mínimo de mecanismos activos de reparación de heridas.

También se describe un método para minimizar la inflamación asociada con la reparación de heridas que incluye la etapa de puesta en contacto una herida dérmica con una cantidad eficaz de APC-3K3A, minimizando así la inflamación asociada con la reparación de heridas.

También se describe un uso de APC-3K3A en la fabricación de un medicamento para tratar una herida dérmica.

También se describe el uso de APC-3K3A para tratar una herida dérmica.

En otra realización, se proporciona APC-3K3A o una formulación que lo contiene, incluida una cantidad efectiva de APC-3K3A para uso en el tratamiento de una herida dérmica.

En las realizaciones descritas anteriormente, la herida típicamente no está asociada con una apoptosis significativa. Típicamente, la herida dérmica no se caracteriza por una apoptosis significativa o no surge de la apoptosis.

En las realizaciones descritas anteriormente, la cantidad efectiva de APC-3K3A puede administrarse tópicamente a la herida, poniendo en contacto así la herida con la APC-3K3A.

En otra realización, se proporciona una formulación para uso en el tratamiento de una herida dérmica, en donde la formulación incluye APC-3K3A. En esta realización, la formulación está adaptada para la aplicación tópica a una herida dérmica. La formulación puede estar en forma de gel, pomada, loción o spray.

También se describe un dispositivo, artículo de cuidado personal o apósito formulado o adaptado para el tratamiento o manejo de una herida dérmica que incluye una cantidad efectiva de APC-3K3A para el tratamiento o manejo de una herida dérmica. En esta realización, la APC-3K3A puede proporcionarse en forma de gasa, malla, esponja o vendaje.

En las realizaciones descritas anteriormente, la herida dérmica puede ser una herida crónica o aguda y puede surgir de laceración, quemadura, incisión, maceración, aplastamiento, abrasión, punción o lesión similar.

Otros aspectos de la presente invención y otras realizaciones de los aspectos descritos en los párrafos precedentes resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción, dada a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Disminuciones en el área de la herida como un porcentaje de la herida original en ratones tratados con APC, APC-3K3A.

Figura 2. Mejoras en la reparación de heridas en ratones tratados con APC y APC-3K3A.

Figura 3. APC-3K3A tiene una mayor potencia para disminuir el área de la herida que APC.

Figura 4. APC-3K3A aumenta la velocidad de curación de heridas en comparación con APC.

Figura 5. APC-3K3A y APC aumentan la velocidad de curación de heridas en comparación con placebo.

Figura 6. Secuencias de aminoácidos de APC-3K3A.

Descripción detallada de las realizaciones

Se entenderá que la invención descrita y definida en esta memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas diferentes combinaciones constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.

Como se discutió anteriormente, APC -3K3A es un análogo de APC en el que se han eliminado los 3 restos de lisina en el bucle 37 de APC relevantes para la escisión del Factor Va, lo que permite que el análogo proporcione una función antiapoptótica al tiempo que elimina la función anticoagulante. La secuencia de APC-3K3A se muestra en la Figura 6.

APC-3K3A se preparó con el único propósito de proporcionar una actividad citoprotectora completa en afecciones que implican apoptosis (incluidos accidentes cerebrovasculares y trastornos neurodegenerativos) al tiempo que se reduce el riesgo de hemorragia. Mosnier supra. De acuerdo con el documento WO2005/007820, APC-3K3A está diseñada para permitir su uso para prevenir o aliviar el daño asociado al menos en parte con la apoptosis, que incluye en sujetos con riesgo de daño a los vasos sanguíneos o al tejido de diversos órganos causado al menos en parte por la apoptosis. Ver también los documentos WO2008/055145, WO2008/073603; Wang et al., 2012 Stroke 43:2444-2449; y Guo et al., 2009 Eur. J. Neurosci. 29:1119-1130.

Los inventores han encontrado que APC-3K3A puede usarse para mejorar la reparación de heridas dérmicas. El hallazgo es particularmente sorprendente dado que la apoptosis generalmente no se considera un mecanismo celular que respalde la reparación de heridas dérmicas o que esté implicado en la patología de la herida, incluida la formación de una herida crónica.

Este hallazgo se ha realizado en circunstancias en las que, antes de la invención, se entendía que al menos la actividad anticoagulante de la APC era relevante para la reparación de heridas dérmicas, y había escasez de conocimiento sobre si la eliminación de la función anticoagulante afectaría a la actividad de la gelatinasa A y a la función antiinflamatoria de la APC necesaria para la reparación de una herida dérmica.

Un hallazgo particularmente sorprendente de la invención es que APC-3K3A se puede utilizar para proporcionar una respuesta de reparación de heridas dérmicas mejorada con respecto a la observada con la función anticoagulante de APC. Específicamente, como se muestra en los ejemplos en este documento, los inventores han descubierto que APC-3K3A se puede usar para acelerar la velocidad de curación de heridas y reducir el tiempo de curación de heridas en modelos de escisión in vivo. Por tanto, en una realización se proporciona un método para el tratamiento de una herida dérmica que incluye la etapa de poner en contacto una herida dérmica con una cantidad efectiva de APC-3K3A, tratando así la herida dérmica.

En el método descrito anteriormente, el individuo puede tener riesgo de reparación de heridas deteriorada o curación de heridas deteriorada. En particular, el individuo puede tener factores de riesgo sistémicos o locales para la reparación prolongada de heridas. Los factores de riesgo sistémicos incluyen infección sistémica, síndrome metabólico, diabetes o intolerancia a la glucosa, función cardiovascular deteriorada. Los factores de riesgo locales incluyen los relacionados con la lesión, incluida la naturaleza de la lesión en sí (por ejemplo, un traumatismo o quemadura), inflamación anormal, estrés físico repetido por el movimiento o exposición a la radiación UV.

La invención puede incluir la etapa de evaluar a un individuo para determinar si el individuo o el lugar de la lesión tiene uno o más factores de riesgo sistémicos o locales descritos anteriormente para un proceso de reparación de heridas deteriorado. Típicamente, se evalúa al individuo para determinar uno o más factores de riesgo sistémicos o locales aplicables a la formación de una herida crónica como los descritos en este documento.

Cuando se evalúa que el individuo tiene uno o más factores de riesgo locales o sistémicos para un proceso de reparación de heridas deteriorado, el método puede incluir la etapa adicional de seleccionar al individuo para el tratamiento con APC-3K3A para minimizar la probabilidad de inicio de un proceso de reparación de heridas deteriorado.

Típicamente, la lesión es una que surge de una agresión al tejido dérmico, cutáneo o tejido de la piel. La agresión puede afectar a todas las capas del tejido dérmico, por ejemplo, al estrato basal (estrato germinativo), estrato espinoso, estrato granuloso, estrato lucidum. Ejemplos de lesiones particulares incluyen laceración, abrasión, ruptura, quemadura, contusión, compresión.

La lesión puede ser una quemadura, incluida una quemadura de primer, segundo o tercer grado.

Típicamente, la lesión es una lesión aguda.

En una realización, la lesión puede no estar asociada con una inflamación crónica.

Típicamente, la lesión no se asocia con fibrosis.

Típicamente, la lesión no es un trastorno inflamatorio, un trastorno alérgico o un trastorno o enfermedad idiopática.

La APC-3K3A se puede aplicar en el sitio de la lesión del tejido antes de que el proceso de reparación de la herida haya formado un coágulo de fibrina. En otra realización, la APC-3K3A puede aplicarse al sitio de la lesión del tejido antes de que el proceso de reparación de la herida haya formado una matriz temporal. En otra realización, la APC-3K3A puede aplicarse al sitio de la lesión del tejido antes de que el proceso de reparación de la herida haya formado una matriz final. Típicamente, la APC-3K3A se aplica aproximadamente en el momento de la formación de la matriz temporal o poco después.

Típicamente, el individuo se trata con APC-3K3A para que se complete la reparación de la herida en aproximadamente 3 a 4 semanas de la lesión del tejido.

No obstante lo anterior, los expertos en la técnica entienden que la cantidad de dosificación de APC-3K3A variará con la enfermedad o afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad o afección, el(los) tipo(s) de administración local, la velocidad de excreción del compuesto, la duración del tratamiento, la identificación de cualquier otro fármaco que se administre al animal, edad, tamaño y especie del animal, y factores similares conocidos en la técnica médica. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto o combinación de compuestos será aquella cantidad que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. La cantidad de dosificación, la forma de dosificación y el modo de administración serán determinados por un médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. Las cantidades de dosificación, formas de dosificación y modos de administración efectivos para los diversos compuestos y combinación(combinaciones) de compuestos se pueden determinar empíricamente y la realización de tales determinaciones está dentro del conocimiento de la técnica.

En determinadas realizaciones, es importante que se proporcione la APC-3K3A para permitir el contacto de APC-3K3A con las células de la piel como se describe en el presente documento en el sitio de la lesión tisular, ya que, aunque no se desea quedar limitado por hipótesis, se cree que es mediante este contacto que la APC-3K3A proporciona mejoras en la curación de heridas. Generalmente, aquellas células que se han puesto en contacto con APC-3K3A pueden reconocerse por tener las siguientes características: proliferación aumentada y apoptosis disminuida; caspasa-3 disminuida; activación de los receptores 1, 2 o 3 activados por proteasa; activación reducida de NF-kB; activación reducida de la molécula de señalización, p38; secreción reducida de TNF; proteína metaloproteinasa de matriz (MMP)-2 aumentada y activación; MMP-9 reducido; esfingoisina-1-fosfato aumentada; angiopoyetina (Ang) 1 aumentada y Ang 2 disminuida; activación de Tie2 aumentada; activación de la molécula de señalización Akt. Por tanto, se puede establecer el contacto de las células con APC-3K3A y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento mediante la evaluación de estos fenotipos celulares.

En una realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de APC-3K3A puede prevenir o inhibir la formación de una cicatriz patológica en un individuo. Este resultado puede evaluarse mediante las medidas cualitativas o cuantitativas que se analizan a continuación.

En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva de APC-3K3A es de 0,1 pg a 5000 pg de APC-3K3A por cm2 de la región de piel a la que se aplica APC-3K3A, o de 1 pg a 2000 pg de APC-3K3A por cm2 de la región de piel a la que se aplica APC-3K3A, o de 10 pg a 1000 pg de APC-3K3A por cm2 de la región de piel a la que se aplica APC-3K3A, o de 10 pg a 200 pg, o de 10 pg a 400 pg, o de 10 pg a 800 pg de APC-3K3A por cm2 de la región de piel a la que se aplica APC-3K3A

La APC-3K3A puede administrarse una vez por semana hasta dos veces al día, dependiendo de la naturaleza de la lesión tisular. Por lo general, se proporciona durante no más de 20 semanas de días consecutivos, o desde no más de 6 semanas de días consecutivos.

Los métodos de tratamiento tópico, por ejemplo, usando una pasta, gel, crema, aceite, loción, espuma, ungüento o una sustancia similar, son particularmente útiles cuando la región de la piel relevante es una que contiene una superficie cutánea rota, ya que esto permite la penetración de la APC-3K3A a los estratos relevantes del tejido de la piel donde residen los fibroblastos.

En una realización, la cantidad terapéuticamente eficaz de APC-3K3A puede ser de 0,1 a 2000 pg, preferiblemente de 20 a 200 pg de APC-3K3A por cm2 de la región de la piel. Generalmente, se prefiere una cantidad mayor cuando la piel está más gravemente afectada, o cuando el individuo tiene un riesgo particular debido a la presencia de factores locales o sistémicos para la reparación de heridas deteriorada, como se describió anteriormente. Se pueden preferir cantidades menores cuando la piel no se ve gravemente afectada.

La concentración de APC-3K3A en la formulación puede estar entre aproximadamente 10 g/ml y 1 mg/ml y el volumen de composición aplicado a la región de la piel es aproximadamente de 100 I a 10 ml.

En una realización, una formulación que incluye APC-3K3A como componente activo para la curación o reparación de heridas incluye aproximadamente 200 a 600 pg de APC-3K3A, preferiblemente aproximadamente 200 a 250 pg de APC-3K3A, más preferiblemente 250 pg de APC-3K3A o 500 pg de APC-3K3A. Se cree que esta cantidad de APC-3K3A proporciona una aceleración de la curación de heridas que es generalmente mayor que la observada con APC solo, particularmente cuando el área de la herida es menor que 20 cm2. Así, en otra realización se proporciona un método para el tratamiento de una herida dérmica que incluye la etapa de puesta en contacto de una herida dérmica con aproximadamente 200 a 600 pg de APC-3K3A, preferiblemente aproximadamente 200 a 250 pg de APC-3K3A, más preferiblemente 250 pg de APC-3K3A, o 500 pg de APC-3K3A, tratando así la herida dérmica. Cuando el área de la herida es mayor que 20 cm2 se requieren cantidades mayores de APC-3K3A, particularmente de aproximadamente 600 a 1000 pg de APC-3K3A, preferiblemente de aproximadamente 800 a 1000 pg de APC-3K3A. Por tanto, en otra realización se proporciona un método para el tratamiento de una herida dérmica que incluye la etapa de puesta en contacto de una herida dérmica con aproximadamente 600 a 1000 pg de APC-3K3A, preferiblemente aproximadamente 800 a 1000 pg de APC-3K3A. En estas realizaciones, la formulación se puede proporcionar en una forma adecuada para la administración tópica o parenteral.

La composición se puede proporcionar a la piel generalmente con una superficie estéril, tal como un dedo o una espátula en una capa de no más de aproximadamente 10 mm de espesor, preferiblemente de aproximadamente 3 mm de espesor. Luego se puede frotar o masajear en la región de la piel y el área circundante. La aplicación es generalmente de una vez al día a una vez por semana, y generalmente no más de 20 semanas, o no más de 12 semanas.

En una realización, la composición que contiene APC-3K3A se puede aplicar a un sustrato sólido, es decir, un vendaje, apósito o similar, y luego se fija el sustrato a la región de la piel relevante.

En determinadas realizaciones, los resultados anteriores se obtienen estableciendo una concentración local de APC-3K3A al menos 2 veces mayor que la línea basal de APC. Esta cantidad de APC-3K3A y APC puede medirse midiendo la actividad de APC-3K3A y APC de la biopsia de piel usando ELISA y el ensayo de sustrato cromogénico Spectrozyme PCa como se mencionó anteriormente. La inyección intradérmica o subcutánea se prefiere generalmente como vía de administración cuando el estrato córneo está intacto y es de tal naturaleza que existe una penetración limitada de APC-3K3A a través de la capa de piel. Generalmente se puede usar una aguja de calibre fino en una aguja (-28-34G) en una jeringa de 0.3 a 1 ml. Se pueden administrar múltiples inyecciones para cubrir el área de la superficie de la piel, con ~1 inyección por cm2. La cantidad por inyección variará de 10 pl a 1 ml, siendo la cantidad típica de 50 pl. Generalmente, la administración se administra de una vez al día a una vez por semana, y generalmente no más de 20 semanas. La inyección intradérmica o subcutánea se puede utilizar concurrentemente con la aplicación tópica de APC-3K3A.

La APC-3K3A para uso en un método o producto descrito en este documento puede producirse mediante un proceso como se describe en el documento W02005/007820. Además, APC-3K3A puede obtenerse de ZZ Biotech. La secuencia de aminoácidos de APC-3K3A se muestra en la Figura 6.

En determinadas realizaciones, APC-3K3A puede incorporar modificaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, deleciones y adiciones de secuencias de aminoácidos heterólogas), formando así análogos de APC-3K3A que pueden, por ejemplo, potenciar la actividad biológica o la expresión de la proteína respectiva. Por ejemplo, un análogo de APC-AK3A puede contener la mutación RR229/230AA correspondiente al bucle de calcio de APC, la mutación RR306/312AA correspondiente al bucle de autólisis de APC o la RKRR306/314AAAA correspondiente al bucle de autólisis de APC. Cada uno de estos ejemplos de análogos de APC tiene una actividad anticoagulante reducida en comparación con la actividad de APC nativa. Sin embargo, cada uno de ellos tiene una función APC relacionada en términos de unión a EPCR y PAR-1 o PAR-3.

Los análogos de APC-3K3A generalmente tienen una secuencia que es homóloga a la secuencia de la proteína C humana. El porcentaje de identidad entre un par de secuencias puede calcularse mediante el algoritmo implementado en el programa informático BESTFIT (Smith & Waterman. J. Mol. Biol. 147:195-197, 1981; Pearson, Genomics 11:635-650, 1991). Otro algoritmo que calcula la divergencia de secuencia se ha adaptado para una búsqueda rápida en la base de datos y se ha implementado en el programa informático BLAST (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997). En comparación con la secuencia humana, el polinucleótido o polipéptido de la proteína C puede ser solo aproximadamente un 60% idéntico a nivel de aminoácidos, 70% o más idéntico, 80% o más idéntico, 90% o más idéntico, 95% o más idéntico, 97% o más idéntico, o mayor que 99% idéntico.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos (p. ej., Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys, Gln/Asn) también se pueden considerar al hacer comparaciones porque se espera que la similitud química de estos pares de restos de aminoácidos resulte en equivalencia funcional en muchos casos. Las sustituciones de aminoácidos que se espera que conserven la función biológica del polipéptido conservarían los atributos químicos de los restos de aminoácidos sustituidos tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga de cadena lateral o tamaño. En comparación con la secuencia humana, el polipéptido de la proteína C puede ser solo aproximadamente 80% o más similar, 90% o más similar, 95% o más similar, 97% o más similar, 99% o más similar, o aproximadamente 100% similar . La equivalencia funcional o la conservación de la función biológica pueden evaluarse mediante métodos de determinación estructural y bioensayo.

Los codones usados también pueden adaptarse para la traducción en un anfitrión heterólogo adoptando las preferencias de codones del anfitrión. Esto acomodaría la maquinaria de traducción del huésped heterólogo sin un cambio sustancial en la estructura química del polipéptido.

APC-3K3A también se puede glicosilar mediante métodos bien conocidos en la técnica y que pueden comprender medios enzimáticos y no enzimáticos.

Los compuestos miméticos de APC-3K3A adecuados (es decir, compuestos que imitan la función de APC-3K3A) pueden diseñarse usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para diseñar miméticos de péptidos basados en secuencias de péptidos en ausencia de información estructural secundaria y terciaria. Por ejemplo, los compuestos miméticos de péptidos se pueden producir modificando cadenas laterales de aminoácidos para aumentar la hidrofobicidad de regiones definidas del péptido (por ejemplo, sustituyendo hidrógenos con grupos metilo en restos aromáticos de los péptidos), sustituyendo cadenas laterales de aminoácidos con cadenas laterales no de aminoácidos (por ejemplo, sustituyendo restos aromáticos de los péptidos con otros grupos arilo) y sustituyendo los extremos amino y/o carboxi con diversos sustituyentes (por ejemplo, sustituyendo grupos alifáticos para aumentar la hidrofobicidad).

Alternativamente, los compuestos miméticos pueden ser los denominados peptoides (es decir, no péptidos) que incluyen la modificación de la cadena principal del péptido (es decir, mediante la introducción de enlaces amida sustitutos, por ejemplo, reemplazando los átomos de nitrógeno en la cadena principal con átomos de carbono), o incluyen restos de glicina N-sustituidos, uno o más D-aminoácidos (en lugar de L-aminoácido(s)) y/o uno o más aaminoácidos (en lugar de p-aminoácidos o Y-aminoácidos). Otras alternativas de compuestos miméticos incluyen "péptidos retro-inversos" donde los enlaces peptídicos se invierten y los D-aminoácidos se ensamblan en orden inverso al orden de los L-aminoácidos en la secuencia peptídica en la que se basan, y otras estructuras no peptídicas tales como esteroides, sacáridos, benzazepinel, pirrolidinona 3,4-trisustituida, piridonas y piridopirazinas. Los compuestos miméticos adecuados también se pueden diseñar/identificar mediante modelado/determinación estructural, mediante el cribado de productos naturales, la producción de bibliotecas de presentación de fagos, proteínas minimizadas, selección SELEX (Aptámero), bibliotecas combinatorias y bibliotecas combinatorias enfocadas, cribado virtual/búsqueda en bases de datos, y técnicas racionales de diseño de fármacos bien conocidas en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas de APC-3K3A comprenden APC-3K3A y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición que contiene APC-3K3A puede ser generalmente una que es un producto liofilizado estable de alta pureza que comprende un agente de carga (como sacarosa, manitol, trehalosa y rafinosa), una sal (como cloruro de sodio y cloruro de potasio), un tampón (como citrato de sodio, Tris-acetato y fosfato de sodio) y APC-3K3A. Por ejemplo, una composición liofilizada estable puede comprender una relación en peso de aproximadamente 1 parte de APC-3K3A, entre aproximadamente 7-8 partes de sal y entre aproximadamente 5-7 partes de agente de carga. Un ejemplo de una composición liofilizada estable de este tipo es: 5,0 mg de APC, 30 mg de sacarosa, 38 mg de NaCl y 7,56 mg de citrato, pH 6,0, por vial.

Las diversas formas recombinantes y sintéticas de los análogos de APC-3K3A y APC-3K3A pueden ensayarse para su uso en el tratamiento de una cicatriz patológica mediante el cribado de la eficacia relevante en un modelo animal establecido, cuyos ejemplos se describen a continuación.

En una realización particularmente preferida, la APC-3K3A se proporciona en forma de una composición o formulación que se adapta para la administración tópica en un sitio relevante de lesión tisular, según un método descrito en el presente documento. Los ejemplos de tales formulaciones incluyen aquellas que se pueden aplicar directamente a la superficie relevante permitiendo la administración local de APC-3K3A en el sitio relevante. Estas formulaciones incluyen geles, aceites, aerosoles, formulaciones de roll-on, ungüentos, lociones, espumas y similares. En una realización, la APC-3K3A se proporciona en forma de gel de una metilcelulosa y puede contener estabilizantes tales como hidratos de carbono y sales.

El ungüento para la piel puede ser una combinación de ingredientes orgánicos, para la salud, de belleza o medicinales, generalmente en una base de aceite de petróleo. Esto le da al ungüento para la piel una fórmula más espesa, menos soluble en agua que permanece en la superficie del cuerpo más tiempo para que los ingredientes puedan funcionar de manera más efectiva para tratar una amplia variedad de problemas. Hay muchos ungüentos para la piel naturales y orgánicos que se pueden solicitar a empresas (como Therapex).

También se puede utilizar espuma de propionato de clobetasol (CP) (0,05%). Se trata de una espuma en aerosol en emulsión que se ha utilizado para el tratamiento de las manifestaciones inflamatorias y pruriginosas de las dermatosis que responden a los corticosteroides en los Estados Unidos y para las manifestaciones inflamatorias y pruriginosas de la dermatitis atópica moderada a grave en Canadá (espuma Olux-E (propionato de clobetasol), 0.05% Stiefel Laboratories Inc, Research Triangle Park, NC (2011).

Cuando la formulación es un gel, puede contener APC-3K3A en una cantidad de 10-5000 pg/g de gel.

Se puede suministrar una formulación inyectable de APC-3K3A como un polvo liofilizado estéril para infusión intravenosa que incluye APC-3K3A, sacarosa, NaCl y citrato de sodio. Los viales se pueden reconstituir con agua estéril para inyección, USP, para dar una concentración de aproximadamente 2 mg/ml de APC-3K3A, y esta APC-3K3A diluida se puede añadir después a una inyección de cloruro de sodio al 0,9% para obtener una concentración de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 pg/ml de APC-3K3A para la administración a un paciente. Esta es una formulación particularmente preferida para la administración de APC-3K3A mediante inyección subcutánea.

Ejemplos

Ejemplo 1 APC-3K3A promueve la reparación de heridas en un modelo de escisión in vivo

Materiales & métodos

Los ratones C57BL/6J tenían 7-8 semanas de edad cuando comenzaron el protocolo de heridas. Los ratones se obtuvieron y se alojaron en Kearns Facility, Kolling Medical Research Institute, bajo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad a 22°C.

Se hicieron heridas en la piel de espesor total usando una tijera de iris y se usó una herramienta de biopsia con punzón estéril de 6 mm para delinear un patrón en el dorso de los ratones.

Se inyectó control recombinante (r)3K3A-APC, rAPC o solución salina tamponada de fosfato (PBS) en la piel en 4 puntos, cada uno de los cuales recibió 10 pl, alrededor de la periferia interna de las heridas, y se añadieron 10 pl tópicamente a la herida, una vez al día. día durante los primeros tres días consecutivos.

A continuación, los animales se mantuvieron bajo anestesia durante 15 minutos para permitir la absorción de la solución. Las heridas se dejaron abiertas y los animales se alojaron en jaulas individuales.

La cicatrización de la herida se controló tomando fotografías digitales y midiendo a ciegas el área de la herida trazando el perímetro de la herida con un marcador de punta fina sobre una rejilla Visitrak 6 estéril. A continuación, se escanearon los trazados para obtener una lectura digital del área de la herida.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del comité local de ética y cuidado de animales.

Resultados & discusión

Figura 1 y Figura 2: los resultados se muestran como media ± SE. Para PBS, 10 pg de r3K3A-APC y 10 pg de rAPC: número de heridas = 12, número de ratones = 6. Para otras concentraciones: heridas = 6, ratones = 3. P <0,01, PBS frente a r3K3A-APC 10 pg. P <0,01, r3K3A-APC 10 pg frente a rAPC 10 pg (ANOVA de medidas repetidas). En resumen, la dosis óptima en este estudio para rAPC-3K3A es de 10 pg. Los datos muestran que rAPC-3K3A mejora la curación de heridas en comparación con el control PBS. Además, rAPC-3K3A mejora la curación de heridas en comparación con rAPC.

Hubo una diferencia significativa entre 10 pg de 3K3A y PBS en los primeros momentos, con p <0,01 en los días 2, 3 y 4. Se observaron diferencias similares entre 10 pg de APC y 10 pg de 3K3A. El % de mejora de 10 pg de 3K3A sobre PBS fue del 28%, 23% y 30% en los días 2, 3 y 4 respectivamente. El % de mejora de 10 pg de 3K3A sobre 10 pg de APC fue del 24%, 29% y 36% en los días 2, 3 y 4 respectivamente. Cuanto más rápido se cura una herida, especialmente en las primeras etapas, mayor es la probabilidad de que se produzca la regeneración del tejido, en lugar de solo la reparación. La regeneración generalmente se refiere a tejido nuevo que es el mismo que el tejido original, mientras que la reparación se asocia con cicatrices. (Mlin, Su; Wang, Song W.; Orr, William (2006). “Graphic General pathology: 2.2 complete regeneration:". Pathology. pathol.med.stu.edu.cn. Recuperado el 07-12-2012). Los primeros días son el período de tiempo crítico para la regeneración durante la curación de la herida: cuanto más lenta es la curación, más probabilidades hay de que se produzcan cicatrices (Ferguson MW1, O'Kane S; Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 29 de mayo de 2004; 359(1445):839-50. Scar-free healing: from embrionic mechanisms to adukt therapeutic intervention. (Profyris C, Tziotzios C y Do Vale I. Cutaneous scarring: Pathophysiology, molecular mechanisms and scar reduction thepareutics Part I. The molecular basis of scar formation. J Am Acad Dermatol 2012; 66: 1-10). Por tanto, la marcada mejora inducida por 10 pg de 3K3A en los puntos temporales tempranos conduce más probablemente a la curación sin cicatrices deseada, en comparación con el tratamiento con 10 pg de APC o PBS. Este empuje temprano proporciona un impulso para la angiogénesis acelerada, la formación de tejido de granulación, la epitelización y la reorganización de la matriz. Esto proporciona una ventaja tangible sobre la curación normal (Control) y el tratamiento con 10ug APC.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. APC-3K3A para uso en el tratamiento de una herida dérmica, en donde el tratamiento comprende la etapa de puesta en contacto de una herida dérmica con una cantidad efectiva de APC-3K3A.

2. APC-3K3A para uso según la reivindicación 1, en donde la APC-3K3A es para administración tópica a la herida, contactando así la herida dérmica con la cantidad efectiva de APC-3K3A.

3. APC-3K3A para uso según la reivindicación 2, en donde la APC-3K3A es para administración tópica a la herida en forma de una formulación seleccionada del grupo que consiste en un gel, un ungüento, una loción y un aerosol.

4. APC-3K3A para uso según la reivindicación 1, en donde la APC-3K3A es para administración a la herida mediante inyección, poniéndose en contacto así la herida con una cantidad efectiva de APC-3K3A.

5. APC-3K3A para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida dérmica no está caracterizada por apoptosis significativa, o no surge de la apoptosis.

6. APC-3K3A para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida es crónica o aguda.

7. APC-3K3A para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida es una quemadura, incisión, laceración, abrasión, punción o úlcera.

8. APC-3K3A para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la APC-3K3A se proporciona en una cantidad de 250 pg o 500 pg.