DE69333728T2

DE69333728T2 - Redombinanter Poxvirus als Impfstoff gegen den Virus der Marek-Krankheit.

Info

Publication number: DE69333728T2
Application number: DE69333728T
Authority: DE
Inventors: Enzo Paoletti; Jill Taylor; James Tartaglia; Louis Ross
Original assignee: Virogenetics Corp
Current assignee: Virogenetics Corp
Priority date: 1992-01-13
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2013-01-08
Also published as: WO1993014219A1; EP0623172B1; DE69333728D1; ES2236684T3; EP0623172A4; DK0623172T3; JPH07503843A; ATE286137T1; CA2127700C; AU680609B2; JP3706130B2; AU3435393A; PT623172E; EP0623172A1; CA2127700A1; EP1489165A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Vacciniavirus und Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung rekombinantes Vacciniavirus, dieses Virus exprimiert Genprodukte eines Marek-Virus-Gens und Impfstoffe, die protektive Immunität gegen Marek-Virus-Infektionen schaffen.
Es wird in dieser Anmeldung auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die vollständige Anführung zu diesen Literaturnachweisen findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vor den Ansprüchen. Diese Literaturnachweise beschreiben das Fachgebiet, zu welchem diese Erfindung gehört.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Vacciniavirus, und in letzter Zeit andere Pockenviren, sind für die Insertion und Expression von Fremd-Genen verwendet worden. Das grundlegende Verfahren zur Insertion von Fremd-Genen in lebende infektiöse Pockenviren schließt die Rekombination zwischen Pocken-DNA-Sequenzen, welche ein fremdes genetisches Element in einem Donorplasmid flankieren, und homologe Sequenzen, die im „Rescuing"-Pockenvirus vorhanden sind, ein (Piccini et al., 1987).
Im Speziellen, werden die rekombinanten Pockenviren in zwei im Fachgebiet bekannten Schritten konstruiert, analog zu den Verfahren zur Herstellung synthetischer Rekombinanten des Vacciniavirus, die im U.S.-Patent Nr. 4.603.112 beschrieben sind, die Offenbarung dieses Patentes ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Erstens wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus inseriert werden soll, vorzugsweise ein offener Leserahmen von „Nicht-Pocken"-Ursprung, in ein E. coli- Plasmidkonstrukt platziert, in welches DNA inseriert worden ist, die homolog zu einem Abschnitt der DNA des Pockenvirus ist. Die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, wird gesondert an einen Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbindung wird im Plasmidkonstrukt so positioniert, dass die Promotor-Gen-Verbindung an beiden Enden von DNA flankiert wird, die homolog zu einer DNA-Sequenz ist, die einen Bereich der Pocken-DNA flankiert, die einen nicht-essentiellen Locus enthält. Das daraus resultierende Plasmidkonstrukt wird dann durch Wachstum in E. coli-Bakterien amplifiziert (Clewell, 1972) und isoliert (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982).
Zweitens wird das isolierte Plasmid, welches die DNA-Gensequenz enthält, die inseriert werden soll, in eine Zellkultur transfiziert, z.B. Hühnerembryo-Fibroblasten zusammen mit dem Pockenvirus. Rekombination zwischen homologer Pocken-DNA, jeweils im Plasmid und dem viralen Genom, ergibt ein Pockenvirus, welches durch die Anwesenheit von Fremd-DNA-Sequenzen, in einen nicht-essentiellen Bereich seines Genoms, modifiziert ist. Der Begriff „Fremd"-DNA bezeichnet exogene DNA, besonders DNA von einer „Nicht-Pocken"-Herkunft, welche für Genprodukte codiert, die gewöhnlich nicht von dem Genom hergestellt werden, in welches die exogene DNA platziert ist.
Genetische Rekombination ist im Allgemeinen der Austausch von homologen Abschnitten von DNA zwischen zwei DNA-Strängen. In bestimmten Viren kann RNA die DNA ersetzen. Homologe Abschnitte von Nucleinsäuren sind Abschnitte von Nucleinsäure (DNA oder RNA), welche die gleichen Sequenzen von Nucleotidbasen aufweisen.
Genetische Rekombination kann normalerweise während der Replikation oder der Herstellung von neuen viralen Genomen innerhalb der infizierten Wirtszelle stattfinden. Folglich kann die genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyclus stattfinden, welcher in einer Wirtszelle stattfindet, die mit zwei oder mehreren verschiedenen Viren oder anderen genetischen Konstrukten co-infiziert ist. Ein DNA-Abschnitt von einem ersten Genom wird in der Konstruktion des Abschnittes des Genoms eines zweiten, co-infizierenden Virus austauschbar verwendet, in dem die DNA homolog zu der des ersten viralen Genoms ist.
Rekombination kann jedoch auch zwischen Abschnitten von DNA in verschiedenen Genomen stattfinden, die nicht völlig homolog sind. Wenn ein solcher Abschnitt von einem ersten Genom stammt, der mit einem Abschnitt eines anderen Genoms homolog ist, mit Ausnahme der Anwesenheit innerhalb des ersten Abschnitts, von zum Beispiel einem genetischen Marker oder einem Gen, das eine Antigendeterminate codiert, die in einem Teil der homologen DNA inseriert ist, kann die Rekombination nach wie vor stattfinden und die Produkte dieser Rekombination sind dann durch die Anwesenheit des genetischen Markers oder des Gens in dem rekombinanten viralen Genom nachweisbar.
Die erfolgreiche Expression der inserierten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus setzt zwei Gegebenheiten voraus. Erstens muss die Insertion in einem nicht-essentiellen Bereich des Virus erfolgen, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Voraussetzung für die Expression der inserierten DNA ist die Anwesenheit eines Promotors in der richtigen Beziehung zu der inserierten DNA. Der Promotor muss so platziert sein, dass er stromaufwärts von der DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, liegt.
Ein attenuierter Vektor ist durch sequenzielle Deletion von sechs nicht-essentiellen Bereichen vom Kopenhagen-Stamm des Vacciniavirus entwickelt worden. Diese Bereiche codieren bekanntlich Proteine, die eine Rolle in der viralen Virulenz spielen könnten. Die deletierten Bereichen sind das TK-Gen, das hämorrhagische Gen, das A-Typ-Einschlusskörpergen, das Hämagglutiningen und das Gen, das die große Untereinheit der Ribonucleotidreduktase codiert, sowie auch die vorher definierten C7L-bis K1L-Sequenzen (Perkus et al., 1990). Die Sequenzen und genomischen Positionen dieser Gene im Kopenhagen-Stamm des Vacciniavirus sind vorher definiert worden (Goebel et al., 1990 a, b). Der sich daraus ergebende attenuierte Vaccinia-Stamm wird als NYVAC bezeichnet.
Die Technologie der Herstellung von Vacciniavirus-Rekombinanten wurde vor kurzem auf andere Mitglieder der Pockenvirusfamilie ausgedehnt, die ein eingeschränkteres Wirtsspektrum haben.
Das Hühnerpockenvirus ist vorteilhafter Weise als ein Vektor gestaltet worden, der Antigene von Geflügel-Pathogenen exprimiert. Das Hämagglutinin-Protein eines virulenten Geflügelinfluenza-Virus wurde in einer Rekombinanten des Hühnerpockenvirus exprimiert (Taylor et al., 1988 a). Nach der Inokulation der Rekombinanten in Hühner und Truthähne wurde eine Immunantwort induziert, welche entweder gegen eine homologe oder heterologe virulente Hühnerpest-„Challenge" geschützt hat (Taylor et al., 1988 a). Außerdem wurden die Oberflächenglycoproteine (Fusion und Hämagglutinin) eines virulenten Stammes des Newcastle-Disease-Virus in einem Hühnerpockenvirus-Vektor exprimiert und zeigten Induktion einer schützenden Immunantwort (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990 a, b).
Hühnerpockenvirus ist das prototypische Virus der Vogelpocken-Gattung aus der Pockenvirusfamilie. Das Virus verursacht eine ökonomisch wichtige Krankheit von Geflügel, welche seit den 1920iger Jahren durch die Verwendung von lebenden attenuierten Impfstoffen gut kontrolliert wurde. Die Replikation der Vogelpockenviren ist auf Vogelspezies beschränkt (Esposito, 1991) und es gibt in der Literatur keine Hinweise, dass das Virus in irgendeiner Nicht-Vogel-Spezies, einschließlich des Menschen, eine produktive Infektion verursacht. Diese Wirtsbeschränkung stellt eine inhärente Sicherheitsbarriere für die Übertragung des Virus auf andere Spezies dar und macht die Verwendung des Hühnerpockenvirus als einen Impfstoffvektor in Geflügel zu einem reizvollen Vorschlag.
Die Marek-Krankheit ist eine lymphoproliferative Krankheit in Hühnern, die durch Infektion mit dem Herpesvirus MDV verursacht wird. Die Erkrankung ist durch eine mononucleäre Infiltration von einem oder mehrerer der folgenden Bereiche gekennzeichnet; periphere Nerven, Keimdrüse, Regenbogenhaut, verschiedene innere Organe, Muskeln und Haut (Calnek und Witter, 1991). Es gibt drei relevante Serotypen; (1) Serotyp 1, welcher onkogene Marek-Viren enthält (2) Serotyp 2, welcher nicht- onkogene Marek-Viren enthält (3) Serotyp 3, welcher das nahe verwandte Herpesvirus von Truthähnen (HVT) enthält.
Die Biologie des Marek-Virus wurde durch Schat (1987) zusammenfassend beschrieben. Die Art der Infektion des Marek-Virus verläuft über direkten oder indirekten Kontakt zwischen Vögeln, da Virusausbreitung durch Übertragung in der Luft möglich ist. Nach dem anfänglichen Kontakt sind drei Phasen der Infektion ersichtlich. Die erste Phase ist als eine frühe cytolytische Infektion definiert. Während dieser Phase wird eine produktive Infektion, die zu einer Freisetzung von zellfreiem Virus führt, im Feder-Follikel-Epithel (FFE) stattfinden. Zur selben Zeit findet eine nicht-produktive Replikation in den Lymphorganen statt. Definiert als eine produktiv- restriktive Infektion, findet während dieses Stadiums DNA-Replikation statt und Marek-Virus-Antigene werden exprimiert, aber die produzierten Virionen haben keine Hülle und sind daher nicht infektiös (Calnek und Witter, 1991). Die produktiv-restriktive Infektion resultiert in der Nekrose von B-Lymphocyten, begleitet von der Infiltration von Makrophagen und Granulocyten und Hyperplasie der retikulären Zellen, was zu einer Vergrößerung der Milz führt (Payne et al., 1976). Als Ergebnis davon werden T-Zellen aktiviert und exprimieren MHC Klasse II (Ia) Antigene (Schat, 1987). Aktivierte T-Zellen, aber nicht ruhende T-Zellen, werden dann für die Infektion mit Marek-Virus anfällig (Calnek et al., 1984, 1985). Die transiente Immunsuppression, welche mit der frühen cytolytischen Infektion assoziiert wird, ist daher wahrscheinlich die Folge lytischer Infektion von B-Zellen in der Milz und der Bursa (Schat, 1987).
Auf diese Phase folgend, treten infizierte Vögel in das zweite Stadium, definiert als latente Infektion, ein. Die infizierten T-Zellen, in welchen das virale Genom vorhanden ist, produzieren keine viralen Antigene oder virale Partikel. Latente Infektionen werden ungefähr sechs Tage nach der anfänglichen Infektion des Vogels festgestellt.
Die dritte und letzte Phase ist durch eine sekundäre cytolytische Infektion, Immunsuppression und Tumorbildung gekennzeichnet. Diese Art der Infektion tritt nur mit virulenten Serotyp 1-Viren auf. Eine sekundäre cytolytische Infektion tritt im Feder-Follikel-Epithel auf und das ist der einzige Bereich, in dem infektiöses zellfreies Virus produziert wird. Die Bedeutung dieser entzündlichen Infektion für die Tumorbildung ist nicht eindeutig, es wird jedoch angenommen, dass latent infizierte Lymphocyten vom Feder-Follikel-Epithel angelockt werden, wo sie Blastogenese durchlaufen. Das könnte eine Voraussetzung für ihre Transformation in Tumorzellen sein. Außerdem werden nicht infizierte Lymphocyten zur Stelle der Infektion gelockt, wo sie cytolytisch infiziert werden oder sich in Tumorzellen verwandeln (Schat, 1987). Permanente Immunsuppression ist zu dieser Zeit oft offensichtlich. Der Wechsel von einer latenten Infektion ist auch durch Tumorbildung in den inneren Organen, Nerven, Muskeln und Haut gekennzeichnet (Payne et al., 1976, Payne, 1985) und die Tumorzellen exprimieren jetzt eine Anzahl an Marek-Virus-Antigenen.
Vor der Verwendung von Impfstoffen stellte das Marek-Virus eine ökonomisch wichtige Krankheit für die Geflügelindustrie dar. Gegenwärtige Impfstoffe bestehen aus drei Arten (1) hoch attenuierte Serotyp-1-Viren, (2) natürlich-avirulente Serotyp-2-Viren, oder (3) die serologisch verwandten Herpesviren vom Truthahn. Die effizientesten und am häufigsten verwendeten sind die von Okazaki et al. (1970) entwickelten HVT-Impfstoffe. Es gibt Probleme in den gegenwärtigen Impfstrategien, hervorgerufen durch unsachgemäße Handhabung des Impfstoffes, Beeinträchtigung durch mütterliche Antikörper und assoziiertem Stress und gleichzeitigen Infektionen. Darüber hinaus hat das Auftreten von hochvirulenten Marek-Virus-Stämmen, gegen welche die Immunisierung mit HVT alleine nicht schützt, zur Einbeziehung von mehrfachen Serotypen in Impfstoffen geführt (zusammenfassend besprochen von Calnek und Witter, 1991).
Die Marek-Virus-Isolate sind, aufgrund ihrer Vorliebe für Lymphocyten, als Gamma-Herpesviren klassifiziert worden. In den letzten Jahren wurde jedoch ein beträchtlicher Aufwand auf das Verstehen der genomischen Organisation des Marek-Virus erbracht und es ist jetzt offensichtlich, dass es mehr genetische Homologie mit den Alpha-Herpesviren als mit den Gamma-Herpesviren gibt (Ross et al., 1989, 1991). Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde eine Anzahl an Antigenen identifiziert, die bei der Hervorrufung der Immunantwort wichtig sind. Unter diesen Antigenen sind das Herpes-Simplex-Virus-1-gB-Homolog und das Herpes-Simplex-Virus-gD-Homolg. Das Herpes-Simplex-Virus-1-gB-Homolog wurde von Ross et al. (1989) identifiziert. In anderen Herpesviruserkrankungen ist gezeigt worden, dass gB-Glycoprotein sowohl humorale als auch Zell-vermittelte Immunantworten induziert und schützende Immunität verleiht (Cantin et al., 1987, Marchioli et al., 1987, Guo et al., 1990). Das B-Antigen ist ein Komplex von Glycoproteinen mit Molekulargewichten von 100 kD, 60 kD und 49 kD, in mit Marek-Virus infizierten Zellen (Calnek und Witter, 1991). Das Antigen befindet sich auf der Oberfläche der infizierten Zelle und im Cytoplasma (Kato und Hirai, 1985) und es wird angenommen, dass es neutralisierende Antikörper induziert (Ono et al., 1985). Auf ähnliche Weise wurde das Marek-Virus-Homolg des Herpes-Simplex-Virus-1-gD von Ross und Binns (1991) und Ross et al., (1991) identifiziert. Es wurde gezeigt, dass das Herpes-Simplex-Virus gD ein wirkungsvolles Immunogen gegen HSV-Infektion ist (Paoletti et al., 1984, Cremer et al., 1985).
WO/A/9002803 offenbart die Verwendung eines Virusvektors zur Expression von Marek-Virus-Proteinen (d.h. gB oder gT-Glycoproteine). Der verwendete Vektor ist ein Herpesvirus-Vektor (HVC) zur Insertion der heterologen DNA, in diesem Dokument werden jedoch keine Expressions- oder Impfstoffdaten im Hinblick auf das rekombinante Herpesvirus gezeigt. Piccini et al., Methods in Enzymology 153 (1987), 545–563, beschreibt die Verwendung von Vacciniavirus zur Expression von heterologer DNA, es ist jedoch nicht auf die Verwendung von rekombinanten Vacciniaviren als Impfstoffe zur Behandlung der Marek-Krankheit gerichtet.
Obwohl gegenwärtige Impfstrategien gegen den Marek-Virus ziemlich erfolgreich waren, zeigt das Auftreten von hoch-virulenten Marek-Virus-Stämmen, welche durch gegenwärtige HVT-Impfstoffe nicht entsprechend kontrolliert werden können, dass die Einbeziehung mehrfacher Immunogene von hochvirulenten Stämmen in einen Impfstoff eine umfassendere Immunantwort schaffen könnte.
Man kann daher verstehen, dass die Bereitstellung eines rekombinanten Marek-Virus-Pockenvirus und eines Impfstoffes auf rekombinanter Basis, der schützende Immunität gegen Marek-Virus-Infektionen schafft und in welchem mehrfache Immunogene des Marek-Virus exprimiert sein könnten, ein höchst erstrebenswerter Fortschritt über den momentanen Stand der Technologie wäre.
GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Es ist daher ein Gegenstand dieser Erfindung, rekombinante Vacciniaviren bereitzustellen, wobei diese Viren Genprodukte des Marek-Virus exprimieren und ein Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanter Vacciniaviren bereitzustellen.
Es ist ein zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung, codierende Sequenzen für die Clonierung und Expression des Marek-Virus bereitzustellen, insbesondere Sequenzen, die antigenisch relevante Glycoproteine des Marek-Virus in einem Vacciniavirusvektor codieren.
Es ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, einen Impfstoff bereitzustellen, der im Stande ist Marek-Virus neutralisierende Antikörper und schützende Immunität gegen Marek-Virus-Infektion hervorzurufen.
Diese und andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden, nach Betrachtung des Folgenden, leichter ersichtlich werden.
DIE ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vacciniavirus, das eine DNA-Sequenz des Marek-Virus in einem nicht-essentiellen Bereich des Vacciniavirusgenoms enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert das rekombinante Vacciniavirus ein Antigen des Marek-Virus. Im Besonderen codiert die fremde Marek-Virus-DNA ein strukturelles Protein, vorzugsweise ein antigenisch relevantes Glycoprotein des Marek-Virus. Vorteilhafterweise wird eine Vielzahl an Marek-Virus-Glycoproteinen im Wirt durch das rekombinante Pockenvirus co-exprimiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff zur Induktion einer immunologischen Reaktion in einem Wirtstier, das mit dem Impfstoff inokuliert wurde, der Impfstoff enthält einen Trägerstoff und ein rekombinantes Vacciniavirus, welches DNA des Marek-Virus in einem nicht-essentiellen Bereich enthält.
Vorteilhafterweise codiert und exprimiert die DNA ein strukturelles Protein des Marek-Virus, vorzugsweise ein Marek-Virus-Glycoprotein. Eine Vielzahl an Marek-Virus-Glycoproteinen wird zweckmäßigerweise im Wirt co-exprimiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Man wird durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung haben, in welchen:
1 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pSD460 für die Deletion des Thymidinkinasegens und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP410 schematisch zeigt;
2 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pSD486, für die Deletion des hämorrhagischen Bereichs und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP553 schematisch zeigt;
3 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pMP494Δ für die Deletion des Bereiches des A-Typ-Einschlusskörpers und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP618 schematisch zeigt;
4 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pSD467, für die Deletion des Hämagglutiningens und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP723 schematisch zeigt;
5 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pMPCSK1Δ für die Deletion des Genkomplexes [C7L–K1L] und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP804, schematisch zeigt; und
6 ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pSD548 für die Deletion der großen Untereinheit der Ribonucleotidreduktase und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP866 (NYVAC) schematisch zeigt;
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft rekombinantes Vacciniavirus, das eine DNA enthält, die ein Antigen des Marek-Virus in einem nicht-essentiellen Bereich des Vacciniavirusgenoms codiert, wobei das TK-Gen, der hämorrhagische Bereich, der Bereich des A-Typ-Einschlusskörpers, das Hämagglutiningen, der C7L-K1L-Bereich und das Gen für die große Untereinheit der Ribonucleotidreduktase aus dem Vacciniavirusgenom deletiert worden sind. Im Besonderen wurden Marek-Virus-Gene, die strukturelle Proteine des Marek-Virus codieren, isoliert, charakterisiert und in NYVAC-Rekombinanten (Vacciniavirus) inseriert.
Zelllinien und Virusstämme.
Der Vacciniavirusstamm, der als ein „Rescue" für Marek-Virus-Sequenzen verwendet wurde, war NYVAC (vP866). NYVAC ist ein stark attenuierter Stamm des Vacciniavirus, abgeleitet vom Kopenhagen-Stamm, durch Deletion von 18 offenen Leserahmen, welche mit der Bestimmung der viralen Virulenz und Wirtsspektrum-Beschränkung in Verbindung gebracht wurden. Rekombinante Plaque-Selektion und Virusamplifikation wurden auf Kaninchennierenzellen (RK13, ATCC CCL37) durchgeführt.
Die Plasmide pMDV517 und pUC13gB enthalten DNA-Sequenzen, welche die Marek-Virus-Glycoproteine gD und gB des Stammes RB1B codieren. Das Plasmid pUC13gB enthält ein 3,9 kb DNA-Fragment von genomischer DNA des Marek-Virus (Stamm RB1B). Das Fragment, welches das Marek-Virus-gB-Gen enthält, wird als ein EcoRI-SalI-Fragment in pUC13 inseriert. Die Sequenz des inserierten Fragmentes ist in Ross et al. (1989) beschrieben. Das Plasmid pMDV517 enthält ein 5,2 kb DNA-Fragment von genomischer DNA des Marek-Virus (Stamm RB1B). Das Fragment, welches das Marek-Virus-gD-Gen enthält, wird an der EcoRI-Stelle von pUC13 inseriert. Die Sequenz des Fragmentes ist in Ross et al. (1991) beschrieben.
Beispiel 1 – ATTENUIERTER VACCINIA-IMPFSTOFFSTAMM NYVAC
Um einen neuen Vaccinia-Impfstoffstamm zu entwickeln wurde der Kopenhagen-Impfstoffstamm des Vacciniavirus durch die Deletion von sechs nicht-essentiellen Bereichen vom Genom modifiziert, welche bekannte oder potentiell virulente Faktoren codieren. Die sequenziellen Deletionen werden nachstehend genau beschrieben. Alle Bezeichnungen von Vaccinia-Restriktionsfragmenten, offenen Leserahmen und Nucleotidpositionen basieren auf der Terminologie, die in Goebel et al. (1990 a, b) ausgewiesen wurde.
Die Deletionsloci wurden auch als Empfängerloci für die Insertion von Fremd-Genen gestaltet.
Die Bereiche, die in NYVAC sequentiell deletiert wurden, sind nachstehend aufgelistet. Auch die Abkürzungen und Bezeichnungen der offenen Leserahmen für die deletierten Bereichen (Goebel et al., 1990 a, b) sind aufgelistet und die Bezeichnungen der Vacciniarekombinante (vP), die alle Deletionen einschließlich der näher beschriebenen Deletionen enthält:

(1) Thymidinkinasegen (TK; J2R) vP410;
(2) hämorrhagischer Bereich (u; B13R + B14R) vP553;
(3) Bereich des A-Typ-Einschlusskörpers (ATI; A26L) vP618;
(4) Hämagglutiningen (HA; A56R) vP723;
(5) Wirtsspektrum-Bereich (C7L – K1L) vP804; und
(6) große Untereinheit, Riboucleotidreduktase (I4L) vP866 (NYVAC)

DNA-Clonierung und Synthese.
Die Plasmide wurden konstruiert, abgesucht und durch Standardverfahren gezüchtet (Maniatis et al., 1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Die Restriktionsendonucleasen wurden von GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD; New England Biolabs, Beverly, MA; und Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, bezogen. Das Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals bezogen. Bal-31-Exonuclease und Phagen-T4-DNA-Ligase wurden von New England Biolabs bezogen. Die Reagenzien wurden wie von den verschiedenen Lieferanten vorgegeben verwendet.
Synthetische Oligodesoxyribonucleotide wurden auf einem Biosearch 8750 oder einem Applied Biosystems 380B DNA-Synthesegerät, wie vorstehend beschrieben (Perkus et al., 1989), erzeugt. DNA-Sequenzierung wurde mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., 1977) unter Verwendung von Sequenaee (Tabor et al., 1987), wie vorstehend beschrieben (Guo et al., 1989), durchgeführt. DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), zur Verifizierung der Sequenz (Engelke et al., 1988), wurde unter Verwendung von speziell angefertigten, synthetisierten Oligonucleotidprimern und GeneAmp-DNA-Amplifizierungs-Reagens-Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), in einem automatisierten Perkin Elmer Cetus DNA-PCR-Gerät, durchgeführt. Überschüssige DNA-Sequenzen wurden von den Plasmiden durch Restriktionsendonuclease-Spaltung deletiert, gefolgt von limitierter Spaltung mit BAL-31 und Mutagenese (Mandecki, 1986) unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide.
Zellen, Viren und Transfektion.
Die Ursprünge und Bedingungen der Züchtung des Kopenhagen-Stammes des Vacciniavirus sind vorher beschrieben worden (Guo et al., 1989). Die Herstellung von rekombinantem Virus durch Rekombination, in situ-Hybridisierung von Nitrocellulosefiltern und Screenen auf β-Galactosidaseaktiviät erfolgt wie vorstehend beschrieben (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).
Konstruktion von Plasmid gSD460 für die Deletion des Thymidinkinasegens (J2R).
Jetzt Bezug nehmend auf 1, enthält das Plasmid pSD406 Vaccinia HindIII J (Pos. 83359–88377), in pUC8 cloniert. pSD406 wurde mit HindIII und PvuII geschnitten und das 1,7 kb Fragment von der linken Seite von HindIII J in pUC8 cloniert, das mit HindIII/SmaI geschnitten worden war, um pSD447 zu bilden. pSD447 enthält das gesamte Gen für J2R (Pos. 83855–84385). Das Initiationscodon ist in der NlaIII-Stelle enthalten und das Terminationscodon ist in der SspI-Stelle enthalten. Die Transkriptionsrichtung wird in 1 durch einen Pfeil angezeigt.
Um einen linken flankierenden Arm zu erhalten wurde ein 0,8 kb HindIII/EcoRI-Fragment von pSD447 isoliert, dann mit NlaIII gespalten und ein 0,5 kb HindIII/NlaIII-Fragment isoliert. Die aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotide MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2)
wurden mit dem 0,5 kb HindIII/NlaIII-Fragment in das pUC18 Vektor-Plasmid ligiert, welches mit HindIII/EcoRI geschnitten war, um auf diese Weise das Plasmid pSD449 zu erzeugen.
Um ein Restriktionsfragment zu erhalten, das einen rechten flankierenden Arm von Vaccinia und pUC-Vektorsequenzen enthält, wurde pSD447 mit SspI (unvollständig) innerhalb der Vacciniasequenzen und HindIII, am Übergang von pUC/Vaccinia, geschnitten und ein 2,9 kb Vektorfragment isoliert. Dieses Vektorfragment wurde mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN45/MPSYN46 ligiert (SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4),
um dadurch pSD459 zu erzeugen.
Um die linken und rechten flankierenden Arme in einem Plasmid zu vereinigen wurde ein 0,5 kb HindIII/SmaI-Fragment von pSD449 isoliert und mit dem pSD459 Vektorplasmid ligiert, das mit HindIII/SmaI geschnitten war, um Plasmid pSD460 zu erzeugen. pSD460 wurde als Donorplasmid für die Rekombination mit dem parentalen Wild-Typ-Vacciniavirus des Kopenhagen-Stammes VC-2 verwendet. Eine mit ³²P markierte Sonde wurde durch Primer-Extension unter Verwendung von MPSYN45 (SEQ ID NO: 3) als Matrize und dem komplementären 20mer-Oligonucleotid MPSYN47 (SEQ ID NO: 5)
(5' TTAGTTAATTAGGCGGCCGC 3') als Primer synthetisiert. Das rekombinante Virus vP410 wurde durch Plaque-Hybridisierung identifiziert.
Konstruktion von Plasmid pSD486 für die Deletion des hämorrhagischen Bereichs (B13R + B14R).
Jetzt Bezug nehmend auf 2 enthält das Plasmid pSD419 Vaccinia SalI G (Pos. 160.744–173.351), in pUC8 cloniert. pSD422 enthält das zusammenhängende Vaccinia SalI-Fragment rechts davon, SalI J (Pos. 173.351– 182.746), in pUC8 cloniert. Um ein Plasmid mit deletiertem hämorrhagischen Bereich, u, B13R–B14R (Pos. 172.549–173.552), zu konstruieren, wurde pSD419 als Bezugsquelle für den linken flankierenden Arm verwendet und pSD422 wurde als Bezugsquelle für den rechten flankierenden Arm verwendet. Die Transkriptionsrichtung für den u-Bereich wird in 2 durch einen Pfeil angezeigt.
Um unerwünschte Sequenzen von pSD419 zu entfernen wurden Sequenzen links von der NcoI-Stelle (Pos. 172.253) durch Spaltung von pSD419 mit NcoI/SmaI, gefolgt von der Überführung in glatte Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung, um Plasmid pSD476 zu erzeugen.
Ein rechter flankierender Arm von Vaccinia wurde durch Spaltung von pSD422 mit HpaI, am Terminationscodon von B14R, und durch Spaltung mit NruI, 0,3 kb rechts davon, erhalten. Dieses 0,3 kb Fragment wurde isoliert und mit einem 3,4 kb-HincII-Vektorfragment, welches von pSD476 isoliert wurde, ligiert, um auf diese Weise Plasmid pSD477 zu erzeugen. Die Stelle der teilweisen Deletion des u-Bereiches von Vaccinia in pSD477 ist durch ein Dreieck gekennzeichnet. Die in pSD477 verbleibenden B13R-Codierungssequenzen wurden durch Spaltung mit ClaI/HpaI entfernt und das sich daraus ergebende Vektorfragment wurde mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden SD22mer/SD20mer (SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7) ligiert,
um dadurch pSD479 zu erzeugen. pSD479 enthält ein Initiationscodon (unterstrichen), gefolgt von einer BamHI-Stelle. Um E. coli Beta-Galactosidase unter der Kontrolle des u-Promotors in den B13-B14 (u) Deletionslocus zu platzieren wurde ein 3,2 kb BamHI-Fragment, welches das Beta-Galactosidasegen (Shapira et al., 1983) enthält, in die BamHI-Stelle von pSD479 inseriert, um pSD479BG zu erzeugen. pSD479BG wurde als Donorplasmid für die Rekombination mit dem Vacciniavirus vP410 verwendet. Rekombinantes Vacciniavirus vP533 wurde in der Anwesenheit des chromogenen Substrates X-Gal als ein blauer Plaque isoliert. In vP533 ist der B13R-B14R-Bereich deletiert und durch Beta-Galactosidase ersetzt.
Um die Beta-Galactosidasesequenzen von vP533 zu entfernen, wird das Plasmid pSD486 benützt, ein Derivat von pSD477, das einen Polylinkerbereich aber kein Initiationscodon am u-Deletionsübergang enthält. Zuerst wurde das ClaI/HpaI-Vektorfragment von pSD477, auf welches vorstehend verwiesen wird, mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden SD42mer/SD40mer (SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9) ligiert,
um auf diese Weise Plasmid pSD478 zu erzeugen. Als Nächstes wurde die EcoRI-Stelle am Übergang von pUC/Vaccinia durch Spaltung von pSD478 mit EcoRI zerstört, gefolgt von der Überführung in glatte Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung, um auf diese Weise das Plasmid pSD478E- zu erzeugen. pSD478E- wurde mit BamHI und HpaI gespalten und mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden HEM5/HEM6 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11) ligiert,
um pSD486 zu erzeugen. pSD486 wurde als Donorplasmid für die Rekombination mit dem rekombinanten Vacciniavirus vP533 verwendet, um auf diese Weise vP533 zu erzeugen welches, in der Anwesenheit von X-gal, als klarer Plaque isoliert wurde.
Konstruktion von Plasmid pMP494Δ für die Deletion des Bereichs des A-Typ-Einschlusskörgers (A26L). Jetzt Bezug nehmend auf 3, enthält pSD414 SalI B, in pUC8 cloniert. Um unerwünschte DNA-Sequenzen links vom A26L-Bereich zu entfernen, wurde pSD414 mit XbaI innerhalb der Vacciniasequenzen (Pos. 137.079) und mit HindIII am Übergang von pUC/Vaccinia geschnitten, dann mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase in glatte Enden überführt und ligiert, um Plasmid pSD483 zu erzeugen. Um unerwünschte Vaccinia-DNA-Sequenzen rechts vom A26L-Bereich zu entfernen, wurde pSD483 mit EcoRI (Pos. 140.665 und am Übergang von pUC/Vaccinia) geschnitten und ligiert, um auf diese Weise Plasmid pSD484 zu bilden. Um den für A26L codierenden Bereich zu entfernen, wurde pSD484 mit NdeI (unvollständig), etwas stromaufwärts des offenen Leserahmens von A26L (Pos. 139.004), und mit HpaI (Pos. 137.889), etwas stromabwärts des offenen Leserahmens von A26L geschnitten. Das 5.2 kb-Vektorfragment wurde isoliert und mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden ATI3/ATI4 (SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13) ligiert,
um den Bereich stromaufwärts von A26L zu rekonstruieren und den offenen Leserahmen von A26L durch einen kurzen Polylinkerbereich zu ersetzen, der, wie vorstehend angezeigt, die Restriktionsstellen BglII, EcoRI und HpaI enthält. Das sich daraus ergebende Plasmid wurde als pSD485 bezeichnet. Da die BglII und EcoRI-Stellen im Bereich des Polylinkers nicht einmalig sind, wurden unerwünschte BglII- und EcoRI-Stellen vom Plasmid pSD483 (vorstehend beschrieben) durch Spaltung mit BglII (Pos. 140.136) und mit EcoRI am Übergang von pUC/Vaccinia entfernt, gefolgt von der Überführung in glatte Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung. Das sich daraus ergebende Plasmid wurde als pSD489 bezeichnet. Das 1,8 kb ClaI (Pos. 137.198)/EcoRV (Pos. 139.048)-Fragment von pSD489, welches den offenen Leserahmen von A26L enthält, wurde durch den entsprechenden 0,7 kb-Polylinker ersetzt, welcher das ClaI/EcoRV-Fragment von pSD485 enthält, um pSD492 zu erzeugen. Die BglII- und EcoRI-Stellen im Bereich des Polylinkers von pSD492 sind einmalig.
Eine 3,3 kb-BglII-Kassette, die das Beta-Galactosidasegen von E. coli (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Vacciniapromotor enthält (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), wurde in die BglII-Stelle von pSD492 inseriert, um dadurch pSD493KBG zu bilden. Das Plasmid pSD493KBG wurde in der Rekombination mit dem „Rescuing"-Virus vP533 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP581, welches Beta-Galactosidase im A26L-Deletionsbereich enthält, wurde in der Anwesenheit von X-gal als blauer Plaque isoliert.
Um ein Plasmid für die Entfernung der Beta-Galactosidasesequenzen vom rekombinanten Vacciniavirus vP581 zu erzeugen, wurde der Bereich des Polylinkers von Plasmid pSD492 unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN177 (SEQ ID NO: 14)
(5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3')
durch Mutagenese deletiert (Mandecki, 1986). In dem sich daraus ergebenden Plasmid pMP494Δ wird Vaccinia-DNA, umfassend die Positionen [137.889–138.937], einschließlich des gesamten offenen Leserahmens von A26L deletiert. Rekombination zwischen pMP494Δ und der Vaccinia-Rekombinante vP581, die Beta-Galactosidase enthält, führte zu der Vaccinia-Deletionsmutante vP618, welche als klarer Plaque, in der Anwesenheit von X-gal isoliert wurde.
Konstruktion von Plasmid pSD467 für die Deletion der Hämagglutiningens (A56R).
Jetzt Bezug nehmend auf 4, das Vaccinia-SalI G-Restriktionsfragment (Pos. 160.744–173.351) kreuzt den HindIII A/B-Übergang (Pos. 162.539). pSD419 enthält Vaccinia-SalI G, in pUC8 cloniert. Die Transkriptionsrichtung für das Hämagglutiningen (HA) ist in 4 durch einen Pfeil angezeigt. Vacciniasequenzen, die von HindIII B abgeleitet wurden, sind durch Spaltung von pSD419 mit HindIII innerhalb der Vacciniasequenzen, und beim Übergang von pUC/Vaccinia entfernt worden, gefolgt von einer Ligierung. Das daraus resultierende Plasmid pSD456 enthält das Hämagglutiningen A56R, flankiert durch 0,4 kb-Vacciniasequenzen links davon und 0,4 kb-Vacciniasequenzen rechts davon. Die codierenden Sequenzen von A56R wurden durch Schneiden von pSD456 mit RsaI (unvollständig; Position 161.090), stromaufwärts der codierenden Sequenzen von A56R und mit EagI (Pos. 162.054) nahe dem Ende des Gens entfernt. Das 3,6 kb-RsaI/EagI-Vektorfragment von pSD456 wurde isoliert und mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN59 (SEQ ID NO: 15), MPSYN62 (SEQ ID NO: 16), MPSYN60 (SEQ ID NO: 17) und MPSYN61 (SEQ ID NO:18) ligiert,
dabei wurden die DNA-Sequenzen stromaufwärts des offenen Leserahmens von A56R rekonstruiert und der offene Leserahmen von A56R, wie vorstehen angezeigt, durch einen Polylinkerbereich ersetzt. Das daraus resultierende Plasmid ist pSD466. Die Vacciniadeletion in pSD466 umfasst die Positionen [161.185–162.053]. Die Stelle der Deletion in pSD466 ist in 4 mit einem Dreieck angezeigt.
Eine 3,2 kb BglII/BamHI (unvollständige)-Kassette, die das Beta-Galactosidasegen von E. coli (Shapira et al., 1983), unter der Kontrolle des 11 kDa Vacciniapromotors (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989) enthält, wurde in die BglII-Stelle von pSD466 inseriert, um pSD466KBG zu bilden. Das Plasmid pSD466KBG wurde in der Rekombination mit dem „Rescue"-Virus vP618 verwendet. Der rekombinante Vacciniavirus vP708, der Beta-Galactosidase in der A56R-Deletion enthält, wurde als ein blauer Plaque in der Gegenwart von X-gal isoliert.
Beta-Galactosidasesequenzen wurden vom vP708 unter Verwendung des Donorplasmids pSD467 deletiert. pSD467 ist identisch zu pSD466 außer, dass EcoRI-, SmaI- und BamHI-Stellen vom pUC/Vaccinia-Übergang durch Spaltung von pSD466 mit EcoRI/BamHI entfernt wurden, gefolgt von der Überführung in glatte Enden mittels dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligation. Die Rekombination zwischen vP708 und pSD467 führte zu der rekombinanten Vaccinia-Deletionsmutante vP723, welche in der Anwesenheit von X-gal als klarer Plaque isoliert wurde.
Konstruktion von Plasmid pMPCSK1Δ für die Deletion der offenen Leserahmen [C7L-K1L].
Jetzt Bezug nehmend auf 5 wurden die folgenden Vacciniaclone in der Konstruktion von pMPCSK1Δ benützt. pSD420 ist SalI H, cloniert in pUC8. pSD435 ist KpnI F, in pUC18 cloniert. pSD435 wurde mit SphI geschnitten und wieder ligiert, um pSD451 zu bilden. In pSD451 sind die DNA-Sequenzen in HindIII M links von der SphI-Stelle (Pos. 27.416) entfernt (Perkus et al., 1990). pSD409 ist HindIII M, in pUC8 cloniert.
Um ein Substrat für die Deletion des [C7L-K1L]-Genkomplexes von Vaccinia bereitzustellen, wurde E. coli-Beta-Galactosidase, wie folgt, zuerst in den Vaccinia-M2L-Deletionslocus (Guo et al., 1990) inseriert. Um die BglII-Stelle in pSD409 zu entfernen, wurde das Plasmid mit BglII in der Vacciniasequenz (Pos. 28.212) und mit BamHI am Übergang von pUC/Vaccinia geschnitten und dann ligiert, um Plasmid pMP409B zu bilden. pMP409B wurde an der einmaligen SphI-Stelle (Pos. 27.416) geschnitten. Die für M2L codierenden Sequenzen wurden durch Mutagenese (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids entfernt.
Das daraus resultierende Plasmid pMP409D enthält eine einmalige BglII-Stelle, die wie vorstehend angezeigt, in den M2L-Deltionslocus inseriert ist. Eine 3,2 kb BamHI-(unvollständig)/BglII-Kassette, die das E. coli-Beta-Galactosidasegen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa Promotors (Bertholet et al., 1985) enthält, wurde in pMP409D, das mit BglII geschnitten war, inseriert. Das daraus resultierende Plasmid pMP409DBG (Guo et al., 1990) wurde als Donorplasmid für die Rekombination mit dem „Rescue"-Vacciniavirus vP723 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vp784, welches Beta-Galactosidase inseriert in den M2L-Deletionslocus enthält, wurde als ein blauer Plaque in der Anwesenheit von X-gal isoliert.
Ein Plasmid, dessen Vacciniagene [C7L-K1L] entfernt sind, wurde in pUC8 zusammengesetzt, mit SmaI, HindIII geschnitten und mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase in glatte Enden überführt. Der linke flankierende Arm, der aus Vaccinia-HindIII C-Sequenzen besteht, wurde durch Spaltung von pSD420 mit XbaI (Pos. 18.628) erhalten, gefolgt von einer Überführung in glatte Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Spaltung mit BglII (Pos. 19.706). Der rechte flankierende Arm, bestehend aus Vaccinia HindIII K-Sequenzen, wurde durch Spaltung von pSD451 mit BglII (Pos. 29.062) und EcoRV (Pos. 29.778) erhalten. Von dem daraus resultierende Plasmid pMP581CK wurden die Vacciniasequenzen zwischen der BglII-Stelle (Pos. 19.706) in HindIII C und der BglII-Stelle (Pos. 29.062) in HindIII K deletiert. Die Stelle der Deletion der Vacciniasequenzen im Plasmid pMP581CK ist in 5 durch ein Dreieck angezeigt.
Um überschüssige DNA am Übergang der Vacciniadeletion zu entfernen, wurde das Plasmid pMP581CK an den NocI-Stellen innerhalb der Vacciniasequenzen geschnitten (Pos. 18.811; 19.655), mit Bal-31-Exonuclease behandelt und unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN233 (SEQ ID NO: 20)
5' TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT 3'
einer Mutagenese unterzogen (Mandecki, 1986). Dem daraus resultierende Plasmid PMPCSK1Δ wurden die Vacciniasequenzen der Positionen 18.805–29.108, einschließlich des offenen Leserahmens [C7L–K1L], entfernt. Die Rekombination zwischen PMPCSK1Δ und der Vacciniarekombinante vP784, die Beta-Galactosidase enthält, führte zur Vaccinia-Deletionsmutante vP804, welche als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-gal isoliert wurde.
Konstruktion von Plasmid pSD548 für die Deletion der großen Untereinheit, Ribonucleotidreduktase (I4L).
Jetzt Bezug nehmend auf 6 enthält das Plasmid pSD405 Vaccinia HindIII I (Pos. 63.875–70.367), in pUC8 cloniert. pSD405 wurde mit EcoRV, innerhalb der Vacciniasequenzen (Pos. 67.933), und mit SmaI am Übergang von pUC/Vaccinia gespalten und ligiert, um daraus das Plasmid pSD518 zu bilden. pSD518 wurde als die Bezugsquelle für alle Vaccinia-Restriktionsfragmente verwendet, die in der Konstruktion von pSD548 verwendet wurden.
Das Vaccinia-I4L-Gen erstreckt sich von Position 67.371–65.059. Die Transkriptionsrichtung von I4L ist in 6 durch einen Pfeil angezeigt. Um ein Vektor-Plasmidfragment zu erhalten, welchem ein Teil der für I4L codierenden Sequenzen entfernt worden ist, wurde pSD518 mit BamHI (Pos. 65.381) und HpaI (Pos. 67.001) gespalten und unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-Polymerase in glatte Enden überführt. Dieses 4,8 kb Vektorfragment wurde mit einer 3,2 kb SmaI-Kassette ligiert, die das E. coli Beta-Galactosidasegen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa Promotors von Vaccinia (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) enthält, resultierend in Plasmid pSD524KBG. pSD524KBG wurde als Donorplasmid für die Rekombination mit dem Vacciniavirus vP804 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP855, welches Beta-Galactosidase in einer unvollständigen Deletion des I4L-Gens enthält, wurde als blauer Plaque in der Anwesenheit von X-gal isoliert.
Um Beta-Galactosidase und den Rest des offenen Leserahmens von I4L von vP855 zu entfernen, wurde das Deletionsplasmid pSD548 konstruiert.
Die rechten und linken flankierenden Arme von Vaccinia wurden wie nachstehend genau beschrieben und in 6 schematisch dargestellt in pUC8 getrennt zusammengesetzt.
Um ein Vektorplasmid zu konstruieren, welches den linken flankierenden Arm von Vaccinia aufnimmt, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI geschnitten und mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden 518A1/518A2 (SEQ ID NO: 21/SEQ ID NO: 22) ligiert,
um daraus Plasmid pSD531 zu bilden. pSD531 wurde mit RsaI (unvollständig) und BamHI geschnitten und ein 2,7 kb-Vektorfragment isoliert. pSD518 wurde mit BglII (Pos. 64.459)/RsaI (Pos. 64.994) geschnitten und ein 0,5 kb Fragment isoliert. Die beiden Fragmente wurden ligiert, um dadurch pSD537 zu bilden, welches den gesamten flankierenden Arm von Vaccinia links von der I4L-codierenden Sequenz enthält.
Um ein Vektorplasmid zu konstruieren, welches den rechten flankierenden Arm von Vaccinia aufnimmt, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI geschnitten und mit den aneinandergelagerten synthetischen Oligonucleotiden 518B1/518B2 (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 24) ligiert,
um daraus Plasmid pSD532 zu bilden. pSD532 wurde mit RsaI (unvollständig)/EcoRI geschnitten und ein 2,7 kb-Vektorfragment isoliert. pSD518 wurde mit RsaI innerhalb der Vacciniasequenzen (Pos. 67.436) und EcoRI am Übergang von pUC/Vaccinia geschnitten und ein 0,6 kb Fragment isoliert. Die beiden Fragmente wurden ligiert, um dadurch pSD538 zu bilden, welches den gesamten flankierenden Arm von Vaccinia rechts von der I4L-codierenden Sequenz enthält.
Der rechte flankierende Arm von Vaccinia wurde als ein EcoRI/BglII-Fragment von pSD538 isoliert und in das pSD537-Vektorplasmid, das mit EcoRI/BglII geschnitten war, ligiert. In dem daraus resultierenden Plasmid pSD539 ist der offene Leserahmen von I4L (Pos. 65.047–67.386) durch eine Polylinker-Region ersetzt, welche von 0,6 kb-Vaccinia-DNA auf der linken Seite und 0,6 kb Vaccinia-DNA auf der rechten Seite flankiert ist und das alles in einem pUC-Hintergrund. Die Stelle der Deletion innerhalb der Vacciniasequenzen wird in 6 durch ein Dreieck angezeigt. Um mögliche Rekombinationen der Beta-Galactosidasesequenzen in dem von pUC abgeleiteten Teil von pSD539 mit Beta-Galactosidasesequenzen im rekombinanten Vacciniavirus vP855 zu vermeiden, wurde die Vaccinia-I4L-Deletionskassette von pSD539 in pRC11 verlegt, ein pUC-Derivat von dem alle Beta-Galactosidasesequenzen entfernt worden und mit einem Polylinkerbereich ersetzt worden sind (Colinas et al., 1990). pSD539 wurde mit EcoRI/PstI geschnitten und das 1,2 kb Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in pRC11 ligiert, der mit EcoRI/PstI (2,35 kb) geschnitten wurde, um pSD548 zu bilden. Die Rekombination zwischen pSD548 und der Vacciniarekombinanten vP855, welche Beta-Galactosidase enthält, führte zu der Vaccinia-Deletionsmutante vP866, welche als klarer Plaque in Anwesenheit von X-gal isoliert wurde.
Die DNA des rekombinanten Vacciniavirus vP866 wurde durch Restriktionsspaltungen gefolgt von Elektrophorese auf einem Agarosegel analysiert. Die Restriktionsmuster entsprachen den Erwartungen. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Engelke et al., 1988) unter Verwendung von vP866 als Matrize und Primern, welche die sechs Genloci flankieren, die vorstehend genau beschriebenen wurden, erzeugten DNA-Fragmente in den erwarteten Größen. Sequenzanalysen der durch PCR erzeugten Fragmente in den Gebieten der Deletionsübergänge bestätigten, dass die Übergänge den Erwartungen entsprachen. Das rekombinante Vacciniavirus vP866, welches die wie vorstehend beschriebenen sechs abgeleiteten Deletionen enthält, wurde als Vaccinia-Impfstoffstamm „NYVAC" bezeichnet.
Beispiel 2 – KONSTRUKTIONEN DER PLASMIDE
Konstruktion eines Plasmids für die Insertion des Marek-Virus-gB in den Vacciniavirus.
Das vorher beschriebene Plasmid pRW878 wurde mit HincII gespalten und ein 2.8 kb Fragment, welches die codierende Sequenz für das Marek-Virus-Gb enthält, verbunden mit dem H6-Promotor des Vacciniavirus, wurde an der SmaI-Stelle des Vaccinia-Insertionsplasmids pSD553VC inseriert, um Plasmid pRW879 abzuleiten. Das Plasmid pSD553VC ist ein Insertionsplasmid, welches das Wirtsspektrum-Selektionssystem nützt, das in Perkus et al. (1989) beschrieben wurde. In diesem Plasmid liegen das K1L-Gen des Vacciniavirus und die Polylinker-Regionen innerhalb flankierender Arme des Kopenhagen-Vaccinia und ersetzen auf diese Weise den Bereich des A-Typ-Einschlusskörpers (offene Leserahmen A25L und A26L), der in Goebel et al. (1990 a, b) beschrieben wurde. Der gesamte Bereich befindet sich in einem pUC8-Vektor und Insertionsstellen werden von Stop-Codons der Translation und Stop-Signalen der Transkription flankiert. Das Plasmid pRW879 wurde bei der in vitro-Rekombination mit NYVAC (vP866) als das „Rescuing"-Virus verwendet, um die Rekombinante vP935 abzuleiten, die das Marek-Virus-gB-Gen exprimiert.
Konstruktion eines Plasmids für die Insertion des Marek-Virus-gD in das Vacciniavirus.
Vier PCR-Reaktionen wurden verwendet, um ein Insertionsplasmid zu erzeugen. In der 1. Reaktion wurde Plasmid pRW880 als eine Matrize verwendet, um ein Fragment abzuleiten, welches die H6-Promotorsequenz des Vacciniavirus gekoppelt mit der 5'-Sequenz des Marek-Virus-gD, mit dem ATG des Promotors, welches das Initiations-ATG des Marek-Virus-gD-Gen überlappt, enthält. Das Plasmid pRW880 enthält die vorstehend beschriebene H6-Promotorsequenz, gekoppelt an ein unpassendes Gen im F16-Insertionslocus. Die in dieser Reaktion verwendeten Primer waren RW389 (SEQ ID NO: 36) und RW390 (SEQ ID NO: 37).
RW 389: TGAGATATATCTAAAGAAGAATACTTTCATTACGATACAAACTTAAC
RW 390: TAATATAATCTTTTATAC
In der zweiten und dritten PCR-Reaktion wurde pMDV517 als Matrize verwendet. Plasmid pMV517 enthält ein 5,2 kb DNA-Fragment, welches das Marek- Virus-gD-Gen, inseriert an der EcoRI-Stelle von pUC13, enthält. Das Ziel der Reaktionen war es, zwei interne TTTTTNT-Signale zu ändern, um die Möglichkeit einer frühzeitigen Termination auszuschließen (Yuen und Moss, 1987). In der zweiten Reaktion wurden die Oligonucleotide RW386 (SEQ ID NO: 38) und RW391 (SEQ ID NO: 39) als Primer verwendet, um TTTTTTTTT in TTCTTCTTT zu ändern.
RW 386: CCGTTCAGCTTCTTCGTCAATGGTACAACACGGCTGTTAGAC
RW 391: GAGCGGTCGACAAGCTTATAGGCGGGAATATGC
In der dritten Reaktion wurden die Oligonucleotide RW387 (SEQ ID NO: 40) und RW388 (SEQ ID NO: 41) als Primer verwendet, um TTTTTTTGT in CTTCTTCGT zu ändern.
RW 387:
TGTTGTACCATTGACGAAGAAGCTGAACGGTTTGCATAGTTTGTTATC
RW 388: ATGAAAGTATTCTTCTTTAGATATATCTCATCCAC
Die Produkte der drei PCR-Reaktionen wurden vereinigt und RW390 (SEQ ID NO: 37) und RW391 (SEQ ID NO: 39) als Primer für eine vierte PCR-Reaktion verwendet. Die Produkte der letzten PCR-Reaktion wurden mit NruI und HindIII geschnitten und ergaben ein 1.2 kbp-Fragment, welches das 3'-Ende des H6-Promotors und die codierende Sequenz des Marek-Virus-gD enthält. Plasmid pRW880 (der Ursprung ist nachstehend beschrieben) wurde mit NruI und HindIII (das entfernt das unpassende Gen und hinterlässt das 5'-Ende des H6-Promotors) gespalten und mit dem 1,2 kb-Fragment ligiert, welches nach Spaltung des endgültigen PCR-Produktes erhalten wurde. Das daraus entstandene Plasmid pRW893, wurde dann mit NotI gespalten und ein 1,4 kbp-Fragment freigesetzt, welches das, durch H6 getriebene Marek-Virus-gD-Gen enthält welches in die SmaI-Stelle des vorstehend beschriebenen pSD533VC inseriert wurde, um pRW894 zu erzeugen. Das Plasmid pRW984 wurde in der in vitro-Rekombination mit NYVAC (vP866) als das „Rescuing"-Virus verwendet, um die Rekombinante vP1005 zu erzeugen, die das Marek-Vius-gD-Gen exprimiert.
Beispiel 3 – ENTWICKLUNG EINER AUF DEM VACCINIAVIRUS BASIERENDEN REKOMBINANTE, DIE MAREK-VIRUS-GLYCOPROTEINE EXPRIMIERT
Vorstehend beschriebene Plasmide wurden unter Verwendung des Calcium-Phosphat-Ausfällverfahren, das früher beschrieben wurde, in Zellen transfiziert, die mit NYVAC infiziert waren (Panicali und Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987). Positive Plaques wurden auf Basis der Hybridisierung an spezifische radioaktiv markierte Marek-Virus-Sonden ausgewählt und sequentiellen Runden der Plaque-Reinigung unterzogen, bis eine reine Population erzielt worden war. Repräsentative Plaques von jeder infektiösen Virus-Rekombinante (IVR) wurden dann amplifiziert und ein Vorrat an Viren erstellt.
Indirekte Immunfluoreszenz wurde unter Verwendung eines polyclonalen Huhn-anti-Marek-Virus-Serum, bezeichnet als Huhn #392, wie in Taylor et al. (1990) beschrieben, durchgeführt.
Immunopräzipitationsreaktionen wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Reagens, wie in Taylor et al. (1990) beschrieben, durchgeführt.
NYVAC-REKOMBINANTEN, DIE MAREK-VIRUS EXPRIMIEREN
Glycoproteine.
Die Transfektion des Plasmids pRW879 führte zur Entwicklung der NYVAC-Rekombinante vP935.
Immunfluoreszenzanalyse deutete darauf hin, dass ein Protein, welches vom Marek-Virus-Immunserum erkannt wurde, auf der Oberfläche der infizierten Zellen exprimiert wurde. Immunopräzipitationsanalysen, die das gleiche Immunserum von Hühnern verwendeten, stellte die Anwesenheit von drei Hauptexpressionsprodukten mit den ungefähren Molekulargewichten von 110 kDa, 64 kDa und 48 kDa fest. Diese Größen entsprechen den erwarteten Produkten des Marek-Virus-gB-Gens.
Die Transfektion des Plasmids pRW894 führte zur Entwicklung der NYVAC-Rekombinante vP1005. Ein Plaque-Immunscreen-Assay deutete darauf hin, dass ein Protein, welches vom Marek-Virus-Immunserum erkannt wurde, auf der Oberfläche der infizierten Zellen exprimiert wurde. Eine Immunpräzipitationsanalyse deutet auf die Herstellung von zwei Produkten hin, mit Molekulargewichten von etwa 45 kDa (entsprechend der Vorläuferform des Proteins) und 65 kDa, welches das prozessierte Glycoprotein verkörpert.
LITERATURNACHWEIS

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Claims

Rekombinantes Vacciniavirus, das eine DNA enthält, welche ein antigenisches Marek-Virus-Glycoprotein oder -Strukturprotein in einem nicht-essentiellen Bereich des Vacciniavirusgenoms codiert, wobei das TK-Gen, der hämorrhagische Bereich, der Bereich des A-Typ-Einschlusskörpers, das Hämagglutiningen, der C7L-K1L-Bereich und das Gen für die große Untereinheit der Ribonucleotidreduktase aus dem Vacciniavirusgenom deletiert worden sind.
Rekombinantes Vacciniavirus nach Anspruch 1, wobei die DNA ein Marek-Virus-Strukturprotein codiert.
Rekombinantes Vacciniavirus nach Anspruch 2, wobei die DNA ein Marek-Virus-Glycoprotein codiert.
Rekombinantes Vacciniavirus nach Anspruch 3, wobei die DNA das Marek-Virus-Glycoprotein gB codiert.
Rekombinantes Vacciniavirus nach Anspruch 3, wobei die DNA das Marek-Virus-Glycoprotein gD codiert.
Impfstoff zur Anregung einer immunologischen Antwort in einem mit dem Impfstoff geimpften Wirtstier, wobei der Impfstoff einen Trägerstoff und ein rekombinantes Vacciniavirus umfasst, welches in einem nicht-essentiellen Bereich DNA enthält, die ein antigenisches Marek-Virus-Glycoprotein oder -Strukturprotein codiert, wobei das TK-Gen, der hämorrhagische Bereich, der Bereich des A-Typ-Einschlusskörpers, das Hämagglutiningen, der C7L-K1L-Bereich und das Gen für die große Untereinheit der Ribonucleotidreduktase aus dem Vacciniavirusgenom deletiert worden sind.
Impfstoff nach Anspruch 6, wobei die DNA ein Marek-Virus-Strukturprotein codiert und exprimiert.
Impfstoff nach Anspruch 7, wobei die DNA ein Marek-Virus-Glycoprotein codiert und exprimiert.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die DNA das Marek-Virus-Glycoprotein gB codiert und exprimiert.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die DNA das Marek-Virus-Glycoprotein gD codiert und exprimiert.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei das Wirtstier ein Huhn ist.
Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Transfizieren von mit Vacciniavirus infizierten Zellen mit (a) einem Plasmid, das die entsprechenden codierenden Sequenzen enthält, und (b) Plasmiden, die eine Deletion der entsprechenden Gene aufweisen, das Auswählen, Aufreinigen und Amplifizieren der positiven Plaques, um das gewünschte Virus zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 6 bis 11, welches die Kombination des Trägerstoffs und des rekombinanten Vacciniavirus umfasst.