KR100931863B1 - 약독화된 콕사키바이러스게놈을 이용한 외래 유전자 발현시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 콕사키바이러스의 단백질 코딩 영역 중에서 세포내 신호 전달과 관련이 있는 특정 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드를 변형시켜 약독화시킨 콕사키바이러스의 게놈을 이용하여 항체 또는 다른 생물학적 활성 물질을 생산할 수 있는 외부 유전자가 삽입되어 있는 발현 시스템 및 이 발현 시스템을 이용한 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 발현 시스템을 통하여 다양한 바이러스 질환의 백신 개발을 위한 항체 생산 및 생물학적 활성을 가진 분자생물학적인 의학적 또는 약제 조성물의 발현 시스템으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

콕사키바이러스(Coxsackievirus), ITAM, 약독화(attenuation), 외래 유전자(heterogeneous gene), 벡터(vector), 발현 시스템(expression system)

Description

약독화된 콕사키바이러스게놈을 이용한 외래 유전자 발현 시스템{Expression System of Heterologous Gene using Attenuated Coxsackievirus Genome}

본 발명은 유전자 발현 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 염기 서열이 변형되어 그 독성이 약화된 콕사키바이러스의 게놈을 이용하여 외래 유전자를 발현시키기 위한 시스템 및 이를 이용한 의학적 조성물에 관한 것이다.

콕사키바이러스(Coxsackievirus)는 피코나바이러스 과(Picornaviridae family)의 엔테로바이러스 속(Enterovirus, 장-바이러스)에 속하는 인간 장내 바이러스로서, 어린 마우스에 감염하였을 때의 마비(flaccid paralysis)를 유발하는 병원성의 유무에 따라 크게 A-type과 B-type으로 구분된다. 그 중 B-type에 속하는 콕사키바이러스(Coxsackievirus B, CVB)는 급성무균성뇌막염(acute aseptic meningtis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 급성 췌장염(acute pancreatitis), type-1 당뇨병과 관련이 있으며, 특히 심근염(myocarditis), 확장성 심근증(dilated cardiomyopathy) 등과 같은 심장근육병증(cardiomyopathy)을 일으키는 주요 원인인 것으로 알려져 있다. CVB는 현재까지 6개의 혈청형(serotype)이 보고되었으며(CVB1~CVB6), CVB1, CVB3, CVB5의 3종류가 심장 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 그 중에서 CVB3에는 임상적으로 심각한 심근염을 유발하는 strain(cardiovirulent strain)과 경미한 급성열성질환이나 무균성수막염을 유발하는 약화된 strain(non-cardiovirulent strain)으로 구분될 수 있다.

이러한 콕사키바이러스의 게놈 구조 및 이 게놈에 의하여 바이러스 단백질이 발현되는 과정은 잘 알려져 있는데, 다른 피코나바이러스 과의 바이러스와 마찬가지로, CVB는 단일 가닥의(single-stranded), 양성 센스(positive sense)의 RNA 게놈(약 7.4kb)을 갖는 non-enveloped 바이러스이다. CVB의 게놈은 바이러스 게놈의 번역 및 복제를 제어하는 시그널을 가지는 양 말단의 non-translated region(5'-NTR, 3'-NTR) 사이에 단일한 열린해독틀(open reading frame)로 이루어지는 단백질 코딩 영역으로 구성되어 있다.

콕사키바이러스의 단백질 코딩 영역은 다시 P1, P2, P3의 3 영역으로 구분되는데, P1 영역은 구조 단백질 코딩 영역으로서 VP4(1A), VP2(1B), VP3(1C), VP1(1D)의 4개의 캡시드 단백질을 암호화하고 있으며, 특히 VP4와 VP2 영역을 통칭하여 VP0으로 지칭하기도 한다. 반면, P2 및 P3 영역은 CVB의 복제 등을 위하여 요구되는 비구조 단백질을 암호화하고 있는데, P2 영역은 2A(protease), 2B, 2C를 P3 영역은 3A/3B(Vpg), 3C(protease), 3D(polymerase)를 암호화하고 있다. CVB의 게놈 분석 결과, 각각의 혈청형은 길이가 유사하여 가장 짧은 CVB1이 7389개의 뉴클레오 티드로 구성되어 있으며 가장 긴 CVB5는 7402개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 것으로 밝혀졌다.

특히, CVB3의 게놈은 숙주세포에서 2185개의 아미노산으로 구성되는 monocistronic polyprotein으로 우선 발현되고, protease2A와 protease3C에 의하여 polyprotein이 절단되어 캡시드 단백질을 포함한 11개의 성숙한 단백질을 갖는 virus particle이 완성된다. 각각의 캡시드 단백질은 protomer를 형성하며 60개의 protomer가 icosahedral protein shell을 형성하여 CVB의 게놈을 내부에 싸고 있다.

현재까지의 연구에 따르면, 콕사키바이러스를 포함하는 엔테로바이러스에 의한 심근염 및 심근증에 대한 병리기전으로서는 ⅰ) 감염 바이러스에 의하여 심근세포가 손상되고 지속적으로 심근세포에 바이러스가 존재하여 장기적인 심근의 기능부전을 초래하거나, ⅱ) 바이러스에 감염된 심근세포와 정상 심근세포가 바이러스에 의하여 유발된 세포면역기전 또는 자가-면역 반응에 의하여 손상, ⅲ) 바이러스에 의해 혈관세포의 손상으로 인한 혈관수축 등으로 보고되었다. 특히, 심근 내에 지속적으로 존재하는 바이러스 게놈이나 캡시드(capsid) 단백질에 의하여 심근의 기능장애가 유발되거나 바이러스 감염이 지속되는 세포는 바이러스에 의하여 유발된 숙주 면역반응이 손상되고 섬유조직으로 치환되고 심근의 기능부전을 초래할 수 있다.

한편, 통상적으로 백신이라 함은 감염증, 전염병의 병원균 자체나 그 일부를 사용하여 비감염자를 면역시키는데 사용하는 항원으로 정의할 수 있는데, 최근 분자생물학의 급속한 발전으로 인하여 유전자 재조합의 방법을 통해 병원균의 특정 유전자를 포함하는 핵산 단편을 생체 외(in vitro)에서 발현 및 분리 정제하여 얻은 단백질을 백신으로 사용하는 방법(subunit vaccine)을 가능케 하였다. 이와 같은 백신화(vaccination) 방법은 생체내의 체액성 면역 반응(humoral immune response)을 증가시키지만, 일반적으로 세포 매개 면역 반응(cell mediated immune response, CMI)에 비효과적인 것으로 확인되고 있다.

이런 문제점으로 인하여 CMI를 활성화시킬 수 있는 새로운 형태의 백신 개발이 이루어지고 있는데, 대표적인 것이 약독화된 백신 주(attenuated vaccine strain)에 다른 병원균의 유전자를 주입하는 재조합 백신 방법이다. 이렇게 제조되는 재조합 박테리아 또는 바이러스는 생체 내에 감염되었을 때 이종 유전자(heterologous gene)가 세포 안에서 발현되어 체액성 면역은 물론 MHC class Ⅰ에 항원성 펩타이드를 제시(present)함으로써 CTL(Cytotoxic T lymphocyte, CD8T) 반응을 유발시키는 데 효과적이라고 보고되고 있다.

콕사키바이러스와 관련하여 US 6,323,024 B1(Steven M. Tracy et al., 2001. 11. 27)에서는 특히 CVB3의 게놈을 구성하는 비-번역 영역인 5' NTR을 폴리오바이러스 또는 에코바이러스 등의 다른 엔테로바이러스의 NTR로 바꾸거나, 또는 5' NTR을 이루는 특정 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 돌연변이 CVB3의 활성을 약화시킨 CVB3의 게놈에 사이토카인의 일종인 쥐의 IL4(murine IL4, mIL4) 등을 삽입시 킨 바이러스 벡터를 개시하고 있다. 삽입된 mIL4의 인근에는 CVB3 protease 2A에 의해 인식되는 서열이 존재하며, 상기 mIL4 외래 유전자는 캡시드 단백질과 protease 2A(P2A)사이에 삽입되는데, 생체 내에 주입시켰을 경우 CVB3의 게놈과 함께 발현됨으로써, CVB3의 감염으로 야기되는 질환을 조기에 제어할 수 있도록 구성되었다.

그런데, 상술한 특허 자료에서 알 수 있는 것처럼 다양한 혈청형으로 존재하는 콕사키바이러스 중에서 주로 CVB3에 대한 연구가 진행된 것이 사실이다. 따라서 다른 혈청형을 포함하여 다양한 콕사키바이러스를 이용하여 안정적으로 백신 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있는 연구가 지속적으로 요구되는 실정이다. 상술한 미국특허에서는 콕사키바이러스가 발현되는 과정에서 특히 전사 메커니즘을 조절하여 약독화된 콕사키바이러스 게놈을 이용하고 있어 실제 콕사키바이러스에 의한 숙주 세포의 감염 메커니즘에 적용하기에는 명백한 한계를 가지고 있다. 아울러, 이와 같이 전사 메커니즘에 관여하는 유전자 서열이 변형된 바이러스는 복제 속도가 느려지게 되어 안정성을 향상시킬 수 있지만 복제 속도가 느림에 따라 백신 제작 및 효능에 문제가 있다. 따라서 실제 콕사키바이러스의 게놈에 의하여 최종적으로 발현되는 펩타이드에 의한 숙주 세포 내에서의 감염 기작에 직접적으로 관여하도록 함으로써, 콕사키바이러스에 의하여 야기될 수 있는 각종 질환 등을 치료하거나 미연에 예방할 수 있는 백신 또는 유전자 요법을 위한 치료용 조성물에 대한 연구가 요구된다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 콕사키바이러스에 의한 감염 메커니즘에 있어서 중요한 시그널을 이루는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드의 일부가 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드로 치환되어 있는 약독화된 콕사키바이러스 게놈에 발현 가능한 하나 이상의 이종 핵산이 삽입되어 있는 재조합 바이러스 벡터를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 것과 같이 특정 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 변형되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈에 발현 가능한 이종 핵산이 삽입되도록 생명공학적으로 변형되어 있는 바이러스를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 약독화된 콕사키바이러스 게놈에 발현 가능한 하나 이상의 이종 핵산이 삽입되어 있는 재조합 바이러스 벡터를 유효 성분으로 포함함으로써, 약독화된 콕사키바이러스의 감염으로 인하여 숙주 세포 내에서 T-cell 및 B-cell과 같은 면역 세포의 활성화를 통하여 체액성/세포 매개 면역 반응을 유도함은 물론이고, 바이러스와 함께 발현되는 외래 유전자에 의한 강한 면역 반응을 유도하거나 또는 유전적 질환을 치료할 수 있도록 함으로써 단순한 중화 백신은 물론이고 치료용 백신 및 유전자 치료를 위한 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부하는 도면을 참조하여 보다 분명해질 것이다.

상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 콕사키바이러스의 게놈을 갖는 발현 벡터로서, 상기 발현 벡터는 상기 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역에 존재하는 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-base Activation motif)을 이루는 아미노산 중에서 적어도 하나의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드로 변형되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈을 포함하며, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 적어도 하나의 클로닝 사이트를 통하여 적어도 하나의 발현 가능한 외래 핵산이 삽입되어 있는 발현 벡터를 제공한다.

이때, 상기 ITAM 서열은 상기 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역 중 VP2(viral protein 2) 영역에 존재한다.

특히, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 상기 ITAM 서열을 구성하는 아미노산 중에서 적어도 하나의 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드가 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드로 변형되어 있으며, 상기 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드는 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드로 치환되어 있다.

한편, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 콕사키바이러스 B(CVB)의 게놈, 예를 들어 CVB3의 게놈에서 유래될 수 있다.

바람직하게는 상기 약독화된 콕사키바이러스는 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17의 변형된 VP2 펩타이드 서열을 가지거나 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 변형된 VP2 영역을 암호화하는 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에 따라 약독화된 콕사키바이러스 게놈으로 삽입될 수 있는 상기 발현 가능한 외래 핵산은 항원 에피토프를 암호화하거나 또는 상기 발현 가능한 외래 핵산은 생물학적으로 활성인 물질을 암호화한다.

특히 바람직하게는 상기 적어도 하나의 발현 가능한 외래 핵산은 번역 개시 코돈 및 프로테아제에 의하여 인식되는 3' 서열을 포함하며, 상기 적어도 하나의 발현 가능한 외래 핵산은 상기 약독화된 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역의 업스트림(upstream)에 삽입되어 있다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 변형된 콕사키바이러스의 게놈을 가지도록 생명공학적으로 변형된 바이러스로서, 상기 콕사키바이러스의 캡시드 단백질의 ITAM 서열을 구성하는 아미노산 중에서 적어도 하나의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드로 변형되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈을 포함하며, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 적어도 하나의 외래 유전자의 코딩 영역을 포함하고 있는 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상술한 것과 같이 약독화된 콕사키바이러스의 게놈으로 외래 유전자가 삽입된 발현 벡터를 유효 성분으로 함유하고 있는 치료용 조성물을 제공한다. 이 치료용 조성물은 예를 들어 백신으로 사용되거나 또는 다양한 유전자 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서는 심근염, 심근증 등과 같은 심장 질환은 물론이고 췌장염, 수막뇌염, type-1 당뇨병을 야기하는 것으로 알려진 콕사키바이러스의 감염 메커니즘에 관여하는 것으로 추측되는 캡시드 단백질의 특정 영역을 암호화하는 뉴클레오티드를 치환하여 약독화된 콕사키바이러스의 게놈에 하나 이상의 이종(외래) 유전자가 삽입되어 있는 재조합 바이러스 벡터, 생명공학적으로 변형된 바이러스 및 바이러스 벡터를 포함하는 치료용 조성물을 제시하고 있다.

즉, 본 발명에서는 콕사키바이러스에 의한 숙주 세포 내의 신호 전달 기작에 관여하는 것으로 추측되는 염기 서열을 변형시켜 약독화된 콕사키바이러스 게놈에 기초하여 항원 인식 생성물과 같은 면역학적으로 의미가 있는 외래 유전자 또는 그 일부를 삽입시킨 발현 시스템을 가능하게 하였다.

이와 같이 본 발명에서는 인위적으로 약독화시킨 콕사키바이러스 게놈에 항원 에피토프 또는 면역 조절 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 삽입하고, 생체 내에서 독자적으로 발현되도록 하여, 고위험 감염원에 의하여 야기될 수 있는 각종 질환을 예방, 치료할 수 있는 백신 및 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 원하는 유전자를 정제하는 과정 없이 높은 타이터를 갖는 바이러스를 손쉽게 확보할 수 있으므로 경제성이 높은 백신이 만들어질 수 있으며, 바이러스의 세포내 신호 전달 기작을 변화시킴으로서 안정성이 향상된 시스템을 개발하였다.

특히, 본 발명에서는 약독화된 콕사키바이러스에 의하여 체액성/세포 매개 면역 반응을 유도함은 물론이고, 바이러스와 함께 발현되는 외래 유전자에 의한 강한 면역 반응을 유도하거나 또는 유전적 질환을 치료할 수 있도록 함으로써 단순한 중화 백신은 물론이고 치료용 백신 및 유전자 치료 등에 이용될 수 있을 것으로 기대되며,

본 발명의 구체적인 실시예를 기술하기에 앞서 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 일부 용어의 의미는 다음과 같다.

"ITAM 서열" 또는 "ITAM 시그널"이라는 용어는 Immunoreceptor Tyrosine-Base Activation Motif의 약어로서, 본 명세서 및 청구의 범위에 있어서는 콕사키바이러스의 구조 단백질의 특정 영역에 존재하는 특정 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서, 보존적인 아미노산 서열은 "YxxI/Lx_(6-12)YxxI/L"(Y는 티로신, x는 임의의 아미노산, I는 이소류신, L은 류신이다.)이다. "ITAM에 필수적인 서열"이란 용어는 상술한 ITAM 서열을 이루는 아미노산 서열 중에서 반드시 요구되는 티로신(Y), 이소류신(I), 류신(L) 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드를 의미한다.

"바이러스 벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 외래 또는 이종 유전 정보(foreign/heterologous genetic information)를 숙주의 내부로 전달 또는 운반할 수 있는 바이러스를 의미한다.

"벡터"라는 용어는 다른 DNA 또는 RNA 부분이 부착되어 부착된 부분의 복제를 일으킬 수 있는 플라스미드, 파지, 코스미드 또는 바이러스와 같은 레플리콘(replicon)을 지칭한다. 만약, 투여된 벡터가 숙주에 의하여 받아들여질 수 있는 것이라면 그 벡터는 "약학적으로 수용가능한(pharmacologically acceptable)"이라는 용어가 사용된다. 만약 투여된 벡터와 같은 제제의 양이 생리적으로 의미 있는 것이라면, 그와 같은 제재는 "치료적으로 효율적인 양(therapeutically effective amount)"라는 용어가 사용된다. 만약 제재의 존재로 인하여 숙주의 생리에 변화가 야기된다면 그와 같은 제제는 생리적으로 의미 있다고 할 수 있다.

"항원 에피토프(antigenic epitope)"란 용어는 면역 시스템에 관여하는 세포에 의하여 항원으로서 인식되어, 항원-항체 반응과 같은 면역 반응을 직접적으로 야기하는 서열 또는 단백질을 의미한다.

"생물학적으로 활성인 물질(biologically active molecule)"이란 용어는 유전자 치료에 관여하거나 또는 면역 반응을 조절할 수 있는 물질로서, 세포내 신호 전달 기작(signal transduction mechanism) 또는 다른 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 포함한다. 이와 같은 물질로는 성장 인자, 암 치료용 물질, 종양 억제 물질(tumor suppressor), 사이토카인(cytokine), 인터페론(interferon) 등을 포함한다.

"유전자 치료에 관여하는 물질"이란 용어는 유전자의 결함 등으로 인하여 야기될 수 있는 종양 또는 암과 같은 유전적 질환을 억제 또는 치료할 수 있는 물질로서, 결함이 있는 유전자를 대신하여 원래의 기능을 발휘하는 유전자를 인체에 주 입하여 이 유전자의 발현을 통하여 해당 유전적 질환을 억제 또는 치료할 수 있는 물질을 지칭한다.

현재까지 콕사키바이러스에 의하여 야기되는 심근염 및 확장성 심근증 등의 면역 기작의 일부가 보고된 바 있으나 정확한 면역 기작은 여전히 밝혀지지 않고 있다. 그런데, 콕사키바이러스의 감염에 의한 면역 반응은 단순히 숙주 세포를 보호하는 기작 외에도 숙주세포에 유해한 영향을 미치는 방향으로 진행될 수 있기 때문에, 콕사키바이러스의 감염으로 야기되는 보호 기작 및 숙주세포에 유해한 효과를 제어할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 콕사키바이러스가 숙주 세포를 감염시키는 메커니즘에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 여겨지는 특정 시그널 서열을 변형시키게 되면 콕사키바이러스에 의한 감염을 억제할 수 있으며 이와 같이 약독화된 콕사키바이러스의 게놈에 면역학적으로 의미가 있는 외래 유전자를 삽입하고 이를 발현할 수 있는 시스템을 통하여 유전적 치료 내지는 특정 질병에 대한 백신으로 사용될 수 있도록 하였다.

앞서 살펴본 바와 같이, 콕사키바이러스는 바이러스 게놈의 발현 및 복제를 제어하는 양 말단의 non-translated region(5'-NTR, 3'-NTR) 사이에 단일한 열린해독틀(open reading frame)로 이루어지는 단백질 코딩 영역(P1, P2, P3)으로 구성된다. 그 중에서 P1 영역은 VP4(1A), VP2(1B), VP3(1C), VP1(1D)의 4개의 캡시드 단백질을 암호화하는 구조 단백질 코딩 영역이며, P2 및 P3 영역은 CVB의 복제 등을 위하여 요구되는 비구조 단백질을 암호화하고 있는데, P2 영역은 2A(protease), 2B, 2C를 P3 영역은 3A/3B(Vpg), 3C(protease), 3D(polymerase)를 암호화하고 있다. 특히, P1 영역 중에서 VP2는 바이러스 어셈블리(viral assembly) 과정에서 VP4와 융합되는데, 이와 같이 융합된 VP4-VP2를 VP0으로 호칭한다. 바이러스 RNA가 성숙한 virion으로 encapsidation되는 최종 단계에서 VP0은 이른바 "성숙 분할(maturation cleavage)"에 의하여 VP4 및 VP2로 자동적으로 절단된다.

이에 본 발명자들은 콕사키바이러스에 의하여 발현되는 구조 단백질을 구성하는 P1 영역 중에서 VP2 영역의 C-말단 부분에 바이러스에 의한 숙주 세포 내에서의 면역 메커니즘과 관련하여 세포내 시그널 전달(signal transduction)에 관여하는 것으로 추측되는 아미노산 서열을 발견하고, 이 아미노산 서열 중에서 세포내 시그널 전달에 중요한 역할을 수행하는 일부 아미노산 서열을 변형시킴으로써, 콕사키바이러스에 의한 병원성을 약화시킬 수 있다는 점에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

우선, 본 발명자들은 6개의 혈청형으로 존재하는 특정 균주의 CVB3의 VP2 영역의 공개된 아미노산 서열 및 염기 서열에 기초하여 alignment를 수행하였다. alignment를 위하여 분석된 CVB1 내지 CVB6의 VP2 영역을 이루는 아미노산 서열은 서열목록 중에 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11로 표시되어 있으며, CVB1 내지 CVB6의 VP2 영역을 이루는 아미노산을 암호화하는 염기 서열은 서열목록 중에 각각 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12로 표시되어 있다.

이와 같은 alignment 수행 결과, 도 1에 도시된 것과 같이, CVB의 VP2 영역 중 C-말단 부근에 면역 메커니즘에 관여하는 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif) 유사 서열이 존재한다. ITAM은 일반적으로 면역 시스템을 구성하는 B-cell receptor(BCR) 또는 T-cell receptor(TCR) 등의 세포질 영역에 존재하는 특정 아미노산 서열로서, 그 보존 서열(conserved sequence)은 "YxxI/Lx_(6-12)YxxI/L"이다(여기서 Y는 티로신, x는 임의의 아미노산, I는 이소류신, L은 류신을 의미한다.).

ITAM은 세포외 신호(extracellular signals)를 세포내 신호전달 물질(intracellular signaling molecules)로 전달하여 세포의 활성화 및 증식을 일으킨다. 즉, BCR 또는 TCR과 같은 리셉터가 적절한 리간드를 인식하면, Lck 또는 Fyn과 같은 Src-family kinase에 의하여 ITAM 시그널을 구성하는 티로신(Y)은 인산화(phosphorylation)된다. 티로신이 인산화되면 Syk(B-cell) 또는 ZAP-70(T-cell)과 같이 SH2(Src homology 2)를 함유하는 물질인 protein tyrosine kinase(PTK)가 활성화되고, 일련의 신호 전달(signal transduction)을 통하여 NF-kβ, NF-AT 등과 같은 다양한 전사조절 인자(transcriptional factor)를 활성화시키고, 최종적으로 세포의 활성화 및 증식을 일으킴으로써 면역 과정에 관여한다. 결국, ITAM은 면역 세포에 의한 면역 기작에 있어서 외부 환경의 신호를 세포 내부로 전달하는 중간 단계에서 중요한 역할을 수행한다.

이와 같은 점을 토대로 본 발명자들은 콕사키바이러스의 캡시드 단백질 영역인 VP2 영역의 C-말단 부위에 존재하는 ITAM 서열 역시 콕사키바이러스의 감염 메커니즘에 있어서도 큰 역할을 할 수 있을 것으로 예상된다. 본 발명자들이 분석한 바에 따르면 VP2 영역을 기준으로 CVB1은 240-257번째 아미노산 서열이, CVB2는 241-258번째 아미노산 서열이, CVB3은 240-257번째 아미노산 서열이, CVB4는 238-255번째 아미노산 서열이, CVB5는 238-255번째 아미노산 서열이 각각 ITAM 시그널을 이루고 있다.

특히, 앞서 살펴본 바와 같이 ITAM 서열에 의한 면역 메커니즘의 시발점은 티로신의 인산화라는 점에 착안하여, 분석된 ITAM 서열 중에서 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드를 인산화가 일어날 수 없는 다른 뉴클레오티드로 치환하면 ITAM 서열에 의한 감염 메커니즘은 기대하기 힘들다고 생각된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 VP2 영역의 ITAM 시그널을 이루는 티로신 중 적어도 하나의 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드를 인산화가 일어날 수 없는 구조의 아미노산, 예를 들어 티로신과 비교하여 그 구조는 매우 유사하지만 인산화가 일어날 수 없는 페닐알라닌(F)을 암호화하는 뉴클레오티드로 인위적으로 변형시킨 돌연변이체를 제작하였다. 이와 같이 특정 영역의 특정 아미노산을 암호화하는 염기 서열이 변형된 돌연변이 바이러스는 wild-type 바이러스와 비교할 때, 생체 내에서 그 독성이 크게 감소하였으며, 특히 항체 생산 능력은 wild-type과 차이가 없다는 점을 확인하였다.

특히, 본 발명에서는 이와 같이 약독화된 콕사키바이러스의 게놈의 특정 영 역으로 면역학적으로 활성이 있는 물질을 발현할 수 있는 외래 유전자(heterologous gene) 또는 그 일부인 외래 핵산(heterologous nucleic acid)이 삽입되어 있는 발현 시스템을 구현한다. 도 2는 본 발명에 따라 특정 영역의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 치환되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈으로 외래 유전자로서 HCV E2의 일부를 삽입한 발현 벡터를 통하여 HCV E2가 생체 내에서 발현되기까지의 과정에 대한 개략적인 모식도이고, 도 3은 외래 유전자를 벡터 내로 삽입하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.

우선, 도 2에 도시된 것과 같이 구조 단백질 코딩 영역에서 세포내 신호 전달 기작에 관여하는 것으로 추론되는 아미노산을 암호화하는 염기를 다른 아미노산을 암호화하는 염기로 치환하여 약독화된 콕사키바이러스의 게놈으로 항원 에피토프(antigenic epitope) 또는 면역학적 활성 물질로 발현될 수 있는 외래 유전자 또는 외래 유전자의 일부(예를 들어 HCV E2, 서열번호 21)가 삽입된다.

본 발명에 따른 바이러스 벡터를 통하여 발현될 수 있는 외래 핵산 또는 외래 유전자는 약독화된 콕사키바이러스의 게놈의 다양한 위치에 삽입될 수 있다. 예를 들어 외래 유전자는 콕사키바이러스의 캡시드 단백질에 대한 코딩 영역(P1 영역)과 바이러스 프로테아제에 대한 코딩 서열(예를 들어 2A 영역) 사이에 삽입될 수 있다. 또는 외래 유전자는 콕사키바이러스의 열린해독틀의 개시 위치, 즉 P1 영역 중 5'에 위치하는 VP0(보다 구체적으로는 VP4)의 upstream으로 삽입될 수 있다. 이를 위하여 외래 핵산은 번역 개시 코돈과 바이러스 프로테아제에 의하여 인식될 수 있는 3' 서열을 포함할 수 있다.

이와 같이 외래 유전자가 VP0 코딩 영역의 직근 업스트림(immediate upstream)으로 삽입되면, 우선 외래 유전자는 바이러스의 polyprotein의 아미노-말단 융합으로서 발현되고, 아미노-말단 융합된 외래 단백질은 바이러스 프로테아제에 의하여 절단되어 최종적으로 별도의 단백질로 발현된다. 이 경우 외래 유전자의 5'쪽으로는 번역 개시 코돈(ATG)을 포함하는 올리고 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 3' 쪽으로는 바이러스의 프로테아제, 예를 들어 바이러스에 의하여 발현되는 P2-A 또는 P3-C에 의하여 인식되는 서열이 포함될 수 있다. 따라서, 외래 유전자의 3' 말단으로 바이러스 프로테아제에 의하여 인식되는 서열이 함께 삽입된다면, 외래 유전자는 콕사키바이러스의 VP4의 최초의 ATG 서열의 직근 다운스트림(immediate downstream)으로 삽입될 수 도 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 외래 유전자는 VP0 캡시드 단백질의 근접 업스트림으로 삽입되며, 외래 유전자의 N-말단으로 콕사키바이러스의 VP0(보다 구체적으로는 VP4)의 translational 개시 서열(서열번호 19)이 삽입되며, 콕사키바이러스의 P3-C(3C^pro)에 의하여 인식되는 VP2의 말단에 존재하는 절단 서열(cleavage site, 서열번호 20)이 외래 유전자의 C-말단과 콕사키바이러스의 polyprotein 영역(VP0) 사이에 위치하도록 구성되어 있다. 따라서, 약독화된 콕사키바이러스가 복제되는 과정에서 바이러스 3C^pro는 외래 유전자의 C-말단에 위치하는 인위적 절단 서열에서 단일 시스트론성 융합 폴리단백질(monicistronic fusion polyprotein)을 절단하여 외래 유전자가 발현되고 바이러스 단백질만이 encapsidation 또는 packaging 될 수 있게 된다.

그러나, 예를 들어 외래 유전자의 N-말단으로는 바이러스에 의하여 인식되는 임의의 translation 개시 서열이 삽입될 수 있으며 외래 유전자의 C-말단으로 바이러스의 프로테아제에 의하여 인식되는 임의의 절단 서열이 위치할 수 있음은 물론이다.

이와 같이, 약독화된 바이러스 벡터에 의하여 숙주 세포 내부로 운반되어 발현되는 면역조절단백질(예컨대 사이토카인)을 치료 목적으로 사용할 수 있다. 이런 면에서, 약독화된 콕사키바이러스 게놈을 갖는 발현 벡터가 있어야 하며, 이 발현 벡터는 면역 조절 단백질을 발현할 수 있어야 하고, 마지막으로 그 벡터는 면역조절 단백질 또는 항원 에피토프를 표적 조직으로 운반하여 특정 질환에 의한 증상을 감소시킬 수 있어야 한다.

이러한 목적을 위하여, 본 발명에 따라 외래 유전자를 발현시키기 위하여 사용되는 플라스미드 형태의 벡터에는 통상의 바이러스 벡터와 마찬가지로 다양한 제한 효소가 인식할 수 있는 서열을 함유하여 제한 효소로 절단되는 서열 사이에 외래 유전자가 삽입될 수 있는 하나 이상의 클로닝 사이트, 바람직하게는 멀티 클로닝 부위(multi cloning site, MCS), 약독화된 콕사키바이러스 게놈 및 이에 삽입된 외래 유전자가 발현될 수 있는 프로모터 서열(예를 들어 T7 프로모터)과 같은 발현 조절 부위, 예를 들어 f1 phage의 복제 원점(f1(-) origin) 또는 pUC origin을 포 함할 수 있다. 또한, 벡터에는 Amp ^r , Neo ^r 과 같은 항생제 내성 유전자, 및/또는 lacZ' 유전자 및 이 유전자의 전사를 촉진하는 CAP protein binding site인 lac promoter가 형성되어, 외래 유전자가 삽입된 콕사키바이러스 게놈이 정확하게 벡터 내로 끼워졌는지의 여부를 용이하게 판단할 수 있도록 구성되는 것이 바람직하다. 이와 같은 벡터의 예로는 pBluescript 계열의 플라스미드가 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 약독화된 콕사키바이러스 게놈에 삽입되어 호스트 내로 이동되는 외래 핵산 서열은 임의의 유전자 산물을 암호화 할 수 있는데, 일례로 RNA, 펩타이드, 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스 벡터에 의하여 운반되는 발현 가능한 외래 핵산은 병원체(pathogen) 또는 독소(toxin)의 항원/면역원이거나 그 일부인 항원/면역원 에피토프(antigenic epitope)를 포함한다. 특히 외래 유전자가 B-cell epitope 및/또는 T-cell epitope와 같이 자체 면역원 서열(immunogenic sequence)을 포함하고 있다면 이들 외래 유전자는 바이러스 벡터에 의하여 별도로 발현됨으로서 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명에 따라 약독화된 콕사키바이러스 게놈의 영역으로 삽입되어, 에피토프로 기능하여 발현될 수 있는 될 수 있는 항원으로는 Hepatitis B Virus(HBV) 또는 Hepatitis C Virus(HCV)와 같은 Hepatitis virus 항원(예를 들어 HCV E2), Hantaan virus 항원, Human Papillomavirus(HPV) E7, G형 간염 바이러스 B(GBB) E2 등과 같이 생체 안에서 항원으로서 기능할 수 있는 임의의 유전자 또는 그 단편 을 포함할 수 있다.

일례로, 본 발명의 실시예에서는 고위험 감염원인 hepatitis C virus의 envelope protein E2(HCV E2, HCV 게놈 중의 384-661번째 아미노산)를 암호화하는 외래 유전자 또는 핵산이 절단된 형태로 VP0 캡시드 단백질의 직근 업스트림으로 삽입된다. 이와 같이 절단된 형태의 E2 단백질은 원래의 구조를 유지하고 있으며 중화 활성을 통하여 항체를 유도하는 고변이부위1(hypervariable region 1, HVR1)을 포함하고 있으므로, 전체 유전자를 삽입하는 것과 비교하여 유전적 안정성이 크게 향상될 수 있다.

한편, 본 발명에 따르면 상술한 항원 에피토프로 발현될 수 있는 것 외에도 면역학적으로 활성이 있는 물질과 같은 생물학적으로 활성인 산물(예를 들어 생물학적으로 활성인 단백질) 또는 유전 치료를 위하여 사용될 수 있는 물질로 발현될 수 있는 외래 유전자가 또한 삽입될 수 있다. 이와 같은 기능을 할 수 있는 외래 핵산으로 성장 인자(growth factor) 또는 치료용 유전자가 있으며, 이들 유전자는 암 치료용 물질, 종양 억제 물질(tumor suppressor), 사이토카인(cytokine), 인터페론(interferon) 등을 암호화한다.

구체적으로 이들 외래 유전자로는 fibroblast growth factor (FGF) 유전자, Vascular endothelial growth factor (VEGF) 유전자, erythropoietin (EPO) 유전자는 물론이고 α-글로빈, β-글로빈, γ-글로빈, granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor(TNF), 인터류 킨(interleukin), macrophage colony stimulating factor, granulocyte colony stimulating factor, mast cell growth factor, tupor suppressor p53, interferon, retinoblastoma 등을 암호화하는 유전자를 포함한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 인위적으로 약독화된 콕사키바이러스 게놈을 이용한 바이러스 벡터를 사용하여 면역 조절 단백질 및/또는 항원 에피토프를 전달할 수 있는 효율적인 유전자 전달 벡터로 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 ITAM 서열을 구성하는 필수 아미노산을 암호화하는 염기를 다른 아미노산을 암호화하는 염기로 치환됨으로써 약독화된 콕사키바이러스 게놈으로 삽입될 수 있는 외래 유전자 발현의 안정성을 향상시키려면 원래의 구조(conformation)와 활성(activity)을 갖는 최소-크기의 유전자 또는 그 일부 단편이 요구되는데, 일례로 약독화된 콕사키바이러스의 게놈으로 삽입될 수 있는 외래 유전자 또는 외래 핵산 서열은 대략 1kb 이하인 것이 바람직하다. 물론 약독화된 콕사키바이러스의 게놈 중 일부 영역(예를 들어 캡시드 단백질 코딩 영역)을 제거된다면 예를 들어 3~4kb 크기의 외래 유전자 또는 외래 핵산이 삽입될 수 있다. 이 경우에는 바이러스의 encapsidation을 위하여 삭제된 캡시드 단백질을 제공할 수 있도록 helper 바이러스가 함께 공급될 수 있을 것이며, 이와 같은 바이러스 벡터의 조작은 잘 알려져 있다.

한편, 본 발명의 다른 양태에 따르면 상술한 재조합 바이러스 벡터와 배합되 어 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 치료용 조성물을 포함한다. 이와 같은 치료용 조성물은 액상, 서스펜션(suspension), 에멀션 등의 형태로 제조되어 경구(oral), 비경구(parenteral), 피하(subcutaneous), 진피내(intradermal), 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous) 등의 방법으로 투여될 수 있다. 이 경우, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 예를 들어 멸균수(sterile water), 생리적 식염수, 글루코스, 최소 필수 배지(MEM), HEPES 완충제 등과 같은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제(excipient)와 함께 혼합될 수 있다. 이와 아울러 치료용 조성물 중에는 습윤제, 에멀션화제, pH 버퍼링제, 겔화 또는 점도 촉진제 등과 같은 보조 성분이 함유될 수 있다. 이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명한다.

실시예 1 : ITAM의 확인 및 약독화된 CVB 벡터의 제조

본 실시예에서는 이미 그 아미노산 서열이 공개된 콕사키바이러스의 캡시드 단백질 중 VP2 영역에 대하여 컴퓨터 프로그램을 이용하여 alignment를 수행하였다. 본 발명에 따라 분석된 콕사키바이러스의 strain은 다음과 같다.

CVB1(strain Japan); CVB2(strain Ohio); CVB3(strain Woodruff); CVB4(strain E2), CVB5(strain Peterborough); CVB6(strain Schmitt).

본 실시예에 따라 분석된 다양한 strain의 콕사키바이러스의 VP2 영역에 대한 아미노산 서열과 염기 서열은 서열번호 1 내지 12에 표시하였다. 분석 대상이 된 콕사키바이러스의 VP2 영역에 대한 alignment의 수행결과 각각의 콕사키바이러 스의 VP2 영역 중 C-말단에 존재하는 것으로 확인된 ITAM 서열은 도 1에 도시되어 있다. 본 실시예에 따라 분석 대상이 된 콕사키바이러스의 VP2 영역 및 ITAM 서열의 위치는 표 1에 정리되어 있다.

표 1. 콕사키바이러스의 VP2 영역 및 ITAM 서열 정보

CVB 유형	VP2		ITAM
	polyprotein에서의 위치*	게놈 내 위치**	VP2 영역에서의 위치*	게놈 내 위치**
CVB1	70-332(서열번호 1)	951-1733(서열번호 2)	240-257	1666-1719
CVB2	70-332(서얼변호 3)	950-1741(서열번호 4)	241-258	1670-1723
CVB3	70-333(서열번호 5)	950-1741(서열번호 6)	240-257	1667-1720
CVB4	70-330(서열번호 7)	952-1734(서열번호 8)	238-255	1663-1716
CVB5	70-330(서열번호 9)	951-1733(서열번호 10)	238-255	1662-1715
CVB6	70-330(서열번호 11)	951-1733(서열번호 12)	-	-

^* : 아미노산 서열

^** : 뉴클레오티드 서열

이어서, 심장 질환 등과 가장 밀접한 관련이 있는 CVB3의 우드러프 변이형(Woodruff variant)의 cDNA 정보와 alignment를 통하여 밝혀진 ITAM 서열 정보에 기초하여 site-directed mutagenesis 기법을 사용하여 CVB3의 cDNA 중 VP2 영역의 ITAM 시그널에 중요한 아미노산인 티로신을 페닐알라닌으로 치환한 돌연변이체를 제조하였다. 표 1에서 알 수 있는 것과 같이, CVB3는 VP2 영역 중 240-257 번째 아미노산이 ITAM 시그널을 구성하며 그 중에서 240번째 아미노산과 254번째 아미노산이 티로신이다. 본 실시예에서는 240번째 아미노산인 티로신이 페닐알라닌으로 치 환된 돌연변이체(이하, "Y240F"), 254번째 아미노산인 티로신이 페닐알라닌으로 치환된 돌연변이체(이하, "Y254F"), 240번째/254번째 아미노산인 티로신이 모두 페닐알라닌으로 치환된 돌연변이체(이하, "YYFF")를 각각 제작하였다.

wild-type의 감염성 CVB3 (H3 strain) 및 돌연변이 서열을 갖는 CVB3의 VP2 영역을 암호화하는 서열을 PCR 방법을 사용하여 증폭하고, 각각 증폭된 산물은 pcDNA 3.1(+)의 HindⅢ 및 XhoⅠ으로 ligation시키는 방법을 통하여, wild-type의 CVB3 게놈 및 변이된 서열을 갖는 CVB3 게놈을 pBluescript Ⅱ SK(-) phagermid로 통상적인 방법으로 삽입하였다. 각 돌연변이체의 서열 정보는 하기 표 2에 표시되어 있다.

표 2. 약독화된 돌연변이체의 VP2 서열

	아미노산 서열	염기 서열	비고
Y240F	서열번호 13	서열번호 14	VP2 영역의 240번째 아미노산인 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드 1667-1669 (TAC)를 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드(TTC)로 치환
Y254F	서열번호 15	서열번호 16	VP2 영역의 254번째 아미노산인 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드 1709-1711 (TAC)를 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드(TTC)로 치환
YYFF	서열번호 17	서열번호 18	VP2 영역의 240번째 아미노산인 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드 1667-1669 (TAC)와 254번째 아미노산인 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드 1709-1711(TAC)가 각각 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드(TTC)로 치환

실시예 2: 외래 유전자가 삽입되지 않은 돌연변이 CVB3 바이러스의 독성 및 항체 생성 능력 분석

1) 플라크 분석(plaque assay)

상기 실시예 1에서 제조된 돌연변이 게놈 서열이 삽입된 벡터에 의하여 만들어지는 바이러스와 wild-type 바이러스 역가 및 바이러스의 성장을 분석하였다. 우선 경부 HeLa-UVM 암 세포주(이하, "HeLa cell")는 10% fetal bovine serum으로 보충이 된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) 내에서 유지되었다. 한편, B-cell의 세포주인 BJAB cell과 T-cell의 세포주인 Jurkat cell(BJAB cell 및 Jurkat cell은 모두 American Type Culture collection, Mansaasa, VA)은 10% 열-불활성 fetal bovine serum을 함유하는 RPMI 1640 (Gibco-BRL)에서 유지되었다. 돌연변이 게놈 서열이 삽입된 벡터와 wild-type 바이러스를 HeLa cell 등에 에 lipopectamine을 사용하여 transfection하고, 24시간 이후에 thawing & unthawing을 반복하여 생산된 바이러스를 채집하였다. 채집된 바이러스는 통상의 절차에 따라 plaque assay로 titer를 결정하였다. 그 결과 HeLa cell 및 BJAB cell에서 wild-type 바이러스 1 ㎍에서 생산되는 바이러스는 10⁹ pfu/㎍인데 비하여 Y254F 및 YYFF 1㎍에서 생산되는 바이러스는 10⁶ pfu/㎍으로 약 1000배 정도 낮게 바이러스가 만들어지는 것으로 확인되었다. 반면에, Jurkat cell에서 wild-type 및 돌연변이 바이러스 모두 10⁶ pfu/㎍으로 유사한 titer 수치를 나타내었다.

2) 바이러스 주입에 따른 마우스 성장 분석

위에서 채집된 돌연변이 바이러스 및 wild-type 바이러스를 마우스에 투여하 고 일정 시점까지의 생존율을 분석하였다. 각각 1 × 10⁶ pfu의 돌연변이 바이러스 및 wild-type 바이러스를 4-주령의 Balb/c 수컷 10 마리에 복강투여에 의하여 감염시킨 뒤 생존율을 관찰하였다. 각 실험은 3회 반복하였다. 본 실시예에 따라 wild-type 바이러스와 특정 염기 서열이 치환된 돌연변이 바이러스를 마우스에 투여한 뒤 36일이 경과하기까지 마우스의 생존율을 측정한 결과, wild-type의 바이러스에 감염된 마우스는 감염 후 10일 이내에 대부분이 사망하여 최종적으로 30%의 생존율을 보이나, Y254F 및 YYFF에 감염된 마우스는 전혀 사망하지 않았으며, Y204F에 감염된 마우스 역시 최종적으로 70%의 생존율을 보였다.

3) 마우스의 중화항체역가 측정

위에서 얻은 돌연변이 바이러스 및 wild-type 바이러스를 마우스에 주입한 후, 수득된 마우스의 혈청을 대상으로 중화항체 생성능력을 측정하였다. 본 실시예에 의한 중화항체역가(neutralizing antibody titre)란 수득된 혈청을 대상으로 바이러스 감염 정도가 50% 감소된 최고의 희석 농도의 역수를 의미한다. 본 실시예에 따르면 중화 항체는 감염 후 3일째에는 나타나지 않았으나 7일째에는 높은 중화항체가를 보여주었으며 감염 후 21일이 경과한 시점에서도 높은 중화항체가를 보여주고 있다. 특히, 21일째의 경우에는 돌연변이 바이러스로 감염된 마우스는 wild-type 바이러스로 감염된 마우스에 비하여 훨씬 높은 중화항체가를 유지하고 있다. 이는 본 발명에 따라 인위적으로 변형된 돌연변이 바이러스들(Y240F, Y254F, YYFF) 은 wild-type 바이러스와 비교할 때 중화항체 유도 능력이 전혀 뒤지지 않는다는 것으로서, 이들 변이 바이러스를 이용하여 백신 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

이와 같은 점을 종합할 때, 콕사키바이러스의 VP2 영역에 존재하는 ITAM 서열에 필수적인 아미노산을 암호화하는 서열을 다른 아미노산을 암호화하는 서열로 치환되어 있는 콕사키바이러스 게놈을 갖는 바이러스는 wild-type에 비하여 독성이 크게 약화되면서도 특히 항체를 생산하는 능력에 있어서는 wild-type에 비하여 별 차이를 보이지 않았으므로 약독화된 백신으로 사용될 수 있을 것으로 추론되었다.

실시예 3: 외래 유전자가 삽입된 벡터의 제조

본 실시예에서는 실시예 1을 통하여 CVB3의 VP2 영역에 존재하는 ITAM 서열을 이루는 2개의 티로신이 모두 페닐알라닌으로 치환되어 약독화된 CVB3 재조합 게놈(YYFF 바이러스)에 외래 유전자로서 HCV E2의 일부 아미노산(384-661)을 암호화하는 유전자(서열번호 21)가 외래 핵산으로 삽입되어 있는 벡터(YYFF-HCV)를 제조하였다(도 3 참조).

우선, 서열번호 21의 HCV E2를 암호화하는 핵산은 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 22)와 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 23)를 사용하여 PCR 과정을 통하여 증폭하고 양쪽에 EcoRⅠ과 XhoⅠ의 제한효소가 인식할 수 있 는 서열을 삽입하였다. 이어서, YYFF 바이러스의 5'NTR/PBST를 EcoRI과 XhoI으로 자른 후 동일한 제한효소로 자른 HCV E2 gene PCR 산물과 ligation을 14℃에서 하룻밤 실시한 후 대장균에 transformation하여 삽입된 colony를 선별한 뒤, 염기서열 분석을 하여 원하는 유전자의 삽입을 확인하였다. 계속해서 YYFF/PBST의 뒤쪽에 존재하는 또 다른 XhoI 사이트를 site-directed mutagenesis에 의해 없앤 후 NotI/XhoI으로 자르고 나서 원하는 유전자를 가지고 있는 5'NTR/PBST을 NotI/XhoI으로 절단하여 함께 14℃에서 하룻밤 ligation 한 뒤, positive colony를 선별한 후 염기서열 분석을 통해 정확한 유전자 삽입을 확인하였다.

실시예 4: 발현 벡터의 바이러스 역가(titer) 측정

본 실시예에서는 위에서 제작된 발현 벡터(YYFF-HCV E2)와 외래 유전자가 삽입되지 않은 약독화된 바이러스 벡터(YYFF) 및 wild-type의 CVB3 유전자가 삽입된 벡터를 대상으로 바이러스 역가를 측정하였다.

우선 각각 제작된 바이러스가 콕사키바이러스인지를 확인하기 위하여 immunized horse serum(from ATCC)과 단일글론항체(8A6, gift from Sally Huber)를 이용하여 plaque forming assay로 확인하였다. 먼저 HeLa cell monolayer를 만든 후 바이러스와 항체를 시험관에서 37℃에서 30분간 반응시킨 후 HeLa cell을 감염시키고 30분간 다시 37℃에서 배양한 후 3% Difco agar/DMEM을 3mm정도 덮은 후 plaque이 형성될 때까지 3-4일간 CO₂ 배양기에서 배양하였다. Plaque가 형성되면 100% methanol과 acetic acid(3:1) 용액으로 고정하고 세척 후 1% crystal violet으로 세포를 염색하여 plaque를 관찰하였다. 이 방법으로 확인된 바이러스는 다시 HeLa 세포를 이용하여 증폭하고 PFU assay로 정량하여 -70℃에 보관하였다.

정량한 바이러스를 100 moi의 농도로 HeLa 세포를 감염시키고 감염 6-12 시간 후 cytopathic effect가 관찰되면 단백질을 분리하여 냉동보관하고(NTE buffer; 100mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM EDTA and NP-40, protease inhibitor: PMSF, aprotinin), 일부는 4% paraformaldehyde로 고정하여 면역형광염색을 위해 냉장 보관하였다.

위에서 확인된 재조합 플라스미드를 HeLa cell에 transfection 하여 48시간이 지나면 바이러스 제작이 일어나면 바이러스에 의한 cytopatic effect (CPE) 현상이 일어나 세포가 죽는 현상을 보이면 상층액을 모아 -80℃에 보관하고, 이 중 0.5ml을 T75 플라스크에 배양한 HeLa cell에 다시 감염 시켜 18시간 후에 플라스크를 freezing and thawing을 3회 실시한 후 3000 g에서 5분간 4℃에서 원심분리한 후 상층액을 -80℃에 보관하고, 이와 같이 보관된 stock은 HeLa cell을 이용하여 바이러스 역가를 측정하였다. 만일 CPE가 나타나지 않으면 recombinant plasmid를 transfection 한 후 24시간 지나 cell lysate를 확보하여 reporter에 대한 항체를 이용하여 western blot 실시하여 발현 유무를 확인하였다.

이와 같은 방법으로 제작된 바이러스를 1×10⁶ pfu/ml로 Hela cell에 감염 시킨 후 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간마다 상층액을 수거하여 바이러스 역가를 plaque assay를 통해 측정하였다. 도 4는 본 실시예에 따라 측정된 one-step growth curve를 도시한 그래프로서, 외래 유전자가 삽입된 약독화된 CVB3 바이러스는 wild-type에 비하여 3-fold 정도, YYFf에 비해서는 2-fold 정도 바이러스 역가가 낮게 측정되었음을 확인하였다.

실시예 5: 외래 유전자 발현 확인

본 실시예에서는 발현 벡터가 실제로 외래 유전자를 발현하는지의 여부를 측정하였다.

1) Western-blotting

위에서 만들어진 YYFF-HCV와 YYFF를 HeLa cell에 감염시킨 뒤, 감염된 세포의 cell lysate를 harvest 한 후 적량하여 SDS-PAGE 한 후 nitrocellulose membrane으로 옮겨 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 HCV H77C strain의 higher variable region 1 (HVR1)에 대한 LMF86 rabbit peptide polyclonal antibody를 사용 (미국 NIH/NIAID/LVD/Hepatitis Virus Section, Dr. Robert H. Purcell로 부터 제공됨)하였으며, 비교를 위해 상업적으로 판매하는 coxsackievirus VP1에 대한 monoclonal antibody 사용하여 동일한 샘플을 이용하여 분석하였다.

각각의 재조합 벡터에 의하여 감염된 HeLa Cell을 통하여 추출된 단백질을 냉동보관하고, 냉동보관한 단백질을 4×loading buffer(0.125M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.2 bromophenol blue, 200 mM DTT)와 섞은 후 acrylamide gel에 loading 하여 80 Volt로 약 3시간 전기영동한 후 하루 밤 동안 4℃에서 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 2차 항체로 방은 후, ECL(Amersham)방법으로 특정 단백질의 표현여부를 관찰하였다. 본 실시예에 따른 분석 결과가 도 5에 표시되어 있다. YYFF는 VP1은 잘 발현하지만 HCV E2는 전혀 발현하지 않은 반면에, YYFF-HCV는 HCV E2 부분뿐만 아니라 coxsackieivirus VP2도 동시에 발현 하고 있음을 확인하였다.

2) Immunofluorescent staining

YYFF-HCV가 감염된 Hela cell에서 HCV E2 발현을 immunoflorescent assay로 확인하기 위해 HCV E2 항체인 LMF86와 콕사키바이러스 VP1 항체를 이용하여 double staining하여 관찰하였다. Western blot과 동일하게 YYFF와 YYFF-HCV를 감염 시키고, YYFF-HCV와 동일하게 HCV E2 같은 부분을 가지고 있는 plasmid (pE2surf661)을 Hela cell에 transfection시켜 positive control로 사용하였다.

각각의 바이러스에 감염된 HeLa Cell을 24-48 시간 경과 후, 4% paraformaldehyde로 10-15분간 고정하고, 0.3% Triton X-100으로 처리하여 permeable하도록 하였다. 3% 알부민(bovine)으로 30분간 block한 후 1차 항체와 2차 항체로 immunostaining하여 감염된 세포에서의 특정 단백질의 표현여부를 형광현미경으로 관찰하였다.

도 6은 본 실시예에 따른 분석 결과를 도시한 것으로, pE2surf661을 transfection 시킨 세포에서는 오직 HCV E2만이 발현되며, YYFF를 감염 시킨 HeLa cell에서는 오직 콕사키바이러스 VP1만을 발현하고 있다. 그러나 YYFF-HCV를 감염 시킨 HeLa cell에서는 HCV E2와 콕사키바이러스 VP1 모두를 발현된다. 따라서, 본 발명에 따라 제작된 YYFF-HCV는 HCV E2 부분을 HeLa cell에서 효율적으로 잘 발현되고 있는 것으로 판단된다.

실시예 6: 발현 벡터의 유전적 안정성

본 실시예에서는 위에서 제작된 재조합 벡터에서 복제되는 바이러스의 유전적 안전성을 알아보기 위하여 제작된 재조합 바이러스를 HeLa cell에 연속적으로 배양한 후 각 세대에서의 바이러스의 특징을 분석하였다.

재조합 벡터로부터 얻어진 바이러스를 HeLa cell에 감염시키고 24시간 후에 상층액을 수거하여 다시 HeLa cell에 감염시키고 연속 계대 배양하여 그 상층액을 수거한 후 YYFF-HCV 바이러스 게놈 안에 HCV 유전자가 지속적으로 발현되는지를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 감염된 HeLa cell에서 CPE가 보이지 않는 단계까지 연속 감염 실시하였으며, 각 단계에서 수거한 recombinant virus를 이용하여 외부 유전자발현 여부를 IFA/Western blot assay를 통해 확인하였다. 최종적으로 외부 유전자 삽입 부분에 대한 염기서열 분석을 통해 얼마나 안정적으로 외부 유전자를 재조합 바이러스가 보유하는지를 분석하였다. 도 7은 본 실시예에 따라 측정된 분석 결과로서, 8연속 배양 후에도 YYFF-HCV genome안에 본 발명에서 삽입한 HCV 유 전자가 증폭되어 나오는 것을 확인하여 최소한 8 계대 이후에도 안정적으로 유전자가 보존되어 있음을 확인하였다.

실시예 7: 외래 유전자의 생체 내에서의 발현 확인

YYFF-HCV 3 × 10⁶ pfu를 Balb/c mouse에 1회 복강(i.p.)으로 면역하고, 2주후에 혈청을 확보하여 생체 내에서 외래 유전자의 발현을 확인하였다. pE2surf661을 transfection 한 HeLa cell lysate를 Western blot의 positive control로 사용하였으며, YYFF-HCV를 감염 시킨 cell lysate와 상호 비교하였다. 1차 항체로 YYFF-HCV를 면역한 마우스의 혈청으로 사용한 Western blot 결과 YYFF-HCV로 면역된 마우스 혈청 내에는 HCV E2에 대한 항체와 콕사키바이러스 VP1에 대한 항체가 동시에 존재 하는 것으로 판단되었다(도 8의 A 부분). 이어서, 이를 Immunofluorescent analysis로 재확인 한 결과, pE2surf661 transfected cell에서 YYFF-HCV 혈청은 HCV E2의 발현이 확인되어 HCV E2 항체가 존재함을 보여 주었으며, YYFF 및 YYFF-HCV 감염 세포에서는 동시에 양성을 나타내었다(도 8의 B 부분).

이는 YYFF-HCV 면역 마우스 혈청내에 HCV E2 항체뿐만 아니라 coxsackievirus VP1에 대한 항체도 동시에 가지고 있음을 의미하며 따라서 HCV E2의 발현은 YYFF-HCV의 복제 및 coxsackieviral protein의 발현과 동시에 일어남을 시사하고 있다.

실시예 8 : 마우스 생존율 분석

본 실시예에서는 wild-type 바이러스와 YYFF 바이러스 및 YYFF-HCV 바이러스를 마우스의 복강에 투여하여 3일 주기로 마우스의 생존율을 살펴보았다. 도 9는 본 실시에에 따른 측정 결과로서, mutant recombinant virus인 YYFF-HCV는 마우스의 생존에 전혀 영향을 미치지 않았지만 WT virus는 관찰기간 동안 최대 약 80%의 치사율을 보이는 것으로 확인되었다.

실시예 9: 생체 장기 내에서의 바이러스 역가 분석

본 실시예에서는 YYFF-HCV 바이러스, wild-type 바이러스를 마우스의 주요 기관으로 접종시킨 뒤 각 바이러스의 역가를 분석하였다. 상기 virus들의 in vivo 특징을 관찰하기 위해, 생후 6-8 주된 Balb/c 생쥐를 1 × 10⁴ H3와 약독 바이러스인 10A1 바이러스로 감염시켜 감염 후 1,3,5,7,14일에 전혈을 채취하고 간, 심장, 비장을 적출하여 혈청을 분리하고, 분리한 각 sample들은 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. 저장된 장기들의 일부 무게를 측정한 후, 1%의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유되어 있는 DMEM media 500㎕씩에 넣어 homogenization하고 1,500g로 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 filter로 여과한 후 PFU assay로 바이러스 역가를 측정하였다. 도 10a 내지 도 10c는 각각 심장, 간 및 비장에서 측정된 바이러스 역가를 도시한 그래프로서, YYFF-HCV는 wild-type과 비교할 때 적은 titer로 존재하는 것으로 관찰되었으며, 특히 복강 접종(i.p.)한 경우가 피하 투여(s.c.)한 경 우보다 1~2 배 정도 titer가 높은 것으로 관찰되었다.

실시예 10 : 병리학적 조직 분석

본 실시예에서는 장기 조직 내의 염증 생성 여부를 관찰하기 위하여 위 실시예 9에서 얻은 각 장기 조직을 파라핀으로 고정한 후, 후, section하여 Hematoxylin-Eosin staining을 수행하였다. 즉, 고정된 조직 절편은 paraffin block을 만들어 5μm 두께로 자른 후 hematoxylin and eosin 염색하여 현미경으로 관찰하여 심근염의 정도를 0 에서 +4 까지 정량화하여 관찰하고 섬유화의 정도는 Mason Trichrome 염색으로 관찰하였다. 본 실시예에 따른 결과가 도 11에 도시되어 있다. WT virus가 감염된 마우스의 심장, 췌장, 간조직에서는 염증반응이 일어난 것을 확인할 수 있었지만 YYFF-HCV가 감염된 마우스의 각 장기의 조직에서는 염증반응이 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 11: 항체 형성 확인

본 실시예에서는 마우스에 wild-type 바이러스와 YYFF-HCV 바이러스를 주입하여 면역을 유도한 뒤, 3일, 7일, 14일 째 얻은 혈청을 사용하여 항체 형성 여부를 확인하였다. 이를 위하여 HCV E2 protein을 cell surface로 발현하는 pE2surf661 vector를 HeLa cell에 transfection시킨 후, 상기 혈청들을 사용하여 IFA (Immunofluorescent assay)를 실시함으로써 혈청내의 HCV에 대한 항체 형성을 확인하였으며, Positive control로는 위에서 YYFF-HCV를 면역한 후 얻었던 mouse 혈청을 사용하였다. 본 실시예에 따른 결과가 도 12에 표시되어 있다. 면역 후 3일째에서는 항체 형성이 관찰되지 않았지만 7일째에서부터는 항체 형성이 관찰되었으며, 외부 항원에 대한 항체 형성이 적응 면역 기간에 이루어진다는 사실과 일치하였다.

실시예 12: 마우스 장기에서의 HCV E2 발현

각 장기들을 파라핀으로 고정하여 section한 조직으로부터 파라핀을 제거한 후 HCV E2 항체인 LMF86을 사용하여 IFA (Immunofluorescent assay)를 실시함으로써 조직 내에서의 HCV E2 protein 발현 여부를 확인하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 13에 표시되어 있다. 위 실시예서 관찰된 감염된 마우스 장기 내에서의 virus titer 변화 경향과 일치하게, virus 면역 후 3일째 된 마우스의 장기 조직 내에서 가장 많은 HCV E2 protein이 확인되었고 7일째, 14일째로 갈수록 발현량이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 13: inflammatory cytokine induction 확인

본 실시예에서는 바이러스 감염에 따른 혈중 cytokine 변화의 확인을 통해 염증반응 및 바이러스 감염에 따른 숙주 방어 기작을 조사하기 위해 Chemicon 회사에서 판매하는 cytokine ELISA kit를 활용하여 IL-4, IFN-r, TNF-a, IL-6 등의 혈중 농도를 측정하였다. 이를 위하여 YYFF-HCV가 감염된 후 7일째에 mouse 3마리의 혈청을 동일양으로 섞어 inflammatory cytokine induction 유무를 확인하였다.

1 × 10⁶ pfu의 YYFF-HCV를 Balb/c 마우스에 면역 후 10일 후 1회 동일 양으로 boosting 후 4일째 면역된 마우스의 spleen을 무균적으로 적출하여 primary cell culture를 실시하였다. Target cell은 P815 세포를 사용하였으며, 이 세포를 HCV E2 부분의 synthetic peptide [WHYPCTINY (순도 95%) or LLSTTQWQV (순도 95%)]로 감작시켜 미리 준비된 effector 세포와 섞은 후, lactate dehydrogenase (LDH) release 반응을 측정하며 Promega 회사에서 나온 Cytotox96 nonradioactive cytotoxicity assay kit를 이용하여 측정하였다. Effector cell과 Target cell의 비율은 각각 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1 이 되도록 하였다.

4 시간동안 배양한 후 2500g에서 4분 동안 원심분리시키고. 상층액 50ul를 immunoplate에 넣은 후 substrate 혼합액 50ul를 넣은 후 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료를 하기 위해 stop 용액 50ul를 넣은 후 microplate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, Cytotoxic T cell lymphocyte 측정결과는 다음과 같은 공식에 의해서 구하였다.

Cytotoxicity (%) = [(experimental - effector spontaneous - target spontaneous) ÷ (target maximun - target spontaneous)] × 100

Virus를 감염시키지 않은 mouse 3마리의 혈청(negative control, NC)을 역시 동일한 방식으로 섞어 YYFF-HCV를 면역한 마우스 혈청과의 inflammatory cytokine induction 차이를 확인하였으며, 측정 결과는 도 14에 표시되어 있다. 도시된 것과 같이, LIX, sTNF RI, MIP-1r 등과 같이 염증 반응과 무관한 cytokine은 negative control 및 YYFF-HCV로 면역한 마우스 모두에서 발현되었으나, 일반적인 inflammatory cytokine들은 전혀 induction 되지 않았다. 이를 통하여 YYFF-HCV로 면역한 경우에는 inflammatory cytokine induction이 이루어지지 않음을 알 수 있었다.

이러한 사실은 이러한 사실은 YYFF-HCV로 접종한 마우스의 생존율이 100%이며, 심장, 췌장, 간에서 아무런 inflammation 반응이 보이지 않은 사실과 일치한다. 따라서 본 발명에 따라 제작된 YYFF-HCV는 마우스 수준에서 장기에 염증을 유발하지 않으면서 외부 유전자를 잘 발현하여 이에 대한 항체 생성이 잘 유도되는 안전한 viral vector system이라고 생각된다.

실시예 14: 다른 세포에서의 발현 확인

본 실시예에서는 HeLa cell 외에도 대표적인 immune cell line인 BJAB (B-cell)과 Jurkat (T-cell)에서도 YYFF-HCV 감염 후, HCV E2 protein이 잘 발현하는지 살펴보기 위해 IFA 실시하였다. 각 cell line에 대한 YYFF-HCV 감염 48시간 후, HCV E2 항체인 LMF86을 1:100 비율로 사용하였으며, 그 측정 결과가 도 15에 표시되어 있다. 도시된 것과 같이, HeLa cell에서보다 그 발현 정도가 약하기는 하였으나 HCV E2의 발현을 확인할 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 기술하였으나, 본 발명은 상술한 실시예로 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다 할 것이다. 그러나 그와 같은 변형과 변경은 본 발명의 기본 정신을 훼손하지 아니하는 범위 내에서 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 후술하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해 질 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 스트레인의 콕사키바이러스 각각의 VP2 영역을 대상으로 alignment를 수행하여 VP2 영역의 C-말단에 인접한 아미노산 중에서 ITAM 서열의 존재를 보여주는 도면이다.

도 2는 본 발명에 따라 콕사키바이러스의 VP2 영역의 C-말단에 존재하는 것으로 확인된 ITAM 서열의 핵심적인 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드를 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드로 치환하여 약독화된 콕사키바이러스의 게놈으로 발현 가능한 외래 유전자로서 HCV가 삽입되어 최종적으로 발현되기까지의 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명에 따라 외래 유전자를 벡터 내로 삽입하는 과정을 개략적으로 도시한 도면으로서 고위험성 병원균으로서 항원 에피토프를 발현할 수 있는 HCV E2 유전자의 일부 단편이 약독화된 콕사키바이러스의 단백질 코딩 영역의 직근 업스트림으로 삽입되고, 외래 유전자가 함께 플라스미드로 삽입된 재조합 벡터를 도시하고 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 외래 유전자가 삽입되어 있는 약독화된 CVB3 벡터(YYFF-HCV), 외래 유전자가 없이 약독화된 CVB3 벡터(YYFF) 및 wild-type의 CVB3 벡터를 HeLa cell에 주입한 뒤 바이러스 역가를 측정한 그래프이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따라 YYFF 및 YYFF-HCV 벡터를 HeLa cell에 감염시킨 뒤에 특정 단백질의 발현 여부를 western-blotting 방법을 이용하여 분석한 사진이다.

도 6은 발명의 실시예에 따라 YYFF 및 YYFF-HCV 벡터를 HeLa cell에 감염시킨 뒤에 특정 단백질의 발현 여부를 immmunofluorescent assay(IFA) 방법에 따라 분석한 사진이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 따라 YYFF-HCV 벡터를 HeLa cell에 감염시키고 계대 배양한 뒤에 각 세대에서 HCV의 발현 정도를 측정한 사진이다.

도 8은 본 발명의 실시예에 따라 YYFF-HCV 벡터를 마우스에 접종시킨 뒤에 마우스 혈청에서 특정 단백질의 발현 여부를 western-bloting 방법을 이용하여 분석한 사진(A) 및 IFA 방법에 따라 분석한 사진이다(B).

도 9는 본 발명의 실시예에 따라 wild-type, YYFF 바이러스, YYFF-HCV 바이러스를 마우스에 접종시킨 뒤 일정 시점이 경과한 시점에서 마우스의 생존율을 측정한 그래프이다.

도 10a 내지 도 10c는 각각 wild-type 및 YYFF-HCV 바이러스를 마우스에 접종하고 일정 시점이 경과한 시점에서 심장, 간 및 췌장에서의 바이러스의 성장 정도를 측정하기 위한 바이러스 역가를 도시한 그래프이다.

도 11은 wild-type 및 YYFF-HCV 바이러스에 접종된 마우스의 심장, 췌장 및 간 조직의 염증 정도를 보여주는 사진이다.

도 12는 wild-type, YYFF 및 YYFF-HCV 바이러스에 접종된 마우스의 혈청에서 HCV의 발현 정도를 접종 날짜별로 측정한 사진이다.

도 13은 YYFF-HCV로 감염된 마우스의 장기에서 감염 후 특정 시점이 경과된 시점에서 특정 단백질의 발현 정도를 측정한 사진이다.

도 14는 YYFF-HCV가 감염된 마우스의 혈청에서의 cytokine 유도 여부를 확인할 수 있는 array 사진이다.

도 15는 다른 면역 세포주를 대상으로 YYFF-HCV를 감염시킨 뒤, 이들 세포에서 HCV E2 단백질의 발현 여부를 살펴보기 위하여 면역학적 방법으로 분석한 사진이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Expression System of Heterologous Gene using Attenuated Coxsackievirus Genome <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Coxsackievirus B1 VP2 region <400> 1 Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Glu Tyr Leu Lys Asp Asn Glu Ala Thr 35 40 45 Gly Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Glu Ser Val Gln Trp Met Lys Asn Ser Ala Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ser Gln Met Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ser Asn Leu Asn Asn Thr Pro Lys Phe Ala 130 135 140 Glu Leu Ser Gly Gly Asp Asn Ala Arg Met Phe Thr Asp Thr Glu Val 145 150 155 160 Gly Thr Ser Asn Asp Lys Lys Val Gln Thr Ala Val Trp Asn Ala Gly 165 170 175 Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile 180 185 190 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Ile Asn 195 200 205 Ser Val Pro Met Asp Asn Met Tyr Arg His Asn Asn Leu Thr Leu Met 210 215 220 Ile Ile Pro Phe Val Pro Leu Asn Tyr Ser Glu Gly Ser Ser Pro Tyr 225 230 235 240 Val Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr Asn Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Ala Ser Ser Gln 260 <210> 2 <211> 789 <212> DNA <213> Coxsackievirus B1 VP2 region <400> 2 tccccctctg ccgaagagtg tggttatagt gacagggttc gatcaataac cctcgggaac 60 tccactatca caacacagga gtgtgctaat gttgtggttg ggtatggtgt gtggccagaa 120 tatttgaagg acaatgaagc cacaggcgag gaccaaccaa cacaacccga cgtggccaca 180 tgtcggttct acactttaga gtccgtgcag tggatgaaga attcagcagg ttggtggtgg 240 aagttaccag atgcactttc acaaatgggg ttgtttggac aaaatatgca gtaccactac 300 ttagggagaa caggctacac catccacgtg cagtgcaacg catctaagtt tcatcagggc 360 tgtctactag tggtgtgtgt gccggaagcg gaaatgggat gctcaaatct aaacaacacc 420 ccaaagtttg ctgaactttc cggaggagat aatgctagaa tgttcactga caccgaagtg 480 gggacatcca acgataagaa agtacaaaca gcagtgtgga atgcaggtat gggtgttggt 540 gttggcaacc tgactatatt cccacaccag tggatcaacc tgaggacaaa caatagtgct 600 accattgtaa tgccttacat caacagcgtt cccatggaca acatgtatag acacaacaac 660 ttgacactga tgataatccc attcgtcccg ctcaactata gtgagggatc atcaccttac 720 gtaccaatca cagtcacaat tgcgccaatg tgcgcagaat acaatggcct tagactggct 780 agtagccag 789 <210> 3 <211> 264 <212> PRT <213> Coxsackievirus B2 VP2 region <400> 3 Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Thr Trp Pro Arg Tyr Leu Ser Asp Lys Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Ser Ser Val Gln Trp Gln Arg Glu Ser Ala Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asp Met Gly Leu Phe Ala Gln Asn Met 85 90 95 Met Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Thr Asn Lys Glu Asn Thr Pro Leu Phe Glu 130 135 140 Lys Leu Cys Gly Gln Asp Asn Ala Lys Glu Phe Thr Arg Glu Gly Pro 145 150 155 160 Thr Ile Ser Lys Gly Ala Thr Asp Val Gln Thr Ala Val Cys Asn Ala 165 170 175 Gly Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp 180 185 190 Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Ile 195 200 205 Asn Ser Val Pro Met Asp Ser Met Ile Arg His Asn Asn Phe Thr Leu 210 215 220 Met Ile Ile Pro Phe Val Pro Leu Asp Tyr Val Asn Gly Ser Ser Pro 225 230 235 240 Tyr Ile Pro Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Ser Ala Glu Tyr Asn 245 250 255 Gly Leu Arg Leu Ala Ser Thr Gln 260 <210> 4 <211> 792 <212> DNA <213> Coxsackievirus B2 VP2 region <400> 4 tcgccgtcgg cagaggagtg tgggtatagc gatagggtga ggtctataac actgggaaat 60 tccactatca ccacgcagga gtgtgcaaat gttgttgtgg gttatggcac ttggccacgt 120 tacttgagtg acaaggaggc tacagcagaa gaccaaccaa cgcagccaga cgtcgcaaca 180 tgtagatttt acacattatc atccgtgcag tggcagagag aatctgctgg ttggtggtgg 240 aagtttcccg acgcactatc agacatgggc ttattcgcac agaatatgat gtaccactac 300 ctgggtagga ccgggtacac aatacacgta cagtgcaacg catccaagtt tcatcaggga 360 tgcttgctgg tcgtatgtgt gcctgaggct gaaatggggt gcactaacaa agaaaacacc 420 cctctatttg agaatctatg tggtcaggac aatgccaaag agttcacacg ggagggaccc 480 accatctcaa aaggcgcaac tgatgtccaa actgcagtat gcaatgctgg catgggagtg 540 ggggttggaa atttaacaat attcccacat cagtggatta atttgcgcac gaacaatagc 600 gccactatag ttatgcctta cataaatagt gtgccaatgg acagcatgat tagacacaac 660 aactttacct tgatgatcat tccatttgtg ccacttgact atgtcaacgg gtcttctccg 720 tacataccca tcaccgttac cgtggctcca atgtctgctg aatataatgg gttgcgtctc 780 gctagtacgc aa 792 <210> 5 <211> 263 <212> PRT <213> Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 5 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu Lys Asp Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Asp Ser Val Gln Trp Gln Lys Thr Ser Pro Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ser Asn Leu Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Asn Asn Thr Pro Ser Ser Ala 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Ala Lys Glu Phe Ala Asp Lys Pro Val 145 150 155 160 Ala Ser Gly Ser Asn Lys Leu Val Gln Arg Val Val Tyr Asn Ala Gly 165 170 175 Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile 180 185 190 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Thr Asn 195 200 205 Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Val Thr Leu Met 210 215 220 Val Ile Pro Phe Val Pro Leu Asp Tyr Cys Pro Gly Ser Thr Thr Tyr 225 230 235 240 Val Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr Asn Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 6 <211> 789 <212> DNA <213> Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 6 tcccccacag tagaggagtg cggatacagt gacagggtga gatcaatcac actaggtaac 60 tccaccataa cgactcagga atgcgctaac gtggtggtag gctatggagt gtggccagat 120 tatctgaagg atagcgaggc tacagcagag gaccaaccga cccaaccaga cgttgccaca 180 tgtaggttct atacccttga ctctgtacaa tggcagaaaa cctcaccagg atggtggtgg 240 aagctgcctg atgctttgtc gaacttagga ctgtttgggc agaacatgca gtaccactac 300 ttgggccgaa ctgggtatac catacatgtg cagtgcaatg catccaagtt ccaccaagga 360 tgcttgctag tagtgtgtgt accggaagct gagatgggtt gcgcaacgct aaacaacacc 420 ccatccagtg cagaattgct ggggggcgat agcgccaaag agtttgcgga caaaccggtt 480 gcatccgggt ccaacaagtt ggtacagagg gtggtgtata atgcaggcat gggggtgggt 540 gttggaaacc ttaccatttt ccctcaccag tggatcaatc tacgcaccaa caatagtgct 600 acaattgtga tgccatacac caacagcgta cctatggata acatgtttag gcataacaac 660 gtcaccctaa tggttatccc atttgtaccg ctagattact gccctgggtc taccacgtac 720 gtcccaatca cgatcacgat agccccaatg tgtgccgagt acaatggact acgtttggcc 780 gggcaccag 789 <210> 7 <211> 261 <212> PRT <213> Coxsackievirus B4 VP2 region <400> 7 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu Ser Asp Glu Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Lys Ser Val Lys Trp Glu Met Gln Ser Ala Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Glu Met Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Thr Asn Ala Glu Asn Ala Pro Thr Tyr Gly 130 135 140 Asp Leu Cys Gly Gly Glu Thr Ala Lys Gln Phe Glu Gln Asn Ala Val 145 150 155 160 Thr Gly Glu Thr Ala Val Gln Thr Ala Val Cys Asn Ala Gly Met Gly 165 170 175 Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu 180 185 190 Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Ile Asn Ser Val 195 200 205 Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe Thr Leu Met Ile Ile 210 215 220 Pro Phe Ala Pro Leu Asp Tyr Val Thr Gly Ala Ser Ser Tyr Ile Pro 225 230 235 240 Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Ser Ala Glu Tyr Asn Gly Leu Arg 245 250 255 Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 8 <211> 783 <212> DNA <213> Coxsackievirus B4 VP2 region <400> 8 tcaccaactg tagaagagtg tgggtatagt gacagggtta gatcgataac actgggaaat 60 tcaacaataa caacacaaga atgtgccaat gttgtggtgg ggtacggtgt atggcccgac 120 taccttagtg acgaggaggc gacggcagag gaccaaccca cccaaccaga cgttgcaaca 180 tgcaggtttt acacactgaa gtcagtgaaa tgggagatgc agtcagcggg gtggtggtgg 240 aagttcccag atgcgctgtc agagatgggt ctctttgggc aaaatatgca atatcactat 300 cttggcagat cggggtatac gatccacgta caatgcaacg cgtctaagtt ccatcagggc 360 tgcttgctag tagtgtgcgt gcctgaggcc gagatggggt gcactaacgc ggaaaatgcg 420 cccacatatg gtgatctatg cggaggggaa acagcaaaac aatttgaaca aaatgcagtc 480 acaggtgaga ctgctgtgca aacagctgtg tgtaacgcgg gcatgggtgt aggagttggc 540 aacctgacca tatacccaca ccagtggatt aacctgagaa ctaacaacag tgccactatt 600 gtgatgcctt atattaacag tgtcccaatg gataacatgt tcaggcacaa taacttcaca 660 ctgatgataa taccatttgc tccgttagat tacgttacgg gagcgtcctc ctacattccc 720 atcactgtga cagttgctcc aatgagcgct gaatacaatg gcttgcgatt ggctggccac 780 caa 783 <210> 9 <211> 261 <212> PRT <213> Coxsackievirus B5 VP2 region <400> 9 Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Thr Trp Pro Thr Tyr Leu Lys Asp Glu Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Glu Ser Val Met Trp Gln Gln Ser Ser Pro Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Val His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Ala Asn Lys Pro Asp Gln Lys 130 135 140 Ser Leu Ser Asn Gly Glu Thr Ala Asn Thr Phe Asp Ser Gln Asn Thr 145 150 155 160 Thr Gly Gln Thr Ala Val Gln Ala Asn Val Ile Asn Ala Gly Met Gly 165 170 175 Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu 180 185 190 Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Ile Asn Ser Val 195 200 205 Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe Thr Leu Met Ile Ile 210 215 220 Pro Phe Ala Pro Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Thr Thr Tyr Val Pro 225 230 235 240 Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr Asn Gly Leu Arg 245 250 255 Leu Ala Gly Lys Gln 260 <210> 10 <211> 783 <212> DNA <213> Coxsackievirus B5 VP2 region <400> 10 tcgccgtctg ccgaggagtg tggatatagt gacagagtga gatctatcac gttgggaaat 60 tcgacaatca ccacacagga atgtgctaat gtggtggtcg gatatggcac atggcccacg 120 tacctcaaag atgaagaggc tacagcagag gaccaaccaa ctcagccaga cgtagcaacg 180 tgcaggttct ataccctgga gtccgtgatg tggcagcaga gttcacctgg atggtggtgg 240 aaattcccgg acgccctttc aaacatgggc ttgttcggac agaacatgca gtaccattat 300 ctggggagag ctggatacac agtgcatgta caatgcaacg cctccaagtt tcaccaagga 360 tgtttgctgg tagtctgtgt accagaggct gagatggggt gtgcaacttt ggctaacaag 420 ccagatcaaa agagcttgag taatggagag acagctaata cgtttgattc gcaaaacacg 480 actgggcaga cagctgtgca ggccaacgtc attaatgcag gaatgggagt gggcgtcggt 540 aacctaacca tcttcccaca tcaatggatc aacttgcgaa ccaacaacag tgccacaatt 600 gttatgccat atataaatag tgtgccaatg gacaatatgt ttagacacaa caatttcact 660 ctaatgatta tacccttcgc acccttgagc tacagtacag gtgcaactac ctacgtgccg 720 atcacagtga ctgtggcgcc aatgtgtgca gagtataatg gtttgcgatt ggcagggaaa 780 caa 783 <210> 11 <211> 261 <212> PRT <213> Coxsackievirus B6 VP2 region <400> 11 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Ala Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu His Asp Asp Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Asp Ser Val Ser Trp Gln Ser Ser Ser Ala Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ser Asn Leu Asn Asn Ala Pro Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Leu Ser Ala Gly Glu Val Ala Arg Gln Phe Thr Val Glu Pro Ala 145 150 155 160 Asn Gly Gln Asn Gln Val Gln Thr Ala Val His Asn Ala Ala Met Gly 165 170 175 Val Ala Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu 180 185 190 Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Ile Asn Ser Val 195 200 205 Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe Thr Leu Met Ile Ile 210 215 220 Pro Phe Ala Lys Leu Ala Tyr Ser Asp Gly Ala Ser Thr Phe Val Pro 225 230 235 240 Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro Met Asn Ala Glu Tyr Asn Gly Leu Arg 245 250 255 Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 12 <211> 783 <212> DNA <213> Coxsackievirus B6 VP2 region <400> 12 tcacccactg ttgaagagtg tgggtatagt gatagagtta gatctattac tctagggaac 60 tcgaccatta caacacagga gtgtgcaaac gtggtggtcg catatggggt gtggcccgat 120 tacctgcatg atgatgaagc aactgcagag gaccaaccga cacaaccaga cgtagccacc 180 tgcaggtttt acacattgga ctctgtttcg tggcaatcat catcagcagg gtggtggtgg 240 aagtttcctg atgcgctgtc caatatgggc ctgttcgggc aaaatatgca gtatcactac 300 ctaggtagat cggggtacac gattcacgtg cagtgcaacg catccaaatt tcaccaaggg 360 tgcctcttgg tggtgtgcgt gccggaagca gaaatgggtt gctctaacct aaacaacgct 420 ccactagcgg ctgacctgag tgcaggggag gtggcgcgcc aattcactgt agaacccgca 480 aatggacaaa atcaggtaca aacagcagtg cacaacgctg ccatgggggt ggcagtggga 540 aacctaacaa ttttcccgca tcagtggatt aatttacgca cgaacaacag tgctacaata 600 gtaatgccat acataaatag tgtgcccatg gacaatatgt tcaggcacaa taactttact 660 ctgatgatca ttcccttcgc aaagttagca tactctgatg gggcctcaac attcgtgcca 720 atcacagtga ccatagcacc aatgaacgct gaatacaacg gattaaggct agcagggcac 780 cag 783 <210> 13 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 13 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu Lys Asp Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Asp Ser Val Gln Trp Gln Lys Thr Ser Pro Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ser Asn Leu Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Asn Asn Thr Pro Ser Ser Ala 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Ala Lys Glu Phe Ala Asp Lys Pro Val 145 150 155 160 Ala Ser Gly Ser Asn Lys Leu Val Gln Arg Val Val Tyr Asn Ala Gly 165 170 175 Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile 180 185 190 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Thr Asn 195 200 205 Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Val Thr Leu Met 210 215 220 Val Ile Pro Phe Val Pro Leu Asp Tyr Cys Pro Gly Ser Thr Thr Phe 225 230 235 240 Val Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr Asn Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 14 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievrus B3 VP2 region <400> 14 tcccccacag tagaggagtg cggatacagt gacagggtga gatcaatcac actaggtaac 60 tccaccataa cgactcagga atgcgctaac gtggtggtag gctatggagt gtggccagat 120 tatctgaagg atagcgaggc tacagcagag gaccaaccga cccaaccaga cgttgccaca 180 tgtaggttct atacccttga ctctgtacaa tggcagaaaa cctcaccagg atggtggtgg 240 aagctgcctg atgctttgtc gaacttagga ctgtttgggc agaacatgca gtaccactac 300 ttgggccgaa ctgggtatac catacatgtg cagtgcaatg catccaagtt ccaccaagga 360 tgcttgctag tagtgtgtgt accggaagct gagatgggtt gcgcaacgct aaacaacacc 420 ccatccagtg cagaattgct ggggggcgat agcgccaaag agtttgcgga caaaccggtt 480 gcatccgggt ccaacaagtt ggtacagagg gtggtgtata atgcaggcat gggggtgggt 540 gttggaaacc ttaccatttt ccctcaccag tggatcaatc tacgcaccaa caatagtgct 600 acaattgtga tgccatacac caacagcgta cctatggata acatgtttag gcataacaac 660 gtcaccctaa tggttatccc atttgtaccg ctagattact gccctgggtc taccacgttc 720 gtcccaatca cgatcacgat agccccaatg tgtgccgagt acaatggact acgtttggcc 780 gggcaccag 789 <210> 15 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 15 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu Lys Asp Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Asp Ser Val Gln Trp Gln Lys Thr Ser Pro Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ser Asn Leu Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Asn Asn Thr Pro Ser Ser Ala 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Ala Lys Glu Phe Ala Asp Lys Pro Val 145 150 155 160 Ala Ser Gly Ser Asn Lys Leu Val Gln Arg Val Val Tyr Asn Ala Gly 165 170 175 Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile 180 185 190 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Thr Asn 195 200 205 Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Val Thr Leu Met 210 215 220 Val Ile Pro Phe Val Pro Leu Asp Tyr Cys Pro Gly Ser Thr Thr Tyr 225 230 235 240 Val Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 16 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievirus VP2 region <400> 16 tcccccacag tagaggagtg cggatacagt gacagggtga gatcaatcac actaggtaac 60 tccaccataa cgactcagga atgcgctaac gtggtggtag gctatggagt gtggccagat 120 tatctgaagg atagcgaggc tacagcagag gaccaaccga cccaaccaga cgttgccaca 180 tgtaggttct atacccttga ctctgtacaa tggcagaaaa cctcaccagg atggtggtgg 240 aagctgcctg atgctttgtc gaacttagga ctgtttgggc agaacatgca gtaccactac 300 ttgggccgaa ctgggtatac catacatgtg cagtgcaatg catccaagtt ccaccaagga 360 tgcttgctag tagtgtgtgt accggaagct gagatgggtt gcgcaacgct aaacaacacc 420 ccatccagtg cagaattgct ggggggcgat agcgccaaag agtttgcgga caaaccggtt 480 gcatccgggt ccaacaagtt ggtacagagg gtggtgtata atgcaggcat gggggtgggt 540 gttggaaacc ttaccatttt ccctcaccag tggatcaatc tacgcaccaa caatagtgct 600 acaattgtga tgccatacac caacagcgta cctatggata acatgtttag gcataacaac 660 gtcaccctaa tggttatccc atttgtaccg ctagattact gccctgggtc taccacgtac 720 gtcccaatca cgatcacgat agccccaatg tgtgccgagt tcaatggact acgtttggcc 780 gggcaccag 789 <210> 17 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 17 Ser Pro Thr Val Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys Ala Asn Val Val 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Asp Tyr Leu Lys Asp Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr Cys Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Asp Ser Val Gln Trp Gln Lys Thr Ser Pro Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ser Asn Leu Gly Leu Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Thr Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val Val Cys Val Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Asn Asn Thr Pro Ser Ser Ala 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Ala Lys Glu Phe Ala Asp Lys Pro Val 145 150 155 160 Ala Ser Gly Ser Asn Lys Leu Val Gln Arg Val Val Tyr Asn Ala Gly 165 170 175 Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln Trp Ile 180 185 190 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr Thr Asn 195 200 205 Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Val Thr Leu Met 210 215 220 Val Ile Pro Phe Val Pro Leu Asp Tyr Cys Pro Gly Ser Thr Thr Phe 225 230 235 240 Val Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Ala Gly His Gln 260 <210> 18 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Coxsackievirus B3 VP2 region <400> 18 tcccccacag tagaggagtg cggatacagt gacagggtga gatcaatcac actaggtaac 60 tccaccataa cgactcagga atgcgctaac gtggtggtag gctatggagt gtggccagat 120 tatctgaagg atagcgaggc tacagcagag gaccaaccga cccaaccaga cgttgccaca 180 tgtaggttct atacccttga ctctgtacaa tggcagaaaa cctcaccagg atggtggtgg 240 aagctgcctg atgctttgtc gaacttagga ctgtttgggc agaacatgca gtaccactac 300 ttgggccgaa ctgggtatac catacatgtg cagtgcaatg catccaagtt ccaccaagga 360 tgcttgctag tagtgtgtgt accggaagct gagatgggtt gcgcaacgct aaacaacacc 420 ccatccagtg cagaattgct ggggggcgat agcgccaaag agtttgcgga caaaccggtt 480 gcatccgggt ccaacaagtt ggtacagagg gtggtgtata atgcaggcat gggggtgggt 540 gttggaaacc ttaccatttt ccctcaccag tggatcaatc tacgcaccaa caatagtgct 600 acaattgtga tgccatacac caacagcgta cctatggata acatgtttag gcataacaac 660 gtcaccctaa tggttatccc atttgtaccg ctagattact gccctgggtc taccacgttc 720 gtcccaatca cgatcacgat agccccaatg tgtgccgagt tcaatggact acgtttggcc 780 gggcaccag 789 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Coxsackievirus VP4 translational ininitaion sequence <400> 19 aaaatggcag ctcaagaatt c 21 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Coxsackievirus VP2 proteolytic cleavage sequence <400> 20 ccctcgaggg aggctttgtt tcaaggagct caa 33 <210> 21 <211> 834 <212> DNA <213> nucleotide for coding amino acid 384~661 of HCV E2 <400> 21 gaaacccacg tcaccggggg aaatgccggc cgcaccacgg ctgggcttgt tggtctcctt 60 acaccaggcg ccaagcagaa catccaactg atcaacacca acggcagttg gcacatcaat 120 agcacggcct tgaattgcaa tgaaagcctt aacaccggct ggttagcagg gctcttctat 180 caacacaaat tcaactcttc aggctgtcct gagaggttgg ccagctgccg acgccttacc 240 gattttgccc agggctgggg tcctatcagt tatgccaacg gaagcggcct cgacgaacgc 300 ccctactgct ggcactaccc tccaagacct tgtggcattg tgcccgcaaa gagcgtgtgt 360 ggcccggtat attgcttcac tcccagcccc gtggtggtgg gaacgaccga caggtcgggc 420 gcgcctacct acagctgggg tgcaaatgat acggatgtct tcgtccttaa caacaccagg 480 ccaccgctgg gcaattggtt cggttgtacc tggatgaact caactggatt caccaaagtg 540 tgcggagcgc ccccttgtgt catcggaggg gtgggcaaca acaccttgct ctgccccact 600 gattgcttcc gcaaacatcc ggaagccaca tactctcggt gcggctccgg tccctggatt 660 acacccaggt gcatggtcga ctacccgtat aggctttggc actatccttg taccatcaat 720 tacaccatat tcaaagtcag gatgtacgtg ggaggggtcg agcacaggct ggaagcggcc 780 tgcaactgga cgcggggcga acgctgtgat ctggaagaca gggacaggtc cgag 834 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying HCV E2 <400> 22 gcgtcgaatt catggaaacc cacgtcaccg ggggaaatgc c 41 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying HCV E2 <400> 23 ggttcctcga gggctcggac ctgtccctgt cttccag 37

Claims (28)

1. 콕사키바이러스의 게놈을 갖는 발현 벡터로서,

   상기 발현 벡터는 상기 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역에 존재하는 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-base Activation motif)을 이루는 아미노산 중에서 적어도 하나의 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드가 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드로 변형되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈을 포함하며,

   상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 적어도 하나의 클로닝 사이트를 통하여 적어도 하나의 발현 가능한 외래 핵산이 삽입되어 있는 발현 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 ITAM 서열은 상기 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역 중 VP2(viral protein 2) 영역에 존재하는 발현 벡터.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 콕사키바이러스 B(CVB)의 게놈에서 유래된 발현 벡터.
4. 제 3항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 CVB3의 게놈에서 유래된 발현 벡터.
5. 제 4항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스는 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17의 변형된 VP2(viral protein 2) 펩타이드 서열을 갖는 발현 벡터.
6. 제 4항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 변형된 VP2(viral protein 2) 영역을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 발현 벡터.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현 가능한 외래 핵산은 항원 에피토프를 암호화하는 발현 벡터.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현 가능한 외래 핵산은 생물학적으로 활성인 물질을 암호화하는 발현 벡터.
9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현 가능한 외래 핵산은 서열번호 21의 HCV E2(hepatitis C Virus envelope protein 2)를 암호화하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현 가능한 외래 핵산은 번역 개시 코돈 및 프로테아제에 의하여 인식되는 3' 서열을 포함하고 있는 발현 벡터.
11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현 가능한 외래 핵산은 상기 약독화된 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역의 업스트림(upstream)에 삽입되어 있는 발현 벡터.
12. 변형된 콕사키바이러스의 게놈을 가지도록 생명공학적으로 변형된 바이러스로서,

    상기 콕사키바이러스의 캡시드 단백질의 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-base Activation motif) 서열을 구성하는 아미노산 중에서 적어도 하나의 티로신을 암호화하는 뉴클레오티드가 페닐알라닌을 암호화하는 뉴클레오티드로 변형되어 약독화된 콕사키바이러스의 게놈을 포함하며,

    상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 적어도 하나의 외래 유전자의 코딩 영역을 포함하고 있는 바이러스.
13. 제 12항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 콕사키바이러스 B(CVB)의 게놈에서 유래된 바이러스.
14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 CVB3의 게놈에서 유래된 바이러스.
15. 제 14항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스는 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17의 변형된 VP2(viral protein 2) 펩타이드 서열을 갖는 바이러스.
16. 제 14항에 있어서, 상기 약독화된 콕사키바이러스 게놈은 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 변형된 VP2(viral protein 2) 핵산 서열을 갖는 바이러스.
17. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 외래 유전자는 항원 에피토프를 암호화하는 바이러스.
18. 제 12항 또는 제13항에 있어서, 상기 외래 유전자는 생물학적으로 활성인 물질을 암호화하는 바이러스.
19. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 외래 유전자는 HCV E2(hepatitis C Virus envelope protein 2)를 발현시키는 것을 특징으로 하는 바이러스.
20. 제 12항 또는 제13항에 있어서, 상기 외래 유전자는 상기 약독화된 콕사키바이러스의 펩타이드 코딩 영역의 업스트림(upstream)에 삽입되어 있는 바이러스.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제

Images