JP3617668B2 - 麻疹ウイルス組換え体ポックスウイルスワクチン - Google Patents
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Description
本発明は1990年11月20日に出願した先願同時系属出願第07/621,614号の一部継続出願である。
産業上の利用分野
本発明は修飾ポックスウイルスおよびそれの製造方法並びに使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ウイルスが麻疹ウイルス属遺伝子の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、および麻疹ウイルス属感染に対して防御免疫を提供するワクチンに関するものである。
本出願中において括弧内のアラビア数字によりいくつかの出版物が引用されている。これらの参照文献に関する全ての引用を請求の範囲の直前で明細書の終りに記載する。これらの参照文献は、本発明が属する従来技術を記載している。
発明の背景
ワクチニアウイルスおよびより最近の他のポックスウイルスは異種遺伝子の挿入と発現に用いられてきた。異種遺伝子を生感染性ポックスウイルス中に挿入する基本技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するポックスDNA配列とレスキューイング(rescuing)ポックスウイルス中に存在する同種配列との間の組換えを含む(ピッチーニら、1987)。
特に、組換えポックスウイルスは、従来技術において知られている2つの工程により構成され、米国特許第4,603,112号に記載されているワクチニアウイルスの合成組換え体を産生する方法と類似しており、その特許の開示をここに参照文献として含む。
第1に、ウイルス中に挿入されるDNA遺伝子配列、特に非ポックス源からの読み取り枠は、ポックスウイルスのDNAの部分と相同なDNAが挿入されるE.coliプラスミド構成物中に配される。それとは別に、挿入されるDNA遺伝子配列はプロモーターに連結される。プロモーター遺伝子結合は、そのプロモーター遺伝子結合が可欠座を含有するポックスDNAの領域を側腹に有するDNA配列と相同なDNAにより両端の側腹にあるようにプラスミド構成物中に位置する。産生したプラスミド構成物は次いでE.coliバクテリア内の成長により増幅され(クレウェル、1972)、単離される(クレウェルら、1969;マニアチスら、1982)。
第2に、挿入されるDNA遺伝子配列を含有する単離プラスミドは、ポックスウイルスとともに細胞培養、例えばひな胚胎繊維芽細胞中にトランスフェクションされる。プラスミド中の相同ポックスDNAとウイルスゲノムとの間の組換え体はそれぞれ、そのゲノム中の可欠領域中に異種DNA配列の存在により修飾されるポックスウイルスを与える。「異種」DNAという用語は、外因性DNAが配されるゲノムにより通常産生されない遺伝子産生物をコードする外因性DNA、特に非ポックス源からのDNAを称する。
遺伝子組換えは、一般的にDNAの2本鎖間のDNAの相同部分の交換である。あるウイルスにおいて、RNAはDNAを置換する。核酸の相同部分は、同一のヌクレオチド塩基の配列を有する核酸(DNAまたはRNA)の部分である。
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製または産生中に自然に生じる。それゆえ、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、2つ以上の異なるウイルスまたは他の遺伝子構成物に共感染した宿主細胞中で生じるウイルス複製サイクル中に生じる。第1のゲノムからのDNAの部分は、DNAが第1のウイルスゲノムのDNAと相同である第2の共感染ウイルスのゲノムの部分を構成するのに交換可能に用いられる。
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のDNAの部分間にも生じ得る。そのような1つの部分が、例えば相同なDNAの部分中に挿入される抗原決定基をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第1の部分内の存在を除いた別のゲノムと相同の第1のゲノムからのものである場合、組換えはまだ生じ、その組換えの産生物は次いで、組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在により検知可能である。
修飾感染ウイルスによる挿入DNA遺伝子配列の発現を成功させるには2つの条件が必要である。第1に、修飾ウイルスが生存し続けるように、ウイルスの可欠領域中に挿入がなされなければならない。挿入DNAの発現の第2の条件は、挿入DNAへの適切な関係にあるプロモーターの存在である。発現されるDNA配列から上流に位置するようにプロモーターを配しなければならない。
イヌジステンパーウイルス(CDV)および麻疹ウイルス(MV)は、科パラミクソウイルス属の麻疹ウイルス属亜型の一員である(ジアロ、1990;キングスバリーら、1978)。ウイルスは負の極性の非分節1本鎖RNAゲノムを含有する。イヌジステンパーは非常に感染しやすい犬または他の肉食性動物の熱性病である。死亡率は高い;30から80パーセントの間の範囲に亘る。犬が生存してもしばしば永久の中枢神経系が損傷することがある(フェナーら、1987)。同様に、麻疹ウイルスも全身大丘疹性発疹により特徴付けられるひどく感染しやすい熱性病を生じる。その病気は主に子供を冒す。
麻疹ウイルス属の特徴が近年ノービーとオクスマン(1990)並びにジアロ(1990)により報告された。他のパラミクソウイルス属に報告されているように(アベリーおよびニベン、1979;マーツら、1980)、2つの構造タンパク質が防御免疫応答の誘発に重要である。これらのタンパク質は、血球凝集と宿主細胞へのウイルスの吸着の原因である膜糖タンパク質血球凝集素(HA)、およびウイルスと感染細胞との間または感染細胞と隣接した未感染細胞との間の膜融合を生じる融合糖タンパク質(F)である(グレーブスら、1978)。MVゲノム中の遺伝子の順序はリチャードソンら(1985)およびドーリングら(1986)により推測された。MVHA遺伝子およびMVF遺伝子のヌクレオチド配列がアルクハチブとブリーディス(1986)およびリチャードソンら(1986)によりそれぞれ求められた。
CDVとMVは構造的に類似しており、類似した血清関係を共有している。イムノプレシピテーションの研究により、MVに対する抗血清が全てのCDVタンパク質(P、NP、F、HAおよびM)を沈殿させることが示された。対称的に、CDVに対する抗血清は、HA糖タンパク質以外の全てのMVタンパク質を沈殿せしめる(ホールら、1980;オーベルら、1980;ステフェンソンら、1979)。この類似の血清関係に照らして、MVによるワクチン接種は犬のCDV抗原投与に対する防御を引き出すことが以前から示されている(ギレスピーら、1960;モーラら、1961;ワレンら、1960)。CDVに対する中和抗体がヒト抗MV血清中に報告されているが(アダムスら、1957;イマガワら、1960;カーゾン、1955;カーゾン、1962)、MVに対する中和抗体は犬からの抗CDV血清中には発見されていない(ディレイら、1965;カーゾン、1962;ロバーツ、1965)。
MV HAおよびF遺伝子が、ワクチニアウイルス(ドリリアンら、1988;ウィルドら、1991)、鶏痘ウイルス(スフェナーら、1990;ウィルドら、1990)、アデノウイルス(アルハチブら、1990)およびバキュロウイルス(ブィアラードら、1990)を含むいくつかのウイルスベクター中に発現されている。これらの研究において、血球凝集(ブィアラードら、1990)溶血反応(アルハチブら、1990;ブィアラードら、1990)または細胞融合(アルハチブら、1990;ブィアラードら、1990;ウィルドら、1991)検定において機能した真正のMVタンパク質が発現された。ワクチニアウイルスベクター中に挿入されるときに、HAまたはFタンパク質のいずれかの発現は、MV脳炎に対するネズミ中の防御免疫応答を引き出すことができた(トリリエンら、1988)。同様に、鶏痘ウイルスベクター中のFタンパク質の発現は、ネズミ中のMV脳炎に対する防御免疫を引き出した(ウィルドら、1990)。どの防御研究も他のベクターについては報告されなかった。
欧州特許第0 314 569号は鶏痘中のMV遺伝子の発現に関するものである。
パーカスらは近年(1990)、ワクチニアウイルス中の2つの独特な宿主域遺伝子の定義を記載した。これらの遺伝子は、生体外の様々な細胞基体上のワクチニアウイルスの複製を認める宿主域機能をコードする。その遺伝子は、ヒト細胞並びに家ウサギとブタの源の細胞上のワクチニアウイルス複製の宿主域機能をコードする。これら遺伝子の定義は、一方ではまだ興味のある異種遺伝子を発現し、定義された細胞中で複製する能力において厳しく制限されたワクチニアウイルスベクターの発達を提供する。これによりワクチニアウイルス組換え体の安全特性を大幅に高める。
弱毒化されたベクターは、ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株からの6つの可欠領域の系列欠損により発達せしめられている。これらの領域はウイルスの毒性における役割を有するタンパク質をコードすることが知られている。欠損した領域は、tk遺伝子、出血性遺伝子、A型含有遺伝子、血球凝集遺伝子、およびリボヌクレオチド還元酵素の大サブユニット並びに以前に定義したC7LからK1Lの配列をコードする遺伝子である(パーカスら、1990)。ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株中のこれらの遺伝子の配列および遺伝子配置が以前に定義されている(ゲーベルら、1990a、b)。産生した弱毒化ワクチニア菌株はNYVACと称する。
ワクチニアウイルス組換え体を産生する技術が、より制限された宿主域を有するポックスウイルス科の他のメンバーに最近広がっている。アビポックスウイルス、鶏痘は、狂犬病G遺伝子を発現する組換えウイルスとして設計されている(テイラーら、1988b)。この組換えウイルスはまたPCT公報WO89/03429号に記載されている。組換え体の多数の非鶏種への接種により、ネズミ、ネコおよびイヌにおいて致死量の狂犬病抗原投与に対して防御を示す狂犬病に対する免疫反応が引き出される。
イヌジステンパーと麻疹の両者は弱毒化ワクチンの使用により現在制御されている(フェンナーら、1987;プレブラッドら、1988)。生後8週間と生後12から16週間で生弱毒化ワクチンを使用する免疫化が、CDVの制御に推奨されている。CDVに対する免疫は一生のものであるが、病気の重大さと作用因子の高い感染特性のために、例年のワクチン再接種が通常推奨される。
継続的なワクチン再接種の現在の方針に関する1つの問題点は、CDV免疫母体が初乳中の子孫に対する中和抗体を通過することである。子犬にワクチン接種を行なう、これらの抗体の水準が衰えるときを確かめることは困難である。これは子犬がCDV感染に対して感染しやすい場合に糸口を残す。麻疹ウイルス糖タンパク質のみを発現する組換えワクチンの使用により、母の抗体の抑制効果を克服し、新生児のワクチン接種を行なう方法が提供される。実際、CDV免疫母体を哺乳した子犬中のCDV特異抗体は、MVワクチンで接種したときにMV特異抗体の発達を妨げなかったことが示されている(ベイカーら、1966)。
通常使用されている修飾生CDVワクチンの他の制限が以前に記載されており(チザード、1990)、ワクチン接種された動物内で複製するこれらのワクチン菌株の能力と関連付けられる。CDVワクチン菌株を、イヌアデノウイルス1および2とともに、免疫抑制、血小板減少、および脳炎となるイヌに接種した場合に、これらの欠損効果が最も著しい(ベステッティら、1987;ハートリー、1974;フィリップスら、1989)。修飾生CDVワクチンはまた、キツネ、キンカジョス(Kinkajous)、フェレットおよびパンダを含む他の動物種にジステンパーを誘発せしめることが示されている(ブッシュら、1976;カーペンターら、1976;カザコスら、1981)。それゆえ、組換えCDVワクチン候補物の使用により、修飾生CDVの環境への継続的な導入と、従来のCDVワクチンの使用により生じる潜在的なワクチン関連とワクチン誘発の併発が除去される。
ポックスウイルスの使用はまた、現在使用されているイヌの弱毒化CDV菌株によるワクチン接種の際に母体抗体が有する文献に記載した抑制効果を克服する手段を提供する。若年にポックスウイルス組換え体で免疫化した母体に生まれた子犬は、CDV特異母体抗体の干渉を避ける。加えて、これらの反応および2つのポックスウイルスの間の血清の緊密な反応性の欠如を引き出すMV HA遺伝子とF遺伝子を含有するワクチニアウイルスとカナリヤポックスウイルスベクターの両者の能力は、1つのベクターが子犬の生涯の初期に用いられ、もう一方が後期に用いられてCDV特異免疫を高めるというさらなる利点を提供する。これは、弱毒化DCV菌株の環境への放出と、ワクチン誘発およびワクチン関連の併発の発生に関連付けられるできごととを除去する(チザード、1990)。
それゆえ、麻疹ウイルス属組換えポックスウイルス、および麻疹ウイルス属感染に対する防御免疫を提供するワクチンを提供することは、技術の現在の状況よりも非常に望ましい利点であることが理解されよう。
発明の目的
それゆえ、本発明の目的は、麻疹ウイルス属の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルスを提供すること、およびそのような組換えポックスウイルスを産生する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、ポックスベクター、特にワクチニアウイルスベクターまたはカナリヤポックスウイルスベクター中の麻疹ウイルス属暗号配列、特に麻疹ウイルス暗号配列のクローニングおよび発現を提供することにある。
本発明の別の目的は、麻疹ウイルス属中和抗体、血球凝集抑制抗体および麻疹ウイルス属感染と致死量の麻疹ウイルス属抗原投与に対する防御免疫を引き出すことのできるワクチンを提供することにあり、特に麻疹ウイルス組換えポックスウイルスワクチンを用いてイヌジステンパーに対するイヌの緊密な防御を提供することにある。
本発明のこれらと他の目的および利点は、以下の検討の後に容易に明確となる。
発明の概要
一面において、本発明はポックスウイルスゲノムの可欠領域の麻疹ウイルス属からのDNA配列を含有する組換えポックスウイルスに関するものである。ポックスウイルスは好ましくは、カナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクチニアウイルスである。麻疹ウイルス属は好ましくは麻疹ウイルスである。
本発明によると、組換えポックスウイルスは異種の麻疹ウイルス属遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、異種DNAは、麻疹ウイルス糖タンパク質、好ましくは麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードする。好ましくは、複数の麻疹ウイルス糖タンパク質が組換えポックスウイルスにより宿主中にともに発現される。
別の面において、本発明は、ワクチン接種した宿主動物中の免疫応答を誘発するワクチンに関し、ここでそのワクチンは、可欠領域中に麻疹ウイルス属からのDNA、特に麻疹ウイルスを含有する組換えポックスウイルスおよび担体を含む。好ましくは、DNAは、麻疹ウイルス糖タンパク質、特に麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードして発現する。複数の麻疹ウイルス糖タンパク質は好ましくは宿主中でともに発現される。本発明によるワクチン中に用いられるポックスウイルスは、好ましくはワクチニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスである。
【図面の簡単な説明】
本発明をより深く理解するために添付した図面を参照して説明する。
第1図は、MV血球凝集素遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスvP557を誘導するのに用いたプラスミドpSPM2LHAVCを構成する方法を模式的に示す。
第2図は、MV融合遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスvP455を誘導するのに用いたプラスミドpSPMFVCを構成する方法を模式的に示す。
第3図は、MV血球凝集素遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスvP756を誘導するのに用いたプラスミドpRW843を構成する方法を模式的に示す。
第4図は、MV融合遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスvP800を誘導するのに用いたプラスミドpRW850を構成する方法を模式的に示す。
第5図は、MV融合遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスvCP40を誘導するのに用いたプラスミドpRW800を構成する方法を模式的に示す。
第6図は、MV血球凝集素遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスvCP50およびMV融合遺伝子とMV血球凝集素遺伝子をともに発現するvCP57を誘導するのに用いたプラスミドpRW810を構成する方法を模式的に示す。
第7図は、MV血球凝集素遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスvCP85を誘導するのに用いたプラスミドpRW852を構成する方法を模式的に示す。
第8図は、MV血球凝集素遺伝子とMV融合遺伝子をともに発現するvCP82を誘導するのに用いたプラスミドpRW853Aを構成する方法を模式的に示す。
第9図は、チミジンキナーゼ遺伝子を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP410を産生するプラスミドpSD460を構成する方法を模式的に示す。
第10図は、出血性領域を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP553を産生するプラスミドpSD486を構成する方法を模式的に示す。
第11図は、AT I領域を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP618を産生するプラスミドpMP494Δを構成する方法を模式的に示す。
第12図は、血球凝集素遺伝子を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP723を産生するプラスミドpSD467を構成する方法を模式的に示す。
第13図は、遺伝子クラスター[C7L−K1L]を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP804を産生するプラスミドpMPCSK1Δを構成する方法を模式的に示す。
第14図は、大サブユニットリボヌクレオチド還元酵素を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスvP866(NYVAC)を産生するプラスミドpSD548を構成する方法を模式的に示す。
第15図は、MV血球凝集素遺伝子およびMV融合遺伝子をともに発現する組換えNYVACウイルスvP913を誘導するのに用いたプラスミドpRW857を構成する方法を模式的に示す。
発明の詳細な説明
説明のために示した以下の実施例を参照して、本発明と本発明の多くの利点を詳細に説明する。
実施例1−麻疹血球凝集素遺伝子を含有するワクチニアウイルス組換え体の産生
両者の組換え体の産生に用いたレスキューイング(rescuing)ウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損せしめられたワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスが成長せしめられ、ベロ細胞単層上に滴定した。
初期/後期ワクチニアウイルスH6プロモーター(ロセルら、1986;テイラーら、1988a、b)を、4つの重複オリゴヌクレオチド、H6SYN A−Dをアニールすることにより構成した。生成したH6配列は以下のとおりである。
ワクチニアウイルスH6プロモーター(配列認識番号1/配列認識番号2):
ここで第1図を参照する。アニールしたH6SYNオリゴヌクレオチドを、Xho I/Hind IIIで切断されたpMP2LVC中に連結してプラスミドpSP131を産生した。プラスミドpMP2LVCは、pUC8内のワクチニアウイルス(コペンハーゲン菌株)Hind III K領域の一番左の0.4kbpを含有する。pMP2LVCの構成は以下のようにして行なった:Hind III K領域からの0.4kbpのHind III/Sal I断片を単離して、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。この断片を、Pvu IIで切断したpUC18中に挿入した。産生したプラスミドをpMP2VCと称した。プラスミドpMP2VCをSsp Iで線状にした。合成オリゴヌクレオチドMPSYN52(配列認識番号3)(5′−ATTATTTTTATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT−3′)およびMPSYN53(配列認識番号4)(5′−AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT−3′)をアニールしてワクチニアウイルス配列内に位置する2つのSsp I部位の一番左に挿入した。生成したプラスミドpMP2LVCは、K1LおよびK2L読み取り枠の間の遺伝子間領域中に多重クローニング領域を含む。
アニールしたオリゴヌクレオチド3P1(配列認識番号5)(5′−GGGAAG−ATGGAACCAATCGCAGATAG−3′)およびHA遺伝子の先端の3′配列と粘着末端EcoR Iを含有する3P2(配列認識番号6)(5′−AATTCTATCTG−CGATTGGGGTTCCATCTTCCC−3′)を、HA遺伝子の残留基とXho IおよびEcoR Iで切断したpSP131とを含有するpMH22からの1.8kbpのXho I/Sma I断片に連結した。生成したプラスミドをpSPMHA11と称した。プラスミドpMH22は、ATG開始コードンにXho I部位を生成することにより麻疹HA遺伝子の全長のcDNAクローンから誘導した(アルハチブら、1986)。
麻疹HA遺伝子を含有する、pSPHMA11からの1.9kbpのHind III/EcoR I断片を単離して、2mMのdntpの存在下でE.Coli DNAポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。単離した断片をBgl IIで切断したpMP409DVC(グオら、1989)中に挿入して、ムンビーン(mung bean)ヌクレアーゼの処理により鈍端とした。このベクター中への挿入によりプラスミドpSPMHA41を産生した。H6プロモーターとHA遺伝子の開始コードンとの間のXho I部位を、オリゴヌクレオチドHAXHOD(配列認識番号7)(5′−ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT−3′)を用いたオリゴヌクレオチド定方向2本鎖開裂突然変異(マンデック、1982)により除去した。プラスミドpSPM2LHAVCをこの方法により産生した。レスキューイングウイルスとしてのワクチニアウイルスvP458による生体外組換え実験において、プラスミドpSPM2LHAVCの挿入を用いて組換え体vP557を産生した。vP458はvP410のM2L挿入部位にE.coli乳Z遺伝子を含有する。このワクチニアウイルス組換え体は、乳Z遺伝子を置換する、ゲノムのM2L座中に麻疹HA遺伝子を含有する。
実施例2−麻疹融合遺伝子を含有するワクチニアウイルス組換え体の産生
第2図を参照する。アニールしたオリゴヌクレオチド3PA(配列認識番号8)(5′−CCTAAAGTTTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTATGTAAGGTCGCTCTGATTTTTATCGGCCGA−3′)および麻疹融合遺伝子の3′末端、ワクチニアウイルス初期転写終止信号(ユエンら、1987)およびEag I末端並びにHind III末端を含有する3PB(配列認識番号9)(5′−AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATGTTCCCGTAAGATCAGGCTTTAGG−3′)を、Sal IとHind IIIで切断したpUC8およびpCRF2からの1kbpのSal I/Hae III断片(カナダH3A 1A1、モントリオール、C.リチャードソン、カナダの国立研究議会(生物工学研究所)から得られる)に連結した。生成したプラスミドpMF3PR14は麻疹融合遺伝子の1kbpの断片の3′末端を含有した。
5′Sma I部位と3′Bst XI部位を含有する、アニールしたオリゴヌクレオチド5PA(配列認識番号10)(5′−GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGCCATATTC−3′)および5PB(配列認識番号11)(5′−ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC−3′)を、pCRF2からの820bpのBst XI/Sal I断片およびSma IとSal Iで切断したpUP8に連結した。生成したプラスミドpSPMF5P16は麻疹融合遺伝子の5′部分を含有した。pSPMF5P16からの820bpのSma I/Sal I断片およびpMF3PR14からの1kpbのSal I/Eag I断片を、Sma IとEag Iで切断したpTP15中に連結した。プラスミドpTP15(グオら、1989)は、ワクチニアウイルス(コペンハーゲン菌株)ゲノムのHA座からの配列により側腹に連結したワクチニアウイルス初期/後期H6プロモーターを含有する。HA挿入プラスミド内のH6プロモーターに並列した3′の麻疹融合遺伝子を含有する生成プラスミドをpSPHMF7と称した。
オリゴヌクレオチド定方向突然変異をpSPHMF7に行なった。最初に生体外突然変異反応(マンデック、1982)を行なって、オリゴヌクレオチドPSMAD(配列認識番号12)(5′−TATCCGTTAAGT−TTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT−3′)を用いたSma I部位の除去によりH6プロモーターと麻疹融合遺伝子との正確なATG:ATG連結を生成した。これによりpSPMF75M20が生成した。続いて、既知の方法(マンデック、1982)にしたがってオリゴヌクレオチドSPBGLD(配列認識番号13)(5′−AATAAATCACTTTTTATACTAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT−3′)を用いてH6プロモーターの5′末端のBgl II部位を除去した。生成したプラスミドをpSPMFVCと称した。レスキューイングウイルスとしてのワクチニアウイルスvP410により生体外組換え実験においてこのプラスミドを用いてvP455を産生した。
実施例3−イムノプレシピテーション分析
組換え体vP455およびvP557が真正のタンパク質を発現したことを確認するために、記載した方法(テイラーら、1990)にしたがってイムノプレシピテーション実験を行なった。手短に言うと、ベロ細胞単層を35S−メチオニンの存在下で細胞当り10pfuで親ウイルスまたは組換えウイルスのいずれかで感染せしめた。カルボキシ末端融合ペプチドに対して直列した家ウサギ抗血清を用いて感染細胞溶解産物から融合タンパク質を特異的に沈殿せしめた。多クローン性単特異生抗血清を用いて感染細胞溶解産物から血球凝集素タンパク質を特異的に沈殿せしめた。
融合特異血清を用いたイムノプレシピテーションに関して、未感染ベロ細胞、親感染ベロ細胞、またはHA組換え体vP557に感染した細胞中には全く放射線標識産生物は検出されなかった。融合組換え体vP455に感染した細胞において、約60kdの分子量を有する融合前躯体F0および44kdと23kdの分子量を有する2つの開裂産生物F1とF2が検出された。同様に、約75から77kdの分子量を有するHAタンパク質のグリコシル化形状のイムノプレシピテーションに関して、未感染ベロ細胞、親感染細胞、またはvP455に感染したベロ細胞中には産生物は全く検出されなかった。
加えて、イムノフルオレセンス研究は、両者のタンパク質が感染細胞表面上に発現されたことを示した。
実施例4−細胞融合実験
麻疹ウイルス属細胞変性性の特徴は、感染細胞と周囲の未感染細胞との融合により生じる融合細胞の形成であり、続いてその融合細胞の中心に向かって核が移動する(ノービーら、1982)。これはウイルス拡散の重要な方法であることが示されており、その拡散はパラミクソウイルス属に関して、血球凝集素特異抗体の存在下で生じ得る(マーツら、1980)。この能力は、他のパラミクソウイルス属との相似によりF1ペプチドのアミノ末端にあるとされている(ショパンら、1981;ノビックら、1988;パターソンら、1987)。
ワクチニアウイルス中で発現された麻疹ウイルスタンパク質が機能的に活性であることを確認するために、ベロ細胞単層に、それぞれ細胞当り1pfuの、親のまたは組換えウイルスvP455およびvP557を接種した。37℃での1時間の吸収後、接種物を取り出し、オーバーレイ媒質を置き換えて、接種物の入ったプレートを37℃で一晩培養した。感染の18時間後、プレートを顕微鏡で観察し、写真を写した。親ウイルスであるvP455またはvP557を接種したベロ細胞には全く細胞融合活性が見られなかった。しかしながら、vP455およびvP557をともに接種した場合に、十分な細胞融合活性が観察された。
この結果は、麻疹/ワクチニアウイルス組換え体に感染した様々な細胞系における融合細胞の形成には、融合および血球凝集素遺伝子の両者の発現が必要であることを確認したウィルドら(1991)により最近確認された。しかしながら、その結果は、麻疹融合タンパク質を発現する非常に多重なアデノウイルス組換え体に感染した293の細胞中の細胞融合を記載した先の報告(アルハチブ、1990)とは著しく異なる。同様に、麻疹融合タンパク質を発現するバキュロウイルス組換え体に感染した昆虫細胞中で、pH5.8で培養したときにのみに細胞融合が観察されたことが報告されている(ブィアラードら、1990)。いずれの場合においても、融合活性は、麻疹血球凝集素タンパク質を発現する適切な組換え体による共感染(co−infection)により高められなかった。融合工程に含まれる変化要因は、細胞の種類(ギロードンら、1984)、媒質のpH(ブィアラードら、1990)および融合タンパク質の発現水準(ノービーら、1982)である。
実施例5−血清試験
ウイルス中和(VN)抗体試験の技術は先に詳細に記載している(アペルら、1973)。CDV−VN抗体滴定試験を、CDVの適応オンダーステポート(Onderstepoort)菌株によりベロ細胞中で行なった。MV−VN抗体滴定の試験は、MVの適応エドモンストン(Edmonston)菌株によりベロ細胞中で行なった。血清試験の結果を表1に示す。
実施例6に記載したように、麻疹融合タンパク質を発現するvP455またはワクチニア親ウイルスのいずれかで免疫化したイヌは、MVに対する中和抗体を発生させなかった。HAタンパク質を発現するvP577で免疫化したか、または組換え体vP455およびvP557の両者で共接種したイヌは、1回の接種後に中和抗体を発生された。抗体の水準は、MVの弱毒化エドモンストン菌株の接種により誘発された水準と等しかった。
実施例6−動物防御研究
組換え体を接種したイヌ中の麻疹ウイルスタンパク質の発現がCDV抗原投与に対する防御免疫反応を誘発するのに十分であるかどうかを確認するために、14匹の生後10週間の、特定の病原体のないビーグル犬について研究した。血液試料を実験の最初と、その後に繰り返し集積した。各群2匹ずつの4つの群を、3週間間隔で2回の注射で免疫化した。第1の群にはワクチニアウイルスのみを注射した。第2の群には、麻疹ウイルスのFタンパク質(vP455)の挿入物を有するワクチニアウイルスを注射した。第3の群には、MVのHA抗原(vP557)の注入物を有するワクチニアウイルスを注射し、第4の群には第2と第3の組合せを注射した。各イヌに、1mlの量中約4×108pfu(皮下で0.6ml、筋肉内で0.4ml)のワクチニアウイルスを接種した。2匹の対照イヌには105 50%組織培養感染量(TCID50)のMVの弱毒化エドモンストン菌株を筋肉内に注射し(1mlの量)、2匹の対照イヌには、毒性CDVの抗原投与の前に104TCID50のCDVの弱毒化ロックボーン菌株を皮下に注射した。2匹のイヌは、抗原投与の前には接種されない状態であった。
最後の接種の2週間後に、全てのイヌを、104TCID50の毒性CDVのスナイダーヒル菌株を含有する1mlの細胞培養液体を鼻内接種することにより抗原投与した。イヌの臨床反応を、毎日の観察および体温の記録により、そして2週間に1回体重の増加または減少の記録により監視した。循環血液リンパ球を、抗原投与の前および抗原投与後の日数(dpc)3、5、7および10で数えた。イヌの肺のマクロファージによる共培養(co−cultivation)による被膜形成細胞からのウイルスの単離(アペルら、1967)をdpc3、5、7および10で行なった。血清試験の血液試料は、ワクチン接種の前、抗原投与の時期までの1週間ごと、およびdpc7、10および20で集積した。
抗原投与の結果を表2に示す。
免疫化していない対照イヌおよび親ワクチニアウイルスでワクチン接種したイヌは重い病気の臨床的徴候を示し、脱水症状が明確になったときに安楽死させた。vP455で免疫化した療法のイヌは、対照のイヌに見られたのよりも短い期間であるけれども、体重損失、体温の上昇、およびリンパ球減少を含むCDVに感染した徴候を示した。言うまでもなく、両方のイヌが致死量のCDVの抗原投与にもかかわらず生き残った。vP557を接種したイヌまたは療法の組換え体を共接種したイヌは、感染の最小限の徴候を示し、抗原投与にも生き残った。MVの弱毒化エドモンストン菌株またはCDVの弱毒化ロックボーン菌株のいずれかで接種したイヌはまた、最小限の病気の徴候を示して抗原投与にも生き残った。
実施例7−追加のワクチニア/麻疹構成物
ここで第3図を参照する。プラスミドpRW843の挿入により、tk座内に麻疹HA遺伝子を含有する第2のワクチニアウイルス組換え体を産生した(vp756)。pRW843を以下の方法に従って構成した。正確なATG:ATG配列中に3′−末端側の26bpを欠損したHA遺伝子と融合したH6プロモーターの3′−末端側の24bを含有する1.8kbpのEcoR V/Sma I断片をpSPM2LHAVCから単離した。この断片を用いてpSPMHA11の1.8kbpのEcoR V/Sma I断片を置き換えてpRW803を産生した。プラスミドpRW803は、正確に完全な麻疹HA遺伝子と連結した完全なH6プロモーターを含有する。
麻疹HA遺伝子を有する先の構成物の確認すると、公表された配列と比較してコードン18(CCC)の配列が欠損したことに気付いた(アルハチブら、1986)。オリゴヌクレオチドRW117(配列認識番号14)(5′−GACTATCCTACTT−CCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA−3′)
Pro 18
を使用するクンケル法(クンケル、1985)を用いてオリゴヌクレオチド突然変異誘発によりCCC配列を置き換えた。pIBI25中のpRW803からのH6/HAカセッテを含有するプラスミドpRW819から1本鎖のテンプレートを誘導した(IBI、ニューハブン、CT.)。コードン18でプロリン残基をコードする挿入物(CCC)を含有する突然変異誘発プラスミドをpRW820と称した。pRW820のHind IIIとXba I部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した。Hind III部位はH6プロモーターの5′縁に位置し、一方Xba I部位はHA遺伝子の開始コードンから230bp下流に位置する。Xba Iから下流のHA暗号配列を含有し、終止コードンを含有する、pRW803からの1.6kbpのXba I/EcoR I断片を用いてpRW820の等量の断片を置き換え、pRW837を産生した。pRW837内に含有される突然変異誘発の発現カセッテは、Hind IIIとEcoR Iでの切断により誘導し、2mMのdNTPの存在下でのE.coliDNAポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端としてpSD573VCQのSma I部位に挿入してpRW843を産生した。レスキューイングウイルスとしてのvP618による生体外組換え実験においてプラスミドpRW843を用いてvP756を産生した。親ウイルスvP618は、チミジンキナーゼ、出血性およびA型含有遺伝子が欠損せしめられたコペンハーゲン菌株ウイルスである。約75kdの血球凝集素糖タンパク質を正確に発現するイムノプレシピテーション分析により組換え体vP756が示されている。
ここで第4図を参照する。ゲノムのAT I座に麻疹融合遺伝子を含有する第2のワクチニアウイルス組換え体(vP800)を、プラスミドpRW850の挿入により産生した。pRW850を構成するために、以下の操作を行なった。正確にATG:ATG配列中にH6プロモーターと連結した麻疹融合遺伝子を含有するプラスミドpSPMF75M20をNru IとEag Iで切断した。H6プロモーターターの3′−末端側の28bpおよび完全な融合遺伝子を含有する1.7kbpの鈍端の断片を単離して、Nru IとXba Iで切断し鈍端としたpRW823に挿入した。生成したプラスミドpRW841は、pIBI25プラスミドベクター中に麻疹融合遺伝子に連結したH6プロモーターを含有する(IBI、ニューハブン、CT.)。Sma Iでの切断によりpRW841からH6/麻疹融合発現カセッテを誘導し、生成した1.8kbp断片を、Sma Iで切断したpSD494VCに挿入してpRW850を産生した。レスキューイングウイルスとしてのvP618により生体外組換え実験においてプラスミドpRW850を用いてvP800を産生した。確実に処理した融合糖タンパク質を発現するイムノプレシピテーション分析により組換え体vP800が示されてた。
実施例8−vP455を接種した家ウサギとモルモット中の麻疹中和抗体の評価
2匹の家ウサギを、麻疹融合タンパク質を発現する合計1×108pfuの組換え体vP455により5つの部位に皮内に接種した。両方の家ウサギに12週間後それぞれ接種により追加抗原投与した。追加抗原投与後2週間、すなわち14週間後に連続的な流血を集積し、家ウサギを血清中和抗体の存在について試験した。
4匹のモルモットをそれぞれ1×108pfuの組換え体vP455で皮下に接種した。それぞれの抗原投与接種は21日後に行なった。連続的な出血を集積した。
麻疹ウイルス血清中和抗体の存在を、マイクロタイタウェル(well)当り10TCID50のウイルスを用いたマイクロタイタ試験(アペルら、1973)により評価した。その結果を表3に示す。
実施例9−麻疹ウイルス組換えカナリヤポックスウイルスの産生
鶏痘ウイルスについて先に記載したものと同様な方法を用いて、麻疹/カナリヤポックスウイルス組換え体を産生した(テイラーら、1988a、b)。
麻疹FおよびHA遺伝子をカナリヤポックスウイルス中に挿入するプラスミドを以下のようにして産生した。
ここで第5図を参照する。H6プロモートした麻疹F遺伝子を含有するpSPMF75M20からの1.8kbpの鈍端Bal II/Eag I断片をpRW764.2の鈍端EcoR I部位に挿入した。プラスミドpRW764.2は、ウイルス複製に可欠であると確認された独特なEcoR I部位を有するカナリヤポックスゲノムからの3.4kbpのPvu II断片を含有する。麻疹F遺伝子を含有する生成したプラスミドはpRW800と称し、レスキューイングウイルスとしてのカナリヤポックスによる組換え実験に用いてvCP40を産生した。
ここで第6図を参照する。正確なATG:ATG配列でHAと融合したH6プロモーターの3′−末端側の28bpを含有するpSPM2LHAからの1.8kbpのEcoR V/Sma I断片を、pSPMHA11のEcoR VおよびSma I部位の間に挿入した。生成したプラスミドをpRW803と称した。H6プロモートした麻疹HA遺伝子を含有するpRW803の2kbpのHind III/EcoR I断片を鈍端として、プラスミドpRW764.5の鈍端Bal II部位に挿入した。プラスミドpRW764.5は、ウイルスの成長に可欠であると先に確認された独特なBal II部位を有するカナリヤポックスゲノムの800bp Pvu II断片を含有する。この挿入により、組換え試験に用いたプラスミドpRW810を生成してvCP50を産生した。
麻疹FおよびHA配列の挿入により個別に、それぞれ組換え体vCP40およびvCP50を発生せしめた。二重の組換え体を生成するために、pRW810に含まれるHA遺伝子を挿入するレスキューイングウイルスとして単一F組換えvCP40を用いた。これにより二重の組換え体vCP57が発生した。
実施例10−イムノプレシピテーション分析
組換え体vCP40、vCP50およびvCP57が真正のタンパク質を発現したことを確認するために、HAまたはFタンパク質にいずれかに対して指向性のある単一特異性血清を用いたイムノプレシピテーション分析を行なった。vCP40とvCP57に感染した細胞の溶解産物から、正確に処理した融合ポリペプチドを特異的に沈殿せしめた。約60kdの分子量を有する融合前駆体F0およびそれぞれ約44kdおよび23kdの分子量を有する2つの開裂産物F1およびF2を検出した。未感染CEF細胞、親感染CEF細胞またはHA組換え体vCP50に感染したCEF細胞中にはどの融合特異産生物も検出不可能であった。同様に、単一HA組換え体vCP50および二重組換え体vCP57に感染したCEF細胞から、約75kdの糖タンパク質が特異的に沈殿せしめた。未感染細胞、親感染細胞または融合組換え体vCP40に感染した細胞中にはどのHA特異産生物も検出されなかった。
実施例11−細胞融合実験
麻疹ウイルス組換え体が機能的に活性であることを確認するために、細胞融合検定を行なった。ベロ細胞単層を、細胞当り1pfuのCP親または組換えウイルスで感染せしめ、感染から18時間後に細胞変性効果を試験した。親、vCP40またはvCP50ウイルスを接種したベロ細胞中には全く細胞融合活性は明確にはならなかった。しかしながら、ベロ細胞に二重組換え体vCP57を接種したときまたは細胞をvCP40とvCP50の両方で共接種したときに、十分な細胞融合活性が示された。
実施例12−血清試験
実施例13に記載するように、カナリヤポックス/HA組換え体vCP50、ワクチニア/HA組換え体vP557、カナリヤポックス/HA/F二重組換え体vCP57を接種したイヌまたはvP455とvP557で共接種したイヌは、1回の接種の後に麻疹ウイルスに対して著しい血清中和抗体を発生せしめた。カナリヤポックス/F組換え体vCP40を接種した2匹のイヌのいずれも、1または2回の接種の後に中和抗体を発生せしめなかった。血清試験の結果を表4に示す。
加えて、vCP40を接種したモルモットは再現できるが低い水準の血清中和抗体を発生した。
実施例13−動物防御研究
麻疹ウイルスタンパク質を発現する非複製カナリヤポックスベクターがCDV抗原投与に対する防御免疫反応を誘発するかどうかを確認するために、生後10週間の特定の病原を有さないビーグル犬にカナリヤポックス親および組換えウイルスを接種した。2匹のイヌに1×108pfuの各組換え体の皮下注射を3週間の間隔で2回、同時に接種した。比較するために、あるイヌは同一の摂生で、単一のワクチニアウイルス組換え体vP455およびvP557並びにその両方の組合せのそれぞれを接種した。あるイヌはまた、MVの弱毒化エドモンストンの105TCID50の1回の投与量を筋肉内に接種した。あるイヌは、CDVの弱毒化ロックボーン菌株の104TCID50の1回の投与量を皮下に接種した。それぞれのイヌに、鼻内の最終接種の2週間後、致死量のCDVの毒性スナイダーヒル菌株の104TCID50を抗原投与した。イヌの臨床反応を毎日監視した。結果を表5に示す。
実験の過程中にどのイヌにもワクチン接種に反する反応は見られなかった。親カナリヤポックスウイルスで免疫化した2匹のイヌおよび2匹の非免疫化対照イヌは毒性CDVの抗原投与後重大な病気を示した。4匹のイヌ全てが上昇した体温、体重損失、リンパ球減少症およびひどい脱水症状を示した。CDVロックボーンで免疫化したイヌは、抗原投与の前にMVに対してではなくCDVに対する血清中和抗体を発生し、抗原投与にも生き残り、症状は示さなかった。弱毒化MVで免疫化したイヌは、抗原投与の前にCDVではなくMVに対する血清中和抗体を発生し、穏やかな感染の徴候を見せたが抗原投与に生き残った。vCP50、vCP57、vP557を接種したイヌまたはvP445およびvP557を共接種したイヌは、1回の接種の後にMVに対する著しい血清中和抗体を発生し、ほとんど症状を示さず抗体投与に生き残った。
実施例14−追加のカナリヤポックス/麻疹構成物
ここで第7図を参照する。MV HA遺伝子を発現するカナリヤポックスウイルス組換え体を産生するために、以下の挿入プラスミドを生成した。正確に麻疹HAに連結されたH6プロモーターの3′末端側の26bpを含有するpRW837から1.8kbpのEcoR V/EcoR I断片を、pRW838からの3.2kbpのEcoR V/EcoR I断片に連結した。pRW838誘導断片は、H6プロモーターの5′部分およびC5座側腹アームを含有する。プラスミドpRW838およびpRW831(下記以下参照)を以下に従って誘導した。
880bp Pvu IIカナリヤポックス遺伝子断片をpUCのPvu II部位の間に挿入した。生成したプラスミドはpRW764.5と称した。製造者の仕様書に従って改良T7酵素シーケナーゼTMキット(米国、バイオケミカル、クレブランド、OH)を用いて、880bpカナリヤポックス断片のヌクレオチド配列を求めた。配列反応は、バイオサーチ8700(サンラファエル、CA)またはアプライドバイオシステムス3800(フォスターシティー、CA)により調製された注文合成プライマー(17−18mers)を用いた。これによりC5読み取り枠の規定が可能になった。
特異的にC5読み取り枠を欠損せしめるために、Rsa IでpRW764.5を部分的に切断し、線状産生物を単離した。Rsa I線状断片をBal IIで再度切断し、位置156から位置462が欠損したRsa I−Bal IIを有するpRW764.5断片を単離して、以下の合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いた:RW145(配列認識番号15):(5′−ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA−3′)RW146(配列認識番号16):(5′−GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT−3′)。オリゴヌクレオチドRW145およびRW146をアニールし、上述したpRW764.5Rsa I−Bal IIベクター中に挿入した。生成したプラスミドはpRW831である。
このC5欠損プラスミドは、他のカナリヤポックスウイルス読み取り枠の妨害なく形成された。C5暗号配列を、Hind III、Sma I、およびEcoR Iの制限部位を含む上述アニールしたオリゴヌクレオチド(RW145およびRW146)で置き換えた。
狂犬病G遺伝子(テイラーら、1988b)並列3′を含有するSma I断片をワクチニアウイルスH6プロモーターに挿入することによりpRW831からプラスミドpRW838を誘導した。pRW837からの1.8kbpのEcoR V/EcoR I断片をpRW838からの3.2kbpのEcoR V/EcoR I断片に連結することによりプラスミドpRW852を構成した。プラスミドpRW852を、ALVACと称するカナリヤポックス単離体による組換え実施例に用いてvCP85を産生した。ALVACは、カナリヤのワクチン接種に用いられるカナリヤポックスウイルス(CPV)の非常に弱毒化した菌株である、レントシュラー菌株から誘導したCPVのプラーククローン単離体である。ALVACおよび誘導組換え体の複製は、鳥類種に制限されている。家ウサギ抗HA血清により認識される約75kdのタンパク質が組換え体vCP85に感染したCEF細胞中に発現されることがイムノプレシピテーション分析により確認された。
ここで第8図を参照する。MV HAおよびF遺伝子の両方を含有するカナリヤポックスウイルス組換え体を産生するために、以下の構成物を生成した。Sma I制限部位をH6プロモートした麻疹融合遺伝子の末端に加えた。これを行なうために、ワクチニアウイルスH6プロモーターを含有するpIBI25であるpRW823をXba I部位のプロモーター配列の下流で切断した。その末端を、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。鈍端DNAを続いてNru Iで切断して、H6プロモーターの5′末端側の100bpを含有する3.0kbp断片を離生した。この断片を単離して、pSPMF75からの1.7kbpの鈍端Eag I/Nru I断片に連結した。生成したプラスミドをpRW841と称した。
pRW841の切断により誘導された1.8kbpのSma I断片をC5欠損ベクター、pRW831中に挿入した。プラスミドpRW851を、3′末端を融合遺伝子に位置させたEcoR I部位で線状にして、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。H6プロモーター配列に対して麻疹HA遺伝子並列3′末端を含有するプラスミドpRW837をHind IIIおよびEcoR Iで切断して、クレノー断片で鈍端とした。生成した1.8kbp断片を単離して、EcoR Iで線状にされ鈍端となったpRW851中に挿入した。生成したプラスミドは尾から尾の配置に両方の遺伝子を含有し、これをpRW853Aと称し、レスキューイングウイルスとしてのカナリヤポックス(ALVAC)による生体外組換え実験において用い、vCP82を産生し、これをALVAC−MVと称した。イムノプレシピテーションおよびイムノフルオレセンスを用いた発現分析により、組換え体vCP82に感染した細胞中において、真正に処理したHAおよびFタンパク質が発現されたことが確認された。組換え体は細胞融合活性について機能的であった。
ALVAC−MV(vCP82)を接種したモルモットと家ウサギの血清の血清分析結果
4匹のモルモットにALVAC−MV(vCP82)を皮下経路で接種した。2匹のモルモット(026および027)にそれぞれ1×108pfuを接種し、もう2匹のモルモット(028および029)にはそれぞれ1×107pfuを接種した。28日後に、モルモットに同一量を再接種した。2匹の家ウサギに、皮下経路で1×108のALVAC−MV(vCP82)を接種した。28日後に、家ウサギに同一量を再接種した。アペルとロビンソン(1973)により記載されたマイクロタイタ中和試験またはアルブレフトら(1981)により記載されたプラーク低減中和試験のいずれかを用いて、これらの動物の連続的な流血を、麻疹ウイルス中和活性について分析した。加えて、マーツら(1980)に記載されたように行なった抗融合検定において麻疹ウイルス誘導細胞−細胞融合を阻害できる抗体の存在について、血清を分析した。
麻疹ウイルス血清中和抗体の存在についての分析結果を表6および7に示す。1×108のALVAC−MVを接種されたモルモット(026および027)の両方は1回の接種後に血清転化して、血清は追加抗原投与の接種後に抗体の上昇を示した。1×107pfuを接種された1匹のモルモット(029)はまた、1回の接種後に血清転化した。4匹めのモルモットは、1回の接種後に検知可能な応答を示さなかったが、2回の接種後に等量の力価を達成した。
プラーク低減中和法を用いて家ウサギの血清もまた分析した。結果を表7に示す。両方の動物は1回の接種後に血清転化した。家ウサギ063の血清を、マイクロタイタ中和試験およびプラーク低減中和試験の両方により試験した。両方の方法を用いて得られた力価は同じであった。病気からの防御には、ワクチン接種した子供に1.2から1.9の最小限の血清中和力価が必要であることが報告されている(レノンおよびブラック、1986;ブラックら、1984)。この分類基準を用いて、2回の接種まで血清転化を示さなかった1匹のモルモットを除いて全ての動物が、1回の接種後に防御水準の抗体を示した。
不活性化したワクチンは、乏しい防御効能およびウイルスへの再露出で高められた麻疹病に関連することが以前に研究により示されている。不活性ワクチンの宿主は融合タンパク質に対する抗体がないことを示し、不活性化工程がタンパク質を非免疫遺伝にすることが提議されている(ノービーおよびゴルマー、1975;ノービーら、1975)。加えて、他のパラミクソウイルスに関して、Fタンパク質に対する抗体が組織培養中のウイルスの細胞から細胞への拡散を促成でき、一方血球凝集素成分に対する抗体はそのようにはできないことが示されている(マーツら、1980)。
それゆえ、ALVAC−MV(vCP82)を接種した動物が、麻疹ウイルスの細胞から細胞への伝染を阻害できるFタンパク質に対する抗体を誘発できたことを示すことは重大であった。この抗融合検定の結果を表8に示す。抗融合活性は、ALVAC−MV(vCP82)を接種したモルモットと家ウサギの両方の血清において明白であった。分析した血清は、追加抗原投与の接種後2または3週間で採取した。ALVAC親ウイルスを接種した家ウサギの血清中には、どの抗融合活性も検出できなかった。
ALVAC−MVを接種した動物の血清中のMV血球凝集素およびMV融合タンパク質の両方に対する抗体の存在を示すさらなる試験において、イムノプレシピテーション実験を行なった。ALVAC−MVを接種した家ウサギの血清は、エドモンストン菌株MVを接種したベロ細胞の放射線標識した溶解産物からの血球凝集素および融合タンパク質の両方を特異的に沈殿せしめることが示された。
同様の研究において、モルモット、家ウサギおよびネズミの群を、筋肉内にALVAC−MVを接種し、麻疹ウイルスに対するそれらの血清反応について、血球凝集−阻害(HI)試験を用いてモニターした。カナリヤポックスウイルスに対する血清反応はELISA検定によりモニターした。この研究において、5匹のモルモットに5.5log10TCID50を接種し、30匹のネズミに4.8log10TCID50を接種し、5匹の家ウサギに5.8log10TCID50を接種した。全ての動物に、28日後に等量を再接種した。動物を規則的な間隔で出血させ、麻疹ウイルスに対するそれらの反応をHI検定で評価した。HI検定における検出限界は、1のlog10力価に対応し、血清陽性(防御)の子供は1.6から2.8の範囲の血清力価を有すると考えられる。分析結果を表9、10および11に示す。
ネズミの血清を5つの動物の群に別けて分析した(表9)。全ての動物は、2回目の接種後に追加抗原投与したカナリヤポックスウイルスに対して初期の応答を示した。ネズミは1回の接種後にはMVに対する応答を示さなかった。6つの群のうち3つの群が、接種後8週間で防御範囲内の力価を示した。同様に、全てのモルモット(表10)が、2回目の接種後に追加抗原投与した1回目の接種後のカナリヤポックスウイルスに対して応答を示した。5匹の動物のうち4匹が1回の接種後に抗HI力価を発生させ、これらのうち1つが防御範囲内にあった。2回目の接種の1週間後、全ての動物の力価が防御範囲内にあった。これらの力価は、実験を終了した接種後8週間まで保持された。ALVAC−MV(vCP82)を接種した全ての家ウサギ(表11)は、カナリヤポックス接種に対して血清学的に反応した。5匹の動物のうち4匹が1回の接種後に麻疹ウイルスに対して血清転化した(そのうち1つが防御範囲内にあった)。全ての動物の血清力価は、2回目の接種後1週間で防御範囲内にあった。
ALVAC−MV(vCP82)を接種したリスサル(squirrel monkey)の血清の血清分析の結果:麻疹ウイルス特異免疫反応の誘発におけるポックスウイルスへの露出前の感染
9匹のリスサル(Saimiri sciureus)にALVAC−MV(vCP82)を接種した。全てのサルは麻疹ウイルスに対する経験がなかった。7匹のサルをワクチニアウイルスおよび/またはカナリヤポックスウイルスに先に露出した。先の免疫の経歴を表12に示す。皮下経路により5.8log10pfuの量を全てのサルに接種した。4匹のサル(39、42、53および58)に、最初の接種から15週間後に等量を再接種した。HI試験により抗麻疹抗体を測定した。その結果を表12に示す。
最初の接種後、9匹のうち2匹のサルはALVAC−MVの接種に対して低い反応を示した。2回目の接種後、再接種した4匹のサルを防御免疫に必要な範囲の著しい抗体力価で血清転化した。達成された力価は、サルがワクチニアウイルスおよびALVACへの先に露出されたかまたは全くポックスウイルスに露出しなかったかに対応する。
実施例15−弱毒化ワクチニアワクチン菌株NYVAC
新たなワクチニアワクチン菌株を発生させるために、既知のまたは潜在的な毒性要因をコードするゲノムの6つの可欠領域を欠損せしめることによりワクチニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を変性した。配列欠損を以下詳細に示す。ワクチニア制限断片、読み取り枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、ゲーベルら(1990a、b)に報告されている用語に基づく。
異種遺伝子の挿入の受容座として欠損座も生成した。
NYVAC中に配列欠損した領域を以下に列記する。欠損領域の短縮形および読み取り枠の名称(ゲーベルら、1990a、b)並びに以下に特定した欠損の全ての欠損を含有するワクチニア組換え体(vP)の名称もまた列記する:
(1)チミジンキナーゼ(TK;J2R)vP410;
(2)出血性領域(u;B13R+B14R)vP553;
(3)型含有ボディ領域(AT I;A26L)vP618;
(4)血球凝集素遺伝子(HA;A56R)vP723;
(5)宿主域遺伝子領域(C7L−K1L)vP804;
および
(6)大サブユニット、リボヌクレオチド還元酵素(I4L)vP866(NYVAC)。
DNAクローニングおよび合成
標準的な方法によりプラスミドを構成し、スクリーニングし、成長せしめた(マニアチスら、1986;パーカスら、1985;ピッチーニら、1987)。制限エンドグルカナーゼを、メリーランド州、ゲイサースブルク、GIBCO/BRL;マサチューセッツ州、ビバーリー、ニューイングランドバイオラボ;およびインディアナ州、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。BAL−31エキソヌクレアーゼおよびファージT4 DNAリガーゼはニューイングランドバイオラボから得た。試薬は様々な供給者により明示されたものとして用いた。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ8750またはアプライドバイオシステムス380B DNAシンセサイザーにより調製した(パーカスら、1989)。DNAの塩基配列決定は、前述したように(グオら、1989)、シーケナーゼ(タバーら、1987)を用いたジデオキシ鎖終止法(サンガーら、1977)により行なった。配列を証明する(エンゲルケら、1988)ポリメラーゼ鎖反応(PCR)によるDNA増幅は、自動化パーキンエルマーセタスDNAサーマルサイクラー中の注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジェネアンプDNA増幅試薬キット(パーキンエルマーセタス、ノルウォーク、CT)を用いて行なった。過剰のDNA配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断によりプラスミドから欠損せしめ、それに続いてBAL−31エキソヌクレアーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発(マンデックら、1986)を行なった。
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養の条件と起源が以前に記載されている(グオら、1989)。組換えによる組換え体ウイルスの産生、ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成およびベータガラクトシダーゼ活性のスクリーニングは以前に記載している(パニカリら、1982;パーカスら、1989)。
チミジンキナーゼ遺伝子(J2R)の欠損したプラスミドpSD460の構成
ここで第9図を参照する。プラスミドpSD406はpUC8中にクローンされたワクチニアHind III J(位置83359−88377)を含有する。pSD406まをHind IIIおよびPvu IIで切断し、Hind III Jの左側から1.7kbの断片をHind III/Sma Iで切断したpCU8中にクローンして、pSD447を形成した。pSD447はJ2Rの完全な遺伝子(位置83855−84385)を含有する。開始コードンはNla III部位内に含有され、終止コードンはSsp I部位内に含有される。転写の方向は第9図中の矢印により示される。
左の側腹アームを得るために、0.8kbのHind III/EcoR I断片をpSD447を単離し、次いでNla IIIで切断し、0.5kbのHind III/Nla III断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドNPSYN43/MPSYN44(配列認識番号17/配列認識番号18)
を0.5kbのHind III/Nla III断片と連結せしめ、Hind III/EcoR Iで切断したpUC18ベクタープラスミド中に挿入し、プラスミドpSD449を産生した。
ワクチニア右側腹アームおよびpUCベクター配列を含有する制限断片を得るために、pSD447を、ワクチニア配列内のSsp I(部分的)およびpUC/ワクチニア接合でのHind IIIで切断し、2.9kbのベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドNPSYN45/MPSYN46(配列認識番号19/配列認識番号20)
と連結し、pSD459を産生した。
左と右の側腹アームを1つのプラスミド中に結合せしめるために、0.5kbのHind III/Sma I断片をpSD449から単離し、Hind III/Sma Iで切断したpSD459ベクタープラスミドと連結し、プラスミドpSD460を産生した。野性型親ワクチニアウイルスコペンハーゲン菌株VC−2との組換えの供与体プラスミドとしてpSD460は用いられた。テンプレートとしてのMPSYN45(配列認識番号19)およびプライマーとしての相補的20merオリゴヌクレオチドMPSYN47(配列認識番号21)(5′−TTAGTTAATTAGGCGGCCGC−3′)を用いたプライマー・エクステンションにより32P標識プローブを合成した。組換えウイルスvP410を、プラーク雑種形成により同定した。
出血性領域(B13R+B14R)が欠損したプラスミドpSD486の構成
ここで第10図を参照する。プラスミドpSD419はpUC8中にクローンされたワクチニアSal I G(位置160,744−173,351)を含有する。pSD422は、その右側に隣接ワクチニアSal I断片、pUC8中にクローンされたSal I J(位置173,351−182,746)を含有する。出血性領域、u、B13R−B14R(位置172,549−173,552)が欠損したプラスミドを構成するために、左側腹アームの供給源としてpSD419を用い、右側腹アームの供給源としてpSD422を用いた。u領域の転写方向は第10図中の矢印で示した。
不必要な配列をpSD419から除去するために、pSD419をNco I/Sma Iでの切断により、Nco I部位(位置172,253)の左側の配列を除去し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とし、連結してプラスミドpSD476を産生した。B14Rの終止コードンでのpSD422のHpa Iによる切断および右側の0.3kbのNru Iによる切断によってワクチニア右側腹アームを得た。この0.3kbの断片を単離して、pSD476から単離した3.4kbのHinc IIベクター断片と連結し、プラスミドpSD477を産生した。pSD477におけるワクチニアu領域の部分的な欠損の位置を三角形により示す。pSD477中の残りのB13R暗号配列は、Cla I/Hpa Iによる切断により除去し、生成したベクター断片を、アニールした合成オリゴヌクレオチドSD22mer/SD20mer(配列認識番号22/配列認識番号23)
と連結し、pSD479を産生した。pSD479はBmaH I部位により示された開始コードン(下線部)を含有する。uプロモーターの制御下でE.coliベータガラクトシダーゼをB13−B14(u)欠損座に配するために、ベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.2kbのBamH I断片(シャピラら、1983)をpSD479のBamH I部位中に挿入し、pSD479BGを産生した。pSD479BGは、ワクチニアウイルスvP410による組換えの供与体プラスミドとして用いた。色素基体Xギャルの存在下でブループラークとして組換えワクチニアウイルスvP533を単離した。vP533において、B13R−B14R領域は欠損され、ベータガラクトシダーゼにより置き換えられている。
vP533からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するがu欠損接合部には開始コードンを含有しないpSD477の誘導体であるプラスミドpSD486を用いた。最初に上述したpSD477からのCla I/Hpa Iベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドSD42mer/SD40mer(配列認識番号24/配列認識番号25)
と連結し、プラスミドpSD478を産生した。次に、pUC/ワクチニア接合部でのEcoR I部位をpSD478のEcoR Iによる切断により分断してE.coliポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結してプラスミドpSD478E-を産生した。pSD478E-をBamH IとHpa Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドHEM5/HEM6(配列認識番号26/配列認識番号27)
と連結し、プラスミドpSD486を産生した。組換えワクチニアウイルスvP533の組換えの供与体プラスミドとしてpSD486を用いてvP553を産生し、このvP533をX−ギャルの存在下で透明プラークとして単離した。
AT I領域(A26L)の欠損したプラスミドpMP494Δの構成
ここで第11図を参照する。pSD414はpUC8中にクローンされたSal I Bを含有している。A26L領域の左側の不必要なDNA配列を除去するために、pSD414を、ワクチニア配列内のXba I(位置137,079)およびpUC/ワクチニア接合部でのHind IIIで切断し、E.coliポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結してプラスミドpSD483を産生した。A26L領域の右側の不必要なDNA配列を除去するために、pSD483をEcoR I(位置140,665およびpUC/ワクチニア接合部)で切断して連結し、プラスミドpSD484を産生した。A26L暗号領域を除去するために、pSD484を、A26L ORFのやや上流のNde I(位置139,004)(部分的)およびA26L ORFのやや下流のHpa I(位置137,889)で切断した。5.2kbのベクター断片を単離して、アニールした合成オリゴヌクレオチドAT I3/AT I4(配列認識番号28/配列認識番号29)
と連結し、A26Lから上流の領域を再構成して上述したように制限部位Bgl II、EcoR IおよびHpa Iを含有する短いポリリンカー領域でA26L ORFで置換した。生成したプラスミドをpSD485と称した。pSD485のポリリンカー領域におけるBgl IIおよびEcoR I部位は特異ではないので、Bgl II(位置140,136)およびpUC/ワクチニア接合部でのEcoR Iでの切断によって不必要なBgl IIおよびEcoR I部位をプラスミドpSD483から除去し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結した。生成したプラスミドをpSD489と称した。A26L ORFを含有するpSD489からの1.8kbのCla I(位置137,198)/EcoR V(位置139,048)断片を、pSD485からの対応する0.7kbのポリリンカー含有Cla I/EcoR V断片と置換して、pSD492を産生した。pSD492のポリリンカー領域のBgl IIおよびEcoR I部位は特異である。
ワクチニア11kDaプロモーター(バートレットら、1985;パーカスら、1990)の制御下でEcoliベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.3kbのBgl IIカセッテ(シャピラら、1983)をpSD492のBgl II部位に挿入して、pSD493KBGを産生した。レスキューイングウイルスvP553による組換えにプラスミドpSD493KBGを用いた。A26L欠損領域にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルスvP581をX−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
ワクチニア組換えウイルスvP581からベータガラクトシダーゼ配列が除去されたプラスミドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドMPSYN177(配列認識番号30)(5′−AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATA−ACTTATTTTTTGAATATAC−3′)を用いた突然変異誘発(マンデック、1986)により、プラスミドpSD492のポリリンカー領域を欠損せしめた。生成したプラスミドであるpMP494Δにおいて、完全なA26L ORFを含有するワクチニアDNA包含位置[137,889−138,937]は欠損せしめられる。pMP494Δと、ワクチニア組換え体であるvP581を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクチニア欠損突然変異体vP618が産生され、このvP618はX−ギャルの存在下で透明プラークとして単離される。
血球凝集素遺伝子(A56R)が欠損したプラスミドpSD467の構成
ここで第12図を参照する。ワクチニアSal I G制限断片(位置160,744−173,351)はHind III A/B接合部(位置162,539)を交雑する。pSD419はpUC8中にクローンされたワクチニアSal I Gを含有している。血球凝集素(HA)遺伝子の転写方向は、第12図中の矢印により示されている。ワクチニア配列内のおよびpUC/ワクチニア接合部でのHind IIIによりpSD419の切断によりHind III Bから誘導されたワクチニア配列を除去し、次いで連結した。生成したプラスミドであるpSD456は、HA遺伝子、A56Rを含有し、左側に0.4kbのワクチニア配列並びに右側に0.4kbのワクチニア配列をその側腹に有する。A56R暗号配列から上流のRsa I(部分的;位置161,090)、および遺伝子の近傍のEag I(位置162,054)でpSD456を切断することによりA56R暗号配列を除去した。pSD456からの3.6kbのRsa I/Eag Iベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN59(配列認識番号31)、MPSY62(配列認識番号32)、MPSYN60(配列認識番号33)、およびMPSYN61(配列認識番号34)
と連結し、A56R ORFから上流のDNA配列を再構成し、上述したようにA56R ORFをポリリンカー領域で置換した。生成したプラスミドはpSD466である。pSD466の欠損したワクチニアは、位置[161,185−162,053]を包含する。pSD466の欠損した部位は第12図中の三角形により示されている。
ワクチニア11kDaプロモーター(バートレットら、1985;グオら、1989)の制御下でE.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.2kbのBgl II/BamH Iカセッテ(部分的)(シャピラら、1983)をpSD466のBgl II部位に挿入して、pSD466KBGを産生した。プラスミドpSD466KBGをレスキューイングウイルスvP618による組換えに用いた。A56R欠損部にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルスであるvP708をX−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
供与体プラスミドpSD467を用いてベータガラクトシダーゼ配列をvP708から欠損せしめた。pSD466のEcoR I/BamH Iによる切断によりpUC/ワクチニア接合部からEcoR I、Sma IおよびBamH I部位が除去されて、続いてE.coliポリメラーゼのクルノー断片で鈍端とされて連結されたことを除いては、pSD467はpSD466と等しい。vP708とpSD467との間の組換えにより、組換えワクチニア欠損変異体、vP723が産生され、そのvP723はX−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
読み取り枠[C7L−K1L]が欠損したプラスミドpMPCSK1Δの構成
ここで第13図を参照する。pMPCSK1Δの構成に以下のワクチニアクローンを用いた。pSD420はpUC8中にクローンされたSal I Hである。pSD435はpUC18中にクローンされたKpn I Fである。pSD453をSph Iで切断して再連結し、pSD451を産生した。pSD451において、Hind III M中のSph I部位(位置27,416)の左側のDNA配列は除去される(パーカスら、1990)。pSD409はpUC8中にクローンされたHind III Mである。
ワクチニアからの[C7L−K1L]遺伝子クラスターの欠損した基質を提供するために、E.coliベータガラクトシダーゼを以下のようにワクチニアM2L欠損座中に挿入した(グオら、1990)。pSD409中のBgl II部位を除去するために、ワクチニア配列中のBgl II(位置28,212)およびpUC/ワクチニア接合部でのBamH Iでプラスミドを切断し、次いで連結してプラスミドpMP409Bを産生した。pMP409Bを特異Sph I部位で切断した(位置27,416)。合成オリゴヌクレオチド
を用いた突然変異誘発(グオら、1990;マンデック、1986)によりM2L暗号配列を除去した。
生成したプラスミド、pMP409Dは、上述したようにM2L欠損座に挿入された特異Bgl II部位を含有する。11kDaプロモーターの制御下(バートレットら、1985)でE.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.2kbのBamH I(部分的)/Bgl IIカセッテ(シャピラら、1985)を、Bgl IIで切断したpMP409D中に挿入した。生成したプラスミドpMP409DBG(グオら、1990)は、レスキューイングワクチニアウイルスvP723による組換えの供与体プラスミドとして用いた。M2L欠損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルス、vP784を、X−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
ワクチニア遺伝子[C7L−K1L]が欠損したプラスミドをSma I、Hind IIIで切断したpUC8中に組み立て、E.coliポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。ワクチニアHind III C配列からなる左腹側アームは、pSD420のXba I(位置18,628)での切断により得て、次いでE.coliポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とし、Bgl II(位置19,706)で切断した。ワクチニアHind III K配列からなる右側腹アームをBgl II(位置29,062)およびEcoR V(位置29,778)でのpSD451の切断により得た。生成したpMP581CKは、Hind III C中のBgl II部位(位置19,706)とHind III K中のBgl II部位(位置29,062)との間のワクチニア配列が欠損している。プラスミドpMP581CK中のワクチニア配列の欠損した部位を、第13図中に三角形で示す。
ワクチニア欠損接合部での過剰のDNAを除去するために、プラスミドpMP581CKをワクチニア配列内のNco I部位(位置18,811;19,655)で切断し、Bal31エキソヌクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドMPSYN233(配列認識番号36)5′−TGTCATTTAACACTA−TACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT−3′を用いた突然変異誘発(マンデック、1986)を施した。生成したプラスミドpMPCSK1Δは、12ワクチニア読み取り枠[C7L−K1L]を包含するワクチニア配列位置18,805−29,108が欠損している。pMPCSK1Δと、ワクチニア組換体vP784を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えにより、ワクチニア欠損変異体vP804が産生され、そのvP804は、X−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
大ユニットのリボヌクレオチド還元酵素(I4L)が欠損したプラスミドpSD548の構成
ここで第14図を参照する。プラスミドpSD405はpUC8内にクローンされたワクチニアHind III I(位置63,875−70,367)を含有している。pSD405をワクチニア配列内のEcoR V(位置67,933)およびpUC/ワクチニア接合部でのSma Iで切断して連結し、プラスミドpSD518を産生した。pSD548の構成に用いた全てのワクチニア制限断片の供給源としてpSD518を用いた。
ワクチニアI4L遺伝子は位置67,371−65,059に亘る。I4Lの転写方向を第14図中の矢印により示す。I4L暗号配列の部分が欠損したベクタープラスミド断片を得るために、pSD518をBamH I(位置65,381)およびHpa I(位置67,001)で切断し、E.coliポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端とした。この4.8kbのベクター断片を、ワクチニア11kDaプロモーター(バートレットら、1985;パーカスら、1990)の制御下でE.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子(シャピラら、1983)を含有する3.2kbのSma Iカセッテに連結して、プラスミドpSD524KBGを産生した。pSD524KBGは、ワクチニアウイルスvP804による組換えの供与体プラスミドとして用いた。I4L遺伝子が部分的に欠損したベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルス、vP855を、X−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
ベータガラクトシダーゼおよびvP855からのI4L ORFの残留物を除去するために、欠損プラスミドpSD548を構成した。左右のワクチニア側腹アームを、前述したようにpUC8中に別々に組み立て、第14図中に模式的に示した。
左ワクチニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、pUC8をBamH I/EcoR Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド518A1/518A2(配列認識番号37/配列認識番号38)
と連結し、プラスミドpSD531を産生した。pSD531をRsa I(部分的)およびBamH Iで切断し、2.7kbのベクター断片を単離した。pSD518をBgl II(位置64,459)/Rsa I(位置64,994)で切断し、0.5kbの断片を単離した。2つの断片をともに連結し、pSD537を産生し、このpSD537はI4L暗号配列の左側に完全なワクチニア側腹アーム含有する。
右ワクチニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、pUC8をBamH I/EcoR Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド518B1/518B2(配列認識番号39/配列認識番号40)
と連結し、プラスミドpSD532を産生した。pSD532をRsa I(部分的)/EcoR Iで切断し、2.7kbのベクター断片を単離した。pSD518をワクチニア配列内のRsa I(位置67,436)およびワクチニア/pUC接合部のEcoR Iで切断し、0.6kbの断片を単離した。2つの断片をともに連結し、pSD538を産生し、このpSD538はI4L暗号配列の右側に完全なワクチニア側腹アーム含有する。
右ワクチニア側腹アームをpSD538からの0.6kbのEcoR I/Bgl II断片として単離し、EcoR I/Bgl IIで切断したpSD537ベクタープラスミドに連結した。生成したプラスミド、pSD539において、I4L ORF(位置65,047−67,386)はポリリンカー領域と置き換えられ、その領域には、全てpUCを背景として、左側に0.6kbのワクチニアDNAを、右側に0.6kbのワクチニアDNAをその側腹に有する。ワクチニア配列内の欠損部位を第14図中の三角形で示す。pSD539のpUC誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクチニアウイルスvP855中のベータガラクトシダーゼ配列との起こり得る組換えを避けるために、ワクチニアI4L欠損カセッテをpSD539から取り出してpRC11中に組り込み、このpRC11は全てのベータガラクトシダーゼ配列が除去されたpUC誘導体であり、ポリリンカー領域により置き換えられる(コリナスら、1990)。pSD539をEcoR I/Pst Iで切断し、1.2kbの断片を単離した。この断片をEcoR I/Pst Iで切断したpRC11(2.35kb)に連結し、pSD548を産生した。pSD548とワクチニア組換え体、vP855を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換え体により、ワクチニア欠損変異体vP866が産生され、このvP866はX−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
組換えワクチニアウイルスvP866からのDNAを、制限切断により分析し、次いでアガロースゲルの電気泳動を行なった。制限模様は予期したものであった。テンプレートとしてvP866を用いたポリメラーゼ鎖反応(PCR)(エンゲルケら、1988)および上述した6つの欠損座を側腹に有するプライマーは、予期したサイズのDNA断片を産生した。欠損接合部の区域の辺りのPCR産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであったことが確認された。譲受した6つの生成欠損を含有する組換えワクチニアウイルスvP866をワクチニアワクチン菌株「NYVAC」と称した。
実施例16−麻疹融合および血球凝集素糖タンパク質を発現するNYVAC−MV組換え体の構成
麻疹ウイルスMVのHAおよびFタンパク質(エドモンストン菌株)をコードする配列のcDNAコピーを、NYVAC中に挿入し、NYVAC−MV(vP913)と称する二重組換え体を産生した。組換え体は真正に、感染細胞の表面上に両方の麻疹糖タンパク質を発現した。イムノプレシピテーション分析は、FおよびHA糖タンパク質の両方の正確な処理方法を示した。組換え体はまた融合細胞形成を誘発することが分かった。
細胞およびウイルス
NYVAC−MVの産生に用いたレスキューイングウイルスは、NYVACと称するワクチニアウイルスの修飾コペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスが成長し、ベロ細胞単層上で滴定された。
プラスミドの構成
ここで第15図およびテイラーらの文献(1991)を参照する。プラスミドpSPM2LHAは、正確なATG配列に対するATGの関係に、前述したワクチニアウイルスH6プロモーターと連結した完全麻疹HA遺伝子を含有している(テイラーら、1988a,b;グオら、1989;パーカスら、1989)。1.8kbpのEcoR V/Sma I断片は、正確なATG:ATG配列の関係に、3′末端側の26bpが欠損したHA遺伝子と融合したH6プロモーターの3′末端側の24bpを含有する。この断片を、pSPMHA11の1.8kbpのEcoR V/Sma I断片(テイラーら、1991)を置き換えてpRW803を産生するのに用いた。プラスミドpRW803は、正確に完全な麻疹HA遺伝子に連結した完全なH6プロモーターを含有する。
プラスミドpSD513VCVQを、ポリリンカー配列の転化によりプラスミドpSD460から誘導した。ワクチニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損せしめられるようにプラスミドpSD460を誘導した(図9)。
麻疹ウイルスF遺伝子をHA挿入プラスミド中に挿入するために、pSPHMF7に操作を行なった。プラスミドpSPHM7(テイラーら、1991)は、前述したワクチニアウイルスH6プロモーターを3′の近位に有する麻疹F遺伝子を含有している。完全なATGに対するATG配列を達成し、プロモーターの3′末端と麻疹F遺伝子のATGとの間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドSPMAD(配列認識番号41)を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を行なった。
SPMAD:5′−TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT−3′
生成したプラスミドをpSPMF75M20と称した。
正確なATGに対するATGの配列の関係でH6プロモーターと現在連結している麻疹F遺伝子を含有するプラスミドpSPMF75M20を、Nru IとEag Iで切断した。生成した、H6プロモーターの3′末端側の27bpおよび完全な融合細胞を含有する1.7kbpの鈍端断片を単離し、Nru IとXba Iで切断し、鈍端とした中間プラスミドpRW823中に挿入した。Sma Iでの切断によりH6/麻疹FカセッテをpRW841から除去し、生成した1.8kb断片をpRW843(麻疹HA遺伝子を含有する)中に挿入した。最初にプラスミドpRW843をNot Iで切断し、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。それゆえ、生成したプラスミドpRW857は、尾対尾の配列で連結した麻疹ウイルスFおよびHA遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワクチニアウイルスH6プロモーターに連結される。
NYVAC−MVの発達
前述したリン酸カルシウム沈殿法(パニカリら、1982;ピッチーニら、1987)を用いることにより、プラスミドpRW857をNYVAC(vP866)感染ベロ細胞中にトランスフェクションした。特定のMV FおよびHA放射線標識プローブに対する現場でのプラーク雑種形成に基づいて、陽性のプラークを選択し、選択したプラークについて、純粋な固体群が達成されるまで、6回連続でプラーク精製を行なった。次いで1つの代表のプラークを増幅し、生成した組換え体をNYVAC−MV(vP913)と称した。
免疫蛍光法
前述したように間接免疫蛍光法を行なった(テイラーら、1990)。使用した単特異性試薬は、家ウサギに麻疹FまたはHA遺伝子を発現するカナリヤポックス組換え体を接種することにより産生した血清であった。
イムノプレシピテーション
前述したようにモルモット抗麻疹血清(ウィタッカーM.A.バイオプロダクツ、ウォーカースビル、MD)を用いてイムノプレシピテーション反応を行なった。
細胞融合実験
60mmの皿中のベロ細胞単層を、多数の、細胞当たり1pfuの親または組換えウイルスで接種した。37℃での1時間の吸収後に接種物を除去し、重層媒質を置き換え、皿を37℃で1晩接種した。感染20時間後、皿を検査した。
麻疹ウイルスFおよびHA遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを確認するために、麻疹FまたはHA遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体に対する家ウサギ中に産生された単特異性血清を用いて間接免疫蛍光法分析を行なった。その結果、FおよびHA遺伝子産生物が、両単特異性血清での強い表面蛍光により示されるように、感染細胞表面上に発現されたことが示された。親NYVAC菌株を接種した細胞の血清のいずれかに関して明確である背景の染色はなく、単特異性血清がHAまたはF遺伝子のいずれかを発現するワクチニア単組換え体に対して試験された場合、交差反応染色はない。
NYVAC−MVにより発現されたタンパク質が麻疹ウイルス特異血清で免疫反応性であり、感染細胞中で真正に処理されたことを示すために、イムノプレシピテーション分析を行なった。ベロ細胞単層に、多様な、10pfu/細胞35S−メチオニンの存在下で親または組換え体ウイルスを接種した。イムノプレシピテーション分析は、それぞれ44kDaおよび23kDaの分子量を有する切断融合産生物F1およびF2並びに約76kDaのHA糖タンパク質を示した。未感染ベロ細胞または親細胞NYVACウイルスに感染した細胞中には、麻疹特異産生物が検出されなかった。
MV細胞変異性の特性は、感染細胞の周囲の感染または未感染細胞による融合により生じる融合細胞の形成と続いての融合細胞の中心に向かう核の移行である(ノービーら、1982)。これは、パラミクソウイルスにとって、HA特異ウイルス中和抗体中で生じ得る重要なウイルス展着法であることが示されている(マーツら、1980)。ワクチニアウイルス中で発現されたMVタンパク質が機能的に活性であることを確認するために、ベロ細胞単層に、NYVACおよびNYVAC−MVを接種し、細胞変異性効果についてその単層を観察した。感染後約18時間後に、NYVAC−MV感染ベロ細胞中で強い細胞融合活性が明白となった。親細胞NYVACに感染した細胞中では細胞融合活性は全く明白にはならなかった。
NYVAC−MV(vP913)を接種した家ウサギの血清の血清分析の結果
この研究において、2匹の家ウサギを皮下経路により1×108pfuのNYVAC−MV(vP913)を接種した。28日目にその動物に等量の追加抗原投与した。連続の出血を、プラーク還元法を用いてMV中和活性について分析した。結果を表13に示す。その結果は、いずれの家ウサギもNYVAC−MVの最初の接種には反応しなかったことを示している。しかしながら、2回目の接種後の鋭く立ち上がる反応は、動物が感作されたことを示す。両方の動物が防御範囲の中和抗原力価を達成した。
実施例14に示したALVAC−MV(vCP82)の免疫抗原性の体内分析は、ある範囲の種の接種において、組換え体は、標準血清試験で測定可能な血清反応を誘発できることを示している。達成された力価は、病気からの防御に必要とされる範囲内にある。NYVAC−MV(vP913)の家ウサギへの接種は同様に、防御的である麻疹ウイルス中和抗体の水準を誘発する。
Claims (4)
- カナリヤポックスウイルスゲノムの可欠領域中に麻疹ウイルスからのDNAを含有する組換えカナリヤポックスウイルスであって、前記DNAが、麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質、麻疹ウイルス融合糖タンパク質、および麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質と麻疹ウイルス融合糖タンパク質の組合せからなる群より選択される麻疹ウイルス糖タンパク質をコードし、かつ前記カナリヤポックスウイルスがALVACであることを特徴とする組換えカナリヤポックスウイルス。
- 前記DNAを発現させるプロモーターをさらに含有することを特徴とする請求項1記載の組換えカナリヤポックスウイルス。
- ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンであって、担体および請求項1または2記載の組換えポックスウイルスを含むことを特徴とするワクチン。
- イヌジステンパーに対してイヌを防御する方法であって、請求項1または2記載の組換えカナリヤポックスウイルスを前記イヌに接種する工程を含み、前記DNAが麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする方法。
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