JPH099978A - 組み換えウイルスおよびそれより成るワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 移行抗体への対応が可能なワクチンを提供す
る。 【解決手段】 親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
にヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＥをコ
ードするＤＮＡ、またはヘルペス属に属するウイルスの
糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡおよび糖タンパク
質ｇＩをコードするＤＮＡを含有する組み換えウイル
ス、およびこれを有効成分とするワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組み換えウイルス及び
それから成るワクチンに関し、さらに詳しくは、ヘルペ
ス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＥをコードする
ＤＮＡ、または糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡお
よびｇＩをコードするＤＮＡを、異種外来抗原タンパク
質をコードするＤＮＡと共に、その増殖に非必須なゲノ
ム領域に挿入した組み換えウイルス、および当該組み換
えウイルスを有効成分とするワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在の養鶏分野においては、種鶏、産卵
鶏、及び肉用鶏の別を問わず、ワクチネーションによる
疾病予防は衛生管理の柱である。しかしながらワクチネ
ーションのプログラムは実に過密であり、従ってこれに
要する人手、時間ならびに経費は大きな問題となってい
る。

【０００３】この解決策として、近年、組み換えＤＮＡ
技術により、ある病原体より免疫誘導に必要なタンパク
質をコードする遺伝子のみを取り出し、これを含む組み
換えウイルスを構築することが可能となった。このよう
な組み換えウイルスを組み換え生ワクチンとして接種す
ることにより、挿入した遺伝子がコードする抗原タンパ
ク質に対する免疫を誘導することが可能となった。ポッ
クスウイルスに属するアビポックスウイルスはそのよう
な組み換えウイルスの構築に用いるのに好適なウイルス
である。ファウルポックスウイルス（以下、ＦＰＶとい
う）に代表されるこれらウイルスは、大きなゲノムＤＮ
Ａを持ち、その多くの領域がウイルス増殖に非必須であ
り、同一ウイルスのこれらの非必須領域に複数の抗原遺
伝子を挿入することができる。このような組み換えウイ
ルスワクチンは、ワクチンを接種した宿主の液性免疫、
細胞性免疫を誘導することができると推測される。この
方法は、従来、鶏痘に対する生ワクチンとして使用され
てきた弱毒化ＦＰＶに遺伝子工学的手法を用いて外来遺
伝子を挿入した組み換えＦＰＶとして応用されてきた。
外来遺伝子として、鶏病ウイルスであるニューキャッス
ル病ウイルスの抗原をコードした遺伝子（以下、抗原遺
伝子という）、マレック病ウイルスの抗原遺伝子、鶏イ
ンフルエンザウイルスの抗原遺伝子を挿入した組み換え
ＦＰＶが構築され、実験的にＳＰＦ鶏に接種して、ワク
チン効果を確認している（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、１７８、２９７−３００（１９９０）；
Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０
９−１４１３（１９９２）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃ
ｉｎｅ、６、５０４−５０８（１９８８））。このよう
に組み換えＦＰＶは、目的に応じて種々の外来抗原遺伝
子を挿入することができ、また同時に複数の抗原遺伝子
を挿入できるために、１回接種で複数の病原体に対して
有効な多価ワクチン可能になり、その結果前述の過密な
ワクチンプログラム問題の解決策と成りうると有望視さ
れている。

【０００４】一方、新しいワクチンを実用化する過程で
考慮しなければならない重大な事柄の１つに移行抗体が
挙げられる。生まれて間もない個体は、免疫機構が未熟
なため病原体の感染の危険に曝されている。生体側の防
御機能として母親から種々の病原体に対する抗体を受け
取り、生まれてくる。このような母親由来の抗体は、移
行抗体と呼ばれ、生後数週間、個体を病原体の感染から
守ってくれる。しかし、その反面、この時期ワクチンと
して接種した弱毒ウイルスも同様に移行抗体によって排
除される。この結果、ワクチンによるプライミング効果
は得られず、移行抗体が消失するころに病原体に対する
感染の危険性が高まる。さらにこの移行抗体は、個体に
よってその成分、力価にばらつきがあるため、移行抗体
の消失時期を見計らって集団ワクチン接種することが望
まれるが、実際には不可能に近い。たとえば、ニワトリ
の初生に接種するニューキャッスル病ウイルス（以下、
ＮＤＶという）生ワクチンの場合、初生雛の時期に２、
３回の接種を行い、個体の移行抗体価のばらつきによる
ワクチン効果の低減を最小限に押さえる努力がなされて
いる。また伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、
ＩＢＤＶという）ワクチンの場合は、繁殖雌鶏に、およ
そ２２週令の産卵期の始まる前に不活化した油−乳濁性
セ゛ンウイルスワクチンを接種し、受精卵内に高いレベル
の移行抗体を含有させて羽化後の数週間にわたって鶏を
保護することを目的としている。かりに、前述のワクチ
ン効果が認められたと文献で報告されている組み換えＦ
ＰＶを実験室レベルで飼育されているＳＰＦ鶏ではなく
市販の移行抗体を保有している鶏に接種した場合、移行
抗体の影響を受けてワクチン効果が低減すると予想され
る。さらに、複数の抗原遺伝子を挿入した多価組み換え
ＦＰＶを接種すれば、それぞれの抗原に対する移行抗体
が速やかにこの組み換えＦＰＶを排除するためさらに移
行抗体の影響は大きくなり、いずれの抗原に対するワク
チン効果もできないことが予想される。

【０００５】ところで最近の単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）の研究で、宿主の免疫グロブリン（以下、ＩｇＧ
という）と結合する特性を有する２つの糖タンパク質ｇ
ＩとｇＥとが同定された。この二つのタンパク質は複合
体を形成しており、ＩｇＧのＦｃ領域と結合するＦｃレ
セプターとしての機能を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２、１３４７−１３５４（１９８
８））。組み換えＤＮＡ技術を用いて作製したｇＥある
いはｇＩ遺伝子欠損変異体ＨＳＶはｉｎ ｖｉｔｒｏに
おいて抗ＨＳＶ抗体の存在下で、著しく増殖が阻害され
た（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７７、４
３７−４４４（１９９０）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、６５、７０４６−７０５０（１９９
１））。これらの研究結果よりＨＳＶのｇＩ、ｇＥは、
ウイルスの抗体の関与する免疫応答より逃避するために
重要な役割を果たしていると推測される。ｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいてのｇＩ、ｇＥの機能は未解明であるが、唯一
ｇＩ、ｇＥは、ウイルスの増殖に必須ではないことが明
らかになっている。

【０００６】ＭＤＶにおいても最近ｇＩ遺伝子の全長と
ｇＥ遺伝子の一部の塩基配列が明らかになった（Ｖｅｌ
ｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１６号）。しか
し、それらの機能面については全く明らかにされておら
ず、さらにこれらの遺伝子を組み換えウイルスで発現し
たときにどのような現象が現れるかを予測することは困
難であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、移行抗
体の影響を受けにくい新たな組み換えワクチンを得るべ
く鋭意検討した結果、親ウイルスの増殖に非必須な領域
に、ヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質である
ｇＥをコードするＤＮＡを病原体の抗原遺伝子と一緒に
挿入すると、移行抗体による影響を受けにくい新しいタイ
フ゜のワクチンとして機能する組み換えウイルスが得られ
ることを見い出し、本発明を完成するに到った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域（以下、非
必須領域という）にヘルペス属に属するウイルスの糖タ
ンパク質ｇＥ（以下、ｇＥという）をコードするＤＮＡ
（以下、ｇＥ遺伝子という）、またはｇＥ遺伝子とヘル
ペス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＩ（以下、ｇ
Ｉという）をコードするＤＮＡ（以下、ｇＩ遺伝子とい
う）とを含有する組み換えウイルスが提供され、またウ
イルスの増殖に非必須なゲノム領域にｇＥ遺伝子、また
はｇＥ遺伝子およびｇＩ遺伝子とともに異種外来抗原タ
ンパク質（以下、単に抗原タンパク質という）をコード
するＤＮＡ（以下、抗原遺伝子という）を含有する組み
換えウイルス、および当該組み換えウイルスを有効成分
とするワクチンが提供される。

【０００９】本発明の組み換えウイルスは、例えば、以
下のようにして調製される。予め親ウイルスの火必須領
域を組み込んだプラスミドの当該非必須領域に、親ウイ
ルス内で機能するプロモーターの支配下となるように連
結されたｇＥ遺伝死闘を組み込み、プラスミドベクター
を得る。ついで、親ウイルス感染細胞にこのプラスミド
ベクターを導入することにより、相同組み換えを起こさ
せ、その結果生じたウイルスを選択、純化し、目的とす
る組み換えウイルスを得る。

【００１０】（親ウイルス）本発明において、親ウイル
スとは、ｇＥ遺伝子等が組み込まれるウイルスをいい、
その種類は如何なる種類であってもよい。例えばワクチ
ンとして用いる場合には、ワクチンを接種する個体への
感染性のあるウイルスが望ましく、一般に組み換え用の
ウイルスとして用いられているウイルス、具体例として
はラクーンポックスウイルス、ワクチニアウイルス等の
オルソポックスウイルス類やピジョンポックスウイル
ス、フォウルポックスウイルス、カナリーポックスウイ
ルス、七面鳥ポックスウイルス等のアビポックスウイル
ス類（以下、ＡＰＶという）などのポックスウイルスに
属するウイルスや、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）
等のヘルペスウイルス類、アデノウイルス類、インフル
エンザウイルス類などが例示される。

【００１１】ほ乳類用ワクチンを得る場合には、ワクチ
ニアウイルスを用いるのが好ましく、その具体例として
は、コペンハーゲン株、ＷＲ株などが挙げられる。鳥類
用ワクチンを得る場合には、ＡＰＶを用いるのが好まし
く、ＡＰＶの種類は鳥類に感染するものである限り如何
なるウイルスでもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家
禽類の細胞中で増殖可能な、例えばＦＰＶ、ピジョンポ
ックスウイルス、カナリーポックスウイルス、七面鳥ポ
ックスウイルス、クエルポックスウイルス等が例示され
る。その具体例としては、ＦＰＶではＡＴＣＣ ＶＲ−
２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−２
２９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２８
８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワクチン
株由来のウイルスのうち、鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に
感染したとき大きいプラークを形成するものなどのごと
き狭義のＦＰＶや、ＮＰ株（鶏胎化鳩痘中野株）等のご
とき狭義のＦＰＶと近縁のウイルスであって、鳩痘生ワ
クチン株として使用されるウイルスなどが例示される。
これらは、市販または分譲などにより容易に入手でき
る。

【００１２】（非必須領域）本発明で使用される非必須
領域は、親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域であ
り、親ウイルスがワクチニアウイルスである場合の具体
例としては、ワクチニアウイルスのＴＫ遺伝子領域、Ｈ
Ａ遺伝子領域などが例示され、親ウイルスがアビポック
スウイルスである場合は、ＴＫ遺伝子領域や特開平１−
１６８２７９号に記載されている領域を使用することが
できる。その具体例としては、例えば前記公報に記載さ
れたＡＰＶのＮＰ株ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（約７．３
ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｋ
ｂ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片（約５．２ｋｂ）、クエルポックスウイルスのＴ
Ｋ遺伝子領域、七面鳥ポックスウイルスのＴＫ遺伝子領
域等、あるいはこれらと相同組み換えを起こす領域が例
示される。

【００１３】（非必須領域を含有するベクター）後述す
る本発明の組み換え用ベクターの構築には、ウイルスの
非必須領域をクローニングするためのベクターが用いら
れる。このようなベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、
ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプ
ラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファー
ジ、ｐＨＣ７９等のコスミド等のベクターを適当な制限
酵素で処理して、常法に従って上述したようなウイルス
非必須領域のＤＮＡ断片を組み込むことにより得られ
る。

【００１４】（組み換え用ベクター）本発明で用いる組
み換え用ベクターは、抗原遺伝子とそれを支配するプロ
モーターが挿入された非必須領域を含むものである。前
述の非必須領域を含むベクターのウイルス非必須領域に
後述するｇＥ遺伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、お
よび抗原遺伝子と、さらにそれぞれ各遺伝子を支配する
プロモーターを挿入すればよく、また、そのようなベク
ター由来の抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが
挿入されたウイルスの非必須領域を含む断片を他のベク
ターに組み込んだりしてもよい。さらに、組み換えウイ
ルスの純化などの効率化のために大腸菌のｌａｃＺ遺伝
子などのマーカー遺伝子とそれを発現するための後述す
るプロモーターを組み込んでもよい。

【００１５】（ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子）本発明で用い
るｇＥ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、ヘルペス属に属する
ウイルスのゲノム由来のものであればよい。ヘルペス属
ウイルスは、人に感染する単純ヘルペスウイルス、ウシ
に感染する牛ヘルペスウイルス、馬に感染する馬ヘルペ
スウイルス、ブタに感染するオーセスキー病ウイルス、
猫に感染する猫鼻気管炎ウイルスなど哺乳類に感染する
ヘルペス属ウイルスや、マレック病ウイルス、伝染性咽
頭気管炎ウイルスなど鳥類に感染するヘルペス属ウイル
ス等が挙げられる。ワクチン接種の対象となる動物種に
感染するウイルス由来のｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子を利用
するのが好ましい。即ち、鶏用ワクチンとして利用する
にはマレック病ウイルス由来の遺伝子を用いるのが好ま
しい。

【００１６】また、本発明のｇＥ遺伝子やｇＩ遺伝子
は、必ずしも完全なｇＥまたはｇＩをコードするもので
ある必要はなく、ｇＥ遺伝子またはｇＩ遺伝子と実質的
に同等である遺伝子であればよい。ここで言う実質的に
同等である遺伝子とは、天然のヘルペス属ウイルス
［Ａ］のｇＥ遺伝子またはｇＩ遺伝子の全長を１００％
としたとき、一部の塩基の欠落や挿入、付加などの自然
または人工的な変異によって通常約８０％〜約１２０％
程度、好ましくは約９０％〜１１０％程度の範囲で全長
（塩基の長さ）が変化した前記ウイルス［Ａ］由来の遺
伝子や、自然または人工的な変異によりｇＥ遺伝子また
はｇＩ遺伝子の塩基の一部（ここで言う一部とは、通
常、全体の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに
好ましくは５％以下）が置換され、別のアミノ酸をコー
ドする塩基に変化した前記ウイルス［Ａ］由来の遺伝子
であるが、前記ウイルス［Ａ］由来の天然のｇＥまたは
ｇＩとその変異体であるｇＥまたはｇＩとのアミノ酸配
列での比較において、相同性が通常８０％以上、好まし
くは９０％以上、より好ましくは９５％以上である必要
がある。なお、本発明で言う相同性とは、ＤＮＡシーケ
ンス入力解析システム「ＤＮＡＳＩＳ」（発売元：宝酒
造（株））により測定されたものを指標とするものであ
る。

【００１７】本発明において人工的な変異を起こす方法
は特に制限されず、常法に従って行うことができる。そ
の具体例としては、天然のｇＥ遺伝子を適当な制限酵素
で処理した後、アミノ酸への翻訳の読み枠がずれないよ
うに適当なＤＮＡ断片を挿入し（または脱落させて）、
再び連結する方法やＦｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの
インビトロ突然変異法（Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７−６４９７（１９８
２））などによりアミノ酸の一部を別のアミノ酸に翻訳
するように改変させる方法などが挙げられる。

【００１８】上述した範囲内での変異であれば、遺伝子
によってコードされたタンパク質は、通常天然のｇＥや
ｇＩの機能は実質的に等価の機能を有していると考えら
れる。ここでいう天然のｇＥやｇＩの機能とは、ｇＩと
ｇＥとの複合体（ｇＩ−ｇＥ）またはｇＥ単独が、Ｉｇ
ＧのＦｃ部位と結合する生理活性を有し、その結果、保
体または抗体依存性の細胞障害による免疫応答が阻害さ
れる機能であり、出生直後の移行抗体の約５０％をまだ
保有している生物に、抗原遺伝子、ｇＥ遺伝子、必要に
応じてｇＩ遺伝子を組み込んだ組み換えウイルスをワク
チンとして接種し、移行抗体が約１０％程度となった時
点で強毒株を接種し、移行抗体が実質的に失われた時点
での感染防御率が、ｇＥ、ｇＩ非発現で同じ抗原遺伝子
を組み込んだ組み換えウイルスをワクチンとして接種し
た群の約１．５倍以上、好ましくは約２倍以上であると
きを天然のｇＥ、ｇＩと実質的に等価の機能であると判
断する。

【００１９】上述したヘルペス属ウイルス由来のｇＥ遺
伝子またはこれと実質的に同等の遺伝子の具体例として
は、マレック病ウイルスＩ型 ＧＡ株由来の配列番号１
３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば配列
番号１１の第１２０７番目〜第２６９７番目の配列が挙
げられる。また、上述したヘルペス属ウイルス由来のｇ
Ｉ遺伝子またはこれと実質的に同等の遺伝子の具体例と
しては、マレック病ウイルスＩ型 ＧＡ株由来の配列番
号１２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば
配列番号１１記載の第１番目〜第１０６５番目の配列が
挙げられる。

【００２０】本発明においては、ｇＥ遺伝子のみでも移
行抗体の影響を受けにくいワクチンとしての効果を得る
ことはできるが、より高い効果を得るためにはｇＩ遺伝
子と共に組み込むのが望ましい。組み換えウイルス中の
ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子および後述する抗原の遺伝子の
連結の順番は、各遺伝子が実質的にｇＥ、ｇＩおよび抗
原タンパク質を発現し得るように連結されている限り特
に制限されない。すなわち、５’上流側からｇＥ遺伝子
−ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺
伝子−抗原遺伝子の順番、ｇＥ遺伝子−抗原遺伝子−ｇ
Ｉ遺伝子の順番、ｇＩ遺伝子−抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子
の順番、抗原遺伝子−ｇＥ遺伝子−ｇＩ遺伝子の順番、
抗原遺伝子−ｇＩ遺伝子−ｇＥ遺伝子の順番の何れであ
っても構わないが、操作上の簡便さから、ｇＩ遺伝子の
後ろ（３’側）にｇＥ遺伝子が連結され、抗原遺伝子は
これらの遺伝子の５’側または３’側に連結するのが望
ましい。また、組み換えウイルスの選択に有用なマーカ
ー遺伝子を組み込む場合、その連結部位も特に制限され
ない。これらの遺伝子の連結方法も特に制限されず、適
当なリンカー等を用いて各遺伝子を連結させて予め挿入
すべき遺伝子を作製する方法や各遺伝子を有するベクタ
ーを用いる相同組み換えにより組み換えベクターを直接
作製する方法などの常法に従って連結することができ
る。

【００２１】（異種外来抗原タンパク質、抗原遺伝子）
本発明において異種外来抗原タンパク質は、親ウイルス
とは異なるウイルスや細菌由来のタンパク質であり、親
ウイルス中で転写、翻訳されて抗原タンパク質として発
現されるものであればよい。鶏用ワクチンを得る場合の
異種抗原タンパク質をコードするＤＮＡ（抗原遺伝子）
の具体例としては、ＭＤＶの糖タンパク質をコードする
遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７
０、１７８９−１８０４（１９８８））、ＮＤＶのＨＮ
をコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７（１９８
６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎ
ｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５、３４３−３５６
（１９８６））、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの
構造タンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌｉ
ｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１、１３０３−
１３１２（１９９０））等の感染防御に関与した抗原を
コードした遺伝子が好ましい。

【００２２】（プロモーター）本発明で用いるプロモー
ターは、組み換えウイルス感染宿主中でプロモーターと
して機能するののであれば、特に限定されない。例え
ば、ＶＶやＡＰＶなどのポックスウイルスを親ウイルス
とする場合では、７．５Ｋポリペプチドをコードするワ
クチニアウイルス遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペ
プチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモ
ーター、チミジンキナーゼをコードするワクチニアウイ
ルス遺伝子のプロモーターなどが例示されるほか、プロ
モーターとして機能する限りにおいては、一部を削除す
るなど改変したものであってもよく、また合成されたも
のであってもよい。本発明のおいては、初期プロモータ
ーと後期プロモーターの両方の配列を有する合成プロモ
ーター（Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．、２１５、７４９−７６９、およびｐ７７１−
７８１（１９８９））やその一部をプロモーター活性が
喪失しない範囲で削除する、塩基を変更するなどして改
変したもの（例えば、塩基配列が、５’−ＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧ
ＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴ
ＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣ−３’で示されるもの）を用いる
ことが特に好ましい。なお、この合成プロモーターある
いはその改変物は、その塩基配列の５’側の端にＴ（チ
ミジン）が多数連続しているが、プロモーター活性の高
さ、抗原遺伝子の発現量の多さの点から、１５〜４０個
のＴが連続していることが好ましく、１８〜３０個のＴ
が連続していることがより好ましい。

【００２３】もちろん、ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、抗原
遺伝子、マーカー遺伝子をそれぞれ支配するように、プ
ロモーターを連結させることができるが、各遺伝子に連
結したプロモーターは、必ずしも同じプロモーターであ
る必要はない。

【００２４】（組み換えウイルスの作製方法）組み換え
ウイルスの作製方法は特に限定されず、常法に従って行
えばよい。すなわち、予め親ウイルスを感染させた細胞
に、例えば、リン酸カルシウム共沈法等によりｇＥ遺伝
子、ｇＩ遺伝子、抗原遺伝子等を有する組み換えベクタ
ーが導入されることにより、ベクターと感染細胞中のウ
イルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換えが起こり、組
み換えウイルスが構築される。得られた組み換えウイル
スは、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞
に感染させ、生育してくるプラークを組み込んだ抗原遺
伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法や、抗
原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方
法により候補株を純化し、組み込んだ抗原遺伝子により
コードされたポリペプチドに対する抗体を使用し、イム
ノアッセイ等の方法により、目的の組み換えウイルスで
あることを確認すればよい。例えば、マーカー遺伝子と
してｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えＡＰＶ
の場合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、そ
の気質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−Ｂ
ＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するので、その
性質を利用して選択、純化することができる。宿主細胞
としては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可
能なものであれば特に限定されず、例えば、ＦＰＶを用
いた場合は、鶏繊維芽（ＣＥＦ）細胞や、発育鶏卵しょ
う尿膜細胞等が挙げられる。

【００２５】（ワクチン）本発明のワクチンは、１種類
以上の本発明の組み換えウイルスからなるワクチンであ
る。即ち、本発明により開示されたＭＤＶ由来のｇＥ遺
伝子またはｇＥ遺伝子とｇＩ遺伝子、および抗原遺伝子
等を有する組み換えウイルスを単独で用いるほか、他の
２〜３種類の組み換えウイルスを組み合わせてもよい。
また、組み換えウイルス以外にも薬理学的に問題のない
キャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含んでい
てもよい。本発明のワクチンの調製方法は特に限定され
ない。例えば、本発明で組み換えウイルスが生育するこ
とのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスで感染
し、組み換えウイルスが増殖するまで培養する。その
後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離
機によって遠心分離チューブ中で沈殿物と組み換えウイ
ルスを含んだ高力価上清とに分離する。本質的に宿主細
胞を含まず、細胞培養培地と組み換えウイルスを含んだ
この遠心上清は、本発明のワクチンとして使用できる。
また、薬理学的に受け入れられる生理食塩水などのよう
なもので、希釈して使用してもよい。遠心上清を凍結乾
燥することにより凍結乾燥ワクチンとしても利用でき
る。

【００２６】本発明のワクチンが鶏用ワクチンである場
合、ワクチン中の組み換えウイルスが家禽に感染して防
御免疫を引き起こすような方法であれば、どのような方
法で家禽に投与してもよい。例えば、翼膜穿刺、皮膚に
引っかき傷をつけてワクチンを接種したり、注射針やそ
の他の器具で家禽の皮下にワクチン接種することができ
る。また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料
の固形物に混入して、経口接種させることも可能であ
る。さらに、エアロゾルやスプレーなどによるワクチン
を吸入させる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔
内接種法等を用いることもできる。

【００２７】接種量は、例えば、鶏の場合、１羽あたり
通常１０〜１０⁶プラーク形成単位（ＰＦＵ）であり、
好ましくは１０²〜１０⁴ＰＦＵである。注射する場合に
は、この量を生理食塩水等の薬理学的に受け入れられる
液体で希釈して０．１ｍｌ程度にすればよい。本発明の
ワクチンは、普通のワクチンと同様の条件下で保存、使
用することが可能である。例えば、本発明の組み換えウ
イルスを凍結乾燥すれば、冷蔵庫（０〜４℃）での保存
が可能であり、さらに短期間であれば室温（２０〜２２
℃）での保存も可能である。また、ウイルスの懸濁液を
−２０〜−７０℃にして凍結させ、保存することも可能
である。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

【００２９】（実施例１）ＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡ
の抽出 ＭＤＶのＧＡ株が感染したＣＥＦ細胞をトリプシン処理
でシャーレにより回収し、ＰＢＳで２回その細胞を洗っ
た後、プロテナーゼＫバッファー（１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤ
Ｓ）で懸濁し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を５０μｇ／ｍｌの
濃度になるように加えた。５５℃で２時間放置した後、
フェノール／クロロホルムで２回、タンパク質の除去を
行い、２倍量のエタノールを加えて−２０℃で２０分間
放置した後、遠心し、ＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡを
得た。

【００３０】（実施例２）ＭＤＶのｇＩ、ｇＥ遺伝子の
クローニング ｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とをＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤ
ＮＡからクローンニングするためにＶｅｌｉｃｅｒらが
発表したＭＤＶのＧＡ株のユニークショート領域の塩基
配列（Ｖｅｌｉｃｅｒら、米国特許第５，２５２，７１
６号）をもとに配列番号１および２記載の２種類のＤＮ
Ａプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴ
ＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号
１）、５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡ
ＡＡＴＴ−３’（配列番号２））を使用した。配列番号
１のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＩ遺伝子
の第１番目〜１８番目に記載される塩基配列を含み、配
列番号２のプライマーは、配列番号１１で示されるｇＥ
遺伝子の第１４９６番目〜１５１８番目に記載される塩
基配列を含む。これらのプライマーを用いて実施例１で
得たＭＤＶのＧＡ株ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラ
ーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲという）
により、ｇＩ遺伝子の全長およびｇＥ遺伝子の一部を有
するＤＮＡ断片の増幅を行った。反応組成はＭＤＶゲノ
ムＤＮＡ２０ピコグラムを含む水溶液６４．５μｌに８
μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ反応バッファー（２００ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム、２
５ｍＭ塩化マグネシウム）、４μｌの２．５ｍＭのｄＮ
ＴＰｓ、５Ｕ／μｌ濃度のタックポリメラーゼ０．５μ
ｌおよび２０μｍの各プライマー１μｌづつを加えた。
反応条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを５５℃
で２分間、ポリメラーゼ反応を７２℃で２分間、３０サ
イクロをパーキンエルマーシータス社製のサーマルサイ
クラー４８０で行った。その結果、ｇＩ遺伝子の全長と
ｇＥ遺伝子の５’末端の一部の塩基配列を含む約１．５
ｋｂのＤＮＡ断片を得た。

【００３１】実施例１で得たＭＤＶのＧＡ株を各種制限
酵素で切断後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行
い、ゲル中のＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトラン
スファーし、前述のＰＣＲ産物をプローブとしたサザン
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｇＩ遺伝
子を含む約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ ＤＮＡ
断片とｇＥ遺伝子を含む約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片がハイブリダイズしている事
を確認した。これらのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のＢａ
ｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部
位にクローニングし、それぞれｐＵＣ−ｇＩ−１とｐＵ
Ｃ−ｇＥ−１を得た。ｐＵＣ−ｇＥ−１にクローニング
した約６．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮ
Ａ断片を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製
した。これを利用して、ｇＥ遺伝子を含む約２．２ｋｂ
のＫｐｎＩ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＫｐ
ｎＩ−ＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ
−ｇＥ−２を得た。ｇＥ遺伝子の全塩基配列（配列番号
１１中、第１２０７〜２７００番目の塩基配列）は、サ
ンガーのダイデオキシチェーンターミネーション法（Ｓ
ａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７（１９７７））
によって、ｐＵＣ−ｇＥ−２の一連の欠失変異体の配列
を調べることにより決定した。

【００３２】（実施例３）ＦＰＶ組み換え用プラスミド
ｐＮＺ５９２９（図１参照） プラスミドｐＮＺ９８（特開平３−２７８４号公報記
載）を制限酵素ＳａｃＩで部分消化後、さらに制限酵素
ＢａｍＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を
回収した。一方、プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎ
ａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１
４０８（１９９２））をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化
し、この部位に配列番号３と配列番号４に記載の２種類
の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧ
ＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号３）、５’−ＧＧＣＣ
ＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニー
リングしたＳｆｉＩ部位を含む合成アダプターを挿入
し、プラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを構築した。このプラ
スミドｐＮＺ１８２９Ｒを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
後、さらに制限酵素ＳａｃＩで部分消化し、前述の約
１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡ断片を挿入
して、目的のプラスミドｐＮＺ５９２９を構築した。

【００３３】（実施例４）抗原遺伝子挿入用プラスミド
ｐＧＰＴｓおよびｐＧＴＰ７．５の構築 プラスミドｐＧＰＴｓは、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ
−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７１９Ｒ（Ｙａｎ
ａｇｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１
４０８（１９９２））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａ
ｌＩで消化して得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を挿
入し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号
５記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣ
ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａ
ｌＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ
（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）
を挿入し、最後にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号
７記載の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧ
ＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。プ
ラスミドｐＧＴＰ７．５は、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１０３７（Ｏｇａ
ｗａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８、４８６−４９０（１９９
０））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで消化し
て得られた約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、さらに
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載の合成
ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
ＣＴＴＧＣＡ−３’）を挿入し、次にＳａｌＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ部位に配列番号６記載の合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧ
ＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’）を挿入し、最後
にＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に配列番号７記載の合成Ｄ
ＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡ
ＧＣＴ−３’）を挿入して構築した。

【００３４】（実施例５）ＦＰＶ組み換え用プラスミド
ｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥの構築（図２、３参照） 実施例２で得たｐＵＣ−ｇＥ−１を鋳型とし、配列番号
８と９に示すプライマーを利用してＰＣＲを行った。反
応組成および条件は、実施例２と同様とした。得られた
ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化
後、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、プラスミドｐ
ＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位の間にＢ
ｇｌＩＩ部位を作るための配列番号１０記載の合成ＤＮ
Ａ（５’−ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡ−３’）を組
み込んで調製したプラスミドｐＵＣ−ＸＧのＢｇｌＩＩ
−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ−ｇＥ−Ｐ
ＣＲを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配列を確認
したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなかった。こ
のプラスミドｐＵＣ−１８−ｇＥ−ＰＣＲを制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩとＳａｌＩとで消化後、約１．５ｋｂのＤＮＡ
断片を回収し、ｐＧＴＰｓのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位
に挿入し、プラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを構築した。こ
のプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素ＢｇｌＩで消
化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片をＦＰＶ組み換え用ベクターｐＮＺ１８２９−Ｓ
ｆｉのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的の組み換え用プラス
ミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥを構築した。

【００３５】（実施例６）ＦＰＶ組み換え用プラスミド
ｐＮＺ５９２９−ｇＥの構築（図４参照） 実施例５で得たプラスミドｐＧＰＴｓ−ｇＥを制限酵素
ＢｇｌＩで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用
ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、目的
の組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥを構築し
た。

【００３６】（実施例７）ＦＰＶ組み換え用プラスミド
ｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥの構築（図５、６） 実施例２のＰＣＲで得た約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制
限酵素ＫｐｎＩで消化後、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで
部分消化し、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。こ
のＤＮＡ断片を実施例４で得たｐＧＴＰ７．５のＢａｎ
ＨＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入して、プラスミドｐＧＴＰ
７．５−ｇＩを構築した。挿入したＤＮＡ断片の塩基配
列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見られなか
った。このプラスミドｐＧＴＰ７．５−ｇＩを制限酵素
ＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を実施例３で得たＦＰＶ組み換え用
ベクターｐＮＺ５９２９のＳｆｉＩ部位に挿入し、プラ
スミドｐＮＺ５９２９−ｇＩを構築した。次に、実施例
５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥを制限酵素Ｂｇｌ
Ｉで消化後、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。こ
のＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ
のＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え用プラ
スミドｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩｇＥを構築した。

【００３７】（実施例８）組み換えＦＰＶの作製と純化 単層になったＣＥＦにＦＰＶのワクチンから単離した大
型プラーク形成を表現型として持つウイルス（Ｎａｚｅ
ｒｉａｎら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．、３３、４５８−４
６５（１９８９））を０．１の感染多重度で感染した。
３時間後、これらの細胞をトリプシン処理で剥がし、細
胞懸濁液とした。この懸濁液からの２×１０⁷個の細胞
と１０μｇの組み換え用プラスミドの混合物をＳａｌｉ
ｎｅ Ｇ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化
カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、０．
５ｍＭ塩化マグネシウム６水和物、０．０１１％グルコ
ース）に懸濁し、室温において、ジーンパルサー（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓｅｃ条
件下で、エレクトロポレーションした。プラスミドを導
入した細胞を、その後、３７℃で７２時間培養し、３回
の凍結乾燥によって細胞を溶解した。放出した組み換え
ウイルスは次のように選別された。

【００３８】溶解した細胞から放出された子孫ウイルス
を含んだ溶解液の１０倍段階希釈液を継代したＣＥＦに
感染させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層
した。室温中で寒天を固めた後、典型的なＦＰＶのプラ
ークが出現するまで３７℃で培養した。さらにＢｌｕｏ
−ｇａｌを２５０μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天をそれぞれ
の培養プレートに重層し、さらに２４時間３７℃で培養
した。すべての子孫ウイルスに対して、およそ１％の比
率で青色プラークが出現した。これらの青色プラークを
単離し、含まれているウイルスを回収し、形成する全て
のプラークがＢｌｕｏ−ｇａｌで青く染まるまで、同じ
方法でさらに組み換えウイルスの純化を行った。通常、
この過程は３〜４回で終了する。この純化されたウイル
スを、ｆＮＺ５９２９と名付けた。このｆＮＺ５９２９
は、サザンハイブリダイゼーション法により解析され、
ＮＤＶのＦ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子が予想通りの位置に
あることが確認された。実施例４、５、６で示した組み
換え用プラスミドｐＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｐＮＺ５９２
９−ｇＥ、ｐＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥは、上記
と同様の方法でＦＰＶ感染細胞に導入し、得られた組み
換えウイルスを、それぞれｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ、ｆＮ
Ｚ５９２９−ｇＥ、ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥ
と名付けた。

【００３９】（実施例９）組み換えウイルスを接種した
鶏の強毒ＮＤＶに対する感染防御効果 組み換えＦＰＶは、穿刺用針で１０⁴ＰＦＵを、３日齢
のニューカッスル病に対する移行抗体保有鶏の右側翼膜
に接種し、３１日齢で１０⁴ＰＦＵの強毒ＤＮＶ佐藤株
をモモの筋肉中に接種した。その後、４５日齢になるま
でニューカッスル病による死亡を記録した。この結果
を、表１に示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】この結果によれば、未接種、親株ＦＰＶ、
ｆＮＺ２９ＭＤ−ｇＥ接種群の鶏は、強毒ＮＤＶの攻撃
試験に対し、ほとんどすべてニューカッスル病で死亡し
たが、ＮＤＶのＦ遺伝子を挿入した組み換えＦＰＶであ
るｆＮＺ５９２９を接種した鶏では、２４％が生存し、
ｆＮＺ５９２９にｇＥ遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２９
−ｇＥ、ｇＥとｇＩの両遺伝子を挿入したｆＮＺ５９２
９−ｇＩ−ｇＥの本発明の組み換えＦＰＶを接種した鶏
の生存率は、それぞれ３８％、４７％であった。特に、
ｆＮＺ５９２９−７．５ｇＩ−ｇＥのワクチン効果はｆ
ＮＺ５９２９のそれと比較して約２倍であったことか
ら、ヘルペス属ウイルスのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを
抗原遺伝子と共に組み込んだ組み換えウイルスは、移行
抗体存在条件下でも有効なワクチンとして機能すること
が判った。

【００４２】（実施例１０）ＦＰＶ組み換え用プラスミ
ドｐＮＺ９９２９ＶＰ２Ｓ−７．５ｇＩ−ｇＥの構築と
組み換えＦＰＶの作製 大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研寄託番号：微工研菌寄第
１２４２２号）から常法により抽出できる約６．０ｋｂ
のプラスミドｐＩＢＤＶをＰｖｕＩで消化後、接着末端
をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化
して約３．２ｋｂｐのＩＢＤＶ ＳｅｇＡ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を回収した。実施例３で構築したプラスミド
ｐＮＺ１８２９ＲをＢａｍＨＩで消化後、接着末端をＫ
ｌｅｎｏｗで平滑末端にし、さらにＫｐｎＩで消化して
開裂した部位に上記の約３．２ｋｂｐのＳｅｇＡ ＤＮ
Ａ断片を挿入して、プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡを
構築した。次に実施例７で得たプラスミドｐＧＴＰ７．
５−ｇＩをＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ
断片を回収した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＮ
Ｚ２９ＲＳｅｇＡのＳｆｉＩ部位に挿入し、プラスミド
ｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩを構築した．さらに
実施例５で得たプラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥをＢｇｌＩ
で消化後、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。こ
のＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−７．
５ｇＩのＳｆｉＩ部位に挿入し、目的のＦＰＶ組み換え
用プラスミドｐＮ２９ＲＳｅｇＡ−７．５ｇＩｇＥを構
築した。

【００４３】このプラスミドを用いて実施例８と同様の
手法で組み換えＦＰＶを作製し、純化した。得られた組
み換えＦＰＶは、実施例９で示されたのと同様、組み換
え生ワクチンとして有効であると期待される。

【００４４】

【発明の効果】かくして本発明によれば、親ウイルスの
増殖に非必須なゲノム領域にニューカッスル病の感染防
御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤＶのｇＩ、ｇＥ
遺伝子を組み込まれた組み換えウイルスが得られ、この
組み換えウイルスは、ニューカッスル病に対する移行抗
体を保有している鶏に接種すると、この移行抗体の影響
を低減し、ワクチンとしての高い効果を有する。さらに
本発明のワクチンは、マレック病、伝染性ファブリキウ
ス嚢病、伝染性喉頭気管炎等のニューカッスル病以外の
病原体の感染防御抗原をコードした遺伝子とともにＭＤ
ＶのｇＩ遺伝子とｇＥ遺伝子とを組み換えウイルスに挿
入した場合にも同様のワクチン効果が期待できる。

【００４５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGGAGATCT GCGATGTATG TACTACAATT A 31

【００４６】

【配列表】

配列番号：2 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGATCCGCAT CGACAATAAA TT 22

【００４７】

【配列表】

配列番号：3 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCGGCCG GGGGGGCCAG CT 22

【００４８】

【配列表】

配列番号：4 配列の長さ：14４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCCCCCCCG GCCG 14

【００４９】

【配列表】

配列番号：5 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTGCCCCC CCGGCAAGCT TGCA 24

【００５０】

【配列表】

配列番号：6 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACATTTT TATGTAC 17

【００５１】

【配列表】

配列番号：7 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCGGCCG GGGGGGCCAG CT 22

【００５２】

【配列表】

配列番号：8 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGAGATCT CATAATGTGT GTTTTCCAAA TC 32

【００５３】

【配列表】

配列番号：9 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGTCGAC GTCCATATAC TATATCCC 28

【００５４】

【配列表】 配列番号：10 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTAGATCT TGCA 14

【００５５】

【配列表】

配列番号：11 配列の長さ：2760 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名： マレック病ウィルス Ｉ型 株名： ＧＡ株 配列 ATG TAT GTA CTA CAA TTA TTA TTT TGG ATC CGC CTC TTT CGA GGC ATC 48 Met Tyr Val Leu Gln Leu Leu Phe Trp Ile Arg Leu Phe Arg Gly Ile 1 5 10 15 TGG TCT ATA GTT TAT ACT GGA ACA TCT GTT ACG TTA TCA ACG GAC CAA 96 Trp Ser Ile Val Tyr Thr Gly Thr Ser Val Thr Leu Ser Thr Asp Gln 20 25 30 TCT GCT CTT GTT GCG TTC TGC GGA TTA GAT AAA ATG GTG AAT GTA CGC 144 Ser Ala Leu Val Ala Phe Cys Gly Leu Asp Lys Met Val Asn Val Arg 35 40 45 GGC CAA CTT TTA TTC CTG GGC GAC CAG ACT CGG ACC AGT TCT TAT ACA 192 Gly Gln Leu Leu Phe Leu Gly Asp Gln Thr Arg Thr Ser Ser Tyr Thr 50 55 60 GGA ACG ACG GAA ATC TTG AAA TGG GAT GAA GAA TAT AAA TGC TAT TCC 240 Gly Thr Thr Glu Ile Leu Lys Trp Asp Glu Glu Tyr Lys Cys Tyr Ser 65 70 75 80 GTT CTA CAT GCG ACA TCA TAT ATG GAT TGT CCT GCT ATA GAC GCC ACG 288 Val Leu His Ala Thr Ser Tyr Met Asp Cys Pro Ala Ile Asp Ala Thr 85 90 95 GTA TTC AGA GGC TGT AGA GAC GCT GTG GTA TAT GCT CAA CCT CAT GAT 336 Val Phe Arg Gly Cys Arg Asp Ala Val Val Tyr Ala Gln Pro His Asp 100 105 110 AGA GTA CAA CCT TTT CCC GAA AAG GGA ACA TTG TTG AGA ATT GTC GAA 384 Arg Val Gln Pro Phe Pro Glu Lys Gly Thr Leu Leu Arg Ile Val Glu 115 120 125 CCC AGA GTA TCA GAT ACA GGC AGC TAT TAC ATA CGT GTA GCT CTC GCT 432 Pro Arg Val Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Tyr Ile Arg Val Ala Leu Ala 130 135 140 GGA AGA AAT ATG AGC GAT ATA TTT AGA ATG GCT GTT ATT ATA AGG AGT 480 Gly Arg Asn Met Ser Asp Ile Phe Arg Met Ala Val Ile Ile Arg Ser 145 150 155 160 AGC AAA TCT TGG GCC TGT AAT CAC TCT GCT AGT TCA TTT CAG GCC CAT 528 Ser Lys Ser Trp Ala Cys Asn His Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ala His 165 170 175 AAA TGT ATT CGC TAT GTC GAC CGT ATG GCC TTT GAA AAT TAT CTG ATT 576 Lys Cys Ile Arg Tyr Val Asp Arg Met Ala Phe Glu Asn Tyr Leu Ile 180 185 190 GGA CAT GTA GGC AAT TTG CTG GAC AGT GAC TCG GAA TTG CAT GCA ATT 624 Gly His Val Gly Asn Leu Leu Asp Ser Asp Ser Glu Leu His Ala Ile 195 200 205 TAT AAT ATT ACT CCC CAA TCC ATT TCC ACA GAT ATT AAT ATT ATA ACG 672 Tyr Asn Ile Thr Pro Gln Ser Ile Ser Thr Asp Ile Asn Ile Ile Thr 210 215 220 ACT CCA TTT TAC GAT AAT TCG GGA ACA ATT TAT TCA CCT ACG GTT TTT 720 Thr Pro Phe Tyr Asp Asn Ser Gly Thr Ile Tyr Ser Pro Thr Val Phe 225 230 235 240 AAT TTG TTT AAT AAC AAT TCC CAT GTC GAT GCA ATG AAT TCG ACT GGT 768 Asn Leu Phe Asn Asn Asn Ser His Val Asp Ala Met Asn Ser Thr Gly 245 250 255 ATG TGG AAT ACC GTT TTA AAA TAT ACC CTT CCA AGG CTT ATT TAC TTT 816 Met Trp Asn Thr Val Leu Lys Tyr Thr Leu Pro Arg Leu Ile Tyr Phe 260 265 270 TCT ACG ATG ATT GTA CTA TGT ATA ATA GCA TTG GCA ATT TAT TTG GTC 864 Ser Thr Met Ile Val Leu Cys Ile Ile Ala Leu Ala Ile Tyr Leu Val 275 280 285 TGT GAA AGG TGC CGC TCT CCC CAT CGT AGG ATA TAC ATC GGT GAA CCA 912 Cys Glu Arg Cys Arg Ser Pro His Arg Arg Ile Tyr Ile Gly Glu Pro 290 295 300 AGA TCT GAT GAG GCC CCA CTC ATC ACT TCT GCA GTT AAC GAA TCA TTT 960 Arg Ser Asp Glu Ala Pro Leu Ile Thr Ser Ala Val Asn Glu Ser Phe 305 310 315 320 CAA TAT GAT TAT AAT GTA AAG GAA ACT CCT TCA GAT GTT ATT GAA AAG 1008 Gln Tyr Asp Tyr Asn Val Lys Glu Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Lys 325 330 335 GAG TTG ATG GAA AAA CTG AAG AAG AAA GTC GAA TTG TTG GAA AGA GAA 1056 Glu Leu Met Glu Lys Leu Lys Lys Lys Val Glu Leu Leu Glu Arg Glu 340 345 350 GAA TGT GTA TAGGTTTGAG AAACTATTAT AGGTAGGTGG TACCTGTTAG 1105 Glu Cys Val 355 CTTAGTATAA GGGGAGGAGC CGTTTCTTGT TTTAAAGACA CGAACACAAG GCCGTAAGTT 1165 TTATATGTGA ATTTTGTGCA TGTCTGCGAG TCAGCGTCAT A ATG TGT GTT TTC 1218 Met Cys Val Phe 1 CAA ATC CTG ATA ATA GTG ACG ACG ATC AAA GTA GCT GGA ACG GCC AAC 1266 Gln Ile Leu Ile Ile Val Thr Thr Ile Lys Val Ala Gly Thr Ala Asn 5 10 15 20 ATA AAT CAT ATA GAC GTT CCT GCA GGA CAT TCT GCT ACA ACG ACG ATC 1314 Ile Asn His Ile Asp Val Pro Ala Gly His Ser Ala Thr Thr Thr Ile 25 30 35 CCG CGA TAT CCA CCA GTT GTC GAT GGG ACC CTT TAC ACC GAG ACG TGG 1362 Pro Arg Tyr Pro Pro Val Val Asp Gly Thr Leu Tyr Thr Glu Thr Trp 40 45 50 ACA TGG ATT CCC AAT CAC TGC AAC GAA ACG GCA ACA GGC TAT GTA TGT 1410 Thr Trp Ile Pro Asn His Cys Asn Glu Thr Ala Thr Gly Tyr Val Cys 55 60 65 CTG GAA AGT GCT CAC TGT TTT ACC GAT TTG ATA TTA GGA GTA TCC TGC 1458 Leu Glu Ser Ala His Cys Phe Thr Asp Leu Ile Leu Gly Val Ser Cys 70 75 80 ATG AGG TAT GCG GAT GAA ATC GTC TTA CGA ACT GAT AAA TTT ATT GTC 1506 Met Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Val Leu Arg Thr Asp Lys Phe Ile Val 85 90 95 100 GAT GCG GGA TCC ATT AAA CAA ATA GAA TCG CTA AGT CTG AAT GGA GTT 1554 Asp Ala Gly Ser Ile Lys Gln Ile Glu Ser Leu Ser Leu Asn Gly Val 105 110 115 CCG AAT ATA TTC CTA TCT ACG AAA GCA AGT AAC AAG TTG GAG ATA CTA 1602 Pro Asn Ile Phe Leu Ser Thr Lys Ala Ser Asn Lys Leu Glu Ile Leu 120 125 130 AAT GCT AGC CTA CAA AAT GCG GGT ATC TAC ATT CGG TAT TCT AGA AAT 1650 Asn Ala Ser Leu Gln Asn Ala Gly Ile Tyr Ile Arg Tyr Ser Arg Asn 135 140 145 GGG GAC GAG GAC TGC AAG CTG GAT GTT GTT GTG GTT GGC GTT TTG GGT 1698 Gly Asp Glu Asp Cys Lys Leu Asp Val Val Val Val Gly Val Leu Gly 150 155 160 CAA GCA AGG GAT CGC CTA CGC CAA ATG TCC AGT CCT ATG ATC TCA TCC 1746 Gln Ala Arg Asp Arg Leu Arg Gln Met Ser Ser Pro Met Ile Ser Ser 165 170 175 180 CAC GCC GAT ATC AAG TTG TCA TTA AAA AAC TTT AAA GCA TTA GTA TAT 1794 His Ala Asp Ile Lys Leu Ser Leu Lys Asn Phe Lys Ala Leu Val Tyr 185 190 195 CAC GTG GGA GAT ACT ATC AAT GTC TCG ACG GCG GTT ATA CTA GGA CCT 1842 His Val Gly Asp Thr Ile Asn Val Ser Thr Ala Val Ile Leu Gly Pro 200 205 210 TCT CCG GAG ATA TTC ACA TTG GAA TTT AGG GTG TTG TTC CTC CGT TAT 1890 Ser Pro Glu Ile Phe Thr Leu Glu Phe Arg Val Leu Phe Leu Arg Tyr 215 220 225 AAT CCA ACG TGC AAG TTC GTC ACG ATT TAT GAA CCT GGT ATA TTT CAC 1938 Asn Pro Thr Cys Lys Phe Val Thr Ile Tyr Glu Pro Gly Ile Phe His 230 235 240 CCC AAA GAA CCA GAG GGT ATT ACT ACT GCA GAA CAA TCG GTA TGT CAT 1986 Pro Lys Glu Pro Glu Gly Ile Thr Thr Ala Glu Gln Ser Val Cys His 245 250 255 260 TTC GCA TCC AAC ATT GAC ATT CTG CAG ATA GCC GCC GCA CGT TCT GAA 2034 Phe Ala Ser Asn Ile Asp Ile Leu Gln Ile Ala Ala Ala Arg Ser Glu 265 270 275 AAT TGT AGC ACA GGG TAT CGT AGA TGT ATT TAT GAC ACG GCT ATC GAT 2082 Asn Cys Ser Thr Gly Tyr Arg Arg Cys Ile Tyr Asp Thr Ala Ile Asp 280 285 290 GAA TCT GTG CAG GCC AGA TTA ACC TTC ATA GAA CCA GGA ATT CCT TCC 2130 Glu Ser Val Gln Ala Arg Leu Thr Phe Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser 295 300 305 TTT AAA ATG AAA GAT GTC CAG GTA GAC GAT GCG GGA TTG TAT GTG GTT 2178 Phe Lys Met Lys Asp Val Gln Val Asp Asp Ala Gly Leu Tyr Val Val 310 315 320 GTG GCT TTA TAT AAT GGA CGT CCA AGT GCA TGG ACT TAC ATT TAT TTG 2226 Val Ala Leu Tyr Asn Gly Arg Pro Ser Ala Trp Thr Tyr Ile Tyr Leu 325 330 335 340 TCA ACG GTG GAA ACA TAT CTT AAT GTA TAT GAA AAC TAC CAC AAG CCG 2274 Ser Thr Val Glu Thr Tyr Leu Asn Val Tyr Glu Asn Tyr His Lys Pro 345 350 355 GGA TTT GGG TAT AAA TCA TTT CTA CAG AAC AGT AGT ATC ATC GAC GAA 2322 Gly Phe Gly Tyr Lys Ser Phe Leu Gln Asn Ser Ser Ile Ile Asp Glu 360 365 370 AAT GAG GCT AGC GAT TGG TCC AGC TCG TCC ATT AAA CGG AGA AAT AAT 2370 Asn Glu Ala Ser Asp Trp Ser Ser Ser Ser Ile Lys Arg Arg Asn Asn 375 380 385 GGT ACT ATC CTT TAT GAT ATT TTA CTC ACA TCG CTA TCA ATT GGG GCG 2418 Gly Thr Ile Leu Tyr Asp Ile Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ile Gly Ala 390 395 400 ATT ATT ATC GTC ATA GTA GGG GGT GTT TGT ATT GCC ATA TTA ATT AGG 2466 Ile Ile Ile Val Ile Val Gly Gly Val Cys Ile Ala Ile Leu Ile Arg 405 410 415 420 CGT AGG AGA CGA CGT CGC ACG CGG GGG TTA TTC GAT GAA TAT CCC AAA 2514 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Pro Lys 425 430 435 TAT ATG ACG CTA CCA GGA AAC GAT CTG GGG GGC ATG AAT GTA CCG TAT 2562 Tyr Met Thr Leu Pro Gly Asn Asp Leu Gly Gly Met Asn Val Pro Tyr 440 445 450 GAT AAT GCA TGC TCT GGT AAC CAA GTT GAA TAT TAT CAA GAA AAG TCG 2610 Asp Asn Ala Cys Ser Gly Asn Gln Val Glu Tyr Tyr Gln Glu Lys Ser 455 460 465 GAT AAA ATG AAA AGA ATG GGT TCG GGT TAT ACC GCT TGG CTA AAA AAT 2658 Asp Lys Met Lys Arg Met Gly Ser Gly Tyr Thr Ala Trp Leu Lys Asn 470 475 480 GAT ATG CCG AAA ATT AGG AAA CGC TTA GAT TTA TAC CAC TGATATGTAC 2707 Asp Met Pro Lys Ile Arg Lys Arg Leu Asp Leu Tyr His 485 490 495 ATATTTAAAC TTAATGGGAT ATAGTATATG GACGTCTATA TGACGAGAGT AAA 2760

【００５６】

【配列表】

配列番号：12 配列の長さ：355 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名： マレック病ウィルス Ｉ型 株名： ＧＡ株 配列 Met Tyr Val Leu Gln Leu Leu Phe Trp Ile Arg Leu Phe Arg Gly Ile 1 5 10 15 Trp Ser Ile Val Tyr Thr Gly Thr Ser Val Thr Leu Ser Thr Asp Gln 20 25 30 Ser Ala Leu Val Ala Phe Cys Gly Leu Asp Lys Met Val Asn Val Arg 35 40 45 Gly Gln Leu Leu Phe Leu Gly Asp Gln Thr Arg Thr Ser Ser Tyr Thr 50 55 60 Gly Thr Thr Glu Ile Leu Lys Trp Asp Glu Glu Tyr Lys Cys Tyr Ser 65 70 75 80 Val Leu His Ala Thr Ser Tyr Met Asp Cys Pro Ala Ile Asp Ala Thr 85 90 95 Val Phe Arg Gly Cys Arg Asp Ala Val Val Tyr Ala Gln Pro His Asp 100 105 110 Arg Val Gln Pro Phe Pro Glu Lys Gly Thr Leu Leu Arg Ile Val Glu 115 120 125 Pro Arg Val Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Tyr Ile Arg Val Ala Leu Ala 130 135 140 Gly Arg Asn Met Ser Asp Ile Phe Arg Met Ala Val Ile Ile Arg Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Trp Ala Cys Asn His Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ala His 165 170 175 Lys Cys Ile Arg Tyr Val Asp Arg Met Ala Phe Glu Asn Tyr Leu Ile 180 185 190 Gly His Val Gly Asn Leu Leu Asp Ser Asp Ser Glu Leu His Ala Ile 195 200 205 Tyr Asn Ile Thr Pro Gln Ser Ile Ser Thr Asp Ile Asn Ile Ile Thr 210 215 220 Thr Pro Phe Tyr Asp Asn Ser Gly Thr Ile Tyr Ser Pro Thr Val Phe 225 230 235 240 Asn Leu Phe Asn Asn Asn Ser His Val Asp Ala Met Asn Ser Thr Gly 245 250 255 Met Trp Asn Thr Val Leu Lys Tyr Thr Leu Pro Arg Leu Ile Tyr Phe 260 265 270 Ser Thr Met Ile Val Leu Cys Ile Ile Ala Leu Ala Ile Tyr Leu Val 275 280 285 Cys Glu Arg Cys Arg Ser Pro His Arg Arg Ile Tyr Ile Gly Glu Pro 290 295 300 Arg Ser Asp Glu Ala Pro Leu Ile Thr Ser Ala Val Asn Glu Ser Phe 305 310 315 320 Gln Tyr Asp Tyr Asn Val Lys Glu Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Lys 325 330 335 Glu Leu Met Glu Lys Leu Lys Lys Lys Val Glu Leu Leu Glu Arg Glu 340 345 350 Glu Cys Val 355

【００５７】

【配列表】

配列番号：13 配列の長さ：493 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名： マレック病ウィルス Ｉ型 株名： ＧＡ株 配列 Met Cys Val Phe Gln Ile Leu Ile Ile Val Thr Thr Ile Lys Val Ala 1 5 10 15 Gly Thr Ala Asn Ile Asn His Ile Asp Val Pro Ala Gly His Ser Ala 20 25 30 Thr Thr Thr Ile Pro Arg Tyr Pro Pro Val Val Asp Gly Thr Leu Tyr 35 40 45 Thr Glu Thr Trp Thr Trp Ile Pro Asn His Cys Asn Glu Thr Ala Thr 50 55 60 Gly Tyr Val Cys Leu Glu Ser Ala His Cys Phe Thr Asp Leu Ile Leu 65 70 75 80 Gly Val Ser Cys Met Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Val Leu Arg Thr Asp 85 90 95 Lys Phe Ile Val Asp Ala Gly Ser Ile Lys Gln Ile Glu Ser Leu Ser 100 105 110 Leu Asn Gly Val Pro Asn Ile Phe Leu Ser Thr Lys Ala Ser Asn Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Leu Asn Ala Ser Leu Gln Asn Ala Gly Ile Tyr Ile Arg 130 135 140 Tyr Ser Arg Asn Gly Asp Glu Asp Cys Lys Leu Asp Val Val Val Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Gly Gln Ala Arg Asp Arg Leu Arg Gln Met Ser Ser Pro 165 170 175 Met Ile Ser Ser His Ala Asp Ile Lys Leu Ser Leu Lys Asn Phe Lys 180 185 190 Ala Leu Val Tyr His Val Gly Asp Thr Ile Asn Val Ser Thr Ala Val 195 200 205 Ile Leu Gly Pro Ser Pro Glu Ile Phe Thr Leu Glu Phe Arg Val Leu 210 215 220 Phe Leu Arg Tyr Asn Pro Thr Cys Lys Phe Val Thr Ile Tyr Glu Pro 225 230 235 240 Gly Ile Phe His Pro Lys Glu Pro Glu Gly Ile Thr Thr Ala Glu Gln 245 250 255 Ser Val Cys His Phe Ala Ser Asn Ile Asp Ile Leu Gln Ile Ala Ala 260 265 270 Ala Arg Ser Glu Asn Cys Ser Thr Gly Tyr Arg Arg Cys Ile Tyr Asp 275 280 285 Thr Ala Ile Asp Glu Ser Val Gln Ala Arg Leu Thr Phe Ile Glu Pro 290 295 300 Gly Ile Pro Ser Phe Lys Met Lys Asp Val Gln Val Asp Asp Ala Gly 305 310 315 320 Leu Tyr Val Val Val Ala Leu Tyr Asn Gly Arg Pro Ser Ala Trp Thr 325 330 335 Tyr Ile Tyr Leu Ser Thr Val Glu Thr Tyr Leu Asn Val Tyr Glu Asn 340 345 350 Tyr His Lys Pro Gly Phe Gly Tyr Lys Ser Phe Leu Gln Asn Ser Ser 355 360 365 Ile Ile Asp Glu Asn Glu Ala Ser Asp Trp Ser Ser Ser Ser Ile Lys 370 375 380 Arg Arg Asn Asn Gly Thr Ile Leu Tyr Asp Ile Leu Leu Thr Ser Leu 385 390 395 400 Ser Ile Gly Ala Ile Ile Ile Val Ile Val Gly Gly Val Cys Ile Ala 405 410 415 Ile Leu Ile Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Arg Gly Leu Phe Asp 420 425 430 Glu Tyr Pro Lys Tyr Met Thr Leu Pro Gly Asn Asp Leu Gly Gly Met 435 440 445 Asn Val Pro Tyr Asp Asn Ala Cys Ser Gly Asn Gln Val Glu Tyr Tyr 450 455 460 Gln Glu Lys Ser Asp Lys Met Lys Arg Met Gly Ser Gly Tyr Thr Ala 465 470 475 480 Trp Leu Lys Asn Asp Met Pro Lys Ile Arg Lys Arg Leu Asp Leu Tyr 485 490 495 His 497

【００５８】

【図面の簡単な説明】

【図１】組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９の構築手
順を示した説明図である。

【図２】組み換え用プラスミドＰＧＰＴｓ−ｇＥの構築
手順を示した説明図である。

【図３】組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＭＤｇＥの
構築手順を示した説明図である。

【図４】組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−ｇＥの
構築手順を示した説明図である。

【図５】組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９−７．５
ｇＩの構築手順を示した説明図である。

【図６】組み換え用プラスミドｐＮＺ５９２９／７．５
ｇＥｇＩの構築手順を示した説明図である。

【図７】組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−
７．５ｇＩの構築手順を示した説明図である。

【図８】組み換え用プラスミドｐＮＺ２９ＲＳｅｇＡ−
７．５ｇＩｇＥの構築手順を示した説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
   にヘルペス属に属するウイルスの糖タンパク質ｇＥをコ
   ードするＤＮＡ、またはヘルペス属に属するウイルスの
   糖タンパク質ｇＥをコードするＤＮＡおよび糖タンパク
   質ｇＩをコードするＤＮＡを含有する組み換えウイル
   ス。
2. 【請求項２】 ヘルペス属に属するウイルスがマレック
   病ウイルスである請求項１記載の組み換えウイルス。
3. 【請求項３】 親ウイルスがアビポックスウイルスであ
   る請求項１または２記載の組み換えウイルス。
4. 【請求項４】 糖タンパク質ｇＥが配列番号１３または
   これらと相同性が９０％以上であるアミノ酸配列である
   請求項１、２または３記載の組み換えウイルス。
5. 【請求項５】 糖タンパク質ｇＩが配列番号１２または
   これらと相同性が９０％以上であるアミノ酸配列である
   請求項１、２、３、または４記載の組み換えウイルス。
6. 【請求項６】 さらに異種外来抗原タンパク質をコード
   するＤＮＡを含有する請求項１、２、３、４、または５
   記載の組み換えウイルス。
7. 【請求項７】 異種外来抗原タンパク質がニューキャッ
   スル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリ
   キウス嚢病ウイルス、および伝染性喉頭気管炎ウイルス
   からなる群より選択されるウイルス由来の抗原タンパク
   質である請求項６記載の組み換えウイルス。
8. 【請求項８】 異種外来抗原タンパク質がニューキャッ
   スル病ウイルスのＦ抗原タンパク質またはＨＮ抗原タン
   パク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＥ、伝染
   性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質、お
   よび伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢから
   なる群より選択される抗原タンパク質である請求項６記
   載の組み換えウイルス。
9. 【請求項９】 請求項６、７、または８記載の組み換え
   ウイルスを有効成分とするワクチン。