JPH07503843A

JPH07503843A - マレック病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH07503843A
Application number: JP5512546A
Authority: JP
Inventors: パオレッティ，エンゾ; テイラー，ジル; タータグリア，ジェームズ; ロス，ルイス
Original assignee: ヴァイロジェネティクス　コーポレイション
Priority date: 1992-01-13
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: DE69333728T2; EP0623172B1; AU680609B2; EP0623172A4; DK0623172T3; AU3435393A; JP3706130B2; EP1489165A1; ES2236684T3; WO1993014219A1; CA2127700A1; PT623172E; CA2127700C; EP0623172A1; DE69333728D1; ATE286137T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は修飾ポックスウィルスおよびその製造方法並びに使用方法に関するものである。本発明はさらに詳しくは、そのウィルスがマレック病ウィルス（ＭＤＶ）遺伝子の遺伝子産生物を発現させる組換えポックスウィルス、およびＭＤＶ感染に対して防御免疫を与えるワクチンに関するものである。

本出願において、いくつかの出版物を引用している。これらの参照文献の完全な引用は、請求の範囲の直前で明細書の終りに記載しである。これらの参照文献は本発明が関連する従来技術である。

発明の背景ワクシニアウィルスおよび最近では他のポックスウィルスが、異種遺伝子の挿入および発現に使用されている。異種遺伝子を生感染ポックスウィルスに挿入する基本技術の例としては、供与体プラスミド中に異種遺伝要素を側腹に有する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ボックスＤＮＡ配列とレスキュー（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウィルス中に存在する相同配列との間の組換えが挙げられる（ピッチｍ＝等、１９８７）。

具体的には、組換えポックスウィルスは従来技術で知られており、米国特許第４．６０３．１１２号に記載されているワクシニアウィルスの合成組換え体の産生方法と同様な２段階で構成される。この特許をここに引用する。

第１に、ウィルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に非ボックス源からの読取り枠を、ポックスウィルスのＤＮＡの切片と相同のＤＮＡが挿入されるＥ、ｃｏｌｉプラスミド構成物中に配する。別々に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに連結する。プロモーター−遺伝子結合が、可欠座を含有するボックスＤＮＡの領域を側腹に有するＤＮＡ配列と相同のＤＮＡにより両端の側腹にあるように、プロモーター−遺伝子結合をプラスミド構成物中に配置する。産生じたプラスミド構成物を次いでＥ、ｃｏｌｌバクテリア内での成長により増幅しくフレウェル、１９７２）、単離した（フレウェル等、１９６９；マニアチス等、１９８２）。

第２に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離したプラスミドをポックスウィルスときもに細胞培養体（例えば、ニワトリ胚胎繊維芽細胞）中にトランスフェクションする。プラスミド中の相同ボックスＤＮＡとそれぞれのウィルスゲノムとの間の組換えによって、ゲノムの切欠領域において、異種ＤＮＡ配列の存在により修飾されたポックスウィルスが得られる。「異種Ｊ　ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡ、特に非ボックス源からなるＤＮＡを意味し、これは外因性ＤＮＡを配置するゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコード化する。

遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間のＤＮＡの相同切片の交換である。ある種のウィルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡの役割を果たしている。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の切片である。

遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新しいウィルスゲノムの複製または製造中に自然に行なわれている。したがって、ウィルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウィルスまたは遺伝子構成物に共感染した（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）宿主細胞中で行なわれるウィルス複製サイクル中に行なわれている。第１のゲノムからのＤＮＡの切片は、ＤＮＡが第１のウィルスゲノムのＤＮＡと相同である第２の共感染ウィルスのゲノムの切片を構成する際に相互に交換可能に用いられる。

しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの切片間にも行なわれ得る。そのような切片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分に挿入される抗原決定基のための遺伝子コード化または遺伝子マーカーの第１の切片内に存在することを除いて、別のゲノムの切片と相同の第１のゲノムからのものである場合、組換えがまだ行なわれ得、その組換えの産生物は、その組換えウィルスゲノム中の遺伝子または前記遺伝子マーカーの存在により検出可能である。

修飾感染ウィルスによる挿入（１ｎｓｅｒｔｅａ）　Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子配列の発現を成功させるのには２つの条件を満たす必要がある。第１に、修飾ウィルスが生存可能であるように、挿入はウィルスの切欠領域中に行なわれなければならない。

挿入ＤＮＡを発現するための第２の条件は、挿入ＤＮＡに対して適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現すべきＤＮＡ配列より上流に位置するように配置しなければならない。

弱毒ベクターは、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株からの６つの切欠領域を順次欠失することにより発生させた。これらの領域は、ウィルス毒性における役割を有しているタンパク質をコード化することが知られている。

欠失される領域は、ｔｋ遺伝子、出血性遺伝子、Ａ型封入遺伝子、血球凝集素遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素の巨大サブユニット並びに以前に定義したＣ７ＬからＫＩＬまでの配列である（パーカス等、１９９０）。ワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株中のこれらの遺伝子の配列およびゲノム位置は以前に定義している（ゲーベル等、１９９０ａＳｂ）。産生じた弱毒ワクシニア菌株をＮＹＶＡＣと称する。

ワクシニアウィルス組換え体を産生ずる技術は、より宿主範囲が制限されたポックスウィルスの系統群の他のものにまで最近法がってきた。

鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）は好ましくは家きん病原体からの抗原を発現するベクターとして産生されている。毒性鳥インフルエンザウィルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換え体中に発現された（ティラー等、１９８８ａ）。組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、相同または非相同の毒性インフルエンザライスル抗原投与のいずれかに対して防御する免疫応答が誘発された（ティラー等、１９８８　ａ　）。さらに、ニューカッスル病ウィルスの毒性菌株の表面糖タンパク質（融合および血球凝集素）がＦＰＶベクター中に発現され、防御免疫応答を誘発することが示されている（ティラー等、１９９０　、エドバウアー等、１９９０　、バースネル等、１９９０ａ、　ｂ）。

ＦＰＶはポックスウィルス科のアビボックス属の原型ウィルスである。このウィルスは、生弱毒ワクチンの使用により１９２０年代以来じょうずにコントロールされている、家きんにおける経済的に重要な病気の原因である。アビポックスウィルスの複製は鳥類に限定されており（エスボシト、１９９１）　、このウィルスがヒトを含む非鳥類において増殖感染することについての報告はどの文献にもない。このような宿主の限定は、ウィルスの他の種への伝染に対して固有の安全障壁を与え、それによってＦＰＶを家きんのワクチンベクターとして利用することが有用性を有するものとなる。

マレック病は、ヘルペスウィルスＭＤＶの感染により生じたニワトリのリンパ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　）病である。この病気は、以下の部位１つ以上の単核浸透により特徴付けられる；末梢神経、生殖腺、虹彩、様々な内臓、筋肉および皮膚（カルネツクおよびライツタ−，１９９１）。

関連のある３つの血清型がある；（１）腫瘍遺伝子ＭＤＶを含有する血清型１、（２）非腫瘍遺伝子ＭＤＶを含有する血清型２、および（３）密接に関連した七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）を含有する血清型３゜シャトがＭＤＶの生物学を考察した（１９８７）。ＭＤＶの感染の様式は鳥間の直接的な接触または間接的な接触によるものであり、空気伝染経路によりウィルスを広げさせる。

最初の接触後、ウィルス感染の３つの段階が明らかである。

第１段階は初期の細胞溶解性の感染として定義される。この段階中は、結果として細胞を含まないウィルスを放出する増殖感染が羽胞上皮（Ｆ　Ｆ　Ｅ）中に生じる。同時に、非増殖複製がリンパ器官中に生じる。この段階において、増殖制限感染として定義されるＤＮＡ複製が生じ、ＭＤＶ抗原が発現されるが、産生されたウィルス粒子は非被覆（ｎ。

ｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ　）であり、したがって、非感染性である（カルネツクおよびライツタ−，１９９１）。増殖制限感染の結果、マクロファージと顆粒球の浸透および膵臓腫脹（ｓｐｌｅｎｉｃｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ　）に導かれる細網細胞の増生を伴って８９２８球が壊死する（ペイン等、１９７６）。結果として、Ｔ細胞が活性化され、ＭＨＣクラスＩＩ　（Ｉａ）抗原を発現する（シャト、１９８７）。休止Ｔ細胞ではなく、活性化されたＴ細胞は、ＭＤＶによる感染に感受性を有するようになる（カルネック等、１９８４．１９８５）。したがって、初期細胞溶解感染に関連する一過性免疫抑制はおそらく、膵臓およびのう（ｂｕｒｓａ　）におけるＢ細胞の溶菌感染によるものである（シャト、１９８７）。

この段階に続いて、感染した鳥は潜伏感染として定義される第２段階に進む。感染Ｔ細胞内にウィルスゲノムは存在するが、この感染Ｔ細胞はウィルス抗原もウィルス粒子も産生じない。潜伏感染は、鳥の最初の感染から約６日後に確立される。

第３段階および最終段階は、第２細胞溶解感染、免疫抑制および腫瘍形成により特徴付けられる。この種の感染は、毒性血清型１ウイルスによりのみ生じる。第２の細胞溶解感染はＦＦＥにおいて生じ、これは感染細胞を含まないウィルスが産生される唯一の区域である。腫瘍形成におけるこの炎症感染の重要性は明らかではないが、潜在感染したリンパ球は、幼若化を経験するＦＦＥに引き付けられると考えられている。このことは腫瘍細胞中へのトランスフォーメーションのための必要条件となっている。さらに、非感染リンパ球は、腫瘍細胞に細胞溶解的に感染またはトランスフォーメーションする感染部位に引き付けられる（シャト、１９８７）。永久的な免疫抑制はしばしばこの時点で明らかとなる。潜在感染からの変化はまた、内臓器、神経、筋肉および皮膚における腫瘍形成により特徴付けられる（ベイン等、１９７６；ベイン、１９８５）。腫瘍細胞は今では多くのＭＤＶ抗原を発現する。

ワクチンを使用する以前は、ＭＤＶは、家きん工業にとって経済的に重要な病気を構成した。現在のワクチンには３種類のものがある：（１）非常に弱毒化した血清型１ウイルス、（２）天然の無毒性血清型２ウイルス、または（３）血清学的に関連したＨＶＴウィルス。最も効果的で最も広く用いられるのは、尼崎等により開発されたＨＶＴワクチンである（１９７０）。現在のワクチン接種の戦略には、ワクチンの不適切な取扱い、母性抗体と関連ストレスによる干渉および同時感染によって発生した問題がある。さらに、ＨＶＴによる免疫化のみでは防御しない非常に毒性の強いＭＤＶ菌株が出現したことにより、ワクチンに多くの血清型を含むことになった（カルネツクおよびライツタ−により調査された、１９９１）。

ＭＤＶ単離体は、リンパ球のためのプレディレクション（ｐｒｅｄｉｌｅｃｔｉｏｎ）に基づいてガンマヘルペスウィルスとして分類されている。しかしながら、近年では、ＭＤＶのゲノム構成を理解することに著しい努力が費される、ガンマヘルペスウィルスよりもアルファヘルペスウィルスとより遺伝的に相同性があることが明らかである（ロス等、１９８９．１９９１）。この手法を用いて、免疫応答を誘発するのに重要な多くの抗原を同定してきた。これらの抗原の中には、ＨＳＶＩ　ｇＢ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ　）およびＨＳＶ　ｇＤ相同体がある。ＨＳＶＩ　ｇＢ相同体はロス等により同定された（１９８９）。他のヘルペスウィルス病において、ｇＢ糖タンパク質は、液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答を誘発し、防御免疫を与えることが示されている（カンチス等、１９８７　、マーチオリ等、１９８７　、グオ等、１９９０）。ＭＤＶ感染細胞においては、Ｂ抗原は、１００　ｋ　Ｄ、　６０ｋ　Ｄおよび４９ｋＤの分子量を有する糖タンパク質の複合体である（カルネツクおよびライツタ−，１９９１）。抗原は感染細胞の表面上と細胞室中に位置しく加藤および平井、１９８５）　、中和抗体を誘発すると考えられる（小野等、１９８５）。同様に、ＨＳＶ−１ｇＤのＭＤＶ相同体ハロスおよびビンス（１９９１）並びにロス等（１９９１）により同定された。ＨＳＶ　ｇＤは、Ｈ３Ｖ感染に対する効果的な免疫原であることが示されている（パオレッティ等、１９８４　；フレマー等、１９８５）。

ＭＤＶに対する現在のワクチン接種の戦略はきわめて成功しているが、現在のＨＶＴワクチンにより適切には制御されない非常に毒性の強いＭＤＶ菌株が出現したことによって、ワクチン中に毒性の強い菌株の多数の免疫原を含有して広い免疫応答を付与し得ることが分かる。

したがって、ＭＤＶ感染に対する防御免疫を供し、かつＭ　Ｄ　Ｖの多数の免疫原が発現され得る組換え体を元としたワクチン、およびＭＤＶ組換えポックスウィルスを提供することが、現在の技術状態より優れた非常に望ましい進歩したがって本発明の目的は、ＭＤＶの遺伝子産生物を発現する組換えポックスウィルスを提供すること、並びにそのような組換えポックスウィルスを製造する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、ＭＤＶ暗号配列、特に、ポ・ソクスウイルスベクター、特にワクシニアウィルスベクターまたは鶏痘ウィルスベクター中の、抗原的に適切なＭＤＶからの糖タンパク質をコード化する配列のクローニングおよび発現を提供することにある。

本発明の別の目的は、ＭＤＶ中和抗体およびＭＤＶ感染に対する防御免疫を誘発できるワクチンを提供することにある。

本発明のこれらと他の目的並びに利点は以下の内容を検討した後には容易に明らかとなる。

発明の構成ある実施態様において、本発明は、ポックスウィルスゲノムの切欠領域中にＭＤＶからのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウィルスに関するものである。ポックスウィルスは好ましくはワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルスのようなアビポックスウィルスである。

本発明によると、組換えポックスウィルスは異種ＭＤＶ遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、異種ＤＮＡは、ＭＤＶからの構造タンパク質、特に抗原的に適切な糖タンパク質をコード化する。好ましくは、複数のＭＤＶ糖タンバク質は組換えポックスウィルスにより宿主中で共発現される。

別の実施態様において、本発明は、ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンであって、その可欠領域中にＭＤＶからのＤＮＡを含有する組換えポックスウィルスおよび担体を含むワクチンに関するものである。

好ましくは、ＤＮＡはＭＤＶ構造タンパク質、特にＭＤＶ糖タンパク質を発現する。複数のＭＤＶ糖タンパク質は好ましくは宿主中で共感染される。本発明のワクチンに使用するポックスウィルスは好ましくは、ワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルスのようなアビポックスウィルスである。

図面の簡単な説明添付した図面を参照して、本発明をより理解する。

第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子を欠失するためのプラスミドｐｓＤ４６０の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示している。

第２図は、出血性領域を欠失するためのプラスミドｐｓＤ４８６の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示している。

第３図は、ＡＴＩ領域を欠失するためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成方法および組換えワクシニアウィルスＶＰ６１８の産生方法を模式的に示している。

第４図は、血球凝集素遺伝子を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示している。

第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］を欠失するためのプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δの構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示している。

第６図は、大型サブユニットであるリボヌクレオチドレダクターゼを欠失するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構成方法および組換えワクシニアウィルスＶＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を模式的に示している。

第７図は、対照群（接種または接触により抗原投与した）およびワクチン接種した群（ｖＦＰ１０８によりワクチン接種し、接触により抗原投与した）についてのある期間に亘るニワトリの死亡率をプロットしたグラフ。

発明の詳細な説明本発明は、ポックスウィルスゲノムの可欠領域にＭＤＶからのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウィルスに関するものである。組換えポックスウィルスは異種ＭＤＶ遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、ＭＤＶ構造タンパク質をコード化するＭＤＶ遺伝子を単離し、特徴付け、ＮＹＶＡＣ（ワクシニアウィルス）組換え体およびＴＲＯＭＡＣ（鶏痘ウィルス）組換え体に挿入した。

細胞系統およびウィルス菌株ＦＰＶ指定（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ）　Ｆ　Ｐ　−１の菌株ニツイテ前述している（ティラー等、１９８８ａ、　ｂ）。その菌株は、初生ひなのワクチン接種に有用な弱毒ワクチン菌株である。親ウィルスであるデュベット菌株は、フランス国、リヨンのローン　メリュークスから得た。ウィルス遺伝子学により得られたウィルスに４連続のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体を第１ＣＥＦ細胞中でさらに増幅し、ＴＲＯＭＡＣと称する保存ウィルス（ｓｔｏｃｋ　ｖｉｒｕｓ　）を産生じた。

ＴＲ０ＶＡＣまたはＴＲ０ＶＡＣベースの組換え体についての組換え試験、プラーク検定および増幅の全ては、ＳＰＦ起源の生後１０日から１１日の感染幼虫包蔵卵から産生じた第１ＣＥＦ単層中で行なった。

ＭＤＶ配列のレスキューとして使用したワクシニアウィルス菌株はＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）　であツタ。ＮＹＶＡＣは、ウィルスの毒性および宿主範囲の制限を決定する際に用いられる１８の読取り枠が欠失したことによりコペンノ１−ゲン菌株から由来したワクシニアウィルスの非常に弱毒化された菌株である。組換え体のプラーク選択およびウィルス増幅はウサギの腎臓細胞で行なった（ＲＫ１３、ＡＴＣＣＣＣＬ３７）。

プラスミドｐＭＤＶ５１７およびｐＵｃ１３ｇＢは、菌株ＲＢＩＢからのＭＤＶ　ｇＤおよびｇＢ糖タン／９質をコード化するＤＮＡ配列を含有している。プラスミドｐＵＣ１３ｇＢｉ；！、ＭＤｖのゲ／ムＤＮＡ（７）３．９　ｋｂ（７）ＤＮＡ断片を含有している（菌株ＲＢＩＢ）。ＭＤＶｇＢ遺伝子を含有している断片をＥｃｏＲＩ−３ａ　１１断片としてｐＵＣ１３中に挿入する。挿入した断片の配列はロス等の文献（１９８９）中に記載されている。プラスミドｐＭＤＶ５１７は、ＭＤＶ（７）ゲノムＤＮＡ（７）５．２　ｋｂのＤＮＡ断片を含有している（菌株ＲＢＩＢ）。ＭＤＶｇＤ遺伝子を含有している断片をｐＵｃ１３のＥｃｏＲＩ部位に挿入する。断片の配列はロス等の文献（１９９１）に記載されている。

実施例１−弱毒ワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ中しいワタシニアワクチン菌株を開発するために、既知のまたは潜在的な毒性因子をコード化するゲノムの６つの可欠領域を欠失することにより、ワクシニアウィルスのコペンハーゲンワクチン菌株を修飾した。連続的欠失を以下詳細に記載する。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌクレオチド位置の全ての命名は、ゲーベル等（１９９０ａ、　ｂ）　。

に報告された用語法に基づいている。

異種遺伝子の挿入のための受容塵として欠失塵を作成した。

ＮＹＶＡＣ中で連続的に欠失した領域を以下に列記する。

省略型および欠失領域の読取り枠の名称（ゲーベル等、１９９０ａＳｂ）並びに記載した欠失による全ての欠失を含有するワクシニア組換え体（ｖＰ）の名称もまた列記する。

（１）　チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；　Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０　；（２）　出血領域（ｕ　；　Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３　；（３）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ　；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８　；（４）　血球凝集素遺伝子（ＨＡ　；Ａ３６Ｒ）ｖＰ７２３　；（５）　宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ）ｖＰ８０４　；および（６）　大型サブユニット、リボヌクレオチド　レダクターゼ（１４Ｌ）ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）。

ＤＮＡクローニングおよび合成プラスミドを標準方法により構成し、スクリーニングし、成長させた（マニアチス等、１９８２　、パーカス等、１９８５；ピッチｍ＝等、１９８７）。制限エンドヌクレアーゼを、メアリーランド州、ゲイサースバーグのギブコ／ＢＲＬ、マサチューセッツ州、ビバーリーのニュー　イングランド　バイオラボ；およびインディアナ州、インディアナポリスのべ一リンガー　マイハイム　バイオケミカルから得た。Ｅ。

ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片をベーリンガー　マイハイム　バイオケミカルから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４　ＤＮＡリガーゼをニュー　イングランド　バイオラボから得た。各々の供給元による指定にそって試薬を用いた。

前述したようにバイオサーチ８７５０または応用バイオシステムス３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを調製した（パーカス等、１９８９）。前述したように（グオ等、１９８９）シーケナーゼ（タボア等、１９８７）を用いてジデオキシ鎖終止法（サンガー等、１９７７）によりＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキン　エルマー　セタスＤＮＡサーマル　サイクラ−中で注文合成オリゴヌクレオチド　プライマーおよびジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（コネチカット州、ノルウオークのパーキン　エルマー　セタス）を用いて、配列確認のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断と続いてのＢＡＬ− ３１エキソヌクレアーゼによる制限切断および合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデツキ、１９８６）によりプラスミドから過剰のＤＮＡ配列を欠失した。

細胞、ウィルス、およびトランスフェクションワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株の培養条件および起源は前述しである（グオ等、１９８９）。組換え、ニトロセルロース　フィルタのその場での雑種形成およびＢ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウィルスの産生は以前に記載している（パニカリ等、１９８２　、パーカス等、１９８９）。

チミジン　キナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐｓＤ４６０の構成第１図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０６はｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ　（位置８３．３５９−８８．３７７）を含有している。ｐｓＤ４０６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕｌｌで切断し、ＨｉｎｄｌｌＩ／Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＵＣ８中にＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片をクローニングし、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３．８５５−８４．３８５）の完全な遺伝子を含有している。開始コドンはＮｌａＩｌｌ部位内に含まれており、終止コドンはＳｓｐ　１部位内に含まれている。転写の方向は第１図の矢印により示している。

左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４４７から０．８ｋｂのＨｔｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片を単離して、次いでＮ１ａｌＩＩで切断し、０．５ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ／Ｎ１ａｌｌＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４　（配列認識番号１／配列認識番号２）を、０．５ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／Ｎｌａ　Ｉ　Ｉ断片と連結してＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵ０１８ベクタープラスミド中にクローニングし、プラスミドｐＳＤ４４９を産生じた。

ワクシニア右側フランキングアームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内の５ａｐｌ　（部分的）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２．９ｋｂのベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列認識番号３／配列認識番号４）に連結し、ｐＳＤ４５９を産生じた。

左側フランキングアームと右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離して、Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉで切断したｐｓＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐｓＤ４６０を産生じた。

ｐｓＤ４６０を、野生里親ワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２の供与体プラスミドとして用いた。テンプレートとしてＭＰＳＹＮ４５　（配列認識番号３）およびプライマーとして補体２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド　ＭＰＳＹＮ４７　（配列認識番号５）（５’　ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣ３’　）を用いたプライマー延長により、３２ｐ標識プローブを合成した。組換えウィルスＶＰ４１０をプラーク雑種形成により同定した。

出血性流域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失するためのプラスミド　５Ｄ４８６の構成ここで第２図を参照する。プラスミドｐｓＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニア５ａｌｌ　Ｇ（位置１６０．７４４−１７３，３５１　）を含有している。ｐＳＤ４２２はｐＵＣ８中にクローニングされた、右側に接触したワクシニア５ａｌＩ断片、５ａｌＩ　Ｊ（位置１７３，３５１−１８２．７４６）を含有している。出血性領域である旦、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２　）の欠失したプラスミドを構成するために、ｐ　ＳＤ４１９を左側フランキングアームの供給源として用い、ｐＳＤ４２２を右側フランキングアームの供給源として用いた。旦領域の転写方向は第２図の矢印により示している。

好ましくない配列をｐｓＤ４１９から除去するために、ｐｓＤ４１９をＮｃｏｌ／Ｓｍａｌで切断し、続いてＥ。

ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとして連結し、プラスミドｐＳＤ４７６を産生することにより、Ｎｃｏ　Ｉ部位（位置１７２，２５３　）の左側の配列を除去した。ｐＳＤ４２２をＢ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａｌにより切断し、右側に０．３ｋｂのＮｒｕＩで切断することにより、ワクシニア右側フランキングアームを得た。この０゜３ｋｂ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した３、４ｋｂのＨ４ｎｃ１ベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生じた。ｐＳＤ４７７中でワクシニアＵ領域が部分的に欠失した位置を三角形により示している。ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒ暗号配列を、Ｃ１ａｌ／ＨｐａＩで切断することにより除去し、生成したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列認識番号６／配列認識番号７）と連結し、ｐＳＤ４７９を産生じた。ｐＳＤ４７９はＢａ失座にＥ、ｃｏｌｉベーターガラクトシダーゼを配するために、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３、２ｋｂのＢａｍＨＩ断片（シャビラ等、１９８３）をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４７９８Ｇを産生じた。

ワクシニアウィルスｖＰ４１０による組換えのための供与体プラスミドとしてｐＳＤ４７９８Ｇを用いた。色素基質Ｘ−ｇａｌの存在下で組換えワクシニアウィルスｖＰ５３３をブループラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失しており、ベーターガラクトシダーゼにより置き換えられている。

ｖＰ５３３からベーターガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するが旦欠失接合部に開始コドンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に、上述したｐＳＤ４７７からのＣ１ａＩ／Ｈｐａｌベクタ一断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅ　ｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列認識番号８／配列認識番号９）と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生じた。次に、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで切断し、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとし、連結してプラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−を産生ずることにより、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲ１部位を破壊した。

ｐＳＤ４７８Ｅ−をＢａｍＨＩとＨｐａｌで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６　（配列認識番号１０／配列認識番号１１）と連結腰プラスミドｐＳＤ４８６を産生じた。組換えワクシニアウィルスｖＰ５３３による組換えのために供与体プラスミドとしてｐＳＤ４８６を用いて、ｖＰ５５３を産生した。ｖＰ５５３はＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

ＡＴＩ領域（Ａ　２６　Ｌ）を欠失するためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成ここで第３図を参照する。ｐｓＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされた５ａｉｌ　Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側の好ましくないＤＮＡ配列を除去するために、ｐｓＤ４１４をワクシニア配列内のＸｂａｌ（位置１３７．０７９）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとし、連結してプラスミドｐＳＤ４８３を産生じた。Ａ２６Ｌ領域の右側の好ましくないワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０．６６５およびｐＵＣ／ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を産生じた。Ａ２６Ｌ暗号領域を除去するために、ｐＳＤ４８４を、Ａ２６ＬＯＲＦ　（位置１３９．００４　）かられずかに上流のＮｄｅＩ（部分的）およびＡ２６Ｌ　ＯＲＦかられずかに下流のＨｐａｌ（位置１３７，８８９　）で切断した。５．２ｋｂのベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴ１３／ＡＴＩ４（配列認識番号１２／配列認識番号１３）と連結し、Ａ２６Ｌの上流の領域を再構成し、Ａ２６ＬＯＲＦを、上述した制限部位Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　ＲＥｃｏＲＩおよびＨｐａｌを含有する短いポリリンカー領域で置き換えた。

産生じたプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中のＢａ１ＩＩとＥｃｏＲ１部位は固有のものではないので、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ　（位置１４０，１３６　）で切断し、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとして連結することにより、プラスミドｐＳＤ４８３（上述）からＢｇｌｌＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を除去した。生成したプラスミドをｐＳＤ４８９と称した。

Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９からｃ７）１．８ｋｂのＣＩａＩ　（位置１３７，１９８　）　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＶ　（位置１３９．０４８　）断片を、ｐＳＤ４８５からのＣ１ａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を含有する対応０．７ｋｂポリリンカーと置き換えて、ｐＳＤ４９２を産生じた。ｐｓＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌｌＩおよびＥｃｏＲＩは固有のものである。

ワクシニア１１ｋＤａのプロモーターのコントロール下で（パーツレット等、１９８５　、パーカス等、１９９０）　Ｅ、ｃ。

１１ベーターガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３、３ｋｂのＢｇｌＩＩカセットをｐ　ＳＤ４９２（７）Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位１：挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。レスキューウィルスＶＰ５５３による組換えにプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いた。Ａ２６Ｌ欠失領域にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ５８１をＸ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ワクシニア組換えウィルスｖＰ５８１からベーターガラクトシダーゼ配列を除去するためのプラスミドを産生ずるために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７　（配列認識番号１４）（５’　ＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴｒＧＴｒＡＡＣＴｒＴＡＴＡＴＡＡＣＴｒＡＴｒＴｒＴＴＧＡＡＴＡＴＡＣ３’）を用いた突然変異誘発（マンデツキ、１９８６）によりプラスミドｐｓＤ４９２のポリリンカー領域を欠失した。産生じたプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６ＬＯＲＦを含有するワクシニアＤＮＡ包含位置［１３７，８８９−１３８，９３７］を欠失する。ベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ５８１とｐＭＰ　４９４Δとの間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が産生され、Ｘ− ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

血球凝集素遺伝子（Ａ　５６　Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成ここで第４図を参照する。ワクシニア５ａｉｌ　Ｇ制限断片（位置１６０．７４４−１７３，３５１　）はＨｉｎｄｌｌｌ　Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９　）　と交差している。ｐｓＤ４１９はｐＵＣｇにクローニングされたワクシニア５ａｉｌ　Ｇを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図の矢印により示す。ｐｓＤ４１９をワクシニア配列内とｐｕｃ、、’ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉにより切断し、続いて連結することにより、Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｂから誘導したワクシニア配列を除去した。生成したプラスミドｐＳＤ４５６は、０．４ｋｂのワクシニア配列を左側と右側の側腹にそれぞれ有するＨＡ遺伝子Ａ３６Ｒを含有している。ｐＳＤ４５６をＡ３６Ｌ暗号配列から上流のＲｓａｌ（部分的；位置１６１．０９０　）およびこの遺伝子の末端近くのＥａｇｌ　（位置１６２，０５４　＞で切断することによりＡ３６Ｌ暗号配列を除去した。ｐＳＤ４５６から３．６ｋｂのＲｓａＩ／Ｅａｇｌベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９　（配列認識番号１５）、ＭＰＳＹＮ６２　（配列認識番号１６）　、ＭＰＳＹＮ６０（配列認識番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１　（配列認識番号１８）ＡＣＡＣＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴｒＴＧＱＡＡＡＧＴｒｒＴＡＴＡＧＧＴＡＧＴＴ（！ＴＡＱＡ−と連結し、Ａ３６ＲＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ３６ＲＯＲＦを上述したポリリンカー領域と置き換えた。産生じたプラスミドはｐＳＤ４６６である。ｐＳＤ４６６中のワクシニア組換は、位置［１６１，１８５−１６２゜０５３］を包含している。ｐＳＤ４６６中の欠失部位は第４図の三角形により示している。

ワクシニア１１ｋＤａプロモーターのコントロール下で（パーツレット等、１９８５　、グオ等、１９８９）　Ｅ、ｃ　ｏ　Ｉ　ｉベーターガラクトシダーゼを含有している３、２ｋｂのＢａ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的）（シャビラ等、１９８３）をｐＳＤ４６６のＢａ１１１部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウィルスｖＰ６１８による組換えに用いた。Ａ３６Ｒが欠失している部位にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ７０８をＸ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベーターガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０８から欠失した。ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとして連結したことにより、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢ　ａｍＨ１部位がｐＵＣ／ワクシニア接合部から除去されていることを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。

ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えの結果として、組換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３を得た。ｖＰ７２３は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ　Ｉ　Ｌ］を欠失するためのプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δ の構成ここで第５図を参照する。ｐＭＰｃｓＫ１Δの構成に、以下のワクシニアクローンを用いた。ｐｓＤ４２０はｐＵＣ８にクローニングされた５ａｉｌ　Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵｃ１８にクローニングされたＫｐｎＩ　Ｆである。ｐＳＤ４３５を５ｐｈｌで切断し、再連結してｐＳＤ４５１を形成した。ｐｓＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ中（ＤＳｐｈ１部位（位ｆｆｉ！２７．４１６）　（７）左側（７）ＤＮＡ配列は除去されている（パーカス等、１９９０）。ｐｓＤ４０９はｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄｌＩＩ　Ｍである。

ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］遺伝子クラスターを欠失するための基質を用意するために、以下のようにＥ。

ｃｏｌｉベーターガラクトシダーゼを最初にワタシニアＭ２Ｌ欠失座（グオ等、１９９０）に挿入した。ｐ　ＳＤ４０９中のＢｇ１１１部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中のＢｇｌｌＩ（位置２８．２１２）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢａｍＨＩで切断し、連結してプラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。ｐＭＰ４０９Ｂを固有のｓｐｈ　１部位（位置２７．４１６）で切断した。合成オリゴヌクＴＡＴＧＴＡＡＣＡＡＴＡ３’ を用いた突然変異誘発（グオ等、１９９０　、マンデツキ、１９８６）によりＭ２Ｌ暗号配列を除去した。生成したプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上述したようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された固有のＢｇｌＩＩ部位を含有している。１１ｋＤａのプロモーターのコントロール下で（パーツレット等、１９８５）Ｅ、ｃｏｌｉベーターガラクトシダーゼを含有する３、２ｋｂのＢａｍＨＩ（部分的）７８ｇｌｌｌカセットを、ＢｇＩＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄに挿入した。レスキューワクシニアウィルスｖＰ７２３による組換えのための供与体プラスミドとして、生成したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオ等、１９９０）を用いた。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ７８４を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］が欠失したプラスミドをＳｍａｌおよびＨｉｎｄｌｌＩで切断したｐＵＣＢ中に組み入れて、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとした。ワクシニアＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩＣ配列からなる左フランキングアームを、ｐｓＤ４２０をＸｂａｌ（位置１８．６２８）で切断し、続いてＥ、ｃｏｌｔポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドとし、ＢｇｌＩＩ（位置１９．７０６）で切断することにより得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋ配列からなる右フランキングアームを、ｐｓＤ４５１をＢｇｌｌｌ（位置２９．０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９．７７８）で切断することにより得た。生成したプラスミドｐＭＰ　５８　Ｌ　ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ中のＢｇ１１１部位（位置１９．７０６）とＨｉｎｄｌｌｌ　Ｋ中のＢｇ１１１部位（位置２９．０６２）との間のワクシニア配列が欠失している。プラスミドｐＭＰ５８１ｃＫ中のワクシニア配列が欠失している部位を第５図に三角形により示している。

ワクシニア欠失接合部で過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ｃＫをワクシニア配列内のＮｃ。

■部位（位置１８．８１１　；　１９．６５５）で切断し、Ｂａ１−３１エキソヌクレアーゼで処理し、これに合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３　（配列認識番号２０）５’　ＴＧＴＣＡＴｒＴＡＡＣＡＣＴＡＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡｎＴＡＴＴ　３゜を用いた突然変異誘発（マンデツキ、１９８６）を施した。生成したプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］を包含しているワクシニア配列位置１８．８０５−２９．１０８が欠失している。ワクシニア組換え体ｖＰ７８４を含有するベーターガラクトシダーゼとｐＭＰＣ３ＫＩΔとの間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られた。ｖＰ８０４は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

大型サブユニットであるリボヌクレオチド　レダクターゼ（１４Ｌ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構ここで第６図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄ１１１　１（位置６３．８７５−７０．３６７）を含有している。ｐＳＤ４０５をワクシニア配列内のＥｃｏＲＶ（位置６７、９３３）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳｍａ　Ｉで切断し、連結してプラスミドｐｓＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構成に用いた全てのワクシニア制限断片の供給源としてｐＳＤ５１８を用いた。

ワクシニア１４Ｌ遺伝子は位置６７、３７１−６５．０５９におよんでいる。１４Ｌ・の転写方向を第６図の矢印により示す。Ｉ４Ｌ暗号配列の部分が欠失したベクタープラスミド断片を得るために、ｐｓＤ５１８をＢａｍＨＩ　（位置６５．３８１）およびＨｐａＩ（位置６７、００１）で切断し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドとした。

この４．８ｋｂのベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーターのコントロール下で（パーツレット等、１９８５；パーカス等、１９９０）　Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉベーターガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３、２ｋｂのＳｍａＩカセット（シャピラ等、１９８３）と連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを形成した。ワクシニアウィルスｖＰ８０４による組換えのための供与体プラスミドとしてｐＳＤ５２４ＫＢＧを用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子が部分的に欠失した位置にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ８５５を、Ｘ −ｇａＬの存在下でブループラークとして単離した。

ｖＰ８５５からＩ４Ｌ　ＯＲＦの残りの部分およびベーターガラクトシダーゼを欠失するために、欠失プラスミドｐｓＤ５４８を構成した。以下に記載するように、左右のワクシニアフランキングアームを別々にｐＵＣ８中に組み入れ、模式的に第６図に示した。

左側ワクシニアフランキングアームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１１５１８Ａ２　（配列認識番号２１／配列認識番と連結し、プラスミドｐｓＤ５３１を形成した。ｐＳＤ５３１をＲｓａｌ　（部分的）およびＢａｍＨＩで切断し、２゜７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐｓＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位１６４，４５９）　／Ｒｓ　ａ　Ｉ　（位置６４．９９４）で切断し、０．５ｋｂの断片を単離した。２つの断片を共に連結して、ｐＳＤ５３７を形成した。ｐ　Ｓ　Ｄ　５３７　ハ、Ｉ４Ｌ暗号配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有している。

右側ワクシニアフランキングアームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１１５１８Ｂ２　（配列認識番号２３／配列認識番と連結して、プラスミドｐｓＤ５３２を形成した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐｓＤ５１８をワクシニア配列内のＲｓａＩ　（位置６７、４３６）およびワクシニア／ｐＵＣ接合部でのＥｃｏＲＩにより切断し、０．６ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結して、Ｉ４Ｌ暗号配列の右側の完全なワクシニアフランキングアームを含有しているｐＳＤ５３８を形成した。

右側ワクシニアフランキングアームをｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープラスミド中に連結した。生成したプラスミドｐＳＤ５３９において、全てｐＵＣのバックグランドで左右それぞれの側腹に０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡを有するポリリンカー領域によりＩ４Ｌ　０ＲＦ（位置６５．０４７− ６７、３８６）を置き換えた。ワクシニア配列内の欠失部位を第６図において三角形により示ず。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分におけるベース−ガラクトシダーゼ配列の組換えワクシニアウィルスｖＰ８５５中のベーターガラクトシダーゼ配列による可能性のある組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットをｐｓＤ５３９からｐＲｃｌｌ中に移動した。

このｐＲｃｌｌは、全てのベーターガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域により置き換えたｐＵＣの誘導体である（コリナス等、１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉで切断し、１．２ｋｂの断片を単離した。

この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したＩ）　ＲＣ１１（２，３５ｋｂ）に連結し、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ８５５との間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られた。ｖＰ８６６は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断と続いてのアガロースゲル上の電気泳動により分析した。制限模様は予期したものであった。テンプレートとしてのｖＰ８６６および上述した６つの欠失塵を側腹に有する（　ｆ　ｌａｎｋｉｎｇ）プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケ等、１９８８）により、予期したサイズのＤＮＡ断片を産生じた。欠失接合部の区域の周りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであることを確認した。上述したような６つの作成欠失部を含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６を、ワクシニアワクチン菌株ｒＮＹＶＡｃＪと称した。

プラスミドｐＲＷ７３１．１５はＴＲ０ＶＡＣゲ／ムＤＮＡからクローニングした１０ｋｂｐのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ−ＰｖｕＩＩ断片を含有している。ヌクレオチド配列を３６６０ｂ　ｐのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖について決定した。

この配列は以下のとおりである（配列認識番号２５）ＴＡＧＡＴＡＴＡＡＧ３６１　ＩＩｖＩＩＡＡＴＧＡＴｒｒ　ＴｒＡＣＡＡＡＡＡＴ　ＡＡＣＣＴＡＴＡＡＧ　ＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡ　ＡＴＡＴＡＡＴｒＡＣＡｍＡＣＧＧＭＡＴＧＴＡＡＴＧＡＡＴｒＡＡＡＣＧＡＴＴＴｒＡＡＡＧＡＣＡＡ３２４＋　ＡＣＧＴＧＧＴｒＡ丁ＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴｒＡＣＣＣＧＧ　ＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴ　ＡＡＡＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＧ丁ＡＴＴＡＴＡＴＡＴｒＡＴＧＡＴ３４２１　ＴＣＡＡＴＡＧＡＡＡ　ＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴ　ＣＡＴＴｒＴＡＴＡＡ　ＡＴＡＴＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＣＴＡＧＣＴＦ８と称した読取り枠の制限をこの配列内で決定した。

位置４９６で読取り枠は開始し、位置１８８７で終止する。以下に記載するように、位置７８０から位置１９２７までの欠失部を作成した。

プラスミドｐＲＷ７６１は、２４２９ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａｌで切断し、Ｓｓｐ　Ｉで部分的に切断した。３７００ｂ　ｐのＸｂａｌ−３ｓｐＩバンドを単離し、アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡＯ１７（配列認識番号２６）およびＪＣＡＯ１８（配列認識番号２７）ＪＣＡＯ１７：ＪＣＡＯ１８：と連結した。

この連結により生成したプラスミドをｐＪｃＡＯＯ２と称した。

アニールしかつキナーゼした（ｋｉｎａｓｅｄ　）オリゴヌクレオチドＣＥ２０５　（配列認識番号２８）およびＣａ２Ｏ６（配列認識番号２９）Ｃａ２Ｏ３：Ｃａ２Ｏ６：をｐＪｃＡＯＯ２のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩＩ部位に挿入してｐＣＥ７２を形成することにより、追加のクローニング部位をｐＪｃＡＯＯ２中に含有させた。

挿入プラスミド中にＦＰＶフランキングアームの長さを延長するために、プラスミドｐＪｃＡＯ２１を構成した。

ＰＲＷ７３１．１５　（前述した）からの４９００ｂ　ｐのＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐブルースクリプトＳＳ　Ｋ”（カリフォルニア州、ラジョラのストラタジエネ）のＳｍａＩ部位およびＨｉｎｄ１１部位に挿入することにより、プラスミドｐＪｃＡＯ２１を得た。次いでｐＣＥ７２からの１３ｇ１ＩＩからＥｃｏＲＩまでの断片をｐＪｃＡＯ２１のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲ１部位に連結することによりｐｃＥＮｌｏｏを産生じた。

ＭＤＶ　ｇＢ配列をＴＲ０ＶＡＣ中に挿入するためのプラスミドの構成ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生じた３つの断片が挿入プラスミドの構成に必要であった。反応１により、ＭＤＶ　ｇＢ遺伝子の５′末端を有する正確なＡＴＧ　＋ＡＴＧ配置中に融合したワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有した断片を生成した。この反応のために、前述したＨ６プロモーター（ティラー等、１９８８ａ、　ｂ　；グオ等、１９８９）を含有するプラスミドｐ　ＲＷ８２５を、テンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＲＷ２９７（配列認識番号３０）およびＲＷ２９８（配列認識番号３１）ＲＷ２９７：　ＱＡＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＭＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧをプライマーとして用いた。

反応２により、ＴＴＴＴＴＴＴ配列がＴＡＴＴＣＴＴに変えられて初期終止の可能性のないＭＤＶ　ｇＢ遺伝子の５′末端を含有する断片を産生じた（ユエンおよびモス、１９８７）。産生じた断片の３′末端を、反応３において産生じた断片の５′末端と重複させた。反応２において、ＭＤＶ　ｇＢ暗号配列を含有するプラスミドｐＵｃ１３ｇＢをテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＲＷ２９９（配列認識番号３２）およびＲＷ３００（配列認識番号３をプライマーとして用いた。

反応３により、ＭＤＶ　ｇＢ遺伝子の３′末端を定義する断片を産生じ、ｐＵｃ１３ｇＢに含まれた非暗号配列を除去した。プラスミドｐＵＣｇＢをこの反応のテンプレートとして用い、ＲＷ３０１（配列認識番号３４）およびＲＷ３０２（配列認識番号３５）をプライマーとして用いた。

これらの３つのＰＣＲ反応の産生物を集積し、第４のＰＣＲにおいて、プライマーＲＷ２９７（配列認識番号３０）およびＲＷ３０２（配列認識番号３５）のテンプレートとして用いた。最終的な１２５０ｂｐのＰＣＲ産生物を単離し、Ｈｉｎｃｌｌで切断し、ＨｉｎｃＩＩで切断したプラスミドｐｃＥＮ１００中に挿入してｐＲＷ８７１を誘導した。

Ｈ８への挿入を指示してるＴＲ０ＶＡＣゲノムＤＮＡを含有するｐｃＥＮｌｏｏの誘導について上述している。プラスミドｐ　ＲＷ８７１を部分的にＸｂａ　Ｉで切断し、線状産生物を単離し、Ａｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉで再切断して、７．７ｋｂｐの断片を単離した。プラスミドＩ）ＵＣ１３ｇＢをＡｆｌｌＩおよびＸｂａｌで切断し、ｇＢ暗号領域を含有する、生成した２１４０ｂｐの断片をｐＲＷ８７１から誘導された７、７ｋｂｐの断片中に挿入した。生成したプラスミドｐＲＷ８７８をＴＲ０ＶＡＣによるｉｎ　Ｖｉｔｒｏ組換え中でレスキューウィルスとして用いて、組換え体ｖＦＰ１０８を誘導した。

屹工Ｌ−１Ｕ巳ソニ三ヱユエ土エセヨしりｊ憾差二二ラスミドの構成前述したｐＲＷ８７８をＨｉｎｃｌｌで切断し、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結したＭＤＶ　ｇＢ暗号配列を含有する２、８ｋｂｐの断片を、ワクシニア挿入プラスミドｐＳＤ５５３ｖＣのＳｍａ　１部位に挿入し、プラスミドｐ　ＲＷ８７９を誘導した。プラスミドｐＳＤ５５３ＶＣは、パーカス等（１９８９）により記載された宿主範囲選択システムを用いた挿入プラスミドである。

このプラスミドにおいて、ワクシニアウィルスＫＩＬ遺伝子およびポリリンカー領域はフランキングコペンハーゲンワクシニアアーム内に位置しており、ゲーベル等（１９９０ａ、　ｂ）により記載されたＡＴＩ領域（読取り枠Ａ２５ＬおよびＡ２６Ｌ）を置換した。全領域はｐＵＣ８ベクター中にあり、挿入部位は翻訳停止コドンおよび転写停止信号の側腹にある。プラスミドｐ　ＲＷ８７９をＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えにおけるレスキューウィルスとして用い、マレックｇＢ遺伝子を発現する組換え体ｖＰ９３５を誘導した。

ＭＤＶ　Ｄをワクシニアウィルス中に挿入するためのプラスミドの構成４つのＰＣＲ反応を用いて挿入プラスミドを産生じた。

反応１において、プラスミドをｐ　ＲＷ８８０をテンプレートとして用いて、ＭＤＶ　ｇＤ遺伝子の開始ＡＴＧを重複させるプロモーターのＡＴＧによりＭＤＶ　ｇＤ５’配列に連結したワクシニアウィルスＨ６プロモーター配列を含有する断片を誘導した。プラスミドｐＲＷ８８０は、Ｆ１６挿入座中の非関連遺伝子に連結した、前述のＨ６プロモーター配列を含有している。この反応に用いたプライマーはＲＷ３８９（配列認識番号３６）およびＲＷ３９０（配列認識番号３７）日Ｗ　３８９：　ＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴｒＴＣＡＴｒＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣ第２および第３のＰＣＲ反応ニオイテ、ｐＭＤＶ５１７をテンプレートとして用いた。プラスミドｐＭＤＶ５１７は、ｐＵｃ１３のＥｃｏＲＩで挿入されたＭＤＶ　ｇＤ遺伝子を含有する５、２ｋｂのＤＮＡ断片を含有している。反応の目的は、２つの内部ＴＴＴＴＴＮＴ信号を変更して未熟終止の可能性をなくすことにあった（ユエンおよびモス、１９８７）。第２の反応において、オリゴヌクレオチドＲＷ３８６（配列認識番号３８）およびＲＷ３９１（配列認識番をプライマーとして用いて、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴをＴＴＣＴＴＣＴＴＴに変更した。

第３の反応において、オリゴヌクレオチドＲＷ３８７（配列認識番号４０）およびＲＷ３８８（配列認識番号４ＲＷ３８７゜ＴＧＴＴＧＴＡＣＣＡＴｒＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧｍＧＣＡＴＡＧｍＧＴｒＡＴＣＲＷ３８８：　ＡＴＧＡＡＡＧＴＡＴｒＣＴｒＣＴＴＴＡＧＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣを用いて、配列ＴＴＴＴＴＴＴＧＴを配列ＣＴＴＣＴＴＣＧＴに変更した。

３つのＰＣＲ反応の産生物を集積し、第４のＰＣＲ反応のためにＲＷ３９０（配列認識番号３７）およびＲＷ３９１（配列認識番号３９）により活性化した。最終的なＰＣＲ反応の産生物をＮｒｕｌおよびＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断し、Ｈ６プロモーターの３′末端およびＭＤＶ　ｇＤ暗号配列を含有する１、２ｋｂｐの断片を得た。プラスミドｐＲＷ８８０（以下に記載する誘導）をＮｒｕ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断しく非関連遺伝子を除去してＨ６プロモーターの５′末端を残す）、最終ＰＣＲ産生物の切断後に得た１゜２ｋｐ断片と連結した。次いで生成したプラスミドｐＲＷ８９３をＮｏｔｌで切断し、以前に記載したｐＳＤ５３３ｖＣのＳｍａ１部位に挿入されたＨ６プロモーテッド（ｐｒｏｍｏｔｅｄ）　Ｍ　Ｄ　Ｖ　ｇ　Ｄ遺伝子を含有する１、４ｋｂｐ断片を放出してｐ　ＲＷ８９４を産生じた。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えにおいてレスキューウィルスとしてプラスミドｐ　ＲＷ８９４を用いて、マレックｇＤ遺伝子を発現する組換え体ｖＰ１００５を産生した。

Ｈ１６座での鶏痘挿入プラスミドの構成プラスミドｐＦＰ２３に−１は、タータグリア等（１９９０）に記載された１０．５ｋ　ｂ　ｐのＨｉｎｄＩＩＩ鶏痘ＤＮＡ断片を含有している。以下のプライマーＲＷ２６４（配列認識番号４２）　、ＲＷ２６５　（配列認識番号４３）　、ＲＷ２６６（配列認識番号４４）およびＲＷ２６７（配列認識番号を用いたＰＣＲ反応のために、テンプレートとしてプラスミドｐＦＰ２３に−１を用いた。

プライマーＲＷ２６４およびＲＷ２６７は第１の反応を活性化した。プライマーＲＷ２６５およびＲＷ２６６は第２の反応を活性化した。ＲＷ２６６、ＲＷ２６７および第１および第２の反応による２つの産生物を最終ＰＣＲのために結合した。テンプレート上のプライマーの指向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　）は以下のとおりであるニブライｖ−ＲＷ２６６は、Ｎｄｅ１部位を有する１０．５　ｋｂｐの配列内の位置９８８３から始まる。ＲＷ２６５およびＲＷ２６４の５′末端は重複し、互いに逆の補体である。ＲＷ２６５およびＲＷ２６４は、位置１０．０５４　ｂ　Ｉ）でのＡを、挿入部位Ｓｍａ　Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含有する６１ｂｐにより置き換える。翻訳終止コドンおよび転写停止信号は、挿入部位を側腹に有する。ＲＷ２６７の５′末端は、ＥｃｏＲ１部位で始まる位置１０．２２９　ｂ　ｐにある。

第３および最終ＰＣＲ産生物をＮｄｅＩとＥｃｏＲ［で切断し、ｐＲＷ１７５のＮｄｅ１部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、ｐＲＷ８６４を産生じた。プラスミドｐＲＷ７１５はＰｖｕｌｌで切断されたプラスミドｐＵｃ９である。ＥｃｏＲＩリンカ−を３００ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ断片の位置に挿入した。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＬａｃＺ遺伝子を挿入するために、プラスミドｐＡＭＩＢＧを用いた。プラスミドｐＡＭＩＢＧは、１１にワタシニアウイルスプロモーター（パオレッティ等、１９８４）の前述したＢａｍＨＩ部位３′に挿入されたｐＭｃ１８７１（カサダバン等、１９８３）からのＬａｃＺ　ＢａｍＨＩ断片を含有している。プラスミドｐＡＭＩＢＧをＢａｍＨＩで部分的に切断し、線状産生物を単離してＰｓｔＩで切断した。ＩＩＫ　プロモートした（ｐｒｏｍｏｔｅｄ）　Ｌ　ａ　ｃ　Ｚ遺伝子を含有するＰｓｔｌ−Ｂａｍ）ＩＩ断片をプラントエンドとし、ｐＲＷ８６４（上述）のＳｍａ１部位中に連結した。産生じたプラスミドをｐＲＷ８６７Ａと称した。

プラスミドｐ　ＲＷ８６６は、タータグリア等（１９９０）に記載された］、０．５ｋｂｐの鶏痘ＤＮＡ断片を含有しているプラスミドｐ　Ｆ　Ｐ　２３　Ｋ　 −１のサブクローンである。ｐＦＰ２３に−１からの７．３に、ｂｐのＮａｅｌからＮｄｅ　Ｉまでの鶏痘断片をｐＵｃ９のＰｖｕ　ｌ　１部位とＮｄｅ１部位の間に挿入することにより、プラスミドｐ　ＲＷ８６６を構成した。プラスミドｐｒｗ８６６は２つのＦｓｐＩ部位を含有している。１つはｐＵＣ中にあり、位置１９５５ｂ　ｐでのもう１つはＨ１６と称する遺伝入間挿入部位を定義している。

ＦｓｐＩ挿入座は、ＡＴＧを含有しているいかなる読取り枠をも妨害しない。ｐＲＷ８６６をＦｓｐｌで部分的に切断して得た線状産生物を単離し、１１にプロモートしたＬａｃＺ遺伝子を含有するｐＲＷ８６７Ａからの３．３ｋｂｐのＮｏｔｌ断片に連結した。この操作により、プラントエンドとしたＬａｃＺ遺伝子断片をＦｓｐｌ遺伝子遺伝入間挿入部位中してプラスミドｐＲＷ８６８を産生できた。ｐＲＷ８６８中のＬａｃＺ遺伝子を、Ｓｍａ　Ｉ部位、ＢａｍＨＩ部位およびＨｉｎｄ１１１部位を含有し、ｐＲＷ８６４の発生に用いた翻訳停止配列および転写終止配列を側腹に有する６１ｂｐ断片（前述）と置き換えた。この置換の結果として、プラスミドｐＲＷ８１３が得られた。プラスミドｐ　ＲＷ８９４の最初の構成にテンプレートとして用いたプラスミドｐ　ＲＷ８８０は、Ｆ１６挿入座のＳｍａ　１部位のＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有している。

実施例３−ＭＤＶ糖タンパク質を発現するポックスウィルスベースの組換え体の発生前述したプラスミドを、前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いることにより、ＮＹＶＡＣまたはＴＲ０ＶＡＣ感染細胞中にトランスフェクションした（パニカリおよびパオレッティ、１９８２；ピッチｍ＝等、１９８７）。陽性プラークを特定のＭＤＶ放射線標識化プローブに対する雑種形成に基づいて選択し、この陽性プラークについて純粋な固体群が達成されるまで連続してプラーク精製を行なった。各々のＩＶＲからの代表的なプラークを増幅し、保存ウィルスを確立した。

ティラー等（１９９０）に記載されたようにニワトリ３９２番と称する多クローン性ニワトリ抗−ＭＤＶ血清を用いて間接免疫蛍光法を行なった。

ティラー等（１９９０）に記載されたように上述した試薬を用いてイムノプレシピテーション反応を行なった。

ＭＤＶ糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体プラスミドｐＲＷ８７９のトランスフェクションにより、ＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ９３５が発生した。免疫蛍光性分析により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面上に発現されることが示された。ニワトリからの同一の免疫血清を用いたイムノプレシピテーションにより、１１０　ｋＤａ、６４ｋＤａおよび４８ｋＤａのおおよその分子量を有する３つの主要発現産生物の存在が検出された。

これらのサイズはＭＤＶ　ｇＢ遺伝子の予期した産生物に対応している。

プラスミドｐＲＷ８９４のトランスフェクションによりＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ１００５が発生した。プラークのイムノスクリーン検定（ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎ　ａｓｓａｙ）により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面に発現されることが示された。イムノプレシビテーション分析により、処理した糖タンパク質を示す４５ｋＤａ（タンパク質の前駆体形状に対応する）および６５ｋＤａのおおよその分子量を有する２つの産生物の産生が示された。

ｇＢ糖タンパク質を発現するＴＲ０ＶＡＣ組換え体プラスミドｐＲＷ８７７８のトランスフェクションにより、組換え体ｖＦＰ１０８が発生した。免疫蛍光性分析により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面上に発現されることが示された。ニワトリからの同一の免疫血清を用いたイムノプレシピテーション分析により、１１０　ｋ　Ｄ　ａ’、　６４ｋ　Ｄ　ａおよび４８ｋＤａのおおよその分子量を有する３つの主要発現産生物の存在が検出された。

実施例４−ニワトリの免疫化と続いての抗原投与生後２５日のＳＰＦのニワトリの群に、１回の投与量が４゜０１０ｇ＋ｏｌ）ｆｕのＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　ｇＢ　（ｖＦＰ１０８）を皮下経路で接種した。１０羽のニワトリは接種しないままにした。接種から１４日後、１０羽の接種していない対照を含むニワトリに、事前に１００％が死に至ることを確認したＪＭＶ腫瘍細胞系の希釈物を腹腔内接種により抗原投与し、生存したニワトリを評価した。

防御の結果を表１に示す。

表　１ＳＰＦニワトリにおけるＴＲ０Ｖ＾Ｃ−ＭＤＶ　ｇＢ　（ｖＦＰ１０８）の効能防御率処理群　生存／合計　生存％ａ、　ニワトリに４．Ｑ　ｌｏｇ＋ｏ　ｐｆｕのｖＦＰ１０８を接種した。１４日後に、ＪＭＶ腫瘍細胞系の接種によりニワトリに抗原投与した。

第２の実験において、アイソレータ中でふ化し、ＭＤＶ。

七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）および他のアビアン病原に対する母性抗体を有さない２０羽のロードアイランドレッドひな鳥に、生後初日に６．３１０ｇ＋。ｐｆｕの鶏痘組換え体ｖＦＰ１０８を筋肉内ワクチン接種した。接種から７日後、接触感染によりひな鳥にＭＤＶを抗原投与した。

ワクチン接種したひな鳥と、１５日前に３．０　ｌ　ｏ　ｇ、、ｐ　ｆ　ｕのＭＤＶのＲＢＩ−Ｂ菌株を接種した８羽のニワトリと混合することにより接触感染を行なった。同一のふ化から由来した２０羽のワクチン接種しないひな鳥の第２の群を対照として用いた。また上述したような接触によりこれらにＭＤＶの抗原投与を行なった。２つの群を、高水準安全室中の別々のかごに保持した。２０羽のワクチン接種しないひな鳥の第３の群には、３．０１ｏｇ、。ｐｆｕのＲＢＩ −Ｂを接種することにより抗原投与し、別室に保持した。この群は、２つの方法による抗原投与の効果を比較する実験のために採用した。

ひな鳥を毎日観察し、死んだひな鳥について内臓器および末梢神経における大きなマレック病の病巣について試験した。大きなマレック病の病巣が明らかではない場合には、組織実験のために組繊細胞を採取した。

鶏痘組換え体によりワクチン接種した群の２羽のひな鳥は、おそらくは鶏痘による眼感染の症候群を示し、ＭＤＶ感染ひな鳥との接触から２日以内に死んだ。それらは実験から除外し、表２および第７図に示した致死結果には含めない。

結果により、鶏痘組換え体によるワクチン接種が致死を著しく遅らせたことが分かる。ワクチン接種した群とワクチン接種しなかった群（接触抗原投与）における死亡の平均時間は、それぞれ５６日と３５日であった。スチューデントのｔ検体を用いたデータのログトランスフォーメーションの分析により示されたように、差は著しかった（Ｐ＜０．００５）。

１９週の延長期間後、２つの群における合計の致死は、カイ二乗検定により示したように著しくは異ならなかった。

しかしながら、ワクチン接種後６から７週間間に、致死率は、対照ではほぼ１００％であり、ワクチン接種したな鳥では１０％であるように著しく異なった。ブロイラーのニワトリは通常生後６から７週間で市場に送られることに注意すべきである。

接触感染による抗原投与は接種による抗原投与と比較して効果的であったことが第７図から分かる。２つの群の合計致死は同様であり、累積致死曲線の傾斜は約２週開運れた後（接触感染）同様になった。これはおそらくは、感染を確立するのに必要な時間を示すものであろう。

ワクチン接種した群は、同一の室に保持されたワクチン接種しなかった群により放たれたＭＤＶに暴露され続けたことに注意すべきである。

結論として、初生臼にワクチン接種され、２つの異なる方法によるＭＤＶを抗原投与した、遺伝的に感受性のあるニワトリを使用する厳しい条件下で、防御免疫原としてのＭＤＶ　ｇＢの重要性水された。

表　２死亡までの期間（日）鶏痘ワクチン接種　ワクチン接種せず　ワクチン接種せず接触抗原投与　接触抗原投与　接種抗原投与数　１２　１９　１８群当りの合計ひな鳥　１８　２０　１９結果は、家きん工業におけるＭＤＶに対するワクチン接種のためのＴ、ＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ組換え体の潜在能力を示している。鶏痘ウィルスの制限宿主範囲により、組換え体の非アビアン種へのトランスミッションに対する固有の安全バリアが得られる。全体のウィルスというよりもむしろＭＤＶの抗原領域を使用すれば、生ヘルペスウィルスを環境に導入する必要性がなくなる。大量の異種遺伝情報を含むＴＲ０ＶＡＣの能力により、血清型の範囲から多くの抗原決定基を含むことを考慮すべきである。

実施例５−ＴＲ−ＴＲ０ＶＡＣ−の比較効能（ｖＦＰ１０８およびＨＶＴ）以前の実験において、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖＦＰ１０８）のＭＤＶ抗原投与に対して防御する能力を２つの方法により評価した。第１の実験において、初生のＳＰＦのニワトリに４０１０ｇ＋ｏｌ）ｆｕのｖＦＰ１０８を皮下経路で首すじにワクチン接種した。接種から１４日後にニワトリに腹腔内でＪＭＶ腫瘍細胞系を接種することにより抗原投与し、４４％のニワトリが抗原投与に対して生存した。第２の実験において、初生のＳＰＦのニワトリに、６．３　ｌ　ｏ　ｇ、。

ｐｆｕのｖＦＰ１０８を筋肉的経路によりワクチン接種した。接種から７日後、ワクチン接種したニワトリとワクチン接種しなかったニワトリに、ＭＤＶ菌株ＲＢ１８に感染したニワトリによる接触感染によって抗原投与した。ワクチン接種から６から７週間後に、９０％のワクチン接種したニワトリが抗原投与に対して生存した。

最も一般的に用いられるＭＤＶワクチンは、血清学的にＭＤＶに関連する七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶ　Ｔ）ワクチンである。この実施例はＨＶＴおよびＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖＦＰ１０８）の比較効能を示している。

生後２０日のＳＰＦニワトリに、皮下経路により３．８１゜ｇ　＋ｏＥ　Ｉ　Ｄ　ｓｏのＴ　ＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖ　Ｆ　Ｐ　１０８）を首すじに接種した。２０羽のニワトリに皮下経路で３．Ｑｌ。

ｇ　Ｉｏｌ）　ｆ　ｕの細胞関連ＨＶＴワクチンを接種した。１０羽のニワトリは接種しないままにした。接種から５日後、ワクチン接種したニワトリと対照のニワトリに、ＲＢＩＢ抗原投与ウィルスを腹腔内接種により抗原投与した。検死した４９日までの期間に亘りニワトリを観察し、マレック病に典型的な病巣について試験した。抗原投与の結果を表３に示す。

結果は、ワクチン接種をせずに抗原投与した対照の９０％が感染のために死亡したことが分かる。ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖＦＰ１０８）をワクチン接種したニワトリは、７５％の生存率を示し、ＨＶＴワクチンを接種したニワトリ□は８５％の生存率を示した。この結果は、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）ワクチンにより与えられた防御は細胞関連ＨＶＴに匹敵したことを示している。したがって、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶは効果的なワクチンである。

表　３ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖＦＰ１０８）およびＨＶＴの比較効能ワクチン　防御率　防御％ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ　（ｖＦＰ１０８）　１５／２０　７５ＨＶ　Ｔ　１７／２０　８５無　１／１０　１０ａ：抗原投与した合計数に対して防御されたひな鳥の率参　照　文　献Ｌ　Ｂａｒｔｈｏｌａｔ、Ｃ，、Ｒ，Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、ａｎｄ　Ｒ，Ｗｉｔｔａｋ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｇｚ、　２０９６−２１００　（１９ａ５）。

（１９Ｂ３ン。

ｌＯ，Ｃｌｅｗａｌｌ、Ｄ、Ｂ、、Ｊ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｌｌｏ、６６７− ６７６　（１９７２）。

ユ２＋　Ｃｒｔｍａｒ、ＬＪ＋、Ｍ、Ｍａｃｋａｔｔ、Ｃ，Ｗｏｈｌｅｎｂａｒｇ、Ａ、Ｌ。

Ｎｏｔｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｂ＋Ｍｏ５ｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．７３７−７４０　（１９８５）。

（１９９０ａ）。

（１９９０ｂ）。

２４、Ｍａｒｅｈｉｏｌｉ、　Ｃ，Ｃ，、ＲＪ、　Ｙａｎｃｅｙ、　Ｅ、Ａ、　Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　Ｊ、Ｇ。

Ｔｉｍｒｎｉｎｓ　ａｎｄ　Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６エ、　：＋９７７−３９ｓｌ：（１９８７）。

２５、　Ｎａｚｅｒｉａｎ、Ｋ、、Ｅ、Ａ、５ｔａｐｈａｎｓ、Ｊ、Ｍ、Ｓｈａｒｍａ、Ｌ、Ｆ、Ｌｅｅ。

Ｍ、　Ｇａ１ｌｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒ，Ｌ、　Ｗｉｔｔｅｒ、　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　２工、６９−７６　（１９７７）＋３４、Ｐａｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、、　Ａ、　Ｐｉｃｃｉｎｉ、　Ｂ、Ｒ，Ｌｉｐｉｎｓｋａｓ、　ａｎｄ　Ｂ＋Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　５ｃｉａｎｃａ　２２９．９８１−９８４　（１９８５）。

（１９Ｂ９）。

コ９．　ｓａｎｇ＠ｒ、Ｆ、、Ｓ、Ｎ１ｃｋｌ＠ｎ、ａｎｄ　Ａ＋Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ＋　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　フ４．　５４６３−５４６７　（１９７７）。

４０＋５ｃｈａｔ、　Ｋ、Ａ、、　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖａｙｓ　６．　１− ３７　（１９８７）。

４１、　５ｈａｐｉｒａ、　Ｓ、に、、　Ｊ、　Ｃｈｏｕ、　Ｆ、Ｖ、　Ｒｉｃｈａｕｄ、　ａｎｄ　Ｍ、Ｊ。

Ｃａｇａｄａｂａｎ、Ｇａｎｅ２５．７１−８２　（１９８３）。

４コ、　Ｔａｒｔａｇｌｉａ、Ｊ、、Ｓ、Ｐｉｎｃｕｓ　ａｎｄ　Ｅ、Ｐａｏｌａｔｔｉ、Ｃｒ１ｔ。

Ｒａｖｓ、　ｉｎ工ｍｍｕｎｏ１．　ｉｏ、　１３−３０　（１９９０）。

４４、Ｔａｙｌｏｒ、　Ｊ、、　Ｒ，Ｗｅｉｎｂａｒｇ、　Ｙ、　Ｋａｗａｏｋａ、λＧ、　Ｗａｂｓｔｅｒ。

ａｎｄ　Ｅ、　Ｐａｏｌａｔｔｉ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　６．５０４−５０８　（１９８５１ａ）。

ＦＩＧＵＲＥ　１ＦＩＧＵＲＥ３ｖＰ５８１　ｖＰ６１８７”ｌシー　７９う〜り　、）九、ａ月７・ラークＦＩＧＵＲＥ　４ｐｓｃ＋４１９Ｐ７０Ｂ７ａ（−７５−７ＦＩＧＵＲＥ　５Ｐ８０４、透７明７６ラークＦＩＧＵＲＥ　６フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１０５５　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　７１００　９２８１−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡＣ１２Ｒ１：９２）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰＩＣ１２Ｒ１：９２）（７２）発明者　タータグリア、ジェームズアメリカ合衆国　ニューヨーク州　１２３０３シエネクタデイ　クリスティーナ　ドライヴ　７（７２）発明者　ロス、ルイスイギリス国　ハンチイントン　アルコンベリー　ピーイー１７５デイーエヌ　ラストレーン　スビニー　ハウス　（番地なし）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポックスウイルスゲノムの可欠領域にマレック病ウイルスからのＤＮＡを含有することを特徴とする組換えポックスウイルス。
２．前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの構造タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
３．前記ＤＮＡがマレック肩ウイルスの糖タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第２項記載の組換えポックスウイルス。
４．前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢまたは糖タンパク質ｇＤをコード化することを特徴とする請求の範囲第３項記載の組換えポックスウイルス。
５．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
６．前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えボックスウイルス。
７．前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の組換えポックスウイルス。
８．ワクチンを接種した宿主動物に免疫応答を誘発するワクチンであって、担体と、可欠領域にマレック病ウイルスからのＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスとからなることを特徴とするワクチン。
９．前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの構造タンパク質をコード化して発現させることを特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチン。
１０．前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの糖タンパク質をコード化して発現させることを特徴とする請求の範囲第９項記載のワクチン。
１１．前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢまたは糖タンパク質ｇＤをコード化して発現させることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のワクチン。
１２．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチン。
１３．前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチン。
１４．前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１３項記載のワクチン。
１５．前記宿主動物がニワトリであることを特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチン。