JP2538367B2 - Ｆｏｗｌｐｏｘウィルスの非必須領域 - Google Patents

Ｆｏｗｌｐｏｘウィルスの非必須領域

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Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、DNA組み換え技術の分野に属するもの
で、外来DNAにたいしベクターとして作用するfowlpoxウ
ィルスに関わるものである。
（背景技術） 従来、他のウィルスまたは他の生物種由来の遺伝子を
運搬・発現するのに、複数のDNAゲノムを持つ数種のウ
ィルスが用いられてきた。このように利用されるウィル
スは、「ベクター」と呼ばれ、また、ウィルス自身のも
のではなく、このような方式で発現される遺伝子は、
「外来遺伝子」と言われる。ウィルスを、このようなや
り方でベクターとして用いるのに、まず要求される条件
の一つは、外来遺伝子の挿入に適した部位があるという
ことである。このウィルスのある部位に遺伝子を挿入し
たことが、増殖にとって欠かせないある機能の崩壊を引
き起こすのであれば、そのような部位を用いることはで
きない。適当な部位とは、そこへの挿入がいかなる機能
も損なわないか、もしくは、その部位の機能がウィルス
の増殖にとって非必須であって、損なわれても平気でい
られるものである。このような部位は、「非必須領域」
と呼ばれる。この意味における「非必須」という語句
は、すくなくともそのウィルスが生体外で増殖すること
のできるある条件下で、もしくは、そのウィルスが生体
内で生き延びることのできるある条件下で、増殖する場
合に非必須ということである。
非必須領域を含むという理由で、ベクターに用いられ
るウィルスの例としては、orthopoxウィルス、アデノウ
ィルス、ヘルペスウィルスがある。しかし、使用される
領域は各例においてまちまちではある。ベクターとして
用いられるワクシニアウィルス（VV）は、orthopoxウィ
ルスであり、これは、ポックスウィルス科の一種であ
る。この特許出願の主題である、fowlpoxウィルス（FP
V）も、一種のポックスウィルスであるが、別の属、す
なわち、avipoxウィルスの一種である。VVは組織培養で
育てることができ、また、この培養過程において、ウィ
ルスのゲノムに外来遺伝子を挿入することができる。イ
ンビトロの複数種類の組織培養システムにおいて、VVの
数領域が非必須であることが判明した。
この中には、左端近方の大領域として、B.Mossら（J.
Virology 40,387−395,1981）は、左端から6.4メガダル
トンに欠損を持つ突然変異VVについて記載しており、D.
Panicaliら（J.Virology,37,1000−1010,1981）は、左
端から6.85メガダルトンの地点から始まる欠損を持つ突
然変異VVについて記載しており、チミジン・キナーゼ
（TK）遺伝子については、D.PanicaliとE.Paoletti（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,79,4927−4931,1982）、M.Macke
ttら（J.Gen.Virol.45,683−701,1982）が、ワクシニア
増殖因子（VGF）遺伝子については、R.M.L.Bullerら
（J.Virology 62,866−874,1988）が記載している。上
記のような部位は、生体内の増殖にとっても非必須であ
るかもしれない。しかしながら、TK、VGFのいずれの遺
伝子においても、その遺伝子の中に挿入しても組織培養
による増殖には影響はまったくないか、あるいはほんの
わずかしかないが、生体内の増殖や毒性は顕著な影響を
被ることが判明した（R.M.L.Buller et al.,Nature 31
7,813−815,1985と同書1988）。すなわち、Bullerら
は、上記遺伝子は、そのウィルスの生体内増殖には全く
非必須ではないことを示した。しかしながら、この生体
内の弱毒化は、もしそれがそのウィルスの好ましくない
病原作用を低下させるものならば、有益であろう。
このために、弱毒化を伴う生体内の増殖が、この発明
の目的にとって適正な増殖条件である。
ある部位が、ある組織培養システムにとっては必須で
あるが、別のシステムでは非必須であることがある。例
えば、VVには、ヒト細胞内の複製にとっては必須である
が、ニワトリ胚繊維芽細胞内にとっては非必須な遺伝子
がある（S.Gil−lard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
83,5573−5577,1986）。近縁のorthopoxウィルス属牛と
うウィルスの別の遺伝子は、チャイニーズ・ハムスター
の卵巣細胞内の増殖にとっては必須であるが、ニワトリ
胚繊維芽細胞にとってはそうではない（D.Spehner et a
l.,J.Virology,62,1297−1304,1988）。上記の例は、組
織培養システムの違いが、どの領域が非必須であるかに
たいして影響することがあることを示している。
VVゲノムは、完全解読からはほど遠く、しかも、FPV
ゲノムについては比較的僅かしか知られていない。知ら
れているのは、FPVはTK遺伝子を持っており、これは、
アミノ酸レベルで見ると、VVのTK遺伝子と約60％の相同
性を持っている、ということである（D.B.Boyle et a
l.,Virology,156,355−365,1987）。VVのTK遺伝子同
様、このTK遺伝子も、少なくともある条件下では、相同
的組み換えにたいして非必須領域の役割を果たす（PCT
出願WO 88/02022（CSIRO）参照）。大腸菌キサンチン・
グアニン・フォスフォリボシル・トランスフェラーゼ
（Ecogpt）遺伝子を、優性選択標識として、VV「7.5」
プロモーターと共同で用い、インフルエンザ血球凝集素
（HA）遺伝子を、FPVのTK領域に挿入し、このFPVをニワ
トリ胚皮膚細胞中で育てた。HA遺伝子の発現は、HA抗体
と標識蛋白Ａの、組み換えFPVのプラークにたいする結
合によって証明された。
FPVのゲノムは、他にも、いくつかの領域でVVと類似
性を持つことが知られている。例えば、DNAポリメラー
ゼ遺伝子はきわめて近縁関係にあり、アミノ酸レベルで
42％の相同性を持つ（M.M.Binns et al.,Nucleic Acids
Res−earch,15,6563−6573,1987）。一方、ポックス・
ウィルス／イリド・ウィルスに関する第６回ワークショ
ップ（Cold Spring Harbor,New York,24−28 Sept−emb
er,1986）における話の中で、F.M.Tomleyは、ゲノムの
一端の近くに位置する、11.2 kbのFPVDNAフラグメント
と、VVDNAとの相関を求めようとする試みについて述べ
た。FPVにおける48 kdポリペプチドを予告する遺伝子
と、VVにおいて48 kdのポリペプチドをコードする遺伝
子との間には、アミノ酸にして25％の相同性があると彼
女は報告しているけれども、その他には、有意な一致は
認められなかった。この研究のさらに詳細については、
E.M.Tomley et al.,J.Gen.Virol.,69,1025−1040（198
8）に記載されている。
F.M.Tomleyらはさらに、M.MackettとL.C.Archard（J.
General.Virology.,45,683−701,1979）を引用し、1038
ページに次のように述べている。すなわち、orthopoxウ
ィルス・ゲノムの末端部分は中央領域に比べて保存が悪
いこと、さらに、長さにしてほぼ30−35 kbの末端領域
は、ウィルスの特質を決定する遺伝子をコード化してい
ると考えられることで、このウィルスの特質とは、例え
ば、宿主範囲、毒性、組織偏向性、細胞病原性であり、
このために、保存が悪くなるのであろうと。VVの末端領
域は、非必須領域に関連して、興味ある部分であろうと
いうことが知られていた。ここに、M.E.Perkusら（Viro
logy,152,285−297,1986）は、ブロモオキシデウリジン
の存在下で、VVのゲノムに欠損が生じることを発見し
た。その内の一つは、左端のヌクレオチド2700から2410
0まで広がっており、しかも、この欠損変異性ウィルス
は組織培養中で生存する（細胞タイプは明確に述べられ
ていない）。
国際ポックス・ウィルス・ワークショップ（Cold Spr
ing Harbor,New York,9−13,September,1987）で、J.I.
A.Campbellが掲示したポスターの中で、FPVのまさに末
端領域そのものについて、若干の知見がもたらされた。
（ポスターの方が、“Modern Approaches to New Vacci
nes including Prevention of AIDS",CSH,1987,page 45
に発表された抄録よりもたくさんの情報を含んでい
る）。VVやcowpoxウィルス同様、FPVの末端塩基配列
は、互いに反転重複の関係にあり、共に共用結合的な相
互結合を持っている。末端の、末端反転（逆位）反復
（TIR）列の一部をBamHIで消化し、クローンした。BamH
Iフラグメントは6.3 kbの長さを持つと書かれてある。
ポスターでは、塩基配列の全体的配置が描かれてあった
が、それは、左から右へ向かって、短い非反復な領域、
一式の縦列反復配列、及び次に続く、長い非反復な領域
とから成る。長い非反復領域は、おそらく３個の開放読
み取りフレームを含むと思われる。ポスターの要約に
は、このFPV末端フラグメントは、VVおよびcowpoxウィ
ルスの末端フラグメントと、ヌクレオチド配列の全体的
パターンが共通していること、同時にまた、いくつかの
著しい違いのあること、が書かれていた。
VVのTIRの一部、すなわち、左端からほぼヌクレオチ
ド6800から9000にわたる部分の塩基配列が、S.Venkates
anらによって報告されている（J.Virology.,44,637−64
6,1982）。
VVとFPVのDNA塩基配列の間には大きな相違のあること
が予想される。なぜなら、FPVゲノムは、VVゲノムより
も、すくなくとも３分の１長いことが推定されているか
らである。前述した現在の知識に基づいて言うと、FPV
ゲノムとVVゲノムの間の相違の多くは、ゲノムの中心部
というより、末端部に近いらしい。したがって、VVの末
端領域に関する情報は、FPVとの関連においてはさほど
の興味を引かない。
従来から、fowlpoxウィルスにおいて、TK遺伝子以外
の、明確に定義づけられた非必須領域を位置づけること
が課題とされていた。ごく最近（1989年４月20日）、PC
T出願公開WO 89/03429（Health Research Inc.）におい
て、FPVの組み換え遺伝子について記載されているが、
そこに述べられている非必須領域は必ずしも十分には定
義されていない。この組み換え体は、ただFPV遺伝子を
複数のフラグメントに分割し、試験構築を用いてそのフ
ラグメントをテストし、試験対象となった外来遺伝子が
発現するかどうかを見ようとしたものであった。
VVのHindIII−Ｄフラグメントは、このウィルスのも
ので最もよくその特性の明らかにされているものの一つ
である。この1606bpフラグメントの塩基配列は決定され
ており（Niles et al.,Virology.,153,96−112,198
6）、13個の遺伝子（D1−D13）が特定されている。
いくつかの温度感受性を持つ突然変異体が、HindIII
−Ｄ内部の遺伝子に位置づけられており、さらに細かく
位置づけしてみると、これらは、D2,D3,D5,D6,D11,D13
に割り当てられた（Seto et al.,Virology.,160,110−1
19,1987）。したがって、これらの遺伝子は、ウィルス
の複製にとって必須である。VV Hind III−Ｄフラグメ
ント内の他の遺伝子が、ウィルスの増殖にとって必須で
あるが、非必須であるかは不明である。最近の実験が示
唆した（証明ではないが）ところによると、膜通過蛋白
をコードするD8は、組織培養におけるワクシニア・ウィ
ルスの継代にとって必須ではないかもしれない（Niles
and Seto,J.Virology.,62,3772−3778,1988）。上記の
実験において、フレームシフト突然変異を、D8のカルボ
キシ末端に起こさせ、これによって、D8のカルボキシ末
端の56個のアミノ酸が取り除かれた。この突然変異を含
むフィルスの増殖速度は、野生種のウィルスのものと区
別がつかなかった。
しかしながら、D8遺伝子が、fowlpoxウィルスに見ら
れるかどうかは予測できなかったし、仮に予測できたと
しても、それが非必須であるかどうかは、予測できな
い。さらに、FPVゲノムの中にD8遺伝子をどのようにし
たら位置づけることができるかという問題がある。とい
うのは、FPVゲノムは比較的マッピングされておらず、
また、VVのものよりもはるかに大きいからである。従っ
て、ワクシニア・ウィルスHindIII−Ｄフラグメントを
さらに調べても、FPV内に非必須領域をこれ以上探し出
す方法は得られなかった。
現在次のことが判明した。すなわち、末端反転反復列
（TIR）のBamHIフラグメントの内部に完全に収まってい
る３個の開放読み取りフレーム（ORF）が非必須領域で
あり、これは、相同的組み換え現象の部位として働き、
それによって、外来遺伝子をFPV内に挿入することがで
きる（第１図参照）。このORFは、次のような特徴を持
つ。すなわち、ほぼ670、370、300のヌクレオチド長を
持ち、BamHIフラグメント内部のTIRの長い非反復配列
（LUS）の中に収まるものである。BamHIフラグメント
は、約6.3 kbの長さを持つことが判明し、また、長い非
反復配列は、左端から数えると、ほぼヌクレオチド4100
から始まっている。（ヌクレオチドの数え方について
は、この後に示すDNA塩基配列直前の注意書きを参照し
てください。）ORFの長さは、そのコードしていると予
測されるポリペプチドの分子量の近似値としても表わす
ことができる。すなわち、26.0,13.9,11.5キロダルトン
と表現することもできる。この表記法を、今後、同定の
目的で用いることにする。26.0と11.5遺伝子は、同一鎖
上にコードされるが、フラグメントを、５′末端からBa
mHI部位に向かって左から右へと読みとっていった場
合、この順番で、コード化される。なぜなら、11.5遺伝
子は、３′未端をBamHI部位の近くに持っているからで
ある（第３図参照）。13.9遺伝子は、もう一方の相補的
DNA鎖にコード化されており、右から左へ読みとられる
が、第１鎖の26.0,11.5遺伝子をコードしている領域と
別で、かつその間に位置する領域内に存在する。
この所見および他の所見から推定すると、次の妥当な
仮説に導かれる。すなわち、TIRの長い非反復配列の全
体が非必須領域であり、この中には、BamHI部位の右端
のごく近傍の配列も含まれる。すなわち、F.M.Tomleyら
（上記引用箇所、1988）が配列を決定した11.2 kbフラ
グメント内部のものも含まれるのである。TIRは、約10
kbの長さを持っている。すなわち、10−6.3＝3.7kbが1
1.2 kbフラグメント内部に収まっていることになる。し
たがって、長い非反復配列が、ヌクレオチド約4100から
右に向かって、TIRのその他の長さ全体に渡って延びて
いるわけであり、これは約6 kbになる。
従って、本発明の重要な一つの目的は、相同DNA組み
換えによる、組み換えfowlpoxウィルス（FPV）を生産す
るのに役立つ組み換えベクターを供給する。ここに、上
記組み換えベクターは、FPVの末端反転反復列（TIR）の
長い非反復配列（LUS）の少なくとも一部を含む非必須
領域（NER）を含んでおり、上記NERは、一個ないし複数
個の外来遺伝子によって、かつ、取り込まれた各外来遺
伝子の発現を調整する一個ないし複数個の配列によっ
て、中断され得る。
できれば、NERは、6.3 kb BamHIフラグメント内部
の、長い非反復配列（LUS）の一部の中にあることが望
ましい。さらに特殊な点について言えば、NERは、ほぼ6
70,370,300個のヌクレオチド長を持ち、TIRのBamHIフラ
グメント内部のLUSの一部の中に完全に収まる開放読み
取りフレーム（ORF）の少なくとも相同的に組み換え可
能な長さから成る。しかしながら、われわれはまた、次
のような所見も得た。すなわち、FPVの同一種からの分
離種のあるものは、BamHI部位の長さ一杯に渡る、200 b
pのDNAを越える長い配列を持たない。これは、その部位
の長さ一杯に渡る配列の非必須性を示す重要な指針とな
る。従って、FPV全体にあてはまる正式の定義として、
「BamHIフラグメント」とういう用語を用いるのは不適
当である。故に、これらORFは、縦列反復列後のLUSの最
初の2.2 kb以内にあるもの、すなわち、その外部端の2.
2 kb以内にあるものと定義する方が良い。この2.2 kb以
内にあるNERが望ましい。NERの望ましい位置については
上に述べた通りであるが、この立場は、組み換えベクタ
ーやこの発明に含まれる隣接配列にもあてはまる。すな
わち、外来遺伝子（単数および複数）やその調節遺伝子
配列に隣接する相同的に組み換え可能な配列についても
あてはまる。
われわれは、他にも、fowlpoxウィルスについてある
非必須領域複数個を発見した。前述したものは、末端反
転反復列の一部以内にあるが、それ以外の、他に発見さ
れたものは、FPVDNA分子のもっと中央部にある。すなわ
ち、FPVのEcoRIライブラリーの6.3 kbフラグメントの一
端内部もしくは近傍にある。しかも、このEcoRIライブ
ラリーの遺伝子は、ワクシニア・ウィルス（VV）のHind
III−Ｄフラグメントのある種の遺伝子と有意な相同性
を示す。
本発明における、上記の第２の点は、その起源を次の
ものの中に持っている。すなわち、FPVゲノム部分のラ
ンダム・クローニング、ランダム・クローンの配列決定
は、６種の読み取りフレームすべてについて、遺伝子予
測を可能にするような開放読み取りフレームがないかど
うか探り出す探球、から始まったものである。このよう
にして得られた配列を、ワクシニア・ウィルス（VV）の
蛋白の配列と比較した。すると、ある程度の相同性が、
VVタンパク質のD1−D13のいくつかに認められた。この
中には、VV D1,D5,D9,D10,D13にたいする近似的な適合
を含める。従って、VV遺伝子にたいしある程度の相同性
を示すFPV遺伝子にたしい、仮に、“D"という用語を用
いることに決めた。VV D9にマッチするFPVのM13クロー
ンを、FPVのEcoRIライブラリー内のクローンを特定する
ため、プローブとして用いた。pMB379と名付けたこのよ
うなクローンについて、これは6.3 kbの挿入部を含んで
いるが、その塩基配列を決定した。このクローンは、D9
遺伝子の一部と、D10,D11,D12、D13のすべてを含んでい
た。（後に挙げた４種の遺伝子は、対応するVV相同体に
コードされるアミノ酸にたいし、40％、62％、53％、55
％の一致性を示した。）D7,D8遺伝子をクローンするた
め、プラスミドpUC13 SmalでクローンされたFPV DNAの
Dralライブラリーを構築した。M379−27S（これは、FPV
D9遺伝子内部にある）と名付けたM13クローンから得
たプライム・カット・プローブをコロニーのプローブと
し、pMB389と名付けたプラスミドを含む、１個の陽性コ
ロニーをさらに調べた。mMB389は、D6遺伝子の「カルボ
キシ」末端、全D7,D9,D10遺伝子と、D11遺伝子の「カル
ボキシ」末端を含むことが判明した。（D11の配列は、D
10と逆方向に走っているので、そのカルボキシ末端は、
D10に近い側のものである。「カルボキシ」末端とは、
予測されるポリペプチドのカルボキシ末端に相当する、
コードするDNA鎖の３′末端である。）VVD8遺伝子に
は、これといって特定できる相同体がなかった。もっと
も、もう一つ別の遺伝子がD7とD9の間にあり、これは、
都合が良いので、「D8」と名付けた。特に予測し得なか
った発見として、pMB379,pMB389の両方に存在するD9の
複製が、そのVVの対応部分と比較すると、フレームシフ
ト突然変異体を含んでいたことで、このために、FPVに
おいてD9の発現が起こらなかったのらしい。
現在、次のことが判明した。すなわち、FPVのD8,D9遺
伝子は、非必須遺伝子で、外来DNAの挿入に使用するこ
とができる。遺伝子間領域も非必須と考えられるので、
原理的には、D7のカルボキシ末端から、D9遺伝子のカル
ボキシ末端までの領域全体が、非必須領域（NER）とい
うことになる。（遺伝子D7,D8,D9,D10はみな同一方向に
並んでいる）。しかしながら、この後で説明するよう
に、NERは、D9遺伝子のカルボキシ末端のぎりぎりいっ
ぱいのちょうどそこまで伸長しているわけではなく、D1
0遺伝子との間に干渉の起こるのを避けるため、末端の
手前で止まる。これは、D10遺伝子は、D9やD10遺伝子の
プロモーターと重複しているからである。このNERは、
以後、簡単のために、D8−D9 NERと呼ぶことにする。
したがって、本発明は、上述したように、さらにもう
一つの組み換えベクターを提供しており、そのベクター
においては、NERは、D7カルボキシ末端からD9カルボキ
シ末端近傍に至る領域のNERである（ただし、D10遺伝子
とD10プロモーター領域とを除く）。
また、別の重要な目的として、本発明は、組み換えベ
クターを提供する。これは、例えば、上記したようなNE
R配列（TIRまたはD8−D9）を持つプラスミドである。こ
のようなベクターは、上に定義した組み換えベクターを
調製するのに有効である。
第３に、本発明は、あるDNA分子を含むものである
が、これは、実質的または基本的に、上に定義したNER
配列から成り、かつ、その分子をFPVのゲノムDNAと区別
するために、その一端または両端において１端あたり、
例えば（任意に述べると）1000 bpまでの、相同的に組
み換え可能な隣接配列をいくつか持っているか、また
は、持たないものである。
第４に、本発明は、このベクターに適合し、この発明
にかかるベクターのいずれかを有する宿主をカバーして
おり、そのベクターとはすなわち、この組換えベクター
または、この新規のNER配列を含むすべての中間ベクタ
ーである。
第５に、本発明は、上に定義した組み換えベクターの
挿入DNAでの母性FPVの相同組み換えによって生産された
組み換えFPVを包含する。
第６に、本発明は、上に特定した組み換えFPVによっ
て感染された動物細胞、特にニワトリ細胞を含む。すな
わち、上記細胞のインビトロ培養過程、および、当該特
許法の容認する場合においては、受容動物、特にニワト
リにたいする組み換えFPVのワクチン接種法である。
さらに特異的な面について述べるならば、本発明の組
み換えベクターは、順に次のものを含む。
（１）第一の、相同的に組み換え可能な隣接配列、 （２）非必須領域の第一部分内の配列、 （３）プロモーターDNA、 （４）プロモーターの下流にあって転写可能な外来遺伝
子、（これによって、fowlpoxウィルスDNAポリメラーゼ
がプロモーターに結合する時、これが、外来遺伝子をmR
NAに転写することができる）、 （５）同じ非必須領域の第二の部分における配列で、第
一と第二の配列は、ウィルスゲノム内の非必須領域の第
一と第二の部分と同じ相対的方向性を持っている、 （６）第二の、相同的に組み換え可能な隣接配列。
（発明を実施するための最良の形態） 先ず末端反転反復列（TIR）のNERと第２図を参照する
と、FPVのTIRのBamHIフラグメントは、約6.3kbの長さを
持っている。これは、0.23 kbの短い非反復配列と、そ
れに続く、縦列反復列を含む約3.87 kb長の領域、さら
に2.18 kb長の長い非反復配列を含む。
本発明において使用されるTIR NERをあたえる遺伝子
の、BamHIフラグメントにおけるおよその位置を、第３
図をマップに示す。矢印は、13.9遺伝子が、相補的DNA
鎖にあることを示す。このマップおよびこの後の知見か
ら、これらの遺伝子は、VVにおいて既知の片割れに近い
ものを持たないことが分かるであろう。BamHI部位は、
先に説明した理由によって、これも非必須部位の一部で
あると考えられる。全部で５種のORFが、TIRのこの長い
非反復配列の中に認められた。FPVの、それぞれ別々の
コドン・バイアスによってポリペプチドをコード化して
いると思われるものは以下の通りである。
Ｃ＝は、下記のヌクレオチド配列に示したものにたい
して相補的なDNA鎖に存在する。
26.0,13.9,11.5と名付けた３種のORFの他に、相補的D
NA鎖には、もっと短い２種のORFがある。このORFのいず
れも、必要なFPVコドン・バイアスを示さないので、遺
伝子をコードしているとは思われない。
以下に、BamHIフラグメントのDNA配列を、左端から始
め、常例通り、５′から３′に向かって読みとったもの
を示す。また、同時に、コード化されていると予測され
るポリペプチドも併せて示した。しかしながら、銘記し
ておかなければならないことは、縦列反復領域の配列決
定には困難がともなうこと、したがって、この領域内の
ヌクレオチド数は、何らかの修正を受ける可能性がある
ことである。このことは、本発明にとってまったく重要
なことではない。なぜなら、本発明は、縦列反復領域に
は関わっていないからである。このことから、長い非反
復配列は、かならずしも、絶対数にしてヌクレオチド41
10からスタートしないかもしれない。したがって、この
クヌレオチド数は、単なる読者にたいする手引として扱
うべきで、これによって、読者が、言及されたORFを特
定することができ、したがって、記載事項やクレームに
ついて推察できるようにするためのものである。
上記の配列は、FPV属全体を定義づけるものではない
ことは明かであろう。なぜなら、FPVの異なる型あるい
は株の間には若干の不可避的な変動があり、その内のあ
るものは欠損あるいは挿入という形をとるであろうし、
また、所望の相同的組み換えと適合し得るNER変種のい
ずれも、ここに使用可能だからである。特に、上記の配
列と、少なくとも、例えば、90％の相同的を示す配列を
持つORFに基づくNER配列を持つDNAは、この発明の好ま
しき特例である。
BamHI部位（GGATCC）を越えると、ヌクレオチド配列
は、そのままF.M.Tomleyら（上に引用、1988）の1029ペ
ージの記載に続く。すなわち、上記のヌクレオチド6275
は、BamHI識別配列の第１番目であり、Tomleyらの順番
のNo.1である。BamHI全長にわたるORFはないけれども、
少なくとも、Tomleyらの11.2 kbフラグメントの中に160
bpまで踏み込む配列は、非必須であると証明可能であ
り、それに続く配列も、非必須であるらしい。
本発明のNERは、外来遺伝子をFPVの中に挿入するのに
用いることができる。できれば、その遺伝子を安定に取
り込み、したがって、それによって生じた組み換えFPV
が、組織培養において、大規模に、繰り返し培養される
ことが望ましい。これまでの証拠から、13.9遺伝子は、
他の二つよりも安定性が低い。
外来遺伝子は、組み換え用プラスミドのNER配列内の
いずれかの場所に挿入され得る。できれば、その場所
は、極端に、一端または他端に片寄らないことがのぞま
しい。すなわち、野生種FPVの対応するNERとの相同的組
み換えができるほど十分な長さの部位を与えるものであ
ることが望ましい。しかしながら、組み換えベクターに
おいて、NERの一端または両端を越えて延びる隣接配列
を設けることによって、NER以外の場所で、相同的組み
換えを起こすことは可能である。密な縦列反復を持つ隣
接配列を用いることは、大抵の場合、あまり得策ではな
いであろう。
なぜなら、こうすると、所望しているのとは別の組み
換え事象の起こる確率が増すからである。したがって、
LUSの外部末端を越えて長く縦列反復領域にまで走る隣
接配列は、避けるのがもっとも賢明であろうことが窺わ
れる。
ここでD8−D9 NERと図面の第９図を参照すると、プ
ラスミド pMB379とpMB389は、FPV DNA挿入部を持って
いるが、この挿入部は、D9,D10遺伝子領域で重複してい
る。この挿入部の配列を決定することによって、長いヌ
クレオチド配列が得られた。これは、D6の３′末端から
D13まで伸びており、それを越えて隣接するA2遺伝子に
まで達する。
下に示す配列において、この発明に関わらない部分は
省略した。制限部位、Dral（TTTAAA）,EcoRI（GAATT
C）,BcII（TGATCA）,AsuII（TTCGAA）,BgIII（AGATCT）
は、クローニングや、非必須領域をテストするさいに、
プラスミドの構築体として用いられた。予測される遺伝
子のアミノ酸配列を、一文字コードで示した。FPVでは
発現されないと考えられるD9遺伝子については、アミノ
酸配列を示していないが、ヌクレオチド1298から1984ま
で伸長していると考えられる。開始、停止コドンには下
線を引いた。ここに示した配列は、D7遺伝子のカルボキ
シ末端とD11遺伝子のカルボキシ末端とに渡っている。
（D11遺伝子は、他のものと逆方向に走る開放読み取り
フレームを持っているので、そのD10近傍末端は、おそ
らくD11蛋白と思われるもののカルボキシ末端をコード
化するものである。）この配列は、D11遺伝子のDraI部
位を示す（第９図も併せて参照）。
D10遺伝子は、D9遺伝子の末端内でスタートする。こ
れは、別の読み取りフレーム内部にあるからである。し
たがって、D10プロモーターもD9遺伝子内部にある。し
たがって、非必須領域は、D10プロモーター領域の開始
点まで延びていると定義される。この開始点は、D10に
たいするATGスタート・コドンの前ほぼ35塩基、すなわ
ち、ヌクレオチド1936にあると推定される。
D10遺伝子への外来遺伝子の挿入は不安定であること
を示す、予備的な観察がある。したがって、D10遺伝子
は、この発明の目的に適合するNERではない。
ここで、この発明にかかわるすべてのNERを参照して
みると、組み換えベクターは、NERの両側に、十分な長
さの、相同的に組み換え可能な隣接配列を含むことがで
きる。この長さは、好ましくは少なくとも100ヌクレオ
チド、もっと好ましくは少なくとも250ヌクレオチド、
さらにもっと好ましは少なくとも500ヌクレオチドであ
る。一方、組み換えベクターにたいする挿入部をあまり
大きくしたくないという立場に立てば、NER外部のこの
隣接配列を、例えば、1000 bpを越えない範囲に限定す
ることが好ましいことも多い。
ついでに触れておきたいが、隣接配列とNERの厳密な
相同性は、必ずしも必要ではない。W0 89/03429にこの
意味のことを言及した部分があるが、それは、ここでも
あてはまる。
本発明の、組み換えFPVを調製するにあたって、まず
第一に必要なものはプロモーターである。著名なワクシ
ニア・ウィルス・プロモーターP7.5,H6（先に引用したP
CT出願公開、No.W0 89/03429参照）または、P11を用い
ることができる。なぜなら、これらは、生育に影響ない
ものとして、FPVによって受け入れられるからである。
しかしながら、できれば、FPVプロモーターを用いるの
がよい。以前のPCT特許出願公開No.W0 89/03879（Natio
nal Research Developement Corporation）において、
数種のプロモーターが記載されている。この中で“4b",
“13.2K"プロモーターが特に好ましい。
この発明は、特に、家禽、中でもニワトリに関わるも
のである。この目的にそって、家禽の状態の改善に関わ
るいずれの外来遺伝子についても、挿入しようとすれ
ば、fowlpoxウィルスの中に挿入することができるであ
ろう。できれば、その遺伝子は、生体内サブユニット・
ワクチンに相当するものであることが望ましい。例え
ば、感染性肺炎ウィルス（IBV）、感染性嚢胞病ウィル
ス、ニューカッスル病ウィルス（NDV）、マレック病ウ
ィルス及び感染性喉頭気管炎ウィルス、アイメリア属の
抗原性蛋白をコードする遺伝子である。興味ある特定の
遺伝子について述べるなら、IBVのスパイク遺伝子、NDV
のHN及びＦ遺伝子であり、これらは、PCT特許出願公開n
o.W0 86/05806とヨーロッパ特許出願公開No.227414A
（いずれも、National Research Dev−elopment Corpor
ation）に記載してある通りである。
外来遺伝子が生体内で正しく翻訳されるためには、そ
の外来遺伝子自らのATGスタート・コドンを、プロモー
ターにすぐ続く領域に挿入しておく必要がある。
単一のポックス・ウィルスには１個を越える外来遺伝
子の発現が可能である。mRNAについて、２個の外来遺伝
子について単独の非必須領域内で別々の方向に転写させ
るように配置することは可能である。このような「背中
合わせ」の構築を、例７に示す。また、個々の外来遺伝
子を、ここに記載する個々のNER内に挿入することも可
能である。もちろん融合蛋白遺伝子を形成することもで
きるが、普通は、各遺伝子を、別々のプロモーターの制
御の下におくのが望ましい。
次に、プロモーターと外来遺伝子を、FPVゲノムの非
必須領域（NER）の中に挿入しなければならない。相同
的性組み換えの工程は、図面の第１図に示した通りであ
るが、その方法を示している。NERを含むゲノムDNAのフ
ラグメントを、クローン用ベクターでサブクローンす
る。次に、クローン・ベクターにおいて、次の構築体を
設ける。すなわち、NERの一部を含み、その次にプロモ
ーターが続き、その次に外来遺伝子が続き、その次にNE
Rの別の一部が最初のものと同じ方向に続く、そのよう
な構築体である。この構築体は、適当なベクターに入る
と、組み換えベクターを形成し、これは、FPVを、例え
ば、燐酸カルシウム法を用いて、トランスフェクション
するのに用いることができるから、組み換えベクターの
NER配列とFPVのNER配列との間に組み換えが起こる。次
に、FPVは、この変換ゲノムを自動的に再びパッケージ
するから、この変換FPV（組み換えFPV）は、この発明の
一部である。
上記の組み換えベクターは、各種の方法で調製が可能
であって、必要な要素はいずれの順番によって導入され
ても良い。第４図を参照して述べると、この発明で使用
について上に定義し、かつ、（例えば）２カ所の制限部
位A,Bを持つ非必須領域は、適当なベクター中に挿入さ
れるが、このベクターは、図の都合上、ただのプラスミ
ドと書かれている。もう一つの、同一の（あるいは結合
し得る）制限部位A,Bを持つプラスミドにおいて、構築
体が、プロモーター配列、それに続く外来遺伝子配列に
よって形成される。当然のことであるが、この構築体
は、必ず次のようにできていなければならない。すなわ
ち、mRNA転写が、外来遺伝子の開始コドンの所で、ある
いは、その前で始まるようになっていなければならな
い。mRNA転写の開始位置が、どこで、何かの特定プロモ
ーターの作用を受けるのかを正確に決定することは時間
のかかることであるから、100個、または、できれば150
個の塩基対を持つプロモーターDNAを、これは、それが
通常プロモーターするFPV遺伝子の直前にあるのである
が、プロモーターの活動を確実にするためには、単にそ
のDNAを、挿入するやり方が簡便である。
制限部位A,Bは、FPVプロモーターDNAと外来遺伝子に
隣接するプラスミドDAの中に位置する。もちろん、Ａ
は、プロモーターDNAの非機能的な部分内に入るなら
ば、プロモーターDNA内にあってもよい。ＡとＢは、二
つの別々の制限部位であるけれども、もちろん、両者は
同一物であってもよい。これらは、粘着端部位であって
も、あるいは平滑端部位であってもよいし、人工的に調
製したもの、例えば、組み換えDNA分野ではよく知られ
ている方法であるが、さらに別のヌクレオチドを充填し
たり、削除したりして調製したものでもよい。都合がよ
ければ、ＡとＢは、単一の平滑端部位（Ｃ）であって、
または、単一の平滑端部位（Ｃ）に変換したものであっ
て、それを、NER内の単一平滑端部位（Ｃ）に結合させ
たものであってもよい。もちろん、他の配列のDNA結合
が起こるのを防ぐように、プラスミドDNA内の単一の部
位を選ぶよう注意を払わなければならない。ここに挙げ
た例では、NERのSpeI,NcoI,BgIIIにたいする単一部位を
そのまま使用したり、充填したりして、プロモーター・
遺伝子構築体挿入のために単一平滑端部位を調製したの
であった。
２個のプラスミド由来のDNAは、インビトロで結合さ
れ、次に、宿主に形質導入され、ここで、本発明の最終
の組み換えプラスミドを生産する。
第５図は、組み換えベクターを調製するもう一つの方
法を図示している。この方法においては、まず構築体を
調製する。これは次のものを含む。
NERの第一部分、次にプロモーター、次に短いヌクレ
オチド配列が来るが、これは外来遺伝子の挿入用に少な
くとも１個のクローン部位を含んでおり、さらにその次
にNERの第二部分が来るが、これはほとんど必ず第一部
分と同じ方向性を持つものである。もちろん、事実上ど
のような長さのDNAであっても、何らかのやり方で、外
来遺伝子を挿入するのに適当なクローン部位を備えるよ
うにすれば、そのようにできるであろう。
できれば、この構築体は、複数のクローン部位を持つ
こと、すなわち、さまざまな制限酵素の作用部位を、例
えば、少なくとも10部位含むようなDNA長を持つことが
望ましい。このような構築体は、広範な応用性を持つ。
というのは、ほとんどどのような外来遺伝式にたいして
も、その隣接DNAを、各外来遺伝子の末端近傍に限定す
ることがずっと簡単になるし、また、第５図に図示した
複数のクローン部位に外来遺伝子を挿入するのもずっと
簡単になるからである。簡単のために、ただ２部位X,Y
しか示していないが、これらは、望みのままに、充填し
たり削除したりして、同一の平滑端部位とすることがで
きる（X,Yの代わりにＺを用いる）。最終の組み換えプ
ラスミドでは、プロモーターDNAは、外来DNAと、複数ク
ローン部位の一部によって隔てられているが、これは、
最終ウィルスにおけるmRNAの転写に悪影響を及ぼさな
い。
いずれの構築法を採るにしても、NERは、プロモータ
ーと外来遺伝子によって分割される。もちろん、NER
が、中央領域で分割されるのは、本質的なことではな
い。また、NERの第二部分が、NERの全体バランスを構成
していようと、残余を構成していようと、これもまた本
質的なことではない。上に説明したように、NER内部
に、または、一端に、相同的組み換えに十分な長さのDN
Aが含まれている限り、NERの一部が、その間のどこかで
切断されていたり、別の（無関係な）DNAが、組み換え
プラスミド調製中に挿入されたとしても、それは問題で
はない。あるいは、さらに、NERが長さにしてほんの数b
pであってもそれは問題ではない（ただし、通常、それ
は、約20 bp長未満ではないし、また、そのような短いN
ERがあったとしても、そこに外来DNAを挿入するのは実
際上困難であろう）。
第６図には、もう一つの、組み換えプラスミドの調製
法が図示してある。NERプラスミドは、前と同様の制限
を受ける（平滑端部位、または、粘着端部位を充填して
平滑端としたもの、Ｃは、この図では任意に描かれてい
る）。他方のプラスミドは、それ自体のプロモーターを
持つマーカー遺伝子と、それ自体の遺伝子を反対方向に
持つ外来遺伝子を含む。不正な組み換えの起こる可能性
を避けるために、別々のプロモーターを用いなければな
らない。このプラスミド同士を結合させると、マーカー
は外来遺伝子に結合される。したがって、組み換えFPV
中のマーカーの存在は、外来遺伝子がうまくFPV内に取
り込まれたことを表わすものとなるかもしれない。都合
の良いことに、マーカーは、色や、蛍光反応や、化学発
光反応によって、簡単に検出できる。ベータ・ガラクト
シダーゼあるいはlacZ遺伝子をNER中に挿入し、５−bro
mo−４−chloro−３−indoly−Ｄ−galactopyranoside
（Ｘ−gal）基質が、育成培養液中に存在する場合に生
産される青色のプラークによって、組み換え体を検出す
ることができる。lacZ遺伝子を用いるこの方法は、VVに
かんしてS.Chakrabartiら（Molecular and Cellular Bi
ology,５,3403−3409,1985）によって記載されている。
できれば、このマーカー遺伝子も選択可能であること
が望ましい（あるいは、これを、１個の選択可能な遺伝
子または、２個の別々の遺伝子で、１個はマーカー、１
個は選択可能なものと代えてもよい）。選択可能な遺伝
子の例としては、既に引用したPCT出願WO 88/02022や、
また、F.G.FalknerとB.Moss（J.Virology,62,1849−185
4,1988）によって記載されているEcogpt遺伝子がある。
外来遺伝子がうまくNER内部に取り込まれたらしいと
いうことが分かれば、組み換えプラスミドを調製する場
合にも有益である。これをチェックする一つの方法は、
第７図に示した操作法を採用することができる。ここで
も、平滑端部位（ＺとＭ）が示されている。第一のプラ
スミドでは、これはNERを含むものであるが、あるマー
カー遺伝子をNER内に挿入し、かつ、任意に、複数のク
ローン部位をマーカー遺伝子内部に挿入する。次に、別
のプラスミドの中に含まれた、自身のプロモーター付き
の外来遺伝子を、図示したように二つのプラスミドを結
合することによって、マーカー遺伝子内に挿入する。外
来遺伝子は、マーカー遺伝子内の、マーカー機能を阻害
ないし変更する、いずれかの部位に挿入され、このた
め、挿入を識別することができる。例えば、大腸菌lacZ
遺伝子は、マーカー遺伝子として用いることができる。
この場合ただαフラグメントを挿入してやればよい。と
いうのは、処理に必要な遺伝子の残りの要素は、宿主菌
によって供給されるからである。lacZ用プロモーター、
lacZ開始コドン、また、できれば、開始部位の数コドン
内に複数のクローン部位があって、それに続いてαフラ
グメントがあることが望ましいが、これらは大腸菌のプ
ロモーターによって供給される。αフラグメントが、都
合良く上記複数クローン部位に挿入可能な外来遺伝子に
よって中断された場合は、Ｘ−gal基質上に与えられる
青色コロニーは通常得られない。白色コロニーは、組み
換えプラスミドの存在の可能性を表わす。
さらに、組み換えベクターは、時によって、mRNAの転
写を停止させる停止信号部位を設けることができる。こ
れは、初期に活動するプロモーターを用いる場合、mRNA
を安定化するのに有用であろう。この場合、これは、外
来遺伝子の下流に挿入するが良いであろう。しかしなが
ら、多くの場合においては、感染ポックス・ウィルスの
通常の停止信号または、FPVのもう一つの、下流にある
遺伝子の転写を開始する信号で十分であろう。
ここでのFPV（あるいはVV）以外のベクターについて
の参照事項は、適当な宿主内部における構築体の大量生
産に好適な、いかなる原核性または、真核性クローン・
ベクターをも包含するものである。原核性ベクターとは
通常プラスミドかファージである。適当な原核性宿主は
細菌を含む。菌類、酵母、動物細胞、例えば、SV40のよ
うな真核性ベクターも、その方が好都合だと思えば用い
てもよい。
使用される組み換えベクターは、通常、二重鎖DNAで
あるが、相同的組み換え用に、一本鎖DNAを用いること
もできる。
本発明の組み換えベクターは、NER、プロモーター、
外来遺伝子を含むものであるが、これは、「親（paren
t）」のFPV DNAと、その位置を「取り替えっこ（swapp
ed over）」しなければならない。このためには、適当
な動物の、できれば家禽のものだが、また、かならずし
もそうでなくても良いが、その細胞に母性FPVを感染さ
せ、次に、組み換えベクターをその細胞内に導入する。
この過程をインビトロで行なう。親FPVには野生種を用
いないのが賢明であるが、その理由を言うまでもない。
FPVは、通常のいずれの弱毒法によっても、簡単にその
活性を減ずることができる（突然変異を引き起こし、そ
れを、より毒性の小さいものにする）。
組み換えウィルスを検出したり、または、選択するた
めには、各種の方法が利用可能であり、VVに関しては、
M.MackettとG.L.Smith（J.General Virology,67,2067−
2082,1986）の総説に記載されている。このような方法
は、本発明においても応用可能である。一つの方法は、
組み換えプラスミドを拡大して、所期の外来遺伝子と共
に、前述したように（第６図）、さらにマーカー遺伝子
を含むようにしたものである。またもう一つの方法で
は、外来遺伝子の挿入を、ハイブリダイゼーション定量
法（アッセイ）によって検出することができる。この方
法では、外来遺伝子配列にたいして相補的な、標識ヌク
レオチド配列を用いる。このような定量法はよく知られ
ている。
次に、外来遺伝子を持つFPV組み換え体を、適当な細
胞内で生育させる。本発明のNERは、ニワトリ胚繊維芽
細胞において非必須なものである。これらを、他の種類
の細胞でもFPVの増殖に用いることができるのかどうか
を決めるために、通例の実験を実行してみる必要がある
だろう。他の種類の細胞とは、例えば、ニワトリ胚皮膚
細胞、ニワトリ繊維芽細胞、ニワトリ胚上皮細胞で、こ
れらは、通常の組織培養法、主に、組織、または、ふ化
したニワトリまたは七面鳥卵の將尿膜（CAM）をトリプ
シン処理して得たものである。
鳥類にワクチンとして投与するには、この組み換えウ
ィルスを、いずれの適当な方法で与えてもよい。例え
ば、エアロゾル、飲み水を通じて、経口投与、筋注、ま
たは、翼えらへの接種、いずれでもよい。スキム・ミル
クまたはグリセロールのような成分を、ウィルスを安定
化するのに用いてもよい。できれば、１日令のニワトリ
にエロゾル投与によってワクチン投与することが望まし
い。鳥一羽あたりの組み換えFPVが、102から108pfu、好
ましくは104から106pfuの用量が、一般に薦められる処
方である。
本発明は、主として、ニワトリの治療を意図したもの
であるが、可能性としては、FPVを安全に接種すること
のできる他の動物のワクチン投与に関連しても効果を有
する。さらに、適当な臨床試験を実施した後ならば、FP
Vを人間に感染させても安全と考えてもよいだろう。
下記の実施例は、本発明を具体的に示すものである。
（実施例１） この例は、末端反転反復NERに関わる。
ウィルス株 fowlpoxウィルスのHP438株と、ミュンヘン、Ludwig−
Maximillians大学のA.Mayr,H.Mahnel教授より入手し
た。HP438株は、組織培養において、病原性HP1株を、ニ
ワトリ胚繊維芽細胞（CEF）において438継代して得られ
たものである（A.Mayr et al.,Zentralblatt fuer Vete
rinarmedizin,B13:1−13,1966）。クローニング用のDNA
を得るのに用いたHP444株は、CEF細胞においてさらに６
代継代させて得られた。
組織培養液 CEF細胞は、199（Wellcome）培養液に、ペニシリン
（200U/ml）、ストレプトマイシン（200μg/ml）、Fung
izone（２μg/ml）、10％新生子牛血清を添加したもの
の中で増殖させた。
細胞培養ならびにウィルスDNA精製 FPV株HP444は、ニワトリ胚繊維芽細胞（CFF）一次培
養体中で増殖させ、FPV DNAは、M.M.Binnsら（Nucleic
Acids Research,15,6563−6573,1987）の記載する通り
に調製した。
末端フラグメントの特定 ポックス・ウィルスのゲノムは、二重鎖DNAである。
通例の通り、二本の鎖は、水素結合によって互いに保持
されている。しかしながら、ポックス・ウィルスのゲノ
ムの末端においては、二本の鎖は、共有的に結合してい
る。立体配置的には、このことは、DNAは連続した一本
鎖であると言うに等しい。ゲノムを、制限酵素でフラグ
メントに切断すると、内部フラグメントは、末端フラグ
メントと立体配置的に異なるから、振舞いも異なる。加
熱すると（二本の鎖を分離するために）、内部フラグメ
ントは完全に分離するが、なまし戻しの過程は緩やかで
ある（急速に冷やすと、ほとんどなまし戻しが起こらな
い）。末端フラグメントは、共有的に結合しているの
で、空間的にあまり遠くまで分離できない。冷却する
と、中央から「チャック閉じ」されて、急速になまし戻
される。これは、「パッチン戻し（snap−back）」と呼
ばれる。したがって、加熱し急速に冷却すると、末端フ
ラグメントだけが、ゲル電気泳動によって観察される。
この、末端フラグメントの特定法は、「パッチン戻し
（snap−back）」法と呼ばれるが（L.C.Archard＆M.Mac
kett,J.General Virol.,45,61−63,1979、参照）、ここ
ではこの方法を用いた。
BamHI制限酵素（10μｇ）消化DNAを一旦フェノールで
抽出し、水溶相をジエチルエーテルで抽出し、フェノー
ルを除去し、水溶相のDNAをエタノールで沈澱させた。D
NAペレットを乾燥し、20μｌのTE（10mM Tris HCl pH7.
5,1mM,EDTA）中で再懸濁させた。次に、DNA溶液（10μ
ｌ）を、50mM Tris HCl pH7.5に溶かした95％容量／容
量脱イオンホルムアミド40μｌを加えて変性させ、60℃
で10分間インキュベートした。標本をいれた試験管を、
NaClを含む湿った氷の上で急速に冷却し、その後、アガ
ロース・ゲル電気泳動によってDNAを分析した。末端フ
ラグメントと想定されるサンプルは、無傷のFPV DNA内
においてのみ急速に再生され、これは、ほぼ6.3 kbのバ
ンドと検出された。BamHI由来のパッチン戻しフラグメ
ントはただ一つだけであった。これは、BamHI部位は、T
IRの十分内部に現われたからである。
FPV DNAの末端フラグメントのクローニング BamHIフラグメントの末端相互結合は、S1ヌクレアー
ゼを用いて消化した。すなわち、100μｇのFPV DNA
と、20単位のS1ヌクレアーゼ（Boehringer Mannheim）
とを、30mMの酢酸ナトリウムpH4.5、0.3M NaCl、1mM Zn
SO4、５％（v/v）グリセロールの混合溶液250μｌに、3
7℃で20分間溶解させたものを用いた。次に、DNAの末端
修復のために、エタノール沈澱させ、100μｌの結合バ
ッファー（50mM Tris HCl pH7.5,10mM塩化マグネシウ
ム、10mM DTT）中で再懸濁させた。
さらに、このバッファーには、５単位の大腸菌ポリメ
ラーゼＩクレノウ・フラグメント、１単位のT4DNAポリ
メラーゼ、それぞれ0.025mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTPが含
まれていた。この反応は、室温で１時間放置して行なっ
た。この反応は、70℃で10分間加熱して停止させ、反応
液の20μｌを、メーカーの推薦に従って、10単位のBamH
I（Boeringer Mannheim）で消化した。このDNA ５μｌ
を、20ngのBamHI/Sma I切断のプラスミドpBGS19に結合
させた（B.G.Spratt et al.,Gene 41,337−342,198
6）。これによって、T4 DNAリガーゼ２単位と1mM ATPを
含む、全容量20μｌの結合用バッファーができたわけで
あるが、これを一晩４℃でインキュベートし、大腸菌に
形質転換した。末端フラグメントを含む組み換え体のス
クリーニングは、ゲルから分離した、放射性標識したFP
V BamHI末端フラグメントを用い、T.Maniatisら（‘Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual′,New York,Cold
Spring Harbor Laboratory,1982）およびHolmesとQuig
ley（Analytical Biochemistry,114,193−197）によっ
て記載された標準法にしたがって行なった。組み換えプ
ラスミドpB3が分離された。
NERのクローニング 非必須性テストの対象となる３種の遺伝子は、短絡変
更されたプラスミドpB3の中に、自然の配列を守りなが
ら、共に保持されていた。第８図参照。pB3は、BamHIフ
ラグメントから、短い非反復配列と、反復配列を取り除
いて短縮した（第８図参照）。これは、SstIによる消化
によって行なった。pBGS19においては、BamHI部位の直
前にSstI部位があり、このBamHIの中に、FPV BamHIフラ
グメントが挿入された。SstI消化は、全容量20μｌの推
薦バッファー中で、10単位のSstIを用い、37℃で行なっ
た。反復列の中には、たくさんのSstI部位があるが、そ
の最後のものは、ヌクレオチド4005で切断を引き起こ
す。従って、SstIでの切断後、プラスミドpB3（9.8 k
b）を100μｌ容量で再結合した。これによて、前述した
結合バッファーを用い、15℃で一晩置いたときの分子内
結合は促進され、プラスミドpB3ME（5.8 kb）を生じ
た。これは、BamHIフラグメントDNAの4.0 kbを欠けてい
た。SstI切断DNAの内、短い方のDNAを失ったものではな
くて、5.8 kbクローンを選択するために、選択コロニー
を生育し、次に、ゲル電気泳動にかけた。反復部がすべ
て取り除かれたことをチェックするために、プラスミド
をBglIIで消化し、フラグメントをゲル電気泳動で分析
した。
VV 7.5KプロモーターとlacZ遺伝子を含むプラスミドの
調製 VV 7.5Kプロモーターは、プラスミドpGS20のものが
利用可能である。このプラスミドは、Geoff Smith博士
（ケンブリッジ大学、病理学科、ウィルス部、Addenbro
oke′s Site,Hills Road,Cambridge,英国）から入手し
たもので、M.Mackett,G.L.SmithとB.Moss（J.Virology
49,857−864,1984）によって記載され、下記のDNA配列
に見られるように、大腸菌のlacZと結合させることがで
きる。その結果生じたプラスミドをpPGlと名付ける。VV
7.5KプロモーターとlacZ配列を結びつけるために用い
られる他の方法については、VVに関する論文中に記載さ
れている。
VV 7.5Kプロモーター/lacZ遺伝子構築体を、FPV NER
中に挿入し、組み変えプラスミドを形成すること 全容量20μｌのバッファー中で、p7.5＋lacZフラグメ
ント（約3.6 kb）を、10単位のBamHIを用いて、アンピ
シリン耐性プラスミドpPGlから切り出した。次に、この
DNA末端を、DNAポリメラーゼのクレノウ・フラグメント
を用いて修復し、平滑端DNA分子を生じた。したがっ
て、このフラグメントを、等量の、TE飽和フェノールを
用いて、フェノール抽出し、次に、エタノール沈殿し
た。これを、20μｌの結合バッファー中で再懸濁した。
このバッファーは、１単位のT4ポリメラーゼの中に５単
位のクレノウフラグメントを含み、それぞれ0.025mMのd
ATP,dCTP,dTTP,dGTPを含むものである。これを、室温で
１時間放置した。同様に、pB3ME（Spel,NcoI,BqlII）も
BamIIによって消化し、修復し、平滑端部位を形成させ
た。次に、P7.5＋lacZフラグメントは、次のようにし
て、pB3ME内に平滑端結合させた。すなわち、（それぞ
れ20ng）のプラスミドとフラグメントを、全容量10μｌ
の前述の結合バッファー中で結合させた。このバッファ
ーは、１単位のT4DNAリガーゼと1mM ATPとを含む。これ
を４℃で一晩インキュベートし、大腸菌に移送（形質転
換）した。Ｘ−galカナマイシン・プレードの青色コロ
ニーが選択され（pBGS 19は、カナマイシン耐性ベクタ
ーである）、数コロニーのDNAを、HolmesとQuigley（先
に引用）の方法によって調べた。各結合は二つの異なる
結果をもたらした。すなわち、p7.5＋lacZは、二つの異
なる方向のどちらかで、pB3MEに結合させることができ
た。各部位の構築体のペアを、pEFL2/4,pEFL5/6,pEFL7/
8と呼んだ。pEFL,2,6,8においては、p7.5＋lacZ挿入部
は、挿入された遺伝子と同じ方向に位置した。すなわ
ち、pEFL2（BglII,26.0）とpEFL8（Spel,11.5）におい
ては、左から右、pEFL6（Ncol,13.9）においては、右か
ら左である。
組み換え 前述した方向性を持つp7.5Kプロモーター/lacZ構築体
を含むプラスミドpEFL2,6,8を、組み換え実験に用い
た。この組み換えには、下記の一般的段階があった。
1. CEF細胞をFPVで感染させ、あらかじめ調製した燐酸
カルシウム沈澱物形態の組換えプラスミドDNAを加え
る。数日間生育するにまかせる。（組み換えが起こ
る。） 2. 細胞を回収し、凍結・解凍を３回繰り返す（ウィル
スが細胞から放出される）。
3. この標本を、さまざまの希釈度でCEFに加え、10cm
皿あたり約500−1000プラークを持つプレートを生産す
る（この内の約0.1％が組み換えプラークである）。
4. Xgalを重層し、青色のプラークを見えるようにす
る。
5. 分離プラークを釣り上げる。凍結・解凍を３回繰り
返し、ウィルスをプラーク細胞から放出させる。
6. 再びCFFで定量し、さらに多くのプラークを得る。
7. ４に戻り、ステージ４−６を繰り返す。これを、組
み換えの純粋プラークが得られるまで行なう。
さらに詳しく述べると、ニワトリ胚繊維芽細胞は、80
％の集密的であるとすると、プラーク精製したHP440 fo
wlpoxウィルスの細胞１個あたり、３個のプラーク形成
性単位（感染性ウィルス粒子）によって感染されること
になる。このウィルスは、市販の血清を含まない培養液
（“199"）1mlの中に含まれており、これを、37℃で２
時間放置し、細胞に付着するのにまかせた。その後、ウ
ィルス接種体を除去し、５％新生子牛血清（SC）を含む
新鮮血清10mlを加えた。1.5時間後、ウィルスに組み換
えさせられる、プラスミドDNA構築体の沈澱が調製され
た。1mlのHepes緩衝衛生食液（pH7.12）に、pEFL 2,6ま
たは８のプラスミドDNAを、約１μg/1μｌの割合でTEに
溶かした溶液10−20μｇを加えた。2.5M塩化カルシウム
50μｌをゆっくりと加え、室温（25℃）で30分間放置
し、微細なDNA/燐酸カルシウム沈澱が、形成されるのに
まかせた。次に、ウィルス感染を受けた細胞からの培養
液を除去し、沈澱の1mlを細胞に加え、室温で30分放置
した。次に、５％CSを含む新鮮な培養液10mlを細胞に加
え、さらに４時間、37℃でインキュベートした。次に、
細胞の状態を調べ、もし、DNA燐酸カルシウム沈澱があ
まりに濃すぎると思われるときは、培養液を交換した。
それでなければ、翌日に、交換した。細胞を、さらに５
日間37℃でインキュベートし、次に、細胞を培養液に掻
き落として、ウィルスを回収した。細胞内ウィルスは、
凍結・解凍を３周期重ねて放出させ、そのウィルスは、
通常のプラーク定量法によって定量した。
培養液を細胞から除去し、300μg/mlのXgal（５−bro
mo−４−chloro−３−indolyl−beta D−galactoside）
を含む、ゲル化温度の低い１％アガロース（LGT）から
成る細胞培養液の重層を加えた。37℃で一晩インキュベ
ーションした後、1acZ遺伝子を表わすプラーク、すなわ
ち、青色プラークを観察した。
青色プラークを、500μｌの10mM Tris pH9の中に釣り
上げ、細胞内ウィルスを、凍結・解凍３周期によって放
出し、ウィルスを通例のプラーク定量法によって定量し
た。プラークの釣り上げ、再定量という工程を繰り返
し、最後に、プラーク精製組み換え体を得た。
次に、プラーク精製組み換え体を、第１の釣り上げ
後、次の数の継代だけ、組織培養中で代を重ねた。
プラスミドpEFL8由来の組み換え体（Spel挿入）−少
なくとも３継代安定。
プラスミドpEFL6由来の組み換え体（Ncol挿入）−わ
ずか２継代だけ安定。
プラスミドpEFL2由来の組み換え体（BglII挿入）−少
なくとも６継代安定。
Ncol準拠組み換え体の場合、上記と異なる条件下で
は、もっと長い期間安定であることも可能である。
FPV組み換え体のDNA分析 親FPVのDNAをBamHIで消化すると、数個の制限フラグ
メントが生成される。これらは、アガロース・ゲル上で
分離できる。末端フラグメントは、6.3kb大であり、他
のバンドと比べると、２倍の強度を持っている。なぜな
ら、これには二つのコピーがあるからでらる（ゲノムの
各端から一つずつ）。pEFL2で形成された組み換え体のD
NAを消化すると、バンドのパターンは同じである。ただ
し、二重の6.3 kbフラグメントが、二重の9.9 kbフラグ
メントによって置き換えられているところが異なる。こ
れは、大きさが、6.3 kbから9.9 kbに増したことと一致
しており、この増加は、恐らく、3.6 kb p7.5＋lacZフ
ラグメントが末端フラグメントに挿入されたからであろ
う。ニトロセルロースに移した後、制限消化を調べてみ
ると、9.9 kbバンドが、実際にlacZ配列を含んでいるこ
とが判明した。
（実施例２） この例は、D8−D9NERに関わる。
D9,D10,または、D8位置にあるfowlpox遺伝子が増殖に
とって非必須であるかどうかをテストするために、さら
に操作を実行した。
1. D8については、プラスミドpMB389を、dam−大腸菌
宿主WK262の中で増殖させ、再び、pMB434として分離し
た。この理由は、通常の大腸菌株では、ここで用いられ
るBclI酵素は、制限できないから、それは、そのTGATCA
識別配列中の制御下のアデニン塩基がメチル化されるか
らである。dam−株は、メチル化に耐性を示すから、こ
の宿主においては、酵素BclIは、D8領域内にある２個の
識別部位を切断することができる。次に、このプラスミ
ドを、BclIで切断し、再結合し、583 bp BclIフラグメ
ントを欠いたクローンが、若干のプラスミド標本を含む
数個のコロニーをスクリーニングすることによって分離
された。このようにして、単一のBclI部位を含み、その
D8領域の大部分を取り除かれたプラスミドpMB441が分離
された。pBPGl由来のBamHIフラグメントは、これは、ワ
クチニアp7.5Kプロモーターのコントロールの下で、β
−ガラクトシダーゼを含むものであるが、pMB441の、こ
の単一なBclI部位に挿入された（BamHIとBclIは、互い
に結合し得る粘着端を生成するので、末端修復は必要で
はなかった）。正確な構造を含むプラスミド・クローン
pMB447を分離し、組み換え定量に用いた（後を参照）。
2. D9については、pMB389をAsuII（D9遺伝子の中にあ
る単一な部位）で切断し、末端修復した。pBPG1をBamHI
で切断し、末端修復し、次に、同様に末端修復したAsuI
I切断pMB389で結合した。XgaI Ampプレート上の青色と
して選択された１コロニーが、ワクチニアp7.5Kプロモ
ーターとD9遺伝子中に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ
を含んでいることが判明した。
3. D10については、EcoRIフラグメントを、pMB389から
（一つのEcoRI部位は、D9遺伝子内にあり、もう一方
は、pMB389のpUC13ベクターのポリリンカー内にあ
る）、EcoRIで切断したpUC13に移送してサブクローンし
た。それによって生じたプラスミドpMB439は、D10遺伝
子内に、単一のBglIIを含む。ワクシニアp7.5Kプロモー
ターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むBamHIフラグ
メントを、pMB439のBglII部位に移送してクローン化し
てpMB443を得た。（この場合も、末端修復は必要ではな
かった。なぜなら、BamHI,BglIIも結合可能な付着（粘
着）末端を持っているからである。）次に、プラスミド
pMB443を、組み換え定量法を用いてテストした。
上記のプラスミド構築を、第10図に、模式的に示す。
プラスミドpBG1は、pGl由来のBamHIフラグメントを切断
し（このフラグメントは、p7.5−β−ガラクトシダーゼ
遺伝子構築を含んでいる）、それをプラスミドpBGS19内
に挿入して得たものである（実施例１参照）。
組み換え 組み換え実験の最初の青色プラークから得たウィルス
は、３回プラーク精製を施すと、外見上安定になった
（すなわち、３度目の継代で、白いプラークは全然観察
されなかった）。ウィルスDNAは、プラーク精製ウィル
スから作成し、これをEcoRIで消化した。もとの（組み
換え体ではない）（「野生種」）FRVからのDNAも、EcoR
Iで消化し、コントロールとして用いた。これらのDNAを
二重アガロース・ゲル上に走らせ、Southernプロット
し、その中で挿入が行なわれたと考えられ、かつ、組み
換え体と推定されるFPV EcoRIフラグメントか、また
は、β−ガラクトシダーゼを含むpPGlのいずれかを、プ
ローブとした。EcoRI消化物をゲル上に走らせ、組み換
え体と推定されるFPVと野生種とを比較すると、野生種D
NAに存在する正常EcoRIフラグメントは、D8,D9両方の推
定組み換え体において大きさを増した。新しいD8フラグ
メントは、新しいD9フラグメントよりも小さかったが、
これは、予想通り、小さいBclIフラグメント（377−96
0）が取り除かれたためであった。β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を含むpBG1プラスミドDNAでプローブすると、
野生種FPV DNAは輝かないが、D8,D9推定組み換え体は
いずれも、推定組み換えEcoRIフラグメント由来のプロ
ーブを用いた場合と同じ位置で輝いた。このことから、
D8およびD9組み換え体の構造は予想通りであることが確
かめられた。
D10遺伝子にたいしても同様の実験を試みたが、所期
の確証は得られなかった。
（実施例３） ウィルス株 この例では、ニューカッスル病ウィルス（NDV）Ｆ及
びHN遺伝子を含むベクターの構造、および、Ｆ遺伝子を
用いた、鳥の防御の成功例を述べる。TIR NERを用い
た。
A. NDV融合遺伝子（Ｆ）と血球凝集素−ニューラミニ
ダーゼ（NH）遺伝子のサブクローニング NDVのＦおよびHN遺伝子は、Newcastle−upon−Tyne大
学のP.T.Emmerson教授から贈与されたもので、各々、プ
ラスミドpUC19に移送してクローンした（P.Chambers et
al.,Journ al of Ceneral Virology,67,2685−2694,19
86;N,S.Miller et al.,Jounal of General Viro−logy,
67,1917−1927,1986）。ヨーロッパ特許出願227414（Na
tional Research Deve lopment Corporation）をも参照
されたい。ここには、ブタペスト条約下における、プラ
スミドpUC18及びpVC19内のNDV cDNAの、スコットラン
ド、アバディーンの国立産業用細菌保存機関における19
86年７月１日登録の、NCIB 12277（Ｆ遺伝子）、NCIB 1
2278（HN遺伝子）について言及されている。ここで実際
に用いたpUC19クローンについて述べるならば、Ｆ遺伝
子は、それより下流にあるHN遺伝子の一部を含んでい
た。Ｆ遺伝子は、制限酵素BaHI（好都合なことに、これ
は、Ｆ遺伝子５′末端の発端ATGコドンよりも29塩基上
流を切断する）と、HindIII（これは、Ｆ遺伝子３′末
端より約820塩基下流で切断するが、この余分の配列に
は、若干のHN遺伝子が含まれる）を用いて切断し、これ
を、BamHIとHindIIIによって切断された、カナマイシン
耐性プラスミドpBGS18に移送してサブクローンした。こ
れによって生じたプラスミドをpBGFlと呼んだ（第11図
参照）。
HN遺伝子を含むpUC19プラスミドも、HN遺伝子の上流
に、Ｆ遺伝子配列を持っている。HN遺伝子近傍にポック
ス・ウィルスプロモーターを位置づけることを簡単にす
るために、Ｆ遺伝子配列を、エキソヌクレアーゼBal31
を用いて、取り除いた。このプラスミドを、制限酵素Sp
hI（これは、HN遺伝子の５′側において、pUC19の複数
クローン部位を切断する）を用いて分割し、下記のよう
に適当な時間範囲で消化した。用いた方法は、T.Maniat
isらの“Molecular Cloning（A Labo−ratory Manua
l）,Cold Spring Harbor,USA,1982）に記載してあると
おりである。20μｌのDNA（約500μg/ml濃度）を、20μ
ｌのBSA（1mg/ml）と、40μｌの２倍「Bal31バッファ
ー」（24mM CaCl2,24mM MgC12,0.4M NaCl,40mM Tris/HC
l pH8.0,2mM EDTA）とで混合し、30℃に温めた。0.5単
位のBal31を加え、標本を、０、１、２、３、４、５分
インキュベートした。次に、20μｌの水と３μｌの0.5M
Tris/HCl pH7.5,100mM MgCl2を加え、この標本を、10
単位のSstIで60分間消化した（これは、HN遺伝子の下流
を切断する）。標本を、アガロース・ゲルの上に走ら
せ、消化されたDNA量を推定し、０分、１分、２分後に
標本をその後の使用に選んだ。次に、（前述のように）
T4 DNAポリメラーゼとクレノウフラグメントを用い
て、分子を修復し、Smal切断pBGS18に移送してクローン
した。数種の異なる分離株について、HN遺伝子の５′末
端で配列を調べたところ、その内の一つにおいて、HN遺
伝子より上流の塩基が僅か49個しか（GGCTTCACAAという
配列で始まる）ないことが判明した。このプラスミドを
pBHNlと呼んだ（第13図参照）。
B. Ｆ遺伝子を、組み換えベクター内でクローンする Ｆ遺伝子を、p7.5K VVプロモーターの制御下に置くた
めに、Ｆ遺伝子を、BamHIとHindIIIを用いて、pBGFlか
ら切り出し、記述の通りに末端修復し、pGS20のSmal部
位に移送してクローンした（Mackett et al.,Journal o
f Virology,49,857−864）。このプラスミドをpGSFlと
呼んだ（第11図参照）。プラスミドpEFL16は（第12
図）、pUC19由来のPvuIIフラグメントをpB3MEのSpel部
位に挿入することによって（前述の通り）構築した。こ
のフラグメントは、ベータ・ガラクトシターゼのアルフ
ァ・ペプチドのコード化配列を含んでおり、かつ、複数
クローン部位が次のような配置を持っている。すなわ
ち、この部位にフラグメントがクローンされると、ベー
タ・ガラクトシダーゼの翻訳が損なわれるようになって
いる。このため、このフラグメントは、Xgalを含むプレ
ート上で白色のコロニーとなるので、検出することがで
きる。（この構築体pEFL16は、既に、実施例１で記載
し、第７図に示した「組み換えプラスミド」に相当する
ものになっている。）Ｆ遺伝子プラスp7.5プロモーター
を、XbaIとNheIを用いて、pGSFlから切り出し、前述の
ように末端修復し、pEF16のSmalの単一な部位に移送し
てクローンした。これによって生じたプラスミド（既
に、p7.5プロモーターを上流に持ち、Ｆ遺伝子を、fowl
poxの末端フラグメントのSpel非必須領域に挿入してい
る）を、pEFF2と呼ぶ（第12図）。
C. HN遺伝子を組み換えベクターに移送してクローンす
る HN遺伝子をp7.5プロモーターの制御下に置くために、
HN遺伝子を、SstIとBamHIを用いて、pBHNlから切り出
し、pGS20のSmal部位に移送してクローンした。このプ
ラスミドを、pGSHN1と呼んだ（第13図）。HN遺伝子プラ
スp7.5プロモーターを、SallとAsp718を用い、pGSHNlか
ら切り出し、前述のように修復し、あらかじめSpeIで切
断し、修復しておいたpB3MEに移送してクローンした。
このプラスミドをpEFH3と呼んだ（第14図参照）。
D. Ｆ遺伝子を含むFPV組み換え体の生産 用いたfowlpoxウィルスのPoxine株は、Du−phar氏の
好意により寄贈されたものである。これを、組織培養に
おいて、ニワトリ胚繊維芽細胞CEF中で３代継代させ
た。この段階で、単一プラークを釣り上げ、３回プラー
ク精製した。このようにして得られたウィルスを、Ｐ×
4.1と呼んだ。これを、実施例１でHP444株について記載
したのと同じやり方で組織培養中で増殖させた。
プラスミドpEFF2を、実施例１で記載したように、FPV
のＰ×4.1株と組み換えを起こさせた。組み換えによっ
て得たウィルスをCEF中で定量し、次に、一皿あたり約1
00プラークを生産するウィルス濃度で、10cmペトリ皿で
プラーク形成させた。このウィルスに、１％低ゲル温度
アガロースに溶いた細胞培養液を重層した。４−５日
後、アガロース重層を除去し、無菌のペトリ皿中に、４
℃で保存した。乾燥した、ニトロセルロース・フィルタ
ーを、細胞シートの上にかぶせ、20 X SSCを浸み込ませ
た、円形のWhatman 3MMクロマトグラフィー紙を上から
押しつけた。次に、フィルターを、細胞シートとそれに
付着するプラークを付けたまま、皿から取り上げ、3MM
紙は取り除き、フィルターは、80℃の真空中で、２時間
乾燥させた。次に、組み換えウィルスを特定するため
に、Ｆ遺伝子か、HN遺伝子か、いずれかに特異的な、放
射標識プローブを用いてプローブした。このフィルター
をＸ線フィルムに暴露し、組み換えプラークの位置を、
このオートラディオグラムと、保存しておいたアガロー
ス重層と重ね合わせることによって、特定した。次に、
組み換えウィルスは、アガロース重層から、パスツール
・ピペットを用いて、一塊のアガロースを取り去ること
によって分離した。この塊を、10mM Tria pH 9.0の中で
再懸濁し、凍結・解凍を３回繰り返し、再びプラーク形
成させた。組み換えウィルスは、再び、プローブによっ
て特定し、この過程を、全部で３回繰り返し、最後に、
プラーク精製したウィルスを得た。
E. HN遺伝子を含むFPV組み換え体の生産 プラスミド pEFH3は、前述の通り、プラーク精製した
HP440ウィルス（実施例１に述べたHP 438をさらに２代
継代したもの）と組み換えするにまかせた。このウィル
スをFP9と呼ぶ。HN遺伝子を含む組み換えウィルスは、
Ｆ遺伝子について述べたやり方で、分離された。
F. 組織培養におけるＦ遺伝子の発現 組み換えウィルスと、コントロールとして、相当する
親株を用いて、CEFの5cmペトリ皿を約5pfu/cell（プラ
ーク形成単位／細胞）の割合で感染した。ウィルスは、
さまざまの時間増殖させ、次に、500μｌの沸騰する標
本採取用バッファー（24mM Tris/HCl pH6.8,1％ SDS,20
％グリセロール、0.02％ブロモフェノール・ブルー）を
加えて、細胞を溶かした。HN組み換え体の場合には、こ
のバッファーはさらに0.1M dithio−threitolを含んで
いた。感染細胞は、標本採取用バッファーに掻き落し、
この標本を、２分間煮沸し、氷上で冷やし、−20℃で凍
結した。次に、標本を、標準ポリアクリルアミド蛋白ゲ
ルに負荷し、電気泳動し、蛋白を分離し、Westernブロ
ッティングによって、ニトロセルロース・フィルターに
移した。このWesternブロットを（A.C.R.Samson et a
t.,Journal of General Virology,67,1199−1203の記載
した方法で）、Ｆ蛋白に特異的なモノクロナール抗体で
プローブした、あるいは、HN蛋白には、組み換えによっ
て生産されるＦ蛋白は全く認められなかった。CEFがNDF
によって感染することによってもたらされるＦ蛋白は、
モノクロナール抗体によって検出されたが、HNよりも低
レベルであった。したがって、もしも、Ｆについて、組
み換え蛋白にたいする無傷の蛋白の割合が、HNの場合と
同じであるならば、組み換えＦは実際に認められること
はないであろう。
G. NDV感染にたいする鳥類の防御 14日令のロードアイランド赤色ニワトリに、静注によ
り、１羽あたり106 pfuの、Ｆ遺伝子組み換え体（４
羽）か、または、挿入遺伝子を持たないfowlpox株FP9
（６羽）を接種した。
組み換え体を接種しない10羽のトリを今後「コントロ
ール・トリ」と名付ける。28日目に、接種を繰り返し
た。64日で、NDVの、悪性のHerts 33株105×LED50（ELD
＝胚致死量）を筋注してチャレンジとした。チャレンジ
後３日で、コントロール・トリの内４羽が死に、８羽が
重体であった。チャレンジ後４日では、12羽のコントロ
ール・トリの内10羽が死に、チャレンジ後５日までに
は、すべてのコントロール・トリが死んだ。Ｆ組み換え
体を接種した４羽はすべて正常であった。
Ｆ組み換え体を接種したトリ、および、NDVでチャレ
ンジする前のコントロール・トリから、血清を採取し
た。精製したNDVヴィリオンのWesternブロットをプロー
ブとして、この血清を調べたところ、Ｆ組み換え体を接
種したトリから得た血清だけが、Ｆ蛋白にたいする抗体
を持っていることが判明した。したがって、組み換え体
によって生産されたＦ蛋白をインビトロで検出すること
はできなかったけれども、生体内実験において、防御作
用が達成されていること、NDV Ｆ遺伝子を含むＦ組み
換え体によってＦ蛋白が何らかの形で生産されているこ
とが、きわめて説得的な形で明らかにされた。
実施例６は、この実施例のNDV HN遺伝子構築体を用
いた防御実験について記載する。
（実施例４） この例は、１日令のトリの、NDV Ｆ遺伝子/FPV組み
換え体によるワクチン法を例示する。
６羽または７羽の、ロードアイランド赤色ニワトリか
らなるグループに、１日令で、翼えら法により、実施例
3 8907374に記載したNDV Ｆ遺伝子/poxineFPV組み換え
体か、または、Px4.1親poxineFPV株のいずれかを接種し
た。各ウィルス株は、４グループのトリに接種した。そ
の用量は、１羽あたり、５×104,5×103,5×102,5×101
pfuであった。したがって、全部で８グループであり、
それに、未接種のトリから成るもう一つのグループが加
わった。トリは、１日令で接種し、出願8907374にある
通り、26日後に筋注によりチャレンジした。未接種でコ
ントロルとして用いたトリは、チャレンジにたいして防
御されなかった。すなわち、38羽すべてが４日までに死
んだ。fowlpox/NDV Ｆ組み換え体を接種したトリは、
際だって防御された。すなわち、28羽の内22羽がチャレ
ンジを凌いで生き延びた（79％）。用いたワクチンの用
量は、防御のレベルには、外見上ほとんど影響しないよ
うであった。もっとも、最低用量の場合に、最高の防御
作用を呈した。
（実施例５） この例は、NDV Ｆ遺伝子組み換え体によるトリのワ
クチン接種に関して、実施例３（Ｇ節）で示された結果
を確認するもので、この接種が、静注同様、翼えらを用
いても可能であることを示す。
実施例３の工程にそのまま従った。ただし、ブースタ
ー接種は、誕生から27日（28日ではなく）であり、チャ
レンジは、誕生から42日（64日ではなく）であり、親po
xine株をコントロールとして用い、５グループのトリを
用いた（２群は静注接種、２群は翼えら接種、１群は未
接種）。
第２表の結果から、NDV Ｆ遺伝子/poxineFPV組み換
え体による接種を受けたすべての動物が延命したこと、
一方、他のものはすべて志望したことが明らかになっ
た。
（実施例６） この例は、NDV HN遺伝子/FPV組み換え体も防御作用
を与えることを示す。したがって、防御作用は、Ｆ遺伝
子単独または、HN遺伝子単独でも得ることができる。
実施例５をそのまま繰り返した。ただし、実施例３
（Ｅ節）に記載してある通りのNDV HN/HP440 FPV組み換
え体を用い、HP440株をコントロールとして用いた。
第３表はその結果を示す。ここでも、NDV HN遺伝子で
ワクチン接種を受けたトリは防御され、一方、他のトリ
はすべて死んだ。
（実施例７） この例では、組み換えベクターを、Ecogptを用いて作
成したが、その構築物は、既に引用したPCT出願W088/02
022の中にCSIROによって記載されているものと一般的に
は類似しているが、TK遺伝子配列ではなく、本発明にか
かる非必須領域配列が隣接しているところが異なる。組
み換えベクターは、順に、次のものを含む。
（１）非必須領域（ほぼBgIII部位近傍） （２）Ecogpt遺伝子 （３）VV P.5プロモーター （４）VV Pllプロモーター （５）IBVスパイク蛋白遺伝子 （６）非必須領域 この二つのプロモーターが、W0 88/02022に示したよ
うに、「背中合わせ」になっており、したがって、互い
に逆方向に転写していくことに注意せよ。
クローンpEFL2（これは、FPV末端フラグメントに、ワ
クチニアP7.5プロモーターとベータ・ガラクトシダーゼ
を含む。前述）を、制限酵素SphIとNcolで切断し、既に
述べたやり方で修復し、再結合した。これによって生じ
た構築体を、pEFL18と名付けるが、これは、予想通り、
FPV配列のほぼ850 bpを失っていたが、また、sphI部位
に直接に接するHindIII部位を欠いていた。したがっ
て、このプラスミドは、P7.5プロモーターとベータ・ガ
ラクトシダーゼ遺伝子との間に、互いにごく近接した、
たった２個のHindIII部位しか持たない。（したがっ
て、HindIIIによる消化は、ごく僅かなフラグメントを
除去するだけなので、自身のATGコドンを含む遺伝子フ
ラグメントを挿入して、ベータ・ガラクトシダーゼ融合
構築体を形成するのに用いることができる。）このプラ
スミドをHindIIIとEsplで切断し（Esplは、ベータ・ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の３′末端近くで切る）、修復し
た。この修復した部位に、大腸菌ecogpt遺伝子を含むプ
ラスミドpSV2gpt（Mulligan＆Berg,Science,209,422−1
427,1980）由来の、BgIII/ApaIフラグメント（修復済
み）を挿入した。こうして、ベータ・ガラクトシダーゼ
遺伝子が取り除かれ、Ecogpt遺伝子が、P7.5プロモータ
ーの制御下に置かれたわけである。このプロモーターの
上流の、単一なSalI部位には、他のプロモーターやプロ
モーター／遺伝子構築体を挿入することができる。この
プラスミドをpEFGP13と呼んだ。
P11後期ワクチニア・プロモーターを、pUC19へ移送す
ることによって複数のクローン用部位（BamHI,XhoI,Xba
I,SalI）を備えたpMM6（Michael Mackettの寄贈によ
る）から切り出し、得られたP11クローン用部位構築体
を、pEFGPT3のSalI部位に挿入した。これによって生じ
たプラスミドをpEFGPT6と名づけた。このプラスミドに
は、P11プロモーターの制御の下で、さまざまの場所に
遺伝子を挿入することができる。感染性気管支炎ウィル
スのスパイク蛋白遺伝子（NRDCのPCT出願公開No.W086/0
5806を参照）を、プロモーターの下流に挿入した。
プラスミドpEFGPT3は、前述の通りに、FPV株FP9内で
組み換えを行なわせた。組み換えウィルスを、マイコフ
ェノール酸を含むMXHAT培養液（Boyle＆Coupar,Gene,6
5,123−129,1988）を用いて選択した。MXHAT培養液の存
在下で最初の組み換えを起こさせた後、ウィルスを、凍
結・解凍処理で放出させ、選択条件下に２継代通した。
細胞変性効果が認められ、このことから、ウィルスが、
選択条件下で増殖していることが示された。次に、ウィ
ルスでプラーク形成させ、Ecogpt特異的プローブでプロ
ーブした。高い割合の（約75％）プラークが陽性であ
り、このことから、選択が有効であり（通常、ウィルス
のわずか0.1％しか組み換え体にならない）、したがっ
て、Ecogpt遺伝子を発現する組み換え体が分離されたこ
とが明らかになった。
同様の組み換え実験を実施し、Ecogpt遺伝子を、FPV
のPoxine株の中に取り込ませた。組み換えさせ、選択条
件下で継代させて後、ウィルスの細胞変性効果を認める
ことができ、このことから、Ecogpt遺伝子を発現する組
み換えウィルスが生産されたことが明らかになった。こ
れは、BgIIIの非必須領域（SpaI領域同様）が、Poxine
に存在することを確証するものである。
（図面の簡単な説明） 第１図は、この発明の相同的組み換え過程を模式的に
描いたものである。
第２図は、FPV DNAのBamHI未満フラグメントのマッ
プであって、その内部の、TIRの長い非反復配列の開始
部の位置を示す。
第３図は、FPV TIRのDNAマップであって、本発明に
有用な３個の非必須領域および他のORFを示す。また、
同時に、VV TIRのマップを載せるが、ここにはVVに認
められる様々のORFが示される。
第４から７図は、本発明における、組み換えプラスミ
ド構築の、様々の一般的方法を模式的に描いたものであ
る。
第８図は、FPVの非必須領域を含み、かつ、その中に
外来遺伝子を挿入させた、本発明の特定組み換えプラス
ミドの構築を模式的に描いたものである。
第９図は、遺伝子D6からD13までと、近傍の遺伝子A2
のマップであって、プラスミドpMB379と389にクローン
された遺伝子、および、これらプラスミドにおける重要
な制限部位を示す。
第10図は、D8,D9,D10（本発明では、D8,D9であって、
D10は比較対照）遺伝子内部は、外来遺伝子が挿入され
る配列を有する、この発明の特定の組み換えプラスミド
の構築を模式的に描いたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/00 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８９１０５２０．９ (32)優先日 1989年５月８日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ブルスネル，マイケル・エドワード・グ リフイス イギリス国、イングランド、ケンブリツ ジシヤー・ピー・イー・17・６・イー・ エフ、ハンテイングドン、セント・アイ ブス、ローリー・クローズ・２ (72)発明者 キヤンベル，ジヨン・イヤーボ・アミー メノジエナ イギリス国、イングランド、ケンブリツ ジシヤー・ピー・イー・17・４・テイ ー・テイー、ハンテイングドン、セン ト・アイブス、シエイクスピア・ロー ド・35 (72)発明者 トムリー，フイオナ・マーガレツト イギリス国、イングランド、ケンブリツ ジ・シー・ビー・２・１・エル・アー ル、バテイマン・ストリート・56

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】相同的DNA組み換えによる組み換えfowlpox
    ウィルス（FPV）を生産するのに用いられる組み換えベ
    クターであって、該組み換えベクターが非必須領域（NE
    R）DNE配列を含有するクローニングベクターから成り、
    該NERが少なくとも１つの外来遺伝子か又は、その外来
    遺伝子若しくはその各外来遺伝子の発現を制御するため
    の少なくとも１つの配列によって中断されており、該NE
    R配列が、 （ａ） FPVの末端反転（逆方向）反復列（TIR）の長い
    非反復配列（LUS）内にあるか、又は （ｂ） D7遺伝子のカルボキシ端とD9遺伝子のカルボキ
    シ端との間に存在するFPVゲノム領域内にある（但し、D
    10遺伝子とD10遺伝子プロモーター領域は除く）ことを
    特徴とする組み換えベクター。
  2. 【請求項２】前記NERが、すべてTIRのLUS内にあること
    を特徴とする請求の範囲１に記載の組み換えベクター。
  3. 【請求項３】前記NERが、すべてLUSの外部末端から2.2
    キロ塩基対以内にあることを特徴とする、請求の範囲２
    に記載の組み換えベクター。
  4. 【請求項４】前記NERが、オープンリーディングフレー
    ム（ORF）内にあり、そのORFが、実質的に下記の配列中
    の4125〜4790、5261〜5629又は5883〜6185のいずれかで
    あって、かつ、ここに特定された核酸配列をもつもの
    か、又は、別のFPV株に見られる変異体であることを特
    徴とする、請求の範囲３に記載の組み換えベクター：
  5. 【請求項５】前記NERがD8やD9遺伝子の内部にあること
    を特微とする、請求の範囲１に記載の組み換えベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】請求の範囲１に記載の組み換えベクターを
    調製するのに有用な組み換えベクターであって、この組
    み換えベクターは請求の範囲１〜５のいずれかに定義さ
    れたNER配列を含むことを特微とする組み換えベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】請求の範囲１〜５のいずれかにおいて定義
    されたNER配列から成るDNA分子。
  8. 【請求項８】組み換えfowlpoxウィルス（FPV）であっ
    て、親FPVと、請求の範囲１〜５のいずれかにおいて定
    義された組み換えベクターの挿入用DNAとの相同的組み
    換えの産物である前記ウィルス。
  9. 【請求項９】請求の範囲８に記載の組み換えFPVに感染
    させた動物細胞のインビトロ培養体。
  10. 【請求項１０】動物（人を除く）のワクチン接種法であ
    って、請求の範囲８に記載の組み換えFPV、又は、請求
    の範囲９に記載の培養体をその動物に接種することから
    成るワクチン接種法。
  11. 【請求項１１】動物がニワトリであることを特徴とす
    る、請求の範囲10に記載の方法。
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