RU2812055C1 - Агент для использования при лечении или профилактике офтальмологических расстройств - Google Patents
Агент для использования при лечении или профилактике офтальмологических расстройств Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812055C1 RU2812055C1 RU2022110142A RU2022110142A RU2812055C1 RU 2812055 C1 RU2812055 C1 RU 2812055C1 RU 2022110142 A RU2022110142 A RU 2022110142A RU 2022110142 A RU2022110142 A RU 2022110142A RU 2812055 C1 RU2812055 C1 RU 2812055C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- ngf
- present
- administration
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 596
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 564
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 562
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 187
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 100
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 claims abstract description 88
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 60
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 155
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 55
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 48
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 42
- 208000022982 optic pathway glioma Diseases 0.000 claims description 16
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 15
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 13
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 12
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 11
- 208000001749 optic atrophy Diseases 0.000 claims description 11
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 claims description 10
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 10
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000009702 Optic Disk Drusen Diseases 0.000 claims description 5
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010069732 neurotrophic keratopathy Diseases 0.000 claims description 5
- 208000036584 Optic disc drusen Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 49
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000006735 deficit Effects 0.000 abstract description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 155
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 153
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 151
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 128
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 110
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 description 86
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 78
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 68
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 60
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 59
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 59
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 57
- 101001111439 Homo sapiens Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 47
- 102000046917 human NGF Human genes 0.000 description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 34
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 32
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 30
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 21
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 21
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 20
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 20
- YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N capsaicin Chemical compound COC1=CC(CNC(=O)CCCC\C=C\C(C)C)=CC=C1O YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 20
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 19
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 18
- 101100404651 Mus musculus Ngf gene Proteins 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 208000030768 Optic nerve injury Diseases 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 10
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 229960002504 capsaicin Drugs 0.000 description 10
- 235000017663 capsaicin Nutrition 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 10
- 208000020911 optic nerve disease Diseases 0.000 description 10
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 101710129634 Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 7
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 7
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 208000003906 hydrocephalus Diseases 0.000 description 7
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 7
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 6
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 6
- -1 coatings Substances 0.000 description 6
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 102220075962 rs762634382 Human genes 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000001992 Autosomal Dominant Optic Atrophy Diseases 0.000 description 5
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000032087 Hereditary Leber Optic Atrophy Diseases 0.000 description 5
- 208000010038 Ischemic Optic Neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 201000000639 Leber hereditary optic neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 5
- 206010030924 Optic ischaemic neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 206010061323 Optic neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 201000007058 anterior ischemic optic neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 4
- KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N Ala-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N 0.000 description 4
- IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N Cys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCHONUZTYDQMBY-PYJNHQTQSA-N His-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WCHONUZTYDQMBY-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 4
- ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N His-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- MJAYDXWQQUOURZ-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MJAYDXWQQUOURZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 4
- JXGUUJMPCRXMSO-HJOGWXRNSA-N Tyr-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JXGUUJMPCRXMSO-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MJFSRZZJQWZHFQ-SRVKXCTJSA-N Val-Met-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MJFSRZZJQWZHFQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- KJFBXCFOPAKPTM-BZSNNMDCSA-N Val-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KJFBXCFOPAKPTM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- 201000010802 Wolfram syndrome Diseases 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 108091004359 cenegermin Proteins 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000000917 hyperalgesic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 4
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 230000003363 transsynaptic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N Arg-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- CTBMEDOQJFGNMI-IHPCNDPISA-N Lys-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CTBMEDOQJFGNMI-IHPCNDPISA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010029174 Nerve compression Diseases 0.000 description 3
- SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N Phe-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 206010057430 Retinal injury Diseases 0.000 description 3
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 3
- SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N Thr-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 3
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 3
- LIQJSDDOULTANC-QSFUFRPTSA-N Val-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LIQJSDDOULTANC-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 3
- XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N Val-Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- RWOGENDAOGMHLX-DCAQKATOSA-N Val-Lys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C(C)C)N RWOGENDAOGMHLX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 206010047555 Visual field defect Diseases 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000003977 optic chiasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 230000004400 visual pathway Effects 0.000 description 3
- 210000000239 visual pathway Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NIELFHOLFTUZME-HJWJTTGWSA-N Arg-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NIELFHOLFTUZME-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 2
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010015958 Eye pain Diseases 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- JZJGEKDPWVJOLD-QEWYBTABSA-N Glu-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JZJGEKDPWVJOLD-QEWYBTABSA-N 0.000 description 2
- 101000712899 Homo sapiens RNA-binding protein with multiple splicing Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091008604 NGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150008375 Pou4f1 gene Proteins 0.000 description 2
- TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N Pro-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 102100033135 RNA-binding protein with multiple splicing Human genes 0.000 description 2
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 2
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229950004206 cenegermin Drugs 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 210000002592 gangliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 150000004688 heptahydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000006776 neuronal homeostasis Effects 0.000 description 2
- 230000007511 neuronal proliferation Effects 0.000 description 2
- 201000008106 ocular cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- ZVKDKTDLBDCNNS-WCCKRBBISA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ZVKDKTDLBDCNNS-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N Ala-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- MIPWEZAIMPYQST-FXQIFTODSA-N Ala-Cys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIPWEZAIMPYQST-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 201000009487 Amblyopia Diseases 0.000 description 1
- ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N Amiodarone hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCC[NH+](CC)CC)C(I)=C1 ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N Arg-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N Arg-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- PTSDPWIHOYMRGR-UGYAYLCHSA-N Asn-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PTSDPWIHOYMRGR-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N Asn-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YFSLJHLQOALGSY-ZPFDUUQYSA-N Asp-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YFSLJHLQOALGSY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N Asp-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006992 Color Vision Defects Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- KZZYVYWSXMFYEC-DCAQKATOSA-N Cys-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KZZYVYWSXMFYEC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000005696 Diammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000208011 Digitalis Species 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000001692 Esotropia Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N Gln-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XEYMBRRKIFYQMF-GUBZILKMSA-N Gln-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XEYMBRRKIFYQMF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FGSGPLRPQCZBSQ-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FGSGPLRPQCZBSQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- NPSWCZIRBAYNSB-JHEQGTHGSA-N Gly-Gln-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NPSWCZIRBAYNSB-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N Gly-Glu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N Gly-His-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- FHQRLHFYVZAQHU-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FHQRLHFYVZAQHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N His-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FONIDUOGWNWEAX-XIRDDKMYSA-N His-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FONIDUOGWNWEAX-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- YERBCFWVWITTEJ-NAZCDGGXSA-N His-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)O YERBCFWVWITTEJ-NAZCDGGXSA-N 0.000 description 1
- 101001051709 Homo sapiens Ribosomal protein S6 kinase-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 1
- GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N Ile-Asp-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- FDGAMQVRGORBDV-GUBZILKMSA-N Met-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC FDGAMQVRGORBDV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000001140 Night Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N Phe-Asn-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N Pro-Arg-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JFNPBBOGGNMSRX-CIUDSAMLSA-N Pro-Gln-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JFNPBBOGGNMSRX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AQSMZTIEJMZQEC-DCAQKATOSA-N Pro-His-Ser Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O AQSMZTIEJMZQEC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 1
- 208000016624 Retinal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038926 Retinopathy hypertensive Diseases 0.000 description 1
- 102100024914 Ribosomal protein S6 kinase-related protein Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N Ser-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PZHJLTWGMYERRJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PZHJLTWGMYERRJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N Thr-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- DIPIPFHFLPTCLK-LOKLDPHHSA-N Thr-Gln-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O DIPIPFHFLPTCLK-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- HPQHHRLWSAMMKG-KATARQTJSA-N Thr-Lys-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O HPQHHRLWSAMMKG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N Thr-Met-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Cys-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047513 Vision blurred Diseases 0.000 description 1
- 208000034699 Vitreous floaters Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 230000001618 algogenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.Cl[Al](Cl)Cl JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940009861 aluminum chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000003464 asthenopia Diseases 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 230000007844 axonal damage Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 description 1
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037012 chymotrypsin-like activity Effects 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical class OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L cobalt chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Co+2] GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical compound [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000335 cobalt(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000007254 color blindness Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007717 corneal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000004452 decreased vision Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 201000004356 excessive tearing Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010008237 glutamyl-valyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940076153 heptahydrate zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 108091008147 housekeeping proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001948 hypertensive retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K iron trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].Cl[Fe+]Cl NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229940053050 neomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000004297 night vision Effects 0.000 description 1
- 210000000929 nociceptor Anatomy 0.000 description 1
- 108091008700 nociceptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 206010029864 nystagmus Diseases 0.000 description 1
- 210000005112 optic tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000004421 optic tracts Effects 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000005043 peripheral vision Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000001127 pigmented epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 201000010041 presbyopia Diseases 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002400 pro-nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000020129 regulation of cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007832 reinnervation Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 description 1
- 210000001116 retinal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000020341 sensory perception of pain Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- JNMRHUJNCSQMMB-UHFFFAOYSA-N sulfathiazole Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)NC1=NC=CS1 JNMRHUJNCSQMMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001544 sulfathiazole Drugs 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013520 translational research Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000016776 visual perception Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой применение полипептида SEQ ID NO: 4 в лечении и/или профилактике офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, где офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство характеризуется нарушением ганглиозных клеток сетчатки. Изобретение касается также композиции для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, содержащей полипептид SEQ ID NO: 4, при этом офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство характеризуется нарушением ганглиозных клеток сетчатки. Изобретение позволяет эффективно использовать композиции для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, при этом офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство характеризуется нарушением ганглиозных клеток сетчатки. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение предоставляет агент, подходящий для применения при лечении и профилактике офтальмологических расстройств, включая, без ограничения таковыми, нарушения, связанные с повреждением и/или расстройством зрительного нерва и сетчатки.
Предпосылки создания изобретения
Зрительный нерв состоит из пучка, состоящего из более чем 1 миллиона нервных волокон, передающих зрительные сообщения. Зрительный нерв соединяет сетчатку с мозгом. Эта связь включает на клеточном уровне ганглиозные клетки сетчатки (RCG). Ганглиозная клетка сетчатки (RGC) представляет собой тип нейрона, расположенного вблизи внутренней поверхности сетчатки глаза (слой ганглиозных клеток). RGC различаются по размеру, связям и реакции на визуальную стимуляцию, но все они имеют общий длинный аксон, идущий по направлению к мозгу. Эти аксоны образуют зрительный нерв.
Повреждение зрительного нерва может привести к потере зрения. Тип потери зрения и степень повреждения зависит от того, где произошло повреждение. Это может повлиять на один или оба глаза.
Существует множество различных типов расстройств зрительного нерва, в том числе:
- Глаукома представляет собой группу заболеваний, являющиеся основными причинами слепоты, в частности, в Соединенных Штатах. Глаукома обычно возникает, когда давление жидкости внутри глаз медленно повышается и повреждает зрительный нерв.
- Неврит зрительного нерва представляет собой воспаление зрительного нерва. Причины включают инфекции и расстройства, связанные с иммунитетом, такие как рассеянный склероз. Иногда причина неизвестна.
- Атрофия зрительного нерва представляет собой поражение зрительного нерва. Причины включают плохой приток крови к глазу, заболевание, травму или воздействие, вызванное токсическими веществами или приемом лекарств [такими как этамбутол, изониазид, наперстянка, антибиотики (хлорамфеникол, сульфаниламиды) и амиодарон].
- Друзы диска зрительного нерва представляют собой скопления белка и солей кальция, которые со временем накапливаются в зрительном нерве.
Все описанные выше нарушения могут привести к повреждению аксона RGCs в зрительном нерве, что в конечном итоге может привести к гибели этих клеток. Для большинства расстройств зрительного нерва лечения не существует, или лечение способно только предотвращать дальнейшую потерю зрения. Следовательно, повышение жизнеспособности или функции RGC остается основной целью фундаментальных и трансляционных исследований.
До сих пор на рынок не было представлено лекарство, действительно эффективное для противодействия потере RCG при офтальмологических расстройствах. Таким образом, офтальмологические расстройства, особенно те, которые связаны с потерей или повреждением RCG, до сих пор трудно поддаются лечению. Таким образом, потребность в лечении по-прежнему очень высока.
Описаны некоторые эффекты глазного введения в экспериментальной модели повреждения зрительного нерва, например у Mesentier-Louro et al., 2019, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. 1056-1069.
В крысиных моделях повреждения зрительного нерва массивная дегенерация RGC обычно происходит в течение 2 недель после повреждения зрительного нерва в результате снижения ретротранспорта факторов роста, включая фактор роста нервов (NGF). В соответствии с современным уровнем техники введение рекомбинантного человеческого NGF (rhNGF) в стекловидное тело и введение путем глазных капель может противодействовать раздавливанию зрительного нерва у взрослых крыс только при введении сразу же после повреждения зрительного нерва в соответствии с превентивной экспериментальной парадигмой (Mesentier-Louro et al., 2019, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. 1056-1069.). Однако это не похоже на клиническую картину офтальмологических расстройств человека. Для предполагаемой терапии офтальмологических расстройств человека терапевтическое вмешательство может иметь место только после некоторого периода задержки после индукции первого повреждения зрительного нерва, эти экспериментальные данные в модели раздавливания зрительного нерва у крысы не могут быть переведены в клиническое применение у людей. В частности, в результате ONC могут быть запущены дальнейшие нисходящие процессы в зрительном нерве, включая потенциальное дальнейшее повреждение RCG. Остается неизвестным, будут ли rhNGF или другие молекулы терапевтически эффективными при введении на стадии пост-ONC-повреждения RGC. Таким образом, также остается неясным, будет ли терапия эффективной, если агент вводится в ситуации, включающей или напоминающей офтальмологические расстройства у людей.
Таким образом, по-прежнему существует потребность в эффективном лечении расстройств глаз, в частности тех, при которых происходит поражение зрительного нерва, лечении, не обладающим неблагоприятным воздействием, как, например, невыносимые или иным образом нежелательные побочные эффекты, а также в терапевтическом средстве, пригодном для таких целей и доступном практикующим врачам с воспроизводимой и приемлемой чистотой для введения субъектам-млекопитающим, включая людей.
ПРОБЛЕМА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ
Первичной целью изобретения является обеспечение лечения или профилактики офтальмологических нарушений, при котором не наблюдается нежелательного или болезненного побочного эффекта, такого как алгезия. Кроме того, желательно предоставить терапевтическое средство, удобное в употреблении и которое может быть введено практикующими врачами. Также желательно предоставить терапевтически активный агент с достаточным выходом и чистотой, чтобы такое лечение стало возможным. Таким образом, дальнейшие цели настоящего изобретения включают устранение недостатков, связанных с уровнем техники. Эти и другие дополнительные решения, лежащие в основе настоящего изобретения, станут очевидными из следующего подробного описания в свете преимуществ, достигнутых по сравнению с предшествующим уровнем техники. Конкретные цели включают предоставление надежного способа лечения субъекта с офтальмологическим расстройством, не обладающего нежелательными побочными эффектами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к полипептиду для применения при лечении и/или профилактике офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, где полипептид выбран из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4. Эти полипептиды характеризуется мутацией аминокислотной последовательности NGF человека (SEQ ID NO: 2), где указанная мутация связана со сниженной ноцицептивной активностью. В частности, аргинин в положении 100 hNGF заменен глутаминовой кислотой.
Особенно предпочтительным полипептидом является полипептид с SEQ ID NO: 4. Указанный полипептид характеризуется по меньшей мере отсутствием пролина в положении 61, более предпочтительно заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 SEQ ID NO: 3 заменен серином.
Предпочтительно субъект-млекопитающее представляет собой человека.
Предпочтительно введение полипептида по изобретению не вызывает каких-либо нежелательных эффектов у субъекта-млекопитающего. Особенно предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика по настоящему изобретению не вызывали гипералгезии у субъекта-млекопитающего.
Предпочтительно офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или расстройство зрительного нерва.
Предпочтительно офтальмологическое расстройство характеризуется нарушением ганглиозных клеток сетчатки.
Предпочтительно полипептид вводят после повреждения зрительного нерва.
Предпочтительно офтальмологическое расстройство включает по меньшей мере одно расстройство, выбранное из группы, состоящей из глаукомы, нейротрофического кератита, неврита зрительного нерва, атрофии зрительного нерва, друз диска зрительного нерва и глиомы зрительного пути.
Предпочтительно полипептид предназначен для введения в глаза. Более предпочтительно введение выбирают из группы, состоящей из местного введения в глаз и интравитреального введения, при этом местное введение в глаз является наиболее предпочтительным.
Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через четыре дня после индукции повреждения зрительного нерва.
В одном варианте осуществления полипептид вводят повторно. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид вводят повторно, по меньшей мере, три раза в день.
В одном варианте осуществления полипептид вводят повторно, например, до полного излечения офтальмологического расстройства или, по крайней мере, до улучшения симптомов расстройства. Альтернативно, полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно введение прекращают после завершения указанного периода.
Предпочтительно доза/каждая доза составляет от 0,3 до 30 мкг полипептида на глаз, более предпочтительно от 1 до 10 мкг полипептида на глаз и наиболее предпочтительно 5 мкг полипептида на глаз. Более предпочтительно эти дозировки предназначены специально для местного введения в глаз.
В одном варианте осуществления полипептид содержится в водной среде, и эту водную среду вводят субъекту-млекопитающему. Более предпочтительно полипептид входит в состав композиции, включающей следующее:
a) от 0,2 до 20 мг/мл указанного полипептида,
b) буфер ацетата натрия от 5 до 100 мМ,
c) от 5 до 100 мМ метионина,
d) рН от 5,0 до 6,0.
Наиболее предпочтительно полипептид входит в состав композиции, включающей следующее:
а) 2 мг/мл указанного полипептида,
b) 20 мМ буфера ацетата натрия,
c) 20 мМ метионина,
d) рН 5,5.
В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Получение может включать очистку, то есть отделение таковых от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Необязательно, полипептид с SEQ ID NO: 3 или полипептид с SEQ ID NO: 4 может быть получен в процессе, который включает (ре)фолдинг, и/или хроматографическую очистку, и/или расщепление протеазами, и, необязательно, доведение белка до конечной концентрации и приготовление желаемой рецептуры. В одном варианте осуществления полипептид можно получить рекомбинантной экспрессией и очисткой, при этом очистка включает очистку на стационарной фазе смешанного типа. Предпочтительно полипептид для применения согласно настоящему изобретению по существу не содержит продуктов деградации полипептида, в частности, по существу не содержит варианта полипептида des-nona.
Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 из рекомбинантного источника, очищенный, как описано здесь для применения в способе лечения человека или животного посредством терапии, как описано здесь.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет композицию, содержащую полипептид, выбранный из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4, причем композиция характеризуется рН от 5,0 до 6,0 (предпочтительно рН 5,5). , и включает в себя следующее:
a) от 0,2 до 20 мг/мл указанного полипептида (предпочтительно 2 мг/мл),
b) буфер ацетата натрия от 5 до 100 мМ (предпочтительно 20 мМ),
c) от 5 до 100 мМ метионина (предпочтительно 20 мМ).
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Это описание в целом вместе с формулой изобретения и чертежами раскрывает конкретные и/или предпочтительные варианты осуществления и варианты отдельных признаков изобретения. Настоящее изобретение также рассматривает в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления те варианты осуществления, которые созданы путем объединения двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов осуществления, описанных здесь для настоящего изобретения. Таким образом, настоящее раскрытие также включает все объекты, соединения, признаки, стадии, методы или композиции, упомянутые или указанные в данном описании, по отдельности или вместе, а также любые и все комбинации таковых или любые два или более из указанных объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций. Таким образом, если в настоящем документе специально не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на отдельный объект, соединение, признак, этап, метод или композицию должна охватывать один и множество (т.е. более одного, например, два или более, три или более или все) из этих объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций. Если специально не указано иное или контекст не требует иного, каждый вариант осуществления, аспект и пример, раскрытые в настоящем документе, должны рассматриваться как применимые и сочетаемые с любым другим вариантом осуществления, аспектом или примером, раскрытыми в настоящем документе.
Специалисту в данной области техники понятно, что изобретение, описанное здесь, допускает вариации и модификации, отличные от конкретно описанных. Таким образом, объем настоящего раскрытия не ограничивается описанными здесь конкретными вариантами осуществления, которые представлены здесь в целях иллюстрации и демонстрации. Функционально или иным образом эквивалентные объекты, соединения, признаки, стадии, способы или композиции входят в объем настоящего изобретения. Специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее описание включает все варианты и модификации объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций, буквально описанных здесь.
Каждая из цитируемых здесь ссылок (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, презентации и т. д.), приведенные выше или ниже, настоящим полностью включены посредством ссылки. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как допущение того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать конкретному учению, и/или как допущение того, что конкретная ссылка, отличная от общеизвестных, содержит информацию, достаточно ясную и полную для того, чтобы ее мог использовать специалист в данной области техники.
Как правило, если специально не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области (например, в медицине, офтальмологии, неврологии, генетике, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, биологии клеточнах культур, иммунологии, нейробиологии, хроматографии, химии белков и биохимии). Учебники и обзорные статьи, опубликованные, например, в англоязычной литературе как правило определяют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области.
Выражение «и/или», например «X и/или Y», следует понимать как означающее либо «X и Y», либо «X или Y», а также как обеспечивающее явное раскрытие «и», «или» и обоих значений («и» или «или»).
Используемые здесь, если не указано иное, термины «приблизительно», «около» и «по существу» все означают приблизительно или почти, и в контексте численного значения или диапазона, изложенного в настоящем документе, предпочтительно обозначает +/- 10%, более предпочтительно +/- 5% вокруг численного значения или диапазона, указанного или заявленного.
Если прямо не указано иное, слово «содержать» или варианты, такие как «содержит» или «содержащий», используются в контексте настоящего документа для указания того, что в дополнение к элементам списка, представленногх термином «содержащий», могут присутствовать опциональные дополнительные члены. Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» включает возможность отсутствия дополнительных элементов, т.е. для целей данного варианта осуществления «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».
Если специально не указано иное, все указания относительных количеств в отношении настоящего изобретения сделаны на основе массы/массы. Подразумевается, что обозначения относительных количеств компонента, характеризуемого родовым термином, относятся к общему количеству всех конкретных вариантов или членов, охватываемых указанным родовым термином. Если определено, что определенный компонент, определяемый родовым термином, присутствует в определенном относительном количестве, и если этот компонент далее характеризуется как конкретный вариант или элемент, охватываемый родовым термином, то это означает, что никакие другие варианты или члены, охватываемые родовым термином, дополнительно не присутствуют таким образом, чтобы общее относительное количество компонентов, охватываемых родовым термином, превышало бы указанное относительное количество; более предпочтительно- вообще не присутствуют никакие другие варианты или члены, охватываемые родовым термином.
Все способы и процессы, описанные здесь, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное или если контекст явно не диктует иное.
Используемый здесь термин «агент», если не указано иное, обычно относится к соединению или композиции, предпочтительно к соединению. Агент способен оказывать действие на живой организм и/или на клетку живого организма или полученную из живого организма, т.е. воздействует на клетку и/или ткань тела или действует в окружающей среде. Физическое состояние агента конкретно не ограничено и, если не указано иное, может находиться в газообразном, жидком и/или в твердом состоянии. Тип агента конкретно не ограничен, если не указано иное, и, таким образом, агент может быть химическим веществом и/или биомолекулой, такой как белок или нуклеиновая кислота. Конкретные агенты, определенные здесь, применимы в настоящем изобретении.
Используемый здесь термин «неблагоприятный эффект» представляет собой нежелательный вредный эффект, возникающий в результате введения агента (лекарственного средства) субъекту. Побочные эффекты включают, без ограничения, заболеваемость, смертность, гипералгический синдром, боль, изменение массы тела, уровней ферментов, потерю функции или любые патологические изменения, обнаруживаемые на микроскопическом, макроскопическом или физиологическом уровне. Побочные эффекты могут вызывать обратимые или необратимые изменения, включая увеличение или уменьшение восприимчивости человека к другим химическим веществам, продуктам питания или процедурам, таким как взаимодействие с лекарственными средствами.
Используемые здесь термины «хроматография», «хроматографический» и т.п. обычно относятся к методу, подходящему для разделения смеси, при котором смесь добавляют к нежидкому материалу, называемому «неподвижной фазой», с целью разделить, по крайней мере частично, один или несколько компонентов смеси. Для этой цели неподвижная фаза может быть подвергнута воздействию жидкости и/или смесь может быть растворена в жидкости; указанная жидкость, находящаяся в контакте с неподвижной фазой, также может называться «подвижной фазой». В общем, любой этап, который «выполняется с помощью хроматографии», как описано в настоящем документе, может синонимично называться «хроматографическим этапом».
Используемый здесь термин «подвижная фаза» имеет значение, обычно используемое в данной области техники, и может относиться ко всем жидкостям, вступающим в контакт с неподвижной фазой во время хроматографии, т.е. к промывочным жидкостям, а также к жидкостям (смесям), содержащим белки, представляющие интерес, такие как один или несколько белков, описанных в настоящем документе. В настоящем изобретении смесь, подвергнутая хроматографии, как указано в настоящем документе, обычно содержит один или несколько белков, таких как, в частности, белки, описанные в настоящем документе, такие как полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4, предшественник любого из таковых, протеазу и/или белки клетки-хозяина (HCP).
«Неподвижная фаза» обычно включает базовую матрицу, которая представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно в форме частиц или геля, такой как смола. Во многих случаях, включая варианты осуществления, описанные в настоящем документе, неподвижная фаза содержит базовую матрицу и фрагмент, который может связываться по меньшей мере с одним компонентом, содержащимся в смеси, подлежащей хроматографии. Базовая матрица обычно представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно в форме частиц или геля. Неограничивающими примерами базовых матриц являются сефароза и агароза, например очень жесткая агароза.
«Стадия хроматографии», используемая в данном документе, относится к действию добавления жидкости к хроматографическому материалу (предпочтительно стационарной фазе), содержащей по меньшей мере одно соединение, подлежащее анализу и/или очистке, которое предпочтительно представляет собой белок (и в в контексте настоящего изобретения указанный белок наиболее предпочтительно представляет собой полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4), необязательно к промывке хроматографического материала одним или несколькими промывочными растворами и элюции по меньшей мере одного указанного соединения. В этом контексте процесс, характеризующийся, например, двумя хроматографическими стадиями, характеризуется тем, что жидкость, содержащую по меньшей мере одно такое соединение, подлежащее анализу и/или очистке, добавляют к первому хроматографическому материалу, как описано выше, и, после элюирования с него жидкость, содержащую по меньшей мере одно такое соединение, добавляют ко второму хроматографическому материалу, из которого таковое также элюируют, как описано выше. Целью любой «хроматографической стадии» является то, что по меньшей мере один компонент, входящий в состав смеси, нанесенной на неподвижную фазу, предпочтительно в хроматографии, связывается с неподвижной фазой. Такое соединение может представлять собой один или несколько описанных здесь белков. Соединение может быть извлечено из стационарной фазы, например, заменой подвижной фазы и/или продолжительным воздействием подвижной фазы с течением времени.
Термин «связывает», когда он используется в отношении хроматографии, например, для описания связывающей способности стационарной фазы, конкретно не ограничивается, но обычно относится к нековалентному связыванию. Таким образом, обычно по меньшей мере один компонент, входящий в состав смеси, например, по меньшей мере один белок, нековалентно связывается с неподвижной фазой. Стадия хроматографии необязательно, но предпочтительно включает промывку стационарной фазы, с которой связан по меньшей мере один компонент. По меньшей мере один компонент может представлять собой по меньшей мере один белок, такой как по меньшей мере один белок, описанный в настоящем документе.
Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов.
Термины «дисульфид» и «дисульфидная связь» используются в контексте настоящего изобретения в значении, обычно используемом в данной области техники. В общем, «дисульфид» относится к функциональной группе со структурой R-S-S-R'. Связь также называется «SS-связью» и обычно образуется путем сочетания двух тиоловых групп. Дисульфидные связи в белках образуются между тиоловыми группами остатков цистеина в процессе окислительного фолдинга; такая специфическая дисульфидная связь между тиоловыми группами двух остатков цистеина также может называться «дисульфидным мостиком». Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, в данной области техники обычно понимают, что в эукариотических клетках дисульфидные мостики образуются в просвете эндоплазматического ретикулума (и митохондриальном межмембранном пространстве), но обычно не в цитозоле, и у прокариот дисульфидные мостики образуются в периплазме (соответствующих организмов, в частности грамотрицательных бактерий); дисульфидные мостики также могут быть обнаружены в белках внеклеточной среды как эукариотических, так и прокариотических клеток.
Термины «экспрессировать», «экспрессированный» и «экспрессия», «экспрессия гена» и т.п., используемые в данном документе, относятся к использованию информации гена в синтезе функционального генного продукта. Экспрессия гена включает по меньшей мере транскрипцию и необязательно включает один или несколько дополнительных признаков, необязательно выбранных из открытого списка, включающего трансляцию и посттрансляционную модификацию. В контексте рекомбинантной экспрессии белка в клетке-хозяине этот термин обычно означает, что белок продуцируется клеткой-хозяином (в любом компартменте клетки и/или секретируется и/или включается в тельца включения), если только контекст не диктует иное.
Термины «глазное расстройство» и «офтальмологическое расстройство» используются здесь взаимозаменяемо и включают все расстройства, поражающие глаза. Без ограничения, все расстройства, связанные с повреждением и/или нарушением функции зрительного нерва и/или сетчатки, охватываются значением этих терминов.
Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов или источников. Например, в клетке-хозяине, отличной от человеческой, которая содержит человеческий ген (или ген, кодирующий неприродный полипептид, такой как полипептид по изобретению), указанный ген является "гетерологичным" по отношению к клетке, и клетка может быть способна к «гетерологичной» экспрессии соответствующего гена. Гетерологичная экспрессия гена также может называться «рекомбинантной».
Термин «тельца включения» имеет значение, обычно используемое в данной области техники, и предназначен для обозначения агрегатов или частиц, обнаруживаемых в цитозоле или периплазме клетки-хозяина; тельца включения обычно содержат белок, такой как, в частности, белок, рекомбинантно экспрессируемый в клетке-хозяине. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, понятно, что при рекомбинантной экспрессии тельца включения обычно содержат рекомбинантно экспрессируемый белок и относительно небольшое количество белка клетки-хозяина (HCP), рибосомные компоненты или фрагменты ДНК/РНК. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что тельца включения обычно содержат, по крайней мере частично, белок, который неправильно свернут (неправильно свернутый белок), в частности неправильно свернутый рекомбинантно экспрессированный белок. Понятно, что тельца включения обычно содержат белок в неправильно свернутой форме, то есть в контексте настоящего изобретения они обычно содержат полипептид по настоящему изобретению и/или его предшественник в неправильно свернутой форме. Термин «неправильно свернутая» обычно описывает биомолекулу, такую как нуклеиновая кислота или полипептид, которая не находится в нативной конформации, то есть в неправильно свернутой форме.
Под «выделенным» подразумевается материал, который значительно или по существу свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. Например, «выделенный пептид» или «выделенный белок», используемые в настоящем документе, относятся к пептиду или белку, соответственно, которые были очищены от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, окружающей его в природном состоянии, например, от клетки, в которой он был экспрессирован, такой как клетка-хозяин. В альтернативном описании термины «выделенный пептид» или «выделенный белок» и т.п., используемые в данном документе, относятся к выделению и/или очистке пептида или белка in vitro, соответственно, из его естественного клеточного окружения и из ассоциации с другими компонентами среды, в которой обычно находится пептид или белок. В другом примере термин «выделенная клетка» в данном контексте относится к клетке, которая была очищена от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткани или клеточные колонии, окружающие ее в естественном состоянии, например, к клетке-хозяину, которая была удалена из окружающей среды, обычно примыкающей к клетке. В соответствии с приведенным выше определением слова «выделять», «изолировать», как используется в данном документе, представляет собой глагол, описывающий деятельность по получению «изолированного» материала, такого как, например, изолированная клетка или изолированный пептид или белок.
Термины «множество» и «несколько», используемые здесь, означают множество, т.е. любое количество, состоящее из двух или более объектов.
Термин «мутация», используемый в данном документе, относится к изменению нуклеотидной последовательности генома организма, вируса или внехромосомной ДНК или других генетических элементов. Термин также распространяется на мутации аминокислотной последовательности, особенно аминокислотной последовательности гена, который несет по крайней мере одну (не молчащую) мутацию. Если не указано иное, мутация нуклеотидной последовательности является постоянным изменением. Мутации, присутствующие в зародышевой линии, обычно передаются по наследству. В общем, мутация нуклеотидной последовательности может привести к множеству различных типов изменений в последовательностях: мутации в генах могут либо не иметь никакого эффекта, либо изменить продукт гена, либо препятствовать правильному или полному функционированию гена. Мутации также могут присутствовать в негенных областях. Если не указано иное, последовательность дикого типа используется в качестве эталонной последовательности для описания мутации. Так, например, когда говорят, что данный мутант характеризуется мутацией в положении 100 полипептидной последовательности, это указывает на то, что в положении 100 мутант не имеет того же аминокислотного остатка, что полипептид дикого типа. Конкретные типы мутаций нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности включают такие изменения, как делеции, замены, добавления, вставки и варианты сплайсинга. «Делеция» в отношении нуклеотидной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Делеция» в отношении аминокислотной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде. «Добавление» в отношении нуклеотидной последовательности относится к присутствию одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Добавление» в отношении аминокислотной последовательности относится к присутствию одного или нескольких дополнительных аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде. «Замена» в отношении нуклеотидной последовательности относится к замене одного или нескольких нуклеотидов на (другие) нуклеотиды в нуклеотидной последовательности. «Замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене одного или нескольких аминокислотных остатков на (другие) аминокислотные остатки в полипептиде. Добавления, делеции и замены в нуклеотидной последовательности, например, в открытой рамке считывания, могут быть 5'-концевыми, 3'-концевыми и/или внутренними. Добавления, делеции и замены в полипептиде могут быть на амино-конце, карбокси-конце и/или внутригенными. «Инсерция» в отношении нуклеотидной последовательности и/или полипептидной последовательности представляет собой добавление одного или нескольких нуклеотидов или одного или нескольких аминокислотных остатков, соответственно, конкретно во внутреннем положении соответствующей последовательности. Термин «вариант сплайсинга» используется для описания того, что РНК, кодирующая полипептидную последовательность, подвергается сплайсингу иначе, чем соответствующая РНК дикого типа, как правило, в результате мутации на уровне нуклеиновой кислоты, обычно приводящей к продукту трансляции полипептида, отличающегося от полипептида дикого типа. Термин «вариант сплайсинга» можно использовать не только в отношении соответствующей РНК, но также в отношении соответствующей последовательности матричной ДНК (обычно геномной ДНК) и в отношении последовательности полипептида, кодируемого такой РНК.
Термин «мутант», как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, отличающейся от последовательности дикого типа. Таким образом, мутантная последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере одну мутацию по отношению к соответствующей последовательности дикого типа. В случаях, когда существуют полиморфизмы в последовательности нуклеиновой кислоты, которые, однако, не отражаются на уровне соответствующего кодируемого полипептида (молчащие мутации, вырождение генетического кода), термин «мутантный» на уровне нуклеиновой кислоты конкретно относится только к тем вариантам нуклеиновой кислоты, которые кодируют мутантный полипептид. Мутанты могут содержать различные комбинации мутаций, по отдельности или в комбинации, и включать более одной мутации или различные типы мутаций.
Термин «фактор роста нервов», сокращенно «NGF» или «бета-NGF», обозначает нейротрофический фактор и нейропептид, участвующие в регуляции роста, поддержания, пролиферации и выживания определенных нейронов и других клеток в соответствии с общепринятыми значения в данной области техники (см., например, Levi-Montalcini, 2004, Progress in Brain Research, vol. 146, p. 525-527). Если контекст не требует иного, термин фактор роста нервов относится только к NGF дикого типа и не включает полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4. NGF дикого типа представляет собой бета-субъединицу 2,5S, 26 кДа, которую можно получить из биологически активного предшественника NGF: NGF дикого типа связывается по крайней мере с двумя классами рецепторов: тропомиозиновой рецепторной киназой A (TrkA) и низкоаффинным рецептором NGF (LNGFR/p75NTR). Термин «NGF», если не указано иное, относится к NGF любого вида, предпочтительно вида млекопитающих; однако человеческий NGF всегда является предпочтительным. «hNGF», используемый в данном документе, означает NGF человека. Если из контекста не следует иное, термины «NGF» и «hNGF» относятся к NGF дикого типа, т.е. hNGF означает NGF дикого типа. Аминокислотная последовательность NGF человека дикого типа соответствует положениям 121-239 SEQ ID NO: 1 (серый цвет на Фиг. 2А). Последовательности нечеловеческого NGF доступны, например, в научной литературе посредством алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 121-239 SEQ ID NO: 1 в качестве приманки, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.
Термины «NGF мутеин» и «мутеин NGF» или, в отношении NGF «мутеина такового», используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полипептида, который характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с NGF дикого типа, как далее подробно описано здесь. Полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 представляют собой мутеины NGF. Предпочтительно мутеин NGF имеет от 80 до 99,5% идентичности последовательности с NGF, в частности, с NGF человека, более предпочтительно, мутеин имеет от 90 до 99% идентичности последовательности с NGF, в частности с NGF человека.
Термины «зрелая часть» «зрелая часть» в отношении NGF используются взаимозаменяемо с термином «бета-NGF» и относятся к полипептиду NGF, который характеризуется тем, что он не содержит пропептид (и, следовательно, конечно, не пре-пропептид) NGF. По аналогии, термин «зрелая часть» также используется для обозначения полипептидов SEQ ID NO: 3 или 4, поскольку эти полипептиды также не содержат пропептид (и, следовательно, конечно, не пре-про-пептид). Предпочтительно, чтобы зрелая часть также не содержала С-концевой расщепляемый пептид, кодируемый открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой С-концевой расщепляемый пептид, в случае NGF человека, состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Более конкретно, зрелая часть может быть получена, без ограничений, расщеплением про-NGF протеазой Фурин (и другими протеазами, способными точно расщеплять непосредственно N-конец первого аминокислотного остатка NGF или полипептида SEQ ID NO: 3 или 4 соответственно). Например, хорошо известно, что сайт расщепления фурином NGF человека и многих ортологов состоит из последовательности R1S2K3R4 (однобуквенный код аминокислоты, последовательности пронумерованы от N до C конца). В зрелом NGF обычно нет ни сайта расщепления фурином, ни какой-либо аминокислоты на N-конце сайта расщепления фурином. Например, зрелая часть человеческого NGF состоит из полипептида, представленного аминокислотными позициями 122-239 SEQ ID NO: 1. Зрелую часть нечеловеческого NGF можно идентифицировать, например, поиском последовательности и/или анализом последовательности, где указанная зрелая часть NGF человека используется для выравнивания последовательности.
Термины «пептид» и «полипептид» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к цепи аминокислот, связанных пептидными (амидными) связями, и оба термина включают, без ограничения, все полипептиды, представленные на Фиг. 2.
Термин «предшественник», используемый здесь в отношении NGF, относится к любой пептидной последовательности, из которой NGF может быть получен посредством протеолитического расщепления. Например, как про-NGF, так и пре-про-NGF, а также их варианты являются типичными примерами предшественников NGF. Термин «предшественник», используемый в данном документе, может относиться к предшественникам, наиболее С-концевой аминокислотный остаток которых является наиболее С-концевым остатком NGF, а также к предшественникам, которые выходят на С-конце за пределы последнего С-концевого аминокислотного остатка NGF, поскольку NGF может быть получен из такового путем протеолитического расщепления; хотя встречающийся в природе предшественник человеческого про-NGF дикого типа (SEQ ID NO: 1) содержит С-концевой дипептид (аминокислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1, обозначено жирным шрифтом на Фиг. 1), в настоящем изобретении предпочтительно, чтобы предшественник не содержал С-концевой расщепляемый пептид, кодируемый открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой C-концевой расщепляемый пептид, в случае NGF человека, состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1).
Используемые здесь термины «препептид» или «пре-последовательность» обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой частью открытой рамки считывания NGF, на N-конце непосредственно примыкающей к пропептиду. Для иллюстрации: препептид NGF состоит из последовательности, включающей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 1 SEQ ID NO: 1 до остатка 18 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих препептидов предшественников нечеловеческих NGF доступны, например, в научной литературе посредством алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 1-18 SEQ ID NO: 1 в качестве приманки, и в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot. Полипептид или белок, состоящий из препептида и про-NGF, в котором С-конец препептида непосредственно примыкает к N-концу про-NGF, может называться здесь «пре-про-NGF».
Термины «пропептид» или «пропоследовательность», используемые в данном документе, обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой в природе частью открытой рамки считывания NGF, на N-конце непосредственно примыкающей к зрелому NGF, причем последовательность полипептида не включает препептид. Для иллюстрации: пропептид содержится в предшественнике NGF дикого типа. Пропептид предшественника NGF состоит из последовательности, включающей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до остатка 121 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих пропептидов нечеловеческого происхождения pro-NGF доступны, например, в научной литературе, посредством алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-121 SEQ ID NO: 1 в качестве приманки, и в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.
«Про-NGF» в данном контексте относится к пептидной последовательности, содержащей как зрелую часть NGF, так и соответствующий пропептид, но не содержащий соответствующий препептид. Pro-NGF человека состоит из последовательности, содержащей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до по крайней мере остатка 239 SEQ ID NO: 1. Хотя про-NGF человека дикого типа содержит С-концевой дипептид (аминокислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1), предпочтительно, чтобы про-NGF, полученный и используемый в настоящем изобретении, не содержал С-концевой расщепляемый пептид, кодируемый открытой рамкой чтения NGF дикого типа; такой С-концевой расщепляемый пептид, в случае NGF человека, состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Последовательности нечеловеческого pro-NGF доступны, например, в научной литературе посредством алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-239 SEQ ID NO: 1 в качестве приманки, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.
Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются здесь взаимозаменяемо и относятся как к РНК, так и к ДНК, включая кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК и эквиваленты ДНК/РНК, содержащие аналоги нуклеотидов, аналоги фосфатов и/или аналоги сахаров. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной (т.е. смысловой цепью или антисмысловой цепью). Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают гены, открытые рамки считывания, фрагменты генов, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, siРНК, микроРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные нуклеиновые кислоты любого типа и последовательности, зонды и праймеры нуклеиновых кислот, а также аналоги нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты могут иметь трехмерную структуру любого типа.
Термин «пептид» по изобретению включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, включающим два или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно более 16, предпочтительно 21 или более, и до предпочтительно 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности 100 аминокислот, ковалентно соединенных с цепью пептидными связями.
Термин «белок» предпочтительно относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но в целом термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются здесь взаимозаменяемо, если контекст не диктует иное. Таким образом, термины «полипептид SEQ ID NO: 4» и «белок SEQ ID NO: 4» имеют одинаковое значение.
Термин «фармацевтически приемлемый» обычно описывает, что определенное вещество может быть введено субъекту, необязательно и предпочтительно в комбинации с агентом, при этом агент не вызывает непереносимых побочных эффектов в используемой дозе.
Термины «фармацевтически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый эксципиент» используются для обозначения любого одного или нескольких растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов и агентов, замедляющие всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми и подходящими для введения субъекту, как описано в настоящем документе, или иным образом не мешают такому введению. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или несколько из следующих: воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. В частности, в случае жидких фармацевтических композиций может быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, увеличивающие срок хранения или эффективность агента. Фармацевтически приемлемый носитель обычно содержится в композиции по настоящему изобретению.
Термин «фармацевтически активный агент» относится к агенту, который может быть использован при введении субъекту, в период, агент будет полезен, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. Кроме того, «фармацевтически активный агент» может оказывать положительный или благоприятный эффект на состояние или болезненное состояние субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, фармацевтически активный агент обладает целебными свойствами и может быть введен для улучшения, облегчения, реверсирования, отсрочки наступления или уменьшения тяжести одного или более симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный агент может обладать профилактическими свойствами и может применяться для задержки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Например, агент по изобретению рассматривается здесь как фармацевтически активный ингредиент для лечения кистозного фиброза, как заявлено. В другом примере фармацевтически активный белок можно использовать для лечения клетки или индивидуума, которые в норме не экспрессируют белок, или экспрессируют не на желаемых уровнях, или неправильно экспрессируют белок, например, фармацевтически активный белок может компенсировать мутации или в случае отсутствия достаточно высокой экспрессии путем доставки желаемого белка. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает целые белки или полипептиды, а также может относиться к фармацевтически активным фрагментам таковых. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.
«Открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывный участок кодонов, начинающийся со стартового кодона и заканчивающийся стоп-кодоном.
Термины «субъект» и «пациент», используемые в данном документе, относятся к млекопитающему. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения представляют собой человека, приматов, отличных от человека, домашних животных, включая, без ограничения таковыми, собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней, лошадей и т. д., лабораторных животных, включая, без ограничения таковыми, мышей, крыс, кроликов и т. д., а также животных в неволе, таких как животные зоопарков. Термины «субъект» и «пациент», используемые в настоящем описании, в частности, включают человека. Субъект (человек или животное) имеет два набора хромосом; то есть субъект диплоидный. Термин «пациент» относится к субъекту, который страдает от расстройства/состояния, подвергается риску расстройства/состояния, страдал от расстройства/состояния или прогнозируется, что будет страдать от расстройства/состояния, и который может быть подвергнут терапии, например, введением агента. Состояние больного может быть хроническим и/или острым. Таким образом, «пациент» также может быть описан как субъект, подвергающийся терапии и/или нуждающийся в терапии.
Термин «терапия» следует понимать в широком смысле, и он относится к лечению субъекта с целью предотвращения или лечения состояния у субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления терапия конкретно включает введение агента субъекту.
Термин «трипсин», используемый здесь, обычно относится к протеолитическому ферменту, классифицированному как ЕС 3.4.21.4). Трипсин расщепляет пептидные цепи в основном по карбоксильной стороне аминокислот лизина или аргинина, обычно за исключением случаев, когда за ними следует пролин. Не ограничиваясь какой-либо теорией, понятно, что трипсин представляет собой сериновую протеазу и что трипсин естественным образом содержится в пищеварительной системе многих позвоночных, где он гидролизует белки. Предпочтительным в настоящем изобретении является трипсин из рекомбинантных источников. Хотя in vivo трипсин образуется вместе с пропептидом (называемым «трипсиноген»), термин «трипсин» в данном контексте предпочтительно относится к зрелому трипсину, лишенному какого-либо пропептида. Использование трипсина для протеолитического расщепления также можно назвать «трипсиновым протеолизом» или «трипсинизацией», а белки, полученные в результате расщепления трипсином, называют «трипсинизированными».
«Вариант» предшественника NGF или полипептида SEQ ID NO: 3 или 4 относится к полипептиду или белку, в котором аминокислотная последовательность не является частью зрелого NGF (бета-NGF) или не является частью SEQ ID NO: 3 или 4, соответственно, характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с предшественником NGF дикого типа, таким как про-NGF дикого типа или пре-про-NGF дикого типа; указанная по меньшей мере одна мутация предпочтительно находится на N-конце аминокислотной последовательности зрелого NGF (бета-NGF). Таким образом, используемый здесь термин «вариант» предшественника NGF или подобного относится к пептиду или белку, где препептид и/или пропептид характеризуется по меньшей мере одной мутацией в отношении аминокислотной последовательности препептида и/или пропептида, например, те варианты (без ограничения таковыми), которые описаны в WO 2013/092776 A1 и в US 2018/0086805 A1. Например, в WO 2013/092776 A1 описаны «варианты» про-NGF, в которых сайт расщепления фурином (дикого типа) отсутствует из-за одной или нескольких специфических мутаций.
Термин «вектор» или «клонирующий вектор» обычно относится к нуклеиновой кислоте, которую можно ввести в клетку-хозяина. Примеры векторов включают, без ограничения, плазмиды, фаги и все другие типы нуклеиновых кислот, которые могут быть введены в клетку-хозяина. Термин «вектор» следует понимать в широком смысле, и он включает векторы, которые кодируют пептид или белок для гетерологичной экспрессии (такие векторы могут служить матрицами для создания транскриптов), а также те, которые этого не делают. Векторы первого типа будут содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок или пептид, который может экспрессироваться, когда вектор присутствует в клетке-хозяине. Хотя тип вектора, который выберет специалист в данной области техники, будет зависеть от типа клетки-хозяина, которую выберет специалист в данной области техники, в конкретном случае клонирующие векторы для всех обычных клеток-хозяев, включая E. coli, коммерчески доступны, и Таким образом, специалист в данной области техники может выбрать конкретный вектор с полным учетом выбранной клетки-хозяина.
Термин «дикий тип» используется здесь для обозначения гена или белка, обычно встречающихся в природе, предпочтительно у здорового субъекта. Ген или белок, который не является «диким типом», упоминается здесь как «мутантный» или «мутированный» или тому подобное. Для иллюстрации SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность предшественника NGF человека дикого типа; SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность NGF человека дикого типа.
Настоящее изобретение основано на нескольких открытиях, которые являются взаимосвязанными и, таким образом, вместе приводят изобретателей к различным аспектам изобретения, которые будут описаны далее по отдельности.
Агент по настоящему изобретению
Настоящее изобретение относится к агенту для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего. Агент может быть использован при введении субъекту, когда агент будет полезен, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. В частности, агент, применимый в настоящем изобретении, представляет собой полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение, в частности, предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. для использования в терапии. Терапия обычно включает введение указанного полипептида в организм человека или животного, как описано ниже.
Согласно настоящему изобретению, полипептид SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 предоставляют в качестве фармацевтически активных агентов. По настоящему изобретению полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предназначен для медицинского применения, в частности, для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 происходит из рекомбинантного источника. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает также рекомбинантный полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для медицинского применения, как описано здесь.
Агент по настоящему изобретению, также называемый здесь «полипептид SEQ ID NO: 3» или «полипептид SEQ ID NO: 4», теперь будет описан более подробно. Термин «полипептид с SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 3, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Термин «полипептид с SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 4, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Таким образом, в эти термины также включены функционально эквивалентные фрагменты или аналоги таких полипептидов. Одним из примеров биологически эквивалентной части полипептида может быть домен или подпоследовательность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, которые включают сайт связывания, позволяющий домену или подпоследовательности проявлять такую же биологическую активность, как у полноразмерного полипептида SEQ ID NO: 3 или полноразмерного полипептида SEQ ID NO: 4, или, альтернативно, гена, кодирующего такой полипептид. Термин «по существу одинаковая биологическая активность» относится к эквивалентной части или аналогам полипептида, обладающим по меньшей мере 50%, предпочтительно не менее 60%, более предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, более предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95% и наиболее предпочтительно не менее 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% активности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4 в анализах, описанных в Примере 4. Пример биологически эквивалентного аналога полипептида может быть слитым белком, который включает по меньшей мере часть аминокислотной последовательности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, но он также может быть гомологичным аналогом полипептида. Кроме того, полностью синтетические молекулы, которые имитируют специфическую биологическую активность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, могут представлять собой «биологически эквивалентные аналоги».
Более предпочтительно термин «полипептид с SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 3; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, содержащие среди прочего аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 3. Наиболее предпочтительно термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и аналогичные термины обозначают в настоящем документе полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, определенной по SEQ ID NO: 3; в этом варианте осуществления агент состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке, как определено SEQ ID NO: 3. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно несет одну, две или три внутренние цистеиновые связи, так что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи предпочтительно эквивалентны таковым в человеческом NGF дикого типа.
Столь же более предпочтительно термин «полипептид с SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 4; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, которые содержат среди прочего аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 4. Наиболее предпочтительно термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и аналогичные термины обозначают в настоящем документе полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, определенной по SEQ ID NO: 4; в этом варианте осуществления средство состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке, как определено SEQ ID NO: 4. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно имеет одну, две или три внутренние цистеиновые связи, так что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи предпочтительно эквивалентны таковым в человеческом NGF дикого типа.
Полипептид по настоящему изобретению необязательно может быть охарактеризован дополнительными посттрансляционными модификациями. Такие посттрансляционные модификации необязательно включают гликозилирование и/или фосфорилирование. Однако предпочтительно полипептид по настоящему изобретению не подвергается гликозилированию и/или фосфорилированию. Действительно, принимая во внимание, что приведенные здесь экспериментальные примеры демонстрируют положительный эффект на излечение расстройств глаз и соотношение положительного и отрицательного эффектов, при этом используемый полипептид был получен путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях, обычно не приводящей к гликозилированию и /или фосфорилированию, то вполне вероятно, что полезный эффект настоящего изобретения не зависит от такого типа посттрансляционной модификации. Следовательно, в предпочтительных вариантах полипептид по настоящему изобретению не характеризуется гликозилированием и/или фосфорилированием.
Как правило, полипептид по настоящему изобретению представляет собой неприродный полипептид, который естественным образом не вырабатывается субъектом, которому вводят полипептид. Это связано не только с преимуществом обнаруживаемости у субъекта после введения, но также свидетельствует о том, что введение (из внешнего источника, такого как, например, композиции, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением) необходимо вводить субъекту для достижения успеха в лечении или профилактике расстройства.
Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению представляет собой выделенный полипептид. Более предпочтительно полипептид по настоящему изобретению по существу не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (таких как, например, вариант des-nona) и протеаз (таких как, например, трипсин). Когда полипептид по настоящему изобретению по существу не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (таких как, например, вариант des-nona) и протеаз (таких как, например, трипсин), его также можно назвать «чистым полипептидом». Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению вводят в виде чистого полипептида. Более предпочтительно чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 3, и/или чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 4, имеет весовую долю 90% или более, предпочтительно 92% или более, более предпочтительно 93% или более, более предпочтительно 94% или более, более предпочтительно 96% или более, более предпочтительно 97% или более, более предпочтительно 98% или более, более предпочтительно 99% или более, более предпочтительно 99,2% или более, более предпочтительно 99,4% или более, более предпочтительно 99,6% или более, более предпочтительно 99,8% или более, более предпочтительно 99,9% или более по отношению к общему белку в композиции. Такой чистый полипептид доступен на основании настоящего раскрытия, включающего Примеры 1 и 2. Наиболее предпочтительно чистый полипептид по настоящему изобретению имеет степень чистоты, совместимую с надлежащей производственной практикой (GMP).
Как показано в проведенных здесь экспериментах, в частности в Примере 4, в отдельных экспериментах введенные дозы агента по настоящему изобретению не вызывали какого-либо гипералгезического синдрома (боли). Отсутствие боли особенно примечательно, потому что агент вводили местно и многократно в поврежденный глаз, также в течение длительного периода времени (подробности см. в примерах).
Необязательно, согласно настоящему изобретению, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 вводят в эффективном количестве нуждающемуся в этом субъекту. Подробности введения, эффективного количества и субъекта, нуждающегося в этом, описаны ниже.
Полипептиды, состоящие из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно, отличаются в одном или двух положениях от аминокислотной последовательности фактора роста нервов человека (NGF, также называемого человеческим NGF дикого типа или дикий тип NGF, см. SEQ ID NO: 2). Отличие полипептида по настоящему изобретению от полипептида с SEQ ID NO: 2 оказывает заметное влияние на лечение или профилактику расстройств глаз с отсутствием побочных эффектов, как подробно раскрыто в настоящем документе и подтверждено экспериментальными данными в настоящем документе.
Фактор роста нервов (NGF) представляет собой нейротрофин, необходимый для развития и выживания определенных популяций нейронов. NGF представляет собой гомодимерный пептид, который естественным образом запускает пролиферацию и гомеостаз нейронов. В организме NGF связывается по крайней мере с двумя типами рецепторов: киназой рецептора тропомиозина A (TrkA) и низкоаффинным рецептором нейротрофина NGF p75 (LNGFR/p75NTR/p75). Оба связаны с определенными расстройствами у людей и животных, хотя соответствующие механизмы действия, вероятно, различаются. Было предложено несколько терапевтических применений NGF, но лишь немногие из них дошли до рынка.
Однако многие терапевтические применения NGF, которые предполагались в прошлом, не созрели для выпускаемых на рынок терапевтических продуктов NGF, и одну из причин можно увидеть в том, что NGF, помимо желаемого эффекта на пролиферацию и гомеостаз нейронов, связан с болевыми ощущениями: он может при местном или системном введении вызывать гипералгезию (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci., vol. 6, p. 1903-1912; Della Seta et al., 1994, Pharmacol. Biochem. Behav., vol. 49, p. 701; Dyck et al, 1997, Neurology, vol. 48, 501-505; McArthur, et al., 2000, Neurology, vol. 54, p. 1080-1088 ; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247 ; Ruiz et al., 2004, Brain Res., vol. 1011, p. 1-6). В качестве решения были разработаны мутантные версии NGF («мутеины»), которые связаны со сниженной ноцицептивной активностью («безболезненный NGF») и для которых характерна по крайней мере одна мутация в домене NGF, взаимодействующем с рецептором TrkA. (WO 2008/006893 A1, Malerba et al. PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425). Однако такие полипептиды до сих пор не доступны широкой публике в фармацевтически приемлемой чистоте, и их не предлагали и не разрабатывали для лечения или профилактики офтальмологических расстройств глаза, возможно, также ввиду предубеждений и общего отрицательного опыта исследований по факторам роста в этой терапевтической области в целом.
Известно, что NGF (дикого типа) воздействует на клетки-мишени посредством связывания с двумя отдельными рецепторами: (а) рецептором тирозинкиназы А (TrkA), что приводит к выживанию нейронов, и (b) рецептором нейротрофина р75, который участвует в регуляция гибели клеток (Mesentier-Louro et al., 2017, Int. J. Mol. Sci., vol. 18(98), так что элементы полипептидной последовательности NGF дикого типа после повреждения зрительного нерва также могут иметь эффект обострения дегенерации сетчатки посредством стимуляции апоптоза, см. Mesentier-Louro et al., 2018, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. Также известно, что остаток R100 человеческого NGF дикого типа участвует в связывании NGF с p75, и что мутация этого остатка влияет на связывание p75, см., например, WO 2008/006893 А1. В отличие от NGF дикого типа, hNGF, полипептиды по настоящему изобретению обладают более низкой аффинностью связывания с p75. (см., например, Malerba et al., 2015, PlosOne, 10(9): e0136425). NGF P61SR100E человека соответствует полипептиду SEQ ID NO: 4. Среди нескольких мутантов человеческого NGF (мутанты hNGF) мутантный человеческий NGF P61SR100E считается наиболее многообещающим, а мутанты упоминаются как подходящие, помимо прочего, при офтальмологических заболеваниях. Однако конкретное применение лечения и/или профилактики в соответствии с настоящим изобретением не раскрывается в этих ссылках, и эти ссылки также не делают соответствующие полипептиды доступными с достаточно высокой степенью чистоты, чтобы их можно было использовать в медицинских целях. Таким образом, полипептиды для применения согласно настоящему изобретению, как описано и представлено в настоящем документе, обеспечивают несколько неожиданных преимуществ по сравнению с человеческим NGF дикого типа. В частности, экспериментальные данные, лежащие в основе настоящего изобретения (см. примеры), не могут быть объяснены исключительно тем фактом, что агент согласно настоящему изобретению является «безболезненным», поскольку его способность вызывать боль никогда не исследовалась экспериментально в иннервируемой области глаза, т.е. области, характеризующейся открытыми ноцицепторами. Кроме того, хотя введение агента по настоящему изобретению вызывает укрепление нервов (см., например, пример 3), введение не связано с болью.
В соответствии с настоящим изобретением стабильность и, следовательно, долговременная чистота полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 может быть получена и/или улучшена с помощью аспектов и вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. Таким образом, настоящее изобретение не только делает доступным новое лечение или профилактику офтальмологического расстройства, но также обеспечивает агент, подходящий для такого лечения или профилактики, со степенью чистоты, подходящей для терапевтического применения, включая введение млекопитающему. Агент по настоящему изобретению ранее не был доступен широкой публике с такой предпочтительной степенью чистоты.
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 не встречается в природе и может также называться неприродным полипептидом. Таким образом, агент по настоящему изобретению не является NGF дикого типа и, в частности, не является NGF человека дикого типа.
Предпочтительно неприродный полипептид по настоящему изобретению получают с высокой степенью чистоты. Необязательно полипептид содержит внутренние дисульфидные мостики. Необязательно, полипептид правильно свернут. Необязательно полипептид растворим в водной среде.
Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с животными моделями повреждения или расстройства зрительного нерва (см. Пример 4). Полипептид вызывал значительное и дозозависимое улучшение времени заживления нарушений, связанных с повреждением и/или расстройством зрительного нерва, по сравнению с животными, получавшими плацебо. Это улучшение очевидно при дозах, лишенных побочных эффектов, связанных с болью, что демонстрирует потенциальное преимущество по сравнению с известным уровнем техники.
В частности, данные, полученные in vivo на моделях расстройств, связанных с повреждением и/или расстройством зрительного нерва, продемонстрировали, что полипептид по настоящему изобретению безболезнен, но сохраняет активность нацеливания на систему рецепторов NGF и, таким образом, обеспечивает терапевтический агент для лечения или профилактики офтальмологических нарушений. Действительно, полипептид по изобретению сохраняет трофические свойства NGF дикого типа в отношении ангиогенеза и реиннервации, что способствует заживлению зрительного нерва, не проявляя проноцицептивных эффектов NGF дикого типа в месте нанесения и на системном уровне.
Настоящее изобретение относится к полипептиду для применения при лечении и/или профилактике офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, где полипептид выбран из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для применения в способе лечения человека или животного с помощью терапии, как описано здесь.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к конкретному терапевтическому применению полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4, где конкретное терапевтическое применение представляет собой лечение и/или профилактику офтальмологического расстройства у субьекта-млекопитающего. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду SEQ ID NO: 3 и полипептиду SEQ ID NO: 4 для применения в способе лечения организма человека или животного с помощью терапии, где терапия включает лечение и/или профилактику офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего. Субъект-млекопитающее обычно является субъектом, характеризующимся потребностью в таком лечении.
Полипептид с SEQ ID NO: 3, а также полипептид с SEQ ID NO: 4 характеризуется мутацией аминокислотной последовательности NGF человека (hNGF, SEQ ID NO: 2), при этом указанная мутация связана со сниженной ноцицептивной активностью. В частности, аргинин в положении 100 hNGF заменен глутаминовой кислотой. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что терапевтический эффект может быть достигнут без побочных эффектов, известных из предшествующего уровня техники.
Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид по настоящему изобретению содержал один или несколько дисульфидных мостиков, а наиболее предпочтительно три дисульфидных мостика. Зрелый и правильно уложенный NGF человека характеризуется тремя дисульфидными мостиками (связывающие положения 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231, номера положений относятся к SEQ ID NO: 1; см. Wiesmann et al., 1999, Nature, vol. 401, p. 184-188). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид по настоящему изобретению содержал эквивалентные дисульфидные мостики (номера положений которых доступны специалисту в данной области путем сопоставления полипептида по настоящему изобретению с полипептидом SEQ ID NO: 1 и Wiesmann et al., см. выше.
Описание наличия и отсутствия побочных эффектов
Предпочтительно лечение и/или профилактика не вызывают побочных эффектов или неблагоприятных эффектов у субъекта, которому вводят или вводили полипептид. Таким образом, введение полипептида по изобретению предпочтительно не вызывает каких-либо нежелательных эффектов у субъекта-млекопитающего.
Один побочный эффект или неблагоприятный эффект, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, представляет собой гипералгезию или боль. Особенно предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика по настоящему изобретению не вызывали гипералгезии у субъекта-млекопитающего. Таким образом, введение агента по настоящему изобретению предпочтительно не вызывает какого-либо гипералгезического синдрома (боли).
Важно отметить, что отсутствие боли не просто предоставляет более благоприятное (или менее неприятное) лечение, чем при введении эталонного соединения, вызывающего боль (например, NGF дикого типа), но, по крайней мере, частично является причиной. для успеха лечения или профилактики расстройств глаз как таковых: учитывая, что полипептид по настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно местно вводят в глаз, отсутствие боли позволит субъекту, получающему лечение, принять введение полипептида без побочных реакций, таких как соскабливание, смывание или иное удаление такового с целью уменьшения боли, и в результате этого полипептид будет оказывать терапевтически полезный эффект, такой как лечение или профилактика расстройства глаз . Таким образом, отсутствие боли, связанной с полипептидом по настоящему изобретению, будет выгодным для преодоления нежелания потребителей и беспокойства регулирующих органов. Другими словами, отсутствие боли связано со значительным увеличением отношения пользы к риску по сравнению с агентами, связанными с болью.
В частности, предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали гипералгезии у субъекта-млекопитающего. В одном варианте осуществления субъект, которому вводят полипептид по изобретению, не страдает механической аллодинией. Точнее, механическая аллодиния не индуцируется у субъекта, которому вводят полипептид по изобретению, так что субъект, которому вводят полипептид, не страдает механической аллодинией.
Дополнительным побочным эффектом или неблагоприятным эффектом, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, является злокачественное новообразование или рак. В частности, введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно не связано с аномальным ростом клеток и еще более предпочтительно не связано с аномальным ростом клеток с возможностью проникновения или распространения в другие части тела. Особенно предпочтительно, чтобы введение полипептида по настоящему изобретению субъекту не ассоциируется с раком глаза.
Таким образом, в целом, введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно не связано с неблагоприятными эффектами, такими как злокачественное новообразование и/или боль.
Обычно введение агента по настоящему изобретению хорошо переносится субъектом. В частности, предпочтительно введение полипептида по настоящему изобретению не связано с образованием антилекарственных антител у субъекта. Действительно, поскольку аминокислотная последовательность полипептида по настоящему изобретению отличается только одним или двумя аминокислотными положениями от NGF человека дикого типа, вполне вероятно, что иммунологическая переносимость у людей является особенно предпочтительной, и вполне вероятно, что введение полипептида по настоящему изобретению не связано с образованием антилекарственных антител у человека.
Предпочтительно введение по настоящему изобретению положительно влияет на одно или несколько из следующего: воспаление, отложение внеклеточного матрикса, иннервацию и ангиогенез.
Обнаруживаемость полипептида
Предпочтительно полипептид для применения по настоящему изобретению может быть селективно распознан специфичным реагентом в отношении эндогенного (например, человеческого) NGF. Термины «избирательно распознаваемый» и «выявляемый» используются здесь взаимозаменяемо и обычно относятся к специфической идентификации белков, предпочтительно с помощью молекулярных методов, в биологическом образце.
В этом отношении полипептид по настоящему изобретению предпочтительно выявляется антителом или другой иммунореактивной молекулой.
Белок, обнаруживаемый антителом или другой иммунореактивной молекулой, также может называться антигеном. В некоторых вариантах осуществления биологический образец может характеризоваться наличием или отсутствием отображения одного или нескольких специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения полипептид, введенный субъекту, предпочтительно обнаруживается в биологическом образце, полученном от субъекта после введения полипептида. Одним из неограничивающих способов выявления присутствия белка является вестерн-блоттинг, но другие иммунологические методы в равной степени охватываются контекстом настоящего изобретения. Антитело или другая иммунореактивная молекула либо помечены (например, помечены флуорофором) сами по себе, либо распознаются меченым вторичным антителом или другой иммунореактивной молекулой, которая добавляется для этой цели. Таким образом, в некоторых случаях вторичная молекула, которая помогает в обнаружении, например, необязательно меченое вторичное антитело для облегчения обнаружения, также добавляется.
В соответствии с изобретением считается, что антиген присутствует в биологическом образце, если уровень такового выше предела обнаружения и/или если уровень достаточно высок для обеспечения возможности связывания антиген-специфическими антителами, добавленными к образцу. В соответствии с изобретением говорят, что антиген не экспрессируется на клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком низок, чтобы осуществить связывание антиген-специфическими антителами, добавленными к образцу.
Антитело или другая иммунореактивная молекула может распознавать эпитоп на клетке. Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, т.е. к части или фрагменту молекулы, которая распознается, т.е. связывается, иммунной системой, например, которая распознается антителом или другой иммунореактивной молекулой. Обнаружение эпитопа, специфичного для любого конкретного антигена, обычно позволяет сделать вывод, что этот конкретный антиген присутствует в анализируемой клетке.
В одном варианте осуществления образец, полученный от субъекта, в частности от субъекта, которому вводили полипептид по настоящему изобретению, можно охарактеризовать с помощью иммунофенотипирования. «Иммунофенотипирование» обычно означает, что клетка или образец могут быть охарактеризованы антиген-специфичными молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляют к образцу для определения присутствия антигена. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, а также методы анализа лизированных клеток и лизированных образцов, такие как вестерн-блоттинг.
В настоящем изобретении особенно предпочтительным является полипептид, который может быть специфически обнаружен даже в присутствии NGF дикого типа, такого как человеческий NGF дикого типа. Хотя любая мутация аминокислотной последовательности, такая как, например, любая точечная мутация, может сделать полипептид специфически обнаруживаемым даже в присутствии соответствующего немутантного полипептида дикого типа и, следовательно, каждый из полипептидов SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 могут быть специфически обнаружены prima facie даже в присутствии NGF человека дикого типа, в частности, полипептид SEQ ID NO: 4, для которого доступно антитело, способное отличить указанный полипептид от NGF человека дикого типа (WO 2008/006893 A1).
Таким образом, полипептид предпочтительно характеризуется по меньшей мере отсутствием пролина (который присутствует в положении 61 SEQ ID NO: 2, для справки), более предпочтительно заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте пролин в положении 61 заменен серином. В этом предпочтительном варианте осуществления полипептид для применения согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид SEQ ID NO: 4. Этот полипептид характеризуется по меньшей мере отсутствием пролина в положении 61, более предпочтительно заменой пролина в положении 61 на другую аминокислоту. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 SEQ ID NO: 3 заменен серином.
Офтальмологическое расстройство
Согласно настоящему изобретению, полипептид по настоящему изобретению предназначен для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства. Для такого применения и всех его вариантов полипептид SEQ ID NO: 4 является особенно предпочтительным.
Офтальмологическое расстройство может быть наследственным и/или приобретенным офтальмологическим расстройством.
В некоторых вариантах осуществления офтальмологическое расстройство представляет собой поражение глаз или включает таковое. В одном варианте осуществления поражение глаза включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва и/или сетчатки.
Хотя такие термины, как «офтальмологическое расстройство», «повреждение», «расстройство», «глаз», «зрительный нерв», «сетчатка» и другие термины используются здесь в единственном числе, настоящее изобретение также применимо к субъектам, страдающим множественными офтальмологическими расстройствами, расстройствами, повреждениями, а также к введению и лечению всех (обоих) глаз, всех (обоих) зрительных нервов и всех (обеих) сетчаток субъектов.
Предпочтительными расстройствами, подлежащими лечению или предупреждению в соответствии с настоящим изобретением, являются заболевания, затрагивающие зрительный путь. В целом зрительный путь включает сетчатку, зрительный нерв, перекрест зрительных нервов, зрительные лучи и затылочную кору. Таким образом, предпочтительными нарушениями, подлежащими лечению или предупреждению согласно настоящему изобретению, являются нарушения, поражающие любую одну или несколько областей сетчатки, зрительного нерва, перекреста зрительных нервов, зрительных лучей и затылочной коры. Повреждение оптического/зрительного пути может вызвать различные дефекты поля зрения. Такие дефекты поля зрения можно лечить или предотвращать согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает лечение и/или предотвращение дефектов поля зрения, включая частичную и полную потерю зрения.
Офтальмологические расстройства включают, помимо прочего, зрительное напряжение, покраснение глаз, куриную слепоту, ленивый взгляд, косоглазие (косоглазие), нистагм, цветовую слепоту, увеит, пресбиопию, нечеткость зрения, боль в глазах, светочувствительность, мушки, сухость глаз, избыточное слезотечение, катаракту, глаукому, расстройства сетчатки, конъюнктивит, расстройства роговицы, боль в глазах, проблемы с веками, изменения зрения, снижение зрения, проблемы, связанные с контактными линзами, расстройства, связанные с повреждением и/или расстройством зрительного нерва, и расстройства, связанные с повреждением и/или нарушением ганглиозных клеток сетчатки. Полипептид по настоящему изобретению можно вводить субъекту, страдающему любым из этих расстройств, для лечения соответствующего расстройства. В качестве альтернативы или дополнительно полипептид по настоящему изобретению можно вводить субъекту с риском развития любого из этих нарушений для предотвращения соответствующего нарушения. Настоящее изобретение также применимо, без ограничения, к списку заболеваний, включающему глаукому, нейротрофический кератит, неврит зрительного нерва, атрофию зрительного нерва, друзы диска зрительного нерва и глиому зрительного пути. Нейропатии зрительного нерва, к которым применимо настоящее изобретение, включают, без ограничения, следующие: глаукому, глиому зрительного пути, переднюю ишемическую оптическую невропатию, посттравматическую оптическую невропатию, атрофию зрительного нерва после гидроцефалии, транссинаптическую дегенерацию волокон зрительного нерва, компрессию зрительного нерва преоптического хиазмального пути, аутосомно-доминантную атрофия зрительного нерва, наследственную оптическую нейропатию Лебера, синдром Вольфрама, оптическую нейропатию.
Без ограничения настоящее изобретение также охватывает лечение и профилактику одного или нескольких состояний из следующего списка: аутосомно-доминантная атрофия зрительного нерва, наследственная нейропатия зрительного нерва Лебера, передняя ишемическая нейропатия зрительного нерва, травматическая невропатия зрительного нерва, глиома зрительного пути, нейротрофический кератит, язва роговицы, глаукома, пигментный ретинит, дегенерация желтого пятна, диабетическая ретинопатия, дисфункция ганглиозных клеток сетчатки.
Особенно предпочтительным является применение полипептида по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства, затрагивающего зрительный нерв. В некоторых вариантах реализации зрительный нерв повреждается или поражается. Как показано, например. в Примере 4 полипептид по настоящему изобретению при введении в варианте осуществления настоящего изобретения оказывает прямое лечебное действие на такие офтальмологические расстройства. Таким образом, предпочтительно, офтальмологическое расстройство, подлежащее лечению и/или предупреждению с помощью полипептида по настоящему изобретению, включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва. Субъекты, имеющие такое повреждение и/или расстройство зрительного нерва, описаны здесь, и настоящее изобретение и последующее описание конкретных повреждений и/или расстройств, затрагивающих зрительный нерв, применимы ко всем таким субъектам, если контекст не требует иного. Расстройства, связанные с повреждением и/или расстройством зрительного нерва, включают, без ограничения, глаукому, нейротрофический кератит, неврит зрительного нерва, атрофию зрительного нерва, друзы головки зрительного нерва и глиому зрительного пути. Настоящее изобретение включает лечение и/или профилактику всех этих нарушений, а также других нарушений, затрагивающих зрительный нерв. В таких вариантах осуществления средство по настоящему изобретению предназначено для лечения с целью предотвращения расстройства, включающего повреждение и/или расстройство зрительного нерва.
Особенно предпочтительным является применение полипептида по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства, затрагивающего сетчатку. В некоторых вариантах осуществления сетчатка повреждена или поражена. Сетчатка - самый внутренний светочувствительный слой ткани глаза млекопитающих. Глаз оптически создает сфокусированное двухмерное изображение визуального мира на сетчатке, которая переводит это изображение в нейронные импульсы в мозге для создания зрительного восприятия. Нервная часть сетчатки состоит из нескольких слоев нейронов, соединенных между собой синапсами и поддерживается наружным слоем пигментированных эпителиальных клеток (фоторецепторных клеток). Предпочтительно офтальмологическое расстройство характеризуется поражением сетчатки. Например, расстройство может быть вызвано расстройством нейронов сетчатки и/или эпителиальных клеток сетчатки. К предпочтительным расстройствам сетчатки относятся дегенерация желтого пятна (возрастная или невозрастная), ретинопатия (диабетическая или недиабетическая ретинопатия), пигментный ретинит, ретинобластома, конусо-стержневая дистрофия (CORD и отслоение сетчатки). Пигментный ретинит обычно передается по наследству и приводит к потере ночного и периферического зрения. Дегенерация желтого пятна характеризуется потерей центрального зрения из-за гибели или повреждения клеток макулы. При расслоении сетчатки сетчатка отделяется от задней части глазного яблока. Гипертоническая ретинопатия и диабетическая ретинопатия характеризуются повреждением крошечных кровеносных сосудов, снабжающих сетчатку, и в некоторых вариантах осуществления вызывается сахарным диабетом. Ретинобластома представляет собой рак сетчатки. В некоторых вариантах осуществления зрительный нерв физически поврежден или поражен, например при сдавлении нерва (ONC, Пример 4) или глиоме зрительного пути. Настоящее изобретение включает лечение и/или профилактику всех этих и других расстройств сетчатки. В таких вариантах осуществления средство по настоящему изобретению предназначено для применения при лечении с целью предотвращения расстройства, включающего повреждение и/или расстройство сетчатки.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению вводят субъекту, страдающему невропатией. В предпочтительных воплощениях средство по настоящему изобретению предназначено для введения субъекту, страдающему невропатией, такой как, в частности, невропатия зрительного нерва. Такие субъекты могут быть диабетическими или недиабетическими субъектами. Невропатия может быть локальной или системной. В некоторых вариантах осуществления введение по настоящему изобретению может уменьшить невропатию у субъекта. Уменьшение невропатии может быть местным и/или системным. В одном варианте осуществления уменьшение невропатии включает уменьшение невропатии в глазу, в который вводят полипептид по изобретению. Нейропатии зрительного нерва, к которым применимо настоящее изобретение, включают, без ограничения, следующие: глаукому, глиому зрительного пути, переднюю ишемическую оптическую невропатию, посттравматическую оптическую невропатию, атрофию зрительного нерва после гидроцефалии, транссинаптическую дегенерацию волокон зрительного нерва, компрессию зрительного нерва преоптического хиазмального пути, аутосомно-доминантную атрофию зрительного нерва, наследственную оптическую нейропатию Лебера, синдром Вольфрама, оптическую нейропатию. В изобретении явно предусмотрено введение детям, в частности, при следующих состояниях, без ограничения таковыми: глиома зрительного пути и атрофия зрительного нерва после гидроцефалии.
Особенно предпочтительным является применение полипептида по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства, которое затрагивает ганглиозные клетки сетчатки. В некоторых вариантах осуществления ганглиозные клетки сетчатки повреждены или поражены. Такие заболевания были описаны, например, у Garcia et al., 2016, Cytokin Groth Fact. Rev., vol. 34, p. 1359-1601 and by Levin et al., 2002, Progr. Retin. Eye Res., vol. 21, p. 465-484). Как правило, ганглиозная клетка сетчатки (RGC) представляет собой тип нейрона, расположенного вблизи внутренней поверхности сетчатки глаза (слой ганглиозных клеток). Однако все ганглиозные клетки сетчатки также имеют длинный аксон, идущий в головной мозг. Эти аксоны образуют зрительный нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт. Таким образом, многие расстройства, затрагивающие зрительный нерв, также являются заболеваниями, затрагивающими ганглиозные клетки сетчатки, и наоборот. Эти термины не являются взаимоисключающими. Точно так же многие расстройства сетчатки также являются заболеваниями, затрагивающими ганглиозные клетки сетчатки, и наоборот. Эти термины не являются взаимоисключающими. В любом случае, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения офтальмологическое расстройство, подлежащее лечению и/или предотвращению, предпочтительно характеризуется нарушением ганглиозных клеток сетчатки. Расстройства, связанные с повреждением и/или нарушением ганглиозных клеток сетчатки, включают, помимо прочего, глаукому, глиому зрительного пути, переднюю ишемическую оптическую невропатию, посттравматическую оптическую невропатию, атрофию зрительного нерва после гидроцефалии, транссинаптическую дегенерацию волокон зрительного нерва, компрессию преоптического хиазмального пути, аутосомно-доминантную атрофию зрительного нерва, наследственную оптическую нейропатию Лебера, синдром Вольфрама, оптическую нейропатию. В изобретении явно предусмотрено введение детям, в частности, без ограничения таковыми, при следующих состояниях: глиома зрительного пути и атрофия зрительного нерва после гидроцефалии. В некоторых вариантах осуществления RCG физически повреждены или поражены, например, при размозжении зрительного нерва (ONC, Пример 4) и глиоме зрительного пути. Настоящее изобретение включает лечение и/или профилактику всех этих и других нарушений, связанных с повреждением и/или нарушением RGC. В таких вариантах осуществления средство по настоящему изобретению предназначено для применения при лечении с целью предотвращения нарушения, включающего повреждение и/или расстройство RGC.
Наиболее предпочтительные офтальмологические заболевания, подлежащие лечению и/или предупреждению в соответствии с настоящим изобретением, выбирают из списка, состоящего из глаукомы, глиомы зрительного пути, передней ишемической оптической нейропатии, посттравматической оптической нейропатии, постгидроцефалии зрительного нерва, транссинаптической дегенерации волокна зрительного нерва, компрессии преоптического хиазмального пути, аутосомно-доминантной атрофии зрительного нерва, наследственной оптической нейропатии Лебера, оптической нейропатии синдрома Вольфрама. В изобретении явно предусмотрено введение детям, в частности, без ограничения таковыми, при следующих состояниях: глиома зрительного пути и атрофия зрительного нерва после гидроцефалии.
Субъекты, для которых особенно подходит средство по настоящему изобретению
Согласно настоящему изобретению, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 можно вводить субъекту, нуждающемуся в таком введении. Субъект, нуждающийся в таком введении, может быть субъектом, страдающим описанным здесь расстройством, субъектом, подверженным риску развития такого расстройства, или иным образом страдающим таким расстройством. Агент вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество может быть определено врачом с учетом настоящего описания.
В частности, полипептид по изобретению вводят субъекту-млекопитающему. Субъект также может называться «пациент». Наиболее предпочтительно млекопитающим является человек.
Субъект может быть взрослым субъектом или невзрослым субъектом, таким как ребенок или подросток. Введение детям явно рассматривается в изобретении.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего офтальмологическим расстройством, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4. Термины «пациент» и «субъект» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, в частности, в отношении пациента/субъекта, характеризующегося офтальмологическим расстройством, как описано в настоящем документе.
Предпочтительно офтальмологическое расстройство характеризуется повреждением и/или расстройством зрительного нерва, и/или сетчатки, и/или ганглиозных клеток сетчатки субъекта. Такое повреждение и/или расстройство включает нарушение функции и снижение функции ганглиозных клеток сетчатки. Описаны расстройства, характеризующиеся повреждением и/или расстройством зрительного нерва и/или сетчатки, и/или ганглиозных клеток сетчатки, например, описанные выше, и следующее описание субъектов применимо ко всем таким повреждениям и/или нарушениям у таких субъектов, если контекст не требует иного.
В контексте настоящего изобретения термин «предотвращать» следует понимать в широком смысле, и он включает не только предотвращение возникновения расстройства, но также и предотвращение прогрессирования расстройства. В частности, в контексте нарушения, связанного с повреждением и/или расстройством зрительного нерва, термин «предотвратить» также включает предотвращение дальнейшего прогрессирования повреждения зрительного нерва.
В контексте настоящего изобретения термин «лечить» следует понимать в широком смысле, и он включает, помимо прочего, облегчение симптомов расстройства. Действительно, предпочтительно, а также продемонстрировано приведенными здесь экспериментальными примерами, что достижение облегчения офтальмологического расстройства, такого как, например, (частичное) восстановление зрения или другое улучшение или облегчение состояния или расстройства является предпочтительной неотъемлемой частью заявленного здесь изобретения. Действительно, достижение заявленного терапевтического эффекта является функционально-техническим признаком настоящего изобретения. Приведенные здесь примеры делают правдоподобным тот факт, что указанная функциональная техническая характеристика достижима как прямой результат введения полипептида по настоящему изобретению. Другими словами, авторы настоящего изобретения установили, что полипептид по настоящему изобретению является причиной улучшения состояния у субъекта, страдающего офтальмологическим расстройством. Офтальмологическое расстройство предпочтительно характеризуется повреждением и/или расстройством зрительного нерва.
Настоящее изобретение особенно подходит для подгруппы субъектов, страдающих офтальмологическим расстройством. Такие подгруппы описаны здесь. Также возможно, что конкретный субъект попадает в одну или несколько описанных здесь подгрупп; введение полипептида по настоящему изобретению субъектам, относящимся к одной из описанных здесь подгрупп, в равной степени охватывается настоящим изобретением как введение полипептида по настоящему изобретению субъектам, относящимся более чем к одной из описанных здесь подгрупп.
Изобретение не ограничивается конкретными причинами повреждения и/или расстройства зрительного нерва. Механические и немеханические причины повреждения и/или расстройства зрительного нерва включены в изобретение. Кроме того, в изобретение включены диабетические причины повреждения и/или нарушения зрительного нерва, а также недиабетические причины таковых.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению необязательно предназначен для введения субъекту, перенесшему операцию. Соответственно, полипептид по настоящему изобретению подходит для лечения или профилактики одного или нескольких послеоперационных осложнений на глазах. Альтернативно, полипептид по настоящему изобретению также подходит для предотвращения хирургического вмешательства у субъекта. Например, при глиоме зрительного пути зрительный нерв может быть укреплен введением полипептида по изобретению, и это может сделать хирургическое вмешательство ненужным или необязательным. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет неинвазивное введение.
Настоящее изобретение подходит для лечения офтальмологических расстройств, таких как, в частности, повреждения и/или расстройства зрительного нерва, у больных диабетом и у лиц, не страдающих диабетом. Дополнительные подробности повреждений и/или нарушений зрительного нерва описаны выше.
Офтальмологические расстройства могут возникать у больных диабетом. Такие офтальмологические расстройства можно лечить и/или предотвращать на основе настоящего изобретения.
В некоторых воплощениях млекопитающее, которому вводят полипептид по изобретению, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету; соответствующий субъект упоминается здесь как «диабетический субъект».
Сахарный диабет является распространенным и инвалидизирующим заболеванием, поражающим различные органы. Способы выявления диабета хорошо известны в данной области. Способы выявления диабета в одном варианте осуществления не являются частью настоящего изобретения, но они могут облегчить лечение или профилактику офтальмологического расстройства в соответствии с настоящим изобретением.
В типичных вариантах осуществления сахарный диабет выбран из сахарного диабета типа 1 и сахарного диабета типа 2.
Необязательно офтальмологическое расстройство включает расстройство, вызванное сахарным диабетом или иным образом связанное с сахарным диабетом. Таким образом, настоящее изобретение применимо к субъектам, страдающим сахарным диабетом, а также к субъектам, не страдающим сахарным диабетом. В некоторых вариантах осуществления средство по настоящему изобретению предназначено для введения субъекту, страдающему диабетом. Таким образом, полипептид по изобретению можно вводить в глаза субъекту, страдающему диабетом. Таким образом, в одном варианте осуществления применение полипептида по настоящему изобретению включает введение в глаз субъекту, страдающему диабетом.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает лечение и/или профилактику офтальмологических состояний у субъекта, страдающего диабетом. Действительно, в соответствии с настоящим изобретением эффективное лечение может не только помочь пациентам вылечиться от этих глазных осложнений, но также может привести к улучшению качества их жизни и снижению объема медицинской помощи и/или расходов.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает преимущество по сравнению с существующими способами лечения, которые часто не могут обеспечить эффективный способ лечения офтальмологических расстройств. Настоящее изобретение обеспечивает лечение и/или профилактику таких офтальмологических расстройств.
Глазное введение
Лечение или профилактику по настоящему изобретению можно проводить путем введения, предпочтительно местного введения, полипептида по настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению глаз субъекта является предпочтительным местом введения полипептида изобретения. В общем, когда здесь говорится, что полипептид вводят в глаз субъекта, такое введение может осуществляться либо на поверхность глаза, либо в глаз, если контекст не требует иного.
Предпочтительно полипептид предназначен для введения в глаза. Более предпочтительно введение выбирают из группы, состоящей из местного введения в глаза и интравитреального введения, при этом местное введение в глаз является наиболее предпочтительным.
В предпочтительных воплощениях средство по настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики расстройства, включающего повреждение и/или расстройство зрительного нерва, и с этой целью таковое вводится в глаз. Согласно настоящему изобретению, полипептид подходит для лечения или профилактики повреждений и/или нарушений зрительного нерва, и для таких целей таковое вводят в глаз.
Настоящее изобретение не ограничивается субъектами, имеющими офтальмологическое расстройство только одного глаза, или субъектами, имеющими офтальмологическое расстройство обоих глаз. Таким образом, термины «глаз» и «зрительный нерв», независимо от их использования в единственном или множественном числе в настоящем раскрытии, явно включают все эти варианты единственного и множественного числа.
В некоторых вариантах осуществления администрация n проводится в стационаре. В некоторых вариантах лечение не проводят в стационаре. Например, введение глазных капель обычно не требует госпитализации субъекта.
Необязательно, но не исключая друг друга, офтальмологическое расстройство включает по меньшей мере одно механическое повреждение. Таким образом, настоящее изобретение также включает лечение или предотвращение механических повреждений, при этом лечение таких повреждений имеет практически большее значение, чем предотвращение. К таким расстройствам относятся расстройства, связанные с раздавливанием зрительного нерва (ONC), и другие расстройства, поражающие зрительный нерв.
Таким образом, и как подробно описано здесь, согласно настоящему изобретению, полипептид вводят в глаз субъекта, страдающего или подверженного риску развития офтальмологического расстройства.
В другом варианте осуществления агент по настоящему изобретению предназначен для лечения или профилактики рака глаза, например, глиомы зрительного пути, и/или расстройств глаз, связанных с такими видами рака, без ограничения таковыми.
В другом варианте осуществления агент по настоящему изобретению предназначен для лечения или профилактики офтальмологического расстройства, возникающего в результате генетического расстройства у субъекта или на которое влияет генетическое расстройство у субъекта.
Путь введения
Настоящее изобретение предоставляет гетерологичный полипептид для введения субъекту.
Предпочтительно полипептид предназначен для местного введения. Таким образом, полипептид по изобретению предпочтительно вводят в глаз. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят интравитреально. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят местно в глаза.
Более предпочтительно полипептид вводят на поверхность глаза. Другими словами, полипептид по настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно местно вводят в глаз. Наиболее предпочтительно полипептид вводят на конъюнктиву субъекта. Введение на конъюнктиву субъекта также называют «конъюнктивальным» введением. Конъюнктивальное введение наиболее предпочтительно осуществляют путем введения с помощью глазных капель.
Введение по настоящему изобретению обычно не требует хирургического вмешательства для субъекта. В одном варианте осуществления введение полипептида по изобретению не включает и не предполагает инвазивную стадию, представляющую собой существенное физическое вмешательство в организм, которое требует проведения профессиональной медицинской экспертизы и влечет за собой значительный риск для здоровья, даже если таковое осуществляется с соблюдением необходимых требований профессиональный ухода и опыта. Напротив, в более типичных вариантах осуществления введение полипептида по изобретению, особенно местное введение, обычно считается безопасным для субъекта, и, следовательно, полипептид может вводиться самим субъектом, особенно в случае, если субъект является человеком.
Необязательно глаз закрывают пластырем и/или повязкой до и/или во время и/или после введения. Огромное разнообразие доступных типов пластырей и/или глазных повязок не ограничивается настоящим изобретением. Таким образом, можно использовать любые пластыри и/или глазные повязки, за исключением тех случаев, когда это явно неприемлемо с технической точки зрения. Предпочтительны пластыри и/или глазные повязки, подходящие для покрытия глаз. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению вводят одновременно с наложением пластыря или повязки на глаза; необязательно пластырь или глазная повязка содержат полипептид по изобретению, необязательно в форме водной среды, наносимой на глазную повязку перед введением.
В альтернативном и более предпочтительном варианте полипептид вводят повторно. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид вводят повторно от одного до пяти раз в день. В одном варианте осуществления полипептид вводят один раз в день. В одном варианте осуществления полипептид вводят два раза в день. В одном варианте осуществления полипептид вводят три раза в день (см. также Пример 4). В одном варианте осуществления полипептид вводят четыре раза в день. В одном варианте осуществления полипептид вводят пять раз в день. Особенно предпочтительно, чтобы полипептид вводили субъекту-человеку два раза в день. Все вышеупомянутые введения предпочтительно повторяют в течение нескольких дней, как описано здесь. Например, полипептид можно вводить повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней и предпочтительно от одного до пяти раз в каждый из этих дней.
Предпочтительно средство по настоящему изобретению при введении в глаз, как описано здесь, не вызывает гипералгезического синдрома (боли). Таким образом, средство по настоящему изобретению может контактировать с ноцицептивными волокнами (нервами), включая зрительный нерв, не вызывая гипералгезического синдрома (боли). По этой и другим причинам настоящее исследование предоставляет большое преимущество, особенно при лечении и/или профилактики расстройств, затрагивающих зрительный нерв.
Период и интервалы введения
Как правило, полипептид по настоящему изобретению вводят многократно или однократно.
В одном варианте осуществления полипептид вводят однократно. В этом варианте осуществления полипептид вводят однократно, и после этого однократного введения введение прекращают.
В альтернативном варианте осуществления полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно введение прекращают после завершения указанного интервала.
В одном варианте осуществления полипептид вводят повторно. В одном варианте осуществления полипептид вводят повторно, например, до полного излечения офтальмологического расстройства или, по крайней мере, до тех пор, пока не будет наблюдаться улучшение симптомов расстройства. Альтернативно, полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно введение прекращают после завершения указанного периода. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид вводят повторно, по меньшей мере, три раза в день.
Предпочтительно полипептид вводят после повреждения зрительного нерва.
Предпочтительно полипептид вводят как можно скорее после диагностированного повреждения зрительного нерва, чтобы свести к минимуму степень гибели RGC. «Как можно скорее» включает варианты осуществления через один день или менее после диагностики повреждения зрительного нерва. Однако полипептид по-прежнему обладает нейропротекторным действием, если его вводят через несколько дней после возникновения повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через три дня после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через четыре дня после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через пять дней после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через шесть дней после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через семь дней после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через восемь дней после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через девять дней после индукции повреждения зрительного нерва. Предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через десять дней после индукции повреждения зрительного нерва. Однако наиболее предпочтительно полипептид вводят по меньшей мере через четыре дня после индукции повреждения зрительного нерва. Во всех этих вышеизложенных вариантах осуществления термин «по меньшей мере (количество) дней после индукции повреждения» в случае повторного введения означает, что первую дозу вводят через указанное количество дней. Необязательно дополнительные дозы можно вводить позже, в тот же день и/или в последующие дни, в соответствии с раскрытием в настоящем документе.
Доза
Описанные здесь агенты и композиции вводят в эффективных количествах. В соответствии с настоящим изобретением «эффективное количество» представляет собой количество или дозу, которая обеспечивает желаемую реакцию или желаемый эффект либо отдельно, либо вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного расстройства желаемая реакция предпочтительно связана с замедлением течения заболевания. Это включает замедление прогрессирования заболевания и, предпочтительно, прерывание или обращение вспять прогрессирования заболевания. Желаемая реакция при лечении заболевания или состояния может также включать задержку или предотвращение начала указанного заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления желаемая реакция включает полное излечение симптомов расстройства местно и/или системно.
Эффективное количество агента или композиции, описанных в настоящем документе, будет зависеть от состояния или расстройства, подлежащего лечению, тяжести расстройства, индивидуальных параметров субъекта, которому вводят агент, таких как возраст, физиологическое состояние, сопутствующее состояние (при наличии), рост и вес, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (при наличии), конкретный путь введения и других параметров Соответственно, вводимые дозы агентов, описанных здесь, могут зависеть от различных таких параметров. В случае недостаточной реакции у пациента при начальной дозе можно использовать более высокие дозы (или эффективно более высокие дозы, достигаемые другим, более локализованным путем введения).
Согласно настоящему изобретению подходящие и терапевтически эффективные дозы для введения терапевтического средства для введения человеку для лечения и/или профилактики глаз могут быть определены на основании экспериментально определенных подходящих и терапевтических доз для введения терапевтического агента грызуну, в частности, мыши, для лечения и/или профилактики расстройства глаз.
Модели на животных (Пример 4) помогают установить фармакологический ответ, а также оценить потенциальную токсичность лечебных продуктов. В некоторых вариантах осуществления доза, которую вводят субъекту, представляет собой дозу, как описано в Примере 4, или в Примере 5, или в Примере 6.
Предпочтительно дозу полипептида определяют в начале или до начала лечения. В одном варианте осуществления дозу корректируют для последующего введения (введений) в зависимости от прогресса лечения. В альтернативном варианте осуществления дозировку не корректируют для последующего(их) введения(ий), так что последующие дозы соответствуют первой дозе.
Полипептид активен как при местном (например) конъюнктивальном, так и при интравитреальном введении. В частности, для местного (наиболее предпочтительно конъюнктивального) введения (предпочтительно глазных капель) предпочтительная доза/каждая доза составляет от 0,3 до 30 мкг полипептида на глаз, более предпочтительно от 1 до 10 мкг полипептида на глаз и наиболее предпочтительно около 5 мкг полипептида на глаз. Наиболее предпочтительно эти указанные дозировки предназначены специально для введения в глаз человеку.
Способ получения полипептида
В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии. Для этого открытую рамку считывания, кодирующую соответствующий полипептид, вводят в источник рекомбинантных белков, например, в клетку-хозяина или в бесклеточную систему для экспрессии белка. Действительно, учитывая, что NGF человека продуцируется in vivo лишь в незначительных количествах, NGF мыши обычно продуцируется в виде гетерогенной смеси различных белков (см. WO 2000/022119 A1), а полипептиды по настоящему изобретению не являются природными и, таким образом, вообще не продуцируются in vivo, наиболее целесообразной возможностью получения полипептида по настоящему изобретению является рекомбинантная экспрессия в соответствии с эквивалентными предложениями для NGF дикого типа в состоянии уровня техники (WO 2000/022119 A1, WO 2008/006893 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303, US 2018/0086805 A1). Однако получение таких полипептидов со степенью чистоты, достаточной для введения млекопитающим, было постоянной проблемой. Эта проблема была преодолена настоящим изобретением, как подробно описано здесь (см. также Примеры 1 и 2).
Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению можно получить путем рекомбинантной экспрессии в бактериях. Более предпочтительно полипептид по настоящему изобретению можно получить путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях. Как правило, бактериальные клетки, в частности E. coli, способны рекомбинантно продуцировать большое количество рекомбинантных белков, но, как и в случае со многими другими рекомбинантно экспрессируемыми генами, продукция рекомбинантного NGF и подобных полипептидов в бактериях приводит к биологически неактивному продукту трансляции, который затем накапливается в клетке (цитозоле) в виде агрегатов (так называемых телец включения (ТВ) (WO 2000/022119 A1; US 2018/0086805 A1). В отличие от NGF, pro-NGF является достаточно нестабильным и требует больших усилий для рефолдинга и очистки при низких скоростях извлечения, что делает процесс продукции NGF путем продукции pro-NGF в бактериях относительно сложным и дорогим. Таким образом, основные трудности, связанные с продуцируемым бактериями NGF и подобными продуцируемыми бактериями полипептидами через соответствующие проформы, касаются фолдинга, процессинга и очистки рекомбинантного белка. Теперь эти трудности решены (см. Примеры 1 и 2). В результате этого полипептиды SE ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 становятся доступными со степенью чистоты, подходящей для введения млекопитающим, включая человека.
Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению экспрессируется вместе с про-последовательностью. Без ограничения, подходящая про-последовательность представляет собой про-последовательность NGF человека дикого типа (аминокислотные положения с 18 по 121 SEQ ID NO: 1), обычно слитую с N-концом полипептида SEQ ID NO: 3. или 4. Было показано, что для NGF дикого типа, хотя он и не является частью зрелого NGF и, следовательно, не требуется для биологической функции NGF, присутствие ковалентно присоединенной про-последовательности способствует рефолдингу рекомбинантного NGF из телец включения. с сопутствующим образованием дисульфидных связей зрелой части (бета-NGF). Таким образом, присутствие ковалентно присоединенной про-последовательности положительно влияет на выход и скорость рефолдинга по сравнению с рефолдингом in vitro зрелого NGF из телец включения (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303). Без ограничения конкретной теорией, то же самое вероятно и постулируется в данном документе для полипептида SEQ ID NO: 3 и 4.
Таким образом, если полипептид по настоящему изобретению получают в тельцах включения, то требуется правильный рефолдинг такового, и это обычно достигается посттрансляционно, как и отщепление такового от ковалентно присоединенной про-последовательности; сложные способы фолдинга, расщепления и очистки были предложены в прошлом, в частности, для NGF человека дикого типа. Примечательно, что в большинстве опубликованных исследований NGF применяется общий режим рефолдинга, ранее установленный Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, p. 3296-3303). В рамках этого оригинального исследования были подробно исследованы несколько параметров рефолдинга белка (например, температура, время рефолдинга, рН реакции рефолдинга, аргинин, глутатион и концентрация белка) и оценено их влияние на эффективность рефолдинга. Протокол Rattenholl et al. основан на ренатурации проформы, имеющей очень плохую растворимость, получаемой из телец включения после рекомбинантной продукции в прокариотах, где про-NGF солюбилизируется в растворе денатурирующего агента в денатурирующей концентрации, переносится в раствор, который не является денатурирующим или является слабо денатурирующим, так что растворимость сохраняется, а растворенный денатурированный про-NGF может принимать биологически активную конформацию, включая образование дисульфидных связей, как в нативном NGF, а затем NGF очищается и про-последовательность удаляется протеолитически (WO 2000/022119 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303). Примечательно, что в рамках этого исследования было обнаружено, что низкая концентрация белка приводит к более высокому удельному выходу правильно свернутого продукта по сравнению с более высокой концентрацией белка. Например, концентрации белка около 50 мг на литр реакции рефолдинга приводили к удельному выходу примерно 25% правильно свернутого pro NGF, в то время как эта фракция уменьшалась до 10% при концентрации белка 500 мг на литр. Исходя из этого, Раттенхолл и соавт. предполагают, что концентрация белка в растворе для рефолдинга должна быть очень низкой: согласно Rattenholl et al., на выходе ожидается 15-20 мг правильно свернутого белка на литр реакции рефолдинга. Однако это потребует масштабирования (например, за пределами лабораторного масштаба) для очистки даже нескольких сотен мг рекомбинантного белка.
В то время как про-NGF человека содержит нативный сайт расщепления для протеазы фурина (Arg1-Ser2-Lys3-Arg4; R1S2K3R4), и фурин расщепляет про-NGF в этом сайте in vivo, фурин недоступен в коммерчески значимой чистоте или количестве. Согласно настоящему изобретению, полипептид согласно настоящему изобретению при экспрессии вместе с пропоследовательностью, например, в E. coli предпочтительно расщепляется протеазой трипсином (EC 3.4.21.4), которая имеется в продаже. Действительно, сообщалось, что для NGF дикого типа трипсин дает удовлетворительный биологически активный зрелый NGF, который в конечном итоге может быть очищен (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303), а основанный на трипсине протеолиз рекомбинантно экспрессированного про-NGF был принят другими исследователями (например, D'Onofrio et al., 2011, PLoS One, vol. 6, e20839). Однако позже было показано, что расщепление про-NGF дикого типа трипсином с образованием бета-NGF сопряжено с несколькими недостатками, поскольку низкие количества трипсина приводят к неэффективному расщеплению, тогда как высокие количества трипсина еще больше снижают селективность расщепления, поскольку трипсин способен отщеплять с С-конца любой остаток аргинина и лизина (остаток R и K), так что при расщеплении R1S2K3R4--содержащего про-NGF трипсином можно получить несколько альтернативных продуктов расщепления; таким образом, использование трипсина в качестве расщепляющего фермента привело бы к очень низким выходам правильно расщепленного NGF, а также к проблемам с очисткой и выходом, поскольку различные продукты расщепления экономически невыгодно разделять в стандартных условиях. В качестве одного из решений было предложено экспрессировать вариант про-NGF, в котором сайт расщепления протеазой R1S2K3R4в пропептиде заменен по крайней мере в положениях R1 и К3, соответствующих положениям 101 и 103 последовательности человеческого про-NGF дикого типа (SEQ ID NO: 1) другой аминокислотой (WO 2013/092776 A1). В одном примере R1 и K3, соответственно, заменены валином (V) и аланином (A), превращая исходный сайт расщепления фурином R1S2K R1S2K3R4 в V1S2A3R4, где трипсин способен специфически расщеплять только C-конец R4; Опосредованное трипсином расщепление соответствующего про-NGF также можно назвать «методом VSAR». Хотя в WO 2013/092776 A1 ничего не говорится о полипептидах с SEQ ID NO: 3 или 4 в соответствии с настоящим изобретением, первоначально предполагалось, что метод VSAR применим к определенным вариантам мутеинов про-NGF, хотя сообщалось, что условия протеолиза необходимо подбирать с осторожностью (US 2018/0086805 A1). В ходе разработки настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что технология VSAR, вопреки более ранним предположениям, не решает удовлетворительным образом проблемы, связанные с рекомбинантным получением полипептида по настоящему изобретению с удовлетворительной чистотой. Действительно, очистка рекомбинантно экспрессированного бета-NGF или его мутеинов не только от белков клетки-хозяина (HCP), но также от трипсина (или другой протеазы, используемой для расщепления) все еще является проблемой; Само собой разумеется, требуется, чтобы протеолитический фермент (такой как трипсин) отсутствовал в конечном препарате фармацевтического белка, чтобы избежать протеолиза во время хранения полипептида, чтобы полипептид был по существу чистым и не обнаруживал продуктов деградации в момент введения его субъекту согласно настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения решили эту проблему, как описано здесь. Таким образом, настоящее изобретение делает полипептид с SEQ ID NO: 3 или 4 доступным с высокой чистотой и, таким образом, практически свободным от трипсина и/или продуктов деградации полипептида. Хотя некоторые способы получения NGF (например, WO2013092776 A1) и полипептида с SEQ ID NO: 4 (например, Malerba et al., 2015, PLOS One, vol. 10, e0136425) были описаны ранее, настоящее раскрытие неожиданно показывает, что ранее опубликованные способы недостаточны для получения соответствующего полипептида с высокой степенью чистоты. В качестве решения этих недостатков настоящее раскрытие предоставляет новый процесс и связанные с ним аспекты, как подробно описано здесь.
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 путем рекомбинантной экспрессии, например, в клетке-хозяине по настоящему изобретению может включать очистку. Очистка в самом широком смысле означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 отделяют от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Таким образом, очистка может включать отделение от одной или нескольких других молекул, включающих другие белки, такие как белки клетки-хозяина, протеазы (например, трипсин) и/или продукты деградации полипептида по изобретению.
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 по настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:
(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4,
(d) очистка,
где очистка на стадии (d) обычно включает очистку на стационарной фазе смешанного режима. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 может быть получен рекомбинантной экспрессией и очисткой, где очистка включает очистку на стационарной фазе смешанного режима. Термин «на стационарной фазе смешанного режима» следует понимать в широком смысле и означает, что смесь, содержащая полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из таковых вместе с другими молекулярными видами, подвергается воздействию стационарной фазы смешанного режима, например при хроматографии или другой подходящей технологической процедуре. Действительно, предпочтительно смесь, включающая полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из них, вместе с другими молекулярными видами, подвергают хроматографии, так что очистка на стадии (d) включает очистку с помощью хроматографии смешанного режима. Предпочтительно хроматография смешанного режима включает использование стационарной фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, и ароматическую и/или гидрофобную группу.
Очистка в самом широком смысле согласно настоящему изобретению означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 по крайней мере частично отделен от других молекулярных видов, включающих другие белки, такие как белки клетки-хозяина, предшественники и/или продукты распада. В результате можно получить полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, который по меньшей мере частично очищен. В то время как другие виды молекул могут быть необязательно удалены или сохранены, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предпочтительно получают и сохраняют в результате очистки.
Предпочтительно смешанная хроматография включает использование стационарной фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, и ароматическую группу и/или гидрофобную группу.
Каждый из этих этапов может сам включать в себя несколько действий, которые для простоты также можно назвать стадиями. Для иллюстрации и как подробно описано ниже, стадия (d) может включать более чем одну стадию очистки, например более чем на одной неподвижной фазе.
Любую букву или цифру, используемую здесь в отношении одного или нескольких этапов процесса, такую как, например, (a), (b), (c), (d), (d1), (d2) следует понимать не как ограничивающую, а скорее как справочную. Не следует думать, что последовательность событий в процессе или применении согласно настоящему изобретению может быть ограничена алфавитной последовательностью букв или числовой последовательностью цифр. Несмотря на вышеизложенное, настоятельно предпочтительно, чтобы последовательность событий в способе или применении согласно настоящему изобретению представляла собой описанную здесь последовательность.
Дополнительные аспекты смешанной хроматографии, особенно подходящие стационарные фазы, будут описаны более подробно ниже, но эти аспекты в целом применимы к настоящему изобретению. Таким образом, в частности, все те стационарные фазы, включая все их варианты осуществления, которые описаны ниже как особенно полезные для смешанной хроматографии на стадии (d2), обычно применимы для очистки полипептида SEQ ID NO: 3 и/или полипептида SEQ ID NO: 4 по настоящему изобретению, и таковые можно использовать во всех типах вариантов осуществления, например, в сочетании со стадией (d1) улавливающей хроматографии или без нее. Действительно, в Примере 2В описывается, что некоторые преимущества могут быть достигнуты за счет использования хроматографии смешанного режима в варианте протокола, соответствующему современному уровню техники.
Необязательно, полипептид с SEQ ID NO: 3 или полипептид с SEQ ID NO: 4 может быть получен в процессе, который включает (ре)фолдинг, и/или хроматографическую очистку, и/или расщепление протеазами, и, необязательно, доведение до конечной концентрации белка и/приготовление желаемой рецептуры.
Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 субъекту, нуждающемуся в этом, как описано в настоящем документе, также возможно благодаря промышленно приемлемым чистоте и выходу полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID. NO: 4, который доступен специалисту в данной области техники на основании раскрытия в данном документе. Таким образом, настоящее изобретение также описывает способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 по настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:
(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, например, путем рекомбинантной экспрессии,
(d) очистку, где очистка включает очистку на стационарной фазе смешанного режима.
В настоящем изобретении также предпочтительно, чтобы предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергался стадии
(c) воздействие протеазы.
Упомянутое воздействие обычно проводят перед стадией (d).
Способ по настоящему изобретению также предпочтительно характеризуется тем, что перед воздействием протеазы не проводят хроматографическую очистку. Действительно, настоящее описание (Примеры 1, 2) показывает, что расщепление протеазой работает хорошо и эффективно также в отношении неочищенной фракции, полученной из клетки-хозяина, т.е. когда перед стадией воздействием протеазы не проводилась хроматографическая очистка.
Предпочтительно стадия получения (а) включает экспрессию предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, предпочтительно рекомбинантную экспрессию. Более предпочтительно рекомбинантная экспрессия осуществляется в клетке-хозяине. После культивирования клетки-хозяина полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают из фракции клеточной культуры. Фракция может состоять из клеток-хозяев, т.е. в случае, если белок по существу не секретируется из клеток-хозяев. Это тот случай, например. когда полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 продуцируется в тельцах включения и/или иным образом во внутриклеточном компартменте, включая цитозоль. Подходящие клетки-хозяева могут быть выбраны из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, хотя в типичных вариантах осуществления предпочтительными являются прокариотические клетки-хозяева. Предпочтительные прокариотические клетки-хозяева включают Escherichia coli (E.coli), предпочтительно E.coli Rosetta (DE3). В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают в конформации, отличной от нативной конформации, и/или в агрегатах, наиболее предпочтительно в тельцах включения. Затем предпочтительно способ по настоящему изобретению включает стадию (b) (ре)фолдинга полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно стадию (c) проводят после стадии (b) .
Предпочтительно на стадии (c) протеаза представляет собой протеазу, способную расщеплять полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 таким образом, что образуется (зрелый) полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления указанная протеаза представляет собой трипсин, предпочтительно трипсин свиньи, необязательно экспрессируемый рекомбинантно.
Предпочтительно стадия очистки (d) включает следующие стадии, предпочтительно в последовательном порядке:
(d1) захват,
(d2) полировка.
Предпочтительно стадию захвата (d1) проводят хроматографией, предпочтительно колоночной хроматографией. Более предпочтительно указанную стадию захвата (d1) проводят с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии или стационарной фазы смешанной хроматографии (хроматографии смешанного режима). Еще более предпочтительно указанную стадию захвата (d1) проводят с использованием стационарной фазы смешанной хроматографии, которая предпочтительно представляет собой Capto MMC.
Стадию полировки (d2) предпочтительно проводят с помощью хроматографии, предпочтительно колоночной хроматографии. Более предпочтительно указанную стадию полировки проводят с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии. Еще более предпочтительно указанную стадию захвата (d1) проводят с использованием SP-сефарозы, предпочтительно SP-сефарозы с малым размером частиц. SP является сокращением от сульфопропила.
Необязательно способ по настоящему изобретению включает дополнительную стадию доведения до конечной концентрации белка и/или приготовления желаемого состава. В результате получается композиция согласно изобретению.
Другими словами, настоящее изобретение относится к хроматографии смешанного режима для получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Хроматографию смешанного режима можно использовать для получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В предпочтительных вариантах осуществления предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергают воздействию протеазы с целью расщепления, и хроматографию в смешанном режиме используют на стадии, следующей за воздействием протеазы. В предпочтительных вариантах осуществления хроматографическую очистку полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 не проводят до указанного воздействия протеазы.
Чистота полипептида
Полипептид по изобретению значительно или по существу свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. Полипептид по изобретению выделяют перед введением. В одном варианте осуществления «выделенный полипептид» относится к полипептиду, очищенному из клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, которая окружает его в природном состоянии, например, из клетки, в которой он был экспрессирован, например, в клетке-хозяине. В другом варианте осуществления «выделенный полипептид» относится к выделению и/или очистке полипептида in vitro, соответственно, из его естественной клеточной среды и из ассоциации с другими компонентами среды, в которой обычно находится полипептид.
Предпочтительно полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для применения в соответствии с настоящим изобретением практически не содержит примесей. Такой преимущественно чистый полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 можно получить, как описано в настоящем документе.
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в настоящем документе, рассматривается как фармацевтически активный пептид или белок.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид по настоящему изобретению получают по существу свободным от продуктов деградации указанного полипептида. В частности, настоящее раскрытие показывает, что, в отличие от сообщений данного уровня техники о NGF человека дикого типа, воздействие трипсина на предшественник SEQ ID NO: 4 по своей природе приводит к частичному отщеплению указанного предшественника C от аргинина на конце по остатку аргинину (Arg, R), остатку 9 SEQ ID NO: 4 либо до, либо после очистки, если очистка не полностью удаляет трипсин (вариант des-nona, данные не показаны). Конкретным способом очистки, предусмотренным в настоящем изобретении, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен по существу свободным от трипсина и/или варианта дез-нона.
Предпочтительно полипептид, получаемый, как описано выше, практически не содержит продуктов деградации полипептида. В частности, настоящее описание делает полипептид по изобретению доступным с новой, улучшенной степенью чистоты, и предпочтительно, чтобы полипептид был введен с такой высокой степенью чистоты. Предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 90%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 91%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 92%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 93%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 94%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 95%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 96%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 97%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 98%. Еще более предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 99%.
Наиболее предпочтительно полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты более 99,0%, например, степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4% %, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8% %, более 99,9%.
Здесь «степень чистоты» обычно относится к массе (w) в процентах полипептида по настоящему изобретению по отношению к массе (w) биологического материала, отличного от полипептида по настоящему изобретению. Для иллюстрации, как правило, при степени чистоты 99,0% полипептид по настоящему изобретению присутствует в относительном количестве (массе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), и сумма масс всех биологических материалов, отличных от полипептида по настоящему изобретению составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Такой биологический материал, отличный от полипептида по настоящему изобретению, включает, без ограничения таковыми, белки клетки-хозяина, нуклеиновые кислоты, протеазы, такие как, например, трипсин, инактивированный или активированный, продукты деградации полипептида по изобретению, и другие макромолекулы биологического происхождения. В конкретном варианте осуществления степень «чистоты» относится к степени чистоты по сравнению с полипептидами, отличными от полипептидов по изобретению. Для иллюстрации, в этом варианте осуществления при степени чистоты 99,0% полипептид по настоящему изобретению присутствует в относительном количестве (массе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), и сумма масс всех полипептидов, которые являются неидентичный полипептиду по настоящему изобретению, составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Продукты деградации полипептида по настоящему изобретению, во избежание сомнений, включены в «полипептиды, не идентичные полипептиду по настоящему изобретению». Конкретным продуктом деградации является вариант des-nona (см. Примеры 1 и 2).
В частности, практически свободный от des-nona вариант полипептида. Вариант des-nona представляет собой ранее не охарактеризованный продукт деградации полипептида по настоящему изобретению, возникающий при продукции определенных вариантов NGF, включая полипептид по настоящему изобретению, если полипептид не произведен новым способом, раскрытым в настоящем документе (см., например, Примеры 1 и 2). «Практически свободный» в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по отношению к варианту des-nona более 99,0%, например, степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%, все по отношению к варианту des-nona. В наиболее предпочтительном варианте вариант des-nona не обнаруживается и/или отсутствует.
Также предпочтительно, чтобы полипептид по настоящему изобретению по существу не содержал какой-либо протеазы (такой как трипсин). "Практически свободный" в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по отношению к сумме всех протеаз (включая трипсин) более 99,0%, например степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%, все значения даны по отношению к сумме всех протеаз (включая трипсин). В наиболее предпочтительном варианте осуществления трипсин не обнаруживается и/или отсутствует.
Такой высокий уровень чистоты в вышеописанных вариантах осуществления связан с улучшенной котировкой/приемлемостью для регулирующих органов и квалифицирует полипептид по настоящему изобретению как лекарственное средство для применения у млекопитающих, в частности, у людей. Таким образом, степень чистоты по настоящему изобретению впервые позволяет использовать этот полипептид для введения в глаз, включая глазное введение человеку, безопасным и надежным способом. Высокая степень чистоты в отношении протеазы (трипсина), в частности, позволяет хранить полипептид также в незамороженной форме.
Композиции
Далее будут описаны композиции, содержащие полипептид по настоящему изобретению. Такие композиции являются частью настоящего изобретения как сами по себе, так и в конкретном контексте применения для профилактики и/или лечения офтальмологических нарушений по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает как медицинское применение таких композиций, так и композиции как таковые.
В композициях по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента содержится полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Могут быть включены дополнительные ингредиенты.
В одном варианте осуществления полипептид содержится в водной среде. Указанная водная среда предназначена для введения субъекту-млекопитающему.
Конкретная водная композиция для применения согласно настоящему изобретению представляет собой жидкую композицию, пригодную для применения в виде глазных капель. Как правило, глазные капли представляют собой капли жидкости, подходящие для введения в глаз. Термин «глазные капли» конкретно не ограничен и обычно относится к композиции, как правило, водной жидкой композиции, которую можно вводить в глаз, не вызывая повреждения глаза. В целом, глазные капли имеют меньший риск побочных эффектов, чем, например, пероральные препараты или препараты для интравитреального введения. По этим и другим причинам глазные капли являются особенно предпочтительными.
Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид входит в состав композиции, подходящей для применения в виде глазных капель.
Указанные глазные капли предназначены для введения субъекту-млекопитающему. Глазные капли предназначены для глазного введения агента по настоящему изобретению. Предпочтительно глазные капли вводят местно в глаза.
Способы изготовления глазных капель известны в данной области техники. Без ограничения таковыми и только для иллюстрации способы изготовления глазных капель описаны в WO 2016/162812 A1.
В некоторых вариантах осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в настоящем документе, содержится в композиции, такой как композиция глазных капель, дополнительно включающей один или несколько носителей и/или один или несколько вспомогательных веществ. Используемый здесь термин «носитель» относится к органическому или неорганическому компоненту природного или синтетического происхождения, который смешивают с активным ингредиентом, чтобы сделать возможным, усилить или облегчить применение активного ингредиента. Используемый здесь термин «эксципиент» предназначен для обозначения всех веществ, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению и которые не являются такими активными ингредиентами.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере воду в качестве эксципиента. В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит водную среду, и более предпочтительно композиция по настоящему изобретению находится в форме водного раствора. В одном варианте осуществления полипептид содержится в водной среде, и эту водную среду вводят субъекту-млекопитающему. Водная среда может быть, например, водным раствором. Водные растворы и другие соответствующие композиции в некоторых вариантах осуществления могут быть получены непосредственно при очистке NGF в водной среде. Например, когда агент по настоящему изобретению получают из биологического источника путем очистки, соответствующие водные композиции могут быть получены непосредственно на последней стадии очистки, т.е. при элюировании с последней хроматографической колонки (обычно на этапе полировки) и/или фильтрация. В качестве альтернативы, соответствующие композиции доступны через дополнительную стадию доведения белка до конечной концентрации и/или получения желаемого состава. Такая дополнительная стадия может включать, например, стадию осветления или фильтрации, как описано здесь, и/или добавление одного или нескольких наполнителей и/или одного или нескольких носителей. Примеры композиций, полезных в настоящем изобретении, описаны здесь без ограничения таковыми.
Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в настоящем документе, может присутствовать в композиции, например, в фармацевтической композиции. Композиции, описанные в настоящем документе, предпочтительно являются стерильными и предпочтительно содержат полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 в качестве фармацевтически активного пептида или белка и, необязательно, дополнительные агенты, упомянутые или не упомянутые здесь. Композиции могут находиться в любом состоянии, т.е. могут быть жидкими, замороженными, лиофилизированными и др.
Композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать соли, буферные вещества, консерванты, носители, разбавители и/или эксципиенты, все из которых предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми. Термин «фармацевтически приемлемый» описывает нечто нетоксичное и/или не препятствующее действию активного ингредиента фармацевтической композиции.
Подходящие буферные вещества для использования в изобретении включают уксусную кислоту в виде соли, лимонную кислоту в виде соли, борную кислоту в виде соли и фосфорную кислоту в виде соли. Например, предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению, как результат различных аспектов настоящего изобретения мог быть получен в буфере, имеющем рН от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0. В одном варианте осуществления ацетатный буфер является подходящим буфером для таких целей и поэтому является особенно предпочтительным. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид по изобретению получен в ацетатном буфере, имеющем рН от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0. В частности, считается, что ацетатный буфер является оптимальным буфером для стабилизации NGF и его производных в диапазоне рН от 5,0 до 5,8.
Поскольку NGF и, вероятно, также полипептиды по настоящему изобретению чувствительны к окислению остатков метионина, метионин предпочтительно содержится в лекарственном препарате.
Настоящее изобретение дополнительно направлено на композицию, содержащую полипептид, выбранный из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4, где композиция характеризуется рН от 5,0 до 6,0 (предпочтительно рН 5,5) и включает следующее:
а) от 0,2 до 20 мг/мл указанного полипептида (предпочтительно 2 мг/мл),
b) от 5 до 100 мМ буфер ацетата натрия (предпочтительно 20 мМ),
c) от 5 до 100 мМ метионина (предпочтительно 20 мМ).
Таким образом, предпочтительно полипептид входит в состав композиции, включающей следующее:
а) от 0,2 до 20 мг/мл полипептида по настоящему изобретению,
b) от 5 до 100 мМ буфер ацетата натрия,
c) от 5 до 100 мМ метионина,
d) рН от 5,0 до 6,0.
Более предпочтительный диапазон рН составляет от 5,0 до 5,8.
Наиболее предпочтительно полипептид входит в состав композиции, включающей следующее:
а) 2 мг/мл указанного полипептида,
b) 20 мМ мМ буфера ацетата натрия,
c) 20 мМ метионина,
d) рН 5,5.
Другой предпочтительный состав по настоящему изобретению представляет собой следующее:
1 мг/мл полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4 (предпочтительно)
10 мМ буфер ацетата натрия
10 мМ метионин
154 мМ NaCl
0,1 мг/мл Полисорбат 80
рН 5,5
Предполагается, что эти и другие составы подходят в качестве лекарственного препарата для глазного применения.
Вышеуказанные композиции предпочтительно представляют собой глазные капли. Вышеупомянутые композиции предпочтительно представляют собой водные композиции.
Композиция (препарат) по настоящему изобретению может быть сохранена, без ограничений, в соответствии с одним или несколькими из следующих вариантов осуществления:
- Первый вариант осуществления: указанный выше состав можно хранить в замороженном виде при температуре -70°С (данные не показаны) и размораживать перед введением.
- Второй вариант: вышеуказанный состав можно хранить в холодильнике, предпочтительно при температуре от +2 до +8 градусов С (данные не представлены).
- Третий вариант осуществления: указанный выше состав можно подвергнуть сушке или лиофилизации, а затем хранить, например, в холодильнике. при комнатной температуре (данные не показаны). Состав можно восстановить перед введением.
Все приведенные выше варианты осуществления обеспечивают определенные преимущества для замораживания, например, при -20 градусов C, так как это позволяет избежать использования сухого льда, необходимости оттаивания и повторного смешивания после оттаивания и т. д. В таких вариантах осуществления состав по настоящему изобретению преодолевает определенные неудобства современных фармацевтических составов NGF, например, оксерват (ценегермин).
Пример особенно предпочтительной композиции для введения по настоящему изобретению представлен в Примере 3.
Подходящие консерванты для использования в композициях по настоящему изобретению включают консерванты, известные в данной области техники, среди которых для иллюстрации, но без ограничения таковыми, находятся бензиловый спирт, бензалконий и его соли, М-крезол, фенол, хлорбутанол, парабен и тимеросал. Эти и другие консерванты необязательно включаются в композицию по настоящему изобретению.
Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептиду SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для терапевтического применения, т.е. для применения в способе лечения организма человека или животного с помощью терапии. Терапия может включать профилактику и/или лечение состояния. Ввиду возможности терапевтического применения указанный полипептид также может называться фармацевтически активным белком или пептидом.
Необязательно введение по настоящему изобретению сопровождается введением по меньшей мере одного противомикробного агента, такого как антибиотик. Противомикробный агент может быть частью композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, или альтернативно может быть введен субъекту отдельно, в то же самое или другое место, тем же или другим путем введения.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в настоящем документе, подходит для различных целей, например, для терапевтических применений, как описано здесь.
Следующие примеры и фигуры предназначены для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения, который определяется формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ОБЩИЕ ДЛЯ НЕСКОЛЬКИХ ПРИМЕРОВ
Если не указано иное, следующие экспериментальные примеры конкретно относятся к полипептиду SEQ ID NO: 4, характеризующемуся по отношению к человеческому NGF дикого типа заменами P61S R100E (обозначается как «NGF P61S R100E», Malerba et al. PLOS One, 2015). , vol.10, e0136425, SEQ ID NO: 4), а также проформам такового и т.д. Полипептид SEQ ID NO: 4 также может называться «мутеином NGF», но следует иметь в виду, что терапевтическая пригодность, специфичная для этого белка, по данному изобретению и, как показано в экспериментальных примерах, особенно в Примере 4, заметно отличается от NGF человека дикого типа. Аналогичным образом, как описано в Примере 2, очистка полипептида SEQ ID NO 4 отличается от опубликованных протоколов очистки NGF дикого типа, и конкретный способ получения указанного полипептида по настоящему изобретению подходит для достижения высокой чистоты, в частности приводит к отсутствию варианта дез-нона и трипсина.
Полипептид SEQ ID NO: 4 был рекомбинантно экспрессирован как предшественник. С этой целью SEQ ID NO: 4 сливали с пропептидом NGF человека дикого типа (положения 1-121 SEQ ID NO: 1). Другими словами, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 состоял из предшественника NGF человека дикого типа (SEQ ID NO: 1), за исключением замен P61S R100E в зрелой части NGF человека дикого типа ( но, для ясности, отсутствуют 2 наиболее С-концевые аминокислоты SEQ ID NO: 1, которые не составляют часть полипептидной последовательности NGF человека дикого типа). Экспрессию проводили в E.coli Rosetta (DE3) (штамм: E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-hpro NGF P61S R100E) в виде нерастворимых телец включения.
Оборудование
Устройство | Инвентарь | Серийный N | Поставщик |
1 л биореакторы (включая датчики и насосы) | E023, E024 | 07462/09, 07463/09 | Sartorius Stedim |
Биореактор 10 л | E082 | - | Sartorius Stedim |
300 V Источник питания | E018; E019 | - | VWR |
Äkta Explorer100a | E011 | 001054 | GE Healthcare |
Äkta Explorer100a | E054 | 18111241 | GE Healthcare |
Автоклав Systec VX-120 | E050 | 2512 | Systec GmbH |
Центрифуга Galaxy 14D | E016 | 904090 | VWR |
Центрифуга Sorvall Evolution RC | F683 | - | Sorvall |
Чистый стол | E006 | 40970929 | Thermo Scientific |
Камера для электрофореза Novex Mini Cell | - | - | Invitrogen |
Гомогенизатор высокого давления APV 2000 | F688 | 5-07.791 | APV |
HPLC, 1100 Series | E053 | - | Agilent |
Магнитная мешалка MR Hei-Mix S | E013 | 30948231 | Heidolph |
Магнитная мешалка PC-620D | 686 | - | Corning |
pH-метр лабораторный pH720 | E017 | 9080718 | WTW |
Фотометр Genesys 10uv | E051 | 2L9Q013008 | Thermo Spectronics |
Пипетки | - | - | Hirschmann Laborgeräte |
Насос VL 1000 | F606 | 0208004 | Verder |
Весы | F651 | - | Sartorius |
Весы | E030 | W092934 | Kern |
Весы | E009 | - | Mettler |
Шейкер IKA KS 4000ic | E049 | - | IKA |
Вортекс | E012 | 40934086 | VWR |
Таблица 1 Список используемого оборудования.
Белковые параметры белков и пептидов, описанных в настоящем документе
Теоретические значения белковых параметров соответствующих белков были рассчитаны с помощью ExPASy ProtParam-Tool, который доступен по адресу http://web.expasy.org/protparam. Они показаны в Таблице 2 следующим образом:
Проформа SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 4 | Трипсин свиньи | |
MW мономер | 24.8 kDa | 13.23 kDa | 24.4 kDa |
pI | 9.7 | 8.2 | 7.0 |
ε | 25168 l/моль/см | 19668 l/моль/см | 34295 l/моль/см |
Таблица 2: Теоретически полученные свойства соответствующих белков/полипептидов
Аналитические методы
SDS-PAGE и вестерн-блот
SDS-PAGE и вестерн-блоты проводили с использованием стандартных процедур. Для SDS-PAGE 12% гели Bis-TRIS NuPAGE (Артикул № NP0342BOX от Thermo Fisher) использовали в восстановительных условиях при постоянном напряжении (175 В) в рабочем буфере NuPAGE MES (Article № NP0002 от Thermo Fisher). Первичное антитело для вестерн-блоттинга было приобретено у Santa Cruz Biotechnology (NGF (H-20) sc-548).
Аналитическая CEX-HPLC
CEX-HPLC выполняли с использованием ProPac SCX-10 от Dionex. Колонка работала с 50 мМ цитратным буфером, рН 5,5, со скоростью 1 мл/мин. Для элюирования добавляли 1 М NaCl (В) и осуществляли элюцию линейным градиентом в течение 50 минут от 0 до 100% В.
SE-HPLC
SE-HPLC выполняли с использованием Superdex 200 Increase 10/300 GL от GE Healthcare. Колонка работала в PBS. Продукт обнаруживали при 280 нм.
Эндотоксин, ДНК и HCP
Эндотоксин, ДНК и белки клетки-хозяина (HCP) определяли в соответствии со стандартными протоколами.
ПРИМЕР 1: ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДА SEQ ID NO: 4 В КАЧЕСТВЕ БЕЛКА-ПРЕКУРСОРА
Производственный штамм
Ген, кодирующий про-NGF, был клонирован в экспрессирующую плазмиду pET11a. Ген был получен из H.sapiens, и две точечные мутации (а именно, P61S и R100E) были введены в открытую рамку считывания. Затем химически компетентные клетки Rosetta (DE3) трансформировали экспрессионной плазмидой и отобрали одну колонию (полученный штамм был назван ШТАММ E5901 (=E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-pro NGF P61S R100E) NGF RCB C-151101)). Аликвоты хранили при температуре <-60°C в объеме 1,0 мл.
В Примере 1 описано развитие начального брожения на основе штамма E5901 STRAIN.
Оборудование
Устройство | Инвентарь | Серийный N | Поставщик |
Автоклав Systec VX-120 | E050 | 2512 | Systec GmbH |
Центрифуга Galaxy 14D | E016 | 904090 | VWR |
Центрифуга Sorvall Evolution RC | F683 | - | Sorvall |
Чистый стол | E006 | 40970929 | Thermo Scientific |
Магнитная мешалка MR Hei-Mix S | E013 | 30948231 | Heidolph |
Магнитная мешалка PC-620D | 686 | - | Corning |
pH-метр лабораторный pH720 | E017 | 9080718 | WTW |
Фотометр Genesys 10uv | E051 | 2L9Q013008 | Thermo Spectronics |
Пипетки | - | - | Hirschmann Laborgeräte |
Шейкер IKA KS 4000ic | E049 | - | IKA |
Гири Kern 572 | E030 | W092934 | Kern |
Гири Mettler AE160 | E009 | - | Mettler |
1 л биореакторы (включая датчики и насосы) | E023, E024 | 07462/09, 07463/09 | Sartorius Stedim |
Культуральная среда для роста клеток
Комплексная среда для ферментации
Комплексная среда, используемая для ферментации, состояла из: 49,3 г/л дрожжевого экстракта, 0,61 г/л MgSO4*7H2O, 0,5 г/л NH4Cl, 14,2 г/л K2HPO4*3H2O и 10 г/л глюкозы. Подпитка, используемая для этой ферментации, состояла из 263 г/л дрожжевого экстракта и 133 г/л глюкозы.
Минимальная среда (MM) для ферментации
Составляющие | MM I - Конечная конц. [мМ] | MM II - Конечная конц. [мМ] |
Хлорид алюминия, гексагидрат | N/A | 0.000063 |
Сульфат аммония | 39.4 | N/A |
Борная кислота | 0.005 | 0.000125 |
Кальция хлорид, дигидрат | 2 | 0.000875 |
Лимонная кислота, моногидрат | 25.2 | 10 |
Кобальт(II) хлорид, гексагидрат | N/A | 0.00075 |
Кобальта(II) сульфат, гептагидрат | 0.014 | N/A |
Медь(II) сульфат пентагидрат | 0.032 | 0.00425 |
Диаммонийфосфат | N/A | 35 |
Дикалийфосфат | N/A | 45 |
Гидрофосфат натрия | 7.5 | N/A |
Хлорное железо, гексагидрат | 0.37 | 0.17 |
Канамицин | 0.103 | 0.103 |
Сульфат магния, гептагидрат | 4 | 3 |
Марганца(II) сульфат, моногидрат | 0.142 | 0.00375 |
Полипропиленгликоль 2000 | N/A | N/A |
Хлорид калия | 53.6 | N/A |
Хлорид натрия | 8.5 | 40 |
Дигидрофосфат натрия, моногидрат | 31.9 | N/A |
Молибдат натрия дигидрат | 0.001 | 0.00005 |
Цинка сульфат, гептагидрат | 0.073 | 0.000375 |
Для периодической фазы (стадия роста периодической культуры) в обе основные среды добавляли 30 г/л глюкозы. Если не указано иное, подпитка имела тот же состав, что и соответствующая загрузочная среда, но содержало 300 г/л соответствующего источника углерода.
Чашки с LB-агаром с ампициллином и хлорамфениколом
Чашки с LB-агаром были свежезалиты. Среда состояла из 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 15 г/л агара. После автоклавирования в среду добавляли 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола.
Ферментация
Если не указано иное, ферментацию в этом Примере 1 проводили в 1 л стеклянных биореакторах с мешалкой, контролируемых установкой Biostat B от Sartorius. Как правило, pO2 поддерживали на уровне 30%, температуру культивирования устанавливали на уровне 37°C, а pH доводили до 7 с использованием 2 М фосфорной кислоты и 25% гидроксида аммония. Если не указано иное, за периодической фазой следовала экспоненциальная подача подпитки с F0=6 г/л/ч и μ=0,25/ч. Из практических соображений все экспоненциальные подпитки были аппроксимированы двумя линейными подпитками. Как правило, индукцию экспрессии продукта проводили путем добавления 1 мМ IPTG, и после индукции применяли постоянную скорость подачи подпитки 10 г/л/ч. Биомассу клеток собирали центрифугированием с использованием Sorvall Evolution RC от Thermo Scientific. Центрифугу снабдили ротором SLC-6000 и культуру центрифугировали при 8500 об/мин и 4°С в течение 30 мин.
Относительное количественное определение продукта в образцах биомассы
В заданные моменты времени образцы культур разбавляли до OD600, равной 10, и осаждали биомассу из 100 мкл аликвот этого разведения. Осадки ресуспендировали в 150 мкл (невосстанавливающего) буфера Лэммли и образцы кипятили в течение 5 мин. при 95°С. 10 мкл каждого образца анализировали на 10% геле Bis-Tris от Novex. Электрофоретическое разделение проводили в течение 90 мин при 125 В и гели окрашивали Кумасси. Очищенные гели сканировали и с помощью денситометрии количественно определяли содержание полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4. Чтобы дополнительно скорректировать изменчивость используемой биомассы, интенсивность полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, нормализовали до интенсивности белка домашнего хозяйства.
Относительное накопление продукта рассчитывали по увеличению полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, после и до индукции. Примечательно, что измеренное значение представляет собой конкретный выход (т.е. нормированный к OD600=10). Для абсолютного выхода данной ферментации необходимо учитывать фактическую плотность клеток (см. ниже).
Абсолютное количественное определение продукта в образцах биомассы
Стандарт для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 был получен из Европейского института исследования мозга (EBRI, Рим, Италия). Стандарт разводили до концентрации 65 мкг/мл в буфере Лэммли. Указанная концентрация белка была определена EBRI. Стандартную кривую строили с 260, 520, 780, 1040 и 1300 нг стандарта для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. Образцы анализировали на том же геле, что и стандартную кривую, и коэффициент разбавления образца учитывался при расчете абсолютного выхода продукта продукта в данный момент времени.
Резюме и выводы Примера 1
На основании вышеизложенного делается вывод, что производственный штамм (ШТАММ E5901, см. выше) был успешно использован для ферментации в масштабе 1 л. В то время как различные композиции сред оценивались на предмет их способности стимулировать рост бактерий и экспрессию продуктов, минимальная среда MM I с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта оказалась благоприятной с точки зрения выхода экспрессии и получаемой плотности клеток. Когда основную культуру культивировали с антибиотиками, или без них (ампициллин и хлорамфеникол, данные не представлены), с точки зрения образования продукта не наблюдалось существенных различий.
Пример 1 можно масштабировать для получения полипептида в промышленном масштабе.
ПРИМЕР 2: ОЧИСТКА В ЛАБОРАТОРНЫХ МАСШТАБАХ, СОЗДАНИЕ CAPTO MMC
Предшественник SEQ ID NO: 4, используемый в этом примере, был получен в тельцах включения, как описано в Примере 1.
Отправная точка для оптимизации с учетом современного уровня техники
Вначале было высказано предположение, что способ улучшенной очистки полипептида по настоящему изобретению мог бы, при отсутствии указаний на обратное, следовать основным принципам очистки NGF, как сообщалось ранее в литературе. Однако также имелось в виду, что для эффективного производства в больших масштабах следует рассмотреть варианты адаптации, подходящие для более позднего масштабирования. Таким образом, на основании Rattenholl et al. (выше), в WO 2013092776 A1 и других публикаций, было предположено, что полипептид с SEQ ID NO: 4 может быть также получен, по крайней мере, в процессе лабораторного масштаба через его проформу с использованием неспецифического расщепления с использованием трипсина и последующей очистки. Было высказано предположение, что таким образом может быть получен высокочистый зрелый полипептид SEQ ID NO: 4. Однако только посредством конкретных адаптаций и модификаций, описанных в этом примере, был получен высокочистый зрелый полипептид SEQ ID NO: 4. Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 4 нуждающемуся в этом субъекту возможно, в частности, именно ввиду высокой чистоты полипептида SEQ ID NO: 4, как описано в настоящем документе.
Оборудование для производства полипептида SEQ ID NO: 4
Устройство | Инвентарь | Серийный N | Поставщик |
1 л биореакторы (включая датчики и насосы) | E023, E024 | 07462/09, 07463/09 | Sartorius Stedim |
300 V Источник питания | E018; E019 | - | VWR |
Äkta Explorer100a | E011 | 001054 | GE Healthcare |
Äkta Explorer100a | E054 | 18111241 | GE Healthcare |
Автоклав Systec VX-120 | E050 | 2512 | Systec GmbH |
Центрифуга Galaxy 14D | E016 | 904090 | VWR |
Центрифуга Sorvall Evolution RC | F683 | - | Sorvall |
Чистый стол | E006 | 40970929 | Thermo Scientific |
Камера для электрофореза Novex Mini Cell | - | - | Invitrogen |
Гомогенизатор высокого давления APV 2000 | F688 | 5-07.791 | APV |
HPLC, 1100 Series | E053 | - | Agilent |
Магнтная мешалка MR Hei-Mix S | E013 | 30948231 | Heidolph |
Магнтная мешалка PC-620D | 686 | - | Corning |
pH-метр лабораторный pH720 | E017 | 9080718 | WTW |
Фотометр Genesys 10uv | E051 | 2L9Q013008 | Thermo Spectronics |
Пипетки | - | - | Hirschmann Laborgeräte |
Насос VL 1000 | F606 | 0208004 | Verder |
Весы | F651 | - | Sartorius |
Весы | E030 | W092934 | Kern |
Весы | E009 | - | Mettler |
Шейкер IKA KS 4000ic | E049 | - | IKA |
Вортекс | E012 | 40934086 | VWR |
Список оборудования, использованного в Примере 2.
Подробности производственного процесса в соответствии с этим Примером, включая усовершенствования, описанные в Примере 2В, приведены в обзоре процесса на Фиг. 1.
Если не указано иное, аналитические методы были такими же, как описано выше в разделе «Аналитические методы».
Пример 2А: очистка на основе ранее описанных протоколов.
Клетки E. coli, экспрессирующие предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 («биомасса»), получали, как описано в Примере 1, и далее клетки лизировали добавлением лизоцима с последующей обработкой ультразвуком на льду. Тельца включения («IB») (1) экстрагировали из клеток-хозяев и промывали 6% Triton X100 (в 1,5 М NaCl, 60 мМ EDTA) и (2) солюбилизировали в 6 М гуанидиний HCl («gHCl»), 0,1 М Трис-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA, 100 мМ (свежий) DTT. IB солюбилизировали в течение 2ч при комнатной температуре. После этого pH снижали до 3-4 добавлением 37% HCl. Полученный таким образом раствор, содержащий солюбилизированный предшественник предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 («солюбилизат»), подвергали диализу против 6 М gHCl (pH 3-4).
Рефолдинг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 проводили в 0,1 М трис-HCl, 1 М L-аргинина, 5 мМ EDTA, 0,61 г/л окисленного глутатиона и 1,53 г/л восстановленного глутатиона, рН 9,5 при +4°С. Поэтому каждый час добавляли 50 мкг белка на мл буфера для рефолдинга. После рефолдинга реакционную смесь диализовали против 50 мМ фосфата натрия, рН 7,0. При замене буфера происходило значительное осаждение.
Предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 очищали с помощью последовательной катионообменной хроматографии (SP Sepharose HP, работающей с 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюирующей градиентом NaCl) и последующей хроматографии гидрофобного взаимодействия (Phenyl Sepharose HP, обработанная 50 мМ фосфатом натрия, 1 М сульфатом аммония, pH 7,0). После этого был использован еще один диализ для замены буфера образца на 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0 (обратите внимание, что такой второй диализ, однако, можно исключить в процессе производства). И снова значительное количество продукта осаждалось в процессе снижения проводимости буфера.
Полученный таким образом предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 подвергали ограниченному протеолизу путем добавления 1 мг трипсина на 250 мг про-NGF. Воздействие протеазы на предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 проходило в течение 14 ч при 2-8°С.
Наконец, созревший NGF очищали на катионообменнике (SP Sepharose XL работала с 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюция проводилась градиентом NaCl). Наконец, продукт концентрировали до 0,5-1 мг/мл и замораживали при температуре <-65°C.
Пример 2B: Оптимизация
Далее описываются несколько вариантов оптимизации по сравнению с Примером 2А, которые были испытаны и реализованы в ходе разработки настоящего изобретения. Если контекст не диктует иное, все детали, которые не указаны явно, были такими, как описано выше для Примера 2А.
Оптимизация IB -солюбилизации
В то время как ранее сообщалось, что небольшие количества IB (например, полученные при встряхивании культур в колбах) легко растворяются в буфере для солюбилизации (6 М gHCl, 0,1 М Трис-HCL, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ (свежий) DTT), IB, полученные в результате ферментации с высокой плотностью клеток, не могли быть полностью растворены. Здесь эта проблема решена путем добавления 2 М мочевины к указанному солюбилизирующему буферу, что, как оказалось, значительно улучшает выход солюбилизации (данные не показаны). Во избежание сомнений 2 М мочевина присутствовала в дополнение к 6 М gHCl и другим ингредиентам.
Оптимизация рефолдинга
Было решено, первоначально на основании Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, p. 3296-3303; Rattenholl, 2001, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.), Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Germany)), и, что также важно, в расчете на более позднюю масштабируемость процесса, проводить рефолдинг с использованием от 200 до 500 мг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на литр реакции рефолдинга, предпочтительно от 200 до 300 мг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на литр реакции рефолдинга. Данная оптимизация приводит к относительно хорошему выходу солюбилизированного предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. В частности, важно принять во внимание, что при таком повышенном количестве NGF на объем реакции рефолдинга с учетом того, что реакция рефолдинга включает относительно дорогостоящие ингредиенты, такие как глутатион и аргинин, относительно большее количество предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, может подвергаться повторной укладке в расчете на объем реакции повторной укладки, что должно сделать повторную укладку экономически целесообразной, также и в производственных масштабах.
Очистка предшественника полипептида SEQ ID NO: 4
Очистку предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 после рефолдинга проводили с помощью подхода, который использует довольно высокую изоэлектрическую точку про-NGF и катионообменную стационарную фазу (а именно, SP-сефарозу) для очистки. Для проведения хроматографии этого типа по техническим причинам рефолдинговый буфер необходимо заменить буфером с низкой проводимостью. При этом осаждаются значительные количества предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 (данные не показаны). Этот факт можно объяснить снижением концентрации аргинина в буфере.
Вследствие этого были предприняты некоторые усилия по замене улавливающей колонки на другую (колонку с другой селективностью), которая могла бы быть более устойчивой к присутствию аргинина в реакции рефолдинга. При первой попытке сделать это была оценена производительность нескольких r стационарных фаз, но ни один из подходов не дал желаемых результатов (см. Таблицу 6). Поэтому стационарная фаза, используемая для колонки улавливания, сохранялась такой, какой она была определена в предыдущем процессе. Однако из-за высокой изоэлектрической точки (pI) предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 стало возможным увеличение проводимости рабочего буфера (путем добавления 250 мМ L-аргинина) без влияния на производительность. Благодаря этому повторно уложенный предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 стало возможным стабилизировать до определенной степени, а количество осажденного предшественника уменьшить (данные не представлены).
Потенциальный этап захвата | Краткое описание | Оценка |
Хроматография гидрофобного взаимодействия | Хроматография гидрофобного взаимодействия не чувствительна к проводимости и солевому составу загруженного образца. | Если к продукту, находящемуся в буфере для рефолдинга, добавляли сульфат аммония или хлорид натрия, белок сильно осаждался. Даже добавление небольшого количества сульфата аммония (до концентрации 0,25 М) приводило к выпадению осадка. Кроме того, добавление хлорида натрия было невозможно без провоцирования осаждения продукта. Следовательно, стадия захвата на основе фенил- или бутил-сефарозы невозможна. |
Смешанная хроматография | Capto MMC представляет собой смешанную стационарную фазу, сочетающую гидрофобные свойства со свойствами стационарной фазы для катионного обмена. Поскольку связывание опосредовано не только ионными взаимодействиями, эта стационарная фаза более солеустойчива, чем классическая стационарная катионообменная фаза. | В исходной настройке к фосфатному буферу с pH 5,5 добавляли 0,25 М L-аргинина, а элюцию облегчали градиентом NaCl. Однако при таком подходе не было извлечено значительных количеств продукта (предшественника). |
Эксклюзионная хроматография | Эксклюзионная хроматография имеет хорошее разрешение и не зависит от буфера для образцов. Типичное узкое место этого типа хроматографии (то есть ее ограниченная производительность) делает ее неприменимой, поскольку производится относительно небольшое количество продукта. | Хотя препаративная хроматограмма выглядела многообещающе, отделение предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 от примесей. Это может быть связано с существованием данного специфического прекурсора в виде полидисперсной смеси в исследованных условиях. |
Таблица выше: Альтернативные селективности, протестированные для захвата предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и их оценка.
Что касается хроматографии смешанного режима, то следует понимать, без ограничения какой-либо конкретной теорией, что предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 эффективно не элюируется при хроматографии смешанного режима, тогда как зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 элюируется эффективно.
Расщепление протеазой с получением зрелого NGF
Для производства полипептида SEQ ID NO: 4 протеаза (трипсин) необходима, поэтому было высказано предположение, что в идеале конкретный выбранный трипсин должен соответствовать следующим критериям:
1. Получен из рекомбинантного источника. Сертификация неживотного сырья имеет решающее значение для последующего соответствия процесса требованиям GMP.
2. Низкая побочная активность трипсина. Примечательно, что трипсин может подвергаться автолизу. Результатом этого процесса может быть так называемый псевдотрипсин, обладающий расширенным субстратным спектром и обладающий химотрипсиноподобной активностью. Ca2+ (например, 1 мМ CaCl2) может быть добавлен для уменьшения автолиза. Однако в настоящее время, как правило, «модифицированный трипсин» применяется для каждого протокола, что требует строгой специфичности последовательности (например, для пептидного фингерпринтинга). Этот модифицированный трипсин обычно получают путем ацилирования открытых ε-аминогрупп трипсиновых остатков лизина.
3. Низкая изменчивость от партии к партии для обеспечения воспроизводимого производственного процесса. В качестве альтернативы выбранный фермент должен поставляться с сертификатом, в котором указывается удельная активность соответствующей партии. Тогда необходимое количество фермента может основываться на активности, а не на массе фермента.
Несмотря на всесторонний поиск, на коммерческом рынке не было обнаружено ни одного препарата трипсина, удовлетворяющего обоим критериям 1 и 2. Было высказано предположение, что критерий 1 является наиболее важным. Для уменьшения автолиза может быть достаточно добавления CaCl2. В результате в качестве сырья для процесса был выбран рекомбинантный трипсин «класса GMP» от Roche (Roche 06369880103, Lot: 11534700). Последовательность этого фермента, который экспрессируется в Pichia pastoris, была получена от Sus scrofa. Согласно сертификату использованная партия трипсина имеет удельную активность 4997 ЕД/мг (определена по USP).
Пропуск второго этапа очистки перед трипсинизацией
В рамках начального скрининга в поисках оптимальных соотношений фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации использовали предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, полученный из колонки захвата (см. выше). В отличие от ранее установленного процесса (European Brain Research Institute (EBRI)), детали не опубликованы, основан на Rattenholl et al., выше) было решено не использовать дополнительную хроматографию гидрофобного взаимодействия перед трипсинизацией. Решение исключить такую вторую стадию очистки на колонке перед трипсинизацией было в основном основано на двух соображениях: с одной стороны, продукт, полученный после улавливания на колонке, уже был практически чистым в соответствии с SDS-PAGE. С другой стороны, сама трипсинизация может помочь улучшить профиль примесей за счет переваривания оставшихся белков клетки-хозяина (HCP).
В Таблице 7 представлена матрица условий процесса, проверенных в ходе первого раунда. Результаты трипсинизации исследовали в 12% SDS-PAGE (данные не представлены). Результаты (данные не показаны) показывают, что трипсинизация воспроизводимо дает стабильный полипептид с SEQ ID NO: 4 в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат (т.е. от 1 до 5 мкг трипсина на 375 мкг предшественника полипептида с SEQ ID NO: 4). Время переваривания не имеет большого значения. Следовательно, остановка реакции и время, необходимое для загрузки реакции в полирующую колонку, по-видимому, не является лимитирующим. Это открытие имеет особое значение, поскольку реакцию невозможно надлежащим образом или экономично погасить в препаративном масштабе.
Были проведены некоторые дополнительные эксперименты, чтобы уточнить оптимальное соотношение фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации, и было обнаружено, что при соотношении фермент/субстрат от 1/100 до 1/200 (вес белка/вес белка) хорошие выходы полипептид SEQ ID NO: 4, с одной стороны, и небольшое количество укороченных продуктов, с другой стороны, могут быть получены воспроизводимо. Следует отметить, что в используемых условиях (т.е. в фосфатно-аргининовом буфере (pH 7,0) при 2-8°C и инкубации (для воздействия протеазы) в течение от двух до шести часов) качество переваривания не сильно зависело от соотношения фермент/субстрат. Это открытие имеет особое значение, поскольку лежащее в основе ферментативное расщепление подвержено незначительным вариациям в экспериментальной установке (например, изменение активности трипсина из-за изменчивости фермента от партии к партии или условий хранения фермента; время и температура стадии инкубации (для воздействия протеазы); ошибки в определении концентрации белка). Более того, это также является причиной того, что расширенная тонкая настройка в малых масштабах для дальнейшего уменьшения потенциальных продуктов усечения не имеет смысла. Если «оптимальные» условия будут определены в небольшом масштабе, все еще есть хорошие шансы получить продукт со слегка измененной структурой в следующий раз, когда фактически то же самое переваривание будет повторено в большем масштабе.
Полирующая хроматография с целью получения чистого полипептида после трипсинизации
В отличие от ранее установленного процесса (Европейский институт исследования мозга (EBRI), детали не опубликованы, основан на Rattenholl et al., см. выше), в котором использовалась стационарная фаза SP-сефарозы для полировки зрелого полипептида (примечание: SP-сефароза представляет собой катионообменую стационарную фазу), здесь искали более подходящую стационарную фазу, исходя из следующих соображений: для эффективной загрузки в колонку с SP-сефарозой необходимо снижение проводимости раствора, содержащего предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, например, при буферном обмене. Однако известно (например, Пример 2А), что снижение ионной силы раствора действительно приводит к осаждению молекулы-мишени, и поэтому следует избегать замены буфера на буфер с низкой электропроводностью. Кроме того, катионообменная стационарная фаза уже использовалась для захвата предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и ортогональная селективность предпочтительна для достижения лучшего отделения оставшихся примесей. Третий и последний аргумент против использования стационарной фазы SP для очистки реакции трипсинизации заключается в том, что потенциально остающийся предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 будет связываться с этой колонкой и может быть отделен от зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 просто по селективности элюирования, а не по селективности связывания.
Для создания такой ортогональной полирующей колонки для очистки зрелого полипептида SEQ ID NO: 4, в первую очередь предполагалось использовать колонку гидрофобного взаимодействия (HIC). Эта стационарная фаза была выбрана не только из-за ортогональной селективности, но и потому, что в данном случае нет необходимости в замене буфера на буфер с низкой электропроводностью. Несмотря на испытания нескольких стационарных фаз и условий HIC (например, фенил- и бутил-сефарозы, работающих с 1 M M (NH4)2SO4 и 0.5 M (NH4)2SO4 соответственно), не удалось реализовать удовлетворительную стадию полировки на основе HIC (данные не показаны).
Тем не менее, в еще одной экспериментальной установке для этапа полировки была протестирована хроматография смешанный режим с неподвижной фазой Capto MMC, которая могла быть успешно реализована. Было обнаружено, что при оптимизированных условиях стационарная фаза обратимо связывается с полипептидом SEQ ID NO: 4, и продукт можно элюировать при повышении рН (данные не показаны). Напротив, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 необратимо связывается со стационарной фазой и может быть элюирован только при использовании 1М NaOH в качестве подвижной фазы (данные не показаны). Кроме того, можно было показать, что трипсин вообще не связывается с колонкой, работающей в тех же условиях (данные не показаны). Эти результаты ясно свидетельствуют о том, что стационарная фаза Capto MMC способна эффективно отделять зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 от трипсина и оставшегося предшественника полипептида SEQ ID NO: 4.
Введение дополнительной мембранной хроматографии
Для дальнейшего истощения эндотоксинов и ДНК в процесс была включена дополнительная анионообменная мембрана. В целом, как известно, мембранная хроматография характеризуется тем, что раствор, содержащий компонент, подлежащий анализу или очистке (в данном случае полипептид SEQ ID NO: 4), пропускают над или сквозь мембрану, которая, как правило, заряжена. С этой целью в данном случае STIC-мембрана (Sartorius, Goettingen, Germany) была включена в положения, указанные на Фиг. 1. Было показано, что полипептид SEQ ID NO: 4 не связывается с мембраной, и, таким образом, было представлено доказательство того, что мембранная хроматография подходит для очистки полипептида SEQ ID NO: 4. Для иллюстрации включения опции в полный процесс, включающий мембранную хроматографию, см. Фиг. 1.
Воспроизводимость процесса по Примеру 2
Для проверки стабильности процесса, процесс проводили пять раз, и полученные фракции анализировали в отношении их выхода и чистоты. На протяжении этих прогонов проводилась постоянная оптимизация деталей процесса, а состав буфера, градиенты и т. д. сохранялись до тех пор, пока не были установлены окончательные оптимизированные детали процесса (см. Фиг. 1). Результаты показывают, что в лабораторных условиях приблизительно от 50 до 100 мг полипептида SEQ ID NO: 4 можно получить в результате одного последовательного производственного цикла. Примечательно, что полученный продукт постоянно обнаруживается с помощью электрофореза в SDS полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси или серебром, как относительно чистый (имеющий менее пяти процентов загрязняющих белков клетки-хозяина и только следы усеченного NGF, данные не показаны).
Для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 не удалось разработать значимый метод SE-HPLC. Напротив, анализ SE-HPLC для зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 был простым и привел к гомогенному пику продукта приблизительно 16 кДа, что соответствует мономерному состоянию полипептида SEQ ID NO: 4n (данные не показаны).
Резюме и выводы
Для этого процесса повторно уложенный предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 был захвачен с использованием SP Sepharose FF ("FF" означает Fast Flow, т.е. стационарню фазу с относительно крупными частицами) и впоследствии обработан трипсином для получения зрелого NGF. Для этой цели концентрацию аргинина в реакции рефолдинга снижали с 1М (как рекомендовано в предшествующем уровне техники) до 350 мМ.
Контроль протеолитического расщепления предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 с получением зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 считается наиболее важным фактором процесса. Здесь были идентифицированы условия для воспроизводимого облегчения расщепления с высокой эффективностью, с одной стороны, и предотвращения образования продуктов деградации NGF, с другой. Приведенные здесь экспериментальные данные показали, что потенциально надежный производственный процесс может быть установлен в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат. Для стадии трипсинизации выходы, по-видимому, будут хорошими, и на этой стадии процесса не ожидается значительных потерь. Полученный профиль продукта, по-видимому, не сильно зависит от используемых условий реакции (с точки зрения соотношения фермент/субстрат и времени инкубации (времени воздействия протеазы). Примечательно, что даже если ожидается хороший выход при полировки фермента, все равно необходимо обработать по меньшей мере 2х грамма полипептида с SEQ ID NO: 4, чтобы получить x грамм зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.
Очистка продукта в соответствии с этим примером представляет собой обедненный процесс, состоящий только из двух стадий хроматографической очистки. Существующий процесс очистки был дополнительно оптимизирован, и некоторые аспекты были адаптированы для масштабирования (см. Фиг. 1). Например, ранее использовавшиеся методы разрушения клеток могут быть заменены гомогенизацией под высоким давлением, а все стадии диализа могут быть заменены фильтрацией с тангенциальным потоком. Установленный таким образом способ позволяет доставлять полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой степенью чистоты.
Несмотря на названные проблемы, в целом процесс способен обеспечить получение продукта приемлемого качества. В частности, способ дает полипептид SEQ ID NO: 4 в состоянии, которое по существу не содержит продуктов деградации полипептида, в частности, по существу не содержит варианта полипептида des-nona. Таким образом, процесс дает полипептид высокой чистоты.
Полный процесс, включающий усовершенствования в соответствии с Примером 2, включая мембранную хроматографию, схематически изображен на фиг. 1.
Пример 2 может быть масштабирован для получения полипептида в промышленном масштабе.
Пример 3: Приготовление состава по настоящему изобретению
Состав, содержащий полипептид SEQ ID NO: 4, предварительно полученный в соответствии с Примером 2, был приготовлен с учетом предложений of Eng et al., 1997, Anal. Chem., vol. 69, p. 4184-4190
В частности, приготовленный состав имеет следующий состав:
2 мг/мл полипептида в соответствии с SEQ ID NO: 4, полученного, как описано в Примере 2.
20 мМ буфер ацетата натрия
20 мМ метионина
рН 5,5
В частности, считается, что ацетат является подходящим буфером для стабилизации NGF и его производных в диапазоне рН от 5,0 до 5,8. Поскольку NGF и, вероятно, также полипептиды по настоящему изобретению чувствительны к окислению остатков метионина, метионин включен в состав.
Следующие варианты осуществления работают, среди прочего, для сохранения состава:
- Первый вариант осуществления: указанный выше состав можно хранить в замороженном виде при температуре -70°С (данные не показаны) и размораживать перед введением.
- Второй вариант: вышеуказанный состав можно хранить в холодильнике, предпочтительно при температуре от +2 до +8 градусов С (данные не представлены).
- Третий вариант осуществления: указанный выше состав можно подвергнуть сушке или лиофилизации, а затем хранить, например, в холодильнике. при комнатной температуре (данные не показаны). Состав можно восстановить перед введением.
Все приведенные выше варианты осуществления обеспечивают определенные преимущества замораживания, например, при -20 градусов C, так как это позволяет избежать использования сухого льда, необходимости оттаивания и повторного смешивания после оттаивания и т. д. В таких вариантах осуществления состав по настоящему изобретению не имеет определенных неудобств современных фармацевтических составов NGF, например, оксерват (ценегермин).
Пример 4: Доказательство концепции на млекопитающих, отличных от человека
Целью этого примера является исследование эффективности полипептида SEQ ID NO: 4 для лечения и/или профилактики офтальмологических расстройств у животных, отличных от человека.
Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с животными моделями.
В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, отличным от человека. Полипептид с SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой степенью чистоты экспрессией, как описано в Примере 1, и очисткой, как описано в Примере 2. Таковой готовили, как описано в Примере 3.
Материал и методы
Модель раздавливания зрительного нерва (ONC)
Крыс (Sprague Dawley, самцы, 180-200 г, Charles River, Италия) содержали в виварии с регулируемой температурой и влажностью (12-часовой цикл темнота/свет, свободный доступ к пище и воде). Поведенческие эксперименты проводились в тихой комнате с контролируемой температурой (от 20 до 22°C) с 9 до 17 часов. оператором, не осведомленным о статусе лечения/обработки.
Для проведения раздавливания зрительного нерва (ONC) крыс анестезировали смесью кетамина и ксилазина (90 мг/кг и 3 мг/кг соответственно, внутрибрюшинно, i.p) и доступ к зрительному нерву осуществлялся через разрез конъюнктивы височно вокруг глаз. Левый зрительный нерв раздавливали на расстоянии 1 мм от диска зрительного нерва в течение 10 секунд, применяя постоянную и последовательную силу с помощью перекрестных щипцов. Все процедуры проводились на левом глазу в асептических условиях. ONC индуцировали в левом экспериментальном глазу, тогда как правый глаз служил внутренним контролем. До и после процедуры осуществляли осмотр глазного дна через операционный микроскоп для оценки целостности ретинального кровотока.
В первой экспериментальной установке сетчатку рассекали на 4, 7 и 14 день после ONC и проводили иммунодетекцию ганглиозных клеток сетчатки для оценки динамики повреждения сетчатки во времени. Нетронутые и необработанные контралатеральные правые глаза использовали в качестве контроля для ONC-индуцированной потери ганглиозных клеток сетчатки. День 7 после проведения ONC был выбран в качестве оптимального момента времени для начального исследования действия полипептида SEQ ID NO: 4, поскольку присутствовало приблизительно 50% популяции ганглиозных клеток сетчатки.
Крыс подвергали лечению лекарственным средством путем интравитреальной инъекции и путем применения глазных капель в соответствии со схемой неотложной терапии для исследования эффекта полипептида SEQ ID NO: 4 в экспериментальных условиях, которые потенциально могли бы быть перенесены в клинические учереждения, включающей:
обработку раствором носителя или полипептида SEQ ID NO: 4: 20, 2, 0,2 мкг/мл; интравитреальное введение 2 мкл, начиная с 4-го дня после травмы и продолжая до 7-го дня.
обработку носителем или полипептидом SEQ ID NO: 4: раствор 200 мкг/мл; объем 25 мкл глазных капель, начиная с 4-го дня после травмы и продолжая до 7-го дня, один, два или три раза в день.
После лечения сетчатку вырезали и проводили иммунодетекцию ганглиозных клеток сетчатки для количественной оценки повреждения сетчатки и эффекта различных обработок полипептидом SEQ ID NO: 4.
Иммуногистохимия
Срезы сетчатки постфиксировали в формалине на 24 часа и заливали в парафин. Некоторые срезы, фиксированные формалином и залитые парафином (5 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического исследования. Остальные срезы подвергали депарафинизации и регидратации путем последовательной инкубации в ксилоле и растворах этанола нисходящего ряда (100%, 90% и 70%). Извлечение антигена осуществляли путем обработки срезов в микроволновой печи в 10 мМ цитратном буфере (pH 6,0) в течение 5 минут. Срезы инкубировали с первичными антителами (Brn3a, 1:500 и RBPMS 1:500) в течение 1 часа во влажной камере. Затем срезы инкубировали с предварительно разведенными биотинилированными вторичными антителами кролика против IgG мыши или с биотинилированными вторичными антителами против морских свинок (1:200, #BA-7000, Vector Laboratories, Burlingame, US), 30 минут при комнатной температуре и в растворе авидин-биотинового комплекса (#PK-7200, Vectastain Elite ABC-HRP Kit, Vector Laboratories, Burlingame, US) в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем срезы переносили на пероксидазный субстрат (#K3468, ImmPACT DAB, Vector Laboratories, Burlingame, US) на 4-6 минут для реакции проявления хромогена и промывали в дистиллированной воде перед монтажом. Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Ткани визуализировали и цифровые изображения получали с помощью оптического микроскопа Leica DM2500 (Leica Microsystems, Milan, Italy).
После отбора иммунопозитивных клеток при малом увеличении количественное определение общего числа клеток, клеток Brn3a+ и RBPMS+ проводили в боксах 7-104 мкм2 при большом увеличении (HPF, X400, Leica Microsystem). Для каждой крысы анализировали 3 разных среза для каждого глаза.
Данные (среднее значение±стандартная ошибка (SEM)) сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным сравнением с использованием поправки Бонферрони. GraphPad Prism (version 5.00, La Jolla, USA) использовался для всех анализов, и значение P < 0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
У крыс, подвергнутых интравитреальному лечению носителем, начиная с 4-го дня после ONC, в соответствии с данными, полученными во время настройки модели, снижение количества ганглиозных клеток сетчатки наблюдалось около 60%. Полипептид SEQ ID NO: 4, введенный интравитреально в 3 различных дозах (20, 2, 0,2 мкг/мл раствора; объем инъекции 2 мкл), оказывал дозозависимое защитное действие на гибель ганглиозных клеток сетчатки, которое достигало статистической значимости у крыс, получавших интравитреальную инъекцию раствора 20 мкг/мл. В этой группе количество ганглиозных клеток сетчатки в глазу, подвергнутом ONC, было таким же, как и в здоровом контралатеральном глазу (Фиг. 3).
Кроме того, в группах крыс, подвергавшихся лечению глазными каплями ONC и носителя, начиная с 4-го дня после травмы, потеря ганглиозных клеток сетчатки была наложена на потерю, определяемую количественно на этапе настройки модели и в эксперименте по оценке действия полипептида SEQ ID NO: 4 после интравитреальной инъекции. Реанимационный лечебный эффект глазных капель полипептида SEQ ID NO: 4 (200 мкг/мл) исследовали при применении 3 различных схем лечения: один, два или три раза в день. Полученные данные показывают значительно более высокую биологическую активность раствора 200 мкг/мл, принимаемого три раза в день, при этом тенденция к эффективности также очевидна после введения один раз и два раза в день (Фиг. 4).
Вывод: Реанимационные эффекты полипептида SEQ ID NO: 4 при введении через четыре дня после повреждения зрительного нерва совершенно неожиданны и открывают возможность того, что соединение может быть эффективным для функционального восстановления пациентов с поражением зрительного нерва и другими нарушениями сетчатки при травматических повреждениях, или при ишемических, воспалительных, метаболических или неопластических причинах, когда потеря RGC является частью патологического процесса.
Пример 5: Сравнение полипептида SEQ ID NO: 2 с полипептидом SEQ ID NO: 4 в отношении индукции ноцицептивного поведения и лицевой аллодинии после глазного введения мышам
Целью этого примера является исследование эффективности полипептида SEQ ID NO: 4 для лечения и/или профилактики офтальмологических расстройств у животных, отличных от человека.
Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с животными моделями.
В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, отличным от человека. Полипептид с SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой степенью чистоты экспрессией, как описано в Примере 1, и очисткой, как описано в Примере 2. Таковой готовили, как описано в Примере 3.
Цели этого примера:
1. В данном примере проводится сравнение алгогенной активности полипептида SEQ ID NO: 4 по отношению к NGF человека дикого типа (полипептид SEQ ID NO: 2) и NGF мыши дикого типа (mNGF) после глазного закапывания мыши в модели сужения/констрикции подглазничного нерва (CION).
2. Эффект аналога NGF (полипептид SEQ ID NO: 4) будет оцениваться путем измерения способности такового индуцировать острые ноцицептивные реакции после закапывания в глаз по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 2, mNGF и эталонным раздражающим соединением капсаицином, который, как известно, вызвает ноцицептивную реакцию. Испытывали следующие дозы: 0,5, 1, 5 и 10 мкг в 5 мкл/глаз, разведенные в изотоническом растворе (NaCl 0,9%). Капсаицин был протестирован в концентрации 0,001-0,5 нмоль/5 мкл/глаз.
3. Затем было проверено влияние подпороговых доз различных соединений на способность индуцировать ноцицептивную реакцию после закапывания в глаза в модели констрикции подглазничного нерва (CION).
Материалы и методы
Мышиный NGF (мышиный NGF, mNGF)
Мышиный NGF представлял собой нативный мышиный NGF 2.5S высокой чистоты (>95%), и был получен экстракцией с очисткой из подчелюстных желез мыши в соответствии со способом, описанным Bocchini et al., 1969, Pro.c Natl. Acad. Sci. U S A, vol. 64, p. 787-794. mNGF состоит из остатков 129-241 полипептидной последовательности UniProt P01139.
Модели ноцицепции
in vivo
Эксперименты на животных проведены в соответствии с рекомендациями Европейского Союза (ЕС) по процедурам ухода за животными и применением итальянского законодательства (DLgs 26/2014) Директивы ЕС 2010/63/ЕС. Исследования проведены в соответствии с разрешением Университета Флоренции № 194/2015-PR. Мыши C57BL/6 (самцы, 25-30г, Envigo, Милан, Италия) использованы для ноцицептивных тестов. Животные размещены в виварии с контролируемой температурой и влажностью (12-часовой цикл темноты/света, свободный доступ к пище и воде). Поведенческие эксперименты проводились в тихой комнате с контролируемой температурой (от 20 до 22°C) с 9:00 до 17:00. оператором, не осведомленном о статусе лечения.
Констрикция подглазничного нерва (CION)
CION будет выполняться на мышах C57BL/6, как сообщалось (Vos et al., 1994, J. Neurosci., vol. 14, p. 2708-2723; Luiz et al., 2010, Neuropeptides, vol. 44, p. 87). -92) Вкратце, мышей анестезируют внутрибрюшинной (в/б) инъекцией смеси кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (3 мг/кг) и делают надрез на коже левой верхней губы сбоку от носа и рострального конца подглазничного нерва. Затем две слабо стягивающие лигатуры (шелковая нить № 6/0). ture) будет располагаться вокруг подглазничного нерва на расстоянии 2 мм. При имитационной процедуре левый подглазничный нерв обнажается, но не перевязывается. На рану наносят неомицина сульфат и сульфатиазол (порошок, 0,05 г и 9,95 г соответственно; Boehringer Ingelheim Italia S.p.A, Italy), а разрез зашивают. Мышей контролируют, адекватно регидратируют и поддерживают при контролируемой температуре (37°C) до полного восстановления после анестезии. Весь эксперимент проводится на 10-й день после операции. В конце экспериментов животных усыпляют вдыханием CO2 плюс 10-50% O2.
Анализ протирания глаз у мышей
Закапывание в глаза (5 мкл) испытуемых соединений, полипептида SEQ ID NO: 4, полипептида SEQ ID NO: 2, mNGF (все, 0,5, 1, 5 и 10 мкг в 5 мкл/глаз) и капсаицина (0,5 нмоль /5 мкл/глаз) или соответствующих носителей таковых (изотонический солевой раствор, 0,9% NaCl и 1% диметилсульфоксид, DMSO) будет использоваться для индукции острого ноцицептивного ответа, как описано ранее (De Petrocellis et al., 2010, Pharmacol. Res., vol. 63, p. 294-299). Мыши будут помещены индивидуально в камеру из плексигласа и будут акклиматизированы в течение 20 минут до индукции стимула. Количество протирающих глаз движений после закапывания лекарственного средства в глаз будет регистрироваться в течение 5-минутного периода времени и рассматриваться как показатель жгучести.
На 10-й день после CION или ложной/иммитационной процедуры мышам будут закапывать в глаз (5 мкл/глаз) подпороговые дозы полипептида SEQ ID NO: 2, mNGF и полипептида SEQ ID NO: 4 или капсаицина и будет измеряться ноцицептивная реакция.
Результаты
В первой части примера испытывали разные дозы (0,001-0,5 нмоль) капсаицина, вводимые путем закапывания в глаз (5 мкл/капля глаз), на способность таковых индуцировать острую ноцицептивную реакцию, измеряемую как количество протираний глаз в 5-минутный период времени. Капсаицин индуцировал дозозависимую ноцицептивную реакцию, о чем свидетельствовало усиление реакции протирания глаз, измеренное после закапывания капсаицина в глаза (0,001-0,5 нмоль/5 мкл/глаз) (Фиг. 5).
Затем оценивали различные дозы (0,001-5 мкг 5 мкл/глаз) NGF мыши (mNGF), NGF человека (полипептид с SEQ ID NO: 2) и полипептида с SEQ ID NO: 4). Все соединения вызывали дозозависимое усиление ноцицептивной реакции, измеряемой как количество протираний глаз после нанесения в глаз. Применение полипептида SEQ ID NO: 2 показало большую эффективность в отношении индукции ноцицептивного ответа по сравнению с mNGF и, что более важно, по сравнению с мутированной формой полипептида SEQ ID NO: 2 (Фиг. 6).
Затем оценивали эффект подпороговой дозы различных соединений в модели сужения.констрикции подглазничного нерва (CION). Модель CION индуцировала сенсибилизацию к дальнейшим ноцицептивным стимулам (Trevisan et al., 2016, Brain, 139 (Pt 5), p.1361-1377).
На 10-й день после CION или ложной процедуры мышам вводили в глаза подпороговую дозу капсаицина (0,001 нмоль/5 мкл/глаз), mNGF (0,001 нмоль/5 мкл/глаз), полипептида SEQ ID NO: 2 (0,001 нмоль /5 мкл/глаз) и полипептида SEQ ID NO: 4 (0,001 нмоль/5 мкл/глаз) для измерения ноцицептивной реакции протирания глаз.
Данные показали, что в сенсибилизированной модели (модель CION) ноцицептивные реакции, вызванные подпороговой дозой капсаицина, вызывали более интенсивный ответ у мышей, оперированных CION, чем у мышей, подвергшихся ложной операции (Фиг. 7). Такие же результаты были получены, когда mNGF и полипептид SEQ ID NO: 2 закапывали в глаза мышам, оперированным CION. Закапывание в глаза полипептида SEQ ID NO: 4 не вызывало усиления ноцицептивного ответа.
Пример 6: Применение для лечения или профилактики офтальмологических расстройств у людей
Целью этого примера является дальнейшее подтверждение эффективности полипептида SEQ ID NO: 4 для лечения и/или профилактики офтальмологических расстройств у людей.
Подходящие дозы полипептида могут быть определены специалистом в данной области техники на основании приведенных здесь указаний.
Авторы изобретения предлагают использовать для людей те же концентрации, которые оказались эффективными для крыс с повреждением зрительного нерва (для глазных капель 200 мкг/мл три раза в день), в частности, для местного применения. Наиболее предпочтительным является конъюнктивальное введение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1: Схема процесса согласно Примеру 2, включая усовершенствования, описанные в Примере 2B.
Фиг. 2: Полипептидные последовательности. Звездочка (*)=положение 61 в зрелом NGF человека; крест (+): положение 100 в зрелом NGF человека.
A: SEQ ID NO: 1: последовательность pre-pro NGF человека, кодируемая соответствующей открытой рамкой считывания человека.
Препептид: позиции аминокислот 1-18; пропептид: положения аминокислот 19-121; зрелый NGF: положения аминокислот 122-239; С-концевой дипептид: положения аминокислот 240-241.
Дисульфидные связи (в правильно свернутой зрелой части): связывание позиций аминокислот 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231.
Сайт расщепления фурином (RSKR): положения аминокислот 118-121.
B: Схематический обзор препептида, пропептида и зрелого NGF.
C: SEQ ID NO: 2: последовательность зрелого NGF человека.
D: SEQ ID NO: 3
E: SEQ ID NO: 4
Фиг. 3: ЭФФЕКТ ПОЛИПЕПТИДА SEQ ID NO: 4 ("CHF 6467") ПОСЛЕ ИНТРАВИТРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ONE-WAY-ANOVA С ПОСЛЕДУЮЩИМ АПОСТ-АНАЛИЗОМ БОНФЕРРОНИ. N=6/ГРУППА.
Фиг. 4: ЭФФЕКТ ПОЛИПЕПТИДА SEQ ID NO: 4 ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫМИ КАПЛЯМИ. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ONE-WAY-ANOVA С ПОСЛЕДУЮЩИМ АПОСТ-АНАЛИЗОМ БОНФЕРРОНИ. N=3/ГРУППА (ДОПОЛНИТЕЛЬНО СМ. ПРИМЕР 4).
Фиг. 5: Дозозависимая реакция протирания глаз, вызванная закапыванием в глаза (5 мкл/глазная капля) капсаицина (0,001-0,5 нмоль) у мышей C57BL/6. Столбики погрешностей указывают среднее значение ± SEM (стандартная ошибка), 6-8 мышей в группе. Veh обозначает носитель CPS. *P<0,05, ***P<0,001 vs, Veh. One-way ANOVA анализ с апостериорной коррекцией Бонферрони.
Фиг. 6: Дозозависимая реакция вытирания глаз, вызванная закапыванием в глаз (5 мкл/глазная капля) NGF мыши (mNGF), полипептида SEQ ID NO: 2 ("человеческий NGF") и полипептида SEQ ID NO: 4 («мутированный NGF») (0,001-0,5 нмоль) у мышей C57BL/6. Столбики погрешностей указывают среднее значение ± SEM (стандартная ошибка, 6-8 мышей в группе. Veh является носителем mNGF, полипептида SEQ ID NO: 2 и полипептида SEQ ID NO: 4. *P<0,05, ***P<0,001 vs, Veh. One-way ANOVA анализ с апостериорной коррекцией Бонферрони.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Чайзи Фармасьютичи S.p.A.
<120> Агент для использования при лечении или профилактике
офтальмологических заболеваний
<130> D411P2
<140>
<141>
<150>
<151>
<150>
<151>
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 241
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Последовательность pre-pro NGF человека, кодируемая
соответствующей открытой рамкой чтения человека
<400> 1
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala
<210> 2
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> SEQ ID NO: 2: Последовательность зрелого NGF человека
<400> 2
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<210> 3
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная Последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO: 3
<400> 3
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<210> 4
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная Последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO: 4
<400> 4
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<---
Claims (35)
1. Применение полипептида SEQ ID NO: 4 в лечении и/или профилактике офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, где офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение ганглиозных клеток сетчатки.
2. Применение по п.1, где субъектом-млекопитающим является человек.
3. Применение по любому из предшествующих пунктов для введения в глаз.
4. Применение по п.3, где введение выбрано из группы, состоящей из местного введения в глаз и интравитреального введения, при этом местное введение является предпочтительным.
5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где полипептид вводят многократно.
6. Применение по п.5, где полипептид вводят многократно, по меньшей мере три раза в день.
7. Применение по п.5 или 6, где полипептид вводят многократно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней.
8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где полипептид вводят после повреждения зрительного нерва.
9. Применение по п.8, где полипептид вводят по меньшей мере через четыре дня после повреждения зрительного нерва.
10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где офтальмологическое расстройство включает по меньшей мере одно расстройство, выбранное из группы, состоящей из глаукомы, нейротрофического кератита, неврита зрительного нерва, атрофии зрительного нерва, друз диска зрительного нерва и глиомы зрительного пути.
11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где доза/каждая доза составляет от 0,3 до 30 мкг полипептида на глаз, более предпочтительно от 1 до 10 мкг полипептида на глаз и наиболее предпочтительно 5 мкг полипептида на глаз.
12. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лечение и/или профилактика не вызывают гипералгезии у субъекта-млекопитающего.
13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где полипептид содержится в водной среде, и водную среду вводят субъекту-млекопитающему.
14. Применение по п.13, где указанный полипептид входит в состав композиции, включающей:
а) от 0,2 до 20 мг/мл указанного полипептида,
b) от 5 до 100 мМ буфер ацетата натрия,
c) от 5 до 100 мМ метионина,
d) рН от 5,0 до 6,0.
15. Применение по п.13, где указанный полипептид входит в состав композиции, включающей:
а) 2 мг/мл указанного полипептида,
b) 20 мМ буфер ацетата натрия,
c) 20 мМ метионина,
d) рН 5,5.
16. Применение по любому из предшествующих пунктов, где полипептид по существу не содержит продуктов деградации полипептида, в частности, по существу не содержит варианта полипептида des-nona.
17. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный полипептид может быть получен рекомбинантной экспрессией и очисткой, при этом очистка включает очистку на стационарной фазе смешанного режима.
18. Композиция для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, содержащая полипептид SEQ ID NO: 4, где композиция характеризуется pH от 5,0 до 6,0 и содержит:
a) от 0,2 до 20 мг/мл указанного полипептида,
b) от 5 до 100 мМ буфер ацетата натрия,
c) от 5 до 100 мМ метионина,
при этом офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение ганглиозных клеток сетчатки.
19. Композиция для лечения и/или профилактики офтальмологического расстройства у субъекта-млекопитающего, содержащая полипептид SEQ ID NO: 4, где композиция характеризуется pH 5,5 и содержит:
a) 2 мг/мл указанного полипептида,
b) 20 мМ буфер ацетата натрия,
c) 20 мМ метионина,
при этом офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение зрительного нерва или где офтальмологическое расстройство включает повреждение и/или нарушение ганглиозных клеток сетчатки.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP19197687.7 | 2019-09-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2812055C1 true RU2812055C1 (ru) | 2024-01-22 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008006893A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Lay Line Genomics S.P.A. | Muteins of hngf, therapeutic uses and pharmaceutical compositions |
RU2674148C2 (ru) * | 2013-04-30 | 2018-12-05 | Юниверсити Оф Саузерн Калифорния | Ускоренное заживление повреждений глаз с помощью ангиотензиновых пептидов |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008006893A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Lay Line Genomics S.P.A. | Muteins of hngf, therapeutic uses and pharmaceutical compositions |
RU2674148C2 (ru) * | 2013-04-30 | 2018-12-05 | Юниверсити Оф Саузерн Калифорния | Ускоренное заживление повреждений глаз с помощью ангиотензиновых пептидов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Malerba F, Paoletti F, Bruni Ercole B, Materazzi S, Nassini R, Coppi E, Patacchini R, Capsoni S, Lamba D, Cattaneo A. Functional Characterization of Human ProNGF and NGF Mutants: Identification of NGF P61SR100E as a "Painless" Lead Investigational Candidate for Therapeutic Applications. PLoS One. 2015 Sep 15; 10(9):e0136425. doi: 10.1371/journal.pone.0136425. PMID: 26371475; PMCID: PMC4570711. Eng M, Ling V, Briggs JA, Souza K, Canova-Davis E, Powell MF, De Young LR. Formulation development and primary degradation pathways for recombinant human nerve growth factor. Anal Chem. 1997 Oct 15; 69(20):4184-90. doi: 10.1021/ac9704016. PMID: 9337594. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11471539B2 (en) | Genetic construct | |
Wang et al. | A thermo-responsive protein treatment for dry eyes | |
IL256243A (en) | Methods and preparations for treating conditions related to aging | |
KR20170120703A (ko) | 프로톡신-ii 변이체 및 사용 방법 | |
KR20170134542A (ko) | 프로톡신-ii 변이체 및 사용 방법 | |
US20220401517A1 (en) | Agent for use in treatment or prevention of ophthalmic disorders | |
US20220064243A1 (en) | Agent for treatment of dermatological disorders | |
RU2812055C1 (ru) | Агент для использования при лечении или профилактике офтальмологических расстройств | |
JP2023515916A (ja) | 神経損傷及び関連障害を治療するための方法 | |
CN111905103A (zh) | 一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法和药物 | |
US20230272023A1 (en) | Ngf variants, production, compositions, and therapeutic uses | |
RU2799211C2 (ru) | Средство для лечения дерматологических заболеваний | |
WO2022204331A1 (en) | Compositions comprising branched kgf-2 derived peptides and methods for use in ocular treatment | |
US20220088139A1 (en) | Nerve growth factor mutant | |
WO2020228681A1 (zh) | 一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法和药物 |