BRPI0708332A2 - flavivìrus pseudoinfeccioso e uso deste - Google Patents

Abstract

FLAVIVìRUS PSEUDOINFECCIOSO E USOS DESTE A presente invenção descreve um vírus pseudoinfeccioso deficiente de replicação que pertence á família Flavívirídae que não tem o gene capsídeo, onde o vírus pseudoinfeccioso deficiente de replicação propaga somente em células que ex- pressarn o capsideo ou proteína capsídeo, prM e envelope do fiavivírus. A presente invenção também descreve o método de produzir tais vírus em grande escala e o uso destes vírus pseudoinfeccíosos como vacinas para prevenção de doenças causadas por infecções humanas ou animais pelos vírus que pertencem a esta família.

Description

"FLAVIVÍRUS PSEUDOINFECCIOSO E USOS DESTE"ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito aos campos da biolo-gia molecular, virologia e imunologia. Em geral, a presenteinvenção descreve a construção de vírus deficientes de re-plicação que pertencem à família Flaviviridae e seus usoscomo vacina na prevenção de doenças causadas por vírus quepertencem a esta família. Mais especificamente, a presenteinvenção fornece flavivírus deficientes de replicação ouflavivírus pseudoinfecciosos (PIV aka RepliVAX) e descreveseus usos como vacinas preventivas contra doenças associadas

Descrição da Tecnologia Relacionada

O gene Flavivírus da família Flaviviridae contém umavariedade de importantes patógenos humanos e animais e foramclassificados em quatro complexos antigênicos distintos combase nas diferenças na reatividade em testes imunológicos.No geral, o flavivírus circula entre hospedeiros de amplifi-cação de aves e mamíferos e vetores de mosquito ou carrapa-to.

O genoma do flavivírus é um RNA envelopado de fitasimples de polaridade positiva que não tem uma seqüência po-li (A) 3' terminal. Ele codifica um único polipeptídeo que éco- e pós-transducionalmente processado nas proteínas estru-turais virais, C, prM/M, e E, partículas virais de formação,e as proteínas não estruturais, NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,NS4B e NS5, necessárias para replicação do genoma viral eseu empacotamento em virions infecciosos (Chambers, 1990) .Virions contêm uma única cópia de RNA genômico viral erapaco-tada em um nucleocapsideo contendo proteína C, circundadopor lipideo envelope que suporta heterodímeros de proteínasM e E. Ao contrário de muitos outros vírus envelopados, ainteração entre nucleocapsideo e envelope pregado não é mui-to específica e envelope contendo M/E pode eficientemente seformar em volta do nucleocapsideo derivado de flavivírus he-terólogo, demonstrando nível limitado de homologia na se-qüência do capsídeo (Lorenz, 2002) . Alternativamente, a ex-pressão de prM e E na ausência de C pode levar à formação departículas subvirais (SVPs), que não contêm nenhum RNA ouproteína C (Mason, 1991).

Cassetes PrM/M-E que produzem partículas subvirais sãoa base de vários candidatos a vacina que são conhecidos natecnologia. Estes candidatos a vacina incluem vacinas de su-bunidade (Konishi, 1992; 2001; 2002; Qiao, 2004), DNA (Phil-lpotts, 1996; Kochel, 1997; Schmaljohn, 1997; Colombage,1998; Aberle, 1999; Konishi, 2000; Konishi, 2000; Kochel,2000; Davis, 2001), e de vetores vivos (Mason, 1991 ; Koni-shi, 1992; Pincus, 1992; Fonseca, 1994; Pugachev, 1995; Co-lombage, 1998; Kanesa, 2000; Minke, 2004) . Entretanto, estasvacinas têm sérias desvantagens. Por exemplo, as vacinas desubunidades são seguras para usar, mas difíceis de produzirgrandes quantidades; as vacinas de DNA são fracamente imuno-gênicas e as vacinas de vetores virais sofrem de falta depotência na presença de imunidade do vetor.

Desta forma, a despeito de uma grande preocupação comrelação às doenças associadas ao flavivírus e continuo espa-Ihamento do flavivírus em novas áreas, terapêuticas antivi-rais ainda não foram desenvolvidas para estas infecções, eum número muito limitado de vacinas aprovadas foi produzidoaté hoje. Vacinas virais inativadas (INVs) foram licenciadaspara prevenir encefalite transmitida por carrapato (TBEV) eEncefalite japonesa (JEV). Entretanto, assim como outras va-cinas virais inativadas, estas vacinas têm baixa potêncialimitada e requerem múltiplas vacinações. A despeito destasdesvantagens, a encefalite japonesa e encefalite transmitidapor carrapato INVs têm. uma vantagem de bons registros de se-gurança. O única vacina atenuada viva licenciada (LAV) paraum flavivírus é a vacina atenuada viva amplamente utilizadaa base da cepa 17D do vírus da febre amarela (YFV) que foidesenvolvida por passagem em série da cepa Asibi tipo selva-gem do vírus da febre amarela em tecidos de embrião de gali-nha. Embora esta vacina atenuada viva seja considerada muitosegura e efetiva, casos de febre amarela em vacinas foramreportados, incluindo um caso recente era recrutas militaresdos US (Gerasimon, 2005) . Além disso, esta vacina não é re-comendada para uso em crianças, mulheres grávidas ou nos in-divíduos imunocomprometidos devido aos efeitos adversos, in-cluindo encefalite associada à vacina.

Entretanto, o desenvolvimento dos sistemas genéticosreversos para flavivírus levou à produção e projeto de novostipos de vacina atenuada viva, a base de atenuação racionaldestes vírus. Esta classe inédita de vacinas inclui quimerasa base de vírus da febre amarela 17D, em que o cassete dofragmento do genoma que codifica o vírus da febre amarelaprM-E foi substituído pelo cassete prM-E derivado do flavi-vírus heterólogo (Chambers, 1999) . Abordagem a base de vírusquiméricos similares foi aplicada para espinhas dorsais abase de dengue e TBE (Pletnev, 2002; Huang, 2003). Na maio-ria dos casos, flavivírus quiméricos demonstram um fenótipoaltamente atenuado e são capazes de elicitar eficiente res-posta imune protetora e proteger contra a seguinte infecçãocom vírus, cujas proteínas estruturais são expressas pelasquimeras (Monath, 2002). A vacinação efetiva com estes can-didatos quiméricos à vacina parece não ser prevenida pelaimunidade do "vetor" pré-existente (Monath, 2002), que in-terferiu com a potência das vacinas virais recombinantes abase de outros vetores virais. Adicionalmente, embora osflavivírus quiméricos devam fornecer uma abordagem universalrazoável para produzir vacinas inéditas, existem preocupa-ções de que as quimeras em si devem ser patogênicas (Cham-bers, 1999) pelo menos nos indivíduos imunocomprometidos, ouque quimeras patogênicas devem surgir, uma vez que mutaçõesforam detectadas durante o processo de propagação destes ví-rus (Pugachev, 2004) .

Uma outra direção promissora no desenvolvimento de va-cina é baseada na criação de deleções irreparáveis no genomado flavivírus que faz replicação de vírus produtiva no hos-pedeiro vacinado tanto um menos eficiente quanto um eventoimpossível. No último caso, genomas virais que codificam to-do o maquinário replicativo, mas que não têm, por exemplo, aregião que codifica C, podem ser distribuídos para imuniza-ção in vivo tanto como RNA sintetizado in vitro, capaz deauto-replicação (Kofler, 2004; Aberle, 2005), quanto prova-velmente na forma de DNA (mediante o controle dos promotoresde RNA polimerase II ou como RNA sintetizado in vitro, capazde auto-replicação (Kofler, 2004; Aberle, 2005). A imuniza-ção direta com genomas de RNA defeituosos sintetizados invitro, que especifica a produção de SVPs na ausência de umciclo de replicação viral completo, demonstrou ser segura eefetiva na produção de imunidade protetora (Kofler, 2004;Aberle, 2005). Entretanto, pode haver obstáculos significa-tivos na produção de um candidato a vacina a base de RNA,devido a questões de síntese, estabilidade e distribuição.

Assim, a tecnologia anterior é deficiente em seguran-ça, tipo potente e efetivo de vacina que pode ser usada con-tra doenças causadas por infecção com vírus que pertencem àfamília Flaviviridae. A presente invenção preenche esta ne-cessidade e desejo a longo prazo na tecnologia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido umvírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação da famíliaFlaviviridae. Um vírus pseudoinfeccioso deficiente em repli-cação Flaviviridae compreende: uma deleção na proteína (C)do capsídeo que codifica a seqüência de nucleotídeo, de ma-neira tal que a deleção não interrompe a seqüência de RNAnecessária para ciclização do genoma, a seqüência de sinalpara proteína prM que é necessária para a própria maturaçãode prM/M ou uma combinação destes, onde o vírus pseudoinfec-cioso deficiente em replicação replica somente em célulasque expressam proteína C ou C, prM, proteína envelope, pro-teína C mutada, prM mutada, proteína envelope mutada ou com-binações destes do vírus da família .-Flaviviridae.

Em uma outra modalidade relacionada da presente inven-ção, é fornecido um sistema de cultura celular que expressaproteína C ou C5 prM, proteína envelope, proteína C mutada,prM mutada, proteína envelope mutada ou combinações . destesdo vírus da família Flaviviridae efetivos para possibilitara propagação do vírus pseudoinfeccioso deficiente em repli-cação descrito anteriormente da família Flaviviridae em con-dições adequadas.

Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, éfornecido um método de produzir o vírus pseudoinfeccioso de-ficiente em replicação da família Flaviviridae descrito an-teriormente. Um método como este compreende gerar um víruspseudoinfeccioso deficiente em replicação da família Flavi-viridae que compreende deleção no gene do capsídeo, de ma-neira tal que a deleção não interrompe a seqüência de RNAnecessária para ciclização do genoma, a seqüência de sinalpara proteína prM que é necessária para a maturação adequadade prM/M ou uma combinação destes; gerar uma linhagem celu-lar que expressa proteína C ou C, prM, proteína envelope,proteína C mutada, prM mutada, proteína envelope mutada oucombinações destes do vírus da família Flaviviridae, onde alinhagem celular fornece altos níveis das proteínas do Fla-viviridae necessári para a propagação do vírus pseudoinfec-cioso deficiente em replicação da família Flaviviridae; einfectar a linhagem celular com o vírus pseudoinfeccioso dafamília Flaviviridae, produzindo assim o vírus pseudoinfec-cioso deficiente em replicação da família Flaviviridae.

Em uma outra modalidade relacionada da presente inven-ção, é fornecida uma combinação farmacêutica, compreendendoo vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação da famíliaFlaviviridae produzido pelo método aqui descrito.

Em uma modalidade adicional relacionada da presenteinvenção, é fornecido um método de proteger um sujeito deinfecções resultantes da exposição a Flaviviridae. Um métodocomo este compreende administrar ao sujeito uma quantidadeimunologicamente efetiva da combinação farmacêutica produzi-da pelo método descrito aqui, que elicita uma resposta imunecontra o Flaviviridae no sujeito, protegendo assim o sujeitodas infecções.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A figura 1 é uma representação esquemática da replica-ção de flavivírus PIV nas células que produzem C ou todas asproteínas estruturais virais para trans-complementação dodefeito. A replicação de PIVs em células normais in vivo ouin vitro leva a liberação de SVPs sem nenhum nucleocapsídeo.

As figuras 2A-2C mostram que linhagens celulares queexpressam C de YFV e C de YFV, prM e E podem complementar areplicação de PIV de YF. A figura 2 A é uma representaçãoesquemática do genoma PIV de YF que expressa YFV e GFP. Afigura 2B é uma representação esquemática de replicons VEEVque expressam o gene Pac e C de YFV com o peptídeo sinal doprM (C ancorado; VEErep/Cl/Pac) , ou C ancorado com 20 a. a.de prM (VEErep/C2/Pac) , ou todas as proteínas estruturaisYFV (VEErep/C-prM-E/Pac). A figura 2C mostra a liberação dePIV de YF pelas linhagens celulares transfectadas com genomaPIV sintetizado in vitro. 0 meio foi substituído nos pontosde tempo indicados, e títulos de PIVs foram determinados. Assetas indicam pontos de tempo quando células foram subpassa-das em uma razão de 1:5.

As figuras 3A-3B mostram curvas de crescimento de PIVde YF nas linhagens celulares de empacotamento. Células BHK-21 contendo replicons VEErep/C2/Pac e VEErep/C-prM-E/Pac fo-ram infectadas com PIV de YF nos MOIs indicados em unidadesinfecciosas por célula. Nos tempos indicados, os meios foramsubstituídos e os títulos de PIV liberado foram determina-dos. As setas indicam pontos de tempo quando células foramsubpassadas em uma razão de 1 :5. A figura 3A mostra a curvade crescimento a MOI 10 inf.u/célula e a figura 3B mostra acurva de crescimento a MOI 0,1 inf.u/célula. As figuras 4A-4C mostram que células que expressam gene C otimizado no có-don produziram PIV de YF. A figura 4 A mostra a seqüência denucleotídeo do gene sintético. As mutações introduzidas sãoindicadas por letras minúsculas (SEQ ID NO: 1). A figura 4Bmostra curvas de crescimento de PIV de YF nas linhagens ce-lulares de empacotamento. Células BHK-21 contendo repliconsVEErep/C2/Pac, VEErep/C-prM-E/Pac, VEErep/C2opt/Pac e VEE-rep/Copt-prM-E/Pac foram infectadas com PIV de YF nos MOIsindicados em unidades infecciosas por célula. Nos tempos in-dicados, o meio doi substituído e títulos de PIV liberadoforam determinados. A figura 4C mostra placas desenvolvidasem linhagem celular contendo VEErep/C2opt/Pac por YFV e PIVde YF depois de 4 dias de incubação a 37 °C.

As figuras 5A-5C mostram que PIV de WN desenvolve es-palhamento de infecção nas células empacotadas. A figura 5Aé uma representação esquemática do genoma PIV de WN e repli-con VEEV que expressa os genes estruturais WNV. A figura 5Bmostra que PIV de WN produziu foci de células positivas paraantigeno WNV (reveladas com um anticorpo tparao infecção me-diante NSl de células BHK(VEErep/C*-E*-Pac) depois de 70 ho-ras de incubação. A figura 5C mostra que as mesmas prepara-ções PIV de WN produziram somente células infectadas únicas(reveladas a 70 horas depois da infecção com o mesmo métodode manchamento com tragacanto usado na figura 5B) em infec-ção de monocamadas de célula Vero.

As figuras 6A-6C mostram detecção de proteína E medi-ante liberação de células infectadas com YF e PIVs de WN. Nafigura 6A, células BHK-21 foram infectadas com PIV de YF aum MOI de 5 inf.u/célula. Os SVPs liberados foram coletadose purificados por ultracentrifugação. Amostras foram resol-vidas por SDS PAGE, transferidas para filtros, proteína Efoi detectada por D1-4G2 MAB. Meio coletado das células nãoinfectadas, coluna 1; meio coletado das células infectadascom PIV de YF a 48 horas depois da infecção, coluna 2; meiocoletado das células infectadas com PIV de YFs a 72 horasdepois da infecção, coluna 3; YFV (2X107 PFU) , coluna 4. Nafigura 6B, células vero foram infectadas com PIV de WN por24 horas, e então porções do fluido de cultura clarificado(coletado antes que qualquer Iise celular fosse detectada),foram resolvidas por SDS PAGE, transferidas para filtros, ereagiram com um MAB especifico de E (7H2; Bioreliance) . Rea-ção das mesmas amostras com soro policlonal não falharam pa-ra revelar quaisquer proteínas não estruturais associadas àcélula nesta preparação (resultados não apresentados) con-firmando que a proteína E foi ativamente secretada. Amostrade WNV, coluna 1; meio coletado de células não infectadas,coluna 2; meio coletado das células infectadas com PIV de WNa 48 horas depois da infecção, coluna 3. Na figura 6C, umwestern blot que mostra o teor de proteína E de frações pre-paradas de um gradiente de densidade de sacarose obtidas deSVPs coletadas de células BHK normais (não empacotadas) ele-troporadas com PIV de YFV RNA. O pico de reatividade da pro-teína E (a 32 % de sacarose) correspondeu à densidade deSVPs e de acordo com este fato, migraram mais lentamente queYFV corrido em uma análise lado-a-lado (42 %) .

As figuras 7A-7F mostram representação esquemática deplasmídeos usados para produção de vírus pseudoinfeccioso(PIV) da febre amarela (YF) e West Nile (WN) . A figura 7Amostra pYFPIV, a figura 7B mostra pWNPIV, a figura 7C mostrapVEErep/Cl/Pac, a figura 7D mostra pVEErep/C2/Pac, a figura7E mostra pVEErep/C3/PAc, a figura 7F mostra pVEErep/C*- E*-Pac.

As figuras 8A-8V mostram as seqüências dos plasmídeosaqui usados. As figuras 8A-8D mostram seqüência de pYFPIV(SEQ ID NO: 6) ,| a figuras 8E-8H mostra seqüência de pVEE-rep/Cl/Pac (SEQ ID NO: 7), a figuras 8I-8K mostra seqüênciade pVEErep/C2/Pac (SEQ ID NO: 8), a figuras 8L-80 mostra se-qüência de pVEErep/C-prM-E/Pac (SEQ ID NO: 9), a figuras 8P-8R mostra seqüência de pVEErep/C2opt/pac (SEQ ID NO: 10), afiguras 8S-8 V mostra seqüência de pVEErep/Copt-prM-E/Pac(SEQ ID NO: 11) .

A figura 9 mostra uma representação esquemática dasregiões de sobreposição de RepliVAX e o replicon VEE usadopara fornecer C em trans. Trinta e seis mutações foram inse-ridas no VEErep/pac-Ubi-C* para minimizar recombinação homó-loga com o fragmento de C codificada pelo genoma RepliVAX.2Posição das seqüências CS 51 e 3' no genoma RepliVAX.

A figura 10 mostra comparação lado a lado de foci in-feccioso produzido na linhagem celular que expressa C{BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)} por RepliVAX WN na passagem 0 (apartir da eletroporação) e passagem 10 revela que variantesque crescxem melhor são prontamente selecionadas.

A figura 11 mostra titulação de RepliVAX PIV produzidoem células Vero certificadas por WHO contendo um cassete deexpressão de C (VEErep/Pac-Ubi-C*). Embora o PIV resultanteseja de um titulo ligeiramente inferior que o produzido nascélulas BHK, as múltiplas células Vero coletam de PIV de al-to titulo, que não é possível com células BHK.

As figuras 12A-12B mostram mutantes de ciclização. Afigura 12A mostra replicação de replicon WNV/IRES-RLuc comúnica base, o pareamento perfeito das mutações CS demonstraque algumas imitações de base única replicam em níveis WT. Aparte esquerda do painel mostra o genoma de teste acima dasseqüências CS 5' e 3' . 0 lado direito mostra níveis de re-plicação detectados usando reportador Rluc, na forma de umaporcentagem do níveis de replicação WT. Bases sublinhadasdenotam bases mutadas. A figura 12B mostra replicação de re-plicon WNV/IRES- RLuc com pareamento perfeito das o mudançasde base dupla (ml 7) derivadas pela combinação de mlO e ml3(Painel A) , comparado aos níveis de replicação detectadoscom mutantes que combinam o WT e CS mutado em ambos os for-matos possíveis, juntamente com um mutante projetado paraproduzir uma polimerase inativa (controle negativo). A parteesquerda do painel mostra o genoma de teste acima das se-qüências CS 5' e 3'. 0 lado direito mostra níveis de repli-cação detectados usando reportador Rluc, na forma de umaporcentagem dos níveis de replicação WT. Bases sublinhadasdenotam bases mutadas. * denota nenhuma replicação detecta-da .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Vacinas seguras e efetivas somente foram produzidaspara poucas doenças causadas por flavivírus. Os métodos devacina viral inativada clássica (INV) e vacina atenuada viva(LAV) que foram usados para produzir vacinas para YF, JE, eTBEV ainda não produziram produtos lisenciados para prevenirdoenças causadas por outros flavivírus, notavelmente denguee encefalite do West Nile (WNE). Ainda existem preocupaçõesde segurança sobre a existência de produtos de LAVs (viru-lência residual ou reversão para virulência) e INV (reatoge-nicidade devido à carga de antígeno e antígenos adventitio-sos). Adicionalmente, INVs normalmente requer múltiplas va-cinações. Adicionalmente, ambos os tipos de vacinas são sub-metidas a assuntos de produção, incluindo a necessidade deevitar reversão à virulência durante a propagação da vacinaatenuada viva, e devido às quantidades de material necessá-rio para produzir forte resposta imunes aos produtos de va-cina viral inativada e a necessidade de altas instalações derefreamento para propagar o virus virulento usado para pro-duzir produtos INV. Embora existam candidatos promissorespara tipos inéditos de vacinas de flavivirus, o caminho paraseus desenvolvimentos precisará sobrepor estes problemas.

A presente invenção, no geral, é descrita para cons-trução e utilização de virus pseudoinfectivo deficiente emreplicação que pertencem à família Flaviviridae. Com relaçãoa isto, a presente invenção descreve o desenvolvimento de umtipo inédito de flavivirus deficiente em replicação tambémreferido como RepliVAX que combina a segurança das vaciansinativadas com a eficácia e escalabilidade das vacinas ate-nuadas vivas. Estes flavivirus, também identificados comovírus pseudoinfecciosos (PIVs) na presente invenção, contêmgenoma geneticamente modificado por engenharia do flaviví-russ com uma deleção da maioria das regiões que codificam ocapsídeo (C), prevenindo assim este genoma de produzir pro-genia infecciosa nas linhagens celulares normais ou animaisvacinados. Entretanto, estes vírus pseudoinfecciosos podemser propagados em linhagens celulares que expressam tanto Cquanto um cassete C-prM-E, onde eles replicam a altos ní-veis. Assim, estes flavivirus pseudoinfecciosos não podemdesenvolver o espalhamento de infecção em células normais invitro ou in vivo devido à falta de complementação trans pelaproteína C e , desta forma, são incapazes de causar doença emanimais. Ao contrário das vacinas e dos métodos para gerarestas vacinas que são conhecidso na tecnologia, a presenteinvenção fornece um sistema para produção em escala indus-trial de flavivirus pseudoinfecciosos que tornaria tais va-cinas mais baratas de se produzir que as vacians inativadasmao mesmo tempo tornando-as mais seguras para uso que as va-cina atenuada vivas. Então fornecendo um tipo inédito de va-cina recombinante que é capaz de somente uma única rodada dereplicação nos animais ou humanos imunizados levando à libe-ração de partículas subvirais (SVPs) que não têm o materialgenético, mas que servem como imunógenos eficientes.

A presente invenção demonstrou que flavivirus pseudo-infecciosos pode ser gerado tanto para vírus da febre amare-la (YFV) quanto para vírus West Nile (WNV) . Com base nisto,a presente invenção contempla que o método descrito aqui po-de ser amplamente aplicável ao desenvolvimento de vacinascontra outros flavivirus. Adicionalmente, infecção de linha-gens celulares normais com tais flavivirus pseudoinfecciososproduziu SVPs que não tinham nucleocapsídeo e um materialgenético. 0 flavivirus pseudoinfecciosos aqui descrito de-monstrou incapacidade de causar qualquer doença e assim fo-ram seguros. Adicionalmente, estes flavivirus pseudoinfec-ciosos foram imunogênicos em camundongos devido a competên-cia para única rodada de replicação e liberação de SVPs, an-tígenos de apresentação viral. PIVs de WN também protegeramcamundongos de uma encefalite letal depois do desafio com WNV.

Os PIVs aqui descritos podem ser produzidos de uma ma-neira que permite produção de alto rendimento em cultura ce-lular, e incapacidade de causar doença em animais. Estesprodutos podem ser distribuídos a animais onde seu processode replicação defeituosa previne o espalhamento e doença,mas permitiu a produção de SVPs, um imunógeno da subunidadede flavivírus que mostrou ser efetivo na elicitação de umaresposta imune eficaz contra doença causada por vários fla-vivírus.

A presente invenção também demonstrou que a abordagemdo flavivírus pseudoinfecciosos pode ser aplicada a doisflavivírus transmitidos por mosquito distantemente relacio-nados. A aplicabilidade de uma tecnologia similar para o de-senvolvimento de vacinas a base de RNA para um flavivírustransmitidos por carrapato (Kofler, 2004) indica que a tec-nologia a base de PIV será aplicável a flavivírus mais dis-tantemente relacionados. Adicionalmente, o trabalho com va-cinas TBEV a base de RNA indica que além das respostas deanticorpo aos SVPs (similar à aqui descrita), a introduçãode genoma do flavivíruss ativo na replicação nas células dohospedeiro vacinados igualmente produzirá respostas de célu-la T (Kofler, 2004; Aberle, 2005). Embora as respostas decélula T não tenham sido medidas aqui, contempla-se que osPIVs são capazes de induzir resposta de célula T que imitaas produzidas pela infecção viral.

Embora as vacinas PIV aqui descritas contem com a mes-ma estratégia de replicação de flavivírus e produção de SVPque foi utilizada pelas vacinas a base de RNA preparadas pa-ra TBEV (Kofler, 2004; Aberle, 2005), estas vacinas de PIVque não necessitam distribuição de disparo de gene dos ani-mais, podem prontamente crescer em culturas celulares, e po-dem ser submetidas aos mesmos tipos de condições de estabi-lização e armazenamento (secagem com congelamento) atualmen-te aplicadas à vacina YFV 17D comercialmente produzida, for-necendo assim um produto de vacina graduável, armazenável evendável. Estudos preliminares de estabilidade de RepliVAXWN mostraram gue preparações secas por congelamento não a-presentam nenhuma perda detectável no titulo guando armaze-nadas por 30 dias a 4C.

Para desenvolver as condições de crescimento de altonivel necessárias para eficiente complementação trans (e as-sim produção) de flavivirus pseudoinfecciosos, a presenteinvenção utilizou células gue expressam altos níveis de C(ou C-prM-E) a partir de replicons VEEV. Replicons VEEV sãomenos citopáticos gue os replicons derivados de outros alfa-vírus e printamente estabelecem replicações persistentes emalgumas linhagens celulares de origem vertebrada e inseto.Este sistema parece ser adeguado para produção de flaviviruspseudoinf ecciosos, uma vez gue i) Replicons VEEV são alta-mente eficientes na síntese de proteínas heterólogas e, napresente invenção C sintetizado ao nível necessário para en-capsidação do genoma do flavivirus. ii) Replicons VEEV nãointerferem detectavelmente com a replicação de flavivirus(Petrakova, 2005) . Além disso, replicons VEE e os genomasPIV de YF podem replicar juntos em células BHK- 21 sem cau-sar CPE. iii) Replicons VEEV podem ser empacotados em altostítulos em vírions VEE gue podem ser usados para rápido es-tabelecimento das linhagens celulares de empacotamento queproduzem proteína(s) estrutural de flavivirus.

Além disso, o exame do efeito do contexto da expressãode C na produção de PIV indicou que as células empacotadasque expressam a forma ancorada de C com um adicional de 20um.um. de prM produziu mais partículas que as células queexpressam C ancorada sozinhas, sugerindo a importância daseqüência apropriada de processamento de eventos na formaçãode vírions. A base para a melhor eficiência de empacotamen-to, pelo construtor contendo os primeiros 20 aminoácidos, deprM não é clara, mas este fenômeno deve ser explicado poruma necessidade de ordem específica de clivagem nos dois lo-cais de clivagem próximos (específico NS2B/NS3- e peptidasesinal) (Yamshchikov e Compans, 1994) e/ou diferenças na dis-trubuição/estabilidade de produtos de proteína C nestes doisdiferentes contextos. Além do mais, observou-se que a co-expressão de C com prM e E (VEErep/C-prM-E/Pac) causou so-mente menor aumento na produção de PIV comparado a VEE-rep/C2/Pac, que expressou C âncora com o fragmento de prM.Quando a otimização do códon dos genes de C codificados porreplicon VEEV foi examinada para determinar se esta altera-ção da seqüência do gene C melhorou a produção de PIV, elanão revelou uma forte diferença na liberação de PIV de YFV apartir das células que não expressam um gene C otimizado nocódon. Esta observação sugeriu que mesmo com os repliconsVEEV do gene não otimizado parece produzir C em um nível desaturação. Estes resultados foram consistentes com outrosestudos que demostram que as linhagens celulares que expres-saram replicons VEEV que codificam o cassete WNV C-E produ-ziram nivel de E maior que o detectado nas células infecta-das WNV. A despeito da incapacidade do gene C otimizado ex-presso por trans de aumentar a produção de PIV de YF, as cé-lulas que hospedam o replicon VEEV que expressa Copt desen-volveram CPE e produziram placas quando infectadas com PIVde YF. Isto torna uma infecção PIV nas células Copt aindamais similar a infecção desencolcida pelo virus competentede replicação. Uma vantagem adicional de usar replicons VEEVque codificam um gene C de YFVopt na produção de flaviviruspseudoinf eccioso foi o nivel de segurança, uma vez que asmudanças nos códons reduziram a chance de recombinação homó-loga com o genoma do flavivirus pseudoinfeccioso. Além dis-so, o gene Copt também foi alterado na sua seqüência de ci-clização (da forma aqui descrita para a região que codificaC WNV nas células BHK (VEErep/C*-E*-Pac) ), para reduzir achance de recombinação que produz um flavivirus que codificaC ativo na replicação. Até hoje, nem os sistemas PIV WN nemos YF aqui descritos produziram flavivirus ativos na repli-cação que podem ser detectados tanto em cultura celularquanto em animais altamente suscetíveis. Adicionalmente, ex-perimentos in vivo demonstratam que PIVs tanto YF quanto WNforam seguros e não podem causar nenhuma doença mesmo depoisda inoculação i.e. de camundongos com 3- a 4- dias de idadecom a maior dose dos PIVs. Todavia, PIVs WN foram capazes deinduzir altos níveis de anticorpos neutralizantes e protege-ram camundongos contra infecção com WNV competente de replicação.

Além disso, hepatite C está na mesma posição que aAIDS como uma principal causa infecciosa de morbidade e mor-talidade para os quais nenhuma vacina está atualmente dispo-nível. No Japão e Coréia, HCV atualmente excede a hepatite Bem contribuição ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelu-lar, um dos tipos mais comuns de câncer e um modo comum demorte devido a doença do fígado. Este padrão é provável dese tornar crescentemente comum em outros países da Ásia e emqualquer outro em desenvolvimento, devido a crescente preva-lência de HCV acoplado com imunização efetiva contra hepati-te B . Em algumas comunidades no Egito ou em outro lugar, aprevalência de infecção por hepatite C é espetacularmentealta, provavelmente devido, pelo menso em parte, às tradi-cionais práticas de cuidado de saúde e/ou a introdução detecnologias de Western perigosas no passado (por exemplo,transmissão por agulha do vírus durante campanhas de saúdepúblicas direcionadas contra esquistossomose).

Em muitos países em desenvolvimento, onde as taxas decâncer de fígado e cirrose são altas, existe pouco controleefetivo de hepatite C durante a transfusão sangüínea. A he-patite C também é um principal problema de saúde pública nosEstados Unidos, onde exitem aproximadamente 4 milhões deportadores de HCV, muitos dos quais estão em risco de mortedevido a doença de fígado de estágio terminal ou câncer nofígado. Atualmente estima-se que existem entre 8.000 e10.000 de mortes anualmente devido a hepatite C nos EstadosUnidos. Este número é provável de triplicar nos próximos 10-20 anos, potencialmente excedendo o número de mortes devidoa AIDS, na ausência de novas medidas terapêuticas ou preven-tivas .

Ainda, nenhuma vacina está disponível para prevençãodesta infecção, e esforços (tanto national quanto interna-cional) de desenvolver uma vacina são severamente limitadosdevido às dificuldades técnicas percebidas, pouco interesseno desenvolvimento de vacina, no geral na parte da indústriafarmacêutica, e à inércia das principais agências de finan-ciamento. E, assim como muitas doenças infecciosas, está emdesvantagem os que estão em maior risco de sérias doenças defígado ou morte devido à hepatite C.

Atualmente, tentativas de criar uma vacina efetivacontra infecção por HCV não foram bem sucedidas. Entretanto,nos últimos anos, o campo do HCV começou rapidamente a sedesenvolver e agora este vírus se replica em cultura de te-cidos a títulos razoavelmente altos, aproximadamente 10<6>inf.u/ml. Existem inúmeras similaridades óbvias entre o ge-noma do HCV e os genomas de outros flavivírus, tipo YF, JEV,TBE e outros. Desta forma, a estratégia de projetar flaviví-rus deficientes de replicação pode ser aplicada não somenteaos membros do gênero Flavivirus, mas igualmente ao gêneroHepacivirus (que inclui HCV) . A proteína capsídeo HCV podeser produzida por replicons de alfavírus recombinente (a ba-se de SINV, VEEV EEEV e outros) em inúmeras linhagens celu-lares, incluindo células Huh-7 e Huh-7.5 que são atualmenteconhecidas como suscetíveis a infecção por HCV. Genomas deHCV deficientes de replicação, que não têm o gene do capsí-deo, podem ser transfectados nas linhagens celulares queproduzem capsídeo e serão empacotados em partículas contendocapsídeo infecciosas. Os successivos ciclos de infecção ne-cessários para a produção em grande escala, podem ser reali-zados igualmente nestas células. Entretanto, in vivo, no he-patócito naive (e possivelmente outros tipos celulares), osgenomas de HCV que não têm o gene do capsideo completo ounenhum gene do capsideo de modo algum, produzirão somente asproteínas virais não estruturais, e glicoproteínas El e E2.Estas proteínas serão apresentadas ao sistema imune i) de-pois da degradação do proteassoma; ii) na superfície celulare iii) na forma de partículas tipo vírus com El- e E2-contendo envelope. A deficiência de capsídeo tornará o vírusincapaz de se espalhar eassim limitado às células infectadaspela dosagem da vacinação.

Em resumo, a presente invenção demonstrou que flaviví-rus pseudoinfecciosos deficientes de capsídeo i) podem pro-duzir um espalhamento da infecção nas linhagens celularesque expressam capsídeo ou em todos os genes estruturais deflavivírus; ii) PIVs foram incapazes de produzir espalhamen-to da infecção em células normais, (iii) PIVs produziramproteína E contendo SVPs quando eles infectatam células nor-mais; (iv) PIVs apresentaram um alto nível de segurança nosanimais; (v) PIVs protegera os camundongos de subsequenteinfecção por flavivírus. Tomadas juntas, a presente invençãodemonstrou que PIVs de flavivírus deve ser uma plataformasegura, potente e eficaz para desenvolver vacinas contra in-fecções por flavivírus e infecções causadas por vírus simi-lares ao flavivírus. A presente invenção é direcionada a umFlaviviridae pseudoinfeccioso deficiente de replicação, com-preendendo: uma deleção na proteína (C) do capsideo que co-difica a seqüência de nucleotideo, de maneira tal que a de-leção não rompe a seqüência de RNA necessária para cicliza-ção do genoraa, a seqüência de sinal para proteína prM que énecessária para a maturação adequada de prM/M ou uma combi-nação destes, onde o Flaviviridae replica somente nas célu-las que expressam proteína C ou C5 prM, proteína envelope,proteína C mutada, prM mutada, proteína envelope mutada oucombinações destes de um vírus da família Flaviviridae. Nogeral, o Flaviviridae compreende um vírus que pertence aogênero flavivírus, Hepacivirus ou Pestivirus ou outras qui-meras do dito vírus criados pela troca dos cassetes prM-E deoutros vírus com os cassetes prM-E do Flaviviridae pseudoin-feccioso. Os exemplos dos vírus que pertencem ao gênero Fla-vivírus não são limitados, mas podem incluir vírus da febreamarela, vírus West Nile, vírus da dengue, vírus da encefa-Iite transportado por carrapato, vírus da encefalite de Sa-int Louis, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalitede Murray Valley. Além disso, o exemplo do vírus que perten-ce ao gênero Hepacivirus inclui, mas sem limitações, vírusda hepatite C e os que pertencem ao gênero Pestivirus inclu-em, mas sem limitações, vírus da diarréia bovina, um vírusda febre suína ou um vírus da cólera de porco.

No caso de flavivírus, a seqüência de nucleotideo quecodifica a proteína C do Flavivírus que é deletado pode co-dificar aminoácidos 26 a 100 ou uma combinação de aminoáci-dos nos aminoácidos 26 a 100 da proteína C. Tais combinaçõespodem incluir, mas sem limitações, aminoácidos 26-93, 31-100ou 31-93. Um versado na tecnologia pode usar os mesmos guiaspara deletar a seqüência de nucleotideo da proteína C de ou-tros virus que pertencem à família Flaviviridae ou outrosvírus com o mesmo material genético que estes vírus. Em ge-ral e aplicável a todos os vírus, o gene deletado é substi-tuído por um gene que codifica uma proteína marcadora ou umantígeno. O exemplo de uma proteína marcadora pode incluir,mas sem limitações, uma proteína fluorescente verde.

A presente invenção também é direcionada a um sistemade cultura celular que expressa proteína C ou C, prM, prote-ína envelope, proteína C mutada, prM mutada, proteína enve-lope mutada ou combinações destes de um vírus da famíliaFlaviviridae, efetivo para possibilitar a propagação do Fla-viviridae deficiente em replicação descrito anteriormente emcondições adequadas. Para este propósito, as células que ex-pressam proteínas tipo selvagem ou mutado do Flaviviridaepodem ser geradas usando replicons geneticamente modificadospor engenharia derivados de vetores virais.

Em geral, o gene que codifica a proteína (s) do vírusdo vírus família Flaviviridae no replicon é substituído poruma versão otimizada do códon do gene que codifica a proteí-na (s) do vírus, de maneira tal que a substituição reduza acapacidade dos genes codificados pela linhagem celular derecombinar com o genoma do vírus pseudoinfeccioso da famíliaFlaviviridae e/ou aumentar a produção do vírus pseudoinfec-cioso da família Flaviviridae.

Por exemplo, tais replicons podem expressar uma prote-ína C que compreende mutações em pelo menos 36 posições denucleotideo do gene que codifica proteína C do vírus da fa-mília Flaviviridae. 0 replicon pode expressar uma proteína Cno replicon que compreende seqüências de ciclização não na-turais, de maneira tal que a presença da seqüência de cicli-zaçãos reduza as chances de recombinação produtiva do víruspseudoinfeccioso deficiente de replicação com vírus natural.

Adicionalmente, o replicon pode expressar as proteínas com-preendendo seqüências de nucleotídeos alteradas que codifi-cam junção C-prM truncada, de maneira tal que a presença detais seqüências alteradas melhore a produção do vírus pseu-doinfeccioso deficiente de replicação na cultura celular,produção de SVP contendo prM/E in vivo ou uma combinaçãodestes.

Além disso, os replicons que expressam as proteínas deFlaviviridae são introduzidos nas células por transfecçãocom replicons de RNA sintetizados in vitro, por transfecçãocom DNAs de plasmídeo projetados para sintetizar repliconsalfavirais funcionais de promotores específicos de RNA poli-merase II celular ou por infecção com replicons alfaviraisempacotados dentro das proteínas estruturais alfavirais. Osvetores virais aqui usados podem ser alfavírus. Exemplos re-presentativos de tais alfavírus não se limitam, mas podemincluir vírus da encefalite eqüina venezuelana (VEEV), VírusSindbis, Vírus da encefalite eqüina oriental (EEEV), Vírusda encefalite eqüina ocidental (WEEV) ou Vírus de Ross River.

A presente invenção é adicionalmente direcionada a ummétodo de produzir um vírus pseudoinfeccioso deficiente emreplicação da família Flaviviridae, compreendendo; gerar umvírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação da famíliaFlaviviridae que compreende uma deleção no gene do capsídeo,de maneira tal que a deleção não rompa a seqüência de RNAnecessária para ciclização do genoma, a seqüência de sinalpara proteína prM que é necessária para a maturação adequadade prM/M ou uma combinação destes; gerar uma linhagem celu-lar que expressa proteína C ou C, prM, proteína envelope,proteína C mutada, prM mutada, proteína envelope mutada oucombinações destes de um vírus da família Flaviviridae, ondea linhagem celular fornece altos níveos das proteínas neces-sárias para propagação do vírus pseudoinfeccioso deficienteem replicação da família Flaviviridae; e infectar a linhagemcelular com o vírus pseudoinfeccioso da família Flavivirida-e, produzindo assim o vírus pseudoinfeccioso deficiente emreplicação da família Flaviviridae. Todos os outros aspectoscom relação aos tipos de vírus, a posição das deleções nogene do capsídeo, o método de gerar a linhagem celular queexpressa as proteínas tipo mutada e selvagem do Flavivirida-e, o tipo de replicons e as mutações nos replicons e as mo-dificações no gene que codifica as proteínas tipo mutada eselvagem do Flaviviridae nos replicons são os mesmos discu-tidos anteriormente.

A presente invenção também é direcionada a uma combi-nação farmacêutica, compreendendo o vírus pseudoinfecciosodeficiente em replicação da família Flaviviridae produzidopelo método descrito anteriormente. A presente invenção éadicionalmente direcionada a um método de proteger um sujei-to de infecções resultantes da exposição ao Flaviviridae,compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade imunolo-gicamente efetiva da combinação farmacêutica aqui descrita,onde a composição elicita uma resposta imune contra o Flavi-viridae no sujeito, protegendo assim o sujeito das infec-ções. Uma composição como esta pode ser administrada por viaintraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intramuscular,oral ou intranasal. Além disso, o sujeito que se beneficiado uso desta composição pode ser um humano ou um animal.

Da forma aqui usada, o termo, "um" ou "uma" pode sig-nificar um ou mais. Da forma aqui usada na reivindicação (s),quando usadas em conjunto com a palavra "compreendendo", apalavra "um" ou "uma" pode significar um ou mais que um. Daforma aqui usada "um outro" ou "outro" pode significar pelomenos um segundo ou mais do mesmo ou diferente elemento dereivindicação ou componentes deste. Da forma aqui usada, otermo "Flaviviridae" inclui os gêneros Flavivirus, Hepacivi-rus e Pestivirus. Os exemplos de virus que pertencem ao gê-nero Flavivirus incluem, mas sem limitações, virus da febreamarela, virus do West Nile, virus da dengue, um virus daencefalite transmitido por carrapato um virus da encefalitede Saint Louis, um virus da encefalite japonesa ou um virusda encefalite de Murray Valley. Similarmente, o exemplo dovirus que pertence ao gênero do virus Hepaci inclui, mas semlimitações, virus da hepatice C e os que pertencem ao gêneroPestivirus incluem, mas sem limitações, virus da diarréiabovina, um virus da febre suina ou um virus da cólera de porco.Além disso, embora a presente invenção descreva aconstrução e utilidade de um Flaviviridae pseudoinfecciosodeficiente de replicação que pertence ao gênero Flaviviri-dus, um versado na tecnologia pode usar as mesmas linhas pa-ra construir quimeras compreendendo outros virus que perten-cem ao Flaviviridae ou para construir quimeras trocando oscassetes prM-E do virus.no Flaviviridae ou outros virus si-milares e os virus no Falviviridae. As combinações farmacêu-ticas compreendendo o virus pseudoinfeccioso que pertencem àfamília Flaviviridae aqui discutidas podem ser administradasconcorrente ou seqüencialmente uma com a outra das combina-ções farmacêuticas). O efeito da co-administração de taiscomposições é proteger um indivíduo das infecções causadaspor tais vírus e outra doença tratável com vacina. A compo-sição aqui descrita, a outra combinação farmacêutica, oucombinação destes pode ser administrada independentemente,tanto sistematica quanto localmente, por qualquer método pa-drão na tecnologia, por exemplo, subcutânea, intravenosa,parenteral, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular,tópica, enteral, retal, nasal, bucal, vaginalmente ou porjato de inalação, por bomba de medicamento ou contido em a-desivo ou implante transdérmico. Formulações de dose da com-posição aqui descrita podem compreender carreadores ou veí-culos convencionais atóxicos, fisiologica ou farmaceutica-mente aceitáveis para o método de administração e são bemconhecidas por um indivíduo versado na tecnologia.

A composição, aqui descrita, a outra combinação farma-cêutica ou combinação desta, desta forma, pode ser adminis-trada independentemente uma ou mais vezes para alcançar,manter ou melhorar um efeito terapêutico. Versados na técni-ca sabem como determinar a dosagem ou se uma dosagem adequa-da de uma ou outra ou ambas as composições compreende umaúnica dosagem administrada ou múltiplas dosagens administra-das. Uma dosagem apropriada depende da saúde do sujeito, daproteção do indivíduo das infecções flavivirais, da via deadministração e da formulação usada.

Os seguintes exemplos são dados para propósitos ilus-trativos de várias modalidades da invenção e não se destinama limitar a presente invenção de nenhuma maneira. Um versadona tecnologia prontamente perceberá que a presente invençãoé bem adaptada para realizar os objeticos e obter as finali-dades e vantagens mencionadas, bem como os objetivos, fina-lidades e vantagens inerentes aqui. Mudanças nela e outrosusos que estão englobados no espírito da invenção, da formadefinida pelo escopo das reivindicações, ocorrerão para osversados na tecnologia.

EXEMPLO 1

Culturas celulares

As células BHK-21 foram fornecidas por Paul Olivo (Wa-shington University, St. Louis, Mo) . Elas foram mantidas a37 °C em meio essencial mínimo alfa (aMEM) suplementado comsoro bovino fetal 10 % (FBS) e vitaminas. Células Vero cer-tificadas por WHO, originalmente preparadas para uso na pro-dução de uma vacina humana, foram fornecidas por Dr. SteveWhitehead da NIH. células Vero foram mantidas em MEM conten-do FBS 6 %.EXEMPLO 2

Construtores de plasmídeo

Técnicas de DNA recombinante padrão foram usadas paratodas as construções de plasmideo. Uma representação esque-mática dos plasmideos usados é apresentada nas figuras 7A-7F. Maps e seqüências são apresentadas nas figuras 8A-8F. 0plasmideo parental de baixo número de cópias pACNR/FLYF-17Dxcontendo cDNA infeccioso do genoma da cepa YFV 17D foi des-crito em outro lugar (Bredenbeek et al. , 2003) e fornecidopor Dr. Charles M. Rice (Rockefeller University, New York,N. Y.). pYFPIV continha genoma YFV defeituoso (PIV de YF),em que aminoácidos 26-93 que codificam fragmento do gene YFdo capsideo foram substituídos por gene GFP otimizado porcódon derivado de pEGFP-Nl (Clontech) . O genoma PIV de WN(pWNPIV) foi derivado de um cDNA infeccioso do Texas 2002(Rossi et al., 2005), por fusão de códon 30 ao C para códon101 de C (ver figura 5A). Os plasmideos pVEErep/Cl/Pac, pVE-Erep/C2/Pac e pVEErep/C-prM-E/Pac (Figura 2A) codificaramReplicons subgenômicos duplos VEEV, em que o promeito promo-tor subgenômico foi na condução da transcrição dos RNAs con-tendo 5'UTR de RNA de VEEV 26S seguido pelas seqüências,correspondendo ao nt 119-481, 119-541 e 119-2452 do genomaYFV, respectivamente. 0 segundo promotor subgenômico foi nacondução da expressão do gene da puromicina acetiltransfera-se (Pac), cujo produto foi a preparação de células resistan-tes a interrupção de tradução causada por puromicina (Pur).Replicons VEEV não citopáticos que expressam o cassete C-prM-E de WNV {derivado de um replicon do vírus Sindbis (S-cholle et al., 2004)} fundido ao gene Pac (designado pVEE-rep/C*-E*-Pac) foram criados a partir de um replicon VEE nãocitopático (Petrakova et al., 2005); seqüência que codificaE foi fundida com gene Pac por meio de um ligante que con-siste nos primeiros 9 códons de NSl e os últimos 25 códonsde NS2B, seguido por 2 códons de NS3 fundidos diretamente aoFMDV. 2 A (ver figura 5A). A seqüência otimizada pelo códonque codifica capsideo YFV 17D e os primeiros 20 aminoácidosde prM foram progetados usando os dados de freqüência de có-don descritos em outro lugar (Haas et al., 1996). Este genefoi sintetizado por PCR a partir de oligonucleotideos sinté-ticos de sobreposição. O fragmento amplificado foi sequenci-ado antes da clonagem nos cassetes de expressão VEE-rep/C2opt/Pac e VEErep/Copt- prM-E/Pac. Os últimos repliconstinham essencialmente os mesmos projetos que pVEErep/C2/Pace pVEErep/C-prM-E/Pac, mas continham seqüência otimizada pe-lo códon apresentada na figura 4A.

Adicionalmente, um WN-RepliVAX quimérico que expressao JEV prM-E também foi gerado. Isto foi construído substitu-indo os genes prM e E da cepa Nakayama de JEV em A RepliVAXque codifica o genoma WNV. A troca do gene foi alcançada porfusão direta do último códon da proteína C truncada WNV parao primeiro códon do prM que codifica a seqüência de JEV (Na-kayama strain). A mesma estratégia de fusão foi empregada naextremidade 3' do cassete, com o códon final da proteína EJEV fundido diretamente ao primeiro códon de NSl de WNV. Es-tas fusões foram introduzidas em um plasmídeo BAC que codi-fica todo o cDNA de RepliVAX WN ligado por um promotor T7 euma ribozima, e o RNA recuperado deste DNA BAC foi introdu-zido nas células BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*). 0 RepliVAX resul-tante (designado RepliVAX JE) levou ao espalhamento de focoinfeccioso em BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*). Como para RepliVAX WN,o foco formado nesta linhagem celular é menor que o produzi-do por uma quimera WNV-JEV completamente infecciosa. Repli-VAX JE cresce em títulos aproximadamente 10 vezes menoresque RepliVAX WN, alcançando títulos de mais de IO5 U/mL emBHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)· Conforme esperado, RepliVAX JE reagecom MAbs específicos de JE, e percebeu-se que tipo flaviví-rus quiméricos, RepliVAX JE induzirá altos níveis de anti-corpos neutralizantes de JEV e protegem contra JE.

EXEMPLO 3

Transcrições de RNA

Plasmídeos foram purificados por centrifugação em gra-dientes CsCl. Antes da reação de transcrição, os plasmídeosforam linearizados por XhoI (para pYFPIV) ou MhuI (para re-plicon VEE e helper VEE que codificam plasmídeos) ou Swal(para pWNPIV). RNAs foram sintetizados por RNA polimeraseSP6 ou T7 na presença de análogo cap. A produção e integri-dade das transcrições foram analisadas por eletroforese emgel em condições de desnaturação. Alíquotas das reações detranscrição foram usadas para eletroporação sem purificaçãoadicional.

EXEMPLO 4

Análise de transfecçãos de RNA e replicação de PIV

Eletroporação de células BHK-21 foi realizada em con-dições previamente descritas (Liljestrom et al., 1991). PArao estabelecimento de empacotamento de culturas celulares,Pur foi adicionada ao meio a uma concentração de 10 g/mL 24horas depois da eletroporação dos replicons VEEV. A trans-fecção de genoma PIV de YF sintetizado in vitro foi realiza-da 5 dias depois, quando células contendo replicon resumiramcrescimento eficiente. Amostras foram coletadas nos pontosde tempo indicados nas figuras substituindo o meio pelo mes-mo meio, contendo Pur. Em muitos experimentos, células queSecretamsPIV foram divididas quando atingiram confluência.

Replicons VEEV foram empacotados nos virions infeccio-sos VEEV por co- eletroporação do replicon sintetizado invitro e 2 RNAs helper (Volkova et al. , 2006) nas célulasBHK-21. Partículas virais contendo replicon foram coletadas24 horas depois da transfecção e usadas para infectar célu-las BHK-21 nativas, seguido por seleção de Pur. No caso dePIV de WN, o RNA de PIV sintetizado in vitro foi transfecta-do nas células BHK contendo replicon VEErep/C*-E*-Pac queexpressam C, prM e E e Pac de WN [BHK(VEErep/C*-E*-PAC) cé-lulas] . 0 esquema do genoma VEErep/C*-E*-PAC é apresentadona figura 5A. PIVs coletados foram passados nestas célulasusando métodos padrão (Rossi et al., 2005).

EXEMPLO 5

Medição do título de PIV YF

Para a medição dos títulos de PIV de YF liberado, cé-lulas BHK-21 foram semeadas em placas Coastar de seis poçosem uma concentração de 5xl05 células/poço. Quatro horas de-pois, as células foram infectadas com diferentes diluiçõesde replicons empacotados, e depois de 1 hora de incubação a37 0C em um incubador de C02 5 %, elas foram sobrepostas com2 mL de MEM suplementado com FBS '10 %. Inúmeras células in-fectadas foram estimadas contando células positivas para GFPem um microscópio UV invertido. A fração de células infec-tadas da quantodade semeada foi determinada por meio de con-tagem de células que produzem fluorescência em uma área de-finida do campo microscópico. Contagens para 5 diferentescampos foram ponderadas e recalculadas para o titulo corres-pondente a cada diluição em série. Nos últimos experimentos,os títulos também foram medidos por ensaio de placa nas mo-nocamadas das células BHK-21, carregando replicon VEE-rep/Copt- prM-E/Pac, usando as condições previamente descri-tas (Lemm et al., 1990), exceto que as células foram incuba-das em agarose para desenvolvimento da placa por 5 dias, en-tão fixadas por formaldeído 2,5 % e coradas com cristal vio-leta .

EXEMPLO 6

Passagem de PIVs de YF

Linhagens celulares de empacotamento foram estabelecí-das tanto por transfecção dos RNAs do replicon VEEV sinteti-zados in vitro quanto por infecção de células com os mesmosreplicons empacotados em proteínas estruturais de VEEV emuma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 inf.u/célula. De-pois da seleção de Pur, elas foram infectadas com PIV de YFem diferentes MOIs. Amostras foram coletadas nos pontos detempo indicados nas figuras substituindo o meio.

EXEMPLO 7

Análise da produção de SVP de YFCélulas BHK-21 foram semeadas a uma concentração de 2χ IO6 po disco de 100 mm. Depois de 4 horas de incubação a37 0C, as células foram infectadas com PIV de YF a um MOI de10 inf.u/célula, e então incubadas por 24 horas em 10 mL deMEM suplementado com FBS 10 %. Então o meio foi substituídopor 10 mL de meio sem soro VP-SF (Invitrogen) que foi subs-tituído a cada 24 horas para analisar a liberação de SVP. Asamostras de VP-SF coletadas foram clarificadas por centrifu-gação em baixa centrifugação (5.000 r.p.m, 10 minutos, 4°C), e então concentradas por ultracentrifugação em 2 mL desacarose 10 %, preparado em PBS, em motor SW-41 a 39.000r.p.m, 4 0C por 6 horas. Material precipitado foi dissolvidono tampão de carga por eletroforese em gel de SDS- poliacri-lamida, que não tem b-mercaptoetanol (para conservar a liga-ção a D1-4G2 MAB) e adicionalmente analisadas por Westernblotting. Depois da transferência da proteína, as membranasde nitrocelulose foram processadas por D1-4G2 MAB, e anti-corpos anti-camundongo de burro secundário conjugados comperoxidase de rábano silvestre (HRP) comprados da Santa CruzBiotechology. HRP foi detectado usando o reagente WesternBlotting Luminol de acordo com as recomendações do fabrican-te (Santa Cruz Biotechnology). Para obter amostra de contro-le positivo, YFV (2xl08 PFU) foi submetido a ultracentrifu-gação em sacarose 10 % cushion da forma descrita anterior-mente para SVPs.

Para análise de gradiente de densidade de sacarose deSVPs de YFV, células BHK-21 foram electroporadas com o RNAdo genoma de PIV de YF sintetizado in vitro. Em 24 horas de-pois da transfecção, o MEM completo foi substituído por meioVP-SF, que foi coletado 2 4 horas depois. Neste momento, maisque 95 % das células foram positivas para GFP e não apresen-taram nenhum sinal de CPE. A amostra coletada foi clarifica-da por centrifugação em baixa velocidade (5.000 rpm. 10 mi-nutos, 4 °C) e então concentrada por centrifugação durantetoda a noite em um motor S W-28 a 25.000 rpm, 4 0C. O preci-pitado resultante foi suspenso em tampão TN (Tris HCl 10 nm(pH 7,5), NaCl 100 mM, BSA 0,1 %) e adicionalmente foi rea-lizada análise da forma descrita (Schalich et al., 1996).

Resumidamente, 0,5 mL.de amostras foi caregado no gra-diente de sacarose contínuo (1,5 mL de sacarose 50 %, 1,5 mLde sacarose 35 % e 1,5 mL de sacarose 10 % preparada em tam-pão PBS) . Centrifugação foi realizada em motor SW-55 a45.000 rpm a 4 0C por 1 hora em ultracentrífuga Optima MAX(Beckman). Precipitados foram dissolvidos no tampão de cargapara eletroforese em gel de SDS poliacrilamida, que não temb-mercaptoetanol (para conservar a ligação a D1-4G2 MAB) eadicionalmente analisados por Western blotting. Depois datransferência da proteína, as membranas de nitrocelulose fo-ram processadas por D1-4G2 MAB e anticorpos anti-camundongode burro secundário conjugados com peroxidase de rábano sil-vestre (HRP) comprados da Santa Cruz Biotechnology. HRP foidetectado usando reagente de Western Blotting Luminol deacordo com a recomendação do fabricante (SantaCruz Biotech-nology). Análises de gradiente lado a lado foram realizadascom YFV (2X108 PFU), submetidas aos mesmos procedimentos daforma descrita anteriormente para SVPs derivados de YFV-PIV.EXEMPLO 8

Análise de PIV de WN

Títulos de PIV de WN foram determinados infectando mo-nocamadas de cálulas Vero com diluições em série de vírus, eentão fixando 2 4 horas depois e corando istoquimicamente comum fluido de ascite de camundongo hiperimune policlonal es-pecífico para WNV, da forma previamente descrita (Rossi etal., 2005). Células infectadas foram enumeradas e usadas pa-ra determinar o título. Para avaliar a capacidade do PIV deWN para formação de foco nas células Vero ou nas célulasBHK(VEErep/C*-E*-PAC), monocamadas foram infectadas com di-luições de PIV de WN, sobrepostas com uma sobreposição detragacanto semi-sólido, incubadas a 37 °C, e então fixadas ecoradas com um MAB específico para NSl de WNV (fornecido porE.Konishi, Kobe, Japan), da forma descrita anteriormente.

EXEMPLO 9

Estudos de segurança de PIV

A segurança de PIV foi estabelecida por inoculação dediferentes doses de vírus (YFV 17D ou WNV TX02 recuperadosde cDNAs infecciosos parentais) ou PIV em camundongos de 3 a4 dias de idade (outbred Swiss Webster, Harlan) pela via in-tracranial (i.e.) (20 mL volume), ou camundongos fêmeas de4-5 semanas de idade (outbred Swiss Webster, Harlan) pelavia intraperitoneal (i.p.) (100 mL volume). Camundongos fo-ram monitorados por 14 dias para os sinais de doença e mor-te, animais que estavam moribundos, e pareceram incapazes desobreviver até o próximo dia foram humanamente eutanizados eclassificados como "mortos" no dia seguinte.EXEMPLO 10

Estudos de potência e eficácia de PIV de WN

Animais selecionados inoculados com PIV de WN da formadescrita anteriormente foram eutanizados e bled em 21 diaspós inoculação. Soros foram coletados dos animais, agrupadose testados quanto a sua capacidade de reduzir formação defocos de WNV em monocamadas de cálulas Vero usando os méto-dos descritos anteriormente. Os animais remanescentes foraminoculados com 1.000 inf.u (determinado pelo ensaior de for-mação de foco nas células Vero), correspondendo a aproxima-damente 100 LD5.0 da cepa NY99 de WNV (Xiao et al. , 2001), eanimais foram então observados por mais 14 dias, da formadescrita anteriormente.

EXEMPLO 11

Cassetes que expressam C-prM-E tanto de C de YFV quan-to de YFV podem complementar a replicação de PIV de YFV.

A estratégia geral para a complementação de uma dele-ção de defeito de C no genoma do flavivirus está apresentadana figura 1. Ela se baseia no desenvolvimento de genomas quenão têm o gene C e propagação destes genomas virais pseudo-infeccioosos (genomas PIV) nas células que expressam C (outodas asproteinas estruturais virais), mas não em célulasnormais. A replicação nas últimas células, não produzindonenhuma proteína estrutural viral necessária para trans-complementação doo defeito no genoma do PIV, leva a libera-ção de SVPs contendo o imunógeno E protetor crítico, mas nãotêm o nucleocapsídeo contendo Ceo material genético viral.

Um genoma de YFV recombinante (genoma de PIV de YF)foi modificado por engenharia para conter GFP no lugar doaminoácido 26-93 de C, clonado in-frame com o resto do poli-peptideo (Figura 2A). A expressão de GFP forneceu uma manei-ra conveniente de determinar os títulos de PIVs contendo ge-noma nos experimentos. Espera-se que a deleção na seqüênciaque codifica C deste genoma do PIV destrua a capacidade de Cde formar um nucleocapsídeo funcional, mas não espera-se queafete a produção de formas funcionais de prM e E. Assim, cé-lulas que expressam este genoma, que produziram fluorescên-cia GFP, não podem liberar vírus infeccioso. Entretanto, es-pera-se que a progênie infecciosa seja produzida a partir decélulas "de empacotamento" que expressam altos níveis de C.

Para rápido desenvolvimento das linhagens celularespara eficiente produção de PIV, foi usado o sistema de ex-pressão a base do genoma do vírus da encefalite eqüina vene-zuelana (VEEV) (replicons) (Petrakova et al., 2005). Repli-cons VEEV são menos citopáticos que replicons derivados deoutros alfavírus e prontamente estabelecem persistente re-plicação em algumas linhagens celulares de origem vertebradae inseto.

Os cassetes de expressão foram projetados comoconstrutores subgenômicos duplos (Figura 2B), em que um dospromotores subgenômicos conduziu a expressão de Pac, forne-cendo um eficiente meio para eliminar células nas culturastransfectadas que não contêm o replicon VEEV que expressaPac. 0 segundo promotor subgenômico conduziu a transcriçãode proteínas estruturais de YFV que codificam RNA subgenômi-co. Para identificar os cassetes de empacotamento mais efi-cientes, replicons VEEV que codificam tanto i) C de YFV como peptideo sinal de prM, também conhecido como C ancorada(Lindenbach e Rice, 2001), (VEErep/Cl/Pac), quanto ii) C como peptideo sinal e aminoácido 20 de prM (VEErep/C2/Pac), ouiii) todas as proteínas estruturais de YFV (VEErep/C-prM-E/Pac). O rationale do projeto foi reter o peptideo sinalnos cassetes que codificam C, que esperou-se ser essencialpara alvejar C no compartimento celular apropriado.

Os RNAs de replicon VEEV sintetizados in vitro foramtransfectados nas células BHK-21 e nas linhagens celularesestáveis de PurR foram selecionados nos próximos 4-5 dias nomeio contendo Pur. Durante os primeiros 2-3 dias pós trans-fecção, a replicação de RNAs derivados de VEEV causou inter-rupção do crescimento, então, da forma previamente descrita(Petrakova et al., 2005), replicação se tornou meos eficien-te e as células retomaram seu crescimento. As culturas dePurR resultantes foram transfectadas com os RNAs de PIV deYF sintetizados in vitro, e em diferentes horas pós trans-fecção, títulos das partículas infecciosas liberadas, con-tendo genomas que expressam GFP foram determinados (Figura2C) . Surpreendentemente, a presença de dois diferentes RNAsde replicação (específicos para YFV e VEEV) nas células BHK-21 não resultou no efeito citopático (CPE), e manteve tantoresistência ao Pur quanto expressão de alto nível de GFP,indicando replicação tanto do replicon VEEV quanto no RNA dePIV de YF. Da forma apresentada na figura 2C, culturas queexpressam ambos destes genes marcadores foram capazes decrescer e requererá subpassaging (a razão de -1:5 a cada 4dias) para prevenir as culturas de atingir confluência. Osexperimentos apresentados na figura 2 demonstraram que todosos três replicons VEEV foram capazes de fornecer C de YFV emníveis suficientes para formação de PIVs infecciosos; nenhu-ma partícula infecciosa foi liberada das células BHK-21 nai-ve transfectadas com o RNA de PIV de YF na ausência de re-plicons VEEV (dados não apresentados). Entretanto, célulasque expressam estes cassetes de empacotamento diferiram nasua capacidade de produzir PIV. Construtores que expressam Cde YFV seguidos pelo peptídeo sinal prM (C ancorada; VEE-rep/Cl/Pac) demonstraram o menor nível de empacotamento deRNA de PIV de YF, comparado aos cassetes que expressam maio-res seqüências de proteínas. A base para a menor eficiênciade empacotamento pelo construtor Cl não é clara, mas estefenômeno deve ser explicado por uma necessidade de uma orde-nação específica de clivagem nos dois l;ocais de clivagempróximos (NS2B/NS3 e signal peptidase) (Yamshchikov e Com-pans, 1994), e/ou diferenças na distrubuição/estabilidade daproteína C produzida nestes dois diferentes contextos, daestabilidade desta proteína. Assim, depois destes experimen-tos, VEErep/Cl/Pac foi eliminado de todos os experimentosadicionais. Tanto replicons VEErep/C2/Pac quanto VEErep/C-prM-E/Pac empacotaram PIV de YF para os títulos similaresque aproximam acima de IO7 inf.u/ml. Além disso, a liberaçãodas partículas de PIV continuou até qua os experimentos fo-ram terminados, com cada célula liberando ~ 20 PIV de YF in-feccioso por período de tempo de 24 horas. As mesmas célulasforam prováveis também liberando SVPs contendo prM/E que nãotêm o nucleocapsídeo e genoma, mas esta possibilidade nãofoi adicionalmente investigada.

EXEMPLO 12

PIV de YFs com genomas defeituosos podem ser produzi-dos em grande escala

A última utilidade de PIV como candidatos a vacina de-pende da capacidade de produzir estas partículas nas escalasnecessárias, por exemplo, para produção comercial. A confi-ança em um sistema de trans-complementação a base de RNA(replicons VEEV) para fabricação de vacina requer padroniza-ção adicional, uma vez que existe uma posibilidade de acúmu-lo das mutações nos genes heterólogos clonados nos genomasde vírus de RNA. 0 uso de linhagens celulares de low-passageé uma das soluções para superar esta limitação. Alternativa-mente, o acúmulo de mutações nos genomas VEErep pode ser mi-nimizado por transfecção repetida do replicon nas célulasnaive, ou pela produção dos replicons VEEV empacotados se-guido por infecção das células naive. 0 uso de replicons VEEempacotados foi considerado um meio simples e eficiente paraestabelecer as linhagens celulares de empacotamento.

Para produzir eficientemente PIVs, foi usada uma tec-nologia que permite a produção de culturas celulares que ex-pressam replicon de alfa vírus em replicons VEEV previamenteempacotados. Resumidamente, replicons VEEV foram empacotadosem vírions infecciosos VEEV usando sistema de dois helperpreviamente descrito (Volkova et al., 2006), nas preparaçõesque continham títulos de aproximadamente 10 9 inf.u/ml. Célu-las BHK-21 infectadas com estas partículas e selecionadas napresença de Pur podem ser usadas para obter culturas célula-res que codificam proteína estrutural YFV em 3-5 dias. De-pois do estabelecimento, as linhagens celulares contendo VE-Erep/C2/Pac- e VEErep/C-prM-E/Pac- foram infectadas com a-mostras previamente geradas de PIV de YFs em MOIs alto (10inf.u/célula) e baixo (0.1 inf.u/célula) . Em todos os casos,os YFVs defeituosos replicara produtivamente (ver figura 3)e infectaram todas as células nas monocamadas que produzemaltos títulos de PIVs. Assim, o estabelecimento de linhagenscelulares de empacotamento infectando células com repliconsVEEV empacotados, seguido por infecção com PIVs parece serum sistema simplee e eficiente para produção em grande esca-la de PIVs com a seqüência C deletada no genoma.

EXEMPLO 13

PIV de YFs usando replicons VEE que expressam a formaotimizada do códon do gene C de YFV

Um outro possível problema no uso de sistemas de empa-cotamento para suportar a replicação de vírus defeituoso é arecombinação entre os genomas virais defeituosos e os RNAsque codificam o gene da trans-complementação. Tal recombina-ção deve levar a geração do vírus infeccioso. Nos experimen-tos aqui descritos, YFV infeccioso usando um ensaio de placanunca foi detectado, mas foi necessário excluir a possibili-dade que o vírus vivo pode ser formado nestas células.

Além do mais, espera-se que as proteínas codificadaspor muitos vírus arthropod-borne tenham sido envolvidas parautilizar o maquinário de tradução em dois hospedeiros muitodiferentes. Assim, não espera-se que seu uso do códon sejaideal para ecpressão expression em ambos os hospedeiros.Desta forma, a seqüência que codifica C nos cassetes de ex-pressão foi modificada para atingir dois objetivos: i) me-lhorar o rendimento de produção de C e ii) reduzir a possi-bilidade de recombinação homóloga entre genoma PIV de YF eRNA subgenômico que codifica C de replicons VEE. C de YFVfoi sintetizado usando a freqüência do códon encontrada nosgenes mamíferos mais eficientemente traduzidos (Figura 4A) .Estas mutações silenciosas também romperam a seqüência deciclização necessária para replicação do genoma do flaviví-rus, assim, reduzindo a possibilidade de gerar replicaçãocompetente de YFV em um evento de recombinação entre genomade PIV de YF e RNA que codifica C de YFV do replicon VEEV.

O gene Copt foi clonado em construtores VEErep, VEE-rep/Copt/Pac e VEErep/Copt-prM-E/Pac, usando a mesma estra-tégia que VEErep/C2/Pac e VEErep/C- prM-E/Pac, e linhagenscelulares de PurR de trans complementação foram estabeleci-das tanto por transfecção de RNA quanto por infecção das cé-lulas com RNAs empacotados. A transfecção destas células como RNA do genoma PIV sintetizado in vitro produziu PIV comeficiências que foram similares às selecionadas com as célu-las que expressam replicons VEEV que expressam o gene C deYFV não otimizado (Figura 4B) . Entretanto, as células queexpressam o C otimizado pelo códon mostraram ser um reagenteusado em que elas foram capazes de desenvolver CPE e formarplacas claramente visíveis quando infectadas com PIV de YF eoverlaid com meio contendo agarose com baixa concentração deFBS (Figura 4C) . Assim, embora a otimização do códon do geneC de YFV não altere a produção de PIV a partir destas célu-las, as células que expressam o C de YFV otimizado pelo có-don representam um sistema muito útil para avaliação de PIVde YFs, particularmente as não que expressam nenhum marcadorde fluorescência. Em testes adicionais, uma correlação muitoboa foi observada entre os títulos das mesmas amostras de-terminadas nos ensaios que formam placa e ensaios de foco deGFP.

As placas formadas por PIV de YF foram menores que asde YFV que indicam que proteínas estruturais foram mais pro-vavelmente produzidas na função eis mais eficientemente naformação de partícula viral. A razão para atingir a capaci-dade de formar placas ainda não é completamente entendida.Entretanto, especula-se que C de YFV tenha algum nível decitotoxicidade em virtude de que as linhagens celulares con-tendo replicons VEEV que expressam a versão otimizada do có-don desta proteína demonstraram menores taxas de crescimentoque as duplicatas correspondentes com gene C natural que co-difica replicon. Assim, replicação de genoma de PIV de YFdeve levar a mudanças adicionais no ambiente intracelularque foram suficientes para causar CPE.

EXEMPLO 14

PIVs podem ser gerados para outros flavivírusPara provar que PIVs podem ser facilmente gerados paraoutros flavivírus, a estratégia descrita anteriormente foiaplicada ao WNV. Com esta finalidade, um genoma de PIV de WNcom uma proteína de 35 aminoácidos de comprimento foi criado(Figura 5A) . Para empacotar este genoma de PIV de WN, umalinhagem celular de empacotamento gerada por transfecção decélulas BHK com um replicon VEEV não citopático que expressaWNV C/prM/E e Pac [BHK(VEErep/C*-E*-Pac) foi usado. Para mi-nimizar a possibilidade de recombinação entre genomas PIV deWN que replicam nesta linhagem celular e a proteína C codi-ficada por RNA VEErep de levar a geração do WNV infeccioso,o gene que codifica C de WNV no replicon VEEV foi modificadopara conter mutações silenciosas agrupadas no domínio de ci-clização de WNV.

0 meio coletado de células BHK (VEErep/C*-E*-Pac)transfectadas com o genoma de PIV de WN sintético foram ca-pazes de produzir foco positivo de antígeno nas células em-pacotadas (Figura 5B) indicando que PIV infeccioso de WN foiproduzido. Entretanto, somente células positivas para antí-geno foram detectadas mediante infecção de monocamadas decálulas Vero com as mesmas amostras (Figura 5C) . Os títulosde até 1 χ IO8 inf.u/ml de PIV de WN foram produzidos nascélulas empacotadas e, conforme esperado, PIV de WN pode serrepetidamente passado nesta linhagem celular. Assim, usandouma linhagem celular estabelecida, altos estoques de títulode PIV de WN podem ser prontamente obtidos usando o mesmosistema de complementação descrito anteriormente para YFV.Interessantemente, no caso de linhagem celular de empacota-mento de WNV e PIV de WN5, observou-se que o vírus produziuinfecção plateaued late, simultaneamente com o aparecimentode CPE (resultados não apresentados), enquanto que as célu-las que co-replicam o genoma PIV de YF e replicons VEEV con-tinuaram a produzir PIV por muitos dias (Figura 2).

EXEMPLO 15Células infectadas com PIV de YF ou WNs produzem SVPsPara demonstrar que células infectadas com PIVs produ-ziram SVPs, células BHK-21 foram tanto transfectadas com oRNA de PIV de YF sintetizado in vitro ou infectadas com PIVde YFs produzidas em céluals que expressam C. As partículasliberadas das células BHK-21 foram purificadas por ultracen-trifugação, e analisadas por western blotting usando um an-ticorpo monoclonal de camundongo (MAB) específico para E,D1-4G2 (Gentry et al. , 1982). Células tanto transfectadascom RNA quanto infectadas com PIV produzira proteína E quepode ser precipitada do meio (Figura 6A) , indicando que es-tava presente em uma forma particulada. Uma vez que estascélulas não apresentaram nenhum CPE, e as amostras foramultracentrifugação, é improvável que a proteína E detectadana fração precipitada represente restos celulares. Similar-mente, análise western blot demonstrou que células Vero in-fectadas com o PIV de WN produziu (antes do desenvolvimentode qualquer sinal de CPE) formas extracelulares de E que fo-ram indistinguíveis em tamanho das produzidas por célulasVero infectadas por WNV (Figura 6B).

Para adicionalmente avaliar a natureza física da pro-teína E liberada pelas células infectadas por PIV, meio co-letado de células contendo genoma dos PIVs que replicam so-mente foram submetidos à análise de gradiente de densidadede sacarose de acordo com os dados publicados (Schalich etal., 1996). SVPs foram encontrados na fração com sacarose 2% (Figura 6C). No mesmo experimento, vírions YFV demonstra-ram alta densidade e foram detectados na fração com sacarose42 %. Partículas contendo proteína E que migram notamanhoesperado de SVPs de WNV também foram detectados em culturasinfectadas com PIVs de WNV. A presença de E no meio de célu-Ias infectadas por PIV foi consistente com a produção deSVPs pelas células que expressam somente vacinas de RNA deprM/E ou TBEV que não têm um gene C funcional.

EXEMPLO 16

Segurança, potência e eficácia de PIV em animais

A segurança de PIVs de WN e YF foi estabelecida porinoculação i.e. de litros de camundongos de 3 a 4 dias deidade. Estes estudos mostraram que camundongos inoculadoscom YFV ou WNV de WT foram rapidamente mortos, e estes vírusapresentaram uma dose letal de 50 porcento (LD50) de aproxi-madamente 1 PFU nestes animais (Tabela 1) . Entretanto, PIVde WN e YFs inoculados em camundongos bebês em uma dose de 2χ IO6 inf.u fracassaram em matar qualquer camundongo (Tabela1). A segurança foi adicionalmente documentada por inocula-ção i.p. de camundongos adultos com vírus de tipo selvagem(wt) e PIVs de WN. Estes estudos mostraram que os PIVs de WNforam completamente seguros em camundongos adultos (Tabela2). Além disso, WNV wt mataram uma porção significativa decamundongos adultos, com uma LD50 menor que 1 PFU5 e dosesde até 3 χ IO6 inf.u de PIV de WN fracassaram em causarqualquer morte (Tabela 2). Mais interessantemente, entretan-to, é a descoberta de que os PIVs de WN foram imunógenosmuito potentes (títulos NEUT foram detectados com inoculaçãode somente 30.000 inf.u), e 100 % dos animais vacinados com3 χ 104, 3 χ 105, ou 3 χ 106 inf.u foram protegidos de um de-safio de 100LD50 da cepa NY99 de WNV (Tabela 2) .

Tabela 1: Segurança de PIVs em camundongos bebês

<table>table see original document page 49</column></row><table>

a Preparação inoculada, diluída em meio de cultura com FBS10 %. b Distribuída por via i.e. em um volume de 20mL/animal. c Sobrevivência em 14 dias pós inoculação (vi-da/morte) d tempo de sobrevivência médio de animais que mor-reram de infecção (desvio padrão). e Não aplicável.

Tabela 2: Segurança, potência e eficácia de PIV em ca-mundongos adultos

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

a Preparação inoculada, diluída em meio de cultura com FBS10 % b Distribuída por via i.e. em um volume de 20mL/animal. c Sobrevivência em 14 dias pós inoculação (vi-da/morte) d tempo de sobrevivência médio de animais que mor-reram de infecção (desvio padrão) . e título NEUT de sorosagrupados coletados de 2 animais em 21 dias pós inoculação(título mostrado é a maior diluição que dá 80 % de reduçãode formação de foco de WNV) . f Proteção do desafio com100LD50 da cepa NY99 de WNV demonstrada pela sobrevivênciaem 14 dias pós desafio; único sobrevivente do grupo inocula-do diluente mostrou sinais de doença (costas encurvadas, pê-lo atrapalhado e indisposição) de dias 8-14. Nenhum dos ani-mais inoculados com PIV apresentou nenhumm sinal de doençano período de observação pós desafio de 14 dias. g Não apli-cável. h títulos NEUT nos soros de camundongos umunizadostestados lado a lado com soros dos camundongos inoculadoscom PIV de WN.

EXEMPLO 17

Modificações adicionais para aumentar a produção e se-gurança de PIVs/RepliVAX

A presente invenção demonstra que a passagem repetidade RepliVAX não resultou em recombinação, mas variantes commelhor crescimento foram selecionadas: O RepliVAX de WNVpassou repetidamente em uma linhagem .celular que codifica aproteína C de WNV. Esta proteína C foi produzida fundindouma cópia do gene C de WNV a um gene Pac induzido pelo pro-motor subgenômico de um VEErep não citopático (Petrakova etal., 2005). No construtor resultante (VEErep/Pac-Ubi-C*), ogene ubiquitina (Ubi) foi inserido em frente ao gene C, e Cfoi seguido por um códon de parada. Neste contexto, uma pro-teína de fusão Pac-Ubi pode ser produzida juntamente com umaproteína C madura (que não tem a âncora hidrofóbica; ver fi-gura 9) . 0 gene C neste VEErep (denotado como xxC*") foi adi-cionalmente modificado pela inserção de 36 mutações que re-movem o sinal CS, convertendo esta região de base 11 daGUCAAU AUGCU (SEQ ID NO: 2) a GUgAAcAUGuU (SEQ ID NO: 3),mantendo ao mesmo tempo a capacidade de codificar C. Estegrande número de mutações drasticamente reduz a probabilida-de de recombinação homóloga e, além disso, se a recombinaçãorealmente ocorreu entre os genomas, a produção de um genomaativo na replicação não pode ocorrer, uma vez que o RNA re-sultante pode ter CSs que não coincidem, prevenindo a repli-cação (Figura 9).

Para testar a possibilidade improvável de recombinaçãoprodutiva, uma linhagem celular de clonagem foi derivada decélulas BHK que expressam VEErep/Pac-Ubi-C* {BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)}, e esta linhagem celular foi usada para passar oRepliVAX WN 10 vezes (em cada caso com infecção a um MOI de0,01), e o RepliVAX resultante foi caracterizado em detalhe.Para determinar se esta população 10-(pl0) de passagem con-tinha algum virus vivo, monocamadas de cálulas Vero foraminfectadas em muitiplicidades de 0,1, 1, e 10 com o RepliVAXWN plO, e lavadas extensivamente para remover RepliVAX ex-tracelular. Estas monocamadas foram ré-lavadas 24 horas de-pois e então coletadas 2 dias depois. A passagem dos fluidossobrenadantes destas culturas nas culturas de células Verorecém preparadas fracassou em revelar algumas células imuno-positivas quando coradas com um anticorpo policlonal alta-mente sensível para WNV, indicando que RepliVAX não foi pro- dutivamente recombinado com a proteína C codificada pelo em-pacotamento da linhagem celular.

Interessantemente, quando o RepliVAX WN plO foi compa-rado ao RepliVAX pO na linhagem celular BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*), o RepliVAX plO produziu focos polimórficos de infecção,muitos dos quais foram muito maiores que os produzidos peloRepliVAX pO (Figura 10). Além disso, RepliVAX plO replica 10vezes mais que RepliVAX pO em pontos de tempo anteriores,com um título de ponto final duas vezes tão alto.

Análise dos produtos de PCR obtidos de cDNA produzidoa partir de células Vero infectadas com este RepliVAX plOdemonstrou que não houve nenhum produto que continha uma re-gião que codifica C de comprimento completo. Entretanto, a-nálise de seqüência da junção C-prM do produto que abrangeestas regiões revelou que duas mutações tinham aparecido du-rante a passagem. Conforme esperado da natureza heterogêneados focos produzidos pelo RepliVAX plO nas células empacota-das (Figura 10), ambas as mutações estavam presentes comomisturas com a seqüência RepliVAX original. Uma das muta-ções, que pareceu estar presente na metade da população deácido nucléico nestas reações de seqüência (sequenciadas emambas as direções), consistiu de uma mutação AGOuGC (S>C) naposição P4 que precede o local de clivagem da peptidase si-nal (S (c)VGAVTLS (SEQ ID NO: 4) no genoma RepliVAX. A segun-da mutação, que estava presente em somente cerca de 30 % dasseqüências amplificadas (novamente em reações completadas emambas as direções) consistiu de um AAG>AuG (K>M) na posiçãoP3 depois do local de clivagem NS2B/NS3 (QKKRGGK(m)T)(SEQ IDNO: 5). Embora estas mutações estejam na posição do SL5 de-letado, elas não alteram as estruturas de RNA previstas. Arápida seleção (somente 10 ciclos de crescimento) de um Re-pliVAX que cresce melhor é muito excitante, uma vez que in-dica que a seleção de variantes de melhor crescimento é ummétodo poderoso para melhorar RepliVAX. As posições destasmutações não foram inesperadas, uma vez que sabe-se que aalteração da eficiência de NS2B/NS3 em função da clivagem dapeptidase sinal pode influenciar na produção e infectividadeda partícula de flavivírus (Keelapang et al. , 2004; Lee etal., 2000;Lobigs e Lee, 2004;Yamschikov et al., 1997). Estu-dos continuam na seleção de variantes ainda melhores decrescimento e estas duas mutações são alvejadas para inser-ção noso construtores RepliVAX de segunda geração, para con-firmar sua capacidade de trabalhar separadamente (ou junto)para melhorar a produção de RepliVAX e produção de antigeno.Todavia, os dados apresentados aqui indicam que nestas con-dições de passagem: 1) nenhuma recombinação ocorreu, 2) se-leção positiva pode ser usada para produzir melhor Repli-VAXs .

A passagem cega de RepliVAX JE similarmente produziuvariantes de melhor crescimento com mutações nas mesmas re-giões do genoma. A capacidade de os produtos de RepliVAX depassagem cega produzir variantes de melhor crescimento é umacaracterística chave desta invenção, e uma vantagem clarasobre LAV tradicional, onde a produção de variantes de me-lhor crescimento é sempre complicada pela preocupação de queestas variantes de melhor crescimento podem ter perda de suaatenuação no homem.

Além disso, o melhor cassete de expressão de C mutado(VEErep/Pac-Ubi-C*), que mostrou ser estável, e demonstrouliberdade de recombinação quando usado em uma linhagem celu-lar BHK (não aprovado para geração de vacina humana), tambémmostrou ser estável e útil para propagação de PIV quando in-troduzido em células Vero (uma linhagem celular aceita paraa produção de vacinas humanas). Especificamente, RNAs cor-respondentes ao replicon VEE foram introduzidos células Verode uma semente certificada usando os mesmos métodos aplica-dos às células BHK. Depois da introdução do RNA nestas célu-las Vero, as células foram mantidas em meio sem soro (um im-portante assunto para geração de vacina) contendo puromicinae estas células mostraram ser úteis para a propagação dePIV. Nestas condições de propagação, estas células mostraramproduzir títulos de PIV ligeiramente menores que células BHKsimilarmente derivadas, mas as células VEErep/Pac-Ubi-C*-Vero sustentaram melhor estas condições de cultura, permi-tindo múltiplas coletas. A figura 11 mostra que a produçãode PIV a partir destas células pode ser obtida para múlti-plas coletas em condições sem soro.

Em resumo, a propagação de PIVs em linhagens celularesque expressam C (especialmente cassetes C que contêm a se-qüência de sinal de prM, ou esta região mais porções dos ge-nes prM e E) pode teoricamente recombinar com o genoma doPIV, produzindo um vírus vivo que pode causar doença, aumen-tando o risco do método de geração de vacina. Para superareste problema, a presente invenção demonstrou que linhagenscelulares para a propagação de PIV de WN podem ser produzi-das usando uma proteína C que finaliza precisamente no localde clivagem de NS2B/NS3, minimizando a chance de recombina-ção nesta região do genoma do PIV, fornecendo uma vantagemsobre outros métodos de propagação em que linhagens celula-res codificam RNAs que codificam a porção da âncora de C(que também é conhecida como o peptídeo sinal de prM) quesão compartilhados pelo PIV.

Para adicionalmente melhorar a segurança deste cassetede expressão de C, a presente invenção demonstrou que a por-ção do cassete que é usado para preparar o C codificado porVEErep que complementa o genoma do PIV (a saber os primeiros30 códons que codificam a seqüência de aminoácido que sãonecessárias para produzir um genoma do PIV de replicação de-vido aos elementos de RNA salientados necessários para re-plicação viral) pode ser especificamente mutada para produ-zir um cassete que difere do genoma do PIV em 36 posições denucleotideo (introduzidas sem alterar o produto da proteína)resultando em um gene C que tem uma probabilidade drastica-mente reduzida de recombinação com o genoma do PIV (figura9) . Além disso, este gene C mutado foi criado para ter trêsmutações no sinal de ciclização (CS) que deve ser complemen-tar a um CS no 3'UTR do genoma do PIV para permitir replica-ção viral, fornecendo uma característica de segurança adi-cional para prevenir recombinação (figura 9) . Finalmente,este gene C foi inserido no VEEreplicon depois do gene mar-cador selecionável (pac), usando um gene ubiquitina para oproduto C intacto da poliproteína resultante (seqüências deauto-clivagem alternativas, tais como a auto-proteinase 2Ade FMDV, ou outras seqüências relacionadas podem ser facil-mente substituídas por ubiquitina). A criação deste cassetede poliproteína único fornece a vantagem de produzir um VEE-replicon geneticamente mais estável, reduzindo a chance derecombinação nas linhagens celulares de propagação, elimi-nando o cassete de expressão de C, e reduzindo a produção dePIV. 0 construtor resultante (VEErep/Pac-Ubi-C*, Figura 9)foi introduzido nas células BHK, e as células foram usadaspara produzir uma linhagem celular de clonagem que expressao replicon VEE usando métodos estabelecidos (Fayzulin etal., Virologia 2006) .

Uma linhagem celular de clonagem foi examinada depoisde 18 passagens a partir da clonagem de única célula e ob-servou que ela não tem nenhuma evidência de nenhuma deleçãogenética dos cassetes C (por RT- PCR), nem observou-se queela tem nenhuma mutação detectável no cassete de expressãode C. Acima de tudo importante, esta linhagem celular apre-sentou capacidade similar de propagar o PIV de WNV em um ní-vel de passagem de até 41. Finalmente, depois de 10 passa-gens de PIV nesta linhagem celular, não foi observada nenhu-ma evidência de recombinação que produz recombinantes de PIVcapazes de replicação produtiva nas células que não expres-sam o cassete C (a saber células Vero de WT), e nenhuma evi-dência de introdução de seqüências que codificam C no genomado PIV por RT PCR.

Além disso, para abordar problemas que PIV deve recom-binar com flavivírus em vacinas no hora da vacinação, produ-zindo flavivírus virulantos inéditos, a presente invençãodemonstrou que genomas de WNV com sinais de ciclização "nãonaturais" (CS) presentes em todos os flavivírus circulantesnaturalmente conhecidos, podem ser gerados que replicam paraaltos níveis. Evidência foi produzida em vários laboratóriosque os dois CS encontrados nas extremidades 5' e 3' dos ge-nomas de todos os flavivírus deve ser 100 % complementar pa-ra fornecer replicação viral produtiva (Khromykh et al. J.Virol., 2001; Lo et al. , J. Virol., 2003; Alvarez et al.,Virol., 2003). Estes estudos também demonstraram que CSs nãonaturais podem produzir genomas de replicação, desde que oCS fosse 100 % complementar. Entretanto, estes investigado-res registraram que todos os genomas com seqüências CS nãonaturais tinham replicação defeituosa. Por análise sistemá-tica de CS em genomas de WNV, especificamente o teste da ca-pacidade de cuidadosamente selecionar trocas de bases únicaspara produzir replicação em alto nivel, mudanças em basesúnicas, e subsequentes mudanças de base dupla que permitemaltos níveis de replicação do genoma (Figura 12A), foram i-dentifiçadas. A figura 12B demonstra que replicação em altonível de genoma de WNV com substituições de duas bases épossível e que genomas intencionalmente criados com seqüên-cias de pareamento imperfeito de CS (a saber WT e o mutantede 2 bases) não são ativos na replicação. Esta mutação, eoutras como esta, pode desta forma ser utilizzda para produ-zir PIV com um perfil de segurança superior, uma vez quequalquer vírus recombinante resultante de uma recombinaçãogenética de único ponto entre a vacina de PIV modificado porCS e um vírus circulante em áreas onde as pessoas são subme-tidas a vacinação não é ativo na replicação e, assim, podenão causar doença.

EXEMPLO 18

Células BHK que expressam gene C de WNV mantêm seu fe-nótipo para múltiplas passagens

Estudos com uma linhagem celular de clonagem que ex-pressa C de WNV derivada de células BHK transfectadas comVEErep/Pac-Ubi-C* demonstraram sua estabilidade a longo pra-zo e utilidade na geração de RepliVAX por várias razões.Promeiramente, estas células foram usadas para repetidaspassagens de RepliVAX. Segundo, ensaios de formação de focolado a lado nas células em dois diferentes níveis de passa-gem (passagens 8 & 24 depois da clonagem de única célula)mostraram títulos de RepliVAX WN e tamanhos de focos indis-tinguíveis. Finalmente, análise direta da seqüência do cas-sete que codifica C nestas células no nível de passagem 24não revelou nenhuma chance com relação à seqüência VEEreporiginal. Tomados juntos, estes dados indicam que VEErepsque expressam C que abriga células devem ser estáveis sufi-cientemente para uso no formato de lote de célula mestre a-tualmente aceito usado para produzir vacinas humanas. Alémdisso, o fato que VEEreps já foram usados em experimentoshumanos torna provável que a aplicação da tecnologia de cé-lula VEErep a células Vero não encontre nenhum obstáculo i-nesperado durante a aprovação regulatória.

EXEMPLO 19

Alvejamento de tecido Iinfóide de VLPs de WNV

Conforme indicado anteriormente, VLPs de WNV são simi-lares ao RepliVAX, exceto no lugar das proteínas prM/E deflavivírus, eles podem codificar um gene reportador ou elespodem simplesmente conter um replicon de flavivírus sem umreportador. VLPs podem ser prontamente produzidos em célulasempacotadas que expressam todas as três proteínas estrutu-rais WNV, e foram produzidas em alto título (Fayzulin etal., 2006). Quando IO7 U de VLP foram inoculados nos camun-dongos, estes animais produziram 1.000 a 5.000 U/mL de in-terferon tipo I (IFN) em seu soro 24 horas depois da inocu-lação. Respostas de IFN foram produzidas por injeção coximplantar (fp) tanto ip quanto subcutânea. Além disso, nodosde linfa popliteal dissecados 24 horas depois da inoculaçãofp com VLPs que expressam b-galactosidase continham grandesnúmeros de células positivas para b-galactosidase, indicandoque VLPs, que entram nas células de uma maneira indistinguí-vel de RepliVAX, são órgãos da linfa importantes para alve-jamento. Este resultado é consistente com os altos níveis deIFN elicitados por injeção de VLP e sugere que o alvejamentosimilar é responsável pela alta potência e eficácia de Re-pliVAX.

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Quaisquer patentes ou pedidos de patente mencionadosnesta especificação são indicativos dos níveis dos versadosna tecnologia à qual a invenção pertence. Adicionalmente,estas patentes e pedidos de patente são incorporados aquipela referência até certo ponto como se cada publicação in-dividual fosse especifica e individualmente indicada paraestar incorporada pela referência.

Claims (35)

1. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende: uma deleção na proteína (C) do capsídeo que codifica aseqüência de nucleotídeo, de maneira tal que a deleção nãointerrompa a seqüência de RNA necessária para ciclização dogenoma, a seqüência de sinal para proteína prM que é neces-sária para a maturação adequada de prM/M ou uma combinaçãodestes, em que o dito vírus pseudoinfeccioso deficiente emreplicação replica somente em células que expressam proteínaC ou C5 prM, proteína envelope, proteína C mutada, prM muta-da, proteína envelope mutada ou combinações destes de um ví-rus da família Flaviviridae.

2. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito vírus é um Flavivirus,Hepaci vírus ou Pesti vírus ou outras quimeras do dito víruscriadas trocando o cassete prM-E de outros vírus pelos cas-setes prM-E do vírus pseudoinfeccioso.

3. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Flavivírus é um vírusda febre amarela, um vírus do West Nile, um vírus da dengue,um vírus da encefalite transportado por carrapato, um vírusda encefalite de Saint Louis, um vírus da encefalite japone-sa ou um Vírus da encefalite de Murray Valley.

4. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de nucleotideoque codifica a proteína C do dito Flavivirus que é deletadocodifica os aminoácidos 26 a 100 ou uma combinação de amino-ácidos nos aminoácidos 26 a 100 da proteína C.

5. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Hepacivirus é um vírusda hepatite C.

6. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Pestivirus é um vírusda diarréia bovina, um vírus da febre suína ou um vírus dacólera de porco.

7. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene deletado é subs-tituído por um gene que codifica uma proteína marcadora ouum antígeno.

8. Vírus pseudoinfeccioso deficiente em replicação dafamília Flaviviridae, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína marcadora é umaproteína fluorescente verde.

9. Sistema de cultura celular, CARACTERIZADO pelo fatode que expressa proteína C ou C, prM, proteína envelope,proteína C mutada, prM mutada, proteína envelope mutada oucombinações destes de um vírus da família Flaviviridae, efe-tiva para possibilitar a propagação do vírus deficiente dereplicação, de acordo com a reivindicação 1, em condiçõesadequadas.

10. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as células queexpressam as proteínas tipo selvagem ou mutadas do vírus sãogeradas usando replicons modificados por engenharia genéticaderivados de vetores virais.

11. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene que co-difica a proteína(s) do vírus da família Flaviviridae no re-plicon é substituído por uma versão otimizada do códon dogene que codifica a proteína (s) do dito vírus, de maneiratal que a substituição reduza a capacidade dos genes codifi-cados por genes codificados por linhagem celular para recom-binar com genoma do vírus pseudoinfeccioso da família Flavi-viridae e/ou aumentar a produção do vírus pseudoinfecciosoda família Flaviviridae.

12. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito repli-con expressa uma proteína C que compreende mutações em pelomenos 36 posições de nucleotídeo do gene que codifica prote-ína C do vírus que pertence à família Flaviviridae.

13. Cultura celular, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADA pelo fato de que o replicon expressa uma pro-teína C no replicon que compreende seqüências de ciclizaçãonão naturais, de maneira tal que a presença das ditas se-qüências de ciclização reduza as chances de recombinaçãoprodutiva do vírus pseudoinfeccioso deficiente de replicaçãocom vírus natural.

14. Cultura celular, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADA pelo fato de que o dito replicon expressa pro-teínas compreendendo seqüências de nucleotídeos alteradasque codificam junção C-prM truncada, de maneira tal que apresença de tais seqüências alteradas melhore a produção dovírus pseudoinfeccioso deficiente de replicação em culturacelular, SVP contendo prM/E produzido in vivo ou uma combi-nação destes.

15. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que os repliconsque expressam as proteínas tipo selvagem ou mutado do vírusda família Flaviviridae são introduzidos nas células portransfecção com replicons de RNA sintetizados in vitro, portransfecção com DNAs de plasmídeo projetados para sintetizarreplicons alfavirais funcionais de promotores específicos deRNA polimerase II celular ou por infecção com replicons al-favirais empacotados dentro das proteínas estruturais alfavirais.

16. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que os vetores vi-rais são alfavírus.

17. Sistema de cultura celular, de acordo com a rei-vindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o alphavirus éVírus da encefalite eqüina venezuelana (VEEV), Vírus Sind-bis, Vírus da encefalite eqüina oriental (EEEV), Vírus daencefalite eqüina ocidental (WEEV) ou Vírus de Ross River.

18. Método de produzir um vírus pseudoinfeccioso defi-ciente em replicação da família Flaviviridae, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende; gerar um vírus pseudoinfecciosodeficiente em replicação da família Flaviviridae que compre-ende uma deleção no gene do capsídeo, de maneira tal que adeleção não interrompa a seqüência de RNA necessária paraciclização do genoma, a seqüência de sinal para proteína prMque é necessária para a maturação adequada de prM/M ou umacombinação destes; gerar uma linhagem celular que expressaproteína do capsídeo ou capsídeo, prM, proteína E, proteínado capsídeo mutada, prM mutada, proteína E mutada ou combi-nações destes do vírus da família Flaviviridae, em que a li-nhagem celular fornece altos níveis das proteínas necessá-rios para propagação do vírus pseudoinfeccioso deficiente emreplicação da família Flaviviridae; e infectar a linhagemcelular com o vírus pseudoinfeccioso da família Flavivirida-e, produzindo assim o vírus pseudoinfeccioso deficiente emreplicação da família Flaviviridae.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito vírus é um Flavivirus,Hepacivirus ou Pestivirus ou outras quimeras do dito víruscriado trocando os cassetes prM-E de outros vírus com oscassetes prM-E do vírus pseudoinfeccioso.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Flavivírus é um vírusda febre amarela, um vírus do West Nile, um vírus da dengue,um vírus da encefalite transportado por carrapato, um vírusda encefalite de Saint Louis, um vírus da encefalite japone-sa ou um Vírus da encefalite de Murray Valley.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de nucleotídeoque codifica a proteína C do dito Flavivírus que é deletadocodifica os aminoácidos 26 a 100 ou uma combinação de amino-ácidos nos aminoácidos 26 a 100 da proteína C.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Hepacivirus é um vírusda hepatite C.

23. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Pestivirus é um vírusda diarréia bovina, um vírus da febre suína ou um vírus dacólera de porco.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que as células que expressam asproteínas tipo selvagem ou mutada do vírus são geradas usan-do replicons modificados geneticamente derivados de vetoresvirais.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que o gene que codifica a proteí-na (s) mutada do vírus da família Flaviviridae no replicon ésubstituído por uma versão otimizada do códon do gene quecodifica a proteína (s) do dito vírus, de maneira tal que asubstituição reduz a capacidade dos genes codificados porlinhagem celular de recombinar o genoma do Flaviviridaepseudoinfeccioso e/ou aumentar a produção do Flaviviridaepseudoinfeccioso.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito replicon expressa umaproteína C que compreende mutações em pelo menos 36 posiçõesde nucleotídeo do gene que codifica proteína C do vírus quepertence à família Flaviviridae.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o replicon expressa uma pro-teína C no replicon que compreende seqüências de ciclizaçãonão naturais, de maneira tal que a presença das ditas se-qüências de ciclização reduza as chances de recombinaçãoprodutiva do vírus pseudoinfeccioso deficiente de replicaçãocom vírus natural.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito replicon expressa pro-teínas compreendendo seqüências de nucleotídeos alteradasque codificam junção C-prM truncada, de maneira tal que apresença de tais seqüências alteradas melhore a produção dovírus pseudoinfeccioso deficiente de replicação em culturacelular, SVP contendo prM/E produzido in vivo ou uma combi-nação destes.

29. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que os replicons que expressam asproteínas tipo selvagem ou mutadas do vírus da família Fla-viviridae são introduzidos nas células por transfecção comreplicons de RNA sintetizados in vitro, por transfecção comDNAs de plasmídeo projetados para sintetizar replicons alfa-virais funcionais de promotores específicos de RNA polimera-se II celular ou por infecção com replicons alfavirais empa-cotados dentro das proteínas estruturais alfavirais.

30. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que os vetores virais são alfaví-rus.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que o alfavirus é vírus da ence-falite eqüina venezuelana (VEEV), vírus Sindbis, vírus daencefalite eqüina oriental (EEEV), vírus da encefalite eqüi-na ocidental (WEEV) ou Vírus de Ross River.

32. Combinação farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fatode que compreende o vírus pseudoinfeccioso deficiente em re-plicação da família Flaviviridae produzido pelo método des-crito na reivindicação 18.

33. Método de proteger um sujeito de infecções resul-tantes da exposição ao Flaviviridae, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende administrar ao sujeito uma quantidade imu-nologicamente efetiva da combinação farmacêutica, de acordocom a reivindicação 32, em que a dita composição elicita umaresposta imune contra o Flaviviridae no sujeito, protegendoassim o sujeito das infecções.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita administração é pormeio da via intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, in-tramuscular, oral ou intranasal.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sujeito é um humano ouum animal