CN1240480A - 运送和表达干扰素－α核酸的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了为治疗目的而对干扰素α进行组织特异性表达的方法和组合物。

Description

运送和表达干扰素-α核酸的 方法和组合物

                       发明背景

人干扰素α(IFN-α)是含有至少24个亚种的蛋白家族(Zoon，K.C，干扰素9：1(1987)，Gresser，I.编辑，学术出版社，纽约)。干扰素最初描述为在细胞中能够诱导抗病毒状态的药剂，但现在已知是影响免疫系统许多功能的多效性淋巴因子(Openakkev等，实验45：513(1989))。

INF-α已广泛地用以治疗目的，包括多毛细胞白血病、卡波济肉瘤、肾细胞癌、非何杰金淋巴瘤、T-细胞白血病、多发性和慢性骨髓白血病、恶性黑色素瘤、膀胱细胞癌、结肠癌(带有5-FU)、尖锐湿疣、鼻病毒以及作为乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、非甲非乙型病毒(NANB)、或肝炎δ病毒(HDV)感染的结果而发生的各种形式的慢性病毒性肝炎(Pestka AIDA研究&人反转录病毒8(5)：776-786(1992))。已发现IFN-α在治疗骨髓及外骨髓增殖疾病患者中对区核细胞增多病及控制血小板增多症是多度有效的(Talpaz等，国际医学年鉴99：789-792(1983)；Gisslinger等，柳叶刀i：634-637(1989)；Ganser等，血液70：1173-1179(1987))。

通过将治疗基因的表达靶向目的组织，基因治疗技术有潜力限定受治疗对象暴露给基因产物，如干扰素。然而在一般情况下，靶向目的组织的能力是基因治疗的主要挑战之一。作为干扰素基因靶向的例子，使用导管系统通过将此基因施用到血管壁伤口区域，WIPO专利申请公开号WO 93/15609说明了将干扰素基因传递给血管组织。在另一例子中，编码能酶解转换前体药物“自杀基因”的蛋白的腺病毒以及编码细胞因子的基因直接施用到实体肿瘤中。

将治疗基因靶向目的组织的其它方法包括三种总的类型，转导靶向、位置靶向以及转录靶向(评论，见例如Miller等，美国实验动物学会杂志9：190-199(1995))。转导靶向指主要通过受体配体的选择，选择性进入特异的细胞。基因组内位置靶向指整合进所想要的位点，例如染色质活性区域，或通过和内源核苷酸序列如靶基因进行同源重组。转录靶向指通过转录启动子的加入所获得的选择性表达，比转录启动子定向于目的细胞具有基因表达的高度特异调控。

组织特异启动子的例子包括肌酸激酶启动子，它已用于指导在肌肉和心脏组织中肌营养不良蛋白cDNA表达(Cox等，自然364：725-729(1993))；以及免疫球蛋白重链或轻链启动子，用于在B细胞中自杀基因的表达(Maxwell等，癌研究51：4299-4304(1991))。已表示了内皮细胞特异的调控区域的特征(Jahroudi等，分子细胞生物学14：999-1008，(1994))已经构建了双嗜性反转录病毒载体，它带有在白蛋白或甲胎蛋白启动子控制下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Huber等，美国国家科学院院刊88：8039-8043(199)以分别靶向肝谱系的细胞和肝细胞瘤细胞。可以在反转录病毒(Hartzoglou等，生物化学杂志265：17285-17293(1990)以及腺病毒载体(Friedman等，分子细胞生物学6：3791-3797(1986)中使用这些组织特异的启动子并仍保留它们组织的特异性。

这样，需要靶向α干扰素的表达以治疗肿瘤、肝炎和其它能用α干扰素治疗的状况。本发明说明此需要以及其它。

                          发明概述

本发明的一个方面是指供患者α干扰素多肽的表达，包括将载体导入患者的目的组织，此载体包含编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和具有目的组织特异性的启动子能可操作连接，其中多肽在目的组织中表达。

本发明的另一方面是提高在患者目的组织中干扰素α水平的方法，包括将载体导入目的组织，载体包含编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和具有目的组织特异性的启动子能可操作连接，其中干扰素α多肽在患者目的组织中表达。

本发明的另一方面是治疗对干扰素α有反应的癌症的方法，包括向癌组织施用载体，此载体包含编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和具有组织特异性的启动子能可操作连接，其中α干扰素多肽在组织中表达。

本发明的另一方面是治疗肝炎的方法，包括向患者肝中施用载体，此载体包含编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和具有肝脏特异性的启动子能可操作连接，其中干扰素α多肽在患者肝脏中表达。

本发明的另一方面是包含载体的组合物，此载体包含编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和具有目的组织特异性的启动子能可操作连接。

                     附图简述

图1是描述干扰素α抗人前列腺癌细胞增殖效应的图。

图2是描述虫荧光素酶活性的图，此虫荧光素酶活性作为由肝特异基因的启动子驱动的虫荧光素酶表达的测定。

                 具体实施方案的详述

本发明提供使用组织特异启动子来组织特异地表达IFN-α的方法。如此处所使用的术语IFN-α打算包括干扰素α、其删除、插入或置换变异体、生物活性片段以及等位基因形式的所有亚类。如此处所使用的“生物活性”是指由本领域已知技术所测量的抗病毒或抗增殖活性(见例如，Openakker等，上文；Mossman免疫学方法杂志65：55(1983))。几个研究小组已克隆并在大肠杆菌中表达了重组干扰素α(例如，Weissman等，科学209：1343-1349(1980)；Sreuli；等，科学209：1343-1347(1980)；Goeddel等，自然290：20-26(1981)；Henco等，分子生物学杂志185：227-260(1985))。尽管可以使用任何干扰素α，优选地，干扰素α是干扰素α2a或2b(见，例如，WO 91/18927)。

编码IFN-α多肽的核酸可以是DNA或RNA。术语“编码的核酸序列”是指能指导特异蛋白或肽表达的核酸。核酸序列包括能转录成RNA的DNA链序列以及翻译成蛋白的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及来源于全长蛋白的非全长序列。我们可进一步理解序列包括天然序列的简并密码子或可以导入以便在特异宿主细胞中提供密码子优先的序列。

术语“载体”指病毒表达系统、自主自我复制的环状DNA(质粒)，并包括表达和非表达质粒。在重组微生物或细胞培养物描述为带有“表达载体”的地方，这包括染色体外环状DNA以及整合进宿主染色体的DNA。在载体由宿主细胞维持的地方，载体通过细胞在有丝分裂过程中作为自主结构稳定复制，或者整合入宿主基因组内。载体含有位置和序列定向的多个遗传元件，即可操作地和其它必要的元件相连接。这样在编码IFN-α载体中的核酸可以转录，当需要时，可以在转染细胞中翻译。

如用在此处的术语“基因”意指编码多肽的核酸序列。此定义包括各种序列多态性、突变体和/或序列变异体。其中此改变不影响基因产物的功能。术语“基因”不仅包括编码序列，也包括调控区域如启动子、增强子和终止区域。术语进一步包括来自mRNA转录子剪接的所有内含子和其它DNA序列，以及产生于可选择的剪接位点的变异体。

术语“质粒”是指能在细胞内复制的自主环状DNA分子，并包括表达和非表达类型。在重组微生物或细胞培养物描述为带有“表达载体”的地方，这包括染色体外环状DNA分子以及整合进宿主染色体内的DNA。在载体由宿主细胞维持的地方，质粒或者由细胞在有丝分裂过程中作为自主结构稳定复制，或者整合进宿主基因组中。

术语“重组蛋白”或“重组合成的蛋白”是指使用非天然细胞所合成的肽或蛋白，此天然细胞没有能表达此蛋白的DNA内源拷贝。因为通过合适核酸序列的导入细胞已得到遗传改变，这些细胞能合成此蛋白。重组蛋白将不和一般伴随合成此蛋白的细胞的蛋白和其它亚细胞成份相伴。术语“蛋白”和“多肽”可以在此替换使用。

一般来说，在表达载体中提供IFN-α，此载体含有下列为功能表达而以合适距离顺序连接的元件：组织特异性启动子、转录起始位点，3′非翻译区、5′mRNA前导序列、编码α干扰素多肽的核酸序列和多聚腺苷酸信号。在表达载体中也可以包括帮助表达的增强子序列和其它序列。也可以包括附加的基因，例如编码药物抗性的基因，以允许选择或筛选重组载体的出现。这些附加的基因包括，例如编码新霉素抗性、多药抗性、胸苷激酶、β-半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和氯霉素乙酰转移酶的基因。

在本发明中、通过使用目的组织优选地使用的启动子和/或其它表达元件完成将IFN-α靶向特异的目的组织。已知组织特异启动子的例子包括肌酸激酶启动子，它已用于指导在肌肉和心脏组织中营养不良蛋白的cDNA的表达(Cox等，自然364：725-729(1993))；免疫球蛋白重链或轻链启动子，用于B细胞中基因的表达；白蛋白或甲胎蛋白启动子以分别靶向肝谱系的细胞和肝细胞瘤细胞。

对于肝脏的典型组织特异表达元件包括但不限于HMG-CoA还原酶启动子(Luskey，分子细胞生物学)7(5)：1881-1893(1987))；甾醇调控元件1(SRE-1；Smith等，生物化学杂志26514)：2306-2301(1990)；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子(Eisenberger等，分子细胞生物学12(3)：1396-1403(1992))；人C-反应性蛋白(CRP)启动子(Li等，生物化学杂志265(7)：4136-4142(1990))；人葡糖激酶启动子(Tanizawa等，分子内分泌学617)：1070-81(1992))；胆固醇7-α羟化酶(CYR-7)启动子(Lee等，生物化学杂志.269(20)：14681-(1994))；β-半乳糖苷酶α-2.6唾液酸基转移酶启动子(Svensson等，生物化学杂志265(34)：20863-8(1990))；胰岛素样生长因子连结蛋白(IGFBP-1)启动子(Babajko等，生物化学生物物理研究社196(1)：480-6(1993))；醛缩酶B启动子(Bingle等，生物化学杂志294(Pt2)：473-9(1993))；人转铁蛋白启动子(Mendelzon等，核酸研究18(19)：5717-21(1990))；胶原类型I启动子(Houglum等，临床研究杂志94(2)：808-14(1994))。

对于前列腺典型的组织特异表达元件包括但不限于前列腺酸磷酸酶(PAP)启动子(Banas等，Biochim.Biophys.Acta 1217(2)：188-94(1994))；前列腺分泌蛋白94(PSP 94)启动子(Nolet等，Biochim.Biophys.ACTA 1098(2)：247-9(1991))；前列腺特异性抗原复合物启动子(Casper等，类固醇生物化学分子生物学杂志47(1-6)：127-35(1993))；人腺血管舒缓素基因启动子(hgt-1)(Lilja等泌尿科学世界杂志11(4)：188-91(1993))。

对胃组织典型的组织特异表达元件包括但不限于人H⁺/K⁺ ATP酶α亚单位启动子(Tanura等、FEBS Letters 298：(2-3)：137-41(1992))。

对胰腺典型的组织特异表达元件包括但不限制于胰腺炎相关蛋白启动子(PAP)(Dusetti等，生物化学杂志268(19)：14470-5(1993))；弹性蛋白酶1转录增强子(Kyuse等，基因和发育7(5)：774-86(1993))；胰腺特异淀粉酶和弹性蛋白增强子启动子(Wu等，分子细胞生物学11(9)：4423-30(1991)；Keller等，基因和发育4(8)：1316-21(1990))；胰腺胆固醇酯酶基因启动子(Fontaine等，生物化学30(28)：7008-14(1991))。

对子宫内膜典型的组织特异表达元件包括但不限制于子宫球蛋白启动子(Helftenbein等，纽约学术科学年鉴622：69-79(1991))。

对肾上腺细胞典型的组织特异表达元件包括但不限于胆固醇侧链切割(SCC)启动子(Rice等，生物化学杂志265：11713-20(1990))。

对总的神经系统典型的组织特异表达元件包括但不限于γ-γ烯醇酶(神经元特异的烯醇酶，NES)启动子(Forss-Petter等，神经元5(2)：187-97(1990))。

对脑典型的组织特异表达元件包括但不限于神经纤维重链(NF-H)启动子(Schwartz等，生物化学杂志。269(18)：13444-50(1994))。

对淋巴细胞典型的组织特异表达元件包括但不限于CBL-1/粒酶B启动子(Hanson等，生物化学杂志266(36)：24433-8(1991)；末端脱氧转移酶(TdT)、λ5、V_preB和LCK(淋巴细胞特异的酪氨酸蛋白激酶p^561ck)启动子(Lo等，分子细胞生物学11(10)：5229-43(1991))；人CD2启动子和它的3′转录增强子(Lake等，欧洲分子生物学组织杂志9(10)：3129-36(1990))；和人NK和T细胞特异活化(NKG5)启动子(Houchins等，免疫遗传学37(2)：102-7(1993))。

对结肠典型的组织特异表达元件包括但不限制于pp^60c-src酪氨酸激酶启动子(Talamonti等，临床研究杂志91(1)：53-60(1993))；器官特异的新抗原(OSNs)、mw40KDa(p40)启动子(Ilantzis等，微生物免疫学37(2)：119-28(1993))；结肠特异的抗原-P启动子(Sharkey等肿瘤73(增刊3)864-77(1994))。

对乳腺细胞典型的组织特异表达元件包括但不限制于人α乳白蛋白启动子(Thean等，英国肿瘤杂志)61(5)：773-5(1990))。

其它在目的组织中有助于表达特异性的元件可以包括分泌前导序列、增强子、核定位信号、endosmolytic肽等等。优选地，这些元件来源于目的组织以有助于特异性。

发明的核酸序列核酸操作的技术，例如将编码多肽的核酸序列亚克隆进表达载体，标记探针、DNA杂交等等一般在Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，(1989)中得到说明，在此处作为参考引入。这个手册在此之后称作“Sambrook等”。

一旦分离并克隆了编码目的序列的DNA，我们可以在许多重组工程化细胞中表达编码的蛋白。预期本领域的那些技术在可得到的许多用于编码DNA表达的表达系统是熟知的。这儿并不试图详细说明已知的用于在真核细胞或原核细胞中表达蛋白的各种方法。

简要概括地说，通过将DNA或cDNA可操作地连接到启动子(它可以是组成性或诱导性的)上，接着整合进表达载体中，一般可以获得编码目的序列的天然或合成核酸的表达。载体在原核细胞或真核细胞中是适于复制和整合的。一般的表达载体包含对目的多核苷酸序列表达调控有用的转录和翻译终止子、超始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，需要构建表达质粒，它最低限度含有指导转录的强启动子、转录超始的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子。表达载体也可以含有遗传表达序列组合元件，它至少包含一个独立的终止子序列、允许质粒在真核细胞和原核细胞中都能复制的序列，即穿梭载体，以及对原核和真核系统的选择性标记。见Sambrook等。

通过许多种方法，本发明的构建物可以体内或体外导入目的组织。在本发明的实施方案中，载体通过象微注射、磷酸钙沉淀、脂质融合或Diolistics的方法导入细胞。在进一步的实施方案中，DNA直接由目的组织吸收。在其它实施方案中，构建物包装进入病毒载体系统以有利于导入细胞。

在本发明实施中有用的病毒载体系统包括腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、大鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒和反转录病毒例如劳斯肉瘤病毒和MOMLV。

一般情况下，本发明构建物插入这些载体中以允许用伴随的病毒DNA包装干扰素表达构建物、感染敏感的宿主细胞和表达干扰素-α基因。尤其有利的载体是由Mills等，人基因治疗5：1079-1088(1994)说明的腺病毒载体。

在本发明的另一实施方案中，本发明的重组IFN-α构建物通过DNA连接分子和细胞受体配体偶联以利于吸收(如包被窝的凹入和核内体的内化)(Wu等，生物化学杂志263：14621-14624(1988)；WO92/06180)。例如本发明的DNA构建物通过多聚赖氨酸分子连接到asialo-oromucocid它是肝细胞脱唾液酸糖蛋白受体的配体。

相似地，用于包装本发明构建物的病毒外壳通过对受体特异的受体配体或抗体的加入得到修饰，以允许受体-介导的细胞胞吞作用进入特异的细胞(如WO 93/20221、WO 93/14188；WO 94/06923)。在本发明的一些实施方案中。本发明的DNA构建物和病毒蛋白相连结，例如腺病毒颗粒，以有利于细胞胞吞作用(Curiel等，美国国家科学院院刊88：8850-8854(1991))。在其它实施方案中，本发明的分子偶联物可以包括微管抑制剂(WO/9406922)；合成肽模仿流感病毒血凝素(Plank等，生物化学杂志269：12918-12924(1994))；以及核定位信号例如SV40T抗原(WO 93/19768)。

如在此处所用的术语“治疗”是指为了将目的组织，尤其是一个或更多细胞表现出某些病理的组织暴露给α干扰素。将编码α-干扰素的核酸导入患者。这样，例如“癌”组织是指这样的组织，其中一个或多个细胞归类为癌的、恶性的、肿瘤的、癌前期的、转化的、或作腺瘤或癌、或对这些状态在本领域中通常使用的任何其它同义词。

如在此处所用的“非癌”细胞在本领域理解为从癌或癌细胞定义中排除出来的，可以包括正常细胞和表现某些病理状态如被病毒、细菌、寄生虫、或其它生物体感染的细胞、受可遗传状态影响使得它们比正常或野生型细胞较差的细胞、受某些推测的非感染疾病状态如糖尿病等等影响的细胞以及从这些压力下幸存的细胞。

能从IFN-α的施用受益的任何紊乱的治疗可以开始于紊乱的诊断前或状态诊断后任何时间。这样，例如具有癌变前期损伤或具有发展成某种类型癌的上升的可能性的患者可以用以用本发明的组合物治疗。相似的，暴露于病原体如乙型肝炎病毒的人在肝炎诊断之前可以用本发明的组合物治疗。此外，在疾病的大体状态改善之后可以治疗HBV可疑的病毒携带者或有可能变成病毒携带者的患者。

本发明的构建物对治疗各种癌、肝炎以及其它紊乱是有用的，在这些状态中IFN-α的施用以提高组织中IFN-α的水平是有益的，包括但不限制于溃疡结肠炎、鼻病毒、尖锐湿疣、喉乳头瘤炎；HIV感染、纤维变性、由于过量的IL-4和IgE合成的过敏性疾病、肉芽肿疾病例如Crohn′s疾病。尽管可以靶向任何组织，对于此组织可以确认某些组织特异的表达元件，例如启动子，但是特异的目的是组织特异的施用IFN-α以提高癌组织中如人前列腺癌和肝癌组织中IFN-α的水平。此外本发明的构建物可用以提高病理状态下组织中的IFN-α水平，其中非癌细胞在干扰素的合成中是缺乏的，即比健康细胞合成较少的干扰素，例如慢性乙型肝炎病毒携带者(Nouri-Aria等，肝脏学14(6)：1308-1311(1991))。在本发明某些实施方案中，重组构建物靶向邻近组织或细胞从在目的细胞群体提高干扰素α的局部浓度。

通过本领域已知的、从对哺乳类受治疗者，尤其是人，可接受的施用方式将本发明的组合物制剂化。在本发明某些实施方案中，本发明的组合物通过注射进入供应目的组织的血管直接进入组织。在本发明另一实施方案中，本发明的组合物可从“locoregionally”即膀胱内、损伤部内和/或局部地施用。在本发明其它实施方案中，本发明的组合物通入注射、吸入、栓剂经皮肤传递等等而全身施用。在本发明另一实施方案中，组合物通过导管或其它装置施用以允许进入远的目的组织，例如内部器官。本发明的组合物也可以在储存形式的装置、移植物、或有胶囊包裹的制剂中以允许缓慢或持久地释放组合物。

本发明提供施用的组合物，它包括溶解或悬浮于可接受载体中，优选水性载体中的本发明的组合物溶液。可以使用许多水性载体，例如水、缓冲水、0.8％的盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等等。这些组合物可以通过传统的、熟知的灭菌技术灭菌或者过滤灭菌。得到的溶液可以包装使用，如冻干的制备物在施用前和灭菌溶液联合，组合物可以含有接近生理状态所需的药物可接受辅助物质，例如pH值调节和缓冲剂、张力调节剂、增湿剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、油酸三乙醇胺等等。

本发明的组合物在药物制剂中的浓度可以变化很大，即通过重量从少于0.1％，通常在或至少2％左右至20％至50％，根据所选择施用的特定方式，主要通过液体体积、粘度等等来选择。

本发明的组合物也可以通过脂质体来施用。脂质体包括乳剂、泡沫、胶粒、不可溶单层、液态晶体、磷脂胶体溶液、片层等等。在这些制备物中，要传递的本发明组合物单独或和结合靶的分子如抗体联合、或和其它治疗或致免疫组合物联合掺入作为脂质体的一部分。这样用本发明所要组合物填充或修饰的脂质体可以系统传递或定向到目的组织，在此脂质体再传递选择的治疗/致免疫肽组合物。

本发明所使用的脂质体从标准小泡(Vesicle)形成脂中形成，它一般包括中性或带负电荷的磷脂和甾醇。例如胆固醇。脂的选择一般通过考虑如脂质体大小、在血流中酸不稳定性和稳定性来指导。可以得到许多制备脂质体的方法，如在Szoka etal生物物理和生物工程年度评论9：467(1980)、美国专利号4 235 871、4501728、4837028和5019369中所描述的，在此作为参考引入。

含有本发明组合物的脂质体悬浮液可以以某一剂量静脉内、局部、表面等施用，此剂量根据特别是施用的方式、要运送的本发明组合物、和要治疗的疾病状态而变化。

对固体组合物，可以使用传统的非毒性固体载体，它包括如药学级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、邻磺酰苯甲酰亚胺钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。对口服施用通过掺入通常使用的任何赋形剂如前面所列的那些载体，以及一般10-95％活性成份，即本发明一个或更多组合物，更优选25％-75％的浓度，形成药物可接受非毒性组合物。

对于气溶胶施用，和表面活性剂和推进剂一起以很好的分离形式优选地提供本发明组合物。本发明组合物的一般百分率是重量的0.01％至20％，优选1％至10％。表面活性剂必须，当然，是无毒的，优选地在推进剂中可溶解。这些药剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，例如具有脂肪多羟基醇或它的环酐的乙酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、(olesteric)、和油酸。也可以采用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂按重量可以占组合物的0.1％-20％，优选0.25％-5％。组合物的余量是常规推进剂。也可以包括如所描述的带有卵磷脂的载体以用于鼻内传递。

本发明的构建物通过本领域熟知的技术在储存型系统、胶囊包被的形式、或移植物中附加地运送。相似的，构建物可以通过泵运送到目的组织。

在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物可从体外施用到从患者体内取出的细胞或组织上，然后返回患者。体外施用基因治疗构建物的例子包括Arteaga等癌研空56(5)：1098-1103(1996)；Nalta等，美国国家科学院院刊93(6)：2414-9(1996)；Koc等，肿瘤讨论会23(1)：46-65(1996)；Raper等，外科学年鉴223(2)：116-26(1996)；Dalesandro等，J.Thorac.Cardi.Surg.11(2)：416-22(1996)；和Makarov等，美国国家科学院院刊93(1)402-6(1996)。

为了说明的目的包括下面的实施例，但不应该认为它们限制本发明。

                         实施例I对前腺腺癌细胞增殖有效的干扰素α

研究三个不同的前列腺癌细胞，LNCaP(依赖雄激素的，美国典型培养物保藏中心#CRL1740)、PC-3细胞(不依赖雄激素的，美国典型培养物保藏中心#CRL1435)、和DU-145(不依赖雄激素的，美国典型培养物保藏中心#HTB81)。这些细胞在下列培养基在5种不同的干扰素-α2b(Schering-Plough)浓度(10、10²、10³、10⁴、10⁵IU/ml)中生长72小时：PC-3在补加7％胎牛血清的Ham′s F12K培养基(GIBCO BRL)中培养；DU-145在补加10％胎牛血清的DMEM(GIBCO BRL)中培养；LnCap在补加5％胎牛血清的RPMI1640(GIBCO BRL)中培养。

通过MTT实验测量干扰素的抗增殖效应(Mossman免疫学方法杂志65：55(1983))。PC-3和DU-145细胞干扰素增长的浓度表现出一致的敏感性，在10⁴IU/ml达到平台期。雄激素敏感的LNCaP细胞对IFN无反应。两个对雄激素无反应的细胞之间，PC-3比UD-145细胞更敏感。数据总结在图1。实心块代表细胞系PC-3(不依赖雄激素的)；交叉线块代表细胞系DU-145(不依赖雄激素的)；斜线块代表LNCaP(依赖雄激素的)。II表达序列盒的构建

构建一表达载体，它具有在前列腺癌细胞中INF-α组织特异表达的前列腺特异抗原基因(PSA)的大约600bp基本启动子控制下的完整干扰素α2b(IFN-α2b)cDNA序列以及IFN-α2b的完整信号序列(Sreuli等，科学209：1343-1347(1980)；Goeddel等，自然290：20-26(1981)；Henco等，分子生物学杂志185：227-260(1985)。首先5′末端具有推定信号前导子的全长IFN-α2b cDNA克隆进哺乳类表达载体PCDNA3(Invitrogen)CMV启动子下游的HindII和EcoRI克隆位点以制造质粒DIFN。含有PSA启动子的PSA基因5′侧翼序列(BBRC 161：1151-1159(1989)；Genebank #M27274)插入载体，转换CMV启动子以制造质粒PSADIFN。III克隆肝特异基因的基本启动子

来自四个人肝特异基因，白蛋白(HAL)、α1-抗胰蛋白酶(HAT)、甲胎蛋白(AFP)、和羟甲基-戊二酰基CoA还原酶(HMG)的5′侧翼序列。包括基本启动子分别从ATCC 65731、ATCC 61597、ATCC 65735和ATCC 59567亚克隆进入pCRScript载体，以用于在肝细胞中干扰素基因的转移和组织特异表达(Luskey等，分子细胞生物学7(5)：1881-1893(1987)；Minghetti等，生物化学杂志261(15)：6747-6757(1986)；Long et al，生物化学23：4828-4837(1984))；Gibbs，生物化学26：1332-1343(1987))。

在含有上述肝特异酶基因的5′侧翼序列的pCRScript载体中制定插入子的限制性酶图谱后，插入子放置于来自pCRScript载体的报告质粒pGL3(Promega)中虫荧光素酶基因的下游。用这四个构建以及对照质粒pGLL(PROMEGA Corp)通过电穿孔转染中国仓鼠卵巢(CHO-K1，美国典型培养物保藏中W.#CCL-61)、人肝癌(HepG2，美国典型培养物保藏中心#NB8065)和人肝癌(Hep3B美国典型培养物保藏中心#HB8064)细胞。pGLC含有SV40启动子和SV40增强子控制下的虫荧光素酶基因。

在转染细胞中通过四个肝特异启动子序列的虫荧光素的表达和对照质粒pGLC及载体pGL3相比较。数据总结于图2中(未显示HAL的结果)。通过具有所显示的突出特征的DNA构建于转染三种细胞类型。实心块代表人肝癌HepG2细胞；交叉线块代表中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；斜线块代表人肝癌Hep3B细胞(Hep3B)。pGLB是阴性对照质粒；pGLC是阳性对照质粒；HAT表示α1-抗胰蛋白酶启动子；HMG表示粉羟甲基-戊二酰基CoA还原酶启动子；AFP表示人甲胎蛋白启动子。在四个组织特异启动子中，在这些条件下人-抗胰蛋白酶(HAT)启动子好象是肝特异表达的最佳候选者。

通过构建具有肝特异增强子序列如人α-胎蛋白增强子(Watanabe等，生物化学杂志262(10)：4812-4818(1987)，Genebank #Jo2693)、人白蛋白增强子(Hayashi等，生物化学杂志267(21)：14580-14585(1992)，Genebank #M92816)、人α-1微球蛋白bikunin增强子(Rouet等，生物化学杂志267(29)：20765-20773(1992)，Genebank#X67082)、或肝炎B增强子(Valenzuela等，动物病毒遗传学编辑，BBiels等，p.p.57-70，学术出版社，纽约(1981)；Galibert等，自然281：646-650(1979))的表达载体进一步优化HAT启动子驱动的表达。

尽管为了清晰理解的目的通过图解和实施例的方法以某种详尽的程度说明上述发明，很明显地附属权利要求书的范围内可以进行某些发展和修改。

在此所提及的所有文献为了所有的目的作为一个整体引入。

Claims (13)

1.包括一种载体的组合物，所述载体含有编码干扰素α多肽的核酸区段，此核酸区段和目的组织特异启动子可操作性地连接。

2.权利要求1的组合物，其中所述载体是病毒性的。

3.权利要求2的组合物，其中病毒性载体是腺病毒。

4.权利要求3的组合物，其中启动子是肝特异性启动子。

5.权利要求4的组合物，其中启动子是前列腺特异性启动子。

6.权利要求4或5的组合物，进一步包含和编码干扰素α多肽的核酸可操作性的连接的干扰素α分泌前导序列。

7.包含权利要求1至6中任一项的组合物的药物制剂。

8.向组织提供干扰素α多肽的方法，包括向目的组织导入载体，此载体包括编码干扰素α多肽的核酸区段，所述核酸区段可以和具有目的组织特异性的启动子可操作连接，其中干扰素α多肽在患者目的组织中表达。

9.权利要求8的方法，其中干扰素α是干扰素α2b。

10.权利要求9的方法，其中病毒性载体是腺病毒载体。

11.权利要求10的方法，其中启动子是肝特异性启动子。

12.权利要求10的方法，其中启动子是前列腺特异性启动子。

13.权利要求11或12的方法，其中编码干扰素α的核酸区段和编码干扰素α分泌前导肽的核酸可操作性地连接。