JP4108742B2 - ポックスウイルス−イヌジステンパーウイルス（ｃｄｖ）組み換え体類および組成物類および前記組み換え体類を用いる方法 - Google Patents

ポックスウイルス−イヌジステンパーウイルス（ｃｄｖ）組み換え体類および組成物類および前記組み換え体類を用いる方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ポックスウイルス−イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）組換体類、特にＮＹＶＡＣ−ＣＤＶおよびＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ組換体類、前記組換体類からの発現産物類、ポックスウイルス−ＣＤＶ組換体またはそのような組換体からの発現産物を含む抗原性、免疫性またはワクチン組成物のような組成物類；前記ポックスウイルス−ＣＤＶ組換体を製造し使用する方法類；および前記組成物を製造し使用する方法類に関する。
下記の本文全体でさまざまな刊行物が引用されており、参考文献と見出しの付いた章においてこれらの刊行物の全文引用がなされている。下記の本文で引用された各刊行物は、本文で参考文献として引用している。
発明の背景
ワクシニアウイルスおよびさらに最近になっては他のポックスウイルスが、外来性遺伝子類の挿入および発現に使用されてきている。生きている感染性ポックスウイルスへの外来性遺伝子類の挿入の基本的技術では、ドナープラスミド中の外来性遺伝子要素に隣接するポックスＤＮＡ配列類とレスキューポックスウイルス中に存在する相同配列類の組換えを行う（Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８７）。
特に、組換えポックスウイルス類は、当該技術で公知でかつ本文でその開示を参考として引用した米国特許第４、７６９、３３０号、第４、７７２、８４８号、第４、６０３、１１２号、第５、１００、５８７号および第５、１７９、９９３号に記載のワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスのようなポックスウイルス類の合成組換体を調製する方法類と同様の２段階で構築される。
まず第１に、前記ウイルスに挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に、ポックス以外に由来するオープンリーディングフレームを、前記ポックスウイルスのＤＮＡの１部分に相同のＤＮＡを挿入したＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築体中に入れる。これとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を、プロモーターに連結する。プロモーター−遺伝子連結物を前記プラスミド構築体中に位置させ、非必須座を含むポックスＤＮＡの１領域に隣接するＤＮＡ配列に相同のＤＮＡをこのプロモーター−遺伝子連結物の両端で隣接させるようにする。生成したプラスミド構築体をその後、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内部で増殖によって増幅させ（Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９７２）、単離する（Ｃｌｅｗｅｌｌら、１９６９；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。
第２に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離したプラスミドを、ポックスウイルスとともに、例えばニワトリ胚線維芽細胞のような細胞培養物中に移入する。前記プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムの組換えは、それぞれ、そのゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡ配列が存在することによって改変されたポックスウイルスを提供する。「外来性」ＤＮＡという用語は、遺伝子を入れるゲノムによっては本来産生されない遺伝子産物をコードしている外来性ＤＮＡ特にポックス以外に由来するＤＮＡを意味する。
遺伝子組換えとは、通常、ＤＮＡの２本の鎖間でのＤＮＡの相同性部分の交換である。あるウイルス類では、ＲＮＡがＤＮＡに取って代わることもある。核酸の相同性部分とは、同一配列のヌクレオチド塩基類を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）部分である。
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内部で新規ウイルスゲノム類の複製または生成の間に自然にも起こることがある。したがって、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２種以上の異なるウイルス類または他の遺伝的構築体に同時感染した宿主細胞中で起こるウイルス複製サイクルでも起こりうる。第１ゲノム由来ＤＮＡ部分は、第１ウイルスゲノムのそれにＤＮＡが相同の第２同時感染ウイルスのゲノム部分を構築する際に、交換可能なように用いられる。
しかし、また、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡ部分間でも組換えは起こりうる。もしこのような第１ゲノム由来の１部分が、例えば相同ＤＮＡのある部分に挿入された遺伝子マーカーまたは抗原決定基をコードする遺伝子のその第１領域内部における存在を除いて、別のゲノムの１部分に相同であるならば、組換えがそれでもなお起こり得、その際、この組換え産物は、組換えウイルスゲノム中におけるその遺伝マーカーまたは遺伝子の存在によって検出可能である。組換えワクシニアウイルス産生のための他の手段も最近報告されている。
改変された感染性ウイルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるには、２つの条件が必要となる。まず第一に、改変されたウイルスを生きたままとするため、このウイルスの非必須領域中に挿入を行わなければならない。挿入ＤＮＡ発現のための第２の条件は、挿入ＤＮＡとの適切な関係にあるプロモーターが存在することである。このプロモーターは、発現されるＤＮＡ配列の上流に位置するように、入れなければならない。
ワクシニアウイルスは、１９８０年に天然痘が世界中から撲滅されるようになるまで天然痘に対して免疫するために使用され、成果を上げてきた。その歴史的経緯の中で、多くのワクシニア株類が生じてきた。これらの異なる株類は、さまざまな免疫原性を示し、程度の異なる潜在的合併症に関連づけられており、その最も重篤なものは、ワクチン接種後の脳炎と全身性痘疹である（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ、１９８３）。
天然痘撲滅とともに、ワクシニアの新しい役割が重要となり、すなわち、外来性遺伝子類の発現のための遺伝子工学によるベクターのそれである。膨大な数の非相同抗原類をコードする遺伝子類がワクシニアにおいて発現されており、しばしば、対応する病原体による投与に対する防御免疫が生じた（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９０、１９９３ａにおいてレビュー）。
ワクシニアベクターの遺伝的バックグランドから、発現された外来性免疫原の防御効果に影響を及ぼすことが明らかにされている。たとえば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０のワクシニアウイルスＷｙｅｔｈワクチン株中における発現は、ＥＢＶ誘発リンパ腫に対してコットントップタマリン類を保護せず、一方、ワクシニアウイルスのＷＲ実験室株における同一遺伝子の発現は防御性であった（Ｍｏｒｇａｎら、１９８８）。
ワクシニアウイルスをベースとした組換えワクチン候補の効果と安全性の微妙なバランスが極めて重要である。この組換えウイルスは、ワクチン接種した動物において防御性免疫応答を惹起するがいかなる重大な病原性も有していないように免疫原（類）を提供しなければならない。したがって、ベクター株の弱毒化は、現在の技術水準に勝る極めて望ましい進歩である。
組織培養におけるウイルスの増殖に非必須でありかつその欠失または不活化は種々の動物系で毒性を低下させるいくつかのワクシニア遺伝子が確認されている。
このワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子がマッピングされており（Ｈｒｕｂｙら、１９８２）、配列決定されている（Ｈｒｕｂｙら、１９８３；Ｗｅｉｒら、１９８３）。前記チミジンキナーゼ遺伝子の不活化または完全欠失は、組織培養中の広範囲の細胞においてワクシニアウイルスの増殖を抑制しない。ＴＫ-ワクシニアウイルスは、また、種々の宿主の接種部位において種々の経路で生体内で複製可能である。
単純ヘルペスウイルス２型について、モルモットの膣内ＴＫ-ウイルス接種は、ＴＫ+ウイルス接種の場合に比べて、脊髄におけるウイルス力価が有意に低いことが明らかにされている（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら、１９８５）。ヘルペスウイルスがコードしているインビトロＴＫ活性が活発に代謝中の細胞におけるウイルス増殖には重要ではないが、静止状態細胞中におけるウイルス増殖には必要であることが明らかにされている（Ｊａｍｉｅｓｏｎら、１９７４）。
脳内および腹腔内経路でマウスに接種したＴＫ-ワクシニアの弱毒化が明らかとなっている（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８５）。弱毒化は、ＷＲ神経毒性実験室株およびＷｙｅｔｈワクチン株の両者について観察された。皮内経路で接種されたマウスにおいてＴＫ-組換えワクシニアは、親ＴＫ+ワクシニアウイルスと比較し、同等の抗ワクシニア中性化抗体類を産生し、このことは、この試験系ではＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に低下させないことを示唆している。ＴＫ-およびＴＫ+組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻腔内接種した後、脳を含む他部位へのウイルスの伝搬が有意に低下することが観察された（Ｔａｙｌｏｒら、１９９１ａ）。
ヌクレオチド代謝に関連するもうひとつの酵素は、リボヌクオチド還元酵素である。ラージサブユニットをコードする遺伝子の欠失による単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）におけるウイルスがコードしたリボヌクレオチド還元酵素活性の喪失は、ウイルス増殖およびインビトロ細胞分割におけるＤＮＡ合成に全く影響を有さないが、血清飢餓細胞におけるウイルスの増殖能を非常に低下させることが示された（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９８８）。眼の急性ＨＳＶ感染および三叉神経節における再活性化可能な潜伏感染マウスモデルを用いて、野生型ＨＳＶによる毒性に比較し、リボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットを欠失したＨＳＶについて毒性の低下が明らかとされた（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、１９８９）。
リボヌクレオチド還元酵素のスモールサブユニット（Ｓｌａｂａｕｇｈら、１９８８）およびラージサブユニット（Ｓｃｈｍｉｄｔｔら、１９８８）が、ワクシニアウイルスで同定されている。マウスの頭蓋内接種で測定したところ、ワクシニアウイルスＷＲ株へのリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットの挿入による不活化は、ウイルスの弱毒化を起こす（Ｃｈｉｌｄら、１９９０）。
ワクシニアウイルスの血球凝集素遺伝子（ＨＡ）がマッピングされ配列決定されている（Ｓｈｉｄａ、１９８６）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は組織培養における増殖に非必須である（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉら、１９７１）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子の不活化によって、頭蓋内経路で接種したウサギで神経毒性が低下し、さらに、皮内接種部位においてウサギで外傷が小さくなった（Ｓｈｉｄａら、１９８８）。このＨＡ座を、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Ｓｈｉｄａら、１９８７）、Ｌｉｓｔｅｒ株の派生体類（Ｓｈｉｄａら、１９８８）およびコペンハーゲン株（Ｇｕｏら、１９８９）への外来性遺伝子の挿入に使用した。外来性遺伝子類を発現する組換えＨＡ-ワクシニアウイルスは、免疫原性であり（Ｇｕｏら、１９８９；Ｉｔａｍｕｒａら、１９９０；Ｓｈｉｄａら、１９８８；Ｓｈｉｄａら、１９８７）および関連病原体による投与に対して防御性である（Ｇｕｏら、１９８９；Ｓｈｉｄａら、１９８７）ことが明らかとされている。
ウシポックスウイルス（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ赤株）は、ニワトリ卵の漿尿膜上に赤い（出血性の）痘疹を生ずる。ウシポックスゲノム内部での自然発生欠失は、白色痘疹を生ずる変異株類を生ずる（Ｐｉｃｋｕｐら、１９８４）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされる３８ｋＤａタンパク質までマッピングで示されている（Ｐｉｃｋｕｐら、１９８６）。この遺伝子はセリンプロテアーゼ阻害剤類に相同性を有し、ウシポックスウイルスに対する宿主炎症性応答を阻害することが示されており（Ｐａｌｕｍｂｏら、１９８９）、血液凝固阻害剤である。
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９ｂ）。外来性遺伝子の挿入によってｕ遺伝子が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換え体を接種したマウスは、ｕ遺伝子が未変化である同様の組換えワクシニアウイルスを接種したマウスと比較し、この外来性遺伝子産物に対して高い抗体レベルを生ずる（Ｚｈｏｕら、１９９０）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株中（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ，ｂに報告された用語定義によればオープンリーディングフレームＢ１３およびＢ１４）に欠陥のある非機能性形態で存在する。
ウシポックスウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）中において感染細胞に局在化する（Ｋａｔｏら、１９５９）。ＡＴＩ機能は、動物から動物への伝搬時においてウシポックスウイルス粒子の保護にあると考えられている（Ｂｅｒｇｏｉｎら、１９７１）。ウシポックスゲノムのＡＴＩ領域はＡＴＩ体のマトリックスを形成する１６０ｋＤａのタンパク質をコードする（Ｆｕｎａｈａｓｈｉら、１９８８；Ｐａｔｅｌら、１９８７）。ワクシニアウイルスはそのゲノム中に相同領域を含んではいるが、通常、ＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株では、ゲノムのＡＴＩ領域が９４ｋＤａタンパク質として翻訳される（Ｐａｔｅｌら、１９８８）。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株中では、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほとんどが欠失しており、この領域の残りの３’末端がＡＴＩ領域上流の配列に融合し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ、ｂ）。
種々の自然発生（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒら、１９８９；Ｄｒｉｌｌｉｅｎら、１９８１；Ｌａｉら、１９８９；Ｍｏｓｓら、１９８１；Ｐａｅｚら、１９８５；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８１）および工学的（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９１；Ｐｅｒｋｕｓら、１９８９；Ｐｅｒｋｕｓら、１９８６）欠失は、ワクシニアウイルスゲノムの左末端近傍にあると報告されている。１０ｋｂ自然発生欠失を有するワクシニアウイルスのＷＲ株は、マウスに頭蓋内接種すると弱毒化されることが示された（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８５）。この欠失は、後になって、１７個の潜在的ＯＲＦ類を含むことが示された（Ｋｏｔｗａｌら、１９８８）。この欠失領域内における特異的遺伝子類として、ビロカインＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ、ｂに報告された用語定義によればＣ３Ｌ）が含まれる。Ｎ１Ｌの挿入による不活化で、正常およびヌードマウスの両者に対する頭蓋内接種によって、毒性が低下する（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９ａ）。この３５ｋＤａタンパク質は、Ｎ１Ｌと同様、ワクシニアウイルス感染細胞の培地中に分泌される。このタンパク質は、補体対照タンパク質属、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）に相同性を有している（Ｋｏｔｗａｌら、１９８８）。ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は、細胞性Ｃ４ｂｐと同様、補体の第４成分を結合し、従来の補体カスケードを阻害する（Ｋｏｔｗａｌら、１９９０）。したがって、このワクシニア３５ｋＤａタンパク質が、このウイルスが宿主防御機構を回避するのを補助することに関連しているようである。
ワクシニアゲノムの左末端には、宿主範囲遺伝子類、Ｋ１Ｌ（Ｇｉｌｌａｒｄら、１９８６）およびＣ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０）として同定された２個の遺伝子類を含んでいる。これら遺伝子を両者ともに欠失すると、ワクシニアウイルスの種々のヒト細胞系統で増殖する能力を低下させる（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０）。
２個のその他のワクチンベクター系では、天然の宿主制限ポックスウイルス類であるアビポックスウイルス類を使用することが行われる。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）およびカナリアポックスウイルス（ＣＰＶ）の両者ともに遺伝子工学処理され、外来性遺伝子産物を発現する。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のアビポックス属のプロトタイプウイルスである。このウイルスは経済的に重要な家禽疾患の原因であるが、弱毒生ワクチン類の使用によって１９２０年代以降コントロールが良好に行われている。アビポックスウイルスの複製は鳥類種に限定されており（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、１９８２）、鳥類以外のヒトを含むいかなる種においても強い感染を起こすアビポックスについての報告は文献に示されていない。この宿主制限は、他の種に対するウイルス伝搬に対する固有の安全バリアを提供し、アビポックスウイルスをベースとしたワクチンベクター類が獣医学およびヒト適応において魅力ある物となる。
ＦＰＶは、家禽病原体由来の抗原発現ベクターとして有効に利用されてきた。毒性鳥類インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質は、ＦＰＶ組換体中で発現された（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ａ）。ニワトリおよび七面鳥にこの組換体を接種後、相同または非相同のいずれかの毒性生インフルエンザウイルス投与に対して防御性の免疫応答が誘発された（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ａ）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質類を発現するＦＰＶ組換体類も同様、開発された（Ｔａｙｌｏｒら、１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒら、１９９０）。
鳥類系に対してのＦＰＶおよびＣＰＶ複製についての宿主制限にも関わらず、これらのウイルス類に由来する組換体類は、非鳥類起源の細胞中において外来性のタンパク質類を発現することが見いだされた。さらに、上記組換えウイルス類は、外来性遺伝子産物に関する免疫応答を惹起することが示され、適当である場合には、対応する病原体による投与に対して防御を付与することが示唆された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３ａ、ｂ；Ｔａｙｌｏｒら、１９９２；１９９１ｂ；１９８８ｂ）。
イヌジステンパー（ＣＤ）は、イヌ類およびその他の肉食獣の高感染性の熱病性疾患である（Ｆｅｎｎｅｒらがレビュー、１９８７）。死亡率は高く、３０乃至８０％に及んでいる。生き残ったイヌは、永久的中枢神経障害を受けることが多い（Ｆｅｎｎｅｒら、１９８７）。同様に、麻疹ウイルス（ＭＶ）は、全身性大丘疹発生を特徴とする急性感染熱性疾患である。本疾患は、主に、小児が罹患する。ＣＤの確定病因は、パラミクソウイルス科の一員であるＣＤウイルス（ＣＤＶ）として公知のモルビリウイルス属による感染である。一般に、パラミクソウイルス類は、負の極性を有する１８−２０ｋｂ一重鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルス類である。このゲノムは、融合部（Ｆ）および血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）または血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質のいずれかを含む５−７個の構造タンパク質類をコードする。膜糖タンパク質血球凝集素（ＨＡ）は、血液凝集およびウイルスの宿主細胞への結合に関与し、さらに融合糖タンパク質（Ｆ）は、ウイルスと感染細胞間または感染細胞と隣接非感染細胞間の膜融合を起こす（Ｇｒａｖｅｓら、１９７８）。ＭＶゲノム中における遺伝子類の並び方順序は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９８５）およびＤｏｗｌｉｎｇら（１９８６）によって推定されている。ＭＶＨＡ遺伝子およびＭＶＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＡｌｋｈａｔｉｂおよびＢｒｉｅｄｉｓ（１９８６）およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９８６）によって、それぞれ、決定されている。ＣＤＶの場合、ＦおよびＨＡ糖タンパク質の両者が、ウイルスエンベロープ中および感染細胞表面に存在することが見いだされている。
他のモリブリウイルス類、特に麻疹ウイルスによる分析から推定して、ＣＤＶＦおよびＨＡ糖タンパク質類は、ＣＤＶ感染性とその免疫生物学に重要であると考えられる（Ｄｉａｌｌｏがレビュー、１９９０）。麻疹ウイルスによる研究から、ＨＡおよびＦタンパク質類が、中性化抗体類を誘発することが確認された（Ｎｏｒｒｂｙら、１９７５）。さらに、麻疹ＨＡまたはＦ単独または同時に発現させるポックスウイルスをベースとした組換体類は、ＭＶ脳炎に対してマウスに防御性免疫応答を惹起し（Ｄｒｉｌｌｉｅｎら、１９８８；Ｗｉｌｄら、１９９０）、致死的ＣＤＶ投与に対してイヌに防御性免疫応答を惹起する（Ｔａｙｌｏｒら、１９９１ｄ；Ｔａｙｌｏｒら、１９９２）ことが示された。特にＣＤＶに対して、精製Ｆタンパク質は、イヌにおいてＣＤＶ投与に対する防御を付与することが示されている（Ｎｏｒｒｂｙら、１９８６）。
ＣＤＶおよびＭＶは構造的に類似し、血清学的に近い関係を有している。免疫沈降研究では、ＭＶ抗血清が、全てのＣＤＶタンパク質類（Ｐ、ＮＰ、Ｆ、ＨＡおよびＭ）を沈降させるであろうと示している。対照的に、ＣＤＶ抗血清は、ＨＡ糖タンパク質を除くあらゆるＭＶタンパク質類を沈降させるであろう（Ｈａｌｌら、１９８０；Ｏｒｖｅｌｌら、１９８０；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら、１９７９）。この近接した血清学的関係と照らし合わせ、ＭＶによるワクチン接種がイヌにおけるＣＤＶ投与に対して防御を惹起するであろうということが以前に明らかになった（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、１９６０；Ｍｏｕｒａら、１９６１；Ｗａｒｒｅｎら、１９６０）。ＣＤＶに対する中性化抗体類が、ヒト抗ＭＶ血清で報告されている（Ａｄａｍｓら、１９５７；Ｉｍａｇａｗａら、１９６０；Ｋａｒｚｏｎら、１９５５；Ｋａｒｚｏｎ、１９６２）が、ＭＶに対する中性化抗体類はイヌ由来抗ＣＤＶ血清で見いだされていない（Ｄｅｌａｙら、１９６５；Ｋａｒｚｏｎ、１９６２；Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９６５）。
したがって、ＭＶ抗原類もしくは組換えポックスウイルスで発現されたＭＶ抗原類によるイヌの防御は、ＣＤＶ抗原類またはＣＤＶ抗原類を発現する組換えポックスウイルスに対する防御を教示もしないしまたは示唆することもない。実際、これまで、ＣＤＶ抗原類のコード配列およびＣＤＶ抗原類のコード配列を含む組換えポックスウイルスは公知でもないし示唆されてもいなかった。
現在、生の弱毒化ワクチン株類によるワクチン接種が、イヌのジステンパーをコントロールする効果的手段となっている。しかし、これらのワクチン株類の複製能に由来するワクチン関連合併症が、ワクチン接種動物で報告されている（Ｔｉｚａｒｄ、１９９０）。したがって、これまで教示も示唆されてもいないＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとしたＣＤＶおよび／またはＭＶ組換え体類が変化した生のＣＤＶまたはＭＶの環境中へのゆっくりとした導入を撲滅させる手段を付与し、一方、ＣＤＶまたはＭＶ遺伝子の発現に由来するその産物を発現させるための安全かつ有効な手段とおよび抗原性、免疫すなわちワクチン組成物を提供することが理解できる。
発明の目的および要約
したがって、本発明の目的は、安全性が高められた改変組換えウイルス類を提供すること、およびこのような組換えウイルス類の製造方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、公知の組換えポックスウイルスワクチン類または抗原性または免疫性組成物に比較して安全性が高い組換えポックスウイルス抗原性、免疫性またはワクチン組成物を提供することである。
さらに発明の目的は、宿主中において弱毒化された毒性を有するように改変された改変ベクターを前記宿主中において遺伝子産物を発現させるために提供することである。
また、本発明の目的は、安全性が高められた改変組換ウイルスまたは改変ベクターを用いて生体外培養細胞中において遺伝子産物を発現する方法を提供することである。
本発明のこれらおよびその他の目的および利点は、下記を考慮すればより容易に分かるであろう。
本発明は、一面において、組換えウイルスが弱毒化された毒性と高められた安全性を有するようにウイルスでコードされた遺伝的機能類を不活性化された前記改変組換えウイルスに関する。前記機能類は非必須であるかまたは毒性に関連していてもよい。前記ウイルスは、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルスのようなアビポックスウイルスであるのが好都合である。前記改変された組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域内に、例えばモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、好適にはＣＤＶまたはＭＶのような病原体由来の抗原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことができる。
本発明は、別の面では、抗原性または免疫組成物ワクチンを接種された宿主動物において抗原性反応を誘発するワクチンに関し、前記組成物には、担体、および、組換えウイルスが弱毒化された毒性と高められた安全性を有するようにウイルスでコードされた遺伝的機能類を不活性化された前記改変組換えウイルスが含まれる。ワクチン抗原性すなわち免疫組成物中に使用されるウイルスとして、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルスのようなアビポックスウイルスが好都合である。前記改変された組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域内に、例えばモルビリウイルス、好適にはＣＤＶまたはＭＶのような病原体由来の抗原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことができる。
本発明は、さらに別の面では、組換えウイルスが弱毒化された毒性と高められた安全性を有するようにウイルスでコードされた遺伝的機能類を不活性化された前記改変組換えウイルスを含む免疫組成物に関する。前記改変された組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域内に、例えばモルビリウイルス（好適にはＣＤＶまたはＭＶ）のような病原体由来の抗原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことができ、前記組成物を宿主に投与すると、前記病原体によってコードされたタンパク質に特異的な免疫応答を誘発できる。
さらに別の面では、本発明は、弱毒化された毒性と高められた安全性を有する改変組換えウイルスを生体外培養細胞中に導入することによって、前記細胞中に遺伝子産物を発現する方法に関する。前記改変された組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域内に、例えばモルビリウイルス、好適にはＣＤＶまたはＭＶのような病原体由来の抗原性タンパク質をコードする非相同ＤＮＡ配列を含むことができる。
さらに本発明は、別の面において、ウイルスが弱毒化された毒性を有するようにその内部でウイルスがコードしている非必須遺伝的機能類を不活性化させた改変組換えウイルスに関し、前記改変組換えウイルスがさらにウイルスゲノムの非必須領域中の異種起源由来のＤＮＡを含むことを特徴とする。前記ＤＮＡは、モルビリウイルス、好適にはＣＤＶまたはＭＶの抗原をコードし、より好適にはＣＤＶのＦおよび／またはＨＡ抗原類および／またはＣＤＶまたはＭＶのＭおよび／またはＮ抗原類をコードする。特に、前記の遺伝的機能類は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失することによってまたは自然の宿主制限ウイルス類を利用することによって、不活化される。本発明によって使用されるウイルスは、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルスのようなアビポックスウイルスであるのが好都合である。前記オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、および１４Ｌ（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ、ｂに報告された用語定義による）およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるのが好都合である。前記オープンリーディングフレームは、この観点から、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝子領域、またはリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニット、またはそれらの組み合わせからなる。前記ワクシニアウイルスの改変されたコペンハーゲン株は、ＮＹＶＡＣとして同定される（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９２）。
この抗原性、免疫すなわちワクチン組成物は、好適には、モルビリウイルス中性化抗体類、血球凝集素阻害抗体類および特にイヌにおいて、モルビリウイルス、特にＣＤＶに対する防御性免疫を惹起する。組換体類の発現産物およびそれによって惹起された抗体類は、試料中のＣＤＶまたはＭＶ存在または不在を調べるための結合アッセイに使用でき、前記組換体類由来のＤＮＡは、ＤＮＡプローブ類およびプライマー類の調製に使用できる。
本発明のその他の目的類および態様類は、下記の詳細な説明に開示されるかまたはそれから自明であろう。
【図面の簡単な説明】
例示のために示したが本発明を記載した特定の態様にのみ限定することを意図しているわけではない下記の詳細な説明は、付属の図面を参照すれば、さらに良く理解されるであろう。図面において、
第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６０の構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０産生方法を概略で示している。
第２図は、出血性領域欠失のためのプラスミドｐＳＤ４８６の構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３産生方法を概略で示している。
第３図は、ＡＴＩ領域欠失のためのプラスミドｐＭＰ４９４△の構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８産生方法を概略で示している。
第４図は、血球凝集素遺伝子欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６７の構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３産生方法を概略で示している。
第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＫ１Δの構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４産生方法を概略で示している。
第６図は、リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）産生方法を概略で示している。
第７図は、ＴＫ欠失座への狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子挿入のためのプラスミドｐＲＷ８４２の構築および組換えワクチニアウイルスｖＰ８７９産生方法を概略で示している。
第８図は、前記Ｃ５ ＯＲＦ含有カナリアポックスＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列（配列番号３９）を示している。
第９Ａおよび９Ｂ図は、組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）構築方法を概略示している。
第１０図はＮＹＶＡＣ産生のために欠失させたＯＲＦｓを概略示している。
第１１図は、Ｆ８ ＯＲＦ含有ＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示している。
第１２図は、Ｆ７ ＯＲＦ含有ＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡの２３５６塩基対断片のＤＮＡ配列（配列番号５１）を示している。
第１３Ａ図から１３Ｄ図までは、狂犬病中性化抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）、同一または別のワクチンのいずれかで先に免疫した志願者におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０5.5ＴＣＩＤ５０）のブースター効果のグラフを示している（ワクチンは、第０日、２８日および１８０日に投与し、抗体力価は、第０日、７日、２８日、３５日、５６日、１７３日、１８７日および２０８日に測定した）。
第１４Ａ−Ｄ図は、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ ＨＡおよびＣＤＶ ＨＡ翻訳のヌクレオチド配列を示している（配列番号８３）。
第１５Ａ−Ｄ図は、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ ＦおよびＣＤＶ Ｆ翻訳のヌクレオチド配列を示している（配列番号８６）。
第１６Ａ−Ｇ図は、Ｈ６でプロモートされたイヌジステンパー（ＣＤＶ）ウイルスＦ、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ ＨＡ、Ｉ４Ｌ隣接ＮＹＶＡＣ配列類、およびＣＤＶオープンリーディングフレームの翻訳物のプラスミドｐＭＭ１２６由来ヌクレオチド配列を示している（配列番号９１、９２）。
第１７Ａ−Ｇ図は、Ｈ６でプロモートされたイヌジステンパー（ＣＤＶ）ウイルスＦ、Ｈ６でプロモートされた促進ＣＤＶ ＨＡ、Ｃ６隣接ＡＬＶＡＣ配列類、およびＣＤＶオープンリーディングフレームの翻訳物の推定ヌクレオチド配列を示している（配列番号９３、９４）。
第１８図は、ＣＤＶ Ｎ遺伝子のヌクレオチド配列を示している（配列番号１２５）。
第１９図は、ＣＤＶ Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を示している（配列番号１３０）。
第２０図は、ＭＶ Ｎ遺伝子のヌクレオチド配列を示している（配列番号１３４）。および、
第２１図は、ＭＶ Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を示している（配列番号１３９）。
発明の詳細な説明
新規ワクシニアワクチン株ＮＹＶＡＣ（ＶＰ８６６）を開発するため、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株を、公知であるかまたは潜在的な毒性因子類をコードするゲノムの６個の非必須領域の欠失によって改変した。下記に、連続的な配列欠失を詳細に示す。ワクシニア制限断片類、オープンリーディングフレーム類およびヌクレオチド位置の全ての名称は、Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ、ｂに報告された用語定義に基づいている。
また、欠失座は、外来性遺伝子の挿入用レシピエント座として遺伝子工学で製造した。
ＮＹＶＡＣに欠失している領域を下記に列挙した。また、欠失領域の略称およびオープンリーディングフレーム名称（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０ａ、ｂ）および特定された欠失による全ての欠失体を含むワクシニア組換体（ｖＰ）の名称を列挙した。
（１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（２）出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（３）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（４）血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（５）宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
（６）ラージサブユニット、リボヌクレオチド還元酵素（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）
ＮＹＶＡＣは、毒性および宿主範囲に関連する遺伝子産物をコードする１８個のオープンリーディングフレーム類を特異的に欠失することによって産生された遺伝子工学産物のワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは、ｉ）マウス新生児に頭蓋内接種した後の毒性低下、ii）遺伝的（ｎｕ+／ｎｕ+）または化学的（シクロホスファミド）免疫不全マウスにおける接種可能性（ｉｎｏｃｕｉｔｙ）、iii）免疫不全マウスに汎発性感染を起こさないこと、iv）ウサギ皮膚における顕著な硬化および潰瘍の欠如、v）接種部位からの迅速な消失、および、vi）ヒト由来のものも含めていくつかの組織培養細胞株における極めて低下した複製能力、を含むいくつかの基準によって、顕著に弱毒化される。にもかかわらず、ＮＹＶＡＣをベースとするベクター類は、外来性免疫原に対して良好な応答を誘発し、防御免疫を付与した。
ＴＲＯＶＡＣとは、ニワトリポックスウイルスのＦＰ−１ワクチン株から誘導したプラーククローン化単離体である弱毒化ニワトリポックスを称し、１日齢のニワトリのワクチン用に許可されている。ＡＬＶＡＣは、許可カナリアポックスワクチンであるＫａｎａｐｏｘ（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９２）のプラーククローン化誘導体である弱毒化カナリアポックスウイルスをベースにしたベクターである。ＡＬＶＡＣは、Ｋａｎａｐｏｘのいくつかの一般的特性と同様のいくつかの一般的特性を有している。また、ＡＬＶＡＣをベースとし外来性免疫原を発現する組換えウイルス類は、また、ワクチンベクター類として有効であることが明らかとなっている（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３ａ、ｂ）。このアビポックスウイルスは、繁殖性複製が鳥類に限定されている。ヒト細胞培養では、カナリアポックスウイルス複製は、ウイルスＤＮＡ合成前にウイルス複製サイクルにおいて初期に中断される。にもかかわらず、外来性免疫原を発現させるために遺伝子工学に操作すると、ほ乳類細胞においてインビトロで実際の発現とプロセッシングが観察され、多数のほ乳類種への接種がこの外来性免疫原に対して抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同系の病原体による投与に対して防御を付与する（Ｔａｙｌｏｒら、１９９２；Ｔａｙｌｏｒら、１９９１ｃ）。欧州および米国における最近のカナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）のフェーズＩ臨床試験は、この実験的ワクチンのトレランスが良好で、防御レベルの狂犬病ウイルス中性化抗体力価を誘発した（Ｃａｄｏｚら、１９９２；Ｆｒｉｅｓら、１９９２）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧワクチン接種者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激した時有意レベルのリンパ球増殖を示した（Ｆｒｉｅｓら、１９９２）。
したがって、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、モルビリウイルス抗原類、特にＣＤＶ抗原類をコードするため、好適にはＣＤＶ Ｆおよび／またはＨＡおよび／またはＣＤＶまたはＭＶ Ｍおよび／またはＮをコードするための好適な挿入用ベクター類である。本発明による組換えポックスウイルスは、前記ワクチン、抗原性または免疫組成物類において、好適には、適切な担体、滅菌水のような希釈剤または賦形剤、生理食塩水、グルコース等との混合物である。
さらに一般的には、本発明の抗原性、免疫またはワクチン組成物類（本発明のポックスウイルス組換体類を含む組成物類）は、薬学または獣医学に熟練した者に周知の標準的技術によって調製できる。上記組成物類は、投与を必要とする動物またはヒト患者に対して、特定のヒトまたは動物患者の年齢、性、体重および状態のような要因および投薬経路を考慮しながら医学または獣医学技術に熟練した者に周知の技術によって、投薬で投与できる。
本発明の組成物類の例として、例えば口腔、鼻腔、肛門、膣等のような開口部投与用の懸濁剤、シロップ剤または内用液のような液体調製物、および非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例 注入可能な投与）のための無菌懸濁物またはエマルジョン等の調製物が挙げられる。このような組成物中において、前記組換えポックスウイルスは、滅菌水、生理食塩水、グルコース等の適切な担体、希釈剤または賦形剤、との混合物であることもできる。
免疫、抗原性またはワクチン組成物類のような本発明の組換えウイルス組成物類の投与手順は、非経口経路（皮内、筋肉内または皮下）であってもよい。このような投与は、全身免疫応答を可能とする。他の投与経路は、経口、鼻腔、肛門、膣等である。例えば組換えポックスウイルス感染食物のような可食物、または坐剤のような固化組成物類も同様、本発明の組成物類であり、獣医学および薬学技術で公知の技術によって調製される。
さらに、本発明の組換えポックスウイルス類の発現産物を直接用いて、ヒトまたは動物において免疫応答を刺激できる。したがって、発現産物は、上記組成物中における本発明の組換えポックスウイルスの代わりにまたはそれに追加して、本発明の組成物中において使用できる。
さらに、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれによる発現産物は、ヒトおよび動物において免疫すなわち抗原反応を刺激する。こうした抗体からまたは当該技術で周知の技術によって、モノクローナル抗体を調製でき、さらに、このモノクローナル抗体を周知の抗体結合アッセイ、診断キットまたは検査に用いて、特定モルビリウイルス抗原（類）の存在または不在およびそれゆえに前記ウイルスの存在または不在を調べ、または、前記ウイルスまたは抗原（類）に対する免疫応答が単に刺激されただけなのかを調べることができる。このモノクローナル抗体類を同様に免疫吸着クロマトグラフィに使用し、免疫不全ウイルスまたは本発明の組換えポックスウイルス発現産物を回収できる。
モノクローナル抗体類は、ハイブリドーマ細胞によって産生されるイムノグロブリンである。１個のモノクローナル抗体は単一の抗原決定基と反応し、従来の血清由来抗体よりも高い特異性を示す。さらに、多数のモノクローナル抗体類をスクリーニングすることで、所望の特異性、結合力およびイソタイプを有する個々の抗体を選択できる。ハイブリドーマ細胞系統は、化学的に同一の抗体類の安価な安定した供給源であり、上記抗体類の調製は、容易に標準化できる。モノクローナル抗体類調製方法は、当該技術に熟練した者に周知である。例えば、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｈ．ら、米国特許第４、１９６、２６５号、１９８９年４月１日発行を本文で参考として引用した。
モノクローナル抗体類の用途類は公知である。このようなひとつの用途は、診断方法にあり、例えば、Ｄａｖｉｄ、Ｇ．およびＧｒｅｅｎｅ、Ｈ．，米国特許第４、３７６、１１０号、１９８３年３月８日発行を本文で参考として引用した。モノクローナル抗体類はまた免疫吸着クロマトグラフィで物の回収に使用されてきた。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．，１９８０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、２４３：６６、７０を本文で参考として引用した。
さらに、本発明の組換体類に由来するＤＮＡをプローブとして用いて、当該技術で公知の方法によって、試料中モルビリウイルスＤＮＡの存在を検出でき、または、ＰＣＲプライマーを生成できる。
本発明の組換えポックスウイルスは、いくつかの用途を有している；血清陰性動物またはヒトへの投与のための抗原性、免疫すなわちワクチン組成物類として；インビトロにおいて、抗原性、免疫性またはワクチン組成物中においてまたは治療用組成物類中において使用可能な抗原類を産生すること；下記に使用できる抗体類を（直接投与によってまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産物の投与によって）産生すること；例えば血清のような試料中におけるモルビリウイルスの存在または不在を確認する等のためかまたはウイルス、または特定抗原（類）に対する免疫応答が惹起されたかどうかを調べるための、血清のような試料中における抗原類の存在または不在を確認するため診断、検査またはキットにおいて使用すること；または免疫吸着クロマトグラフィ中において使用すること。さらに、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのＤＮＡの産生またはＰＣＲプライマー調製のため。他の用途も同様に、本発明の態様のために存在している。
本発明およびその多くの利点についての理解は、例示のために示した下記の実施例から深まるであろう。
実施例
ＤＮＡクローニングと合成 プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に従って増殖させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。制限エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手した。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０ＢＤＮＡ合成装置により前述のように調製された（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＤＮＡシークエンスはジデオキシチェーン終結法により（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７）Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を用いて前述のとおり行った（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。配列確認のためのＤＮＡの複製連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて自動化Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った。過剰のＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続くＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定分解および合成ヌクレオチドを用いた突然変異（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）によりプラスミド中から除去した。
細胞、ウイルス、および形質導入 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。組換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのインサイチュハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。組換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのインサイチュハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
親カナリアポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞において２００回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは寒天の下で４回の連続的プラーク精製にかけられ、１つのプラークは５回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後一日のニワトリのワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスかさぶたとして得られた。このウイルスはニワトリ受精卵中で約５０回連続継代され続いてニワトリ胚繊維芽細胞において２５回継代された。このウイルスは４回の連続的プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体がさらに初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名され、ストックウイルスとされた。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターおよびその派生体は以前に記述されたように増殖された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＶＥＲＯ細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は以前に記述されたように増殖された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。
実施例１ チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６０の構築
今、図１を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含んでいる。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断され、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵＣ８中にクローン化され、ｐＳＤ４４７となった。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）全体の遺伝子を有している。開始コドンはＮｌａＩＩＩサイト内部に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩサイト内部に含まれている。転写方向は図１中に矢印で示されている。
左側の隣接アーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｍ）を得るため、０．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、続いてＮｌａＩＩＩで消化し、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号１／配列番号２）
Figure 0004108742
を０．５ｋｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８中へ連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を生成した。
ワクシニア右隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含む制限酵素断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内部においてＳｓｐＩで（部分的に）、そしてＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分において消化し、２．９ｋｂｐのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号３／配列番号４）
Figure 0004108742
と連結し、ｐＳＤ４５９を創出した。
隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＤ４５９と連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を創出した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ−２との組換えのドナープラスミドとして用いた。ＭＰＳＹＮ４５（配列番号３）をテンプレートとして、および相補的な２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列番号５）（５’ ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ ３’）をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、32Ｐ標識されたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０がプラークハイブリダイゼーションにより同定された。
実施例２ 出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４８６の構築
今、図２を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩ Ｇ（位置１６０７４４−１７３３５１）を有している。ｐＳＤ４２２は、右側に近接したワクシニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ Ｊ（位置１７３３５１−１８２７４６）を有している。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２５４９−１７３５５２）を欠失させたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ４１９を左側隣接アームの源として、そしてｐＳＤ４２２を右側の隣接アームの源として用いた。領域ｕの転写方向は図２において矢印で示されている。
所望でない配列をｐＳＤ４１９から取り除くため、ＮｃｏＩサイト（位置１７２２５３）の左側の配列は、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４７６を生成した。ワクシニア右隣接アームは、ｐＳＤ４２２を、Ｂ１４Ｒの終止コドンでＨｐａＩで消化し、そして０．３ｋｂｐ右側をＮｒｕＩで消化して得た。この０．３ｋｂｐ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂｐのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７とした。ワクシニアｕ領域のｐＳＤ４７７の部分的欠失の位置は三角形で示した。残りのプラスミドｐＳＤ４７７中のＢ１３Ｒをコードしている領域配列を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列番号６／配列番号７）
Figure 0004108742
と連結させ、ｐＳＤ４７９とした。ｐＳＤ４７９は、ＢａｍＨＩサイトが続いている開始コドン（下線）を有している。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼをＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座中に、ｕプロモーターのコントロール下で配置するため、３．２ｋｂｐのベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）を含むＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩに挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧとした。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３は、色素基質Ｘ−ｇａｌ存在下でプループラークとして単離された。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠失されベータガラクトシダーゼで置換されていた。
ベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ５３３から取り除くため、ｐＳＤ４７７からの派生体でポリリンカー領域は含むが、ｕ欠失結合部分の開始コドンは有さないｐＳＤ４８６を用いた。第１に、前述のｐＳＤ４７７由来ＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列番号８／配列番号９）
Figure 0004108742
と連結させ、プラスミドｐＳＤ４７８とした。次にｐＵＣ／ワクシニア結合部分のＥｃｏＲＩサイトを、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊して、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ-とした。ｐＳＤ４７８Ｅ-をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列番号１０／配列番号１１）
Figure 0004108742
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６とした。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えにドナープラスミドとして用いて、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離されたｖＰ５３３を創出した。
実施例３ ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）欠失のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
今、図３を参照しているが、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ Ｂを含んでいる。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り除くため、ｐＳＤ４１４を、ＸｂａＩでワクシニア配列の内部（位置１３７０７９）で、ＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８３とした。Ａ２６Ｌ領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くため、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩで切断し（位置１４０６６５およびｐＵＣ／ワクシニア結合部分）、ライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８４とした。Ａ２６Ｌコード領域を除去するため、ｐＳＤ４８４はＮｄｅＩで（部分的に）Ａ２６ＬＯＲＦの僅かに上流を（位置１３９００４）、ＨｐａＩでＡ２６ＬＯＲＦの僅かに下流を（位置１３７８８９）切断した。５．２ｋｂｐのベクター断片を単離し、アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号１２／配列番号１３）
Figure 0004108742
と連結し、Ａ２６Ｌ上流領域を再構築し、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ制限酵素サイトを有する短いポリリンカー領域で、Ａ２６ＬＯＲＦを上記のように置換した。構築されたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトは固有ではないので、所望でないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトをｐＳＤ４８３（前述）から、ＢｇｌＩＩ（位置１４０１３６）、およびＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化することにより取り除いた。生成されたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来のＡ２６ＬＯＲＦを含む１．８ｋｂｐのＣｌａＩ（位置１３７１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９０４８）断片を、対応するｐＳＤ４８５由来の０．７ｋｂｐポリリンカーを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片で置換し、ｐＳＤ４９２を生成した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトは固有である。
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ５５３の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ５８１は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失領域内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１から除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号１４）
Figure 0004108742
を用いた突然変異により欠失させた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。生成されたプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいては、Ａ２６Ｌ ＯＲＦの全体を含む位置［１３７８８９−１３８９３７］を取り巻くワクシニアウイルスＤＮＡが欠失していた。ｐＭＰ４９４Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ５８１との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が、Ｘ−ｇａｌ存在下での透明プラークとして単離され、得られた。
実施例４ 血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６７の構築
今、図４を参照しているが、ワクシニアＳａｌＩ Ｇ制限酵素断片（位置１６０７４４−１７３３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ Ａ／Ｂ結合部分（位置１６２５３９）で交差している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩ Ｇ断片を有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図１３中に矢印で示されている。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｂから派生したワクシニア配列は、ｐＳＤ４１９をＨｉｎｄＩＩＩでワクシニア配列内部とｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成されたプラスミド、ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを、左に０．４ｋｂｐのワクシニア配列、右に０．４ｋｂｐのワクシニア配列と隣接した状態で有している。Ａ５６Ｒコード配列を、ｐＳＤ４５６をＲｓａＩで（部分的；位置１６１０９０）Ａ５６Ｒコード配列の上流を、またＥａｑＩで（位置１６２０５４）遺伝子の末端ちかくを切断することにより除去した。３．６ｋｂｐＲｓａＩ／ＥａｑＩベクター断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番号１５）ＭＰＳＹＮ６２（配列番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号１７）およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号１８）
Figure 0004108742
とライゲーションし、Ａ５６Ｒ ＯＲＦの上流域を再構築し、Ａ５６Ｒ ＯＲＦを上記のポリリンカー領域で置換した。その結果生成されたプラスミドはｐＳＤ４６６である。プラスミドｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は位置［１６１１８５−１６２０５３］を含んでいる。ｐＳＤ４６６中の欠失サイトは図４に三角形で示されている。
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７０８は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失部内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ配列を、ｖＰ７０８からドナープラスミドｐＳＤ４６７を用いて除去した。ｐＳＤ４６７は、ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化した後にＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションして、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩサイトがｐＵＣ／ワクシニア結合部分から取り除いてある以外はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、ｖＰ７２３が生成し、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離された。
実施例５ オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
今は、図５を参照しているが、以下のワクシニアクローンがｐＭＣＳＫ１Δの構築のために利用された。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８中にクローン化されたＫｐｎＩ Ｆである。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再び連結され、ｐＳＤ４５１となった。ｐＳＤ４５１中では、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ中のＳｐｈＩサイト（位置２７４１６）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローン化されたＨｉｎｄＩＩＩ Ｍである。
ワクシニア由来の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠失のための基質を供与するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアＭ２Ｌ欠失座に以下のように挿入された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩサイトを除去するために、プラスミドをワクシニア配列中（位置２８２１２）でＢｇｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩでｐＵＣワクシニア結合部分で切断し、続いて連結しｐＭＰ４０９Ｂとした。ｐＭＰ４０９Ｂを固有のＳｐｈＩサイト（位置２７４１６）で切断した。続いてＭ２Ｌコード配列を合成ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。
ＭＰＳＹＮ８２（配列番号１９）
Figure 0004108742
その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、Ｍ２Ｌ欠失座に上記のように挿入された固有のＢｇｌＩＩサイトを含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ（部分）／ＢｇｌＩＩカセットをｐＭＰ４０９ＤのＢｇｌＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧはレスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３の組換えにおいてドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７８４は、Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして単離された。
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドが、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、で切断されＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化されたｐＵＣ８中に集められた。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ配列からなる左隣接アームはｐＳＤ４２０をＸｂａＩで消化し（位置１８６２８）続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した後ＢｇｌＩＩで消化して（位置１９７０６）得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ配列からなる右隣接アームはｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９７７８）で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ中のＢｇｌＩＩサイト（位置１９７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ中のＢｇｌＩＩサイト（位置２９０６２）との間のワクシニア配列を欠失された。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠失サイトは図５において三角形で示されている。
ワクシニア欠失結合部位の過剰のＤＮＡを取り除くため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩサイト（位置１８８１１；１９６５５）で切断し、ＢａＩ−３１エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列番号２０）
Figure 0004108742
を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、ｐＭＣＳＫ１Δは、１２のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７−Ｋ１Ｌ］を含む位置１８８０５−２９１０８のワクシニア配列を欠失していた。ｐＭＣＳＫ１Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ７８４との組換えにより、ワクシニア欠失変異体、ｖＰ８０４が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
実施例６ リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築
今、図６を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｉ（位置６３８７５−７０３６７）を有している。ｐＳＤ４０５をＥｃｏＲＶでワクシニア配列内部（位置６７９３３）を、およびＳｍａＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラスミドｐＳＤ５１８とした。ｐＳＤ５１８はｐＳＤ５４８の構築において用いられた、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７３７１−６５０５９にわたっている。Ｉ４Ｌの転写方向は図６中で矢印によって示されている。Ｉ４Ｌコード配列部分を欠失させたベクタープラスミド断片を得るため、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５３８１）、およびＨｐａＩ（位置６７００１）で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した。この４．８ｋｂｐのベクダー断片は、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＳｍａＩカセットと連結され、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧとなった。ｐＳＤ５２４ＫＢＧを、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えでドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、ｖｐ８５５は、ベータガラクトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子部分欠失部位中に含み、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして得られた。
ベータガラクトシダーゼとＩ４Ｌ ＯＲＦの残りの部分をｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。左および右ワクシニア隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図６中に模式的に示されているようにｐＵＣ８中に集められた。
左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号２１／配列番号２２）
Figure 0004108742
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１とした。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分）およびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂｐの断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４４５９）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）で切断し、０．５ｋｂｐの断片を単離した。２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左の完全ワクシニア隣接アームを有するプラスミドｐＳＤ５３７とした。
右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号２３／配列番号２４）
Figure 0004108742
と連結させ、ｐＳＤ５３２とした。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂｐのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ＲｓａＩでワクシニア内部（位置６７４３６）を、ＥｃｏＲＩでワクシニア／ｐＵＣ結合を切断し、０．６ｋｂｐの断片を単離した。この２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むｐＳＤ５３８とした。
右ワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８由来の０．６ｋｂｐＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離され、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＳＤ５３７中へ連結された。その結果生成したプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４Ｌ ＯＲＦ（６５０４７−６７３８６）はポリリンカー領域で置換され、ポリリンカー領域は左で０．６ｋｂｐのワクシニア配列、右で０．６ｋｂｐのワクシニア配列と、すべてｐＵＣのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配列内部での欠失部位は、図６で三角形で示されている。組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列と、ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットがｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１へ移動され、ｐＵＣ派生体からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した（Ｃｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂｐ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂｐ）中へ挿入し、ｐＳＤ５４８とした。ｐＳＤ５４８とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ８５５との組換えの結果、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡを、制限酵素消化とそれに続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りのものであった。ｖＰ８６６をテンプレートとして、上に詳述された６欠失座に隣接するプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）により、期待されたサイズのＤＮＡ断片が生産された。ＰＣＲにより生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６は、上記の６つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡＣ」と命名された。
実施例７ 狂犬病糖タンパク質 Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）の支配下で狂犬病糖タンパク質 Ｇをコードしている遺伝子を、ＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除いてプラスミドｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
今、図７を参照しているが、ポリリンカー領域はｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（配列番号２５／配列番号２６）
Figure 0004108742
と連結することにより挿入され、ベクターｐＳＤ５１３を生成した。ｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）支配下の狂犬病糖タンパク質 Ｇを含むＳｍａＩ末端化１．８ｋｂｐのカセットと連結した。生成したプラスミドはｐＲＷ８４２と命名された。ｐＲＷ８４２はＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）との組換えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を、狂犬病糖タンパク質 Ｇに対する32Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された個体内でのランナウェイ感染（ｒｕｎａｗａｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を有利に減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境への汚染を減少もさせる。
改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。
実施例８ ニューカッスル病ウイルスの融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築
本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターＴＲＯＶＡＣ、およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性ＮＤＶ株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）ベクターを構築した。創出された組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶは実際にプロセシングされたＮＤＶ糖タンパク質を、組換えウイルスを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後１日のニワトリへの接種により、それに続く毒性ＮＤＶ投与に対して防御する。
細胞とウイルス ＮＤＶテキサス株は短期潜伏性の株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡの調製は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＦＰＶウイルスのＦＰ−１と命名された株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶたとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽細胞で２５回の継代により弱毒化された。ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初期ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを生成するために用いられたストックウイルスは、プラーク単離体から初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられた。
ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築 ５’末端からの２２ヌクレオチドを除く全てのＦタンパク質をコードしている配列を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＮＤＶ８１（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）から切り出し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＥ１３とした。以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）は、ｐＣＥ１３をＳａｌＩで消化し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＥ１３中に挿入した。Ｈ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、続いてｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８とした。完全５’末端は、ｐＣＥ３８をＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列番号２７）およびＣＥ７６（配列番号２８）を挿入して生成し、ｐＣＥ４７を生成した。
Figure 0004108742
ＮＤＶ−Ｆの３’末端非コード領域を取り除くため、ｐＣＥ１３由来のＳｍａＩからＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩおよびＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＣＥ２３とした。非コード領域をｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩによる連続的消化により除去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列番号２９）およびＣＥ４３（配列番号３０）を続いて挿入しｐＣＥ２９とした。
Figure 0004108742
ＮＤＶ−Ｆ配列の３’末端を続いて、既にｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩ−ＳａｃＩサイトに挿入することによりＮＤＶ−Ｆの５’末端を有しているプラスミドｐＣＥ２０に挿入しｐＣＥ３２とした。ｐＣＥ２０の開発は以前にＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。
Ｈ６プロモーターおよびｐＣＥ４７に含まれているＮＤＶ−Ｆ５’配列を、ＰＣＥ３２に含まれている３’ＮＤＶ−Ｆ配列とを整列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩサイトへ挿入し、ｐＣＥ４９とした。Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆは続いてＯＲＦを除いたＦ８座（以下に記述）へ、ｐＣＥ４９由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片をｐＪＣＡ００２（以下に記述）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩサイトへ挿入することにより移し、ｐＣＥ５４とした。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分的にＢａｍＨＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６６（配列番号３１）およびＣＥ１６７（配列番号３２）を挿入することにより、ｐＣＥ５４へ転写終結シグナルを挿入し、ｐＣＥ５８とした。
Figure 0004108742
ＮＤＶ−Ｆ完全３’末端を、ｐＣＥ５４をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＣＥ１８２（配列番号３３）およびＣＥ１８３（配列番号３４）をプライマーとした複製連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。
Figure 0004108742
ＰＣＲ断片はＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩにより消化させ、ＨｐａＩおよび部分的にＰｖｕＩＩにより消化したｐＣＥ５８中へクローン化した。その結果生成されたプラスミドはｐＣＥ６４と命名された。ｐＣＥ６４由来の完全Ｈ６プロモーターおよびＦコード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩサイトにクローン化することにより、翻訳終結シグナルを挿入し、最終ＮＤＶ−ＦカセットであるｐＣＥ７１を生成した。プラスミドｐＲＷ８４６は実質的にｐＪＣＡ００２（以下に記述）と同一ではあるが、Ｈ６プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。ｐＲＷ８４６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターは除かれるが停止シグナルは手つかずで残る。
ＮＤＶ−ＨＮカセットの構築 プラスミドｐＲＷ８０２の構築は以前にＥｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。このプラスミドはワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３’末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列をｐＵＣ９ベクター中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５’末端を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶサイトに挿入しｐＲＷ８３０とした。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列番号３５）およびＣＥ１６３（配列番号３６）をｐＲＷ８３０に挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全３’末端を得て、最終ＮＤＶ−ＨＮカセットであるｐＣＥ５９を生成した。
Figure 0004108742
ＦＰＶ挿入ベクターの構築 プラスミドｐＲＷ７３１−１５は、ゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をコードしている。３６６０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖に関してヌクレオチド配列が決定された。ここでＦ８と名付けられたオープンリーディングフレームの限定が決定された。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８オープンリーディングフレームの全体は、ｐＲＷ７６１中のＸｂａＩサイトおよびＳｓｐＩサイトの間に含まれている。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組換えにおいてＦ８ＯＲＦを取り除く挿入プラスミドを創出するために、以下の工程が行われた。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで、部分的にＳｓｐＩで消化した。ゲルから単離された３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドをアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。
Figure 0004108742
このライゲーションの結果生成されたプラスミドはｐＪＣＡ００２と命名された。
ＮＤＦ ＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築 Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆカセット中に、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填したｐＣＥ５９由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＣＥ７１のＨｐａＩサイトへクローン化することにより挿入し、ｐＣＥ８０とした。プラスミドｐＣＥ８０は完全にＮｄｅＩで、部分的にＢｇｌＩＩで部分的に消化し、Ｆ８隣接アームに連結し、ともにＨ６プロモーターによって駆動されているＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含む４７６０ｂｐ断片を生成した。プラスミドｐＪＣＡ０２１は、ｐＲＷ７３１−１５由来の４９００ｂｐのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ+のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩに挿入することにより得られた。プラスミドｐＪＣＡ０２１を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片と連結し、ｐＪＣＡ０２４とした。プラスミドｐＪＣＡ０２４は、それ故、ＦＰＶ隣接アームの間に３’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を有している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されている。ＮＤＶ−Ｆ配列に近い右隣接アームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。ＮＤＶ−ＨＮ配列に近い左隣接アームは１７００ｂｐＦＰＶ配列からなる。
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発 プラスミドｐＪＣＡ０２４を、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初期ＣＥＦ細胞中に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて１つの代表プラークを増幅し、その結果得られたＴＲＯＶＡＣ組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）と命名された。
免疫蛍光 直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、およびモノ特異的試薬として、ＮＤＦ−ＶまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換体に対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。
イムノプレシピテーション イムノプレシピテーション反応を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）ＳＰＡＦＡＳ Ｉｎｃ．Ｓｔｏｒｒｓ，ＣＴより得たポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて行った。
ストックウイルスを、Ｆ８ＯＲＦのが欠失されていることを確認するためにインサイチュ プラークハイブリダイゼーションにより選別した。ＴＲＯＶＡＣゲノムへのＮＤＶ遺伝子の正確な挿入およびＦ８ＯＲＦの欠失は、サザンブロットハイブリダイゼーションによってもまた確認された。
ＮＤＶ感染細胞中では、Ｆ 糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性膜内外領域によって膜に固定され、プレカーサーＦ0の、２つのジスルフィド結合したポリペプチドＦ1およびＦ2への翻訳後の分解を必要とする。Ｆ0の分解は、与えられたＮＤＶ株の病原性の決定において重要であり（Ｈｏｍｍａ ａｎｄ Ｏｃｈｉａｉ，１９７３；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９７６；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０）、分解サイトのアミノ酸配列は、それ故にウイルスの毒性の決定に重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換体ｖＦＰ２９を生成したＮＤＶ−Ｆ配列中の分解サイトのアミノ酸は、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３９）（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を有し、これは毒性ＮＤＶ株で要求されると判明している配列（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｅｓｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＧｉｎｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）と一致していた。ＮＤＶ毒性株に感染した細胞中で合成されるＨＮ糖タンパク質は分解されていない７４ｋＤａの糖タンパク質である。例えばＵｌｓｔｅｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのような極端に無毒性の株は、活性化には分解を要求するＨＮ（ＨＮ0）をコードしている（Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されているかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の表面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供されていることを決定するために、ＦもしくはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が確認された。
イムノプレシピテーション実験を、親および組換えウイルスに感染させたＣＥＦ細胞の（35Ｓ）メチオニン標識破砕物を用いて行った。Ｆ1およびＦ2のグリコシル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ５４．７および１０．３ｋＤａである（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いたイムノプレシピテーション実験において、適当なサイズの融合特異的産物がＮＤＶ−Ｆ単独組換体ｖＦＰ２９（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換体ｖＦＰ９６から検出された。適切なサイズのＨＮ糖タンパク質もまたＮＤＶ−ＮＨ単独組換体ｖＦＰ４７（Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶから検出された。感染させなかった細胞、および親ＴＲＯＶＡＣを感染させたＣＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。
ＣＥＦ細胞においてＦおよびＨＮ糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供され、そこにおいてそれらはＮＤＶ免疫血清によって認識された。イムノプレシピテーション分析により、毒性株で要求されるようにＦ0タンパク質は正確にＦ1およびＦ2成分へと分解されることが示された。同じようにＨＮ糖タンパク質は組換体ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染させたＣＥＦ細胞中で正確にプロセシングされた。
以前の報告（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂ，ｃ；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）では、ＨＮもしくはＦのいずれかのみの発現で、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。ＳＶ５ウイルスはＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できるが、Ｆ糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。（Ｍｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合成分の不活性化によるものであると提案されている（Ｎｏｒｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中性化抗体の誘導に反応性である（Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、および両方の糖タンパク質は、独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を誘導できることが示されているが、最も効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タンパク質を発現しなくてはならないことが理解されている。
実施例９ 狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築
本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発およびその安全性と効率を記述する。
細胞とウイルス 親カナリアポックス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞上で２００回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは４回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、１つのプラーククローンがさらに５回の付加的な継代により増幅され、その後ストックウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
カナリアポックス挿入ベクターの構築 ８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ９中のＰｖｕＩＩサイトの間にクローン化し、ｐＲＷ７６４．５とした。この断片の配列を図８（配列番号３９）中の位置１３７２および２２５１の間に示す。Ｃ５と命名されたオープンリーディングフレームの限定が決定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置１６６から開始され、位置４８７で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干渉することなくＣ５の欠失がなされた。位置１６７から位置４５５までの塩基は配列（配列番号４０）
ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ
により置換された。この置換用配列はＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ挿入サイトおよび、それに続くワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼによって認識される翻訳停止および転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を有している。Ｃ５ ＯＲＦ欠失は以下に記述されるように行った。プラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、直線状産物を単離した。ＲｓａＩ直線状断片を再びＢｇｌＩＩで切断し、今、位置１５６から位置４６２へのＲｓａＩからＢｇｌＩＩへの欠失のあるｐＲＷ７６４．５断片を単離し、以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた：
（配列番号４１および４２）
Figure 0004108742
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングさせ、ｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに上記のように挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３１と命名された。
狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿入ベクターの構築 ｐＲＷ８３８の構築を以下に記述する。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンおよび狂犬病ＧのＡＴＧとオーバーラップしているが、これらをｐＵＣ９中にｐＲＷ７３７としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーター、ＮｒｕＩでの開始、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩを通ってそれに続くＢｇｌＩＩを含んでいる。
オリゴヌクレオチドＡからＥ（（配列番号４３）−（配列番号４７））の配列は：
Figure 0004108742
アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡからＥの配置は以下の通りである：
Figure 0004108742
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングさせ（９５℃、５分間、続いて室温まで冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）の１．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のためのベクターとして用い、ｐＲＷ７３９を生成した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯのＨｉｎｄＩＩＩサイトは狂犬病Ｇ遺伝子の翻訳開始コドンから８６ｂｐ下流にある。ＢｇＩＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒｕＩで切断し、完全にＢｇＩＩＩで切断し、以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｈ６プロモーターの３’末端を狂犬病Ｇ遺伝子全体を通して含んでいる１．７ｋｂｐのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＲＷ８２４のＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩサイトの間に挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３２と命名された。ｐＲＷ８２４への挿入によりＮｒｕＩのＨ６プロモーター５’を付加した。ｐＲＷ８２４の、ＳｍａＩが続いているＢａｍＨＩの配列は（配列番号４７）：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有している。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切り出した。１．８ｋｂｐｐＲＷ８３２のＳｍａＩ断片は、Ｈ６プロモートされた狂犬病Ｇを有しており、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩサイト中に挿入され、プラスミドｐＲＷ８３８を生成した。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発 プラスミドｐＲＷ８３８を、ＡＬＶＡＣを感染させた初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで６回の連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生成されたＡＬＶＡＣ組換体はＡＬＶＡＣ−ＲＧと命名された（ｖＣＰ６５）（図９Ａおよび９Ｂもまた参照されたい）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。
免疫蛍光 成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた初期ＣＥＦ細胞について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親ＡＬＶＡＣに感染させたものは検出されなかった。
イムノプレシピテーション 予め形成された初期ＣＥＦ単層、Ｖｅｒｏ（アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）およびＭＲＣ−５細胞（ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）を、１０ｐｆｕの親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧで放射性標識35Ｓ−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述されたように処理した（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。イムノプレシピテーションを、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約６７ｋＤａの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ＡＬＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。
連続継代実験 非鳥類種の範囲でのＡＬＶＡＣウイルスの研究においては、拡散的感染も明白な病気も観察されなかった（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ）。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適応しないようにするために、連続継代実験を行った。
２つのウイルス、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧを３種類の細胞系統で１０連続盲継代（ｂｌｉｎｄ ｐａｓｓａｇｅ）を行った：
（１）１１日経過白レグホン胚から調製された初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
（２）Ｖｅｒｏ細胞−アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の連続系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）；
（３）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）。
最初の接種は０．１ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで、一皿あたり２ｘ１０6の細胞を含む３枚の６０ｍｍのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、４０μｇ／ｍｌのＤＮＡ複製阻害剤シトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ）の存在下で接種した。１時間、３７℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、２つのディッシュ（試料ｔ０からｔ７）では５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ ＮＢＣＳで、第３のディッシュでは４０μｇ／ｍｌのＡｒａ Ｃを含む５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ ＮＢＣＳで（試料ｔ７Ａ）置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、試料ｔ０は−７０℃で凍結した。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間保温し、その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。
それぞれの細胞系統のｔ７試料の１ｍｌを希釈せずに、同じ細胞系統の３枚のディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供するため）に、そして１枚の初期ＣＥＦ細胞のディッシュに接種した。試料ｔＯ、ｔ７およびｔ７Ａを継代１として扱った。付加的なＣＥＦ細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。
この工程を１０回（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８回（Ｖｅｒｏ）の連続盲継代について繰り返した。試料は続いて３回凍結、融解させ、初期ＣＥＦ単層上での滴定によりアッセイした。
それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のＣＥＦ単層上のプラーク滴定により決定した。まとめた実験の結果を表１および２に示す。
結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧは両方ともＣＥＦ単層上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Ｖｅｒｏ細胞においては、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、そしてＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５細胞においては、同様の結果が明白となり、１継代の後はウイルスは検出されなかった。表５および６には４継代の結果のみを示したが、この一連の工程はＶｅｒｏについては８継代、ＭＲＣ−５については１０継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。
継代１においては、比較的高いレベルのウイルスが、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞のｔ７試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはｔ０試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保温されたｔ７Ａ試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類種細胞で７日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく残存ウイルスを示していることを表している。
アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの７日の回収物を許容的ＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られた時点、またＣＰＥが見られなかった場合は７日で回収した。この実験の結果を表３に示す。許容的細胞系統を通した増幅の後ですらも、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞は付加的な２継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、いずれのウイルスもＶｅｒｏもしくはＭＲＣ−５細胞中での増殖への適応は無かったことを示している。
マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）への接種 ４匹のＨＩＶ血清陽性マカクを最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧで表８に記述したように接種した。１００日後、これらの動物をブースター効果を決定するために再接種し、さらに付加的に７匹の動物をある投与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、５６℃、３０分間熱失活させた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて血清を分析した。
チンパンジーへの接種 ２匹の雄成チンパンジー（５０−６５ｋｇの体重範囲）を、１ｘ１０7ｐｆｕのｖＣＰ６５で筋肉内または皮下で接種した。動物は反応を観察し、ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）による抗狂犬病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から１３週間後に同じ投与量で再接種した。
マウスへの接種 マウスの群を５０−１００μｌの範囲の異なったバッチのｖＣＰ６５の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。１４日目に、１５−４３マウスＬＤ５０の狂犬病ウイルス毒性ＣＶＳ株を頭蓋内接種で投与した。マウスの生存を観察し、５０％防御率（ＰＤ50）を、接種後２８日に計算した。
イヌおよびネコへの接種 生後５ヶ月の１０匹のビーグル犬および生後４ヶ月の１０匹のネコに、６．７もしくは７．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下で接種した。４匹のイヌおよびネコには接種しなかった。動物から接種後１４および２８日に採血し、抗狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験で評価した。６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には接種後２９日に、３．７ｌｏｇ10マウスＬＤ50（イヌ）もしくは４．３ｌｏｇ10マウスＬＤ50（ネコ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。
リスザルへの接種 ４匹のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群に、３つのウイルス、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体、の１つを接種した。接種は、ケタミン麻酔（ｋｅｔａｍｉｎｅ ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）のもとで行った。各々の動物は同時：（１）２０μｌを右目の表面に傷付処理なしに点眼；（２）１００μｌを口内へいくつかの水滴として；（３）１００μｌを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の２つの皮内接種部位それぞれに；（４）１００μｌを右大腿部前方筋肉中に受け取った。
４匹の猿に各々のウイルスを、２匹はトータルで５．０ｌｏｇ10ｐｆｕ、２匹はトータルで７．０ｌｏｇ10ｐｆｕ接種した。動物から規則的な間隔で採血し、血清をＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて抗狂犬病抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した。最初の接種の６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを受け取った４匹の猿、最初にｖＣＰ３７を受け取った２匹の猿、最初にＡＬＶＡＣを受け取った２匹の猿に加えて接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ10ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下接種した。ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）により狂犬病中和抗体の存在について血清を観察した。
ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種 ウイルスが生産的に複製されない非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため、５つの細胞型、１つは鳥類種で４つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種された細胞は：
（ａ）Ｖｅｒｏ、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１；
（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒト胚肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１；
（ｃ）ＷＩＳＨ、ヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５；
（ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；および
（ｅ）初期ＣＥＦ細胞。
１１日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された２ｘ１０6の細胞の単層について以下に記述するように行った。
Ａ．ＤＮＡ分析の方法
３枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを５ｐｆｕ／細胞のウイルスで試験のもとで接種し、別の１つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおいた。１つのディッシュは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ）の存在下で保温した。３７℃、６０分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために２回洗浄した。培地（Ａｒａ Ｃが存在もしくは不在）は続いて置換された。１つのディッシュ（Ａｒａ Ｃ無し）からの細胞を、時間０の試料として回収した。残りのディッシュは、３７℃で７２時間保温し、そのとき細胞を回収しＤＮＡ蓄積分析に用いた。２ｘ１０6の細胞それぞれは、０．５ｍｌの４０ｍＭＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、３７℃で５分間保温した。等量の、４２℃で予め保温された１２０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも１５分固定化された。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッファー（１％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、２００ｍＭＥＤＴＡ）中で１２−１６分間５０℃で保温した。溶解バッファーを、続いて５．０ｍｌの滅菌０．５ｘＴＢＥ（４４．５ｍＭトリス−ホウ酸、４４．５ｍＭホウ酸、、０．５ｍＭＥＤＴＡ）で置換し、４℃で６時間にわたり３回ＴＢＥバッファーを交換して平衡化した。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞ＲＮＡおよびＤＮＡと分画した。電気泳動は２０時間にわたり１８０Ｖで５０−９０秒のランプで、１５℃、０．５ｘＴＢＥ中で行った。ＤＮＡはラムダＤＮＡ分子量スタンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドはエチジウムブロミド染色により可視化した。ＤＮＡは続いてニトロセルロース膜に移され、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製された放射性標識プローブで探索した。
Ｂ．ウイルス収量の評価
投入多重度を０．１ｐｆｕ／細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディッシュに接種した。感染後７２時間で、３回連続の凍結融解サイクルにより破砕した。ウイルス収量はＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
多重度１０ｐｆｕ／細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し、さらに付加的は１つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。１時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。３０分の期間の後に、この培地を２５μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含むメチオニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーＡ溶解バッファーを添加して溶解させた。イムノプレシピテーションを、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。
結果：ウイルス収量の評価 ０．１ｐｆｕ／細胞での接種後７２時間後の収量の滴定の結果を表５に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなされうる一方で、４つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方法では検出されなかったことを示唆している。
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析 生産的ウイルス複製の防御が、ＤＮＡ複製の前で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のＤＮＡを電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在を探索した。感染させなかった細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた時間０のＣＥＦ細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞、および４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞由来のＤＮＡは全て、いくらかの、恐らくは放射性標識ＡＬＶＡＣ ＤＮＡプローブの調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの混入によるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後７２時間のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をＤＮＡ合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった。Ｖｅｒｏ細胞中で生成された相当する試料では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた時間０のＶｅｒｏ細胞において、約３５０ｋｂｐのかすかなバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後７２時間には増幅されており、ウイルスの繁殖の増加とはならないＶｅｒｏ細胞において、いくらかのレベルのウイルス特異的ＤＮＡの複製が起こっていることが示唆された。ＭＲＣ−５細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下ではウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験を続いて付加的なヒト細胞系統、特にＷＩＳＨおよびデトロイト５３２細胞を含むように拡張した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性コントロールとして用意した。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種した、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２細胞のいずれにおいても、ウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界はまだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスＤＮＡ複製を3Ｈチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５について得られた結果を支持していた。
狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析 いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するため、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた、35Ｓ−メチオニン標識された鳥類および非鳥類細胞破砕物についてイムノプレシピテーション実験を行った。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いたイムノプレシピテーションの結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびデトロイト細胞中で６７ｋＤａの糖タンパク質のイムノプレシピテーションを示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていないか又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。
この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体は感染を開始しＨ６ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの転写制御のもとで外来遺伝子を発現することは可能であるが、ＤＮＡ複製を通した複製は進行せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Ｖｅｒｏ細胞中においては、いくらかのレベルでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積は見られたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はＤＮＡ複製の開始に先だって起こるが、その一方Ｖｅｒｏ細胞中では防御はウイルスＤＮＡ複製の開始に続いて起こることを示唆しているであろう。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いた同様の試験を行った。９つの異なったウイルス調製物（シードウイルスを１０連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を、６．７から８．４のｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍｌの感染力価の範囲で連続的に希釈し、５０から１００μｌの希釈液を４匹の生後６週間のマウスの足部に接種した。マウスに１４日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定により決定された１５から４３マウスＬＤ50を含む３００μｌの狂犬病ウイルスＣＶＳ株を投与した。ＰＤ50（５０％防御量）として表された能力を、投与後１４日に計算した。この実験の結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは一貫して、３．３３から４．５６、平均３．７３（標準偏差０．４８）のＰＤ50値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示された。この研究の拡散として、雄マウスを、６．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣを含む５０μｌのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋内に接種した。マウスを接種後１日、３および６日に犠牲にし、脳を取り除き、固定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は無いことが示された。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、１４の生後５ヶ月のビーグル犬の群および１４の生後４ヶ月のネコの群を試験した。それぞれの種の４匹の動物はワクチン接種されなかった。５匹の動物は６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を皮下で受け取り、５匹の動物は７．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を同じ経路で受け取った。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種されなかったまたは６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を受け取った動物に、接種後２９日目に３．７ｌｏｇ10マウスＬＤ50（イヌ、側頭中）または４．３ｌｏｇ10マウスＬＤ50（ネコ、首中）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験の結果を表７に示した。
いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な反応は見られなかった。６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で免疫化された５匹のイヌのうちの４匹は、ワクチン接種後１４日で抗体力価を有し、２９日には全てのイヌが有していた。全てのイヌは、対照の４匹中３匹を殺した投与に対して保護された。ネコにおいては、６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を受け取った５匹のうち３匹が、１４日に特異的抗体力価を有し、２９日には全てのネコが陽性であったが平均抗体力価は２．９ＩＵと低かった。全ての対照を殺した投与に対して５匹中３匹が生き残った。７．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で免疫化された全てのネコは１４日に抗体力価を有し、２９日には、相乗平均力価は８．１国際単位と計算された。
リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応を調べた。猿のグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在について血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、不利な反応はいずれの猿においても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚外傷から、皮下接種の後、接種後２日および４日のみに単離された。全ての検体７日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種された４匹の全ての猿が、ＲＦＦＩ試験で測定された抗狂犬病血清中性化抗体を生産した。最初の接種から約６ヶ月後、全ての猿および１匹の付加的な接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表８に示す。
狂犬病にかかったことのない５匹の猿のうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種後７日までに血清学的反応を生成した。接種後１１日までには、５匹の猿全てが検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした４匹の猿の、全てがワクチン接種後の３日と７日との間に顕著な血清中性化力価の増加を示した。この結果はリスザルのＡＬＶＡＣ−ＲＧでのワクチン接種は、不利な副作用を引き起こさず、初期中性化抗体反応が誘導されうることを示している。アムナネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）反応もまた再ワクチン接種で誘導される。ＡＬＶＡＣもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体への事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった。
ＨＩＶ−２血清陽性マカクのＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫的反応を評価した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中性化抗体の存在をＲＦＦＩ試験によって評価した。その結果は、表９に示されているが、皮下経路で接種されたＨＩＶ−２陽性動物は、抗狂犬病抗体を１回の接種の１１日後までに生成した。アムナネスティック反応が、最初の接種の約３ヶ月後に与えられたブースター接種の後で検出された。経口経路で組換体を受け取った動物においては反応は検出されなかった。加えて、一連の６匹の動物を、減少させた量のＡＬＶＡＣ−ＲＧで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された６匹の内の５匹が、接種後１４日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。ＨＩＶに事前にさらされたチンパンジーを、７．０ｌｏｇ10ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧで皮下もしくは筋内経路で接種した。接種後３ヶ月に、両方の動物を同じ方法で再接種した。結果を表１０に示す。
筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方のチンパンジーは最初の接種に１４日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反応が検出された。
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実施例１０ 狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）を用いたヒトの免疫化
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は実施例９および図９Ａおよび９Ｂで記述されたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を特定の病原体のない卵から派生した初期ＣＥＦ細胞中で増殖させた。細胞を多重度０．０１で感染させ、３７℃で３日間保温した。
ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破砕により得た；細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤（アミノ酸混合物）を加え、１回分の量ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安定剤中のウイルス懸濁液を１０倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減少してゆく３つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。
細胞基質、培地およびウイルスシードおよび最終産物の品質制御テストを、実験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましくない特徴は何も発見されなかった。
臨床前データ 生体外での研究により、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧの増殖を支持しないことが示された；一連の８（Ｖｅｒｏ）および１０（ＭＲＣ−５）盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中での増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を感染もしくは接種したヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫもしくはＥＢＶを形質転換したリンパ芽球細胞）の分析で、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはＤＮＡ合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスＤＮＡ複製に先だって行われることを示している。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効率は、動物における一連の実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類（乳児および成マウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスザル、アカゲザルマカク、およびチンパンジーに、１０5から１０8ｐｆｕの範囲にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内および皮内であったが、経口（サルおよびマウス）および頭蓋（マウス）内も用いられた。
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は乱切部位において「受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮内接種は、拡散せずに７−１０日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こした。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくない副作用は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種に続いて、齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス投与実験により、防御が立証された。
ボランティア ２５人の健康な、２０−４５歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの注入、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎表面抗原に対する血清陽性が含まれていた。
研究計画 参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチ番号Ｅ０７５１（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｓｅｒｕｍｓ ＆ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または研究用ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を割り当てた。
この試みは量増加研究と命名された。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチンの３つのバッチは、３つのグループのボランティア（グループＡ、ＢおよびＣ）に順番に、各々の段階の間に２週間の間隔を置いて用いられた。３つのバッチの濃度はそれぞれ、１０3.5、１０4.5、１０5.5組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）／投与量であった。
それぞれのボランティアは、同じワクチンを４週間の間隔をおいて三角筋領域に皮下で２投与量受け取った。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。
２回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチンの中程度の量を割り当てられたグループＢのボランティアは、少ない量を１時間前に接種され、大量を割り当てられたグループＣは、少量および中程度の量を１時間の間隔をおいて連続的に受け取った。
６ヶ月後、最も多い投与量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの受取人に、３回目の量のワクチンを要請した；彼らは無作為に、前回と同じワクチンを受け取るかまたは別のワクチンを受け取るようにされた。その結果、以下の免疫化の手順に相当する４種類のグループが形成された。１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
副作用の観察 全ての対象を注入後１時間観察し、次の５日間毎日再検査した。彼らは局所的および全体的反応を次の３週間記録するよう要請され、１週間に２回問診された。
実験室調査者 登録前およびそれぞれの接種後２、４および６日後の血液見本を得た。分析は、完全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセイを含んでいた。
抗体アッセイ 最初の注入の７日前および、研究の７、２８、３５、５６、１７３、１８７および２０８日に抗体アッセイを行った。
狂犬病に対する中性化抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｙａｅｇｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｎ Ｒａｂｉｓ中）を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ＥＬＩＳＡにより測定した。抗原である、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で破壊した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化された血清の希釈液を室温で２時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼで標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清で明らかとされた。この結果は４９０ｎｍの光学密度により表されている。
分析 ２５人の対象が登録され、研究を実行された。１０人の男性と１５人の女性で平均年齢は３１．９歳であった（２１から４８まで）。３人を除く全ての対象が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた；残りの対象の３人は典型的な傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。３人の対象は少量の実験用ワクチン（１０3.5、１０4.5ＴＣＩＤ50）の投与量で受け取り、９人の対象は１０5.5ＴＣＩＤ50の投与量で受け取り、１０人はＨＤＣワクチンを受け取った。
安全性（表１１） 最初のシリーズの免疫化の間、接種後２４時間以内に３７．７℃を超える熱が、１人のＨＤＣ受取人（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６５ １０5.5ＴＣＩＤ50の受取人（３８℃）において見られた。ワクチン接種に帰属される他の全体的反応はいずれの受取人においても観察されなかった。
局所的反応は皮下でＨＤＣワクチンを接種された受取人１０人中９人で見られ、ｖＣＰ６５の１０3.5、１０4.5、１０5.5ＴＣＩＤ50での受取人ではそれぞれ３人中０人、３人中１人および９人中９人であった。
圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常２４時間以内に沈静化し、７２時間以上は続かなかった。
血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無かった。
免疫反応；狂犬病に対する中性化抗体（表１２） 最初の注入から２８日後に全てのＨＤＣ受取人は防御的力価（０．５ＩＵ／ｍｌ以上）を有していた。これとは対照的に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の受取人は、グループＡおよびＢ（１０3.5、１０4.5ＴＣＩＤ50）では０人が、グループＣ（１０5.5ＴＣＩＤ50）では９人中２人のみがこの防御的力価に達していた。
５６日目（即ち第２の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の受取人のうち、グループＡでは３人中０人、グループＢでは３人中２人、およびグループＣでは９人中９人においてこの防御的力価が達成され、１０人のＨＤＣ受取人の全てにおいても保持されていた。
５６日の相乗平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣそれぞれにおいて０．０５、０．４７、４．４および１１．５ＩＵ／ｍｌであった。
１８０日には、全ての対象において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが、ＨＤＣ受取人１０人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）受取人９人中５人において最小防御力価である０．５ＩＵ／ｍｌより大きく残存していた；相乗平均力価はグループＨＤＣおよびグループＣで、それぞれ０．５１および０．４５ＩＵ／ｍｌであった。
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表１３） 観察された免疫化前力価は、高い力価を示した対象が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず、力価０．２２から１．２３Ｏ．Ｄ．単位で広く変化していた。免疫化前と２回目の免疫化後の力価との間での２倍より大きい増加と定義した場合、血清変換はグループＢでは対象３人中１人、グループＣでは対象９人中９人で得られたが、ＨＤＣまたはグループＡでは対象は１人も血清変換されなかった。
ブースター注入 ワクチンは同様に６ヶ月後のブースター接種時にも十分耐性があった：ＨＤＣブースター受取人９人中２人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター受取人１０人中１人で熱がみられた。局所的反応はＨＤＣブースター受取人９人中６人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター受取人９人中５人でみられた。
観察 図１３Ａ−１３Ｄは、狂犬病中性化抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）ＩＵ／ｍｌ）を示している：同じまたは別のワクチンで予め免疫化されたボランティア体内におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０5.5ＴＣＩＤ50）のブースター効果。ワクチンは０、２８および１８７日および２０８日に与えられた。０、７、２８、３５、５６、１７３および１８０日に抗体力価を測定した。
図１３Ａ−１３Ｄに示されるとおり、与えられたブースター量は免疫化の方式に拘わらず全ての対象中で、狂犬病抗体力価のさらなる増加をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースターは全体的に、ＨＤＣブースターより低い免疫反応を誘導し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）グループは他の３つのグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター注入は、ＨＤＣワクチンを以前に受け取った対象５人中３人、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された対象５人すべてにおいて、カナリアポックス抗体力価の増加をもたらした。
全体として、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランティアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。
狂犬病中性化抗体は、マウス中の血清中性化試験と相関することが知られている高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。１０5.5ＴＣＩＤ50の受取人９人のうち、５人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。狂犬病抗体の防御的力価が、２回目の接種の後で、試験された多量の受取人の全て、および、中程度の量の受取人においてすら３人中２人において得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化ＨＤＣにはされていない、皮下経路で投与された。この接種経路は、接種部位を注意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりＨＤＣ受取人における抗体の遅い出現が説明できる：事実、ＨＤＣ受取人は７日には１人も抗体増加を有していなかったが、ＨＤＣワクチンが筋内で投与された殆どの研究においては、かなりの割合の対象が有している（Ｋｌｉｅｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１；Ｋｕｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の投与に限定されない。
狂犬病中性化抗体のＧＭＴ（相乗平均）は、試験しているワクチンはＨＤＣ対照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本研究で用いられた３種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、より多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。
抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である；事実、狂犬病抗体力価は量、どの免疫化の方式でも、６ヶ月後に全ての対象において得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンによるブースターにブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワクシニアウイルス組換体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ １９９１，３３７：５６７−７２；Ｅｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４７０−７２，１９９１）。
このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間において免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点があるが、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともなわずに利用可能であることが明白に示された。
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実施例１１ ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ 50 の様々なワクシニアウイルス株との比較
マウス 雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ ｍｉｃｅ）を、タコニック ファーム（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入し、マウス用食事および水 ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍで生後３週間で使用するまで育てた（「通常」マウス）。両方の性の新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続いての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは２日間の期間内に配達された。
ウイルス ＡＬＶＡＣはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により派生し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製された。ショ糖密度勾配遠心分離による精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。ワクシニアウイルスＷＲ（Ｌ）変異体は、ＷＲの大プラーク表現型の選択により派生された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。ニューヨーク州保健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるＷｙｅｔｈは、Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃａｌｆ Ｌｙｍｐｈ ＴｙｐｅワクチンＤｒｙｖａｘ、制御番号３０２００１Ｂより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスＶＣ−２をＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅより得た。ワクシニアウイルス株ＮＹＶＡＣはコペンハーゲンＶＣ−２から派生された。Ｗｙｅｔｈ株を除く全てのワクシニアウイルス株をＶｅｒｏアフリカグリーンモンキー腎臓細胞中で培養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてＶｅｒｏ細胞上でのプラーク形成単位を数え上げた。Ｗｙｅｔｈ株はＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＣＥＦ細胞中で数え上げた。
接種 １０匹の通常マウスに、ストック調整物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の１つを、０．０５ｍｌ頭蓋内経路（ｉｃ）で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製物を接種に用いた。
１０匹の、生後１日または２日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入量が０．０３ｍｌで用いられたこと以外は同じようにｉｃで接種した。
全てのマウスについて、接種後１４日（新生マウス）または２１日（通常マウス）の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。
実験集団の死亡率５０％を達成するために要求される致死量（ＬＤ50）をＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法により測定した。
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ 50 と、様々なワクシニアウイルス株との比較 若マウス、通常マウスにおけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、他の試験されたワクシニアウイルスよりも数桁のオーダーで低かった（表１５）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Ｗｙｅｔｈ株より通常マウス中で３０００倍以上も毒性が低いこと；１２５０００以上も親ＶＣ−２より毒性が低いこと；および６３００００００倍もＷＲ（Ｌ）派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両方とも極端に大量（３．８５ｘ１０8ｐｆｕ；ＡＬＶＡＣ および３ｘ１０8ｐｆｕ；ＮＹＶＡＣ）に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によってマウスにおいて死を引き起こすが、ＡＬＶＡＣは一般的に頭蓋内経路で投与された場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、新生異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ 50 と、様々なワクシニアウイルス株との比較 ５つのポックスウイルス株の相対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内（ｉｃ）投与モデルシステムにおいて滴定により試験した（表１５）。終了点としての死亡率に関し、ＬＤ50値は、ＡＬＶＡＣは１０００００倍以上もワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株よりも非毒性であること；ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株より２０００００倍以上も非毒性であること；およびワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ株より２５００００００倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最も多量の投与量６．３ｘ１０7ｐｆｕでは、死亡率１００％という結果であった。６．３ｘ１０6ｐｆｕでは、３３．３％という死亡率であった。死の原因は、実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量（約６．３ＬＤ50）のグループの平均生存時間（ＭＳＴ）は６．７プラスマイナス１．５日だったので、毒物学的またはトラウマ的本質ではないようであった。５ＬＤ50の投与量ではＭＳＴが４．８プラスマイナス０．６日であるＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣのＭＳＴは顕著に長かった（Ｐ＝０．００１）。
ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは１５０００倍以上も毒性であり；ＶＣ−２は３５０００倍以上も毒性であり；ＷＲ（Ｌ）は３００００００倍以上も毒性であった。ＡＬＶＡＣと同様に、最も多量の２つのＮＹＶＡＣ投与量６ｘ１０8ｐｆｕおよび６ｘ１０7ｐｆｕは、１００％の死亡率を引き起こした。しかしながら、３８０ＬＤ50に相当する、最も多量に投与されたマウスのＭＳＴはたったの２日であった（９匹が２日に死に、１匹が４日に死んだ）。これと対照的に、最も多量の５００ＬＤ50に相当するＷＲ−Ｌを投与された全てのマウスは、４日まで生存した。
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実施例１２ ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
イムノプレシピテーション 事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層に１０ｐｆｕ／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）もしくはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで２％の透析牛胎児血清を添加したＥＭＥＭ中で接種を行った。１時間の保温の後で、接種物を除去し、培地を２０μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含むＥＭＥＭ（メチオニンフリー）で置換した。一晩、約１６時間の保温の後、細胞をバッファーＡ（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、５００単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．０２％フェニルメチルスルフォニルフロリド）の添加により溶解させた。イムノプレシピテーションを、Ｃ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ博士、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ研究所、ニューヨーク州保健部、Ａｌｂａｎｙ、ニューヨークによって供給された２４−３Ｆ１０と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体、およびベーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体（型番＃６０５−５００）を用いて行った。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージーより得られたプロテインＡセファロースＣＬ−４８を支持マトリクスとして用いた。イムノプレシピテーション沈殿物は、Ｄｒｅｙｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）の方法に従って１０％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ゲルを固定化し、間接撮影用に１Ｍサリチル酸ナトリウムで１時間処理し、イムノプレシピテーションされたタンパク質種を視覚化するためにコダックＸＡＲ−２フイルムに曝露した。
動物の起源 ニュージーランド白ウサギはＨａｒｅ−Ｍａｒｌａｎｄ（Ｈｅｗｉｔｔ、ニュージャージー）より得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター異系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ+ｎｕ+）マウスはタコニックファーム社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ニューヨーク）より得た。全ての動物はＮＩＨガイドラインに従って維持された。全ての動物プロトコルはＩＡＣＵＣ協会で承認されている。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。
ウサギにおける外傷 ２匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ１０4、１０5、１０6、１０7または１０8ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０．１ｍｌ接種した。ウサギを４日から外傷が治るまで毎日観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。
接種部位からのウイルスの回収 １匹のウサギに、皮下で複数の部位に、１０6、１０7、１０8ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０／１ｍｌ接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取された皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはＣＥＦ単層上でのプラーク滴定によりアッセイした。
マウス中での毒性 マウス１０匹、またはヌードマウス実験では５匹のグループを、いくつかの０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中のウイルス希釈液のうちの１つで、ｉｐ接種した。実施例１１を参照した。
シクロホスファミド（ＣＹ）処理 マウスをｉｐ経路で４ｍｇ（０．０２ｍｌ）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）で−２日に接種し、続いて０日にウイルスを接種した。感染後に続く日々には、マウスにＣＹをｉｐ接種：１日には４ｍｇ；４、７および１１日には２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日には３ｍｇ。免疫抑制を間接的にクルターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）により１１日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていないマウス（ｎ＝４）で１μｌあたり１３５００細胞、ＣＹ処理対照マウス（ｎ＝５）で１μｌあたり４２２０細胞であった。
ＬＤ 50 の計算 死亡率５０％をなすために必要な致死量（ＬＤ50）を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８）により決定した。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧのマウス中での能力試験 生後４−６週間のマウスに、５０から１００μｌのＶＶ−ＲＧ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの、２．０−８．０ ｌｏｇ10 組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ50）を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは８匹のグループからなっていた。接種後１４日に、マウスに脳内接種で１５ＬＤ50の狂犬病ウイルスＣＶＳ株を投与した（０．０３ｍｌ）。２８日には、生存したマウスを数え、防御量５０％（ＰＤ50）を計算した。
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導 ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣは、コペンハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるＶＣ−２から開発された。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能を含む１８のワクシニアＯＲＦを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないＯＲＦが現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図１０はＮＹＶＡＣを開発するために欠失されたＯＲＦを模式的に示している。図１０の上部は、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のＨｉｎｄＩＩＩ制限地図を示している。拡大部分は、ＮＹＶＡＣの開発において連続的に欠失されたＶＣ−２の６つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述されている（実施例１から６）。以下に、座からＯＲＦが欠失された欠失座を、機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記する。
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統上での複製の研究 ヒト起源の細胞中でのワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製のレベルを決定するために、６種類の細胞系統に、細胞あたり０．１ｐｆｕの投入多重度で液体培地で接種し、７２時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）も接種した。初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞（１０−１１日経過したＳＰＦ起源の受精卵から得た、Ｓｐａｆａｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ、ＣＴ）を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表させて含めた。培養を２つの基準：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分析した。
多数のヒト派生細胞中でのＮＹＶＡＣの複製能力を図１６に示した。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣは両方ともＣＥＦ細胞中で生産的に複製可能であったが、ＮＹＶＡＣは僅かに収量が減少した。ＶＣ−２は、試験された６種類のヒト派生細胞系統のうち、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−バーウイルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照）を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であった。これに反し、ＮＹＶＡＣは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統においてもその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上の感染可能なウイルスの少量の増加が、ＮＹＶＡＣに感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚肺細胞）およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞、Ｗｈｉｔｔｉｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、型番＃７０−１５１）細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞から得られた収量、または親ＶＣ−２（表１６）と比較して、顕著に減少していた。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のＣＥＦ細胞中の２４時間での収量は７２時間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに４８時間（さらに２回のウイルス増殖サイクル）保温することは、従って、得られる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。
ヒト派生細胞系統ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２において得られる低レベルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がみられた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞でみられたものと関連して、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系統ＤＮＡ蓄積レベルの相対ウイルス収量を比較した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積はいずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。
同等の実験をアビポックスウイルスＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製の結果は表１６に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ＡＬＶＡＣがこれらのヒト派生細胞内で生産的複製をの欠失は、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも一致している。
ヒト細胞中でのＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現 効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換体ウイルス（ｖＰ８７９、実施例７）35Ｓメチオニン存在下でで接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質のイムノプレシピテーションを行った。６７ｋＤａのタンパク質のイムノプレシピテーションが検出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的に交叉反応する生産物は、非感染もしくは親ＮＹＶＡＣ感染細胞破砕物においては検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得られた。
ウサギ皮膚への接種 皮内（ｉｄ）接種に続いくウサギの外傷の誘導および本質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｆｅｎｎｅｒ，１９５８；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｇｈｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｎｏｓ，１９６４）。故に、ワクシニア株ＷＲ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ１１９、ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０上でプラーク精製、およびＬ変異体と命名されたプラーク単離体、ＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５ Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１に記載の通りに選択）、Ｗｙｅｔｈ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ３２５、ＤＲＹＶＡＣとして流通、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣでのｉｄ接種と関連した外傷の本質を、２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）への接種により評価した。２匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体的感受性を示し、ウサギＡ１２８はウサギＡ０６９よりも深刻ではない反応を示した。ウサギ１２８Ａにおいては、外傷は比較的小さく接種後２７日までに治癒した。ウサギＡ０６９においては、外傷は強烈で、特にＷＲ接種部位に対してひどく、４９日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。全ての外傷を、４日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大きさと治癒に要した日数の平均を計算した（表１７）。対照ＰＢＳを接種した部位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株ＷＲ、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈを接種した部位で観察された。重要なことには、ＮＹＶＡＣを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。
感染可能なウイルスの接種部位での持続性 これらのウイルスの接種部位での相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、１０6、１０7または１０8ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷｙｅｔｈまたはＮＹＶＡＣを含む０．１ｍｌのＰＢＳを接種した。各々のウイルスは、１０7ｐｆｕ量を背脊椎上に、１０6および１０8量を隣接させて位置させた。接種部位を１１日間毎日観察した。ＷＲは最も強烈な反応を誘導し、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈが続いた（表１８）。潰瘍化は最初に９日目にＷＲおよびＷｙｅｔｈで、１０日目にＶＣ−２で観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は潰瘍化も硬化も示さなかった。接種後１１日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に破壊し、ウイルスをＣＥＦ細胞で滴定した。結果を表２２に示す。この時点で、投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株ＷＲの回収は、投与ウイルス量に関係なく約１０6ｐｆｕであった。ワクシニア株ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２の回収は投与量に関係なく１０3から１０4ｐｆｕであった。感染可能なウイルスはＮＹＶＡＣ接種部位から回収されなかった。
遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種 大量のＮＹＶＡＣ（５ｘ１０8ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０9ｐｆｕ）を腹腔経路でヌードマウスに接種したが、１００日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられなかった。これと対照的に、ＷＲ（１０3から１０4ｐｆｕ）、Ｗｙｅｔｈ（５ｘ１０7または５ｘ１０8ｐｆｕ）もしくはＶＣ−２（１０4から１０9ｐｆｕ）を接種したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。ＷＲまたはＷｙｅｔｈを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後には死へとつながっていたが、ＶＣ−２に感染させたマウスは殆どは最後には回復した。計算されたＬＤ50値は表１９に示されている。
特に、ＶＣ−２を接種されたマウスは、つま先に、１から２日後には尾に外傷（赤い丘疹）を示した。これらの外傷は接種後（ｐｉ）１１から１３日の間に最も高い投与量のマウスにおいて（１０3、１０8か、１０7かおよび１０6ｐｆｕ）、ｐｉ１６日には１０5ｐｆｕ投与されたマウス、およびｐｉ２１日には１０4ｐｆｕ投与されたマウスにおいて起こった。１０3および１０2ｐｆｕを接種したマウスにおいては、１００日の観察期間の間は外傷はみられなかった。ｐｉ２３日には、１０9および１０8ｐｆｕを接種したマウスにおいて、７日後には他のグループ（１０7から１０4ｐｆｕ）において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に１０9および１０8ｐｆｕグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、１００日間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、ｐｉ３０−３５日頃に起じてきた痘様外傷が、２、３のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常はｐｉ６０−９０日の間に治癒した。１０9ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死に（ｐｉ３４日）、１０8ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死んだ（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２を接種されたマウスにおいて他に死亡は観察されなかった。
１０4ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ１７日で痘外傷を示し始めた。これらの外傷はＶＣ−２を注入されたマウスによって示された（つま先、尾と拡がる）外傷と同様に現れた。１０3ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ３４日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のＷＲ（１０4ｐｆｕ）を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。１０4ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスは全て、ｐｉ２１日から３１日の間に死ぬか必要と思われたときは安楽死された。１０3ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウス５匹のうち４匹はｐｉ３５日から５７日の間に死ぬか必要と思われるときには安楽死された。低いＷＲの投与量（１から１００ｐｆｕ）を接種されたマウスにおいて死亡は観察されなかった。
ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株を多量に（５ｘ１０7ｐｆｕおよび５ｘ１０8ｐｆｕ）接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ。５ｘ１０6ｐｆｕもしくはこれ以下のＷｙｅｔｈを注入されたマウスは病気もしくは外傷の兆候を示さなかった。
表１９に示されるとおり、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポックスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２に対するＬＤ50値は、このモデルシステムにおいては、ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように、Ｗｙｅｔｈ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌードマウスでみられたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを投与されたＣＹ処理マウスにおいて、投与量に関係なく、いくつかの死亡が観察された。これらのランダムな出来事が死の原因と考えられる。
全てのＷｙｅｔｈ投与量（９．５ｘ１０4から９．５ｘ１０8ｐｆｕ）で注入されたマウスは、ｐｉ７日と１５日の間にそれらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのＶＣ−２投与量（１．６５ｘ１０5から１．６５ｘ１０9ｐｆｕ）で注入されたマウスもまた、Ｗｙｅｔｈで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察された。少量のＷＲウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、これらのグループにおいて死亡は引き起こされた。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの能力試験 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化が、その結果生じたＮＹＶＡＣ株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化させることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子として用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬病に対する標準ＮＩＨマウス能力試験（ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，１９７３）により評価した。表２０は高度弱毒化ＮＹＶＡＣベクターから得られたＰＤ50値は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）を用いて得られた値と同一であり、鳥類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるＡＬＶＡＣ−ＲＧについて得られたＰＤ50値に近かったことを示している。
観察 公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するＮＹＶＡＣを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これらの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、ＷＲ、２つのワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈ（ニューヨーク市保健局）およびコペンハーゲン（ＶＣ−２）、さらにカナリアポックスウイルス株、ＡＬＶＡＣ（実施例１１を参照）と比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよびウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるＷＲ、立証された特性とともに以前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン（ＶＣ−２）およびＷｙｅｔｈ、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供しているＡＬＶＡＣに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）と比較して高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を明白に示している（表１４−２０）。重要なことには、ＮＹＶＡＣのＬＤ50値は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣについて見られた値と匹敵するものであった。ＮＹＶＡＣによる死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、極端に大量のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された（実施例１１、表１４、１５、１９）。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異的は必然的結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理）における分析はまた、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン株と比較して、ＮＹＶＡＣの相対的に高い弱毒化特性を示している（表１７および１８）。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病気の証拠が、ＮＹＶＡＣを接種された動物またはＡＬＶＡＣを接種させた動物においては、観察期間にわたって観察されなかったことである。ＮＹＶＡＣ中の複数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のＮＹＶＡＣの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された（表１７および１８）。非鳥類種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣについての結果を考えると、ＡＬＶＡＣの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引き起こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているのではない。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることはあり得る。ＮＹＶＡＣの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。
同じく、実施例１１を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、ＷＲ、および以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を示している。事実、試験された動物モデルシステムにおける、ＮＹＶＡＣの病原性プロフィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス、ＡＬＶＡＣのそれに近かった。ヒト（表１６）およびマウス、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への潜在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播の、低い可能性をベクターに提供する。
重要なことには、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補株は効率的であることが示されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体は、致死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。ＮＹＶＡＣベースの狂犬病糖タンパク質組換体の能力は、ｔｋ遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコペンハーゲンベースに対するＰＤ50値に匹敵していた（表２０）。ＮＹＶＡＣベースの組換体は麻疹ウイルス中性化抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全性の利点を付与している（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。さらには、ＮＹＶＡＣの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワクシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。
以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例１１を含む文書中の実施例は、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることを示している：ａ）接種部位での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位からの感染可能はウイルスの速やかな消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がない（ヌードマウス）；ｄ）大きく減少された毒性（頭蓋内投与、生後３週間および新生マウス）；ｅ）大きく減少された病原性および免疫不全対象物（ヌードおよびシクロホスファミド処理マウス）において拡散性がない；およびｆ）劇的に減少された、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化されているにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外因性抗原に対して強力な免疫反応を誘導する能力を保持している。
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実施例１３ トリインフルエンザウイルス血球凝集素糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ組換体の構築
この実施例はトリインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。
細胞およびウイルス Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含むプラスミドを、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅより入手した。ＦＰ−１と命名されたＦＰＶ株は以前に記述されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。これは、生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。親株はふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞で２５回の継代により弱毒化された。このウイルスは１９８０年にＲｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅで得られ、マスターウイルスシードを作り出した。このウイルスは１９８９年にＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓに受領され、ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初期ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成するために用いられたストックウイルスは、初期ＣＥＦ中で８回の継代にかけられさらに増幅された。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成するために用いられたストックウイルスは、初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられさらに増幅された。
Ｆ８座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 プラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を有している。３６５９ｂｐＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図１１に示す（配列番号４８）。本研究室でＦ８と命名されたオープンリーディングフレームの限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置４９５から開始され位置１８８７で終了する。以下に記述するように、位置７７９から位置１９２６までを欠失させた。
プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。
Figure 0004108742
この連結により生じたプラスミドをｐＪＣＡ００２と命名した。プラスミドｐＪＣＡ００４はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子をプラスミドｐＪＣＡ００２中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。プラスミドｐＪＣＡ００４をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、非関連遺伝子とＨ６プロモーター３７末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配列番号４９）およびＲＷ１７９（配列番号５０）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩサイトの間に入れ、ｐＲＷ８４６を生成した。
Figure 0004108742
それ故、プラスミドｐＲＷ８４６はＨ６プロモーターの５’ＥｃｏＲＶを、ＯＲＦ欠失されたＦ８座に有している。プラスミドｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターの３’ＨｉｎｃＩＩサイトに、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーター（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）により認識される転写終結コドンおよびＳｍａＩサイトが続いている。
Ｆ７座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 元々のＦ７ＯＲＦが欠失されていない挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、５．５ｋｂｐのＦＰゲノムのＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイト中に有している。挿入サイトはこれらの配列内部の固有のＨｉｎｃＩＩである。図１２に示されているヌクレオチド配列（配列番号５１）は、固有のＨｉｎｃＩＩサイトを含む２３５６ｂｐの領域について決定された。この配列の解析により、固有のＨｉｎｃＩＩサイト（図１２、下線）は９０アミノ酸のポリペプチドをコードしているＯＲＦの内部に位置していることが明らかとなった。ＯＲＦは位置１５３１のＡＴＧにより始まり、位置８９８で終わる（図１２中で矢印で示された位置）。
ＯＲＦ欠失させた挿入プラスミドのためのアームはｐＲＷ７３１．１３をテンプレートとして用いたＰＣＲにより派生した。ＯＲＦの上流領域に相当する５９６ｂｐのアーム（ＨＢと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列番号５２）およびＦ７３ＰＢ（配列番号５３）により増幅された。
Figure 0004108742
ＯＲＦの下流領域に相当する２７０ｂｐのアーム（ＥＨと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７５ＰＨＥ（配列番号５４）およびＦ７３ＰＨ１（配列番号５５）により増幅された。
Figure 0004108742
断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化し、１２６ｂｐの断片を生成した。ＥｃｏＲＶサイトは３’末端にあり、５’末端はＨｉｎｃＩＩの３’末端を含むようＰＣＲにより形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１とした。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで直線化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、５９６ｂｐのＨＢ断片へ連結した。生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と命名した。全体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。
プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化し、６００ｂｐの断片を生成させた。この断片をＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、続いてＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。その結果生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と命名した。このプラスミドは４０４ｂｐのＨＢアームと１２ｂｂｐのＥＨアームを含んでいる。
プラスミドｐＦ７Ｄ３を、ＸｈｏＩで直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片で２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で平滑化した。この直線化されたプラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号５６）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号５７）と連結させた。
Figure 0004108742
これは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ制限サイトを含むマルチプルクローニング領域をＥＨアームとＨＢアームとの間に挿入するために行った。生成されたプラスミドをｐＦ７ＤＯと命名した。
Ｆ８座へのＨ４血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３／８０から派生したトリインフルエンザＨ４をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片でｄＮＴＰの存在下で平滑化した。Ｈ４コード領域を含む平滑化２．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片を、ｐＩＢＩ２５（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、直線状の産物を単離しＨｉｎｄＩＩＩで再び切断した。今、１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩを欠失されたプラスミドｐＲＷ８２８は、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列番号５８）およびＲＷ１５３（配列番号５９）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶサイトからのＨ６プロモーターの３’部分を表し、Ｈ４ｃＤＮＡのＡＴＧをプロモーターのＡＴＧと並列させている。
Figure 0004108742
これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＢａｎＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩ欠失ｐＲＷ８２８ベクター中に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断し、３’Ｈ６プロモートされたＨ４コード配列を含む１．７ｋｂｐ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩサイトに挿入し、ｐＲＷ８４８とした。プラスミドｐＲＷ８４８は、それ故、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード領域を、ニワトリポックスウイルスＦ８座ＯＲＦ欠失領域中に有している。
Ｆ８座へのＨ５血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅｌａｎｄ／１３７８／８３から派生したトリインフルエンザＨ５をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＨ２９中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。合成ヌクレオチドＲＷ１０（配列番号６０）からＲＷ１３（配列番号６３）までは、以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンをＨ５遺伝子のＡＴＧとオーバーラップさせるために設計された。配列は、Ｈ５遺伝子の５’ＳａｌＩサイトを通して連続しており、Ｈ５停止コドンを含む３’Ｈ５ＤｒａＩサイトで再び開始する。
Figure 0004108742
オリゴヌクレオチドを、９５℃で３分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる。
Figure 0004108742
ｐＲＷ７４２のＥｃｏＲＶとＰｓｔＩサイトとの間へのオリゴヌクレオチドのクローン化によりｐＲＷ７４４を生成した。ｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を有するプラスミドｐＲＷ７４２Ｂは以前に記述された。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶによる消化で、非関連遺伝子およびＨ６プロモーターの３’末端を除去した。今、プラスミドｐＲＷ７４４はトリインフルエンザＨ５のＡＴＧとオーバーラップしたＨ６プロモーターの３’部分を有している。このプラスミドはまた、５’ＳａｌＩサイトを通ったＨ５配列およびＨ５停止コドン（ＤｒａＩサイトを含む）からの３’配列を含む。ＤｒａＩサイトの利用によりＨ５ ３’非コード末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を付与する。Ｈ６プロモートされたＨ５の構築を完成させるため、Ｈ５コード領域を１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片としてｐＴＨ２９から単離した。プラスミドｐＲＷ７４４をＤｒａＩで部分分解し、直線状断片を単離し、ＳａｌＩで再び消化した、ＳａｌＩとＤｒａＩとの間の８ベースを欠失させたプラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片のベクターとして用いた。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７５９をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断した。３’Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含む１．７ｋｂｐのｐＲＷ７５９ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４９は、ＯＲＦ欠失Ｆ８座内にＨ６プロモートされたトリインフルエンザウイルスＨ５遺伝子を含んでいた。
Ｆ７座へのＨ７血球凝集素挿入ベクターの構築 Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５由来のＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ７１は、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、ｐＩＢＩ２５のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入し、ｐＲＷ８２７とした。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号６４）およびＲＷ１６６（配列番号６５）とをアニーリングさせ、ＨｉｎｃＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶおよびＳｔｙＩサイトに挿入し、ｐＲＷ８４５とした。
Figure 0004108742
オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号６２）およびＲＷ１６６（配列番号６３）はＨ６プロモーターの３’部分をＨ７遺伝子に連結している。Ｈ７遺伝子の３’非コード末端は、ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ消化の直線状産物を単離し、ＥｃｏＲＩで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドＲＷ２２７（配列番号６６）およびＲＷ２２８（配列番号６７）とアニーリングさせることにより除去した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８５４である。
Figure 0004108742
ｐＲＷ８５４のＨ７の停止コドンにはＨｐａＩサイトが続いている。ＯＲＦ欠失されたＦ７座中のＨ６プロモートされたＨ７構築物中間体を、ｐＲＷ８５４のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｓｔＩサイトを平滑化させたｐＲＷ８５８中に移動させることにより生成した。プラスミドｐＲＷ８５８（以下に記述）は、Ｈ６プロモーターをＦ７ＯＲＦ欠失中に含む挿入プラスミドである。
プラスミドｐＲＷ８５８は、非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを有する８５０ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、以前に記述されたｐＦＤＯのＳｍａＩサイトに挿入することによって構築された。この非関連配列は、ｐＲＷ８５８のＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３’末端の２４ｂｐ上流のサイト）およびＰｓｔＩでの消化により取り除いた。３．５ｋｂｐのその結果生じた断片を単離しＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を用いて２ｍＭのｄＮＴＰ存在下で平滑末端化した。この平滑化された断片を、ｐＲＷ８５４（以前に記述）から派出した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結された。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶ Ｈ６プロモーターの最３’２４ｂｐの３’に並列された完全ＡＩＶ ＨＡ（Ｈ７）遺伝子を有している。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８６１と命名された。
１２６ｂｐＥＨアーム（以前に定義）は、ｐＲＷ８６１中で、ＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡとの組換え頻度を増加させるために伸長された。これを実行するため、５７５ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（以前に定義）から派生させた。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩサイトとＮａｅＩサイトとの間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、ＡＩＶ Ｈ７遺伝子に隣接している７２５ｂｐのＥＨアームおよび４０４ｂｐのＨＢアームを有し、ｐＲＷ８６９と命名された。プラスミドｐＲＷ８６９は、それ故、５’末端でワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されたＨ７コード配列を有している。左隣接アームは４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり右隣接アームは欠失ＯＲＦＦ７座への挿入を目的とした７２５ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなる。
ＴＲＯＶＡＣ−トリインフルエンザウイルス組換体の開発 トリインフルエンザウイルスＨＡコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。ＨＡ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅されてストックウイルスとされた。プラスミドｐＲＷ８４９は、生体外組換えテストにおいて用いられ、その結果、Ｈ５血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）を生成した。プラスミドｐＲＷ８４８が用いられ、その結果、Ｈ４血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成した。プラスミドｐＲＷ８６９が用いられ、その結果、Ｈ７血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成した。
免疫蛍光 インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、ＨＡ分子は合成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したＨＡ1およびＨＡ2サブユニットとなるタンパク質分解である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエンベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ組換体に感染させた細胞中でＨＡ分子が細胞表面で発現されているかどうかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４ではＨ４血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５ではＨ５血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ではＨ７血球凝集素が表面で発現していることが、表面蛍光により確認された。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡ特異的モノクローナル抗体のプールを用いて検出された。Ｈ４ＨＡの発現はヤギ単独特異的抗Ｈ４血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異的モノクローナル抗体調製物を用いて分析した。
イムノプレシピテーション ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝集素のポリペプチドの分解が必要であるため、血球凝集素分子の分解サイトおよびそのの周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが同定されている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスは、ＨＡ1にカルボキシ末端において１以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸を認識する細胞内プロテアーゼに血球凝集素を分解することを可能にし、感染可能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられている。無毒性株のＨ４血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが添加されないかぎり分解されない。
ＴＲＯＶＡＣ組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシングされているか否かを決定するため、イムノプレシピテーション実験を記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、上記の特異的試薬を用いて行った。
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）によって発現されたＨ５血球凝集素のイムノプレシピテーション分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ｋＤａの分子量の分解産物ＨＡ1およびＨＡ2として明瞭であることを示した。感染させていない細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ１００）によって発現されたＨ５血球凝集素のイムノプレシピテーション分析により、分解産物ＨＡ2特異的沈殿を示した。ＨＡ1分解産物は認識されなかった。感染させていないＣＥＦ細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。これと対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）によって発現されたＨ４血球凝集素のイムノプレシピテーション分析においては、プレカーサータンパク質ＨＡ0のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中での発現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、Ｈ４特異的タンパク質は検出されなかった。組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによるインサイチュハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された通りである（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
実施例１４ イヌ・ジステンパー・ウイルス（Onderstepoort株）・赤血球凝集素・オープンリーディング・フレーム（開いた読み取り枠・ＯＲＦ）を含むＮＹＶＡＣ組換体の作製
イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）・Onderstepoort株は、M.Appel博士（コーネル大学、Ithaca、ニューヨーク）から入手した。ＲＮＡは、ＣＤＶ感染したベロ（Vero）細胞から収集し、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）は下記の方法で調製した。
ＣＤＶ感染ベロ細胞からのＲＮＡの分離は、Chirgwinら（１９７９）のグアニジウム・イソチオシアネート・塩化セシウム法で行った。第１ストランドｃＤＮＡをＡＭＶ逆転写酵素（Life Sciences社、St.Petersburg、フロリダ）、オリゴヌクレオチド・プライマー・ＣＤＶＦＳＰ（配列番号６８）
Figure 0004108742
およびＣＤＶ感染細胞からのＲＮＡで合成を行った。ＣＤＶＦＳＰ（配列番号６８）は、ＣＤＶ融合（Ｆ）開始コドンの上流の８０塩基対から合成が始まり、正のセンス一本鎖ｃＤＮＡが産生されるが、このｃＤＮＡには、Ｆ遺伝子および血球凝集素（ＨＡ）のコード配列が含まれる（Barrettら、1987； Curranら、1991）。
ＨＡ特異的オープンリーディングフレーム（開いた読み取り枠・ＯＲＦ）（Curranら、１９９１に記載）を、複製連鎖反応（ＰＣＲ）により、第１ストランドｃＤＮＡ産物から増幅させた（Engelkeら、1988）。この複製連鎖反応には、オリゴヌクレオチドプライマーであるＣＤＶＨＡ１（配列番号６９）
Figure 0004108742
とＣＤＶＨＡ２（配列番号７０）
Figure 0004108742
を使用し、ＣＤＶＦＳＰ由来の第１ストランドｃＤＮＡを鋳型として使用した。ＣＤＶＨＡ１にはワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Perkusら、1989）の最３’部位があり、その後に、翻訳開始コドンからＣＤＶ／ＨＡ・ＯＲＦ（Curranら、1991）方向に合成が進む塩基配列が続く。ＣＤＶＨＡ２（配列番号７０）は、ＨＡ・ＯＲＦの停止コドンからその合成が開始されＣＤＶ・ＨＡ・５’末端に進む（Curranら、1991）。合成された１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ由来クレノー断片を用いて、２０μＭ・ｄＮＴＰの存在下で処理して末端平滑化を行った。この１．８Ｋｂｐの平滑末端化断片をｐＳＤ５５４のＨ６プロモーターの中のNruI部位とＨ６プロモーターのSmaI・３’部位の間に挿入した（以下を参照）。その結果として得られたプラスミドｐＣＤＶＨＡには、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦを含む筈であったが、ＣＤＶ・ＨＡ・５’末端で予期せぬ欠失があった。この欠失部位の修復については下記で説明する。
プラスミドｐＳＤ５５４には、ワクシニア隣接アーム内に、ワクシニア・Ｋ１Ｌ・宿主範囲遺伝子（Gillardら、1986）とワクシニア・Ｈ６プロモーターがあり、その後に挿入部位が続いている。フランキング・ワクシニア・アームは、ＡＴＩ部位に取って代わるものであり、オープンリーディングフレームであるＡ２５ＬとＡ２６Ｌとなるものである（Geobelら、1990a,b）。プラスミドのｐＳＤ５５４は下記の方法で調製した。
左右のワクシニア・フランキング・アームは、ワクシニア・SalI・B（Goebelら、1990a,b）を含む鋳型ｐＳＤ４１４を使用して構築した。左アームは、オリゴヌクレチド・プライマー・ＭＰＳＹＮ２６７（配列番号７１）
Figure 0004108742
および、ＭＰＳＹＮ２６８（配列番号７２）
Figure 0004108742
を使用し、鋳型をｐＳＤ４１４として複製連鎖反応で合成した。右アームは、オリゴヌクレチド・プライマー・ＭＰＳＹＮ２６９（配列番号７３）
Figure 0004108742
および、ＭＰＳＹＮ２７０（配列番号７４）
Figure 0004108742
を使用し、鋳型をｐＳＤ４１４として複製連鎖反応で合成した。左右のアームを含む２個のＰＣＲから産生された断片を、さらに複製連鎖反応により結合させた。この複製連鎖反応からの産生物を、EcoRIとHindIIIで切断して、０．９ｋｂの断片として分離した。ここで分離された０．９ｋｂｐの断片をpUC8・EcoRIとHindIII部位の間に挿入した。この結果得られたプラスミドｐＳＤ５４１は、Ｋ１Ｌ遺伝子を取り入れる。その追加の挿入部位は下記の方法で作製した。
プラスミドｐＳＤ５４１をBq1IIとXhoIで切断して、アニールした相補オリゴヌクレオチド・ＭＰＳＹＮ３３３（配列番号７５）
Figure 0004108742
およびＭＰＳＹＮ３３４（配列番号７６）
Figure 0004108742
で結合させて、プラスミドｐＳＤ５５２を作製した。ｐＳＤ４５２（Perkusら、1990）にはＫ１Ｌ遺伝子が含まれる。このｐＳＤ４５２をHpaIで切断して、さらに、BqlIIで部分的に切断し、Ｋ１Ｌ遺伝子を含む１ｋｂｐの断片をｐＳＤ５５２のBq1II部位とHpaI部位に挿入した。この結果得られたプラスミドｐＳＤ５５３をNruIで切断して、ワクシニアＨ６プロモーター（Perkusら、1989）を含むSmaI/NruI断片を挿入した。この結果得られたプラスミドｐＭＰ５５３Ｈ６は、そのＡ２６Ｌ挿入遺伝子座の中のＫ１Ｌ遺伝子の下流にワクシニア・Ｈ６プロモーターを有する。
プラスミドｐＭＰ５５３Ｈ６をNruIとBamHIで切断して、アニールした合成オリゴヌクレオチド・ＭＰＳＹＮ３４７（配列番号７７）
Figure 0004108742
およびＭＰＳＹＮ３４８（配列番号７８）
Figure 0004108742
で結合させた。この結果得られたプラスミドｐＳＤ５５４はＫ１Ｌ遺伝子とＨ６プロモーターを有しており、この後に挿入部位があり、これはワクシニア隣接塩基配列内にあり、ＡＴＩ部位に取って代わるものである。
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターとＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦの５’末端をＰＣＲによる産生断片としてｐＣＤＶＨＡに付加した。調節部位Ｈ６のＡＴＧは、ＰＣＲによる産生断片のＣＤＶ・ＨＡ・翻訳開始コドンに重なる。ワクシニアウイルス・Ｈ６プロモーターについては、１９８９年にPerkusらが報告している。
ｐＥＩＶ５Ｌには修飾したＨ６プロモーターと非関連遺伝子が含まれる。ｐＥＩＶ５Ｌは、１５６ｂｐの断片作製のために、オリゴヌクレオチドプライマーＨ６５ＰＨ（配列番号７９）
Figure 0004108742
およびＣＤＶＨＡＨ６（配列番号８０）
Figure 0004108742
と共に複製連鎖反応に使用した。ＣＤＶＨＡＨ６にはＣＤＶ・ＨＡの５’・１８塩基対が含まれており、その後に、翻訳開始コドンからＨ６プロモーター５’末端に向かって合成が進む塩基配列が続く。Ｈ６５ＰＨ（配列番号１２）には、HindIII部位が含まれており、その後に、Ｈ６プロモーター５’末端から３’末端に合成が進む塩基配列が続く。ＰＣＲにより産生された１５６塩基対のＨ６５ＰＨ／ＣＤＶＨＡ６（配列番号７９／配列番号８０）には、Ｈ６プロモーターとＣＤＶ・ＨＡ・コード塩基配列の５’・１８塩基対が含まれている。
ＣＤＶＦＳＰ（配列番号６８）第１ストランドｃＤＮＡは、４５９塩基対断片作製のために、オリゴヌクレオチドプライマーＣＤＶＨＡＡＴＧ（配列番号８１）
Figure 0004108742
およびＣＤＶＨＡＥＣＯ（配列番号８２）
Figure 0004108742
と共に複製連鎖反応に使用された。ＣＤＶＨＡＡＴＧ（配列番号８１）は、翻訳開始コドンからＣＤＶ・ＨＡ・３’末端に向かって合成を開始する。ＣＤＶＨＡＥＣＯ（配列番号８２）は、後に続くＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・塩基配列の５８３部位からＣＤＶ・ＨＡ・５’末端に向かって合成を開始する。ＰＣＲにより産生された１５６塩基対と４５９塩基対断片は、Ｈ６５ＰＨ（配列番号７９）とＣＤＶＨＡＥＣＯ（配列番号８２）を使用して、ＰＣＲにより融合させ、５９７塩基対断片を産生する。ＰＣＲによる産生物を、HindIIIとEcoRIで切断して、Ｈ６プロモーターとＣＤＶ・ＨＡ・コード配列の最５’末端・３８７塩基対を含む５２０塩基対断片を作製した。HindIIIとEcoRIで切断した５２０塩基対のＰＣＲ断片を、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア）のHindIIIとEcoRI部位の間に挿入して、ｐＢＳＣＤＶＨＡ５Ｓを作製した。プラスミドｐＢＳＣＤＶ・ＨＡ５５は、ｐＢＳ−ＳＫのＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦのＨ６でプロモートされたの５’末端を有し，ＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦの３’末端を下記の方法で付加した。
プラスミドｐＣＤＶ・ＨＡをSmaIで切断し、その後、EcoRIで部分切断することで、ＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦの３’末端を含む１．４ｂｐの断片を作製した。１．４ｋｂｐのｐｃＤＶＨＡ・EcoRI/SmaI断片をｐＢＳＣＤＶＨＡ５ＳのEcoRI/SmaI部位に挿入した。ここで得られたプラスミドｐＢＳＣＤＶＨＡをBamHIで切断し、その後、XhoIで部分的に切断して、Ｈ６でプロモートされた・ＣＤＶＨＡ・オープンリーディングフレーム（開いた読み取り枠・ＯＲＦ）を含む１．９ｋｂｐの断片を作製した。１．９ｋｂｐのBamHI/XholI・ｐＢＳＣＤＶＨＡをｐＳＤ５５３のBamHIとXholI部位に挿入した（上記参照）。この結果得られた挿入プラスミドｐＢＳＣＤＶＨＡは、そのＡＴＩ挿入部位にＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ遺伝子を含む。図１４Ａ−Ｄは、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡおよびＣＤＶ・ＨＡ翻訳部（配列番号８３）のヌクレトチド塩基配列を示している。ＮＹＶＡＣ（（vP866;Tartagliaら、1992）のin vivo・組換え実験（Picciniら、1987）にｐＢＳＣＤＶＨＡを使用して、ｖＰ１０２８を作製した。
実施例１５ イヌジステンパーウイルス融合ＯＲＦを含むＮＹＶＡＣ組換体の作製
オリゴヌクレオチドプライマーＣＤＶ・ＦＳＰ（配列番号６８）由来で、ＣＤＶ・Ｆ遺伝子およびＨＡ遺伝子コード配列を含む第１ストランドｃＤＮＡについては前述された。ＣＤＶ融合（Ｆ）特異的オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）（Barrettら、1987）を第一ストランドｃＤＮＡから、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して増幅させた。オリゴヌクレオチド・プライマ・ＣＤＶＡＴＧＦ１（配列番号８４）
Figure 0004108742
および、ＣＤＶＦＴ（配列番号８５）
Figure 0004108742
をＣＤＶＦＳＰ（配列番号６７）由来の第１ストランドｃＤＮＡを鋳型として複製連鎖反応を起こさせた。ＣＤＶＡＴＧＦ１（配列番号８４）には、ワクシニアウイルスＨ・６プロモーター（Perkusら、1989）の最３’部位があり、この後に、ＣＤＶＦ翻訳開始コドンからＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（Barrettら、1987）に向かって合成を開始する塩基配列が存在する。ＣＤＶＦＴ（配列番号８５）には、BamHI部位があり、その後に、ＣＤＶＦ中止コドンからＣＤＶＦ５’末端（Barrelら、1987）に向かって合成を開始する塩基配列が存在する。この結果得られたＰＣＲ産生物をNruIとBamHIで切断して、２ｋｂｐの断片を作製して、これをｐＳＤ５５４・NruIとBamHIとの間に挿入した。その結果得られた挿入プラスミドｐＡＴＩＣＤＶＦ１には、ワクシニアウイルスＡＴＩ挿入遺伝子座にＨ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦを含む（配列番号８６）。図１５Ａ−Ｄは、Ｈ６でプロモートされたＣＤＦ・ＦおよびＣＤＦ・Ｆ翻訳部位でのヌクレオチド塩基配列を示したものである。ＮＹＶＡＣ（（vP866;Tartagliaら、1992）のin vivo・組み換え実験（Picciniら、1987）にｐＡＴＩＣＤＶＦ１を使用して、ｖＰ１０２９を作製した。
実施例１６ イヌジステンパーウイルス赤血球凝集素ＯＲＦを含むＡＬＶＡＣ組換体の作製
オリゴヌクレオチド・ＲＷ１３２（配列番号８７）
Figure 0004108742
およびＲＷ１３３（配列番号８８）
Figure 0004108742
をアニールして二本鎖のリンカー塩基配列を形成させた。ＲＷ１３２／ＲＷ１３３（配列番号８７／配列番号８８）二本鎖塩基配列をｐＢＳＣＤＨＡのＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦの５’HindIII部位に挿入した。この結果得られたプラスミドｐＢＳＣＤＶＨＡＶＱをSmaIで切断して、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶＨＡＯＲＦ（配列番号８３）を含む２ｋｂｐの断片を作製して、これをＨＣ５ＬＳＰ２８のSmaI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＣ５ＣＤＶＨＡには、Ｃ５遺伝子座にＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦ（配列番号８３）を含む。ＡＬＶＡＣ（CPpp; Tartagliaら、1992）のin vivo・組み換え実験（Picciniら、1987）にｐＣ５ＣＤＶＨＡを使用して、ｖｃＰ１８４を作製した。
実施例１７ イヌジステンパーウイルス融合ＯＲＦを含むＡＬＶＡＣ組換体の作製
プラスミドｐＡＴＩＣＤＶＦ１にはＨ６でプロモートされたＣＤＶ融合（Ｆ）ＯＲＦが含まれる。２ｋｂｐのｐＡＴＩＣＤＶＦ１・NruI/XhoI・断片は、ワクシニアウイルス・Ｈ６プロモーター（Perkusら、1989）の３’末端・２８塩基対を有し、その後にＣＤＶ・Ｆオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号８６）が存在するが、この断片をＶＱＨ６Ｃ３ＬＳＡ・２のNruIとXhoIの間に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＭＭ１１５には、Ｃ３遺伝子座にＣＤＶ・ＯＲＦ（SEQID NO:86）を含む。ＡＬＶＡＣ（CPpp; Tartagliaら、1992）のin vivo・組み換え実験（Picciniら、1987）にｐＭＭ１１５を使用して、ｖＣＰ１９４を作製した。
実施例１８ イヌ・ジステンパーウイルス・融合ＯＲＦおよび赤血球凝集素ＯＲＦを含むＡＬＶＡＣ組換体の作製
プラスミドｐＣ５ＣＤＶＨＡとｐＭＭ１１５については、上記で説明した。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦ（配列番号８３）を有する２ｋｂｐのｐＣ５ＣＤＶＨＡ・SmaI・断片をＩ４ＬベクターｐＳＤ５５０のSmaI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＭＭ１２４をＨ６でプロモートされたＣＤＶＦＯＲＦ（配列番号８６）のベクターとして使用した。
相補的オリゴヌクレオチド５３９Ａ（配列番号８９）
Figure 0004108742
および５３９Ｂ（配列番号９０）
Figure 0004108742
をＩ４Ｌ挿入ベクターｐＳＤ５４８（Tartagliaら、1992）のBqlIIとSmalI部位との間に挿入することによってプラスミドｐＳＤ５５０を構築した。その結果得られたプラスミドｐＳＤ５５０は、ｐＳＤ５４８のBqlII部位とSmaI部位の間に付加Ｉ４Ｌ挿入部位を有する。
Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（配列番号８６）を有する２．２ｋｂｐのｐＭＭ１１５・BamHI・断片をｐＭＭ１２４のBamHI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＭＭ１２６は、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦおよびＨ６でプロモートされたＣＤＶＨＡＯＲＦ（配列番号９１）を有し、Ｉ４Ｌ遺伝子座の中で、互いに向きが離れる方向に転写がなされる。
図１６Ａ−Ｇは、Ｈ６でプロモートされた・イヌジステンパ・ウイルス（ＣＤＶ）ＦのプラスミドｐＭＭ１２６から誘導された４３４３ｂｐ塩基配列、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ、Ｉ４Ｌ隣接ＮＹＶＡＣ塩基配列、および、ＣＤＶ・ＯＲＦ（配列番号９１，９２）の翻訳部位を示している。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆの５’末端は２１９９の位置にある。ＣＤＶＦコード塩基配列は、２０７５位置から位置９０に存在する。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡの５’末端は、２３５５の位置にある。ＣＤＶＨＡコード塩基配列は、位置２４７９から４２９０の位置にある。ＮＹＶＡＣ（vP866; Tartagliaら、1992）のin vivo組み換え実験（Picciniら、1987）にｐＭＭ１２６を使用して、ｖＰ１２０２を作製した。
実施例１９ イヌ・ジステンパーウイルス・融合ＯＲＦおよび赤血球凝集素ＯＲＦを含むＡＬＶＡＣ組換体の作製
Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦ（配列番号８３）を有する２ｋｂｐのｐＢＳＣＤＶＨＡＶＱ・SmaI・断片をＨＣ５ＬＳＰ２８のSmaI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＣ５ＬＣＤＶＨＡをＨ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（配列番号８６）のベクターとして使用した。ｐＣ５ＬＣＤＶＨＡ・ベクターは、SmaIにより部分的に切断し、その後、BamHIにて切断して、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（配列番号８３）、ＡＬＶＡＣ隣接アーム、ｐＵＣ８を含む６．５ｋｂｐの断片を単離して調製した。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（配列番号８６）を含む２．１ｋｂｐのｐＡＴＩＣＤＶＦ１・HpaI/BamHI・断片を上記のｐＣ５ＬＣＤＶＨＡ・SmaIとBamHIの部位に挿入した。その結果得られたプラスミドｐＣ５ＬＣＤＶＨＡＦ１は、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦ（配列番号８６）およびＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦ（配列番号８３）を有し、Ｃ５遺伝子座の中で、互いに向きが離れる方向に転写がなされる。
ｐＣ５ＬＣＤＶＨＡＦ１をBamHIで切断して、２０ｍＭ・ｄＮＴＰの存在下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼから得たクレノー断片で処理し、BamHIの末端平滑化をした後、SmaIにより切断した。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆ・ＯＲＦおよびＨ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡ・ＯＲＦ（配列番号９３）を含む４．２ｋｂｐのブラントエンド（末端平滑化された）BamHiからSmaI断片をＣ６ＬのSmaI部位に挿入した。図１７Ａ−Ｇは、Ｈ６でプロモートされた・イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）Ｆ、Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｃ６隣接ＨＡ、ＡＬＶＡＣ塩基配列、ＣＤＶ・ＯＲＦ（配列番号９３，９４）の翻訳部位のヌクレオチド塩基配列を予測したものである。ｐＭＭ１０３をすべての結合塩基配列とフランキング塩基配列の確認のために使用した。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・Ｆの５’末端は位置２３０７にある。ＣＤＶ・Ｆ・コード塩基配列は、２１８３から１９８の位置にある。Ｈ６でプロモートされたＣＤＶ・ＨＡの５’末端は位置２４６４にある。ＣＤＶ・ＨＡ・コード塩基配列は位置２５８８から４３９９（配列番号９３）にある。ＡＬＶＡＣ（cppp;Tartagliaら、1992）のin vivo・組み換え実験（Picciniら、1987）に、得られたプラスミドｐＭＭ１０３を使用して、ｖＰ２５８を作製した。
実施例２０ Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６・ＡＬＶＡＣベクターの作製
遺伝子座Ｃ３は、３．４ｋｂｐのカナリアポックスウイルス・PvuII・クローン・pRW64.2内でEcoRIを取り囲んだ状態で存在する。Ｃ３・ＯＲＦを下記の方法で除去するためにＣ３ベクターＶＱＨ６Ｃ３ＬＳＡ．２を構築した。
Ｃ３・ＯＲＦを有する８．５ｋｂｐのカナリアポックスウイルス・BqlII・断片をｐＢＳ−ＳＫのBamHI部位に挿入してｐＷＷ５を作製した。鋳型をｐＷＷ５として、オリゴヌクレオチド・プライマーＲＧ２７７（配列番号９５）
Figure 0004108742
とＲＧ２７８（配列番号９６）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させ２８０ｂｐ断片を作製した。鋳型をｐＷＷ５として、オリゴヌクレオチド・プライマーＲＧ２７９（配列番号９７）
Figure 0004108742
とＲＧ２８０（配列番号９８）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させ、２５０ｂｐの断片を作製した。２８０ｂｐの断片をAsp718とEcoRIで切断し、２５０ｂｐ断片をSacIとEcoRIで切断して、この２個の断片をｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア）のAsp718とSacI部位に一緒に挿入した。その結果得られたプラスミドがｐＣ３Ｉである。鋳型をｐＷＷ５として、オリゴヌクレオチド・プライマーＣＰ１６（配列番号９９）
Figure 0004108742
とＣＰ１７（配列番号１００）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させた。その結果得られた６０４塩基対カナリアポックスウイルス断片をAsp718とXhoIで切断して、ｐＩＢＩ２５のAsp718 XhoI部位に挿入し（International Biotechnologies社、New Haveｎ ＣＴ）ＳＰＣ３ＬＡを作製した。９０８塩基対のｐＷＷ５・NsiI/SspI・カナリアポックスウイルス・断片をＳＰＣ３ＬＡのEcoRVとNsiI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドＳＰＣＰＬＡＸは、１４４４塩基対のカナリアポックスウイルスのＣ３遺伝子座の上流域を含む。
ｐＸＸ４は、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア）のPstI部位に、６．５ｋｂｐのNsiIカナリアポックスウイルス・断片を含む。鋳型をｐＸＸ４として、オリゴヌクレオチド・プライマーＣＰ１９（配列番号１０１）
Figure 0004108742
とＣＰ２０（配列番号１０２）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させ２７９塩基対のカナリアポックス断片を作製した。２７９塩基対の、ＰＣＲにより産生させたカナリヤポックス断片をXhoIとSacIで切断して、ｐＩＢＩ２５（Intenational Biotechnologies Inc., New Haven CT）のSacIとXhoI部位に挿入した。ここで得られたプラスミドは、ＳＰＣ３ＲＡである。
ｐＣ３ＩのEcoRIとClaIとの間に追加の挿入部位を、アニールした相補的オリゴヌクレオチドＣＰ１２（配列番号１０３）
Figure 0004108742
およびＣＰ１３（配列番号１０４）
Figure 0004108742
を挿入して作成し、プラスミドＳＰＣ３Ｓを得た。２６１塩基対のBqlII/SacI／ＳＰＣ３ＲＡ断片と２１７８塩基対のBqlII/StyI・ｐＸＸ４・断片の両方を一緒にＳＰＣＰ３ＳのStyIとSaCI部位に挿入した。その結果得られたプラスミドＣＰＲＡＬは２５７２塩基対のカナリアポックスＣ３遺伝子座の下流を含む。１４３６塩基対・Asp718/AccI・ＳＰＣＰＬＡＸ断片をＳＰＣＰ３ＳのAsp718部位とAccI部位との間に挿入した。その結果得られたプラスミドＣＰＬＡＬは１４５７塩基対のカナリアポックスＣ３遺伝子座の上流を含む。２４３８塩基対のStyI/SacI・ＣＰＲＡＬ断片をＣＰＬＡＬ・StyIとSacI部位との間に挿入した。その結果得られたプラスミドＣＰ３Ｌは、１４５７塩基対のカナリアポックスＣ３遺伝子座の上流を含んでいる。
ＰＣＲにより作製された断片としてＣＰ３ＬにはＨ６プロモーターを付加した。プラスミドｐＲＷ８３８には、Ｈ６プロモーターと無関連の遺伝子を含んでいる。鋳型をｐＲＷ８３８として、オリゴヌクレオチド・プライマーＣＰ２１（配列番号１０５）
Figure 0004108742
とＣＰ２２（配列番号１０６）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させた。Ｈ６プロモーターを含む２００塩基対のＰＣＲ派生断片をBamHIとEcoRIで切断して、ＣＰ３ＬのBamHI部位とEcoRI部位との間に挿入した。その結果得られたプラスミドをＶＱＨ６ＣＰ３Ｌと名づけた。
アニールした相補的オリゴヌクレオチドＣＰ３４（配列番号１０７）
Figure 0004108742
とＣＰ３５（配列番号１０８）
Figure 0004108742
を、ＶＱＨ６ＣＰ３ＬのNsiI部位とNotI部位との間に挿入することでＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ・カナリアポックス・隣接アームのひとつを短縮化させた。その結果得られたプラスミドＶＱＨ６Ｃ３ＬＳＡ．２にはワクシニアウイルスＨ６プロモーターがあり、それに続いてＣ３挿入部位がある。
遺伝子座Ｃ５が、０．９ＫＢＰのカナリアポックスPvuII・クローン・ｐＲＷ７６４．５の中の２個のBglII部位を取り囲んだ状態で存在する。Ｃ５・ＯＲＦを除去するために下記の方法でＣ５ベクター・ＨＣ５ＬＳＰ２８を構築した。
鋳型をカナリアポックスのゲノムＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド・プライマーＣ５Ａ（配列番号１０９）
Figure 0004108742
とＣ５Ｂ（配列番号１１０）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させた。その結果得られた１．５ｋｂｐの断片を、EcoRIを使用してＣ５Ａ端で切断し、他方の端を平滑末端としてそのままにし、ｐＵＣ８のEcoRI部位とSmaIの部位との間に挿入した。鋳型をカナリアポックスゲノムＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド・プライマーＣ５Ｃ（配列番号１１１）
Figure 0004108742
とＣ５ＤＡ（配列番号１１２）
Figure 0004108742
を使用して、複製連鎖反応を起させた。その結果得られた４００ｋｂｐの断片を、PstIを使用してＣ５ＤＡ端で切断し、他方の端を平滑末端としてそのままにし、Ｃ５ＬＡＢのSmaI部位とPstIの部位との間に挿入し、ｐＣ５Ｌを作製した。アニールした相補的オリゴヌクレオチド・ＣＰ２６（配列番号１１３）
Figure 0004108742
とＣＰ２７（配列番号１１４）
Figure 0004108742
をｐＣ５ＬのAsp718部位とNotI部位との間に挿入した。その結果得られたプラスミドＨＣ５ＬＳＰ２８は、遺伝子座Ｃ５ベクターである。
遺伝子座Ｃ６が、１．３ｋｂｐのカナリアポックスPvuII・クローン・ｐＲＷ７６４．７の中の２個のEcoRI部位を取り囲んだ状態で存在する。Ｃ６・ＯＲＦを除去するために下記の方法でＣ６ベクター・ｐＣ６Ｌを構築した。
ｐＣ６Ｌの構築のために、オリゴヌクレオチド・プライマーＣ６Ａ１（配列番号１１５）
Figure 0004108742
Ｃ６Ｂ１（配列番号１１６）
Figure 0004108742
Ｃ６Ｃ１（配列番号１１７）
Figure 0004108742
Ｃ６Ｄ１（配列番号１１８）
Figure 0004108742
を使用した。鋳型をカナリアポックスＤＮＡして、オリゴヌクレオチド・プライマーＣ６Ａ１（配列番号１１５）とＣ６Ｂ１（配列番号１１６）を使用して、複製連鎖反応を起させ３８０塩基対の断片を作製した。カナリアポックスＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレチド・プライマーＣ６Ｃ１（配列番号１１７）とＣ６Ｄ１（配列番号１１８）を使用して、第二の複製連鎖反応を起させ１１５５塩基対の断片を作製した。この二回の複製連鎖反応により作製された産物をプールして、Ｃ６Ａ１（配列番号１１５）とＣ６Ｄ１（配列番号１１８）を使用して最終の複製連鎖反応を起こさせ、１６１３塩基対の断片を作製した。この最終の複製連鎖反応により作製された産物をSacIとKpnIで切断して、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene社、La Jolla、カルフォルニア）のSacI部位とKpnI部位との間に挿入した。ここで得られた挿入プラスミドをｐＣ６Ｌと呼ぶ。
実施例２１ ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣをベースにしたＣＤＶ組み換えウイルスの発現分析
感染したベロ（Vero）細胞破砕物を調製し、以前に説明したように（Taylorら、1990）、ＣＤＶ血清反応陽性イヌ（ＮＹＶＡＣベースの組換体用）から採取した抗血清、およびＣＤＶＨＡまたはＦ糖タンパク質のいずれかを発現しているワクシニアウイルス組換体を接種したウサギ（ＡＬＶＡＣベースの組換体）から採取したモノ特異的抗血清を使用して免疫沈降分析を行った。この分析結果から、組換体ウイルスによる適当なＣＤＶ遺伝子産生物の発現が確認された。
実施例２２ イヌにおける、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶＨＦ（ｖＣＰ２５８）によるＣＤＶ感染防御
ＡＬＶＡＣベースのＣＤＶ・ＨＡとＦ・組換体ウイルスの防御効果について、イヌを、接種に続いて、生きたＣＤＶ投与に暴露させることによって評価した。この評価試験では、１３匹のＣＤＶ血清反応陰性のビーグル犬を２つの接種群（３匹には、１０7pfu・ｖＣＰ２５８ワクチンを投与、４匹には１０5.5pfu・ｖＣＰ２５８ワクチンを投与）に分け、残り６匹を非接種の対照群とした。ワクチン接種は、３週間ごとにｖＣＰ２５８ワクチンの１０7pfu（グループ１）かまたは１０5.5pfu（クループ２）のいずれかを皮下接種で行った。４２日目に、全部のイヌに１：１０・ＮＶＳＬ／ＣＤＶ投与ストックの頭蓋内投与をした。投与後２８日間毎日これらのイヌの罹患率と死亡率をモニターした。
ｖＣＰ２５８を接種したイヌには局所的にも全身的にも望まくしない作用は認められなかった。接種をしていない全部のイヌでは、ウイルスへの投与後６日から１７日で、食欲不振、結膜炎、うつ病、体重減少、脱水症などのＣＤＶ感染を示す臨床徴候を示した。投与後１，３，８，１３日目の４回に亘り、発熱のピーク（＞１０３．５°Ｆ）が観察された。対照群のうちの４匹では重篤な臨床徴候を示した。これらのうちの１匹は投与時から１２日に死亡し、残りの３匹は投与１３日から１７日で安楽死させた。生き残った２匹は、症状は軽く再度回復し投与から１９日目に体重の増加が見られた。
重要なことには、いずれの投与量でワクチンを投与したグループにおいても、ＣＤＶ感染の臨床的徴候は見られなかった。すべてのイヌで体重増加が見られ、観察期間中も正常な行動を示した。さらに、発熱の徴候も認められなかった。
表２１は、投与前の種々の時間における各群でのＣＤＶ特異的血清反応を示したリストである。抗体価は、５０％中和端点で表示され、各グループの平均抗体価を示している。この１０5.pfu・ワクチン投与量が、相当レベルのＣＤＶ血清中和活動を誘導していないにもかかわらず、このような低レベル量を投与したイヌはすべて有害なＣＤＶ感染に対して完全に防御作用を示したことは興味深いことである。
Figure 0004108742
実施例２３ イヌにおける別のイヌ病原体ワクチンと併用した場合の、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）の効果
ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）をイヌの他の病原体ワクチンと併用した場合にも感染防御効果があるかどうかを調べるために、下記の研究を行った。ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）をｍｌ当たり１０4.6，１０4.8，１０5.5ＴＣＩＤ50の投与量に希釈し、イヌアデノウイルス２型ワクチン（ＣＡＶ2）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰｉ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶx1）、レプトスピラ・カニコラーイクテロハモリーゲ・バクテリン（Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae Bacterin）（ＬＣＩ）またはＡＬＶＡＣ−狂犬病ウイルスワクチン（ｖＣＰ６５）と混合した。２４匹の血清反応陰性イヌおよび２匹の血清反応陽性イヌに、表２２で示したような方法で、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ単独で、あるいは、別のイヌワクチンを併用で接種した。０日目、２１日目の２回、イヌに皮下で接種した。ＣＤＶ血清中和力価を測定するために０日目、２１日目、ウイルス投与前に採血した。イヌの頭蓋内への第二接種後２４日または５０日のいずれかに２グループについて、ＵＳＤＡにより提供されたＣＤＶウイルスを投与した。ウイルスへの投与後、５カ月に亘り、ＣＤＶ感染をモニターするために観察した。投与結果、血清学結果を表２３に示す。
結果は、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）の４．８ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のみを接種したイヌのＣＤＶ特異的平均中和抗体価が１．２であったのに対して、５．５ｌｏｇ10のイヌワクチンを併用した場合の平均抗体価は１．０、４．８ｌｏｇ10の併用の場合には、抗体価は０．７であった。これらのワクチンを接種したイヌはすべて投与されても生き残った。５．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を併用接種したグループの中の１匹はウイルス投与後に非特異的徴候を示し、４．８ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を併用接種したグループのうちの１匹がＣＤＶ感染に特異的な徴候を示した。
この研究では、イヌ・コロナウイルス・ワクチンの接種およびＡＬＶＡＣ狂犬病ウイルスワクチンの接種における血清反応もモニターした。さらに重要なことは、併用ワクチンの中にＡＬＶＡＣ−ＣＤＶを混合した場合にも、イヌコロナウイルスワクチンと狂犬病ウイルスワクチンに対する血清反応を阻害することはなかった。
実施例２４ ＣＤＶ感染に対してフェレットをモデルに使用した場合
イヌジステンパーウイルスと麻疹ウイルス（ＭＶ）は、ともにParamyxoviridae科のMorbillivirus属であり互いに関係が深い。Hallらは（1980）、ＭＶに対する抗血清は、ＭＶとＣＤＶの両方のＨＡ、Ｐ、ＮＰ、Ｆ、Ｍポリペプチドを免疫沈降させ、一方、ＣＤＶに対する抗血清も、すべてのＣＤＶポリペプチドとＨＡ以外のすべてのＭＶポリペプチドを沈降させたことを報告している。Morbillivirus（麻疹ウイルス）はそのウイルス間では互いに関係が深いけれども、本来のものでない宿主との交雑感染は容易にはしない（De Lay et aL.,1965）。その理由は、おそらくウイルス性血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の各ウイルスの種特異的細胞レセプターとの特異的な相互作用のためである（Dorigら、1994）。このように、麻疹ウイルスの病因やワクチン開発用に直接使用できる適当な小型動物モデルは存在しない。但し、自然の宿主では、別の違った種類の麻疹ウイルスが全く似たような病気の原因となり、その防御免疫のメカニズムも非常に関連が深いのである（Liuら、1957，Kauffmaら、1982，Beauvergerら、1993，Krakowkaら、1979，Stephensen and ter Meulen、1979，Brown and McCarthy、1974）。しかし、ＣＤＶは自然にフェレットに感染するので、麻疹ウイルスの病原体の研究用の優れたモデルとなる。さらに、麻疹ワクチンでフェレットを免疫化することで、ＣＤＶ投与に対する防御が可能であることが示されており（Gerberら、1976，Bakerら、1966）、子犬に対する異種ＭＶ接種がＣＤＶによる直接接種の母子抗体阻害を克服する方法として獣医により長い間利用させてきた（Bakerら、1970，Chalmersら、1994，Strating 1975，Dudleyら、1978，Prydie 1968）。このため、ＣＤＶワクチンと麻疹ワクチンの両方の投与感染に対する防御の効果を試験するためにＣＤＶ接種フェレットモデルを使用した。
そこで、フェレットモデルをＣＤＶとＭＶワクチンの感染防御効果の評価に使えるかどうかを知るために下記の実験を行った。ヨーロッパ・フェレット（Mustela putorius furo）に、筋内投与により１０8pfuのＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ・ＨＡ＋Ｆ（ｖＣＰ２５８）ワクチンまたはＮＹＶＡＣ−ＣＤＶ・ＨＡ＋Ｆ（ｖＰ１２０２）ワクチンを接種した。対照動物には、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣの組換体の同等投与量または生理食塩水を接種した。フェレットの１グループに、フェレットの試験ではすでに広く使用されている（Appelら、1988）弱毒化・生ワクチン（DISTEM-RTC、シェーリングCorp.、ニュージャージ州）を投与した。１４−１８週齢のフェレットを免疫化してその血清反応をモニターした。第２回目の接種の後、２２週目、４週目に鼻腔内投与によりＣＤＶウイルスのシンダーヒル株（Snyder Hill）の１×１０3ＴＣＩＤ50をフェレットに投与し、発病の臨床経過をモニターした。接種と感染操作の結果は表２４の通りである。
この結果が示すように、対照群ではＣＤＶ特異的中性化抗体価を示さず、発熱、体重減少、白血球減少症、活動低下、結膜炎、ジステンパー感染とＣＮＳ感染に特徴的な紅班性発疹を発症した後、ウイルス投与後１８日目までに死亡した。ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶとＮＹＶＡＣ−ＣＤＶ、および弱毒化生ＣＤＶワクチンを投与された群では、≧１：９６のウイルス中和抗体価を示し、全部のフェレットが生存した。組み換えワクチンを投与したフェレットには感染の徴候はなかった。弱毒化ワクチンを接種したフェレットには、体重減少、リンパ球減少症、典型的紅班性発疹の徴候が現れた。これらの結果から、フェレットがＣＤＶワクチンの効果を評価するモデルとして優れていることが判明した。
実施例２５ Ｍ遺伝子とＮ遺伝子をＡポックス・ウイルス・ベクター由来のワクチンに導入することにより得られる防御増強効果に関する評価
これまでの研究で分かったことは、ＣＤＶまたはＭＶ・ＨＡおよびＦ・タンパクが発現することがイヌにおけるＣＤＶ感染の防御の役目をし（本出願およびTaylor 1992）、これらのタンパク質の発現が、確実にすべてのベクター由来のワクチンの効果の基礎となっているということである。但し、Ｎタンパク質の役割については依然不明である。Brinckmannら（1991）は、Ｎ遺伝子を発現するＶＶベースの組換体を接種したラットでは、麻疹脳炎に対して完全な感染防御を示したことを報告している。その後の研究で、Ｎタンパク質に特異的なＣＤ４+Ｔリンパ球の存在がこの防御の基礎になっていることが示唆された（Bankampら、1991）。これと対照的に、Wildら（1992）は、ＢＡＬＢ／ｃ投与マウスでは、Ｎタンパク質の発現だけでは投与に対して十分でないことを示している。ＣＢＡ投与マウスにおいて、ＶＶ−Ｆ−Ｎ組換体からＦとＮが一緒に発現した時には、Ｆ遺伝子だけを単独で発現した場合に較べてその防御効果が高まっている。げっ歯類に、呼吸感染の原因となる麻疹ウイルスを頭蓋内投与したことにより誘導された防御から何がわかるかについては不明である。防御機能を誘発するＮタンパク質の役割については、関連した系においてまだ研究すべきことが多い。同様に、ラットモデルにおいて、ＶＶベクターによって単独に発現するＭタンパク質の場合の防御効果は限定的である（Brinckmannら、1991）。ただし、Ｍタンパク質はウイルス粒子集合体に関連していることは判明しているので（Norrby and Oxmanら、1990）、別のウイルス粒子タンパク質と一緒にＭタンパク質を発現させることにより、組換体感染細胞内の抗原作用を最適化しうるかも知れない。このようなアプローチをすることは、候補ワクチンの増強免疫原性につながるであろう。Ｍタンパク質とＮタンパク質をポックスウイルスベクター由来のワクチンに導入することで付加的に得られるであろう長所を評価するために下記の組み換え操作を行った。
ＣＤＶ・Ｍ・Ｎ遺伝子のｃＤＮＡクローン誘導： ベロ（Vero）細胞単層にＣＤＶのOnderstepoort株を接種した。早期の細胞変性効果が明白であるとき、感染細胞単層を収集して、Chirgwinらが報告（1979）しているような総ＲＮＡ調製物を誘導するために抽出をした。ランダムプライミングヘキサマーを用いたHuynhらの方法で、このＲＮＡ調製物から第１の一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いての32Ｐ・ｄＡＴＰの取り込みによって、合成経過をモニターした。
ＣＤＶ・ＮをＡＬＶＡＣとＮＹＶＡＣベクターに挿入するためのプラスミドの作製： ｃＤＮＡの合成の後、Ｎ遺伝子を含む塩基配列を特異的プライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して増幅させた。プライマー５’ＣＤＶＮＸ（配列番号１２３）と３’ＣＳＶＮ２（配列番号１２４）の配列には、エントモポックスウイルス４２Ｋプロモーターを含む５’非ハイブリダイズ塩基配列を含んでいた。このＰＣＲ産物をAsp718とXbaIにより切断し、１．６ｋｂの断片を単離し、Asp718とXbaIで消化したｐＢＳ・ＳＫ＋中にクローン化した。
プライマー５’ＣＤＶＮＸ（配列番号１２３）：
Figure 0004108742
プライマー３’ＣＳＶＮ２（配列番号１２４）：
Figure 0004108742
ＣＤＶ・Ｎ遺伝子の塩基配列は、図１８で、配列番号１２５として示した。この塩基配列をOnderstepoort株（Genbank Accession ＃Ｌ１３１９４）のＣＤＶ・Ｎ遺伝子と比較した場合、位置８２，８３，１８９，１９０，１０５０，１０５１，１０５２，１３７０，１４０２，１４０９および１４３２の１１個のヌクレオチドに差異があった。この結果、アミノ酸位置２８，６３，６４，３５１，４５７，４６８，４７０および４７８の８個のアミノ酸変化が発生した。いくつかの独立に誘導されたｃＤＮＡクローンの分析においても同一の塩基配列が見られたことから、これらの差異は真のもので、ランダムＲＴまたはＰＣＲ上のエラーから発生したものではないことが判明した。
これらのクローンの塩基配列の決定を行ったところ、そのすべてに４２ｋｂプロモーター塩基配列に欠失があることが分かった。このクローンのうち欠失が最小のものを鋳型として使用し、ワクシニアＩ３Ｌプロモーター塩基配列を含むプロモーターとして、プライマー５’・Ｉ３ＬＮ２（配列番号１２６）と３’・ＸｍａＮ２（配列番号１２７）を使用して、ＡＴＧ部位とPspAI部位との間のＮ遺伝子の５’末端を増幅させた。１７５塩基対のバンドを単離し、Asp718とPspAIで切断し、Asp718とXbaIで切断したｐＢＳ・ＳＫ+中にクローン化してプラスミドＮＨ７とした。このプラスミドＨＮ７の塩基配列を決定することで、このクローンにはＮ遺伝子と結合している完全なＩ３Ｌプロモーターが含まれることが確認された。このプラスミドＨＮ７をAsp718とXbaIで切断し、１．６ｋｂのバンドを単離し、Asp718とXbaIで切断したプラスミドＶＱＣ５Ｌ−ＳＰ１中にクローン化した。このプラスミドは、ＡＬＶＡＣのＣ５遺伝子座に挿入することを目的としている。ここで作製したプラスミドＶＱＣＮ１の塩基配列を調べてＮ遺伝子とプロモーター結合状態を確認した。ＮＹＶＡＣベースの挿入プラスミドを作製するために、Ｉ３Ｌプロモーターと連結しているＮ遺伝子を有する１．６ＫＰのXbaI/Asp718断片をＨＮ７プラスミドから分離し、その後、ｐＳＤ５４４ＶＣ由来の３．６ＫＢのHindIII/Asp718断片中にクローン化した。このプラスミドｐＳＤ５４４ＶＣは、ＡＬＶＡＣのＨＡ遺伝子座に挿入することを目的としている。この結果得られたプラスミドｐＨＡＤＣＤＶＮＩ３Ｌの塩基配列を決定して、ＣＤＶＮ遺伝子およびプロモーターの適当な挿入を確認した。
プライマー５’Ｉ３ＬＮ２：配列番号２６
Figure 0004108742
プライマー３’ＸｍａＮ２：配列番号２７
Figure 0004108742
ＣＤＶ・Ｍ遺伝子をＡＬＶＡＣに挿入するためのプラスミドの作製： ｃＤＮＡ合成に続いて、Ｍ遺伝子を有する塩基配列を、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させた。プライマー５’ＣＤＶＭ３（配列番号１２８）および３’ＣＤＶＭ２（配列番号１２９）の塩基配列にはＥ３Ｌプロモーターを特定する５’非ハイブリダイズ塩基配列を含んでいた。このＰＣＲ産物をBamHIで切断し、１．１ｋｂのバンドとして単離して、その後、BamH1切断のｐＢＳＳＫ+中にクローン化し、これをプラスミドＭ１とした。プラスミドＭ１の塩基配列を決定し、完全なＥ３ＬプロモーターとＭ遺伝子が含まれていることが判明した。Ｍ遺伝子の塩基配列は、配列番号１３０として図１９に示されている。Onderstpoort株（Genbank Accession ＃Ｌ１３１９４）のＣＤＶＭ遺伝子の塩基配列に比較して、このＭ遺伝子の配列では、位置４７、４７４、５２９、５８４および６３９に５個のヌクレトチドの違いを有している。この結果、１６，１７７，１９５および２１３の位置の４個のアミノ酸に変化が起こった。いくつかの独立に誘導されたｃＤＮＡクローンの分析をしたところ、その塩基配列が同一であり、これらの相違は、真のもので、ランダムＲＴやＰＣＲでのエラーが原因ではないことを示している。
プライマー５’ＣＤＶＭ３：配列番号２８
Figure 0004108742
プライマー３’ＣＤＶＭ２：配列番号２９
Figure 0004108742
プラスミドＭ１を、その後、BamHIとBamHIで切断し、BamHI切断ＶＱＣ５Ｌ−ＳＰ１中にクローン化した。このプラスミドＶＱＣ５Ｌ−ＳＰ１は、ＡＬＶＡＣのＣ５遺伝子座に挿入することを目的としている。この結果得られたプラスミドＶＱＣＭ７の塩基配列を決定して、Ｍ遺伝子の塩基配列とプロモーター結合を確認した。
ＣＤＶ・Ｍ遺伝子とＮ遺伝子をＡＬＶＡＣベクターに挿入するためのプラスミドの作製： Ｉ３Ｌプロモーターと結合しているＣＤＶ・Ｎを含む１．６ｋｂのXbaI/Asp718断片をプラスミドＨＮ７から単離し、Ｅ３Ｌプロモーターと結合しているＭ遺伝子を含むAsp718/XbaI切断のＶＱＣＭ７中へクローン化した。その結果得られたプラスミドＶＱＣＭＮ３の塩基配列を決定して適切な挿入位置を確認した。
ＭＶ・Ｍ・Ｎ遺伝子のｃＤＮＡクローン誘導： ベロ細胞単層にＭＶのEdmonston株を接種した。早期の細胞変性効果が明白であるときに、感染細胞単層を収集して、Chirgwinらが報告（1979）しているような総ＲＮＡ調製物を誘導するための抽出を行った。Huynhら（1985）の方法で、プライマーＭＶＰ１（配列番号１３１）を使用して、このＲＮＡ調製物から第１の一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて32Ｐ・ｄＡＴＰの取り込みにより合成経過をモニターした。
プライマーＭＶＰ１：配列番号３１
Figure 0004108742
ＭＶ・Ｎ遺伝子をＡＬＶＡＣとＮＹＶＡＣベクターに挿入するためのプラスミドの作製： ｃＤＮＡ合成に続いて、Ｎ遺伝子を有する塩基配列を、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させた。使用したプライマーＭＶＮ１（配列番号１３２）とＭＶＮ２（配列番号１３３）の塩基配列にはＩ３Ｌプロモーターを特定する５’非ハイブリダイズ塩基配列を含んでいた。このＰＣＲ産物をＪ６９と名付け、Pst1/HindIIIで切断し、１．６ｋｂのバンドとして単離して、Pst1/HindIII切断のｐＢＳ−・ＳＫ+中にクローン化し、これをプラスミドＱＰ１とした。第２のクローンＱＰ３も得られた。
プライマーＭＶＮ１：配列番号１３２
Figure 0004108742
プライマーＭＶＮ２：配列番号１３３
Figure 0004108742
ＭＶ・Ｎ遺伝子のヌクレオチド塩基配列は、配列番号１３４として図２０に示されている。Edmonston株の麻疹Ｎ遺伝子の塩基配列とちがって（Billeterら、1990，遺伝子銀行 寄託番号 ＃Ｋ０１７１１、ｘ１６５６５）、このＭＶ・Ｎ遺伝子の配列では、６６５，６６６，９２２，９２５，９４４，１０４４，１１４０，１２６３，１２９１，１４７９，１４８０，１４９０および１５４７の位置に１３個のヌクレトチドの違いを有している。この結果、２２２，３０８，３０９，３１５，４２１，４９３，４９４，４９７および５１６の位置の９個のアミノ酸に変化が起こった。いくつかの独立に誘導されたｃＤＮＡクローンの分析をしたところ、その塩基配列が同一であり、これらの相違は、真のもので、ランダムＲＴやＰＣＲでのエラーが原因ではないことが判明した。
これらのクローンの塩基配列決定により、プラスミドＱＰ１には位置１４５に塩基エラーがあり、プラスミドＱＰ３には位置１２１６に塩基エラーがあることが分かった。これらのエラーを修正するために、約７００ｂｐのEcoRV/HindIII断片をプラスミドＱＰ３から単離し、プラスミドＱＰ１由来の３．８ｋｂEcoRV/HindIII断片中にクローン化した。その結果得られたプラスミドＱＴ１は、塩基配列分析により配列は正しいものであることが確認され、これをＰＢＳＭＶＮと名付けた。Ｉ３Ｌプロモーターを含むＰＣＲ断片Ｊ９９とBamHI部位までの５’Ｎ配列を、プライマーＪＰ２９０（配列番号１３）とＪＰ２８４（配列番号１４）および鋳型ＰＢＳＭＶＮを使用して合成を行った。ＰＣＲ断片Ｊ９９をXhoI/BamHIで切断し、ＰＢＳＭＶＮから分離した４．４ｋｂのXhoI/BamHI断片中にクローン化した。この結果得られたプラスミドＲＭ１の塩基配列決定分析を行った。１．５ｋｂのXhoI/PstI断片をＲＭ１から単離して、SmaIで切断されたプラスミドｐＭＭ１１７中にクローン化した。このプラスミドｐＭＭ１１７は、ＡＬＶＡＣのＣ６挿入遺伝子座に挿入することを目的としている。その結果得られたプラスミドｐＣ６ＭＶＮＩ３Ｌの塩基配列決定を行った。同等のＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを作製するために、１．５ｋｂのXhoI/PstI断片をプラスミドＲＭ１から誘導、SmaI切断のｐＳＤ５５０ＶＣ中にクローン化した。このプラスミドｐＳＤ５５０ＶＣは、ＡＬＶＡＣの１４Ｌ挿入遺伝子座に直接挿入した。この結果得られたプラスミドｐＩ４ＬＭＶＮＩ３Ｌの塩基配列決定を行った。
プライマーＪＰ２９０：配列番号１３５
Figure 0004108742
プライマーＪＰ２８４：配列番号１３６
Figure 0004108742
ＭＶ ＭのＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベクターへの挿入用プラスミドの開発： ｃＤＮＡ合成に続いて、Ｍ遺伝子を有する塩基配列を、複製連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。Ｅ３Ｌプロモーターに結合した麻疹遺伝子を含む、ＰＣＲ断片Ｊ８９をプライマーＪＰ２８５（配列番号１３７）とＪＰ２８６（配列番号１３８）を使用し、第１ストランドｃＤＮＡを鋳型として作製した。
プライマーＪＰ２８５：配列番号１３７
Figure 0004108742
プライマーＪＰ２９６：配列番号１３８
Figure 0004108742
ＰＣＲ産物Ｊ８９をPstIで切断して１ｋｂのバンドとして単離し、カナリアポックスウイルスのＣ６遺伝子座に挿入することを目的とするｐＭＭ１１７のPstI切断中にクローン化した。その結果得られたプラスミドＲＦ１の塩基配列決定を行った結果、Ｅ３Ｌプロモーター部位にエラーを含んでいることが判明した。マトリックス遺伝子の塩基配列を図２１に［配列番号１３９］として示した。Edmonston株の麻疹Ｍ遺伝子の塩基配列とちがって（Billeterら、1990，遺伝子銀行 寄託番号 ＃Ｋ０１７１１、Ｘ１６５６５）、この遺伝子の配列では、１９０，４２５の位置に２個のヌクレトチドの違いを有していた。この結果、６４，１４２の位置の２個のアミノ酸に変化が起こった。いくつかの独立に誘導されたｃＤＮＡクローンの分析をしたところ、その塩基配列が同一であり、これらの相違は、真のもので、ランダムＲＴやＰＣＲでのエラーが原因ではないことを示している。単離したＰＣＲＪ８９をその後、PstI切断のｐＢＳ−ＳＫ＋中にクローン化した。この結果得られたプラスミドＲＨ２の塩基配列決定をした結果、完全なＥ３Ｌプロモーターを含んでいることが判明した。完全なＥ３ＬプロモーターとＭ遺伝子のAvrII部位まで５’末端を含む３００ｂｐのPstI/AvrII断片をＲＨ２から単離し、ＲＦ１から単離した５．３ｋｂのPstI/AvrII断片中にクローン化した。この結果得られるプラスミドＲＮ１は、塩基配列は正確だが遺伝子が逆配向であることが判明した。１ｋｂのPstI断片をＲＮ１から単離し、PstI切断のｐＭＭ１１７中にクローン化した。この結果得られたプラスミドｐＣ６ＭＶＭＥ３Ｌの塩基配列を決定した。対応するＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを作製するために、１ｋｂのPstI断片をＲＮ１プラスミドから分離し、その後、Asp718で切断されたプラスミドｐＳＤ５５０ＶＣ中にクローン化した。この結果得られたプラスミドｐＩ４ＬＭＶＭＥ３Ｌは、Ｉ４Ｌ遺伝子座に挿入することを目的としており、その塩基配列が確認された。
ＣＤＶ・Ｎ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣとＮＹＶＡＣベースの組換体の作製： Ｉ３Ｌプロモーターに結合しているＣＤＶ・Ｎ遺伝子を有する挿入プラスミドＶＱＣＮ１とｐＨＡＤＣＤＶＮＩ３ＬをＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣウイルスにそれぞれ感染させた初期ＣＥＦ細胞にトランスフェクト（移入）した。Ｎ遺伝子特異的放射線標識したプローブを使用して、in situ・プラーク・ハイブリダイゼーションを基礎にして組換え子孫を選択した。同質集団が得られるようになるまで組換体をプラーク精製し、そして組換体をＣＥＦ細胞内で増幅させて発現分析を行った。ＣＤＶ・Ｎ遺伝子をＡＬＶＡＣに挿入した結果、組換体ｖＣＰ３３１が産生され、ＮＹＶＡＣへの挿入ではｖＰ１３３１が産生された。Ｄ１１０１と命名されたＮ特異的モノクローナル抗体を使用して、ＣＤＶ、ｖＰ１３３１、またはｖＣ３３１で感染させたベロ細胞の放射線標識をした破砕物の免疫沈降分析を行った。この分析の結果、ＣＤＶ、ｖＰ１３３１、またはｖＣ３３１で感染させたベロ細胞には、５６と５３ＫＤａの２個のタンパク質が発現していることが判明した。感染をさせてない細胞またはＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染させた細胞ではタンパク質は沈降しなかった。プラスミドｐＨＡＤＣＤＶＮＩ３Ｌを、以前にＣＤＶ・ＨＡやＦ遺伝子を発現すると報告されている組換体ＮＹＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＰ１２０２）で感染させた細胞への移入に使用した。この結果得られた組換体ｖＰ１３３０は免疫沈降法によりＮ遺伝子を発現することが判明した。
ＣＤＶ・Ｍ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換体の作製： Ｅ３Ｌプロモーターと結合しているＣＤＶ・Ｍ遺伝子を有するプラスミドＶＱＣＭ７をＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染させたＣＥＦ細胞に移入した。放射線標識したＭ遺伝子特異的プローブを使用して、in situプラーク・ハイブリダイゼーションを基礎にして組換え子孫を選択した。その結果派生された組換体ｖＣＰ３３４が、Ｍ特異的モノクローナル抗体ＸＩ・６・１０を使用したウエスタンブロット法により約３７ＫＤａのタンパク質を発現することが判明した。このタンパク質はＣＤＶに感染させたベロ細胞に見られる同等のタンパク質とともに泳動され、これにより発現産物が真正であることが示された。
ＣＤＶ・ＭとＮ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換体の作製： Ｅ３Ｌプロモーターと結合しているＣＤＶＭ遺伝子とＩ３Ｌプロモーターと結合しているＣＤＶＮ遺伝子を含むプラスミドＶＱＣＭＮ３をＡＬＶＡＣ親ウイルスまたは、以前にＨＡとＦ遺伝子を発現すると報告されているＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）に感染させた細胞に移入した。Ｍ遺伝子とＮ遺伝子特異的放射線標識したプローブを使用して、in situ・プラーク・ハイブリダイゼーションを基礎にして組換え子孫を選択した。ＡＬＶＡＣベースの組換体をｖＣＰ３３６と名付け、ｖＣＰ２５８ベースの組換体をｖＣＰ３３５と名付けた。Ｎ特異的モノクローナル抗体Ｄ１１０１を使用して免疫沈降分析により、ｖＣＰ３３５とｖＣＰ３３６内でのＮ遺伝子の発現を確認した。Ｍ特異的モノクローナル抗体ＸＩ・６・１０を使用したウエスタンブロット法によりＭタンパク質の発現を確認した。
ＭＶ・Ｎ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣベースの組換体の作製： Ｉ３Ｌプロモーターと連結しているＭＶ・Ｎ遺伝子を有する挿入プラスミドｐＣ６ＭＶＮＩ３ＬとｐＩ４ＬＭＶＮＩ３Ｌを、ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣウイルスにそれぞれ感染させた初期ＣＥＦに移入した。Ｎ遺伝子特異的放射線標識したプローブを使用して、in situ・プラーク・ハイブリダイゼーションを基礎にして組換え子孫を選択した。ＭＶＮ遺伝子をＡＬＶＡＣに挿入した組換体をｖＣＰ３１８とし、ＭＶＮ遺伝子をＮＹＶＡＣに挿入した組換体をｖＰ１２９４とした。Ｎ特異的モノクローナル抗体Ｎ２５を使用して、ｖＰ１２９４またはｖＣＰ３１８に感染させたHeLa細胞の放射線標識をした破砕物で免疫沈降分析を行った。この沈降分析の結果、ＭＶＮタンパク質の公知となっているサイズと一致する約６０ＫＤａのタンパク質の発現があることが確認された。感染させてない細胞または親ウイルスに感染させた細胞からはタンパク質の沈降はなかった。以前すでにＭＶ・ＨＡ遺伝子とＦ遺伝子を発現させることが判明している組換体ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）に感染させた細胞への移入にプラスミドｐＣ６ＭＶＮＩ３Ｌも使用した。その結果得られた組換体ｖＣＰ３３３もＮ遺伝子を発現させることが免疫沈降分析で判明している。以前すでのＭＶ・ＨＡ＋Ｆを発現させることが判明している組換体ＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）に感染させた細胞への移入にプラスミドｐＩ４ＬＭＮＩ３Ｌも使用した。その結果得られた組換体ｖＰ１３２６はＮ遺伝子を発現することがウエスタンブロット分析で明らかになった。
ＭＶ・Ｍ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換体の作製： Ｅ３Ｌプロモーターと連結しているＭＶ・Ｍ遺伝子を有するプラスミドｐＣ６ＭＶＭＥ３Ｌを、ＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染させたＣＥＦ細胞に移入した。Ｍ遺伝子特異的放射線標識したプローブを使用して、in situ・プラーク・ハイブリダイゼーションを基礎にして組換え子孫を選択した。ケミコン・インターナショナル社の市販の８９１０と命名されたＭ特異的モノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った結果、ここで得られた組換体ｖＣＰ３１７は、約３７ＫＤａのタンパク質を発現することが判明した。
Figure 0004108742
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本発明の好適な実施例について詳しく説明したが、添付クレームにおいて限定した本発明は、上記で説明した詳細例に限定されるものでなく、この発明の精神と範囲に反することなしに多くに異なる実施態様を構成できることは明白である。
Figure 0004108742
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Claims (17)

  1. ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡがイヌジステンパーウイルス融合タンパク質およびイヌジステンパーウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードしており、該ポックスウイルスが、
    （ｉ）Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌが欠失した、あるいはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域および巨大サブユニットリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の読取り枠が欠失した、組換えワクシニアウイルス；および
    （ii）ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣの全ての性質を有するポックスウイルス；よりなる群から選択され、さらに前記タンパク質を発現することを特徴とする組換えポックスウイルス。
  2. 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
  3. ＮＹＶＡＣ組換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
  4. ｖＰ１２０２であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
  5. 前記ポックスウイルスがＡＬＶＡＣウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
  6. ｖＣＰ２５８であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
  7. ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡがイヌジステンパーウイルス融合タンパク質をコードしており、該ポックスウイルスがＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣの全ての性質を有するポックスウイルスであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
  8. ｖＣＰ１９４であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の組換えポックスウイルス。
  9. ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡがイヌジステンパーウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードしており、該ポックスウイルスがＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣの全ての性質を有するポックスウイルスであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
  10. ｖＣＰ１８４であることを特徴とする請求の範囲第９項記載の組換えポックスウイルス。
  11. ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡがイヌジステンパーウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードしており、該ポックスウイルスが、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌが欠失した、あるいはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域および巨大サブユニットリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の読取り枠が欠失した、組換えワクシニアウイルスであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
  12. ｖＰ１０２８であることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の組換えポックスウイルス。
  13. ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡがイヌジステンパーウイルス融合タンパク質をコードしており、該ポックスウイルスが、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌが欠失した、あるいはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域および巨大サブユニットリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の読取り枠が欠失した、組換えワクシニアウイルスであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
  14. ｖＰ１０２９であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の組換えポックスウイルス。
  15. イヌまたは他の肉食動物（ヒトを除く）において、イヌジステンパーウイルスに対する抗原反応または免疫反応を誘導する方法であって、請求の範囲第１項、第７項、第９項、第１１項または第１３項のいずれか１項記載のポックスウイルスを適当な担体と共に含有する組成物を、前記イヌまたは他の肉食動物に投与することを含むこと特徴とする方法。
  16. 請求の範囲第１項、第７項、第９項、第１１項または第１３項のいずれか１項記載のポックスウイルスを適当な担体と共に含有することを特徴とする、抗原反応または免疫反応を誘導するための組成物。
  17. 請求の範囲第１項、第７項、第９項、第１１項または第１３項のいずれか１項記載のウイルスを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子産物を生体外で培養された細胞で発現させる方法。
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