PT90967B - Processo para a preparacao de um vector de recombinacao que produz um virus de variola de aves domesticas recombinante, mediante recombinacao de dna homologo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO DA PATENTE DE INVENÇÃO N ° w· 90 967

REQUERENTE:	NATIONAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION, britânica, com sede em 101 Newington Cause way Lindon SEI 6BU, Inglaterra.
EPÍGRAFE:	” PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM VECTOR DE RECOMBINAÇÃO QUE PRODUZ UM VÍRUS DE VARÍOLA DE AVES DOMÉSTICAS RECOMBINANTE, MEDIANTE RECOMBINAÇÃO DE DNA HOMÓLOGO

INVENTORES: Matthew Mckinley Binns, Michael Edward

Griffith Boursnell, Joan Iyabo Amiemenoghena Campbell e Fiona Margaret Tomley,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. Inglaterra em 24 de Junho de 1988,27 de Fevereiro de 1989, 31 de Março de 1989 e 8 de Maio de Maio de 1989, respectivamente sob os n?s. 8815098, 8904411.9 , 8907374.6 e 8910520.9.

INP1 MOO 113 RF 1Q732

Ρ.Ι.Ν3. 90 967 | MEMÓRIA DESCRITIVA DO INVENTO

I para «PROCESSO RARA A PREPARAÇÃO DE UE VECTOR DE RECCNBTÍÍAÇÃO QUE produz ul: vírus de varíola de aves domésticas reccnbinante, MEDIANTE RECOKBINAÇÃO DE DNA HOMOLOGO que apresenta

I NATIONAL RESEARCE DEVELOPMENT CORPORATION, britânica, comer1 ciai e industrial, com sede em 101 Newington Dauseway London I SEI 6BU, Inglaterra

R e s u m o

A invenção refere-se ao processo para a preparação de DNA de vírus de varíola de aves domésticas (FPV) proporcionando uma região não essencial para a inserção de genes estranhos na citada região e a construção de um vector para a recombinação homóloga com um tipo de FPV selvagem, pelo que o FPV recombinante resultante pode ser utilizado na vacinação de animais, em especial de pintos. De acordo com a invenção, a região não -essencial consiste essencialmente em uma extensão de DNA proveniente da sequência única comprida da repetição invertida terminal (TIR) do FPV, ou da região de FPV que corresponde aproximadamente ao fragmento Eind III D dos genes D8 e D9 do virus da vacina.

ENQUADR/E. ENTO GERAL DA INVENÇÃO

1. Campo técnico sta invenção insere-se no campo da tecnologia de r^combinação de ADN e refere-se ao virus da varíola como vector para .ADU estranho.

2. Descrição do stado da Técnica Anterior

Vários virus com genomas de ADN têm sido usados para veicular e fazer a expressão de genes de outros virus ou de outras espécies. Os virus usados con: tal objectivo são conhecidos como vectores” e genes; todos os outros genes diferentes dos próprios e expressos dessa forma são referidos como genes estranhos. Um dos principais requisitos para um virus ser usado como uc vector desta forma é a existência de um sítio adequado para a inserção de um gene estranho. Se a inserção de um gene num sítio do virus oausa a ruptura de alguma função essencial para o crescimento, então tal sítio não poderá ser usado. Os sítios adequados são aqueles nos quais a inserção não causa qualquer ruptura de funções ou aqueles cujas funções não são essenciais para o crescimento do virus e consequentemente podem ser rompidos sem problemas. Tais sítios são conhecidos como regiões não essenciais. A expressão não essencial neste contexto significa não essencial para o cres cimento sob pelo menos algumas condições, sob as quais o virus pode crescer in vitro e sob menos algumas condições em que ele sobrevive in vivo.

Exemplos de virus que foram usados como vectores em virtude do facto de que contém regiões não essenciais são os virus da vaíola vulgar, os adenovirus e os virus da herpes, apesar de as regiões usadas poderem ser diferentes em cada caso. 0 virus Vaccinia (VV), que tem eido usado como um vector, é um virus da varíola vulgar, um membro dos virus da varíola.

virus da varíola das aves (FPV), o objecto do presente pedido de patente, é também um virus da varíola, mas é um membro de um género diferente, os virus da varíola das aves domésticas. C VV pode desenvolver-se em culturas de tecidos, e podem ser introduzidos genes estranhos no genoma virai durante o processo. Várias regiões do W verificou-se serem não essenciais in vitro em mais do que um sistema de cultura de tecidos. F.stas incluem vastas regiões da extremidade da esquerda, B. L’oss et al., J» Virology 40» 387-395, (1981) que descreve um nutante de VV apresentando uma anulação de 6,4 megaDaltona na extremidade da esquerda; D. Panicali et al., -J. Virology ZL 100C—1010, 1981, que descreve um mutante de VV apresentando uma anulação inicial de 6,65 megaPaltons na extremidade da esquerda; o gene da timidina^quinase (TK), D. Panicali e Paoeletti Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 4927-4931 (1982); J'.

1'acket et al., J. Gen. Virol 45. 683-701» (1982); e o gene do factor de crescimento de Vaccinia (VGP) R.V.L. Buller et al., J. Virology 62» 866-874 (1988). Sítios como estes podem também ser regiões não essenciais para o crescimento in vivo.

Xo entanto, tando no caso do gene TF como no caso do gene VGF, verificou-se que, apesar de o crescimento em culturas de tecidos não ser afectado ou apenas fracamente afectada por inserção no gene, o crescimento e a virulência são francamente afectadas in vivo. R.w.L Buller et al., ííature 317» 813-815 (1985) e loc. olt. (1988), mostrando que estes genes não são complctamente não essenciais para o crescimento do virus in vivo. Esta atenuação in vivo pode no entanto ser útil se reduzir oa efeitos patogénicos não desejados do virus e por consequência, o crescimento in vivo com a simultânea atenuação é uma condição válida de crescimento para o propósito da invenção.

Alguns sítios são essenciais em determinados sistemas de culturas de tecidos o são não essenciais noutros. Por exemplo,

existe um. gene no VV que é essencial para a replicação em células humanas mas que é não essencial em células fibroblásticas de embriões de galinha, S. C-illard et al., S. Cillard et al., Proc. iíatl. Acad. Sei. USA 53, 5573—5577, (1986). Outro (gene no virus da varíola em gado bovino relacionado com o virus verdadeiro é essencial para o desenvolvimento em células do ovário de cricetos chineses mas não para o desenvolvimento em células fibroblásticas de embriões da galinha ?. Spehner e t al., J. Virology 62, 1297-1304 (1988). Pstes exemplos mostram que diferenças nos sistemas de culturas de tecidos podem afectar regiões não essenciais.

genoma de W está longe de ser con.pletamente conhecido e relatívamente poucas publicações foram feitas acerca do genoma de ??V. Sabe-se que o FPV possui um gene TK o qual tem cerca de 3C ·;' de hjmologia com o gene TK de VV ao nível do aminoácido, B.D. Boyle et al., Virology 156, 355-365 (1987). Tal como o gene ~K de W, ele serve como uma região não essencial para recombinação homóloga sob pelo menos algumas condições: veja-se Pedido de Depósito de -atente de Invenção PC7 '70 88/ /02022 (CSIRO). Usando o gene de xantina-guanina fosforibosil transferase de D. coli (Dcogpt) como um marcador seleccionável dominante, em conjugação com o promotor ”7,5 de VV, o gene da hemaglutinina da gripe/influenza (HA) foi inserido numa região TE do FPV cultivado em células da pele de embriões de galinha. A expressão do gene A foi emonstrado pela ligação de anticorpos HA e proteína c-tiquetada A a placas de PFV recombinante.

C gene de FPV é conhecido como tendo outras semelhanças com VV em. algumas regiões. Por exemplo, os genes de ADM polimerase são estreitamente relacionados, apresentando 42 / de homologia ao nível de aminoácidos, 1*. V. Pinas et al., Hucleic Acids Research 15 6553-6573 (1987). Por outro lado, ?. K. Tomley, numa conferência realizada no 6th Vorkshop on Poxvi-

rus/Iridovirus, Cold Spring iiarbor, Nova Iorque, 24-28 de Setembro de 193o, descreveu uma tentativa de correlação de um fragmento de 11,2 kb de ADN de FW, localizado perto de um extremo do genoma, com o ADM de VV. ' nquanto indicou 25 Τ’ de homologia do aminoácido entre um gene cue prevê um polipéptido de 4 kd em ?FY e um gene em VY codificando um polipépti do de 42 kd, nenhum outro emparelhanento significativo foi encontrado.

liais detalhes deste trabalho são dados em Tomley et al., J. Gen. Virol. 69, 1025-1040 (1988).

?. Tomley et al., em continuação dos trabalhos de Vackett e L.C. Archard, J. General Virology 45» 683-701, (1979), referem também na pág. 1038 que as porções terminais dos geno mas dos virus verdadeiros de varíola são menos bem conserva das do que a região central e afirmam também que se pensa que as regiões terminais, com cerca de 3 a 35 kb de comprimento, são as que codificam genes que determinam as características específicas dos virus tais como a gama dos hospedeiros, a virulência, o tropismo para 03 tecidos e a citopatoglniciaade e portanto são os que têm menor probabilidade de seres conservados.

A região terminal de VV é conhecida como tento possível interesse em relação a regiões não essenciais. Assim , 7. V. Pt-rkus et al., Virology 152, 285-297 (1986), descobriram que anulações no genoma de VV ocorrem em presença da brocoxideuridina, uca d .s quais se prolonga desde cerca dos nucleótidos 2700 a 241CO a partir do extremo do lado esquerdo e que o virus mutante cue contém a anulação é viável em culturas de tecidos (o tipo de células não está claramente definido).

Algumas informações foram dadas acerca da região realmente terminal do ?FV, nun cartaz apresentado por J.I.A. Cacpbell

- dura..te o International oxvirus -orkshop, Col Sgririg ^:arbor, '..ova Iorque, de 9 a 13 de Setembro de 1987. (0 cartaz dá mais informações do que o resumo pulbicado em ?^Todern Apçroaches to ^l;e# Vaccines including Prevention of AIDS G-iS 1937, pág. 45).

Tal co~o o VV e o vírus da varíola bovina, o 7^7 tem sequência terminais as quais são repetições invertidas uma da outra e são covalentemente reticulada em conjunto. Uma parte da sequência da repetição invertida terminal (7IR) foi digerida com BamI e clonada. 0 fragmento de BàmHI foi descrito como apresentando um comprimento de 5,3 kb. 0 cartaz descreve o esquema geral das sequências, que da esquerda até à direita, compreende uma região única curta, um conjunto de sequências repetidas em cadeia e decole uma região única comr.rida compreendendo três estruturas de leitura abertas possíveis. 0 sumário nota que os fragmentos terminaie de F7V partilham a configuração geral da sequência de nucleítidos com os fragmentos terminais de 77 e de virua da varíola bovina, mas também refere algumas diferenças marcadas. Λ sequência de parte da TIR de V7 e no.meadamente a partir dos nucleótidos 63C0 a 9-7C0 a partir da extremidade da esquerda, 4 referida por C. Venkatesan et al., J. Virology 44 637-645 (1982).

São de se esperar grandes diferenças entre a sequência de AD'í ou W e do FPV, visto que se calcula que o ger.oca do 777 é pelo menos, um terço mais comprido do que o do 77. Parece provável, a partir dos conhecimentos actuais acima citados, que muitas das diferenças entre os genomas de F77 e de 77 se encontrem mais próximo da extremidade do que do centro do genoma. Assim, as informações acerca da região terminal de 77 é de interesse limitado em relação ao 7?V.

Constituiu um problema localizar uma região não essencial bem definida, diferente da do gene TK, no virus da varíola de aves

I domésticas, Vuito recentemente (20 de Abril de 191-9), no pedido de depósito da -atente de Invenção ?C7 lublicação 1'-... 3089/03429 (nealth. ^esearch Inc.), foram descritos recombinantes de y?V mas a3 regiões nao essenciais aí mencionadas não ostão todas elas bem definidas. Os r?combinantes foram igorados meramente por clivagem do gene de P3V cm fragmentos e experimentados os fragmentos cora construtos de ensaio para verificar se o gene estranho sob ensaio foi expresso.

C fragmento de VV com ilinlll—3 é uma das regiões melhor cara£ terizadas do virus. A sequência deste fragEento de 16060 bps foi determinada, Niles et al·, Virology 153, 96-112 (1986), e foram identificados 13 genes 31-313).

Vários mutantes sensíveis à temperatura foram mapeados corro genes dentro de dialII-D e o mapeamento fino atribuiu estes a 32, D3, 35, 36, 37. 311 e 313, Seio et al., Virology 150, 110-119 (1987). ~stes genes são portanto essenciais para a rcplicação do virus. Vão se sabe se os restantes genes dentro do fragmente de iindIII-3 são essenciais ou não essenciais para o crescimento do virus. Experiências recentes sugeriram (apesar de não o terem provado) que 38, o qual codifica uma proteína transmembrana, pode ser não essencial para a propagação do virus da vacina em culturas de tecido, Niles e Seto, Journal of Virology 62, 3772-3778 (1988). Nestas experiências, uma mutação de deslocação da estrutura foi introduzida na extremidade de carboxi do 33 a qual removeu os 5'5 aminoácidos da extremidade de carboxi de D8. Os virus que contêm esta mutação tinham velocidades de crescimento indistinguíveis das do virus do tipo natural.

Não é previsível, no entanto, se o gene 38 ocorrerá em virus de varíola de aves domésticas e, se isso acontecei; se será não essencial. Além disso, existia o oroblema de como localizar o gene 03 no genoma de FPV o qual é relativamente não ma-

peado e é muito maior do que □ do V7. Consequenteaente, o cxa ae do fragmento de '-ilndlII-D do virus da vacina não indicou como encontrar outrae regiões não essenciais dentro do 7~V.

Sumário da Invenção

A Requerente descobriu agora que as três estruturas de leitura abertas (CRF) completamente dentro do fragmento de BasRI acima mencionada da repetição invertida terminal (TIR) são regiões não essenciais que podem servir como sítios de eventualidades de rccombinação homóloga por intermédio dos quais um gene estranho pode ser introduzido no P~V (referência à Fig. 1). ^:'stas ORF são caracterizadas pelo facto de terem comprimentos com aproximadamente 670, 370 e 300 nucleótidos e caem duma sequência comprida única (LUS) do 7 IR dentro do fragmento de BanRI. 0 fragmento de Banf-II verificou-se que tinha um comprimento de cerca de 6,3 kb e que a sequência comprida única começa aproximadamente no nucleótido 4100, começando a numeração a partir da extremidade da esquerda. (Fara a numeração dos nucleótidos, chama-se a atenção para a nota do advertência que precede imediatamente a sequência de ADN, na presente memória posteriormente apresentada). Cs comprimentos das CRF podem também ser expressos em termos dos pesos moleculares aproximados dos polipéptldos, que se prevê codificarem nomeaàarente 23,0, 13,9 e 11,5 quilodaltons. ^;sta nomenclatura será usada poBteriormente na presente memória descritiva para finalidades de identificação. Οε genes 26,0 e 11,5 são codificados para a mesma cadeia e na mesma ordem quando se lo o fragmento da esquerda para a direita a partir da extremidade 5’ e em direcção ao sítio de BamHT, tendo o gene de 11,5 o seu extremo 3’ perto do sítio de Bam.’I (ver Fig.

3). 0 gene de 13,9 é codificado na cadeia complementar, lendo

da direita para a esquerda, mas dentro de uia região distinta desta e que fica entre a que codifica para oc genes 25,0 e 11,5 na primeira cadeia.

xtrapolaoões destas e de outras desco bertas conduzem a supo-ΐ siqões razoáveis de que o conjunto da sequência comprida única do ?IR é una região não essencial, incluindo a sequência oue fica iunto ao extremo da direita imediato do sítio de — V

Bam'.I, isto é, dentro do fragmento de 11,2 kb sequenciado por F. 1’. Tomley et al., loc. cit. (1985). A TTR tes um comprimento e cerca de 10 kb, isto é, 10 ->,3 = 3,7 kb ficam dentro do fragmento de 11,2 kb. Assim, a sequência comprida única prolonga-se para a direita a partir de cerca do nucleótido 4100 por cima dos restantes comprimentos da TIR, de cerca de 5 kb.

for consequência, de acordo com um aspecto importante, a presente invenção proporciona um vector de rccombinação para uso na produção de um vírus de varíola de aves do.esticas (prv) por recombinação de ADN homólogo, compreendendo o ref-rido vector de recombinação um vector de clonaçãò que contém uma sequência de uma região não-essencial (JT.TR) compreendendo pelo menos parte da sequência comprida única (LUS) da repetição invertida terminal (7IR) de FRV, sendo a referida ?FR interrompida por um gene ou genes estranhos e por ura sequência ou sequências para regulação da expressão de cada gene estranho presente.

De preferência, a NER está dentro duma parte da sequência comprida única (LUS) que fica dentro do fragmento de 5,3 kb de BanHl. Num aspecto mais particular, a NER consiste em pelo menos um comprimento homologamente recombiaável de uma estrutura de leitura aberta (ORF) que tem um comprimento de aproximadamente 670, 370 ou 300 nucleótidos e cai completamente dentro dessa parte da LUS dentro do fragmento de Bam-il da

7IR. :.0 entanto, a Requerente descobriu também que alguns isolados da mesma cadeia do F77 não têm uma sequência de comprimento superior a 20C bp do A.y: abarcando o sítio de ]'an'.~, o qual c um importante sinal da não ossencialidade da sequência que abarca aquele sito. 7 portanto inaprepriado usar a terminologia fragmento de ?arnHI numa definição formal aplicável ao 7FV na generalidade. Consequentemente, estas ORF são melhor definidas como ficando dentro das primeiras 2,2 kb da LCâ a partir da sua extremidade externa. As .'PP. dentro destes 2,2 kb são as preferidas. As preferências acima mencionadas □ara a localização das *P.R aplicam-s? também às sequências flanqueamento contidas no vector de recombinação e nesta invenção, isto Ó, toda a sequência homologamcnte r-?combinável que, flanqueia 0(3) gene(s) estranho(s) e a(s) sua(s) sequencia(s) regulatória(s)

A Requerente descobriu também outras regiões não-essenciais do virus da varíola de aves domésticas. Rnquanto as acima descritas estão dentro de uma parte da repetição invertida terminal, estas outras regiões encontram-se localizadas numa parte mais central da molécula de AIP do nomeademente dentro ou adjacente a um extremo do fragmento de 1,3 kb de uma biblioteca de RcoRI de FRV, cujos genes apresentam graus de homologia significativos com certos genes do HindIIT-D do vírus da vacina (TV).

ste segundo aspecto da presente invenção tem como a sua origem uma clonação aleatória de partes do genoma do P^V, o secucnclamento dos clones aleatórios e uma pesquisa em todas as seis estruturas de leitora de estruturas de leitura aberta as quais podem predi er genes. As sequências assim geradas foram comparadas com as sequências da proteína do virus da vacina (VV). Aconteceu então que foram notados graus de homologia em relação a algumas proteínas do W, ^1-2)13, incluindo aproximações com al, T>5, B9, D10 e 2)13 de VV. Foi consequente-

mente decidido e~> terzos provisórios a afopção da terminologia ”2’· para os genes de ??V que apresentavam algum grau de l ho.j-ologia com os genes do 77. Ue cloue .113 de ΡΓ7 que emparelha com 33 de 77 foi usado como una a.-.ostra para identificação de clones dentro de uma biblioteca de co?.~ do 3Γ7. Um tal clone, designado por pllB379, compreendendo um inserto de

5,3 kb, foi sequenciado. Este clone continha parte do gene 39 e tolos os genes 310, 311, 312 e 313. (Os último3 quatro genes apresentavam 40 a, 62 /, 53 / c 55 '/ de identidade d?s aminoácidos codificados para os seus homólogos de 77). Λ fia de clonar os genes 07 e 38, foi construída uma biblioteca de Bral de AD'J clonada no plasmídio pl5U13 Smal. As colónias foram ensaiadas com uma amostra de corte primário derivada a partir de um clone 013 designado por 0379-273 (que fica dentro do gene de 177 39) e ama colónia positiva, contendo um plascídio designado por ptíB389, foi osteriomcnte estudado. Observou-s que ο p.’B389 continha a extremidade de carboxi do gene D5, os genes inteiros 37, 39 e P1C e a extremidade de carboxi do gene 311. (Dll prolonga-se no sentido inverso ao 310; assim, a extremidade de carboxi é a mais próximo de 310. Λ extremidade de carboxi é aquela que é a extremidade 3* ds cadeia de codi f icação, corre spondendo à extremidade de carboxi do polipéptido previsto). 72o existiu nenhum homólogo identificável do gene D8 de VV, apesar de uie outro gene estar presente entre 37 c 39. Este foi denominado 38 por una questão de conveniência. Numa descoberta particularmente inesperada, a cópia de 39 presente tanto em pUB379 como em p:.'B389 possuia mutações por deslocações estruturais quando comparada ccm a sua contraparte de W, tornando portanto improvável que 39 esteja expresso em FPV.

A Requerente descobriu agora que os genes 38 e 39 do ??V . ão genes não essenciais os quais podem sor usados para inserção do A37 e.tranho. Como as regiões intergénicas podem também

ser consideradas como não essenciais, concluiu-se oue,

cípio, o conjunto da região a seguir à extremidade de carboxi do T?7 e até à extremidade de carboxi do gene D9 é urra região não essencial (:~R). (Os genes D7, 03, D9 e D1C todas elas se prolonga.·:. no mesmo sentido). 7o entanto, tal como na presente memória descritiva será posteriormente explicado, a ^v não se prolonga directa-ente até ao gene ~9 sas termina ur. pouco antes dele a fira de evitar a possível interferência com o gene 1)10, o qual se sobrepõe con 19 e com o promotor co gene MC. ' sta 7'R será a partir daqui denominada abreviadamente por

^por consequência, a presente invenção proporciona ainda um vector de recombinação, tal como acima se descreveu, no qual a TCR é uma região que se prdonga desde a extremidade de carboxi de D7 à região de ?TER próxima da extremidade de D9 (mas exceptuando o gene D10 e a região promotora D10).

De acordo com um segundo aspecto importante, a invenção proporciona um vector recorabinante, por exemplo, um plasr.ídio contendo uma sequência i'7R (TIR ou D8-D9) tal como se definiu anteriormente. Um tal vector é útil p ra a preparação do vector de recombinação acima definido,

M terceiro lugar, a invenção inclui uma molécula de AD?T a qual consiste substancial ou essencial; ente numa sequência de \TR tal como acima se definiu com ou sem águma sequência de j flanquearaento nomologamente recombinável, digamos (arbitrariamente) até acima de 1000 bp por extremidade tanto numa como em. ambas ae suas extremidades a fim de se distinguir tal molécula do ADA genómico de FPV.

'm quarto luga ', a invenção cobre um hospedeio, apropriado para o vector, abrigando um qualquer do3 vectores da invenção isto é, o vector de recombinação ou um qualquer vector intermediário que contém a nova sequência da N7R.

d quinto lugar, a invenção abarca um F?V recombinante produί zida por recombinação homóloga de um ?~'V parente cos o ADI' introduzido de um vector de recombinação acima definido.

’·:π sexto lugar, a invenção inclui células infectadas de animais, especialmente de galinhas, com o ??V recombinante acima identificada, um processo para a cultura in vltro das re-l feridas células e, desde que a lei de patentes o permite, um método de vacinação de um animal que responde à vacinação, especialmente galinhas, com a F7V recombinante.

Num aspecto mais específico, o vector de recombinação da presente invenção compreende por ordem;

(1) uma primeira sequência de flanqueamento, recombinável homologamente, (2) uma sequência dentro de uma primeira parte da região não-essencial, (3) ADN promotor, (4) um gene estranho transcrevível a jusante do promotor (pelo que, quando a polimerase de ARN do virus da varíola de aves domésticas se liga ao promotor, transcreverá o gene estranho para o mRNA), (5) uma sequência dentro de ura segunda parte da mesma região não-essencial em que as primeira e a segunda sequência estSo na mesma orientação relativa em que estão a primeira e segunda partes da região não-essencial dentro do genoma do virus, e (6) uma 3egunda sequência de flanqueamento recombinável homologamente.

Fig. 1 é uca ilustração esquemática de um processo de recombinação homóloga da invenção;

Fig. 2 é um mapa do fragmento terminal de BamHI do Λ2Κ de PP7 mostrando o sítio onde se inicia a sequência longa única da TIR;

Fig. 3 é ue mapa de ADN da TIR de 7-'V mostrando as três sequências das regiães não-cssenciais úteis na presente invenção e outras ORF, conjuntamente com o mapa da TIR de VV representando as diferentes ORF encontradas em V7;

Fig. 4 a 7 ilustram esquematicamente vários métodos gerais de construção de plasmídios de recombinação de acordo com a presente invenção; e

Fig. 8 ilustra esquematicamente a construção dos plasmídios de recombinação específicos da invenção compreendendo uma sequência de região não-essencial de PFV na qual é inserido um gene estranho.

Fig. 9 é UE: mapa dos genes Dô e F13 θ de um gene adjacente A2 representando 08 genes que sofreram clonação em plasmídios pl33379 e 389 e sítios de restrição importantes nestes plasmídios; e

Fig. 10 ilustra esquematicamente a construção de plasmídios de recombinação específicas da invenção contendo a sequência dentro doe genes Ώ8, D9 e D10 (D8, D9 de acordo com a invenção; D10 comparativo) nos quais o gene estranho é inserido.

Referindo primeiramente às JCR de repetição invertida terminal (TIR) N7R e à Fig. 2, o fragmento de BAnflI de PPV tem um comprimento de cerca de 6,3 kb. ste contém uma sequência loníga única de comprimento igual a 0,23 kb, seguida por uma região de comprimento aproximado igual a 3,97 kb a qual compreende sequências repetidas em séries e então uma sequência longa única de comprimento igual a 2,13 kb.

A localização aproximada dos genes que proporcionam ο ΑΊλ'ϊ da MR da *21R usado na invenção dentro do fragmento Banfil é representada no mapa da Fig. 3. As sotas mostram que o gene 13,9 está num cordão complementar. A partir deste mapa e da Informação da sequência verificar-se-à que estes genes não apresentam quase uma contrapartida conhecida em W. Crê-se que o sítio de BamRI, faz parte de outra região não-ecsencial pelas razães explicadas anteriormente. Foram encontradas um total de cinco ORP na sequência longa única da 7IR, as quais parecem codificar polipéptidos devido ao seu cordão de FPV distinto ocorrer como se segue:

Localização (Kucleótidos numerados a partir da ex-	Rúmero de	Número	Peso molecular do polipéptido
tremidade da		de amino-	Sítio
esquerda)	nucleótidoe	ácidos codificados		único
4125 - 4790	666	222	26,0 kd	3£1 II
5261 - 56290	369	123	13,9 kd	:tco i
5883 - 5185	303	101	11,5 kd	S£e I
C= ocorre ao	cordão complementar do r?	presentado na sequência

de nucleétidos abaixo.

Além das três C7? designadas por 26,0, 13,9 e 11,5 existem duas CRF caís pequenas no cordão complementar, Bois que, no entarto, nenhuma destas Oh? exibe uma linha de cordão de FPV requerida é improvável que codifiquem os genes.

Abaixo está representada a sequência de ADD do fragmento de

Barm:i, iniciando-se a partir do extremo esquerdo e lendo-se no sentido usual 5’ a 3*, conjuntamente com os polipéptidos codificados previsíveis. Deverá ter-se em conta, no entanto, que a ecquênciação da região repetida em séries apresentou dificuldades e que o número de nuieótidcs dentro desta região deve ser sujeito de alguma revisão. Isso não é uma questão de qualquer significância para a presente invenção, a qual não se refere à região em séries repetidas. Segue-se que a sequência louga única não começa necessariamente tido 4H3 na numeração absoluta e os números a cerca do nucle dos nucleótidos devem portanto ser considerados como um mero gula para o lei tor para permitir que ele identifique as ORF referidas e ser construídas de acordo com a descrição e reivindicações.

TABELA

ACCCTCATCTTACGATGAGTATTTATATAGTAAAAAAAATGTATAAACAGTACCTTCCAA

AACCCTAATATACACATTCTTTTACCCCTTAATTIGTTAAGGTGTAAAATACCCCCTATT

121 AAAATATATATTATTGTTTTAATAAAAAAAACCATACGGTTTTACATAAAATAATACTAT

181 ATCTAATTTCCTTCCGGAAAATATTTTATAAAGCTACCCAACGTTAGCGAAAAACTTTTT

241 1AICGAGAGCTCGAGTTATACAAAAAGTTTTTATCGAGATTTCGAAAAGCTTTTTTATCG

301 AGAGCTCGAGTTATACAAAAACTTTTTTATCGAGAGCTAGAGTTATAGAAAAAGTTTTTA

361 1CGAGATTTCGAAAAGCTTTTTTATCGAGCGCTCGAGTTATAGAAAAACTTTT.......

...... continuação de combinações dos blocos das sequênci repetidas..........

3721 .ATAGAAAAAGTTTT LATCGAGATTTCGAAAAGCTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAG

3781 AAAAAC TT T T T TA TCGAGAGCTCGAGTTATAGAAAAAGT TTTTATCGAGATTTCGAAAAG

3841 CTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGAAAAACTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGA

3901 AAAAGTTTTTATCGAGATTTCGAAAAGCTTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGAAAAA

3961 GTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGAAAAACTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGA

4021 AAAACTTTTTTATCGAGAGCTCGAGTTATAGAAAAACTTTTTTATCGAGATTTCGAAAAG

4(4101) Μ I V Ε K I

4081 CTT T T Π TTATCGAGAGCTCGAGAAGTTAAATCGAGACGCCGATATGATCGTAGAGAAAA

AAHLLYPLCLLRCFLCNSVR

4141 TAGCGGCGTGGTTATTGTATCCGCTATGCCTTCTACGATGTTTCCTCTGTAACTCGGTAA PATCKCVHCLLYPFEVCCEC

4201 GGCCCGCCACTTGCAAATGCGTCCACTGTCTCTTGTATCCCTTCGAAGTATGTTGCGAAT

MSETLDSLEHSCCYCCVLPL

4261 GCATGAGCGAGACGTTAGACTCTCTGGAACACAGTTGTTGTTACTGTTGCGTGCTTCCTC

LIIREFWRRVILPTLKATCD

4321 TATTGATTATCAGAGAGTTCTGGAGACGCGTGATATTACCTACTCTAAAAGCGACTTGCG

CIRLPCVLTRRFCKRTICPL

4381 ACTGTATTAGGCTACCGTGCGTTCTCACCAGAAGATTCTGTAAAAGAACCATCTGCCCGT

AKSWCRCFCCPCEVFLRCLL

4441 TAGCTAAATCTTGGTGTCGTTGTTTCTGTTGCCCTTGCGAGGTTTTCTTGAGGTGTCTCC

FPCMMLRRMHRGRLTGVREP

4501 TCTTTCCTTGCATGATGTT GAGAAGAATGCATAGAGGCAGACTGACCGGAGTAAGAGAAC f ' / ¹⁸ gafrdsrdparrgtwvndwc

4561 CGGGAGCGTTTAGAGATTCAAGAGATCCCGCCAGACGGGGAACCTGGGTCAACGACTGGT

Bgl II

EDLCVWIWSPCCYVKRCIRT

4621 GCGAAGATCTCTGCGTATGGATATGGTCTCCGTGTTGTTACGTCAAGAGATGTATTCGCA mcdtftkkifywfiapagsp

4681 CGATGTGCGACACCTTCACTAAAAAAATTTTCTACTGGTTCATCGCCCCCGCAGGATCGC

RMPEEPSPLSRKVFSS*

4741 CGAGAATGCCCGAGGAACCTTCTCCGCTATCGAGAAAGGTCTTTTCGTCGJGAAGCATCG

4801 CGACGTGTAGATGAAAGAGATTGGACGCCAAAAGGTATACGCTCGTATTATTACGAATCG

4861 CGC1CGTCGTCGTGCCTCGAAGATGATAAAGAGAACGCGAGTAAGGAAATACAAGATAAA

4921 AACAAACTGTCGATTCTACGTAATACGATTTCTAAAACGGCGTCTACCGCAATCTTTTTC

4981 ATCAGAGTAAGGGATAGGTTAAGATTCTTAAGGACCTTIATCAAAACTATCGGAGAAAAA

5041 CTTTACGCTAAAGCCGCTCTCATGCTCTTTCACAGACTGGTGACCTATAGGCTTCCTATC

5101 GTTAGGGATATAGTCCCGTTTTATTACGCGAGGAAAAATTTTTGGAGGTTCGCTTTTCTA

5161 TATCTCATGAAGAAAGTCGCTGTTCGTCCTACTAAAAACTAATGCTAAAAAAAAATCTAT

522I CG ΠAAΓΛΛΑΤIAAAAGIΪΛTCGGGT1TTGAATATIAT IAATC1ATGCATACGAAACCGT * D I C V F G Y

5281 ACGTCGCGTTACACGGGGAGAATCCGAACGTTTTCCCGTCCGTATAGGCACACTTACCCA

TANCPSFGFTKGDTYACKGV

5341 CTTCTGGTTTCTTGTCATCCCTTATCCACAAACTCTGCCCCATACCGAATTTGCTTATGA

EPKKDDRIWLSQGMGFKSIF

Nco I

5401 ATTTCATGTCTTTTTCATTGTCTATTAGACTACGTCTAGCTAACGTACCCATGGGAAACG

KMDKENDILSRRALTGMPFT

5461 TTATCAAACACGTAGTCGACGCTTCGCTGTAAGTTTTTTTGTGATGCATTTTATCTAATC I LCTTSAESYTKKHHMKDLR

5521 GGTTTACCCAGATACACTTATTGTTGTAAGAGGTGTACGGTCCTCTGCAATTTAGAGAGT

NVHICKNNYSTYPGRCNLSN

5581 TAGCGCAATCCAACATTAACAACATCGCTATCAAGATTAATGATTTCATTTTGATACACG ACDLMLLMAILILSKM

5641 GATCAATTTTAATAGTCTATAGAGATATACCCCACCAATAGTTACGCGATTAATTTTCAA

TTATACATAATAAAAATCTAGAGGAGTTGCCATGTGATTCTCTGTCGACGACGTTACCTC

GTTAGTTTTATTAATTCTTCTTTAAGTTCTGACGACGGTTATATACCAAAACAGCTTTTA

CTTTTCGTAAGACGATAATTACGTTATAAAAGATTAAGAAATTTTATTTTTACTAAAGTA

MNNDTIFTLFYCKNKKYVRG

TCATGAATAATGACACGATATTTACTTTGTTTTATTGTAAAAATAAAAAATATGTTCGTG

EGGRRRGKTGILLFHPINHR GGGAGGGGGGAAGGAGGAGAGGGAAGACGGGTATCCTTTTATTCCATCCAATAAACCACC

Spe I

VIGTSAHQCYKTRRIG FKLY

GTGTTATAGGAACTAGTGCACATCAGTGTTATAAAACACGAAGAATCGGTTTCAAACTCT

AVAPRHVSTI RCGRSHSAHR

ACGCAGTTGCCCCTCGTCACGTATCCACTATCCGCTGTGGGAGATCCCACTCGGCTCACC

VDKFSFSFQKVDFHCIAGSG

GAGTAGATAAGTTCTCCTTCTCCTTCCAAAAAGTAGATTTTCACTGTATCGCCGGCAGCG

A *

GCGCATAGGTATCTGGCCCTACAGAATTCCATATTCCTGATAGCTCGCGCGACGAAGCCT

CCGICGCCCGTGIGATCATTTTCATAATTCAAGGGGATCC (6280)

Apreciar-se—à que a sequência acima representada não seja definitiva do FPV genericamente, pois existirão inevitavelimente pequenas variações entre os diferentes tipos ou estirpes de FPV, alguns dos quais devem to ar a forma de anulações ou inserções, e qualquer variante de NER compatível com a recombinação homóloga desejada é utilizável nesse caso. Bartijcularmente, AD.'Í tendo uma sequência de NER baseada em ORF que possui uma sequência apresentando pelo menos, digamos, 90 ·;' de homologia com a sequência acima referida, é uma propriedade c?.racterística preferida da presente invençSo.

Para além do sítio de BamHI (GGATCC), a sequência de nucleótidos continua como é indicado por F. 11. Tomley et al., loc. cit. (1998) na pág. 1029, 6endo o nucleótido 6275 acima indicado o primeiro da sequência de reconhecimento do BamHI e B^T?. 1 de acordo com a numeração de Tomley et al. Enquanto não existem ORF de separação do BÍtio de BamHI, a sequência que se prolonga pelo menos até aos primeiros 150 bp do (11,2 kb) fragmento de Tomley et al., é demonstrável não-essencial, enquanto a outra sequência posterior parece ser.

As X~R da invenção podem ser usadas para inserir genes estranhos em FPV. n desejável que o gene seja incorporado estavelmente para que o recombinante FPV resultante possa ser repe— tidamente cultivado em culturas de tecidos numa grande escala. Evidência a realçar presentecente é que o gene 13,9 é menos estável que os outros dois.

gene estranho pode ser inserido num local qualquer dentro da sequência de !J“R do plasmídio de recombinação. De preferência, não é assim tão excessivamente perto de uma extremidade ou de outra para não proporcionar um. sítio suficientemente longo para a recombinação homóloga com a NR correspondente de FPV do tipo nativo.

;o entanto, é possível permitir que a recombinação ho-ólcga ocorra no exterior da j~R proporcionando, no vector de recombinação, uma sequência de flanqueamento que fica para além de uma ou de ambas as extremidades da *i7 proválvel que usualmente não seja benéfico o uso de sequências de flancueamento as quais são muito repetidas en sérios, pois tal fa to aumenta as probabilidades de ocorrência de recombinações eventuais não desejadas. Consequentemente, sugere-se que as sequências de fIanqueamento que se prolongam para além da extremidade externa da LUS para dentro da região da repetição em : série sejam evitadas.

’.<>·ferindo agora à ;I R D8-D9 e à Fig. 9 dos esquemas anexos, os plasmídios p/B379 e piíB3S9 contêm insertos de ADN de FPV que se sobrepõem com a região dos genes D9 c 1Τ0. Sequenciando estes insertos obtém-se uma sequência d^-* nucleótidos longa que se prolonga a partir da extremidade 3* da Dó até D13 e para além deste até ao gene A2 adjacente.

A a sequência abaixo apresentada, essas partes que não são relevantes para a presente invenção foram truncadas. Os sítios de restrição Dral (ΤΤΤΑΛΑ), DcoRI (GAATTC), Reli (1'GAÍCA), ásull (77CGAA) e Dg III (AGATCT) usados na clonação e a construção dos plasmídios para ensaie das regiões não essenciais estão sublinhadas. As sequências dos amlnoácidos doe genes previstos são dadas no código de letras únicas. Ao gene D9, sendo considerado como sendo não expresso no FPY, não é dado como umo sequência aminoácida, mas co.-.sidera-se que se prolonga desde o nucleétido 1298 até ao nucleótido 1984. Codões de iniciação e de terminação foram sublinhados. A sequência representada abrange o terminal de carboxi do gene 37 e o terminal de carboxi do gene Dll. Uomo o gene Dll possui uma estrutura de leitura aberta que se prdbnga no sentido inverso das outras, a sua extremidade perto do D10 é a que codifica o terminal de carboxi da proteína Dll putativo). Λ sequência

mostra o sítio lo Erall no gene Eli (ver também a : ig. 9)· Verificar-se—à que o gene ^rlC começa dentro da extremidade do gene 1'9, encontrando-se dentro de uma estrutura de leitura diferente. 0 promotor 110 fica portanto dentro do gene 09. A região não-essencial é consequenten.ente definida como se prolongando até ao início da região do promotor PIO, o qual se admite estar a aproximadamente 35 bases antes do codão de inítcio de ATO para D10, isto é, a aproximadamente o nucleótido 1936.

D7 (terminal de carboxi) aqsgmessfvflgniiek*

AGCCCAATCTGGAATGGAATCATCTTTTGTTTTCTTAGGTAACATAATTGAAAAATAATA

CTTTAATAAAGATTAATTTACATAATACCTACATCATGTAACGTATAGCTTATTAAACAT

121 GGATAGCATTTAGTAATATTTGTAAAATCAAAAATAACTATAAATATTTTAATAGTATAT

18I TGAATTCTTTATCATGTAGAAAGATATTAGTTATACACACAATGATATGTAAAAATAGTA

241 TTCGACATAAAGAATTGACGTTGATAATATTTCTCTGCTTTATATATCTATCAAAAACTT

301 TTGTAGAAGTAAAAGCACCTCCCTATGTACTCGTACCGGAAGTAGTGATATAAATCTTAC

361 TTGTTTTATTAAAGATGAT£AGGGTGCTGGAGAAGATAAAGTAATTGTAGCGTGGCAACA

421 GGGTGACGGAGAAGTTACTCAAGGAATAAAAACAACTTGGGATACGACACGACAAGTGGG

D8 MLHISKVSKEAEGSYMCV

4SI CCAAACCATGCTACATATATCCAAGGTATCTAAAGAAGCAGAAGGTTCATATATGTGTGT

V Η I NGDADYKKMNLGVFTVS

541 TGTATGGATAAACGGCGACGCTGATTATAAAAAAATGAATCTAGGAGTGTTTACTGTTTC

KKTYMHNEVSITPRRSRVDM

601 AAAAAAAACCTACATGCATAACGAAGTAAGTATAACCCCTCGAAGATCGAGAGTAGATAT

SDGRPLKIECAFSTRRIYGR

661 GTCGGATGGTCGGCCGCTAAAAATTGAATGTGCTTTTAGTACCCGACGAATATATGGTAG

SQVNIKWWKIDGITRKWEQQ

721 AAGCCAAGTCAACATAAAATGGTGGAAGATTGACGGTATTACACGAAAATGGGAACAACA

TSGVNLLLHTYGGIGSLSIP

781 GACTTCGGGAGTTAACTTACTGTTACATACTTATGGAGGGATAGGATCGCTAAGTATCCC

NPTTGESTGKYMCVVTCGDI

841 AAATCCTACAACAGGAGAATCAACAGGTAAGTATATGTGCGTAGTTACCTGTGGAGATAT

GNVGFRLVKSLSPLSDTESD

901 TGGAAATGTTGGATTTAGACTGGTAAAATCATTATCTCCTTTATCAGATACAGAATCIfiA

HSYTSEEGSHFMERCKVKKS

961 KATAGTTATACTTCAGAGGAAGGATCACATTTTATGGAAAGATGCAAAGTCAAAAAAAG

PYGGWIVE*

1021 TCCGTACGGTGGATGGATAGTAGAATAGATCATCTCAGGGACGCGGTATATATTGCTATA

1081 AAGTAAAATAATTTCTCAATACATTTTTCTACTTTAACGATATAATÇGTTAACTTATTAG

1141 TTTAATTATATCATATATTCCTTTATATCTTAATTAAAAAAATATATTCATAAATGGGAT

1201 ACACTAGTATTTTTTTATATAGTTTACGATATGCTATTTCACTATATATAGTTTATCAAA

1261 CATAAGTGAAAAATAAACAACTATAAAAACTAAGATCAIGTTCGATATATCCAGAGAACA ι32ι acaaaatatattagaaaaaaataaagattgtgttattactikgamcaaataaagaata

381 ACTATAGAAAACACTAACATAAAAGATATACTTAGCGATAGACfiAAlKACATATCGCGT

1441 TATGTATTACATCAGATAATATACCTATAATCGGTATAAGAAGAACGTCTTTTATGTATC

1501 AATCGGTTATATCAAAAAGAAGAAGCTTTTCAGAAATATTAGCCGTCGATATAAACCATC

1561 TAAAGTATATGTATAATAACGAAATTAAAGAAATATCATTAGATCAATAGTACCATTCAC

1621 ATATAGCGGATTCAACAACTTTGAAGAGTTAGTATTATTAGGAGGAAGAGTTAAAAATAA

1681 AGAATCAATATATCAATGCCTGAGTAGAGAACTATCGGAAGAAAGCGATGGAATACTTAC

1741 TATAAAAACATTTGGTAATAAAATATTAAAACTTACCATAGAAGATAAGATACTTCGTAG

1801 AACATTTTATGGGTATTGTATAGTGTGTTTTATAGACCAACTCTATTCAGAAATCATTAA

1861 ACCTTTATATAACATAGAAATCAAAGAATTAGGATCATTATTTGATCGATCAAGTAATGA

D10 M G E

1921 AAAATACGAATACTTGCATTTTATTTATAATACCTTATTAACATATAAATATGGGGGAGT

YYKNKLLLRPSVYSDNIQKI

1981 ATTATAAAAATAAATTGCTCCTTAGGCCGTCTGTATATTCTGATAATATACAAAAAATCA

KLVAYEYGKLHAKYPLSVIG

2041 AACTGGTAGCATATGAATATGGCAAACTACATGCTAAATATCCACTATCCGTAATAGGTA

IMKTIDDKFVLCHRYNSFLF

2101 TAATGAAAACAATAGATGACAAGTTTGTTTTATGCCATAGATACAATAGTTTCTTGTTTT

SEIAFTKDKRRKIRLFKKYS

2161 CAGAAATAGCATTTACAAAAGATAAACGACGGAAAATAAGACTCTTTAAGAAATATTCAA

KYHSNIERDILSYKLSLPNN 2221 AGTATATGAGTAACATCGAACGTGATATATTAAGTTATAAGCTATCGCTTCCTAATAACT

YNTNHIDIIFPGGKIKDLES

2281 ATAATACAAACCATATAGATATAATCTTCCCAGGTGGTAAAATAAAAGACTTGGAAAGTA

ITNCLVREIKEELN1DSSYL 2341 TAACTAATTGTCTAGTAAGAGAAATAAAAGAAGAATTAAATATCGATTCCTCTTATCTCG

AIC KNCFVYGSIYDRLIDKD

2401 CTATCTGTAAGAACTGTTTTGTATACGGTTCTATATACGACAGATTGATAGATAAAGATT

FEVIALYVETDLTSRQILNR

2461 • 2

FIPNREIKGISFIDARDINK

2521 TCATCCCTAATAGAGAAATTAAAGGAATATCATTTATAGACGCAAGAGATATTAACAAAG

DYLYTNVIKYIINAVRTSAS 2581 ATTATTTGTATACTAATGTAATTAAATATATAATAAACGCTGTAAGAACATCCGCTAGCA

N S *

264 1 ATAGTTAACATCTATCTAACTGTTAATATATAAATTAATTT....

Dll * R V T L I Y I L K (terminal de carboxi)

2881 ......TAATTTTTTAAACCC......

L K K F G

.â algumas Indicações preliminares de que a inserção dum gene estranho no gene PIO é instável. Por consequência, o gene D10 nao é uma ?;^:‘R para os propósitos da invenção.

Fazendo agora referência a todas as NFR da presente invenção, o vector de recombinação pode conter um comprimento razoável de sequência de flanqueamento homologamente recorobinável em cada lado da ?ITR, preferivelmente pelo menos 100 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos 250 nucleótidos e ainda mais preferivelmente pelo menos 500 nucleótidos. Por outro lado, com o fim de não fazer o inserto para o vector de recombinação demasiado grande, é frequentemente desejável limitar tal sequência de flanqueamento exterior ao N7R a digamos, não mai;3 do que 1000 bp.

Ocasionalmente, ur.a homologia precisa da sequência de flanque.nmento e da NR não é necessariamente requerida. As notas sobre este efeito indicadas na patente de invenção da Organização Mundial de Propriedade Industrial '<70 39/03429 também se aplicam no presente caso.

Pa preparação de ??V recombinante da presente invenção, o primeiro requisito é para um promotor. C promotor 77,5, o promotor I~6 bem conhecidos ou o promotor Pll de virus de vacina (ver a citada Publicação do Pedido de Patente de Invenção PC?' ãs. ,70 89/03429 podem ser usadas pois que são aceites pelo 7PV como compatíveis. De preferência, no entanto, é usado um promotor de PPV. Certos promotores foram descritos numa anterior Publicação da Memória Descritiva do Pedido de Patente

PC? da Organização '-'andial da Propriedade Industrial

Ϊ-Ό 89/03879 (National Resoarch. Development . Corporation), o conteúdo da qual é aqui incorporado como referência.

Os promotores lb” e ”13,2K são especlalmente preferidos.

invenção ter. particular relevância em aves domésticas, especialme-nte, cr galinhas. Para esta finalidade, qualquer gene c:~ tranho relevante para melhorar o estado das aves domésticas pode ser introduzido no virus da varíola das aves domésticas. ?e preferência, o gene será um gene apropriado para uma vacina de nub-unidade in vivo, por exemplo, ur. ou mais genes selecclcnados de entre os virus da bronquite ir.fecciosa (I2V), virus da doença irfecciosa da bclsa einoviol, virus da doença do Ne?;caetle (ZIDV), virus da doença de .arek, virus da laringotraqueite infccciosa e genes qu codificam proteínas antí-génica- da espécie Eireria» Genes com interesse particular são os genes de reforço de IBV e os genes N e F de IÍDV tal como c descrito na Publicação da Memória Tescrltiva da Patente PUT da Organ:zação l'undial da Propriedade Industrial N⁹... '/.O 86/05806 e na Publicação da líemória descritiva da T atente de Invenção Europeia ηδ. 227414A (ambas da íational Reserch Pevelopment Corporatíon). No sentido de o gene estranho ser correctamente traduzido in vivo, é necessário que o gene estranho possua o seu próprio codão de iniciação ATG introduzido na região imediatamente a seguir ao promotor.

,.ais uo que um gene estranho pode ser expresso num único virus da varíola. ' possível arranjar que mRNA para dois genes estranhos seja transcrito en direcções diferentes quando inserido numa região não-essencial única. Uma tal construção género costas com costas é apresentada no Exemplo 7. Também, genes estranhos individuais podem ser inseridos cm Ν’⁷? individuais descritas na presente memória descritiva, 'nquanto genes de fusão de proteínas podem, evidentemente, ser feitos, é normalmente preferido que cada gene esteja sob controlo de um promotor separado.

C promotor e o gene estranho, entãc, deverão ser introduzidos dentro da região não-essencial (l’ER) do genoma de FPV. A técnica de rccombinação homóloga ilustrada pela Fig. 1 dos es-

- queiras anexos proporciona uma form·: de o fa er. Um fragmento de Df genómico contendo a NR ' sub-cionado num vector de clona.-ão. ”ar.-s então ue construto no vector de clonação, compreendendo parte da L*FR seguida pelo promotor seguido pelo gene estranho, seguido por uma parte posterior da .\”'R na mesma orientação que a primeira parte, Rsta estrutura, num vector apropriado, forma o vector ce rscombinação, o qual é usado para transfectar o FRV, por exemplo, pelo método do fosfato de cálcio, por meio do qual ocorre a recombinação entre as sequências de ’<fR no vector de recombinação e as sequências de :’’Tl no FP7. 0 FRV re-armazena automaticamente este genoma alterado e o FFV assim alterado (RFV recombinante) constitui uma parte do objecto desta invenção.

Cs vectores de recombinação acima descritos podem ser preparados de várias .maneiras diferentes, sendo 03 elementos que fazem parte dos requisitos introduzidos por qualquer ordem.

'm referência à Fig. 4, uma região não-essencial acima definida para uso na invenção possuindo (digamos) dois sítios de restrição A e B é inserido num vector apropriado, o qual como ilustração apenas é descrito como um plasmídio. Lun outro plasmídio possuindo os mesmos sítios de restrição A e 3 ou compatíveis em termos de ligação, é feito um construto da sequência promotora seguida pela sequência do gene estranho, videntemente, é essencial que este construto seja feito de forma a que a transcrição de mRNA comece no ou antes do codão de iniciação do gene estranho. Como é uma operação demorada determinar precisamente onde o início da transcrição de mR.NA se efectua por qualouer promotor particular, é conveniente simplesmente inserir, digamos, 100 ou, mais preferivelmente, 150 pares de bases do ADN promotor imediatamente precedentes do gene de FRV que ele normalmente promove, para assegurar o bom funcionamento do promotor.

de restrição Λ e

L estão íocj.1 iza2as ηο ΛΒΒ do alas-

flenqueia ο AD promotor do 1'FV e o g-orr estranho.

. laro, Â pode criar dentro do A??I promotor se esto cair centro de uma sua porção não—funcional, nquanto A e B podem sor dois sítios dc restrição diferentes, eles podem, evidentemente, ser um. e o mesmo, les podem ser sítios com extremidades viscosas ou abruptas e podem Ser preparados artificialmcnte, por exenplo, por enchimento com nucleótidos adicionais ou mastigação posterior, dc formas bem conhecidas no campo do ADN rccombinante. Convenientemente, A e B estão ou são convertidos num sítio único de extremidade abrupta (C) e então permite-se a sua ligação a um único sítio de extremidade abrupta única (C) dentro da ?Γ'Π. Deve tomar-se cuidado, evidentemente, em seleccionar sítios únicos no ADN dos plasmídios para evitar cue possa ocorrer a ligação de outras sequências de ADN. Peste exemplo, sítios únicos para Spel, Ncol, e BglII nas N-'R foram usados e foram preenchidos para proporcionar um sítio único de extremidade abrupta para inserção do construtc gene-promotor.

Cs ADC dos dois plamídios são ligados conjuntamente in vivo e então transformados no hospedeiro, para produzir o pias ídic de recombinação final da presente invenção.

A Fig. 5 ilustra um outro método para a preparação de vectores recombinantes. Neste método, em primeiro lugar, preparar-se um construto que compreende uma primeira parte da N~R, seguida pelo promotor, seguido por uma sequência curta de nucleótidos compreendendo pelo menos uma zona de clonação para introdução de um gene estranho, seguida por uma s°gunda parte da NR que terá quase inevitavelmente a mesma orientação que a primeira parte. Como é evidente, virtualmente qualquer comprimento de ADK proporciona um sítio ce clonação adequado de uma forna ou de outra para introduzir um gene estranho. De preferência, estes construtos contêm um sítio de cio-

nação múltiplo, isto é, diga..os, com um comprimento do AU.

i contendo os sítios de uma variedade dc diferentes enzimas de restrição, pelo menos, 10, por exe-plo. Un tal construtc possui então versatilidade, pois será então muito mais fácil restringir o AjU que flanqueia praticamente qualquer gene estranho nos sítios perto de cada uma das suas extremidades e inserir o g 'ne estranho no sítio de cionação múltipla ilustrauo na . ig. 5. j.pcn as dois sítios ή e Ϊ foram representados para simplificação e estas podem ser enchidas ou mastigadas posteriormente, como se se desejar, para se cbter sítios de extremidade abrupta (d substituindo X e Y). dos plasmídios de rocombinação finais, o ADN promotor é separado do gene estranho por una porção do sítio de clonação múltipla mas isso nãc afecta adversamente a transcrição do aR?IA no viru3 final.

Um qualquer dos dois métodos de construção, a NFR é cortada pelo promotor e pelo gene estranho. Xão é essencial, evidentenente, que esta seja cortada numa região central. f'em é essencial que a sua segunda parte constitua a compensação lntagral ou a parte restante da NER. tal como acima foi explicado, desde que existe dentro da NFR ou em cada extremidade da :'R esta contendo uma cadeia suficiente ente longa de ,\~<i para recombinação homóloga, não importa que uma parte da NZR possa ser excisada algures entre elas ou que ΛΒ.'ί adicional (irrelevante) seja inserido na preparação do plasmídio de re— combinação, ou mesmo que a NmR tenha acenas alguns pcucos bp de comprimento (mas não deverá ter normalmento me.no.e do que cerca de 20 bp de comprimento ou que existam dificuldades prá ticas na inserção do A?:í estranho).

A Fig. 6 ilustra um outro método para a preparação de um pias rídio de recombinação. 0 plasmídio NFR é restringido co.~o ar«teriormente (um sítio de extremidade abrupta :?u viscosa preenchida para se tornar numa zona final abrupta C, é ilustradm arbitrariamente por esta Fig. ). 0 outro plasmídio contém um

gene marcador com o seu próprio promotor e um gene estranho com o seu promotor em orientações opostas. Devem ser usados diferentes promotores para evitar a possibilidade de uma recombinação incorrecta. guando estes plasmídios são ligados conjuntamente entre si, o marcador é ligado ao gene estranho. A presença do marcador em FPV rccombinante é portanto provavelmente uma indicação duma incorporação do gene estranho em PPV realizada com êxito. Convenientecente, o marcador é facilmente detectável através de uma reacção colorida, fluorescente ou químico-lurainiscente. A beta-galactosidase ou o gene LacZ pode ser inserido dentro da L3R e os recombinantes podem ser detectados pelas placas azuis geradas quando está presente o substrato de 5-bromo-4-cloro-3-iodolil-p-galactopiranósido (X-gal) nus; meio de crescimento. ~sta técnica, usando o gene lacZ, foi descrita en relação a VV por S. Chakrabarti et al., Molecular and Celular Diology 5, 3403-3409 (1965).

De preferência, o gene marcador é também seleccionável (ou é substituída por um gene seleccionável ou dois genes separados, estando incluídos um marcador e um seleccionável). Um exemplo de um gene seleccionável é o gene Pcogpt descrito na Memória Descritiva do Pedido de Patente da Organização Mundial de Propriedade Industrial Τ.Ό 88/02022, já citada, e também por P. G. Palkner e B. oss, J. Virology 62, 1849-1354 (1938) s também dtil saber quando se prepara um plasmídio de recom— binação que o gene estranho é passível de ser inserido com êxito dentro da NER. Uma forma de o verificar é a adopção da técnica representada na Fig. 7. Novamente sítios de extremidades abruptas (Z e V>) são representados. Num primeiro plasmí dio compreendendo a .'FMR, é inserido um gene marcador dentro da NPR e opcionalmente um sítio de clonação múltipla é inserido dentro do gene marcador. 0 gene estranho com o seu promotor, contido num plasmídio separado, é então inserido dentro do gene marcador por comlinação de dois plasmídios tal como se / · mostra. 0 gene estranho é inserido em qualquer sítio dentro do gene rarcador o qual interrompe ou altera a sua função de marcador, pelo cue a inserção pode ser reconhecida. Por exem—

I

I pio, o gene lacE de F. coli. pode ser usado como gene marcador. Apenas o alfa-fragmento necessita de ser inserido pois os restantes elementos do gene requeridos para o processamento 3ão proporcionados pelo hospedeiro bacteriano. * propor^cionado cor. o promotor de E. coli. para lacZ, o codão de iniciação lac, e, preferivelmente, um sítio de clonação múltipla dentro de alguns codães de iniciação, seguido pela sequência que codifica o frag:. ento alfa. Quando o alfa-fragmento é interrompido por um gene estranho, convenientemente inserível no referido sítio de clonação múltipla, as colónias azuis formadas num substrato de Z-gal não são obtidas normalmente. 7olónias brancas indicam um provável plasmídio de recombinação.

vector de recombinação poderá, ocasionalmente, ser ainda proporcionado com um sítio de sinal de terminação para terminar a transcrição do mRNA, a qual pode ser útil para estabilizar o mRNA quando se usa um promotor de actuação precoce, ste será inserido a jusante do gene estranho. No entanto, em muitos casos os sinais de terminação ordinários dos virus da varíola que infectam ou os sinais para se iniciar a transcrição de um outro gene, a jusante, de FPV serão adequados.

As referências aqui feitas a outros vectores diferentes de FPV (ou VV) significam qualquer vector e clonação procariótica ou eucariótica conveniente, apropriado para a produção de massa do construto dentro de um hospedeiro adequado. Os vectores procarióticos serão normalmente plasmídios ou fagos. Os hospedeiros procarióticos adequados incluem bactérias. Vec-tores eucarióticos tais como células de fungos, bolores e animais podem ser usados se se pensar que são mais convenientes.

Apesar de o vector de recombinação usado ser normalmente de

APN de uma cadeia dupla é possível que se use APJ ;e uma cadeia simples para a recombinação homóloga.

vector de recombinação da invenção que compreende a N.ER, o promotor e o gene estranho deverá ser trocado” para se obter o AP?{ de FPV parente”. Com este objectivo, são infectadas células de animais adequados de preferência mas não necessáriamente de aves domésticas com o FFV parente e o vector de recombinação é então introduzido nas células. Este processo é levado a cabo in vltro. * melhor não usar FPV parente do tipo não tratado por razões óbvias. 0 FFV pode ser facilmente atenuado (mutado para ficar com menor virulência) por qualquer método convencional de atenuação.

Vuitos métodos diferentes estão disponíveis para a detecção ou a selecção de virus recombinante e foram descritos para VV num artigo de revisão de L'. ^ackett e G.L. Smith, J. General Virology 67, 2067-2082 (1986). Pais métodos são aplicáveis na presente invenção. Um método é o alargamento do plasmídio de recombinação para incluir juntamente com o gene estranho desejado um gene marcador adicional como acima se descreveu (Fig. 6). Alternativamente, a inserção do gene estranho pode ser detectada por um ensaio de hibridização no qual uma sequência de nucleótidos etiquetada complementar da sequência do gene estranho é usada. Tais ensaios são bem conhecidos.

Os recombinantes de FPV possuindo o gene estranho são então desenvolvidos em células apropriadas. As N’~R da invenção são não essenciais em células fibroblásticas de embriões de galinhas. Será necessário realizar experiências de rotina para determinar se elas são também usáveis para o desenvolvimento de FFV noutros tipos de células, por exemplo, células da pele de embriões de galinha, fibroblastos da galinha, células epiteliais de embriões de galinha derivados polos métodos de cultura de tecidos convencionais, principalmentes a tripsiniI

zação de tecidos ou a m-mbrana corioalantóica (CAL') de embriões de galinhas ou de ovos de perua.

Tara administração a aves coco uma vacina, c virus r-comblnante pode ser administrado a aves por um método adequado qualquer tal como por meio de aerossol, água para beber, oralcente, por injecção intramuscular ou inoculação na membrana da asa. Ingredientes tais como leite desnatado ou glicerol podem ser usados para estabilizar o virus. l prefirível vacinar os pintos com a idade de 1 dia por administração por aerossol.

recomendada uma dose de cerca de 10 a 10^ pfu, de Dreferên4 6 cia 10 a 10 pfu, do ?P7 recombinante por ave.

nquanto a invenção tem como objectivo primário o tratamento de galinhas, esta apresenta também interesse potencial em relação a outros animais que possam ser inoculados com 7FV com segurança. D mesmo possível que possa ser considerada segura para infectar seres humanos após ensaios apropriados serem realizados.

Os “xemplos que se seguem ilustram a invenção:

bXFJÚPLO 1 'ste exemplo refere-se a NFRs de repetição terminal invertida.

Fstirpes de virus

1··

A estirpe H?43S do virus da varíola rle aves domésticas foi fornecida pelos Professores A. ?.*ayr e :i. 1'ahnel, Ludwig-Vaximillians TJniversity, 'unich. A espécie HP438 foi obtida a partir da estirpe patogénica HP1 por 43ô passagens em fibroblastos embrionários de pintos (CF.F) em culturas de tecidos. A.

payr et al., Zentralblatt fllr Veterinarmedizin B13: 1-13 (1965)

A espécie RP444 usada para obter a ADN para clonação foi derivada por 6 passagens posteriores em células C':?.

L'eio de Culturas de Tecidos

As células CPP cresceram num meio 199 (.Vellcome), suplementa-

Culturas de células e Purificação do ADN dos Virus

A estirpe H?444 de ?PV foi desenvolvida em fibroblastos de embriões de pintos primários (CPF) e preparou-se ADN de FPV como descrito por .V.P.Pinns et al., Nucleic Acids Research 15, 6563-6573 (1987).

Identificação do fragmento terminal genoma dos virus de varíola é um ADN de dupla cadeia. Como é usual, as duas cadeias estão ligadas conjuntamente por ligações de hidrogénio. No entanto, nas extremidades do geno: a dos virus da varíola, as duas cadeias estão ligadas por ligações covalentes. Tal significa topologicamente que o ADN é uma cadeia contínua. Quando o genoma é cortado em fragmentos com uma enzima de restrição, os fragmentos internos são topologicamente diferentes em relação aos fragmentos terminais e

comportam-se diferentemente. Sob a acção do calor (para separar as duas cadeias), os fragmentos internos separam-se comple tamente e reanelizam-se lentamente (dificilmente se um deles arrefece rapidamente). Os fragmentos terminais, sendo ligados por ligações covalentes, não se podem separar espacialmente para muito longe.

i

1;

iuediante arrefecimento estes reanelizam-sc rapidamente começando pelo meio e fecham vigorosamente. Este facto é denominado por restabelecimento súbito”. ApÓ3 aquecimento e rápido arrefecimento, conEequentemente, apenas os fragmentos terminais podem ser detectados por eletroferese em gel. ”ste método de identificação do fragmento terminal, denominado o método de restabelecimento súbito, ver L.C.Archard ê U. Tackett, J. General Virol. 61-63 (1979), foi aqui usado.

Um AU:: (lC^ug) de digestão de restrição com BacHI foi extraído uma vez com fenol, a fase aquosa foi extraída com éter dietílico para remoção do fenol e ο ΑΖΠ da fase aquosa foi precipitado com etanol. A. pelete de ADH foi seca e ressuspendida em 20 /11 de TE Tris-HCl de pH 7,5 10 mV, ^rDTA 1 m.*'. A solu/ ção de AD5 (10 yul) foi então desnaturada pela adição de 40 yil de formamida desionizada a 95 f em v/v em solução 50 mH de Tris-HCl de pH 7,5 e incubada a 60⁸C durante 10 minutos. 0 tubo com a amostra foi então rapidamente arrefecido em gelo húmido contendo KaCl durante 10 minutos antes de se analisar ; ALH por electroferese em gel de agarose. 0 presumido fragmento terminal renaturou-se rapidamente apenas no ADN de PPV natural e foi detectado como uma banda de aproximadamente 6,3 kb. Existe apenas um fragmento de BamHI derivado por restabelecimento súbito pois o sítio BamHIcai bem dentro das TIR.

Cio nação do fragmento terminal do A Dlí de ??V !

A reticulação terminal do fragmento de BamHI foi digerido com L-iuclease 31, usando 100 ^ug de ADN de FPV e 20 unidades de nuIclease 31 (Boehringer lannheim) em 250 ^ul de solução de acetado de sódio 30 mM, pH 4,5 ; NaOl 0,3M: ZnOC^ 1 ml.l ; glicerol a 5 % (v/v) a 37^SC durante 20 minutos.

Para reparar a extremidade do ADI', este foi então precipitado com etanol e ressuspendido em 100 yul de um tampão de ligação (Tris.1101 de pH 7,5 50 mH, cloreto de magnésio 10 m.'^T, 377 10 clT) contendo 5 unidades de fragmento de Klenow de 3. coli polimerasei euma unidade de ΑΓΜ polimerase e 0,025 ml.’ de cada um de dATP, dOTP, dGTP, e dTT3. Esta mistura reaccional foi deixada durante 1 hora à temperatura ambiente. A reacção foi interrompida por aquecimento durante 10 minutos à tempera tura de 702C e 20 yUl da mistura foram digeridos com 10 uriàades de Baml-H (Boehringer Mannheim) de acordo com as recomendações do fabricante. 5 yul deste ADN foram ligados com 20 ng de plasmídio cortado (pBGS19) com BamHI/Smal, B. G. llpratt et al., Gene 41, 337-342 (1986), para prefazer um volume total de 20 ^ul de tampão de ligação contendo 2 unidades de

ΑΓΝ ligase e ATP 1 m.Y, e incubados a 4⁵0 durante a noite ^T4 e

transformados em E. coli. Foi realizado o ensaio para determinação de recombinantes que continham o fragmento terminal com um fragmento terminal de Banfil radiomarcado de FPV isolado a partir dum gel, usando as técnicas padrão descritas por T. l.'a niatis et al., l.olecular Cloning: A Laboratory 1'anual**, ?Iew Tork, Gol Spring llarbor Laboratory (1982) e líolmes e Quigley, Analytical Biochemistry 193-197. Foi isolado um plasmfdio recombinante pB3.

Clonação das ΕΓ3Ρ.

Os três genes cn ensaio relativamente à sua não-essencialidade foram mantidos conjuntaiaente na sua sequência natural numa modificação encurtada do plasmídio pB3, ver Fig. ô. 0 plasmídio pB3 foi encurtado por remoção da sequência curta única e as sequências repetidas (Ver ^ig. 8) obtidas a partir do fragmento ;iamEI. Tal foi realizado por meio de digestão com f stl. Existe um sítio SstI no plasmídio pBGS19 precisamente antes do sítio de EamEI dentro da qual o fragmente Eam:il de F7V foi inserido. Λ digestão com SstI foi realizada a 37⁹0 num total de 20 yul ae ura tampão recomendado usando 10 unidades de Hstl. Existem muitos sítios de SstI na sequência repetida, a última das quais provoca o corte de nucleótido 4005. Assim, após o corte com SstI, o plasmídio pB3 (9,8 kb) fei re-ligado num volume de 10Cyul, para favorecer a ligação intramolecular usando o tampão de ligação previamente descrito, a 15⁹C durante a noite, para produzir plasmídio pB3'T (5,8 kb) em. que faltam de 4,0 kb do fragmento de Bam::I do ADN. Para seleccionar os clor. jn η* 5,8 kb, de preferência em i ilação aos que perderam comprimentos menores de ΑΒ.Ί cortado com SstI colónias seleccior.adas foram desenvolvidas e depois submetidas a electroforese com gel. Para verificar que todas as repetições foram removicas, o plasmídio foi digerido com RglII € os fragmentos foram snalisaios por electroforese em. gel.

Prepareção de um plasmídio compreendendo o promotor VV 7,57 e o gene lacZ promotor W 7,5K é disponível num plasmídio pGSZO fornecido pelo Pr. Ceoff Smith, nfcrision of Virclogy, Dept. of Pathology, University of Cambridge, Adeenbrooke*s Site, nills Eoad, óambridge, Inglaterra e é descrito ev Packett, G.L. Smith e 2. Moss J. Virology 49, 857-864 (1984) e pode ser combinado com sequências lacZ da Ξ. coli como se apresenta n.i sequência de ABM abaixo. C plasmídio resultante é designado por pPGI. Outros métodos que podem ser usados para combinar o promotor VV 7,5K e a sequência lacZ foram ãescritos em artigos relacionados com W.

<----- sequências p7.5 de pGS20-------------------1 GGATCOCCAATxCCAGCTTGGCTGCAGGTCGACAlATACTATATACTAATACvAA— _____________7ACTC__

AAGASTACGAAACIGATACAATCTCTTATTCATGTGGGTAATGTTCTCGATGTCGAATAGC

121 CATA-GCCGCTAGTTCCGAÍATACATAACTGATCACTAATTCCAAACCCACCCGC— ^TTT

181 TATÂGTAAG7T2TTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTC2CGTAAAAGTAGA

----sequências p7.5 de pGS20-->

241 AAATATATTCTAATTTATíGCACGGTAAGGAAC-TAGAATCATAAAGAACGTGAC

GGATCG <--- sequências SV40 + sequências de ΑΒΓ de ligação ---> <--- sequências lacZ

301 AAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTCCGGAATTCCAAGCTTGGCCTGGCCGTL'et Λ s pLysValPhe A rg A snS erLys Le uG ly Le uA laValCGTTTT ValLeu

361 ACAACGTGGTGACTGGGAAAACGCTC-GCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAG InArg ArgA spTrpGluAsnrzoO-lyValThrC lnLe uA snArg L e uA laA la

GCA3ATCC

Íi:.‘Pro

------------------ continuação de sequências lacZ—

3301 GGGGAIIGGTGGCGACGACTCTGGACGGCGPCAGTÀTCGGCuuaa-zTCCAGCTGlylleGlyClyAspAspSerTrpOerProScrTalSerAlaGluPheGlnGAGCGC

LeuSerAla -----sequências lacZ ..—»<--Sequências de ---3361CGGTCGC2AaCAITACCAGTTGGTCTGGTGíCAAAAATAATAATAACCGGGCA-. GlyArg7yriisTyrCInLeuValTrpCysGlnLvs x**

GGGGGGA ligação—» 4— sequências SV4G-----3481 cacaaataaagcatttttttcactgcattctacttgtgctttgtccaaactcaTJAATGT —sequências SV40--»

3541 atcttatcatgtciggatcggggazcc

Inserção do construto de promotor VV 7,5ã/ /gene lac2 dentro é.e ííer de FPV para fazer plasmídíos de rc-combinação_________________ fragmento P7,5 + lacl·’. (cerca dc 3,6 kb) num volume total de tampão de 20yUl foi cortado dc plas.vidio pPGl resistente a penicilina com 10 unidadeòdo BamHl. As extremidades do ABX foram então reparadas com o fragmento de Klcnow da ADH polimerase para produzir moléculas de ABM de extremidades abruptas. Asám, fragmento foi extraído com fenol com um volume igual de fenol saturado com TE c precipitado com etanol. Foi ressuspemdido em 20 ^ul de tampão de ligação compreendendo 5 unidades de fragmentos de Klenow em 1 unidade de pollmerase, contendo 0,025 m'·’ de cada um dos dATP, dCVP, dTTP, e dGTP e conservou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Similarcente, os plas' ídios pB31PE (Spel» Xcol e PglII) foram também digeridos com RamII e reparados para produzir nítios de extremidades abruptaa. 0 fragmento r7,5 + lacZ foi então ligado pelas extremidades abruptas ao PB3’cíE procedendo como se segue. Assim, o plasnídio e o fragmento (20 ng cada) foram ligados num volume total de 10 yul do tampão de ligação acima descrito compreendendo 1 unidade de ligase AEN e A7P Iml’ e incubadas a 4⁸C durante a noite e foram transformados em E. coli. Colónias azuis de placas de Xgal Canamlcina foram scleccionadas (pBCS 19 é um vector resistente à Canamicina) e o ABN de várias colónias foi examinado polo médodo de Eolmes e Quigley, loc. cit. Cada 15.gação produziu dois resultados diferentes, isto é, o P7,5 + lacf podem ser ligados ao pB3-VE por uma ie duas orientações diferentes. Os pares de construtou de cada oítio foram denominados ρΡΡρ2/4, ?E”L5/6, e pFFL7/C. ~m p”FL2, 6 e 8, o incerto ?7,5 + lacZ estava n. mesma orientação que o gene no qual foi inserido, isto é, da direita para a esquerda no p7L2 (BglII, 26,0) e pZFL8 (Spel, 11,5) e da direita para a esquerda em pT:?L6 (ilcol, 13,9).

Re combinação

Cs plasmídlos pEF12, 6 e 8 que continham o construto promotor P7,5K/lacZ com as orientações descritas foram usados nas experiências do rocombinação* A recombinação possui as fases gerais seguintes:

1. Infectam-se células de CPF com FPV e adiciona-se o plasmídio de recombinação de ADN sob a forma de um precipitado de fosfato de cálcio pré-preparado. Permite-se o crescimento durante vários dias. (A recombinação toma lugar).

2. Paz-se a recolha das células e procede-se a congelamento-descongelamento três vezes (Os virus sao libertados das células).

3. Adiciona-se esta preparação aos C? a várias diluições para produzir placas com cerca de 500-1000 placas por cápsula de 10 cm (cerca de 0,1 < destas são placas recocbinantes).

4. Adiciona-se uma camada de Xgal e visualizam-se as placas azuis.

5. Repicam-se as placas isoladas. Congela-se/descongela-se três vezes para libertar os virus a partir células das placas.

6. 'Jitular-3c novamonte as e obtêm-se mais nlacas.

i i

H

II !i7. Volta-se ao ponto 4. e repetes-se as operações 4 a 6, até se obter usa placa pura do reconbinante.

Noa sais detalhe, células fibroblástlcas de embriões de pintos, quando confluentes em cerca de 80 foram infectadas con. unidades formando cerca de 3 placas (partículas virais infecciosas) por célula de placa purificada de HP44C. Virus da varíola de aves domésticas. 0 viru3 estava contido en 1 ml de seio isento de soro disponível comercialmcnte (199”), e foi deixado a adsorver pelas células durante 2 horas a 37°C depois do que o inóculo do virus foi retirado e sc adicionaras 10 ml de seio fresco compreendendo 5 7' de soro de vitelo recém-nascido (CS) foram adicionados, nora e meia depois preparou-se um. precipitado de construto do plasmídio de AOS a ser rccombinado com os virus: 1 ml de .erpes/solução salina tamponisada (pFÍ 7,12) adicionaram-se 10 a 20 yug de plasmídio p'TL2, 5 ou 8 de AD‘J em solução em 77 a cerca de l^ug/pl. Foram adicionadas lentamente 50yul de cloreto de cálcio 2,51’, e deixoct-se formar um precipitado de fosfato de cálcio/ADN/fi no durante 30 minutos à temperatura ambiente (25°^)· 0 meio das células virais infectadas foi então removido, adlcionou-se 1 ml do precipitado às células e deixou-se em repouso durante trinta minutos à temperatura ambiente. Fntão um volume de 10 ml de meio fresco compreendendo 5 λ de CS foi adicionado às células, o estas foram incubadas a 37³0 durante mais quatro horas. Λ condição das células foi então examinada e se o precipitado de ADli fosfato de cálcio foi considerado d amaciado espesso, o melo foi substituído.

Caso contrário foi substituído no dia seguinte. As células foram incubadas a 37⁵C durante mais 5 dias o então o virus fei colhido porraspagem das células para dentro do meio. Os

viras intracelulares foras. libertados por três ciclos de congclamento/descongclamento e os virus titulados por uma titulação convencional de placas.

C meio líquido foi removido das células e adicionou-se uma camada superior de meio de cultura em 1, de gel agarose de baixa temperatura de gelificação (LGT) compreendendo 300 yUg/ /ml de fgal (5-broco-4-cloro-3—indolil-beta-Γ—galactósido) foram adicionadas. Após incubação durante a noite a 37^?O, as placas que expressam o gene lacZ, de coloração azul, foram obsc rvadas.

As placas azuis foram repicadas em 5CC^ul de Tris 10 rzi: pí’9, os virus intracelulares foram libertados por três ciclos de congelamento-descongclamento e o virus titulado por uma titulação convencional de placa. 0 processo de repicagem de placas e a re-titulação foi repetida até que fosse obtida uma placa recombinante purificada.

Os recombinantes purificados em placa foram então passados numa cultura de tecidos com os seguintes números de etapas após a primeira repicagem;

F.ecombinante do plasmídio p~PL 8 inserção de 5pel: estável durante pelo menos 3 passagens inserção de Ncol: estável durante apenas 2 passagens laser-ão de BglII: estável durante pelo menos 6 passagens.

É possível que os recombinantes baseados em Ncol possam ser estáveis durante um período de tempo superior sob condiçães diferentes a partir destes ensaios acima descritos.

Análises do ΑΡΗ doe recombinantes de 7°V 'uando o ATJN do parente de FFV é digerido com BamUI um número do fragmentos de restrição são gerados os cuai3 podem ser separados em geles de agarose. 0 fragmento terminal apresenta um tamanho de d,3 kb e de dupla intensidade quando comparado com outras bandas pois existem duas cópias deste (um de cada extremidade do genoma). Quando o ΛΣ7Γ do recombinante feito com pB?L2 foi digerido o padrão das bandas foi o mesmo que o esperado con a excepção de que o fragmento duplo de 6,3 kb tinha sido substituído por um fragmento duplo de 9,9 kb. Tal é concordante com o aumento de tamanho de 6,3 kb para 9,9 kb o que será produzido se o fragmento P7,5 + lacZ 3,6 kb for inserido dentro do fragmento terminal. Fazendo uma amostragem da digestão da restrição após a transferência para nitrocelulose verificou-ee que a banda 9,9 kb continha realmente sequências lacZ.

ste exemplo refere-se às NTR Ό8-Ρ9.

A fim de se ensaiar se L9, D10 e o virus da varíola de aves doirésticas presentes na posição P8 eram não essenciais para crescimento, foi levada a cabo a seguinte técnica:

1. ?ara PS, fez-se uma cultura em que o plasmídio pB389 foi desenvolvido num hospedeiro dam“E. coli rK262 e foi ro-isolado como p?*B434. A razão para isso é que nas estirpes vulgares de 7· coli» a enzima Bcll a ser usada não pode restringir porque a sua base de adenina de controlo na sua sequência de reconhecimento 7CATCA é metilada. A estirpe dam” resiste à metilação e, neste hospedeiro, a

enzima Bcll é capaz de clivar os seus dois sítios de reconhecimento o que ocorro na região DS. 'ste plasmídio foi então clivado coc Bcll e re-ligado e foi isolado um clone que não possuía o fragmento 523 bpBcll por peneiração de algumas colónias com pequenos plasiaíeiios preparados. Ur ta plasmídio p.*.'3441 compreendendo um único sítio Bcll e possuindo uma grande parte da sua região D3 isolada. Um fragmento ?am-11 do pBPCI, compreendendo o gene deβ> -galactosidase, sob o controlo do promotor de vacina P7,5K, foi estão inserido dentro deste sítio único Bcll, do p?'B441 (Bam.II geram extremidades viscosas compatíveis tais que não foi necessária a renovação da extremidade). Um clone do plasmídio ¢,(3447 contendo a estrutura correcta foi isolado e usado nos ensaios de recombinação (Ver posteriormente ).

2. Para D9, pl’B389 foi clivado com AsuII (um sítio único que existe no gene L'9) o renovado na extremidade. Clivou-^se pBGl com BaralII e renovou-se nas extremidades e em seguida li.qou-sc com p‘‘B389 clivado com AsuII que também tinha sido renovado nas extremidades. K colónia seleccionado de coloração azul em placas Xgal Amp foi verificado como compreendendo o promotor de vacina ?7,5K e o gene de /b-galactosidase inserido no gene Ώ9.

3. Para D10, um fragmento de EcoRI foi subclonado a partir de pMB389 (um sítio de BCoRI fica dentro do gene D9 enquanto o outro está dentro do poligante do vector PUC 13 de pMB389) dentro do pUC13 cortado com EcoRI. 0 plasmídio resultante pO439 contém um sítio único de BgUI dentro do gene D10. 0 fragmento de BamHI contendo o promotor de vacina P7,5H e o gene deβ-galactosidase foram clonados dentro do sítio de B.qll do pT!B439 para gerar ρ;ΤΒ443. (Fovamente não foi necessário renovar as extremidades porque BamHI e

I

também tem extremidades viscosas C í*j 1VG i. S ) · 0 Ι plasmídio p.VB443 foi então ensaiado em ensaios de recombinação.

As construções dos plasm.ídios acima descritas estão ilustradas esquematicamente na ^ig. 10. 0 plasmídio pBGl é obtido por corte do fragmento de Bamlíl do p?Gl, contendo este fragmento um gene de construção ?7,5 -β-galactosidase e inserindo-se no plasmídio pBGS19 (Referência ao Exemplo 1).

Recombinação

Virus das placas azuis Iniciais de usa experiência de recombinação foram purificadas em placa três vezes e pareceram apresentarem-se estáveis (ieto é, não foram observadas placas brancas na terceira passagem). 0 ADN virai foi obtido a partir de virus purificados em placas e foi digerido com E. coli. A ADrl de ETV original (não-recombinante) (tipo selvagem) foi também digerido com EcoRI para servir como controlo. Os AD?I foram ensaiados en geles de agaros? em duplicado, submetidos a ensaio de r.ancha de Southern e foram testados com qualquer fragmento de EcoRI de 7P7 putativamente recombinante dentro dos quais as inserções se devem ter realizado ou com pBGl contendo o gene de f>-galaotosidase. Comparando o FPV putativamente recombinante com o tipo selvagem quando produtos da digestão com EcoRI foram ensaiados com geles, o fragmento normal de EcoRI presente no ADN do tipo selvagem tinha aumentado de tamanho nos dois recombinantes putativos D8 e D9. 0 novo fragmento Ώ3 era mais pequeno que o novo 19, tal como esperado, devido à remoção do pequeno fragmento Bcll (377-950) neste caso, queaido testado com ADN do plasmídio pBC-1 contendo gene de β-galactosidaee, a ADN de FPV do tipo selvagem não se ilumina mas os recombinantes putativos D8 e D9 am-

'cos sc orientara na mesma posição que quando a amostra do fragmento FcoRI putativamente recombinante foi usado. Isso estabeleceu que as estruturas dos recomblnantes 38 c 39 eram como se esperava.

Experiências análogas para o gene 310 falharam cm proporcionar as confirmações desejadas.

E-.T PLO 3 stirpe de virus 'ste Exemplo descreve a construção de vectores que contêm os genes Pelitf do virus da doença de Kerrcastle (JDV) e a protecção com êxito de aves usando o gene P.

Foram usadas N'R de TIR.

Λ. Subclonação de fusão de NDV (F) e genes de hemaglutinina - Neuraminidase (HN)

Os genes F e :IN da NDV foram obtidos como uma oferta do Professor ?.I. Fmmerscn da University of :iew íork uastle-uponJyne, cada um deles clonado no plasmídio p’JC19, Γ. Chambers et al., Journal of General Virology 67, 2685-2/94 (1986); Π.

8. 1'illar et al., Journal of General Virology, 67, 1917-1927 (1985). Ver também a Memória Descritiva da latente de Invenção Europeia 227414 (National Research Develorment Corporatíon) que se refere aos Pedidos de Depósito de Patente de acordo com o ratado de Budapeste de EV cADN dos plaemídios pUC18 e pUC19 na Jaticnal Collection of Industrial Sacteria, Aberdeen, Escócia em 1 de Julho de 1986 como MGIB 12277 (gene F) e 12278 (gene -21;. Referindo aos clones de pUC19 clones realmcnte aqui usados, o do clone gene F também continha parte

dc gene 'E7 a jusante. 0 gene 7 foi sub-cionado por meio de corte com a ensina de restrição Baimíl (a qual corta convenientemente as 29 bases d-^ jusante do codão A7G de iniciação na extremidade 5’ do gene 7) e EindlIT (a qual corta aproximadamente 820 bases a jusante do extremo 3* do gene 7, incluindo esta sequência extra alguns dos genes de HN) no plasrídio resistente à Janamiciaa pBCS18 cortado com. 7-amEI c EindTIT. 0 plarrídio resultante foi denominado pBG71 (ver Fig. 1).

G plasnídio pUC19 que contém o gene ΙίΠ bem como o gene F, tem a sequência do gene F a jusante em relação ao gene IN. A fim de facilitar o posicionamento de um promotor do virus da varíola adjacentemente ao gene EN, as sequência do gene ? foram removidas usando a exonuclease 3al31. 0 plàsmídio foi clivado com a enzima dc restrição Sphl (a qual corta no sítio de elonação múltipla de pUC19 no sítio 5’ do gene HTI) e digerido num intervalo de tempo apropriado procedendo como se segue. 0 método usado foi como o descrito em ” olecular cloning (A Laboratory 7anual)” de 7. Eaniatis et al., Jold fpring Jarbor, Estados !'nidos da América, (1982). 20 yul de ADN (contendo aproximadamente 500 yUg/ml) foram misturados com 20^ul de BSA (1 mg/ml) e 40 ^ul de 2 x '.‘tampão Lal31ⁿ (CaOlj, 24 ml'; UgClg, 24 m-·; NaCl 0,4 1’, Tris/LÔl pH 8,0 40 ml.'.; ZDTA 2 mE) e aquecida a 30^0. Foram adicionadas 0,5 unidades de Bal31 e foram incubadas amostras durante 0, 1, 2, 3, 4 e 5 minutos. Foram então adicionadas 20 ^11 de água e 3 yUl de Tris/r.Cl 0,5 ?’ pH 7,5, ígtl^ 100 nt*, e as amoetras foram digeridas com 10 unidades de OstI (a qual corta a jusante do gene EN) durante 60 minutos. As amostras foram ensaiadas em gel de agarose para determinar a quantidade de ADN digerida e as amoetras de 0, 1 e 2 minutos foram escolhidas para posterior uso. As moléculas foram então renovadas, como descrito acima, com a polimerase 74 ADN e o fragmento de Klenow e cloaados para obtenção de p3C-S18 cortado ccm Smal. Vários isolados diferentes foram sequenciados na extremidade 5^r do gene ?”I e encontrou-se um no

qual apenas 49 das base maçando pela sequência minado pBZiNl (Ver Fig.

A fim de colocar o gene 7 sob o controlo do promotor W P7,5K. o gene .7 foi excisado a partir do pBCFl com EamiÍl e íindlll, renovado nas extremidades como se descreveu e clonour-ee dentro do sítio Smal do pGS2O (ilackett et al., ournal of ViroÍGgy 49, 857-8¼). 'ste plasmídio foi denominado pOSFl (Ver Fig. 11). Um plasmídio pEFLló (Fig. 12) foi construído por deserção do fra mento pvall do pUC19 dentro do sítio Spel do pn3'T (acima descrito). Este fragmento contém as sequências de codificação do alfa-péptido do 6-galactósido com um sítio do clonação múltipla arranjado de tal forma que, quando os fragmentos são clonados dentro deste sítio a translação da -galactosidase é interrompida e assim podem ser detectados r^corbinantes porque são colónias brancas cm placas contendo Xgal. (Este construto de pFFLIG é agora equivalente ao plasmídio de recombinação descrito no xemplo 1 e representado na Fig. 7). 0 gene F mais o promotor 7,5 foi excisado a partir de pCSFl usando Xbal e Ilhel, renovado nas extremidades como descrito, e clonados dentro ío sítio único Soai de p^Flõ. 0 plasmídio resultante (que agora possui o gene F, com o promotor 77,5 a jusante, colocado dentro da região não-essencial Spel do fragmento terminal do virus de varíola) é senominado p--772 (¾. 12).

Clonação do gene EN dentro do vector de recombinação

A fim de colocar o gene HN sob o controlo do promotor 77,5,

ele foi excisado a partir de ρΒΙΙΠΙ com SstI e Bam.-il, renovado como descrito e clonado no sítio Smal de pGS2O. Fste plasmfdio foi denomi.iado pGSJINl (Fig. 13). 0 gene HN mais o promotor P7,5 foram excisados a partir de pGSIPTl usando Sall e Asp718, renovado como descrito. Fste plasmídio foi denominado pF,?H3 (Ver Fig. 14).

D. Produção do recosbinante de FPV contendo o gene ?

A estirpe Poxine do virua da varíola de aves domésticas usadas foi gentilmente doada por Duphar. Foi passada três vezes por células fibroblásticas de embriões de galinhas CHFs em cultura de tecidos. Uma placa simples foi repicada neste estádio e foi purificada em placa três vezes. C virus assim obt do foi denominado Ρ χ 4·1· e foi desenvolvido em cultura de tecidos tal como foi descrito para a estirpe HP444 do ''xumplo 1.

Foi permitido que o plasmídio pEFE2 se recombina-se na estir pe px4.1 do FFV, como descrito no ^vxemplo 1. 0 virus das re combinações foram titulados nas C”F e então postos em placa em cápsulas de Petri de 10 cm a uma concentração de produção de virus de cerca de 1000 placas por cápsula. 0 virus foi recoberto com um meio de culturas de células em 1 % de gel de agarose de baixa temperatura· Depois de 4 a 5 dias, a camada de agarose foi removida e armaznada a 4^SC numa cápsula de Petri estéril. Um filtro de nitrocelulose seco foi colocado-por cima das células e comprimido para baixo com um círculo de papel de cromatografia Whatman 3W2í de 20 XSSC húmido. 0 filtro foi então levantado da placa, com as folhas de células e placas aderida a este, o papel 3KM foi removido e foi mantido a Õ02C sob vácuo durante 2 horas. Para identificar os virus re combinantes, os filtros foram então submetidos a um ensaio y · /J 50 ^~<*>*u* com amostras de radioetiquetagem específicas tanto para o gene F como para o gene EN. Os filtros foram expostos a uma película de raios-X e a posição das placas recombinantes identificados por alinhagem dos autorradiogramas com as cacadas de agarose armazenadas. 0 virus recombinante foi então isolado da camada de agarose por remoção de um rolhão de agarose usando uma pipeta de Pasteur. Esta amostra foi ressuspendida em solução de Tris 10 mM de pií 9,0, congelada-descongelada três vezes e novamente colocada em placa. Os virus recombinantes foram identificados novamente por ensaio e este processo foi repetido três vezes ao todo até que uma placa purificada de virus fosse obtida.

E. Produção do recombinante de PPV compreendendo o gene EN plasmídio pEFII3 foi permitido recombinaa>-se, como acima, descrito, dentro de virus 1IP440 purificado em placa (:IP 438 como descrito no Exemplo 1, mais duas outras passagens). Fste virus ' denominado PP9. Os virus recombinantes compreendendo gene HN foi isolado como descrito para o gene ?.

F. Expressão do gene F em cultura de tecidos

Os virus recombinantes e a estirpe parente equivalente como controlos, foram usados para infectar placas de Petri de 5 cm de CE? a aproximadamente 5 pfu/célula. Deixou-se desenvolver o virus durante vários tempos e então as células lisadas por adição de 500yul de amostra do tampão em ebulição (contendo Tris/TOl 24mL' pU 6,8, SDS 1 %, glicerol 20 f e azul de bromofenol 0,02 ?)· Para o EN recombinante foi também incluído neete tampão ditiotreitol. As células infectadas foram raspadas no mesmo tampão e as amostras fervidas durante 2 minutos, ar51

refecidas en golo e congeladas a -20⁹C. As amostras foram então carregadas em geles de proteína de poliacrilamida padrão e submetidas a electroforese para separar as proteínas e transferidas para os filtros de nitrocelilose por ensaio de mancha de Vestem. Os ensaios de mancha de estern foram efectuados (como descrito por A.C.R. Samson et al., Journal of C-eneral Virology 67, 1199-1203) com um anticorpo monoclonal específico para a proteína ? ou a proteína H.T não revelou qual quer proteína F produzida pelo recombinante. A proteína F produzida infectando CEF com NDV foi detectada por anticorpos monoclonais mas a um nível mais baixo de Híí e assim se a mesma taxa de proteína nativa para proteína recombinante conduz tanto a F como a HJí, o recombinante F deve não ser observado.

G. Protecção das aves contra amostra de rTDV

Galinhas vermelhas Rhode Island com a idade de 14 dias foram inoculadas por via intravenosa com 10° pfu/ave do gene recocbinante ? (4 aves) ou com uma espécie de virus da varíola FP9 não possuindo genes inseridos (õ aves). Seis aves foram deixadas sem qualquer inoculação. As dez aves não inoculadas com o recombinante são a partir daqui den.minadas como aves de controlo. Vinte e oito dias depois, a inoculação foi repetida. Sessenta e quatro dias depois as aves foram Inoculadas por via intramuscular com 10^ x ~LD^₀ (ELD = dose letal dos embriões) da espécie virulenta Rerts 33 do NDV. 'rês dias depois da inoculação, 4 das^aves controlo estavam mortas e b estavam muito doentes. Quatro dias depois da inoculação, 10 aveu das 12 aves de controlo estavam mortas. Podas as 4 aves inoculadas com F recombinante estavam normais.

Retirou-se soro das aves inoculadas com o F recombinante e das aves de controlo antes da inoculação com NDV. 0 exame deste soro por ensaio de mancha de Tiestern doe viriões de NDV

Agpurificados, mostrou que apenas o soro des aves inoculadas con o recombinante ? apresentava anticorpos à proteína 7. sim, apesar de não ser possível detectar proteína 7 na experiência in vitro, a experiência In vivo mostrou de maneira convincente que a protecção pode ser alcançada, e que a proteína 7 sob algaras formas pode ser produzida polo recombinante de F?V que contém o gene TTOV 'XE?ELO 4 ~ste exemplo demonstra a vacinação das aves de 1 dia de idade com o gene de O r / recombinante de 7PV.

Crupos de seis ou sete pintos de galinhas Rhode Tsland Red foram inoculadas, com um dia de idade, pelo método do tecido da asa com os dois gene NDV F / recombinante FPV poxina descrita no Exemplo 3, 8907374 ou a estirpe parente F7V poxina 7 x 4.1. Cada estirpe de virus foi inoculada em quatro grupos de aves, com εε doses de 5 x 10*, 5 x 10 , 5 x 10^z e 5 x 10^x pfu/ave. Assim, inocularam-se oito grupos ao todo, com um grupo adicional de aves não inoculadas,.As aves hão leram inoculadas com 1 dia de idade c tirou-se uma amostra intramuscular 26 dias depois, como no pedido de patente 8907374. A Tabela 1 mostra os resultados desta amostragem. As aves Inoculadas e de controlo não foram protegidas contra a amostragem, apresen tando-se todas as 38 aves mortas ao fim de 4 dias. As aves inoculadas ccm o virus da 'varíola de aves/recombinante NDV F foram protegidas a um grau Significativo, 22 aves das 28 sobreviveram à amostragem (79 %)· A dose da vacina usada pareceu apresentar um pequeno efeito sobre o nível de protecção, apesar de uma dose mais baixa apresentar melhor protecção.

ϊ A 3 Ξ L A __1

Dose do Uúmero total de aves mortas nos dias virus 3-5 após a exposição à estirpe 'TDV iierts 33

Inóculo		3 dias	4 dias	5 dias	6 dias
Recombi-	5xlO4	0/7	0/7	2/7	2/7
nante MDV P gene	5xlO3	0/7	0/7	2/7	2/7
^x4.1 ? PV
	5xlCr	1/7	1/7	2/7	2/7
	5x10	0/7	0/7	0/7	0/7
Px4.1 F?V só	5xl04	6/7	7/7
	5xlO3	3/6	6/6
	5xl02	5/6	6/6
	5x10	1/5	5/5
Não inocula-		4/7	7/7
das

EXSaPLO 5

Fste exemplo confirma os resultados obtidos no xemplo 3 (Secção G) para a vacinação de aves com um gene recombinante ?íDV F e mostra aue esta pode ser feito pelo uso do método do tecido da asa bem como a via intravenosa.

A técnica do Fxemplo 3 foi seguida, excepto de a inoculação de apoio ter sido feita aos 27 dias de idade da ave (em vez dc no 2b2 dia) e o ensaio realizou-se aos 42 dias de idade da ave (em vez de 64 dias depois do nascimento), a estirpe paren··

te da poxlna foi usada como controlo e -?xlstia 5 grupos de aves (2 inoculadas iv. 2 no tecidc da asa e 1 inoculada).

Os resultados da Tabela 2 mostram que as aves inoculadas corgene NDV F/recombinante P?V poxina sobreviveram, enquanto que todas as outras morreram

ΓΑΒΡΙΑ 2

Numero total de aves cortas no 3³., 4⁸, e

Inóculo Vétodo

14²., dias depois de exposição à estirpe

NDV Herts 33

g. dia

48. dia

14^g. dia

Recombinante NDV F gene/Px4.1 iv

FPV

1x4.1 FPV só iv

Recombinante NDV

F gene/?x4.1

FPV

Tecido da asa

Px4.1 FPV só Tecido da asa

Não inoculados

0/6

6/6

0/6

4/6

9/13

0/6 0/6

0/6 0/6

6/6

13/13

Este cxer.olo mostra que o gene NDV R'1/rcconibinante de ''V também origina protecção. Assim, a protecção pode ser obtida tanto a partir do gene 7 como do gene M, só.

Exemplo 5 foi repetido com a excepção de que o recombinante NDV HN/iíP 440 FPV como descrito no xemplo 3 (Secção E) foi U3adc com a estirpe EF 440 como controlo.

A Tabela 3 apresenta os resultados. aovamente, as aves vacinadas com N*)V foram protegidas enquanto todas as outras morreram.

TABELA 3

Inóculo Kétodo

Recombinante aDV

LIS gene/

F.P 440 F?Viv _'í? 440 sóiv

Xão inoculadonúmero total de aves mortas no 3². 4®. e 14®. dias depois de exposição à estirpe JFDV Derts 33

3®. dia 4®. dia 14®. dia

1/6

6/6

1/6 1/6

9/13

13/13

I

I

este xcmglo os vectores de recombinação

asando o gene Fcopgt, sendo os construtos de tipo goralmente semelhante aos descritos por C3IR0 na ;já citada /emória Descritiva Έ '0 88/02022, ma3 flanqueados por sequências de regiões não-essenciais da presente invenção em detrimento das sequências gene TK. Os vectores de recombinação compreendem por ordem:

(1) região não-essencial (por volta do sítio de BglII) (2) gene Ecogpt (3) promotor 7V P.5 (4) promotor VV ^pll (5) gene da proteína em cacho IBV (6) região não-essencial

Note-se que os dois promotores estão costas-coio-costas”, tal coco <5 apresentado na W0 88/02022, transcrevendo em sentidos opostas.

clone pEFL2 (contendo o promotor ?7,5 de vacina e o gene de β-galactosidase no fragmento terminal FPV, ver acima) foi cortado com as enzimas de restrição SphZ e Ncol, renovado como descrito e religado. 0 constrato resultante designado por ?E.^?L18, perdeu aproximadamente 850 pares de base da sequência ~PV, tal como era eaperado, mas perdeu também uma zona HindlII imediatamente adjacente à zona Sphl. Assim, este plasmídio contém somente dois sítios de HindiII, muito perto um do outro, entro o promotor F7»5 e o gene (S-galactosidase. (A digestão com HindiII assim apenas remove um fragmento mui-

. to pequeno e pode ser usada para inserção de fragmentos de genes contendo os seus próprios codões ATC- para produzir os cor;Struto3 de fusão de β-galactooidase). ^L'ste plasmídio foi cortado com .iindIII e Espl (Espl corta perto do extremo 3’ do gene de β-galactosidase) e renovado. Dentro deste sítio re-eo· parelhaào foi inserido um fragmento Apal/BglII (emparelhado) do plasmídio pSV2gpt (^ulligan .1 Berg, Science 209, 422-1427, 19SC) o qual compreendia o gene eccgpt de 3. coli. Assim, o gene de β-galatosidase foi removido e o gene Fcogpt foi colocado sob controlo do promotor P7.5. Um único sítio de Call a jusante do promotor permite a inserção de outros promotores ou de construtos de promotor/gene. ste plasmídio foi denominado pBFGP13.

último promotor Pll de vacina foi excisado de p..:l6 (que foi oferecido por Uichael Uackett) proporcionou sítios de clonação múltiplas (BamHI. Xhol. Xbal, e Sall) por transferêcia para pUC19 e o construto do sítio dc cloaação Pll resultante foi inserido no sítio de Sall do p_’.PG?I3. 0 plasmídio resultante foi designado pF.FGPTú e permite a inserção dos geneo em vários sítios de controlo do promotor Pll. Um gene de proteína era cacho do Vírus da Bronquite Infecciosa (ver Tútlicação do Pedido de /atente d.a Organização .. undial da Propriedade Industrial 72. wO 86/05805 apresentado por NRDO foi inserido a jusante do promotor.

heixou-se recombinar o plasmídio p^T'FG?T3 dentro da estirpe P?9 de PP9, como descrito acima. Os vírus recombir.antes foram seleccionados usando um meio de KKHAT contendo ácido micofenólico (Boyle à Couper, Gene 65, 123-129, 1988). Após a recon?binação inicial em presença do meio de UZHAT, o vírus foi libertado por congelamento-descongelamento e duas passagens sob condições selectivas. Observou-se um efeito citopático, indicando que o virus se desenvolveu sob condições selectivas. C virus foi então placado e ensaiado c r. uma amostra específica

para Bcopgpt. Uma elevada porção de placas (aproximadamente 75 foram positivas, indicando que a selecção foi bem sucedida (normalmente apenas 0,1 / do virus seria recombinante) e que por esta razão tinham sido isolados recombinantes cue expressam o gene Pcogpt.

xperiências de recombinação si: liares foram realizadas para incorporar o gene Bcogpt na estirpe Poxina de FPV. Após a recombinação e depois da passagem em condições selectivas, um efeito citopático do virus pode ser observado, indicando que foi produzido virus recombinante expressando o gene Pcogpt. Fsse facto confirma que a região não-essencial BglII (bem como a região Soai) está presente em Poxina.

1-·. - Processo para a preparação de um vector de recombinação para ser utilizado na produção de um virus de varíola (FPV) de aves domésticas recombinante mediante recombinação de DNA homólogo, de acordo com a qual (1) se introduz uma sequência de região não-essencial (NER) num vector de clonação N7R de (a) pelo menos, uma parte da sequência comprida única (1US) da repetição invertida terminal (TIR de FPV ou de (b) pelo menos, parte da região do genoma de PPV situada entre a extremidade carboxi do gene D7 e a extremidade carboxi do gene D9 (mas exceptuando o gene D10 e a região promotora do gene D10), e ee interrompe a N~R pela introdução de pelo menos (2) um ge··

ne estranho c, pelo menos, uma sequência para regular a expressão do gene estranho ou de cada gene estranho, caracterizado pelo facto de, como se.uência N2R, se utilizar a sequência I.TR de (a) pelo menos parte da sequência longa única (LUS da repetição invertida terminal (1ΊΗ de FPV, ou (b) pelo menos, uma parte da região genoma FPV situada entre a extremidade carboxi do gene D7 e a extremidade carboxi do gene D9 (mas exceptuando o gene D10 e da região promotora do gene D1C).

2^a. - Processo para a preparação de um vector de recombinação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se introduzir o gene estranho no sítio de clonação múltipla de um veòtor de clonação que contém pela seguinte ordem:

(1) uma primeira sequência de flanqueamento recombinável homologamente, (2) uma sequência dentro de uma primeira parte c!a região não-essencial, (3) I'NA promotor, (4) um sítio de clonação múltiplo a jusante do promotor.

(5) uma sequência dentro de uma segunda parte da mesma região não-essencial, em que a primeira e a segunda sequência estão na mesma orientação relativa que estão a primeira

segunda

tro do genoma do virus, e (6) uma segunda sequência de flanquearento, recombinável homologamente.

>

vector de .Ό

3^a.

recombinação caracterizado

Processo para a de acordo com completamente pelo facto de dentro da

LUS um preparação de as reivindicações se utilizar da

TIR.

ou

2, uma NER situada

4^a

Processo para recombinação de acordo pelo facto de a NER ficar pares de 2,2 LUS. 5^a - Processo com quilobases a de acordo com a NER ficar um vector de preparação de a reivindicação situada completamente dentro de partir da extremidade externa da

3, caracterizado para a preparação de um vector de recombinação a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de situada dentro de uma estrutura de leitura aberta (ORF) a qual é substancialmente uma das estruturas em 4125-4790, 5261--5629 ou 5883-6185, e que tem a sequencia de ácido nucleico identificada, ou uma sua variante de FPV.

numa outra classe

Processo para acordo a preparação de um com as reivindicações de a NER ficar situada a preparação de um que ocorre vector ou dentro de

2, do |7^a. - Processo para recombinante útil na preparação de um vector de recombinação ;^aracterizado pelo facto de se introduzir uma sequencia NER como se define nas vector de

Claims (3)

1. reivindicações 1, 3, sequencia de um recombinável homologamente em uma das em ambas as extremidades da referida iàe clonação.

   L000 bp de uma
2. 4, 5 ou 6 com ou sem flanco adicional, duas extremidades, ou sequencia, num vector

   Ó^a - Processo para a preparação de um ψ-aríola das aves domésticas, segundo o virus recombinante de qual se infectam célu las do animal in vitro com uma estirpe aparentada, infectante, do virus da varíola das aves domésticas, se introduz o DMA do vector de recombinação nas citadas células e se permite que se realize a recombinação homóloga, caracterizado pelo facto de se utilizar um vcctor de recombinação preparado por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
3. 9^?· - Processo para a vacinação de aves, de preferência, pintos a idade de um dia, contra o virus da varíola, caracterizado pelo facto de se administrar a cada animal a vacinar, por qualquer método apropriado (por exemplo, por meio de aerossol, da água de beber, por via oral, por injecção intramuscular ou por inoculação no rebordo da asa), uma dose de vírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, compreendi2 8 da entre 10 e 10 unidades de formação de placas (pfu), em

   4 8 especial, entre 10* e 10 pfu.

   Lisboa, 23 de Junho de 1989

   Américo da Silva Carvalho

   Açeot· Gficial dt Propriedad· Industrial

   R. Castilho, 201-3. E.-1000 LISBOA

   Telefs. 65 13 39-65 46 13 * / i^eecJo^O f tOJ5 ES^tJ/h ?jóOM0W |:^7j ÍZE&ifrl) NAO

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