JPH08242869A - 組み換えポックスウイルス及びそれから成るワクチン - Google Patents
組み換えポックスウイルス及びそれから成るワクチンInfo
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- JPH08242869A JPH08242869A JP8023125A JP2312596A JPH08242869A JP H08242869 A JPH08242869 A JP H08242869A JP 8023125 A JP8023125 A JP 8023125A JP 2312596 A JP2312596 A JP 2312596A JP H08242869 A JPH08242869 A JP H08242869A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新たな抗ＩＢＤＶワクチンを提供する。
【構成】 ポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域に伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタンパク
質をコードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックス
ウイルスであって、当該ＤＮＡが、配列番号１記載の塩
基配列の第１番目〜第１３５９番目の塩基配列またはこ
れとの相同性が９０％以上である塩基配列を有し、かつ
１２９９〜１４１９塩基対であることを特徴とする組み
換えポックスウイルスを有効成分とする鶏用抗伝染性フ
ァブリキウス嚢病ウイルス組み換えウイルスワクチン。
域に伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタンパク
質をコードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックス
ウイルスであって、当該ＤＮＡが、配列番号１記載の塩
基配列の第１番目〜第１３５９番目の塩基配列またはこ
れとの相同性が９０％以上である塩基配列を有し、かつ
１２９９〜１４１９塩基対であることを特徴とする組み
換えポックスウイルスを有効成分とする鶏用抗伝染性フ
ァブリキウス嚢病ウイルス組み換えウイルスワクチン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組み換えポックスウイル
ス及びそれから成るワクチンに関し、さらに詳しくは、
ポックスウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域に伝染性
ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶという）
に対する抗体を誘導することができるポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックスウイル
ス及びそれを主成分とするワクチンに関する。
ス及びそれから成るワクチンに関し、さらに詳しくは、
ポックスウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域に伝染性
ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶという）
に対する抗体を誘導することができるポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックスウイル
ス及びそれを主成分とするワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学、遺伝子工学の発達にともな
い、特定の遺伝子の単離・発現・解析が比較的簡単に行
える方法が見いだされてきた。これらの方法を用いて病
原体の特定の抗原タンパク質を大量に得、これをコンポ
ーネントワクチンとして使用する方法、特定の抗原タン
パク質を生体内で発現するような組み換え微生物を生ワ
クチンとしてそのまま投与する方法など、ワクチンへ応
用が検討されている。組み換え微生物を用いる方法にお
いて目的の抗原を発現するために、多くのウイルスやバ
クテリアがベクターの候補として研究されている。現
在、このような組み換え微生物生ワクチンのベクターと
して最も有望なものは、ポックスウイウルス科に属する
ワクチニアウイルスであると考えられている。ワクチニ
アウイルス弱毒株は、長年、天然痘のワクチンとして用
いられており、このためホ乳類に感染するウイルスとし
ては安全性の高いウイルスとして知られている。また、
感染した宿主に強力な免疫を誘導すること、外来遺伝子
を安定に保持できること、ウイルスの調製が非常に簡便
であること等、多くの優れた性質を持っており、新しい
タイプのワクチン用ベクターとして、その実用化が期待
されている。例えばヨーロッパで１９８８〜１９８９年
には、組み換えワクチニアウイルスを用いた狂犬病ワク
チンを野生動物に試験的に使用し、有効性が確認されて
いる。しかしながら、導入される遺伝子の種類によって
は、現在のシステムでは十分ではなく、病原体の感染を
完全に防御するだけの免疫を誘導することができない場
合も数多く報告されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２、
１５３０〜（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、
６２、１７３１〜（１９８８）、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、１２０、１９３−２０５（１９９１）等）。
い、特定の遺伝子の単離・発現・解析が比較的簡単に行
える方法が見いだされてきた。これらの方法を用いて病
原体の特定の抗原タンパク質を大量に得、これをコンポ
ーネントワクチンとして使用する方法、特定の抗原タン
パク質を生体内で発現するような組み換え微生物を生ワ
クチンとしてそのまま投与する方法など、ワクチンへ応
用が検討されている。組み換え微生物を用いる方法にお
いて目的の抗原を発現するために、多くのウイルスやバ
クテリアがベクターの候補として研究されている。現
在、このような組み換え微生物生ワクチンのベクターと
して最も有望なものは、ポックスウイウルス科に属する
ワクチニアウイルスであると考えられている。ワクチニ
アウイルス弱毒株は、長年、天然痘のワクチンとして用
いられており、このためホ乳類に感染するウイルスとし
ては安全性の高いウイルスとして知られている。また、
感染した宿主に強力な免疫を誘導すること、外来遺伝子
を安定に保持できること、ウイルスの調製が非常に簡便
であること等、多くの優れた性質を持っており、新しい
タイプのワクチン用ベクターとして、その実用化が期待
されている。例えばヨーロッパで１９８８〜１９８９年
には、組み換えワクチニアウイルスを用いた狂犬病ワク
チンを野生動物に試験的に使用し、有効性が確認されて
いる。しかしながら、導入される遺伝子の種類によって
は、現在のシステムでは十分ではなく、病原体の感染を
完全に防御するだけの免疫を誘導することができない場
合も数多く報告されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２、
１５３０〜（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、
６２、１７３１〜（１９８８）、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、１２０、１９３−２０５（１９９１）等）。
【０００３】その原因としては、抗原タンパク質の由来
となるウイルスやバクテリアなどの病原微生物とワクチ
ニアウイルスとのタンパク質合成後の修飾様式が異なる
こと、目的とする特定の病原微生物の抗原タンパク質を
コードする遺伝子のみを組み込んだ為に本来の病原微生
物内で起こるプロセスが再現できないこと、病原微生物
内で本来発現する他のタンパク質との相互作用を受けな
いことなどのために、組み換えワクチニアウイルスが発
現するタンパク質が本来の中和エピトープを再構築でき
ないためと考えられている。このようなワクチニアウイ
ルスと同じポックスウイルス科に属するアビポックスウ
イルスは、鳥類のみをその宿主とするなど特有の性質を
持っているが、ワクチニアウイルス同様鳥類の組み換え
生ワクチン用ベクターとして有望視されている。
となるウイルスやバクテリアなどの病原微生物とワクチ
ニアウイルスとのタンパク質合成後の修飾様式が異なる
こと、目的とする特定の病原微生物の抗原タンパク質を
コードする遺伝子のみを組み込んだ為に本来の病原微生
物内で起こるプロセスが再現できないこと、病原微生物
内で本来発現する他のタンパク質との相互作用を受けな
いことなどのために、組み換えワクチニアウイルスが発
現するタンパク質が本来の中和エピトープを再構築でき
ないためと考えられている。このようなワクチニアウイ
ルスと同じポックスウイルス科に属するアビポックスウ
イルスは、鳥類のみをその宿主とするなど特有の性質を
持っているが、ワクチニアウイルス同様鳥類の組み換え
生ワクチン用ベクターとして有望視されている。
【０００４】ところで、伝染性ファブリキウス嚢炎は、
ＩＢＤＶを病原ウイルスとする鶏の感染病で、きわめて
伝播性が高い。ＩＢＤＶに感染した鶏は、２〜３日の潜
伏期の後、ファブリキウス嚢がまず変状を呈し、鬱血・
腫脹して、ほぼ４日目で最大になる。急性の場合は粘膜
の激しい炎症と、漿膜面の黄色滲出物が認められる。こ
の時期のファブリキウス嚢は平常時の２倍の大きさにな
り、同時にウイルス血症と発熱が現れる。また、ＩＢＤ
Ｖ感染はＢ細胞の破壊を引き起こし、この結果、免疫抑
制をもたらす。これは抗体産生阻害とともに、細胞免疫
の成立にも悪影響を及ぼす。このような免疫抑制作用の
結果、ＩＢＤＶ以外の他の疾病に対する抵抗性が低下
し、更に抑制されている間は、ワクチン投与しても免疫
応答ははかばかしくない。初生雛がＩＢＤＶ感染した場
合、免疫抑制が最も顕著になり、この作用は数週間継続
するが、免疫抑制作用が解除されるまでにどれくらいの
週齢が必要かは不明である。ＩＢＤＶ感染による死亡率
は、通常の株では５％程度と言われているが、毒性の強
い株に感染すると３０％以上にも達すると言われてい
る。また、死亡しないまでも、好ましくない種々の症状
を呈して、廃用せざるを得ない鶏も多く、消耗率は８０
％にまで及ぶこともある。急性のＩＢＤＶ感染症出ない
場合、激しい感染症状が認められないことがある。ま
た、無症状型感染もある。このような場合、発育や産卵
の抑制と言う形で発症する。ＩＢＤＶ感染症の治療薬は
なく、養鶏場内での本病撲滅を目的として飼育密度を下
げたり、衛生管理を強化しても、本病の予防は殆ど無効
で終わるのが現状である。このため、感染前にワクチン
投与するのが最も実用的な手段であると考えられてきて
いる。このため、ＩＢＤＶ感染症予防のために、雛に対
して安全で有効な免疫用ワクチンの開発が望まれてい
る。ワクチン投与の方法としては、例えば、雛に生ワク
チンを投与して能動免疫を付与する方法、親鶏に生およ
び／または不活化ワクチンを投与して、産生雛に受動免
疫を与える方法などがある。このＩＢＤＶは、ラージセ
グメントとスモールセグメントとを有する２重鎖ＲＮＡ
ウイルスである。ラージセグメント（以下、ＳｅｇＡと
いう）は、ＶＰＸ、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、１６Ｋと
呼ばれる５つのポリペプチドをコードしており、一連の
ポリペプチドとして発現した後、プロセスされる。酵母
で発現させたＶＰ２を鶏に接種すると、ＩＢＤＶに対す
る中和抗体の誘導が認められ、得られた抗血清を改めて
鶏に受動免疫すれば、ＩＢＤＶに対する感染防御能を付
与できると報告されている（Ｖａｃｃｉｎｅ、８、５４
９〜（１９９０））。従って、ＩＢＤＶのＳｅｇＡをコ
ードするｃＤＮＡまたはＶＰ２をコードするｃＤＮＡを
ＡＰＶに組み込んで発現させれば、ＩＢＤＶの感染を阻
止できるワクチンが得られるものと思われ、実際にＣ．
Ｄ．Ｂａｙｌｉａｓらは、ＶＰ２をコードするｃＤＮＡ
を大腸菌のｌａｃＺ遺伝子と融合し、ＡＰＶ下のみのタ
ーミナル領域にプロモーターととともに挿入した組み換
えＡＰＶを構築し、鶏に接種し、ＩＢＤＶ感染が或程度
防御できたことを報告している（Ｐｏｘ ａｎｄ Ｉｒ
ｉｄｏ ｖｉｒｕｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９０年５
月）。しかしながら、ここで報告されたワクチンは、接
種量が非常に多く、また接種回数も２回必要であるとい
うことなどから、実用的なワクチン開発という観点でみ
ると、実用レベルとは言いがたいものであった。さら
に、彼らの組み換えＡＰＶは、ＡＰＶゲノムの左右のタ
ーミナル領域２ヶ所にＶＰ２−ｌａｃＺ遺伝子が挿入さ
れており、分子内相同組み換えを起こしやすい不安定な
組み換え体であり、この点でもその実用性は認めがたい
ものであった。また、Ｂｏｙｌｅらは、ＶＰ２をコード
する領域を含むＤＮＡを組み込んだ組み換えフォウルポ
ックスウイルスを構築した。彼らが用いたＶＰ２をコー
ドする領域を含むＤＮＡは、ＳｅｇＡによってコードさ
れているポリプロテインのアミノ末端から数えて５０３
番目のアミノ酸までをコードする遺伝子を用いている。
このＤＮＡを有する組み換えフォウルポックスウイルス
は、セグメントＡ全長を組み込んだ組み換えフォウルポ
ックスウイルスと比べて、ややワクチン効果に優れてい
ると彼らは報告している（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１
３１，２７７−２９２（１９９３））。しかし、それで
もワクチンとしての効果は十分とは言えず、実用化でき
るレベルではなかった。
ＩＢＤＶを病原ウイルスとする鶏の感染病で、きわめて
伝播性が高い。ＩＢＤＶに感染した鶏は、２〜３日の潜
伏期の後、ファブリキウス嚢がまず変状を呈し、鬱血・
腫脹して、ほぼ４日目で最大になる。急性の場合は粘膜
の激しい炎症と、漿膜面の黄色滲出物が認められる。こ
の時期のファブリキウス嚢は平常時の２倍の大きさにな
り、同時にウイルス血症と発熱が現れる。また、ＩＢＤ
Ｖ感染はＢ細胞の破壊を引き起こし、この結果、免疫抑
制をもたらす。これは抗体産生阻害とともに、細胞免疫
の成立にも悪影響を及ぼす。このような免疫抑制作用の
結果、ＩＢＤＶ以外の他の疾病に対する抵抗性が低下
し、更に抑制されている間は、ワクチン投与しても免疫
応答ははかばかしくない。初生雛がＩＢＤＶ感染した場
合、免疫抑制が最も顕著になり、この作用は数週間継続
するが、免疫抑制作用が解除されるまでにどれくらいの
週齢が必要かは不明である。ＩＢＤＶ感染による死亡率
は、通常の株では５％程度と言われているが、毒性の強
い株に感染すると３０％以上にも達すると言われてい
る。また、死亡しないまでも、好ましくない種々の症状
を呈して、廃用せざるを得ない鶏も多く、消耗率は８０
％にまで及ぶこともある。急性のＩＢＤＶ感染症出ない
場合、激しい感染症状が認められないことがある。ま
た、無症状型感染もある。このような場合、発育や産卵
の抑制と言う形で発症する。ＩＢＤＶ感染症の治療薬は
なく、養鶏場内での本病撲滅を目的として飼育密度を下
げたり、衛生管理を強化しても、本病の予防は殆ど無効
で終わるのが現状である。このため、感染前にワクチン
投与するのが最も実用的な手段であると考えられてきて
いる。このため、ＩＢＤＶ感染症予防のために、雛に対
して安全で有効な免疫用ワクチンの開発が望まれてい
る。ワクチン投与の方法としては、例えば、雛に生ワク
チンを投与して能動免疫を付与する方法、親鶏に生およ
び／または不活化ワクチンを投与して、産生雛に受動免
疫を与える方法などがある。このＩＢＤＶは、ラージセ
グメントとスモールセグメントとを有する２重鎖ＲＮＡ
ウイルスである。ラージセグメント（以下、ＳｅｇＡと
いう）は、ＶＰＸ、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、１６Ｋと
呼ばれる５つのポリペプチドをコードしており、一連の
ポリペプチドとして発現した後、プロセスされる。酵母
で発現させたＶＰ２を鶏に接種すると、ＩＢＤＶに対す
る中和抗体の誘導が認められ、得られた抗血清を改めて
鶏に受動免疫すれば、ＩＢＤＶに対する感染防御能を付
与できると報告されている（Ｖａｃｃｉｎｅ、８、５４
９〜（１９９０））。従って、ＩＢＤＶのＳｅｇＡをコ
ードするｃＤＮＡまたはＶＰ２をコードするｃＤＮＡを
ＡＰＶに組み込んで発現させれば、ＩＢＤＶの感染を阻
止できるワクチンが得られるものと思われ、実際にＣ．
Ｄ．Ｂａｙｌｉａｓらは、ＶＰ２をコードするｃＤＮＡ
を大腸菌のｌａｃＺ遺伝子と融合し、ＡＰＶ下のみのタ
ーミナル領域にプロモーターととともに挿入した組み換
えＡＰＶを構築し、鶏に接種し、ＩＢＤＶ感染が或程度
防御できたことを報告している（Ｐｏｘ ａｎｄ Ｉｒ
ｉｄｏ ｖｉｒｕｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９０年５
月）。しかしながら、ここで報告されたワクチンは、接
種量が非常に多く、また接種回数も２回必要であるとい
うことなどから、実用的なワクチン開発という観点でみ
ると、実用レベルとは言いがたいものであった。さら
に、彼らの組み換えＡＰＶは、ＡＰＶゲノムの左右のタ
ーミナル領域２ヶ所にＶＰ２−ｌａｃＺ遺伝子が挿入さ
れており、分子内相同組み換えを起こしやすい不安定な
組み換え体であり、この点でもその実用性は認めがたい
ものであった。また、Ｂｏｙｌｅらは、ＶＰ２をコード
する領域を含むＤＮＡを組み込んだ組み換えフォウルポ
ックスウイルスを構築した。彼らが用いたＶＰ２をコー
ドする領域を含むＤＮＡは、ＳｅｇＡによってコードさ
れているポリプロテインのアミノ末端から数えて５０３
番目のアミノ酸までをコードする遺伝子を用いている。
このＤＮＡを有する組み換えフォウルポックスウイルス
は、セグメントＡ全長を組み込んだ組み換えフォウルポ
ックスウイルスと比べて、ややワクチン効果に優れてい
ると彼らは報告している（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１
３１，２７７−２９２（１９９３））。しかし、それで
もワクチンとしての効果は十分とは言えず、実用化でき
るレベルではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の下で抗ＩＢＤＶ抗体を誘導するポリペプチド
をコードするＤＮＡがＡＰＶゲノムＤＮＡ中に組み込ま
れた増殖可能な組み換えＡＰＶの構築を目指し鋭意研究
を進めた結果、ＩＢＤＶのＤＮＡよりＳｅｇＡをコード
する領域の一部をポックスウイルスの増殖に非必須な特
定ゲノム領域１ヶ所に組み込めば、増殖可能な組み換え
ポックスウイルスが得られ、この組み換えポックスウイ
ルスをワクチンとして接種すると、が超強毒株ＩＢＤＶ
に対しても感染防御できることを見いだし、本発明を完
成するに到った。
従来技術の下で抗ＩＢＤＶ抗体を誘導するポリペプチド
をコードするＤＮＡがＡＰＶゲノムＤＮＡ中に組み込ま
れた増殖可能な組み換えＡＰＶの構築を目指し鋭意研究
を進めた結果、ＩＢＤＶのＤＮＡよりＳｅｇＡをコード
する領域の一部をポックスウイルスの増殖に非必須な特
定ゲノム領域１ヶ所に組み込めば、増殖可能な組み換え
ポックスウイルスが得られ、この組み換えポックスウイ
ルスをワクチンとして接種すると、が超強毒株ＩＢＤＶ
に対しても感染防御できることを見いだし、本発明を完
成するに到った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、ポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に伝
染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタンパク質をコ
ードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックスウイル
スであって、当該ＤＮＡが、３’末端に終止コドンを含
む任意のＤＮＡを有する配列番号１記載の塩基配列の第
１番目〜第１３５９番目の塩基配列またはこれとの相同
性が９０％以上である塩基配列を有し、かつ１２９９〜
１４１９塩基対であることを特徴とする組み換えポック
スウイルス、更に終止コドンを含む任意のＤＮＡが３’
末端を有する他のＩＢＤＶ由来の他のタンパク質をコー
ドするＤＮＡを前記ＤＮＡの３’末端に付加した組み換
えポックスウイルス、及びそれから成るワクチンが提供
される。
ば、ポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に伝
染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタンパク質をコ
ードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポックスウイル
スであって、当該ＤＮＡが、３’末端に終止コドンを含
む任意のＤＮＡを有する配列番号１記載の塩基配列の第
１番目〜第１３５９番目の塩基配列またはこれとの相同
性が９０％以上である塩基配列を有し、かつ１２９９〜
１４１９塩基対であることを特徴とする組み換えポック
スウイルス、更に終止コドンを含む任意のＤＮＡが３’
末端を有する他のＩＢＤＶ由来の他のタンパク質をコー
ドするＤＮＡを前記ＤＮＡの３’末端に付加した組み換
えポックスウイルス、及びそれから成るワクチンが提供
される。
【０００７】ポックスウイルス 本発明においてＩＢＤＶ由来のタンパク質に対する抗体
を誘導することができるポリペプチドをコードしている
遺伝子（以下、抗原遺伝子ということがある）を組み込
むために供されるポックスウイルスは、鳥類に感染する
ものである限りいかなるウイルスでもよいが、鶏、七面
鳥、アヒルなどの家禽類の細胞中で増殖可能な、例えば
ワクチニアウイルス；ピジョンポックスウイルス、ファ
ルポックスウイルス、カナリーポックスウイルス、七面
鳥ポックスウイルス、クエイルポックスウイルスなどの
アビポックスウイルス（以下、ＡＰＶという）が挙げら
れる。これらのウイルス株の具体例としては、ＡＴＣＣ
ＣＲ−２５１、ＡＴＣＣＣＲ−２５０、ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−２２９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣＶＲ−
２２８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワク
チン株由来のウイルスのうち鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）
に感染したとき大きいプラークを形成する狭義のフォル
ポックスウイルス（以下、ＦＰＶという）等狭義のＦＰ
Ｖや、鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）などのごとき狭義の
ＦＰＶと近縁のウイルスであって、鶏痘生ワクチン株と
して使用されるウイルスなどが好ましい例として示され
る。これらの株はいずれも市販されており、容易に入手
することができる。
を誘導することができるポリペプチドをコードしている
遺伝子（以下、抗原遺伝子ということがある）を組み込
むために供されるポックスウイルスは、鳥類に感染する
ものである限りいかなるウイルスでもよいが、鶏、七面
鳥、アヒルなどの家禽類の細胞中で増殖可能な、例えば
ワクチニアウイルス；ピジョンポックスウイルス、ファ
ルポックスウイルス、カナリーポックスウイルス、七面
鳥ポックスウイルス、クエイルポックスウイルスなどの
アビポックスウイルス（以下、ＡＰＶという）が挙げら
れる。これらのウイルス株の具体例としては、ＡＴＣＣ
ＣＲ−２５１、ＡＴＣＣＣＲ−２５０、ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−２２９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣＶＲ−
２２８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワク
チン株由来のウイルスのうち鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）
に感染したとき大きいプラークを形成する狭義のフォル
ポックスウイルス（以下、ＦＰＶという）等狭義のＦＰ
Ｖや、鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）などのごとき狭義の
ＦＰＶと近縁のウイルスであって、鶏痘生ワクチン株と
して使用されるウイルスなどが好ましい例として示され
る。これらの株はいずれも市販されており、容易に入手
することができる。
【０００８】非必須領域 本発明においては、ＩＢＤＶ由来の抗原タンパク質をコ
ードするＤＮＡが前記ポックスウイルスに組み込まれる
部位は、ポックスウイルスの増殖に非必須な領域であれ
ば、特に制限されない。このような非必須領域としては
特開平１−１６８２７９号公報に記載されている領域を
使用することができる。その具体的としては、例えば前
記公報の図２に示すごとき制限酵素地図を示すＮＰ株Ｄ
ＮＡのＥｃｏＲＩ断片（７．３ｋｂ）、この断片を切り
縮めた約２．７ＫｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｋ
ｂ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片（約５．２ｋｂ）、クエイルポックスウイルスの
ＴＫ領域、七面鳥ポックスウイルスのＴＫ領域、特開平
１−１６８２７９号公報に記載されたＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ断片（７．３ｋｂ）を切り縮めた約２．７ＫｂのＥｃ
ｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片など、公知の非必須領域の
一部なども使用可能な非必須領域として例示できる。
ードするＤＮＡが前記ポックスウイルスに組み込まれる
部位は、ポックスウイルスの増殖に非必須な領域であれ
ば、特に制限されない。このような非必須領域としては
特開平１−１６８２７９号公報に記載されている領域を
使用することができる。その具体的としては、例えば前
記公報の図２に示すごとき制限酵素地図を示すＮＰ株Ｄ
ＮＡのＥｃｏＲＩ断片（７．３ｋｂ）、この断片を切り
縮めた約２．７ＫｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｋ
ｂ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片（約５．２ｋｂ）、クエイルポックスウイルスの
ＴＫ領域、七面鳥ポックスウイルスのＴＫ領域、特開平
１−１６８２７９号公報に記載されたＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ断片（７．３ｋｂ）を切り縮めた約２．７ＫｂのＥｃ
ｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片など、公知の非必須領域の
一部なども使用可能な非必須領域として例示できる。
【０００９】非必須領域を含有するベクター 本発明の組み換え用プラスミドの構築に用いられるウイ
ルスの非必須領域をクローニングするためのベクターは
通常の組み換え技術で用いられるものが使用でき、その
具体例としては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐ
ＵＣ９、ｐＵＣ１９などのプラスミド、λファージ、Ｍ
１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９（ジーン，１
１，第２９１頁，１９８０年）などのコスミドが例示さ
れる。これらのベクターを適当な制限酵素で処理して、
前述のウイルス非必須領域のＤＮＡ断片を任意のプラス
ミド、ファージ、コスミドなどが有する制限酵素切断部
位に、常法により挿入し、非必須領域を有するベクター
を構築すればよい。このようなベクターの具体例とし
て、特開平１−１６８２７９号公報に記載されてい各種
プラスミドや、後述する約２．７ＫｂのＥｃｏＲＶ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位に、クレノウフラグメント処理した約５．
４ｂｐのＤＮＡ断片とリガーゼで連結して、構築された
プラスミドＮＺ１３３Ｓなどを挙げることができる。
ルスの非必須領域をクローニングするためのベクターは
通常の組み換え技術で用いられるものが使用でき、その
具体例としては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐ
ＵＣ９、ｐＵＣ１９などのプラスミド、λファージ、Ｍ
１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９（ジーン，１
１，第２９１頁，１９８０年）などのコスミドが例示さ
れる。これらのベクターを適当な制限酵素で処理して、
前述のウイルス非必須領域のＤＮＡ断片を任意のプラス
ミド、ファージ、コスミドなどが有する制限酵素切断部
位に、常法により挿入し、非必須領域を有するベクター
を構築すればよい。このようなベクターの具体例とし
て、特開平１−１６８２７９号公報に記載されてい各種
プラスミドや、後述する約２．７ＫｂのＥｃｏＲＶ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位に、クレノウフラグメント処理した約５．
４ｂｐのＤＮＡ断片とリガーゼで連結して、構築された
プラスミドＮＺ１３３Ｓなどを挙げることができる。
【００１０】抗原遺伝子 本発明において、ポックスウイルスに組み込まれるＤＮ
Ａは、配列番号１に示される塩基配列またはこれとの相
同性が９０％以上、好ましくは９５％以上である配列を
有するＤＮＡ（以下、ＶＰ２ＤＮＡということがある）
単独またはＶＰ２ＤＮＡの３’末端側に他のＩＢＤＶ由
来のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、単に他のＤ
ＮＡということがある）とを連結したＤＮＡである。Ｖ
Ｐ２ＤＮＡは生体内で発現するとＩＢＤＶ由来のＶＰ２
タンパク質に対する抗体を誘導できるタンパク質であ
る。配列番号１に示される塩基配列との相同性が上記の
条件を満たすＤＮＡであっても、全塩基数が多すぎたり
少なすぎたりするＤＮＡでは本発明の効果が得られな
い。従って、本発明において使用されるＩＢＤＶ由来の
ＶＰ２タンパク質に対する抗体を誘導できるＤＮＡの全
塩基数は、通常１２９９〜１４１９塩基対、好ましくは
１３１４〜１４０４塩基対である。配列番号１に示され
る配列は、ＩＢＤＶのＳｅｇＡのポリプロテインをコー
ドするオープンリーディングフレームの開始コドンから
４５３番目のアミノ酸であるアルギニンまでをコードす
るＤＮＡ断片にＴＧＡなどの終始コドンを合成ＤＮＡを
利用して付与してつくられたものである。付与された配
列は、ＩＢＤＶ由来の遺伝子とは関係のない塩基であ
り、これに限らず任意に選択できる。配列番号１におい
て第１３６０番目〜１３６２番目が付与した配列に相当
するが、この配列に制限されるものではない。また、本
発明においてＶＰ２ＤＮＡの３’末端側に連結可能な他
のＤＮＡの具体例としては配列番号１０に示される塩基
配列のうち第１５２２〜１５８８番目の塩基配列（ＩＢ
ＤＶのＶＰ３タンパク質をコードする塩基配列に相当）
またはこれとの相同性が９０％以上、好ましくは９５％
以上である配列を有するＤＮＡが例示される。ここで配
列番号１記載の塩基配列との相同性が９０％以上の配列
は、例えば、天然の鳥類に感染するマイコプラズマ属細
菌から得られたＤＮＡをＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、１０巻、２０号、６４８７〜６５００
頁（１９８２）や特公平６−１６７０９号公報に記載さ
れた部位特定変異誘発方法などにより、人工的に１以上
のアミノ酸を置換・挿入・欠失（これらをまとめて改変
ということがある）させることによって得ることができ
る。配列番号１記載のＤＮＡはＩＢＤＶのＳｅｇＡのポ
リプロテインをコードするオープンリーディングフレー
ムの開始コドンから１５１２番目までの塩基と３’側終
止コドンまでの１３０塩基をインフレームになるように
合成ＤＮＡを利用して付与して作られたものである。付
与された配列はＩＢＤＶ由来の遺伝子とは関係のない塩
基であり、任意に選択できる。配列番号１０において第
１５１３〜１５２１番目が付与した配列に相当するが、
この付与するＤＮＡは任意に選択されるものである。
尚、配列番号１０において第１〜１４１９番目は前記Ｖ
Ｐ２ＤＮＡに相当する。ＶＰ２ＤＮＡのみを発現する組
み換えポックスウイルスを構築する場合、ＶＰ２ＤＮＡ
の３’末端に終止コドンを含む任意のＤＮＡを付加し、
ＶＰ２ＤＮＡと他のＤＮＡとの融合タンパク質を発現す
る組み換えポックスウイルスを構築する場合は、他のＤ
ＮＡの３’末端に終止コドンを含む任意のＤＮＡを付加
する。さらに、本発明の組み換えポックスウイルスを多
価ワクチンとして用いる場合、上述したＩＢＤＶ由来の
抗原遺伝子以外の他のウイルス由来の抗原遺伝子を任意
に組み込んで多価組み換えポックスウイルスを常法にし
たがって構築することもできる。
Ａは、配列番号１に示される塩基配列またはこれとの相
同性が９０％以上、好ましくは９５％以上である配列を
有するＤＮＡ（以下、ＶＰ２ＤＮＡということがある）
単独またはＶＰ２ＤＮＡの３’末端側に他のＩＢＤＶ由
来のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、単に他のＤ
ＮＡということがある）とを連結したＤＮＡである。Ｖ
Ｐ２ＤＮＡは生体内で発現するとＩＢＤＶ由来のＶＰ２
タンパク質に対する抗体を誘導できるタンパク質であ
る。配列番号１に示される塩基配列との相同性が上記の
条件を満たすＤＮＡであっても、全塩基数が多すぎたり
少なすぎたりするＤＮＡでは本発明の効果が得られな
い。従って、本発明において使用されるＩＢＤＶ由来の
ＶＰ２タンパク質に対する抗体を誘導できるＤＮＡの全
塩基数は、通常１２９９〜１４１９塩基対、好ましくは
１３１４〜１４０４塩基対である。配列番号１に示され
る配列は、ＩＢＤＶのＳｅｇＡのポリプロテインをコー
ドするオープンリーディングフレームの開始コドンから
４５３番目のアミノ酸であるアルギニンまでをコードす
るＤＮＡ断片にＴＧＡなどの終始コドンを合成ＤＮＡを
利用して付与してつくられたものである。付与された配
列は、ＩＢＤＶ由来の遺伝子とは関係のない塩基であ
り、これに限らず任意に選択できる。配列番号１におい
て第１３６０番目〜１３６２番目が付与した配列に相当
するが、この配列に制限されるものではない。また、本
発明においてＶＰ２ＤＮＡの３’末端側に連結可能な他
のＤＮＡの具体例としては配列番号１０に示される塩基
配列のうち第１５２２〜１５８８番目の塩基配列（ＩＢ
ＤＶのＶＰ３タンパク質をコードする塩基配列に相当）
またはこれとの相同性が９０％以上、好ましくは９５％
以上である配列を有するＤＮＡが例示される。ここで配
列番号１記載の塩基配列との相同性が９０％以上の配列
は、例えば、天然の鳥類に感染するマイコプラズマ属細
菌から得られたＤＮＡをＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、１０巻、２０号、６４８７〜６５００
頁（１９８２）や特公平６−１６７０９号公報に記載さ
れた部位特定変異誘発方法などにより、人工的に１以上
のアミノ酸を置換・挿入・欠失（これらをまとめて改変
ということがある）させることによって得ることができ
る。配列番号１記載のＤＮＡはＩＢＤＶのＳｅｇＡのポ
リプロテインをコードするオープンリーディングフレー
ムの開始コドンから１５１２番目までの塩基と３’側終
止コドンまでの１３０塩基をインフレームになるように
合成ＤＮＡを利用して付与して作られたものである。付
与された配列はＩＢＤＶ由来の遺伝子とは関係のない塩
基であり、任意に選択できる。配列番号１０において第
１５１３〜１５２１番目が付与した配列に相当するが、
この付与するＤＮＡは任意に選択されるものである。
尚、配列番号１０において第１〜１４１９番目は前記Ｖ
Ｐ２ＤＮＡに相当する。ＶＰ２ＤＮＡのみを発現する組
み換えポックスウイルスを構築する場合、ＶＰ２ＤＮＡ
の３’末端に終止コドンを含む任意のＤＮＡを付加し、
ＶＰ２ＤＮＡと他のＤＮＡとの融合タンパク質を発現す
る組み換えポックスウイルスを構築する場合は、他のＤ
ＮＡの３’末端に終止コドンを含む任意のＤＮＡを付加
する。さらに、本発明の組み換えポックスウイルスを多
価ワクチンとして用いる場合、上述したＩＢＤＶ由来の
抗原遺伝子以外の他のウイルス由来の抗原遺伝子を任意
に組み込んで多価組み換えポックスウイルスを常法にし
たがって構築することもできる。
【００１１】組み換え用ベクター 本発明で用いるウイルス組み換え用ベクターは、少なく
ともポックスウイルスのプロモーターの支配下に前記抗
原遺伝子が挿入された前記非必須領域を含むものであ
る。このような組み換え用ベクターは、常法により得ら
れ、例えばポックスウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ断
片を適当なベクターに組み込んだ後、必要に応じて該断
片中に存在する制限酵素切断点を利用しその下流に制限
酵素切断配列を付加したプロモーターを組み込めば良
い。ここで用いられるプロモーターとは、合成・天然を
問わずポックスウイルスが保有する転写の系でプロモー
ターとして有効に機能しうるものなら如何なる塩基配列
のものでも良く、チミジンキナーゼをコードするＡＰＶ
遺伝子のプロモーターなどＡＰＶ固有のプロモーターは
もちろんのこと、ＡＰＶ以外のウイルス由来のＤＮＡや
真核生物もしくは原核生物由来のＤＮＡであっても上記
条件を満たす限り当然本発明に使用可能である。これら
プロモーターの具体例としては、例えばＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５１，第６６２〜６６９頁
（１９８４年）に例示されるようなＶＶのプロモータ
ー、具体的には７．５ＫポリペプチドをコードするＶＶ
遺伝子のプロモーター、１９Ｋポリペプチドをコードす
るＶＶ遺伝子のプロモーター、４２Ｋポリペプチドをコ
ードするＶＶ遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼ
をコードするＶＶ遺伝子のプロモーター、２８Ｋポリペ
プチドをコードするＶＶ遺伝子のプロモーターなどが例
示される。また、Ｍｏｓｓらの文献（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，２１０，第７４９〜７６頁，第７７１〜７８４
頁，１９８９年）を参考にして合成プロモーターを用い
ることもできる。さらに、先に例示した各種のプロモー
ターを常法により４つ以上連結させた組み合わせプロモ
ーターを用いることもでき、このような組み合わせポッ
クスプロモーターを用いると、より高いワクチン効果が
期待できる。ここで連結するプロモーターは、一種類の
プロモーターであっても二種類以上のプロモーターであ
ってもよく、複数種類のプロモーターを複数連結させる
こともできる。また、プロモーターの連結順序について
は特に限定されないが、初期プロモーターと後期プロモ
ーターとを組み合わせる場合は、後期プロモーターの下
流側に初期プロモーターを連結させることが好ましく、
更に好ましくは実施例記載のプロモーター２Ｌ２Ｅプロ
モーター、またはこれらの塩基配列との相同性が９０％
以上、好ましくは９５％以上のプロモーターである。
ともポックスウイルスのプロモーターの支配下に前記抗
原遺伝子が挿入された前記非必須領域を含むものであ
る。このような組み換え用ベクターは、常法により得ら
れ、例えばポックスウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ断
片を適当なベクターに組み込んだ後、必要に応じて該断
片中に存在する制限酵素切断点を利用しその下流に制限
酵素切断配列を付加したプロモーターを組み込めば良
い。ここで用いられるプロモーターとは、合成・天然を
問わずポックスウイルスが保有する転写の系でプロモー
ターとして有効に機能しうるものなら如何なる塩基配列
のものでも良く、チミジンキナーゼをコードするＡＰＶ
遺伝子のプロモーターなどＡＰＶ固有のプロモーターは
もちろんのこと、ＡＰＶ以外のウイルス由来のＤＮＡや
真核生物もしくは原核生物由来のＤＮＡであっても上記
条件を満たす限り当然本発明に使用可能である。これら
プロモーターの具体例としては、例えばＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５１，第６６２〜６６９頁
（１９８４年）に例示されるようなＶＶのプロモータ
ー、具体的には７．５ＫポリペプチドをコードするＶＶ
遺伝子のプロモーター、１９Ｋポリペプチドをコードす
るＶＶ遺伝子のプロモーター、４２Ｋポリペプチドをコ
ードするＶＶ遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼ
をコードするＶＶ遺伝子のプロモーター、２８Ｋポリペ
プチドをコードするＶＶ遺伝子のプロモーターなどが例
示される。また、Ｍｏｓｓらの文献（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，２１０，第７４９〜７６頁，第７７１〜７８４
頁，１９８９年）を参考にして合成プロモーターを用い
ることもできる。さらに、先に例示した各種のプロモー
ターを常法により４つ以上連結させた組み合わせプロモ
ーターを用いることもでき、このような組み合わせポッ
クスプロモーターを用いると、より高いワクチン効果が
期待できる。ここで連結するプロモーターは、一種類の
プロモーターであっても二種類以上のプロモーターであ
ってもよく、複数種類のプロモーターを複数連結させる
こともできる。また、プロモーターの連結順序について
は特に限定されないが、初期プロモーターと後期プロモ
ーターとを組み合わせる場合は、後期プロモーターの下
流側に初期プロモーターを連結させることが好ましく、
更に好ましくは実施例記載のプロモーター２Ｌ２Ｅプロ
モーター、またはこれらの塩基配列との相同性が９０％
以上、好ましくは９５％以上のプロモーターである。
【００１２】組み換えウイルスの作製方法 本発明の組み換えポックスウイルスは、常法により作製
される。例えば、予めポックスウイルスを感染させた培
養細胞に、リン酸カルシウム共沈法等により前記組み換
え用ベクターを導入することにより、ベクターと感染細
胞中のポックスウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み
換えが起こり、組み換えポックスウイルスが構築され
る。得られた組み換えポックスウイルスは、イーグルＭ
ＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、生育
してくるプラークを目的とする組み換えポックスウイル
スの候補として選択する。候補株の選択でマーカー遺伝
子を用いる場合、例えば、ｌａｃＺ遺伝子をマーカー遺
伝子とすれば、ｌａｃＺ遺伝子が組み込まれた組み換え
ポックスウイルスはβ−ガラクトシダーゼを発現し、そ
の基質の一つであるブルオギャル（Ｂｌｕｅ−ｏ−ｇａ
ｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）が存在下で青いプラーク
を形成するので、これを候補株とすればよい。また、候
補株選択に用いる宿主細胞としては、用いるポックスウ
イルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特
に限定されず、たとえばＦＰＶを用いた場合は、鶏胎児
胚繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞）や発育鶏卵しょう尿膜細胞
等が挙げられ、ワクチニアウイルスを用いた場合にはホ
乳動物由来の細胞、Ｖｅｒｏ細胞やＲＫ−２３細胞など
が挙げられる。このようにして得た候補株を組み込んだ
抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法
や抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現す
るものを選択する方法などにより、組み込んだ抗原遺伝
子のコードする抗原タンパク質に対する抗体をイムノア
ッセイを利用して目的の組み換えポックスウイルスであ
ることを確認すればよい。抗原遺伝子としてＶＰ２ＤＮ
Ａと他のＤＮＡとを連結したＤＮＡを組み込んだ組み換
えポックスウイルスは、ＶＰ２タンパク質と他のＤＮＡ
によってコードされたタンパク質との融合タンパク質を
発現する。
される。例えば、予めポックスウイルスを感染させた培
養細胞に、リン酸カルシウム共沈法等により前記組み換
え用ベクターを導入することにより、ベクターと感染細
胞中のポックスウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み
換えが起こり、組み換えポックスウイルスが構築され
る。得られた組み換えポックスウイルスは、イーグルＭ
ＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、生育
してくるプラークを目的とする組み換えポックスウイル
スの候補として選択する。候補株の選択でマーカー遺伝
子を用いる場合、例えば、ｌａｃＺ遺伝子をマーカー遺
伝子とすれば、ｌａｃＺ遺伝子が組み込まれた組み換え
ポックスウイルスはβ−ガラクトシダーゼを発現し、そ
の基質の一つであるブルオギャル（Ｂｌｕｅ−ｏ−ｇａ
ｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）が存在下で青いプラーク
を形成するので、これを候補株とすればよい。また、候
補株選択に用いる宿主細胞としては、用いるポックスウ
イルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特
に限定されず、たとえばＦＰＶを用いた場合は、鶏胎児
胚繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞）や発育鶏卵しょう尿膜細胞
等が挙げられ、ワクチニアウイルスを用いた場合にはホ
乳動物由来の細胞、Ｖｅｒｏ細胞やＲＫ−２３細胞など
が挙げられる。このようにして得た候補株を組み込んだ
抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法
や抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現す
るものを選択する方法などにより、組み込んだ抗原遺伝
子のコードする抗原タンパク質に対する抗体をイムノア
ッセイを利用して目的の組み換えポックスウイルスであ
ることを確認すればよい。抗原遺伝子としてＶＰ２ＤＮ
Ａと他のＤＮＡとを連結したＤＮＡを組み込んだ組み換
えポックスウイルスは、ＶＰ２タンパク質と他のＤＮＡ
によってコードされたタンパク質との融合タンパク質を
発現する。
【００１３】以上のようにして得られる本発明の組み換
えポックスウイルスは鳥類に接種することにより、抗Ｉ
ＢＤＶ生ワクチンとして機能する。生ワクチンの調製方
法は常法に従って行えばよく、例えば次の方法が挙げら
れる。本発明のポックスウイルスを感染させた細胞を培
養し、ウイルスを増殖させたのち、細胞を回収し、破砕
する。この細胞破砕物を遠心分離機によって遠心分離チ
ューブ中で沈澱物と組み換えポックスウイルスを含んだ
非細胞依存性の高力価遠心上清とに分離する。本質的に
宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み換えウイルスを
含んだこの遠心上清は、本発明のワクチンとして使用で
きる。また、薬理学的に受け入れられる生理食塩水など
のようなものでを添加することもできる。更に、得られ
た遠心上清を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても利
用できる。
えポックスウイルスは鳥類に接種することにより、抗Ｉ
ＢＤＶ生ワクチンとして機能する。生ワクチンの調製方
法は常法に従って行えばよく、例えば次の方法が挙げら
れる。本発明のポックスウイルスを感染させた細胞を培
養し、ウイルスを増殖させたのち、細胞を回収し、破砕
する。この細胞破砕物を遠心分離機によって遠心分離チ
ューブ中で沈澱物と組み換えポックスウイルスを含んだ
非細胞依存性の高力価遠心上清とに分離する。本質的に
宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み換えウイルスを
含んだこの遠心上清は、本発明のワクチンとして使用で
きる。また、薬理学的に受け入れられる生理食塩水など
のようなものでを添加することもできる。更に、得られ
た遠心上清を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても利
用できる。
【００１４】本発明のワクチンの接種方法は、ワクチン
中の組み換えウイルスが家禽に感染して防御免疫応答を
誘導するような方法であれば、どの様な方法であっても
よい。例えば、飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混
入して経口接種する方法、皮下接種法、静脈内接種法、
筋肉中接種法、腹腔内接種法、エアロゾルやスプレーな
どによる吸入接種法のほか、皮膚に引っかき傷を付けて
ワクチン接種したり、注射針やその他の器具で家禽の皮
下にワクチンを接種することができる。本発明のワクチ
ン接種量は、通常、ニワトリの場合、１羽当り１０4〜
１０8プラーク・フォーミング・ユニット（ＰＦＵ）程
度を接種する。注射による接種法では、生理食塩水等で
希釈し、０．１ｍｌ程度の懸濁液として注射する。更
に、本発明のワクチンの保存は、例えば、本発明の組み
換えウイルスを凍結乾燥すれば、２０〜２５℃程度の室
温条件下での保存が可能である。また、乾燥せずに凍結
状態で保存する場合には、ウイルスの懸濁液を−２０℃
〜−７０℃程度にして凍結させ、そのまま保存すること
が可能である。
中の組み換えウイルスが家禽に感染して防御免疫応答を
誘導するような方法であれば、どの様な方法であっても
よい。例えば、飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混
入して経口接種する方法、皮下接種法、静脈内接種法、
筋肉中接種法、腹腔内接種法、エアロゾルやスプレーな
どによる吸入接種法のほか、皮膚に引っかき傷を付けて
ワクチン接種したり、注射針やその他の器具で家禽の皮
下にワクチンを接種することができる。本発明のワクチ
ン接種量は、通常、ニワトリの場合、１羽当り１０4〜
１０8プラーク・フォーミング・ユニット（ＰＦＵ）程
度を接種する。注射による接種法では、生理食塩水等で
希釈し、０．１ｍｌ程度の懸濁液として注射する。更
に、本発明のワクチンの保存は、例えば、本発明の組み
換えウイルスを凍結乾燥すれば、２０〜２５℃程度の室
温条件下での保存が可能である。また、乾燥せずに凍結
状態で保存する場合には、ウイルスの懸濁液を−２０℃
〜−７０℃程度にして凍結させ、そのまま保存すること
が可能である。
【００１５】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。 実施例１ 組み合わせプロモーターの構築と該プロモー
ターの活性測定 （１）ポックスウイルスプロモーターの合成とクローニ
ング Ｍｏｓｓらによって報告されたポックスウイルス初期プ
ロモーター、及び後期プロモーターの配列を参考に、Ｄ
ＮＡシンセサイザーＧｅｎｅｔＡ−ＩＩ（日本ゼオン社
製）を用いて配列番号２及び３の塩基配列の末端に制限
酵素ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで切断されたＤＮ
Ａ断片と連結可能な配列を有する図１および２で表され
るＤＮＡ断片を作製した。配列番号２の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ断片は、初期プロモーターとして機能するも
の（以下、Ｅプロモーターという）であり、配列番号３
の塩基配列で表されるＤＮＡ断片は、後期プロモーター
として機能するもの（以下、Ｌプロモーターという）で
ある。ｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した後、１．５％アガロース電気泳動で、２．
６ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片に、前
記ＥプロモーターとＬプロモーターを加え、リガーゼで
連結した。これを用いてコンピーテントな大腸菌を形質
転換し、アンピシリン５０μｇ／ｌ存在下のＬＢプレー
ト上に、コロニーを形成するものからＥプロモーターと
Ｌプロモーターを単離し、得られたプラスミドをｐＵＣ
１８−ＬＥと命名した。また、このプラスミドに含まれ
るＬプロモーターとＥプロモーターが連結した組み合わ
せプロモーターを、ＬＥプロモーターと命名した。
する。 実施例１ 組み合わせプロモーターの構築と該プロモー
ターの活性測定 （１）ポックスウイルスプロモーターの合成とクローニ
ング Ｍｏｓｓらによって報告されたポックスウイルス初期プ
ロモーター、及び後期プロモーターの配列を参考に、Ｄ
ＮＡシンセサイザーＧｅｎｅｔＡ−ＩＩ（日本ゼオン社
製）を用いて配列番号２及び３の塩基配列の末端に制限
酵素ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで切断されたＤＮ
Ａ断片と連結可能な配列を有する図１および２で表され
るＤＮＡ断片を作製した。配列番号２の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ断片は、初期プロモーターとして機能するも
の（以下、Ｅプロモーターという）であり、配列番号３
の塩基配列で表されるＤＮＡ断片は、後期プロモーター
として機能するもの（以下、Ｌプロモーターという）で
ある。ｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した後、１．５％アガロース電気泳動で、２．
６ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片に、前
記ＥプロモーターとＬプロモーターを加え、リガーゼで
連結した。これを用いてコンピーテントな大腸菌を形質
転換し、アンピシリン５０μｇ／ｌ存在下のＬＢプレー
ト上に、コロニーを形成するものからＥプロモーターと
Ｌプロモーターを単離し、得られたプラスミドをｐＵＣ
１８−ＬＥと命名した。また、このプラスミドに含まれ
るＬプロモーターとＥプロモーターが連結した組み合わ
せプロモーターを、ＬＥプロモーターと命名した。
【００１６】（２）組み合わせプロモーターの構築（図
６、７、８、９、１０参照） プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＤｒａＩで消化し、Ｘ
ｈｏＩリンカー（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’）を導
入し、得られたプラスミドをｐＵＣ１８Ｘと命名した。
このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで
消化し、この部位に配列番号４の塩基配列で表わされる
合成プロモーターの両端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳ
ｐｈＩとで切断されたＤＮＡ断片と連結可能な制限酵素
ＭｌｕＩの認識配列を有する図３で表わされるＤＮＡ断
片（以下、合成ＤＮＡという）を導入し、ｐＵＣ１８Ｍ
ｌｕＩを構築した。このプラスミドを更に、制限酵素Ｓ
ｐｈＩとＸｂａＩで消化した後、クレノウフラグメント
で処理し、リガーゼで連結して得られたプラスミドをｐ
ＵＣ１８ＭＫと命名した。前記（１）で構築したｐＵＣ
１８−ＬＥを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化
した後、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離し約５
０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＵＣ１８ＭＫを制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化し、前記５０ｂｐ
のＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドをｐＬｈと
命名した。このプラスミドにはＬプロモーターが含まれ
ている。また、ｐＵＣ１８−ＬＥを制限酵素ＭｌｕＩと
ＸｈｏＩで消化して得られる約１．２Ｋｂの初期プロモ
ーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８ＭＫを制限酵素
ＭｌｕＩとＸｈｏＩで消化して得られる約２．０Ｋｂの
ＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離
し、回収した。これらの断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、プラスミドｐＥｍを構築した。このプラ
スミドにはＥプロモーターが含まれている。つづいてプ
ラスミドｐＬｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した
後、クレノウフラグメントで処理し、平滑末端とし、Ｂ
ｇｌＩＩリンカー（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’）を
導入し、得られたプラスミドをｐＬｇと命名した。同様
にしてｐＥｍのＭｌｕＩ部位にもＢｇｌＩＩリンカーを
導入し、得られたプラスミドをｐＥと命名した。
６、７、８、９、１０参照） プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＤｒａＩで消化し、Ｘ
ｈｏＩリンカー（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’）を導
入し、得られたプラスミドをｐＵＣ１８Ｘと命名した。
このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで
消化し、この部位に配列番号４の塩基配列で表わされる
合成プロモーターの両端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳ
ｐｈＩとで切断されたＤＮＡ断片と連結可能な制限酵素
ＭｌｕＩの認識配列を有する図３で表わされるＤＮＡ断
片（以下、合成ＤＮＡという）を導入し、ｐＵＣ１８Ｍ
ｌｕＩを構築した。このプラスミドを更に、制限酵素Ｓ
ｐｈＩとＸｂａＩで消化した後、クレノウフラグメント
で処理し、リガーゼで連結して得られたプラスミドをｐ
ＵＣ１８ＭＫと命名した。前記（１）で構築したｐＵＣ
１８−ＬＥを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化
した後、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離し約５
０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＵＣ１８ＭＫを制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化し、前記５０ｂｐ
のＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドをｐＬｈと
命名した。このプラスミドにはＬプロモーターが含まれ
ている。また、ｐＵＣ１８−ＬＥを制限酵素ＭｌｕＩと
ＸｈｏＩで消化して得られる約１．２Ｋｂの初期プロモ
ーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８ＭＫを制限酵素
ＭｌｕＩとＸｈｏＩで消化して得られる約２．０Ｋｂの
ＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離
し、回収した。これらの断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、プラスミドｐＥｍを構築した。このプラ
スミドにはＥプロモーターが含まれている。つづいてプ
ラスミドｐＬｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した
後、クレノウフラグメントで処理し、平滑末端とし、Ｂ
ｇｌＩＩリンカー（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’）を
導入し、得られたプラスミドをｐＬｇと命名した。同様
にしてｐＥｍのＭｌｕＩ部位にもＢｇｌＩＩリンカーを
導入し、得られたプラスミドをｐＥと命名した。
【００１７】ｐＬｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩと
で消化し、アガロースゲル電気泳動により、Ｌプロモー
ターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この断片と、
ｐＬｇを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、回収したＬプロモ
ーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、ｐ２Ｌｈを構築した。このプラスミドにはＬ
プロモーターが二つ含まれている。同様にしてｐＬｇを
制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して、アガロース
ゲル電気泳動により、Ｌプロモーターを含む１．６Ｋｂ
の断片を回収した。この断片と、ｐＬｇを制限酵素Ｘｈ
ｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、アガロースゲル電気泳動
により分離し回収した１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｌｇと命
名した。このプラスミドにはＬプロモーターが二つ含ま
れている。また、ｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ
で消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｅ
プロモーターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この
断片とｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化し
て、アガロースゲル電気泳動により分離し回収したＥプ
ロモーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｅと命名し
た。このプラスミドには２つのＥプロモーターが含まれ
ている。さらに、ｐ２Ｌｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍ
ＨＩで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離
し、Ｌプロモーター二つを含む１．６Ｋｂの断片を回収
した。この断片とｐ２Ｅを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩ
Ｉで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、
回収したＥプロモーター二つを含む１．２Ｋｂの断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得られたプラスミドを
ｐ２Ｌ２Ｅｈと命名した。このプラスミドには、二つの
Ｌプロモーターと二つのＥプロモーター（以下、２Ｌ２
Ｅプロモーターという；配列番号１５参照）が含まれて
いる。
で消化し、アガロースゲル電気泳動により、Ｌプロモー
ターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この断片と、
ｐＬｇを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、回収したＬプロモ
ーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、ｐ２Ｌｈを構築した。このプラスミドにはＬ
プロモーターが二つ含まれている。同様にしてｐＬｇを
制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して、アガロース
ゲル電気泳動により、Ｌプロモーターを含む１．６Ｋｂ
の断片を回収した。この断片と、ｐＬｇを制限酵素Ｘｈ
ｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、アガロースゲル電気泳動
により分離し回収した１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｌｇと命
名した。このプラスミドにはＬプロモーターが二つ含ま
れている。また、ｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ
で消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｅ
プロモーターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この
断片とｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化し
て、アガロースゲル電気泳動により分離し回収したＥプ
ロモーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｅと命名し
た。このプラスミドには２つのＥプロモーターが含まれ
ている。さらに、ｐ２Ｌｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍ
ＨＩで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離
し、Ｌプロモーター二つを含む１．６Ｋｂの断片を回収
した。この断片とｐ２Ｅを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩ
Ｉで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、
回収したＥプロモーター二つを含む１．２Ｋｂの断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得られたプラスミドを
ｐ２Ｌ２Ｅｈと命名した。このプラスミドには、二つの
Ｌプロモーターと二つのＥプロモーター（以下、２Ｌ２
Ｅプロモーターという；配列番号１５参照）が含まれて
いる。
【００１８】実施例２ ＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
Ａを含む組み換えベクターｐＮＺ９９２９の構築（図１
１、１２、１３、１４、１５参照） （１）第一の組み換えベクターの構築 ＡＰＶの増殖に非必須な領域（約７．３ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ断片）をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に組み込んだプ
ラスミドｐＮＺ１３３（特開平１−１６８２７９号）の
ＡＰＶ・ＤＮＡ断片をさらに切り縮めた約２．７Ｋｂの
ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクレノウフラグメント処
理した約５．４ｂｐのＤＮＡ断片とリガーゼで連結し、
プラスミドｐＮＺ１３３Ｓを構築した。ｐＮＺ１３３Ｓ
は、常法でコンピーテントな大腸菌を形質転換し、形質
転換された大腸菌を培養して保存した。使用する際に
は、形質転換された大腸菌から常法で抽出・精製して、
用いた（以下、新しくプラスミドを構築した場合は、同
様の処理をした）。次に、ｐＮＺ１３３ＳのＥｃｏＲＶ
部位にｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩマルチ
クローニングサイトを挿入して、約５．４ｂｐのプラス
ミドｐＮＺ１３３ＳＬを構築した。続いて実施例１
（１）で構築したプラスミドｐＵＣ１８−ＬＥを制限酵
素ＨｉｎｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し合成プロモー
ターを得た。ｐＮＺ１３３ＳＬを制限酵素ＨｉｎｃＩＩ
とＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、挿入し、約４．５Ｋｂ
のＮＺ１３３ＳＬ−Ｐを構築した。
Ａを含む組み換えベクターｐＮＺ９９２９の構築（図１
１、１２、１３、１４、１５参照） （１）第一の組み換えベクターの構築 ＡＰＶの増殖に非必須な領域（約７．３ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ断片）をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に組み込んだプ
ラスミドｐＮＺ１３３（特開平１−１６８２７９号）の
ＡＰＶ・ＤＮＡ断片をさらに切り縮めた約２．７Ｋｂの
ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクレノウフラグメント処
理した約５．４ｂｐのＤＮＡ断片とリガーゼで連結し、
プラスミドｐＮＺ１３３Ｓを構築した。ｐＮＺ１３３Ｓ
は、常法でコンピーテントな大腸菌を形質転換し、形質
転換された大腸菌を培養して保存した。使用する際に
は、形質転換された大腸菌から常法で抽出・精製して、
用いた（以下、新しくプラスミドを構築した場合は、同
様の処理をした）。次に、ｐＮＺ１３３ＳのＥｃｏＲＶ
部位にｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩマルチ
クローニングサイトを挿入して、約５．４ｂｐのプラス
ミドｐＮＺ１３３ＳＬを構築した。続いて実施例１
（１）で構築したプラスミドｐＵＣ１８−ＬＥを制限酵
素ＨｉｎｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し合成プロモー
ターを得た。ｐＮＺ１３３ＳＬを制限酵素ＨｉｎｃＩＩ
とＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、挿入し、約４．５Ｋｂ
のＮＺ１３３ＳＬ−Ｐを構築した。
【００１９】（２）ＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮＡを
含むハイブリッドプラスミドの作製 大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研菌寄１２４２２号）か
ら、常法によって抽出できるＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子
ＤＮＡを有する約６．０ｂｐのプラスミドｐＩＢＤＶを
ＰｖｕＩで消化後、このＤＮＡ断片を接着末端をＤＮＡ
ポリメレースにより平滑末端とした。さらに、このＤＮ
Ａ断片をＫｐｎＩで消化し、これを１．５％アガロース
電気泳動に供した。約３．２ｂｐのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
ＡのＫｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片をアガロースゲルより抽出
し、エタノール沈澱により、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮＡのＫ
ｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片を回収した。先に構築したｐＮＺ
１３３ＳＬ−ＰをＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩで消化した
後、フェノール・クロロホルム処理で抽出し、エタノー
ル沈澱により約５．４Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３Ｓ
Ｌ−Ｐを回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐ
ＤＮＡと、約３．３ＫｂのＳｅｇＡＤＮＡのＫｐｎＩ−
ＰｖｕＩ断片をライゲーションし、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
Ａを含む約８．７ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ
１３３ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡを構築した。
含むハイブリッドプラスミドの作製 大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研菌寄１２４２２号）か
ら、常法によって抽出できるＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子
ＤＮＡを有する約６．０ｂｐのプラスミドｐＩＢＤＶを
ＰｖｕＩで消化後、このＤＮＡ断片を接着末端をＤＮＡ
ポリメレースにより平滑末端とした。さらに、このＤＮ
Ａ断片をＫｐｎＩで消化し、これを１．５％アガロース
電気泳動に供した。約３．２ｂｐのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
ＡのＫｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片をアガロースゲルより抽出
し、エタノール沈澱により、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮＡのＫ
ｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片を回収した。先に構築したｐＮＺ
１３３ＳＬ−ＰをＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩで消化した
後、フェノール・クロロホルム処理で抽出し、エタノー
ル沈澱により約５．４Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３Ｓ
Ｌ−Ｐを回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐ
ＤＮＡと、約３．３ＫｂのＳｅｇＡＤＮＡのＫｐｎＩ−
ＰｖｕＩ断片をライゲーションし、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
Ａを含む約８．７ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ
１３３ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡを構築した。
【００２０】（３）マーカー遺伝子の導入 ｐＭＡ００１（Ｓｈｉｒａｋａｗａら、Ｇｅｎｅ，２
８，第１２７頁，１９８４年）をＢａｍＨＩで消化後、
約３．３Ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を回収し
た。一方、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩ消化後、フェノール
・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱により回収し、
上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とライゲー
ションし、約６．０Ｋｂのハイブリッドプラスミッドｐ
ＮＺ６６を構築した。ハイブリッドプラスミドｐＮＺ６
６をＨｉｎｄＩＩＩで完全消化した後、ＢａｍＨＩで部
分消化し、フェノール・クロロホルム処理で抽出後、エ
タノール沈澱により約６．０Ｋｂの開裂されたｐＮＺ６
６を回収した。配列番号５で表される弱いプロモーター
活性を有する１７ｂｐのＦＰＶ由来の配列を含むＤＮＡ
断片の両端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで
切断された断片と連結可能な配列を有する図４で表され
るＤＮＡ断片と開裂されたｐＮＺ６６とライゲーション
し、約６．０ｋｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６
−Ｐを構築した。
８，第１２７頁，１９８４年）をＢａｍＨＩで消化後、
約３．３Ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を回収し
た。一方、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩ消化後、フェノール
・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱により回収し、
上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とライゲー
ションし、約６．０Ｋｂのハイブリッドプラスミッドｐ
ＮＺ６６を構築した。ハイブリッドプラスミドｐＮＺ６
６をＨｉｎｄＩＩＩで完全消化した後、ＢａｍＨＩで部
分消化し、フェノール・クロロホルム処理で抽出後、エ
タノール沈澱により約６．０Ｋｂの開裂されたｐＮＺ６
６を回収した。配列番号５で表される弱いプロモーター
活性を有する１７ｂｐのＦＰＶ由来の配列を含むＤＮＡ
断片の両端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで
切断された断片と連結可能な配列を有する図４で表され
るＤＮＡ断片と開裂されたｐＮＺ６６とライゲーション
し、約６．０ｋｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６
−Ｐを構築した。
【００２１】次にハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６−
ＰをＫｐｎＩで消化した後、フェノール・クロロホルム
処理で抽出し、エタノール沈澱により開裂されたｐＮＺ
６６−Ｐを回収した。開裂されたｐＮＺ６６−Ｐと配列
番号６に示すポックスウイルスの初期転写終結シグナル
（ＴＴ）を含むＤＮＡ断片の両端に制限酵素ＫｐｎＩで
切断したＤＮＡ断片と連結可能な配列を有する図５で表
わされるＤＮＡ断片とをライゲーションし、約６．０Ｋ
ｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６−ＰＴを構築し
た。上記（２）で構築したハイブリッドプラスミドｐＮ
Ｚ１３３ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡをＳａｃＩで消化した後、
フェノール・クロロホルム処理で抽出し、エタノール沈
澱により、約３．３Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ
−Ｐを回収した。またｐＮＺ６６−ＰＴをＳａｃＩで部
分消化後、これを１．５％アガロース電気泳動に供し
た。約３．３ＫｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより抽
出し、エタノール沈澱により、Ｐ１７−ｌａｃＺ−ＴＴ
断片を回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐと上
記のＰ１７−ｌａｃＺ−ＴＴ断片をライゲーションし、
約１２ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ９９２９を
構築した。
ＰをＫｐｎＩで消化した後、フェノール・クロロホルム
処理で抽出し、エタノール沈澱により開裂されたｐＮＺ
６６−Ｐを回収した。開裂されたｐＮＺ６６−Ｐと配列
番号６に示すポックスウイルスの初期転写終結シグナル
（ＴＴ）を含むＤＮＡ断片の両端に制限酵素ＫｐｎＩで
切断したＤＮＡ断片と連結可能な配列を有する図５で表
わされるＤＮＡ断片とをライゲーションし、約６．０Ｋ
ｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６−ＰＴを構築し
た。上記（２）で構築したハイブリッドプラスミドｐＮ
Ｚ１３３ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡをＳａｃＩで消化した後、
フェノール・クロロホルム処理で抽出し、エタノール沈
澱により、約３．３Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ
−Ｐを回収した。またｐＮＺ６６−ＰＴをＳａｃＩで部
分消化後、これを１．５％アガロース電気泳動に供し
た。約３．３ＫｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより抽
出し、エタノール沈澱により、Ｐ１７−ｌａｃＺ−ＴＴ
断片を回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐと上
記のＰ１７−ｌａｃＺ−ＴＴ断片をライゲーションし、
約１２ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ９９２９を
構築した。
【００２２】実施例３ 組み合わせプロモーターを有す
る組み換えＡＰＶの構築（図１６、１７、１８、１９参
照） （１）組み換え用プラスミドの構築 構築したプラスミドｐ２Ｌ２Ｅｈを制限酵素ＫｐｎＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、各組み合わせプロモーター断
片を回収した。これらの断片を、それぞれｐＮＺ９９２
９を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得ら
れた約８．５Ｋｂの断片とリガーゼにより連結し、得ら
れたプラスミドをそれぞれｐＮＺ２９／２Ｌ２Ｅと命名
した。これらのプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
した後、クレノウフラグメント処理で平滑末端とした。
さらにこれらの制限酵素ＫｐｎＩで消化し、アガロース
ゲル電気泳動により約８Ｋｂの断片を回収した。一方、
ＳｅｇＡのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＩＢＤＶを制
限酵素ＰｖｕＩとＫｐｎＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動により約３．５ＫｂのＳｅｇＡを有するｃＤＮＡ
断片を回収した。この断片を、先に構築した組み合わせ
プロモーターを含むそれぞれのＤＮＡ断片と混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結し、組み換え用プラスミドを構
築した。得られたプラスミドをｐＮＺ９９２９／２Ｌ２
Ｅと命名した。
る組み換えＡＰＶの構築（図１６、１７、１８、１９参
照） （１）組み換え用プラスミドの構築 構築したプラスミドｐ２Ｌ２Ｅｈを制限酵素ＫｐｎＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、各組み合わせプロモーター断
片を回収した。これらの断片を、それぞれｐＮＺ９９２
９を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得ら
れた約８．５Ｋｂの断片とリガーゼにより連結し、得ら
れたプラスミドをそれぞれｐＮＺ２９／２Ｌ２Ｅと命名
した。これらのプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
した後、クレノウフラグメント処理で平滑末端とした。
さらにこれらの制限酵素ＫｐｎＩで消化し、アガロース
ゲル電気泳動により約８Ｋｂの断片を回収した。一方、
ＳｅｇＡのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＩＢＤＶを制
限酵素ＰｖｕＩとＫｐｎＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動により約３．５ＫｂのＳｅｇＡを有するｃＤＮＡ
断片を回収した。この断片を、先に構築した組み合わせ
プロモーターを含むそれぞれのＤＮＡ断片と混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結し、組み換え用プラスミドを構
築した。得られたプラスミドをｐＮＺ９９２９／２Ｌ２
Ｅと命名した。
【００２３】（２）ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質のみを
発現する組み換えベクターｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｌ、
ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓの構築 ＤＮＡ合成機Ｇｅｎｅｔ Ａ−１１（日本ゼオン社製）
で配列番号７、８および９に示す塩基配列のＤＮＡをプ
ライマーとして合成した。次に実施例２で得たｐＮＺ９
９２９をテンプレートとして利用し、合成したＤＮＡを
プライマーにＰＣＲを行った。反応組成はテンプレート
ＤＮＡ２０ピコグラムを含む水溶液４５マイクロリット
ルに５マイクロリットルの１０倍濃縮ＰＣＲ反応バッフ
ァー液（宝酒造社製）、１マイクロリットルの１００ユ
ニットタックポリメラーゼ及び２０ピコモルの各プライ
マーを加えた。配列番号７と９のプライマーをＳｅｇＡ
のアミノ酸配列で第１番目〜第４５３番目までのアミノ
酸配列（以下、ＶＰ２Ｓ）に対応する塩基配列を有する
ＤＮＡ断片をクローニングするために使用した。また、
配列番号７と８のプライマーをＳｅｇＡのアミノ酸配列
で第１番目から第５０３番目までのアミノ酸配列（以
下、ＶＰ２Ｌという）に対応する塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片をクローニングするために使用した。反応温度
は、変性９５℃１分間、アニール５５℃２分間、ポリメ
ラーゼ反応７０℃３分間をパーキングエルマーシータス
社製のサーマルサイクラー４８０で制御し、３０サイク
ル行った。得られた断片を０．８％アガロースゲル電気
泳動を行った後、回収し、制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌＩ
で消化したそれぞれの断片と、先に得たｐＮＺ９９２９
／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌＩとで消化した
断片とをＴ４リガーゼＩで結合し、得られたプラスミド
をそれぞれｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ９９２９
／ＶＰ２Ｌと命名した。
発現する組み換えベクターｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｌ、
ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓの構築 ＤＮＡ合成機Ｇｅｎｅｔ Ａ−１１（日本ゼオン社製）
で配列番号７、８および９に示す塩基配列のＤＮＡをプ
ライマーとして合成した。次に実施例２で得たｐＮＺ９
９２９をテンプレートとして利用し、合成したＤＮＡを
プライマーにＰＣＲを行った。反応組成はテンプレート
ＤＮＡ２０ピコグラムを含む水溶液４５マイクロリット
ルに５マイクロリットルの１０倍濃縮ＰＣＲ反応バッフ
ァー液（宝酒造社製）、１マイクロリットルの１００ユ
ニットタックポリメラーゼ及び２０ピコモルの各プライ
マーを加えた。配列番号７と９のプライマーをＳｅｇＡ
のアミノ酸配列で第１番目〜第４５３番目までのアミノ
酸配列（以下、ＶＰ２Ｓ）に対応する塩基配列を有する
ＤＮＡ断片をクローニングするために使用した。また、
配列番号７と８のプライマーをＳｅｇＡのアミノ酸配列
で第１番目から第５０３番目までのアミノ酸配列（以
下、ＶＰ２Ｌという）に対応する塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片をクローニングするために使用した。反応温度
は、変性９５℃１分間、アニール５５℃２分間、ポリメ
ラーゼ反応７０℃３分間をパーキングエルマーシータス
社製のサーマルサイクラー４８０で制御し、３０サイク
ル行った。得られた断片を０．８％アガロースゲル電気
泳動を行った後、回収し、制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌＩ
で消化したそれぞれの断片と、先に得たｐＮＺ９９２９
／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌＩとで消化した
断片とをＴ４リガーゼＩで結合し、得られたプラスミド
をそれぞれｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ９９２９
／ＶＰ２Ｌと命名した。
【００２４】（３）ＩＢＤＶのＶＰ２とＶＰ３の融合タ
ンパク質を発現する組み換えベクターｐＮＺ９９２９／
ＶＰ２＝３の構築 前記（２）と同様にＤＮＡ合成機ＧｅｎｅｔＡ−ＩＩで
配列番号１１、１２、１３及び１４に示す塩基配列のＤ
ＮＡをプライマーとして合成した。次に実施例２で得た
ｐＮＺ９９２９をテンプレートとして利用し、合成した
プライマーにＰＣＲを行った。反応組成及び条件は、実
施例３（２）と同様とした。配列番号１１と１２のプラ
イマーでＶＰ２ＤＮＡのコード領域の一部、配列番号１
３と１４のプライマーでＶＰ３タンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部をそれぞれ増幅し、前者を制限酵素Ｓ
ｐｅＩとＫｐｎＩ、後者を制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩ
とで消化し、その後、１．５％アガロースゲル電気泳動
を行い、バンドを回収して精製した。前記（２）で得た
ｐＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌ
Ｉとで消化し、得られたＤＮＡ断片の内、１１ｋｂのも
のをアガロース電気泳動で分離して、回収した。これと
ＰＣＲで増幅した２本のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼで結合し、プラスミドｐＮＺ９９２９／ｄＮを構築し
た。更にｐＮ９９２９／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩで
消化したＤＮＡ断片の内、ＳｅｇＡのポリプロテインの
Ｎ末端をコードする領域を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動後、回収し、ｐＮＺ９９２９／
ｄＮを制限酵素ＳｐｅＩで消化したものとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合した。構築したプラスミドをＫｐｎＩとＰ
ｓｔＩとで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、Ｓ
ｅｇＡのポリプロテインのＮ末端側が正しく連結された
プラスミドを選択して、得られたプラスミドをｐＮＺ９
９２９／ＶＰ２＝３と命名した。
ンパク質を発現する組み換えベクターｐＮＺ９９２９／
ＶＰ２＝３の構築 前記（２）と同様にＤＮＡ合成機ＧｅｎｅｔＡ−ＩＩで
配列番号１１、１２、１３及び１４に示す塩基配列のＤ
ＮＡをプライマーとして合成した。次に実施例２で得た
ｐＮＺ９９２９をテンプレートとして利用し、合成した
プライマーにＰＣＲを行った。反応組成及び条件は、実
施例３（２）と同様とした。配列番号１１と１２のプラ
イマーでＶＰ２ＤＮＡのコード領域の一部、配列番号１
３と１４のプライマーでＶＰ３タンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部をそれぞれ増幅し、前者を制限酵素Ｓ
ｐｅＩとＫｐｎＩ、後者を制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩ
とで消化し、その後、１．５％アガロースゲル電気泳動
を行い、バンドを回収して精製した。前記（２）で得た
ｐＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩとＳａｌ
Ｉとで消化し、得られたＤＮＡ断片の内、１１ｋｂのも
のをアガロース電気泳動で分離して、回収した。これと
ＰＣＲで増幅した２本のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼで結合し、プラスミドｐＮＺ９９２９／ｄＮを構築し
た。更にｐＮ９９２９／２Ｌ２Ｅを制限酵素ＳｐｅＩで
消化したＤＮＡ断片の内、ＳｅｇＡのポリプロテインの
Ｎ末端をコードする領域を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動後、回収し、ｐＮＺ９９２９／
ｄＮを制限酵素ＳｐｅＩで消化したものとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合した。構築したプラスミドをＫｐｎＩとＰ
ｓｔＩとで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、Ｓ
ｅｇＡのポリプロテインのＮ末端側が正しく連結された
プラスミドを選択して、得られたプラスミドをｐＮＺ９
９２９／ＶＰ２＝３と命名した。
【００２５】（４）組み換えウイルスの構築 １×１０6ＰＦＵのＦＰＶのＵＳＤＡ株をＣＥＦ細胞に
感染させ、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで５時
間培養した１×１０7個のＣＥＦ細胞をトリプシン処理
して回収した後、２０μｇの上記（１）、（２）および
（３）で構築した組み換え用プラスミドｐＮＺ９９２９
／２Ｌ２Ｅ、ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ９９２
９／ＶＰ２Ｌ、およびｐＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３をジ
ーンバルサー（バイオラッド社製）を用いて、回収した
細胞に導入した。条件は、２５μＦ、３．０ＫＶ／ｃｍ
で行った。この細胞を３７℃、５％ＣＯ2インキュベー
ターで７２時間培養した後、凍結融解を３回繰り返し、
ウイルス液を調製した。このウイルス液をＤＭＥ培地で
適当に希釈し、直径１００ｍｍの細胞培養用皿中に培養
したＣＥＦ細胞に４００μｌ程度を加え、３７℃、５％
ＣＯ2インキュベーターで２時間培養した後、１％バク
トアガー（バイオラッド社製）を含んだＤＭＥ培地を重
層し、更に５日間、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ
ーで培養した。プラークを確認した後、６００μｇ／ｍ
ｌのブルオギャル（Ｇｌｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）と１％
バクトアガーを含んだＤＭＥ培地を重層し、更に１５時
間、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養し、出
現してきた青いプラークを目的とする組み換え体として
単離した。これを１ｍｌのＤＭＥに懸濁し、これをウイ
ルス液とした。再び直径１００ｍｍの細胞培養用皿中に
培養したＣＥＦ細胞に、ウイルス液を４００μｌを加
え、ウイルス感染させ、これに１％バクトアガーを含ん
だＤＭＥ培地を重積し、５日間５％ＣＯ2インキュベー
ターで培養した。ブルオギャルと１％バクトアガーを含
んだＤＭＥ培地を重層し、再び青く染まるプラークを単
離した。この操作を続けて、すべてのプラークが青く染
まるまで繰り返し、組み換えウイルスを純化した。ｐＮ
Ｚ９９２９／２Ｌ２Ｅから得られる組み換え体をｆＮＺ
９９２９／２Ｌ２Ｅ、ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓから得
られる組み換え体をｆＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ
９９２９／ＶＰ２Ｌから得られる組み換え体をｆＮＺ９
９２９／ＶＰ２Ｌ、およびｐＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３
から得られる組み換え体をｆＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３
と命名した。
感染させ、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで５時
間培養した１×１０7個のＣＥＦ細胞をトリプシン処理
して回収した後、２０μｇの上記（１）、（２）および
（３）で構築した組み換え用プラスミドｐＮＺ９９２９
／２Ｌ２Ｅ、ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ９９２
９／ＶＰ２Ｌ、およびｐＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３をジ
ーンバルサー（バイオラッド社製）を用いて、回収した
細胞に導入した。条件は、２５μＦ、３．０ＫＶ／ｃｍ
で行った。この細胞を３７℃、５％ＣＯ2インキュベー
ターで７２時間培養した後、凍結融解を３回繰り返し、
ウイルス液を調製した。このウイルス液をＤＭＥ培地で
適当に希釈し、直径１００ｍｍの細胞培養用皿中に培養
したＣＥＦ細胞に４００μｌ程度を加え、３７℃、５％
ＣＯ2インキュベーターで２時間培養した後、１％バク
トアガー（バイオラッド社製）を含んだＤＭＥ培地を重
層し、更に５日間、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ
ーで培養した。プラークを確認した後、６００μｇ／ｍ
ｌのブルオギャル（Ｇｌｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）と１％
バクトアガーを含んだＤＭＥ培地を重層し、更に１５時
間、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養し、出
現してきた青いプラークを目的とする組み換え体として
単離した。これを１ｍｌのＤＭＥに懸濁し、これをウイ
ルス液とした。再び直径１００ｍｍの細胞培養用皿中に
培養したＣＥＦ細胞に、ウイルス液を４００μｌを加
え、ウイルス感染させ、これに１％バクトアガーを含ん
だＤＭＥ培地を重積し、５日間５％ＣＯ2インキュベー
ターで培養した。ブルオギャルと１％バクトアガーを含
んだＤＭＥ培地を重層し、再び青く染まるプラークを単
離した。この操作を続けて、すべてのプラークが青く染
まるまで繰り返し、組み換えウイルスを純化した。ｐＮ
Ｚ９９２９／２Ｌ２Ｅから得られる組み換え体をｆＮＺ
９９２９／２Ｌ２Ｅ、ｐＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓから得
られる組み換え体をｆＮＺ９９２９／ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ
９９２９／ＶＰ２Ｌから得られる組み換え体をｆＮＺ９
９２９／ＶＰ２Ｌ、およびｐＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３
から得られる組み換え体をｆＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３
と命名した。
【００２６】実施例４ 組み換えウイルスの鶏接種試験 １週令のＳＰＦ白色レグホン鶏６羽に、実施例３（４）
で構築した組み換えウイルスｆＮＺ９９２９／ＶＰ２
Ｓ、ｆＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３、比較例として組み換
えウイルスｆＮＺ９９２９２Ｌ２ＥとＦＮＺ９９２９／
ＶＰ２Ｌ、および、コントロールとして親株であるＦＰ
ＶのＵＳＤＡ株をそれぞれ４×１０4ＰＦＵづつ翼膜下
に接種した。３週間後、同様の方法で再度同じ組み換え
ウイルスを接種し、２１日後に、それぞれの鶏から２ｍ
ｌづつ採血した。得られた血液を、３５００ｒｐｍ、２
０分間遠心分離機にかけ、上清に分離してくる血清を回
収した。同じ群の鶏から得た血清を等量混合し、テスト
血清とした。９６穴の平底マイクロプレートの各穴に５
０μｌつづ血清を加えていないＤＭＥを加えた。更に４
倍づつに段階希釈し、５６℃、３０分間非動化した検体
の血清を１００ＴＣＩＤ50のＩＢＤＶを含む５０μｌと
ともに加えた後、３７℃、６０分間の中和反応を行っ
た。５％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという）を含む培
地で１ｍｌあたり２×１０5細胞に調製したＣＥＦ細胞
を各穴に５０μｌつづ加え、５％ＣＯ2、３７℃で４日
間培養し、細胞変性効果（以下、ＣＰＥという）を示し
た細胞の存在する穴の数を数え、ＴＣＩＤ50の算出と同
様に５０％中和の血清希釈倍率を求め中和価とした。こ
の実験を３回繰り返して行った結果を表１に示す。
で構築した組み換えウイルスｆＮＺ９９２９／ＶＰ２
Ｓ、ｆＮＺ９９２９／ＶＰ２＝３、比較例として組み換
えウイルスｆＮＺ９９２９２Ｌ２ＥとＦＮＺ９９２９／
ＶＰ２Ｌ、および、コントロールとして親株であるＦＰ
ＶのＵＳＤＡ株をそれぞれ４×１０4ＰＦＵづつ翼膜下
に接種した。３週間後、同様の方法で再度同じ組み換え
ウイルスを接種し、２１日後に、それぞれの鶏から２ｍ
ｌづつ採血した。得られた血液を、３５００ｒｐｍ、２
０分間遠心分離機にかけ、上清に分離してくる血清を回
収した。同じ群の鶏から得た血清を等量混合し、テスト
血清とした。９６穴の平底マイクロプレートの各穴に５
０μｌつづ血清を加えていないＤＭＥを加えた。更に４
倍づつに段階希釈し、５６℃、３０分間非動化した検体
の血清を１００ＴＣＩＤ50のＩＢＤＶを含む５０μｌと
ともに加えた後、３７℃、６０分間の中和反応を行っ
た。５％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという）を含む培
地で１ｍｌあたり２×１０5細胞に調製したＣＥＦ細胞
を各穴に５０μｌつづ加え、５％ＣＯ2、３７℃で４日
間培養し、細胞変性効果（以下、ＣＰＥという）を示し
た細胞の存在する穴の数を数え、ＴＣＩＤ50の算出と同
様に５０％中和の血清希釈倍率を求め中和価とした。こ
の実験を３回繰り返して行った結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】この結果から、本発明の組み換えウイルス
ｆＮＺ９９２９／ＶＰ２ＳおよびｆＮＺ９９２９／ＶＰ
２＝３を接種した群の中和価は、本発明のウイルスより
長いＩＢＤＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡを有する比較例の
組み換えウイルスｆＮＺ９９２９／ＶＰＬおよびＳｅｇ
Ａ全長を有する組み換え体ｆＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅよ
り高い中和抗体価を誘導することが判った。
ｆＮＺ９９２９／ＶＰ２ＳおよびｆＮＺ９９２９／ＶＰ
２＝３を接種した群の中和価は、本発明のウイルスより
長いＩＢＤＶ由来の遺伝子のｃＤＮＡを有する比較例の
組み換えウイルスｆＮＺ９９２９／ＶＰＬおよびＳｅｇ
Ａ全長を有する組み換え体ｆＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅよ
り高い中和抗体価を誘導することが判った。
【００２９】実施例５ 組み換えウイルスの鶏接種・攻
撃試験 上記方法によって構築された組み換えウイルスｆＮＺ９
９２９／ＶＰ２Ｓ、比較例として組み換えウイルスｆＮ
Ｚ９９２９を、それぞれ１週令のＳＰＦ白色レグホン鶏
の頸部皮下に１×１０7ＰＦＵを接種した。対照群は組
み換えウイルス非接種の非免疫群、および親株であるＦ
ＰＶのＵＳＤＡ株を頸部皮下に１×１０7ＰＦＵを接種
したＵＳＤＡ株接種群とした。攻撃用のウイルス液とし
て、ＩＢＤＶ超強毒株ＯＫＹＭ（岡山）株感染鶏のファ
ブリキウス嚢の２０％乳剤（力価＝約１０5ＬＤ50）を
使用した。組み換えウイルスによる（免疫）接種から２
４日後、各鶏の採血し、続いて攻撃用のウイルス液を
０．３ｍｌを経口投与することにより攻撃し、４日間、
臨床症状と死亡率を記録した。死亡鶏については死亡確
認後に、生存鶏については、採血後、剖検を行った。同
時に、非免疫非攻撃群も併せて観察した。
撃試験 上記方法によって構築された組み換えウイルスｆＮＺ９
９２９／ＶＰ２Ｓ、比較例として組み換えウイルスｆＮ
Ｚ９９２９を、それぞれ１週令のＳＰＦ白色レグホン鶏
の頸部皮下に１×１０7ＰＦＵを接種した。対照群は組
み換えウイルス非接種の非免疫群、および親株であるＦ
ＰＶのＵＳＤＡ株を頸部皮下に１×１０7ＰＦＵを接種
したＵＳＤＡ株接種群とした。攻撃用のウイルス液とし
て、ＩＢＤＶ超強毒株ＯＫＹＭ（岡山）株感染鶏のファ
ブリキウス嚢の２０％乳剤（力価＝約１０5ＬＤ50）を
使用した。組み換えウイルスによる（免疫）接種から２
４日後、各鶏の採血し、続いて攻撃用のウイルス液を
０．３ｍｌを経口投与することにより攻撃し、４日間、
臨床症状と死亡率を記録した。死亡鶏については死亡確
認後に、生存鶏については、採血後、剖検を行った。同
時に、非免疫非攻撃群も併せて観察した。
【００３０】この結果、本発明の組み換えウイルスｆＮ
Ｚ９９２９／ＶＰ２Ｓ接種群（１２羽）およびＳｅｇＡ
全長を有する組み換えウイルスｆＮＺ９９２９接種群
（１０羽）は、いずれも死亡は認められず、非免疫群
（１２羽）では５羽、ＵＳＤＡ株接種群（６羽）では３
羽の死亡が確認された。また、対象群で生存していた鶏
については沈鬱や羽毛の逆立ちなどのＩＢＤＶ感染によ
る臨床症状が認められたのに対して、ｆＮＺ９９２９／
ＶＰ２Ｓ接種群およびｆＮＺ９９２９接種群では殆ど臨
床症状は認められなかった。なお、コントロールである
非免疫非攻撃群（７羽）での死亡は認められなかった。
しかしながら、鶏のファブリキウス嚢の病変について観
察すると、非免疫群やＵＤＳＡ株接種群では出血等の激
しい病変が認められ、ｆＮＺ９９２９接種群では黄変な
ど従来型ＩＢＤＶ感染に見られる軽度の症状が認められ
たのに対して、本発明の組み換えウイルスｆＮＺ９９２
９／ＶＰ２Ｓ接種群ではファブリキウス嚢の外観に何等
以上は認められなかった。この結果から、本発明の組み
換えウイルスは、ＩＢＤＶ感染に対して高い生存率を示
すことが判った。
Ｚ９９２９／ＶＰ２Ｓ接種群（１２羽）およびＳｅｇＡ
全長を有する組み換えウイルスｆＮＺ９９２９接種群
（１０羽）は、いずれも死亡は認められず、非免疫群
（１２羽）では５羽、ＵＳＤＡ株接種群（６羽）では３
羽の死亡が確認された。また、対象群で生存していた鶏
については沈鬱や羽毛の逆立ちなどのＩＢＤＶ感染によ
る臨床症状が認められたのに対して、ｆＮＺ９９２９／
ＶＰ２Ｓ接種群およびｆＮＺ９９２９接種群では殆ど臨
床症状は認められなかった。なお、コントロールである
非免疫非攻撃群（７羽）での死亡は認められなかった。
しかしながら、鶏のファブリキウス嚢の病変について観
察すると、非免疫群やＵＤＳＡ株接種群では出血等の激
しい病変が認められ、ｆＮＺ９９２９接種群では黄変な
ど従来型ＩＢＤＶ感染に見られる軽度の症状が認められ
たのに対して、本発明の組み換えウイルスｆＮＺ９９２
９／ＶＰ２Ｓ接種群ではファブリキウス嚢の外観に何等
以上は認められなかった。この結果から、本発明の組み
換えウイルスは、ＩＢＤＶ感染に対して高い生存率を示
すことが判った。
【００３１】
【発明の効果】かくして本発明によれば、ポックスウイ
ルスの増殖に非必須なゲノム領域にＩＢＤＶ由来の抗原
コードｃＤＮＡがプロモーター機能を有するＤＮＡと共
に発現可能な形で組み込まれた組み換えポックスウイル
スが得られ、この組み換えウイルスは安定で有効な家禽
用生ワクチンとして利用できる。
ルスの増殖に非必須なゲノム領域にＩＢＤＶ由来の抗原
コードｃＤＮＡがプロモーター機能を有するＤＮＡと共
に発現可能な形で組み込まれた組み換えポックスウイル
スが得られ、この組み換えウイルスは安定で有効な家禽
用生ワクチンとして利用できる。
【００３２】
配列番号：１ 配列の長さ：1362 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源 生物名：伝染性ファブキウス嚢病ウイルス 株名：ＧＢＦ−１Ｅ 配列 ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC CAA CAG ATT GTT CCG TTC ATA CGC 48 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 5 10 15 AGC CTT CTG ATG CCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC ATT CCG GAC GAC ACC 96 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 CTG GAG AAG CAC ACT CTC AGG TCA GAG ACC TCG ACC TAC AAT TTG ACT 144 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 GTG GGG GAC ACA GGG TCA GGG CTA ATT GTC TTT TTC CCT GCA TTC CCT 192 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 GGC TCA ATT GTG GGT GCT CAC TAC ACA CTG CAG AGC AAT GGG AAC TAC 240 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 AAG TTC GAT CAG ATG CTC CTG ACT GCC CAG AAC CTA CCG GCC AGT TAC 288 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 AAC TAC TGC AGG CTA GTG AGT CGG AGT CTC ACA GTG AGG TCA AGC ACA 336 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 CTT CCT GGT GGC GTT TAT GCA CTA AAC GGC ACC ATA AAC GCC GTG ACC 384 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 TTC CAA GGA AGC CTG AGT GAA CTG ACA GAT GTT AGC TAC AAT GGG TTG 432 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 ATG TCT GCA ACA GCC AAC ATC AAC GAC AAA ATT GGG AAT GTC CTA GTA 480 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 GGG GAG GGG GTC ACC GTC CTC AGC TTA CCC ACA TCA TAT GAI CTT GGG 528 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 TAT GTG AGG CTC GGT GAC CCC ATT CCC GCT ATA GGG CTT GAC CCA AAA 576 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 ATG GTA GCC ACA TGT GAC AGC AGT GAC AGG CCC AGA GTC TAC ACC ATA 624 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 ACT GCA GCC GAT GAT TAC CAA TTC TCA TCA CAG TAC CAA CCA GGT GGG 672 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly 210 215 220 GTA ACA ATC ACA CTG TTC TCT GCC AAC ATT GAT GCT ATC ACA AGC CTC 720 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 AGC GTT GGG GGA GAG CTC GTA TTT CAT ACA AGC GTC CAA AGC CTT GTA 768 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe His Thr Ser Val Gln Ser Leu Val 245 250 255 CTG GGC GCC ACC ATC TAC CTT ATA GGC TTT GAT GGG TCT ACG GTA ATC 816 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Ser Thr Val Ile 260 265 270 ACC AGA GCT GTG GCC GCA GAC AAT GGG CTG ACG GCC GGC ACC GAC AAT 864 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn 275 280 285 CTT ATG CCA TTC AAT CTT GTG ATT CCA ACC AAC GAG ATA ACC CAG CCA 912 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Ser Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 29O 295 300 ATC ACA TCC ATC AAA CTG GAG ATA GTG ACC TCC AAA AGT GGT GGT CAG 960 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 GCA GGG GAT CAG ATG TCA TGG TCG GCA AGT GGG AGC CTA GCA GTG ACG 1008 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 ATC CAT GGT GGC AAC TAT CCA GGG GCC CTC CGT CCC GTC ACA CTA GTA 1056 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 GCC TAC GAA AGA GTG GCA ACA GGA TCT GTC GTT ACG GTC GCT GGG GTG 1104 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 AGC AAC TTC GAG CTG ATC CCA AAT CCT GAA CTA GCA AAG AAC CTG GTT 1152 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 ACA GAG TAC GGC CGA TTT GAC CCA GGA CCC ATG AAC TAC ACA AAA TTG 1200 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Pro Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 ATA CTG AGT GAG AGG GAC CGT CTT GGC ATC AAG ACC GTC TGG CCA ACA 1248 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 AGG GAG TAC ACT GAC TTT CGT GAA TAC TTC ATG GAG GTG GCC GAC CTC 1296 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 AAC TCT CCC CTG AAG ATT GCA GGA GCA TTC GGC TTC AAA GAC ATA ATC 1344 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 AGG GCC ATA AGG AGG TGA 1362 Arg Ala Ile Arg Arg 450
【００３３】
配列番号：2 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーター 配列 TAAAAATTGA AAAACTATTC TAATTTATTG CACTCG 36
【００３４】
配列番号：3 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーター 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTG GCATATAAAT AATAAATACA ATAATTAATT A 51
【００３５】
配列番号：4 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTTTTATAA AAAT 14
【００３６】
配列番号：5 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーター 配列 TGAGCTCGGA TCGTTCAAA AATAATATA 29
【００３７】
配列番号：6 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTTTTATAA AAAT 14
【００３８】
配列番号：7 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCACACTAG TAGCCTAC 19
【００３９】
配列番号：8 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGGTCGACT CATGAGGCAG CTCTTGC 27
【００４０】
配列番号：9 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGTCGACTC ACCTCCTTAT GGC 23
【００４１】
配列番号：10 配列の長さ：2391 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源 生物名：伝染性ファブキウス嚢病ウイルス 株名：ＧＢＦ−１Ｅ 配列 ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC CAA CAG ATT GTT CCG TTC ATA CGG 48 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 5 10 15 AGC CTT CTG ATG CCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC ATT CCG GAC GAC ACC 96 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 CTG GAG AAG CAC ACT CTC AGG TCA GAG ACC TCG ACC TAC AAT TTG ACT 144 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 GTG GGG GAC ACA GGG TCA GGG CTA ATT GTC TTT TTC CCT GGA TTC CCT 192 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 GGC TCA ATT GTG GGT GCT CAC TAC ACA CTG CAG AGC AAT GGG AAC TAC 240 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 AAG TTC GAT CAG ATG CTC CTG ACT GCC CAG AAC CTA CCG GCC AGT TAC 288 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 AAC TAC TGC AGG CTA GTG AGT CGG AGT CTC ACA GTG AGG TCA AGC ACA 336 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 CTT CCT GGT GGC GTT TAT GCA CTA AAC GGC ACC ATA AAC GCC GTG ACC 384 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 TTC CAA GGA AGC CTG AGT GAA CTG ACA GAT GTT AGC TAC AAT GGG TTG 432 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 ATG TCT GCA ACA GCC AAC ATC AAC GAC AAA ATT GGG AAT GTC CTA GTA 480 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 GGG GAG GGG GTC ACC GTC CTC AGC TTA CCC ACA TCA TAT GAT CTT GGG 528 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 TAT GTG AGG CTC GGT GAC CCC ATT CCC GCT ATA GGG CTT GAC CCA AAA 576 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 ATG GTA GCC ACA TGT GAC AGC AGT GAC AGG CCC AGA GTC TAC ACC ATA 624 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 ACT GCA GCC GAT GAT TAC CAA TTC TCA TCA CAG TAC CAA CCA GGT GGG 672 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly 210 215 220 GTA ACA ATC ACA CTG TTC TCT GCC AAC ATT GAT GCT ATC ACA AGC CTC 720 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 AGC GTT GGG GGA GAG CTC GTA TTT CAT ACA AGC GTC CAA AGC CTT GTA 768 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe His Thr Ser Val Gln Ser Leu Val 245 250 255 CTG GGC GCC ACC ATC TAC CTT ATA GGC TTT GAT GGG TCT ACG GTA ATC 816 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Ser Thr Val Ile 260 265 270 ACC AGA GCT GTG GCC GCA GAC AAT GGG CTG ACG GCC GGC ACC GAC AAT 864 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn 275 280 285 CTT ATG CCA TTC AAT CTT GTG ATT CCA ACC AAC GAG ATA ACC CAG CCA 912 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Ser Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 ATC ACA TCC ATC AAA CTG GAG ATA GTG ACC TCC AAA AGT GGT GGT CAG 960 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 GCA GGG GAT CAG ATG TCA TGG TCG GCA AGT GGG AGC CTA GCA GTG ACG 1008 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 ATC CAT GGT GGC AAC TAT CCA GGG GCC CTC CGT CCC GTC ACA CTA GTA 1056 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 GCC TAC GAA AGA GTG GCA ACA GGA TCT GTC GTT ACG GTC GCT GGG GTG 1104 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 AGC AAC TTC GAG CTG ATC CCA AAT CCT GAA CTA GCA AAG AAC CTG GTT 1152 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 ACA GAG TAC GGC CGA TTT GAC CCA GGA CCC ATG AAC TAC ACA AAA TTG 1200 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Pro Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 ATA CTG AGT GAG AGG GAC CGT CTT GGC ATC AAG ACC GTC TGG CCA ACA 1248 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 AGG GAG TAC ACT GAC TTT CGT GAA TAC TTC ATG GAG GTG GCC GAC CTC 1296 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 AAC TCT CCC CTG AAG ATT GCA GGA GCA TTC GGC TTC AAA GAC ATA ATC 1344 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 AGG GCC ATA AGG AGG ATA GCT GTG CCG GTG GTC TCT ACA TTG TTC CCA 1392 Arg Ala Ile Arg Arg IIe Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe Pro 450 455 460 CCT GCC GAT GAG GCA CAG GCT GCT TCA GGA ACT GCT CGA GCC GCG TCA 1440 Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr Leu 465 470 475 480 CTG GGC GAT GAG GCA CAG GCT GCT TCA GGA ACT GCT CGA GCC GCG TCA 1488 Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala Ser 485 490 495 GGA AAA GCA AGA GCT GCC TCA GGC GGT ACC GGC TTC CCT CAC AAT CCG 1536 Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Gly Thr Gly Phe Pro His Asn Pro 500 505 510 CGC GAC TGG GAC AGG CTC CCC TAC CTC AAC CTT CCA TAC CTT CCA CCC 1584 Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro 515 520 525 AAT GCA GGA CGC CAG TAC CAC CTT GCC ATG GCT GCA TCA GAG TTC AAA 1632 Asn Ala GIY Arg Gln Tyr His Leu Ala Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys 530 535 540 GAG ACC CCT GAA CTC GAG AGC GCC GTC AGA GCC ATG GAA GCA GCA GCC 1680 Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala 545 550 555 560 AAC GTG GAC CCA CTA TTC CAA TCG GCA CTC AGT GTG TTC ATG TGG CTG 1728 Asn Val Asp Pro Leu Phe Gln Ser Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu 565 570 575 GAA GAG AAT GGG ATT GTG ACC GAC ATG GCC AAC TTC GCA CTC AGC GAC 1776 Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp 580 585 590 CCG AAC GCC ACT CGG ATG CGA AAT TTT CTT GCA AAC GCA CCA CAA GCA 1824 Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala 595 600 605 GGC AGC AAG TCG CAA AGG GCC AAG TAC GGC ACA GCA GGC TAC GGA GTG 1872 Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val 610 615 620 GAG GCC CGG GGC CCC ACA CCA GAG GAA GCA CAG AGG GCA AAA GAC ACA 1920 Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu Ala Gln Arg Ala Lys Asp Thr 625 630 635 640 CGG ATC TCA AAG AAG ATG GAG ACC ATG GGC ATC TAC TTT GCA ACA CCA 1968 Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro 645 650 655 GAA TGG GTA GCA CTC AAT GGG CAC CGA GGG CCA AGC CCG GCC CAG CTA 2016 Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg Gly Pro Ser Pro Ala Gln Leu 660 665 670 AAG TAC TGG CAG AAC ACA CGA GAA ATA CCG GAC CCA AAC GAG GAC TAT 2064 Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu Ile Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr 675 680 685 CTA GAC TAC GTG CAT GCA GAG AAG AGC CGG TTG GCA TCA GAA GAA CAA 2112 Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln 690 695 700 ATC TTA AAG GCA GCT ACG TCG ATC TAC GGC GCT CCA GGA CAG GCA GAG 2160 Ile Leu Lys Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu 705 710 715 720 CCA CCC CAA GCT TTC ATA GAC GAA GTA GCC AAA GTC TAT GAA ATC AAC 2208 Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val AIa Lys Val Tyr Glu Ile Asn 725 730 735 CAT GGG CGT GGC CCA AAC CAA GAA CAG ATG AAA GAT CTG CTC TTG ACT 2256 His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr 740 745 750 GCG ATG GAG CTG AAG CAT CGC AAT CCC AGG CGG GCT CCA CCA AAG CCC 2304 Ala Met Glu Leu Lys His Arg Asn Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro 755 760 765 AAG CCA AAA CCC AAT GCT CCA ACA CAG AGA CCC CCT GGT CGG CTG GGC 2352 Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly 770 775 780 CGC TGG ATC AGG ACT GTC TCT GAT GAG GAC CTT GAG TGA 2391 Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser Asp Glu Asp Leu Glu 785 790 795
【００４２】
配列番号：11 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCACACTAG TAGCCTAG 18
【００４３】
配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGGTACCG CCTGAGGCAG C 21
【００４４】
配列番号：13 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGGTACCG GCTTCCCCA CAAT 24
【００４５】
配列番号：14 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGTCGACT CACTCAAGGT C 21
【００４６】
配列番号：15 配列の長さ：226 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーター 配列 AGATCTAGCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTGGCATATA AATAATAAAT ACAATAATTA 60 ATTACGCGTG GATCTAGCTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT GGCATATAAA TAATAAATAC 120 AATAATTAAT TACGCGTGGA TCTCGCGTAA AAATTGAAAA ACTATTCTAA TTTATTGCAG 180 GATCTCGCGA AAAATTGAAA AACTATTCTA ATTTATTGCA GGATCC 226
【００４７】
【図１】ＥプロモーターのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
の塩基配列を示した説明図である。
の塩基配列を示した説明図である。
【図２】ＬプロモーターのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
の塩基配列を示した説明図である。
の塩基配列を示した説明図である。
【図３】制限酵素ＭｌｕＩ認識配列を含む合成ＤＮＡを
含むＤＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
含むＤＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
【図４】１７ｂｐのＦＰＶ由来のプロモーターを含むＤ
ＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
ＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
【図５】ポックスウイルスの初期転写終結シグナルを含
むＤＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
むＤＮＡ断片の塩基配列を示した説明図である。
【図６】組み合せプロモーターを有するプラスミドの構
築方法を示した説明図である。
築方法を示した説明図である。
【図７】組み合せプロモーターを有するプラスミドの構
築方法を示した説明図である。
築方法を示した説明図である。
【図８】組み合せプロモーターを有するプラスミドの構
築方法を示した説明図である。
築方法を示した説明図である。
【図９】組み合せプロモーターを有するプラスミドの構
築方法を示した説明図である。
築方法を示した説明図である。
【図１０】組み合せプロモーターを有するプラスミドの
構築方法を示した説明図である。
構築方法を示した説明図である。
【図１１】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１２】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１３】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１４】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１５】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１６】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１７】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１８】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
【図１９】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。
方法を示した説明図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 ポックスウイルスの増殖に非必須なゲノ
ム領域に伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタン
パク質をコードするＤＮＡが組み込まれた組み換えポッ
クスウイルスであって、当該ＤＮＡが、配列番号１記載
の塩基配列の第１番目〜第１３５９番目の塩基配列また
はこれとの相同性が９０％以上である塩基配列を有し、
かつ１２９９〜１４１９塩基対であることを特徴とする
組み換えポックスウイルス。 - 【請求項２】 更に、３’末端に伝染性ファブリキウス
嚢病ウイルス由来の他のタンパク質をコードするＤＮＡ
が付加している請求項１記載の組み換えポックスウイル
ス。 - 【請求項３】 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来
の他のタンパク質をコードするＤＮＡが配列番号１０記
載の塩基配列の第１５２３番目〜第２３８８番目の塩基
配列またはこれとの相同性が９０％以上である塩基配列
である請求項２記載の組み換えポックスウイルス。 - 【請求項４】 配列番号１５記載のプロモーター配列支
配下に、ポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
に伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のタンパク質
をコードするＤＮＡが連結している請求項１、２または
３記載の組み換えポックスウイルス。 - 【請求項５】 ポックスウイルスがアビポックスウイル
スである請求項１、３または４記載の組み換えポックス
ウイルス。 - 【請求項６】 請求項１、２、３、４または５記載の組
み換えポックスウイルスを主成分とする抗伝染性ファブ
リキウス嚢病ウイルス組み換えウイルスワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8023125A JPH08242869A (ja) | 1995-01-13 | 1996-01-16 | 組み換えポックスウイルス及びそれから成るワクチン |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-21249 | 1995-01-13 | ||
| JP2124995 | 1995-01-13 | ||
| JP8023125A JPH08242869A (ja) | 1995-01-13 | 1996-01-16 | 組み換えポックスウイルス及びそれから成るワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242869A true JPH08242869A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=26358282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8023125A Pending JPH08242869A (ja) | 1995-01-13 | 1996-01-16 | 組み換えポックスウイルス及びそれから成るワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08242869A (ja) |
-
1996
- 1996-01-16 JP JP8023125A patent/JPH08242869A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050316 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050803 |