PT1279677E

PT1279677E - Péptidos miméticos de gd 3

Info

Publication number: PT1279677E
Application number: PT01921990T
Authority: PT
Inventors: Dai Ishikawa; Koichi Ogino; Takao Taki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2007-06-12
Also published as: CY1108570T1; US7341994B2; EP1279677A4; WO2001081371A1; DE60127113D1; EP1279677A1; US20080125374A1; US20060058226A1; AU2001248822A1; EP1279677B1; ES2283399T3; ATE356140T1; DK1279677T3; DE60127113T2; EP1616875A1; US8017584B2

Description

ΕΡ 1 279 677 /PT DESCRIÇÃO "Péptidos miméticos de GD3"

Campo técnico 0 presente invento refere-se a péptidos miméticos de GD3 e mais particularmente a novos péptidos que se considera que mimetizam estruturalmente GD3, que são conhecidos como antigénios associados a tumores encontrados em tumores tais como melanoma.

Arte anterior

GD3 é uma forma de sialosilesfingoglicolípidos; G significa gangliósido (sialosilesfingoglicolípido) e D significa di-sialo. Sabe-se que GD3, tal como outros antigénios associados a tumores tais como GM2, GM3, GD2 e GT3, é expresso em células tumorais tais como as de melanoma humano. Representa-se a fórmula estrutural de GD3 por NeuAc a2-8 NeuAc a2-3 Gal β1—4 Glc βΐ—1 Cer.

Relatos anteriores relativos a GD3 revelaram, entre outras definições, que o desenvolvimento de um tumor se correlaciona com a expressão de GD3, que GD3 é fortemente expresso em células de melanoma e que a administração de anticorpo monoclonal de ratinho anti-GD3 suprime o crescimento de tumores em doentes de melanoma. Com base nestas revelações, GD3 tornou-se de grande interesse em imunoterapia destes tipos de tumores.

Assim, é de esperar que a resposta imunitária humana contra GD3 proporcione efeitos benéficos durante o decorrer clinico das condições patológicas; de facto, efectuaram-se vários ensaios clínicos no campo técnico das vacinas. Contudo, ainda não foram relatados resultados bem sucedidos que cumpram a expectativa anterior (consultar, por exemplo, Cheresh, D.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 81, 5767-5771 (1984):

Herlyn, M., et al., Câncer Res., 45, 5670-5676 (1985):

Houghton, A.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 82, 1242-1246 (1985): Livingston, P.O., Immunological Rev., 145, 2

ΕΡ 1 279 677 /PT 147-163 (1995): Livingston, P.O., et al., Câncer Immunol.

Immunother., 45, 1-9 (1997)).

Os gangliósidos, que se tem revelado estarem associados com tumores, são assim conhecidos como servindo como um alvo útil no ataque imunológico contra o cancro. Contudo, reconhece-se que têm pouca imunogenicidade.

De modo a ultrapassar esta limitação desenvolveu-se e revelou-se uma composição de vacina contra o cancro para induzir ou estimular a resposta imunológica de anticorpos contra gangliósidos (pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 8-53366). Esta composição é um produto glicosilado em N de gangliósido (ou seja, N-glicosil-GM3).

De igual modo, a patente U.S. n.° 5 102 663 revela um produto de gangliósido acetilado em 9-0 (GD3 9-0-acetilado).

Além disso, a publicação japonesa Kohyo n.° 8-508978 revela que uma vacina contra o cancro semelhante, vacina de complexo de GD3 (complexo GD3-hemocianina de lapa Fissurella) apresenta respostas de anticorpo significativamente melhoradas. De acordo com a revelação nesta publicação, as ligações duplas no esqueleto de ceramida de GD3 são clivadas com ozono para modificação química introduzindo assim um grupo aldeído e provoca-se ligação do grupo aldeído ao grupo aminolisilo da proteína através de aminação redutora para assim construir um complexo com um péptido multi-antigénico sintetizado que apresenta repetições de epítopos de célula T de malária, proteína de invólucro de Neisseria meningitidis (OMP), albumina de soro bovino cationizada (BSAc), hemocianina de lapa Fissurella (KLH) e polilisina. Aquela publicação também descreve que o adjuvante mais eficaz imunologicamente é QS-21, obtido através de extracção da casca de uma árvore encontrada na América do Sul e denominada Quillajasaponaria Molina (Aquila Pharmaceuticals, Worcester, Massachusetts, E.U.A.: Kensil, C.R. et al., J. Immunol., 146, 431 (1991)).

As vacinas convencionais preparadas através da utilização de GD3 por si só como antigénio apresentam apenas respostas imunológicas fracas e os seus efeitos são transitórios. Além disso, têm inconvenientes dado que o material de partida de 3

ΕΡ 1 279 677 /PT GD3 não se encontra facilmente disponível. Ou seja, de um modo geral, a produção em massa de um gangliósido pretendido a partir de um organismo vivo é muito difícil. Igualmente, a síntese de um gangliósido através de síntese química ou engenharia genética é muito difícil.

Quando se preparam vacinas através de várias modificações químicas de GD3, nomeadamente em tratamento químico efectuado para melhorar a antigenicidade ou na preparação de complexos, encontram-se desvantagens em termos de procedimento complicado relativamente a aprovisionamento, preparação, síntese, etc. de materiais de partida para antigénios e complexos e à necessidade de selecção de imunoadjuvantes.

Entretanto, em anos recentes, têm sido utilizadas técnicas de biologia molecular nos campos técnicos dos sacáridos complexos e encontram-se presentemente em desenvolvimento técnicas para substituir a cadeia de açúcares por péptido. Anteriormente, os presentes inventores obtiveram com sucesso, a partir de uma biblioteca peptídica aleatória de exibição em fagos através de ciclos de selecção ("biopanning") utilizando um anticorpo monoclonal contra uma cadeia de açúcares, um péptido que apresenta ligação específica a um anticorpo contra uma forma de gangliósido, GDla.

Verificou-se que este péptido (15 mero) mimetiza a estrutura da cadeia de açúcares de um glicolípido complexo (e consequentemente denomina-se um péptido glico-réplica), liga-se com especificidade a um anticorpo monoclonal contra glicolípido GDla e inibe a ligação de um anticorpo ao antigénio GDla.

Os presentes inventores produziram igualmente este péptido através de síntese química e confirmaram que o péptido reage com um anticorpo monoclonal para GDla, que um péptido réplica de GDla (sintetizado quimicamente) inibe a adesão celular de células de cancro de linhas celulares de cancro altamente metastáticas e que o péptido réplica inibe a metástase de células de cancro (pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 10-237099). 4

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Adicionalmente, os presentes inventores foram bem sucedidos na obtenção, a partir de uma biblioteca de péptidos aleatória, de um péptido que apresenta modulação da actividade de glicosidase e reage com especificidade com um anticorpo contra lactotetraosilceramida ou lactoneotetrasilceramida (consultar pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 10-237099 e Saibo Kogaku, Dai Ishikawa e Takao

Taki, 16 (12) 1821-1828 (1997)).

Um relatório recentemente publicado revela estudos semelhantes aos descritos acima obtidos pelos presentes inventores. Especificamente, Qiu, J., et al. revelaram em Hybridoma 18(1) 103-112 (1999) que um péptido 15-16 mero contendo uma sequência Trp-Arg-Tyr e obtido de uma biblioteca de péptidos de exibição em fagos através da utilização de um anticorpo contra um antigénio GD2/GD3, apresenta reacção cruzada com o anticorpo. willers, J., et al. descrevem que obtiveram, a partir de duas bibliotecas de péptidos de exibição em fagos, com fagos apresentando péptidos 15 mero e 8 mero, quatro péptidos apresentados por fagos capazes de se ligarem a anticorpos monoclonais anti-GD3, MB3.6, MG22 e MG21 (Peptides, 20, 1021-1026 (1999)). De acordo com esta publicação, verificou-se que esses péptidos apresentavam a capacidade de se ligarem a um anticorpo anti-GD3 utilizado para selecção e esta capacidade de ligação foi inibida por GD3, mas a imunogenicidade pretendida não foi observada para nenhum dos péptidos.

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar um novo péptido que mimetiza a estrutura da cadeia de açúcares do gangliósido GD3 e apresenta afinidade elevada para o anticorpo anti-GD3.

Constitui outro objectivo do presente invento proporcionar um péptido imunogénico capaz de produzir um anticorpo especifico de GD3; nomeadamente, um péptido apresentando uma caracteristica especifica tal como anticorpo produzido através de imunização com um imunogénio incluindo um péptido que apresenta reacção cruzada com GD3 e consequentemente tem utilidade como uma vacina que substitui GD3. 5

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Constitui ainda outro objectivo do presente invento proporcionar uma sequência de ADN que codifica para o péptido supramencionado, um vector de expressão recombinante no qual a sequência tenha sido inteqrada, uma célula hospedeira portadora do vector e um produto de expressão recombinante produzido pela célula.

Constitui ainda outro objectivo do presente invento proporcionar uma composição farmacêutica contendo como ingrediente activo o péptido supramencionado ou o vector de expressão recombinante.

Revelação do invento

Os presentes inventores efectuaram estudos extensivos e determinaram uma sequência de aminoácidos nova apresentando elevada afinidade para com um anticorpo anti-GD3. Os inventores também verificaram que um anti-soro obtido através de imunização com um péptido mimético de GD3 incluindo um péptido contendo a sequência de aminoácidos que apresenta reactividade cruzada com GD3 e péptido mimético de GD3 tem utilidade como uma vacina que substitui GD3. 0 presente invento foi obtido com base nestas determinações.

Consequentemente, o presente invento proporciona um péptido mimético de GD3 contendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos dela derivada tal como definido na reivindicação 1. 0 péptido mimético de GD3 apresenta especificidade de ligação a um anticorpo anti-GD3.

Nomeadamente, o presente invento proporciona um péptido mimético de GD3 que está numa forma fundida de péptido -fundido com uma proteina transportadora capaz de aumentar a imunogenicidade - e o péptido mimético de GD3, em que a proteina transportadora é hemocianina de lapa Físsurella; um péptido mimético de GD3 multi-antigénico contendo pelo menos uma espécie do péptido mimético de GD3; um péptido mimético de GD3 imunogénico apresentando a capacidade de produzir um anticorpo especifico de GD3; e um péptido mimético de GD3 apresentando uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:4. 6

ΕΡ 1 279 677 /PT Ο presente invento também proporciona uma composição farmacêutica contendo, como ingrediente activo, o péptido mimético de GD3. 0 presente invento abrange, entre outras, as seguintes concretizações: (1) uma sequência de ADN que codifica o péptido mimético de GD3 do presente invento, nomeadamente uma sequência de ADN que codifica uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:4; (2) uma sequência de ADN como descrito acima, apresentando uma sequência de ADN representada por SEQ ID NO:8; (3) um vector de expressão recombinante no qual se introduziu pelo menos uma destas sequências de ADN; (4) uma célula hospedeira na qual se incorporou o vector de expressão recombinante anterior; (5) uma composição farmacêutica contendo, como ingrediente activo, o vector de expressão recombinante; (6) utilização da composição farmacêutica do presente invento como uma vacina para estimular a indução de um anticorpo capaz de reconhecer GD3 ou para aumentar a produção do anticorpo; (7) utilização da composição farmacêutica do presente invento como um fármaco para suprimir um tumor ou cancro ou para inibir metástases cancerosas; e (8) uma composição farmacêutica que é uma preparação de fármaco em lipossomas. 0 fármaco pode ser utilizado para tratar tumores ou cancro que expressam GD3, nomeadamente condições patológicas seleccionadas do grupo que consiste de melanoma, cancro do intestino grosso, cancro do ovário, cancro de figado, cancro da mama, tumor cerebral, cancro do rim, cancro do pâncreas, cancro cervical, cancro do esófago, cancro do pulmão e cancro do estômago; e

Tal como aqui se utilizam, as abreviaturas para aminoácidos, péptidos, sequências de nucleótidos, ácidos nucleicos, etc. estão de acordo com os padrões IUPAC; padrões 7

ΕΡ 1 279 677 /PT IUB; "Guidelines for Drafting Specifications or Similar Materials Containing a Nucleotide Sequence or na Amino Acid Sequence", (editado pelo Instituto de Patentes Japonês); e símbolos habitualmente utilizados na arte.

Descrição sucinta dos desenhos A figura 1 é um gráfico que mostra a afinidade de ligação, tal como determinada através do método descrito em relação ao exemplo 2, dos péptidos imunogénicos de acordo com o presente invento e o anticorpo anti-GD3. A figura 2 apresenta sequências de péptidos multi-antigénicos utilizados no exemplo 5. A figura 3 é um gráfico que apresenta a afinidade de ligação de péptidos miméticos de GD3 e anticorpo monoclonal anti-GD3. A figura 4 é um gráfico que apresenta o efeito de inibição exercido por péptidos miméticos de GD3 imobilizados, contra a ligação entre GD3 e 4F6 (anticorpo anti-GD3). A figura 5 é um gráfico que apresenta o efeito de inibição exercido por péptidos miméticos de GD3 adicionados externamente, contra a ligação entre GD3 e 4F6. A figura 6 é um gráfico que apresenta o efeito de inibição exercido por péptidos miméticos de GD3 (nove resíduos) adicionados externamente, contra a ligação entre GD3 e 4F6. A figura 7 é um gráfico que apresenta a relação entre o factor de diluição de amostras de soro de ratinhos imunizados com péptido R4 e os resultados de ELISA com GD3. A figura 8 é um gráfico que apresenta a relação entre o factor de diluição de amostras de soro de ratinhos imunizados com R4MAP durante dois meses e os resultados de ELISA com GD3. A figura 9 é um gráfico que apresenta a relação entre o factor de diluição de amostras de soro de ratinhos imunizados com R4MAP durante dois meses e resultados de ELISA efectuados com o péptido R4MAP.

Melhores modos para levar o invento à prática

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento serão seguidamente descritos em detalhe.

Os péptidos miméticos de GD3 do invento são capazes de se ligarem a um anticorpo para GD3 (anticorpo anti-GD3) com especificidade. São adicionalmente aqui descritos péptidos miméticos de GD3 caracterizados por conterem uma sequência de 8 ΕΡ 1 279 677 /PT aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID N0:1 a 3 ou uma sequência de aminoácidos delas derivadas por substituição, deleção, adição ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e que é capaz de se ligar a um anticorpo contra GD3 (anticorpo anti-GD3) com especificidade.

Tal como aqui se utiliza, "anticorpo anti-GD3" é uma expressão geralmente utilizada na arte e é definida como um anticorpo específico capaz de reconhecer GD3 (ou seja, ligação a GD3). 0 anticorpo não apresenta de preferência reactividade cruzada com outros gangliósidos relacionados com GD3 e é nomeadamente, de preferência, um anticorpo monoclonal. A sequência de aminoácidos representada por qualquer umas das SEQ ID N0:1 a 4 é caracterizada por mimetizar a estrutura da cadeia de açúcares de GD3. Assim, um péptido contendo a sequência de aminoácidos apresentando ligação especifica a um anticorpo anti-GD3, é um exemplo preferível dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. A sequência de aminoácidos especifica mencionada acima pode ser uma sequência de aminoácidos derivada através de modificação de uma parte dos resíduos de aminoácido ou uma parte da sequência, desde que a característica estrutural; ou seja, a mimetização da estrutura da cadeia de açúcares de GD3, seja mantida ou apresentada. Não se impõe qualquer limitação especifica à extensão e posição da modificação (ou seja, substituição, deleção, adição ou inserção) da sequência de aminoácidos, desde que a sequência de aminoácidos modificada seja um equivalente em termos de efeito e apresente características semelhantes às da sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID N0:1 a 4; ou seja, a mimetização da estrutura da cadeia de açúcares de GD3 seja mantida ou apresentada. A modificação pode ser geralmente efectuada numa extensão de 80% ou mais homologia, de preferência 90% ou mais homologia.

Entre estes péptidos um péptido apresentando pelo menos dois resíduos de cisteína; por exemplo, um péptido 9

ΕΡ 1 279 677 /PT apresentando uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:2, considera-se que cicliza espontaneamente. Tal péptido ciclico é activo (apresenta ligação especifica a um anticorpo anti-GD3) mesmo quando o péptido se encontra presente numa forma de cadeia linear. Consequentemente, um ou ambos os resíduos de cisteina incluídos no péptido ou numa parte da sequência de aminoácidos compreendida entre esses dois resíduos de cisteina podem ser eliminados sem afectar grandemente as características estruturais de mimetização da estrutura da cadeia de açúcares de GD3. Este fenómeno é apoiado pela literatura (por exemplo, Koivunen, et al., J. Biol. Chem., 268, 20205-20210 (1993)).

Constituem exemplos da sequência de aminoácidos eliminada supramencionada, entre outras, uma sequência de nove resíduos de aminoácido (PHFDSLLYP) presente no terminal N de GD3R2.

Qualquer um dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento é formado por um péptido contendo uma das sequências de aminoácidos específicas supramencionadas abrangidas pelo âmbito do presente invento. Assim, a característica estrutural; ou seja, a mimetização da estrutura da cadeia de açúcares de GD3, é mantida ou apresentada e o péptido mimético de GD3 é caracterizado por ligação específica a um anticorpo anti-GD3.

Do ponto de vista da imunogenicidade e outras propriedades, os péptidos supramencionados contendo qualquer uma das sequências de aminoácidos específicas têm um número de resíduos de aminoácido de pelo menos 5, de preferência 8 a 60, com maior preferência 8 a 30, ainda com maior preferência 10 a 20.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento de preferência têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4. Alternativamente, os péptidos miméticos de GD3 de preferência têm uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4 por substituição, deleção, adição ou inserção de um resíduo de aminoácido. 10

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Com maior preferência, os péptidos miméticos de GD3 do presente invento são péptidos imunogénicos que são capazes de produzir um anticorpo especifico de GD3. Noutras palavras, os péptidos podem induzir um anticorpo específico de GD3.

Os péptidos miméticos de GD3, que se caracterizam por conterem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NO:l a 4, por si só têm a capacidade de produzir anticorpo específico de GD3 e consequentemente tais péptidos são preferidos como péptidos imunogénicos do presente invento.

Os péptidos imunogénicos do presente invento também abrangem péptidos que passaram a apresentar uma imunogenicidade pretendida através de transformação em formas de imunogenicidade aumentada, assim como péptidos das formas de imunogenicidade aumentada.

Assim, os péptidos imunogénicos que apresentam a capacidade de produzir um anticorpo específico de GD3, em que os péptidos são concretizações preferidas do presente invento, abrangem os péptidos não modificados por si só e formas de imunogenicidade aumentada dos péptidos miméticos de GD3 tais como uma forma de um péptido fundido com uma proteína transportadora habitual para aumentar a imunogenicidade e uma forma de um péptido multi-antigénico, estando estas duas formas abrangidas pelo âmbito do presente invento.

Pode confirmar-se se os péptidos miméticos de GD3 do presente invento mantêm ou apresentam a característica estrutural de mimetização da estrutura da cadeia de açúcares de GD3 (ou seja, apresentam ligação específica a um anticorpo anti-GD3) verificando a reactividade com o anticorpo anti-GD3 através de um método de ensaio de rotina. Adicionalmente, pode confirmar-se se os péptidos miméticos de GD3 do presente invento são péptidos imunogénicos apresentando a capacidade de produzir um anticorpo específico de GD3 verificando, através de um método de ensaio de rotina, a reactividade cruzada de anticorpos induzidos com GD3. A detecção da especificidade de ligação dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento a um anticorpo monoclonal 11

ΕΡ 1 279 677 /PT anti-GD3 e a reactividade de GD3 com um anticorpo induzido por um péptido imunogénico serão especificamente descritas nos exemplos descritos adiante.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento abrangem as seguintes concretizações. (a) um péptido mimético de GD3 incluindo um péptido contendo uma sequência de aminoácidos formada através da fusão ou ligação de uma variedade de membros de pelo menos uma espécie das sequências de aminoácidos especificas supramencionadas; (b) um péptido mimético de GD3 numa forma de péptido multi- antigénico incluindo um péptido contendo pelo menos uma espécie da sequência de aminoácidos especifica supramencionada; e (c) um péptido mimético de GD3 na forma de um péptido de fusão, fundido com uma proteína transportadora ou um péptido que pode aumentar a imunogenicidade ou promover a resposta imunológica.

Estes exemplos específicos dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento serão seguidamente descritos mais detalhadamente.

Nos exemplos descritos adiante, os péptidos representados por GD3R1, GD3R2, GD3R3 e GD3R4 denotam péptidos apresentando sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID N0:1 a 4, respectivamente. Estes péptidos são exemplos preferidos dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. Os péptidos formados por 9 a 14 resíduos de aminoácido contínuos de modo arbitrário contidos numa sequência de aminoácidos representada por qualquer uma de SEQ ID NO:l a 4 são também preferidos. Destes, os péptidos formados por 9 a 14 resíduos de aminoácido do terminal N ou do terminal C contidos numa sequência de aminoácidos representada por qualquer uma de SEQ ID N0:1 a 4 são mais preferidos. São particularmente preferidos os péptidos formados por nove resíduos de aminoácidos do terminal N ou do terminal C contidos numa sequência de aminoácidos representada por qualquer uma de SEQ ID N0:1 a 4. Tal como apresentado nos exemplos, estes péptidos foram obtidos por selecção de péptidos apresentando ligação específica a um 12

ΕΡ 1 279 677 /PT anticorpo anti-GD3 por utilização de bibliotecas de exibição em fagos. A etapa de rastreio não é necessariamente repetida para produzir os péptidos miméticos de GD3 do presente invento. Caso pretendido efectua-se o rastreio, por exemplo, do seguinte modo.

Especificamente, produz-se uma grande população de moléculas (biblioteca) e identificam-se péptidos de interesse através de rastreio da biblioteca de moléculas. Pode utilizar-se uma biblioteca de exibição em fagos para o rastreio. 0 método para produzir a biblioteca e o método de rastreio estão revelados na literatura (por exemplo, Scott, J. M. e Smith, G.P., Science, 249, 386-390 (1990); Smith, G.P. e Scott, J.K., Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993)). Constituem exemplos de métodos preferidos para identificar os péptidos miméticos de GD3 do presente invento, entre outros, métodos para identificar péptidos miméticos de cadeia de açúcares de glicolipidos revelados, por exemplo, no pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 10-237099 e 10-237098, e Dai ISHIKAWA e Takao TAKI, Cell Engineering, 16 (12) 1821-1828 (1997).

Os clones de fagos que apresentam um péptido de interesse podem ser rastreados e seleccionados através de um ensaio de ligação (a um anticorpo) utilizando um anticorpo que reconhece GD3, de preferência um anticorpo monoclonal apresentando elevada especificidade para GD3.

Por determinação das sequências de ADN dos clones de fagos seleccionados pode identificar-se um péptido mimético de GD3 de interesse. As sequências de ADN podem ser facilmente determinadas através de qualquer método conhecido na arte; por exemplo, um método de didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 74, 5463-5467 (1977)] ou o método de Maxam-Gilbert [Method in Enzymology, 65, 499 (1980)]. Pode utilizar-se convenientemente um kit de sequenciação comercial ou meios semelhantes para determinar as sequências de nucleótidos correspondentes. (Produção dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento)

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento podem ser produzidos de acordo com a sua sequência de aminoácidos através de qualquer método de síntese química habitual, tais 13

ΕΡ 1 279 677 /PT como métodos de síntese peptídica típicos em fase líquida ou fase sólida.

Mais especificamente, os métodos de síntese peptídica incluem um método de alongamento por etapas no qual os respectivos aminoácidos são sucessivamente ligados de acordo com a informação de sequência de aminoácidos para estender assim a cadeia; e um método de condensação de fragmentos no qual fragmentos são sintetizados preliminarmente a partir de vários aminoácidos e os fragmentos são acoplados. Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento podem ser sintetizados através de qualquer um dos métodos.

Pode ser utilizado qualquer método de condensação para a síntese de péptido anterior. Constituem exemplos destes, entre outros, um método de azida, um método de anidrido ácido misto, um método de DCC, um método de éster activo, um método redox, um método de DPPA (difenilfosf orilazida), um método de DCC + aditivo (por exemplo, 1-hidroxibenzotriazole, N-hidroxi-succinamida ou N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida) e o método de Woodward. 0 solvente empregue nestes métodos é apropriadamente seleccionado entre os solventes habituais bem conhecidos como sendo utilizáveis em várias reacções de condensação de péptidos. Constituem exemplos, entre outros, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetra-hidrofurano (THF), acetato de etilo e suas misturas.

Após a reacção de síntese peptídica anterior, grupos carboxilo dos aminoácidos e péptidos cujos grupos não estão envolvidos na reacção podem ser de um modo geral protegidos através de esterificação para assim formarem um éster de alquilo de cadeia curta (por exemplo, éster metílico, éster etílico ou éster terc-butílico); ou um éster aralquilo (por exemplo, éster benzílico, éster p-metoxibenzílico ou éster p-nitrobenzílico). Um grupo funcional de uma cadeia lateral de um aminoácido; por exemplo, o grupo hidroxilo de Tyr, pode ser protegido por um grupo tal como acetilo, benzilo, benziloxicarbonilo ou terc-butilo, mas a protecção não é essencial. 0 grupo guanidina de Arg pode ser protegido por um grupo protector adequado tal como nitro, 14

ΕΡ 1 279 677 /PT tosilo, 2-metoxibenzenossulfonilo, metanossulfonilo, benziloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo ou adamantiloxicarbonilo. A reacção de desprotecção dos grupos protectores dos aminoácidos, péptidos e dos péptidos imunogénicos finalmente obtidos do presente invento apresentando os grupos protectores anteriores pode ser efectuada através de qualquer método habitualmente utilizado. Por exemplo, pode efectuar-se uma redução catalítica e desprotecção química por utilização de um agente tal como amoníaco líquido/sódio, fluoreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio, cloreto de hidrogénio, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico ou ácido metanossulfónico. A purificação dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento assim obtidos pode ser apropriadamente efectuada através de um método de rotina tal como um método de resina de permuta iónica, cromatografia de partição, cromatografia em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia líquida de elevada resolução (HPLC) ou distribuição em contracorrente, que são habitualmente utilizadas no campo da química de péptidos.

Alternativamente, os péptidos miméticos de GD3 do presente invento podem ser produzidos através de uma técnica de engenharia genética utilizando as sequências de ADN de acordo com o presente invento que codificam os péptidos. 0 procedimento anterior é efectuado através de um método de rotina. Por exemplo, síntese de ADN, produção de um vector de expressão que pode expressar o ADN e o método de expressar o vector em células hospedeiras podem ser efectuados de acordo com técnicas de engenharia genética geralmente utilizadas (consultar Molecular Cloning 2a Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku-Seikagaku Jikken Koza "Gene study I, II, and III," editado pela Sociedade Japonesa de Bioquímica (1986); etc.). 0 ADN que codifica um péptido mimético de GD3 do presente invento pode ser preparado através de um método de rotina com base na informação da sequência de aminoácidos do péptido 15

ΕΡ 1 279 677 /PT mimético de GD3 proporcionada pelo presente invento (por exemplo, Science, 224, 1431 (1984); e Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 80, 5990 (1983) ) .

Mais especif icamente, o ADN pode ser sintetizado quimicamente através do método do fosforamidito ou do método do triéster. A sintese pode ser efectuada utilizando um sintetizador automático de oligonucleótidos disponível comercialmente. Podem produzir-se fragmentos em cadeia dupla a partir de um produto em cadeia simples proporcionado a partir de síntese química incluindo síntese de cadeias complementares e hibridação das cadeias em condições apropriadas; ou por adição de cadeias complementares com uma sequência iniciadora apropriada utilizando uma ADN-polimerase.

Caso se pretenda, a sequência de aminoácidos codificada pelo ADN supramencionado pode ser modificada através de qualquer método conhecido tal como a introdução de uma variação específica do local utilizando um oligonucleótido (Zoller, M., et al., Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982)), ou mutagénese com cassete (Well, J., et al., Gene, 34, 315-323 (1985) ) . A produção e expressão de um péptido de interesse por utilização do ADN pode ser efectuada através de qualquer método conhecido na arte (por exemplo, Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); e Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 80, 5990 (1983)). A produção e a expressão de péptidos e proteínas fundidos podem ser efectuadas de acordo com um método de Ohno et al. "Protein Experiment Protocol 1, function analysis", volume separado de Cell Engineering, série de protocolos experimentais (1997), Shujun-sha) ou outros métodos.

Os péptidos de interesse assim obtidos podem ser isolados e purificados através de vários procedimentos de separação com base em propriedades físicas, químicas e outras propriedades (por exemplo, "Biochemistry Data Book II," 1175-1259, Ia edição, Io fascículo, 23 de Junho de 1980, Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry, 25 (25), 8274-8277 (1986); e Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987)). Constituem exemplos de procedimentos de 16

ΕΡ 1 279 677 /PT separação, entre outros, tratamento de reconstrução geral; tratamento por utilização de um agente de precipitação de proteínas ("saltíng out"); centrifugação; choque osmótico; esmagamento ultra-sónico; ultrafiltração; técnicas de cromatografia líquida tal como cromatografia de peneiros moleculares (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de elevada resolução (HPLC); diálise; e suas combinações.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento são com maior preferência péptidos imunogénicos apresentando a capacidade de produzir um anticorpo específico de GD3, que pode ser uma forma com imunogenicidade aumentada tal como uma forma de péptido de fusão, péptido fundido com uma proteína transportadora, para aumentar a imunogenicidade ou uma forma de péptido multi-antigénico.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento em forma de fusão, fundidos com uma proteína transportadora para aumentar a imunogenicidade, obtêm-se por ligação de qualquer um dos péptidos de acordo com o presente invento a uma proteína transportadora habitual para aumentar a imunogenicidade. Não se impõe qualquer limitação particular relativamente ao tipo de proteína transportadora desde que a proteína possa aumentar a imunogenicidade e podem utilizar-se como proteína transportadora várias proteínas e péptidos que induzem imunogenicidade mais elevada com base no efeito transportador ou que promovem resposta imunológica de organismos vivos. A proteína transportadora pode ser uma proteína ou péptido que exerce adicionalmente um efeito farmacêutico tal como actividade antitumoral.

Quando os péptidos miméticos de GD3 do presente invento são utilizados como fármacos, a proteína transportadora é seleccionada de proteínas e péptidos farmaceuticamente aceitáveis. Constituem exemplos de proteínas transportadoras preferíveis, entre outras, hemocianina de lapa Fissurella (KLH) e citoquinas tais como IL-12 e GM-CSF. Constituem exemplos das proteínas e péptidos supramencionados que exercem 17

ΕΡ 1 279 677 /PT um efeito farmacêutico, entre outros, iFN-a, lFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, TNF, TGF-β, angiostatina, trombospondina e endostatina. A ligação entre o péptido anterior e a proteína transportadora pode ser efectuada através do método de síntese de péptido supramencionado. A ligação pode também ser efectuada por utilização dos seus ADN ou genes através da técnica recombinante supramencionada.

Assim, podem obter-se péptidos miméticos de GD3 do presente invento na forma fundida.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento podem ser péptidos multi-antigénicos (MAP). Estes péptidos caracterizam-se por vários dos péptidos miméticos de GD3 de acordo com o presente invento serem apresentados por uma molécula base. A forma MAP dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento pode ser produzida de preferência utilizando um dendrímero servindo como um molécula base ou um esqueleto.

Tal como é do conhecimento geral, um dendrímero é uma molécula (por exemplo, molécula esférica) com uma configuração dendrítica ou em estrela em que a molécula apresenta ramificações (unidades de repetição) apresentando uma variedade de grupos funcionais (consultar, por exemplo, publicação de patente japonesa Kohyo n.° 60-500295; pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 63-99233 e 3-263431; patentes US n.° 4507466 e 4568737; Polymer Journal, 17, p. 117 (1985); Angewandte Chem. Int. Engl., 29, 138-175 (1990); e Macromolecules, 25, p. 3247 (1992)). Não se impõe qualquer limitação específica ao dendrímero utilizado no presente invento e o dendrímero pode ser formado por um núcleo que serve como local de iniciação de polimerização; um nível interno (geração) incluindo unidades repetidas ligadas ao núcleo iniciador; e uma superfície exterior formada por grupos funcionais ligados às ramificações. 18

ΕΡ 1 279 677 /PT

As características tais como dimensões, morfologia e reactividade do dendrimero podem ser reguladas por modificação do núcleo iniciador, do número de gerações e do tipo de unidades de repetição utilizadas em cada geração. Especificamente, as dimensões de um dendrimero podem ser facilmente aumentadas pelo aumento do número de gerações a incluir (consultar, por exemplo, patente US n.° 4 694 064).

Constituem exemplos de formas tipicas de map dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento, entre outros, um dendrimero incluindo um átomo de azoto servindo como local de núcleo de iniciação; um fragmento -CH2CH2CONHCH2CH2- servindo como unidade repetitiva (ramificação) que se liga a cada local do núcleo; e vários péptidos miméticos de GD3 ligados aos terminais mais exteriores das ramificações do dendrimero; e um dendrimero incluindo um aminoácido (por exemplo, Lys, Arg, Glu ou Asp) servindo como um local de núcleo de iniciação, o mesmo aminoácido servindo como uma unidade repetitiva ligada directamente a cada local do núcleo e vários péptidos miméticos de GD3 ligados aos terminais das ramificações de um modo semelhante. O dendrimero supramencionado apresentando um átomo de azoto servindo como um local de núcleo de iniciação pode ser produzido através de um método habitual ou obtido como um produto comercial (Polysciences, Inc., 400 Vally Road, Warrington, Pensilvânia, 18976 E.U.A.). O dendrimero supramencionado apresentando um aminoácido servindo como um local de núcleo de iniciação e o mesmo aminoácido servindo como uma unidade repetitiva ligada directamente a cada local de núcleo de iniciação pode ser produzido através do método de sintese de péptido supramencionado. Adicionalmente, podem também utilizar-se produtos comerciais tais como resina Fmoc8-LyS4-Lys2-Lys-pAla-Alko (produto de Watanabe Kagaku Kogyo).

Mais especificamente, os dendrimero supramencionados podem ser produzidos através de condensação de a,ω-diaminoácidos servindo como unidades repetitivas e uma resina para sintetizar um péptido em fase sólida, em que dois grupos amino de cada aminoácido foram protegidos por grupos protectores, que são idênticos ou diferentes entre si, na presença ou 19

ΕΡ 1 279 677 /PT ausência de um espaçador; e repetição de remoção dos grupos protectores.

Podem utilizar-se resinas tipicamente utilizadas para síntese peptidica como a resina para sintetizar um péptido em fase sólida. Constituem exemplos, entre outros, resina de poliestireno, resina de poliacrilamida, resina de poliestireno-polietilenoglicol, apresentando os grupos terminais destas resinas um grupo funcional tal como clorometilo, 4-(hidroximetil) fenoxi ou 4— ( (oí—2 ', 4 ' — dimetoxifenil)-9-fluorenilmetoxicarbonilaminometil)fenoxi. Podem utilizar-se um ou mais aminoácidos como espaçadores.

Constituem exemplos de a,ω-diaminoácidos, entre outros, lisina, ornitina, ácido 1,4-diaminobutirico e ácido 1,3-diaminopropiónico. A remoção dos grupos protectores pode ser efectuada através do método de sintese peptidica supramencionado. Constituem exemplos de grupos funcionais, entre outros, um grupo amino, um grupo carboxilo e um grupo hidroxilo. 0 número de niveis de ramificação é ajustado a 2n através de condensação de uma unidade repetitiva e remoção de grupos protectores n vezes no total. Especificamente, o número pode estar compreendido numa gama entre 2 e 16.

Pela ligação de péptidos miméticos de GD3 de acordo com o presente invento aos grupos funcionais ligados aos terminais das ramificações dos dendrímeros, pode obter-se um MAP de interesse. 0 procedimento pode ser efectuado de acordo com o método de sintese peptidica supramencionado. 0 MAP assim produzido pode ser purificado através de cromatografia ou um método semelhante de um modo rotineiro por utilização de uma resina que proporciona exclusão de tamanho numa matriz tal como Sephacryl S-300 (produto de Pharmacia).

Os péptidos miméticos de GD3 de acordo com o presente invento que foram ligados aos terminais das ramificações do MAP de acordo com o presente invento não são necessariamente idênticos entre si e podem combinar-se diferentes espécies arbitrariamente. Constituem exemplos de combinações de 20

ΕΡ 1 279 677 /PT diferentes péptidos miméticos de GD3, entre outros, uma combinação de SEQ ID NO:l, 3 e 4; e uma combinação de um péptido apresentando uma sequência de aminoácidos de 15 residuos de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:4 e um péptido apresentando uma sequência de aminoácidos de nove residuos de aminoácido apresentada na figura 2. Tal MAP complexo aumenta a sua estabilidade no sangue e tecidos do alvo ao qual se administra o MAP e aumenta a imunogenicidade ou outras propriedades da molécula à qual o MAP foi ligado. Assim, pode promover-se a produção de um anticorpo GD3 por qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento.

Qualquer dos MAP do presente invento pode ser transformado num MAP complexo em que a proteína transportadora supramencionada (por exemplo polipéptido que promove a resposta imunológica tal como IL-12 ou GM-CSF) para aumentar a imunogenicidade está ligada na forma de uma parte do péptido mimético de GD3 do presente invento ou a um local de núcleo de iniciação. Outros gangliósidos que são expressos em células de tumor diferentes de péptidos miméticos de GD3 do presente invento, tal como um ou mais péptidos miméticos (por exemplo, GM2, GM3, GDI, GD2, GD3 e GT3) podem também ser utilizados como constituintes de MAP em combinação com qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. Constituem exemplos de MAP complexos, entre outros, uma combinação de pelo menos um péptido contendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4 ou uma sequência de aminoácidos de GD3R4 apresentada na figura 2 com um péptido réplica que mimetiza GDla revelado no pedido de patente japonesa disponível ao público (kokai) n.° 10-237099 supramencionado.

As formas de MAP assim produzidas dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento apresentam imunogenicidade excelente e consequentemente podem exercer efeitos pretendidos; ou seja, induzir produção de um anticorpo anti-GD3 ou produção aumentada do anticorpo.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento sob a forma MAP exercem efeitos como pretendido para uma vacina; ou seja, um efeito carcinostático e um efeito de inibição para metástases cancerígenas. Adicionalmente, um fármaco arbitrário tal como um fármaco que promove resposta imunológica é 21

ΕΡ 1 279 677 /PT incorporado no MAP e os MAP assim modificados podem ser administrados. Assim, os MAP são vantajosos na medida em que a indução de um anticorpo alvo pode ser promovida, a produção de um anticorpo pode ser aumentada adicionalmente e outros efeitos podem ser aumentados. (Composição farmacêutica do presente invento) 0 presente invento proporciona uma composição farmacêutica para humanos e animais contendo, como um ingrediente activo, qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. A composição farmacêutica é útil como, entre outras, um agente de diagnóstico de cancro como base no efeito que o ingrediente activo liga um anticorpo a um antigénio GD3 relacionado com cancro.

De preferência, a composição farmacêutica do presente invento contém como um ingrediente activo qualquer um dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento sob a forma de um péptido imunogénico apresentando a capacidade de produzir um anticorpo especifico de GD3.

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento sob a forma do péptido imunogénico anterior mimetizam a estrutura de GD3 e apresentam uma imunogenicidade semelhante à de GD3. Assim, os péptidos apresentam efeito antitumoral com base na activação de efeitos citotóxicos dependentes de um complemento ou de um anticorpo induzido ou produzido ou de activação de células T citotóxicas; e um efeito de inibição da adesão intercelular através de mediação de GD3 em células de tumor que expressam GD3. Os péptidos são úteis para várias utilizações farmacêuticas.

Constituem exemplos de utilização dos fármacos proporcionados pela composição farmacêutica, entre outros, uma vacina para estimular a indução de um anticorpo que reconhece GD3 ou aumenta a produção do anticorpo; utilização antitumoral, utilização carcinostática ou utilização de inibição para metástases de cancro; e tratamento para tumores ou cancro que expressam GD3, nomeadamente doenças seleccionadas do grupo que consiste de melanoma, cancro do 22

ΕΡ 1 279 677 /PT intestino grosso, cancro do ovário, cancro de figado, cancro da mama, cancro cerebral, cancro de rim, cancro do pâncreas, cancro cervical, cancro do esófago, cancro de pulmão e cancro de estômago. A composição farmacêutica do presente invento pode ser preparada como uma composição contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis utilizados no presente invento são conhecidos na arte e são apropriadamente seleccionados de acordo com a forma da composição a ser preparada. Quando a composição a ser preparada é uma solução aquosa, podem utilizar-se transportadores tais como água e tampões fisiológicos sem limitação e podem também ser utilizados glicol, glicerol e ésteres orgânicos injectáveis tais como azeite. A composição farmacêutica do presente invento pode conter adicionalmente outro ingrediente activo e um ingrediente arbitrário para estabilizar a absorção do ingrediente activo e aumentar a absorção. Constituem exemplos de ingredientes arbitrários, entre outros, hidratos de carbono tais como glucose, sacarose e dextrano; antioxidantes tais como ácido ascórbico e glutationa; agentes quelantes; estabilizantes tais como proteínas de baixo peso molecular e albumina; e veículos.

Na composição farmacêutica do presente invento, podem incorporar-se apropriadamente aditivos arbitrários para conceber preparações de fármacos. Constituem exemplos, entre outros, vários aditivos utilizados geralmente tais como agentes anti-sépticos, agentes de tonicidade, tampões, estabilizantes, solubilizantes e promotores de absorção. Constituem exemplos de agentes anti-sépticos, entre outros, os que são eficazes para fungos e bactérias tais como cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, clorexidina, parabenos (por exemplo, metilparabeno, etilparabeno) e timerosal. Constituem exemplos de agentes de tonicidade, entre outros, álcoois poli-hídricos tais como D-manitol, D-sorbitol, D-xilitol, glicerina, glucose, maltose, sacarose e 23

ΕΡ 1 279 677 /PT propilenoglicol; e electrólitos tais como cloreto de sódio. Constituem exemplos de estabilizantes tocoferol, butil-hidroxianisole, butil-hidroxitolueno, sais de ácido etilenodiaminotetracético (edta) e cisteina.

Uma forma da composição farmacêutica do presente invento é uma preparação de lipossomas. Esta preparação será seguidamente descrita em detalhe. A preparação pode ser produzida fazendo que qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento fique aprisionado em lipossoma contendo, como um ingrediente de formação de membrana, fosfolípido ácido ou incluindo, como ingredientes de formação de membrana, fosfolípido neutro e fosfolípido ácido. Não se impõe qualquer limitação particular relativamente ao tipo de fosfolípido neutro e fosfolípido ácido que servem como ingredientes de formação de membrana e podem utilizar-se espécies lipídicas que são habitualmente utilizadas em tais preparações de lipossomas por si só ou em combinação de duas ou mais espécies. A membrana do lipossoma é formada através de um método habitual por utilização de fosfolípido ácido como um ingrediente de formação de membrana ou por utilização de fosfolípido neutro e fosfolípido ácido em combinação como ingredientes de formação de membrana. 0 teor em fosfolípido ácido é cerca de 0,1 a cerca de 100% mole com base na quantidade total de ingredientes de formação de membrana de lipossoma, de preferência cerca de 1 a cerca de 90% mole, com maior preferência cerca de 10 a cerca de 50% mole.

Após preparação da membrana de lipossoma, podem incorporar-se aditivos tais como colesterol no fosfolípido para assim controlar a fluidez, facilitando assim a preparação da membrana de lipossoma. A quantidade de colesterol incorporada no fosfolípido é geralmente equivalente à de fosfolípido ou inferior, de preferência 0,5-1 equivalentes. A proporção entre fosfolípido ácido e ingrediente(s) activo(s) contidos numa dispersão de lipossomas é cerca de 0,5 a cerca de 100 equivalentes, de preferência cerca de 1 a cerca de 60 equivalentes, com maior preferência cerca de 1,5 a cerca 24

ΕΡ 1 279 677 /PT de 20 equivalentes. A quantidade de qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento é de alguma % mole para algumas dezenas de % mole com base nas espécies lipidicas totais, de preferência cerca de 5 a cerca de 10% mole, sendo tipicamente utilizado cerca de 5% mole. A preparação, concentração, controlo do tamanho da partícula e outros processos do lipossoma podem ser efectuados através de um método habitual. Os diferentes aditivos supramencionados podem ser incorporados na preparação de lipossomas de acordo com as necessidades.

Após a produção de lipossomas, podem ligar-se ácidos gordos (por exemplo, ácido beénico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico ou ácido oleico), um grupo alquilo, um grupo colesterilo ou um grupo semelhante a qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. A produção de uma preparação de lipossoma por utilização de tal péptido modificado pode ser efectuada através de um método habitual (por exemplo, Long Circulating Liposomes: Old drugs, New therapeutics., M.C. Woodle, G. Storm, Ed. : Springer-Verlag Berlim (1998)) . Não se impõe qualquer limitação particular relativamente à quantidade de ingrediente(s) activo(s) contido(s) na composição farmacêutica (preparação de fármaco) do presente invento e a quantidade pode ser seleccionada de uma vasta gama desde que seja farmaceuticamente eficaz.

De um modo geral, qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento está contido numa preparação de fármaco numa quantidade de cerca de 0,00001 a cerca de 70% em peso, de preferência cerca de 0, 0001 a cerca de 5% em peso. Não se impõe qualquer limitação particular relativamente à quantidade de administração da preparação de fármaco e a quantidade é apropriadamente seleccionada de uma vasta gama de acordo com efeitos terapêuticos pretendidos, o método (modo) de administração, o período de terapia e a idade, sexo e outras condições dos doentes. De um modo geral, a dose diária por doente por peso corporal (kg) de preferência fica numa gama de cerca de 0,01 pg a cerca de 10 mg quando reduzidos a ingrediente(s) activo(s), de preferência cerca de 0,1 pg a 25

ΕΡ 1 279 677 /PT cerca de 1 mg. A preparação de fármaco pode ser administrada uma vez por dia ou de um modo dividido. A composição farmacêutica do presente invento é de preferência utilizada como a composição de vacina supramencionada. Em utilização como uma composição de vacina, a composição do presente invento é de preferência administrada conjuntamente com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um adjuvante em combinação de modo a aumentar o seu efeito antitumoral. Não se impõe qualquer limitação particular relativamente ao tipo de adjuvante e os exemplos incluem adjuvante completo de Freund, dipéptido de muramilo, BCG, IL-12, N-acetilmuramin-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), timosina al e QS-21. Apesar da quantidade de adjuvante a ser administrada ser limitada dependendo do tipo de condições patológicas de humanos e animais causadas, após administração, por reacção imunológica tal como malacia, dor e eritema da pele; febre; dor de cabeça; ou dores musculares, a dose diária de adjuvante por doente por peso corporal (kg) é geralmente cerca de 0,1 yg a cerca de 1000 yg, de preferência cerca de 1 yg a algumas centenas de yg. A composição farmacêutica do presente invento pode ser utilizada em combinação com outros fármacos, tal como um péptido promotor de resposta imunológica e um agente quimioterapêutico de cancro (agente anticanceroso) . A quantidade do fármaco administrada em combinação é adequadamente determinada de acordo com a quantidade farmaceuticamente eficaz do fármaco. Por exemplo, quando se utiliza GM-CSF, a sua dose diária por peso corporal (kg) do doente é geralmente cerca de 0,1 yg a cerca de 1000 yg, de preferência cerca de 1 yg a algumas centenas de yg.

Constituem exemplos dos fármacos supramencionados utilizados em combinação, entre outros, agentes de quimioterapia de cancro incluindo 5-fluorouracilo (5-FU), tal como agentes alquilantes, antagonistas de metabolismo, preparações de antibiótico antitumoral, preparações de origem vegetal antitumorais; e as citoquinas supramencionadas apresentando uma actividade antitumoral. 26

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Para utilização combinada, pode incorporar-se um fármaco nos péptidos miméticos de GD3 sob a forma MAP do presente invento do modo supramencionado. Adicionalmente, pode também utilizar-se uma substância de entrega de fármaco tal como um microdispositivo apresentando uma microcâmara que pode alojar outros fármacos e que aloja os péptidos miméticos de GD3 do presente invento. Constituem exemplos de tais substâncias de entrega de fármacos, entre outras, substâncias biológicas tais como lipossomas, microcápsulas apresentando membranas permeáveis ou semi-permeáveis e outros microdispositivos apresentando microcâmaras. Estas substâncias não são tóxicas e podem ser biodegradáveis. A ligação destas substâncias de entrega de fármaco e do péptido mimético de GD3 do presente invento pode ser efectuada através de um método habitual (por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press (1988); e Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). Produz-se uma composição farmacêutica contendo uma substância tal como uma citoquina contendo um carcinostático e exercendo actividade antitumoral através de um método conhecido (por exemplo, Liposomal application to câncer therapy, Y. Namba, N. Oku, J., Bioact. Compat. Polymers, 8, 158-177 (1993)).

Quando a composição farmacêutica do presente invento é utilizada como um agente de diagnóstico, qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento - o ingrediente activo -pode ser marcado para a sua detecção. A marcação pode ser efectuada através de um método habitual e podem utilizar-se materiais tais como compostos radioactivos, substâncias fluorescentes, enzimas, biotina e meio de contraste.

Através da utilização de um tal agente de diagnóstico pode detectar-se um anticorpo anti-GD3 contido em várias amostras tal como tecidos e células de cancro e fluidos corporais tais como sangue. Assim, o agente de diagnóstico é útil para diagnóstico de cancro, monitorização de condições patológicas, etc. (ADN do presente invento) 0 presente invento proporciona ADN incluindo uma sequência que codifica qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. 0 ADN é útil na produção dos péptidos 27

ΕΡ 1 279 677 /PT miméticos de GD3 do presente invento supramencionada através de uma técnica de engenharia genética. Este ADN é adequadamente utilizado para produzir uma vacina de ADN contendo o ADN como um ingrediente activo.

Tal como supramencionado, o ADN que codifica os péptidos miméticos de GD3 do presente invento é de preferência ADN que codifica péptidos imunogénicos apresentando a capacidade de produzir um anticorpo especifico de GD3, em que os péptidos imunogénicos são concretizações dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. Além disso, o ADN pode codificar as supramencionadas formas preferidas dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. A vacina supramencionada inclui uma composição farmacêutica contendo, como um ingrediente activo, o ADN que codifica péptidos imunogénicos apresentando a capacidade de produzir um anticorpo especifico de GD3, em que os péptidos imunogénicos são concretizações dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento ou um vector de expressão recombinante que pode expressar o ADN. A composição farmacêutica é útil para uma vacina de ADN que tem como alvo células ou tecidos de cancro de mamíferos incluindo humano e as utilizações da composição farmacêutica são semelhantes às descritas em relação à composição farmacêutica contendo, como um ingrediente activo, qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento. A vacina de ADN supramencionada pode ser preparada como uma composição farmacêutica através de um método habitual por utilização de um transportador farmaceuticamente aceitável. De preferência, a vacina contém uma solução fisiologicamente aceitável tal como solução salina fisiológica esterilizada ou solução salina fisiológica tamponada esterilizada. Tal como no caso da supramencionada composição farmacêutica contendo como um ingrediente activo qualquer dos péptidos miméticos de GD3 do presente invento, a composição pode ser uma preparação de fármaco de lipossoma e pode ser utilizada em combinação com um adjuvante ou material semelhante. 28

ΕΡ 1 279 677 /PT A composição farmacêutica pode conter um fármaco arbitrário e aditivos. Constituem exemplos do fármaco, entre outros, um fármaco tal como iões cálcio que promovem incorporação de ADN em células e constituem exemplos de aditivos, entre outros, materiais para facilitar transfecção, tal como o lipossoma supramencionado, emulsões de fluoretos de carbono, cocleatos, túbulos, partículas de ouro, microesferas biodegradáveis e polímeros catiónicos. A quantidade de ADN que pode ser expressa e é introduzida num hospedeiro de vacinação ou a quantidade de ARN transcrito que é introduzido num hospedeiro de vacinação é seleccionada de uma vasta gama de quantidades de administração. A quantidade varia de acordo com, por exemplo, a capacidade dos promotores de transcrição e tradução utilizados. A intensidade de resposta imunológica varia de acordo com o nível de expressão de proteína e a imunogenicidade dos produtos génicos expressos. De um modo geral, a vacina é administrada parentericamente numa quantidade eficaz de cerca de 1 ng a cerca de 5 mg com base em ADN, de preferência cerca de 100 ng a cerca de 2,5 mg, com maior preferência cerca de 1 pg a cerca de 750 pg, ainda com maior preferência cerca de 10 pg a 300 pg. De um modo geral, a vacina é administrada directamente a tecidos musculares. Alternativamente, podem também utilizar-se outros métodos de administração tais como injecção hipodérmica, introdução no cório, impressão na pele, administração intraperitoneal, administração intravenosa e inalação.

De um modo geral, a vacina é administrada não uma vez mas efectua-se reforço uma ou mais vezes de modo a aumentar o efeito da vacina concomitantemente com monitorização das condições dos espécimes administrados. Alternativamente, a vacinação de ADN pode ser seguida de reforço por utilização da composição farmacêutica supramencionada incluindo o péptido mimético de GD3 do presente invento. Adicionalmente, as diferentes combinações supramencionadas podem aumentar a eficácia da terapia. Não se impõe qualquer limitação particular relativamente ao tipo de vector de expressão recombinante que pode expressar o ADN da vacina de ADN supramencionada e podem utilizar-se 29

ΕΡ 1 279 677 /PT vectores de expressão utilizados geralmente em tais tipos de vacinas de ADN e outros vectores de expressão utilizáveis. Estes vectores podem ser produzidos através de um método habitual. (Anticorpo do presente invento)

Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento funcionam como antigénios e produzem os anticorpos correspondentes. Especificamente, qualquer dos péptidos que se liga a GD3 liga-se a células tal como células de tumor malignas (por exemplo, células de melanoma) que expressam GD3, produzindo assim um anticorpo (anticorpo neutralizante) que inibe proliferação das células e apresenta actividade para inibir metástase das células. 0 presente invento também proporciona tal anticorpo. A confirmação da produção de tal anticorpo é considerada como um ensaio para diagnóstico do péptido mimético de GD3 do presente invento ser um péptido imunogénico apresentando a capacidade de produzir um anticorpo especifico de GD3.

Os anticorpos de acordo com o presente invento incluem anticorpos monoclonais e policlonais. Estes anticorpos podem ser produzidos através de uma técnica habitualmente utilizada por utilização do péptido mimético de GD3 como um imunogénio. A produção do anticorpo monoclonal será detalhadamente descrita em seguida. 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido, por exemplo, por fusão de células de plasma (imunócitos) de um mamifero que foi imunizado com o imunogénio anterior e células de plasmacitoma (células de mieloma) do mamifero, para assim produzir células fundidas (hibridomas); selecção de um clone que produz um anticorpo pretendido que reconhece GD3 (anticorpo monoclonal); e cultura do clone. 0 anticorpo monoclonal é fundamentalmente produzido de acordo com um método de rotina (por exemplo, Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 15, 105 (1975); Hanfland, P., Chem. Phys.

Lipids, 10, 201 (1976); e Koscielak, J., Eur. J. Biochem., 37, 214 (1978)). 30

ΕΡ 1 279 677 /PT Não se impõe qualquer limitação particular relativamente ao mamífero que é imunizado com o imunogénio no método anterior e utilizam-se ratinhos, ratos, etc. de preferência do ponto de vista da compatibilidade com as células de plasmacitoma a serem fundidas. A imunização pode ser efectuada através de um método habitual tal como administração do imunogénio anterior a um mamífero através de injecção (por exemplo, intravenosa, intradérmica, hipodérmica ou intraperitoneal).

Mais especificamente, quando se utilizam ratinhos, de preferência o imunogénio é diluído a uma concentração adequada com um diluente tal como uma solução salina tamponada de fosfato (PBS) fisiológica ou solução salina fisiológica e é administrado em combinação com um adjuvante habitual opcional de acordo com as necessidades a um espécimen animal várias vezes a intervalos de 2 a 14 dias para uma quantidade total de cerca de 100 a cerca de 500 pg/ratinho. Constituem exemplos do adjuvante que é de preferência utilizado no processo anterior, entre outros, uma vacina pertussis, adjuvante completo de Freund e alúmen. De preferência, os imunócitos utilizados incluem células de baço que foram extirpadas cerca de três dias após a administração final do imunogénio.

Podem utilizar-se várias células de plasmacitoma de mamífero conhecidas como células contra parentais a serem fundidas com os imunócitos anteriores. A fusão pode ser efectuada através de qualquer método conhecido, tal como o método descrito em Milstein et ai. (Method in Enzymology, 73, 3 (1981)). O isolamento e clonagem dos hibridomas obtidos podem ser efectuados através dos métodos habituais.

As estirpes alvo produtoras de anticorpo podem ser recuperadas através de vários métodos geralmente utilizados para detectar anticorpos ("Hybridoma Method and Monoclonal Antibody," emitido por R&D Planning, 30-53, 5 de Março de 1982). Constituem exemplos dos métodos, entre outros, o método ELISA (Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980)), um método de placa, um método de mancha, um método de aglutinação, um método de Ochterlony e radioimunoensaio (RIA). Após recuperação, o imunogénio supramencionado e GD3 podem ser utilizados. 31

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Os hibridomas assim obtidos que produzem um anticorpo monoclonal pretendido que reconhece GD3 podem ser subcultivados num meio habitual e conservados durante um periodo de tempo longo em azoto liquido. Constituem exemplos de métodos para recolher um anticorpo monoclonal dos hibridomas, entre outros, um método incluindo cultivar os hibridomas de um modo rotineiro e recolher um anticorpo de um sobrenadante de cultura; e um método incluindo administração dos hidridomas a um mamífero compatível com os hibridomas para proliferação dos hibridomas e recolha de um anticorpo das ascites. 0 método anterior é adequado para produzir um anticorpo de elevada pureza, ao passo que o último método é adequado para produção em massa de um anticorpo.

Podem utilizar-se o sobrenadante de cultura e ascites de ratinhos obtidas através dos métodos anteriores e contendo hibridomas produtores de anticorpo como líquidos de anticorpo em bruto. Alternativamente, os líquidos em bruto podem ser purificados através de um método de rotina; ou seja, métodos tais como fraccionamento com sulfato de amónio, precipitação de proteína ("salting out"), filtração em gel, cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de afinidade tal como cromatografia em coluna de proteína A para assim produzir um anticorpo purificado.

Exemplos 0 presente invento será seguidamente descrito mais detalhadamente através de exemplos que não devem ser considerados como limitativos deste invento.

As seguintes abreviaturas são aqui utilizadas. TBS: solução salina tamponada com Tris-fosfato TC: tetraciclina KM: canamicina PEG/NaCl: polietilenoglicol/cloreto de sódio TFA: ácido trifluoroacético 32

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Exemplo 1

Identificação do péptido mimético de GD3 (1) Preparação de bibliotecas de exibição em fagos

De acordo com o procedimento revelado por Nishi T., Saya H., et al. (FEBS Letter, 399, 237-240 (1996)), inseriram-se fragmentos de ADN aleatórios que codificam péptidos de 15 resíduos de aminoácido aleatórios no gene pm da proteína de envelope de fago para assim preparar bibliotecas de apresentação de fagos de interesse contendo genes capazes de expressar péptidos aleatórios de 15 resíduos de aminoácidos à superfície do envelope dos respectivos fagos.

Dado que os fagos contêm um gene de resistência a TC, E. coli infectada com os fagos é resistente a TC. As bibliotecas de fagos assim construídas foram armazenadas numa solução de TBS contendo NaN3 a 0,02%.

Descrevem-se características específicas das bibliotecas de apresentação de fagos supramencionadas em Scott, J.K. e Smith G.P. (Science, 249, 386-390 (1990)). (2) Imobilização de um anticorpo monoclonal anti-GD3 O anticorpo anti-GD3 utilizado é um anticorpo monoclonal 4F6 anti-GD3 (doravante designado como um anticorpo GD3 4F6) . O anticorpo GD3 4F6 é um anticorpo monoclonal (IgG) de ratinho contra GD3 (Thomas C. P., et al., Glycocon j. J., 13 (3), 377-384 (1996)), que foi gentilmente cedido pelo Dr. Jacques Portoukalian (INSERM, França).

Transferiu-se uma suspensão de proteína A recombinante-Sepharose (50 pL) (rProtein A Sepharose Fast Flow; produto de Pharmacia Biotech K.K., código n.° 17-1279-01, lote n.° 237393) para um tubo Eppendorf de 0,5 mL e adicionou-se TBS (400 pL) à mistura. Subsequentemente, adicionou-se anticorpo GD3 4F6 (1 mL) e deixou-se a mistura reagir durante a noite a 4°C com agitação extensa. Após finalização da reacção, centrifugou-se a mistura a 3000 rpm durante 5 minutos, rejeitou-se o sobrenadante, adicionou-se TBS (0,5 mL) ao resíduo e agitou-se a mistura extensivamente. Transferiu-se a 33 ΕΡ 1 279 677 /PT mistura resultante para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Adicionou-se TBS (0,5 mL) à mistura, centrifugou-se a mistura a 3000 rpm durante 5 minutos e rejeitou-se o sobrenadante. Subsequentemente, adicionou-se TBS (1 mL) ao resíduo, centrifugou-se a mistura a 3000 rpm durante 5 minutos e removeu-se o sobrenadante. Adicionou-se TBS (100 pL) ao residuo para assim proporcionar uma suspensão; ou seja, uma suspensão de proteina A recombinante-Sepharose (100 pL) ligada ao anticorpo GD3 4F6, que se armazenou a 4°C até utilização.

Transferiu-se uma aliquota da suspensão de proteina A recombinante-Sepharose (50 pL) assim obtida para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e a essa mistura adicionou-se TBS (900 pL) . Subsequentemente, adicionou-se soro padrão de imunoglobulina de ratinho a 12 mg/mL (código n.° RS10-101-2; produto de Bethyl; adquirido de Cosmo Bio Co., Ltd.) em TBS (volume total da solução resultante: 100 pL) e deixou-se a mistura reagir durante a noite a 4°C com agitação extensa. (Fez-se reagir a proteina A com uma quantidade excessiva de IgG de modo a minimizar a quantidade de proteina A que fica por reagir). Após finalização da reacção, centrifugou-se a mistura a 3000 rpm durante 5 minutos, removeu-se o sobrenadante, adicionou-se TBS (1 mL) ao residuo e agitou-se extensivamente a mistura. Transferiu-se a mistura resultante para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Centrifugou-se a mistura a 3000 rpm durante 5 minutos e removeu-se o sobrenadante. Após repetição deste procedimento três vezes, adicionou-se TBS (100 pL) ao residuo para assim preparar uma suspensão; ou seja, uma suspensão de uma proteina A recombinante-Sepharose (100 pL) ligada a IgG de ratinho (250 pg), que foi armazenada a 4°C até utilização. (3) Preparação de E. coli A E. coli utilizada como uma hospedeira do fago foi E. coli K91KAN (estirpe resistente à canamicina; gentilmente cedida pelo Professor SAYA, Hideyuki, Departamento de Genética e Biologia Tumoral da Universidade de Kumammoto).

Por utilização de uma ansa descartável de platina, inoculou-se E. coli K91KAN numa placa NZY contendo canamicina a 100 pg/mL (produto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) 34 ΕΡ 1 279 677 /PT para incubação a 37°C durante a noite. No dia seguinte, retirou-se a placa da incubadora e armazenou-se a 4°C até utilização.

No dia antes da infecção de E. coli com fagos, recolheu-se uma pequena quantidade de E. coli que tinha sido armazenada a 4°C na placa, por utilização de uma ansa de platina e inoculou-se num meio NZY (5 mL) contendo canamicina a 100 pg/mL seguido de agitação da cultura a 200 rpm a 37°C durante a noite (pré-cultura). No dia seguinte, transferiu-se a mistura cultivada (100 pL) para meio NZY fresco (10 mL) seguido de agitação da cultura a 37°C durante 4 horas. Seguidamente, de modo a fazer com que as células desenvolvam cilios F, parou-se a agitação e deixaram-se as células repousar durante 30 minutos. Infectaram-se as células de E. coli assim preparadas com fagos como descrito adiante. O meio NZY supramencionado foi obtido através das seguintes etapas: dissolveram-se nz amina A (produto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.; código n.° 541-00241) (10 g), extracto de levedura de padeiro (nome comercial: EBIOS, produto de Asahi Breweries, Ltd.) (5 g) e NaCl (5 g) em água destilada (1 L) ; a esta mistura adicionou-se NaOH 5 N (1 mL); ajustou-se o pH da mistura a 7,5; esterilizou-se a mistura num autoclave; e armazenou-se a mistura resultante à temperatura ambiente até utilização. (4) Amplificação de fago

Infectaram-se as células hospedeiras de E. coli com os fagos preparados no procedimento descrito em (1).

Sucintamente, colocaram-se E. coli K91KAN (10 pL) preparado acima e uma preparação de fago diluída (10 pL) num tubo de centrífuga de 15 mL e deixou-se a mistura reagir à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionou-se à mistura meio NZY (contendo TC a 0,2 pg/mL) (1 mL) que tinha sido previamente aquecido a 37°C seguido de agitação da cultura a 2000 rpm a 37°C durante 40 minutos. Inoculou-se uma alíquota (200 pL) da mistura resultante numa placa NZY (contendo TC a 20 pg/mL e KM a 100 pg/mL) para incubação a 35

ΕΡ 1 279 677 /PT 37°C durante a noite. No dia seguinte contou-se o número de colónias.

Preparou-se um controlo negativo por adição de E. coli K91KAN (10 pL) ao liquido de diluição (10 pL) . Dado que esta mistura permaneceu sensível a TC a amplificação de fagos não ocorreu na placa de NZY contendo TC. A amplificação de fagos que foram recuperados através de ciclos de selecção {"biopanning"), que serão aqui seguidamente descritos, efectuou-se do seguinte modo.

Colocou-se a totalidade da solução de fago, com excepção da quantidade (2 pL) a utilizar para as medidas de titulação, num tubo Eppendorf de 1,5 mL e adicionou-se a E. coli K91KAN (100 pL) preparada acima, seguido de reacção à temperatura ambiente durante 15 minutos. Após finalização da reacção adicionou-se a totalidade da mistura a um meio NZY suplementado com TC (20 mL; a quantidade de TC: 0,2 pg/mL) que tinha sido previamente aquecido a 37°C num tubo de centrífuga de 50 mL seguido por agitação da cultura a 200 rpm a 37°C durante 40 minutos. Adicionou-se TC a 20 mg/mL (20 pL) e a mistura foi novamente submetida a agitação da cultura a 37°C durante a noite. No dia seguinte, centrifugou-se a mistura resultante a 3000 rpm durante 10 minutos. Transferiu-se o sobrenadante para um tubo de centrífuga Oakridge e centrifugou-se a 12 000 rpm durante 10 minutos para assim remover completamente células de E. coli. Transferiu-se o sobrenadante para outro tubo de centrífuga Oakridge e adicionou-se à mistura PEG/NaCl (3 mL) seguido de agitação extensiva. Deixou-se a mistura resultante em repouso a 4°C durante 4 horas ou mais.

Subsequentemente, efectuou-se centrifugação a 12 000 rpm durante 10 minutos para provocar sedimentação de fagos amplificados. Removeu-se o sobrenadante e suspendeu-se o sedimento de fago em TBS (1 mL) . Transferiu-se a suspensão para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e centrifugou-se a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim remover substâncias insolúveis. Transferiu-se o sobrenadante para outro tubo Eppendorf, 36

ΕΡ 1 279 677 /PT adicionou-se a este PEG/NaCl (150 pL), agitou-se extensivamente a mistura e deixou-se em repouso a 4°C durante 1 hora ou mais.

Centrifugou-se a mistura a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim permitir que os fagos precipitassem. Removeu-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento de fago precipitado em TBS (200 pL) contendo NaN3 a 0,02%. Centrifugou-se a suspensão a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim sedimentar substâncias insolúveis. Transferiu-se o sedimento para um tubo Eppendorf de 500 pL para armazenamento a 4°C e utilizou-se como uma fonte de "fago amplificado" em cada ciclo de selecção ("panning").

Titularam-se os fagos do seguinte modo.

Para titulação de fagos recuperados em cada ciclo, utilizaram-se preparações de fago diluídas ΙΟ2, 103 e 104 vezes enquanto que para titulação de fagos amplificados utilizaram-se preparações diluidas ΙΟ7, 108 e 109 vezes. Utilizou-se TBS/gelatina (produto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) como uma solução de diluição e efectuou-se diluição de acordo com o seguinte esquema de diluição.

Diluição 102x: solução de fago (2 pL) + TBS/gelatina (198 pL)

Diluição 103x: TBS/gelatina l solução :90 pL) de fago diluida 102 vezes (10 pL) Diluição 104x: TBS/gelatina I solução ; 198 pL) de fago diluída 102 vezes (2 pL) Diluição 106χ TBS/gelatina ( : solução :198 pL) de fago diluida 104 vezes (2 pL) Diluição 107x TBS/gelatina ( : solução :90 pL) de fago diluida 106 vezes (10 pL) Diluição 108x TBS/gelatina ( : solução ; 198 pL) de fago diluida 106 vezes (2 pL) Diluição 109x TBS/gelatina ( : solução :90 pL) de fago diluida 108 vezes (10 pL) 37

ΕΡ 1 279 677 /PT Ο título de fago foi calculado a partir da seguinte equação. Título/mL = colónia χ 1020(pL)/200(pL) χ 1000(pL)/10(pL) χ factor de diluição

Calculou-se o título total dos fagos recuperados por multiplicação do valor anterior pelo volume total (mL) da solução de fago recuperada.

Dado que os fagos utilizados na reacção têm um título de 6,2 χ 1010, define-se taxa de recuperação (%) como "título total de fagos recuperados/6,2 χ ΙΟ10" χ 100. (5) Rastreio (ciclos de selecção {"biopanning")) para clones de fagos que estão ligados ao anticorpo anti-GD3.

Durante o rastreio {"biopanning") de clones de fagos que expressam péptidos capazes de se ligarem ao anticorpo GD3 4F6 com especificidade, com o objectivo de rastreio eficaz de fagos capazes de se ligarem à região Fab do anticorpo GD3 4F6, fez-se reagir o anticorpo GD3 4F6 com a biblioteca de fagos da qual se tinham previamente excluído fagos que se ligam a IgG padrão de ratinho e/ou proteína A recombinante-Sepharose.

Especificamente, realizou-se o "biopanning" através do seguinte procedimento.

Ciclo 1:

Dissolveram-se IgG padrão de ratinho - proteína A recombinante-Sepharose (10 pL) e proteína A recombinante-Sepharose (50 pL) em PBS (340 pL) e adicionou-se à mistura uma biblioteca de fagos (10 pL) (título 6,2 χ 1010) . Deixou-se a mistura reagir num tubo Eppendorf de 500 pL a 4°C durante a noite, seguido de centrifugação a 30 000 rpm durante 3 minutos para assim remover partículas de fago ligadas a IgG padrão de ratinho e/ou proteína A recombinante-Sepharose.

Transferiram-se o sobrenadante (380 pL) e o anticorpo GD3 4F6 - proteína A recombinante-Sepharose (50 pL) preparados na etapa (2) anterior para um tubo Eppendorf de 500 pL e deixou- 38

ΕΡ 1 279 677 /PT se reagir a 4°C durante 5 horas seguido de centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos.

Rejeitou-se o sobrenadante e adicionou-se pbs (0,5 mL) ao sedimento para assim preparar uma suspensão. Transferiu-se então a suspensão para um tubo Eppendorf de 1,5 mL seguido de centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos. Após repetição deste procedimento por duas vezes, rejeitou-se o sobrenadante e adicionou-se PBS (500 pL) ao sedimento, obtendo-se uma suspensão. Transferiu-se a suspensão para um tubo Eppendorf de 500 pL seguido de centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante, adicionou-se um tampão de extracção (50 pL) ao sedimento e deixou-se a mistura repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos com agitação suave de 3 em 3 minutos, seguido de centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos. Transferiu-se o sobrenadante para um concentrador (CentriconTM 30 Concentrator: produto de Amicon Corporation) e neutralizou-se com Tris 1 M (pH 9,1) (75 pL) e seguidamente adicionou-se TBS (2 mL) à mistura.

Centrifugou-se a mistura a 5000 rpm durante 20 minutos, adicionou-se TBS (2 mL) e efectuou-se centrifugação a 5000 rpm durante 20 minutos.

Transferiu-se a solução de fago que permaneceu no filtro do Centricon para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Lavou-se o filtro com TBS (50 pL) e adicionaram-se as lavagens ao tubo Eppendorf (volume total: 470 pL) . Amplificaram-se os fagos obtidos (4).

Ciclo 2:

Dissolveram-se os fagos amplificados (100 pL) preparados no ciclo 1 e IgG padrão de ratinho - proteína A recombinante-Sepharose (10 pL; 25 pg) em PBS (350 pL) e transferiu-se a mistura para um tubo Eppendorf de 500 pL para reacção a 4°C durante a noite. Subsequentemente, adicionou-se proteína A recombinante-Sepharose (50 pL) e deixou-se a mistura reagir a 4°C durante a noite e seguidamente centrifugou-se a 3000 rpm durante 3 minutos produzindo um sobrenadante (500 pL).

Transferiu-se o sobrenadante (500 pL) para um tubo Eppendorf de 1,5 mL, adicionou-se uma solução de anticorpo 39

ΕΡ 1 279 677 /PT anti-GD3 (1 mL) e deixou-se a mistura reagir a 4°C durante a noite seguido de separação por centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos.

Subsequentemente, adicionou-se à mistura proteína A recombinante-Sepharose (50 pL) e deixou-se a mistura reagir a 4°C durante 3 horas e seguidamente centrifugou-se a 3000 rpm durante 3 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e adicionou-se TBS (1 mL) ao sedimento para assim preparar uma suspensão. Transferiu-se a suspensão para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e seguidamente centrifugou-se a 3000 rpm durante 3 minutos. Após repetição deste procedimento por duas vezes, rejeitou-se o sobrenadante e adicionou-se um tampão de extracção (50 pL) ao sedimento e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 15 minutos com agitação suave efectuada de 3 em 3 minutos seguido de centrifugação a 3000 rpm durante 3 minutos. Transferiu-se o sobrenadante para um concentrador e neutralizou-se com Tris 1 M (pH 9,1) (75 pL) e seguidamente adicionou-se TBS (2 mL) à mistura. Centrifugou-se a mistura a 5000 rpm durante 20 minutos, adicionou-se TBS (2 mL) e efectuou-se centrifugação a 5000 rpm durante 20 minutos. Transferiu-se a solução de fago que permaneceu no filtro do Centricon para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Lavou-se o filtro com TBS (50 pL) e adicionaram-se as lavagens ao tubo Eppendorf (volume total: 230 pL). Amplificaram-se os fagos obtidos.

Ciclo 3:

Repetiu-se o procedimento geral utilizado para o ciclo 1 por utilização dos fagos amplificados (100 pL) preparados no ciclo 2. Assim, através de reacção de fagos com uma solução de anticorpo anti-GD3 obtiveram-se fagos amplificados. Centrifugaram-se os fagos assim obtidos por utilização de Centricon em que o eluído foi recuperado para uma quantidade total de 110 pL.

Apresentam-se na tabela 1 os resultados dos 3 ciclos de selecção ("panning") anteriores (taxas de recuperação de clones de fagos dos respectivos ciclos). 40

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Tabela 1 Título/poço fd tipo selvagem GD3R-1 GD3R-2 GD3R-3 GD3R-4 109 0,024 0,017 0,055 0,05 0,109 109 0, 08 0,026 0, 034 0,086 0,116 ItF 0, 045 0,067 0,128 0,058 0,14 1010 0, 044 0,055 0,109 0,017 0,102 1—1 o 1—* 0, 03 0,094 0, 049 0,094 0,386 10'11 0,029 0,086 0,012 0,108 0,315

Na tabela 1, "fd tipo selvagem" refere-se à estirpe de fago selvagem do protótipo (sem péptido a ser inserido) que foi proporcionado para construir as bibliotecas de fagos do exemplo 1. Os fagos prototípicos foram preparados através do processo seguinte e utilizados no presente ensaio. Sucintamente, clivaram-se vectores de fago formados de moléculas de ADN dos fagos que constituem a biblioteca de fago péptido para remoção dos locais de inserção de péptido e ligaram-se os fragmentos de vector remanescentes. Os vectores assim reconstruídos foram utilizados para transformar E. coli JM109 (adquirida de Takara), cultivaram-se os produtos de transformação resultantes com um meio NZY durante a noite e recuperaram-se os fagos amplificados. A sequenciação dos péptidos expressos pelos clones de fago preparados ao longo dos 3 ciclos de selecção {"panning") descritos acima foi efectuada do seguinte modo.

De cada uma das placas obtidas através da medição de título descrita acima efectuada após finalização de 3 ciclos de "biopanning", repicaram-se aleatoriamente 32 colónias arbitrárias, inocularam-se numa nova placa NZY e incubaram-se a 37°C durante a noite. A placa resultante, que serviu como placa principal, foi armazenada a 4°C.

Suspendeu-se cada colónia da placa principal num meio NZY (20 mL, contendo TC a 20 pg/ml) contido num tubo de centrífuga de 50 mL seguido por agitação da cultura a 200 rpm a 37°C durante a noite.

Sujeitou-se a cultura a separação por centrífuga a 3000 rpm durante 10 minutos. Transferiu-se o sobrenadante para 41

ΕΡ 1 279 677 /PT um tubo de centrífuga Oakridge e centrifugou-se a 12 000 rpm durante 10 minutos para assim remover células de E. coli. Transferiu-se o sobrenadante para outro tubo de centrífuga Oakridge e foi-lhe adicionado PEG6000/NaCl (3 mL; peg = polietilenoglicol) seguido de agitação extensiva. Deixou-se repousar a mistura resultante a 4°C durante 4 horas.

Subsequentemente, efectuou-se centrifugação a 12 000 rpm durante 10 minutos para provocar sedimentação dos fagos. Removeu-se o sobrenadante e suspendeu-se o sedimento de fago em TBS (1 mL). Transferiu-se a suspensão para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e centrifugou-se a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim remover substâncias insolúveis. Transferiu-se o sobrenadante para outro tubo Eppendorf, adicionou-se PEG/NaCl (150 pL) à mistura e esta foi extensivamente agitada e deixada em repouso a 4°C durante 1 hora.

Centrifugou-se a mistura a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim permitir precipitação dos fagos. Removeu-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento de fagos precipitado em TBS (200 pL) . Centrifugou-se a suspensão a 15 000 rpm durante 10 minutos para assim sedimentar substâncias insolúveis. Transferiu-se o sedimento para um tubo Eppendorf de 0,5 mL para armazenamento dos clones de fago a 4 °C. A extracção de ADN dos clones de fago assim obtidos foi efectuada do seguinte modo. Colocaram-se clones de fago, TBS e fenol saturado com TE (produzido por Nippon Gene Co., Ltd.) num tubo Eppendorf de 1,5 mL nas quantidades de 100 pL, 100 pL e 200 pL, respectivamente e agitou-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos e seguidamente sujeitou-se a separação por centrifugação a 15 000 rpm durante 10 minutos. Subsequentemente, adicionaram-se fenol saturado com TE (200 pL) e clorofórmio (200 pL) ao sobrenadante (fase aquosa; 200 pL) e agitou-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos seguido de separação por centrifugação a 15 000 rpm durante 10 minutos. Adicionaram-se TE (250 pL), acetato de sódio 3 M (40 pL), glicogénio 20 mg/mL (produto de Boehringer Mannheim; 1 pL) e etanol (1 ml) ao sobrenadante (fase aquosa; 150 pL) e deixou-se a mistura em repouso a -20°C durante uma hora num 42

ΕΡ 1 279 677 /PT tubo Eppendorf de 1,5 mL seguido de separação por centrifugação a 15 000 rpm durante 10 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante, adicionou-se cuidadosamente etanol a 80% (-20°C; 1 mL) ao resíduo e removeram-se os sais remanescentes através de separação por centrifugação a 15 000 rpm durante 10 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante, evaporou-se a humidade do interior do tubo e o ADN que precipitou foi dissolvido em água destilada esterilizada (10 pL) para armazenamento a 4°C.

Os ADN de fago assim obtidos foram submetidos a sequenciação de aminoácidos de péptidos. (6) Sequenciação de aminoácidos de péptidos seleccionados A sequência de aminoácidos de um péptido codificado pelo ADN do fago foi determinada pelo método de terminação com corante utilizando um kit de sequenciação de ADN (produzido por Perkin Elmer, código; 402079, lote; A6L015) de acordo com o manual em anexo ao kit. A sequência de ADN do iniciador, apresentada como SEQ ID NO: 10, foi sintetizada com um sintetizador automático de ADN. A reacção de alongamento de ADN foi efectuada utilizando um ciclizador térmico (modelo 9600, Perkin Elmer, 25 ciclos, cada ciclo consistindo de 96°C durante 10 segundos, 50°C durante 5 segundos e 60°C durante 4 minutos). Para

sequenciação de ADN utilizou-se um sequenciador de ADN (ABIPRISMTM 377, produto de ABI).

Dos 32 clones, determinaram-se com sucesso as sequências de ADN de 27 clones e classificaram-se em 4 tipos. Estes 4 tipos de péptidos, que se tomam como sendo péptidos miméticos de GD3, denominaram-se "GD3R1", "GD3R2", "GD3R3" e "GD3R4 (da maior para a menor ocorrência). A sequência de aminoácidos das quatro espécies de péptidos miméticos de GD3 assim determinadas são representadas pelas SEQ ID NO:l, 2, 3 e 4 e as sequências de ADN que codificam para essas 4 espécies de aminoácidos representam-se pelas SEQ ID NO:5, 6, 7 e 8. 43

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Exemplo 2 (Afinidade de ligação entre péptido mimético de GD3 e anticorpo anti-GD3 (ELISA))

Adicionou-se uma solução de NaHC03 0,1 M contendo cada um dos clones de fago obtidos no exemplo 1 (título de 1011, IO10 ou 109 /100 pL) aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços (produto de Nunc) para imobilização dos clones de fago à temperatura ambiente durante uma hora. Removeu-se o sobrenadante e seguidamente submeteram-se os poços a bloqueio por utilização de uma solução de bloqueio (400 mL; TBS contendo BSA a 1%, leite magro a 0,1% e Tween 20 a 0,02%; pH 7,5) a 37°C durante quatro horas.

Removeu-se o sobrenadante e seguidamente adicionou-se anticorpo GD3 4F6 (100 pL), servindo como um anticorpo primário, a cada poço para reacção com agitação à temperatura ambiente durante duas horas. Após finalização da reacção, removeu-se o sobrenadante e seguidamente lavaram-se os poços seis vezes com uma solução de lavagem (400 pL para cada poço, TBS contendo Tween 20 a 0,05%). Subsequentemente, adicionou-se aos poços um anticorpo secundário (IgG-HRP anti-ratinho, produto de Santa Cruz Biotechnology, n.° de catálogo SC-2031, n.° de lote C089) que foi diluído 5000 vezes por utilização de uma solução de bloqueio preparada antecipadamente (100 pL a cada poço) para reacção com agitação à temperatura ambiente durante uma hora. Após finalização da reacção, lavaram-se os poços quatro vezes com uma solução de lavagem (400 pL para cada poço) e seguidamente adicionou-se aos poços um reagente de detecção (TMB Microwell; produto de KPL, n.° de catálogo 50-76-04, n.° de lote WF075) (100 pL a cada poço) e deixou-se a mistura repousar durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se ácido clorídrico 1 N (100 pL) a cada poço para parar a reacção. Mediu-se a absorvância de cada poço a 450 nm e 620 nm e calculou-se "D.O.450 - D.O.620". Utilizou-se um Multiscan (produto de Labosystems) nas medidas de absorvância. Utilizou-se como branco um poço no qual não tinham sido imobilizados fagos e determinou-se a absorvância de cada poço por subtracção do valor do branco ao valor "tal como medido". 44

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Apresentam-se os resultados na figura 1. A figura 1 mostra que GD3R4 apresenta a afinidade de ligação mais forte relativamente ao anticorpo GD3 4F6.

Exemplo 3 (Síntese de péptido mimético de GD3 e afinidade de ligação ao anticorpo anti-GD3) (1) Síntese do péptido mimético de GD3

As quatro espécies de péptido mimético de GD3 obtidas no exemplo 1 foram sintetizadas através do método seguinte.

Sucintamente, por utilização de um sintetizador automático de péptidos (ACT357, produto de Advanced Chemtech) juntamente com um utilitário da mesma companhia, efectuou-se síntese em fase sólida dos respectivos péptidos através do método Fmoc/NMP, HOBt (Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo, NMP: N-metilpirrolidona, HOBt: 1-hidroxibenzotriazole).

De acordo com o programa de síntese, conceberam-se racionalmente péptidos isentos de terminal C (OH) por referência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1-4. Especificamente, a 0,25 mmol de "Fmoc-aminoácido-resina Alko" que correspondia ao aminoácido do terminal C do péptido de interesse, adicionaram-se sequencialmente Fmoc-aminoácidos correspondentes ao segundo aminoácido (relativamente ao terminal C) e aminoácidos subsequentes para alongamento da cadeia.

De igual modo, conceberam-se racionalmente péptidos apresentando uma amida no terminal C, do seguinte modo. De acordo com o programa de síntese, adicionou-se "Fmoc-aminoácido", que correspondia ao aminoácido do terminal C do péptido de interesse, a 0,25 mmol de "Fmoc-NH-resina SAL" para assim induzir uma reacção de condensação entre elas e subsequentemente ligaram-se Fmoc-aminoácidos correspondentes ao segundo aminoácido (relativamente ao terminal C) e causou-se ligação sequencialmente de aminoácidos subsequentes através de reacção de condensação para alongamento da cadeia. 45

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Após finalização da reacção desprotegeu-se o grupo Fmoc do terminal N de acordo com o programa.

Recolheu-se cada uma das resinas de péptido assim obtidas numa mini-coluna (produto de Assist) feita de polipropileno, seguido de lavagem com metanol e secagem no vácuo. Através do seguinte procedimento clivou-se o péptido da resina e removeram-se igualmente grupos protectores das cadeias laterais do péptido. Sucintamente, adicionou-se à resina reagente K (TFA a 82,5%, fenol a 5%, H20 a 5%, tioanisole a 5% e etanoditiol a 2,5%) (2 mL) e deixou-se prosseguir a reacção na mini-coluna durante 60 minutos.

Subsequentemente, adicionou-se gota a gota a mistura reaccional a éter dietilico frio (8 mL) parando assim a reacção e permitindo a precipitação do péptido. Seguidamente, lavou-se a mistura na mini-coluna com TFA (2 mL), adicionou-se éter dietilico frio (5 mL) à mistura, centrifugou-se a mistura e lavou-se o sedimento precipitado com éter dietilico (10 mL) quatro vezes. Seguidamente, solubilizou-se o péptido com acetonitrilo a 50% (cerca de 5 mL) e liofilizou-se. Repetiu-se este procedimento (solubilização e liofilização) duas vezes obtendo-se um produto de interesse em bruto liofilizado. O produto liofilizado foi fraccionado através de cromatografia liquida de elevada resolução (HPLC) de fase reversa utilizando uma coluna Octadecyl (20 (diâmetro) χ 250 mm, produto de YMC), para assim isolar o péptido de interesse.

As resinas e o derivado de aminoácido que foram utilizados no procedimento descrito acima são produtos de Watanabe.

Os respectivos péptidos assim isolados foram identificados através de sequenciação de aminoácidos e medições de peso molecular através de espectrometria de massa. (2) Sintese de péptidos multi-antigénicos

Sintetizaram-se péptidos multi-antigénicos a partir dos péptidos miméticos de GD3 (MAP) obtidos acima utilizando uma Fmoc-MAP-resina Alko (produto de Watanabe). 46

ΕΡ 1 279 677 /PT A reacção entre a Fmoc-MAP-resina Alko (Fmoc8-Lys4-Lys2-Lys-pAla-resina Alko) e cada um dos péptidos miméticos de GD3 processou-se do mesmo modo que o método de síntese em fase sólida descrito acima.

As estruturas dos MAP assim obtidos, apresentadas como representação de uma letra de resíduos de aminoácido, são as seguintes. Péptido MAP de SEQ ID N0:1: (LAPPRPRSELVFLSV)8-Lys4-Lys2-Lys-pAla Péptido MAP de SEQ ID NO:2: (PHFDSLLYPCELLGC) 8-LyS4-Lys2-Lys-pAla Péptido MAP de SEQ ID NO:3: (GLAPPDYAERFFLLS) 8-Lys4-Lys2-Lys-pAla Péptido MAP de SEQ ID NO:4: (RHAYRSMAEWGFLYS) 8-Lys4-Lys2-Lys-pAla (3) Afinidade de ligação ao anticorpo anti-GD3

Adicionou-se uma solução contendo NaHC03 0,1 M de péptido mimético de GD3 do invento sob a forma MAP anterior (100 ng/100 pL) aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços para imobilização à temperatura ambiente durante uma hora. Subsequentemente, de um modo semelhante ao método ELISA utilizado no exemplo 2, investigou-se a afinidade de ligação entre o péptido mimético de GD3 e o anticorpo GD3 4F6.

Utilizaram-se como controlos um anticorpo anti-GD2 e anticorpo anti-OAcGD3 (Cerato, E., et al., Hibridoma, 16(4), 307-316 (1997)) (estes anticorpos foram gentilmente cedidos pelo Dr. Portoukalian).

Apresentam-se os resultados na tabela 2 adiante. 47

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Tabela 2 % de soro 100% 50% 25% 12,50% Anticorpo anti-GD3 GD3R1 0,263 0, 137 0,127 0,083 GD3R2 0,264 0,159 0,105 0,055 GD3R3 0, 483 0, 357 0,237 0,176 GD3R4 0,381 0, 309 0,229 0,144 Anticorpo anti-GD2 GD2R1 0,123 0, 095 0, 067 0,065 GD2R2 0,132 0, 079 0, 071 0,052 GD2R3 0,191 0, 036 0,118 0,077 GD2R4 0,149 0,103 0, 072 0,061 Anticorpo anti-OAcGD3 GD3R1 0,053 0, 046 0,041 0, 04 GD3R2 0,038 0, 027 0,023 0, 021 GD3R3 0,044 0, 031 0,026 0,031 GD3R4 0,061 0, 047 0,043 0, 045

Tal como se torna evidente da tabela 2, entre outros péptidos miméticos, GD3R3 e GD3R4 apresentam ligação mais forte ao anticorpo anti-GD3. Adicionalmente, revelou-se que todos os péptidos se ligam ao anticorpo anti-GD3 com maior força do que aos anticorpos de controlo. (4) Sintese de péptido de fusão

Prepararam-se péptidos de fusão - fundidos com KLH -utilizando cada um dos péptidos miméticos de GD3 obtidos acima ou um seu MAP.

Sucintamente, adicionaram-se cada um dos péptidos sintetizados acima ou um seu MAP e KLH a uma solução de PBS (pH 7,4) contendo glutaraldeído a 0,25% a uma razão por peso de 1:10 e deixou-se a mistura reagir durante a noite à temperatura ambiente para assim sintetizar um péptido de fusão. 48

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Exemplo 4 (Imunização por utilização de um péptido mimético de GD3) (1) Imunização:

Dissolveram-se quatro espécies de péptidos miméticos de GD3 (MAP) obtidas no exemplo 3 (2) em PBS de modo a obter uma concentração de 200 pg/mL. Adicionou-se a solução a adjuvante completo (ou incompleto) de Freund (1:1, em volume) para assim preparar um emulsão.

Imunizaram-se oito ratinhos (C57BL/6) por administração subcutânea da emulsão anterior (0,2 mL/ratinho numa administração, 5 pg de péptido por ratinho). A administração foi efectuada de duas em duas semanas (na segunda administração e nas administrações subsequentes utilizou-se adjuvante incompleto de Freund). Uma semana após as respectivas administrações, recolheu-se sangue da cauda de cada ratinho para assim obter anti-soro. O anti-soro obtido imediatamente após a primeira administração será referido como "Io", o anti-soro obtido após a segunda administração será referido como "2o" e o anti-soro obtido após a terceira administração será referido como "3o". (2) Medição do titulo de anti-soro (ELISA): O titulo, contra GD3, de cada uma das amostras de anti-soro (3x8 ratinhos = 24 amostras) obtidas em (1) anterior foi medido através de ELISA como descrito adiante. O GD3 utilizado no ensaio foi gentilmente cedido pelo Dr. Portoukalian e foi um produto extraído de melanoma e purificado (J. Portoukalian et al., Int. Câncer, 49, 893-899 (1991)). GD3 foi purificado através de HPLC utilizando uma coluna de silica-gel (S i 6 0) (produto de Merck, E.U.A.) num cromatógrafo (Hitachi l-6200). O GD3 que tinha sido adsorvido à parede da coluna foi eluido com uma mistura de isopropanol/hexano/água purificada (com um gradiente desde 55/35/12 até 55/30/15 em volume) . O caudal na coluna foi de 4 mL por minuto. 49

ΕΡ 1 279 677 /PT Ο GD3 purificado assim obtido foi dissolvido em metanol a partir do qual se preparou uma solução de GD3 apresentando uma concentração de 10 pg/mL. Adicionou-se a solução de GD3 aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços em quantidades de 10 pL por poço (que corresponde a 100 ng de GD3 por poço) e evaporou-se o metanol. Subsequentemente, adicionou-se uma solução de bloqueio (TBS suplementado com BSA a 1%) aos poços em quantidades de 50 pL por poço para bloquear a 37°C durante 4 horas.

Rejeitou-se o sobrenadante. Diluiu-se cada uma das amostras de anti-soro obtidas em (1) anterior 100 vezes, 400 vezes ou 1600 vezes com a solução de bloqueio supramencionada. Adicionou-se o anti-soro diluído (50 pL) a cada poço para reacção a 4°C durante a noite. Lavou-se o poço seis vezes com TBS e seguidamente adicionou-se anticorpo IgG de ratinho marcado com HRP e diluído 5000 vezes com a solução de bloqueio (50 pL por poço) para reacção durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavou-se o poço quatro vezes com TBS e seguidamente detectou-se actividade enzimática (peroxidase) do poço com solução TMB (50 pL) . Parou-se a reacção com HC1 1 N (50 pL) e calculou-se o valor correspondente a "420 nm-620 nm".

Preparou-se uma amostra de controlo do seguinte modo. Primeiramente, sintetizou-se um péptido irrelevante (ou seja, um péptido de 15 resíduos de aminoácidos que é diferente de qualquer dos quatro péptidos obtido no exemplo 1 e que não tem afinidade de ligação com o anticorpo anti-GD3; a sequência encontra-se representada pela SEQ ID NO: 10) de um modo semelhante ao utilizado no exemplo 3. O péptido sintetizado foi administrado a um ratinho para imunização e o anti-soro obtido serviu como uma amostra de controlo. Obteve-se o título da amostra de controlo de um modo semelhante ao descrito acima. (Contudo, o número de ratinhos proporcionados foi de cinco e utilizou-se solução apenas 100 vezes diluída). Esta amostra de péptido de controlo foi também utilizada sob a forma de MAP como descrito acima.

Resumem-se nas tabelas 3 a 5 adiante os dados de reactividade das respectivas amostras de anti-soro com GD3. 50

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Tabela 3 GD3R-1 GD3R-2 Amostra n. 0 Factor de diluição Amostra n. 0 Factor de diluição 1/100 1/400 1/1600 1/100 1/400 1/1600 1-1° 0,034 0,017 0, 004 1-1° 0,316 0,252 0,179 2o 0,082 0,025 0, 01 2o 0,34 0,241 0,13 3o 0,023 0,01 0, 003 3o 0,113 0,099 0,036 2-1° 0,052 0,039 0, 007 2-1° 0, 062 0, 035 0,022 2o 0,087 0,027 0, 016 2o 0,183 0, 078 0,039 3o 0,068 0,019 0 3o 0, 08 0,075 0,023 3-1° 0,047 0,026 0 3-1° 0, 042 0, 031 0,053 2o 0,14 0,063 0, 022 2o 0,135 0, 049 0,035 3o 0,066 0,017 0, 002 3o 0, 053 0, 053 0,014 4-1° 0,106 0,057 0, 005 4-1° 0,114 0, 068 0,028 2o 0,188 0,088 0, 034 2o 0,142 0, 071 0,025 3o 0,084 0, 03 0, 008 3o 0, 057 0, 084 0,008 5-1° 0, 03 0,024 0 5-1° 0, 087 0, 05 0,045 2o 0,102 0,074 0, 019 2o 0,131 0, 034 0,016 3o 0,139 0,054 0, 003 3o 0,184 0,161 0,053 6-1° 0,055 0,052 0, 008 6-1° 0,155 0, 078 0,028 2o 0,117 0,047 0, 019 2o 0,115 0, 091 0,033 3o 0,084 0,021 0, 001 3o 0, 09 0, 089 0,028 7-1° 0,059 0,034 0 7-1° 0,076 0, 055 0,014 2o 0,168 0, 06 0, 014 2o 0,072 0, 039 0,016 3o 0,121 0,051 0, 004 3o 0, 05 0, 059 0,012 8-1° 0,061 0,027 0, 016 8-1° 0, 084 0, 044 0,034 2o 0,054 0,039 0, 024 2o 0, 069 0, 047 0,034 3o 0, 08 0, 03 0 3o 0, 098 0, 086 0,023 51

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Tabela 4 GD3R-3 GD3R-4 Amostra n. 0 Factor de diluição Amostra n. 0 Factor de diluição 1/100 1/400 1/1600 1/100 1/400 1/1600 1-1° 0, 062 0, 071 0, 015 1-1° 0, 086 0, 032 0, 007 2o 0, 08 0, 054 0, 024 2o 0,122 0, 058 0,019 3o 0, 047 0, 022 0,016 3o 0,116 0, 053 0,013 2-1° 0,169 0, 083 0, 017 2-1° 0, 042 0, 021 0, 014 2o 0,116 0, 078 0, 025 2o 0, 08 0, 07 0,022 3o 0,126 0, 039 0, 027 3o 0, 088 0, 042 0,008 3-1° 0,105 0, 077 0, 009 3-1° 0, 071 0, 047 0, 014 2o 0, 098 0, 079 0, 025 2o 0,164 0,114 0,026 3o 0,143 0, 032 0, 026 3o 0,176 0, 093 0,029 4-1° 0, 062 0, 004 0, 016 4-1° 0,247 0,108 0, 052 2o 0, 08 0, 112 0, 034 2o 0,195 0,128 0,062 3o 0, 069 0, 028 0, 018 3o 0,253 0,111 0,026 5-1° 0, 098 0, 048 0, 006 5-1° 0, 086 0, 033 0, 009 2o 0,165 0, 118 0, 022 2o 0,153 0, 093 0,033 3o 0,189 0, 073 0, 017 3o 0,19 0,104 0,022 6-1° 0, 051 0, 016 0, 023 6-1° 0, 08 0, 041 0,008 2o 0,132 0, 088 0, 027 2o 0,124 0,106 0,031 3o 0,189 0, 033 0, 018 3o 0,168 0, 098 0,039 7-1° 0, 04 0, 026 0, 003 7-1° 0, 063 0, 034 0,006 2o 0,135 0, 076 0, 018 2o 0,147 0, 079 0,041 3o 0, 073 0, 03 0, 013 3o 0,113 0, 045 0,013 8-1° 0, 165 0, 067 0, 031 8-1° 0, 082 0, 037 0, 012 2o 0, 179 0, 088 0, 07 2o 0, 05 0, 057 0,013 3o 0, 098 0, 023 0, 018 3o 0,147 0, 061 0,024 52

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Tabela 5 Péptido de controlo Amostra n.0 Factor de diluição 1/100 l-io 0,105 2o 0, 064 3o 0, 006 2-1° 0, 088 2o 0, 056 3o 0 3-1° 0, 057 2o 0, 042 3o 0, 007 4-lo 0, 041 2o 0, 028 3o 0, 004 5-1° 0, 051 2o 0, 031 3o 0, 031

Tal como se torna evidente a partir das tabelas 3 a 5, as amostras de anti-soro obtidas através da utilização como um imunogénio de um péptido mimético de GD3 do presente invento apresentam reacção cruzada com GD3; nomeadamente, as amostras obtidas através da utilização como um imunogénio de um GD3R4 do presente invento apresentam reactividade elevada relativamente a GD3. Contrariamente, verificou-se que as amostras de anti-soro obtidas através da utilização do péptido de controlo apresentavam fraca reactividade relativamente a GD3 e tomados conjuntamente sugere-se que os anti-soros obtidos através da utilização de um péptido mimético de GD3 do presente invento apresentam reacção cruzada com GD3.

Os resultados acima sugerem que péptidos miméticos de GD3 do presente invento, nomeadamente GD3R4, mimetizam uma parte da estrutura de GD3; ou seja, uma parte estrutural reconhecida pelo anticorpo anti-GD3 4F6. 53

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Exemplo 5 (Reactividade do péptido mimético de GD3) (1) De um modo semelhante ao descrito no exemplo 3, péptidos dos 9 resíduos de aminoácido do terminal N ou dos 9 resíduos de aminoácido do terminal C de GD3R1, GD3R2, GD3R3 ou GD3R4. A nomenclatura e sequências dos respectivos péptidos utilizados no presente ensaio são apresentadas na figura 2. Estes são utilizados como péptidos multi-antigénicos (MAP). (2) De modo a estender a investigação sobre a ligação entre o anticorpo anti-GD3 4F6 e cada um dos péptidos miméticos de GD3 apresentados na figura 1, submeteram-se péptidos multi-antigénicos (MAP) a ELISA. Proporcionaram-se as amostras MAP apresentando diferentes concentrações apresentadas no eixo dos xx da figura 3 e cada amostra foi imobilizada nos poços de uma placa de 96 poços.

Subsequentemente, bloquearam-se os poços com uma solução de bloqueio (TBS suplementado com BSA a 1%, leite magro a 0,1% e Tween 20 a 0,02%) a 4°C durante a noite. Adicionou-se 4F6 (sobrenadante de hibridoma: utilizado na forma tal como obtida) (100 pL/poço) para reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após finalização da reacção rejeitou-se o sobrenadante e lavaram-se os poços com uma solução de lavagem (TBS suplementado com FBS a 1% e Tween 20 a 0,05%) seis vezes. Subsequentemente, deixaram-se reagir os poços com IgG anti-ratinho marcado com peroxidase (1000 vezes diluído com uma solução de bloqueio) à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavaram-se novamente os poços quatro vezes com uma solução de lavagem e a quantidade de enzima peroxidase que permaneceu em cada poço foi detectada e determinada quantitativamente com o substrato TMB, após o que se investigou a ligação de MAP a 4F6. O ensaio foi efectuado em triplicado e os valores do gráfico são "média ± DP".

Tal como se conclui da figura 3, 4F6 liga-se aos péptidos miméticos de GD3 3 ou 4 de um modo dependente da quantidade. Apesar de parecer que a ligação a GD3 diminuiu a partir de concentração igual ou superior a 0,8 pg/poço, tal facto pode atribuir-se à quantidade excessiva de GD3 imobilizado presente na placa de ELISA que intensificou a hidrofobicidade inibindo assim a ligação ao anticorpo. 54

ΕΡ 1 279 677 /PT (3) A afinidade de ligação apresentada na figura 3 foi investigada por outro método. Sucintamente, proporcionaram-se as amostras de MAP com as diferentes concentrações apresentadas no eixo dos xx da figura 4. Cada amostra foi imobilizada nos poços de uma placa de 96 poços e deixaram-se os poços reagir com 4F6 (100 pL/poço) a 4°C durante a noite. No dia seguinte, recolheu-se o sobrenadante (80 pL) e adicionou-se aos poços de outra placa na qual se tinha imobilizado GD3 antecipadamente (100 ng/poço) para reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após finalização da reacção a quantidade de anticorpo 4F6 que tinha sido condensada com GD3 (ou seja, que não tinha sido absorvida por MAP) foi detectada e determinada quantitativamente através do método descrito em (2) anterior, tendo-se seguidamente investigado o efeito de inibição de MAP sobre a ligação de GD3 a 4F6. O ensaio foi efectuado em triplicado e os valores do gráfico são "média ± DP".

Em resultado, tal como apresentado na figura 4 e tal como no caso de GD3, verificou-se que ambos os péptidos miméticos de GD3 3 e 4 inibem a ligação de GD3 ao anticorpo e a inibição ocorreu de um modo dependente da quantidade imobilizada. (4) Seguidamente, efectuaram-se investigações para determinar se a ligação entre GD3R3 ou GD3R4 e 4F6 ocorria no local de ligação de GD3 em 4F6. Adicionaram-se simultaneamente aos poços de uma placa na qual se tinha imobilizado GD3 (100 ng/poço), cada uma das amostras de MAP com as diferentes concentrações apresentadas no eixo dos xx na figura 5 e 4F6 (100 pL/poço) e seguidamente efectuou-se um ensaio de inibição. O ensaio foi efectuado em triplicado e os valores no gráfico são "média ± DP".

Em resultado, tal como se verifica na figura 5, na gama de concentrações utilizada no presente ensaio, GD3R3, tal como GD3, apresentou efeito de inibição enquanto que R4 não apresentou tal efeito. Com base nestes resultados deduzem-se as duas conclusões seguintes. Primeiramente, a força de ligação entre 4F6 e cada um dos respectivos MAP diminui na ordem GD3 > GD3R3 > GD3R4. Em segundo lugar, GD3R3 liga-se no local de ligação de GD3 ou na sua vizinhança, de 4F6. 55

ΕΡ 1 279 677 /PT (5) Através do procedimento descrito acima, entre outros péptidos miméticos, verificou-se que GD3R3 se liga especificamente ao dominio de ligação de GD3 em 4F6 ou a um local próximo deste. Seguidamente, numa tentativa de determinar o dominio necessário para estabelecer ligação ao anticorpo anti-GD3 4F6 em péptidos miméticos de GD3, sintetizaram-se um MAP com os nove resíduos do terminal N do péptido GD3R3 e um MAP com os nove residuos do terminal C do péptido GD3R3 tal como apresentado na figura 2 e a sua ligação a 4F6 foi estudada utilizando ELISA. Efectuou-se ELISA em triplicado e os valores dos gráficos são "média ± DP".

Em resultado, torna-se evidente da figura 6 que se revelou que GD3R3C9 tinha capacidade comparável com a dos 15 residuos para inibir a ligação entre GD3 e 4F6 e a inibição ocorreu de um modo dependente da quantidade imobilizada.

Tomados conjuntamente, torna-se evidente que GD3R3 é o que apresenta uma ligação mais forte ao anticorpo anti-GD3 4F6 e que os nove residuos do terminal C (GD3R3C9) são críticos para o estabelecimento da ligação.

Exemplo 6 (Imunização com péptido de fusão) (1) Imunização

Efectuou-se imunização, tal como descrito em (1) anterior, utilizando um péptido de fusão R4-KLH obtido no exemplo 3(4) entre GD3R4 e KLH ou uma forma MAP de péptido de fusão R4MAP-KLH criada entre GD3R4 e KLH.

Sucintamente, administrou-se uma emulsão misturada com um adjuvante (1:1, em volume) a cada membro dos grupos de ratinhos, consistindo cada grupo em 3 ratinhos (CD-I) numa quantidade de 100 pL/ratinho (para uma administração (i.p.), péptido a 30 pg/ratinho) para imunização. No caso de R4-KLH a administração foi efectuada semanalmente durante um mês e subsequentemente quinzenalmente durante um mês; e no caso de R4MAP-KLH semanalmente durante 2 meses. Em qualquer dos casos, 4 dias após a imunização final recolheu—se sangue para assim preparar amostras de anti-soro. 56

ΕΡ 1 279 677 /PT

Tal como no caso de imunização com R4-KLH, prepararam-se igualmente amostras de anti-soro através de imunização com GD3 (30 pg).

(2) Ensaio de ELISA

Por utilização de uma placa de ELISA na qual se tinham imobilizado péptido GD3 ou GD3R4, repetiu-se o procedimento descrito no exemplo 4(2).

Placa com GD3 imobilizado: adicionou-se GD3 em metanol-PBS (1:1) (0,5 pg/50 pL) a cada poço e deixou-se a placa em repouso durante uma hora. Lavaram-se os poços com PBS e seguidamente adicionou-se-lhes HSA a 1% em PBS (200 pL/poço) para incubação a 37°C durante 2 horas, seguido de bloqueio dos poços.

Placa com péptido GD3R4 imobilizado: adicionou-se péptido GD3R4 (1 pg) dissolvido em tampão de bicarbonato 0,1 M (pH 9,5) a cada poço seguido de incubação a 37°C durante a noite e lavagem com PBS, seguido de bloqueio dos poços de um modo semelhante ao utilizado acima.

Diluiram-se as amostras de anti-soro obtidas no procedimento anterior com PBS fornecendo assim amostras de anti-soro diluídas 100 a 10 000 vezes. Adicionou-se cada uma das amostras de anti-soro diluídas resultantes (50 pL) a cada poço e deixou-se a mistura reagir durante uma hora. Subsequentemente, deixou-se a reacção progredir com anticorpo de imunoglobulina (anticorpo específico Ig, igM, IgG, IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3) anti-ratinho biotinilado durante uma hora e seguidamente com estreptoavidina-HRP durante uma hora de um modo semelhante, após o que se detectou actividade enzimática em cada poço tal como descrito acima (405 nm). (3) Ensaio de resposta celular

Cortou-se finamente o baço removido assepticamente de cada um dos ratinhos imunizados anteriores num meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%. Prepararam-se linfócitos ricos em células T por utilização de uma coluna de lã de nylon e contaram-se as células. Adicionou-se o meio anterior contendo 57

ΕΡ 1 279 677 /PT as células numa quantidade de IO5 células por 150 pL a cada um dos poços de uma placa de cultura. Adicionou-se PHA de modo a atingir uma concentração final de 1 pg/mL. Adicionou-se um péptido do presente invento ou qualquer dos diferentes gangliósidos em PBS e incubou-se a mistura durante 96 horas. Obteve-se um sobrenadante (100 pL) de cada poço. Determinou-se a actividade IL-2 do sobrenadante através da utilização de células de ratinho dependentes de IL-2, CTLL2. Sucintamente, adicionou-se aos poços o sobrenadante (100 pL) diluido 2 a 50 vezes com um meio numa quantidade de 104 células CTLL2/poço seguido de incubação a 37°C durante 48 horas. Subsequentemente, adicionou-se 3H-timidina (0,5 pCi) a cada poço seguido de incubação durante 6 horas. Recuperaram-se células CTLL2 num papel de filtro e contou-se 3H. (4) Resultados

Verificou-se que as amostras de anti-soro obtidas de imunização quer com R4-KLH quer com R4MAP-KLH continham anticorpos específicos que reagem tanto com o péptido GD3R4 como com GD3. Os titulos de anticorpos IgG e de anticorpos IgM foram praticamente os mesmos. Os resultados relativos à reactividade entre GD3 e anti-soro obtidos de imunização com R4-KLH são apresentados na figura 7. A reactividade entre GD3 e anti-soro obtido de imunização com R4MAP-KLH e a reactividade entre GD3 e anti-soro obtida de imunização com GD3R4 são apresentadas nas figuras 8 e 9, respectivamente.

Considera-se que os linfócitos ricos em células T de ratinhos imunizados com GD3 não estão activados porque a actividade IL-2 não foi detectada na presença de gangliósidos (tabela 6). Contudo, na presença do péptido GD3R4 ou do péptido GD3R3 confirmou-se a produção de IL-2 (tabela 6). Neste âmbito, nos ratinhos imunizados com R4-KLH, confirmou-se que as células T tinham sido activadas pelo péptido GD3R4 ou pelo péptido GD3R3 (tabela 7). Estes resultados indicam que os péptidos do presente invento induzem activação de células T especificas nos ratinhos imunizados com GD3. 58

ΕΡ 1 279 677 /PT

Tabela 6: Absorção de 3H timidina por células CTLL2 dependentes de IL-R incubadas em sobrenadante de cultura de células de baço de ratinhos imunizados com GD3 e estimulados com pha durante 96 horas (na presença de vários gangliósidos ou péptidos)

Estimulação (PHA 1 pg/mL+) Factor de 1/2 diluição do sobrenadante 1/5 1/20 de cultura 1/50 PHA sozinho 2631±248 17971169 804+82 183+19 GD3(0,5pg/ml) 27951175 1876+152 810+72 207+22 GD3(lpg/ml) 25681235 18341169 762+55 186127 GD3(2pg/ml) 2453+264 1901+188 758161 197+28 GD3(5pg/ml) 26561257 1857+185 794+68 179+23 GM3(0,5pg/ml) 256+248 1897+190 824+81 182+22 GM3(lpg/ml) 2792+218 1728+157 833+90 178+24 GM3(2pg/ml) 2725+232 1824+163 859+82 181+28 GM3(5pg/ml) 2658+247 1751+183 832+81 179+22 GM1(0,5pg/ml) 2754+282 1841+167 804+84 182+19 GM1(lpg/ml) 2649+255 1748+181 825+77 175+27 GM1(2pg/ml) 2842+248 1697+190 783+81 167+21 GMl(5pg/ml) 2737+264 1754+184 756+76 182+26 péptido R4(lpg/ml) 586711213 34181749 19941348 8811127 péptido R4(2pg/ml) 1267111643 834911014 32481613 12741156 péptido R4(5pg/ml) 1423711884 1135811563 75261839 26841387 péptido Rl(lpg/ml) 30141671 19671276 8881107 234+43 péptido Rl(2pg/ml) 3219+546 1831+259 906+121 246138 péptido Rl(5pg/ml) 33441497 1956+285 942+116 251144 péptido R2(lpg/ml) 29571326 1784+164 792188 185131 péptido R2(2pg/ml) 30571321 1719+184 8561107 192140 péptido R2(5pg/ml) 30221316 1717+198 9311124 203+36 péptido R3(lpg/ml) 40661853 2654+486 11531246 571+104 péptido R3(2pg/ml) 5791+1154 3243+634 1540+467 749+118 péptido R3(5pg/ml) 7536+1247 3528+543 1566+328 761+102

Os valores são médias ± EP (4 poços) 59

ΕΡ 1 279 677 /PT

Tabela 7: Absorção de 3H timidina por células CTLL2 dependentes de IL-2 incubadas em sobrenadante de cultura de células de baço de ratinhos imunizados com péptido R4 e estimulados com pha durante 96 horas (na presença de vários gangliósidos ou péptidos)

Estimulação Factor de diluição do sobrenadante de cultura (PHA 1 pg/mL+) 1/2 1/5 1/20 1/50 PHA sozinho 2732±265 1628+147 813+96 164+28 GD3 (0,5pg/ml) 26351308 17921154 850187 169125 GD3 (lpg/ml) 27211284 16581134 794182 202124 CD3(2pg/ml) 2797+295 17221163 809174 212128 GD3(5pg/ml) 2619+316 16361145 764168 184123 GM3(0,5pg/ml) 27411279 16831167 812184 167121 GM3(lpg/ml) 28141321 17281181 873190 194125 GM3(2pg/ml) 27541286 16191155 768183 157122 GM3 (5pg/ml) 26311264 15871163 729189 152126 GM1 (0,5pg/ml) 27501317 16831178 801193 204125 GM1 (1 pg/ml) 28121309 17151186 826175 210131 GM1 (2yg/ml) 2788+274 1664+191 837+78 224+29 GM1 (5pg/ml) 2764+285 1728+183 872+71 219+28 péptido R4 (lpg/ml) 6781+1549 4413+854 2420+561 1017+182 péptido R4 (2pg/ml) 15383+2194 10375+1708 7934+1031 2742+751 péptido R4 (5pg/ml) 18692+2310 12657+1624 8354+957 3058+568 péptido RI (lpg/ml) 3218+716 1876+281 949+136 225+38 péptido RI (2pg/ml) 3417+542 1864+327 845+147 220+40 péptido Rl(5pg/ml) 3469+612 1781+285 901+152 236+45 péptido R2(lpg/ml) 2857+493 1714+239 745+ 136 178+38 péptido R2(2pg/ml) 2764+322 1653+286 694+141 163+41 péptido R2(5pg/ml) 28491396 16281245 7481162 174132 péptido R3(lpg/ml) 557711063 29861 327 1491 1 364 6821 120 péptido R3(2pg/ml) 635111314 31841439 1527+ 337 7361137 péptido R3(5pg/ml) 789811496 36521681 16841375 8121151 Os valores são médias 1 EP (4 poços)

Aplicabilidade industrial

De acordo com o presente invento, proporcionam-se aqui novas sequências de aminoácidos que mimetizam GD3 expresso em tecido canceroso ou superfícies de células de cancro. Os péptidos miméticos de GD3 do presente invento contendo qualquer das sequências de aminoácidos são úteis para a preparação de fármacos, incluindo agentes de diagnóstico para cancro ou vacinas de cancro. Descreve-se aqui um método para o tratamento de cancro, método para diagnóstico de cancro, etc., contribuindo assim para a melhoria do efeito terapêutico da terapia do cancro. 60

ΕΡ 1 279 677 /PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Péptido mimético de GD3 <130> 0P0035 <150> JP P2000-124259 <151> 25-04-2000 <16 0> 10 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-1) < 4 0 0 > 1

Leu Ala Pro Pro Arg Pro Arg Ser Glu Leu Vai Phe Leu Ser Vai 15 10 15

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-2) < 4 0 0 > 2

Pro His Phe Asp Ser Leu Leu Tyr Pro Cys Glu Leu Leu Gly Cys 15 10 15

<210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-3) < 4 0 0 > 3

Gly Leu Ala Pro Pro Asp Tyr Ala Glu Arg Phe Phe Leu Leu Ser 1 5 10 15 61

ΕΡ 1 279 677 /PT

<210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-4) < 4 0 0 > 4

Arg His Ala Tyr Arg Ser Met Ala Glu Trp Gly Phe Leu Tyr Ser 15 10 15

<210> 5 <211> 45 <212> ADN <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-1) < 4 0 0 > 5 ctggctcctc ctcggccgcg ttctgagctg gtttttcttt ctgtt 45

<210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-2) < 4 0 0 > 6 ccgcattttg attcgttgct gtatccttgt gagctgctgg ggtgt 45

<210> 7 <211> 45 <212> ADN <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-3) < 4 0 0 > 7 ggtcttgctc cgccggatta tgctgagcgt ttttttcttc tttct 45

<210> 8 <211> 45 <212> ADN <213> Biblioteca de exibição em fagos (GD3R-4) < 4 0 0 > 8 cggcatgctt atggtctat ggctgagtgg gggtttctgt attct 40

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência de iniciador 62

ΕΡ 1 279 677 /PT < 4 Ο Ο > 9 taacactgag tttcgtcacc agta 24

<210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Biblioteca de exibição em fagos < 4 0 0 > 10

Ala Asp Gly Ala Arg Gly Gly Phe Ser Asp Thr Ser Arg Thr Gly Met 15 10 15

Vai Ser Vai Gly Ala Ala Gly 20

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 279 677 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido mimético de GD3 incluindo (i) a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N0:4; (ii) uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:4 por substituição, deleção, adição ou inserção de um resíduo de aminoácido; (iii) uma sequência de aminoácidos consistindo em 9 a 14 residuos de aminoácido contíguos contidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; ou (iv) uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO: 4 e apresentando uma homologia de 80% ou mais com SEQ ID NO:4, sendo o referido péptido mimético de GD3 capaz de se ligar a um anticorpo anti-GD3 e sendo capaz de induzir uma resposta imunitária anti-GD3.
2. Péptido mimético de GD3 de acordo com a reivindicação 1 fundido com uma proteina transportadora que aumenta a imunogenicidade.
3. Péptido mimético de GD3 fundido de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína transportadora é hemocianina de lapa Fissurella.
4. Péptido mimético de GD3 de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, que é um péptido imunogénico apresentado a capacidade de produzir um anticorpo específico de GD3.
5. Péptido mimético de GD3 de acordo com a reivindicação 1, incluindo uma sequência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:4 e apresentando uma homologia de 90% ou mais com SEQ ID NO:4, em que o referido péptido mimético de GD3 é capaz de se ligar a um anticorpo anti-GD3 e é capaz de induzir uma resposta imunitária anti-GD3.
6. Péptido mimético de GD3 de acordo com a reivindicação 1, que consiste da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4. ΕΡ 1 279 677 /PT 2/2
7. Composição farmacêutica contendo, como um ingrediente activo, um péptido mimético de GD3 tal como citado em qualquer das reivindicações 1 a 6.
8. Sequência de ADN que codifica o péptido mimético de GD3 tal como definido em qualquer das reivindicações 1 a 6.
9. Péptido mimético de GD3 multi-antigénico incluindo o péptido mimético de GD3 como definido na reivindicação 1.
10. Péptido mimético de GD3 multi-antigénico de acordo com a reivindicação 9, incluindo adicionalmente (i) uma sequência de aminoácidos seleccionada de qualquer uma de SEQ ID NO:l a 4; (ii) uma sequência de aminoácidos derivada de qualquer uma de SEQ id NO:l a 4 por substituição, deleção, adição ou inserção de um resíduo de aminoácido; (iii) uma sequência de aminoácidos consistindo em 9 a 14 resíduos de aminoácido contíguos contidos em qualquer uma de SEQ ID NO:l a 4; ou (iv) uma sequência de aminoácidos derivada de qualquer uma de SEQ ID N0:1 a 4 e apresentado uma homologia de 80% ou mais com SEQ ID N0:1 a 4, respectivamente. Lisboa,