NL9120026A

NL9120026A - Mazelenvirus-recombinant pokkenvirusvaccin.

Info

Publication number: NL9120026A
Application number: NL9120026A
Authority: NL
Original assignee: Virogenetics Corp
Priority date: 1990-11-20
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 1993-09-01
Also published as: GB2283021B; ITMI913092A0; GB2283021A; FR2669346B1; CA2096633A1; CH683921A5; WO1992008789A1; JP2005040129A; GB9309414D0; AU1253892A; BE1005908A5; GB2264949B; IT1252687B; NL195095C; FR2669346A1; GB9500214D0; NL195058C; JPH06502996A; DE4192786B4; IE913960A1

Description

Mazelenvirus-recombinant pokkenvirusvaccin.

Terrein van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gemodificeerd pokkenvirus en op werkwijzen voor het maken en gebruiken daarvan. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een recombinant pokkenvirus dat genprodukten van een gen van Morbillivirus tot expressie brengt, en op vaccins die beschermende immuniteit geven tegen Morbillivirusinfecties.

In deze aanvrage worden verschillende publicaties aangehaald met Arabische cijfers tussen haakjes. Een volledige vermelding van deze referenties is te vinden aan het eind van de beschrijving direkt voorafgaande aan de conclusies. Deze referenties beschrijven de stand der techniek waarmee deze uitvinding verband houdt.

Achtergrond van de uitvinding,

Vacciniavirus en meer recentelijk andere pokkenvirussen zijn gebruikt voor de insertie en expressie van vreemde genen. De basistechniek voor de insertie van vreemde genen in levend infectieus pokkenvirus houdt recombinatie in tussen pokken-DNA-sequenties die een vreemd genetisch element flankeren in een donorplasmide, en homologe sequenties die aanwezig zijn in het ontvangende pokkenvirus (Piccini et al., 1987).

Specifiek worden de recombinante pokkenvirussen geconstrueerd in twee stappen die bekend zijn in het vakgebied en die analoog zijn aan de werkwijzen voor het creëren van synthetische recombinanten van het vacciniavirus, beschreven in Amerikaans octrooischrift 4.603.112, waarvan de beschrijving hier bij referentie wordt opgenomen.

Eerst wordt de DNA-gensequentie die in het virus geïnserteerd moet worden, in het bijzonder een open lees-frame uit een niet-pokkenbron, gebracht in een plasmidecon-struct van E. coli waarin DNA geïnserteerd is dat homoloog is met een stuk DNA van het pokkenvirus. De te inserteren DNA-gensequentie wordt afzonderlijk geligeerd aan een promotor. De promotor-genkoppeling wordt zo in het piasmi-deconstruct gepositioneerd dat de promotor-genkoppeling aan beide uiteinden wordt geflankeerd door DNA dat homoloog is aan een DNA-sequentie die een gebied van pokken-DNA flankeert dat een niet-essentiële locus bevat. Het resulterende plasmideconstruct wordt vervolgens geamplificeerd door kweken in E. coli bacteriën (Clewell, 1972) en geïsoleerd {Clewell et al., 1969/ Maniatis et al; 1982).

Vervolgens wordt het geïsoleerde plasmide met daarin de te inserteren DNA-gensequentie getransfecteerd in een celcultuur, bijvoorbeeld kippe-embryo-fibroblasten, samen met het pokkenvirus. Recombinatie tussen homoloog pokken-DNA in respectievelijk het plasmide en het virale genoom geeft een pokkenvirus dat gemodificeerd is door de aanwezigheid, in een niet-essentieel gebied van zijn genoom, van vreemde DNA-sequenties. Met de uitdrukking "vreemd" DNA wordt exogeen DNA aangeduid, in het bijzonder DNA uit een niet-pokkenbron, dat codeert voor genprodukten die normaliter niet geproduceerd worden door het genoom waarin het exogene DNA geplaatst is.

Genetische recombinatie is in het algemeen de uitwisseling van homologe stukken DNA tussen twee strengen DNA. In bepaalde virussen kan DNA vervangen zijn door RNA. Homologe stukken nucleïnezuur zijn stukken nucleïnezuur (DNA of RNA) die dezelfde volgorde van nucleotidebasen hebben.

Genetische recombinatie kan op natuurlijke wijze plaatsvinden tijdens de replicatie of vervaardiging van nieuwe virale genomen binnen de geïnfecteerde gastheercel. Zo kan genetische recombinatie tussen virale genen optreden tijdens de virale replicatiecyclus die plaatsvindt in een gastheercel die gecoïnfecteerd is met twee of meer verschillende virussen of andere genetische constructen. Een stuk DNA van een eerste genoom wordt uitwisselbaar gebruikt bij het construeren van het stuk van het genoom van een tweede coinfecterend virus waarvan het DNA homoloog is met dat van het eerste virale genoom.

Recombinatie kan echter ook plaatsvinden tussen stukken DNA in verschillende genomen die niet volmaakt homoloog zijn. Als één dergelijk stuk van een eerste genoom homoloog is met een stuk van een ander genoom, met uitzondering van de aanwezigheid in het eerste stuk van bijvoorbeeld een genetische merker of een gen dat codeert voor een antigene determinant dat geïnserteerd is in een deel van het homologe DNA, kan toch recombinatie plaatsvinden en de produkten van die recombinatie zijn dan te detecteren door de aanwezigheid van die genetische merker of dat.gen in het recombinante virale genoom.

Voor succesvolle expressie van de geïnserteerde DNA-gensequentie door het gemodificeerde infectieuze virus moet aan twee voorwaarden voldaan worden. Ten eerste moet de insertie in een niet-essentieel gebied van het virus plaatsvinden om het gemodificeerde virus levensvatbaar te doen blijven. De tweede voorwaarde voor expressie van geïnserteerd DNA is de aanwezigheid van een promotor met de juiste betrekking tot het geïnserteerde DNA. De promotor moet zo geplaatst zijn dat die stroomopwaarts van de tot expressie te brengen DNA-sequentie gelokaliseerd is.

Hondeziektevirus (CDV) en mazelenvirus (MV) zijn leden van de Morbillivirus subgroep van de familie van het geslacht Paramyxovirus (Diallo, 1990; Kingsbury et al., 1978) . De virussen bevatten een niet-gesegmenteerd enkel-strengs RNA-genoom met negatieve polariteit. Hondeziekte is een zeer infectieuze met koorts gepaard gaande ziekte van honden en andere carnivoren. De mortaliteit is hoog; variërend tussen 30 en 80%. Overlevende honden hebben vaak een permanente schade aan het centraal zenuwstelsel (Fenner et al., 1987). Evenzo veroorzaakt het mazelenvirus een acute infectieuze met koorts gepaard gaande ziekte, die gekenmerkt wordt door een gegeneraliseerde huiduitslag met papels. De ziekte treft voornamelijk kinderen.

Van de eigenschappen van Morbillivirussen is onlangs een overzicht verschenen van de hand van Norrby en Oxman (1990) en Diallo (1990). Zoals vermeld voor andere Paramyxovirussen (Avery en Niven, 1979; Merz et al., 1980) zijn twee structurele eiwitten cruciaal voor de inductie van een beschermende immuunrespons. Dit zijn het membraan-glycoproteïne hemagglutinine (HA), dat verantwoordelijk is voor de hemagglutinatie en de aanhechting van het virus aan de gastheercel, en het fusieglycoproteïne (F), dat mem-braanfusie veroorzaakt tussen het virus en de geïnfecteerde cel of tussen de geïnfecteerde en de aangrenzende niet-geïnfecteerde cellen (Graves et al., 1978). De volgorde van de genen in het MV-genoom is afgeleid door Richardson et al. (1985) en Dowling et al. (1986). De nucleotidensequen-tie van het MVHA-gen en het MVF-gen is bepaald door respectievelijk Alkhatib en Briedis (1986) en Richardson et al. (1986).

CDV en MV vertonen een structurele gelijkenis en zijn serologisch nauw verwant. Immunoprecipitatiestudies hebben aangetoond dat antiserum tegen MV alle eiwitten van CDV (P, NP, F, HA en M) zal precipiteren. Daarentegen zal antiserum tegen CDV alle MV-eiwitten precipiteren behalve het HA glycoproteïne (Hall et al., 1980; Orvell et al., 1980; Stephenson et al., 1979). In het licht van deze nauwe serologische verwantschap is eerder aangetoond dat vaccinatie met MV bescherming tegen een provocatie met CDV in honden zal uitlokken (Gillespie et al., 1960; Moura et al., 1961; Warren et al., 1960). Neutraliserende antilichamen tegen CDV zijn vermeld in.menselijke anti-MV sera (Adams et al., 1957; Imagawa et al., 1960; Karzon, 1955; Karzon, 1962) maar neutraliserende antilichamen tegen MV zijn niet gevonden in anti-CDV sera van honden (Delay et al., 1965; Karzon, 1962; Roberts, 1965).

HA- en F-genen van MV zijn tot expressie gebracht in verschillende virale vectoren waaronder vacciniavirus (Drillien et al., 1988; Wild et al., 1991), vogelpokkenvi-rus (Spehner et al., 1990; Wild et al., 1990), adenovirus (Alkhatib et al., 1990) en baculovirus (Vialard et al., 1990) . In deze studies werden authentieke MV-eiwitten tot expressie gebracht die werkzaam waren in hemagglutinatie (Vialard et al.; 1990), hemolyse (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990) of celfusie (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990; Wild et al., 1991) bepalingen. Bij insertie in een vacciniavirusvector was de expressie van ofwel het HA- ofwel het F-eiwit in staat tot het uitlokken van een beschermende immuunrespons in muizen tegen MV-encefalitis (Drillien et al., 1988). Evenzo lokte de expressie van het F-eiwit in een vogelpokkenvirusvector beschermende immuniteit uit tegen MV-encefalitis in muizen (Wild et al., 1990). Er werden geen studies naar bescherming vermeld met andere vectoren.

Europese octrooiaanvrage 0.314.569 heeft betrekking op de expressie van een MV-gen in vogelpokken.

Perkus et al. (1990) beschreef onlangs de definitie van twee unieke genen voor het gastheerbereik in vacciniavirus. Deze genen coderen voor gastheerbereik-functies die de replicatie van vacciniavirus mogelijk maken op verschillende celsubstraten in vitro. De genen coderen voor gastheerbereik-functies voor replicatie van vacciniavirus in menselijke cellen alsook cellen die afkomstig zijn van het konijn en het varken. Definitie van deze genen maakt de ontwikkeling mogelijk van een vacciniavirusvector die, terwijl hij nog steeds belangrijke vreemde genen tot expressie brengt, ernstig beperkt zou zijn in zijn vermogen te repliceren in bepaalde cellen. Dit zou de veiligheids-kenmerken van vacciniavirusrecombinanten in hoge mate verbeteren.

Er is een verzwakte vector ontwikkeld door de achtereenvolgende deletie van zes niet-essentiële gebieden uit de Copenhagenstam van vacciniavirus. Van deze gebieden is bekend dat ze coderen door eiwitten die een rol kunnen spelen in de virale virulentie. De verwijderde gebieden zijn het tk-gen, het hemorrhagische gen, het A-type inclu-siegen, het hemagglutinine-gen en het gen dat codeert voor de grote subunit van het ribonucleotidereductase alsook de eerder gedefinieerde sequenties van C7L tot en met KIL (Perkus et al., 1990). De sequenties en lokaties op het genoom van deze genen in de Copenhagenstam van het vaccini-avirus zijn eerder gedefinieerd (Goebel et al., 1990 a,b) . De resulterende verzwakte vaccinia stam wordt aangeduid als NYVAC.

De technologie van het genereren van vacciniavi-rusrecombinanten is onlangs uitgebreid tot andere leden van de familie van pokkenvirussen die een beperkter gastheerbe-reik hebben. Het vogelpokkenvirus is gemanipuleerd tot een recombinantvirus dat het rabies G-gen tot expressie brengt (Taylor et al., 1988b). Dit recombinante virus wordt ook beschreven in PCT publicatie nummer WO89/03429. Bij inocu-latie van de recombinant in een aantal niet-vogel-species wordt een immuunrespons tegen rabies uitgelokt die in muizen, katten en honden bescherming biedt tegen een dodelijke provocatie met rabies.

Zowel hondeziekte als mazelen worden op het moment bestreden met behulp van levende verzwakte vaccins (Fenner et al., 1987; Preblud et al., 1988). Voor de bestrijding van CDV wordt immunisering aanbevolen met behulp van een levend verzwakt vaccin op een leeftijd van 8 weken en nogmaals op een leeftijd van 12-16 weken. Hoewel de immuniteit tegen CDV levenslang is, wordt, vanwege de in hoge mate infectieuze aard van de verwekker en de ernst van de ziekte, een jaarlijkse revaccinatie gewoonlijk aanbevolen.

Eén probleem met het huidige beleid van continue revaccinatie is dat CDV-immune moeders neutraliserend antilichaam doorgeven aan hun nakomelingen in het colostrum. Het is moeilijk vast te stellen wanneer het gehalte aan deze antilichamen zover is af genomen dat de jongen gevaccineerd kunnen worden.. Hierdoor blijft een periode over waarin de jongen vatbaar kunnen zijn voor CDV-infec-tie. Gebruik van een recombinant vaccin dat alleen de glycoproteinen van het mazelenvirus tot expressie brengt, kan voorzien in een manier om de remmende effecten van het van de moeder afkomstige antilichaam teniet te doen en vaccinatie van pasgeborenen' mogelijk te maken. In feite is aangetoond dat CDV-specifieke antilichamen in jongen die werden gezoogd door CDV-immune moeders, de ontwikkeling van MV-specifieke antilichamen niet verhinderden bij inoculatie met een MV-vaccin (Baker et al., 1966).

Andere beperkingen van de gewoonlijk gebruikte gemodificeerde levende CDV-vaccins zijn eerder beschreven (Tizard, 1990) en zijn gekoppeld aan het vermogen van deze vaccinstammen te repliceren in de gevaccineerde dieren. Deze schadelijke effecten zijn het meest opmerkelijk wanneer de CDV-vaccinstam gelijktijdig geinoculeerd wordt met honde-adenovirus l en 2 in honden, wat resulteert in immunosuppressie, trombocytopenie en encefalitis (Bestetti et al., 1978; Hartley, 1974; Phillips et al., 1989). Het is ook gebleken dat de gemodificeerde levende CDV-vaccins distemper induceren in andere diersoorten waaronder vossen, rolstaartberen, fretten en de panda (Bush et al., 1976; Carpenter et al., 1976; Kazacos et al., 1981). Daarom zou bij gebruik van een recombinant CDV-vaccin de voortdurende introductie van gemodificeerd CDV in de omgeving en potentiële met het vaccin verbonden en door het vaccin geïnduceerde complicaties die opgetreden zij bij gebruik van de gebruikelijke CDV-vaccins, geëlimineerd worden.

Het gebruik van pokkenvirusvectoren kan ook voorzien in een wijze voor het ondervangen van het beschreven remmende effect dat antilichaam van de moeder heeft op vaccinatie met momenteel gebruikte levende verzwakte CDV-stammen in honden. Bij jongen die geboren zijn uit moeders die eerder op jonge leeftijd geïmmuniseerd zijn met een pokkenvirusrecombinant, kan de interferentie van CDV-specifiek antilichaam van de moeder voorkomen worden. Bovendien biedt het vermogen van zowel vacciniavirus- als kanariepokkenvirusvectoren met daarin HA- en F-genen van MV tot het opwekken van deze respons en het ontbreken van serologische kruisreactiviteit tussen de twee pokkenvirussen een volgend voordeel, in die zin, dat de ene vector vroeg in het leven van het jong gebruikt zou kunnen worden en de andere later, om CDV-specifieke immuniteit te verhogen. Hierdoor wordt het vrijkomen van levende verzwakte CDV-stammen in de omgeving voorkomen, een gebeurtenis die gekoppeld is aan het optreden van door vaccin geïnduceerde en met vaccin verbonden complicaties (Tizard, 1990).

Het is dus duidelijk dat de beschikbaarheid van een Morbillivirus-recombinant pokkenvirus, en van vaccins die beschermende immuniteit bieden tegen Morbillivirusin-fecties, een zeer wenselijke vooruitgang zou betekenen ten opzichte van de huidige stand der techniek.

Doelstellingen van de uitvinding.

Het is dan ook een doelstelling van deze uitvinding te voorzien in recombinante pokkenvirussen, welke virussen genprodukten van Morbillivirussen tot expressie brengen, en te voorzien in een werkwijze voor het maken van dergelijke recombinante pokkenvirussen.

Het is bovendien een doelstelling van deze uitvinding te voorzien in de klonering en expressie van coderende sequenties van Morbillivirus, in het bijzonder coderende sequenties van mazelenvirus, in een pokkenvirusvector, in het bijzonder vacciniavirus- of kanariepokkenvirusvectoren.

Een volgende doelstelling van deze uitvinding is te voorzien in een vaccin dat in staat is tot het opwekken van Morbillivirus neutraliserende antilichamen, hemaggluti-natieremmende antilichamen en beschermende immuniteit tegen Morbillivirusinfectie en een lethale provocatie met Morbillivirus, waarbij in het bijzonder voorzien wordt in kruis-bescherming van honden tegen hondeziekte met behulp van een mazelenvirus-recombinant pokkenvirusvaccin.

Deze en andere doelstellingen en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijker worden na beschouwing van het navolgende.

Uiteenzetting van de uitvinding.

In één aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een recombinant pokkenvirus met daarin een DNA-sequentie van Morbillivirus in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom. Het heeft voordelen als het pokkenvirus een vacciniavirus of een vogelpokkenvirus, zoals een kanariepokkenvirus is. Het heeft voordelen als het Morbillivirus het mazelenvirus is.

Volgens de onderhavige uitvinding vertoont het recombinante pokkenvirus expressie van genprodukten van het vreemde Morbillivirus-gen. In het bijzonder codeert het vreemde DNA voor een glycoproteïne van mazelenvirus, in een gunstig geval hemagglutinine-glycoproteïne van mazelenvirus en fusieglycoproteïne van mazelenvirus. Het is gunstig als meerdere glycoproteinen van mazelenvirus tegelijkertijd tot expressie komen in de gastheer door het recombinante pokkenvirus.

In een volgend aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een vaccin voor het induceren van een immunologische respons in een gastheerdier dat geïnoculeerd is met het vaccin, waarbij dat vaccin een drager bevat en een recombinant pokkenvirus met, in een niet-essentieel gebied daarvan, DNA van Morbillivirus, in het bijzonder mazelenvirus. Het is gunstig als het DNA codeert voor een glycoproteïne van mazelenvirus en dit tot expressie brengt, in het bijzonder hemagglutinine-glycoproteïne van mazelenvirus en fusieglycoproteïne van mazelenvirus. Het is gunstig als meerdere glycoproteinen van mazelenvirus tegelijkertijd tot expressie komen in de gastheer. Het in het vaccin volgens de onderhavige uitvinding gebruikte pokkenvirus is gunstig een vacciniavirus of een vogelpok-kenvirus, zoals kanariepokkenvirus.

Korte beschrijving van'de tekeningen.

De onderhavige uitvinding zal beter begrepen worden aan de hand van de begeleidende tekeningen waarin:

Figuur 1 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSPM2LHAVC dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP557 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;

Figuur 2 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSPMFVC dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP455 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt;

Figuur 3 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW843 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP756 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;

Figuur 4 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW850 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP800 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt;

Figuur 5 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW800 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP40 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt:

Figuur 6 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW810 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinante kanariepokkenvirussen vCP50 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt, en VCP57 dat de MV-fusie- en -hemagglutinine-genen tegelijkertijd tot expressie brengt;

Figuur 7 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW852 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP85 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;

Figuur 8 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW583A dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP82 dat de MV-hemagglutinine- en -fusie-genen tegelijkertijd tot expressie brengt;

Figuur 9 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD460 voor de deletie van het thymidinekinase-gen en de vorming van recombinant vaccinia-virus vP410;

Figuur 10 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD486 voor de deletie van het hemorrhagische gebied en de vorming van recombinant vacci-niavirus vP553;

Figuur 11 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pMP494A voor de deletie van het ATI-gebied en de vorming van recombinant vacciniavirus VP618;

Figuur 12 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD467 voor de deletie van het hemagglutinine-gen en de vorming van recombinant vacciniavirus vP723;

Figuur 13 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pMPCSKlA voor de deletie van genencluster [C7L - KIL] en de vorming van recombinant vacciniavirus vP804;

Figuur 14 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD548 voor de deletie van de grote subunit van ribonucleotidereductase en de vorming van recombinant vacciniavirus VP866 (NYVAC); en

Figuur 15 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW857 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant NYVAC virus vP913 dat de MV-hemagglutinine- en -fusiegenen tegelijkertijd tot expressie brengt.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding en de vele voordelen ervan zullen beter begrepen worden aan de hand van de volgende ter illustratie gegeven voorbeelden.

Voorbeeld 1 - VORMING VAN VACCINIAVIRüSRECOMBINANTEN MET

HET MAZELEN-HEMAGGLUTININE-GEN.

Het bij de produktie van beide recombinanten gebruikte ontvangende virus was de Copenhagenstam van vacciniavirus, waaruit het thymidinekinase-gen was verwijderd. Het kweken van alle virussen en het bepalen van de titer geschiedde op monolagen van Vero cellen.

De vroege late vacciniavirus H6 promotor (Rosel et al., 1986; Taylor et al., 1988a,b) werd geconstrueerd door annealing van vier overlappende oligonucleotiden, H6SYN A-D. De resulterende H6 sequentie is als volgt: Vacciniavirus H6 Promotor (SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2):

HindiII

5'AGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGG GTTGT

AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACA

GTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTT

AAGTT

CAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAA

TTCAA

TGTATCGTAC-31 ACATAGCATGAGCT-5'

Xhol

Met verwijzing nu naar figuur 1 werden de "annea-led" H6SYN oligonucleotiden geligeerd in pMP2LVC dat geknipt was met Xhol/HindiII. wat het plasmide pSP131 opleverde. Het plasmide pMP2LVC bevat de meest linkse 0,4 kbp van het HindiII K gebied van het vacciniavirus (Copen-hagenstam) in pUC18. De constructie van pMP2LVC werd als volgt uitgevoerd: een HindiII/SalI-fragment van 0,4 kbp van het HindiII K gebied werd geïsoleerd en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Dit fragment werd geïnserteerd in pUC18 dat geknipt was met PvuII. Het resulterende plasmide werd pMP2VC genoemd. Het plasmide pMP2VC werd gelineariseerd met Sspl. Synthetische oligonu-cleotiden MPSYN52 (SEQ ID NO:3) (5'-ATTATTTTTATAAGCTTGGA-TCCCTCGAGGGTACCCGCGGGGAGCTCGAATTCT-3') en MPSYN53 (SEQ ID NO:4) (5'- AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT-3') werden "annealed" en geïnserteerd in de meest links gelegen van de twee Sspl-plaatsen die gelokaliseerd zijn in de vacciniavirussequenties. Het resulterende plasmide pMP2LVC bevat een meervoudig kloneringsgebied in het intergene gebied tussen de KIL en K2L open leesframes.

"Annealed" oligonucleotiden 3P1 (SEQ ID NO:5) (51- GGGAAG-ATGGAACCAATCGCAGATAG-3') en 3P2 (SEQ ID NO:6) (5'- AATTCTATCTG-CGATTGGGGTTCCATCTTCCC-31) die de uiterste 3'-sequenties van het HA-gen en een plakkend EcoRI-uiteinde bevatten, werden geligeerd aan een Xhol/ Smal-fracrment van pMH22 van 1,8 kbp dat de rest van het HA-gen bevat, en pSP131 dat geknipt was met Xhol en EcoRI. Het resulterende plasmide werd pSPMHAll genoemd. Het plasmide pMH22 werd afgeleid van een cDNA-kloon van volledige lengte van het mazelen-HA-gen door vorming van een Xhol-plaats bij het ATG initiatd^ecodon (Alkhatib et al., 1986).

Een HindiII/EcoRI-fragment van 1,9 kbp van pSPMHAll met daarop het mazelen-HA-gen werd geïsoleerd en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het geïsoleerde fragment werd geïnserteerd in pMP409DVC (Guo et al., 1989) dat geknipt was met BglII en van stompe uiteinden voorzien door behandeling met "mung bean" nuclea-se. Insertie in deze vector leverde het plasmide pSPMHA41 op. De Xhol-plaats tussen de H6 promotor en het initiatie-codon van het HA-gen werd verwijderd met behulp van oligo-nucleotide-gestuurde mutagenese door het breken van de dubbele streng (Mandecki, 1982) met behulp van oligonucleo-tide HAXHOD (SEQ ID NO:7) (5'- ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT-3'). Met deze werkwijze werd plasmide pSPM2LHAVC gevormd. Insertie-plasmide pSPM2LHAVC werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met vacciniavirus vP458 als het ontvangende virus voor de vorming van recombinant vP557. VP458 bevat het E. coli lac Z gen in de M2L insertieplaats van VP410. Deze vacciniavirusrecombinant bevat het mazelen-HA-gen in de M2L locus van het genoom, waar het het lac Z gen vervangt .

Voorbeeld 2 - VORMING VAN VACCINIAVIRUSRECOMBINANTEN MET

HET MAZELEN-FÜSIE-GEN.

Met verwijzing nu naar figuur 2 werden "annealed" oligonuc1eotiden 3PA (SEQ ID N0:8) (5'- CCTAAAGCCTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTAT- GTAAGGTCGCTCTGATTTTTATCGGCCGA-3 ') en 3PB (SEQ ID NO:9) (5 1 -AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATGTTCCCGTAAG -ATCAGGCTTTAGG-3') met daarop het 31-uiteinde van het mazelen-fusiegen, een vroeg transcriptieterminatiesignaal van vacciniavirus (Yuen et al., 1987) en Eaql- en HindlII-uiteinden geligeerd aan een Sall/HaelII-fragment van 1 kbp van pCRF2 (verkregen van C. Richardson, National Research Council of Canada (Biotechnology Institute), Montreal, Canada H3A 1A1) en pUC8 dat geknipt was met Sall en HindiII. Het resulterende plasmide pMF3PR14 bevat het 3'-uiteinde van het fragment van 1 kbp van het mazelen-fusiegen.

"Annealed" oligonucleotiden 5 PA (SEQ ID NO:10) (5'- GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGCCATATTC-3' en 5PB (SEQ ID NO:11) (51-ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC-3') met een 5'-Smal-plaats en een 31-BstXI-plaats werden geligeerd aan een BstXI/Sall-fragment van 820 bp van pCRF2 en pUC8 dat geknipt was met Smal en Sall. Het resulterende plasmide pSPMF5P16 bevat het 5'-deel van het mazelen-fusiegen. Het Smal/Sall-fragment van 820 bp van pSPMF5P16 en het Sall/

Eagl-fragment van 1 kbp van pMF3PR14 werden geligeerd in pTP15 dat geknipt was met Smal en Eagl. Het plasmide pTP15 (Guo et al.r 1989) bevat de vroege/late H6 promotor van vacciniavirus, geflankeerd door sequenties van de HA-locus van het genoom van vacciniavirus (Copenhagènstam). Het resulterende plasmide met het mazelen-fusiegen aan de 3'-kant geplaatst naast de H6 promotor binnen het HA-insertie-plasmide werd pSPHMF7 genoemd.

Oligonucleotide-gestuurde mutagenese werd uitgevoerd op pSPHMF7. Eerst werd een in vitro mutagenesereactie (Mandecki, 1982) uitgevoerd voor het vormen van een precieze ATG:ATG koppeling van de H6 promotor met het mazelen-fusiegen door de Smal-plaats te verwijderen met behulp van het oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO:12) (51-TATCCGTTAAGT- TTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3'). Dit resulteerde in de vorming van pSPMF75M20. Vervolgens werd de BglII-plaats aan het 5'-uiteinde van de H6 promotor verwijderd met behulp van oligonucleotide SPBGLD (SEQ ID NO:13) (51-AATAAAT- CACTTTTTATACTAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3') volgens een bekende werkwijze (Mandecki, 1982). Het resulterende plasmide werd pSPMFVC genoemd. Dit plasmide werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met vacciniavirus vP410 als ontvangend virus om vP455 te vormen.

Voorbeeld 3 - IMMUNOPRECIPITATIEANALYSE.

Teneinde vast te stellen dat recombinanten vP455 en vP557 authentieke eiwitten tot expressie brachten, werden immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd in wezen zoals beschreven (Taylor et al., 1990). In het kort werden monolagen van Vero cellen geïnfecteerd met 10 pfu per cel met ofwel oudervirus ofwel recombinantvirus in aanwezigheid van 35S-methionine. Het fusie-eiwit werd specifiek geprecipiteerd uit het lysaat van geïnfecteerde cellen met behulp van een konijne-antiserum dat gericht was tegen een car-boxy-eindstandig fusiepeptide. Het hemagglutinine-eiwit werd specifiek geprecipiteerd uit het lysaat van geïnfecteerde cellen met behulp van een polyklonaal monospecifiek ant i-hemagglut inineserum.

Met betrekking tot de immunoprecipitatie met behulp van een fusiespecifiek serum werden geen radioactief gemerkte produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen, met oudervirus geïnfecteerde Vero cellen, of cellen die geïnfecteerd waren met de HA-recombinant vP557. In cellen die geïnfecteerd waren met de fussierecombinant vP455 werden de fusieprecursor F0 met een molecuulgewicht van ongeveer 60 kd en de twee splitsingsprodukten Ρχ en F2 met molecuulgewichten van 44 kd en 23 kd gedetecteerd. Evenzo werden, met betrekking tot de immunoprecipitatie van de geglycosyleerde vorm van het HA-eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 75-77 kd, geen produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen, met oudervirus geïnfecteerde cellen, of met vP455 geïnfecteerde Vero cellen.

Bovendien gaven immunofluorescentiestudies aan dat beide eiwitten tot expressie kwamen op het oppervlak van de geïnfecteerde cel.

Voorbeeld 4 - CELFÜSIE-EXPERIMENTEN

Een kenmerk van de cytopathogeniteit van Morbilli-virus is de vorming van syncytia die ontstaan door fusie van geïnfecteerde cellen met omringende niet-geïnfecteerde cellen, gevolg door migratie van de nuclei naar het centrum van het syncytium (Norrby et al., 1982). Het is gebleken dat dit een belangrijke methode van virale verspreiding is, die voor Paramyxovirussen kan optreden in aanwezigheid van hemagglutinine-specifiek antilichaam (Merz et al., 1980). Dit vermogen is in analogie met andere Paramyxovirussen toegeschreven aan het amino-uiteinde van het F1 peptide (Choppin et al., 1981; Novick et al., 1988; Paterson et al., 1987).

Teneinde vast te stellen dat de mazelen-eiwitten die tot expressie werden gebracht in vacciniavirus functioneel actief waren, werden monolagen van Vero cellen geïnocculeerd met respectievelijk oudervirus of recombi-nante virussen vP455 en vP557 met 1 pfu per cel. Na 1 uur absorptie bij 37°C werd het inoculum verwijderd, het bovenstaande medium vervangen, en werden de schaaltjes overnacht geïncubeerd bij 37°C.· 18 Uur na infectie werden de platen onderzocht met een microscoop en gefotografeerd. Er was geen celfusie-activiteit zichtbaar in Vero cellen die geïnoculeerd waren met oudervirus, vP455 of vP557.

Wanneer echter vP455 en vP557 tegelijkertijd werden geïno-culeerd, werd efficiënte celfusie-activiteit waargenomen.

Dit resultaat is onlangs bevestigd door Wild et al. (1991) die vaststelden dat voor syncytiumvorming in een verscheidenheid aan cellijnen die geïnfecteerd waren met mazelen/vacciniavirusrecombinanten expressie van zowel het fusie- als het hemagglutinine-gen nodig was. Het resultaat is echter in tegenstelling met een eerdere vermelding (Alkhatib, 1990) waarin celfusie beschreven wordt in 293 cellen die geïnfecteerd waren met hoge multipliciteiten van een adenovirus recombinant die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie brengt. Evenzo is vermeld (Vialard et al., 1990) dat celfusie werd waargenomen in insectencellen die geïnfecteerd waren met een baculovirus recombinant die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie bracht, maar alleen bij incubatie bij pH 5,8. In geen van. deze gevallen werd de fusie-activiteit verhoogd door co-infectie met de betreffende recombinant met expressie van het mazelen-hemaggluti-nine-eiwit. Variabelen die betrokken kunnen zijn bij het fusieproces zijn het celtype (Giraudon et al., 1984), pH van het medium (Vialard et al., 1990) en expressieniveau van het fusie-eiwit (Norrby et al., 1982).

Voorbeeld 5 - SEROLOGI5CHE TESTS

De techniek voor het testen van virus neutraliserend (VN) antilichaam werd eerder in detail beschreven (Appel et al., 1973). Het testen op CDV-VN antilichaamti-ters werd gedaan in Vero cellen met de aangepaste Onder-stepoortstam van CDV. Het testen op MV-VN antilichaamtiters werd gedaan in Vero cellen met de aangepaste Edmonston stam van MV. De resultaten van de serologische tests worden getoond in tabel 1.

Honden die geïmmuniseerd waren zoals beschreven in voorbeeld 6 met ofwel het vaccinia oudervirus of VP455 met expressie van het mazelen-fusie-eiwit, ontwikkelden geen neutraliserend antilichaam tegen MV. Honden die geïmmuniseerd waren met ofwel vP557 met expressie van het HA-eiwit ofwel gelijktijdig geïnoculeerd waren met beide recombinanten vP455 en vP557, ontwikkelden neutraliserende antilicha-men na 1 inoculatie. Antilichaamgehalten waren equivalent aan die welke geïnduceerd worden door inoculatie met de verzwakte Edmonston stam van MV.

Tabel 1

Mazelenvirus neutraliserende antilichaamtiters in respons op vaccinatie

Dagen na vaccinatie

Immunisatie Hond No. 0a 7 14 21b 28 35c

Vacc. 4/1 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 4/2 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VP455 4/3 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 4/4 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VP557 4/5 <1,0 2,2d 2,9 2,9 3,4 3,4 4/6 <1,0 2,7 2,9 2,9 3,9 3,4 vP455 & VP557 4/7 <1,0 2,7 3,4 3,2 3,4 3,4 4/8 <1,0 2,5 2,9 2,9 3,6 2,9 MV 4/14 <1,0 2,9 4/15 <1,0 3,2 a) Tijdstip van de eerste immunisatie b) Tijdstip van de tweede immunisatie (eerste immunisatie met MV) c) Tijdstip van de provocatie d) Titer, uitgedrukt als log10 van de laatste antilichaamverdunning die volledige neutralisatie van de infectiviteit laat zien in een microtiter neutralisatietest zoals beschreven door Appel et al. (1973).

Voorbeeld 6 - BESCHERMINGSSTUDIES BIJ DIEREN

Teneinde vast te stellen of expressie van de mazelenvirus-eiwitten in honden die geinoculeerd waren met de recombinanten voldoende was om een beschermende immuun-respons te induceren tegen CDV-provocatie, werden 14 10 weken oude specifiek pathogeenvrije beagles bestudeerd. Bloedmonsters werden genomen bij aanvang van het experiment en herhaaldelijk daarna. Vier groepen met twee honden per groep werden geïmmuniseerd met twee injecties met een tussentijd van drie weken. De eerste groep kreeg alleen vacciniavirus. De tweede groep kreeg vacciniavirus met een insertie voor het F-eiwit van mazelenvirus (vP455). De derde groep kreeg vacciniavirus met een insertie voor het HA-antigeen van MV (vP557) en de vierde groep kreeg een combinatie van twee en drie. Elke hond werd geinoculeerd met ongeveer 4 x 108 pfu vacciniavirus in hoeveelheden van l ml (0,6 ml subcutaan en 0,4 ml intramusculair) . Twee controlehonden kregen intramusculair 105 50% weefselkweek infectieuse doses (TCID50) van de verzwakte Edmonston stam van MV (l ml) en twee controlehonden kregen subcutaan 104 TCID50 van de verzwakte Rockborn stam van CDV twee weken voor provocatie met virulent CDV. Twee controlehonden bleven niet-geïnoculeerd vóór provocatie.

Alle honden werden twee weken na de laatste inoculatie geprovoceerd door intranasale inoculatie met 1 ml weefselkweekvloeistof met daarin 104 TCID50 van de Snyder Hill stam van virulent CDV. De klinische reacties van de honden werden gevolgd door dagelijkse observatie en door registratie van de lichaamstemperatuur en door tweewekelijkse registratie van gewichtstoename of -verlies. Circulerende bloedlymfocyten werden geteld vóór provocatie en op de dagen 3, 5, 7 en 10 na provocatie (dpc). Isolatie van virus uit cellen van de "buffy coat" door samen te kweken met longmacrofagen van de hond (Appel et al., 1967) werd ondernomen op dpc 3, 5, 7 en 10. Bloedmonsters vóór serologisch tests werden afgenomen voor vaccinatie en met tussenpozen van een week tot het tijdstip van provocatie, en op dpc 7, 10 en 20.

De resultaten van de provocatie worden getoond in tabel 2.

Tabel 2

Effecten van rimramrl satie op klinische symt» honen na blootstelling van honden, aan virulent CDV___

Aantal dagen na inoculatie met virulent CDV

Verhoogde Lymfo- Virus

Immunisatie_Hond No _Depressie_Gewichtsver 1 ies_lichaamstemp._feniafa_isolatie dood

Vacc. 4/1 4-10d 3-10 4,5,7,10 7-10 3-7 10 4/2 4-10d 3-10 4,5,8-10 3-10 3-7 10 VP455 4/3 4-8 7-10 4,5,7-10 5,7 5-7 4/4 4-6 7-10 4-6 7 5-7 vP557 4/5 NDe ND 6,7 10 7

4/6 ND 'ND ND ND ND

VP455 & VP557 4/7 ND ND 7 '77- 4/8 ND 7 6 ND 7

MV 4/14 ND ND ND 7 ND

4/15 ND 7 5 5 ND

CDV-Ro 4/16 ND ND- ND ND ND -

4/17 ND ND ND ND ND

Geen 4/18 6,14-17d 7-17 5,7 13-17 10 17 4/19 4-10d 3-10 4,5,7 3,7,10 3-10 10

a) Hoger dan 39,5°C

b) Minder dan 2 x 103 lymfocyten per mm3 c) Geïsoleerd uit cellen van de "buffy coat" samen gekweekt met longmacrofagen van de hond d) Hond raakte gedehydreerd en werd uit zijn lijden verlost e) Niet gedetecteerd

Niet-geïmmuniseerde controlehonden en met vaccinia oudervirus gevaccineerde honden ontwikkelden klinische symptomen van ernstige ziekte en werden uit hun lijden verlost wanneer dehydratie evident was. Beide met vP455 geïmmuniseerde honden vertoonden enige symptomen van infectie met CDV waaronder gewichtsverlies, verhoogde lichaamstemperatuur en lymfopenie hoewel deze symptomen van kortere duur waren dan bij controlehonden. Desalniettemin overleefden beide honden een letale provocatie met CDV. Honden die geïnoculeerd waren met vP557 of gelijktijdig geïnoculeerd met beide recombinanten vertoonden minimale symptonen van infectie en overleefden de provocatie. Honden die geïnoculeerd waren met ofwel de verzwakte Edmonston stam van MV ofwel de verzwakte Rockborn stam van CDV overleefden ook de provocatie met minimale ziekteverschijnselen.

Voorbeeld 7 - AANVULLENDE VACCINIA/MAZELENCONSTRUCTEN

Met verwijzing nu naar figuur 3 werd een tweede vacciniavirusrecombinant gevormd (vP756) die het mazelen HA-gen bevat in de tk-locus, met behulp van insertieplasmi-de pRW843. pRW843 werd geconstrueerd op de volgende manier. Uit pSPM2LHAVC werd een EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp geïsoleerd dat de het meest aan de 3' -kant gelegen 24 bp van de H6 promotor bevat, gefuseerd in een precieze ATG:ATG configuratie met het HA-gen dat de het meest aan de 3'-kant gelegen 26 bp mist. Dit fragment werd gebruikt om het EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPMHAll te vervangen om zo pRW803 te vormen. Plasmide pRW803 bevat de complete H6 promotor, op exacte wijze gekoppeld aan het complete mazelen-HA-gen.

Bij de bevestiging van eerdere constructen met het mazelen-HA-gen was opgemerkt dat de sequentie voor codon 18 (CCC) verdwenen was bij vergelijking met de gepubliceerde sequentie (Alkhatib et al., 1986). De CCC-sequentie werd weer op zijn plaats gezet met oligonucleotide-mutagenese via de methode van Kunkel (Kurikel, 1985) met behulp van oligonucleotide RW117 (SEQ ID NO:14) (5'-GACTATCCTACTT- CCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA-3').

Enkelstrengs-template werd afgeleid van plasmide pRW819 dat de H6/HA-cassette uit pRW803 bevat in pIBI25 (IBI, New Haven, CT.)· Het gemutageniseerde plasmide met daarin het ingevoegde (CCC) dat codeert voor een proline-rest bij codon 18, werd pRW820 genoemd. De sequentie tussen de HindlII- en Xbal-plaatsen van pRW820 werd bevestigd met nucleotidensequentie-analyse. De HindlII-plaats is gelegen aan de 5'-grens van de H6 promotor, terwijl de Xbal-plaats 230 bp stroomafwaarts van het initiatiecodon van het HA-gen gelegen is. Een Xbal/EcoRI-fracrment van 1,6 kbp van pRW803 met daarop de voor HA coderende sequenties stroomafwaarts van de Xbal-plaats en met het terminatiecodon werd gebruikt om het equivalente fragment van pRW820 te vervangen, wat resulteerde in de vorming van pRW837. De gemutageniseerde expressiecassette die zich bevindt in pRW837 werd verkregen door digestie met HindlII en EcoRI. van stompe uiteinden voorzien met behulp van het Klenow fragment van E.coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2mM dNTPs, en geïnserteerd in de Smal-plaats van pSD573VCVQ., wat pRW843 opleverde. Het plasmide pRW843 werd gebruikt in in vitro recombinatie experimenten met vP618 als het ontvangende virus en men verkreeg zo vP756. Oudervirus vP618 is een virus van de Copenhagen stam waaruit het thymidinekinase-gen, het hemorrhagische gen en het A-type inclusiegen verwijderd zijn. Met immunoprecipitatie-analyse is gebleken dat recombinant vP756 correcte expressie vertoont van een hemagglutinine-glycoproteïne van ongeveer 75 kd.

Met verwijzing naar figuur 4 werd een tweede vacciniavirus recombinant (vP800) die het mazelen-fusiegen herbergt in de ATI locus van het genoom, gevormd met behulp van insertieplasmide pRW850. Voor de constructie van pRW850 werden de volgende manipulaties uitgevoerd. Het plasmide pSPMF75M20 met daarop het mazelen-fusiegen in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld aan de H6 promotor, werd geknipt met Nrul en Eagl. Het fragment van 1,7 kbp met stompe uiteinden met daarop de 28 bp die het meest aan de 3'-kant van de H6 promotor liggen en het complete fusiegen werd geïsoleerd en geïnserteerd in pRW823 dat geknipt was met Nrul en Xbal en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide pRW841 bevat de H6 promotor gekoppeld aan het mazelen-fusiegen in de pIBI25 plasmidevector (IBI, New Haven, CT.). De H6/mazelen-fusie-expressiecassette werd verkregen uit pRW841 door digestie met Smal en het resulterende fragment van 1,8 kbp werd geinserteerd in pSD494VC dat geknipt was met Smal en zo verkreeg men pRW850. Het plasmide pRW850 werd in in vitro recombinatie experimenten gebruikt met vP618 als het ontvangende virus om zo vP800 te verkrijgen. Met immunoprecipitatie-analyse is gebleken dat recombinant vP800 een authentiek bewerkt fusie-glycoprote-ine tot expressie brengt.

Voorbeeld 8 - BEPALING VAN MAZELEN NEUTRALISEREND ANTILI-CHAAM IN MET VP455 GEINQCULEERDE CAVIA'S EN KONIJNEN

Twee konijnen werden intradermaal geinoculeerd op 5 plaatsen met een totaal van 1 x IQ8 pfu recombinant vP455 die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie brengt. Beide konijnen kregen in week 12 een boosters met een identieke inoculatie. Seriële bloedmonsters werden verzameld en in week 14, twee weken na de booster, werden de konijnen getest op de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in het serum.

Vier cavia's werden subcutaan geinoculeerd met elk 1 x 108 pfu recombinant vP455. Een identieke booster-inoculatie werd gegeven na 21 dagen. Seriele bloedmonsters werden verzameld.

De aanwezigheid van mazelenvirus neutraliserend antilichaam in serum werd bepaald met een microtitertest (Appel et al., 1973) met 10 TCID50 virus per microtiterput-je. De resultaten worden getoond in tabel 3.

Tabel 3

Resultaten van mazelenvirus neutraliserende antilichamen in serum van met vP455 geïnoculeerde cavia's en konijnen

Weken na inoculatie 0 2 3 4 5 7 14

Dier

Cavia

1 N.D.a N.D. N.D.-0,8b 1,3-1,3 1,3-1,5 1,3 N.TC

2 N.D. N.D. 0,8-1,0 0,8-1,3 1,3-1,5 N.D. N.T.

3 N.D. N.D. N.D.-0,8 0,8-1,5 1,0-1,3 1,0 N.T.

6 N.D. N.D. 0,8-0,8 0,8-0,8 1,0-1,3 1,0 N.T.

Konijn W44 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. 1,5 W86 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T 1,5 a) Niet detecteerbaar b) Resultaten van twee bepalingen c) Niet getest

Voorbeeld 9 - VORMING VAN MAZELENVIRUS-RECOMBINANT KANARIE-POKKENVIRUS

Mazelen/kanariepokkenvirusrecombinanten werden ontwikkeld met behulp van eenzelfde strategie als die eerder beschreven is voor vogelpokkenvirus (Taylor et al.f 1988 a,b).

Plasmiden voor insertie van de mazelen F- en HA-genen in kanariepokkenvirus werden als volgt gegenereerd.

Met verwijzing nu naar figuur 5 werd het Bglll/ Eacrl - fragment van 1,8 kbp met stompe uiteinden van pSPMF75M20 met daarop het door de H6 promotor gecontroleerde mazelen F-gen ingevoegd in de van stompe uiteinden voorziene EcoRI-plaats van pRW764.2. Plasmide pRW764.2 bevat een PvuII-fragment van 3,4 kbp van het kanariepokken-genoom met een unieke EcoRI-plaats waarvan vastgesteld is dat die niet essentieel is voor virale replicatie. Het resulterende plasmide met het mazelen F-gen werd pRW800 genoemd en werd gebruikt in recombinatie experimenten met kanariepokken als het ontvangende virus voor de vorming van vCP40.

Met verwijzing nu naar figuur 6 werd het EcoRV/ Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPM2LHA met de het meest aan de 3'-kant gelegen 28 bp van de H6 promotor, in een precieze ATG:ATG configuratie gefuseerd met HA, geïnserteerd tussen de EcoRV- en Smal-plaatsen van pSPMHAll. Het resulterende plasmide werd pRW803 genoemd. Een HindiII/EcoRI-fragment van 2 kbp van pRW803 met daarop het door de H6-promotor gecontroleerde mazelen-HA-gen werd van stompe uiteinden voorzien en geïnserteerd in de van stompe uiteinden voorziene BglII-plaats van plasmide pRW764.5. Plasmide pRW764.5 bevat een PvuII-fragment van 800 bp van het kanariepokkengenoom met een unieke BglII-plaats waarvan eerder is vastgesteld dat die niet essentieel is voor virale groei. Met deze insertie werd plasmide pRW810 gevormd dat gebruikt werd in recombinatietests voor de vorming van vCP50.

Insertie van de mazelen F- en HA-sequenties leiden afzonderlijk tot de ontwikkeling van respectievelijk recombinanten vCP40 en vCP50. Teneinde een dubbele recombi- nant te vormen werd de enkelvoudige F-recombinant vCP40 gebruikt als een ontvangend virus voor de insertie van het , HA-gen dat aanwezig was in pRW810. Dit leidde tot de ontwikkeling van de dubbele recombinant vCP57.

Voorbeeld 10 - IMMÜNOPRECIPITATIEANALYSE

Teneinde te bevestigen dat recombinanten vCP40, vCP50 en vCP57 authentieke eiwitten tot expressie brachten, werd immunoprecipitatieanalyse uitgevoerd met behulp van monospecifieke sera, gericht tegen ofwel het HA- ofwel het F-eiwit. Een correct bewerkt fusiepolypeptide werd specifiek geprecipiteerd uit lysaten van cellen die geïnfecteerd waren met vCP40 en vCP57. De fusieprecursor F0 met een molecuulgewicht van ongeveer 60 kd en de twee splitsings-producten F-,^ en F2 met molecuulgewichten van respectievelijk ongeveer 44 en 23 kb werden gedetecteerd. Er waren geen fusie-specifieke produkten te detecteren in niet-geïnfecteerde CEF cellen, met oudervirus geïnfecteerde CEF cellen of met de HA-recombinant vCP50 geïnfecteerde CEF cellen. Evenzo werd een glycoproteïne van ongeveer 75 kd specifiek geprecipiteerd uit CEF cellen die geïnfecteerd waren met de enkelvoudige HA-recombinant vCP50 en de dubbele recombinant vCP57. Er werden geen HA-specifieke produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde cellen, met oudervirus geïnfecteerde cellen of met fusierecombinant vCP40 geïnfecteerde cellen.

Voorbeeld 11 - CELFUSIE-EXPERIMENTEN

Teneinde vast te stellen dat de mazelenvirusrecom-binanten functioneel actief waren, werden celfusie-analyses uitgevoerd. Monolagen van Vero cellen werden geïnfecteerd met 1 pfu per cel CP-oudervirus of recombinante virussen en 18 uur na infectie onderzocht op cytopathische effecten. Er was geen celfusie-activiteit zichtbaar in Vero cellen die geïnoculeerd waren met oudervirus, vCP40 of vCP50 virussen. Wanneer Vero cellen echter werden geïnoculeerd met de dubbele recombinant vCP57 of wanneer cellen worden geco-infecteerd met zowel vCP40 als vCP50, is er een duidelijke efficiënte celfusie-activiteit.

Voorbeeld 12 - SEROLOGISCHE TESTS

Honden die geïnoculeerd waren zoals beschreven in voorbeeld 13 met de kanariepokken/HA recombinant vCP50, vaccinia/HA recombinant VP557, de kanariepokken/HA/F dubbele recombinant vCP57, of die gelijktijdig geïnoculeerd waren met vP455 en vP557 ontwikkelden een significante hoeveelheid neutraliserend antilichaam in het serum tegen mazelenvirus na 1 inoculatie. Geen van de twee honden die geïnoculeerd waren met de kanariepokken/F recombinant vCP40 ontwikkelde neutraliserend antilichaam na 1 of 2 inocula-ties. De resultaten van de serologische tests worden getoond in tabel 4.

Bovendien ontwikkelden cavia's die geïnoculeerd waren met de vCP40 recombinant lage maar reproduceerbare gehalten neutraliserend antilichaam in het serum.

Tabel 4

Mazelenvirus neutraliserende antilichaamtitiers (in log10)

Dagen na vaccinatie

Immunisatie Hond No. 0a 7 14 21b 28 35c

Kanariepokkenvirus 9/1 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 (CPV) 9/2 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VCP50 9/3 <1,0 2,7d 2,9 3,2 4,4 4,1 9/4 <1,0 1,7 2,7 2,7 3,9 3,9 VCP40 9/5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 9/6 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VCP57 9/7 <1,0 2,0 2,7 2,5 3,9 3,6 9/8 <1,0 1,0 2,2 2,0 3,6 3,4 VP455 9/9 <1,0 <1,0 <1,0 1,0 1,0 1,0 VP557 9/10 <1,0 2,9 2,5 3,2 3,4 3,4 VP455 & VP557 9/11 <1,0 1,3 2,9 2,9 2,9 -2,9 MV 9/12 <1,0 2,5 2,5

Controle 9/13 <1,0 9/14 <1,0 CDV-Ro 9/15 <1,0 <1,0 <1,0 a) Tijdstip van de eerste immunisatie b) Tijdstip van de tweede immunisatie (eerste immunisatie met MV en CDV-Ro) c) Tijdstip van provocatie d) Bepaling van serum-neutralisatietiters bepaald op bekende wijze (Appel et al., 1973)

Voorbeeld 13 - BESCHERMINGSSTUDIES BIJ DIEREN

Teneinde vast te stellen of niet-replicerende kanariepokkenvectoren met expressie van mazelenvirus eiwitten een beschermende immuunrespons tegen CDV-provoca-tie zouden induceren, werden 10 weken oude specifiek pathogeenvrije beagles geïnoculeerd met kanariepokken-oudervirus en recombinante kanariepokkenvirussen. Twee honden werden tegelijkertijd geïnoculeerd met twee subcuta-ne injecties van 1 x 108 pfu van elke recombinant met tussenpozen van drie weken. Ter vergelijking werd één hond volgens hetzelfde schema geïnoculeerd met elk van de enkelvoudige vacciniavirusrecombinanten vP455 en vP557 en een combinatie van beide. Eén hond werd ook intramusculair geïnoculeerd met 1 dosis van 105 TCID50 van de verzwakte Edmonston stam van MV. Eén hond werd subcutaan geïnoculeerd met 1 dosis van 104 TCID50 van de verzwakte Rockborn stam van CDV. De honden werden twee weken na de laatste inocula-tie geprovoceerd via intranasale inoculatie met een letale dosis van 104 TCID50 van de virulente Snyder Hill stam van CDV. Klinische reacties van de honden werden dagelijks gevolgd. De resultaten worden getoond in tabel 5.

Tabel 5

Hf f entten van immunisatie op klinische symptomen na blootstelling -van, honden aan -virulent CDV_

Aantal dagen na inoculatie met -virulent CDV

Verhoogde Lytnfo- Virus

Tmmnnï gaM e_Hond No._Depressie_Gewichtsverlies_lichaamstemp._penie°_isolatie

Kanariepokken- 9/1 4-10d 3-10 4,5,7,8 5-10 3-10 virus (CPV) 9/2 4-10d 7-10 4,5,7,8 3-10 3-10 VCP50 9/3 NDe 7-10 5-7 5-7 7

9/4 ND 7 5,7 7 ND

VCP40 9/5 4-10 3-10 4 5-10 5-7 9/6 4-6 3-10 4-6 5 5-7

VCP57 9/7 ND ' 7-10 5,6 5 ND

9/8 ND 7-10 4-7,10 7-10 5-7 VP455 9/9 6-8 7-10 4,5,8,9 5-10 3-10

' vP55 7 .9/10 ND 3-10 ND ND ND

VP455 & vP 557 9/11 ND 3-10 ND 5-7 ND

MV 9/12 ND 7-10 ND 5 5

Geen 9/13 4-10d 3-10 4-6 5-10 5-10 9/14 4-10d 3-10 4-5 3-10 5-7

CDV-Ro_9/15_ND_ND_ND_ND_ND

a) Hoger dan 39,5°C

b) Minder dan 2 x 103 lymfocyten per mm3 c) Geïsoleerd uit cellen van de "buffy coat" samengekweekt met longmacrofagen van de hond op bekende wijze (Appel et al., 1967) d) Hond raakte gedehydreerd en werd uit zijn lijden verlost e) niet gedetecteerd

Bij geen van de honden werden ongunstige reacties op de vaccinatie opgemerkt tijdens het experiment. De twee honden die geïmmuniseerd waren met kanariepokken-oudervirus en twee niet-geïmmuniseerde controlehonden vertoonden ernstige ziekte na provocatie met virulent CDV. Alle vier honden raakten gedeprimeerd, vertoonden hoge lichaamstemperatuur, gewichtsverlies, lymfopenie en ernstige dehydratie. Met CDV-Rockborn geïmmuniseerde honden ontwikkelden in het serum neutraliserende antilichamen tegen CDV maar niet tegen MV vóór de provocatie en overleefden de provocatie zonder symptomen. Met verzwakt MV geïmmuniseerde honden ontwikkelden in het serum neutraliserende antilichamen tegen MV maar niet tegen CDV vóór de provocatie, en overleefden de provocatie met lichte verschijnselen van infectie. Honden die geïnoculeerd waren met vCP50, vCP57, vP557 of die gelijktijdig geïnoculeerd waren met vP455 en vP557 ontwikkelden in het serum significante hoeveelheden neutraliserend antilichaam tegen MV na 1 inoculatie en overleefden provocatie met slechts lichte verschijnselen van infectie.

Voorbeeld 14 - AANVULLENDE KANARIEPOKKEN/MAZELENCONSTRüCTEN

Met verwijzing nu naar figuur 7 werden voor het genereren van een kanariepokkenvirusrecombinant met expressie van het MV HA-gen de volgende insertieplasmiden gevormd. Een EcoRV/EcoRI-fragment van 1,8 kbp van pRW837 met daarop de het meest aan de 31-kant gelegen 26 bp van de H6 promotor, op precieze wijze gekoppeld aan het mazelen-HA, werd geligeerd aan een EcoRV/EcoRI-fragment van 3,2 kbp van pRW838. Het van pRW838 afkomstige fragment bevat het 5'-deel van de H6 promotor en flankerende armen van de C5-locus. Plasmiden pRW838 en pRW831 (zie hieronder) werden als volgt afgeleid.

Een PvuII-fragment van 880 bp van het kanariepok-kengenoom werd geïnserteerd tussen de PvuII-plaatsen van pUC9. Het resulterende plasmide werd pRW 764.5 genoemd. De nucleotidensequentie van het kanariepokkenfragment van 880 bp werd bepaald met behulp van de gemodificeerde T7 enzym Sequenase™ Kit (United States Biochemical, Cleveland, OH) volgens de specificaties van de fabrikant. Bij de sequen- cingreacties werd gebruik gemaakt van op maat gesynthetiseerde primers (17-18-meren), bereid met de Biosearch 8700 (San Rafael, CA) of Applied Biosystems 3800 (Poster City, CA). Hierdoor werd de definitie van het open leesframe voor C5 mogelijk.

Voor de specifieke deletie van het open leesframe voor C5 werd pRW764.5 gedeeltelijk geknipt met Rsal en het lineaire produkt werd geïsoleerd.· Het lineaire Rsal-fragment werd opnieuw geknipt met BalII en het fragment van pRW764.5 met een Rsal-BglII-deletie van positie 156 tot positie 462 werd geïsoleerd en gebruikt als een vector voor de volgende synthetische oligonucleotiden: RW145 (SEQ ID NO:15): (5'-ACTCTCA- AAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA-3') RW146 (SEQ ID NO:16): (5'- GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT - 3 ' ) Oligonucleotiden RW145 en RW146 werden "annealed" en geïnserteerd in de bovenbeschreven pRW764.5 Rsal-BqlII-vector. Het resulterende plasmide is pRW831.

Dit C5-deletieplasmide werd geconstrueerd zonder onderbreking van andere open leesframes van kanariepokken-virus. De C5-coderende sequentie werd vervangen door de bovengenoemde "annealed" oligonucleotiden (RW145 en RW146) die de restrictieplaatsen voor Hindi II. Smal en EcoRI bevatten.

Het plasmide pRW838 werd afgeleid van pRW831 door de insertie van een Smal-fragment met daarop het Rabies G-gen (Taylor et al., 1988b) aan de 3'-kant naast de vaccini-avirus H6 promotor. Ligatie van het EcoRV/EcoRI-fragment van 1,8 kbp van pRW837 met het EcoRV/EcoRI-fragment van 3,2 kbp van pRW838 leidde tot de constructie van plasmide pRW852. Plasmide pRW852 werd gebruikt in recombinatie-experimenten met een kanariepokkenisolaat, genaamd ALVAC, voor het verkrijgen van vCP85. ALVAC is een uit een plaque gekloneerd isolaat van kanariepokkenvirus (CPV), afgeleid van de Rentschler stam, een in hoge mate verzwakte stam van CPV die gebruikt voor vaccinatie van kanaries. Replicatie van ALVAC en daarvan afgeleide recombinanten is beperkt tot vogelsoorten. Met imunoprecipitatieanalyse is bevestigd dat een eiwit van ongeveer 75 kd dat herkend wordt door een konijne-anti-HA serum, tot expressie gebracht wordt in CEF cellen die geïnfecteerd zijn met recombinant VCP85.

Met verwijzing nu naar figuur 8 werden voor het genereren van een kanariepokkenvirusrecombinant die zowel het HA-als het F-gen van MV bevat, de volgende constructen gebouwd. Er werden Smal-restrictieplaatsen toegevoegd aan de uiteinden van het door de H6 promotor gecontroleerde mazelen-fusiegen. Om dit te bereiken werd pRW823, dat pIBI25 met daarin de vacciniavirus H6 promotor is, stroomafwaarts van de promotorsequentie bij de Xbal-plaats geknipt. De uiteinden werden stomp gemaakt met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het van stompe uiteinden voorziene DNA werd vervolgens geknipt met Nrul om een fragment van 3,0 kbp vrij te maken dat de het meest aan de 5' -kant gelegen 100 bp van de H6 promotor bevat. Dit fragment werd geïsoleerd en geligeerd aan een van stompe uiteinden voorzien Eagl/Nrul-fragment van 1,7 kbp van pSPMF75. Het resulterende plasmide werd pRW841 genoemd.

Het door ciigestie van pRW841 verkregen Smal-fragment van 1,8 kbp werd geïnserteerd in de C5-deletievec-tor pRW831. Het plasmide pRW851 werd gelineariseerd op de EcoRI-plaats die aan de 3'-kant van het fusiegen gesitueerd is, en werd van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het plasmide pRW837 met daarin het mazelen HA-gen aan de 31-kant naast de H6 promotorsequenties, werd geknipt met HindiII en EcoRI en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment. Het resulterende fragment van 1,8 kbp werd geïsoleerd en geïnserteerd in pRW851 dat gelineariseerd was met EcoRI en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide, dat beide genen bevat in een staart-staart-configuratie, werd pRW853A genoemd en werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met kanariepokken (ALVAC) als het ontvangende virus voor het genereren van vCP82, ook genoemd ALVAC-MV. Expressieanalyse met behulp van immunoprecipitatie en immunofluorescentie bevestigde dat in cellen die geïnfecteerd waren met recom- binant vCP82 authentiek bewerkte HA- en F-eiwitten tot expressie werden gebracht. De recombinant was ook functioneel wat betreft celfusie-activiteit.

Resultaten van serologische analyse van sera van met ALVAC-MV (vCP82) qeïnoculeerde konijnen en cavia's.

Vier cavia's werden langs subcutane weg geïnocu-leerd met ALVAC-MV (vCP82) . Twee dieren (026 en 027) ontvingen elk lxlO8 pfu en twee dieren (028 en 029) ontvingen elk lxlO7 pfu. Na 28 dagen werden de dieren opnieuw geïnoculeerd met een identieke dosis. Twee konijnen werden geinoculeerd met lxlO8 pfu ALVAC-MV (VCP82) langs subcutane weg. Na 28 dagen werden de dieren opnieuw geïnoculeerd met een identieke dosis. Seriële bloedmonsters van deze dieren werden geanalyseerd op mazelenvirus neutraliserende activiteit met behulp van ofwel een microtiterneutralisatietest beschreven door Appel en Robson (1973) of een plaque-reduc-tie neutralisatietest beschreven door Albrecht et. al. (1981). Bovendien werden sera geanalyseerd op de aanwezigheid van antilichaam dat in staat was door mazelenvirus geïnduceerde cel-celfusie te blokkeren in een anti-fusie bepaling, uitgevoerd zoals beschreven door Merz et al. (1980).

De resultaten van de analyse op de aanwezigheid van mazelenvirus neutraliserend antilichaam in serum worden getoond in tabel 6 en 7. De beide cavia's (026 en 027) die lxlO8 pfu ALVAC-MV ontvingen, vertoonden seroconversie na één enkele inoculatie en de sera vertoonden een stijging in antilichaam na de booster-inoculatie. Eén dier (029) dat lxlO7 pfu ontving, vertoonde ook seroconversie na één inoculatie. Het vierde dier (028) vertoonde geen detec-i teerbare respons na één inoculatie maar bereikte gelijkwaardige titers na de tweede inoculatie.

Konijnensera werden ook geanalyseerd met behulp van een plaque-reductie neutralisatiemethode. De resultaten worden getoond in tabel 7. Beide dieren vertoonden.serocon-i versie na één inoculatie. Serum van konijn 036 werd getest met zowel de microtiterneutralisatietest als de plaque-reductie neutralisatietest. De bereikte titers waren vergelijkbaar bij gebruik van beide werkwijzen. Vermeld is dat een minimale neutraliserende titer van het serum van 1,2 tot 1,9 in gevaccineerde kinderen vereist is voor bescherming tegen ziekte (Lennon en Black, 1986; Black et al. 1984) . Aan de hand van deze criteria vertoonden alle dieren, behalve de ene cavia die geen seroconversie vertoonde tot de tweede inoculatie, een beschermend gehalte aan antilichamen na één inoculatie.

Tabel 6

Serologische analyse van sera van cavia's, geïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82): Analyse uitgevoerd met microtiter serum neutralisatieassay.

a) niet getest.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die volledige neutralisatie van het cytopathisch effect geeft.

c) Dieren kregen een booster 28 dagen na inoculatie.

d) Dieren 026 en 027 kregen 1x1O8 pfu.

e) Dieren 028 en 029 kregen lxlO7 pfu.

Tabel 7

Serologische analyse van sera van konijnen, geïnoculeerd met ALVAC-MV (VCP82) a; Titer uitgedrukt als log10

van de reciproke van de laatste verdunning die een vermindering van 50% van het aantal plaques geeft vergeleken met pre-inoculatie serum.

b) Dieren kregen een booster 28 dagen na inoculatie.

c) Titer uitgedrukt, als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die een volledige neutralisatie van het cytophatisch effect geeft.

Eerdere studies hebben aangetoond dat een geïnactiveerd vaccin gepaard ging met een weinig doeltreffende bescherming en een versterkt ziektebeeld van mazelen bij opnieuw blootstellen aan het virus. Ontvangers van het geïnactiveerde vaccin vertoonden een afwezigheid van antilichamen tegen het fusie-eiwit en geopperd werd dat het inactiveringsproces het eiwit niet-immunogeen had gemaakt (Norrby en Gollmar, 1975; Norrby et al., 1975). Bovendien is voor andere paramyxovirussen aangetoond dat antilichaam tegen het F-eiwit de verspreiding van cel naar cel van het virus in weefselkweek kan remmen, terwijl antilichaam tegen de hemagglutinine component dat niet kan (Merz et al., 1980) .

Het was derhalve van belang aan te tonen dat dieren de geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) antilichaam tegen de F-component konden induceren dat in staat was de overdracht van mazelenvirus van cel naar cel te blokkeren. De resultaten van deze anti-fusie-analyse worden getoond in tabel 8. Anti-fusie-activiteit was duidelijk in sera van zowel cavia's als konijnen die geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) . Het geanalyseerde serum werd 2 of 3 weken na de booster-inoculatie afgenomen. Er kon geen anti-fusie-activiteit gedetecteerd worden in sera van konijnen die geïnoculeerd waren met het ALVAC oudervirus.

Tabel 8

Analyse van sera van cavia's en konijnen, geïnoculeerd met ' ALVAC-MV op anti-fusieactiviteit.

a) Caviasera getest 7 weken na vaccinatie.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de hoogste verdunning die volledige remming van door mazelenvirus geïnduceerde celfusie-activiteit geeft.

c) Konijnesera getest 6 weken na vaccinatie.

In volgende tests voor het aantonen van de aanwezigheid van antilichaam tegen zowel het MV-hemagglutinine als het MV-fusie-eiwit in sera van dieren die geïnoculeerd waren met ALVAC-MV, werden immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd. Aangetoond werd dat serum van met ALVAC-MV geinoculeerde konijnen specifiek zowel het hemagglutinine-als het fusie-eiwit precipiteerde uit radioactief gemerkte lysaten van Vero cellen die geïnfecteerd waren met Emonston stam MV.

In een vergelijkbare studie werden groepen cavia's, konijnen en muizen geïnoculeerd langs intramusculaire weg met ALVAC-MV, en werd hun serologische respons op mazelenvirus gevolgd met behulp van de hemagglutinatie-inhibitie (Hl) test. De serologische respons op kanariepok-kenvirus werd gevolgd met een ELISA bepaling. In deze studie werden vijf cavia's geïnoculeerd met. 5,5 log10 tcid50, werden dertig muizen geïnoculeerd met 4,8 log10 TCID50 en werden vijf konijnen geïnoculeerd met 5,8 log10 TCID5q. Alle dieren werden na 28 dagen opnieuw geïnoculeerd met een equivalente dosis. Op gezette tijden werden bloedmonsters van de dieren genomen en werd hun respons op mazelenvirus bepaald met een HI-bepaling. De detectielimiet van de HI-bepaling komt overeen met een log10 titer van 1 en seropositieve (beschermde) kinderen worden geacht een serum titer te hebben in het bereik van 1,6-2,8. De resultaten van de analyse worden getoond in tabel 9, 10 en 11.

Sera van muizen werden geanalyseerd in groepen van vijf dieren (tabel 9). Alle dieren vertoonden een primaire respons op kanariepokkenvirus dat als een booster werd gegeven na de tweede inoculatie. De muizen vertoonden geen respons op MV na één inoculatie. Drie van de zes groepen vertoonden 8 weken na inoculatie titers binnen het beschermende bereik. Evenzo vertoonden alle cavia's (tabel 10) een respons op kanariepokkenvirus na één inoculatie die als een booster werd gegeven na de tweede inoculatie. Vier van de vijf dieren ontwikkelden anti-Ηί titers na één inoculatie, waarvan één in het beschermende bereik. Eén week na de tweede inoculatie waren de titers van alle dieren in het beschermende bereik. Deze titers bleven op peil tot en met 8 weken na inoculatie wanneer het experiment werd beëindigd. Alle konijnen (tabel 11) die geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) vertoonden een serologische respons op inoculatie met kanariepokken. Vier van de vijf dieren vertoonden seroconversie op mazelenvirus na één inoculatie. (één in het beschermende bereik). De serumtiters van alle dieren lagen 1 week na de tweede inoculatie in het beschermende bereik.

Tabel 9

Serologische respons van muizen op inoculatie met ALVAC-MV

(vCP82).

Anti-kanariepokkenrespons

Anti-mazelenrespons

a) Bij groepen van vijf muizen werd bloed afgenomen en werden de sera samengevoegd.

b) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:800 verdund serum.

c) Detectielimiet in HI-test komt overeen met een log^0 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de hoogste verdunning die remming van de hemagglutinatie geeft.

Tabel 10

Serologische respons van cavia's op inoculatie met ALVAC-MV

(vCP82).

Anti-kanariepokkenrespons

Anti-mazelenrespons

a) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:3200 verdund serum.

b) Detectielimiet in HI-test komt overeen met een log10 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt zoals in legende bij tabel 9.

Tabel 11

Serologische respons van konijnen op inoculatie met ALVAC- MV (vCP2).

Anti-kanariepokkenrespons

Anti-mazelenrespons

a) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:1600 " verdund serum.

b) Detectielimiet in Hl-test komt overeen met een log10 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt zoals in legende bij tabel 9.

Resultaten van serolocrische analyse van sera van doodshoofdaap~ies. aeïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82) ; .

invloed van eerdere blootstelling aan pokkenvirus ot> inductie van een mazelenvirus-specifieke immuunrespons.

Negen doodshoofdaapjes (Saimiri sciureus) werden geinoculeerd met ALVAC-MV (vCP82). Alle aapjes waren niet eerdere blootgesteld geweest aan mazelenvirus. Zeven van de aapjes waren in het verleden blootgesteld aan vacciniavirus en/of kanariepokkenvirus. Het verleden van de immunisatie wordt getoond in tabel 12. Alle aapjes werden geinoculeerd met 1 dosis van 5,8 log10 pfu langs subcutane weg. Vier van de dieren (#39, 42, 53 en 58) werden 15 weken na de primaire inoculatie opnieuw geinoculeerd met een equivalente dosis. Anti-mazelen antilichaam werd gemeten met de Hl test. De resultaten worden getoond in tabel 12.

Na de eerste inoculatie vertoonden twee van de negen aapjes een lage respons op inoculatie met ALVAC-MV. Na de tweede inoculatie vertoonden alle vier opnieuw geinoculeerde aapjes seroconversie met significante antili-chaamtiters in het voor beschermende immuniteit vereiste bereik. De bereikte titers waren equivalent ongeacht of het aapje in het verleden blootgesteld was geweest aan vacciniavirus en ALVAC of geen eerdere blootstelling aan pokkenvirus had.

Tabel 12

Inoculatie van doodshoofdaapjes met ALVAC-MV (vCP82): Immuunrespons in aanwezigheid van reeds bestaande ALVAC immuniteit.

a) Dieren kregen 5,8 log10 pfu s.c.

b) Dieren 39, 42, 52 en 53 kregen een booster met een identieke dosis 15 weken na de eerste inoculatie.

Voorbeeld 15 - VERZWAKTE VACCINIA VACCINSTAM NYVAC

Om een nieuwe vaccinia-vaccinstam te ontwikkelen werd de Copenhagen vaccinstam van vacciniavirus gemodificeerd door de deletie van zes niet-essentiële gebieden van het genoom die coderen voor bekende of potentiële virulen-tiefactoren. De achtereenvolgende deleties worden hieronder in detail beschreven. Alle aanduidingen van vaccinia restrictiefragmenten, open leesframes en nucleotideposities zijn gebaseerd op de door Goebel et al. (1990a,b) vermelde terminologie.

De deletie-loei werden ook geconstrueerd als ontvanger-loei voor de insertie van vreemde genen.

De achtereenvolgens door deletie verwijderde gebieden in NYVAC worden hieronder gegeven. Ook gegeven worden de afkortingen en aanduidingen van de open leesframes voor de verwijderde gebieden (Goebel et al.,1990a,b) en de aanduiding van de vacciniarecombinant (vP) die alle deleties tot en met de gespecificeerde deletie bevat: (1) thymidinekinase-gen (TK; J2R) vP41Q,- (2) hemorrhagisch gebied (u,- B13R+B14R) vP553; (3) A type "inclusion body" gebied (ATI; A26L) VP618; (4) hemagglutinine-gen (HA; A56R) vP723; (5) gastheerbereikgenengebied (C7L-K1L) vP804; en (6) grote subunit van ribonucleotidereductase (I4L) vP866 (NYVAC) .

DNA-klonering en -synthese.

Plasmiden werden geconstrueerd, gescreend en gekweekt met standaardwerkwijzen (Maniatis et al., 1986; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Restrictie-endonucleasen werden verkregen van GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; en Boehringer Mann-heim Biochemicals, Indianapolis, IN. Klenow fragment van E. coli polymerase werd verkregen van Boehringer Mannheim Biochemicals. BAL-31 exonuclease en faag T4 DNA-ligase werden verkregen van New England Biolabs. De reagentia werden gebruikt volgens de specificatie van de diverse leveranciers.

Synthetische oligodeoxyribonucleotiden werden bereid op een Biosearch 8750 of Applied Biosystems 380B DNA synthesizer zoals eerder beschreven (Perkus et al., 1989). DNA-sequencing werd uitgevoerd met de dideoxy-ketenbeëin-digingsmethode (Sanger et al., 1977) met behulp van Seque-nase (Tabor et al., 1987) zoals eerder beschreven (Guo et al.,1989). DNA-amplificatie met de polymerase-kettingreac-tie (PCR) voor het verifiëren van de sequentie (Engelke et al.,1988) werd uitgevoerd met behulp van op maat gesynthetiseerde oligonucleotideprimers en GeneAmp DNA amplifi-cation Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in een geautomatiseerde Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Overtollige DNA-sequenties werden uit plasmiden verwijderd door digestie met restrictie-edonuclease, gevolgd door beperkte digestie met BAL-31 exonuclease en mutagenese (Mandecki, 1986) met behulp van synthetische oligonucleoti-den.

Cellen, virus en transfectie.

De oorsprong en kweekomstandigheden van de Copen-hagenstam van vacciniavirus zijn eerder beschreven (Guo et al.,1989). Het genereren van recombinant virus door recom-binatie, in situ hybridisatie van nitrocellulosefilters en het screenen op Beta-galactosidase-activiteit zijn zoals eerder beschreven (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).

Constructie van plasmide PSD460 voor deletie van thvmidinekinase-gen (J2R)

Met verwijzing nu naar figuur 9 bevat plasmide pSD406 vaccinia HindiII J (pos. 83359-88377) gekloneerd in pUC8. pSD406 werd geknipt met HindiII en PvuII, en het fragment van l,7kb van de linkerkant van HindiII J werd gekloneerd in pUC8 dat geknipt was met HindiII/Smal. waarmee pSD447 werd gevormd. pSD447 bevat het complete gen voor J2R (pos. 83855-84385). Het initiatiecodon bevindt zich in een NlalII-plaats en het terminatiecodon bevindt zich in een Sspl-plaats. De richting van de transcriptie wordt aangegeven met een pijl in figuur 9.

Om een flankerende arm aan de linkerkant te verkrijgen werd een HindiII-EcoRIfragment van 0,8 kb geïsoleerd uit pSD447, daarna geknipt met NlalII en werd een

Hindi11/NlaIII-fragment van 0,5 kb geïsoleerd. "Annealed" synthetische oligonucleotiden MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID N0:17/SEQ ID NO:18)

Smal MPSYN43 5' TAATTAACTAGCTACCCGGG 3' MPSYN44 3' GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5'

NlalII EcoRI

werden met het Hindi11/Nlal11-fracrment van 0,5 kb geligeerd in pUC18 vectorplasmide dat geknipt was met HindiII-EcoRI, waarmee plasmide pSD449 werd gegenereerd.

Om een restrictiefragment te verkrijgen met een flankerende arm van vaccinia aan de rechterkant en vector-sequenties van pUC, werd pSD447 geknipt met Sspl (gedeeltelijk) binnen vacciniasequenties en met HindiII bij de PUC/vaccinia-verbinding, en werd een vectorfragment van 2,9 kb geïsoleerd. Dit vectorfragment werd geligeerd met "annealed" synthethische oligonucleotide MPSYN4 5/MPSYN4 6 (SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20)

HindiII Smal

MPSYN45 5' AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA MPSYN46 3' AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTT

Not I SspI

ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACTAAT 3' MPSYN45 TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5' MPSYN46 waarmee pSD459 werd gegenereerd.

Om de linker en rechter flankerende armen te combineren tot één plasmide werd een HindiII/Smal-fragment van 0,5 kb geïsoleerd uit pSD449 en geligeerd met pSD459 vector plasmide dat geknipt was met HindiII/Smal. waarmee plasmide pSD460 werd gegenereerd. pSD460 werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met wild type vaccinia oudervirus Copenhagen stam VC-2. 32P-gemerkte probe werd gesynthetiseerd door ketenverlenging van de primer met behulp van MPSYN45 (SEQ ID NO: 19) als template en het complementaire 20-meer oligonucleotide MPSYN47 (SEQ ID NO:21) (51-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-31) als primer. Recombinant virus vP410 werd geïdentificeerd met plaque-hybridisatie.

Constructie van plasmide pSD486 voor deletie van het hemorhacrische crebied (B13R +B14R) 1 Met verwijzing nu naar figuur 10 bevat plasmide pSD419 vaccinia Sall G (pos. 160.744-173.351) gekloneerd in pUC8. pSD422 bevat het aangrenzende vaccinia Sall-fragment aan de rechterkant, Sall J (pos. 173.351-182.746) gekloneerd in pUC8. Om een plasmide te construeren met deletie van het hemorrhagische gebied, u,B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), werd pSD419 gebruikt als de bron voor de linker flankerende arm en werd pSD422 gebruikt als de bron voor de rechter flankerende arm. De richting van transcriptie voor het u gebied wordt aangegeven met een pijl in figuur 10.

Om ongewenste sequenties uit pSD419 te verwijderen werden sequenties links van de Ncol-plaats (pos. 172.-253) verwijderd door digestie van pSD419 met Ncol/Smal gevolgd door stompmaken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie, waarmee plasmide pSD476 werd gegenereerd. Een rechter flankerende arm van vaccinia werd verkregen door digestie van pSD422 met Hpal bij het terminatiecodon van B14R en door digestie met Nrul 0,3 kb rechts daarvan. Dit fragment van 0,3 kb werd geïsoleerd en geligeerd met een HincII-vectorfraoment van 3,4 kb, geïsoleerd uit pSD476, waarmee plasmide pSD477 werd gegenereerd. De plaats van de gedeeltelijke deletie van het vaccinia u gebied in pSD477 wordt aangegeven met een driehoek. De resterende B13R coderende sequenties in pSD477 werden verwijderd door digestie met Clal/Hpal en het resulterende veetorfragment werd geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden SD22mer/SD20mer (SEQ ID NO:22/SEQ ID NO:23)

Clal BamHI Hpal SD22mer 5' CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3' SD20mer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5' waarmee pSD479 werd gegenereerd. pSD479 bevat een initia-tiecodon (onderstreept) gevolgd door een BamHI-Plaats. Om Beta-galactosidase van E. coli te plaatsen in de B13-B14 (u) deletielocus onder controle van de u promotor werd een BamHI-fragment van 3,2 kb met daarop het Beta-galactosida-se-gen (Shapira et al., 1983) geïnserteerd in de BamHI-plaats van pSD479, waarmee pSD479BG werd gegenereerd. pSD 479BG werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met vacciniavirus vP410. Recombinant vacciniavirus VP533 werd geïsoleerd als een blauwe plaque in· aanwezigheid van chromogeen substraat X-gal. In vP533 is het B13R-B14R . gebied verwijderd en vervangen door Beta-galactosidase. Om Beta-galactosidasesequenties uit vP533 te verwijderen werd plasmide pSD486 gebruikt, en derivaat van pSD477 met een polylinkergebied maar geen initiatiecodon bij de verbinding met de u deletie. Eerst werd het bovengenoemde Clal/Hpal-vectorfragment uit pSD477 geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden SD42mer/SD40mer (SEQ ID N0:24/SEQ ID NO:25)

Clal SacI Xhol Hpal SD42mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3' SD40mer 3' TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 5'

BglII Smal BamHI

waarmee plasmide pSD478 werd gegenereerd. Vervolgens werd de EcoRI-plaats bij de pUC/vaccinia-verbinding vernietigd door digestie van pSD478 met EcoRI, gevolgd door het voorzien van stompe uiteinden met Klenow fragment van E.· coli polymerase en ligatie, waarmee plasmide pSD478E~ werd gegenereerd. pSD478E~ werd geknipt met BamHI en Hpal en geligeerd met "annealed" synthetische oligonuncleotiden. HEM5/HEM6 (SEQ ID NO':26/SEQ ID NO: 27)

BamHI EcoRI Hpal HEM5 5' GATCCGAATTCTAGCT 3' HEM6 3' GCTTAAGAT CGA 5' waarmee plasmide pSD486 werd gegenereerd. pSD486 werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met recombinant vacciniavirus vP533, onder vorming van vP553, dat geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.

Constructie van plasmide pMP494A voor deletie van het ATI gebied (A26L)

Met verwijzing nu naar figuur 11 bevat pSD414 Sall B, gekloneerd in pUC8. Om ongewenste DNA-sequenties links van het A26L gebied te verwijderen werd pSD414 geknipt met Xbal in vacciniasequenties (pos. 137.079) en met HindiII bij de pUC/vaccinia verbinding, vervolgens van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli polymerase en geligeerd, wat resulteerde in plasmide pSD483. Om ongewenste vaccinia DNA-sequenties rechts van het A26L

gebied te verwijderen werd pSD483 geknipt met EcoRI (pos. 140.665 en bij de pCU/vaccinia verbinding) en geligeerd, onder vorming van plasmide pSD484. Om het coderende gebied van A26L te verwijderen werd pSD484 geknipt met Ndel (gedeeltelijk) enigszins stroomopwaarts van het A26L ORF (pos. 139.004) en met Hpal (pos. 137.889) enigszins stroomafwaarts van het A26L ORF. Het vectorfragment van 5,2 kb werd geïsoleerd en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden AT13/AT14 (SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:29)

Ndel

ATI3 5 ' TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT ATI4 3 ' ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTATTCA

BqlII EcoRI Hpal TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3 ' ATI3 ATATATTTAT CTAGACTTAAGCAA 5' AT14 waardoor het gebied stroomopwaarts van A26L werd gereconstrueerd en het A26L ORF werd vervangen door een kort polylinkergebied met de restrictieplaatsen BglII, EcoRI en Hpal, zoals boven aangegeven. Het resulterende plasmide werd pSD485 genoemd. Omdat de BqlII- en EcoRI-plaatsen in het polylinkergebied van pSD485 niet uniek zijn, werden ongewenste BalII- en EcoRI-plaatsen uit plasmide pSD483 (bovenbeschreven) verwijderd door digestie met BqlII (pos. 140.136) en met EcoRI bij de pUC/vaccinia verbinding, gevolgd door voorzien van stompe uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie. Het resulterende plasmide werd pSD489 genoemd. Het Clal (pos. 137.198)/E-coRV (pos. 139.048)-fragment van 1,8 kb van pSD489 met het A26L ORF werd vervangen door het overeenkomstige polylinker bevattende Clal/EcoRV-fragment van 0,7 kb van pSD485, waarmee pSD492 werd gegenereerd. De BalII- en EcoRV-plaat-sen in het polylinkergebied van pSD492 zijn uniek.

Een BqlII-cassette van 3,3 kb met daarop het E. coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al.,1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) werd geïnserteerd in de BglII-plaats van pSD492, waardoor pSD493KBG werd gevormd. Plasmide pSD493KBG werd gebruikt bij recombinatie met ontvangend virus vP553. Recombinant vacciniavirus, VP581, met Bèta- galactosidase in het A26L deletiegebied, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.

Voor het genereren van een plasmide voor de verwijdering van Beta-galactosidasesequenties uit vaccinia recombinant virus vP581 werd het polylinkergebied van plasmide pSD492 verwijderd door mutagenese (Mandecki, 1986) met behulp van synthetisch oligonucleotide MPSYN177 (SEQ ID NO:3 0) (5'-AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATA-ACTTATTTTTTGAAT- ATAC-31). In het resulterende plasmide, pMP494A, is het vaccinia DNA dat posities [137.889-183.937] omvat, waarop het complete A26L ORF, verwijderd. Recombinatie tussen het ΡΜΡ494δ en de Beta-galactisodasebevattende vacciniarecom-binant vP581, resulteerde in vaccinia deletiemutant vP618, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.

Constructie van plasmide PSD467 voor deletie van het hemagglutinine-gen (A56R)

Met verwijzing nu naar figuur 12 loopt het vaccinia Sall G restrictiefragment .(pos. 160.744-173.351) tot voorbij de HindiII A/B verbinding (pos. 162.539). pSD419 bevat vaccinia Sall , G gekloneerd in pUC8. De richting van de transcriptie voor het hemagglutinine (HA) gen wordt aangegeven met een pijl in figuur 12. Van HindiII B afkomstige vacciniasequenties werden verwijderd door digestie van pSD419 met HindiII in vacciniasequenties en bij de pUC/vaccinia verbinding, gevolgd door ligatie. Het resulterende plasmide, pSD456, bevat het HA-gen, A56R, geflankeerd door een vacciniasequentie van 0,4 kb aan de linkerkant en een vacciniasequentie van 0,4 kb aan de rechterkant. Coderende sequenties van A56R werden verwijderd door pSD456 te knippen met Rsal (gedeeltelijk; pos. 161.090) stroomopwaarts van de coderende sequenties van A56R, en met Eagl (pos. 162.054) dicht bij het eind van het gen. Het Rsal/ Eagl-vectorfragment van 3,6 kb van pSD456 werd geïsoleerd en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden MPSYN59 (SEQ ID N0;31), MPSY62 (SEQ ID NO:32), MPSYN60 (SEQ ID NO:33), en MPSYN 61 (SEQ ID N0:34)

Rsal

MPSYN59 5 ' ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGA-. TAGA

MGSYN62 3 ' TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAAC-TATCT 5' MPSYN59 -ACAAAATACATAATTT 3'

BqlII

MPSYN60 5' TGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCT- MPSYN61 3' TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGA-

Smal PstI Eaal MPSYN60 -CCCGGGCTGCAGC 3' MPSYN61 -GGGCCCGACGTCGCCGG 5' waarmee de DNA-sequenties stroomopwaarts van het A56R ORF werden gereconstrueerd en het A56R ORF werden vervangen door een polylinkergebied zoals boven aangegeven. Het resulterende plasmide is pSD466. De vacciniadeletie in pSD466 omvat posities [161.185-162.053]. De plaats van de deletie in pSD466 wordt aangegeven met een driehoek in figuur 12.

Een BqlII/BamHI (gedeeltelijk)-cassette met daarop het E. Coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989) werd geïnserteerd in de BqlII-plaats van pSD466, waarmee pSD466KBG werd gevormd. Plasmide pSD466KBG werd gebruikt in recombinatie me.t ontvangend virus vP618. Recombinant vacciniavirus, vP708, dat Beta-galactosidase in de A56R deletie bevat, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.

Beta-galactosidasesequenties werden uit vP708 verwijderd met behulp van donorplasmide pSD467. pSD467 is identiek aan pSD466, behalve dat EcoRI-, Smal- en BamHI-plaatsen verwijderd waren uit de pUC/vaccinia verbinding door digestie van pSD466 met EcoRI/BamHI, gevolgd door stompmaken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie. Recombinatie tussen vP708 en pSD467 resulteerde in de recombinante vaccinia deletiemutant, vP723, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.

Constructie van plasmide pMPCSKIa voor deletie van open leesframes FC7L-K1L1

Met verwijzing nu naar figuur 13 werden de volgende vacciniaklonen gebruikt bij de constructie van pMPCSKIDA. pSD420 is Sall H gekloneerd in pUC8. pSD435 is Konl F gekloneerd in pUC18. pSD435 werd geknipt met Sphl en weer geligeerd, waardoor pSD451 werd gevormd. In pSD451 zijn DNA-sequenties links van de Sphl-plaats (pos. 27.416) in HindiII M verwijderd (Perkus et al., 1990). pSD409 is Hindi II M gedoneerd in pUC8.

Om te voorzien in een substraat voor de deletie van de [C7L-K1L]-genencluster uit vaccinia, werd E. coli Beta-galactosidase eerst als volgt geïnserteerd in de vaccinia M2L deletielocus (Guo et al., 1990). Om de BglII-plaats in pSD409 te elimineren werd het plasmide geknipt met ΒσΐII in vacciniasequenties (pos. 28.212) en met BamHI bij de pUC/vaccinia verbinding en daarna geligeerd om zo plasmide pMP409B te vormen. pMP409B werd geknipt op de unieke Sphl-plaats (pos. 27.416). Coderende sequenties van M2L werden verwijderd door mutagenese (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986) met behulp van het synthetische oligonucle-otide

Bgl.il MPSYN82 (SEQ ID NO:35) 5' TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTTACTCAAAA TATGTAACAATA 3'

Het resulterende plasmide, pMP409D, bevat een unieke ΒσΙΙΙ-plaats, geïnserteerd in de M2L deletielocus zoals boven aangegeven. Een BamHI(gedeeltelijk)/BglII-cassette van 3,2 kb met daarop het E. coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de 11 kDa promotor (Bert-holet et al., 1985) werd geïnserteerd in pMP409D dat geknipt was met BglII. Het resulterende plasmide, pMP409DBG (Guo et al.,1990) werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met ontvangend vacciniavirus vP723. Recombinant vacciniavirus, vP784, dat β-galactosidase geïnserteerd in de M2L deletielocus bevat, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.

Een plasmide met deletie van vacciniagenen [C7L -KIL] werd opgebouwd in pUC8 dat geknipt was met Smal. HindiII en van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli polymerase. De linker flankerende arm bestaande uit vaccinia HindiII C-sequenties werd verkregen door digestie van pSD420 met Xbal (pos. 18.628), gevolgd door stomp maken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en digestie met BctIII (pos. 19.706). De rechter flankerende arm bestaande uit vaccinia HindiII K-sequenties werd verkregen door digestie van pSD451 met BqlII (pos. 29.062) en EcoRV (pos. 29.778). Het resulterende plasmide, pMP581CK, heeft een deletie van de vacciniase-quenties tussen de BglII-plaats (pos. 19.706) in HindiII C en de BglII-plaats (pos. 29.062) in HindiII K. De plaats van de deletie van de vacciniasequenties in plasmide pMP581CK wordt aangegeven met een driehoek in figuur 13.

Om overtollig DNA bij de vacciniadeletieverbinding te verwijderen werd plasmide pMP581CK geknipt bij de Ncol-plaatsen binnen vacciniasequenties (pos. 18.811; 19.655), behandeld met Bal-31 exonuclease en onderworpen aan mutage-nese (Mandecki, 1986) met behulp van het synthetische oligonucleotide MPSYN233 (SEQ ID NO:36) 5'-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3'. 'Het resulterende plasmide, pMPCSKlA, heeft een deletie van vacciniasequenties posities 18.805-29.108, omvattende 12 open leesframes van vaccinia [C7L - KIL] . Recombinatie tussen pMPCSKlA en de β-galactosidase bevattende vaccinia-recombinant vP784 resulteerde in vaccinia deletiemutant vP804, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.

Constructie van plasmide PSD548 voor deletie van de grote subunit van ribonucleotidereductase (I4L).

Met verwijzing nu naar figuur 14 bevat plasmide pSD405 vaccinia HindiII I (pos. 63.875-70.367), gekloneerd in pUC8. pSD405 werd geknipt met EcoRV binnen vacciniasequenties (pos. 67.933) en met Smal bij de pUC/vaccinia verbinding en geligeerd, waarmee plasmide pSD518 werd gevormd. pSD518 werd gebruikt als de bron van alle vaccinia restric-tiefragmenten die gebruikt werden bij de constructie van pSD548.

Het vaccinia I4L-gen loopt van positie 67.371-65.059. De richting van de transcriptie voor I4L wordt aangegeven met een pijl in figuur 14. Om een vector-plasmidefragment te verkrijgen met een deletie van een deel van de coderende sequenties van I4L werd ,pSD518 geknipt met BamHI (pos. 65.381) en Hpal (pos. 67.001) en van stompe uiteinden voorzien met behulp van Klenow fragment van E. coli polymerase. Dit vee tor fragment van 4,8 kb werd geli-geerd met een Smal-cassette van 3,2 kb met daarop het E. coli β-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), wat resulteerde in plasmide pSD524KBG. pSD524KBG werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met vacciniavirus vP804. Recombinant vaccinia-virus, vP855, dat β-galactosidase bevat in een gedeeltelijke deletie van het I4L-gen, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.

Om β-galactosidase en de rest van het I4L ORF uit vP855 te verwijderen werd deletieplasmide pSD548 geconstrueerd. De linker en rechter flankerende armen van vaccinia werden afzonderlijk ingebouwd in pUC8 zoals hieronder gedetailleerd beschreven en zoals schematisch weergegeven in figuur 14.

Om een vectorplasmide te construeren voor het opnemen van de linker flankerende arm van vaccinia werd pUC8 geknipt met BamHI/EcoRI en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden 518A1/518A2 (SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:3 8)

BamHI Rsal

518A1 5 ' GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT 518A2 3 ' GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA

BalII EcoRI

TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG 3' 518A1 i AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5' 518A2 waarmee plasmide pSD531 werd gevormd. pSD531 werd geknipt met Rsal (gedeeltelijk) en BamHI en er werd een vectorfrag-ment van 2,7 kb geïsoleerd. pSD518 werd geknipt met BalII (pos. 64.459)/Rsal (pos. 64.994) en er werd een fragment i van 0,5 kb geïsoleerd. De twee fragmenten werden aan elkaar geligeerd, waarmee pSD537 werd gevormd dat de complete flankerende arm van vaccinia links van de coderende sequenties van I4L bevat.

Om een vectorplasmide te construeren voor het opnemen van de rechter flankerende arm van vaccinia werd pUC8 geknipt met BamHl/EcoRI en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden 518B1/518B2 (SEQ ID NO:39/SEQ ID NO:40)

BamHI BqlII Smal 518B1 5' GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAGGGATTT 518B2 3'

GTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATCCCTAAA

Rsal EcoRI

GACGTATGTAGCGTACTAGG 3' 518B1 CTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5' 518B2 waarmee plasmide pSD532 werd gevormd. pSD532 werd geknipt met Rsal (gedeeltelijk)/EcoRI en er werd een veetorfragment van 2,7 kb geïsoleerd. pSD518 werd geknipt met Rsal binnen vacciniasequenties (pos. 67.436) en EcoRI bij de. vacci-nia/pUC verbinding en er werd een fragment van 0,6 kb geïsoleerd. De twee fragmenten werden aan elkaar geligeerd, waarmee pSD538 werd gevormd dat de complete flankerende arm van vaccinia rechts van de coderende sequenties van I4L bevat.

De rechter flankerende arm van vaccinia werd geïsoleerd als een EcoRl/BglII-fragment van 0,6 kb uit pSD538 en geligeerd in pSD537 vectorplasmide dat geknipt was met EcoRl/BglII. In het resulterende plasmide, pSD539, is het I4L ORF (pos. 65.047-67.386) vervangen door een polylinkergebied dat geflankeerd wordt door 0,6 kb vaccinia DNA aan de linkerkant en 0,6 kb vaccinia DNA aan de rechterkant, dit alles op een pUC achtergrond. De plaats van de deletie in de vacciniasequenties wordt aangegeven met een driehoek in figuur 14. Om mogelijke recombinatie van β-galactosidasesequenties in het van pUC afkomstige deel van pSD539 met β-galactosidasesequenties in recombinant vacci-niavirus vP855 te vermijden werd de vaccinia I4L-deletie-cassette uit pSD539 overgebracht in pRCll, een pUC-derivaat waaruit alle β-galactosidasesequenties verwijderd zijn en vervangen zijn door een polylinkergebied (Colinas et al., 1990). pSD539 werd geknipt met EcoRI/PstI en het fragment van 1,2 kb werd geïsoleerd. Dit fragment werd geligeerd in pRCll dat geknipt was met EcoRl/PstI (2,35 kb), waardoor pSD548 werd gevormd. Recombinatie tussen pSD548 en de β-galactosidase bevattende vacciniarecombinant vP855 resulteerde in vaccinia deletiemutant vP866 die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.

DNA van recombinant vacciniavirus vP866 werd geanalyseerd met behulp van restrictiedigestie, gevolgd door elektroforese op een agarosegel. De restrictiepatronen waren zoals verwacht. Polymerase-kettingreacties (PCR) (Engelke et al., 1988) met behulp van vP866 als de template en met primers die de zes boven beschreven deletieloci flankeerden, leverde DNA-fragmenten op van de verwachte grootten. Sequentieanalyse van de met PCR gegenereerde fragmenten rond de gebieden van de deletieverbindingen bevestigde dat de verbindingen waren zoals verwacht werd. Recombinant vacciniavirus vP866, met de zes als boven beschreven geconstrueerde deleties, werd vaccinia vaccin-stam "NYVAC" genoemd.

Voorbeeld 16 - CONSTRUCTIE VAN NYVAC-MV RECOMBINANT MET

EXPRESSIE VAN MAZELEN FUSIE- EN HEMAGGLU-TININE-GLYCOPROTEINEN

cDNA-kopieën van de sequenties die coderen voor de HA- en F-eiwitten van mazelenvirus MV (Edmonston stam), werden geïnserteerd in NYVAC om zo een dubbele recombinant te vormen die NYVAC-MV (vP913) werd genoemd. De recombinant vertoonde authentieke expressie van beide mazelenglycopro- teïnen op het oppervlak van geïnfecteerde cellen. Met immunoprecipitatieanalyse werd aangetoond dat de F- en HA- glycoproteïnen beide op correcte wijze werden bewerkt. De « recombinant bleek ook vorming van syncytia te induceren.

Cellen en virussen

Het ontvangende virus dat gebruikt werd bij de productie van NYVAC-MV was de gemodificeerde Copenhagenstam van vacciniavirus met de aanduiding NYVAC. Het kweken en bepalen van de titers van alle virussen geschiedde op monolagen van Vero cellen.

Plamideconstructie

Met verwijzing nu naar figuur 15 en Taylor et al., (1991) bevat het plasmide pSPM2LHA het complete mazelen HA

gen, in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld aan de vacciniavirus H6 promotor die eerder beschreven is (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989). Een EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp met daarop de het meeste aan de 3'-kant gelegen 24 bp van de H6 promotor, in een precieze ATG:ATG configuratie gefuseerd met het HA-gen dat de het meeste aan de 3'-kant gelegen 26 bp mist, werd geïsoleerd uit pSPM2LHA. Dit fragment werd gebruikt om het EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPMHAll (Taylor et al., 1991) te vervangen om zo pRW803 te genereren. Plasmide pRW803 bevat de complete H6 promotor, op precieze wijze gekoppeld aan het complete mazelen HA-gen.

Plasmide pSD513VCVQ werd afgeleid van plasmide pSD460 door toevoeging van polylinkerseguenties. Plasmide pSD460 werd gemaakt om deletie van het thymidinekinase-gen uit vacciniavirus mogelijk te maken (figuur 9).

Om het mazelenvirus F-gen te inserteren in het HA-insertieplasmide werden manipulaties uitgevoerd op pSPHMF7. Plasmide pSPHMF7 (Taylor et al,, 1991) bevat het mazelen F-gen aan de 31-kant naast de eerder beschreven vacciniavirus H6 promotor. Om een perfecte ATG:ATG configuratie te verkrijgen en om interveniërende sequenties tussen het 3' -uiteinde van de promotor en het ATG van het mazelen F-gen te verwijderen werd oligonucleotide-gestuurde mutagenese uitgevoerd met behulp van oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO:41).

SPMAD: 5'-TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3· Het resulterende plasmide werd pSPMF75M20 genoemd.

Het plasmide pSPMF75M20 dat het mazelen F-gen bevat dat nu in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld is aan de H6 promotor, werd geknipt met Nrul en Eagl. Het resulterende fragment van 1,7 kbp met stompe uiteinden met daarop de het meest aan de 31-kant gelegen 27 bp van de H6 promotor en het complete fusiegen werd geïsoleerd en geïnserteerd in een intermediair plasmide pRW823 dat geknipt was met Nrul en Xbal en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide pRW841 bevat de H6 promotor gekoppeld aan het mazelen F-gen in de pIBI25 plasmidevector (IBI, New Haven, CT) . De H6/mazelen F- cassette werd uit pRW841 geknipt door digestie met Smal en het resulterende fragment van 1,8 kb werd geïnserteerd in pRW843 (dat het mazelen HA-gen bevat). Plasmide pRW843 werd eerst geknipt met Notl en van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2mM dNTPs. Het resulterende plasmide, pRW857, bevat daardoor de mazelenvirus F- en HA-genen gekoppeld in een staart-staartconfiguratie. Beide genen zijn gekoppeld aan de vacciniavirus H6 promotor.

Ontwikkeling van NYVAC-MV

Plasmide pRW857 werd getransfecteerd in met NYVAC (vP866) geïnfecteerde Vero cellen met behulp van de eerder beschreven calciumfosfaatprecipitatie werkwijze (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987). Positieve plaques werden geselecteerd op basis van in situ plaque-hybridisatie met specifieke radioactief gemerkte MV-, F- en HA-probes en onderworpen aan zes achtereenvolgende plaquezui-veringsronden totdat een zuivere populatie was verkregen. Eén representatieve plaque werd vervolgens geamplificeerd en de resulterende recombinant werd NYVAC-MV (vP913) genoemd.

Immunofluorescentie

Indirecte immunofluorescentie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Taylor et al., 1990). Gebruikte mono specifieke reagentia waren sera die gegenereerd waren door inoculatie van konijnen met kanariepokkenrecombinanten met expressie van ofwel het mazelen F-gen ofwel het mazelen HA-gen.

Immunoorecipitatie

Immunoprecipitatiereacties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Taylor et· al., 1990) met behulp van een cavia-anti-mazelen serum (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD).

Celfusie-experimenten

Monolagen van Vero cellen in schaaltjes van 60 mm werden geïnoculeerd met een multipliciteit van 1 pfu per cel met oudervirus of recombinante virussen. Na 1 uur absorptie bij 37°C werd het inoculum verwijderd, het bovenstaande medium vervangen en werden de schaaltjes overnacht geïncubeerd bij 37°C. 20 Uur na infectie werden de schaaltjes onderzocht.

Teneinde vast te stellen dat de expressieproducten van de mazelenvirus F- en HA-genen beide aanwezig waren op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen werd indirecte immunofluorescentieanalyse uitgevoerd met behulp van monospecifieke sera die gegenereerd waren in konijnen tegen kanariepokkenrecombinanten met expressie van ofwel het F-ofwel het HA-gen van mazelenvirus. De resultaten gaven aan dat de F- en HA-genproducten beide tot expressie werden gebracht op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen, zoals werd aangetoond met sterke oppervlakfluorescentie met beide monospecifieke sera. Er was geen duidelijke achter-grondkleuring met beide sera op cellen die geïnoculeerd waren met de NYVAC ouderstam, noch was er kruisreactieve kleuring als monospecifieke sera werden getest tegen enkelvoudige vacciniarecombinanten met expressie van ofwel het HA- ofwel het F-gen.

Teneinde aan te tonen dat de door NYVAC-MV tot expressie gebrachte eiwitten immunoreactief waren met mazelenvirus-specifieke sera en op authentieke wijze bewerkt werden in de geïnfecteerde cel, werd immunoprecipi-tatieanalyse uitgevoerd. Monolagen van Vero cellen werden geïnoculeerd met een multipliciteit van 10 pfu/cel oudervi-rus of recombinantvirus in aanwezigheid van 35S-methionine. Immunoprecipitatieanalyse toonde een HA-glycoproteïne aan van ongeveer 76 kDa en de gesplitste fusieproducten Fx en F2 met molecuulgewichten van respectievelijk 44 kDa en 23 kDa. Er werden geen mazelen-specifieke producten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen of in Vero cellen die geïnfecteerd waren met het NYVAC oudervirus.

Een kenmerk van de cytopathologie van MV is de vorming van syncytia die ontstaan door fusie van geïnfecteerde cellen met omringende geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen, gevolgd door migratie van de nucleï naar het centrum van het syncytium (Norrby et al., 1982). Gebleken is dat dit een belangrijke methode voor verspreiding van het virus is, die voor paramyxovirussen kan optreden in aanwezigheid van HA-specifiek virusneutraliserend antili- chaam {Merz et al., 1980). Teneinde vast. te stellen dat de in de vacciniavirus tot expressie gebrachte MV-eiwitten functioneel actief waren, werden monolagen van Vero cellen geinoculeerd met NYVAC en NYVAC-MV en onderzocht op cytopa-tische effecten. In met NYVAC-MV geïnfecteerde Vero cellen werd ongeveer 18 uur na infectie een duidelijke sterke celfusie-activiteit waargenomen. Er was geen duidelijke celfusie-activiteit in cellen die geïnfecteerd waren met NYVAC oudervirus.

Resultaten van serologische analyse van sera van met NYVAC-MV (vP913) cteïnoculeerde konijnen

In deze studie werden twee konijnen geinoculeerd met 1 x 108 pfu NYVAC-MV (vP913) langs subcutane weg. Na 28 dagen kregen de dieren een booster met een equivalente dosis. Seriële bloedmonsters werden geanalyseerd op MV-neutraliserende activiteit met behulp van de plaque-reduc-tiemethode. De resultaten worden getoond in Tabel 13. De resultaten tonen aan dat geen van de konijnen een respons vertoonde op de aanvankelijke inoculatie met NYVAC-MV. De abrupt stijgende respons na de tweede inoculatie echter geeft aan dat de dieren gestimuleerd waren. Beide dieren bereikten neutraliserende antilichaamtiters in het beschermende bereik.

De in voorbeeld 14 getoonde in vivo analyse van de immunogeniteit van ALVAC-MV (vCP82) geeft aan dat de recombinant bij inoculatie van een reeks species in staat is een serologische respons te induceren die meetbaar is met serologische standaardtests. De bereikte titers zijn in het bereik dat vereist is voor bescherming tegen ziekte. Inoculatie van NYVAC-MV (vP913) in konijnen induceert op soortgelijke wijze een gehalte aan mazelenvirus neutraliserend antilichaam dat bescherming zou bieden.

TABEL 13

Anti-mazelen neutraliserend antilichaamtiters (log10) in sera van konijnen geïnoculeerd met NYVAC-MV (vP913)_

Dier Titer weken na inoculatie WO W2 W4C W5 W6 W7

Konijn A116 <1 <1 <1 2,8b 2,2 2,2 _A117 <1_<1_<1_l_j_9_lj_9_1,9 a) Konijnen kregen 8,0 log10 ptu NYVAC-MV (vP913) s.c.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die een vermindering van 50 % van het aantal plaques geeft vergeleken met pre-inoculatie serum.

c) Dieren werden opnieuw geïnoculeerd na 28 dagen.

LITERATUUR

1. Adams, J.M., en D.T. Imagawa, Proc. Soc. Ex-per. Biol. Med. 96, 240-244 (1957).

2. Albrecht, P., K. Herrman, en G.R. Burns, J. Virol. Methode 3, 251-260 (1981).

3. Alkhatib, G., en D. Briedis, Virology 150, 479-490 (1986).

4. Alkhatib, G., C. Richardson, en S-H. Shen, virology 175, 262-270 (1990).

5. Appel, M.J.G., enO.R. Jones, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126, 571-574 (1967).

6. Appel, M.J.G., en D.S. Robson, Am. J. Vet. Res. 34, 1459-1463 (1973).

7. Avery, R.J., en J. Niven, Infect. Immun. 26, 795-801 (1979).

8. Baker, J.A., B.E. Sheffy, D.S. Robson, J. Gilmartin, Cornell Vet (USA) 56, 588-594 (1966).

9. Bertholet, C., R. Drillien, en R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985).

10. Bestetti, G., R. Fatzer, en R. Frankhauser, Acta Neuropathol. 43, 69-75 (1978).

11. Black, F.L., L.L. Berman, M. Libel, C.A. Rei-chelt, F. de P. Pinheiro, A.T. da Rosa, F. Figuera, en E.S. Gonzales, Buil, W.H.O. 62, 315-319 (1984).

12. Bush, M., R.J. Montali, D. Brownstein, A.E. James, Jr., -en M.J.G. Appel, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 959-960 (1976).

13. Carpenter, J.W., M.J.G. Appel, R.C. Erickson, en M.N. Novilla, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 961-964 (1976).

14. Choppin, P.W., C.D. Richardson, D.C. Merz, W.W. Hall, en A. Scheid, J. Infect. Dis. 143, 352-363 (1981).

15. Clewell, D.B., J. Bacteriol, 110, 667-676 (1972) .

16. Clewell, D.B., en D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).

17. Colinas, R.J., R.C. Condit, en E. Paoletti, Virus Research 18, 49-70 (1990) .

18. DeLay, P.D., S.S. Stone, D.T. Karzon, S. Katz, en J. Enders, Am. J. Vet. Res. 26, 1359-1373 (1965) .

19. Diallo, A., Vet. Micro. 23, 155-163 (1990).

20. Bowling, P.C., B.M. Blumberg, J. Menonna, J.E.

Adamus, P. Cook, J.C. Crowley, D. Kolakofsky, en S.D. Cook, J. Gen. Virol, 67, 1987-1992 (1986) .

21. Drillien, R., D. Spehner, A. Kirn, P. Girau-don, R. Buckland, F. Wild, en J.P. Lecocq, Proc. Natl. Acad. sci. USA 85, 1252-1256 (1988).

22. Engelke, D.R., P.A. Hoener, en F.S. Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).

23. Fenner, F., P.A. Bachmann, E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy, M.J. Studdert, en D.O. White, In Vete-rinary Virology, ed. F. Fenner, (Academie Press, Ine., New York) pp. 485-503 (1987).

24. Gillespie, J.H., en D.T. Karzon, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 105, 547-551 (1960).

25. Giraudon, P., Ch. Gerald, en T.F. Wild, In-tervirology 21, 110-120 (1984) .

26. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, en E. Paoletti, Virology 179, 247-266 (1990a).

27. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, en E. Paoletti, Virology 179, 517-563 (1990b).

28. Graves, M.C., S.M. Silver, en P.W. Choppin, Virology 86, 254-263 (1978) .

29. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, en E. Paoletti, J. Virol. 63/ 4189-4198 (1989).

30. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, J. Taylor, E. Norton, G. Allen, B. Languet, P.

Desmettre, en E. Paoletti, J. Virol. 64, 2399-2406 (1990).

31. Hall, W.W., R.A. Lamb, en P.W. Choppin, Viro-logy 100, 433-449 (1980).

32. Hartley, W.J., Vet. Path. 11, 301-312 (1974).

33. Imagawa, D.T., P. Goret, en J.M. Adams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46, 1119-1123 (1960).

34. Karzon, D.T., Pediatrics 16, 809-818 (1955).

35. Karzon, D.T., Annals of the N.Y. Academy of Sci. 101, 527-539 (1962).

36. Kazacos, K.R., H.L. Thacker, H.L. Shivaprasad, en P.P. Burger, J. Am. Vet. Med. Assoc. 179, 1166-1169 (1981).

37. Kingsbury, D.W., M.A. Bratt, P.W. Choppin, R.P. Hanson, T. Hosaka, V. ter Meulen, E. Norrby, W. Plowright, R. Rott, en W.H. Wunner, Intervirology 10, 137-152 (1978).

38. Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985).

39. Lennon, J.L., en F.L. Black, J, Ped. 108, 671-676 (19.86) .

40. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1982).

41. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1986).

42. Maniatis, T., E.F. Fritsch, en J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora-tory, NY 545 pagina's (1982).

43. Maniatis, T., E.F. Fritsch, en J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora-tory, NY 545 pagina's (1986).

44. Merz, D.C., A. Schied, en P. Choppin, J. Exp. Med. 151, 275-288 (1980).

45. Moura, R.A., en J. Warren, J. Bact. 82, 702-705 (1961).

46. Norrby, E., en Y. Gollmar, Infect. Immun. 11, 231-239 (1975)'.

47. Norrby, E., G. Enders-Ruckle, en V. ter Meulen, J. Infect. Dis. 132, 262-269 (1975).

48. Norrby, E., S.N. Chen, T. Togashi, H. Shesbe-radaran, en K.P. Johnson, Archives of Virology 71, 1-11 (1982) .

49. Norrby, E., en M.N. Oxman, In Fields Virology 2nd Ed., B.N. Fields en D.M. Knipe, eds. (Raven Press, NY) pp. 1013-1044 (1990).

50. Novick, S.L. en D. Hoekstra, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7433-7437 (1988).

51. Orvell, C., en E. Norrby, J. Gen. Virol. 50, 231-245 (1980).

52. Panicali, D., en E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

53. Peterson, R.G., en R.A. Lamb, Cell 48, 441-452 (1987) .

54. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, en E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).

55. Perkus, M.E., K. Limbach, en E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

56. Perkus, M.E., S.J. Goebel, S.W. Davis, G.P. Johnson, K. Limbach, E.K. Norton, en E. Paoletti, Virology 179, 276-286 (1990).

57. Phillips, T.R., J.L. Jensen, M.J. Rubino, W.C. Yang, en R.D. Schultz, Can. J. Vet. Res. 53, 154-160 (1989) .

58. Piccini, A., M.E. Perkus, en E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., en Grossman, L., (Academie Press) pp. 545-563 (1987).

59. Preblud, S.R., en S.L. Katz, In Vaccines, eds.

S.A. Plotkin en E.A. Mortimer, (W.B. Saunders Co.) pp. 182-222 (1988).

60. Richardson, C.D., A. Berkovich, S. Rozenblatt, en W. Bellini, J. Virol. 54, 186-193 (1985) .

61. Richardson, C., D. Huil, P. Greer, K. Hasel, A. Berkovich, G. Englund, W. Bellini, B. Rima, en R. Lazzarini, Virology 155, 508-523 (1986) .

62. Roberts, J.A., J. Immunol. 94, 622-628 (1965).

63. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, en B. Moss, J. Virol. 60, 436-449 (1986).

64. Sanger, F., S. Nicklen, en A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

65. Shapira, S.K., J. Chou, F.V. Richaud, en M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).

66. Spehner, D., R. Drillien, en J.P. Lecocq, J.

Virol. 64, 527-533 (1990).

67. Stephenson, J.R. en V. ter Meulen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 6601-6605 (1979).

68. Tabor, S., en C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).

69. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R.G.

Webster, en E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988a).

70. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, P. Des-mettre en E. Paoletti, Vaccine 6; 497-503 (1988b).

71. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F.

Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre, en E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

72. Taylor, J., S. Pincus, J. Tartaglia, C. Ri chardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton, en E. Paoletti, J. Virol. 65, 4263-4272 (1991) .

i 73. Tizard, I., J. Am. Vet. Med. Assoc. 196, 1851- 1858 (1990) .

74. Vialard, J., M. Lalumiere, T. Vernet, D. Briedis, G. Alkhatib, D. Henning, D. Levin, en C. Richardson, J. Virol. 64, 37-50 (1990).

) 75. Warren, J., M.K. Nadel, E. Slater, en S.J.

Millian, Amer. J. Vet. Res. 21, 111-119 (1960).

76. Wild, T.F., E. Malvoisin, en R. Buckland, J. Gen. Virol. 72, 439-442 (1991).

i 77. Wild, F., P. Giraudon, D. Spehner, R. Dril lien, en J-P. Lecocq, Vaccine 8, 441-442 (1990) .

78. Yuen, L., en B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).

Claims

1. Recombinant pokkenvirus met daarin DNA van Morbillivirus in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom.

2. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het Morbillivirus mazelenvirus is.

3. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat. het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus hemagglutinine-glycoproteïne.

4. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus fusieglycoproteine.

5. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor twee mazelenvirus glycoproteïnen.

6. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de mazelenvirus glycoproteïnen hemagglutinine-glycoproteïne en fusieglycoproteine zijn.

7. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het genoemde DNA tot expressie wordt gebracht in een gastheer door de productie van een mazelenvirus glycoproteïne.

8. Recombinant pokkenvirus .volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het mazelenvirus glycoproteine maze-lenvirus hemagglutinine-glycoproteine is.

9. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het mazelenvirus glycoproteine mazelenvirus fusieglycoproteine is.

10. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het genoemde DNA tot expressie wordt gebracht in een gastheer door de productie van twee mazelenvirus glycoproteinen.

11. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de mazelenvirus glycoproteinen mazelenvirus hemagglutinine-glycoproteïne en mazelenvirus fusieglycoproteine zijn.

12. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het pokkenvirus een vacciniavirus is.

13. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het pokkenvirus een vogelpokkenvirus is.

14. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het vogelpokkenvirus kanariepokkenvi-rus is.

15. Recombinant -pokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het genoemde DNA in dat pokkenvirus wordt ingebracht door recombinatie.

16. Recombinant pokkenvirus met daarin DNA van Morbillivirus en een promotor voor de expressie van dat DNA.

17. Vaccin voor het induceren van een immunologische respons in een gastheerdier dat geïnoculeerd is met dat vaccin, waarbij het vaccin een drager omvat en een recombinant pokkenvirus dat, in een niet-essentieel gebied daarvan, DNA van Morbillivirus bevat.

18. Vaccin volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het Morbillivirus mazelenvirus is.

19. Vaccin volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus hemaggluti-nine-glycoproteïne en dit tot expressie brengt.

20. Vaccin volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus fusieglycop-roteïne en dit tot expressie brengt.

21. Vaccin volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor twee mazelenvirus glycop-roteïnen en deze tot expressie brengt.

22. Vaccin volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat de mazelenvirus glycoproteïnen hemagglutinine-glycopro-teïne en fusieglycoproteïne zijn.

23. Vaccin volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het pokkenvirus een vacciniavirus is.

24. Vaccin volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het pokkenvirus een vogelpokkenvirus is.

25. Vaccin volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat het vogelpokkenvirus kanariepokkenvirus is.

26. Vaccin volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het genoemde DNA in het pokkenvirus wordt ingebracht door recombinatie.

27. Werkwijze voor het beschermen van een hond tegen hondeziekte, met het kenmerk, dat men de hond inoculeert met een recombinant pokkenvirus met daarin DNA van Morbillivirus in een niet-essentieel gebied van het pokken-virusgenoom.

. 28. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk, dat het Morbillivirus mazelenvirus is.

29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus hemagglutinine-glycoproteine.

30. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het genoemde DNA codeert voor mazelenvirus fusieglycoproteïne.