CN113039277A - 修饰的正痘病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开涉及修饰的正痘病毒载体以及使用其治疗多种癌症的方法。本发明公开提供了显示出多种有益治疗活性的修饰的正痘病毒载体，所述有益治疗活性包括提高的溶瘤活性、感染的扩散、免疫逃避、肿瘤持久性、掺入外源DNA序列的能力和安全性。我们所发现的病毒还对于大规模生产规程是可采用的。

Description

修饰的正痘病毒载体

技术领域

本发明涉及免疫疗法领域，例如，用于治疗细胞增殖异常，如癌症的免疫疗法领域。具体地，本发明涉及基因修饰的正痘病毒(orthopoxviruses)以及制备和使用所述正痘病毒的方法。

发明背景

可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞并靶向它们进行破坏。使用溶瘤正痘病毒(oncolytic orthopoxviruses)的免疫疗法是癌症研究中快速发展的领域。需要新的方法来工程设计和/或提高溶瘤病毒的肿瘤-选择性以使效率和安全最大化。当将潜在毒性的治疗剂或基因加入至病毒时，这种选择性是特别重要的。

尽管正痘病毒作为临床溶瘤载体的使用是有希望的癌症治疗范式，但是由于在患者中的毒性，如痘病变(pox lesions)以及免疫抑制副作用，大部分当前的临床候选仅显示出有限的临床成功。仍需要方法来工程设计显示出更稳健的病毒复制、癌细胞杀死和从感染点的扩展的正痘病毒。本发明通过使用修饰的牛痘病毒解决了这种需要并且提供了选择性和安全性限制的解决方案。

发明概述

本发明公开描述了正痘病毒用于癌症治疗的使用。具体地，本发明公开部分基于当基因修饰正痘病毒以包含以下基因中的一种或多种或者全部中的缺失时，意外提高的溶瘤活性，感染的扩展以及安全性结果：C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R、K ORF A、K ORF B、B ORFE、B ORF F、B ORF G、B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。在这些基因中的一种或多种或者全部中显示出突变的基因修饰的正痘病毒，如牛痘病毒(例如，哥本哈根(Copenhagen)、西储(Western Reserch)、惠氏(Wyeth)、李斯特(Lister)、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、Tian Tan和WAU86/88-1病毒)可以显示出一系列有益特征，如改善的溶瘤能力、肿瘤内的复制、感染性、免疫逃避(immune evasion)、肿瘤持久性(tumorpersistence)、掺入外源DNA序列的能力和/或大规模生产的可采性。本发明公开描述了进一步基因修饰以包含B8R基因中的缺失的正痘病毒。在以下公开的多个实施方式中，本发明可以或可以不包括B8R基因的缺失。在多个实施方式中，修饰的正痘病毒表达三种转基因中的至少一种：IL-12-TM、FLT3-L和抗-CLTA4抗体。

在第一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组(recombinantorthopoxviruses genome)的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因的缺失，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R基因中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R基因的缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4或5个基因，每个所述基因独立地选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个基因，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。在一些实施方式中，所述缺失包括C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。在一些实施方式中，编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是F1L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。在一些实施方式中，编码BCL-2抑制剂的基因是N1L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。在一些实施方式中，编码dUTP酶的基因是F2L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。在一些实施方式中，编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是B19R。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。在一些实施方式中，编码IL-1-β-抑制剂的基因是B16R。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。在一些实施方式中，编码磷脂酶-D的基因是K4L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。在一些实施方式中，编码PKR抑制剂的基因是K3L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是K2L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。在一些实施方式中，编码TLR信号转导抑制剂的基因是N2L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少2个基因的缺失，每个所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，编码kelch-样蛋白的基因独立地选自F3L和C2L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶(monoglyceride lipase)。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。在一些实施方式中，编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自K5L和K6L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。在一些实施方式中，编码NF-κB抑制剂的基因独立地选自K7R、K1L和M2L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自B18R、B20R和M1L。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，每个所述基因独立地选自B15R、B17R和B14R。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1、2、3或4个基因的缺失，所述基因选自K ORF A、K ORF B、BORF E、B ORF F和B ORF G。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还包括B8R缺失。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自末端反向重复(ITR)基因，所述末端反向重复(ITR)基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4、5、6、7或8个基因，每个基因独立地选自ITR基因，所述ITR基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。在一些实施方式中，所述缺失包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在一些实施方式中，牛痘病毒是选自哥本哈根、西储、Wyeth、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、Tian Tan和WAU86/88-1的株。在一些实施方式中，所述牛痘病毒是选自哥本哈根、西储、天坛(Tian Tan)、惠氏和李斯特的株。在一些实施方式中，所述牛痘病毒是哥本哈根株牛痘病毒。

在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的多核苷酸的部分缺失，从而所述缺失足以使所述基因无功能，例如，当引入宿主细胞中时。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码肿瘤相关抗原的转基因。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原是本文中的表3-30中的任一个中所列的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原是选自下列的肿瘤-相关抗原：CD19、CD33、EpCAM、CEA、PSMA、EGFRvIII、CD133、EGFR、CDH19、ENPP3、DLL3、MSLN、ROR1、HER2、HLAA2、EpHA2、EpHA3、MCSP、CSPG4、NG2、RON、FLT3、BCMA、CD20、FAPα、FRα、CA-9、PDGFRα、PDGFRβ、FSP1、S100A4、ADAM12m、RET、MET、FGFR、INSR和NTRK。在一些实施方式中，所述肿瘤相关抗原包括MAGE-A3或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤相关抗原包括NY-ESO-1或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤相关抗原包括一种或多种人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白或其片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括(i)HPV16的E6和E7蛋白或其片段和(ii)HPV18的E6和E7蛋白或其片段。在一些实施方式中，所述肿瘤相关抗原包括brachyury或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码免疫检查点抑制剂的转基因。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

本文所述的抗体或其抗原结合片段可以是全长抗体或抗体片段，如单克隆抗体或其抗原-结合片段、多克隆抗体或其抗原-结合片段、人源化抗体或其抗原-结合片段、灵长类源化抗体或其抗原-结合片段、双重特异性抗体或其抗原结合片段、多重特异性抗体或其抗原-结合片段、双可变免疫球蛋白域、一价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原-结合片段、单-链Fv分子(scFv)、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、抗体-样蛋白骨架、域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab')₂分子和串联scFv(taFv)。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段含有彼此共价结合的两个或更多个CDR，例如，通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或者二硫桥键或者通过接头，如本文所述的接头连接。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是单链多肽。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有同种型(isotype)，其选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码白介素的转基因。在一些实施方式中，所述白介素(IL)选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。在一些实施方式中，所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。在一些实施方式中，所述白介素是膜结合的。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码干扰素的转基因。在一些实施方式中，所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码TNF超家族成员蛋白的转基因。在一些实施方式中，所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

在一些实施方式中，所述核酸还包括编码细胞因子的转基因。在一些实施方式中，所述细胞因子选自GM-CSF、FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和脒基腺苷酸环化酶(cGAS)。在一些实施方式中，所述细胞因子是Flt3配体。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因的缺失单独重组正痘病毒载体，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4或5个基因，每个所述基因独立地选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。在一些实施方式中，所述缺失包括B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒载体具有至少1个基因的缺失，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、K1L、K2L、K3L、K4L、K7R和F2L。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个基因，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。在一些实施方式中，所述缺失包括C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，所述重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。在一些实施方式中，编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是F1L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码BCL-2抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。在一些实施方式中，编码BCL-2抑制剂的基因是N1L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码dUTP酶。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。在一些实施方式中，编码dUTP酶的基因是F2L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。在一些实施方式中，编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是B19R。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。在一些实施方式中，编码IL-1-β-抑制剂的基因是B16R。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码磷脂酶-D。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。在一些实施方式中，编码磷脂酶-D的基因是K4L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码PKR抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。在一些实施方式中，编码PKR抑制剂的基因是K3L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是K2L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。在一些实施方式中，编码TLR信号转导抑制剂的基因是N2L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码kelch-样蛋白。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，编码kelch-样蛋白的基因独立地选自F3L和C2L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少2个基因的缺失，每个所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。在一些实施方式中，编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自K5L和K6L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码NF-κB抑制剂。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。在一些实施方式中，编码NF-κB抑制剂的基因独立地选自K7R、K1L和M2L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。

在一些实施方式中，重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少2个基因的缺失，每个所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少3个基因的缺失，每个所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自B18R、B20R和M1L。

在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因选自B15R、B17R和B14R。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少2个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。在一些实施方式中，所述重组正痘病毒基因组具有至少3个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在另一个方面，本发明的特征在于包括重组正痘病毒基因组的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因选自K ORF A、K ORFB、B ORF E、B ORF F和B ORF G。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒载体具有至少1个基因的缺失，所述基因选自K ORF A、K ORF B、B ORF E、B ORF F和B ORF G。在一些实施方式中，所述载体具有至少2、3或4个基因的缺失，所述基因选自K ORF A、K ORF B、B ORF E、B ORF F和B ORF G。在一些实施方式中，所述缺失包括K ORF A、K ORF B、B ORF E、B ORF F和B ORF G中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在一些实施方式中，所述重组正痘病毒载体具有至少1个基因的缺失，所述基因选自ITR基因，所述ITR基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。在一些实施方式中，所述缺失包括至少2、3、4、5、6、7或8个基因，每个所述基因独立地选自ITR基因，所述ITR基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。在一些实施方式中，所述缺失包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R中的每一个。在本文所公开的任一个实施方式中，重组正痘病毒基因组还可以包括B8R缺失。

在一些实施方式中，所述正痘病毒是牛痘病毒。

在一些实施方式中，牛痘病毒是选自哥本哈根、西储、惠氏、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、DairenI、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、天坛和WAU86/88-1的株。在一些实施方式中，所述牛痘病毒是选自哥本哈根、西储、天坛、惠氏和李斯特的株。在一些实施方式中，所述牛痘病毒是哥本哈根株牛痘病毒。

在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的多核苷酸的部分缺失，从而所述缺失足以使所述基因无功能，例如，当引入宿主细胞中时。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码肿瘤-相关抗原的转基因。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原是本文中的表3-30中的任一个中所列的肿瘤-相关抗原。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原是选自下列的肿瘤-相关抗原：CD19、CD33、EpCAM、CEA、PSMA、EGFRvIII、CD133、EGFR、CDH19、ENPP3、DLL3、MSLN、ROR1、HER2、HLAA2、EpHA2、EpHA3、MCSP、CSPG4、NG2、RON、FLT3、BCMA、CD20、FAPα、FRα、CA-9、PDGFRα、PDGFRβ、FSP1、S100A4、ADAM12m、RET、MET、FGFR、INSR和NTRK。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括MAGE-A3或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括NY-ESO-1或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括一种或多种人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白或其片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括(i)HPV16的E6和E7蛋白或其片段和(ii)HPV18的E6和E7蛋白或其片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括brachyury或其一个或多个片段。在一些实施方式中，所述肿瘤-相关抗原包括前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码免疫检查点抑制剂的转基因。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

如上所述，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以是全长抗体或抗体片段，如单克隆抗体或其抗原-结合片段、多克隆抗体或其抗原-结合片段、人源化抗体或其抗原-结合片段、灵长类源化抗体或其抗原-结合片段、双重特异性抗体或其抗原结合片段、多重特异性抗体或其抗原-结合片段、双可变免疫球蛋白域、一价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原-结合片段、单-链Fv分子(scFv)、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、抗体-样蛋白骨架、域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab')₂分子和串联scFv(taFv)。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段含有彼此共价结合的两个或更多个CDR，例如，通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或者二硫桥键或者通过接头，如本文所述的接头连接。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是单-链多肽。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有同种型，其选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码白介素的转基因。在一些实施方式中，所述白介素(IL)选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。在一些实施方式中，所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。在一些实施方式中，所述白介素是膜结合的。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码干扰素的转基因。在一些实施方式中，所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码TNF超家族成员蛋白的转基因。在一些实施方式中，所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

在一些实施方式中，所述载体还包括编码细胞因子的转基因。在一些实施方式中，所述细胞因子选自GM-CSF、FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和脒基腺苷酸环化酶(cGAS)。在一些实施方式中，所述细胞因子是Flt3配体。

在一些实施方式中，一旦将哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)与所述核酸或所述重组正痘病毒载体接触，则相对于与不包括所述缺失的正痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的合胞体形成(syncytiaformation)，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的显微镜学技术通过目视检查所评价的。

在一些实施方式中，一旦将哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)与所述核酸或所述重组正痘病毒载体接触，则相对于与不包括所述缺失的正痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的正痘病毒载体的扩展，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的空斑形成测定(plaque-forming assays)所评价的。

在一些实施方式中，相对于不包括所述缺失的正痘病毒载体形式，所述核酸或所述重组正痘病毒载体对哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)施加了升高的细胞毒作用，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的细胞死亡测定所评价的。

在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞来自选自下列的细胞系：U2OS、293、293T、Vero、HeLa、A549、BHK、BSC40、CHO、OVCAR-8、786-0、NCI-H23、U251、SF-295、T-47D、SKMEL2、BT-549、SK-MEL-28、MDA-MB-231、SK-OV-3、MCF7、M14、SF-268、CAKI-1、HPAV、OVCAR-4、HCT15、K-562和HCT-116。

在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或重组正痘病毒载体的包装细胞系(packaging cell line)。

在另一个方面，本发明的特征在于通过向患者施用治疗有效量的所述核酸或所述重组正痘病毒载体，治疗哺乳动物患者中的癌症的方法。

在一些实施方式中，所述哺乳动物患者是人患者。

在一些实施方式中，癌症选自白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌和咽喉癌。

在一些实施方式中，癌症选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS-相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤因肉瘤家族肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、睾丸生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、舌癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、胚胎性癌肉瘤及其它儿童肾瘤、郎格罕细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌、中线道癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低度恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里氏综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和华氏巨球蛋白血症。

在一些实施方式中，所述方法还包括向患者施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，所述方法还包括向患者施用白介素。在一些实施方式中，所述白介素选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。在一些实施方式中，所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。在一些实施方式中，所述白介素是膜-结合的。

在一些实施方式中，所述方法还包括向患者施用干扰素。在一些实施方式中，所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

在一些实施方式中，所述方法还包括向患者施用TNF超家族成员蛋白。在一些实施方式中，所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

在一些实施方式中，所述方法还包括向患者施用细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(脒基腺苷酸环化酶)。

在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或载体的试剂盒和向所述试剂盒用户说明以在宿主细胞中表达核酸或载体的包装说明书。

在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或重组正痘病毒载体的试剂盒和向用户说明以向患有癌症的哺乳动物患者(例如，人患者)施用治疗有效量的所述核酸重组正痘病毒载体，借此治疗所述癌症的包装说明书。

定义

如本文所使用的，术语“约”是指大于或小于所描述的值不超过10％的值。例如，术语“约5nM”表示4.5nM至5.5nM的范围。

如本文所使用的，术语“抗体”(Ab)是指特异性结合至特定抗原或者对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子并且包括多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体和另外抗体的修饰形式，其包括(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、杂缀合抗体(例如，双特异性、三特异性和四特异性抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体)和抗体的抗原结合片段，包括(例如)Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。此外，除非另外说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)表示包括能够特异性结合至靶标蛋白的完整分子以及抗体片段(如(例如)Fab和F(ab')₂片段)两者。Fab和F(ab')₂片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物循环中更快速清除并且可以具有比完整抗体低的非特异性组织结合(参见Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316,1983；该文献作为参考并入本文)。

如本文所使用的术语“抗原-结合片段”是指保留了特异性结合至靶标抗原的能力的抗体的一个或多个片段。可以通过全长抗体片段来发挥抗体的抗原-结合功能。抗体片段可以是Fab、F(ab')₂、scFv、SMIP、双链抗体、三链抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体(aptamer)或域抗体(domain antibody)。术语抗体的“抗原-结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(但不限于)：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的一价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区通过二硫桥键所连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)包括VH和VL域的dAb；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH域组成；(vii)由VH或VL域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)可以通过合成接头任选地连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管通过单独的基因编码Fv片段的两个域VL和VH，但是可以使用重组方法，通过能够将它们制备为其中VL和VH区配对以形成一价分子的单一蛋白链的接头将它们连接(称为单-链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。使用本领域技术人员已知的常规方法可以获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学切割或者在一些实施方式中，通过本领域中已知的化学肽合成程序产生抗原结合片段。

如本文所使用的，术语“双重特异性抗体”是指对至少两个不同的抗原具有结合特异性的单克隆，通常为人或人源化抗体。

如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以可互换使用。所有这些术语还包括它们的子代，所述子代是任何和所有后代。应理解由于故意或偶然突变，所有子代可以不是相同的。

如本文所使用的，术语“嵌合(chimeric)”抗体是指具有来源于一个来源生物，如大鼠或小鼠的免疫球蛋白的可变序列和来源于不同生物(例如，人)的免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397；这些文献作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“互补决定区”(CDR)是指在轻链和重链可变域两者中存在的高变区。可变域更保守的部分被称为框架区(FR)。如本领域中所理解的，基于上下文和本领域中已知的多种定义，描述抗体高变区的氨基酸位置可以是不同的。可变域内的一些位置可以视为杂交的高变位置，其中在一组标准下，可以将这些位置视为在高变区内，尽管在不同组的标准下，可以将其视为是在高变区之外。这些位置中的一个或多个还可以存在于延伸的高变区中。天然重链和轻链的可变域分别包含通过三个CDR连接的4个主要采用β-折叠构型的框架区，其形成了连接β-折叠结构并且在一些情况下构成β-折叠结构的一部分的环。通过FR区将每条链中的CDR以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序紧密的保持在一起，并且与来自另一抗体链的CDR一起有助于抗体靶标结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；该文献作为参考并入本文))。

除非另外说明，否则如本文所使用的，根据Rabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行免疫球蛋白氨基酸残基的编号。

如本文所使用的，术语“保守突变”、“保守替换”或“保守氨基酸取代”是指一种或多种氨基酸对一种或多种显示出类似物理化学性质，如极性、静电电荷和空间体积的不同氨基酸的替换。在下表1中对20种天然存在的氨基酸中的每一种总结了这些性质。根据该表，应理解保守氨基酸家族包括(i)G、A、V、L和I；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H、K和R；(v)N和Q；和(vi)F、Y和W。因此，保守突变或替换是用一种氨基酸替换相同氨基酸家族成员的替换(例如，Ser对Thr或Lys对Arg的替换)。

表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学性质

如本文所使用的，术z等表示移除基因或另外使基因无功能的对所述基因或与之结合或与之操作性连接的调控元件(例如，转录因子-结合位点，如启动子或增强子元件)的修饰(modifications)。如本文所述，示例性缺失包括从靶标基因的起始密码子至终止密码子，将编码所涉及的基因的核酸的全部移除。如本文所述的缺失的其它实例包括编码靶标基因的核酸的部分移除(例如，一个或多个密码子或其部分，如单核苷酸缺失)，从而当部分缺失的靶标基因表达时，产物是无功能的或比靶标基因的野生型形式的功能低。如本文所述的示例性缺失包括与所涉及的基因结合的调控元件的全部或部分移除，如调控靶标基因表达的启动子和/或增强子核酸的全部或部分的移除。

如本文所使用的，术语“衍生化抗体”是指通过化学反应修饰以切割残基或添加分离抗体非天然的化学部分的抗体。可以通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过添加已知的化学保护/封端基团的衍生化、蛋白水解切割、键合至细胞配体或其它蛋白来获得衍生化抗体。可以通过已知技术，无限制地包括使用已建立的规程的特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等来实施任何多种化学修饰。另外，所述衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用琥珀抑制技术(参见，例如，美国专利No.6,964,859；该专利作为参考并入本文)。

如本文所使用的，术语“双链抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL域，所述接头过短(例如，接头由5个氨基酸组成)以使得相同肽链上的VH和VL域不能够分子内结合。这种构型迫使每个域与另一条多肽链上的互补域配对，从而形成均二聚结构。因此，术语“三链抗体”是指包含三条多肽链的三价抗体，其每一条链含有通过接头连接的一个VH域和一个VL域，所述接头非常短(例如，接头由1-2个氨基酸组成)以使得相同肽链内的VH和VL域不能够分子内结合。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式构型的肽通常三聚化，从而将相邻肽链的VH和VL域在空间上彼此邻近布置以允许正确折叠(参见Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,1993；这些文献作为参考并入本文)。

如本文所使用的，“双重可变域免疫球蛋白”(“DVD-lg”)是指通过接头组合了两个单克隆抗体的靶标结合可变域以产生四价、双重靶向单一试剂的抗体。(Gu等人,Meth.Enzymol.,502:25-41,2012；其作为参考并入本文)。

如本文所使用的，术语“内源的”描述了天然存在于特定生物(例如，人)或生物内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。

如本文所使用的，术语“外源的”描述了天然不存在于特定生物(例如，人)或生物内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。外源材料包括从生物或从中提取的培养物的外部来源所提供的那些。

如本文所使用的，术语“框架区”或“FW区”包括邻近于CDR的氨基酸残基。FW区残基可以存在于(例如)人抗体、啮齿类-来源的抗体(例如，鼠科抗体)、人源化抗体、灵长类源化抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如，Fab片段)、单链抗体片段(例如，scFv片段)、抗体域和双重特异性抗体等。

如本文所使用的，术语“异种特异性抗体”是指对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选地人或人源化抗体。通常，异种特异性抗体的重组产生基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条重链具有不同的特异性(Milstein等人,Nature305:537,1983)。例如，在WO93/08829、美国专利No.6,210,668；6,193,967；6,132,992；6,106,833；6,060,285；6,037,453；6,010,902；5,989,530；5,959,084；5,959,083；5,932,448；5,833,985；5,821,333；5,807,706；5,643,759；5,601,819；5,582,996；5,496,549；4,676,980；WO 91/00360；WO 92/00373；EP 03089；Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology 121:21 0(1986)中公开了类似的程序，这些文献作为参考并入本文。异种特异性抗体可以包括强化多重特异性抗体中正确的链结合的Fc突变，如Klein等人,mAbs4(6):653-663,2012中所述；该文献作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“人抗体”是指其中基本上蛋白的每个部分(例如，CDR、框架、C_L、C_H域(例如，C_H1、C_H2、C_H3)、铰链、(V_L、V_H))在人中是基本非免疫原性的抗体，其仅具有少量序列改变或变化。可以在人细胞中(例如，通过重组表达)或者通过能够表达功能上重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生人抗体。此外，当人抗体是单链抗体时，它可以包括在天然人抗体中不存在的接头肽。例如，Fv可以包含接头肽，如2至约8个甘氨酸或其它氨基酸残基，其连接重链可变区和轻链可变区。这些接头肽被认为是人来源的。可以通过本领域中已知的多种方法，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法来制备人抗体。参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 1998/46645；WO 1998/50433；WO 1998/24893；WO 1998/16654；WO1996/34096；WO 1996/33735；和WO 1991/10741；其作为参考并入本文。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。参见，例如，PCT专利公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598；其作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“人源化”抗体是指作为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其它靶标结合子域)的非人(例如，鼠科)抗体形式。通常，人源化抗体将包含基本全部的至少一种，并且通常两种可变域，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些。全部或基本全部的FR区还可以是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白共有序列的恒定区的至少一部分。抗体人源化的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Riechmann等人,Nature 332:323-7,1988；美国专利No:5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和授权给Queen等人的6,180,370；EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；EP592106；和EP519596；其作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是产生它的方法。

如本文所使用的，术语“多重特异性抗体”是指对不止一个靶标抗原显示出亲合力的抗体。多重特异性抗体可以具有类似于完整免疫球蛋白分子的结构并且包括Fc区，例如，IgG Fc区。这些结构可以包括(但不限于)IgG-Fv、lgG-(scFv)2、DVD-lg、(scFv)2-(scFv)2-Fc和(scFv)2-Fc-(scFv)2。在lgG-(scFv)2的情况下，scFv可以连接至重链或轻链中的任一个的N末端或C末端。通过Kontermann,2012,mAbs 4(2):182-197；Yazaki等人,2013,Protein Engineering,Design&Selection 26(3):1 87-1 93和Grote等人,2012,inProetzel&Ebersbach(eds.),Antibody Methods and Protocols,Methods in MolecularBiology 901卷,16章:247-263综述了示例性多重特异性分子；这些文献作为参考并入本文。缺失Fc区并且其中可以掺入抗体或抗体片段的示例性多重特异性分子包括scFv二聚体(双链抗体)、三聚体(三链抗体)和四聚体(四链抗体)、Fab二聚体(通过粘性多肽或蛋白域缀合)和Fab三聚体(化学缀合的)，并且通过Hudson and Souriau,2003,NatureMedicine9:129-134进行描述；该文献作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“序列同一性百分比(％)”是指在序列比对和为了实现最大序列同一性百分比(如有必要)而引入缺口(例如，可以在候选和参考序列之一或两者中引入缺口以进行最优比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定序列同一性百分比的目的，可以通过本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(ONASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，其包括对正在比较的序列全长实现最大比对所需的任何算法。例如，为了与候选序列相比较而比对的参考序列可以显示候选序列在候选序列全长或候选序列邻接氨基酸(或核酸)残基的所选部分显示出50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列长度可以是(例如)参考序列长度的至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的5位被与参考序列中相应位置相同的氨基酸残基占据时，则所述分子在该位置处是同一的。

如本文所使用的，术语“灵长类源化抗体”是指包含来自灵长类动物来源的抗体的框架区和来自非灵长类动物来源的抗体的其它区，如CDR和恒定区的抗体。用于产生灵长类源化抗体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利No.5,658,570；5,681,722；和5,693,780；其作为参考并入本文。

如本文所使用的，在多核苷酸片段的背景中，术语“操作性连接的”旨在表示两个多核苷酸片段连接，从而通过所述两个多核苷酸片段所编码的氨基酸序列保持在框内。

如本文所使用的，术语“调控元件”等表示控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如，在Goeddel,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中描述了这些调控序列；该文献作为参考并入本文。

如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病况(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物。受试者和患者的实例包括接受对疾病或病况，例如，细胞增殖异常，如癌症的治疗的哺乳动物，如人。

如本文所使用的，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变域已连接形成一条链。scFv片段含有包含通过接头分开的抗体轻链(VL)的可变区(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链(VH)的可变区(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)的单个多肽链。连接scFv片段的VL和VH区的接头可以是由蛋白氨基酸组成的肽接头。可以使用替代接头以提高scFv片段对蛋白水解降解的耐受性(例如，含有D-氨基酸的接头)，以提高scFv片段的溶解度(例如，亲水性接头，如含有聚乙二醇的接头或含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，以改善所述分子的生物物理学稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)或者以降低scFv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点的接头)。scFv分子是本领域已知的并且在(例如)美国专利5,892,019,Flo等人,(Gene 77:51,1989)；Bird等人,(Science 242:423,1988)；Pantoliano等人,(Biochemistry 30:10117,1991)；Milenic等人,(Cancer Research 51:6363,1991)；和Takkinen等人,(Protein Engineering 4:837,1991)中进行了描述。scFv分子的VL和VH域可以来源于一种或多种抗体分子。本领域的技术人员还将理解可以修饰本发明的scFv分子的可变区，从而它们在它们所来源的抗体分子的氨基酸序列中是不同的。例如，在一些实施方式中，可以进行导致氨基酸残基的保守替换或改变的核苷酸或氨基酸的替换(例如，在CDR和/或框架残基中)。作为另外一种选择或者另外，使用本领域认可的技术，对CDR氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。例如，在WO 2011/084714中描述了scFv片段；其作为参考并入本文。

如本文所使用的，短语“特异地结合”是指具有特异性的结合反应，其对于(例如)通过抗体或其抗原结合片段所识别的非均一的蛋白和其它生物分子群体中抗原的存在是决定性的。特异性结合至抗原的抗体或其抗原结合片段可以以小于100nM的K_D结合至抗原。例如，特异性结合至抗原的抗体或其抗原结合片段可以以至多100nM(例如，1pM至100nM之间)的K_D结合至抗原。对特定抗原或其表位未显示出特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以对特定抗原或其表位显示出大于100nM(例如，大于500nm、1μΜ、100μΜ、500μΜ或者1mM)的K_D。多种免疫测定形式可以用于选择对特定蛋白或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择对蛋白或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。有关可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见，Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)和Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,New York(1999)。

如本文所使用的，术语“转染”是指通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的任何多种技术，例如，电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。

如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗(therapeutic treatment)，其中目标是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或异常，如细胞增殖异常的发展，如癌症。有益或所期望的临床结果包括(但不限于)症状减轻、疾病程度降低、稳定(即，未恶化)的疾病状态、疾病发展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻和(部分或全部)症状的缓解，无论其是可检测的或不可检测的。需要治疗的那些包括已患有病况或病症的那些以及易患病况或病症的那些或者其中要预防病况或病症的那些。

如本文所使用的，术语“载体”是指核酸载体，例如，DNA载体，如质粒、RNA载体、病毒或其它适合的复制子(例如，病毒载体)。已开发了多种载体以用于将编码外源蛋白的多核苷酸递送至原核或真核细胞。在(例如)WO 1994/11026中公开了这些表达载体的实例；其作为参考并入本文。本发明的表达载体可以含有用于蛋白表达和/或这些多核苷酸序列向宿主细胞，如哺乳动物细胞(例如，人细胞)的基因组中整合的一个或多个其它序列元件。可以用于本文所述的抗体和抗体片段的表达的示例性载体包括含有指导基因转录的调控序列，如启动子和增强子区的质粒。载体可以含有调节靶标基因的翻译速率或改善由基因转录所产生的mRNA的稳定性或核输出的核酸。这些序列元件可以包括(例如)5'和3'未翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和多腺苷酸化信号位点以指导表达载体所携带的基因的有效转录。本文所述的载体还可以含有编码用于含有这些载体的细胞的选择的标志物的多核苷酸。适合的标志物的实例包括编码抗生素(如氨苄西林(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)或诺尔丝菌素(nourseothricin))的抗药性的基因。

如本文所使用的，术语“VH”是指抗体免疫球蛋白重链的可变区，其包括Fv、scFv或Fab的重链。对“VL”的提及表示免疫球蛋白轻链的可变区，其包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体对特定靶标显示出结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体及其它缺少靶标特异性的抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。天然抗体的每条重链在氨基末端具有可变域(VH)，之后是一些恒定域。天然抗体的每条轻链在氨基末端具有可变域(VL)并且在羧基末端具有恒定域。

基因定义

如本文所使用的，“C2L”是指正痘病毒基因，如编码kelch-样蛋白的基因。编码C2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“C2L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“C1L”是指正痘病毒基因。编码C2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“C1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“N1L”是指正痘病毒基因，如编码BCL-2抑制剂的基因。编码N1L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“N1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“N2L”是指正痘病毒基因，如编码TLR信号转导抑制剂的基因。编码N2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“N2L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“M1L”是指正痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码M1L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“M1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“M2L”是指正痘病毒基因，如编码NF-κB抑制剂的基因。编码M2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“M2L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K1L”是指正痘病毒基因，如编码NF-κB抑制剂的基因。编码K1L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K2L”是指正痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码K2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K2L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K3L”是指正痘病毒基因，如编码PKR抑制剂的基因。编码K3L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K3L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K4L”是指正痘病毒基因，如编码磷脂酶-D的基因。编码K4L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K4L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K5L”是指正痘病毒基因，如编码单酸甘油酯脂肪酶的基因。编码K5L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K5L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K6L”是指正痘病毒基因，如编码单酸甘油酯脂肪酶的基因。编码K6L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K6L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“K7R”是指正痘病毒基因，如编码NF-κB抑制剂的基因。编码K7R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“K7R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“F1L”是指正痘病毒基因，如编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因。编码F1L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“F1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“F2L”是指正痘病毒基因，如编码dUTP酶的基因。编码F2L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“F2L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“F3L”是指正痘病毒基因，如编码kelch-样蛋白的基因。编码F3L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“F1L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B14R”是指正痘病毒基因。编码B14R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B14R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B15R”是指正痘病毒基因。编码B15R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B15R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B16R”是指正痘病毒基因，如编码IL-1-β抑制剂的基因。编码B16R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“B16R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B17L”是指正痘病毒基因。编码B17L基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B17L”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B18R”是指正痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码B18R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B18R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B19R”是指正痘病毒基因，如编码IFN-α-β-受体-样分泌糖蛋白的基因。编码B19R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B19R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B20R”是指正痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码B20R基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“B20R”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。

如本文所使用的，“B8R”是指正痘病毒基因，如编码与γ干扰素(IFN-γ)具有同源性的分泌蛋白的基因。在UniProtKB数据库条目P21004中提供了牛痘病毒的哥本哈根株中的示例性B8R基因所编码的蛋白序列的非限制性实例，并且复制如下：

MRYIIILAVLFINSIHAKITSYKFESVNFDSKIEWTGDGLYNISLKNYGIKTWQTMYTNVPEGTYDISAFPKNDFVSFWVKFEQGDYKVEEYCTGLCVEVKIGPPTVTLTEYDDHINLYIEHPYATRGSKKIPIYKRGDMCDIYLLYTANFTFGDSEEPVTYDIDDYDCTSTGCSIDFATTEKVCVTAQGATEGFLEKITPWSSEVCLTPKKNVYTCAIRKEDVPNFKDKMARVIKRKFNKQSQSYLTKFLGSTSNDVTTFLSMLNLTKYS

术语“B8R”还可以包括以上所列的蛋白的片段或变体或者来自另一正痘病毒株的同源基因。变体无限制地包括与本文所公开的序列具有85％或以上的同一性的那些序列。

附图说明

图1显示了59个痘病毒株，包括正痘病毒株的系统发育分析。

图2显示了将5种牛痘病毒在不同肿瘤类型中传代后，不同病毒株的丰度。

图3显示了牛痘野生株中多个不同患者肿瘤中心区中的复制能力。

图4显示了不同牛痘野生株的空斑尺寸测量。

图5A显示了在牛痘哥本哈根基因组中的1kb区内的TTAA位点数目。

图5B显示了牛痘哥本哈根基因组内转座子插入频率。每个点代表了特定基因的转座子敲除。通过敲除频率确定y轴上的点的位置。

图5C显示了痘病毒基因在59个病毒中的保守性。更高的保守性表明该基因存在于多个种中。

图6显示了在许可癌细胞(permissive cancer cell)中传代后，多个转座子敲除的频率。

图7显示了纯化的转座子的空斑尺寸测量。

图8显示了5p缺失(CopMD5p)和3p缺失(CopMD3p)的基因组结构。将CopMD5p和CopMD3p杂交以产生CopMD5p3p。

图9显示了显示用不同剂量的哥本哈根或CopMD5p3p感染后癌细胞死亡的热图。

图10显示了在4种不同的癌细胞系中哥本哈根和CopMD5p3p复制的生长曲线。

图11显示了哥本哈根和CopMD5p3p在患者离体样品中复制的能力，如通过滴度所示。

图12显示了修饰的CopMD5p3p病毒形成的空斑不同于亲代病毒。CopMD5p3p空斑在中间更透明，并且我们可以观察到合胞体(细胞融合)。

图13显示了CopMD5p3p在786-O细胞中诱导合胞体(细胞融合)。

图14显示与哥本哈根野生型类似，CopMD5p3p能够控制肿瘤生长，但是不导致重量减轻。

图15显示与具有胸苷激酶的溶瘤敲除的两种其它牛痘株(哥本哈根和Wyeth)相比时，CopMD5p3p不导致痘病变形成。

图16显示了在裸CD-1小鼠中全身施用之后，牛痘的IVIS生物分布。编码CopMD5p3p的荧光素酶(TK KO)是肿瘤特异性的并且不会在脱靶组织中复制。

图17显示了在全身施用之后，牛痘的生物分布。在肿瘤中，CopMD5p3p与其它溶瘤牛痘类似地复制，但是在脱靶组织/器官中复制较少。

图18显示了牛痘在人PBMC中的免疫原性。CopMD5p3p诱导人先天性免疫细胞激活的能力比野生型哥本哈根更强。通过流式细胞术分析采集数据。

图19显示了牛痘在小鼠脾细胞中的免疫原性。CopMD5p3p诱导小鼠先天性免疫细胞激活的能力比哥本哈根更强。通过流式细胞术分析采集数据。

图20显示了牛痘在人细胞中的免疫原性。CopMD5p3p激活NF-kB免疫转录因子的能力比哥本哈根或vvdd更强，但是类似于MG-1。所显示的数据为免疫印迹数据。

图21显示了在侵袭性黑素瘤模型(B16-F10)中与免疫检查点抑制剂抗-CTLA-4(100μg)的协同作用。在用牛痘和免疫检查点抑制剂抗-CTLA4处理的具有免疫能力的鼠科模型中，通过存活测量了体内效力。

图22显示了与免疫检查点抑制剂抗-CTLA4(100μg)的协同作用。在用牛痘和免疫检查点抑制剂抗-CTLA4处理的具有免疫能力的鼠科模型中，通过肿瘤生长(顶行)和存活(底行)测量了体内效力。将CopMD5p3p(左列)与溶瘤性哥本哈根TK KO(右列)相比较。

图23显示了与免疫检查点抑制剂抗-PD1(100μg)的协同作用。在用牛痘和免疫检查点抑制剂抗-PD1处理的具有免疫能力的鼠科模型中，通过肿瘤生长(顶行)和存活(底行)测量了体内效力。将CopMD5p3p(左列)与溶瘤性哥本哈根TK KO(右列)相比较。

图24显示了与免疫检查点抑制剂抗-PD1(25μg)和抗-CTLA-4(25μg)的协同作用。在用牛痘和免疫检查点抑制剂抗-PD1和抗-CTLA4处理的具有免疫能力的鼠科模型中，通过肿瘤生长(顶行)和存活(底行)测量了体内效力。将CopMD5p3p(左列)与溶瘤性哥本哈根TKKO(右列)相比较。

图25显示了用于在多种牛痘株中产生从头(denovo)5p(左图)和3p(右图)主要缺失的同源重组靶向策略的示意图。

图26显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子在多种细胞系中增殖的能力。

图27显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子对多种细胞系的细胞毒作用，如通过考马斯亮蓝(上部部分)和阿拉玛蓝测定(下部部分)所评价的。沿下部部分中所示的图中的x轴对每个细胞系所列的株的顺序如下所示：从左至右，CopMD5p、CopMD5p3p、CopMD3p和CopWT。

图28显示了通过对小鼠的施用，野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子的分布。

图29显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子激活自然杀伤(NK)细胞和刺激免疫应答的能力。

图30显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子提高NK细胞-介导的对HT29细胞的脱粒(NK细胞活性的量度)和刺激免疫应答的能力。

图31显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子致敏(prime)T细胞以引起抗-肿瘤免疫应答的能力。

图32显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子从初始感染点扩展至较远位置的能力。

图33显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子形成空斑(病毒增殖的量度)的能力。

图34显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子在786-O细胞中形成空斑的能力。

图35显示了在多种痘病毒基因组中在CopMD5p3p中缺失的基因的百分比。

图36显示了SKV-B8R+病毒的正常相对于癌细胞系的感染。

图37显示了SKV-B8R+不损害干扰素信号转导。

图38显示了与SKV-B8R+相比，SKV(CopMD5p3-B8R-)在肿瘤控制中具有类似的效力。

图39显示了工程设计以表达2种免疫治疗性转基因和抗体的SKV。

图40显示了表达鼠科IL-12p35膜结合蛋白的SKV在控制鼠科肿瘤中具有更大的效力。

图41显示了多种牛痘株中工程设计的主要双重缺失(major double deletions)提高了体外癌细胞杀死。

图42显示了用多种牛痘株感染的HeLa细胞的表型鉴定。

图43显示了与野生株相比，5p3p牛痘株不引起体重降低。

图44显示了与野生株相比，5p3p牛痘株不引起痘病变。

发明详述

本发明的特征在于基因修饰的正痘病毒，如牛痘病毒(例如，哥本哈根、西储、Wyeth、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、天坛和WAU86/88-1病毒)以及它们用于治疗多种癌症的使用。本发明部分基于以下意外发现：当将病毒工程设计以包含以下中的一种或多种或全部的缺失时，正痘病毒，如哥本哈根、西储、惠氏、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、Tian Tan和WAU86/88-1病毒显示出显著改善的溶瘤活性、肿瘤内的复制、感染性、免疫逃避、肿瘤持久性、掺入外源DNA序列的能力和大规模生产的可采性：C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R、K ORF A、K ORF B、B ORF E、B ORF F、B ORF G、B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R基因。在本发明的多个实施方式中，修饰的正痘病毒含有B8R基因的缺失。尽管在小鼠中无活性，但是B8R基因中和人IFN-γ的抗病毒活性。在多个实施方式中，随后通过同源重组靶向策略将至少一种转基因插入B8R基因(目前缺失)的基因座。在多个实施方式中，修饰的正痘病毒表达三种转基因中的至少一种：IL-12-TM、FLT3-L和抗-CLTA4抗体。

可以将本文所述的正痘病毒施用于患者，如哺乳动物患者(例如，人患者)以治疗多种细胞增殖异常，包括广泛的癌症。以下部分描述了正痘病毒以及对其的基因修饰，以及生产和增殖基因修饰的正痘病毒的方法和将它们施用于患者的技术。

痘病毒

通常，痘病毒颗粒为卵圆形或砖块形,长约200-400nm。外表面褶皱成平行排列，有时成螺旋状排列。这些颗粒相当复杂，含有超过100种不同的蛋白。胞外形式包含两层膜(EEV：胞外包膜病毒粒子)，而胞内颗粒仅含有内膜(IMV：胞内成熟病毒粒子)。外表面由环绕核心的脂质和蛋白构成，核心由紧密压缩的核蛋白构成。作为抗原，痘病毒也很复杂，同时诱导特异性和交叉反应抗体。颗粒中至少存在10种酶，多数与核酸代谢/基因组复制有关。

野生型痘病毒的基因组是130-300Kbp的线性双链DNA。基因组末端具有含数个串联重复序列的末端发夹环。已测序数种痘病毒基因组，其中大部分必需基因位于基因组中部，而非必需基因则位于末端。痘病毒基因组中有约250种基因。复制发生于细胞质中，因为该病毒足够复杂以具有基因组复制所必需的所有功能。细胞有一定贡献，但这种贡献的性质尚未可知。然而，尽管在去核细胞中发生了痘病毒基因表达和基因组复制，但其成熟被阻断，表明细胞具有某种作用。

一旦进入细胞质，与核心相关的病毒酶开始进行基因表达。表达分为两个阶段：早期基因：其占基因组约50％并且在基因组复制前表达，和后期基因，其在基因组复制之后表达。活性依赖于DNA复制的晚期启动子提供了表达的时间调控。基因组复制被认为是自启动(self-priming)的，从而引起高分子量串联子(concatemers)的形成，随后这些串联子被切割和修复以形成病毒基因组。病毒的组装发生于细胞骨架中，并且可能包括与细胞骨架蛋白(例如，肌动蛋白-结合蛋白)的相互作用。包涵体(inclusions)产生于细胞质中，并成熟为病毒颗粒。细胞到细胞的传播可以为感染扩散提供另一机制。总体上，这种大的复杂病毒的复制很快，平均仅需要12小时。至少有9种不同的痘病毒能在人体中引起疾病，但天花病毒和牛痘是熟知的。天花株分为重型天花(25-30％的致死率)以及轻型天花(症状相同但死亡率小于1％)。两种病毒的自然感染都通过呼吸道进行，并且是全身性的，从而产生了一系列症状，但最值得注意的天花特征是皮肤脓包和疤痕。

作为正痘病毒种的牛痘病毒

牛痘病毒是大的、包膜复杂的病毒，其具有约190K的线性双链DNA基因组，并且编码约250个基因。牛痘熟知的作用是作为根除天花的疫苗。在根除天花后，科学家们寻求使用牛痘作为将基因递送至生物组织中的工具(基因疗法和基因工程)。牛痘病毒因其仅在宿主细胞的细胞质中复制而在DNA病毒中是独一无二的。因此，需要大基因组来编码病毒DNA复制所需的多种酶和蛋白。在复制期间，牛痘产生了其外膜不同的几种感染形式：胞内成熟病毒粒子(IMV)、胞内包膜病毒粒子(IEV)、细胞结合包膜病毒粒子(CEV)和胞外包膜病毒粒子(EEV)。IMV是最丰富的感染形式并且被认为负责宿主间的传播。另一方面，CEV被认为在细胞-至-细胞的传播中起作用，而EEV则被认为对于宿主生物内的大范围扩散是重要的。

牛痘病毒(vaccinia virus)与导致牛痘(cowpox)的病毒密切相关。牛痘的确切来源是未知的，但是最常见的认识是牛痘病毒、牛痘病毒和天花病毒(天花的病原体)均来源于共同的祖先病毒。还推测牛痘病毒最初分离自马。牛痘病毒感染是轻度的并且通常在健康个体中无症状，但是它可能导致轻度的皮疹和发烧，具有极低的死亡率。对牛痘病毒感染所产生的免疫应答保护个体抵抗致死的天花感染。为此，将牛痘病毒用作抵抗天花的活病毒疫苗。牛痘病毒疫苗是安全的，因为它不含天花病毒，但是偶尔可能出现某些并发症和/或疫苗副作用，特别是如果疫苗是损害免疫能力的。

牛痘病毒的示例性株包括(但不限于)哥本哈根、西储、Wyeth、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、Tian Tan和WAU86/88-1。

胸苷激酶突变体

作为溶瘤病毒测试牛痘病毒的几项当前的临床研究在病毒胸苷激酶(TK)基因中具有缺失。这种缺失减弱了病毒，从而使得所述病毒的DNA复制依赖于细胞胸苷激酶活性，并因此减弱了病毒增殖。细胞胸苷激酶在大部分正常组织中以低水平表达，而在多种癌细胞中以高水平表达。通过代谢靶向，TK病毒可以在具有高代谢率的细胞(例如，健康细胞或肿瘤细胞)中生长，并且将不会在具有低胸苷激酶水平的细胞中良好生长。由于存在休眠肿瘤细胞(例如，癌症干细胞)，因此TK病毒杀死这种癌细胞群体的能力可能受损，正如化疗基本无效一样。本发明公开中所述的修饰的病毒载体保留了病毒合成机制(包括TK)并且可能在休眠癌细胞中增殖。本发明公开的病毒修饰可以使病毒是高选择性的，同时不会使TK或其它DNA代谢酶(例如，核糖核苷酸还原酶)缺失并且可以在具有低代谢率的肿瘤内更有效。

病毒增殖

本发明的特征在于痘病毒，其包括与野生型相比，通过一种或多种基因缺失所构建的那些，从而所述病毒显示出所期望的用于抗癌细胞的使用的性质，同时其对非癌细胞是低毒或无毒的。本节通过举例总结了多种用于产生本文所述的重组痘病毒的规程，如通过使用DNA重组技术用于产生突变病毒的方法。

例如，为了在痘病毒基因组中产生突变，可以通过包含在载体中的核酸分子编码天然和修饰的多肽。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将通过标准重组技术装备完善地构建载体，所述标准重组技术描述于Sambrook等人,(1989)和Ausubel等人,1994，以上两篇文献作为参考并入本文。除编码修饰的多肽，如修饰的白树毒素(gelonin)之外，载体可以编码未修饰的多肽序列，如标签或靶标分子。

为了在宿主细胞中增殖载体，它可以含有一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，它是在此起始复制的特异性核酸序列。作为另外一种选择，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(ARS)。

在表达异源核酸序列的背景中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且它包括能够复制载体和/或表达载体编码的异源基因的任何可转化的生物。宿主细胞可以并且已用作载体或病毒的受体(如果它不表达外源多肽，则其不能作为载体)。可以“转染”或“转化”宿主细胞，转染或转化是指通过其将外源核酸，如修饰的蛋白编码序列转移或引入宿主细胞中的方法。转化的细胞包括原代受试者细胞及其子代。宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物，其包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，这取决于所期望的结果是载体的复制还是载体编码的核酸序列的部分或全部的表达。多种细胞系和培养物作为宿主细胞可用，并且它们可以通过美国模式培养物保藏所(ATCC)获得，美国模式培养物保藏所是用作活培养物和基因材料存档的组织(www.atcc.org)。基于载体主链和所期望的结果，本领域技术人员可以确定适当的宿主。质粒或粘粒(例如)可以引入原核生物宿主细胞以用于多种载体的复制。作为用于载体复制和/或表达的宿主细胞使用的细菌细胞包括DH5α、JM109和KCB以及一些可商购的细菌宿主，如

感受态细胞和SOLOPACK^TM Gold细胞(

La Jolla,Calif.)。作为另外一种选择，细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)LE392可以用作噬菌体病毒的宿主细胞。适当的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces Pombe)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自多种细胞类型和生物的多种宿主细胞是可用的并且将是本领域技术人员已知的。类似地，可以结合真核或原核宿主细胞使用病毒载体，特别是对于载体的复制或表达许可的宿主细胞。一些载体可以使用控制序列来使其在原核和真核细胞两者中复制和/或表达。本领域技术人员还将理解培育所有上述宿主细胞以维持它们并使载体复制的条件。将允许载体的大规模生产以及载体编码的核酸以及它们的同源多肽、蛋白或肽的生产的技术和条件也将是所理解和已知的。

对正痘病毒基因组的基因修饰

基因修饰方法。

用于来自靶标基因组的核酸的插入或缺失的方法包括本文所述的和本领域中已知的那些。可以用于将编码靶标基因的多核苷酸引入靶标基因组的一种这种方法包括转座子的使用。转座子是编码转座酶并且含有通过5'和3'切除位点所侧接的所关心的多核苷酸序列或基因的多核苷酸。一旦将转座子递送至靶标核酸(例如，在宿主细胞中)，则转座酶基因的表达起始并且导致产生了从转座子切割所关心的基因的活性的酶。通过经由转座酶的转座子切除位点的位点特异性识别来介导这种活性。在某些情况下，这些切除位点可以是末端重复或末端反向重复。一旦从转座子切除，则可以通过存在于所述细胞的核基因组内的类似的切除位点的转座酶催化的切割，将所关心的基因整合到靶标基因组中。这使得所关心的基因在互补切除位点插入到所切割的核DNA中，并且将所关心的基因连接至靶标基因组DNA的后续磷酸二酯键的共价连接完成了引入过程。在某些情况下，所述转座子可以是反转座子，从而首先将编码靶标基因的基因转录为RNA产物，然后在引入哺乳动物细胞基因组中之前，反转录为DNA。转座子系统包括piggybac转座子(在(例如)WO 2010/085699中详细描述)和睡美人(sleeping beauty)转座子(在(例如)US2005/0112764中详细描述)，以上每篇专利的公开内容作为参考并入本文。

据信用于核酸递送以实现本发明的组合物的表达的其它方法包括如本文所述的，可以通过所述方法将核酸(例如，DNA，包括病毒和非病毒载体)引入细胞器、细胞、组织或生物中或者如本领域的技术人员将已知的几乎任何方法。这些方法包括(但不限于)DNA的直接递送，如通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，以上每篇专利作为参考并入本文)，包括微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利No.5,789,215，这些文献作为参考并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，该专利作为参考并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippe等人,1990)；通过使用DEAE-右旋糖酐，然后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波载入(direct sonicloading)(Fechheimer等人,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley等人,1979；Nicolau等人,1987；Wong等人,1980；Kaneda等人,1989；Kato等人,1991)；通过微弹轰击(PCT专利申请No.WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且以上每篇文献作为参考并入本文)；通过使用碳化硅纤维的搅拌(Kaeppler等人,1990；美国专利No.5,302,523和5,464,765，以上每篇文献作为参考并入本文)；通过农杆菌-介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，以上每篇文献作为参考并入本文)；或者通过PEG-介导的原生质体转化(Omirulleh等人,1993；美国专利No.4,684,611和4,952,500，以上每篇文献作为参考并入本文)；通过干燥/抑制-介导的DNA吸收(Potrykus等人,1985)。通过如这些的技术的应用，可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物。

CopMD5p、CopMD3p和CopMD5p3p缺失。

在多个实施方式中，使多种基因缺失以提高正痘病毒的溶瘤活性。本文所述的大部分缺失涉及对宿主对病毒感染应答的阻断或另外具有未知功能。在多个实施方式中，从重组正痘病毒基因组中缺失了表2中所示的基因中的至少一种。在多个实施方式中，从重组正痘基因组中缺失了表2中所示的基因中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个。在多个实施方式中，从重组正痘病毒基因组中缺失了表2中所示的所有基因。本文描述了本发明的三个示例性实施方式CopMD5p、CopMD3p和CopMD5p3p。下表2中显示了缺失的基因簇以及它们在CopMD5p、CopMD3p和copmd5p3p病毒中的功能。在多个实施方式中，当存在两个ITR拷贝时，仅基因组的右侧ITR缺失，而左侧ITR保持完整。通过完整基因组测序确认了缺失。

表2：正痘病毒中缺失的基因

B8R基因缺失。

在多个实施方式中，对正痘病毒进一步基因修饰以包含B8R基因中的缺失。牛痘病毒B8R基因编码与γ干扰素受体(IFN-γ)具有同源性的分泌蛋白。体外，B8R蛋白结合至并中和几个种的γ干扰素，包括人和大鼠γ干扰素的抗病毒活性；然而，它不明显结合鼠科IFN-γ。B8R基因的缺失防止人中IFN-γ的损伤。B8R基因的缺失导致安全性升高，但不具有相伴的免疫原性降低。

转基因插入

在多个实施方式中，可以将其它转基因插入载体。在多个实施方式中，将1、2或3个转基因插入缺失的B8R基因的基因座中。在一些株中，除存在于B8R缺失位点的转基因之外，所述株还具有至少一个转基因，其插入非缺失的B8R基因的基因座的正痘病毒上的其它基因座中。在多个实施方式中，将至少一个转基因插入5p缺失的边界，将至少一个转基因插入3p缺失的边界或两者。在多个实施方式中，将至少3、4、5或更多个转基因插入修饰的正痘病毒基因组。

在多个实施方式中，所述重组正痘病毒载体可以包括至少一个编码免疫检查点抑制剂的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性免疫检查点抑制剂包括(但不限于)OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。

在多个实施方式中，所述重组正痘病毒载体可以包括至少一种编码至少一种白介素蛋白的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性白介素蛋白包括(但不限于)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。

在多个实施方式中，重组正痘病毒载体可以包括编码干扰素的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性干扰素包括(但不限于)IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

在多个实施方式中，所述重组正痘病毒载体可以包括编码TNF超家族成员蛋白的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性TNF超家族成员蛋白包括(但不限于)TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

在多个实施方式中，所述重组正痘病毒载体可以包括编码细胞因子的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性细胞因子包括(但不限于)GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(脒基腺苷酸环化酶)。

在多个实施方式中，所述重组正痘病毒载体可以包括编码肿瘤-相关抗原的转基因。用于通过本发明所述的组合物和方法的正痘病毒的表达的示例性肿瘤-相关抗原包括(但不限于)CD19、CD33、EpCAM、CEA、PSMA、EGFRvIII、CD133、EGFR、CDH19、ENPP3、DLL3、MSLN、ROR1、HER2、HLAA2、EpHA2、EpHA3、MCSP、CSPG4、NG2、RON、FLT3、BCMA、CD20、FAPα、FRα、CA-9、PDGFRα、PDGFRβ、FSP1、S100A4、ADAM12m、RET、MET、FGFR、INSR、NTRK、MAGE-A3、NY-ESO-1、一种或多种人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白、HPV16的E6和E7蛋白、HPV18的E6和E7蛋白、brachyury或者前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。用于结合本文所述的组合物和方法使用的肿瘤-相关抗原的其它实例包括(但不限于)表3-30中所列的那些。

治疗方法

药物组合物、施用和剂量

可以使用本领域中已知的方法制备含有本发明的重组正痘病毒载体的治疗性组合物。例如，可以使用(例如)生理学可用的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版，Osol,A.主编(1980)；该文献作为参考并入本文)并以所期望的形式，例如，以冷冻干燥制剂或水溶液的形式制备这些组合物。

为了使用本发明所述的方法和组合物诱导溶瘤，杀死细胞，抑制生长，抑制转移，降低肿瘤尺寸以及另外逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，可以将肿瘤与修饰的正痘病毒接触，例如，通过经由(例如)本文所述的一种或多种施用途径，向患有癌症的患者施用正痘病毒。施用途径可以随癌症的位置和性质而改变并且可以包括(例如)皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、局部(例如，在肿瘤附近，特别是具有肿瘤脉管系统或相邻脉管系统的肿瘤附近)、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、肿瘤内、吸入、灌注、灌洗和口服施用和制剂。

应理解术语“血管内”是指向患者脉管系统的递送，其表示递送至患者血管、血管内或血管中。在某些实施方式中，认为向血管的施用是静脉(静脉内)，而在其它实施方式，认为向血管的施用是动脉。静脉包括(但不限于)颈内静脉、外周静脉、冠状静脉、肝静脉、门静脉、大隐静脉、肺静脉、上腔静脉、下腔静脉、胃静脉、脾静脉、肠系膜下静脉、肠系膜上静脉、头静脉和/或股静脉。动脉包括(但不限于)冠状动脉、肺动脉、肱动脉、颈内动脉、主动脉弓、股动脉、周围动脉和/或睫状动脉。据考虑递送可以通过或至小动脉或毛细血管。

将肿瘤内注射或直接向肿瘤脉管系统的注射具体考虑用于单独、实体、可接近的肿瘤。局部、区域或全身施用也可以是适当的。通过以(例如)约1cm间隔的间距，向肿瘤施用多次注射，可以有利地接触病毒颗粒。就手术干预来说，可以术前使用本发明，从而使不能手术的肿瘤进行切除。还可以在适当的情况下，例如，通过将导管植入肿瘤或肿瘤脉管系统中，应用连续施用。这种连续灌注(perfusion)可以在治疗开始后发生(例如)约1-2小时至约2-6小时，至约6-12小时或者约12-24小时的一段时间。通常，通过连续灌注的治疗性组合物的剂量可以相当于通过单次或多次注射所提供的剂量，并且可以在灌注发生期间进行调整。还考虑肢体灌注可以用于施用本发明的治疗性组合物，特别是在黑素瘤和肉瘤的治疗中。

治疗方案可以是不同的，并且通常基于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病发展和患者的健康和年龄。某些类型的肿瘤将需要更积极的治疗，而与此同时，某些患者不可以耐受压力过大的规程。临床医师将最适合于基于治疗制剂的已知效力和毒性(如果有的话)来做出这些决定。在某些实施方式中，正在治疗的肿瘤可以不是可切除的，至少在开始时不是。由于边缘收缩或者通过除去某些特定侵袭性部分，使用本发明公开的治疗剂的治疗可以提高肿瘤的可切除性。治疗后，切除术可以是可能的。切除术之后的其它治疗将用于消除肿瘤位点处的微观残余疾病。

治疗可以包括多种“单位剂量”。单位剂量的定义为含有预定量的治疗性组合物。要施用的量和具体的途径和制剂在临床领域的那些技术人员的技术范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，而是可以包含在规定时间段内的连续输注。可以方便地以病毒构建体的空斑形成单位(pfu)描述本发明的单位剂量。单位剂量可以在10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²至10¹³pfu和更高的范围内。另外或者作为另外一种选择，基于病毒种类和可达到的滴度，可以将1至100、10至50、100-1000或高达约或至少约1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴或1×10¹⁵或以上的感染性病毒颗粒(vp)(包括它们之间的全部值和范围)递送至肿瘤或肿瘤位点。

本文所公开的重组正痘病毒基因组向癌症或肿瘤细胞的另一种递送方法可以通过肿瘤内注射。然而，作为另外一种选择，可以于肠胃外、静脉内、皮内、肌内、经皮或甚至腹膜内施用本文所公开的药物组合物，如美国专利No.5,543,158；美国专利No.5,641,515和美国专利No.5,399,363中所述(其分别具体地以其全部内容作为参考并入本文)。可以通过注射器或用于溶液注射的任何其它方法递送核酸构建体的注射，只要表达构建体可以通过注射所需的特定规格的针。在美国专利No.5,846,233中举例说明了可以用于本文所述的重组正痘病毒的施用的示例性无针注射系统。这种系统的特征在于限定用于保持溶液的安瓿室(ampule chamber)的喷嘴和用于将溶液从喷嘴中推出至递送位点的能量装置。另一种示例性注射器系统是允许以任何深度多次精确注射预定量的溶液的系统(美国专利No.5,846,225)。

可以在与一种或多种赋形剂、载体或稀释剂适当混合的水中制备本文所述的病毒颗粒或核酸的混合物。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油剂中制备分散系。在常规储存条件和使用情况下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。适合于可注射使用的药物形式包括用于无菌可注射溶液或分散系的临时制备的无菌水溶液或分散系以及无菌粉末(美国专利No.5,466,468，具体地以其全部内容作为参考并入本文)。在所有情况下，所述形式可以是无菌的并且可以是达到易于可注射性程度的流体。它可以在生产和储存条件下是稳定的，并且必须以抵抗微生物，如细菌和真菌的污染作用而保存。所述载体可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和/或液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散媒介。可以(例如)通过使用涂层，如卵磷脂，就分散系来说通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等导致对微生物作用的防止。在多数情况下，将优选地包括等渗剂(isotonic agents)，例如，糖或氯化钠。可以通过在所述组合物中使用延缓吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来导致可注射组合物的延长吸收。

对于水溶液中的肠胃外施用，例如，如有必要，可以适当缓冲溶液，并且首先使用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。在这一点上，根据本发明公开，可以使用的无菌水媒介将是本领域技术人员已知的。例如，可以将1个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液并添加至1000ml皮下输液流体或者在所提议的输注位点注射。基于正在治疗的受试者的状况，将在剂量中做出一些必要变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA生物标准局所要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所使用的，“载体”包括任何和全部溶剂、分散媒介、媒介物、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬液、胶体等。这些媒介物和药剂用于药物活性物质的使用在本领域中是熟知的。除了任何常规媒介物或试剂与活性成分不相容以外，考虑其在治疗性组合物中的使用。还可以将补充性活性成分引入所述组合物中。短语“药物可用的”或“药理学可用的”是指当施用于人时，不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白作为活性成分的水性组合物制剂是本领域中熟知的。通常，将这些组合物作为液体溶液或混悬液制备为可注射剂；还可以制备在注射前，适合于在液体中的溶液或者在液体中的混悬液的固体形式。

癌症

可以将本文所公开的重组正痘病毒施用于患有细胞增殖异常，如癌症的哺乳动物受试者，如人，例如，以通过溶瘤直接杀死癌细胞和/或提高对靶标癌细胞的适应性免疫应答的有效性。在一些实施方式中，所述细胞增殖异常是癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌或咽喉癌。在具体的情况下，所述细胞增殖异常可以是癌症，其选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS-相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤因肉瘤家族肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、睾丸生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、舌癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、胚胎性癌肉瘤及其它儿童肾瘤、郎格罕细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌、中线道癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低度恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里氏综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和华氏巨球蛋白血症。

具有本领域中常规技术的医师可以容易地确定用于向对其有需要的哺乳动物受试者(例如，人)施用的重组正痘病毒载体的有效量。例如，医师可以以小于实现所期望的治疗效果所需的水平来起始重组正痘病毒载体的处方剂量，并逐渐提高剂量直至实现所期望的效果。作为另外一种选择，医师可以通过施用重组正痘病毒载体剂量来开始治疗方案并随后逐渐施用较低的剂量直至实现治疗效果(例如，一种或多种肿瘤体积的减小)。通常，本发明的重组正痘病毒载体的适合的日剂量将是作为对于产生治疗效果有效的最低剂量的重组正痘病毒载体的量。可以作为单次剂量或者作为在一天、一周、一个月或一年内以适当间隔，任选地以单位剂量形式单独施用的2、3、4、5、6或更多个剂量施用本发明的重组正痘病毒载体的治疗性组合物的日剂量。尽管有可能单独施用本发明的重组正痘病毒载体，但是它还可以作为药物制剂与赋形剂、载体和任选地，其它治疗剂组合施用。

可以通过本领域中已知的任何多种方法来监测本发明的重组正痘病毒载体降低细胞增殖疾病，如癌症发展的能力。例如，医师可以通过分析患者中一种或多种肿瘤的体积来监测哺乳动物受试者(例如，人)对使用本发明的重组正痘病毒载体的治疗的反应。作为另外一种选择，医师可以通过分析特定受试者的淋巴中T-reg细胞群体来监测受试者(例如，人)对使用本发明的重组正痘病毒载体的治疗的反应性。例如，医师可以从哺乳动物受试者(例如，人)采集样品并使用规定程序，如荧光激活细胞分选术确定癌细胞的量或密度。相对于得自施用重组正痘病毒之前的受试者的样品中的癌细胞的量，样品中癌细胞的量降低(例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的发现可以指示正痘病毒施用有效治疗了癌症。

组合疗法

在多个实施方式中，重组正痘病毒可以与其它癌症治疗共施用。此外，在多种实施方式中，将本文所述的重组正痘病毒结合其它癌症治疗疗法，例如，放射疗法、化疗、手术和/或免疫疗法施用。在本发明的一些方面，将本文所述的重组正痘病毒结合检查点抑制剂施用。在多个实施方式中，可以将重组正痘病毒结合另一种癌症免疫治疗(immunoncology)产品施用。可以通过相同或不同的施用途径同时或顺序施用本发明所述的重组正痘病毒及其它疗法或治疗剂。使用本领域中已知的标准技术，具有常规技术的开业医生可以容易地确定用于在本发明所述的方法中使用的治疗剂的种类和量。

本文所述的重组正痘病毒载体可以与一种或多种其它试剂，如免疫检查点抑制剂一起施用。例如，重组正痘病毒载体可以与免疫检查点抑制剂同时施用，与免疫检查点抑制剂混合或与免疫检查点抑制剂分开施用。用于结合本发明所述的组合物和方法使用的示例性免疫检查点抑制剂包括(但不限于)OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。

另外或者作为另外一种选择，本发明的载体可以与白介素(IL)同时施用，与白介素混合或者与白介素分开施用。例如，重组正痘病毒载体可以与白介素同时施用，与白介素混合或与白介素分开施用。用于结合本发明所述的组合物和方法使用的示例性白介素包括(但不限于)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。

另外或者作为另外一种选择，本发明的载体可以与干扰素同时施用，与干扰素混合或者与干扰素分开施用。例如，重组正痘病毒载体可以与干扰素同时施用，与干扰素混合或与干扰素分开施用。用于结合本发明所述的组合物和方法使用的示例性干扰素包括(但不限于)IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

另外或者作为另外一种选择，本发明的载体可以与TNF超家族成员蛋白同时施用，与TNF超家族成员蛋白混合或者与TNF超家族成员蛋白分开施用。例如，重组正痘病毒载体可以与TNF超家族成员蛋白同时施用，与TNF超家族成员蛋白混合或与TNF超家族成员蛋白分开施用。用于结合本发明所述的组合物和方法使用的示例性TNF超家族成员蛋白包括(但不限于)TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

另外或者作为另外一种选择，本发明的载体可以与细胞因子同时施用，与细胞因子混合或者与细胞因子分开施用。例如，重组正痘病毒载体可以与细胞因子同时施用，与细胞因子混合或与细胞因子分开施用。用于结合本发明所述的组合物和方法使用的示例性细胞因子包括(但不限于)GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(脒基腺苷酸环化酶)。

表3.卵巢癌

表4.乳腺癌

表5.睾丸癌

表6.胰腺癌

表7.肝癌

表8.结肠直肠癌

表9.甲状腺癌

表10.肺癌

表11.前列腺癌

表12.肾癌

表13.黑素瘤

表14.鳞状细胞癌

表15.慢性粒细胞性白血病

表16.急性淋巴母细胞性白血病

表17.急性髓性白血病

表18.慢性淋巴细胞性白血病

表19.早幼粒细胞性白血病

表20.多发性骨髓瘤

表21.B细胞淋巴瘤

表22.膀胱癌

表23.头颈癌

表24.食道癌

表25.脑癌

表26.咽癌

表27.舌肿瘤

表28.滑膜细胞肉瘤

表29.成神经细胞瘤

表30.子宫癌

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基因比对

以下显示了所选正痘病毒基因的示例性比对。5种牛痘病毒株：哥本哈根(“cop”)、西储(“WR”)、天坛(“Tian”)、惠氏和李斯特的多种基因的比对如下所示：

C2L

CLUSTAL O(1.2.4)多序列比对

用于测量病毒特征的测定

本领域中已知的测量肿瘤扩散和病毒毒力的测定包括(但不限于)测量空斑尺寸、合胞体形成和/或彗星测定(EEV)。本领域中已知的测量病毒的免疫刺激性活性的测定包括(但不限于)NK激活(以CD69表达％测量)、NK脱粒(以CD107a的增加倍数测量)和/或T细胞致敏测定。本领域中已知的测量病毒选择性的测定包括(但不限于)尾痘病变(tail poxlesion)、生物分布和/或体重测量。

通过正痘病毒基因编码的蛋白的实例

在下表31-40中再现了在本发明公开中所述的正痘病毒基因所编码的示例性蛋白。如以下所使用的，术语“位置”是指基因相对于本文所述的示例性正痘病毒载体中缺失的核酸的位置。对于多种基因，提供了氨基酸序列信息和蛋白登录ID号。

表31.通过CopMD5p载体中缺失的哥本哈根牛痘基因编码的蛋白的实例

表32.通过等价于CopMD5p载体中缺失的那些的西储牛痘基因编码的蛋白的实例

表33.通过等价于CopMD5p载体中缺失的那些的天坛牛痘基因编码的蛋白的实例

表34.通过等价于CopMD5p载体中缺失的那些的惠氏牛痘基因编码的蛋白的实例

表35.通过等价于CopMD5p载体中缺失的那些的李斯特牛痘基因编码的蛋白的实例

表36.通过CopMD3p载体中缺失的哥本哈根牛痘基因编码的蛋白的实例

表37.通过等价于CopMD3p载体中缺失的那些的西储牛痘基因编码的蛋白的实例

表38.通过等价于CopMD3p载体中缺失的那些的天坛牛痘基因编码的蛋白的实例

表39.通过等价于CopMD3p载体中缺失的那些的惠氏牛痘基因编码的蛋白的实例

表40.通过等价于CopMD3p载体中缺失的那些的李斯特牛痘基因编码的蛋白的实例

实施例

提出以下实施例以向本领域技术人员提供如何实施、制备和评价本文所主张的组合物和方法的描述，并且以下实施例旨在是对本发明的纯粹示例，并且不意欲限制本发明人所认为的她的发明的范围。

实施例1-CopMD5p3p“SKV-B8R+”重组正痘病毒的产生

将来自59个痘病毒株的开放阅读框(ORF)聚类为直系同源基因(orthologs)并在氨基酸水平比对(参见图1的系统发育分析)。实施贝叶斯分析以确定所有株的相关性。痘病毒在基因含量和宿主范围方面非常多样化。存在几种天然存在的牛痘野生株，其彼此不同。

将5种牛痘野生株(哥本哈根、天坛、李斯特、惠氏和西储)以相等的空斑形成单位计数混合并通过NGS测序(接种库(Input pool))。将所得混合物在不同的癌细胞系(HeLa、786-O、HT29、MCF7)中传代三次。通过NGS illumina测序对最终的群体测序。基于序列同一性将读序(短DNA片段)分配给各个株，并将其用于计算每个株在最终群体中的百分比。然后，定量不同病毒株的相对丰度。如图2所示，在4个癌细胞系中的任一个中传代三次后，哥本哈根株是最大量的牛痘株，这表明该株能够比其它株生长的更快，并因此更快复制。

不同的牛痘野生株还用于以低PFU(1×10⁴)感染多个患者的肿瘤中心区。每株平均感染4个复制(replicates)，每个含有3个2×2mm的肿瘤中心区。通过病毒滴度评价复制，并将其表示为空斑形成单位(PFU)，如图3所示。哥本哈根株比其它株生长至更高的滴度，并因此在患者离体样品中更快地复制。患者离体中心区是患者3D肿瘤的优良模拟。

然后，在U2-OS细胞上，以3％的CMC覆盖，对牛痘野生株进行空斑测定。感染后2天，对每个株的20-30个空斑测量了其尺寸。图4显示了哥本哈根、西储、惠氏、李斯特和天坛的空斑尺寸测量。斑块形成受病毒复制、扩散和杀死能力的影响。对于哥本哈根株所观察到的较大的空斑尺寸表明该株在这些能力方面具有优势，这对溶瘤病毒的开发是重要的。

然后，对牛痘哥本哈根基因组中的1kb区域内的TTAA位点数进行计数(参见图5A)。将Ilumina NGS测序组合并用于识别转座子插入位点(Tn-Seq)。将接种(input library)文库在HeLa或U2-OS细胞中传代三次，然后确定转座子敲除频率。敲除频率直接对应于支持该事件的读序的量(参见图5B和图6)。

最终，将来自图1的全部59个痘病毒基因组用于找出ORF并聚类成直系同源组。基于哥本哈根基因组中基因的位置(x轴)和组的规模(y轴)，将含有哥本哈根基因的组作图。当全部59个种共有相同基因时，则保守度认为是100％。转座子插入需要TTAA基序，并且该基序在基因组中普遍存在，这表明转座子可以在基因组中的任何位置插入。然而，注意到转座子优先插入到低痘病毒基因保守度的区域中。当测序转座子敲除时，鉴别了主要缺失并将其标记为CopMD5p和CopMD3p(参见图5C和图6)。存在于基因组中间且具有高基因保守度的基因(图5C)对于病毒复制是重要的。这是因为通过转座子插入将这些基因敲除导致了适应性的降低(传代后较低的频率)。据发现作为主要缺失CopMD5p和CopMD3p的一部分的基因对于病毒复制不太重要，因为它们的缺失不影响适应性。

Illumina NGS深度测序显示在空斑纯化法期间存在主要缺失。CopMD5p和CopMD3p代表空斑纯化且发现具有主要基因组缺失的克隆。将这2个克隆用于以高MOI(MOI 10)共感染HeLa细胞单层以诱导重组。随机空斑挑取和PCR显示存在含有两个基因组缺失的双重缺失的CopMD5p3p(参见图8)。将这2个缺失组合并纯化以提供复制病毒，其在本文中称为“CopMD5p3p”，其显示出在C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R基因中的缺失和在ITR基因B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R中的每一个中的单一缺失。如本文所使用的，“CopWT”是指野生型哥本哈根牛痘病毒，“CopMD5p”是指具有代表性的5'基因(C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L)中的缺失的哥本哈根牛痘病毒，而“CopMD3p”是指具有代表性的3'基因(B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R)中的缺失以及ITR基因B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R中的每一个中的单一缺失的哥本哈根牛痘病毒。

然后，对59个痘病毒基因组评价了CopMD5p3p中缺失的这31个基因的存在。将同源性搜索用于从具有来自哥本哈根基因组的表2基因的氨基酸序列的其它进化枝中查找痘病毒。如图36所示，存在于各个痘病毒株中的这32个基因的百分比随着与哥本哈根株的分化度的升高而降低(图上每个点代表一个痘病毒基因组)。然而，大部分正痘家族成员包含至少85％的在CopMD5p3p重组载体中缺失的基因。

实施例2-癌细胞死亡

以4个重复，在24-孔板中用CopMD5p3p以一系列MOI(1至0.01)感染癌细胞。病毒感染后2天，用结晶紫对板进行染色。将结晶紫染色溶于SDS并通过分光光度法读数。作为未感染细胞的百分比表示数据(参见图9)。该数据显示当暴露于CopMD5p3p病毒时，大部分癌细胞系更快地死亡。

图26、27和29-35中还显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子诱导抗-肿瘤免疫应答和在多种癌细胞系中增殖的能力。

实施例3-癌细胞中的生长

在24-孔板中，以低MOI(0.001)并且在不同时间点，用CopMD5p3p感染4种癌细胞系，重复三次，并且收集病毒并测量滴度。时间0h代表接种。图10显示了HeLa、786-O、HT-29和MCF7的生长曲线。该数据显示修饰的CopMD5p3p病毒的体外生长能力未受到损害。这表示该病毒是有复制能力的，即使是在存在干扰素反应的情况下。在哺乳动物细胞系中的复制能力提供了另一个重要的优势。照此，可以产生具有高速度和效率的病毒。

实施例4-患者肿瘤样品中的生长

手术后立即获得患者肿瘤样品并将其切成2mm×2mm的中心区。用少量野生型哥本哈根或CopMD5p3p病毒(1×10⁴PFU)感染三个中心区。72h后，通过空斑测定评价病毒产量并且最终病毒滴度表示为PFU(参见图11)。该数据显示修饰的CopMD5p3p病毒可以在新鲜的患者肿瘤样品中复制。患者肿瘤样品中的复制是患者3D肿瘤中的优良复制模型。

实施例5-U2-OS细胞中的合胞体

用哥本哈根野生型或CopMD5p3p病毒感染U2-OS细胞单层。2h后，如空斑测定中所做的一样，将培养基更换为覆盖层培养基。感染后48h，通过EVOS采集照片以评价空斑表型(参见图12)。据信细胞融合，也称为合胞体将帮助病毒扩散，因为未感染的细胞将与感染的细胞融合。另外，已显示融合的细胞是免疫原性的并且就癌细胞来说，可以帮助引起抗肿瘤免疫应答。参见，例如，http://cancerres.aacrjournals.org/content/62/22/6566.long.

实施例6-786-O细胞中的合胞体

用哥本哈根野生型或CopMD5p3p病毒感染786-O细胞单层。24h后，以10×放大，用EVOS采集照片(参见图13)。这是合胞体发生的另外的证据。在图12中，显示了空斑的表型。在当前的实验中，在无覆盖层的情况下感染了单细胞层。CopMD5p3p病毒感染的大部分细胞已融合。

实施例7-小鼠模型中的肿瘤控制和重量减轻

对裸CD-1(Crl:CD1-Foxn1nu)小鼠接种HT-29人结肠癌异种移植(5e6个细胞)。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则以1×10⁷PFU，以24h的间隔，用任一种牛痘病毒静脉内处理小鼠三次(短划线)。大致每隔一天对小鼠测量肿瘤尺寸和重量减轻(参见图14)。该实验显示CopMD5p3p是更安全的病毒，因为它不会在免疫受损裸鼠中导致任何重量减轻或其它疾病病征。该实验还显示CopMD5p3p能够与亲代哥本哈根野生型病毒类似地控制肿瘤生长。

实施例8-痘病变形成

以1×10⁷PFU，用任一种牛痘病毒静脉内处理裸CD-1小鼠一次，每组六只小鼠。处理后2周，将小鼠处死并采集尾部照片。手动对每只小鼠的尾部计数尾部上的痘病变。图15显示了代表性照片。该实验显示CopMD5p3p是更安全的病毒，因为它不会在免疫受损裸鼠中导致任何痘病变。这是重要的，因为先前的溶瘤牛痘临床数据已显示治疗时患者出现痘病变。胸苷激酶(TK)的敲除是提高OV(溶瘤病毒)安全性的通用方式，其目前存在于III期溶瘤牛痘和FDA批准的溶瘤T-Vec(Oncolytic T-Vec)中。数据显示TK缺失在该测定中不起重要作用，其中当用TK缺失的病毒激发时，小鼠出现痘病变，但使用具有完整TK的CopMD5p3p时，不出现痘病变。

实施例9-全身施用后牛痘的IVIS生物分布

通过用pSEM1质粒转染感染的细胞，从而用Fluc和YFP替换TK，将牛痘病毒野生型惠氏、野生型哥本哈根和CopMD5p3p工程设计以表达荧光虫荧光素酶(Fluc)和YFP。将病毒空斑纯化并扩增。所有病毒均为TK敲除的并且在它们的TK基因座中编码功能性Fluc。

然后，用HT-29人结肠癌异种移植接种裸CD-1小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则以1e7PFU，用任一种牛痘Fluc编码病毒静脉内处理小鼠一次，每组4只小鼠。处理后4天，对小鼠i.p.(腹膜内)注射萤光素并用IVIS对病毒的存在成象(参见图16)。该实验显示CopMD5p3p是更安全的病毒，因为它对肿瘤特异性更强。其它病毒在尾部、肌肉、爪和鼻腔内显示出脱靶复制。CopMD5p3p仅定位在肿瘤中。如以上图15和16所示，与其它株相比，在尾部中存在少量可检测的CopMD5p3p。图17显示当与其它溶瘤牛痘相比时，CopMD5p3p在其它器官中也具有较低的滴度。由于CopMD5p3p在肿瘤中在与其它病毒相同的水平复制，但是在脱靶组织中的复制较少，因此CopMD5p3p更好地符合溶瘤病毒谱(profile)。

图28显示了多种牛痘病毒载体的生物分布的其它实例，包括野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子。

实施例10-人PBMC中的牛痘免疫原性

从健康人供体的血液中分离了PBMC(n＝2)。将PBMC与任一种牛痘培育24h，并使用流式细胞术检查早期激活标志物(参见图18)。该实验显示CopMD5p3p的免疫原性更强并且是通过免疫细胞更易于可检测的。我们相信这是所期望的性状，因为对于成功的抗-肿瘤免疫应答，肿瘤组织中的OV复制需要激活免疫细胞。

实施例11-小鼠脾细胞中的牛痘免疫原性

用1×10⁷牛痘PFU牛痘病毒静脉内注射具有免疫能力的Balb/C小鼠。一天或两天后，将小鼠处死，收获脾脏并使用流式细胞术分析免疫激活(参见图19)。该实验显示CopMD5p3p的免疫原性更强并且是通过小鼠免疫细胞更易于可检测的。该数据很好地补充了以上图18，因为在小鼠中进行了大部分的体内实验。

实施例12-人细胞中的牛痘免疫原性

以0.01的MOI，用任一种病毒感染人癌细胞786-O。第二天，收获细胞并通过细胞分级来分离核和细胞质。从每个部分提取蛋白，并对NF-kB亚基p65和p50进行印迹(参见图20)。一旦其亚基p65和p50移位至核，则NF-kB免疫转录因子引起免疫应答。一些病毒是免疫抑制的并且阻断其移位，从而防止免疫应答。对于结合免疫治疗方法使用溶瘤病毒的目标来说，抑制NF-kB功能是与直观感受相反的。因此，CopMD5p3p是更有利的病毒，因为它的表现与MG-1类似。

实施例13-在侵袭性黑素瘤模型中与免疫检查点抑制剂抗-CTLA4的协同作用

用B16-F10黑素瘤肿瘤皮下接种(5e5个细胞)具有免疫能力的C57BL/6小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则开始治疗。用CopMD5p3p病毒处理的小鼠以1天的间隔，在肿瘤中(肿瘤内)接受3次1×10⁷PFU的剂量。用抗-CTLA4处理的小鼠以1天的间隔i.p.接受5次100μg剂量的抗体。一旦治疗开始，每隔一天记录存活(参见图21)。在该实验中，我们测试了我们的CopMD5p3p病毒的溶瘤作用是否可以在侵袭性很强的黑素瘤鼠科模型中与熟知的免疫检查点CTLA-4的阻断协同增效。意外地，用病毒和检查点处理的小鼠的中值存活高于任何其它组。这表明CopMD5p3p具有与检查点阻断免疫疗法协同增效的一些刺激性质。

实施例14-与免疫检查点抑制剂抗-CTLA4的协同作用

用CT26-LacZ肿瘤皮下接种(5×10⁵个细胞)具有免疫能力的Balb/C小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则开始治疗。用牛痘病毒处理的小鼠在肿瘤中(肿瘤内)接受3次(相隔24h，前三条短划线)1e7PFU的剂量。用抗-CTLA4处理的小鼠i.p.接受了5次(相隔24h，短划线)100μg剂量的抗体。一旦治疗开始，每隔一天记录肿瘤尺寸和存活(参见图22)。数据显示TK敲除的牛痘病毒与抗-CTLA4协同的效果不如CopMD5p3p。这表明CopMD5p3p的免疫原性更强，并且更能产生抗肿瘤免疫应答。

实施例15-与免疫检查点抑制剂抗-PD1的协同作用

用CT26-LacZ肿瘤皮下接种(5×10⁵个细胞)具有免疫能力的Balb/C小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则开始治疗。用牛痘病毒处理的小鼠在肿瘤中(肿瘤内)接受3次(相隔24h，前三条短划线)1e7PFU的剂量。在最后一次牛痘病毒剂量后24小时，用抗-PD1处理的小鼠i.p.接受了5次(相隔24h，最后5条短划线)100μg剂量的抗体。一旦治疗开始，每隔一天记录肿瘤尺寸和存活(参见图23)。数据显示TK敲除的牛痘病毒与抗-PD1协同的效果不如CopMD5p3p。这表明CopMD5p3p的免疫原性更强，并且更能产生抗-肿瘤免疫应答。

实施例16-与免疫检查点抑制剂抗-PD1和抗-CDLA4的协同作用

用CT26-LacZ肿瘤皮下接种(5×10⁵个细胞)具有免疫能力的Balb/C小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm×5mm的尺寸，则开始治疗。用牛痘病毒处理的小鼠在肿瘤中(肿瘤内)接受3次(相隔24h，前三条短划线)1×10⁷PFU的剂量。用抗-CTLA4处理的小鼠i.p.接受了5次(相隔24h，前5条短划线)100pg剂量的抗体。在最后一次牛痘病毒剂量后24小时，用抗-PD1处理的小鼠i.p.接受了5次(相隔24h，最后5条短划线)100pg剂量的抗体。一旦治疗开始，每隔一天记录肿瘤尺寸和存活(参见图24)。在该实验中，我们测试了如果我们同时阻断两个检查点，低剂量(25pg，而不是100pg)的检查点抑制剂抗体是否可以起作用。在该鼠科模型中，使用低剂量(总计50pg)的两种检查点抑制剂，CopMD5p3p仍设法实现了治愈。由于检查点抑制剂具有剂量依赖性毒性，因此非常低剂量的检查点阻断剂仍可以实现可观察的表型将是有利的。如其它实验中一样，CopMD5p3p病毒设法治愈已建立的肿瘤，并且使用缺少相应CopMD5p3p缺失的野生型病毒，未观察到这种效果。

实施例17-用于受试者治疗的施用

使用本文所述的方法，具有本领域技术的临床医师可以向受试者(例如，患者)施用含有本文所述的重组正痘病毒载体的药物组合物以治疗癌症或肿瘤细胞。所述癌症可以是(例如)白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌或咽喉癌等。

例如，具有本领域技术的临床医师可以评价患者患有癌症或肿瘤并且可以向患者施用治疗有效量(例如，足以降低肿瘤尺寸的量)的含有本文所公开的重组正痘病毒载体的药物组合物。可以按指定时间间隔(例如，每周、每天或每小时)，以一个或多个剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个剂量)向受试者施用所述药物组合物。可以在剂量间评价患者以监测疗法的有效性并根据患者的反应来提高或降低剂量。可以向患者口服、肠胃外(例如，局部)、静脉内、肌内、皮下或鼻内施用药物组合物。治疗可以包括药物组合物的单次剂量施用。治疗可以包括药物组合物的持续剂量施用(例如，数天、数周、数月或数年)。所述治疗还可以包括另一种治疗剂(例如，免疫检查点抑制剂，如抗-PD-1或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、IL-12、FLT3L)的使用。

实施例18-CopMD5p和CopMD3p的靶向缺失

以下用于产生修饰的牛痘病毒载体的规程使用了(例如)Rintoul等人,PLoSOne.6(9):e24643(2011)中所述的技术，该文献的公开内容作为参考并入本文。

简要地，通过g-Block技术(IDT,Coralville Iowa)合成了CopMD5p(在5'基因：C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L中具有缺失的哥本哈根牛痘病毒)和CopMd3p(在3'基因：B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R中具有缺失并且在靶向重组构建体的ITR基因B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R中的每一个中具有单一缺失的哥本哈根牛痘病毒)。以0.01的MOI，在无血清DMEM中，用野生型牛痘病毒(惠氏、西储、天坛、李斯特)感染U2OS细胞1.5小时。吸出病毒上清液并通过Lipofectamine 2000(Invitrogen)，在OptiMEM(Gibco)中用PCR扩增的CopMD5p或CopMd3p靶向g-Blocks转染U2OS细胞。在转染后30分钟将补充有10％FBS的DMEM加入至细胞中并保持过夜。随后几天，吸出转染培养基并将新鲜的DMEM 10％FBS培养基加入至细胞。感染转染后48小时，收获U2OS细胞并通过单一冷冻融化循环裂解。将顺序稀释的裂解液在汇合的单层U2OS细胞上铺板，并分离eGFP阳性(CopMD5p靶向的)或mcherry阳性(CopMd3p靶向)空斑并通过5轮空斑纯化进行纯化。

对于每种病毒，在U2OS细胞中，通过以MOI为5的CopMD5p和CopMd3p缺失的牛痘病毒的共转染，产生了双重主要缺失的牛痘病毒。次日收获细胞并通过1轮冷冻融化裂解。将裂解液顺序稀释，并在汇合的单层U2OS细胞上铺板，并对双重阳性空斑(eGFP+mCherry)进行选择。通过5轮空斑纯化来纯化空斑。

在图25中显示了用于产生本发明公开所述的修饰的牛痘病毒载体(例如，修饰的牛痘病毒载体，如修饰的哥本哈根牛痘病毒载体)的示例性方案。

实施例19-与SKV-(CopMD5p3p-B8R+)相比，SKV-GFP(CopMD5p3p-B8R-)在肿瘤控制方面具有类似的效力

牛痘病毒(VV)B8R基因编码与γ干扰素受体(IFN-γ)具有同源性的分泌蛋白。体外，B8R蛋白结合至并中和几个种的γ干扰素，包括人和大鼠γ干扰素的抗病毒活性；然而，它不明显结合鼠科IFN-γ。在本文中，我们描述了缺少B8R基因的重组VV的构建和表征。靶标构建体和B8R基因座之间的同源重组导致75％的B8R基因被通过两个loxP位点(SKV-GFP)侧接的eGFP转基因替换。

B8R-病毒显示出与B8R+病毒类似的效力。图39。评价了用SKV或SKV-GFP处理的小鼠的存活。在第0天，皮下接种5×10⁶个CT26-LacZ细胞。在第14天，以10⁷pfu的剂量，通过SKV或SKV-GFP的抗肿瘤注射治疗16和18个肿瘤。当所注射的病毒具有B8R基因座缺失时，未观察到效力的明显降低。

实施例20-SKV(CopMD5p3p-B8R+)病毒的正常相对于癌细胞系的感染

将原代健康细胞存活力与癌细胞的相比较。以一系列MOI(pfu/细胞)感染汇合的正常或癌细胞48小时，然后定量存活力。如图37所示，SKV-B8R+病毒优先感染癌细胞。

实施例21-SKV(CopMD5p3p-B8R+)不损害干扰素信号转导。

通过确定多种正常细胞系和一种癌细胞系(786-O)中上调(诱导表达)或下调(抑制表达)的干扰素途径中的基因数目来评价干扰素的信号转导。图38以MOI为3(3×10⁶PFU)，用SKV(CopMD5p3p-B8R+)或者TK基因无功能的亲代哥本哈根病毒株感染1百万个汇合的单层细胞18h。使用RNA-seq对RNA测序并在读序定位和表达归一化之后确定干扰素基因的基因表达。尽管SKV(CopMD5p3p-B8R+)病毒大部分诱导干扰素途径中的基因，但亲代哥本哈根抑制基因。这表明SKV(CopMD5p3p-B8R+)能够诱导I型干扰素信号转导，这在正常细胞的病毒清除中是至关重要的。

实施例22-经工程设计以表达Flt3L、IL-12TM和抗-hCTLA-4的B8R阴性牛痘病毒。

如上所述，将含有CopMD5p3p和B8R缺失两者的修饰的牛痘病毒进一步工程设计以表达免疫治疗性转基因。在转基因表达动力学方面评价了表达三种转基因的SKV-123病毒3(CopMD5p3p-B8R+-IL12TM-FLT3-抗CLTA4)。以MOI为3(3×10⁶pfu)，用SKV-123病毒感染汇合的单层786-O人腺癌细胞系。使用RNA-seq对RNA测序并在表达归一化后，在读序定位后，确定插入转基因的基因表达。转基因表达峰值在细胞感染后的3-4小时。参见图40。

实施例23-表达鼠科IL-12p35膜结合蛋白的SKV(SKV3)在控制鼠科肿瘤中的效力更大

评价了用SKV(CopMD5p3p-B8R+)或者SKV-3(CopMD5p3p-B8R+-IL12TM)病毒(表达鼠科膜结合p35 IL-12)处理的小鼠的存活。在第0天，皮下接种5×10⁶个CT26-LacZ细胞。在第14、16和18天，以1e7 pfu的剂量，通过SKV或SKV-3的抗肿瘤注射治疗肿瘤。尽管SKV病毒延长了具有CT26结肠肿瘤的小鼠的存活，但是SKV-3的IL-12的表达能够引起导致持久治愈的症状缓解。参见图41。

实施例24-多种牛痘株中工程设计的主要双重缺失提高了体外癌细胞杀死。

以0.1的MOI，用以下工程牛痘病毒株感染HeLa细胞：(1)亲代野生型病毒(wt)；(2)5'主要缺失(5p)、(3)3'主要缺失(3p)和(4)重组5'和3'主要双重缺失(5p3p)。感染后72小时，通过阿拉玛蓝测定定量细胞存活力。当与它们的亲代野生型和3p主要缺失株相比时，5p和5p3p主要双重缺失的牛痘株两者在HelLa细胞中的细胞毒性更强。参见图42。图43显示了主要缺失的牛痘株以及5p、3p和5p3p缺失对合胞体、细胞毒性和复制的影响的总结。通过静脉内尾静脉注射，用1×10⁷pfu处理CD-1裸鼠并在指定时间点测量。与野生株相比，5p3p牛痘株不引起重量减轻。图44。注射后6天，还检查了小鼠的痘病变。与野生株相比，5p3p牛痘株不引起痘病变。图45。

一些实施方式

在本说明书中提及的所有专利公开、专利和专利申请以每个独立的专利公开或专利申请具体且单独表明作为参考并入的相同程度作为参考并入本文。

尽管已结合其具体实施方式描述了本发明，但是将理解它能够进一步修饰，并且本发明申请旨在涵盖一般地，根据本发明的原理并且包括本发明所属领域内的已知或惯例实践内的与本发明公开的这些偏离所做的本发明的任何变化、使用或改变，并且可以适用于以上所述的基本特征，并处于权利要求的范围内。

一些实施方式在权利要求之内。

Claims (196)

1.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因的缺失，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述缺失包含以下每个所述基因的缺失：C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R基因。

3.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2、3、4或5个基因的缺失，所述基因选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。

4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述缺失包含所述B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R基因中的每一个。

5.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个基因的缺失，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。

6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述缺失包含所述C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L基因中的每一个。

7.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

9.根据权利要求7或8所述的核酸，其中所述编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是F1L。

10.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。

12.根据权利要求10或11所述的核酸，其中所述编码BCL-2抑制剂的基因是N1L。

13.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。

15.根据权利要求13或14所述的核酸，其中所述编码dUTP酶的基因是F2L。

16.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

18.根据权利要求16或17所述的核酸，其中所述编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是B19R。

19.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

20.根据权利要求1-18中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

21.根据权利要求19或20所述的核酸，其中所述编码IL-1-β-抑制剂的基因是B16R。

22.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。

23.根据权利要求1-56中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。

24.根据权利要求22或23所述的核酸，其中所述编码磷脂酶-D的基因是K4L。

25.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。

27.根据权利要求25或26所述的核酸，其中所述编码PKR抑制剂的基因是K3L。

28.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

29.根据权利要求1-27中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

30.根据权利要求28或29所述的核酸，其中所述编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是K2L。

31.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。

32.根据权利要求1-30中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。

33.根据权利要求31或32所述的核酸，其中所述编码TLR信号转导抑制剂的基因是N2L。

34.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。

35.根据权利要求1-33中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。

36.根据权利要求34或35中任一项所述的核酸，其中所述编码kelch-样蛋白的基因独立地选自F3L和C2L。

37.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。

38.根据权利要求1-36中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。

39.根据权利要求37或38中任一项所述的核酸，其中所述编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自K5L和K6L。

40.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。

41.根据权利要求1-39中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。

42.根据权利要求40或41中任一项所述的核酸，其中所述编码NF-κB抑制剂的基因独立地选自K7R、K1L和M2L。

43.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。

44.根据权利要求1-42中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。

45.根据权利要求43或44中任一项所述的核酸，其中所述编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自B18R、B20R和M1L。

46.包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1或2个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。

47.根据权利要求1-45中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1或2个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。

48.根据权利要求47所述的核酸，其中所述缺失包含所述B15R、B17R和B14R基因中的每一个。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1、2、3、4、5、6、7或8个基因的缺失，所述基因选自ITR基因，所述ITR基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。

50.根据权利要求49所述的核酸，其中所述缺失包含所述B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R基因中的每一个。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的核酸，其中所述牛痘病毒是选自下列的株：哥本哈根、西储、惠氏、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、DairenI、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、天坛和WAU86/88-1。

52.根据权利要求51所述的核酸，其中所述牛痘病毒是选自下列的株：哥本哈根、西储、天坛、惠氏和李斯特。

53.根据权利要求52所述的核酸，其中所述牛痘病毒是哥本哈根株牛痘病毒。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的核酸，其中所述缺失中的每一个是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。

55.根据权利要求1-53中任一项所述的核酸，其中所述缺失中的每一个是编码相应基因的多核苷酸的部分的缺失，并且其中一旦引入宿主细胞，所述缺失足以使所述基因无功能。

56.根据权利要求1-53中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码肿瘤-相关抗原的转基因。

57.根据权利要求56所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原是表3-30中的任一个中所列的肿瘤-相关抗原。

58.根据权利要求56所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原是选自下列的肿瘤-相关抗原：CD19、CD33、EpCAM、CEA、PSMA、EGFRvIII、CD133、EGFR、CDH19、ENPP3、DLL3、MSLN、ROR1、HER2、HLAA2、EpHA2、EpHA3、MCSP、CSPG4、NG2、RON、FLT3、BCMA、CD20、FAPα、FRα、CA-9、PDGFRα、PDGFRβ、FSP1、S100A4、ADAM12m、RET、MET、FGFR、INSR和NTRK。

59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原包含MAGE-A3或其一个或多个片段。

60.根据权利要求59所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原包含一种或多种人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白或其片段。

61.根据权利要求60所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原包含(i)HPV16的E6和E7蛋白或其片段和(ii)HPV18的E6和E7蛋白或其片段。

62.根据权利要求61所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原包含brachyury或其一个或多个片段。

63.根据权利要求62所述的核酸，其中所述肿瘤-相关抗原包含前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。

65.根据权利要求64所述的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。

66.根据权利要求64所述的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

67.根据权利要求64所述的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。

68.根据权利要求64所述的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

69.根据权利要求1-68中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码白介素(IL)的转基因。

70.根据权利要求69所述的核酸，其中所述白介素选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。

71.根据权利要求70所述的核酸，其中所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。

72.根据权利要求71所述的核酸，其中所述白介素是膜结合的。

73.根据权利要求1-72中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码干扰素(IFN)的转基因。

74.根据权利要求73所述的核酸，其中所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

75.根据权利要求1-74中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码TNF超家族成员蛋白的转基因。

76.根据权利要求75所述的核酸，其中所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

77.根据权利要求1-76中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码细胞因子的转基因。

78.根据权利要求77所述的核酸，其中所述细胞因子选自GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(脒基腺苷酸环化酶)。

79.根据权利要求78所述的核酸，其中所述细胞因子是Flt3配体。

80.包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因的缺失的重组正痘病毒载体，每个所述基因独立地选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L、F3L、B14R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R、B20R。

81.包含至少1、2、3、4、5或6个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。

82.根据权利要求80或81所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2、3、4、5或6个基因的缺失，所述基因选自B14R、B16R、B17L、B18R、B19R和B20R。

83.包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个基因的缺失的重组正痘病毒载体，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。

84.根据权利要求80-82中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个基因的缺失，所述基因选自C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L和F3L。

85.重组正痘病毒载体，其包括至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

86.根据权利要求80-84中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。

87.根据权利要求85或86所述的载体，其中所述编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是F1L。

88.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。

89.根据权利要求80-87中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码BCL-2抑制剂。

90.根据权利要求88或89所述的载体，其中所述编码BCL-2抑制剂的基因是N1L。

91.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。

92.根据权利要求80-90中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码dUTP酶。

93.根据权利要求91或92所述的载体，其中所述编码dUTP酶的基因是F2L。

94.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

95.根据权利要求80-93中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白。

96.根据权利要求94或95所述的载体，其中所述编码IFN-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是B19R。

97.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

98.根据权利要求80-96中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码IL-1-β-抑制剂。

99.根据权利要求97或98所述的载体，其中所述编码IL-1-β-抑制剂的基因是B16R。

100.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。

101.根据权利要求80-99中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-D。

102.根据权利要求100或101所述的载体，其中所述编码磷脂酶-D的基因是K4L。

103.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。

104.根据权利要求80-102中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码PKR抑制剂。

105.根据权利要求103或104所述的载体，其中所述编码PKR抑制剂的基因是K3L。

106.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

107.根据权利要求80-105中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。

108.根据权利要求106或107所述的载体，其中所述编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是K2L。

109.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。

110.根据权利要求80-108中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个基因的缺失，所述基因编码TLR信号转导抑制剂。

111.根据权利要求109或110所述的载体，其中所述编码TLR信号转导抑制剂的基因是N2L。

112.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。

113.根据权利要求80-111中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。

114.根据权利要求112-113中任一项所述的载体，其中所述编码kelch-样蛋白的基因独立地选自F3L和C2L。

115.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。

116.根据权利要求80-114中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。

117.根据权利要求115-116中任一项所述的载体，其中所述编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自K5L和K6L。

118.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。

119.根据权利要求80-117中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码NF-κB抑制剂。

120.根据权利要求118-119中任一项所述的载体，其中所述编码NF-κB抑制剂的基因独立地选自K7R、K1L和M2L。

121.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。

122.根据权利要求80-120中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。

123.根据权利要求121-122中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自B18R、B20R和M1L。

124.重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。

125.根据权利要求80-123中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1或2个基因的缺失，所述基因选自B15R、B17R和B14R。

126.根据权利要求124或125所述的载体，其中所述缺失包含所述B15R、B17R和B14R基因中的每一个。

127.根据权利要求80-126中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个基因的缺失，所述基因选自ITR基因，所述ITR基因包括B21R、B22R、B23R、B24R、B25R、B26R、B27R、B28R和B29R。

128.根据权利要求80-127中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述牛痘病毒是选自下列的株：哥本哈根、西储、惠氏、李斯特、EM63、ACAM2000、LC16m8、CV-1、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Dairen I、GLV-1h68、IHD-J、L-IVP、LC16m8、LC16mO、Tashkent、天坛和WAU86/88-1。

129.根据权利要求128所述的重组正痘病毒载体，其中所述牛痘病毒是选自下列的株：哥本哈根、西储、天坛、惠氏和李斯特。

130.根据权利要求129所述的重组正痘病毒载体，其中所述牛痘病毒是哥本哈根株牛痘病毒。

131.根据权利要求129中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述缺失是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。

132.根据权利要求80-131中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述缺失中的每一个是编码相应基因的多核苷酸的部分的缺失，并且其中一旦引入宿主细胞，所述缺失足以使所述基因无功能。

133.根据权利要求80-132中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述载体还包含编码肿瘤-相关抗原的转基因。

134.根据权利要求80-133中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码肿瘤-相关抗原的转基因。

135.根据权利要求136所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原是表3-30中的任一个中所列的肿瘤-相关抗原。

136.根据权利要求134所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原是选自下列的肿瘤-相关抗原：CD19、CD33、EpCAM、CEA、PSMA、EGFRvIII、CD274、EGFR、CDH19、ENPP3、DLL3、MSLN、ROR1、HER2、HLAA2、EpHA2、EpHA3、MCSP、CSPG4、NG2、RON、FLT3、BCMA、CD20、FAPα、FRα、CA-9、PDGFRα、PDGFRβ、FSP1、S100A4、ADAM12m、RET、MET、FGFR、INSR和NTRK。

137.根据权利要求134所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原包含MAGE-A3或其一个或多个片段。

138.根据权利要求134所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原包含一种或多种人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白或其片段。

139.根据权利要求136所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原包含(i)HPV16的E6和E7蛋白或其片段和(ii)HPV18的E6和E7蛋白或其片段。

140.根据权利要求134所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原包含brachyury或其一个或多个片段。

141.根据权利要求134所述的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤-相关抗原包含前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。

142.根据权利要求80-141中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。

143.根据权利要求142所述的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。

144.根据权利要求143所述的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

145.根据权利要求143所述的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。

146.根据权利要求143所述的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

147.根据权利要求80-146中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码白介素(IL)的转基因。

148.根据权利要求147所述的重组正痘病毒载体，其中所述白介素选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。

149.根据权利要求147所述的重组正痘病毒载体，其中所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。

150.根据权利要求147所述的重组正痘病毒载体，其中所述白介素是膜结合的。

151.根据权利要求80-150中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码干扰素(IFN)的转基因。

152.根据权利要求151所述的重组正痘病毒载体，其中所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

153.根据权利要求80-152中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码TNF超家族成员蛋白的转基因。

154.根据权利要求153所述的重组正痘病毒载体，其中所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

155.根据权利要求80-154中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体还包含编码细胞因子的转基因。

156.根据权利要求155所述的重组正痘病毒载体，其中所述细胞因子选自GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(鸟苷酸腺苷酸环化酶)。

157.根据权利要求156所述的重组正痘病毒载体，其中所述细胞因子是Flt3配体。

158.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-159中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述核酸或所述重组正痘病毒载体包含胸苷激酶(TK)基因。

159.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-159中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述核酸或所述重组正痘病毒载体包含核糖核苷酸还原酶基因。

160.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-159中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中一旦将哺乳动物细胞群体与所述核酸或所述重组牛痘病毒载体接触，则相对于与不包含所述缺失的正痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的合胞体形成。

161.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-159中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中一旦将哺乳动物细胞群体与所述核酸或所述重组牛痘病毒载体接触，则相对于与不包含所述缺失的正痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的正痘病毒扩展。

162.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-159中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中相对于不包含所述缺失的正痘病毒载体形式，所述核酸或所述重组正痘病毒载体对哺乳动物细胞群体施加了升高的细胞毒作用。

163.根据权利要求162所述的核酸或所述的重组正痘病毒载体，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

164.根据权利要求163所述的核酸或所述的重组正痘病毒载体，其中所述人细胞是癌细胞。

165.包含根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-157中任一项所述的重组正痘病毒载体的包装细胞系。

166.治疗哺乳动物患者中癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或者根据权利要求80-157中任一项所述的重组正痘病毒载体。

167.根据权利要求166所述的方法，其中所述哺乳动物患者是人患者。

168.根据权利要求166或167所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌和咽喉癌。

169.根据权利要求166或167所述的方法，其中所述癌症选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS-相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤因肉瘤家族肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、睾丸生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、舌癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、胚胎性癌肉瘤及其它儿童肾瘤、郎格罕细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌、中线道癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低度恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里氏综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和华氏巨球蛋白血症。

170.根据权利要求166-169中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂。

171.根据权利要求170所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自OX40配体、ICOS配体、抗-CD47抗体或其抗原结合片段、抗-CD40/CD40L抗体或其抗原结合片段、抗-Lag3抗体或其抗原结合片段、抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗-PD1抗体或其抗原结合片段和抗-Tim-3抗体或其抗原结合片段。

172.根据权利要求170所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段或抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

173.根据权利要求170所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。

174.根据权利要求170所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。

175.根据权利要求166-174中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用白介素。

176.根据权利要求175所述的方法，其中所述白介素选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。

177.根据权利要求175所述的方法，其中所述白介素选自IL-12p35、IL-12p40和IL-12p70。

178.根据权利要求175-177中任一项所述的方法，其中所述白介素是膜结合的。

179.根据权利要求166-178中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用干扰素。

180.根据权利要求179所述的方法，其中所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、IFN-ξ和IFN-γ。

181.根据权利要求165-180中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用TNF超家族成员蛋白。

182.根据权利要求181所述的方法，其中所述TNF超家族成员蛋白选自TRAIL、Fas配体、LIGHT(TNFSF-14)、TNF-α和4-1BB配体。

183.根据权利要求166-182中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用细胞因子。

184.根据权利要求183所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、Flt3配体、CD40配体、抗-TGF-β、抗-VEGF-R2和cGAS(脒基腺苷酸环化酶)。

185.根据权利要求184所述的方法，其中所述细胞因子是Flt3配体。

186.试剂盒，其包含根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或根据权利要求80-157中任一项所述的重组正痘病毒载体和向所述试剂盒的用户说明以在宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的包装说明书。

187.试剂盒，其包含根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或根据权利要求80-157中任一项所述的重组正痘病毒载体和向用户说明以向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的所述核酸或重组正痘病毒载体，借此治疗所述癌症的包装说明书。

188.根据权利要求187所述的试剂盒，其中所述哺乳动物患者是人患者。

189.根据权利要求1-79中任一项所述的核酸或根据权利要求80-157中任一项所述的重组正痘病毒载体，其中所述B8R基因缺失。

190.根据权利要求189所述的核酸或重组正痘病毒，其中将至少一种转基因插入到所述缺失的B8R基因的基因座中。

191.根据权利要求190所述的核酸或重组正痘病毒，其中将至少两个转基因插入到所述缺失的B8R基因的基因座中。

192.根据权利要求191所述的核酸或重组正痘病毒，其中将至少三个转基因插入到所述缺失的B8R基因的基因座中。

193.根据权利要求189-192所述的核酸或重组正痘病毒，其中将至少一种其它转基因插入到非所述B8R基因的基因座的基因座中。

194.根据权利要求193所述的核酸或所述的重组正痘病毒，其中所述基因座是5p缺失的边界。

195.根据权利要求193所述的核酸或所述的重组正痘病毒，其中所述基因座是3p缺失的边界。

196.根据权利要求189-192所述的核酸或所述的重组正痘病毒，其中插入以下转基因中的至少一种：IL-12TM、Flt3-L或抗-CLTA-4抗体。

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