BR112021003820A2 - agente para tratamento de distúrbios dermatológicos - Google Patents

Abstract

AGENTE PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS DERMATOLÓGICOS. A presente invenção refere-se a um polipeptídeo não natural para o tratamento ou prevenção de distúrbios de pele em um mamífero. A administração do polipeptídeo é bem tolerada pelo mamífero. O polipeptídeo não natural é fornecido em alta pureza.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “AGENTE PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS DERMATOLÓGI- COS”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um agente adequado para o tratamento e prevenção de distúrbios dermatológicos, incluindo, mas não limitados a úlceras de pele.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os distúrbios de pele, incluindo feridas crônicas, tal como úl- ceras, incluem uma ferida na pele ou em uma membrana mucosa, fre- quentemente acompanhada por desintegração do tecido. Tipicamente, esses distúrbios de pele podem resultar na perda da epiderme e, fre- quentemente, de partes da derme e até mesmo de gordura subcutânea. Tais distúrbios de pele podem surgir e podem ser causados por uma ampla variedade de fatores, por exemplo, mas não limitados à circula- ção sanguínea prejudicada. As úlceras de pele são frequentes em hu- manos, incluindo indivíduos com diabetes (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, pág. 129 a 134). Esses distúrbios de pele represen- tam um sério problema médico e social.

[0003] No momento, nenhum tratamento curativo adequado para distúrbios dermatológicos deste tipo está disponível. De acordo com as estimativas atuais, os pacientes devem ser tratados por meses e parci- almente por anos, o que resulta em custos significativos e uma grande carga para os pacientes e a sociedade (Buchberger e outros, 2010, GMS Health Technol. Assess., Vol. 1 (6), doc. 12). Em alguns casos, medidas alternativas, tal como o alívio da pressão por meio do uso de dispositivos de molde de alívio de pressão, é uma opção principal para o tratamento de tais distúrbios (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, pág. 129 a 134), mas tais medidas alternativas não fornecem um tratamento curativo.

[0004] Os distúrbios de pele ocorrem com frequência em indivíduos diabéticos: o diabetes é frequente nas sociedades modernas e estima- se que um em cada quatro pacientes com diabetes desenvolverá um distúrbio de pele, em particular uma úlcera nos pés, durante a vida (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, páginas 129 a 134). Este dis- túrbio muitas vezes requer longas estadias em hospitais, reabilitação, cuidados domiciliares e serviços sociais. Assim, as úlceras resultantes do diabetes são um problema sério com um enorme impacto na carga geral de doenças, em vista da prevalência crescente de diabetes, e a falta de opções de tratamento curativo atualmente é uma desvantagem para os indivíduos em questão, bem como para a sociedade.

[0005] Na busca por um tratamento curativo, no passado, alguns fatores de crescimento humano foram propostos para terapia e poten- cial cura de distúrbio de pele, mas agora é aceito que há evidências limitadas que suportam o uso de fatores de crescimento humano no tra- tamento de úlceras de pele (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., vol. 5, pág. 129 a 134). Um exemplo de um fator de crescimento que foi considerado no passado para o tratamento de distúrbio de pele é o fator de crescimento derivado de plaquetas (beclapermina, nome comercial Regranex), mas sua administração foi associada a efeitos colaterais graves, incluindo malignidade (Buchberger e outros, 2010, GMS Health Technol. Assess., Vol. 1 (6), doc. 12; https://www.rxlist.com/regranex- side-effects-drug-center.htm#professional). Outro exemplo testado é o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), mas foi desco- berto que o G-CSF não afetou significativamente a probabilidade de re- solução da infecção ou cicatrização (Cruciani e outros, 2005, Diabetes Care, vol. 28, pág. 454 a 460). Um outro exemplo proposto na literatura é o fator de crescimento epidérmico (EGF), que foi inicialmente proposto para ter efeitos de cicatrização positivos inesperados (por exemplo, WO

2003/075949 A1), mas nenhum tratamento baseado em EGF está real- mente disponível comercialmente, sugerindo que o esperanças neste agente não encontrou suporte ou confirmação.

Alternativamente, o fator de crescimento do nervo humano (hNGF), que foi proposto como tendo propriedades pró-angiogênicas e para facilitar o reparo de feridas (Grai- ani e outros, 2004, Diabetologia, vol. 47, pág. 1047 a 1054), foi proposto para o tratamento de certas condições clínicas neuropáticas, mas o teste clínico foi desanimador (Apfel e outros, 2000, J.

Amer.

Med.

As- soc., vol. 284, pág. 2215 a 2221) e, como resultado, nenhum medica- mento baseado em NGF foi desenvolvido (consultar, por exemplo, https://www.gene.com/media/press-releases/4875/1999-04-08/phase- iii-trial-with-nerve-growth-factor). Por exemplo, embora Graiani e outros não comentem especificamente sobre o efeito alogênico do NGF, é ge- ralmente conhecido que o NGF humano induz dor (Dyck e outros 1997, Neurology, vol. 48, pág. 501 a 505; Svensson e outros, 2003, Pain, vol. 104, pág. 241 a 247). Como um resultado, o NGF humano não pode ser estabelecido como um agente terapêutico adequado para o tratamento de úlceras de pele; entre outros devido à sua atividade causadora de dor e / ou falta de eficiência em doses toleradas.

Consequentemente, considerando que os tratamentos baseados em fatores de crescimento tiveram sucesso ou comprovação limitados, entre outros devido a efei- tos colaterais indesejáveis, a sociedade médica investigou outros poten- ciais fármacos.

Com base no exposto acima, interleucinas e outras mo- léculas de fator de não crescimento foram propostas mais recentemente para o tratamento de certas úlceras de pele.

Por exemplo, foi proposto por Genentech que os derivados de interleucinas, em particular a inter- leucina 22, que tem um papel proposto na modulação do sistema imu- nológico, pode ser adequada para tratar ou prevenir úlceras cutâneas, incluindo úlceras cutâneas diabéticas (ver, por exemplo, https://www.gene.com/stories/mechanisms-of-healing), mas nenhum medicamento desse tipo está disponível para os pacientes, e atual- mente é certo se isso pode mudar.

[0006] Assim, há ainda a necessidade de um tratamento eficaz de condições de pele que não esteja indivíduo a efeitos adversos, tais como efeitos colaterais intoleráveis ou indesejáveis, e de um agente te- rapêutico adequado para tais fins e disponível para os médicos com pu- reza confiável e aceitável para administração a indivíduos mamíferos, incluindo humanos.

[0007] Problema a ser Resolvido

[0008] É um objetivo principal da invenção fornecer um tratamento ou prevenção para distúrbios dermatológicos, incluindo úlceras, em in- divíduos diabéticos e não diabéticos, que não esteja associado a efeitos colaterais indesejáveis ou dolorosos. É também desejado fornecer um agente terapeuticamente ativo com rendimento e pureza suficientes para permitir tal tratamento. Assim, um objetivo da presente invenção inclui eliminar as desvantagens associadas ao estado da técnica. Obje- tivos particulares compreendem o fornecimento de um método confiável para o tratamento de um indivíduo com um distúrbio dermatológico sem efeitos colaterais indesejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção fornece um polipeptídeo para uso no tratamento e / ou prevenção de um distúrbio dermatológico em um indi- víduo mamífero, em que o polipeptídeo é selecionado dentre o polipep- tídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Estes poli- peptídeos são caracterizados por uma mutação da sequência de ami- noácidos de NGF humano (SEQ ID NO: 2), em que a dita mutação está associada a uma redução da atividade nociceptiva. Em particular, a ar- ginina na posição 100 de hNGF é substituída por ácido glutâmico.

[0010] Um polipeptídeo particularmente preferencial é o polipeptí-

deo de SEQ ID NO: 4. O dito polipeptídeo é caracterizado por pelo me- nos a ausência de prolina na posição 61, mais preferencialmente pela substituição da prolina na posição 61 por outro aminoácido. Na SEQ ID NO: 4, a prolina na posição 61 de SEQ ID NO: 3 é substituída por serina.

[0011] De preferência, o indivíduo mamífero é um ser humano.

[0012] Preferencialmente, o distúrbio dermatológico é caracterizado por uma superfície ferida em pelo menos uma parte do corpo do indiví- duo. De preferência, o distúrbio dermatológico é caracterizado por uma superfície ferida. Mais preferencialmente, o distúrbio dermatológico é uma lesão de pele, de preferência caracterizada por ablação pelo me- nos parcial da derme e, opcionalmente, da derme.

[0013] De preferência, o distúrbio dermatológico compreende pelo menos uma úlcera, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em úlceras diabéticas, úlceras de trauma, úlceras cirúrgicas, úlceras por pressão, úlceras crônicas e combinações de qualquer uma dessas úlceras. Em modalidades alternativas, mas não mutuamente ex- clusivas, o distúrbio dermatológico compreende uma queimadura ou uma lesão mecânica.

[0014] De preferência, o mamífero, preferencialmente o ser hu- mano, sofre de diabetes mellitus ou tem uma predisposição para sofrer de diabetes mellitus. Em modalidades típicas, o diabetes mellitus é se- lecionado dentre diabetes mellitus Tipo 1 e diabetes mellitus Tipo 2.

[0015] Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado em uma única administração.

[0016] Em uma modalidade alternativa e mais preferencial, o poli- peptídeo é administrado repetidamente. Em uma modalidade particular- mente preferencial, o polipeptídeo é administrado repetidamente uma a cinco vezes ao dia, de preferência duas vezes ao dia.

[0017] Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado repetida- mente até o fechamento da superfície corporal ferida. Alternativamente,

o polipeptídeo é administrado repetidamente por um período de três a 30 dias, preferencialmente de sete a 14 dias. Opcionalmente, a admi- nistração é descontinuada após o término do dito intervalo.

[0018] Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado a um in- divíduo com úlcera neuropática do pé diabético (DFU), de preferência no pé do indivíduo abaixo do tornozelo.

[0019] De preferência, o polipeptídeo é para administração tópica. Mais preferencialmente, o polipeptídeo é administrado na superfície cor- poral ferida.

[0020] De preferência, a dose do polipeptídeo a ser administrado é determinada com base na superfície corporal ferida a ser tratada. De preferência, a determinação é conduzida no início do tratamento. Em uma modalidade, a dosagem é ajustada para administração(ões) pos- terior(es), dependendo da superfície da superfície corporal ferida no mo- mento de tal administração posterior. Em uma modalidade alternativa, a dosagem não é ajustada para administração(ões) posterior(es), de modo que a dose de administração dependa unicamente da superfície da superfície corporal ferida a ser tratada no início da administração (pri- meira dosagem), e dosagens subsequentes correspondem à primeira dose.

[0021] Em uma modalidade, a dose / cada dose tem uma quanti- dade de 0,3 a 6 μg do polipeptídeo por mm2 de superfície corporal ferida sendo tratada (0,3 a 6 μg / mm2).

[0022] Em uma modalidade, o polipeptídeo está compreendido em um meio aquoso, e o meio aquoso é administrado ao indivíduo mamí- fero.

[0023] De preferência, o tratamento e / ou prevenção não causa hi- peralgesia no indivíduo mamífero.

[0024] Em uma modalidade, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido a partir de uma fonte biológica. Isto pode compreender purificação, isto é, separação de ou- tras moléculas, incluindo outras proteínas, tais como proteínas de célu- las hospedeiras. Opcionalmente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido em um processo que compreende (re)dobramento e / ou purificação cromatográfica e / ou di- gestão por protease e, opcionalmente, ajuste para a concentração de proteína final e / preparação de uma formulação desejada. Em uma mo- dalidade, o polipeptídeo pode ser obtido por expressão recombinante e purificação, em que a purificação compreende a purificação em uma fase estacionária de modo misto.

[0025] Assim, a presente invenção também fornece o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a partir de uma fonte recombinante e purificado conforme descrito neste documento para uso em um método para tratamento do corpo humano ou animal por terapia, como aqui descrito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] Este relatório descritivo em sua totalidade, juntamente com as reivindicações e as figuras, descreve modalidades preferenciais e variantes das características individuais da invenção. A presente inven- ção também considera como modalidades particularmente preferenciais aquelas modalidades que são geradas pela combinação de duas ou mais das modalidades e variantes específicas e / ou preferenciais aqui descritas para a presente invenção. Assim, a presente descrição tam- bém inclui todas as entidades, compostos, recursos, etapas, métodos ou composições referidas ou indicadas neste relatório descritivo, indivi- dualmente ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das ditas entidades, compostos, recursos, eta- pas, métodos ou composições. Assim, a menos que especificamente indicado de outra forma neste documento ou a menos que o contexto exija o contrário, a referência a uma única entidade, composto, recurso, etapa, método ou composição deve ser considerada como abrangendo um e uma pluralidade (ou seja, mais de um, tal como dois ou mais, três ou mais ou todas) dessas entidades, compostos, recursos, etapas, mé- todos ou composições. A menos que especificamente descrito de outra forma ou a menos que o contexto exija o contrário, cada modalidade, aspecto e exemplo descrito neste documento deve ser considerado apli- cável a, e combinável com, qualquer outra modalidade, aspecto ou exemplo descrito neste documento.

[0027] O versado na técnica apreciará que a invenção aqui descrita é susceptível a variações e modificações além daquelas especifica- mente descritas. Assim, a presente descrição não está limitada em es- copo pelas modalidades específicas aqui descritas, que são fornecidas aqui para fins de ilustração e de exemplificação. Funcionalmente ou de outra forma, entidades, compostos, recursos, etapas, métodos ou com- posições equivalentes estão dentro do escopo da presente descrição. Será evidente para o versado na técnica que a presente descrição inclui todas as variações e modificações das entidades, compostos, recursos, etapas, métodos ou composições literalmente descritos neste docu- mento.

[0028] Cada uma das referências citadas neste documento (inclu- indo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, es- pecificações do fabricante, instruções, apresentações, etc.), acima ou abaixo, são incorporadas neste documento por referência em sua tota- lidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admis- são de que a presente invenção não teria o direito de anteceder um ensinamento específico e / ou como uma admissão de que uma refe- rência específica, que não o conhecimento geral comum, contém infor- mações suficientemente claras e completas para que seja realizada por um versado na técnica.

[0029] Geralmente, a menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica (por exemplo, em medicina, dermatologia, neurologia, gené- tica, biologia molecular, expressão gênica, biologia celular, cultura celu- lar, imunologia, neurobiologia, cromatografia, química de proteínas e bi- oquímica). Livros didáticos e artigos de revisão publicados, por exem- plo, em inglês, tipicamente definem o significado como comumente en- tendido por um versado na técnica.

[0030] A expressão “e / ou”, por exemplo, “X e / ou Y” deve ser en- tendida como significando “X e Y” ou “X ou Y” e deve ser considerada para fornecer a descrição explícita de “e”, de “ou” e de ambos os signi- ficados (“e” ou “ou”).

[0031] Conforme usado neste documento, a menos que especifi- cado de outra forma, os termos “cerca de”, “ca.” e “substancialmente” todos significam aproximadamente ou quase, e no contexto de um valor numérico ou faixa aqui apresentada, de preferência designa +/- 10%, mais preferencialmente +/- 5%, em torno do valor numérico ou faixa ci- tada ou reivindicada.

[0032] A menos que seja expressamente especificado de outra forma, a palavra “compreendem”, ou variações como “compreende” ou “compreendendo” é usada no contexto do presente documento para in- dicar que outros elementos podem opcionalmente estar presentes além dos elementos da lista introduzida por “compreendendo”. É, no entanto, considerada como uma modalidade específica da presente invenção que o termo “compreendendo” abrange a possibilidade de nenhum outro elemento estar presente, ou seja, para o propósito desta modalidade “compreendendo” deve ser entendido como tendo o significado de “con- sistindo de”.

[0033] A menos que expressamente especificado de outra forma,

todas as indicações de quantidades relativas em relação à presente in- venção são feitas com base em peso / peso. As indicações de quanti- dades relativas de um componente caracterizado por um termo genérico referem-se à quantidade total de todas as variantes ou elementos espe- cíficos abrangidos por esse termo genérico. Se um determinado com- ponente definido por um termo genérico for especificado como estando presente em uma certa quantidade relativa, e se este componente for ainda caracterizado como uma variante específica ou elemento coberto pelo termo genérico, significa que nenhuma outra variante ou elemento coberto pelo termo genérico está adicionalmente presente de modo que a quantidade relativa total de componentes cobertos pelo termo gené- rico exceda a quantidade relativa especificada; mais preferencialmente, nenhuma outra variante ou elemento coberto pelo termo genérico está presente.

[0034] Todos os métodos e processos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indi- cado de outra forma neste documento ou a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0035] O termo “agente” conforme usado neste documento, a me- nos que especificado de outra forma, geralmente se refere a um com- posto ou composição, de preferência a um composto. Um agente é ca- paz de produzir um efeito sobre um organismo vivo e / ou sobre uma célula de um organismo vivo ou derivado de um organismo vivo, por exemplo, agindo sobre uma célula e / ou tecido corporal, ou em um am- biente. O estado físico de um agente não é particularmente limitado e, a menos que especificado de outra forma, pode estar no ar, água e / ou estado sólido. O tipo de agente não é particularmente limitado, a menos que especificado de outra forma e, portanto, um agente pode ser um produto químico e / ou uma biomolécula, tal como uma proteína ou um ácido nucleico. Os agentes específicos aqui definidos são úteis na pre- sente invenção.

[0036] Um “efeito adverso”, conforme usado neste documento, é um efeito prejudicial indesejado resultante da administração de um agente (um fármaco) a um indivíduo. Os efeitos adversos incluem, sem limita- ção, morbidade, mortalidade, síndrome hiperalgésica, dor, alteração no peso corporal, níveis de enzimas, perda de função ou qualquer altera- ção patológica detectada no nível microscópico, macroscópico ou fisio- lógico. Os efeitos adversos podem causar uma alteração reversível ou irreversível, incluindo um aumento ou diminuição na susceptibilidade do indivíduo a outros produtos químicos, alimentos ou procedimentos, tal como interações medicamentosas.

[0037] Tal como aqui utilizado, os termos “cromatografia”, “croma- tográfico” e similares geralmente se referem a uma técnica adequada para a separação de uma mistura, em que a mistura é adicionada a um material não líquido denominado “fase estacionária” com o objetivo de separar, pelo menos parcialmente, um ou mais constituintes da mistura. Para esse fim, a fase estacionária pode ser exposta a um fluido e / ou a mistura pode ser dissolvida em um fluido; o dito fluido em contato com a fase estacionária também pode ser dito como “fase móvel”. Em geral, qualquer etapa que é “realizada por cromatografia”, conforme descrito neste documento, pode ser denominada como uma “etapa cromatográ- fica”.

[0038] O termo “fase móvel”, tal como aqui utilizado, tem o signifi- cado tipicamente usado na técnica e pode se referir a todos os fluidos colocados em contato com a fase estacionária durante a cromatografia, ou seja, para lavar fluidos, bem como para fluidos (misturas) compreen- dendo uma proteína de interesse, tal como uma ou mais das proteínas aqui descritas. Na presente invenção, a mistura submetida à cromato- grafia, conforme especificado aqui, compreende tipicamente uma ou mais proteínas, tais como em particular as proteínas aqui descritas, tais como os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4, um precursor de qualquer um destes, uma protease, e / ou proteínas de célula hospedeira (HCP).

[0039] Uma “fase estacionária” tipicamente compreende uma matriz de base, que é um material insolúvel em água, geralmente em partícula ou em forma de gel, tal como uma resina. Em muitos casos, incluindo modalidades aqui descritas, uma fase estacionária compreende uma matriz de base e uma porção que pode se ligar a pelo menos um com- ponente compreendido na mistura que deve ser submetida à cromato- grafia. A matriz de base é tipicamente um material insolúvel em água, geralmente na forma de partículas ou gel. Exemplos não limitantes de matrizes de base são sefarose e agarose, por exemplo, agarose alta- mente rígida.

[0040] Uma “etapa cromatográfica”, tal como aqui utilizada, refere- se à ação de adicionar a um material cromatográfico (de preferência uma fase estacionária) um líquido compreendendo pelo menos um com- posto a ser analisado e / ou purificado, que é preferencialmente uma proteína (e em no contexto da presente invenção, a dita proteína é mais preferencialmente o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4), opcionalmente lavando o material cromatográfico com uma ou mais soluções de lavagem, e eluindo pelo menos um dito composto. Nesse contexto, um processo caracterizado por duas etapas cromatográficas, para ilustração, é caracterizado por um líquido compreendendo pelo me- nos um desses compostos a ser analisado e / ou a ser purificado ser adicionado a um primeiro material cromatográfico, como descrito acima, e, após a eluição do mesmo, o líquido compreendendo pelo menos um de tais compostos é adicionado a um segundo material cromatográfico, a partir do qual ele também é eluído, como descrito acima. É objetivo de qualquer “etapa cromatográfica” que pelo menos um componente com-

preendido na mistura aplicada a uma fase estacionária, preferencial- mente em cromatografia, se ligue à fase estacionária. Esse composto pode ser uma ou mais proteínas aqui descritas. O composto pode ser recuperado a partir da fase estacionária, por exemplo, por troca de fase móvel e / ou por exposição continuada à fase móvel ao longo do tempo.

[0041] O termo “se liga”, quando usado com referência à cromato- grafia, tal como para descrever a capacidade de ligação de uma fase estacionária, não é particularmente limitado, mas tipicamente se refere à ligação não covalente. Assim, tipicamente, pelo menos um compo- nente compreendido em uma mistura, tal como pelo menos uma prote- ína, liga-se não covalentemente à fase estacionária. Uma etapa croma- tográfica opcionalmente, mas preferencialmente compreende a lava- gem da fase estacionária à qual pelo menos um componente está li- gado. Pelo menos um componente pode ser pelo menos uma proteína, tal como pelo menos uma proteína aqui descrita.

[0042] O termo “heterólogo”, conforme usado aqui, descreve algo que consiste em vários elementos diferentes.

[0043] Os termos “dissulfeto” e “ligação dissulfeto” são usados, no contexto da presente invenção, dentro do significado comumente usado na técnica. Em geral, um “dissulfeto” refere-se a um grupo funcional com a estrutura R − S − S – R’. A ligação também é chamada de “ligação SS” e geralmente é derivada do acoplamento de dois grupos tiol. As ligações dissulfeto em proteínas são formadas entre os grupos tiol dos resíduos de cisteína pelo processo de dobramento oxidativo; tal ligação dissulfeto específica entre os grupos tiol de dois resíduos de cisteína também pode ser descrita como “ponte dissulfeto”. Sem desejar estar limitado a uma teoria particular, é tipicamente entendido na técnica que, em células eucarióticas, as pontes dissulfeto são formadas no lúmen do retículo endoplasmático (e o espaço intermembrana mitocondrial), mas geralmente não no citosol, e no que diz respeito aos procariontes, as pontes dissulfureto são formadas no periplasma (dos respectivos orga- nismos, particularmente bactérias Gram-negativas); pontes dissulfeto também podem ser encontradas em proteínas do ambiente extracelular de células eucarióticas e procarióticas.

[0044] Os termos “expressar”, “expresso”, “expressão”, “expressão gênica” e similares, tal como aqui utilizados, referem-se ao uso de infor- mações de um gene na síntese de um produto gênico funcional. A ex- pressão gênica compreende pelo menos a transcrição e, opcional- mente, compreende um ou mais recursos adicionais, opcionalmente se- lecionados a partir da lista aberta compreendendo tradução e modifica- ção pós-tradução. No contexto da expressão recombinante de uma pro- teína em uma célula hospedeira, o termo tipicamente implica que a pro- teína é produzida pela célula hospedeira (em qualquer compartimento da célula e / ou secretada e / ou incorporada em corpos de inclusão), a menos que o contexto dite o contrário.

[0045] O termo “heterólogo”, conforme aqui utilizado, descreve algo que consiste em vários elementos ou origens diferentes. Por exemplo, em uma célula hospedeira não humana que compreende um gene hu- mano (ou gene que codifica um polipeptídeo não natural, tal como o polipeptídeo da invenção), o dito gene é “heterólogo” à célula, e a célula pode ser capaz de expressão “heteróloga” do respectivo gene. A ex- pressão gênica heteróloga também pode ser descrita como “recombi- nante”.

[0046] O termo “corpo de inclusão” tem o significado tipicamente usado na técnica e se destina a referir-se a agregados ou partículas encontradas no citosol ou no periplasma de uma célula hospedeira; os corpos de inclusão tipicamente compreendem proteína, tal como, em particular, proteína expressa de forma recombinante na célula hospe- deira. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, entende- se que, no campo da expressão recombinante, os corpos de inclusão contêm tipicamente a proteína expressa de forma recombinante, mas relativamente pouca proteína de célula hospedeira (HCP), componentes ribossômicos ou fragmentos de DNA / RNA. Sem desejar estar vincu- lado a qualquer teoria particular, entende-se que os corpos de inclusão tipicamente compreendem, pelo menos em parte, proteína que não está devidamente dobrada (proteína mal dobrada), em particular proteína mal dobrada expressa de forma recombinante. Entende-se que os cor- pos de inclusão tipicamente compreendem proteína em uma forma não devidamente dobrada, isto é, no contexto da presente invenção, eles tipicamente compreendem o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção e / ou um precursor do mesmo, em uma forma não dobrada adequadamente. O termo “mal dobrado” geralmente descreve uma bio- molécula, tal como um ácido nucleico ou polipeptídeo, que não está na conformação nativa, ou seja, em uma forma não dobrada adequada- mente.

[0047] Por “isolado” entende-se o material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que tipicamente o acompa- nham em seu estado nativo. Por exemplo, um “peptídeo isolado” ou “proteína isolada”, tal como aqui utilizado, refere-se a um peptídeo ou proteína, respectivamente, que foi purificado a partir do ambiente celular e extracelular, tal como o tecido, que o envolve em um estado tipo sel- vagem, por exemplo, a partir da célula na qual ele foi expresso, tal como uma célula hospedeira. Em uma descrição alternativa, um “peptídeo iso- lado” ou “proteína isolada” e similares, tal como aqui utilizados, referem- se ao isolamento in vitro e / ou purificação de um peptídeo ou proteína, respectivamente, de seu ambiente celular natural, e a partir de associa- ção com outros componentes do ambiente em que o peptídeo ou prote- ína tipicamente reside. Em outro exemplo, uma “célula isolada”, tal como aqui utilizada, refere-se a uma célula que foi purificada a partir do ambi- ente celular e extracelular, tal como tecido ou colônias de células, que a rodeiam em um estado tipo selvagem, por exemplo, uma célula hospe- deira que foi removida do ambiente que é tipicamente adjacente à cé- lula. De acordo com a definição acima da palavra “isolado”, “isolar”, con- forme usado neste documento, é o verbo que descreve a atividade para obter material “isolado”, tal como, por exemplo, uma célula isolada ou um peptídeo ou proteína isolada.

[0048] Os termos “multi” e “múltiplos”, conforme usados neste do- cumento, significam uma multidão, ou seja, qualquer número de dois ou mais.

[0049] O termo “mutação”, tal como aqui utilizado, refere-se à alte- ração da sequência de nucleotídeos do genoma de um organismo, vírus ou DNA extracromossômico ou outros elementos genéticos. O termo também se estende a mutações de uma sequência de aminoácidos, par- ticularmente a sequência de aminoácidos de um gene que carrega pelo menos uma mutação (não silenciosa). A menos que especificado de ou- tra forma, uma mutação da sequência de nucleotídeos é uma alteração permanente. As mutações presentes na linha germinativa são tipica- mente hereditárias. Em geral, uma mutação da sequência de nucleotí- deos pode resultar em muitos tipos diferentes de alteração nas sequên- cias: as mutações nos genes podem não ter efeito, alterar o produto de um gene ou impedir que o gene funcione adequadamente ou completa- mente. Mutações também podem estar presentes em regiões não gêni- cas. A menos que especificado de outra forma, a sequência tipo selva- gem é usada como uma sequência de referência para descrever uma mutação. Assim, por exemplo, quando se diz que um dado mutante é caracterizado por mutação da posição 100 de uma sequência polipeptí- dica, isso indica que na posição 100 o mutante não tem o mesmo resí- duo de aminoácido que o polipeptídeo tipo selvagem. Tipos específicos de mutações de uma sequência de nucleotídeos e / ou uma sequência de aminoácidos incluem alterações, tais como deleções, substituições,

adições, inserções e variantes de splice.

Uma “deleção” em relação a uma sequência de nucleotídeos refere-se à ausência de um ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos.

Uma “deleção” em relação a uma sequência de aminoácidos se refere à ausência de um ou mais resíduos de aminoácidos no polipeptídeo.

Uma “adição” em relação a uma sequência de nucleotídeos refere-se à presença de um ou mais nucleotídeos adicionais na sequência de nucleotídeos.

Uma “adição” em relação a uma sequência de aminoácidos se refere à presença de um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais no polipeptídeo relaci- onado.

Uma “substituição” em relação a uma sequência de nucleotídeos refere-se à substituição de um ou mais nucleotídeos por (um) outro(s) nucleotídeo(s) na sequência de nucleotídeos.

Uma “substituição” em re- lação a uma sequência de aminoácidos refere-se à substituição de um ou mais resíduos de aminoácido por (um) outro(s) resíduo(s) de amino- ácido no polipeptídeo.

Adições, deleções e substituições a um polipep- tídeo podem ser no 5’ terminal, 3’ terminal e / ou internas.

Adições, de- leções e substituições a um polipeptídeo podem ser no amino terminal, carbóxi terminal e / ou internas.

Uma “inserção” com relação a uma se- quência de nucleotídeos e / ou uma sequência de polipeptídeos é uma adição de um ou mais nucleotídeos, ou um ou mais resíduos de amino- ácidos, respectivamente, especificamente em uma posição interna da respectiva sequência.

O termo “variante de splice” é usado para descre- ver que o RNA que codifica uma sequência de polipeptídeo é proces- sado de forma diferente do respectivo RNA tipo selvagem, tipicamente como um resultado de uma mutação no nível de ácido nucleico, geral- mente resultando em um produto de tradução de polipeptídeo que é di- ferente do polipeptídeo tipo selvagem.

O termo “variante de splice” pode ser usado não apenas com relação ao respectivo RNA, mas também com relação à respectiva sequência de DNA modelo (tipicamente DNA genômico) e com relação à sequência do polipeptídeo codificada por tal

RNA.

[0050] O termo “mutante” geralmente é destinado a referir-se a uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é dife- rente da sequência tipo selvagem. Uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos mutante tem, portanto, pelo menos uma mu- tação em relação à respectiva sequência tipo selvagem. Nos casos em que existem polimorfismos na sequência de ácido nucleico que, no en- tanto, não são refletidos no nível do respectivo polipeptídeo codificado (mutações silenciosas, degenerescência do código genético), o termo “mutante”, no nível do ácido nucleico, refere-se especificamente apenas às variantes de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo mutante. Os mutantes podem conter diferentes combinações de mutações, isola- damente ou em combinação, incluindo mais de uma mutação e diferen- tes tipos de mutações.

[0051] O termo “fator de crescimento do nervo”, abreviado “NGF” ou “beta-NGF” significa um fator neurotrófico e neuropeptídeo envolvido na regulação do crescimento, manutenção, proliferação e sobrevivência de certos neurônios e outras células, de acordo com o significado comum na técnica (ver, por exemplo, Levi-Montalcini, 2004, Progress in Brain Research, vol. 146, pág. 525 a 527). A menos que o contexto indique o contrário, o termo fator de crescimento do nervo representa apenas NGF tipo selvagem e não inclui os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4. NGF tipo selvagem é a subunidade beta de 2,5S, 26 kDa obtida de um precursor de NGF, que é biologicamente ativo: o NGF tipo selvagem liga-se a pelo menos duas classes de receptores: o receptor quinase A da tropomiosina (TrkA) e o receptor NGF de baixa afinidade (LNGFR / p75NTR). O termo “NGF”, a menos que especificado de outra forma, refere-se a NGF de qualquer espécie, preferencialmente espécies de mamíferos; no entanto, o NGF humano é sempre preferencial. “HNGF”, conforme usado aqui, significa NGF humano. A menos que o contexto indique o contrário, os termos “NGF” e “hNGF” referem-se a NGF tipo selvagem, ou seja, hNGF significa NGF tipo selvagem. A sequência de aminoácidos de NGF humano tipo selvagem corresponde às posições 121-239 da SEQ ID NO: 1 (cinza na Figura 24). As sequências de NGF não humano estão disponíveis, por exemplo, na literatura científica, através de pesquisas de sequência, tal como BLAST, usando as posi- ções 121-239 de SEQ ID NO: 1 como isca, e em bancos de dados pú- blicos de proteínas, como Swissprot.

[0052] Os termos “NGF muteína” e “muteína de NGF”, ou, com re- ferência a NGF “muteína do mesmo”, são usados aqui de forma inter- cambiável para se referir a um polipeptídeo que é caracterizado por pelo menos uma mutação, em comparação com NGF tipo selvagem, como descrito em detalhes aqui. Os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 são muteínas de NGF. Preferencialmente, uma muteína de NGF tem 80 a 99,5% de identidade de sequência com NGF, particularmente NGF humano, mais preferencialmente uma muteína tem 90 a 99% de identidade de sequência com NGF, particularmente NGF humano.

[0053] Os termos “parte madura”, “porção madura”, com referência a NGF, são usados de forma intercambiável com o termo “beta-NGF” e referem-se a um polipeptídeo de NGF que é caracterizado por não com- preender o pró-peptídeo (e, portanto, é claro, não o pré-pró-peptídeo) de NGF. Em analogia, o termo “parte madura” também é usado para se referir aos polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4, uma vez que esses polipeptídeos da mesma forma não compreendem um pró-peptídeo (e, portanto, é claro, não um pré-pró-peptídeo). De preferência, a parte ma- dura também não compreende um peptídeo clivável C-terminal codifi- cado pelo quadro de leitura aberto do NGF tipo selvagem; tal peptídeo clivável C-terminal, no caso de NGF humano, consiste dos dois resíduos de aminoácidos “RA” (240 e 241 em SEQ ID NO: 1). Mais particular- mente, a parte madura pode ser obtida, sem limitação, por clivagem de um pró-NGF com a protease Furina (e com outras proteases capazes de clivar com precisão diretamente o N-terminal do primeiro resíduo de aminoácido de NGF, ou do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou 4, respec- tivamente. Por exemplo, o sítio de clivagem pela furina do NGF humano, e de muitos ortólogos, é bem conhecido por consistir da sequência R1S2K3R4 (código de aminoácido de uma letra, sequências numeradas do N-terminal ao C-terminal; em caixa na Figura 25)). No NGF maduro, tipicamente nem o sítio de clivagem pela furina nem qualquer aminoá- cido N-terminal do sítio de clivagem pela furina está presente. Para ilus- tração, a parte madura do NGF humano consiste do polipeptídeo repre- sentado pelas posições de aminoácidos 122-239 da SEQ ID NO: 1. A parte madura do NGF não humano pode ser identificada, por exemplo, por pesquisa de sequência e / ou análise de sequência, em que a dita parte madura do NGF humano é usada para alinhamento de sequên- cias.

[0054] O termo “precursor”, tal como aqui utilizado com referência a NGF, refere-se a qualquer sequência de peptídeo a partir da qual o NGF é obtido por clivagem proteolítica. Para ilustração, tanto o pró-NGF quanto o pré-pró-NGF, bem como suas variantes, são exemplos típicos de precursores de NGF. O termo “precursor”, tal como aqui utilizado, pode referir-se a precursores em que a maior parte do resíduo de ami- noácido C-terminal é o resíduo mais C-terminal de NGF, e também a precursores que se estendem no C-terminal além do resíduo mais C- terminal de NGF, desde que o NGF seja obtido a partir dele por clivagem proteolítica: embora o precursor tipo selvagem do pró-NGF humano tipo selvagem (SEQID NO: 1) compreenda um dipeptídeo C-terminal (resí- duos de aminoácidos 240 e 241 em SEQ ID NO: 1, a negrito na Figura 1), é preferencial na presente invenção que o precursor não compre- enda um peptídeo clivável C-terminal codificado pela grelha de leitura aberta do NGF tipo selvagem; tal peptídeo clivável C-terminal, no caso de NGF humano, consiste dos dois resíduos de aminoácidos “RA” (240 e 241 em SEQ ID NO: 1).

[0055] Os termos “pré-peptídeo” ou “pré-sequência”, tal como aqui utilizados, geralmente se referem de forma intercambiável a uma se- quência polipeptídica codificada por parte do quadro de leitura aberto do NGF, no N-terminal diretamente adjacente ao pró-peptídeo. Para ilustração: um pré-peptídeo é NGF consiste da sequência que compre- ende a sequência contínua variando do resíduo 1 da SEQ ID NO: 1 ao resíduo 18 da SEQ ID NO: 1. As sequências dos respectivos pré-peptí- deos de precursores de NGF não humano estão disponíveis, por exem- plo, na literatura científica, através de pesquisas de sequência, tal como BLAST, usando as posições 1-18 de SEQ ID NO: 1 como isca, e em bancos de dados públicos de proteínas, como Swissprot. Um polipeptí- deo ou proteína que consiste do pré-peptídeo e de pró-NGF, em que o C-terminal do pré-peptídeo está diretamente adjacente ao N-terminal do pró-NGF, pode ser descrito aqui como “pré-pró-NGF”.

[0056] Os termos “pró-peptídeo” ou “pró-sequência”, tal como aqui utilizados, geralmente se referem de forma intercambiável a uma se- quência polipeptídica codificada na natureza por parte do quadro de lei- tura aberto do NGF, N-terminal diretamente adjacente ao NGF maduro, mas cuja sequência polipeptídica não inclui o pré-peptídeo. Para ilustra- ção: um pró-peptídeo está compreendido no precursor de NGF tipo sel- vagem. O pró-peptídeo do precursor de NGF consiste da sequência que compreende a sequência contínua que varia do resíduo 19 da SEQ ID NO: 1 ao resíduo 121 da SEQ ID NO: 1. As sequências dos respectivos pró-peptídeos de pró-NGF não humanos estão disponíveis, por exem- plo, na literatura científica, através de pesquisas de sequência, tal como BLAST, usando as posições 19-121 da SEQ ID NO: 1 como isca, e em bancos de dados públicos de proteínas, como Swissprot.

[0057] “Pró-NGF”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequên- cia de peptídeo que compreende a parte madura de NGF e o respectivo pró-peptídeo, mas não o respectivo pré-peptídeo. O pró-NGF humano consiste da sequência que compreende a sequência contínua que varia de resíduo 19 da SEQ ID NO: 1 a pelo menos o resíduo 239 da SEQ ID NO: 1. Embora o pró-NGF humano tipo selvagem compreenda um di- peptídeo C-terminal (resíduos de aminoácido 240 e 241 em SEQ ID NO: 1, negrito na Figura 25), é preferencial que o pró-NGF obtido e usado na presente invenção não compreenda um peptídeo clivável C-terminal codificado pelo quadro de leitura aberto de NGF tipo selvagem; tal pep- tídeo clivável C-terminal, no caso de NGF humano, consiste dos dois resíduos de aminoácidos “RA” (240 e 241 em SEQ ID NO: 1). As se- quências de pró-NGF não humano estão disponíveis, por exemplo, na literatura científica, através de pesquisas de sequência, tal como BLAST, usando as posições 19-239 da SEQ ID NO: 1 como isca, e em bancos de dados públicos de proteínas, como Swissprot.

[0058] Os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados de forma intercambiável aqui e referem-se a RNA e DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, DNA sintético e equivalentes de DNA / RNA con- tendo análogos de nucleotídeos, análogos de fosfato e / ou análogos de açúcar. Um ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita simples (isto é, uma fita senso ou uma fita antissenso). Exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem genes, quadros de leitura abertos, fragmentos de genes, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transfe- rência, RNA ribossômico, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinu- cleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, ácidos nucleicos isolados de qualquer tipo e sequência de son- das de ácido nucleico, e iniciadores, bem como análogos de ácido nu- cleico. Os ácidos nucleicos podem ter qualquer tipo de estrutura tridi- mensional.

[0059] O termo “peptídeo” de acordo com a invenção compreende oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias compreendendo dois ou mais, de preferência 3 ou mais, preferencialmente 4 ou mais, preferen- cialmente 6 ou mais, preferencialmente 8 ou mais, preferencialmente 10 ou mais, preferencialmente 13 ou mais, preferencialmente 16 mais, pre- ferencialmente 21 ou mais e até preferencialmente 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular 100 aminoácidos unidos covalentemente a uma cadeia por ligações peptídicas.

[0060] O termo “proteína” refere-se preferencialmente a peptídeos grandes, de preferência a peptídeos com mais de 100 resíduos de ami- noácidos, mas em geral os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” são sinônimos e são usados de forma intercambiável aqui, a menos que o contexto dite de outra forma. Assim, os termos “polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 e “proteína de SEQ ID NO: 4” têm significados idênticos.

[0061] O termo “farmaceuticamente aceitável” geralmente descreve que uma determinada substância pode ser administrada a um indivíduo, opcionalmente e de preferência em combinação com um agente, sem o agente causar efeitos adversos intoleráveis, na dosagem usada.

[0062] Os termos “carreador farmaceuticamente aceitável” e “exci- piente farmaceuticamente aceitável” são usados para se referir a qual- quer um ou mais dos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis e são adequados para administração a um indivíduo como aqui descrito, ou não interferem de outra forma com tal administração. Exemplos de tais carreadores farmaceuticamente aceitáveis compreendem, sem limita- ção, um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combina- ções dos mesmos. Particularmente para o caso de composições farma- cêuticas líquidas, pode ser preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis po- dem compreender ainda substâncias auxiliares, tais como agentes mo- lhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou a eficácia do agente. Um carreador farmaceuticamente acei- tável é tipicamente compreendido em uma composição de acordo com a presente invenção.

[0063] O termo “agente farmaceuticamente ativo” refere-se a um agente que pode ser usado na administração a um indivíduo onde o agente seria benéfico, por exemplo, na melhora dos sintomas de uma doença ou distúrbio. Além disso, um “agente farmaceuticamente ativo” pode ter um efeito positivo ou vantajoso na condição ou estado de do- ença de um indivíduo quando administrado ao indivíduo em uma quan- tidade terapeuticamente eficaz. De preferência, um agente farmaceuti- camente ativo tem propriedades curativas e pode ser administrado para melhorar, atenuar, aliviar, reverter, atrasar o início ou diminuir a gravi- dade de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio. Um agente farmaceuticamente ativo pode ter propriedades profiláticas e pode ser usado para atrasar o início de uma doença ou para diminuir a gravidade de tal doença ou condição patológica. Por exemplo, um agente da in- venção é considerado aqui como um ingrediente farmaceuticamente ativo para o tratamento de fibrose cística, conforme reivindicado. Em outro exemplo, uma proteína farmaceuticamente ativa pode ser usada para tratar uma célula ou um indivíduo que tipicamente não expressa uma proteína, ou não nos níveis desejados, ou que expressa erronea- mente uma proteína, por exemplo, uma proteína farmaceuticamente ativa pode compensar uma mutação, ou por falta de expressão sufici- entemente alta, fornecendo uma proteína desejável. O termo “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa” inclui proteínas ou polipeptídeos inteiros e também pode se referir a fragmentos farmaceuticamente ati- vos dos mesmos. Também pode incluir análogos farmaceuticamente ativos de um peptídeo ou proteína.

[0064] Um “quadro de leitura aberto” ou “ORF” é um trecho contínuo de códons começando com um códon de início e terminando com um códon de terminação.

[0065] Os termos “indivíduo” e “paciente”, conforme usados neste documento, referem-se a um mamífero. Por exemplo, os mamíferos, no contexto da presente invenção, são humanos, primatas não humanos, animais domesticados, incluindo, mas não limitados a cães, gatos, ove- lhas, gado, cabras, porcos, cavalos, etc., animais de laboratório inclu- indo, mas não limitados a camundongos, ratos, coelhos, etc., bem como animais em cativeiro, tal como animais de zoológicos. Os termos “indi- víduo” e “paciente”, conforme usados neste documento, incluem parti- cularmente humanos. O indivíduo (humano ou animal) tem dois conjun- tos de cromossomos; ou seja, o indivíduo é diploide. O termo “paciente” refere-se a um indivíduo que sofre de uma condição, está em risco de sofrer de uma condição, sofreu de uma condição ou está previsto que sofra de uma condição e que pode ser submetido à terapia, por exem- plo, por administração de um agente. A condição do paciente pode ser crônica e / ou aguda. Assim, um “paciente” também pode ser descrito como um indivíduo submetido a uma terapia e / ou em necessidade de uma terapia.

[0066] O termo “terapia” deve ser entendido amplamente e se refere ao tratamento de um indivíduo com o objetivo de prevenir ou tratar uma condição no indivíduo. Em modalidades preferenciais, a terapia inclui especificamente a administração de um agente ao indivíduo.

[0067] O termo “tripsina”, tal como aqui utilizado, geralmente se re- fere a uma enzima proteolítica classificada como EC 3.4.21.4. A tripsina cliva as cadeias de peptídeo principalmente no lado carboxil dos amino- ácidos lisina ou arginina, tipicamente exceto quando qualquer um deles é seguido por prolina. Sem querer se limitar à teoria, entende-se que a tripsina é uma serina protease, e que a tripsina é encontrada natural- mente no sistema digestivo de muitos vertebrados, onde hidrolisa as proteínas. Preferencial na presente invenção é a tripsina de fontes re- combinantes. Embora, in vivo, a tripsina seja formada juntamente com um pró-peptídeo (denominado “tripsinogênio”), o termo “tripsina”, con- forme usado neste documento, preferencialmente se refere à tripsina madura desprovida de qualquer pró-peptídeo. O uso de tripsina para clivagem proteolítica também pode ser descrito como “proteólise de trip- sina” ou “tripsinização”, e as proteínas que resultam da clivagem com tripsina são consideradas “tripsinizadas”.

[0068] Uma “variante” de um precursor de NGF ou do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou 4, refere-se a um polipeptídeo ou proteína em que a sequência de aminoácidos que não faz parte do NGF maduro (beta- NGF) ou não faz parte de SEQ ID NO: 3 ou 4, respectivamente, é ca- racterizada por pelo menos uma mutação em comparação com um pre- cursor de NGF tipo selvagem, tal como com um pró-NGF tipo selvagem ou um pré-pró-NGF tipo selvagem; pelo menos uma dita mutação é pre- ferencialmente encontrada no N-terminal da sequência de aminoácidos do NGF maduro (beta-NGF). Assim, tal como aqui utilizado, uma “vari- ante” de um precursor de NGF ou similar refere-se a um peptídeo ou proteína em que o pré-peptídeo e / ou o pró-peptídeo é caracterizado por pelo menos uma mutação, em relação à sequência de aminoácido do pré-peptídeo e / ou do pró-peptídeo, por exemplo, mas sem limitação, as variantes descritas em WO 2013/092776 A1 e em US 2018/0086805 A1. Para ilustração, o documento WO 2013/092776 A1 descreve “vari- antes” de pró-NGF em que o sítio de clivagem pela furina (tipo selva- gem) está ausente devido a uma ou mais mutações específicas.

[0069] O termo “vetor” ou “vetor de clonagem” geralmente se refere a um ácido nucleico que pode ser introduzido em uma célula hospe- deira. Os vetores exemplificativos incluem, sem limitação, plasmídeos, fagos e todos os outros tipos de ácidos nucleicos que podem ser intro- duzidos em uma célula hospedeira. O termo “vetor” deve ser compreen- dido de forma ampla e compreenderá vetores que codificam um peptí- deo ou proteína para expressão heteróloga (tais vetores podem servir como modelos, para a geração de transcritos), e aqueles que não o fa- zem. Os vetores do primeiro tipo conterão um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína ou peptídeo, que pode ser expresso, quando o vetor está presente em uma célula hospedeira. Embora o tipo de vetor que o versado na técnica escolher dependerá do tipo de célula hospe- deira que o versado escolherá, em um caso particular, os vetores de clonagem para todas as células hospedeiras comuns, incluindo E. coli, estão comercialmente disponíveis, e o versado na técnica, assim, esco- lherá um vetor particular levando em consideração a célula hospedeira escolhida.

[0070] O termo “tipo selvagem” é usado aqui para se referir a um gene ou uma proteína tipicamente encontrada na natureza, preferenci- almente em um indivíduo saudável. Um gene ou proteína que não é de “tipo selvagem” é aqui descrito como “mutante” ou “mutado” ou simila- res. Para ilustração, SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácidos de um precursor de NGF humano tipo selvagem; SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos do NGF humano tipo selvagem.

[0071] A presente invenção é baseada em vários achados, que es- tão inter-relacionadas e, portanto, em conjunto, levam os inventores a chegar aos vários aspectos da invenção, que serão todos descritos in- dividualmente a seguir.

[0072] O agente de acordo com a presente invenção

[0073] A presente invenção fornece um agente para o tratamento e

/ ou prevenção de distúrbios dermatológicos em um indivíduo mamífero. O agente que pode ser usado na administração a um indivíduo onde o agente seria benéfico, por exemplo, na melhora dos sintomas de uma doença ou distúrbio. Em particular, o agente útil na presente invenção é um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Assim, a pre- sente invenção, em particular, fornece um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 para uso em terapia. A terapia tipicamente com- preende a administração do dito polipeptídeo a um corpo humano ou animal, conforme descrito abaixo.

[0074] De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 são fornecidos como agentes farmaceu- ticamente ativos. Pela presente invenção, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é fornecido para uso médico, em particular para o tratamento e / ou prevenção de distúrbios dermatológicos em um indi- víduo mamífero. Opcionalmente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é de uma fonte recombinante. Assim, a presente invenção fornece também o polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 para uso médico, como aqui descrito.

[0075] O agente de acordo com a presente invenção, também de- nominado aqui “polipeptídeo de SEQ ID NO: 3” ou “polipeptídeo de SEQ ID NO: 4” será agora descrito em mais detalhes. O termo “polipeptídeo de SEQ ID NO: 3” e termos similares denotam aqui um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3 e / ou um agente com atividade biológica equivalente. O termo “poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4” e termos similares denotam aqui um poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 4 e / ou um agente com atividade biológica equivalente. Assim, dentro destes termos, o termo também inclui partes funcional- mente equivalentes ou análogos de tais polipeptídeos. Um exemplo de uma parte biologicamente equivalente do polipeptídeo pode ser um do- mínio ou subsequência do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou do polipep- tídeo da SEQ ID NO: 4, que inclui o sítio de ligação para permitir que o domínio ou subsequência exerça substancialmente a mesma atividade biológica do polipeptídeo de comprimento total de SEQ ID NO: 3 ou do polipeptídeo de comprimento total de SEQ ID NO: 4 ou, alternativa- mente, um gene codificando tal polipeptídeo. O termo “substancial- mente a mesma atividade biológica” refere-se a uma parte equivalente ou polipeptídeo análogo tendo pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferenci- almente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e mais preferen- cialmente pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 nos ensaios descritos nos Exemplos 3 e 4. Um exemplo de um análogo biologicamente equivalente do polipeptídeo pode ser uma pro- teína de fusão que inclui pelo menos uma parte da sequência de ami- noácidos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, mas também pode ser um análogo homólogo do polipeptídeo. Além disso, moléculas completamente sintéticas que simulam a ativi- dade biológica específica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 constituiriam “análogos biologicamente equi- valentes”.

[0076] Mais preferencialmente, o termo “polipeptídeo de SEQ ID NO: 3” e termos similares denotam aqui um polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3; tais agentes são opcionalmente proteínas de fusão que compreendem, en- tre outros, a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3. Mais preferencialmente, o termo “polipeptídeo de SEQ ID NO: 3” e termos similares denotam aqui um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3. Nesta modalidade, o agente consiste em um polipeptídeo consistindo dos 118 resíduos de aminoá- cidos em ordem sequencial conforme definido pela SEQ ID NO: 3. Nesta e em outras modalidades, o polipeptídeo carrega opcionalmente uma ou duas ou três ligações de cisteína internas, de modo que resíduos de cisteína (Cys, C) são covalentemente ligados uns aos outros para for- mar pontes dissulfeto intramoleculares. As ligações de cisteína são de preferência equivalentes às do NGF humano tipo selvagem.

[0077] Igualmente mais preferencialmente, o termo “polipeptídeo de SEQ ID NO: 4” e termos similares denotam aqui um polipeptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 4; tais agentes são opcionalmente proteínas de fusão que compreendem, entre outros, a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 4. Mais preferencialmente, o termo “polipeptídeo de SEQ ID NO: 4” e ter- mos similares denotam aqui um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 4. Nesta modalidade, o agente consiste em um polipeptídeo consistindo dos 118 resíduos de aminoá- cidos em ordem sequencial conforme definido pela SEQ ID NO: 4. Nesta e em outras modalidades, o polipeptídeo carrega opcionalmente uma ou duas ou três ligações de cisteína internas, de modo que resíduos de cisteína (Cys, C) são covalentemente ligados uns aos outros para for- mar pontes dissulfeto intramoleculares. As ligações de cisteína são de preferência equivalentes às do NGF humano tipo selvagem.

[0078] O polipeptídeo da presente invenção pode ser opcional- mente caracterizado por outras modificações pós-tradução. Essas mo- dificações pós-tradução incluem opcionalmente glicosilação e / ou fos- forilação. De preferência, no entanto, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção está livre de glicosilação e / ou fosforilação. Na ver- dade, considerando que os exemplos experimentais neste documento demonstram um efeito benéfico na cura de distúrbio de pele e uma re- lação benefício-efeito adverso benéfico, em que o polipeptídeo utilizado foi obtido por expressão recombinante citosólica em bactérias, que tipi- camente não resulta em glicosilação e / ou fosforilação, é plausível que o efeito benéfico da presente invenção não dependa desse tipo de mo- dificação pós-tradução. Portanto, em modalidades preferenciais, o poli- peptídeo de acordo com a presente invenção não é caracterizado por glicosilação e / ou fosforilação.

[0079] Tipicamente, o polipeptídeo de acordo com a presente inven- ção é um polipeptídeo não natural que não é produzido naturalmente pelo indivíduo ao qual o polipeptídeo é administrado. Isto está associado não apenas com a vantagem de detectabilidade no indivíduo pós-admi- nistração, mas também evidências de que a administração (a partir de uma fonte externa, tal como, por exemplo, as composições preparadas de acordo com a presente descrição) precisa ser administrada ao indi- víduo a fim de alcançar sucesso no tratamento ou prevenção da doença.

[0080] De preferência, o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção é um polipeptídeo isolado. Mais preferencialmente, o polipeptí- deo de acordo com a presente invenção é essencialmente livre de pro- teínas da célula hospedeira, produtos de degradação (tal como a vari- ante des-nona, por exemplo) e protease (tal como a tripsina, por exem- plo). Quando o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é es- sencialmente livre de proteínas da célula hospedeira, produtos de de- gradação (tal como a variante des-nona, por exemplo) e protease (tal como tripsina, por exemplo), ele também pode ser descrito como “poli- peptídeo puro”. De preferência, o polipeptídeo de acordo com a pre- sente invenção é administrado como polipeptídeo puro. Mais preferen- cialmente, o polipeptídeo puro consistindo de SEQ ID NO: 3 e / ou o polipeptídeo puro consistindo de SEQ ID NO: 4 tem uma porcentagem em peso de 90% ou mais, preferencialmente 92% ou mais, mais prefe- rencialmente 93% ou mais, mais preferencialmente 94% ou mais, mais preferencialmente 96% ou mais, mais preferencialmente 97% ou mais, mais preferencialmente 98% ou mais, mais preferencialmente 99% ou mais, mais preferencialmente 99,2% ou mais, mais preferencialmente 99,4% ou mais, mais preferencialmente 99,6% ou mais, mais preferen- cialmente 99,8% ou mais, mais preferencialmente 99,9% ou mais, em relação à proteína total na composição. Tal polipeptídeo puro está dis- ponível com base na descrição aqui fornecida, incluindo os Exemplos 1 e 2. Mais preferencialmente, o polipeptídeo puro de acordo com a pre- sente invenção tem um grau de pureza compatível com Boas Práticas de Fabricação (GMP).

[0081] Conforme demonstrado nos experimentos aqui fornecidos, particularmente nos Exemplos 3 e 4, a administração do agente de acordo com a presente invenção não induziu qualquer síndrome hipe- ralgésica (dor), apesar do fato de que o agente foi colocado em contato direto com fibras nociceptivas totalmente expostas (nervos); elas são consideradas totalmente expostas devido à falta de pele, e são consi- deradas hiperativadas em decorrência da lesão cutânea. A ausência de dor neste cenário extremo é particularmente notável porque o agente foi administrado por via tópica e repetidamente na pele danificada, também em um cenário crônico (para detalhes, consultar os Exemplos). Isto tam- bém é particularmente notável em vista dos desanimadores estudos an- teriores com NGF humano exposto a uma área inervada, ou seja, uma área caracterizada por nociceptores expostos (Svensson e outros, 2003, Pain, vol. 104, pág. 241 a 247). Os achados surpreendentes acima não podem ser explicados apenas pelo fato de que o agente de acordo com a presente invenção foi anteriormente descrito como “indo- lor”, uma vez que sua capacidade de induzir dor nunca foi investigada experimentalmente em uma área inervada, ou seja, uma área caracteri- zada por nociceptores expostos, quanto mais nervos hiperativados, como no caso de uma lesão cutânea. Além disso, embora a administra- ção do agente de acordo com a presente invenção seja causadora da reinervação do tecido (ver, por exemplo, Exemplo 3), a administração não está associada a dor. Além disso, o efeito positivo do agente de acordo com a presente invenção na angiogênese (ver exemplos experi- mentais) é surpreendente e não era previsível com base no estado da técnica. A angiogênese é considerada de particular importância para a formação de tecidos e fechamento de feridas. Em resumo, a combina- ção desses efeitos vantajosos é altamente surpreendente face ao es- tado da técnica.

[0082] Opcionalmente, de acordo com a presente invenção, o poli- peptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo em necessidade de tratamento. Deta- lhes da administração, a quantidade eficaz e do indivíduo em necessi- dade de tratamento são descritos abaixo.

[0083] Os polipeptídeos que consistem de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, diferem em uma ou duas posições da sequên- cia de aminoácidos do fator de crescimento do nervo humano (NGF, também descrito como NGF humano tipo selvagem ou NGF tipo selva- gem, ver SEQ ID NO: 2). A diferença do polipeptídeo de acordo com a presente invenção em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 tem um efeito notável no tratamento ou prevenção de distúrbios de pele e na ausência de efeitos colaterais, conforme descrito em detalhes neste do- cumento e suportado pelos exemplos experimentais aqui fornecidos.

[0084] O fator de crescimento do nervo (NGF) é uma neurotrofina necessária para o desenvolvimento e sobrevivência de populações neu- ronais específicas. O NGF é um peptídeo homodimérico que desenca- deia naturalmente a proliferação e homeostase dos neurônios. No corpo, o NGF liga-se a pelo menos dois tipos de receptores: o receptor da tropomiosina quinase A (TrkA) e o receptor de neurotrofina NGF de baixa afinidade p75 (LNGFR / p75NTR / p75). Ambos estão associados a certos distúrbios em humanos e animais, embora os respectivos meca- nismos de ação sejam provavelmente diferentes. Várias aplicações te- rapêuticas para NGF foram propostas, mas poucas amadureceram no mercado.

[0085] No entanto, muitos usos terapêuticos de NGF que foram con- siderados no passado não amadureceram para produtos terapêuticos de NGF comercializados, e uma razão pode ser vista em que NGF, além do efeito desejado na proliferação e homeostase de neurônios, está as- sociado à dor: ele pode, quando administrado topicamente ou sistemi- camente, causar hiperalgesia (Lewin e outros, 1994, Eur. J. Neurosci., vol. 6, pág. 1903 a 1912; Della Seta e outros, 1994, Pharmacol. Bio- chem. Behav., vol. 49, pág. 701; Dyck e outros, 1997, Neurology, vol. 48, 501 a 505; McArthur, e outros, 2000, Neurology, vol. 54, pág. 1080 a 1088; Svensson e outros, 2003 Pain, vol. 104, pág. 241 a 247; Ruiz e outros, 2004, Brain Res., Vol. 1011, pág. 1 a 6). Como uma solução, foram desenvolvidas versões mutantes de NGF (“muteínas”), que estão associadas à redução da atividade nociceptiva (“NG indolor”) e que são caracterizadas por pelo menos uma mutação no domínio do NGF que interage com o receptor TrkA (WO 2008/006893 A1, Malerba e outros PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425). No entanto, tais polipeptídeos até agora não estão disponíveis ao público em pureza farmaceuticamente aceitável, e não foram propostos ou desenvolvidos para o tratamento ou prevenção de distúrbios dermatológicos da pele, possivelmente também em vista do preconceito e da experiência negativa geral com pesquisas sobre fatores de crescimento neste campo terapêutico em geral.

[0086] De acordo com a presente invenção, a estabilidade e, por- tanto, a pureza de longo prazo do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de

SEQ ID NO: 4 do mesmo pode ser obtida e / ou melhorada pelos aspec- tos e modalidades aqui descritos. Assim, a presente descrição não ape- nas disponibiliza um novo tratamento ou prevenção para um distúrbio dermatológico, mas também fornece o agente adequado para tal trata- mento ou prevenção, em um grau de pureza adequado para aplicações terapêuticas, incluindo administração a um mamífero. O agente da pre- sente invenção não estava previamente disponível ao público em tal grau de pureza vantajoso.

[0087] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 não é encontrado na natureza e também pode ser descrito como um polipep- tídeo não natural. Assim, o agente de acordo com a presente invenção não é NGF tipo selvagem e, em particular, não é NGF humano tipo sel- vagem.

[0088] De preferência, o polipeptídeo não natural de acordo com a presente invenção é fornecido com pureza elevada. Opcionalmente, o polipeptídeo compreende pontes dissulfeto internas. Opcionalmente, o polipeptídeo está devidamente dobrado. Opcionalmente, o polipeptídeo é solúvel em um meio aquoso.

[0089] A presente invenção é, em parte, baseada em experimentos com dois modelos animais de úlceras de pele. Nestes modelos, as úl- ceras de pele são induzidas em ratos diabéticos por punção de biópsia circular ou por ciclos de carregamento de pressão, e o polipeptídeo da invenção é aplicado topicamente. O polipeptídeo induziu uma melhora significativa e dose-dependente no tempo de cicatrização das úlceras em comparação com os animais tratados com placebo. Esta melhora foi evidente em doses desprovidas de efeitos colaterais relacionados à dor, demonstrando assim um benefício potencial sobre o estado da técnica.

[0090] Em particular, os dados gerados em modelos in vivo de úl- ceras de pele diabéticas demonstraram que o polipeptídeo da presente invenção é indolor, ainda retém a atividade de direcionamento do sis- tema receptor de NGF e, assim, fornece como um meio terapêutico para o tratamento ou prevenção de distúrbios dermatológicos. Na verdade, o polipeptídeo da invenção retém as propriedades tróficas do NGF tipo selvagem na angiogênese e reinervação que favorece a cicatrização da úlcera sem exercer os efeitos pró-nociceptivos do NGF tipo selvagem no sítio de aplicação tópica e no nível sistêmico.

[0091] A presente invenção fornece um polipeptídeo para uso no tratamento e / ou prevenção de um distúrbio dermatológico em um indi- víduo mamífero, em que o polipeptídeo é selecionado dentre o polipep- tídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Assim, a presente invenção também fornece o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 para uso em um método para uso no tratamento do corpo humano ou animal por terapia, como aqui descrito.

[0092] Mais particularmente, a presente invenção se refere a um uso terapêutico específico do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 e do poli- peptídeo da SEQ ID NO: 4, em que o uso terapêutico específico é o tratamento e / ou prevenção de um distúrbio dermatológico em um indi- víduo mamífero. Assim, a presente invenção também fornece o polipep- tídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 para uso em um método para uso no tratamento do corpo humano ou animal por te- rapia, em que a terapia compreende o tratamento e / ou prevenção de um distúrbio dermatológico em um indivíduo mamífero. O indivíduo ma- mífero é tipicamente um indivíduo caracterizado pela necessidade de tal tratamento.

[0093] O polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, bem como o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, é caracterizado por uma mutação da sequência de aminoácidos do NGF humano (hNGF, SEQ ID NO: 2), em que a dita mutação está associada à atividade nociceptiva reduzida. Em particular, a arginina na posição 100 do hNGF é substituída por ácido glutâmico. A presente invenção é baseada, em parte, no achado surpreendente de que um efeito terapêutico pode ser alcançado sem os efeitos colaterais conhecidos da técnica anterior.

[0094] Sem desejar estar vinculado a uma teoria particular, é prefe- rencial que o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compre- enda uma ou mais pontes dissulfeto, e mais preferencialmente três pon- tes dissulfeto. O NGF humano maduro e devidamente dobrado é carac- terizado por três pontes dissulfeto (posições de ligação 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231, os números das posições referem-se a SEQ ID NO: 1; ver Wiesmann e outros, 1999, Nature, vol. 401, pág. 184 a 188). Sem desejar estar vinculado a uma teoria particular, é preferencial que o po- lipeptídeo de acordo com a presente invenção compreenda pontes dis- sulfeto equivalentes (os números de posição das quais estão disponí- veis para o versado na técnica alinhando o polipeptídeo de acordo com a presente invenção com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e Wiesmann e outros, acima).

[0095] Descrição da presença e ausência de efeitos adversos

[0096] De preferência, o tratamento e / ou prevenção não causa efeitos colaterais ou efeitos adversos no indivíduo ao qual o polipeptídeo é administrado ou foi administrado. Um efeito colateral ou efeito adverso que está preferencialmente ausente neste contexto é a hiperalgesia ou dor. Assim, de preferência, a administração do agente de acordo com a presente invenção não induz qualquer síndrome hiperalgésica (dor).

[0097] É importante salientar que a ausência de dor não causa ape- nas um tratamento mais agradável (ou menos desagradável) do que a administração de um composto de referência associado à dor (tal como NGF tipo selvagem), mas é pelo menos em parte causador para o su- cesso do tratamento ou prevenção de distúrbio de pele como tal: consi- derando que o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é pre-

ferencialmente administrado topicamente, mais preferencialmente ad- ministrado topicamente no sítio do distúrbio de pele (por exemplo, úl- cera), a ausência de dor permitirá ao indivíduo tratado aceitar a admi- nistração do polipeptídeo na superfície corporal sem reações adversas, tal como raspagem ou lavagem ou de outra forma removê-lo a fim de usar para a dor e, como um resultado disso, o polipeptídeo permanecerá exposto à superfície corporal ferida exerce um efeito terapeuticamente benéfico, tal como o tratamento ou a prevenção de distúrbio de pele. Assim, a ausência de dor associada ao polipeptídeo da presente inven- ção será adequada para superar a relutância do consumidor e as preo- cupações das autoridades reguladoras. Em outras palavras, a ausência de dor está associada a um aumento significativo na relação benefício- risco em comparação com os agentes associados à dor.

[0098] Em particular, de preferência, o tratamento e / ou prevenção não causa hiperalgesia no indivíduo mamífero. Em uma modalidade, o indivíduo ao qual o polipeptídeo da invenção é administrado não sofre de alodinia mecânica. Mais precisamente, a alodinia mecânica não é induzida no indivíduo ao qual o polipeptídeo da invenção é administrado, de modo que o indivíduo ao qual o polipeptídeo é administrado não sofre de alodinia mecânica.

[0099] Em uma modalidade, o indivíduo ao qual o polipeptídeo da invenção é administrado não sofre de alodinia térmica. Mais precisa- mente, a alodinia térmica não é induzida no indivíduo ao qual o polipep- tídeo da invenção é administrado, de modo que o indivíduo ao qual o polipeptídeo é administrado não sofre de alodinia térmica.

[0100] Um outro efeito colateral ou efeito adverso que está prefe- rencialmente ausente neste contexto é malignidade ou câncer. Em par- ticular, a administração do polipeptídeo da presente invenção a um in- divíduo não está de preferência associada a crescimento celular anor- mal e, ainda mais preferencialmente, não está associada a crescimento celular anormal com potencial para invadir ou se espalhar para outras partes do corpo. É particularmente preferencial que a administração do polipeptídeo da presente invenção a um indivíduo não esteja preferen- cialmente associada a câncer de pele, em particular da derme ou da epiderme. Nesse aspecto, o tratamento ou administração de acordo com a presente invenção está associado a vantagens significativas em comparação com o estado da técnica, tais como, por exemplo, o trata- mento comercial com fator de crescimento derivado de plaquetas (be- clapermina, marca Regranex). Assim, espera-se que a ausência de ma- lignidade associada ao polipeptídeo da presente invenção seja ade- quada para superar a relutância do consumidor e as preocupações das autoridades reguladoras. Em outras palavras, a ausência de maligni- dade está associada a um aumento significativo na relação benefício- risco em comparação com os agentes associados à malignidade.

[0101] Assim, em resumo, de preferência, a administração do poli- peptídeo da presente invenção a um indivíduo não está associada a efeitos adversos, tal como malignidade e / ou dor.

[0102] Tipicamente, a administração do agente de acordo com a presente invenção é bem tolerada pelo indivíduo. Em particular, de pre- ferência, a administração do polipeptídeo de acordo com a presente in- venção não está associada com a formação de anticorpos antifármaco no indivíduo. De fato, como a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de acordo com a presente invenção difere em apenas uma ou duas po- sições de aminoácidos do NGF humano tipo selvagem, é plausível que a tolerabilidade imunológica em humanos seja particularmente vanta- josa, e é plausível que a administração do polipeptídeo da presente in- venção não esteja associada à formação de anticorpos antifármaco em humanos.

[0103] Preferencialmente, a administração de acordo com a pre- sente invenção influencia positivamente em um ou mais dos seguintes:

inflamação, deposição de matriz extracelular, inervação e angiogênese.

[0104] Detectabilidade do polipeptídeo

[0105] De preferência, o polipeptídeo para uso de acordo com a pre- sente invenção pode ser reconhecido seletivamente por um reagente específico em relação ao NGF endógeno (por exemplo, humano). Os termos “seletivamente reconhecido” e “detectável” são usados de forma intercambiável aqui e geralmente se referem à identificação específica, de preferência por meios moleculares, da proteína, em uma amostra bi- ológica.

[0106] Nesse aspecto, o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção é preferencialmente detectável por um anticorpo ou outra molé- cula imunorreativa.

[0107] Uma proteína detectável por um anticorpo ou outra molécula imunorreativa também pode ser descrita como um antígeno. Em algu- mas modalidades, uma amostra biológica pode ser caracterizada por exibir – ou não exibir – um ou mais antígenos específicos. No contexto da presente invenção, o polipeptídeo administrado ao indivíduo é prefe- rencialmente detectável em uma amostra biológica obtida a partir do in- divíduo após a administração do polipeptídeo. Uma forma não limitante de mostrar a presença de uma proteína é por Western Blot, mas outros métodos imunológicos estão igualmente incluídos no contexto da pre- sente invenção. O próprio anticorpo ou outra molécula imunorreativa é ou marcado (por exemplo, marcado com fluoróforo) ou reconhecido por um anticorpo secundário marcado ou outra molécula imunorreativa, que é adicionada para esse propósito. Assim, em alguns casos, uma molé- cula secundária que auxilia na detecção, tal como, por exemplo, um an- ticorpo secundário opcionalmente marcado, também é adicionado para facilitar a detecção.

[0108] De acordo com a invenção, diz-se que um antígeno está pre- sente em uma amostra biológica se o nível estiver acima do limite de detecção e / ou se o nível for alto o suficiente para permitir a ligação de anticorpos antígeno-específicos adicionados à amostra. De acordo com a invenção, diz-se que um antígeno não é expresso em uma célula se o nível de expressão estiver abaixo do limite de detecção e / ou se o nível de expressão for muito baixo para permitir a ligação de anticorpos antí- geno-específicos adicionados à amostra.

[0109] Um anticorpo ou outra molécula imunorreativa pode reco- nhecer um epítopo na célula. O termo “epítopo” refere-se a um determi- nante antigênico em uma molécula tal como um antígeno, ou seja, a uma parte ou fragmento da molécula que é reconhecido, ou seja, ligado, pelo sistema imunológico, por exemplo, que é reconhecido por um anti- corpo ou outra molécula imunorreativa. A detecção de um epítopo es- pecífico para qualquer antígeno particular tipicamente permite concluir que aquele antígeno particular está presente na célula sendo analisada.

[0110] Em uma modalidade, uma amostra obtida a partir de um in- divíduo, em particular o indivíduo ao qual o polipeptídeo de acordo com a presente invenção foi administrado, pode ser caracterizada por imu- nofenotipagem. “Imunofenotipagem” geralmente significa que a célula ou amostra pode ser caracterizada por moléculas antígeno-específicas, tal como anticorpos ou outras moléculas imunorreativas, que são adici- onadas à amostra para determinar se um antígeno está presente. A imu- nofenotipagem inclui a classificação de células usando vários métodos, incluindo citometria de fluxo, bem como métodos analíticos em células lisadas e amostras lisadas, tal como Western Blotting.

[0111] Na presente invenção, um polipeptídeo que pode ser detec- tado especificamente mesmo na presença de NGF tipo selvagem, tal como NGF humano tipo selvagem, é particularmente preferencial. Em- bora qualquer mutação de uma sequência de aminoácidos, tal como qualquer mutação pontual, por exemplo, possa tornar um polipeptídeo especificamente detectável, mesmo na presença do respectivo polipep- tídeo tipo selvagem não mutado e, portanto, cada um do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser detectado especificamente à primeira vista, mesmo na presença de NGF humano tipo selvagem, é particularmente o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 para o qual um anticorpo está disponível que pode distinguir o dito polipeptí- deo de NGF humano tipo selvagem (WO 2008/006893 A1).

[0112] Assim, preferencialmente o polipeptídeo é caracterizado por pelo menos a ausência de prolina (que está presente na posição 61 da SEQ ID NO: 2, para referência) na posição 61, mais preferencialmente pela substituição da prolina na posição 61 por outro aminoácido. Em uma modalidade particularmente preferencial, a prolina na posição 61 é substituída por serina. Nesta modalidade preferencial, o polipeptídeo para uso de acordo com a presente invenção é o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Este polipeptídeo é caracterizado por pelo menos a ausência de prolina na posição 61, mais preferencialmente pela substituição de prolina na posição 61 por outro aminoácido. Na SEQ ID NO: 4, prolina na posição 61 da SEQ ID NO: 3 é substituída por serina.

[0113] Superfície corporal ferida

[0114] De acordo com a presente invenção, a superfície corporal ferida é submetida à administração do polipeptídeo da invenção.

[0115] As superfícies corporais feridas incluem, sem limitação, úlce- ras (úlceras venosas, úlceras arteriais, úlceras por pressão, úlceras di- abéticas), feridas pós-cirúrgicas, escaras, queimaduras, lacerações, in- cisões, hematomas, abrasões, feridas por punção e similares. Os indi- víduos com tal superfície corporal ferida serão descritos mais abaixo, e a seguinte descrição da superfície corporal ferida é aplicável a todos esses indivíduos, a menos que o contexto dite o contrário.

[0116] Em uma modalidade, o agente de acordo com a presente invenção é fornecido neste documento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio de pele, em que o distúrbio de pele é selecionado a partir de úlceras, feridas pós-cirúrgicas, escaras, queimaduras, lacera- ções, incisões, hematomas, escoriações e feridas de punção.

[0117] Em uma modalidade, o agente de acordo com a presente invenção é fornecido neste documento para o tratamento de prevenção de uma úlcera, em que a úlcera é selecionada a partir de úlceras veno- sas, úlceras arteriais, úlceras por pressão e úlceras diabéticas.

[0118] Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 1 mm ou mais. Em geral, quando referência é feita aqui ao “diâmetro” de uma superfície corporal ferida, para superfícies corpo- rais feridas não circulares, o termo “diâmetro” refere-se ao maior diâme- tro da superfície corporal ferida, medido a partir de uma borda da super- fície corporal ferida através da superfície corporal ferida até a borda oposta da superfície corporal ferida. Para superfícies corporais feridas circulares, o diâmetro é obviamente igual para qualquer direção de me- dição através de uma borda da superfície corporal ferida através da su- perfície corporal ferida até a borda oposta da superfície corporal ferida. O diâmetro pode ser determinado com uma régua ou outro meio ade- quado na superfície externa da superfície corporal ferida.

[0119] Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 1 mm a 50 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 2 mm a 20 cm. As superfícies cor- porais feridas com um diâmetro de 0,5 cm ou mais, de preferência 1 cm ou mais, também podem ser descritas aqui como superfícies corporais feridas “grandes”. A presente invenção também é adequada para o tra- tamento de grandes superfícies corporais feridas, tais como grandes úl- ceras (ver, por exemplo, Exemplo 4). Em algumas modalidades, a su- perfície corporal ferida tem um diâmetro de 3 mm a 10 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 4 mm a 5 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâ- metro de 5 mm a 4 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 6 mm a 3 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 7 mm a 1 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâmetro de 8 mm a 1 cm. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida tem um diâ- metro de cerca de 6 mm. Em algumas modalidades, a superfície corpo- ral ferida tem um diâmetro de cerca de 12 mm.

[0120] Indivíduos para os quais o agente de acordo com a presente invenção é particularmente adequado

[0121] De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 pode ser administrado a um indivíduo em necessidade de tal administração. Um indivíduo em necessidade de tal administração pode ser um indivíduo que sofre de um distúrbio aqui des- crito, um indivíduo em risco de sofrer de tal distúrbio ou de outra forma afligido por tal distúrbio. O agente é administrado ao indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade terapeuticamente efi- caz pode ser determinada pelo médico tendo em vista a descrição aqui fornecida.

[0122] Em particular, o polipeptídeo de acordo com a invenção é administrado a um indivíduo mamífero. O indivíduo também pode ser descrito como “paciente”. Mais preferencialmente, o indivíduo mamífero é um ser humano.

[0123] A presente invenção também se refere a um método de tra- tamento de um paciente que sofre de um distúrbio dermatológico, em que o método compreende administrar uma quantidade eficaz do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 3 ou do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ao pa- ciente. Os termos “paciente” e “indivíduo” são usados de forma inter- cambiável neste documento, particularmente com referência a um paci- ente / indivíduo caracterizado por um distúrbio dermatológico, conforme descrito neste documento.

[0124] De preferência, o distúrbio dermatológico é caracterizado por uma superfície ferida em pelo menos uma parte do corpo do indivíduo. De preferência, o distúrbio dermatológico é caracterizado por uma su- perfície ferida (superfície corporal ferida). As superfícies corporais feri- das foram descritas, por exemplo, acima, e a seguinte descrição dos indivíduos é aplicável a todas as superfícies corporais feridas em tais indivíduos, a menos que o contexto dite o contrário.

[0125] Mais preferencialmente, o distúrbio dermatológico é ou com- preende uma lesão de pele, de preferência uma lesão de pele caracte- rizada por pelo menos ablação parcial da derme e, opcionalmente, da derme. Em uma modalidade, a superfície corporal ferida é ou compre- ende uma lesão, particularmente uma lesão da pele.

[0126] Embora termos como “distúrbio dermatológico”, “ferida”, “su- perfície corporal ferida”, “ferida crônica”, “úlcera” e outros termos sejam usados na forma singular neste documento, a presente invenção tam- bém é aplicável a indivíduos tendo múltiplos distúrbios dermatológicos, feridas, superfícies corporais feridas, feridas crônicas, úlceras e outros distúrbios similares.

[0127] De preferência, a superfície corporal ferida compreende pelo menos uma ferida crônica. Assim, a administração do agente de acordo com a presente invenção é adequada para o tratamento ou prevenção de pelo menos uma ferida crônica. No contexto da presente invenção, o termo “ferida crônica” deve ser entendido de forma ampla e inclui, sem limitações, úlceras de todos os tipos, se ou não explicitamente mencio- nados nesta descrição, escaras, queimaduras, ablações mecânicas da pele. Em particular, as feridas que não cicatrizam nas janelas de tempo típicas da cicatrização em indivíduos saudáveis da respectiva espécie estão incluídas no termo. Além disso, todas as feridas na superfície cor- poral de um indivíduo que não cicatrizaram e / ou fecham por sete dias ou mais, tal como 14 dias ou mais, 21 dias ou mais, 1 mês ou mais, ou um ano ou mais, estão incluídas nos termos “ferida crônica”. O agente de acordo com a presente invenção pode ser administrado a todos es- ses tipos de feridas crônicas, a fim de tratar ou prevenir essas feridas crônicas.

[0128] No contexto da presente invenção, o termo “prevenir” deve ser entendido de forma ampla e inclui não apenas a prevenção do início do distúrbio, mas também a prevenção da progressão do distúrbio. Em particular, no contexto de uma superfície corporal ferida, tal como uma ferida crônica, por exemplo, uma úlcera, o termo “prevenir” também in- clui a prevenção de progressão adicional da extensão da superfície cor- poral ferida, tal como aprofundamento adicional da superfície corporal ferida e / ou aumento no diâmetro da superfície corporal ferida.

[0129] No contexto da presente invenção, o termo “tratar” deve ser entendido de forma ampla e inclui, sem limitação, a melhora dos sinto- mas do distúrbio. Na verdade, é preferencial e também demonstrado pelos exemplos experimentais aqui descritos que conseguir a melhora do distúrbio dermatológico, tal como, por exemplo, o fechamento (par- cial) de uma ferida é uma parte integrante preferencial da invenção como reivindicado aqui. Na verdade, atingir o efeito terapêutico reivindi- cado é uma característica técnica funcional da presente invenção. Os exemplos aqui apresentados tornam plausível que a dita característica técnica funcional seja alcançável como um resultado direto da adminis- tração do polipeptídeo da presente invenção. Em outras palavras, os presentes inventores identificaram que o polipeptídeo da presente in- venção é causador para conseguir uma melhora em um indivíduo que sofre de uma doença dermatológica. O distúrbio dermatológico é prefe- rencialmente caracterizado por uma superfície corporal ferida.

[0130] A presente invenção é particularmente adequada para um subgrupo de indivíduos que sofrem de um distúrbio dermatológico. Es- ses subgrupos são descritos aqui. Também é possível que um determi- nado indivíduo esteja em um ou mais dos subgrupos descritos neste documento; a administração do polipeptídeo de acordo com a presente invenção a indivíduos que estão em um dos subgrupos descritos neste documento está igualmente compreendida pela presente invenção como a administração do polipeptídeo de acordo com a presente inven- ção a indivíduos que estão em mais de um dos subgrupos descritos neste documento.

[0131] A invenção não está limitada a causas particulares da super- fície corporal ferida. Por exemplo, as causas diabéticas estão incluídas na invenção, bem como as causas não diabéticas.

[0132] A superfície corporal ferida pode estar em qualquer uma ou mais partes do corpo. São preferenciais as superfícies corporais feridas nas extremidades, tal como os braços (incluindo as mãos) e as pernas (incluindo os pés), mas as superfícies corporais feridas no torso ou na cabeça ou outras partes do corpo podem ser submetidas à administra- ção do polipeptídeo da invenção também. Em algumas modalidades, a superfície corporal ferida está em uma perna ou pé e, mais preferenci- almente, em um pé. Essas modalidades são frequentes em indivíduos diabéticos, mas a administração a tal superfície corporal ferida particular não está limitada a indivíduos diabéticos.

[0133] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para administração a um indivíduo que foi subme- tido à cirurgia. Consequentemente, o polipeptídeo de acordo com a pre- sente invenção é adequado para tratar ou prevenir uma ou mais com- plicações pós-operatórias, tais como escaras e / ou para tratar feridas cirúrgicas.

[0134] De preferência, a superfície corporal ferida compreende pelo menos uma úlcera. De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo pode ser administrado a pelo menos uma parte da superfície corporal ferida. “Pelo menos uma parte de”, tal como aqui utilizado, inclui qual- quer razão entre 0 e 100%, tal como entre 10 e 90%, entre 20 e 80%, entre 30 e 70%, entre 40 e 60%, e cerca de 50 %; assim, o polipeptídeo pode ser administrado a toda a superfície corporal ferida ou a qualquer parte dela. Opcionalmente, a administração também inclui a área da pele adjacente à superfície corporal ferida.

[0135] De preferência, o distúrbio dermatológico compreende pelo menos uma úlcera. De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo pode ser administrado a pelo menos uma parte de uma úlcera. “Pelo menos uma parte de”, tal como aqui utilizado, inclui qualquer razão entre 0 e 100%, tal como entre 10 e 90%, entre 20 e 80%, entre 30 e 70%, entre 40 e 60%, e cerca de 50%; assim, o polipeptídeo pode ser admi- nistrado a toda a superfície da úlcera ou a qualquer parte dela. Opcio- nalmente, a administração também inclui a área da pele adjacente à úlcera.

[0136] O diabetes mellitus é uma doença comum e debilitante que afeta uma variedade de órgãos, incluindo a pele. Atualmente, estima-se que entre trinta e setenta por cento dos pacientes com diabetes mellitus, tanto do tipo 1 quanto do tipo 2, apresentarão uma complicação cutânea de diabetes mellitus em algum momento da vida. Independentemente de tais considerações teóricas, que não limitam a presente invenção de qualquer maneira, os métodos para detectar diabetes são bem conhe- cidos na técnica. Os métodos de detecção de diabetes não fazem parte, em uma modalidade, da presente invenção, mas ajudam a determinar um subgrupo de indivíduos que está em risco de sofrer de um distúrbio dermatológico, tal como os descritos neste documento, e que podem lucrar com o tratamento ou prevenção de tal distúrbio dermatológico de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o agente de acordo com a presente invenção é para administração a um indivíduo diabético que sofre de neuropatia, tal como, em particular, neuropatia periférica. Os métodos para detectar neuropatia e prever o desenvolvi- mento de úlcera no pé em seres humanos com condições de saúde como diabetes mellitus são conhecidos (por exemplo, sem limitação WO 2010/128519 A1).

[0137] O polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser adminis- trado a uma lesão de pele em um indivíduo diabético, de preferência uma lesão de pele caracterizada por ablação pelo menos parcial da derme, e opcionalmente da derme, em tal indivíduo. Em uma modali- dade, a superfície corporal ferida é ou compreende uma lesão, particu- larmente uma lesão da pele de tal indivíduo. De preferência, a adminis- tração compreende a administração a uma úlcera, em particular a uma úlcera do pé, em um indivíduo diabético.

[0138] As úlceras diabéticas, em particular as úlceras dos pés dia- béticos, são uma das principais complicações da diabetes mellitus. No contexto da presente invenção, o termo “úlcera diabética” não é particu- larmente limitante, além da precisão de que a úlcera é uma úlcera em um indivíduo diabético. De acordo com algumas estimativas, os indiví- duos diabéticos podem ter um risco cinco a quinze vezes maior de am- putação não traumática em comparação com indivíduos não diabéticos (por exemplo, WO 2003/075949 A1). Se não forem tratadas ou não fo- rem tratadas com sucesso, as úlceras do pé diabético podem ser difíceis de curar em alguns indivíduos e podem até exigir amputação, especial- mente se acompanhadas de outras complicações ou distúrbios, tal como infecção. Na verdade, o diabetes mellitus pode afetar múltiplos sistemas de órgãos. As manifestações dermatológicas do diabetes mel- litus têm várias implicações para a saúde, desde aquelas esteticamente preocupantes até aquelas que, se não tratadas, podem até ser fatais. As implicações dermatológicas da diabetes mellitus são descritas, por exemplo, por Rosen e outros, 2000, Endotext, De Groot e outros, Eds,

South Dartmouth (MA, EUA), MDText.com, Inc. A presente invenção for- nece um tratamento e / ou prevenção para tais implicações dermatoló- gicas da diabetes.

[0139] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para administração a um indivíduo diabético que foi submetido à cirurgia. Consequentemente, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é adequado para tratar ou prevenir uma ou mais complicações pós-operatórias, tais como escaras em um indivíduo diabético e / ou para tratar feridas cirúrgicas.

[0140] Em geral, além da úlcera diabética, principalmente a úlcera do pé diabético, bem como escaras e feridas cirúrgicas grandes / pro- fundas, elas podem ser de difícil cicatrização mesmo sob medicação, provavelmente em decorrência do grande tamanho das áreas envolvi- das. Se essas feridas não forem tratadas a tempo, elas se deteriorarão e, posteriormente, poderão se tornar incuráveis e fatais. A presente in- venção fornece um tratamento e / ou prevenção para tais implicações dermatológicas do diabetes. De fato, de acordo com a presente inven- ção, um tratamento médico eficaz pode não apenas ajudar os pacientes a se recuperar dessas complicações de pele, mas também pode levá- los a uma melhor qualidade de vida, redução de cuidados médicos ou despesas, ou mesmo um tempo de vida prolongado.

[0141] A presente invenção também é adequada para tratar super- fícies corporais feridas, em particular úlceras, de grande tamanho, em indivíduos diabéticos e não diabéticos. Em algumas modalidades, a pre- sente invenção é adequada para o tratamento de grandes superfícies corporais feridas com um diâmetro de 5 mm ou mais, tal como 1 cm ou mais. Detalhes adicionais da superfície corporal ferida, incluindo certas modalidades do diâmetro da superfície corporal ferida, são descritos acima.

[0142] Assim, a presente invenção fornece uma vantagem sobre os métodos de tratamento atuais, que muitas vezes podem não ser capa- zes de fornecer um método eficaz para tratar feridas de grandes áreas. A presente invenção fornece um tratamento e / ou prevenção para tais implicações dermatológicas, incluindo feridas de grande área, em indi- víduos diabéticos e não diabéticos.

[0143] De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo é ade- quado para o tratamento ou prevenção de lesões por pressão, incluindo lesões por pressão crônicas. Lesões por pressão, em particular, incluem úlceras por pressão, feridas por pressão, úlceras de decúbito e escaras.

[0144] Em modalidades preferenciais, o agente de acordo com a presente invenção é para uso no tratamento ou prevenção de uma úl- cera e, para esse propósito, é administrado a uma úlcera. De acordo com a presente invenção, a úlcera à qual o polipeptídeo é administrado é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em úl- ceras diabéticas, úlceras de trauma, úlceras cirúrgicas, úlceras por pres- são, úlceras crônicas e combinações de qualquer uma dessas úlceras. Em modalidades específicas, as úlceras são selecionadas a partir de úlceras diabéticas traumáticas, úlceras cirúrgicas diabéticas, úlceras di- abéticas por pressão, úlceras diabéticas crônicas, úlceras diabéticas traumáticas, úlceras cirúrgicas traumáticas, úlceras traumáticas por pressão, úlceras crônicas traumáticas, úlceras cirúrgicas crônicas, úlce- ras crônicas por pressão e outras úlceras. Em algumas modalidades, as úlceras são selecionadas a partir de úlceras de trauma, úlceras cirúrgi- cas, úlceras por pressão e úlceras crônicas em um indivíduo diabético. Em algumas modalidades, as úlceras são selecionadas a partir de úlce- ras de trauma, úlceras cirúrgicas, úlceras por pressão e úlceras crônicas em um indivíduo não diabético.

[0145] A presente invenção não está limitada a indivíduos tendo uma úlcera nem a indivíduos tendo múltiplas úlceras. Entre os indiví- duos com múltiplas úlceras, a presente invenção não está limitada ao tratamento de apenas uma dessas úlceras, nem ao tratamento de um certo número dessas úlceras, nem ao tratamento de todas essas úlce- ras. Assim, os termos “úlcera” e “úlceras”, independentemente do seu uso no singular ou no plural na presente descrição, são explicitamente inclusivos de todas essas modalidades e não estão limitados a qualquer número específico de úlceras no indivíduo nem a qualquer número es- pecífico de úlceras sendo tratadas.

[0146] Foi estabelecido que a ulceração do pé no diabetes pode es- tar associada à neuropatia (úlcera neuropática), doença vascular peri- férica (úlcera isquêmica) ou a ambas (úlcera neuroisquêmica), embora a via etiopatogenética final possa envolver uma combinação desses fa- tores de risco primários e outros fatores causais, tal como trauma. As- sim, em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção é para a preven- ção e / ou tratamento de úlceras isquêmicas, incluindo úlceras do pé isquêmico. Em uma modalidade alternativa, o polipeptídeo da invenção é para a prevenção e / ou tratamento de úlceras neuropáticas, incluindo úlceras do pé neuropático. Finalmente, o polipeptídeo da invenção pode ser para a prevenção e / ou tratamento de úlceras neuroisquêmicas, incluindo úlceras do pé neuroisquêmico. Todas as úlceras mencionadas acima são opcionalmente úlceras diabéticas, embora isso não seja um requisito.

[0147] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo que sofre de isquemia. A isquemia pode ser local ou sistêmica. Em algumas modalidades, a administração de acordo com a presente invenção pode reduzir a isque- mia no indivíduo. A redução da isquemia pode ser local ou sistêmica.

[0148] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo que sofre de neuropa- tia. Em modalidades preferenciais, o agente de acordo com a presente invenção é para administração a um indivíduo que sofre de neuropatia,

tal como, em particular, neuropatia periférica. Esses indivíduos podem ser diabéticos ou não diabéticos. Na verdade, foi relatado que a maioria dos pacientes com úlcera diabética tem neuropatia subjacente (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, pág. 129 a 134). Assim, em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção é administrado a um indivíduo diabético que sofre de neuropatia. A neuropatia pode ser local ou sistêmica. Em algumas modalidades, a administração de acordo com a presente invenção pode reduzir a neu- ropatia no indivíduo. A redução da neuropatia pode ser local e / ou sis- têmica. Em uma modalidade, a redução da neuropatia inclui a redução da neuropatia na área à qual o polipeptídeo da invenção é administrado. Em uma modalidade, a redução da neuropatia inclui a redução da neu- ropatia no órgão ao qual o polipeptídeo da invenção é administrado.

[0149] O tratamento ou prevenção de acordo com a presente inven- ção pode ser realizado por administração, de preferência por adminis- tração tópica, do polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades, a administração é realizada em um hospital. Em algumas modalidades, o tratamento não é realizado em um hospital.

[0150] Opcionalmente, mas não mutuamente exclusivo, o distúrbio dermatológico compreende pelo menos uma queimadura ou lesão me- cânica. Assim, a presente invenção também compreende o tratamento ou prevenção de queimaduras e lesões mecânicas, em que o trata- mento de tais lesões é praticamente mais significativo do que a preven- ção.

[0151] De preferência, o mamífero ao qual o polipeptídeo da inven- ção é administrado, de preferência um ser humano, sofre de diabetes mellitus ou tem uma predisposição para sofrer de diabetes mellitus; um respectivo indivíduo é descrito neste documento como “indivíduo diabé- tico”. Em modalidades típicas, o diabetes mellitus é selecionado entre diabetes mellitus Tipo 1 e diabetes mellitus Tipo 2.

[0152] Úlceras nos pés e outras doenças dermatológicas são co- muns em indivíduos diabéticos. Essas outras doenças dermatológicas podem ser tratadas e / ou prevenidas com base na presente invenção. Uma das principais causas de úlceras nos pés em indivíduos diabéticos é a neuropatia (dano do nervo), tornando difícil para a pessoa identificar lesões nos pés, tal como cortes, hematomas e pressão.

[0153] Assim, em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado a um indivíduo com úlcera no pé. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado a um indivíduo com úlcera de pé diabético (DFU). De fato, úlceras nos pés e suas complicações associadas são frequentes em indivíduos com diabetes, a maioria dos quais tem neuropatia subjacente (Ndip e outros, 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, pág. 129 a 134). Essas úlceras também são chamadas de úlcera neuropática do pé diabético. Assim, de preferência, o polipeptídeo é administrado a um indivíduo com úlcera neuropática do pé diabético.

[0154] Opcionalmente, a administração do polipeptídeo de acordo com a presente invenção também compreende um aspecto de melhorar a aparência estética do indivíduo, em particular da superfície corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, o fechamento da ferida é obtido como um resultado da administração de acordo com a presente inven- ção. Em algumas modalidades, a formação de cicatrizes é mínima. As- sim, a administração de acordo com a presente invenção também for- nece uma vantagem cosmética para indivíduos tratados em compara- ção com indivíduos não tratados. Portanto, a presente invenção também se refere a um método de tratamento cosmético de um indivíduo, em que o método compreende administrar o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0155] Em outra modalidade, o agente de acordo com a presente invenção é para o tratamento ou prevenção de cânceres na pele, tais como, sem limitação, hemangiomas e / ou distúrbios de pele associados a esses cânceres.

[0156] Em uma outra modalidade, o agente de acordo com a pre- sente invenção é para o tratamento ou prevenção de um distúrbio der- matológico que resulta de um distúrbio genético no indivíduo ou é influ- enciado por um distúrbio genético no indivíduo.

[0157] Administração

[0158] A presente invenção fornece um polipeptídeo heterólogo para administração a um indivíduo.

[0159] De preferência, o polipeptídeo é para administração tópica. Assim, preferencialmente, o polipeptídeo da invenção é administrado à pele, ou se a pele estiver ferida ou ausente, à superfície do corpo no sítio em que a pele seria encontrada se não estivesse ferida ou ausente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é administrado na epiderme. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é administrado na derme. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é administrado no tecido que tipi- camente é encontrado sob a epiderme, tal como, sem limitação, a área subcutânea.

[0160] Mais preferencialmente, o polipeptídeo é administrado na su- perfície corporal ferida. Em outras palavras, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é preferencialmente administrado topica- mente, mais preferencialmente administrado topicamente no sítio do distúrbio de pele (por exemplo, úlcera).

[0161] A administração de acordo com a presente invenção tipica- mente não envolve cirurgia do indivíduo. Em uma modalidade, a admi- nistração do polipeptídeo da invenção não compreende ou abrange uma etapa invasiva que representa uma intervenção física substancial no corpo que requer a realização de experimento médico profissional e que acarreta um risco substancial à saúde, mesmo quando realizada com o necessário cuidado profissional e especialização. Em contraste, em mo- dalidades mais típicas, a administração do polipeptídeo da invenção, em particular a administração tópica, é geralmente considerada segura para o indivíduo e, portanto, o polipeptídeo pode ser administrado pelo pró- prio indivíduo, particularmente no caso de um indivíduo humano.

[0162] Opcionalmente, a úlcera é coberta por um curativo antes e / ou durante e / ou após a administração. A enorme variedade de tipos de curativos disponíveis não está limitada pela presente invenção. Assim, qualquer curativo pode ser usado, a menos que seja tecnicamente cla- ramente inapropriado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção é administrado simultaneamente à aplicação de um curativo; opcionalmente, o curativo compreende o polipeptídeo da invenção, opcionalmente na forma de um meio aquoso aplicado ao cu- rativo antes da administração.

[0163] De preferência, o polipeptídeo é administrado a um indivíduo com úlcera no pé do dito indivíduo, abaixo do tornozelo.

[0164] Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado em uma única administração.

[0165] Em uma modalidade alternativa e mais preferencial, o poli- peptídeo é administrado repetidamente. Em uma modalidade particular- mente preferencial, o polipeptídeo é administrado repetidamente uma a cinco vezes por dia. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado uma vez o dia (ver também Exemplo 3). Em uma modalidade, o polipep- tídeo é administrado duas vezes ao dia (ver também Exemplo 5). Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado três vezes ao dia. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado quatro vezes ao dia. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado cinco vezes ao dia. É particularmente preferencial que o polipeptídeo seja administrado a um indivíduo humano duas vezes ao dia. Todas as administrações mencio- nadas acima são preferencialmente repetidas ao longo de um curso de vários dias, como aqui descrito. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado repetidamente por um período de três a 30 dias, de prefe- rência sete a 14 dias, e de preferência uma a cinco vezes em cada um desses dias.

[0166] Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado repetida- mente até o fechamento da superfície corporal ferida. Alternativamente, o polipeptídeo é administrado em uma única administração, e a admi- nistração é descontinuada após essa administração única. Alternativa- mente, o polipeptídeo é administrado repetidamente por um período de três a 30 dias, preferencialmente de sete a 14 dias. Opcionalmente, a administração é interrompida após o término do dito intervalo.

[0167] Em algumas modalidades, o agente é administrado como agente de tal maneira que é colocado em contato direto com fibras no- ciceptivas (nervos). Em algumas modalidades, o agente é administrado como agente de tal maneira que é colocado em contato direto com fibras nociceptivas totalmente expostas (nervos); as fibras nociceptivas (ner- vos) são consideradas totalmente expostas nos casos de falta de pele, como é típico nos casos de superfície corporal ferida. Em algumas mo- dalidades, o agente é administrado como agente de tal maneira que é colocado em contato direto com fibras nociceptivas (nervos) hiperativa- das; as fibras nociceptivas (nervos) são consideradas hiperativadas como resultado da lesão da pele. Em algumas modalidades, o agente é administrado como agente de tal maneira que é colocado em contato direto com fibras nociceptivas (nervos) hiperativadas. De preferência, em tais modalidades em particular, o agente não causa uma síndrome hiperalgésica (dor). Nenhum agente com tais propriedades havia sido colocado anteriormente à disposição da comunidade médica. Por esta e outras razões, a presente invenção fornece uma grande vantagem.

[0168] Dose

[0169] Os agentes e as composições aqui descritos são administra- dos em quantidades eficazes. De acordo com a presente invenção, uma

“quantidade eficaz” é a quantidade ou dose que atinge uma reação de- sejada ou um efeito desejado, isoladamente ou em conjunto com outras doses. No caso do tratamento de um distúrbio particular, a reação de- sejada refere-se preferencialmente à inibição do curso da doença. Isso consiste em desacelerar o progresso da doença e, preferencialmente, interromper ou reverter o seu progresso. A reação desejada no trata- mento de uma doença ou de uma condição também pode compreender um retardo no início ou uma prevenção do início da dita doença ou con- dição. Em algumas modalidades, a reação desejada compreende a ci- catrização completa dos sintomas do distúrbio, local e / ou sistemica- mente.

[0170] Uma quantidade eficaz de um agente ou composição aqui descrita dependerá da condição ou distúrbio a ser tratado, da gravidade do distúrbio, dos parâmetros individuais do indivíduo ao qual o agente é administrado, tais como idade, condição fisiológica, condição(ões) as- sociada(s) (se presente), tamanho e peso, a duração do tratamento, o tipo de terapia associada (se presente), a via específica de administra- ção e outros parâmetros. Consequentemente, as doses administradas dos agentes aqui descritos podem depender de vários desses parâme- tros. No caso de uma reação em um paciente ser insuficiente com uma dose inicial, podem ser usadas doses mais altas (ou doses efetivamente mais altas alcançadas por uma via de administração diferente e mais localizada).

[0171] De acordo com a presente invenção, as dosagens adequa- das e terapeuticamente eficazes para a administração de um agente terapêutico para administração a um indivíduo humano para o trata- mento e / ou prevenção de um distúrbio de pele, tal como úlcera cutânea crônica e queimaduras, podem ser determinadas com base em dosa- gens adequadas e terapeuticamente eficazes determinadas experimen-

talmente para a administração de um agente terapêutico para adminis- tração a um indivíduo roedor, particularmente, um camundongo, para o tratamento e / ou prevenção de um distúrbio de pele, tal como úlcera cutânea crônica e queimaduras. A orientação está disponível em “Gui- dance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds – Deve- loping Products for Treatment”, publicado por Food and Drug Adminis- tration do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, 2006.

[0172] Modelos de feridas em animais (Exemplos 3 e 4) são úteis no estabelecimento de respostas farmacológicas, bem como na avalia- ção de potenciais toxicidades de produtos para o tratamento de feridas. Em algumas modalidades, a dose a ser administrada ao indivíduo é uma dose conforme descrita no Exemplo 3 ou no Exemplo 4 ou no Exemplo

5.

[0173] De preferência, a dose do polipeptídeo a ser administrado é determinada com base na superfície da superfície corporal ferida a ser tratada. De preferência, a determinação é conduzida no início do trata- mento. Em uma modalidade, a dosagem é ajustada para administra- ção(ões) posterior(es), dependendo da superfície da superfície corporal ferida no momento de tal administração posterior. Em uma modalidade alternativa, a dosagem não é ajustada para administração(ões) poste- rior(es), de modo que a dose de administração depende unicamente da superfície da superfície corporal ferida a ser tratada no início da admi- nistração (primeira dosagem) e dosagens subsequentes correspondem à primeira dose.

[0174] Em uma modalidade, a dose / cada dose tem uma quanti- dade de 0,3 a 6 μg do polipeptídeo por mm2 de superfície corporal ferida sendo tratada (0,3 a 6 μg / mm2).

[0175] Opcionalmente, em todas as modalidades de acordo com a presente invenção, a dose é calculada com base no tamanho real da superfície corporal ferida (por exemplo, úlcera) no momento do trata- mento. Em outras palavras, a dose pode ser submetida a cálculo (recál- culo) em cada ponto no tempo de administração com base no tamanho real da superfície corporal ferida (por exemplo, úlcera) naquele ponto no tempo.

[0176] Processo para obter o polipeptídeo

[0177] Em uma modalidade, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 podem ser obtidos a partir de uma fonte biológica. Opcionalmente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4 podem ser obtidos por expressão recombinante. Para esse fim, um quadro de leitura aberto que codifica o respectivo polipeptídeo é introduzido em uma fonte de proteínas recombinantes, por exemplo, uma célula hospedeira ou um sistema livre de células para a expressão de proteínas. De fato, considerando que o NGF humano é produzido apenas em quantidades diminutas in vivo, o NGF de camun- dongo é geralmente produzido como uma mistura heterogênea de vá- rias proteínas (ver WO 2000/022119 A1), e os polipeptídeos da presente invenção não são naturais e, portanto, não produzidos in vivo, a possi- bilidade mais significativa de produzir o polipeptídeo da presente inven- ção é por expressão recombinante, de acordo com sugestões equiva- lentes para NGF tipo selvagem no estado da técnica (WO 2000/022119 A1, WO 2008/006893 A1; Rattenholl e outros, Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pág. 3296 a 3303, US 2018/0086805 A1). No entanto, tem sido um desafio constante obter tais polipeptídeos com um grau de pureza suficiente para administração a um mamífero. Este desafio foi superado pelos presentes inventores, conforme descrito em detalhes neste docu- mento (ver também os Exemplos 1 e 2).

[0178] De preferência, o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção pode ser obtido por expressão recombinante em bactérias. Mais preferencialmente, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode ser obtido por expressão recombinante citosólica em bactérias. Em geral, as células bacterianas, em particular de E. coli, são capazes de produção recombinante de grandes quantidades de proteínas recom- binantes, mas, como é o caso de muitos outros genes expressos de forma recombinante, a produção de NGF recombinante e polipeptídeos similares em bactérias resulta em um produto de tradução biologica- mente inativo que é então acumulado na célula (citosol) na forma de agregados (os chamados corpos de inclusão (IBs) (WO 2000/022119 A1; US 2018/0086805 A1). Em contraste com NGF, o pró-NGF é conhe- cido por ser bastante instável e requer grandes esforços para redobra- mento e purificação a baixas taxas de recuperação, o que torna o pro- cesso de produção de NGF via pró-NGF em bactérias relativamente di- fícil e dispendioso. Assim, as principais dificuldades associadas ao NGF produzido por bactérias e polipeptídeos produzidos por bactérias simi- lares, através das respectivas pró-formas, dizem respeito ao dobra- mento, ao processamento e à purificação da proteína recombinante. Es- sas dificuldades agora foram resolvidas (ver Exemplos 1 e 2). Como um resultado, os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 tornam- se disponíveis em um grau de pureza adequado para administração a um mamífero, incluindo um ser humano.

[0179] De preferência, o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção é expresso juntamente com uma pró-sequência. Sem limitação, uma pró-sequência adequada é a pró-sequência de NGF humano tipo selvagem (posições de aminoácidos 18 a 121 de SEQ ID NO: 1), tipica- mente fundida ao N-terminal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou 4. Para o NGF tipo selvagem, embora não seja parte do NGF maduro e, portanto, não seja necessário para a função biológica do NGF, a pre- sença da pró-sequência ligada covalentemente mostrou promover o re- dobramento do NGF recombinante a partir de corpos de inclusão com formação concomitante de ligações dissulfeto da parte madura (beta-

NGF). Assim, a presença da pró-sequência ligada covalentemente influ- encia positivamente o rendimento e a taxa de redobramento quando comparado com o redobramento in vitro de NGF maduro a partir de cor- pos de inclusão (Rattenholl e outros, Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pág. 3296 a 3303). Sem desejar estar limitado a uma teoria particular, o mesmo é plausível e postulado aqui para o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e 4.

[0180] Assim, quando o polipeptídeo de acordo com a presente in- venção foi produzido em corpos de inclusão, o dobramento correto é necessário, e isto é tipicamente conseguido pós-tradução, tal como a clivagem da pró-sequência ligada covalentemente; métodos sofistica- dos para dobragem, clivagem e purificação foram propostos no pas- sado, em particular para NGF humano tipo selvagem. Notavelmente, a maioria dos estudos publicados sobre NGF aplica um regime de redo- bramento geral que foi previamente estabelecido por Rattenholl e outros (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, pág. 3296 a 3303). Dentro deste es- tudo original, vários parâmetros de redobramento de proteína (por exemplo, temperatura, tempo de redobramento, pH da reação de redo- bramento, arginina, glutationa e concentração de proteína) foram inves- tigados em detalhes e seu efeito na eficiência de redobramento foi ava- liado. O protocolo de Rattenholl e outros depende da renaturação da pró-forma, que tem uma solubilidade muito fraca, obtida a partir de cor- pos de inclusão após a produção recombinante em procariontes, em que o pró-NGF é solubilizado em uma solução de um agente desnatu- rante em uma concentração desnaturante, transferido para um solução que não é desnaturante ou é fracamente desnaturante, de modo que a solubilidade seja mantida e o pró-NGF desnaturado dissolvido pode as- sumir uma conformação biologicamente ativa, incluindo a formação de ligações dissulfeto como em NGF nativo, e depois o NGF é purificado e a pró-sequência é removida proteoliticamente (WO 2000/022119 A1;

Rattenholl e outros, Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pág. 3296 a 3303). Notavelmente, neste estudo foi descoberto que uma baixa concentração de proteína leva a um maior rendimento específico do produto correta- mente dobrado em comparação com uma concentração de proteína mais alta. Concentrações de proteína exemplificativas em torno de 50 mg por litro de reação de redobramento resultaram em um rendimento específico de ~ 25% de pró-NGF corretamente dobrado, enquanto esta fração foi reduzida para 10% em concentrações de proteína de 500 mg por litro. Com base nisso, Rattenholl e outros sugerem que a concentra- ção de proteína na solução de redobramento deve ser muito baixa: de acordo com Rattenholl e outros, 15 a 20 mg de proteína corretamente dobrada por litro de reação de redobramento são esperados como ren- dimento. No entanto, isso exigiria um aumento de escala (por exemplo, além da escala de laboratório) para purificação de até mesmo algumas centenas de mg de proteína recombinante.

[0181] Enquanto o pró-NGF humano contém um sítio de clivagem nativo para a protease Furina (Arg1-Ser2-Lys3-Arg4; R1S2K3R4), e a Fu- rina cliva o pró-NGF nesse sítio in vivo, a furina não está disponível em pureza ou quantidade comercialmente relevante. De acordo com a pre- sente invenção, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção, quando expresso juntamente com uma pró-sequência, por exemplo, em E. coli, é preferencialmente clivado pela protease Tripsina (EC 3.4.21.4), que está disponível comercialmente. De fato, para NGF tipo selvagem, foi relatado que a tripsina produziria NGF maduro, biologicamente ativo satisfatório, que pode ser eventualmente purificado (Rattenholl e outros, Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pág. 3296 a 3303), e a proteólise base- ada em tripsina de pró-NGF expresso de forma recombinante foi, entre- tanto, adotada por outros (por exemplo, D’Onofrio e outros, 2011, PLoS One, vol. 6, e20839). No entanto, foi mais tarde mostrado que a cliva- gem do pró-NGF tipo selvagem com tripsina para produzir beta-NGF está associada a várias desvantagens, já que baixas quantidades de tripsina levariam à clivagem ineficiente, enquanto que grandes quanti- dades de tripsina diminuiriam ainda mais a seletividade da clivagem, uma vez que a tripsina é capaz de clivagem C-terminalmente de qual- quer resíduo de arginina e lisina (resíduo R e K), de modo que por di- gestão de pró-NGF contendo R1S2K3R4 por tripsina, vários produtos de digestão alternativos seriam obtidos; assim, o uso de tripsina como en- zima de clivagem levaria a rendimentos muito baixos de NGF clivado corretamente, e a problemas de purificação e rendimento, uma vez que os diferentes produtos de clivagem não são economicamente separa- dos sob condições padrão.

Como uma solução, foi proposto expressar uma variante de pró-NGF, em que o sítio de clivagem de protease R1S2K3R4 no pró-peptídeo é substituído pelo menos nas posições R1 e K3 correspondentes às posições 101 e 103 da sequência de pró-NGF humano tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) por outro aminoácido (WO 2013/092776 A1). Em um exemplo, R1 e K3, respectivamente, são subs- tituídos por valina (V) e alanina (A), transformando o sítio de clivagem pela furina original R1S2K3R4 em V1S2A3R4, em que a tripsina é capaz de clivar especificamente apenas C-terminalmente de R4; a clivagem mediada por tripsina de um respectivo pró-NGF também pode ser des- crita como o “método VSAR”. Embora WO 2013/092776 A1 seja silen- cioso sobre os polipeptídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4 de acordo com a presente invenção, o método VSAR foi inicialmente proposto para ser aplicável a certas variantes de muteínas pró-NGF, embora tenha sido relatado que as condições de proteólise precisam ser tituladas com cui- dado (US 2018/0086805 A1). No decorrer da chegada à presente inven- ção, os presentes inventores descobriram que a tecnologia VSAR, ao contrário das sugestões anteriores, não resolve satisfatoriamente os problemas de pureza associados à produção recombinante do polipep-

tídeo da presente invenção com pureza satisfatória. De fato, a purifica- ção de beta-NGF expresso de forma recombinante ou suas muteínas, não apenas de proteínas de células hospedeiras (HCP), mas também de tripsina (ou outra protease usada para clivagem) ainda é um desafio; desnecessário dizer, seria necessário que uma enzima proteolítica (tal como a tripsina) estivesse ausente de uma preparação final de uma pro- teína farmacêutica, a fim de evitar a proteólise durante o armazena- mento do polipeptídeo, de modo que o polipeptídeo seja substancial- mente puro e não degradado no ponto no tempo da administração a um indivíduo, de acordo com a presente invenção. Os presentes inventores resolveram este desafio, conforme aqui descrito. Assim, a presente in- venção torna o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ou 4 disponí- vel em alta pureza e, portanto, essencialmente livre de tripsina e / ou de produtos de degradação do polipeptídeo. Embora certos métodos para a produção de NGF (por exemplo, WO 2013092776 A1) e do polipeptí- deo de SEQ ID NO: 4 (por exemplo, Malerba e outros, 2015, PLOS One, vol. 10, e0136425) tenham sido descritos anteriormente, os presentes inventores descobriram, surpreendentemente, que os processos publi- cados anteriormente são insuficientes para a obtenção do respectivo polipeptídeo em alta pureza. Como uma solução para essas insuficiên- cias, os presentes inventores chegaram a um novo processo e aspectos relacionados, conforme descrito em detalhes neste documento.

[0182] Um processo para obter o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a partir de expressão recombinante, por exemplo, em uma célula hospedeira, de acordo com a presente inven- ção, pode compreender purificação. Purificação, no sentido mais amplo, significa que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é separado de outras moléculas, incluindo outras proteínas, tais como proteínas da célula hospedeira. Assim, a purificação pode incluir a se- paração de uma ou mais outras moléculas, incluindo outras proteínas,

tais como proteínas da célula hospedeira, proteases (por exemplo, trip- sina) e / ou produtos de degradação do polipeptídeo de acordo com a invenção.

[0183] O processo para a produção do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 de acordo com a presente inven- ção compreende preferencialmente as seguintes etapas:

[0184] (a) obtenção de um precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4,

[0185] (d) purificação,

[0186] e a purificação na etapa (d) compreende tipicamente a puri- ficação em uma fase estacionária de modo misto. Assim, em uma mo- dalidade, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido por expressão recombinante e purificação, em que a purificação compreende purificação em uma fase estacionária de modo misto. O termo “em fase estacionária de modo misto” deve ser entendido de forma ampla e significa que uma mistura compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 ou precursor de qualquer um destes, juntamente com outras espécies moleculares, é exposta a uma fase estacionária de modo misto, por exemplo, por cromatografia ou ou- tra etapa de processo adequada. Na verdade, de preferência, uma mis- tura compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 ou o precursor de qualquer um destes, juntamente com outras espé- cies moleculares, é submetido à cromatografia, de modo que a purifica- ção na etapa (d) compreende a purificação por cromatografia de modo misto. De preferência, a cromatografia de modo misto compreende o uso de uma fase estacionária com um grupo carregado, de preferência um grupo carregado negativamente, e um grupo aromático e / ou um grupo hidrofóbico.

[0187] Purificação, no sentido mais amplo, de acordo com a pre- sente invenção, significa que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de

SEQ ID NO: 4 das mesmas é pelo menos parcialmente separado de outras espécies moleculares, incluindo outras proteínas, tais como pro- teínas de células hospedeiras, produtos precursores e / ou de degrada- ção. Como um resultado, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 que é pelo menos parcialmente purificado pode ser obtido. Embora as outras espécies moleculares possam ser opcionalmente descartadas ou não, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é preferencialmente obtido e retido como um resultado da purificação.

[0188] De preferência, a cromatografia de modo misto compreende o uso de uma fase estacionária com um grupo carregado, de preferência um grupo carregado negativamente, e um grupo aromático e / ou um grupo hidrofóbico.

[0189] Cada uma dessas etapas pode compreender várias ações, que, para simplificar, também podem ser ditas como etapas. Para ilus- tração, e conforme detalhado abaixo, a etapa (d) pode compreender mais de uma etapa de purificação, por exemplo, em mais de uma fase estacionária.

[0190] Qualquer letra ou número usado neste documento em rela- ção a uma ou mais etapas do processo, tal como, por exemplo, (a), (b), (c), (d), (d1), (d2), não deve ser entendido como limitante, mas sim para referência. Não deve ser entendido que a sequência de eventos no pro- cesso ou uso de acordo com a presente invenção pode ser limitada pela sequência alfabética de letras ou pela sequência numérica de números. Não obstante o anterior, é fortemente preferencial que a sequência de eventos no processo ou uso de acordo com a presente invenção seja uma sequência aqui descrita.

[0191] Aspectos adicionais da cromatografia de modo misto, fases estacionárias particularmente adequadas, serão descritos com mais de- talhes abaixo, mas esses aspectos são geralmente aplicáveis à pre-

sente invenção. Assim, em particular, todas as fases estacionárias, in- cluindo todas as suas modalidades, que são descritas abaixo como sendo particularmente úteis para a cromatografia de modo misto na etapa (d2), são geralmente úteis para a purificação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e / ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 de acordo com a presente invenção, e pode ser usado em todos os tipos de modalidades, tal como em combinação com uma etapa de (d1) cromatografia de cap- tura ou sem. De fato, o Exemplo 2B descreve que algumas vantagens podem ser alcançadas usando cromatografia de modo misto em uma variação de um protocolo de acordo com o estado da técnica.

[0192] Opcionalmente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou o poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido em um processo que com- preende (re)dobramento e / ou purificação cromatográfica e / ou diges- tão por protease e, opcionalmente, ajuste à concentração de proteína final e / preparação de uma formulação desejada.

[0193] Assim, a administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 a um indivíduo em necessidade de tratamento, con- forme descrito neste documento, também é possibilitada por meio da pureza industrialmente relevante e rendimento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4, que está disponível para o versado na técnica com base na descrição aqui fornecida. Assim, a presente des- crição também descreve um processo para a produção do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4.

[0194] O processo para a produção do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente as seguintes etapas:

[0195] (a) obtenção de um precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4, por exemplo, por expressão recombinante,

[0196] (d) purificação, em que a purificação compreende a purifica- ção em uma fase estacionária de modo misto.

[0197] É também preferencial na presente invenção que o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 seja submetido a uma etapa de

[0198] (c) exposição a uma protease.

[0199] A dita exposição é tipicamente realizada antes da etapa (d).

[0200] O processo da presente invenção é de preferência também caracterizado por não ser realizada purificação cromatográfica antes da exposição à protease. De fato, os presentes inventores descobriram sur- preendentemente que a digestão com protease funciona bem e eficiente também em uma fração bruta obtida a partir de uma célula hospedeira, isto é, quando nenhuma purificação cromatográfica foi realizada antes da exposição à protease.

[0201] De preferência, a etapa de obtenção de (a) compreende a expressão de um precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4, de preferência expressão recombinante. Mais preferencial- mente, a expressão recombinante está em uma célula hospedeira. Após a cultura da célula hospedeira, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é obtido em uma fração da cultura de células. A fração pode consistir das células hospedeiras, isto é, no caso de a proteína não ser substancialmente secretada pelas células hospedeiras. Este é o caso, por exemplo, quando o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é produzido em corpos de inclusão e / ou de outra forma em um compartimento intracelular incluindo o citosol. As células hospedei- ras adequadas podem ser selecionadas a partir de células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, embora as células hospedeiras procarióti- cas sejam preferenciais em modalidades típicas. As células hospedeiras procarióticas preferenciais incluem Escherichia coli (E. coli), de prefe- rência E. coli Rosetta (DE3). Em uma modalidade, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é obtido em uma conformação dife-

rente da conformação nativa e / ou em agregados, mais preferencial- mente em corpos de inclusão. Então, de preferência, o processo da pre- sente invenção compreende uma etapa (b) de (re)dobrar o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. De preferência, a etapa (c) é realizada após a etapa (b).

[0202] De preferência, na etapa (c) a protease é uma protease ca- paz de clivar o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 de tal maneira que o polipeptídeo (maduro) de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é liberado. Em uma modalidade particular, a dita protease é tripsina, preferencialmente tripsina suína, opcionalmente expressa de forma recombinante.

[0203] De preferência, a etapa de purificação (d) compreende as seguintes etapas, de preferência em ordem sequencial:

[0204] (d1) captura,

[0205] (d2) polimento.

[0206] Preferencialmente, a etapa de captura (d1) é realizada por cromatografia, preferencialmente cromatografia em coluna. Mais prefe- rencialmente, a dita etapa de captura (d1) é realizada usando uma fase estacionária de cromatografia de troca catiônica ou uma fase estacioná- ria de cromatografia de modo misto. Ainda mais preferencialmente, a dita etapa de captura (d1) é realizada usando uma fase estacionária de cromatografia de modo misto, que é preferencialmente Capto MMC.

[0207] Preferencialmente, a etapa de polimento (d2) é realizada por cromatografia, preferencialmente cromatografia em coluna. Mais prefe- rencialmente, a dita etapa de polimento é realizada usando uma fase estacionária de cromatografia de troca catiônica. Ainda mais preferenci- almente, a dita etapa de captura (d1) é realizada usando SP Sefarose, preferencialmente SP Sefarose com um pequeno tamanho de partícula. SP é uma abreviatura de sulfopropil.

[0208] Opcionalmente, o processo de acordo com a presente inven- ção compreende uma etapa adicional de ajuste à concentração de pro- teína final e / preparação de uma formulação desejada. Como um resul- tado, é possível obter uma composição de acordo com a invenção.

[0209] Em outros termos, a presente invenção fornece cromatogra- fia de modo misto para a preparação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. A cromatografia de modo misto é útil na prepara- ção do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Em modali- dades preferenciais, o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 do mesmo é exposto a uma protease com o propósito de digestão, e a cromatografia de modo misto é usada em uma etapa subsequente à exposição à protease. Em modalidades preferenciais, nenhuma purificação cromatográfica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 é realizada antes da dita exposição à protease.

[0210] Pureza do polipeptídeo

[0211] O polipeptídeo da invenção é substancialmente ou essenci- almente livre de componentes que tipicamente o acompanham em seu estado nativo. O polipeptídeo da invenção é isolado antes de ser admi- nistrado. Em uma modalidade, o “polipeptídeo isolado” refere-se ao po- lipeptídeo, que foi purificado a partir do ambiente celular e extracelular, tal como o tecido, que o envolve em um estado tipo selvagem, por exem- plo, a partir da célula em que foi expresso, tal como uma célula hospe- deira. Em outra modalidade, “polipeptídeo isolado” refere-se ao isola- mento in vitro e / ou purificação de um polipeptídeo, respectivamente, de seu ambiente celular natural, e a partir da associação com outros componentes do ambiente em que o polipeptídeo tipicamente reside.

[0212] De preferência, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 para uso de acordo com a presente invenção está substanci- almente livre de impurezas. Tal polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 vantajosamente puro pode ser obtido como aqui descrito.

[0213] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 aqui descrito é considerado como um peptídeo ou proteína farmaceutica- mente ativa.

[0214] Em uma modalidade particularmente vantajosa da presente invenção, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é obtido essencialmente livre de produtos de degradação do dito polipeptídeo. Em particular, os presentes inventores observaram que, ao contrário dos relatórios sobre NGF humano tipo selvagem no estado da técnica, a exposição de um precursor de SEQ ID NO: 4 à tripsina clivará ineren- temente parcialmente o dito precursor C terminalmente de arginina (Arg, R) resíduo 9 de SEQ ID NO: 4, ou antes ou depois da purificação, se a purificação não remover completamente a tripsina (variante des-nona, dados não mostrados). Pelo método específico de purificação conforme fornecido na presente invenção, o polipeptídeo de acordo com a pre- sente invenção pode ser obtido essencialmente livre de tripsina e / ou da variante des-nona.

[0215] De preferência, o polipeptídeo obtido conforme descrito acima é essencialmente livre de degradantes do polipeptídeo. Em par- ticular, a presente descrição torna o polipeptídeo da invenção disponível com um novo grau de pureza melhorado, e é preferencial que o polipep- tídeo seja administrado com tal alta pureza. De preferência, o polipeptí- deo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 90%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é carac- terizado por um grau de pureza de pelo menos 91%. Mais preferencial- mente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 92%. Mais pre- ferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 93%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 94%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 95%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 96%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da inven- ção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 97%. Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de pelo menos 98%. Ainda mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é carac- terizado por um grau de pureza de pelo menos 99%.

[0216] Mais preferencialmente, o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza de mais de 99,0%, tal como um grau de pureza de mais de 99,1%, mais de 99,2%, mais de 99,3%, mais de 99,4 %%, mais de 99,5%, mais de 99,6%, mais de 99,7%, mais de 99,8%%, mais de 99,9%.

[0217] Aqui, “grau de pureza” geralmente se refere à porcentagem em peso (w) do polipeptídeo de acordo com a presente invenção em relação ao peso (w) de material biológico diferente do polipeptídeo da presente invenção. Para ilustração, em geral, em um grau de pureza de 99,0%, o polipeptídeo da presente invenção está presente em uma quantidade relativa (peso) de 99,0 unidades (por exemplo, 1,0 mg), e a soma do peso de todo o material biológico diferente do polipeptídeo da presente invenção tem 1,0 unidades (por exemplo 1,0 mg). Tal material biológico diferente do polipeptídeo da presente invenção inclui, sem li- mitação, proteínas da célula hospedeira, ácidos nucleicos, protease(s), tal como, por exemplo, tripsina, inativada ou não, produtos de degrada- ção do polipeptídeo da invenção, tais como e outras macromoléculas de origem biológica. Em uma modalidade particular, o grau de “pureza” re- fere-se à pureza versus polipeptídeos diferentes dos polipeptídeos da invenção. Para ilustração, nessa modalidade, em um grau de pureza de 99,0%, o polipeptídeo da presente invenção está presente em uma quantidade relativa (peso) de 99,0 unidades (por exemplo, 1,0 mg), e a soma do peso de todos os polipeptídeos que são não idênticos ao poli- peptídeo da presente invenção é de 1,0 unidades (por exemplo, 1,0 mg). Os produtos de degradação do polipeptídeo da presente invenção, para evitar dúvidas, estão incluídos nos “polipeptídeos que não são idênticos ao polipeptídeo da presente invenção”. Um produto de degradação par- ticular é a variante des-nona (ver Exemplos 1 e 2).

[0218] Em particular, essencialmente livre da variante des-nona do polipeptídeo. A variante des-nona é um produto de degradação anteri- ormente não caracterizado do polipeptídeo da presente invenção que está associado à produção de certas variantes de NGF, incluindo o po- lipeptídeo da presente invenção, a menos que o polipeptídeo seja pro- duzido pelo novo método aqui descrito (ver, por exemplo, Exemplos 1 e 2). “Essencialmente livre”, neste contexto, pretende significar que o po- lipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracteri- zado por um grau de pureza, em relação à variante des-nona, de mais de 99,0%, tal como um grau de pureza de mais de 99,1%, mais de 99,2%, mais de 99,3%, mais de 99,4%%, mais de 99,5%, mais de 99,6%, mais de 99,7%, mais de 99,8%%, mais de 99,9%, todos em re- lação à variante des-nona. Na modalidade mais preferencial, a variante des-nona é indetectável e / ou ausente.

[0219] É também preferencial que o polipeptídeo de acordo com a presente invenção seja essencialmente livre de qualquer protease (tal como tripsina). “Essencialmente livre”, neste contexto, pretende signifi- car que o polipeptídeo da invenção para uso de acordo com a invenção é caracterizado por um grau de pureza, com relação à soma de todas as proteases (incluindo tripsina), de mais de 99,0%, tal como um grau de pureza de mais de 99,1%, mais de 99,2%, mais de 99,3%, mais de 99,4%%, mais de 99,5%, mais de 99,6%, mais de 99,7%, mais de 99,8%%, mais de 99,9%, tudo em relação à soma de todas as proteases (incluindo tripsina). Na modalidade mais preferencial, a tripsina é inde- tectável e / ou ausente.

[0220] Tal grau de pureza elevado, nas modalidades descritas acima, está associado com aceitabilidade melhorada por autoridades reguladoras e qualifica o polipeptídeo da presente invenção como um medicamento para uso em indivíduos mamíferos, incluindo humanos, em particular. Assim, o grau de pureza de acordo com a presente inven- ção permite pela primeira vez o uso deste polipeptídeo para administra- ção à superfície corporal ferida, incluindo a superfície corporal humana ferida e úlceras, em particular, de forma segura e confiável. O alto grau de pureza em relação à protease (tripsina) em particular permite o ar- mazenamento do polipeptídeo também na forma não congelada.

[0221] Composições

[0222] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 aqui descrito é compreendido em uma composição compreendendo adicionalmente um ou mais carreadores e / ou um ou mais excipientes. O termo “carreador”, tal como aqui utilizado, refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de natureza natural ou sinté- tica, que é combinado com o ingrediente ativo a fim de permitir, aumen- tar ou facilitar a aplicação do ingrediente ativo. O termo “excipiente”, tal como aqui utilizado, pretende indicar todas as substâncias que podem estar presentes em uma composição farmacêutica da presente inven- ção e que não são tais ingredientes ativos.

[0223] De preferência, a composição de acordo com a presente in- venção compreende pelo menos água como um excipiente. Em algu- mas modalidades, a composição de acordo com a presente invenção compreende meio aquoso e, mais preferencialmente, a composição de acordo com a presente invenção está na forma de uma solução aquosa. Em uma modalidade, o polipeptídeo está compreendido em um meio aquoso, e o meio aquoso é administrado ao indivíduo mamífero. O meio aquoso pode ser, por exemplo, uma solução aquosa. Soluções aquosas e outras respectivas composições, em algumas modalidades, são obti- das diretamente da purificação de NGF em meio aquoso. Por exemplo, quando o agente de acordo com a presente invenção é obtido por puri- ficação de uma fonte biológica por purificação, as respectivas composi- ções aquosas podem ser obtidas diretamente a partir da última etapa de purificação, por exemplo, eluição a partir da última coluna cromato- gráfica (geralmente a etapa de polimento) e / ou filtração. Alternativa- mente, as respectivas composições estão disponíveis através de uma etapa adicional de ajuste à concentração de proteína final e / preparação de uma formulação desejada. Tal etapa adicional pode incluir, por exem- plo, uma etapa de clarificação ou filtração, conforme descrito neste do- cumento, e / ou adição de um ou mais excipientes e / ou um ou mais carreadores. Composições exemplificativas úteis na presente invenção são descritas aqui, sem limitação.

[0224] Assim, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 aqui descrito pode estar presente em uma composição, por exemplo, em uma composição farmacêutica. As composições aqui descritas são preferencialmente estéreis e preferencialmente contêm o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 como um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa e, opcionalmente, de agentes adicionais, men- cionados aqui ou não mencionados. As composições podem estar em qualquer estado, por exemplo, líquido, congelado, liofilizado, etc.

[0225] As composições aqui descritas podem compreender sais, substâncias tampão, conservantes, carreadores, diluentes e / ou excipi-

entes, todos os quais são preferencialmente farmaceuticamente aceitá- veis. O termo “farmaceuticamente aceitável” descreve algo não tóxico e / ou que não interage com a ação do ingrediente ativo da composição farmacêutica.

[0226] As substâncias tampão adequadas para uso na invenção in- cluem ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal. Por exemplo, é preferencial que o polipeptídeo da invenção, como um resultado dos vários aspectos da presente invenção, seja obtido em um tampão com um pH entre 4,5 e 6,5, de preferência entre 5,0 e 6,0. Em uma modalidade, um tampão de acetato é um tampão adequado para tais propósitos e, portanto, é par- ticularmente preferencial. Assim, em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção é obtido em um tampão de acetato com um pH entre 4,5 e 6,5, de preferência entre 5,0 e 6,0.

[0227] Conservantes adequados para uso nas composições de acordo com a presente invenção incluem aqueles conhecidos na téc- nica, entre os quais são para ilustração, mas sem limitação, benzil ál- cool, benzalcônio e seus sais, M-cresol, fenol, clorobutanol, parabeno e timerosal.

[0228] Assim, a presente invenção fornece o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 para uso terapêutico, isto é, para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. A terapia pode incluir prevenção e / ou tratamento de uma condição. Tendo em vista o potencial para uso terapêutico, o dito polipeptídeo tam- bém pode ser descrito como uma proteína ou peptídeo farmaceutica- mente ativo.

[0229] Opcionalmente, a administração de acordo com a presente invenção é acompanhada pela administração de pelo menos um agente antimicrobiano, tal como um antibiótico. O agente antimicrobiano pode ser parte da composição que compreende o polipeptídeo de acordo com a presente invenção ou, alternativamente, pode ser administrado ao in- divíduo separadamente, no mesmo sítio ou em um sítio diferente, pela mesma via ou por uma via de administração diferente.

[0230] Aplicabilidade Industrial

[0231] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 aqui descrito é adequado para uma variedade de fins, por exemplo, para apli- cações terapêuticas conforme descrito neste documento.

[0232] Os exemplos e figuras a seguir pretendem ilustrar algumas modalidades preferenciais da invenção e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção, que é definido pelas reivindica- ções.

[0233] EXEMPLOS

[0234] Materiais e métodos comuns a mais de um exemplo

[0235] A menos que especificado de outra forma, os seguintes exemplos experimentais dizem respeito especificamente ao polipeptí- deo de SEQ ID NO: 4 caracterizado, em relação ao NGF humano tipo selvagem, pelas substituições P61S R100E (denominado “NGF P61S R100E”, Malerba e outros PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425, SEQ ID NO: 4), bem como pró-formas, etc. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 também pode ser descrito como “muteína de NGF”, mas deve-se ter em mente que a adequação terapêutica, específica para esta proteína, de acordo com esta invenção, e conforme demonstrado nos exemplos ex- perimentais, particularmente os Exemplos 3 e 4, é notavelmente dife- rente do NGF humano tipo selvagem. Da mesma forma, como descrito no Exemplo 2, a purificação do polipeptídeo de SEQ ID NO 4 difere dos protocolos de purificação publicados para NGF tipo selvagem, e o pro- cesso específico para preparar o dito polipeptídeo de acordo com a pre- sente invenção é adequado para alcançar alta pureza, em particular au- sência de variante des-nona e tripsina.

[0236] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi expresso de forma re- combinante como um precursor. Para esse fim, a SEQ ID NO: 4 foi fun- dida com o pró-peptídeo de NGF humano tipo selvagem (posições 1- 121 de SEQ ID NO: 1). Em outras palavras, o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 consistia no precursor de NGF humano tipo selvagem (SEQ ID NO: 1), exceto para as substituições P61S R100E na porção madura de NGF tipo selvagem humano (mas, para maior clareza, faltam os 2 aminoácidos mais C-terminais de SEQ ID NO: 1 que não fazem parte da sequência polipeptídica do NGF humano tipo selvagem). A ex- pressão foi realizada em E. coli Rosetta (DE3) (cepa: E. coli Rosetta (DE3) / pET11a-hpro NGF P61S R100E), na forma de corpos de inclu- são insolúveis.

[0237] Equipamento Dispositivo No. Inventário No. Serial Fornecedor Biorreatores de 1 L (incl. sensores e bombas) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim Biorreator de 10 L E082 - Sartorius Stedim Fonte de alimentação de 300 V E018; E019 - VWR Äkta Explorer100a E011 001054 GE Healthcare Äkta Explorer100a E054 18111241 GE Healthcare Autoclave Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Centrífuga Galaxy 14D E016 904090 VWR Centrífuga Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Bancada limpa E006 40970929 Thermo Scientific Câmara de Eletroforese Novex Mini Cell - - Invitrogen Homogeneizador de alta pressão APV 2000 F688 5-07.791 APV HPLC, 1100 Series E053 - Agilent Agitador magnético MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Agitador magnético PC-620D 686 - Corning Medidor de pH inlab pH720 E017 9080718 WTW Fotômetro Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Pipetus - - Hirschmann Laborgeräte Bomba VL 1000 F606 0208004 Verder Escala F651 - Sartorius Escala E030 W092934 Kern Escala E009 - Mettler Agitador IKA KS 4000ic E049 - IKA Misturador de vórtice E012 40934086 VWR Tabela 1 – Lista de equipamentos usados.

[0238] Parâmetros de proteína de proteínas e peptídeos aqui des- critos

[0239] Os valores teóricos para parâmetros de proteínas de proteí- nas relevantes foram calculados com ProtParam-Tool de ExPASy, que está disponível em http://web.expasy.org/protparam. Eles são mostra- dos na Tabela 2, a seguir: Pró-forma de SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4 Tripsina suína MW monomérico 24,8 kDa 13,23 kDa 24,4 kDa pI 9,7 8,2 7,0 ε 25168 l / mol / cm 19668 l / mol / cm 34295 l / mol / cm Tabela 2: Propriedades teoricamente deduzidas de proteínas / polipep- tídeos relevantes

[0240] Métodos analíticos

[0241] SDS-PAGE e Western Blot

[0242] SDS-PAGE e Western Blots foram realizados usando proce- dimentos padrão. Para SDS-PAGE, géis de Bis-TRIS NuPAGE 12% (Ar- tigo No. NP0342BOX a partir de Thermo Fisher) foram operados sob condições de redução em Volt constante (175 V) em tampão correndo em NuPAGE MES (Artigo No. NP0002 a partir de Thermo Fisher). O anticorpo primário para Western Blot foi adquirido a partir de Santa Cruz Biotechnology (NGF (H-20) sc-548). Exemplos de resultados são mos- trados, por exemplo, na Figura 9A e na Figura 10.

[0243] CEX-HPLC analítico

[0244] CEX-HPLC foi realizado usando um ProPac SCX-10 a partir de Dionex. A coluna foi operada com tampão citrato 50 mM, pH 5,5 a 1 mL / min. Para a eluição, 1 M NaCl (B) foi adicionado e um gradiente linear ao longo de 50 minutos de 0-100% B foi executado. Um exemplo de resultados é mostrado na Figura 9B.

[0245] SE-HPLC

[0246] SE-HPLC foi realizado usando um Superdex 200 Increase 10/300 GL a partir de GE Healthcare. A coluna foi operada em PBS. O produto foi detectado a 280 nm.

[0247] Endotoxina, DNA e HCP

[0248] Endotoxina, DNA e proteínas da célula hospedeira (HCP) fo- ram determinadas de acordo com protocolos padrão.

[0249] Exemplo 1: Expressão do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 como uma proteína precursora

[0250] Cepa de Produção

[0251] O gene codificando o pró-NGF foi clonado no plasmídeo de expressão pET11a. O gene foi derivado de H. sapiens e duas mutações pontuais (isto é, P61S e R100E) foram introduzidas no quadro de leitura aberto. Subsequentemente, células de Rosetta (DE3) quimicamente competentes foram transformadas com o plasmídeo de expressão e uma única colônia foi selecionada (a cepa resultante foi denominada E5901-STRAIN (= E. coli Rosetta (DE3) / pET11a-pro NGF P61S R100E NGF RCB C-151101)). As alíquotas foram armazenadas a < -60 ° C, em 1,0 mL.

[0252] No Exemplo 1, é descrito o desenvolvimento de fermentação inicial com base na cepa E5901-STRAIN.

[0253] Equipamento Dispositivo No. Inventário No. Serial Fornecedor Autoclave Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Centrífuga Galaxy 14D E016 904090 VWR Centrífuga Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Bancada limpa E006 40970929 Thermo Scientific Agitador magnético MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Agitador magnético PC-620D 686 - Corning Medidor de pH inlab pH720 E017 9080718 WTW Fotômetro Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Pipetus - - Hirschmann Laborgeräte Agitador IKA KS 4000ic E049 - IKA Peso Kern 572 E030 W092934 Kern Peso Mettler AE160 E009 - Mettler Biorreatores de 1 L (incl. sensores e bombas) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim

[0254] Meio de crescimento

[0255] Meio complexo para fermentação

[0256] O meio complexo utilizado para a fermentação foi composto de: 49,3 g / L de extrato de levedura, 0,61 g / L de MgSO4 * 7H2O, 0,5 g / L de NH4Cl, 14,2 g / L de K2HPO4 * 3H2O e 10 g / L de glicose. A alimentação utilizada para esta fermentação era composta por 263 g / L de extrato de levedura e 133 g / L de glicose.

[0257] Meio mínimo (MM) para fermentação Constituinte MM I – conc. Final [mM] MM II – conc. Final [mM] Cloreto de alumínio, hexahidratado N/A 0,.000063 Sulfato de amônio 39,4 N/A Ácido bórico 0,005 0,000125 Cloreto de cálcio, dihidratado 2 0,000875 Ácido cítrico, monohidratado 25,2 10 Cloreto de Cobalto (II), hexahidratado N/A 0,00075 Sulfato de Cobalto (II), heptahidratado 0,014 N/A Sulfato de Cobre (II), pentahidratado 0,032 0,00425 Fosfato diamônio N/A 35 Fosfato dipotássio N/A 45 Hidrogenofosfato dissódico 7,5 N/A Cloreto férrico, hexahidratado 0,37 0,17 Canamicina 0,103 0,103 Sulfato de magnésio, heptahidratado 4 3 Sulfato de manganês (II), monohidratado 0,142 0,00375 Polipropileno glicol 2000 N/A N/A Cloreto de potássio 53,6 N/A Cloreto de sódio 8,5 40 Dihidrogenofosfato de sódio, monohidratado 31,9 N/A Molibdato de sódio, dihidratado 0,001 0,00005 Sulfato de zinco, heptahidratado 0,073 0,000375

[0258] Para a fase em lote, ambos os meios básicos foram suple- mentados com 30 g / L de glicose. A menos que indicado ao contrário, a alimentação tinha a mesma composição do respectivo meio em lote, mas continha 300 g / L da respectiva fonte de carbono.

[0259] Placas de LB-ágar com Ampicilina e Cloranfenicol

[0260] As placas de LB-ágar foram recém-vertidas. O meio foi com- posto por 10 g / L de peptona, 5 g / L de extrato de levedura, 5 g / L de NaCl e 15 g / L de ágar. Após autoclavagem, o meio foi suplementado com 100 µg / mL de ampicilina e 30 µg / mL de cloranfenicol.

[0261] Fermentação

[0262] A menos que indicado ao contrário, a fermentação, neste Exemplo 1, a fermentação foi realizada em biorreatores de vidro agita- dos de 1 L controlados por uma unidade Biostat B a partir de Sartorius. Tipicamente, o pO2 foi controlado a 30%, a temperatura de cultivo foi ajustada para 37° C e o pH foi controlado para 7 usando ácido fosfórico 2 M e hidróxido de amônio 25%. A menos que indicado ao contrário, a fase em lote foi seguida por uma alimentação exponencial com F0 = 6 g / L / h e µ = 0,25 / h. Por razões práticas, todas as alimentações expo- nenciais foram aproximadas por duas alimentações lineares. Tipica- mente, a indução da expressão do produto foi executada pela adição de IPTG 1 mM e após a indução, foi aplicada uma taxa de alimentação constante de 10 g / L / h. A biomassa celular foi colhida por centrifugação usando um Sorvall Evolution RC a partir de Thermo Scientific. A centrí- fuga foi equipada com um rotor SLC-6000 e a cultura foi centrifugada a 8500 rpm e 4°C por 30 min.

[0263] Quantificação relativa do produto em amostras de biomassa

[0264] Em determinados pontos no tempo, as amostras de cultura foram diluídas para um OD600 de 10 e a biomassa de alíquotas de 100 µL desta diluição foi peletizada. Os peletes foram ressuspensos em 150 µl (não redutor) de tampão Laemmli e as amostras foram fervidas du- rante 5 min a 95° C. 10 µL de cada amostra foram analisados em um gel Bis-Tris a 10% a partir de Novex. A separação eletroforética foi rea- lizada por 90 min a 125 V e os géis foram corados com Coomassie. Géis descoloridos foram varridos e a abundância da banda correspondente ao precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi quantificada por den- sitometria. Para corrigir ainda mais as variabilidades na biomassa utili- zada, a intensidade da banda correspondente ao precursor do polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4 foi normalizada para a intensidade de uma pro- teína de manutenção.

[0265] O acúmulo relativo do produto foi calculado a partir do au- mento da banda correspondente ao precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, pós- e pré-indução. Notavelmente, o valor medido representa um rendimento específico (isto é, normalizado para um OD600 = 10). Para o rendimento absoluto de uma determinada fermentação, a densi- dade celular real deve ser incluída na consideração (abaixo).

[0266] Quantificação absoluta do produto em amostras de bio- massa

[0267] Um padrão para o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi obtido a partir do European Brain Research Institute (EBRI, Roma, Itália). O padrão foi diluído para uma concentração de 65 µg / mL em tampão Laemmli. A concentração de proteína declarada foi definida por EBRI. Uma curva padrão foi preparada com 260, 520, 780, 1040 e 1300 ng do padrão para o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. As amostras foram analisadas no mesmo gel que a curva padrão e o fator de diluição da amostra foi considerado para calcular o rendimento ab- soluto do produto no momento determinado.

[0268] Sumário e Conclusões do Exemplo 1

[0269] Com base no descrito acima, conclui-se que a cepa de pro- dução (E5901-STRAIN, acima) foi usada com sucesso para fermenta- ção em escala de 1 L. Embora diferentes composições de meios tenham sido avaliadas quanto à sua capacidade de promover o crescimento bacteriano e a expressão do produto, o meio mínimo MM I suplemen- tado com 5 g / L de extrato de levedura provou ser favorável em termos de rendimento de expressão e densidade celular obtida. Em termos de formação do produto, não foram observadas diferenças significativas, quando a cultura principal foi realizada com ou sem antibióticos (Ampi- cilina e Cloranfenicol, dados não apresentados).

[0270] O Exemplo 1 pode ser ampliado para produzir o polipeptídeo em escala industrial.

[0271] Exemplo 2: Purificação em escala de laboratório, estabeleci- mento da Capto MMC

[0272] O precursor de SEQ ID NO: 4, usado neste Exemplo, foi ob- tido em corpos de inclusão conforme descrito no Exemplo 1.

[0273] Ponto de partida para otimização tendo em vista o estado da técnica

[0274] No início, os presentes inventores raciocinaram que o desen- volvimento do processo poderia, na ausência de indicações ao contrá- rio, seguir os fundamentos básicos da purificação de NGF conforme re- latado anteriormente na literatura. No entanto, também foi levado em consideração que, para uma produção eficiente em larga escala, devem ser consideradas adaptações adequadas para um aumento de escala posterior. Assim, foi fundamentado, com base em Rattenholl e outros (acima), em WO 2013092776 A1, e em outras publicações, que o poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 pode igualmente ser obtido pelo menos em um processo em escala de laboratório, por meio de sua pró-forma, em- pregando digestão inespecífica usando tripsina e purificação subse- quente. Foi raciocinado que o polipeptídeo maduro altamente puro de SEQ ID NO: 4 poderia ser obtido desse modo. No entanto, é apenas através das adaptações e modificações específicas relatadas neste exemplo que o polipeptídeo maduro altamente puro de SEQ ID NO: 4 foi obtido. Portanto, a administração de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a um indivíduo em necessidade de tratamento é permitida particular- mente em vista da alta pureza do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, con- forme descrito neste documento.

[0275] Equipamento, produção do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 Dispositivo No. Inventário No. Serial Fornecedor Biorreatores de 1 L (incl. sensores e bombas) E023, E024 07462/09, 07463/09 Sartorius Stedim Fonte de alimentação de 300 V E018; E019 - VWR Äkta Explorer100a E011 001054 GE Healthcare Äkta Explorer100a E054 18111241 GE Healthcare Autoclave Systec VX-120 E050 2512 Systec GmbH Centrífuga Galaxy 14D E016 904090 VWR Centrífuga Sorvall Evolution RC F683 - Sorvall Bancada limpa E006 40970929 Thermo Scientific Câmara de eletroforese Novex Mini Cell - - Invitrogen Homogeneizador de alta pressão APV 2000 F688 5-07.791 APV HPLC, 1100 Series E053 - Agilent Agitador magnético MR Hei-Mix S E013 30948231 Heidolph Agitador magnético PC-620D 686 - Corning Medidor de pH inlab pH720 E017 9080718 WTW Fotômetro Genesys 10uv E051 2L9Q013008 Thermo Spectronics Hirschmann Labor- Pipetus - - geräte

Dispositivo No. Inventário No. Serial Fornecedor Bomba VL 1000 F606 0208004 Verder Escala F651 - Sartorius Escala E030 W092934 Kern Escala E009 - Mettler Agitador IKA KS 4000ic E049 - IKA Misturador de vórtice E012 40934086 VWR Lista de equipamentos usados no Exemplo 2.

[0276] Detalhes do processo de fabricação de acordo com este Exemplo, incluindo as melhoras descritas no Exemplo 2B, são dados na visão geral do processo na Figura 1.

[0277] A menos que especificado de outra forma, os métodos ana- líticos foram conforme descritos na seção “Métodos analíticos” acima.

[0278] Exemplo 2A: Purificação com base em protocolos descritos anteriormente.

[0279] As células de E. coli expressando o precursor do polipeptí- deo de SEQ ID NO: 4 (“biomassa”) foram produzidas conforme descrito no Exemplo 1, e as células foram lisadas pela adição de lisozima e sub- sequente sonicação em gelo. Os corpos de inclusão (“IBs”) foram (1) extraídos das células hospedeiras e lavados com 6% Triton X100 (em 1,5 M NaCl, 60 mM EDTA) e, e (2) solubilizados em 6 M de HCl de guanidínio (“gHCl”), 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM DTT (fresco). Os IBs foram solubilizados por 2 h em temperatura ambiente. Posteriormente, o pH foi reduzido para 3-4 pela adição de HCl a 37%. A solução assim obtida compreendendo o precursor solubilizado do pre- cursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (“solubilizado”) foi dialisado contra 6 M gHCl (pH 3-4).

[0280] O redobramento do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi realizado em 0,1 M Tris-HCl, 1 M L-arginina, 5 mM EDTA, 0,61 g / L de glutationa oxidada e 1,53 g / L de glutationa reduzida, pH 9,5 a +4° C. Portanto, 50 µg de proteína foram adicionados por mL de tampão de redobramento, a cada hora. Após redobramento, a reação foi diali- sada contra 50 mM fosfato de sódio, pH 7,0. Enquanto o tampão foi trocado, ocorreu uma precipitação significativa.

[0281] O precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi purificado em uma sequência consecutiva de cromatografia de troca catiônica (SP Sefarose HP operada com 50 mM fosfato de sódio, pH 7,0 e eluída com um gradiente de NaCl) e subsequente cromatografia de interação hidro- fóbica (Fenil Sefarose HP, operada com 50 mM fosfato de sódio, 1 M sulfato de amônio, pH 7,0). Posteriormente, outra diálise foi empregada para trocar o tampão da amostra por 50 mM fosfato de sódio, pH 7,0 (observa-se que essa segunda diálise poderia, no entanto, ser omitida no processo do Exemplo 5). Novamente, quantidades significativas de produto precipitaram ao longo do processo de redução da condutividade do tampão.

[0282] O precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 assim prepa- rado foi submetido à proteólise limitada pela adição de 1 mg de tripsina por 250 mg de pró-NGF. A exposição do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 à protease foi de 14h a 2 a 8°C.

[0283] O NGF maturado foi finalmente polido sobre um trocador de cátions (SP Sefarose XL operada com 50 mM fosfato de sódio, pH 7,0 e eluída com um gradiente de NaCl). Finalmente, o produto foi concen- trado a 0,5 a 1 mg / mL e foi congelado a < -65°C.

[0284] Exemplo 2B: Melhoras

[0285] A seguir, várias melhoras, em comparação com o Exemplo 2A, conforme testado e implementado pelos presentes inventores no decorrer da obtenção da presente invenção, são descritas. A menos que o contexto indique o contrário, todos os detalhes que não estão expres- samente indicados foram como descritos acima para o Exemplo 2A.

[0286] Otimização de Solubilização de IB

[0287] Embora baixas quantidades de IBs (como exemplo recebido de culturas em frasco de agitação) tenham sido relatadas anteriormente como sendo prontamente resolvidas no tampão de solubilização (6 M gHCl, 0,1 M Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM (fresco) DTT), os IBs obtidos a partir de fermentações de alta densidade celular não po- dem ser resolvidos inteiramente. Isto pode ser resolvido, pelos presen- tes inventores, pela adição de 2 M ureia ao dito tampão de solubilização, o que acabou por melhorar significativamente o rendimento de solubili- zação (dados não mostrados). Para evitar dúvidas: a 2 M ureia estava presente em adição a 6 M gHCl e outros ingredientes.

[0288] Otimização de Redobramento

[0289] Foi decidido, inicialmente com base em Rattenholl e outros (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, pág. 3296 a 3303; Rattenholl, 2001, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum na- turalium (Dr. rer. Nat.), Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Ale- manha)), mas também levando em consideração uma escalabilidade posterior (para cima), para realizar o redobramento com 200 a 500 mg do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 por litro de reação de redobramento, de preferência 200 a 300 mg do precursor do polipeptí- deo de SEQ ID NO: 4 por litro de reação de redobramento. Isto levou a um rendimento relativamente bom do precursor solubilizado do polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4. Em particular, é importante considerar que por tal quantidade aumentada de NGF em comparação com o volume da reação de redobramento, e sob consideração que a reação de redobra- mento compreende ingredientes relativamente dispendiosos tal como glutationa e arginina, relativamente mais o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 poderia ser redobrado por volume da reação de redobra- mento, o que deve tornar o redobramento economicamente viável, tam- bém em escala de produção.

[0290] Purificação do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0291] A purificação do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, após o redobramento, foi feita por uma abordagem que utiliza o ponto isoelétrico bastante alto de pró-NGF e emprega uma fase estacionária de troca catiônica (isto é, SP Sefarose) para purificação. De modo a executar este tipo de cromatografia, por razões técnicas, o tampão de redobramento deve ser trocado por um tampão de baixa condutividade. Enquanto fazendo isso, quantidades significativas do precursor do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 precipitaram (dados não mostrados). Esta observação pode ser atribuída à redução da concentração de arginina no tampão.

[0292] Portanto, alguns esforços foram feitos para substituir a co- luna de captura por outra diferente (coluna com seletividade diferente), que poderia ser mais tolerante à presença de arginina na reação de re- dobramento. Em uma primeira tentativa de fazer isso, o desempenho de várias fases estacionárias foi avaliado, mas nenhuma das abordagens resultou em resultados promissores (Tabela 6). Portanto, a fase estaci- onária utilizada para a coluna de captura foi mantida conforme definida no processo anterior. No entanto, devido ao alto ponto isoelétrico (pI) do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, um aumento na condutivi- dade do tampão de corrida (por adição de 250 mM de L-arginina) foi possível sem afetar o desempenho. Com isso, o precursor redobrado do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 poderia ser estabilizado até certo ponto e a quantidade de precursor precipitado foi reduzida (dados não mostrados). Etapa de Potencial Cap- Descrição Curta Avaliação tura Cromatografia de interação A cromatografia de interação hidrofóbica Se sulfato de amônio ou cloreto de sódio foram adiciona- hidrofóbica não é susceptível à condutividade e à dos ao produto presente no tampão de redobramento, a composição de sal da amostra utilizada. proteína precipitou fortemente. Mesmo a adição de pe- quenas quantidades de sulfato de amônio (a uma con- centração de 0,25 M) levou à precipitação. Além disso, a adição de cloreto de sódio não foi possível sem provocar a precipitação do produto. Portanto, uma etapa de cap- tura com base em fenil- ou butil-sefarose não é uma op- ção. Cromatografia de modo Capto MMC é uma fase estacionária de Dentro de uma configuração inicial, um tampão de fosfato misto modo misto que combina propriedades hi- a pH 5,5 foi suplementado com 0,25 M de L-arginina e a drofóbicas com as de uma fase estacio- eluição foi facilitada com um gradiente de NaCl. No en- nária para troca catiônica. Como a liga- tanto, nenhuma quantidade significativa de produto (pre- ção não é apenas mediada por interações cursor) foi recuperada por esta abordagem.

iônicas, esta fase estacionária é mais to- lerante ao sal do que a fase estacionária de troca catiônica clássica. Cromatografia de exclusão A cromatografia de exclusão de tamanho Embora o cromatograma preparativo pareça promissor, de tamanho tem uma boa resolução e é independente nenhuma separação do precursor do polipeptídeo de do tampão de amostra. O gargalo típico SEQ ID NO: 4 das impurezas pode ser alcançada. Isso deste tipo de cromatografia (isto é, sua pode ser causado pela existência deste precursor especí- capacidade limitada) não é aplicável uma fico como uma mistura polidispersa sob as condições in- vez que quantidades relativamente baixas vestigadas. de produto são solicitadas.

Tabela acima: Seletividades alternativas testadas para a captura do pre- cursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 e sua avaliação.

[0293] Em relação à cromatografia de modo misto, é entendido pe- los inventores, no entanto, sem desejar estar vinculado a uma teoria particular, que o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 não elui eficientemente a partir da cromatografia de modo misto, enquanto o po- lipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 sim.

[0294] Digestão de protease para produzir NGF maduro

[0295] Para a fabricação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, a pro- tease (tripsina) é essencial e, portanto, foi raciocinado que idealmente, a tripsina particular selecionada deveria atender aos seguintes critérios:

[0296] 1. Derivado de uma fonte recombinante. A certificação de matéria-prima livre de animal é fundamental para, posteriormente, a conformidade com GMP necessária do processo.

[0297] 2. Baixa atividade colateral da tripsina. Notavelmente, a trip- sina pode ser submetida à autólise. Este processo pode resultar na cha- mada pseudotripsina, que tem um espectro de substrato alargado e pos- sui atividade semelhante à quimiotripsina. Ca2+ (por exemplo, 1 mM CaCl2) pode ser adicionado para reduzir a autólise. No entanto, hoje em dia, tipicamente, “tripsina modificada” é aplicada para cada protocolo, o que requer uma especificidade de sequência rígida (por exemplo, para impressão digital de peptídeo). Esta tripsina modificada é tipicamente obtida por acilação de grupos ε-amino expostos à tripsina de resíduos de lisina.

[0298] 3. Baixa variabilidade lote a lote, a fim de permitir um pro- cesso de produção reproduzível. Alternativamente, a enzima escolhida deve ser entregue com um certificado atestando a atividade específica do respectivo lote. A quantidade necessária de enzima pode então ser baseada na atividade e não na massa.

[0299] Apesar de uma pesquisa abrangente, nenhuma tripsina que atendesse aos critérios 1 e 2 foi identificada no mercado comercial. Foi raciocinado que o critério 1 é mais importante. Para reduzir a autólise, a adição de CaCl2 pode ser suficiente. Como um resultado, uma tripsina ‘GMP’ recombinante a partir de Roche (Roche 06369880103, Lote: 11534700) foi escolhida como matéria-prima para o processo. A se- quência desta enzima, expressa em Pichia pastoris, foi derivada de Sus scrofa. De acordo com seu certificado, o lote de tripsina utilizado tem atividade específica de 4997 U / mg (determinado de acordo com USP).

[0300] Omissão de uma segunda etapa de purificação antes da trip- sinização

[0301] Dentro de uma triagem inicial procurando por razões enzima / substrato ideais para a tripsinização pretendida, o precursor do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 obtido a partir da coluna de captura (ver acima) foi usado. Em contraste com um processo previamente estabe- lecido (European Brain Research Institute (EBRI), detalhes não publica- dos, com base em Rattenholl e outros, acima), os presentes inventores decidiram não usar uma cromatografia de interação hidrofóbica adicio- nal antes da tripsinização. A decisão de omitir essa segunda etapa de purificação da coluna antes da tripsinização foi baseada principalmente em duas linhas de pensamento: Por um lado, o produto obtido após a coluna de captura já era virtualmente puro de acordo com SDS-PAGE. Por outro lado, a própria tripsinização pode ajudar a melhorar o perfil de impurezas por digestão das proteínas da célula hospedeira (HCPs) res- tantes.

[0302] A Tabela 7 resume a matriz de condições avaliadas na pri- meira rodada. Os resultados da tripsinização foram investigados com SDS-PAGE 12% (dados não mostrados). Os resultados (dados não mostrados) indicam que a tripsinização produz de forma reproduzível o polipeptídeo estável de SEQ ID NO: 4 ao longo de uma ampla faixa de razões enzima / substrato (ou seja, de 1 - 5 µg de tripsina por 375 µg do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4). O tempo de digestão não é altamente crucial. Portanto, a parada da reação e o tempo necessário para carregar a reação na coluna de polimento aparentemente não são limitantes. Esse achado é de especial importância, uma vez que a rea- ção não pode ser adequadamente ou economicamente extinguida em escala preparativa.

[0303] Alguns experimentos adicionais foram conduzidos a fim de refinar uma relação enzima / substrato ideal para a tripsinização pre- vista, e verificou-se que com uma relação enzima / substrato de 1/100 a 1/200 (peso de proteína / peso de proteína), bons rendimentos do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4, por um lado, e baixas quantidades de pro- dutos truncados, por outro lado, podem ser obtidos de forma reproduzí- vel. Deve-se afirmar que nas condições utilizadas (ou seja, dentro de tampão fosfato / arginina (pH 7,0) a 2 a 8° C e incubado (exposto a protease) por duas a seis horas), a qualidade da digestão não foi alta- mente dependente da relação enzima / substrato. Esse achado é de especial importância, uma vez que a digestão enzimática subjacente está propensa a pequenas variações na configuração experimental (por exemplo, alteração da atividade da tripsina devido à variabilidade lote a lote ou armazenamento da enzima; tempo e temperatura da etapa de incubação (exposição à protease); erros na determinação das concen- trações de proteínas). Além disso, essa é também a razão pela qual o ajuste fino estendido em pequena escala para reduzir ainda mais os po- tenciais produtos de truncamento parece não ser significativo. Se uma condição “ótima” for identificada em pequena escala, ainda haverá uma boa chance de produzir um padrão de produto ligeiramente alterado na próxima vez que virtualmente a mesma digestão for repetida em maior escala.

[0304] Cromatografia de polimento com o objetivo de obter polipep- tídeo puro, após tripsinização

[0305] Em contraste com um processo previamente estabelecido (European Brain Research Institute (EBRI), detalhes não publicados, com base em Rattenholl e outros, acima), que empregou uma fase es- tacionária SP Sefarose para o polimento de polipeptídeo maduro (nota: SP Sefarose é uma fase estacionária de troca catiônica), aqui uma fase estacionária mais adequada foi procurada, com base nas seguintes con- siderações: a fim de ser eficientemente carregada em uma coluna de SP Sefarose, uma redução da condutividade da solução compreen- dendo o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NÃO: 4, tal como por troca de tampão, é necessária. No entanto, é conhecido (por exemplo, Exem- plo 2A) que a redução da força iônica da solução resulta na precipitação da molécula alvo e, portanto, uma troca de tampão para um tampão de baixa condutividade deve ser evitada. Além disso, uma fase estacioná- ria de troca catiônica já foi usada para a captura do precursor do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4, e uma seletividade ortogonal é preferencial a fim de conseguir uma melhor separação dos contaminantes restantes. Um terceiro e último argumento contra o uso de uma fase estacionária SP para purificação da reação de tripsinização é que o precursor poten- cialmente restante do polipeptídeo do precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 se ligaria a esta coluna e poderia ser separado do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 meramente por seletividade de eluição e não por seletividade de ligação.

[0306] A fim de estabelecer tal coluna de polimento ortogonal para purificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, pretendia-se usar uma coluna de interação hidrofóbica (HIC) em um primeiro caso. Esta fase estacionária não foi escolhida apenas para ter uma seletividade ortogonal, mas também porque uma troca de tampão para um tampão de baixa condutividade não é necessária. Apesar do teste de várias fa- ses e condições estacionárias de HIC (por exemplo, fenil- e butil-Sefa- rose operadas com 1 M (NH4)2SO4 e 0,5 M (NH4)2SO4, respectiva- mente), nenhuma etapa de polimento satisfatória com base em HIC pode ser implementada (dados não mostrados).

[0307] No entanto, em uma configuração experimental adicional para uma etapa de polimento, a fase estacionária de modo misto Capto MMC foi testada e pode ser implementada com sucesso. Verificou-se que com condições otimizadas, a fase estacionária se liga ao polipeptí- deo de SEQ ID NO: 4 reversivelmente e o produto pode ser eluído au- mentando o pH (dados não mostrados). Em contraste, o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 liga-se irreversivelmente à fase estacio- nária e só pode ser eluído usando 1M NaOH como fase móvel (dados não mostrados). Além disso, pode ser mostrado que a tripsina não se liga de forma alguma à coluna operada nas mesmas condições (dados não mostrados). Estes resultados fornecem evidências claras de que a fase estacionária Capto MMC é capaz de separar eficientemente o po- lipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 da tripsina e do precursor restante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[0308] Estabelecimento de uma cromatografia de membrana adici- onal

[0309] A fim de depletar ainda mais as endotoxinas e o DNA, uma membrana adicional de troca aniônica foi incluída no processo. Em ge- ral, e como é comumente conhecido, a cromatografia de membrana é caracterizada por uma solução compreendendo um componente a ser analisado ou purificado (no presente caso, o polipeptídeo de SEQ ID

NO: 4) é passado sobre ou através de uma membrana, que é tipica- mente carregada. Para esse fim, no presente caso, uma membrana STIC (Sartorius, Goettingen, Alemanha) foi incorporada nas posições indicadas na Figura 1. Pode ser mostrado que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 não se liga à membrana, e assim, foi fornecida uma prova de conceito de que a cromatografia de membrana é adequada para purifi- cação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Para ilustração da incorpora- ção em todo o processo, incluindo cromatografia de membrana, ver Fi- gura 1.

[0310] Reprodutibilidade do processo de acordo com o Exemplo 2

[0311] Para testar a robustez do processo, o processo foi conduzido cinco vezes e as frações resultantes foram analisadas quanto ao seu rendimento e a sua pureza. Ao longo dessas corridas, uma otimização constante dos detalhes do processo foi buscada e a composição do tam- pão, gradientes e assim por diante foram adotados até que os detalhes do processo otimizado final (ver Figura 1) fossem estabelecidos. Os re- sultados indicam que em escala de laboratório aproximadamente 50 a 100 mg de polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 podem ser produzidos a partir de uma corrida de produção consistente. Notavelmente, o produto ob- tido foi consistentemente verificado, por eletroforese em gel de SDS po- liacrilamida seguida por coloração de Coomassie ou coloração de prata, para ser relativamente puro (menos de cinco por cento de proteínas da célula hospedeira contaminantes e apenas traços de NGF truncado, da- dos não mostrados).

[0312] Para o precursor do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, nenhum método significativo para SE-HPLC pode ser estabelecido. Em con- traste, a análise SE-HPLC para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 foi direta e resultou em um pico de produto homogêneo de aproxima- damente 16 kDa que se ajusta a um estado monomérico do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (dados não mostrados).

[0313] Sumário e Conclusões

[0314] Para este processo, o precursor redobrado do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi capturado usando uma SP Sefarose FF (“FF” sig- nifica Fluxo Rápido, ou seja, uma fase estacionária com partículas rela- tivamente grandes) e foi subsequentemente tratado com tripsina para produzir NGF maduro. Para esse efeito, a concentração de arginina da reação de redobramento foi diminuída de 1 M (como recomendado pela técnica anterior) para 350 mM.

[0315] O controle da clivagem proteolítica do precursor do polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4 para produzir o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 é considerado o fator mais crítico para o processo. Aqui, as con- dições foram identificadas para facilitar de forma reproduzível a cliva- gem com alta eficiência por um lado e prevenir a formação de produtos de degradação de NGF. Os dados experimentais neste documento mos- traram que um processo de produção aparentemente robusto pode ser estabelecido em uma gama bastante ampla de relações de enzima / substrato. Para a tripsinização, os rendimentos da etapa são aparente- mente bons e nenhuma perda significativa é esperada nesse estágio do processo. O padrão do produto obtido aparentemente não depende for- temente das condições de reação utilizadas (em termos de relação en- zima / substrato e tempo de incubação (tempo de exposição à pro- tease)). Notavelmente, mesmo se um bom rendimento para o polimento da enzima for esperado, pelo menos 2 * x gramas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 têm que ser processados a fim de entregar x grama de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[0316] A purificação de acordo com este exemplo é um processo pobre que consiste meramente de duas etapas de purificação cromato- gráfica. O processo de purificação existente foi otimizado ainda mais e vários aspectos foram adotados para aumento de escala (ver Figura 1). Métodos exemplificativos de ruptura de células usados anteriormente foram substituídos por homogeneização de alta pressão e todas as eta- pas de diálise puderam ser substituídas por filtração de fluxo tangencial. O processo assim estabelecido é capaz de entregar o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 em alta pureza.

[0317] Apesar dos desafios mencionados, o processo geral parece ser capaz de entregar produtos que parecem ser de qualidade aceitável.

[0318] O processo completo que incorpora as melhoras de acordo com o Exemplo 2, incluindo cromatografia de membrana, é esquemati- camente representado na Figura 1.

[0319] O Exemplo 2 pode ser ampliado para produzir o polipeptídeo em escala industrial.

[0320] Exemplo 3: Prova de conceito in vitro e em mamíferos não humanos

[0321] A presente invenção é, em parte, baseada em experimentos com dois modelos animais de úlceras de pele. Nestes modelos, úlceras de pele são induzidas em camundongos diabéticos por punção de bióp- sia circular ou por ciclos de carregamento de pressão, e o polipeptídeo da invenção é aplicado topicamente.

[0322] É relatado aqui um estudo de administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a animais não humanos. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido em alta pureza por expressão conforme descrito no Exemplo 1 e purificação conforme descrito no Exemplo 2.

[0323] O objetivo deste exemplo é investigar a eficácia da aplicação tópica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na cicatrização de feridas em camundongos diabéticos, histopatologia relacionada, limite de dor e ní- veis de NGF humano no plasma (hNGF). Os compostos de referência (NGF humano (SEQ ID NO: 2) e NGF murino, sequência de aminoáci- dos disponível em recursos públicos) também estão incluídos no estudo.

[0324] Os animais aos quais o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é ad-

ministrado são caracterizados por um distúrbio de pele como aqui des- crito. Os animais representam um modelo animal de um ser humano que sofre de diabetes mellitus ou tem uma predisposição para sofrer de diabetes mellitus, por exemplo, diabetes mellitus Tipo 1 ou diabetes mel- litus Tipo 2.

[0325] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser administrado em uma dose única ou em doses repetidas. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser administrado a indivíduos com úlceras diabéticas, um modelo animal para úlceras neuropáticas do pé diabético (DFU).

[0326] Este exemplo inclui as seguintes seções:

[0327] Exemplo 3A: Teste de alongamento de neurite PC12 in vitro. O objetivo desta seção foi estabelecer a eficácia do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Para este propósito, foi usado um teste de alongamento de neurite convencional in vitro em células sensíveis a NGF (PC12).

[0328] Exemplo 3B: O estudo de eficácia in vivo. O objetivo desta seção foi determinar se a aplicação tópica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 melhorou a cicatrização de feridas (lesão cirúrgica) em camun- dongos diabéticos.

[0329] Os seguintes grupos foram incluídos:

[0330] - db / db, intacto N = 8, cada ponto no tempo

[0331] - db / db, ferida + veículo N = 8, cada tempo

[0332] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 1 µg / dia; N = 8, cada ponto no tempo

[0333] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 10 µg / dia; N = 8, cada ponto no tempo

[0334] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 30 µg / dia; N = 8, cada ponto no tempo

[0335] - db / db, ferida + hNGF, 10 µg / dia N = 8, cada ponto no tempo

[0336] - db / db, ferida + mNGF, 10 µg / dia N = 8, cada ponto no tempo

[0337] (dose em µg refere-se às respectivas doses administradas por ferida (cada animal tendo uma ferida)

[0338] Nesta seção do estudo, os animais foram sacrificados 7 e 30 dias após a indução da ferida, com os seguintes desfechos: tempo para o fechamento; histologia (N = 4) e imuno-histoquímica (N = 4) das le- sões.

[0339] Exemplo 3C: O mecanismo: estudo exploratório. O objetivo desta seção foi explorar os mecanismos moleculares que suportam o efeito positivo do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na cicatrização de feri- das em camundongos diabéticos, com foco na inflamação, deposição de matriz extracelular, inervação, angiogênese.

[0340] Os seguintes grupos foram incluídos:

[0341] - db / db, intacto N = 6

[0342] - db / db, ferida + veículo N = 6

[0343] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 1 µg / dia N =6

[0344] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 10 µg / dia N=6

[0345] - db / db, ferida + polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 30 µg / dia N=6

[0346] - db / db, ferida + hNGF, 10 µg / dia N = 6

[0347] - db / db, ferida + mNGF, 10 µg / dia N = 6

[0348] (dose em µg refere-se às respectivas doses administradas por ferida (cada animal tendo uma ferida))

[0349] Nesta seção do estudo, os animais foram sacrificados 14 dias após a indução da ferida, correspondendo a 50% da cicatrização da ferida, com o seguinte desfecho: exploração de possíveis mecanis- mos responsáveis pelo efeito terapêutico do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, no que diz respeito à expressão e regulação de mRNA (N = 252)

que codifica proteínas envolvidas na biologia da matriz extracelular (N = 84), angiogênese (N = 84), fatores de crescimento e biologia de neu- rotrofinas (N = 84).

[0350] Materiais e métodos neste exemplo

[0351] Animais e monitoramento

[0352] Camundongos homozigotos para a mutação espontânea de diabetes (Leprdb) (histórico genético C57BL / 6J) e os respectivos con- troles heterozigotos da mesma colônia foram usados com 8 a 12 sema- nas de idade (Charles River Laboratories - Calco - Lecco, T / BKS.CG- M + / + LEPR DB / J e S / BKS.CG-M DB / +). Ver a introdução para a composição do grupo e sacrifício de animais.

[0353] Os animais foram alojados em gaiolas individuais, com pele- tes de ração e água à vontade, e um ciclo de claro-escuro de 12 horas. Todos os protocolos com animais aqui descritos foram realizados de acordo com as Diretrizes do Conselho da Comunidade Europeia (2010/63/EU), e aprovados pelo Ministério da Saúde (n° 350/2015-PB), e estão de acordo com as diretrizes publicadas no Guia do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

[0354] O nível de glicemia no sangue foi medido antes do trata- mento, um dia após o último tratamento e antes do sacrifício (Contour XT, Bayer, Basel, Suíça).

[0355] Cronograma experimental para coorte de 8 dias: Dias -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tratamentos com NGF Fotos Teste Plantar Glicemia Sacrifício

[0356] Cronograma experimental para coorte de 30 dias:

[0357] Primeira semana: como para coorte de 8 dias

[0358] Então: fotos duas vezes por semana até o sacrifício

[0359] Glicemia no dia 28

[0360] Sacrifício no dia 29

[0361] Neste exemplo, os experimentos são indicados como coor- tes de “8 dias” e “30 dias”, enquanto os dias do teste ou sacrifício, con- forme relatado no cronograma experimental, são indicados.

[0362] Lesão, medicação e monitoramento.

[0363] Uma ferida circular de 6 mm de diâmetro de espessura total foi criada por uma biópsia dérmica no meio das costas do camundongo. Resumidamente, os animais foram profundamente anestesiados com isofluorano (+2 l / min O2). A pele das costas foi raspada com cera cos- mética e desinfetada com Clorexidina 4% (“Clorexyderm” I.C.F. srl In- dustria Chimica Fine - CR-Itália) ou Iodopovidona 10% (“Poviderm” Nuova Farmec srl - VR - Itália). Uma ferramenta de biópsia por punção estéril de 6 mm de diâmetro foi usada para criar uma ferida aberta de espessura total nas costas do animal. A área da ferida foi imediatamente coberta com o medicamento semioclusivo Tegaderm (Tegaderm Roll - 3M Health Care, St. Paul, MN, EUA) criando uma faixa de 1,5 cm de espessura ao redor do tórax de modo que os camundongos não pudes- sem roer o curativo. Uma agulha de calibre 26 foi usada para infundir 50 µl de medicamento através do Tegaderm no leito da ferida nos dias 0-6 após o ferimento. Notavelmente, o curativo Tegaderm evitou completa- mente o vazamento de solução a partir da lesão.

[0364] Uma ferida circular de espessura total de 6 mm de diâmetro tem uma superfície de 28,26 mm2.

[0365] Com base nisso, as doses administradas aos animais foram as seguintes:

[0366] Dose de 1 µg: 0,0035 µg / mm2

[0367] Dose de 10 µg: 0,35 µg / mm2

[0368] Dose de 30 µg: 1,05 µg / mm2

[0369] Os animais foram monitorados diariamente quanto à integri- dade do curativo e ausência de infecções. O Tegaderm foi trocado se- manalmente em todos os animais, até a cicatrização completa da ferida.

[0370] Uma foto da ferida incluindo uma régua foi então tirada e a área da lesão medida por análise de imagem computadorizada (NIS Ele- ments, Nikon) três vezes durante a primeira semana, depois duas vezes por semana até o final do experimento.

[0371] Administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0372] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e dividido em alíquotas diárias. Todos os procedimentos foram realizados em gelo e as alíquotas finais foram es- tocadas a -80° C.

[0373] NGF humano (hNGF, Recombinante, E. Coli Cat N°: N-245, Alomone, Jerusalém, Israel) e NGF de camundongo recombinante (mNGF, Cat N°: 1156-NG, R&D System) foram usados como NGF de controle.

[0374] Os compostos de teste foram administrados diariamente du- rante 7 dias a partir do dia da indução da ferida. 50 µl de solução de compostos de teste em cada concentração foram injetados sob a banda de Tegaderm na área da ferida com uma agulha de calibre 26. A elasti- cidade de Tegaderm permite o selamento do orifício da agulha após a retração da agulha, não sendo observado vazamento da solução lí- quida.

[0375] Monitoramento do limite da dor

[0376] A hiperalgesia térmica foi avaliada em animais que se mo- viam livremente pelo método de Hargreave usando o instrumento tér- mico de teste plantar (Ugo Basile - Comerio, Varese). Os animais foram deixados se aclimatar na caixa de plexiglass do instrumento por 15 min. Uma fonte de calor radiante de intensidade constante (diâmetro do feixe de 0,5 cm e intensidade 25 I.R.) foi colocada sob a pata traseira e a latência de retirada (segundos) foi registrada como o tempo desde o início da aplicação de calor radiante até a retirada da pata. A média de quatro medidas foi usada para análise estatística. Os animais foram tes- tados com o Teste Plantar no dia -3 (antes da cirurgia) e no dia 7 (24 horas após a última aplicação dos compostos de teste).

[0377] Coleta e processamento de tecidos

[0378] No dia do sacrifício, os camundongos foram profundamente anestesiados (Isoflurano + 2l / min O2) e amostras de pele (1 cm × 1 cm) foram retiradas da área da ferida. Para o estudo B, em cada grupo foram coletadas 4 amostras para imuno-histoquímica e 4 amostras para histologia. Para o estudo C, foram coletados 6 mm de área de pele com a punção excisional (área da ferida), um anel de 8 mm ao redor (área perimetral da ferida) e 6 mm de área de pele intacta foram coletados.

[0379] As amostras coletadas para histologia foram embebidas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina (H&E); as amostras coletadas para imuno-histoquímica foram pós-fixadas, lava- das em sacarose PBS, criosseccionadas e processadas para imunoflu- orescência indireta.

[0380] Imuno-histoquímica e análise quantitativa

[0381] A pele foi imersa em paraformaldeído 4% (peso / volume) e solução aquosa saturada de ácido pícrico em tampão Sörensen 0,1 M pH 7 por 24h, depois lavada por pelo menos 48 h em sacarose 5% em tampão fosfato 0,1 M. Após o congelamento em CO2, as seções (14 μm de espessura) foram cortadas usando um criostato (HM550 Microm, Bio-Optica). As seções foram coletadas em lâminas revestidas de gela- tina, primeiro incubadas em PBS 0,1 M em temperatura ambiente por 20 min, seguido por incubação durante a noite a 4° C em uma atmosfera úmida com os anticorpos primários diluídos em PBS-Triton X-100 0,3%, em volume. Os seguintes antissoros foram usados neste estudo: Lami- nin (Coelho, Sigma, 1:1000); produto do gene da proteína 9.5 (PGP-9.5)

(Coelho, Boheringer, 1:2000). Após enxague em PBS por 20 min (2x10 min), as seções foram incubadas a 37°C por 30 min em uma atmosfera úmida com o antissoro secundário conjugado com Rhodamine Red™ - X-conjugado - IgG de Burro anti-Coelho de afinidade pura (Jackson Immunoresearch) diluído em PBS triton 0,3%. As seções foram então enxaguadas em PBS (como acima) e montadas em glicerol contendo 1,4-fenilendiamina (0,1 g / l).

[0382] As imagens imuno-histológicas foram capturadas por um mi- croscópio Nikon Eclipse E600 equipado com uma câmera digital CCD Q Imaging Retiga-2000RV (Q Imaging, Surrey, BC, Canadá). As análi- ses foram realizadas com o software Nis-Elements AR 3.2. A área imu- norreativa de Laminina e PGP9.5 foi calculada como fração (porcenta- gem de) na camada epidérmica, 7 dias e 30 dias após a indução da lesão na pele. O índice de brotação foi estimado pela observação do número de cortes em que o PGP9,5 IR se aproximava da borda da úl- cera. Para todas as análises morfológicas, foram analisadas cinco ima- gens para cada animal e dois níveis / animal. Todas as análises foram realizadas de forma cega. O valor médio / animal foi utilizado para a análise estatística.

[0383] Quantificação de hNGF

[0384] O sangue foi coletado em tubos Vacuntainer EDTA-K2 e em 30 minutos foi centrifugado a 3000 × g por 10 minutos a 4° C. O plasma foi coletado, aliquotado em tubos de polipropileno e armazenado a -80° C até o uso.

[0385] O kit Human Adipokine Magnetic Bead Panel 2 (HADK2MAG-61K, EMD Millipore Coorporation, Billerica, MA, EUA) foi usado para quantificar hNGF em amostras de plasma usando tecnologia xMAP e uma plataforma MAGPIX Luminex. Essa tecnologia é baseada no uso de diferentes populações de microesferas codificadas por cores conjugadas com anticorpos monoclonais específicos para uma determi- nada proteína, permitindo assim a captura e a detecção simultânea de analitos específicos com alta sensibilidade a partir de um pequeno vo- lume de amostra. Usou-se uma versão simples do kit incluindo apenas uma população de microesferas conjugadas com anticorpo monoclonal NGF-β humano. O ensaio foi realizado seguindo as especificações do fabricante com pequenas modificações.

[0386] Em resumo, após a incubação da população de microesferas conjugadas de anticorpo monoclonal NGF-β humano específico com amostras de plasma (25 μl) durante a noite em RT, as microesferas fo- ram lavadas e incubadas primeiro com solução de anticorpo de detec- ção por 1 h em RT, depois com a solução conjugada de estreptavidina- ficoeritrina por 30 min em temperatura ambiente. Após a lavagem, as microesferas foram ressuspensas em 100 μl de fluido de transmissão e lidos no instrumento MAGPIX. Os dados foram analisados com o sof- tware xPONENT 4.2® e os resultados expressos em pg / mL. Obteve- se valores dentro da faixa dinâmica da curva padrão (de 10000 a 0,128 pg / mL) para todas as amostras. As curvas padrão tiveram um valor de coeficiente de correlação (R2) > 0,98. A precisão dos resultados obtidos foi ainda verificada por meio dos valores obtidos para as soluções de controle de qualidade incluídas no kit (QC1 e QC2), que estavam dentro da faixa especificada pelos fabricantes do kit. O limite de detecção de NGF-β humano foi de 0,3 a 0,7 pg / mL.

[0387] Este ensaio foi escolhido devido à alta sensibilidade e espe- cificidade para hNGF, em comparação com outros métodos ELISA.

[0388] Cultura de PC12 e tratamentos

[0389] As células foram mantidas em condições de cultura padrão no meio de cultura (DMEM, soro de cavalo 10%, FBS 5% e caneta / estreptococos 1x) em frascos T25cm2 (NUNC). Após pelo menos duas passagens, as células foram semeadas (1000 células / poço) em placas de células de fundo plano de 96 poços tratadas com cultura de células (NUNC). Após 1 dia in vitro (DIV), o meio de cultura foi removido e as células foram mantidas no meio de privação (DMEM, soro de cavalo 1%, FBS 0,5% e caneta / estreptococos 1x). As células foram tratadas com três concentrações diferentes de todos os compostos de teste (50, 100 e 200 nM), 24 horas após a privação de soro. Após 2 DIVs, o meio foi atualizado e em DIV 7, as células foram fixadas e coradas para o antí- geno beta-III-tubulina usando imunofluorescência indireta (Figura 1).

[0390] Imunocitoquímica

[0391] Em 7 DIV, as células foram fixadas com Paraformaldeído frio 4% por 20 minutos. Após o tratamento por 1 hora com a solução de bloqueio (PBS, triton X-100 0,3%, BSA 1% e Soro Normal de Burro 1%), as células foram incubadas com o antissoro primário (Anti-beta-III-tubu- lina de camundongo, 1:1000; R&D) durante a noite a 4°C. As células foram então incubadas com o anticorpo anti-camundongo secundário (conjugado com Alexa-488 de burro anti-camundongo; 1:500; Jackson) a 37°C durante 30 minutos. Finalmente, as células foram incubadas com o corante nuclear Hoechst33258 em temperatura ambiente por 20 mi- nutos.

[0392] Análise de triagem de alto conteúdo baseada em células

[0393] A análise do alongamento de neurite foi realizada com Cell Insight™ CX5 High Content Screening (HCS; Thermo Scientific), usando o BioAplicativo de Perfil Neuronal. O software é capaz de reco- nhecer cada célula em cada poço, pela presença da fluorescência do corante nuclear. Cada núcleo é identificado como um objeto, e cada ob- jeto corresponde a uma única célula. O sistema reconhece a fluorescên- cia verde (imunorreatividade da tubulina beta-III) ao redor do núcleo identificando o corpo celular. A ferramenta de perfil neuronal é capaz de reconhecer e rastrear todas as neurites emergentes a partir de cada corpo celular. Isso permite contar e medir todas as neurites a partir de cada célula. O agregado de células não foi reconhecido como um objeto de dimensão única de célula e foi excluído da análise.

[0394] Um número de 2.000 - 4.000 células / poço e 6 poços / trata- mento foi analisado.

[0395] RT-PCR

[0396] O estudo exploratório sobre os possíveis mecanismos que suportam o efeito positivo do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na cicatri- zação de feridas em camundongos diabéticos foi realizado usando uma estratégia exploratória (análise de expressão gênica focada na via usando as matrizes PCR RT2), e com foco nas principais vias molecu- lares envolvidas na cicatrização de feridas em 50% do processo de re- paro, por exemplo, angiogênese, matriz extracelular e proteínas de ade- são, fatores de crescimento. As amostras foram coletadas a partir do núcleo da lesão (6 mm de diâmetro) e o RNA foi extraído de todos os animais (6 animais por grupo), quantificado (espectrofotômetro Nano- drop 2000) e agrupado (100 ng por animal). Assim, 600 ng de RNA por grupo foram usados para a transcrição reversa.

[0397] Uma única matriz de PCR foi realizada para cada grupo, usando o instrumento de PCR em tempo real CFX96 (BioRad). Para todas as placas foi utilizado o mesmo limite e a expressão relativa do gene foi calculada pelo método comparativo 2-ΔΔCq. A angiogênese de camundongo, a matriz extracelular e a proteína de adesão (ECM) e os fatores de crescimento (GFs) Rt2 Profiler™ (QIAGEN) foram usados para traçar o perfil da expressão de 250 genes principais envolvidos na angiogênese, ECM e GFs (84 genes cada) com cDNA sintetizado usando o kit RT2 First Strand (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante.

[0398] Resultados

[0399] Os resultados são apresentados na seguinte ordem:

[0400] - Ensaio PC12 in vitro

[0401] - Eficácia, 8 dias

[0402] - Eficácia, 30 dias

[0403] - Mecanismo, 14 dias

[0404] Exemplo 3A: Teste de alongamento de neurite PC12 in vitro

[0405] A eficácia do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi testada in vitro em células PC12 (ver Figura 1 para o projeto experimental), me- dindo o alongamento de neurite por meio de triagem de alto teor base- ada em células, usando os seguintes parâmetros:

[0406] - Comprimento Médio de Neurite Médio: representa o com- primento médio de neurite por célula;

[0407] - Comprimento Total de Neurite Médio: representa o compri- mento total de neurite por célula;

[0408] -% Comprimento Máximo de neurite Alto: representa a por- centagem de células que apresentam uma neurite igual ou maior que o comprimento do corpo celular.

[0409] Em primeiro lugar, todas as doses dos compostos de teste foram analisadas e comparadas com o grupo de veículo (dados não mostrados). Neste relatório, apenas os resultados para uma dose mais eficaz de cada composto de teste foram mostrados (Figura 1). As célu- las expostas a todas as doses eficazes de compostos de teste mostra- ram um aumento no comprimento médio de neurite média (A; mNGF, P = 0,0394; hNGF, P = 0,0196; polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, P = 0,0033) e comprimento total de neurite média (B; mNGF, P = 0,0338; hNGF, P = 0,0006; polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, P = 0,0211; Aloe, P < 0,0001) em comparação com as células tratadas com veículo. Apenas o poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 (P = 0,0367) foi capaz de aumentar a por- centagem de células que apresentam neurite longa.

[0410] Exemplo 3B: O estudo de eficácia, coorte de 8 dias.

[0411] Monitoramento animal

[0412] Os animais foram monitorados quanto aos níveis de glicose no sangue antes da geração da ferida. Os resultados são relatados na Figura 3. A glicemia foi maior em camundongos diabéticos do que em animais de controle, conforme medido no estudo piloto. Não foram ob- servadas diferenças entre os animais atribuídos aos diferentes grupos experimentais.

[0413] O ganho de peso corporal entre o dia 0 e o dia 7 pós-lesão é relatado na Figura 4. Não foram observadas diferenças de acordo com o tempo (dia 0 vs dia 7) ou o tratamento.

[0414] Hiperalgesia

[0415] A hiperalgesia térmica foi avaliada em animais que se mo- viam livremente pelo método de Hargreave usando o instrumento tér- mico de teste plantar no dia -3 (antes da lesão na pele) e no dia após a última aplicação do composto de teste (dia 7). Os resultados são ilus- trados na Figura 5. Nenhuma diferença entre os grupos foi observada no dia 0. Ao comparar a latência de retirada da pata média no dia 0 e no dia 7 no mesmo grupo de tratamento, uma redução significativa foi observada em animais tratados com hNGF no dia 7. Não foi observada hiperalgesia aos estímulos térmicos nos outros grupos. Notavelmente, um limite mais alto foi observado nos camundongos tratados com poli- peptídeo de SEQ ID NO: 4 no dia 7, indicando um limite de dor mais alto neste grupo.

[0416] Tempo para fechamento

[0417] A avaliação da cicatrização das feridas foi realizada por ob- servação macroscópica de fotos, que foram tiradas a partir do dia 0 (dia da cirurgia) a cada dois dias durante a primeira semana. O “tempo para fechamento” foi medido nessas imagens de feridas usando elementos NIS (Nikon). Os resultados são relatados na Figura 6, onde as áreas externas e internas são plotadas. ANOVA de duas vias indica um efeito de tempo (F (4.203) = 41,25, p < 0,0001) e um efeito de grupo (F (5.203) = 2,565, P = 0,0282).

[0418] O tempo para o fechamento no dia 7 é relatado na Figura 7. Nenhuma diferença é observada entre os grupos, apesar do fato de que uma tendência dose-dependente para promover a cicatrização de feri- das é observada no polipeptídeo dos grupos tratados com SEQ ID NO:

4.

[0419] Níveis plasmáticos de NGF

[0420] O sangue foi coletado no sacrifício, portanto 48 horas após a última aplicação dos compostos de teste. Os níveis plasmáticos de NGF foram determinados por um ensaio baseado em anticorpo usando um anticorpo que é capaz de detectar NGF humano, NGF murino e tam- bém o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 4. Aqui, os níveis plas- máticos de NGF assim determinados são descritos como “níveis plas- máticos totais de NGF”. Os resultados são apresentados na Figura 8. Um aumento dose-dependente nos níveis plasmáticos de NGF total foi observado em camundongos tratados, atingindo valores superiores a 350 pg / ml. Além disso, um aumento também foi observado no grupo tratado com mNGF. Isto não é surpreendente, uma vez que o NGF-β de camundongo recombinante usado para tratamentos é um homodímero de dois polipeptídeos de aminoácidos que compartilham cerca de 90% de identidade a nível de aminoácido com NGF humano, e é reconhecido pelo mesmo anticorpo.

[0421] Exemplo 3C: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0422] Monitoramento animal

[0423] Os animais foram monitorados quanto aos níveis de glicose no sangue antes da geração da ferida, após o final da administração dos compostos de teste e no sacrifício. Os resultados são apresentados na Figura 9. Observou-se um aumento progressivo nos níveis de glicose no sangue ao longo dos 28 dias de observação em todos os grupos experimentais. Não foram observadas diferenças entre os grupos de tra- tamentos nos diferentes tempos.

[0424] O ganho de peso corporal entre o dia 0 e o dia 28 pós-lesão é relatado na Figura 10. Não foram observadas diferenças de acordo com o tempo ou o tratamento.

[0425] Hiperalgesia

[0426] A hiperalgesia térmica foi avaliada em animais que se mo- viam livremente pelo método de Hargreave usando o instrumento tér- mico de teste plantar no dia -3 (antes da lesão na pele) e no dia 7, 24 horas após a última aplicação de NGF. Os resultados são ilustrados na Figura 11. Nenhuma diferença entre os grupos foi observada no dia 0. Ao comparar a latência no dia 0 e no dia 7 no mesmo grupo de trata- mentos, uma tendência não significativa para uma redução na latência de retirada da pata foi observada no dia 7 em animais tratados com hNGF. No entanto, quando os dados de coortes de 8 e 30 dias foram reunidos, uma redução significativa do limite de dor foi observada em animais tratados com hNGF, sugerindo assim que esta formulação de hNGF induz hiperalgesia. Nenhuma diferença foi observada nos outros grupos. Os resultados são apresentados na Figura 12.

[0427] Tempo para fechamento

[0428] A avaliação da cicatrização da ferida foi realizada por obser- vação macroscópica tirando fotos a cada dois dias durante a primeira semana começando a partir do dia -3 (dia da cirurgia), depois duas ve- zes por semana até o sacrifício. O “tempo para fechamento” foi medido nessas imagens de feridas usando elementos NIS (Nikon).

[0429] Os dados individuais para “Tempo para fechamento” são apresentados em forma de tabela (Figura 13). As medições em série da área da ferida externa são representadas em função do tempo na Figura

14. ANOVA de duas vias indicam um efeito de tempo (F (50.434) = 417,3, p < 0,0001), um efeito de tratamento (F (5.434) = 21,45, p < 0,0001), e uma interação entre tratamento e tempo (F (50.434) = 1,638, p = 0,0055).

[0430] Em camundongos tratados com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, a taxa de cicatrização de feridas foi significativamente acelerada em comparação com animais tratados com veículo de uma forma dose- dependente.

[0431] O tempo para fechamento no dia 8 é relatado na Figura 15, onde os dados de coortes de 8 e 30 dias são agrupados. Uma redução significativa da cicatrização de feridas já neste momento é observada no grupo tratado com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na dose de 30 µg / dia, em comparação com o grupo tratado com veículo.

[0432] Níveis plasmáticos de NGF

[0433] O sangue foi coletado no sacrifício. Os níveis plasmáticos de NGF foram determinados por um ensaio baseado em anticorpo usando um anticorpo que é capaz de detectar NGF humano, NGF murino e tam- bém o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 4. Aqui, os níveis plas- máticos de NGF assim determinados são descritos como “níveis plas- máticos totais de NGF”. Os resultados são apresentados na Figura 16. Os níveis plasmáticos de NGF total são muito baixos (em comparação com a Figura 8), não superiores a 10 pg / ml, e similares em todos os grupos.

[0434] Histologia (em 8 e 30 dias) (ver também o relatório do estudo piloto)

[0435] Amostras da pele contendo a área da úlcera incluindo uma margem de 5 mm de pele intacta foram excisadas, embebidas em para- fina e seccionadas em série de acordo com o esquema apresentado na Figura 17B. As seções foram então coradas (H&E) e imagens represen- tativas de baixa potência nos diferentes níveis da ferida são relatadas na Figura 17A. Micrografias de alta potência ilustram o processo de re- epitelização na borda da ferida (Figura 17D), onde a língua em migração da epiderme (MET) é evidente, o extenso tecido de granulação na derme abaixo da camada de epiderme, caracterizado por inflamação,

proliferação celular, deposição de matriz (Figura 17E) e angiogênese (Figura 17F). A re-epitelização foi avaliada medindo a espessura da ca- mada da epiderme. Imagens representativas de animais intactos, ca- mundongos tratados com veículo, polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 1 µg / dia, polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 30 µg / dia são apresentadas na Figura 18. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 induz um espessamento dose-dependente da camada da epiderme, que aparece muito mais alto do que na pele intacta. A camada basal da epiderme é caracterizada pela hipercelularidade das camadas basal e espinhosa, possivelmente refletindo um aumento da proliferação celular. Além disso, a derme tam- bém é mais espessa e fortemente corada, sugerindo maior deposição de matriz extracelular, e é enriquecida por anexos cutâneos (glândulas e folículos pilosos) também de acordo com a dose. A espessura da epi- derme em todos os grupos é apresentada no gráfico. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 induz um espessamento dose-dependente da camada epidérmica, que cresce muito mais espessa do que no grupo de veículo. Além disso, mNGF e hNGF induzem o mesmo efeito, comparável ao grupo de correspondência de dose tratado com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[0436] Imuno-histoquímica (em 8 e 30 dias)

[0437] A reinervação da pele foi analisada por meio da imunomar- cação para a proteína PGP9.5, um marcador neuroectodérmico alta- mente sensível, amplamente utilizado para visualizar a inervação cutâ- nea. A anatomia da inervação da pele é apresentada na Figura 19, onde as fibras PGP9.5 –IR na pele intacta do camundongo são visualizadas. Em particular, os plexos subcutâneos, cutâneos profundos e subepidér- micos são visualizados; o plexo subepidérmico fornece as terminações nervosas epidérmicas livres para a epiderme.

[0438] O efeito da aplicação tópica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 no recrescimento do nervo na pele reparada foi analisado usando um

“índice de brotamento” na borda da lesão no dia 8 após a lesão, e PGP9.5-IR na epiderme e derme da área reparada. Imagens represen- tativas são relatadas na Figura 20. Os painéis A, B e C ilustram PGP9.5- IR em 30 dias, em animais intactos, camundongos tratados com veículo e com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 30 µg / dia, respectivamente. Os resultados da análise morfométrica são apresentados na Figura 21. A aplicação de 30 µg / dia do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 induz um aumento significativo no brotamento aos 8 dias, tal como hNGF. Aos 30 dias, enquanto em animais tratados com veículo a inervação ainda não foi restaurada, não foram observadas diferenças entre animais intactos e tratados com NGF administrando o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (to- das as dosagens) e mNGF. Pelo contrário, e a hiperinervação é obser- vada usando hNGF.

[0439] O efeito da aplicação tópica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na angiogênese foi estimado usando laminina como marcador. A la- minina é um marcador da membrana basal, marcando várias estruturas da pele, incluindo as células endoteliais. Outros marcadores endoteliais como PECAM (também conhecido como CD31), fator de Von Wille- brand, colágeno, apresentaram coloração inadequada para quantifica- ção nas condições de fixação utilizadas neste estudo. Imagens repre- sentativas são relatadas na Figura 22. Os painéis A ilustram a camada epidérmica conforme visualizada por histologia convencional (H&E). As setas indicam a camada basal. O painel B ilustra a membrana basal subjacente à epiderme (setas); o painel C ilustra a inervação sensorial da epiderme derivada do plexo subependimal; o painel D ilustra a borda da úlcera e a inervação relacionada aos 8 dias (E) e após o reparo da pele (F). Os painéis G-I ilustram a angiogênese em 8 dias (G, EE; H, laminina-IR) e 30 dias (I).

[0440] Os resultados da análise morfométrica são apresentados na Figura 23. A aplicação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a 30 µg / dia induz um aumento significativo na laminina-IR em 8 dias, tal como hNGF, que ainda está presente em 30 dias, possivelmente refletindo em angiogênese.

[0441] O mecanismo: Estudo exploratório

[0442] Regulação da expressão gênica

[0443] O objetivo do estudo foi explorar os mecanismos molecula- res que suportam o efeito positivo do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na cicatrização de feridas em camundongos diabéticos, com foco na infla- mação, deposição de matriz extracelular, inervação, angiogênese. Uma estratégia exploratória (análise de expressão gênica focada na via usando Matrizes PCR RT2 Profiler foi usada para identificar a via mole- cular principal na ferida em 50% do processo de reparo). A angiogênese de camundongo, a matriz extraceluar e proteína de adesão (ECM), e os fatores de crescimento (GFs) Rt2 Profiler™ foram usados para traçar o perfil da expressão de 252 genes chave envolvidos na angiogênese, ECM e GFs (84 genes cada).

[0444] A análise da expressão para cada painel (angiogênese, ECM, fator de crescimento) é apresentada por:

[0445] - a lista de genes;

[0446] - o mapa de calor fornecendo uma representação gráfica de dados de expressão de regulação de dobra entre dois grupos sobrepos- tos no layout de placa de matriz de PCR;

[0447] - o gráfico de espalhamento comparando a expressão nor- malizada de cada gene na matriz entre dois grupos, plotando-os um contra o outro para visualizar rapidamente grandes alterações na ex- pressão do gene, e a lista de genes cujas alterações de expressão são maiores do que o limite selecionado (≥ 3).

[0448] Os gráficos de espalhamento ilustram a comparação do grupo da seguinte forma:

[0449] - db / db vs. camundongos WT (WT como grupo de controle)

[0450] - veículo db / db vs. db / db intacto (db / db intacto como grupo de controle)

[0451] - NGF db / db (polipeptídeo de SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) vs veículo db / db (veículo db / db como grupo de controle)

[0452] - NGF db / db (polipeptídeo de SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) vs db / db intacto (grupo de controle db / db intacto)

[0453] Os resultados são avaliados como matriz extracelular e mo- léculas de adesão e fatores de crescimento e neurotrofinas (figuras não mostradas).

[0454] Os principais resultados e conclusões, da presente análise, são os seguintes:

[0455] Efeito do genótipo:

[0456] - A comparação entre db / db intacto vs WT intacto indica que numerosos genes de angiogênese e ECM são regulados diferencial- mente de acordo com os genótipos, enquanto muito poucos genes de GF são expressos diferencialmente, sugerindo que ECM e angiogênese são os processos afetados principalmente pela condição diabética para reparo de feridas.

[0457] - Efeito da lesão em db / db:

[0458] - A lesão induziu a regulação negativa de numerosos genes de angiogênese e ECM, e a regulação positiva de poucos genes GFs, sugerindo que ECM e angiogênese são os principais processos que conduzem o reparo de feridas também em camundongos diabéticos.

[0459] - efeito do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 em db / db (vs veí- culo):

[0460] - o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 regula negativamente vá- rios genes, incluindo: Angiogênese: akt, Ccl2 (quimiocina (motivo C-C) ligando 2), Ctgf (fator de crescimento do tecido conjuntivo), Hif1a, MMP14, thbs2 (trombospondina 2);

[0461] - o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 regula positivamente vários genes, e apenas alguns deles também são regulados por hNGF e mNGF

[0462] - o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 não regula genes de GF, alguns deles são regulados por hNGF e mNGF

[0463] Uma análise STRING também foi realizada (dados não mos- trados). STRING é um banco de dados biológico e recurso da rede de interações proteína-proteína conhecidas e previstas, que é amplamente usado para pesquisar relações de interação entre genes expressos di- ferencialmente. A análise de “agrupamento” do software STRING é ba- seada em todos os genes que são regulados nas diferentes matrizes.

[0464] Conclusões

[0465] As principais conclusões deste exemplo são as seguintes:

[0466] 1. A célula PC12 acoplada a HCS como abordagem analítica é uma abordagem adequada para avaliar a eficácia in vitro do polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4;

[0467] 2. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 melhora a cicatrização de uma maneira dose-dependente.

[0468] 3. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aumenta fortemente o reparo da camada de epiderme e induz um forte aumento de espessura; o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 também afeta positivamente a reiner- vação e a angiogênese (conforme avaliado por laminina-IR). Todos es- ses parâmetros no polipeptídeo de camundongos tratados com SEQ ID NO: 4 são maiores do que em camundongos de controle intactos, suge- rindo assim que a fase de remodelagem da cicatrização de feridas deve ser avaliada em um estudo adicional.

[0469] 4. O estudo exploratório sugere que a via AKT-mTOR pode estar envolvida no efeito do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Akt e mTOR são considerados promotores de sobrevivência e de crescimento celu- lar, e foi sugerido que a ativação farmacológica transiente do eixo de sinalização PI3K-Akt-mTOR pode representar uma nova estratégia de intervenção clínica para acelerar a cicatrização. Notavelmente, uma via AKT-mTOR prejudicada foi indicada como possível causa de prejuízo na cicatrização de feridas em camundongos diabéticos, e a via AKT- mTOR demonstrou estar envolvida na cicatrização aprimorada de feri- das por várias moléculas, como Notoginsenosídeo Ft1 em camundon- gos diabéticos; acemannan; SR-0379; família microRNA-99.

[0470] Assim, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é uma proteína re- combinante com uma sequência polipeptídica similar ao fator de cresci- mento do nervo humano, mas com pelo menos uma mutação que o torna indolor (hNGFp) e terapeuticamente eficaz. Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7

PM PM AM semea- Priva- NGF Meio ICC dura ção de PC12 soro Tabela acima: Modelo experimental para teste de alongamento de neu- rite in vitro em células PC12. Ver métodos para mais detalhes.

[0471] Exemplo 4: Prova de conceito: Modelo de úlcera por pressão em camundongos

[0472] É relatado aqui um estudo de administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 a animais não humanos. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido em alta pureza por expressão conforme descrito no Exemplo 1 e purificação conforme descrito no Exemplo 2.

[0473] Métodos

[0474] Foram incluídos no experimento camundongos machos de controle (C57BL6, albino) e C57BL / KsJ-m +/+ Leprdb (db / db) geneti- camente diabéticos, laboratórios Jackson, de 8 a 10 semanas de idade. Sob anestesia gasosa, os animais foram raspados nas costas e a área raspada foi cuidadosamente limpa para evitar irritação da pele. Uma do- bra cutânea foi levantada e dois discos de cerâmica magnética de 12 mm de diâmetro e uma espessura de 5,0 mm, com peso médio de 2,4 g e força magnética de 1000 G (Magnetic Fountain, Castle Rock, CO), foram aplicados na pele deixando uma “ponte” de aproximadamente 5,0 mm de pele entre os dois ímãs. Este processo cria 50 mm Hg de pressão compressiva entre as duas placas, como foi documentado ser necessá- rio para causar isquemia local do tecido (Peirce e outros, 2000, Wound Repair Regen., Vol. 8, pág. 68 a 76). Três ciclos de isquemia-reperfusão (I / R) foram aplicados para induzir a formação de 2 úlceras de severi- dade homogênea. Um único ciclo de I / R consiste em um período de 12 h para aplicação dos ímãs a partir das 8:00, seguido de um período de descanso de 12 h sem ímãs. Os tratamentos com veículo e compostos de teste foram iniciados 3 dias após o final dos ciclos de I / R para per- mitir a curetagem cirúrgica das úlceras que consiste da remoção de ex- sudado de fibrina e tecido necrótico.

[0475] Alguns dos camundongos foram submetidos a um trata- mento investigativo com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, que também pode ser descrito como fator de crescimento do nervo mutante humano recombinante indolor (hNGFp). Em detalhes, os seguintes grupos expe- rimentais foram investigados:

[0476] - db / db, veículo

[0477] - db / db, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 1 µg / cm2 / dia

[0478] - db / db, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 10 µg / cm2 / dia

[0479] - db / db, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 100 µg / cm2 / dia.

[0480] O tratamento foi continuado diariamente por 14 dias conse- cutivos e depois duas vezes por semana até o fechamento com a mesma dosagem (dosagem calculada em relação ao tamanho da úlcera no momento do tratamento). As úlceras foram monitoradas por inspeção visual para estabelecer o dia do fechamento. Além disso, uma foto da ferida incluindo uma régua foi tirada e a área da lesão medida por aná- lise de imagem computadorizada quando as úlceras foram medicadas duas vezes por semana. A avaliação da úlcera por pressão foi realizada de acordo com uma escala padronizada e medindo a área da ferida por análise de imagem computadorizada.

[0481] O efeito do composto no limite da dor foi avaliado em animais que se moviam livremente no sítio da lesão com o aparelho eletrônico von Frey da Bioseb, um aparelho eletrônico que permite a determinação do limite de sensibilidade à dor mecânica em roedores.

[0482] A histologia da lesão, a inervação e a angiogênese serão analisadas por histologia e imuno-histoquímica e análise de imagem computadorizada.

[0483] Resultados

[0484] Colocar os ímãs em uma dobra da pele nas costas de ca- mundongos diabéticos induziu danos irreversíveis envolvendo todo o te- cido dermoepidérmico sob o sítio da compressão. Tanto a inspeção vi- sual (presença de área necrótica e hemorrágica) quanto a análise his- tológica confirmaram que os 3 ciclos de I / R foram capazes de induzir lesões que lembravam úlcera por pressão.

[0485] Em todos os grupos tratados com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, a taxa de cicatrização de feridas foi acelerada em comparação com os animais tratados com veículo. O fechamento das úlceras nos animais tratados com polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foi aparente come- çando a partir dos dias 17 e 21, enquanto os animais tratados com veí- culo sofreram cicatrização a partir do dia 23.

[0486] No dia 28, o último dia de observação, em mais de 80% dos animais tratados com polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, as úlceras cutâ- neas estavam completamente fechadas; como mostrado na Figura 25; em comparação com os animais tratados com veículo, o efeito foi esta- tisticamente significativo em todas as doses do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, sendo a probabilidade de cicatrização no primeiro grupo inferior a 60%. Estes dados estão de acordo com a evidência da literatura mos- trando que em modelos animais de diabetes, a taxa de cicatrização de feridas é prejudicada e, juntamente com os dados gerados no modelo de úlcera cirúrgica (Exemplo 3), eles sugerem que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode normalizar o processo de cicatrização retardado em camundongos diabéticos.

[0487] Além dos efeitos positivos na cicatrização de feridas, os da- dos histológicos e imuno-histoquímicos fornecem evidências adicionais de que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 tem a capacidade biológica de melhorar o grau dos parâmetros de cicatrização de feridas em camun- dongos diabéticos com problemas de cicatrização. No nível histológico, na área reparada, uma re-epitelização completa e a restauração de uma anatomia normal da pele foram observadas após o tratamento com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. A imuno-histoquímica mostrou que o po- lipeptídeo de SEQ ID NO: 4 também afetou positivamente a reinervação (como medido por PGP 9.5 imunorreatividade na epiderme) e neo-an- giogênese (como medido por imunorreatividade PECAM na derme) (Fi- gura 26 A e B).

[0488] Uma vez que foi relatado que NGF tipo selvagem aumenta a sensibilidade à dor no sítio de administração, o limite mecânico da dor foi avaliado após 14 dias consecutivos de tratamento com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aplicando um estímulo mecânico na borda das úlceras. Nenhuma modificação do limite mecânico da dor foi observada em com- paração com camundongos diabéticos tratados com veículo, sugerindo que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 após o tratamento tópico crônico pode exercer seus efeitos tróficos positivos na pele em um grande inter- valo de doses sem causar sensibilização de nociceptores (Figura 27).

[0489] Exemplo 5: Um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo para investigar a segurança, tolerabilidade, perfis farmaco- cinéticos e farmacodinâmicos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 após doses crescentes únicas e repetidas em indivíduos com úlceras neuro- páticas do pé diabético (DFU).

[0490] É relatado aqui um estudo de administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 em doses crescentes únicas e repetidas em partici- pantes com úlceras neuropáticas do pé diabético (DFU). Os participan- tes são seres humanos.

[0491] O ensaio descrito neste exemplo recebeu aprovação ética das respectivas autoridades.

[0492] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 também pode ser descrito como fator de crescimento de nervo mutante humano recombinante in- dolor (hNGFp). O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é alternativamente de- nominado “FATOR DE CRESCIMENTO DO NERVO HUMANO RE- COMBINANTE (RHNGF)” ou “SUB77552”, e a fórmula molecular com- pleta é C580H895N163O176S8. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 pode ser obtido a partir de origem biológica / biotecnológica (diferente de Ad- vanced Therapy IMP (ATIMP)). É um medicamento recombinante (ver também Exemplo 1). Mais particularmente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é obtido por expressão conforme descrito no Exemplo 1 e purifi- cação conforme descrito no Exemplo 2. Em particular, a alta pureza ob- tida conforme descrito no Exemplo 2, de preferência sob os padrões GMP, permite o uso do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 como um medi- camento.

[0493] Como usado neste exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é um Produto Medicinal sob Investigação (IMP). De acordo com a Di- retiva 2001/20/EC, um “IMP” é uma “forma farmacêutica de uma subs- tância ativa ou placebo testada ou usada como uma referência em um ensaio clínico, incluindo produtos já com uma autorização de comercia- lização, mas usados ou montados (formulados ou embalados) de uma forma diferente da forma autorizada, ou quando usados para uma indi- cação não autorizada, ou quando usados para obter mais informações sobre a forma autorizada. “Aqui, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é um IMP a ser usado em um primeiro ensaio clínico em humanos. Assim, este exemplo descreve um primeiro ensaio clínico em humanos. Não foram identificados fatores de risco de acordo com a orientação primeiro em humanos.

[0494] O IMP usado neste Exemplo é fornecido como uma solução límpida e incolor de hNGFp preparada a 1 mg / ml do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é ajustado à concen- tração desejada e preenchido em um frasco de vidro. A concentração da solução é de 1 mg / ml.

[0495] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é administrado a indivíduos humanos em necessidade de tratamento. O dito polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é administrado como solução cutânea. Esta não é uma formu- lação pediátrica específica.

[0496] Os indivíduos humanos em necessidade de administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 são indivíduos com úlceras neuropá- ticas do pé diabético (DFU). Nenhum fator de risco de acordo com o primeiro na orientação humana foi identificado.

[0497] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é administrado topicamente. Assim, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é para uso tópico (não corrente).

[0498] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é administrado em uma dose total de 0,3 a 6 μg / mm2. “mm2” refere-se à área da úlcera. A quantidade indicada (em μg) refere-se à quantidade do polipeptídeo que é administrado por dia.

[0499] O polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é administrado duas vezes ao dia durante 14 dias consecutivos. Depois disso, a administração é descontinuada.

[0500] Neste estudo existe um placebo. O placebo é descrito como PL1. O placebo é uma solução cutânea. O placebo é para uso tópico (não corrente). O placebo é um placebo para o polipeptídeo de SEQ ID

NO: 4 (PR1). O placebo é de outra forma idêntico ao IMP (PR1). O pla- cebo é administrado de forma idêntica ao polipeptídeo de SEQ ID NO:

4.

[0501] PR1 e placebo 1 são ambos preparados para o ensaio em e por Klifo A / S, Smedeland 36, 2600 Glostrup, Dinamarca.

[0502] Não existe outro medicamento (comparativo) neste estudo.

[0503] Os indivíduos submetidos a este estudo sofrem de ou têm predisposição para uma doença, que é uma doença de pele e do tecido conjuntivo. Mais particularmente, os indivíduos submetidos a este es- tudo são indivíduos com Úlceras Neuropáticas do Pé Diabético (DFU). A úlcera do pé diabético é uma das principais complicações do diabetes mellitus, uma ferida de espessura total que não cicatriza ou cicatriza fracamente, através da derme, abaixo do tornozelo em um indivíduo com diabetes. Versão MedDRA, classe de órgão de sistema, nível, termo e código de classificação (sítio da rede EMEA Eu- draCT (http://eudract.ema.europa.eu/)): Versão Classe de órgão de sistema Código de classificação Termo Nível

20.0 100000004858 10012664 Úlcera do pé diabético LLT

[0504] O ensaio tem um comitê independente de monitoramento de dados.

[0505] A estimativa inicial da duração do ensaio é de 2 anos e 1 mês.

[0506] O número planejado de indivíduos incluiu 92 (60 dos quais na faixa etária de 18 a 64 anos; 32 dos quais na faixa de 65 anos ou mais). O grupo de indivíduos do ensaio consiste em pacientes e não inclui voluntários saudáveis. Populações vulneráveis específicas são in- cluídas.

[0507] O tratamento ou cuidado após o participante ter encerrado sua participação no estudo é o padrão de cuidado.

[0508] A aprovação ética a partir das autoridades foi obtida. Foi emi- tido parecer favorável.

[0509] Objetivo do Ensaio:

[0510] Objetivo principal: Avaliar a segurança e a tolerabilidade da dosagem tópica em dias únicos e múltiplos com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 em indivíduos com DFU.

[0511] Objetivos secundários:

[0512] (a) Avaliar o perfil farmacocinético do fármaco sistemica- mente disponível após dosagem tópica de um e múltiplos dias com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 em indivíduos com DFU;

[0513] (b) Avaliar os efeitos farmacodinâmicos da dosagem tópica de múltiplos dias com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 na cicatrização de DFU ao longo de um período de 12 semanas.

[0514] Não há subestudo.

[0515] Principais critérios de inclusão:

[0516] Parte 1 SD e Parte 2 MD:

[0517] Os indivíduos devem atender a todos os critérios a seguir para serem elegíveis para inscrição no estudo:

[0518] 1. Consentimento informado por escrito do indivíduo obtido antes de qualquer procedimento relacionado ao estudo;

[0519] 2. Indivíduo do sexo masculino ou feminino, com idade entre 18 e 80 anos (extremos inclusive), diagnosticado com diabetes mellitus Tipo I ou Tipo II, com hemoglobina glicosilada (HbA1c) ≤ 10%.

[0520] 3. Indivíduos do sexo feminino sem potencial para engravidar (WONCBP): - devem relatar esterilização cirúrgica (realizada pelo me- nos 6 meses antes da triagem), ou - menopausa (não deve ter sangra- mento menstrual regular por pelo menos um ano antes da triagem, idade ≥ 45 anos e FSH na triagem ≥ 40 mIU / ml).

[0521] 4. Indivíduo do sexo feminino com potencial para engravidar (WOCBP): eles devem estar usando um ou mais dos seguintes métodos confiáveis de contracepção durante o período do estudo e pelo menos dentro de 90 dias após a última administração do medicamento do es-

tudo: a) Colocação de um dispositivo intrauterino (DIU) ou sistema in- trauterino (IUS). b) Contracepção hormonal (implantável, adesivo, oral). c) Métodos de barreira de contracepção: preservativo ou capa oclusiva (diafragma ou abóbadas / capas cervicais) com espuma / gel / filme / creme / supositório espermicida. d) Esterilização do parceiro masculino (com a documentação pós-vasectomia apropriada da ausência de es- permatozoides na ejaculação).

[0522] 5. Indivíduos masculinos; eles devem estar usando dois mé- todos eficazes de contracepção durante todo o período do estudo e não doar esperma dentro de 90 dias após a última administração do medi- camento do estudo.

[0523] 6. Presença de pelo menos uma úlcera de pé diabético aten- dendo aos seguintes critérios:

[0524] a) Diagnosticada como uma DFU neuropática de espessura total, localizada em ou distal ao maléolo (excluindo úlceras entre os de- dos, mas incluindo as do calcanhar).

[0525] b) SD: Presente por 6 semanas a 12 meses, e de 3 a 5 cm 2 na área após desbridamento acentuado, confirmado na triagem.

[0526] MD: presente por 6 semanas a 12 meses, e de 3 a 5 cm2 na área após desbridamento acentuado, confirmado após o período de pré- tratamento de 2 semanas.

[0527] c) Uma margem mínima de 2 cm entre a úlcera de estudo de qualificação e quaisquer outras úlceras no pé especificado.

[0528] d) Profundidade ≥ 5 mm e graduada em 1A de acordo com “The University of Texas Staging System for Diabetic Foot Ulcers” (22), sem cápsula, tendão ou osso exposto e sem tunelamento, descola- mento ou tratos sinusais, após o desbridamento acentuado inicial.

[0529] 7. O indivíduo deve ser capaz de segurar a úlcera alvo em uma posição e orientação que a medicação de estudo possa ser apli- cada sem perda significativa de substância através do escoamento, até que o curativo seja aplicado.

[0530] 8. Perfusão vascular adequada do membro afetado demons- trada dentro de 30 dias antes da triagem, conforme definido por pelo menos um dos seguintes:

[0531] a) Índice tornozelo-braquial (ITB) ≥ 0,9 e ≤ 1,2, confirmado por pressão parcial de oxigênio transcutânea (TcPO2) > 50 mmHg

[0532] b) Pressão do dedo do pé (pletismografia) > 50 mmHg

[0533] c) Ultrassom Doppler (formas de onda bifásicas ou trifásicas) pelo menos em dois vasos no tornozelo consistentes com fluxo sanguí- neo adequado para a extremidade afetada, conforme determinado por SoC.

[0534] Principais critérios de exclusão:

[0535] Parte 1 SD e Parte 2 MD:

[0536] Os indivíduos não devem atender a nenhum dos seguintes critérios para serem elegíveis para inscrição no estudo:

[0537] 1. Somente para mulheres: mulheres grávidas ou amamen- tando, confirmado por um teste de gravidez positivo na triagem e um teste de urina realizado no Dia-1.

[0538] 2. Indivíduo com:

[0539] a) Úlcera(s) acompanhada de celulite infeccionada, osteomi- elite ou sinais ou sintomas clínicos de infecção de acordo com as Dire- trizes da Sociedade de Doenças Infecciosas da América (IDSA) (19).

[0540] b) Gangrena ou necrose em qualquer parte do membro afe- tado.

[0541] c) Pé de Charcot ativo ou crônico no membro do estudo.

[0542] d) Cirurgia vascular planejada, angioplastia ou trombólise ou procedimento de revascularização realizado dentro de 1 mês antes da inscrição.

[0543] e) Úlceras envolvendo a exposição de tendão, osso ou cáp- sula articular (é aceitável ter úlceras se estendendo pela derme e no tecido subcutâneo com presença de tecido de granulação).

[0544] f) Úlcera(s) de etiologia não diabética.

[0545] g) Amputações importantes anteriores no mesmo pé alvo.

[0546] h) Terapia com antibióticos atual ou recente (3 semanas) por qualquer motivo.

[0547] i) Indivíduos acamados ou com expectativa de vida inferior a um ano.

[0548] 3. Uso de qualquer outra terapia com fator de crescimento nos 6 meses anteriores à triagem.

[0549] 4. Histórico de malignidade nos 5 anos anteriores à triagem ou aqueles com um forte histórico familiar de câncer (por exemplo, dis- túrbios de câncer familiar), com exceção de carcinoma de células esca- mosas ou basocelular da pele que foi definitivamente tratado.

[0550] 5. Doença cardiovascular, pulmonar, renal, endócrina, hepá- tica, neurológica, psiquiátrica, imunológica, gastrointestinal, hematoló- gica ou metabólica clinicamente significativa que é, na opinião do inves- tigador, não estabilizada ou pode afetar a segurança do indivíduo ou os resultados do estudo (nos casos de dúvida, o médico de pesquisa clí- nica do patrocinador deve ser consultado).

[0551] 6. Indivíduo em hemodiálise ou diálise peritoneal ou com in- suficiência renal crônica (creatinina plasmática > 2 mg / dl).

[0552] 7. Indivíduo com parâmetros laboratoriais chave significati- vamente anormais, interferindo na segurança do paciente de acordo com o julgamento de PI.

[0553] Escopo do Ensaio / Partes do Ensaio:

[0554] O teste tem duas partes:

[0555] - Parte 1 SD - dose única ascendente

[0556] - Parte 2 MD - dose múltipla ascendente

[0557] Dosagens:

[0558] SD: 0,3, 1, 3 e 6 μg / mm2

[0559] MD: 1 e 3 μg / mm2

[0560] Desfechos:

[0561] Desfecho primário:

[0562] Parte 1 SD:

[0563] Segurança:

[0564] • Eventos adversos (AEs) e reações adversas a fármacos (ADRs)

[0565] • Sinais vitais: pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD)

[0566] • Parâmetros de ECG de 12 derivações extraídos de Holter (HR, PR, QRS, QTcF, QT)

[0567] • Avaliações clínicas laboratoriais (química, hematologia e urinálise).

[0568] Parte 2 MD:

[0569] Segurança:

[0570] • AEs e ADRs;

[0571] • Sinais vitais: PAS, PAD; temperatura;

[0572] • ECG de 12 derivações triplicado;

[0573] (Se quaisquer achados de ECG / cardiovascular emergirem da Parte 1 do estudo, o SAC também pode implementar o monitora- mento Holter para parte ou toda a Parte 2, conforme indicado);

[0574] • Parâmetros de ECG de 12 derivações extraídos de Holter (HR, PR, QRS, QTcF, QT);

[0575] • Achados anormais de Holter ECG de 24 h (pausas totais > 2,5 segundos, fibrilação atrial e flutter atrial, corridas ventriculares, carga de contrações atriais prematuras (PAC), carga de contrações ventricu- lares prematuras (PVC), morfologias aberrantes); frequência cardíaca de 0-24h (do Holter ECG de 24 h) e HR média horária;

[0576] • Avaliações clínicas laboratoriais (química, hematologia e urinálise).

[0577] Ponto(s) no tempo de avaliação deste desfecho: indicado acima.

[0578] Desfecho secundário:

[0579] Parte 1 SD:

[0580] Variáveis farmacocinéticas:

[0581] Os seguintes parâmetros PK serão derivados das concentra- ções séricas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4:

[0582] • AUC 0-12h, AUC00-24h, AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax, t½, CL / F, Vd / F;

[0583] • AUC 0-12h DN, AUC00-24h DN, AUC0-t DN, AUC0-∞ DN, Cmax DN.

[0584] Variáveis de imunogenicidade: ADA Ct

[0585] Parte 2 MD:

[0586] Variáveis farmacocinéticas:

[0587] Os seguintes parâmetros PK serão derivados das concentra- ções séricas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4:

[0588] • No Dia 1: AUC 0-12h, Cmax e tmax;

[0589] • Do Dia 2 ao Dia 13: Ctrough

[0590] • No último dia de administração do fármaco (Dia 14): AUC 0-12h, AUC0-t, AUC0-∞, Ctrough, Cmax, Cmin, tmax, tmin, Cav e Rac, t½, CL / F e Vd / F.

[0591] Variáveis de imunogenicidade:

[0592] • As concentrações séricas de anticorpos antifármacos (ADA) serão avaliadas no dia 1 antes da aplicação da primeira dose, no dia 15 antes da alta, no dia 24 (semana 4), dia 52 (semana 8) e no dia 80 (semana 12).

[0593] • Ct

[0594] Variáveis farmacodinâmicas / eficácia:

[0595] • Redução média da área alvo da úlcera e do volume a partir da linha de base até D14, D21, D28, D56 e D84;

[0596] • Tempo para cicatrização da área e volume da úlcera alvo. A cicatrização será definida como “recuperação completa”. Diferentes “definições de cicatrização também serão aplicadas (redução parcial: 50%, 66%, 75%).

[0597] Ponto(s) no tempo de avaliação deste desfecho: indicado acima.

[0598] A dose única ascendente (SAD) é realizada nas seguintes dosagens: Coorte A: 0,3 g / mm2; Coorte B: 1 g / mm2; Coorte CA: 3 g / mm2; Coorte D: 6 g / mm2. Cada coorte é composta por SEQ ID NO: 4 indivíduos nativos, a fim de evitar a possibilidade de efeitos de transferência entre coortes. Isso é particularmente importante no que diz respeito à hiperalgesia (conhecida por NGF humano tipo selvagem). Se necessário, os níveis de dose são ajustados e períodos de elimina- ção podem ser incluídos, se necessário, para atender aos objetivos do estudo.

[0599] Na dose única ascendente (SAD), o Padrão de Cuidado (SOC) foi administrado na triagem e em cada visita consecutiva até o final do Período de Acompanhamento, a menos que tenha ocorrido re- epitelização / cicatrização completa, persistente por 2 visitas consecuti- vas. Neste caso, o SoC poderia ser descontinuado e o pé do indivíduo gerenciado de acordo com a avaliação / decisão do Investigador. O SoC consistia nos seguintes procedimentos:

[0600] • o desbridamento da úlcera alvo (qualquer possível sangra- mento causado pelo desbridamento foi controlado apenas pela com- pressão e elevação da perna),

[0601] • o curativo da lesão com gaze de parafina e coberto com um curativo protetor feito de gaze estéril,

[0602] • o uso de um andador removível de alívio de pressão (não removível durante o período de acompanhamento) após o enfaixa- mento.

[0603] Em caso de infecção da lesão durante o estudo, a lesão de- veria ser coletada para cultura microbiológica e o indivíduo a ser pres- crito com terapia com antibióticos empírica sistêmica de acordo com a decisão do investigador, que deveria ajustar a terapia de acordo com o resultado da cultura. Cada infecção teve que ser avaliada quanto à sua gravidade, particularmente quando severa em intensidade.

[0604] A dose múltipla ascendente (MAD) é realizada em duas co- ortes, cada uma com indivíduos nativos, em sequência. Os níveis de dose diária alvo são 1 g / mm2 e 3 g / mm2 com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (20) ou placebo (10). Após a triagem, os indivíduos elegíveis são tratados de acordo com o padrão de atendimento (SOC; período de pré-tratamento); inscrição confirmada após medição do tamanho da úl- cera. Se durante este período de pré-tratamento, a área da úlcera for reduzida em 50% ou mais, os indivíduos não serão inscritos.

[0605] Escopo do Ensaio:

[0606] Determinação em humanos de segurança, farmacocinética, farmacodinâmica e outros (tolerabilidade) do IMP.

[0607] Resultados

[0608] Dose Única Ascendente (SOC)

[0609] A dose única ascendente (SAD) foi realizada em quatro co- ortes consecutivas nas seguintes dosagens: Coorte A: 0,3 g / mm2; Coorte B: 1 g / mm2; Coorte CA: 3 g / mm2; Coorte D: 6 g / mm2, além do padrão de atendimento. Em todas essas coortes, os níveis quantificáveis do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 foram detectáveis na circulação sanguínea sistêmica dos respectivos indivíduos humanos. Assim, o polipeptídeo administrado está presente no corpo dos indiví- duos após a administração.

[0610] Os indivíduos foram monitorados quanto a eventos adversos por 28 dias após a administração da dose única. Nenhum evento ad-

verso foi ligado à administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. As- sim, a administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 não foi associada a nenhuma reação adversa ao fármaco observável. Como um resultado da ausência de reações adversas ao fármaco, conclui-se que o polipep- tídeo de SEQ ID NO: 4 é seguro e bem tolerado por indivíduos humanos.

[0611] Panorama

[0612] A atividade biológica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 de- corre de sua capacidade de promover o crescimento, bem como a ma- nutenção, proliferação e sobrevivência de células, particularmente célu- las nervosas.

[0613] Como um resultado deste exemplo, a segurança, a tolerabi- lidade, os perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 após doses crescentes únicas e repetidas em huma- nos são investigados e confirmados.

[0614] Breve descrição das Figuras

[0615] Figura 1: Esboço do processo de acordo com o Exemplo 2, incluindo as melhoras descritas no Exemplo 2B.

[0616] Figura 2: Teste de alongamento de PC12 neurite in vitro.

[0617] Representação do comprimento médio de neurite (A; com- primento médio no poço), comprimento total de neurite (B; comprimento total médio por célula) e porcentagem de células que mostram uma neu- rite mais longa do que o comprimento do corpo celular (C).

[0618] As barras representam a média ± SEM. Análise estatística: ANOVA de uma via seguida por post hoc de Tukey versus o grupo tra- tado com veículo (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001)

[0619] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0620] Figura 3. Estudo de eficácia, coorte de 8 dias

[0621] Níveis de glicose no sangue em camundongos db / db medi- dos no momento da biópsia de pele. Não foram observadas diferenças entre os animais atribuídos aos diferentes grupos de tratamento.

[0622] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0623] Figura 4. Estudo de eficácia, coorte de 8 dias.

[0624] Ganho de peso corporal ao longo do tempo experimental (dia 0 e dia 7 após a lesão na pele).

[0625] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0626] Figura 5: Estudo de eficácia, coorte de 8 dias.

[0627] Limite térmico. Latência para retirada da pata no teste plantar realizado em -3 e 7 dias após a biópsia de pele e administração de NGF. Os dados são representados como média + SEM. Análise estatística realizada pelo teste t de Student, * p < 0,05.

[0628] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0629] Figura 6. O estudo de eficácia, coorte de 8 dias.

[0630] “Tempo para fechamento” medido como área externa e in- terna da úlcera (ver relatório do estudo piloto para detalhes) até o dia 8 da biópsia de pele. Os resultados são expressos como % do valor da área lesada no dia 0; os dados são representados como média + SEM. Consultar o texto para a análise estatística ANOVA de duas vias.

[0631] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0632] Figura 7. B. O estudo de eficácia, 8 dias.

[0633] Tempo para fechamento da úlcera (área externa) no dia 8, expresso como a porcentagem de fechamento da úlcera em compara- ção com o dia 0. Os dados são representados como média + SEM.

[0634] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0635] Figura 8: B. O estudo de eficácia, coorte de 8 dias

[0636] Níveis plasmáticos de NGF no sacrifício. Os dados são mé- dia + SEM; Análise estatística: ANOVA unilateral seguida pelo teste post-hoc de Dunnett. * p < 0,05, ** p < 0,01.

[0637] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0638] Figura 9. O estudo de eficácia, coorte de 30 dias

[0639] A concentração de glicose no sangue foi medida na biópsia de pele (d-1), após o final do tratamento com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (d-8) e no sacrifício (d28). Ver o texto para detalhes.

[0640] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0641] Figura 10. Estudo de eficácia, coorte de 30 dias

[0642] Ganho de peso corporal ao longo do tempo experimental. Não foram observadas diferenças entre os grupos experimentais.

[0643] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0644] Figura 11: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias

[0645] Resultados do teste plantar em 0 e 7 dias após a biópsia de pele e administração do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (N = 8 em cada grupo). Os dados obtidos na coorte de 30 dias são apresentados como média + SEM; análise estatística realizada pelo teste t de Student.

[0646] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0647] Figura 12: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias

[0648] Hiperalgesia térmica medida no dia 0 e no dia 7 após a bióp- sia por punção. Neste gráfico, os dados obtidos nos experimentos de 8 e 30 dias são agrupados (N = 16 em cada grupo); os dados são média + SEM. Análise estatística Teste t de Student, * p < 0,05.

[0649] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0650] Figura 13: Estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0651] A tabela lista o dia de fechamento ao longo do tempo de ob- servação, conforme derivado da observação clínica. “Não” significa que nenhum fechamento foi observado.

[0652] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0653] Figura 14: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0654] Curso de tempo do processo de cicatrização medido como área externa da úlcera até o dia 29 da biópsia da pele. Os resultados são expressos como % do valor da área da lesão no dia 0; os dados são média + SEM. Ver o texto para a análise estatística.

[0655] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0656] Figura 15: O estudo de eficácia, coortes de 8 + 30 dias.

[0657] Tempo para fechamento da úlcera (área externa) no dia 8. Os dados representados no gráfico foram obtidos combinando os valo- res de experimentos de 8 e 30 dias; N = 16. Os dados são representados como média + SEM. Análise estatística: ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett post-hoc: F (5, 77) = 3,007, P = 0,0156.

[0658] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0659] Figura 16: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0660] Níveis plasmáticos de NGF medidos no dia 30. Os dados são representados como média + SEM; Análise estatística: ANOVA unilate- ral e teste post-hoc de Dunnett.

[0661] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0662] Figura 17: Estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0663] A. Micrografias que ilustram a histologia da ferida (coloração H&E) em 7 dias, conforme amostrado de acordo com o esquema pre- sente em B.

[0664] D-F. Microfotografias da borda da ferida ilustrando o MET (língua migrando da epiderme, D, E) e a angiogênese (F).

[0665] Figura 18: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0666] Micrografias representativas do processo de re-epitelização tiradas de camundongos tratados com veículo, SEQ ID NO: 4 (1, 10 e 30 µg / dia). Para fins comparativos, também é relatada uma microfoto- grafia da pele intacta. A espessura da camada epidérmica nos diferen- tes grupos é relatada no gráfico. Os dados são apresentados como mé- dia + SEM; Análise estatística: ANOVA de uma via seguida de teste post-hoc de Tukey, ** p < 0,01; **** p < 0,0001.

[0667] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0668] Figura 19: O estudo de eficácia, coorte de 30 dias.

[0669] Anatomia da inervação da pele do camundongo, conforme visualizado por imunocoloração PGP-9.5.

[0670] Figura 20: O estudo de eficácia, coortes de 8 + 30 dias.

[0671] PGP9.5-IR na pele de animais intactos (A), camundongos tratados com veículo (B) e camundongos tratados com SEQ ID NO: 4 (30 µg / dia) - (C), 30 dias após a indução da lesão. D, E: ROI (região de interesse, D) e configuração de limite (E) para o procedimento de análise de imagem computadorizada usado para avaliar a inervação da pele em 30 dias.

[0672] Figura 21: O estudo de eficácia, coortes de 8 + 30 dias.

[0673] Análise morfométrica de PGP9.5-IR na pele 8 dias (A) e 30 (B) dias após a indução da ferida. Os dados são expressos como média + SEM; Análise estatística: ANOVA unilateral seguida pelo teste post- hoc de Dunnett; * p < 0,05; ** p < 0,01.

[0674] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0675] Figura 22: O estudo de eficácia, coortes de 8 + 30 dias.

[0676] Análise histológica (coloração H&E) e imuno-histoquímica da pele reparada no grupo tratado com SEQ ID NO: 4 (30 µg / dia). A-B: camadas de pele reparadas em uma membrana basal, conforme indi- cado pela coloração com laminina (B, setas); a reinervação vem do plexo subepidérmico e se projeta pela membrana basal (C). O MET (D) é altamente inervado em 8 dias (E) e 30 dias (F) após a lesão; a angio- gênese é observada em MET, conforme visualizado por coloração H&E (G), laminina-IR em ampliação baixa (H) e alta (I).

[0677] Abreviaturas: ep, camada epidérmica; MET, língua migrando da epiderme

[0678] Figura 23: O estudo de eficácia, coortes de 8 + 30 dias.

[0679] Análise morfométrica de Laminina-IR na pele 8 dias (A) e 30 dias (B) após a indução da ferida. A barra horizontal cinza no gráfico B representa a laminina-IR na pele intacta. Os dados são expressos como média + SEM; Análise estatística: ANOVA unilateral seguida pelo teste post-hoc de Dunnett; * p < 0,05; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

[0680] Figura 24: Sequências polipeptídicas. Asterisco (*) = posição 61 em NGF humano maduro; cruzado (+): posição 100 em NGF humano maduro.

[0681] A: SEQ ID NO: 1: Sequência de NGF pré-pró humano como codificado pelo respectivo quadro de leitura aberto humano.

[0682] Pré-peptídeo: posições de aminoácidos 1-18; pró-peptídeo: posições de aminoácidos 19-121; NGF maduro: posições de aminoáci- dos 122-239; dipeptídeo C-terminal: posições de aminoácidos 240-241.

[0683] Ligações dissulfeto (na parte madura corretamente do- brada): ligando as posições de aminoácidos 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231.

[0684] Sítio de clivagem pela furina (RSKR): posições de aminoáci- dos 118-121.

[0685] B: Visão geral esquemática do pré-peptídeo, pró-peptídeo e NGF maduro.

[0686] C: SEQ ID NO: 2: Sequência de NGF humano maduro.

[0687] D: SEQ ID NO: 3

[0688] E: SEQ ID NO: 4

[0689] Figura 25: A taxa de cicatrização de feridas após o trata- mento com veículo ou polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 (1-10-100 µg / cm2 / dia) em camundongos diabéticos é representada como “Proporção de camundongos não cicatrizados” ao longo de todo o curso do estudo. Análise estatística: estimativa da curva de sobrevivência de Kaplan- Meier.

[0690] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0691] Figura 26: Análise morfométrica de PGP9.5-IR (A) e PE- CAM1-IR (A) na pele reparada 28 dias após a indução da ferida. Os dados são expressos como média ± SEM (n = 15-18). Análise estatís- tica: ANOVA unilateral seguida pelo teste post-hoc de Dunnett; * p <

0,05; ** p < 0,01.

[0692] CHF6467 = polipeptídeo de SEQ ID NO: 4

[0693] Figura 27: O efeito do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 no limite mecânico da dor na área ao redor da borda da úlcera foi avaliado após 14 dias de tratamento tópico crônico com o aparelho eletrônico von Frey da Bioseb. Os dados são expressos como média ± SEM (n = 15-18). Análise estatística: ANOVA de uma via.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo selecionado dentre o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento e / ou prevenção de um distúrbio dermatoló- gico em um indivíduo mamífero.

2. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um ser humano.

3. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptí- deo é o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

4. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o distúrbio dermatológico se caracteriza por uma superfície ferida em pelo menos uma parte do corpo do indivíduo.

5. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 4ca- racterizado pelo fato de que o distúrbio dermatológico se caracteriza por superfície ferida que é uma lesão de pele, de preferência se caracteriza por ablação pelo menos parcial da derme e, opcionalmente, da derme.

6. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o distúrbio dermatológico compreende pelo menos uma úlcera, de preferência se- lecionada a partir do grupo que consiste em úlceras diabéticas, úlceras de trauma, úlceras cirúrgicas, úlceras por pressão, úlceras crônicas e combinações de quaisquer dessas úlceras, ou em que o distúrbio der- matológico compreende uma queimadura ou lesão mecânica.

7. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o mamífero, de preferência o ser humano, sofre de diabetes mellitus ou tem uma predisposição para sofrer de diabetes mellitus.

8. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 7,

caracterizado pelo fato de que o diabetes mellitus é selecionado dentre diabetes mellitus Tipo 1 e diabetes mellitus Tipo 2.

9. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptí- deo é administrado em uma única administração.

10. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é administrado repetidamente.

11. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é administrado repetida- mente uma a cinco vezes ao dia, de preferência cerca de duas vezes ao dia.

12. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é administrado re- petidamente, por um período de três a 30 dias, de preferência de sete a 14 dias, ou alternativamente até o fechamento da superfície corporal ferida.

13. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptí- deo é administrado a indivíduos com úlceras do pé diabético (DFU), de preferência a indivíduos com úlceras neuropáticas do pé diabético (DFU).

14. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para ad- ministração tópica.

15. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é administrado na super- fície corporal ferida.

16. Polipeptídeo para uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dose / cada dose tem uma quantidade de 0,3 a 6 μg do polipeptídeo por mm2 de superfície corporal ferida sendo tratada (0,3 a 6 μg / mm2).

17. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o tratamento e / ou prevenção não causa hiperalgesia no indivíduo mamífero.

18. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptí- deo está compreendido em um meio aquoso, e o meio aquoso é admi- nistrado ao indivíduo mamífero.

19. Polipeptídeo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptí- deo pode ser obtido por expressão recombinante e purificação, em que a purificação compreende purificação em uma fase estacionária de modo misto.