JP2018108110A - 改良されたワクチンおよびそれを使用するための方法 - Google Patents

改良されたワクチンおよびそれを使用するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】改良されたワクチンおよびそれを使用するための方法の提供。【解決手段】改良された抗ＨＩＶ免疫原と、それらをコードする核酸分子が開示される。開示される免疫原には、ＨＩＶサブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列を有しているもの、ＨＩＶサブタイプＢエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列を有しているもの、ＨＩＶサブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列を有しているもの、ＨＩＶサブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列を有しているもの、ＨＩＶサブタイプＢコンセンサスＮｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列を有しているもの、ならびに、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス配列を有しているものが含まれる。【選択図】なし

Description

本発明は、改良されたＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、およびガンワクチン、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、およびガンに対する免疫応答を誘導するための改良された方法、ならびに、それらに対して個体を予防的および／または治療的に免疫化するための方法に関する。
ＨＩＶゲノムは、突然変異率が高く、そして機能的補償も高いために、非常に柔軟性が高い。この高い突然変異率は、少なくとも２つの機構：ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）の低い忠実性（これにより、１回の複製サイクルあたり少なくとも１つの突然変異が生じる）、および抗レトロウイルス細胞因子ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ遺伝子とウイルス感染因子Ｖｉｆアクセサリー遺伝子の二重効果によって駆動される。それぞれの可能性のある突然変異、および多くの二重変異を有しているゲノムが、それぞれの複製サイクルの間に作成され、とてつもない数の抗原多様性が生じる。したがって、個々の単離物から導かれた候補のワクチンは、出回っている多様なＨＩＶウイルスから防御するための十分な交差反応性を誘発することができない場合があると主張されている。最近の実験では、コンセンサスな免疫原（非特許文献１；非特許文献２）または祖先型の免疫原（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）がこれに関して有用である可能性があることが示唆されている。しかし、これらのアプローチの最初の実験では、これらの免疫原によって誘導された細胞性免疫の促進は比較的軽微であることを示していた。
最近、Ｄｅｒｄｅｙｎらは、８人のアフリカ人異性愛者の感染ペアにおいてＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ糖タンパク質の配列を分析し、より短いＶｌ、Ｖ２、およびＶ４の長さと、より少ないグリカンが、初期感染者（ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ）から得られた配列が共有している共通の特徴であることを発見した（Ｄｅｒｄｅｙｎ，Ｃ．Ａ．ら、２００４．Ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ ａｆｔｅｒ ｈｅｔｅｒｏｓｅｘｕａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：２０１９−２０２２．）。このデータは、そのようなウイルスを模倣する抗原が、感染速度の早いウイルス（ｅａｒｌｙ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）と関連性がある可能性があることを示唆している。しかし、そのような感染速度の早い構造は、全てのサブタイプについて観察されているわけではない（Ｃｈｏｈａｎ，Ｂ．ら、２００５．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔｅｒ Ｖ１−Ｖ２ ｌｏｏｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｍａｙ ｉｍｐａｃｔ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６５２８−６５３１）。しかし、より短いＶループをエンベロープ免疫原の中に組み込むことには、他の利点、例えば、可溶性ＣＤ４に対する感度の増強（Ｐｉｃｋｏｒａ，Ｃ．ら、２００５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｏｓｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１２５７５−１２５８３）がある可能性があり、考慮されるべきである。
複数の実験により、急性感染および無症候感染の間のウイルス量の制御、ならびに、ＡＩＤＳの発症におけるＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ応答の重要性が示された。しかし、現在のエンベロープをベースとするＤＮＡワクチンが、必要に応じた効果があるかどうかは明らかではない。ＨＩＶ−１免疫原の発現レベルを増大させるためには、例えば、コドン最適化（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、１９９８，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐｌ２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．ら、Ａ．２００１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９１−１１００１）、ＲＮＡの最適化（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ら、２００３．Ｎｏｖｅｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ−１ Ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ Ｃｌａｄｅ−Ａ ｇｐ１６０ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｔｒｏｎｇ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４：１３４−４６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．，Ｍ．ら、１９９７．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｌｌｏｗｓ Ｒｅｖ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇａｇ ａｎｄ Ｇａｇ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１：４８９２−４９０３）、および弱いＲＮＡ二次構造を有している免疫グロブリンリーダー配列の付加（Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ら、２００１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ Ｔｈ１−Ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｓｏｌａｔｅ（ＷＮＶ−ＮＹ１９９９）．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：８０９−８１６）のようないくつかの方法が使用されている。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、環状のｄｓＤＮＡゲノム（７，０００〜８，０００塩基対）を有する。最大２００までの様々な遺伝子型が存在する。系統発生的には、ＨＰＶは高度に保存されている。粘膜のＨＰＶは、「高リスク（Ｈｉｇｈ Ｒｉｓｋ）」または「低リスク（Ｌｏｗ Ｒｉｓｋ）」と分類される。低リスクのグループには、タイプ６、１１、４２などが含まれる。関連する疾患としては、生殖器疣；低悪性度の頸部、肛門、外陰部、膣の形成異常；および反復呼吸器乳頭腫症が挙げられる。高リスクのグループには、タイプ１６、１８、３１、３３、４５、５２、５８などが含まれる。関連する疾患としては、子宮頸ガン、前ガン性形成異常の本質的な原因、肛門、外陰部、膣、へんとうのガンの主原因；ならびに、他の気道・消化器のガンの共同因子が挙げられる。毎日、８００人の女性が子宮頸ガンで死亡している。
ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は腫瘍特異的抗原であり、腫瘍形成と腫瘍状態の維持に必要である。子宮頸ガンの患者には、Ｅ７特異的免疫応答が欠失している。Ｅ６およびＥ７タンパク質はいずれも、細胞性のヒト腫瘍サプレッサー遺伝子の産物と、Ｅ６はｐ５３と、そしてＥ７はＲｂ（網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサー遺伝子）と特異的に相互作用する。Ｅ６およびＥ７は、理想的な免疫治療の標的である。
ｈＴＥＲＴはヒトテロメラーゼ逆転写酵素であり、これは、テロメラーゼの末端上にＴＴＡＧＧＧタグを合成して、染色体が短くなることが原因である細胞死を防ぐ。胚細胞およびいくつかの生殖系列の細胞は、通常はｈＴＥＲＴを発現し、細胞集団の恒常性を調節する。しかし、ガン細胞は、この調節機構を、細胞集団の恒常性を崩壊させるために利用する。例えば、ｈＴＥＲＴの過剰発現は、ヒトのガン細胞の８５％より多くにおいて起こる。したがって、ｈＴＥＲＴは、理想的な免疫治療の標的である。
ｈＴＥＲＴはまた、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染が原因でｈＴＥＲＴを発現している過剰に増殖している細胞に対する免疫療法を促進する可能性もある。高リスクのＨＰＶタイプに由来するＥ６ガンタンパク質は、ヒトのケラチン生成細胞の中でヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の転写を活性化させる。肝臓の中の形成異常の病変および初期新生物の病変もまた、異常に高いレベルでｈＴＥＲＴを発現する。したがって、ＨＰＶおよびＨＣＶに対する免疫療法は、異常なレベルでｈＴＥＲＴを発現する細胞を標的化することによって増強できる場合がある。ｈＴＥＲＴと、ＨＰＶもしくはＨＣＶタンパク質またはそのようなタンパク質をコードする核酸の両方を使用する併用免疫療法は、魅力的な免疫療法である。
インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス粒子の表面上で発現され、ウイルスと宿主細胞との間での最初の接触を担っている。ＨＡは、周知の免疫原である。インフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ５、トリインフルエンザ株（特に、そのＨＡタンパク質が原因でヒト集団を脅かすもの）は、自然な突然変異によってわずかに遺伝的に混ぜ合わされば、他のウイルス株と比較して、ヒト細胞に対して大幅に高い感染性を有することになる。乳幼児および高齢者、または免疫障害を持つ成人のヒトのウイルスＨ１Ｎ５株への感染は、多くの場合に、残念な臨床的結果と関係する。したがって、ＨＡおよびインフルエンザのＨ１Ｎ５株の他のインフルエンザ分子は、理想的な免疫療法の標的である。
Ｇａｏ．Ｆ．ら、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｒｏｕｐ ｍ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００５）７９：１１５４−６３ Ｓｃｒｉｂａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ−ｉｎａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｔａｔ，Ｒｅｖ ａｎｄ Ｎｅｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｃ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ（２００５）２３：１１５８−６９ Ｄｏｒｉａ−Ｒｏｓｅ，Ｎ．Ａ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｔｈｏｓｅ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００５）７９：１１２１４−１１２２４ Ｇａｏ，Ｆ．ら、Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ＨＩＶ−１ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００４）３：Ｓ１６１−Ｓ１６８ Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｉ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｆｏｕｒｔｈ ｔｉｅｒ ｏｆ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００４）３：Ｓ１５１−Ｓ１５９ Ｎｉｃｋｌｅ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｎｄ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｔａｔｅ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）２９９：１５１５−１５１７
要旨
本発明は、それに対して抗ＨＩＶ免疫応答を生じさせることができる改良された免疫原性標的を提供する核酸構築物、およびそれによってコードされるタンパク質に関する。
本発明によっては、ＨＩＶサブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列、ＨＩＶサブタイプＢエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列、ＨＩＶサブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列、ＨＩＶサブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列、ＨＩＶサブタイプＢコンセンサスＮｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列、ならびに、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス配列が提供される。
本発明により、そのようなタンパク質配列をコードする構築物、そのようなタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチン、ならびに、抗ＨＩＶ免疫応答を誘導する方法が提供される。
本発明は、配列番号１；配列番号１の断片；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３；配列番号３の断片；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号５；配列番号５の断片；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号７；配列番号７の断片；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号９；配列番号９の断片；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１１；配列番号１１の断片；配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
本発明は、配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０、および配列番号２１からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸分子に関する。
本発明は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明によってはさらに、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を個体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはさらに、そのような核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを個体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはさらに、そのような核酸分子が含まれている弱毒化させた病原体、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのような弱毒化させた病原体、生の弱毒化させた病原体を、個体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはさらに、配列番号２；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号６；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号６の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号８；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号８の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１０；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１０の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１２；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１２の断片；および配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質が提供される。
本発明によってはさらに、配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０、および配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質が提供される。
本発明によってはさらに、そのようなタンパク質が含まれている薬学的組成物、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのようなタンパク質が含まれている組成物を個体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはさらに、そのようなタンパク質が含まれている組み換え体ワクチン、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを個体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはさらに、そのようなタンパク質が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法におけるそれらの使用が提供される。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を個体に投与する工程が含まれる。
コンセンサスなＨＰＶ遺伝子型１６ のＥ６−Ｅ７アミノ酸配列を含むタンパク質、およびそのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている核酸分子が提供される。
本発明は、配列番号２２；その断片：配列番号２２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はまた、配列番号２３をコードする核酸配列；配列番号２４をコードする核酸配列；配列番号２５をコードする核酸配列；配列番号２６をコードする核酸配列；および配列番号２７をコードする核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子にも関する。
本発明はまた、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、配列番号２３、その断片；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子にも関する。
本発明はまた、配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；および配列番号２７からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質にも関する。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている薬学的組成物、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのようなタンパク質が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている組換え体ワクチン、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
コンセンサスＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂのＥｌ−Ｅ２アミノ酸配列が含まれているタンパク質、ならびに、そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている核酸分子が提供される。
本発明は、配列番号３０；その断片；配列番号３０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はまた、配列番号３１をコードする核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子にも関する。
本発明はまた、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を、上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、配列番号３１；その断片；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子にも関する。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている薬学的組成物、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのようなタンパク質が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている組換え体ワクチン、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
コンセンサスｈＴＥＲＴアミノ酸配列が含まれているタンパク質、およびそのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている核酸分子が提供される。
本発明はさらに、配列番号３４；その断片；配列番号３４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はまた、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を、上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、配列番号３５；その断片；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子にも関する。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている薬学的組成物、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのようなタンパク質が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている組換え体ワクチン、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびｈＴＥＲＴを発現している過剰増殖性の細胞に対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
インフルエンザＨ５Ｎ１コンセンサスＨＡアミノ酸配列、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１コンセンサスＮＡアミノ酸配列、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１コンセンサスＭ１アミノ酸配列、ならびに、インフルエンザＨ５Ｎ１コンセンサスＭ２Ｅ−ＮＰアミノ酸配列が含まれているタンパク質と、そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている核酸分子が提供される。
本発明はさらに、配列番号３６；その断片；配列番号３６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はさらに、配列番号３８；その断片；配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はさらに、配列番号４０；その断片；配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はさらに、配列番号４２；その断片；配列番号４２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子に関する。
本発明はまた、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を、上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのような核酸分子が含まれている薬学的組成物、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのような核酸分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている組換え体ワクチン、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのような核酸分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、ならびに、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、配列番号３７；その断片；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質分子に関する。
本発明はさらに、配列番号３９；その断片；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質分子に関する。
本発明はさらに、配列番号４１；その断片；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質分子に関する。
本発明はさらに、配列番号４３；その断片；配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているヌクレオチド配列；およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質分子に関する。
本発明はまた、そのようなタンパク質分子が含まれている薬学的組成物、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのようなタンパク質分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのようなタンパク質分子が含まれている組み換え体ワクチン、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのようなタンパク質分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を、上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はまた、そのようなタンパク質分子が含まれている薬学的組成物、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法にも関する。この方法には、そのようなタンパク質分子が含まれている組成物を上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのようなタンパク質分子が含まれている組換え体ワクチン、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような組み換え体ワクチンを上記個体に投与する工程が含まれる。
本発明はさらに、そのようなタンパク質分子が含まれている生の弱毒化させた病原体、およびインフルエンザウイルスに対して個体において免疫応答を誘導する方法に関する。この方法には、そのような生の弱毒化させた病原体を上記個体に投与する工程が含まれる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子：配列番号１；配列番号１の断片；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３；配列番号３の断片；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号５；配列番号５の断片；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号７；配列番号７の断片；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号９；配列番号９の断片；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１１；配列番号１１の断片；配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号２２；配列番号２２の断片；配列番号２２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３０；配列番号３０の断片；配列番号３０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３４；配列番号３４の断片；配列番号３４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３６；配列番号３６の断片；配列番号３６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３８；配列番号３８の断片；配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４０；配列番号４０の断片；配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４２；配列番号４２の断片；配列番号４２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号４２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目２）
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０および配列番号４２からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０および配列番号４２からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の相同性を有している配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０および配列番号４２からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９８％の相同性を有している配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０および配列番号４２からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の相同性を有している配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子。
（項目７）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている核酸分子：配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２３をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３１をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３５をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３７をコードするヌクレオチド配列；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３７をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３９をコードするヌクレオチド配列；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３９をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４１をコードするヌクレオチド配列；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４１をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４３をコードするヌクレオチド配列；配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４３をコードするヌクレオチド配列の断片；および、配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目８）
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子。
（項目９）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子：配列番号１；配列番号１の断片；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３；配列番号３の断片；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号５；配列番号５の断片；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号７；配列番号７の断片；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号９；配列番号９の断片；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１１；配列番号１１の断片；配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号１１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目１０）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子：配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１２をコードするヌクレオチド配列の断片；および、配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１１）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子：配列番号２２；配列番号２２の断片；配列番号２２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号２２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目１２）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子：配列番号２３をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１３）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子：配列番号３０；配列番号３０の断片；配列番号３０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号３０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目１４）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子：配列番号３１をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、配列番号３１をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１５）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子：配列番号３４；配列番号３４の断片；配列番号３４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号３４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目１６）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子：配列番号３５をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、配列番号３５をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１７）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目１に記載の核酸分子：配列番号３６；配列番号３６の断片；配列番号３６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号３６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３８；配列番号３８の断片；配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４０；配列番号４０の断片；配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４２；配列番号４２の断片；配列番号４２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；および、配列番号４２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目１８）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列が含まれている、項目７に記載の核酸分子：配列番号３７をコードするヌクレオチド配列；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３７をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３９をコードするヌクレオチド配列；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号３９をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４１をコードするヌクレオチド配列；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号４１をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４３をコードするヌクレオチド配列；配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、配列番号４３をコードするヌクレオチド配列の断片；および、配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１９）
前記分子がプラスミドである、項目１から１８のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２０）
項目１から１９のいずれかに記載の核酸分子が含まれている薬学的組成物。
（項目２１）
項目１から１９のいずれかに記載の核酸分子が含まれている注射可能な薬学的組成物。
（項目２２）
項目１〜１８のいずれかに記載の核酸分子が含まれている組み換え体ワクチン。
（項目２３）
前記組み換え体ワクチンが組み換え体ワクシニアワクチンである、項目２２に記載の組み換え体ワクチン。
（項目２４）
項目１から１８のいずれかに記載の核酸分子が含まれている生の弱毒化病原体。
（項目２５）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれているタンパク質：配列番号２；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号６；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号６の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号８；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号８の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１０；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１０の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１２；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１２の断片；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号２３；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２３の断片；配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３１；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３１の断片；配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３５；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３５の断片；配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３７；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３７の断片；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３９；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３９の断片；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４１；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４１の断片；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４３；配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４３の断片；および、配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目２６）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目２７）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の相同性を有している配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目２８）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の相同性を有している配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目２９）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の相同性を有している配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目３０）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質：配列番号２；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２の断片；配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号の断片；配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号６；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号６の断片；配列番号６に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号８；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号８の断片；配列番号８に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１０；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１０の断片；配列番号１０に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号１２；配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号１２の断片；および、配列番号１２に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目３１）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目３０に記載のタンパク質：配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；および配列番号２１。
（項目３２）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質：配列番号２３、配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号２３の断片；および、配列番号２３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目３３）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目３２に記載のタンパク質：配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；および配列番号２７。
（項目３４）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質：配列番号３１、配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３１の断片；および、配列番号３１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目３５）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目３４に記載のタンパク質：配列番号３１；配列番号３２；および配列番号３３。
（項目３６）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質：配列番号３５、配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３５の断片；および、配列番号３５に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目３７）
アミノ酸配列である配列番号３５が含まれている、項目３４に記載のタンパク質。
（項目３８）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目２５に記載のタンパク質：配列番号３７；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３７の断片；配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号３９；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号３９の断片；配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４１；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４１の断片；配列番号４１に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片；配列番号４３；配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列；配列番号４３の断片；および、配列番号４３に対して少なくとも９０％の相同性を有している配列の断片。
（項目３９）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれている、項目３８に記載のタンパク質：配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；および配列番号４３。
（項目４０）
項目２５から３９のいずれかに記載のタンパク質が含まれている薬学的組成物。
（項目４１）
項目２５から３９のいずれかに記載のタンパク質が含まれている注射可能な薬学的組成物。
（項目４２）
項目２５から３９のいずれかに記載のタンパク質が含まれている組み換え体ワクチン。
（項目４３）
前記組み換え体ワクチンが組み換え体ワクシニアワクチンである、項目４２に記載の組み換え体ワクチン。
（項目４４）
項目２５から３９のいずれかに記載のタンパク質が含まれている生の弱毒化病原体。
（項目４５）
ＨＩＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法であって、項目９または１０に記載の核酸分子、あるいは項目３０または３１に記載のタンパク質が含まれている組成物を該個体に投与する工程が含まれる、方法。
（項目４６）
ＨＰＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法であって、項目１１または１２に記載の核酸分子、あるいは項目３２または３３に記載のタンパク質が含まれている組成物を該個体に投与する工程が含まれる、方法。
（項目４７）
ＨＣＶに対して個体において免疫応答を誘導する方法であって、項目１３または１４に記載の核酸分子、あるいは項目３４または３５に記載のタンパク質が含まれている組成物を該個体に投与する工程が含まれる、方法。
（項目４８）
ｈＴＥＲＴに対して個体において免疫応答を誘導する方法であって、項目１５または１６に記載の核酸分子、あるいは項目３６または３７に記載のタンパク質が含まれている組成物を該個体に投与する工程が含まれる、方法。
（項目４９）
インフルエンザに対して個体において免疫応答を誘導する方法であって、項目１７または１８に記載の核酸分子、あるいは項目３８または３９に記載のタンパク質が含まれている組成物を該個体に投与する工程が含まれる、方法。
図１は、ＥＹ２Ｅ１−ＢおよびＥＫ２Ｐ−Ｂのアミノ酸配列の比較を示す。ＩｇＥリーダー配列に下線を付けた。四角で囲んだ領域は可変領域を示す。＊は、ＣＣＲ５の利用に関係している６個の重要な残基を示す。切断部位は矢印によって示される。膜貫通ドメインは点線で示した。 図２は、２つのＨＩＶ−１サブタプＢエンベロープ配列の系統発生学的関係を示す。４２個のＨＩＶ−１サブタイプＢエンベロープ配列、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ、ＥＫ２Ｐ−Ｂ、２つのサブタイプＤ、および２つのサブタイプＣの配列（外集団）を、系統発生学的分析に含めた。幅広い試料多様性を示すサブタイプＢエンベロープ配列は、以下の１１の国に由来するものであった：アルゼンチン（１）；オーストラリア（６）；中国（１）；フランス（４）；ドイツ（１）；イギリス（２）；イタリア（１）；日本（１）；オランダ（４）；スペイン（１）；アメリカ合衆国（２０）。ＥＹ２Ｅ１−ＢおよびＥＫ２Ｐ−Ｂ配列を黒色の箱の中に示した。 図３は、エンベロープ免疫原の発現を示す。パネルＡは、ＥＹ２Ｅ１−ＢおよびＥＫ２Ｐ−Ｂ遺伝子のウェスタンブロット分析による結果を示す。ＲＤ細胞を様々なプラスミドでトランスフェクトした。４８時間後に、細胞溶解物を回収した。試料をウェスタンブロットによって分析し、ＨＩＶ−１ ｇｐｌ２０モノクローナル（２Ｇ１２）でプローブした。対照のロードに関しては、ブロットを細片とし、モノクローナル抗アクチン抗体で再度プローブした。パネルＢは、ＥＹ２Ｅ１−ＢおよびＥＫ２Ｐ−Ｂ遺伝子の免疫蛍光アッセイによる結果を示す。エンベロープタンパク質を発現しているトランスフェクトしたＲＤ細胞は、象徴的な赤色の蛍光を示した。ＨＩＶ−１エンベロープ特異的モノクローナル抗体Ｆ１０５を、一次抗体の供給源とした。 図４は、免疫化したマウスの血清の中での全ＩｇＧ抗体力価を示す。パネルＡは、サブタイプＢエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。パネルＢは、サブタイプＡ／Ｅエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。パネルＣは、サブタイプＣエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。ＤＮＡ構築物ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでの免疫化後の体液性免疫応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出した。それぞれのマウスを粘膜内に３回、それぞれ１００μｇのＤＮＡで、１週間に２回の間隔で免疫化した。それぞれのグループに由来するマウス（ｎ＝３）を、３回目の免疫化の１週間後に採血し、等量ずつプールした血清をブロック緩衝液中に希釈し、材料および方法に記載したとおりに分析した。ｐＶＡＸで免疫化したマウスから回収したプールした血清を対照として使用した。吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。個々のデータ点は、１つのグループあたり３匹のマウスの血清による３つのＯＤ値の平均を示し、値は、３回の別々のアッセイにおいて得られたＥＬＩＳＡの平均を示す。 図４は、免疫化したマウスの血清の中での全ＩｇＧ抗体力価を示す。パネルＡは、サブタイプＢエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。パネルＢは、サブタイプＡ／Ｅエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。パネルＣは、サブタイプＣエンベロープ特異的抗体応答の測定を示す。ＤＮＡ構築物ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでの免疫化後の体液性免疫応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出した。それぞれのマウスを粘膜内に３回、それぞれ１００μｇのＤＮＡで、１週間に２回の間隔で免疫化した。それぞれのグループに由来するマウス（ｎ＝３）を、３回目の免疫化の１週間後に採血し、等量ずつプールした血清をブロック緩衝液中に希釈し、材料および方法に記載したとおりに分析した。ｐＶＡＸで免疫化したマウスから回収したプールした血清を対照として使用した。吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。個々のデータ点は、１つのグループあたり３匹のマウスの血清による３つのＯＤ値の平均を示し、値は、３回の別々のアッセイにおいて得られたＥＬＩＳＡの平均を示す。 図５は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのいずれにおいても、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによる細胞媒介性免疫応答の誘導を示す。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりのサブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞数（ＳＦＣ）の頻度を、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＡ）とトランスジェニックマウス（パネルＣ）の両方においてＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりの、枯渇させたＣＤ８、サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞の頻度もまた、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＢ）とトランスジェニックマウス（パネルＤ）の両方において決定した。脾臓を個々の免疫化したマウス（１つのグループあたり３匹）から単離し、重複しているコンセンサスサブタイプＢエンベロープペプチドのプールを用いてインビトロで刺激した。基幹であるｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。値は、ＩＦＮ−γ ＳＦＣの平均＋平均の標準偏差である。（パネルＥ）サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的優勢エピトープの特性決定。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスからそれぞれ回収した脾細胞を、２９個のＨＩＶ−１サブタイプＢコンセンサスエンベロープペプチドのプールとともに２４時間培養した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞を、上記のようにＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。 図５は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのいずれにおいても、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによる細胞媒介性免疫応答の誘導を示す。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりのサブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞数（ＳＦＣ）の頻度を、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＡ）とトランスジェニックマウス（パネルＣ）の両方においてＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりの、枯渇させたＣＤ８、サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞の頻度もまた、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＢ）とトランスジェニックマウス（パネルＤ）の両方において決定した。脾臓を個々の免疫化したマウス（１つのグループあたり３匹）から単離し、重複しているコンセンサスサブタイプＢエンベロープペプチドのプールを用いてインビトロで刺激した。基幹であるｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。値は、ＩＦＮ−γ ＳＦＣの平均＋平均の標準偏差である。（パネルＥ）サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的優勢エピトープの特性決定。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスからそれぞれ回収した脾細胞を、２９個のＨＩＶ−１サブタイプＢコンセンサスエンベロープペプチドのプールとともに２４時間培養した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞を、上記のようにＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。 図５は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのいずれにおいても、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによる細胞媒介性免疫応答の誘導を示す。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりのサブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞数（ＳＦＣ）の頻度を、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＡ）とトランスジェニックマウス（パネルＣ）の両方においてＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−ＢでのＤＮＡワクチン接種後の、脾細胞１００万個あたりの、枯渇させたＣＤ８、サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的ＩＦＮ−γスポット形成細胞の頻度もまた、ＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＢ）とトランスジェニックマウス（パネルＤ）の両方において決定した。脾臓を個々の免疫化したマウス（１つのグループあたり３匹）から単離し、重複しているコンセンサスサブタイプＢエンベロープペプチドのプールを用いてインビトロで刺激した。基幹であるｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。値は、ＩＦＮ−γ ＳＦＣの平均＋平均の標準偏差である。（パネルＥ）サブタイプＢコンセンサスエンベロープ特異的優勢エピトープの特性決定。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスからそれぞれ回収した脾細胞を、２９個のＨＩＶ−１サブタイプＢコンセンサスエンベロープペプチドのプールとともに２４時間培養した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞を、上記のようにＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。 図６は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導された交差反応性を示す。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＡ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＢ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＣ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＤおよびＥ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＢａｌＢ／Ｃマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＦ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＧ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＨ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＩおよびＪ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答もまた、測定した。基幹ｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。 図６は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導された交差反応性を示す。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＡ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＢ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＣ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＤおよびＥ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＢａｌＢ／Ｃマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＦ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＧ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＨ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＩおよびＪ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答もまた、測定した。基幹ｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。 図６は、ＢａｌＢ／ＣマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導された交差反応性を示す。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＡ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＢ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＣ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＤおよびＥ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＢａｌＢ／Ｃマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチド（パネルＦ）、ＨＩＶ−１グループＭ（パネルＧ）、サブタイプＣコンセンサスエンベロープペプチド（パネルＨ）、ならびに、２つのサブタイプＣ単離物エンベロープペプチド（パネルＩおよびＪ）の４種類の個々のペプチドのプールに対する、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂでのワクチン接種によって誘導されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける付加的なＴ細胞免疫応答もまた、測定した。基幹ｐＶＡＸで免疫化したマウスを陰性対照として含めた。 図７は、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＡ）とＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（パネルＢ）の両方における、サブタイプＢのＭＮエンベロープ特異的優勢エピトープの特徴を示す。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスおよびトランスジェニックマウスからそれぞれ回収した脾細胞を、２９種類のＨＩＶ−１サブタイプＢのＭＮエンベロープペプチドのプールとともに２４時間培養した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞を、上記に記載したようにＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。 図７は、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウス（パネルＡ）とＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（パネルＢ）の両方における、サブタイプＢのＭＮエンベロープ特異的優勢エピトープの特徴を示す。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスおよびトランスジェニックマウスからそれぞれ回収した脾細胞を、２９種類のＨＩＶ−１サブタイプＢのＭＮエンベロープペプチドのプールとともに２４時間培養した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞を、上記に記載したようにＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。 図８は、Ｅ７２Ｅ１−Ｂの機能的ドメイン（約７００＋のアミノ酸）の模式図を示す。 図９は、Ｅ７２Ｅ１−Ｂ構築物のマップを示す。 図１０のパネルＡおよびＢは、強い細胞性免疫応答がＥ７２Ｅ１−Ｂによって誘導されたことを示す。 図１１のパネルＡおよびＢは、強く、そして幅広い交差反応性の細胞性免疫応答がＥ７２Ｅ１−Ｂによって誘導されたことを示す。 図１２のパネルＡ〜Ｄは、強い交差クレード（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）の細胞性免疫応答がＥ７２Ｅ１−Ｂによって誘導されたことを示す。 図１２のパネルＡ〜Ｄは、強い交差クレード（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）の細胞性免疫応答がＥ７２Ｅ１−Ｂによって誘導されたことを示す。 図１３は、実施例２の実験のために設計した免疫原を示す。 図１４は、系統発生学的関係を示す：３６個のＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ配列、ＥＹ３Ｅ１−Ｃ、ＥＫ３Ｐ−Ｃ、２つのサブタイプＢ、１つのサブタイプＡ、および１つのサブタイプ（Ｄの配列外集団）を系統発生学的分析に含めた。幅広い試料多様性を示すサブタイプＣエンベロープ配列は１２の国に由来した。 図１５のパネルＡおよびＢは、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１６は、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１７のパネルＡ〜Ｄは、同じクレードの中での、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１７のパネルＡ〜Ｄは、同じクレードの中での、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１８のパネルＡおよびＢは、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。パネルＡは、サブタイプＣ（ウルグアイ）ｅｎｖ−特異的ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによるデータを示す。パネルＢは、サブタイプＣ（南アフリカ）ｅｎｖ−特異的ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによるデータを示す。 図１９のパネルＡ〜Ｆは、クレード間でｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１９のパネルＡ〜Ｆは、クレード間でｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。 図１９のパネルＡ〜Ｆは、クレード間でｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された交差反応性の細胞性応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２０のパネルＡ〜Ｘは、ＨＩＶ−１ ｇａｇコンセンサス構築物によって誘発された免疫応答の実験によるデータを示す。 図２１は、生殖系上皮組織の中でのＨＰＶの生活環を示す。 図２２は、ＨＰＶ−１６ゲノムの構造のマップを示す。 図２３は、免疫原の設計を示す：＊は、ｐ５３結合および分解に重要な欠失または変異を意味する；Δは、Ｒｂ結合部位の中での変異を意味する。 図２４は、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質のコード配列とｐＶＡＸを含む遺伝子構築物ｐ１６６７と、ＨＰＶ挿入断片を含まない、陰性対照として使用した基幹プラスミドの説明を含む。 図２５のパネルＡ〜Ｄは、ＤＮＡ免疫原ｐ１６６７によって誘導された細胞性の免疫応答を示す。 図２５のパネルＡ〜Ｄは、ＤＮＡ免疫原ｐ１６６７によって誘導された細胞性の免疫応答を示す。 図２６は、免疫優勢エピトープマッピングの結果を示す。 図２７は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける防御を実験するための、Ｅ６／Ｅ７ ＤＮＡワクチンを使用する予防的実験による結果を示す。 図２８は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける防御を実験するための、Ｅ６／Ｅ７ ＤＮＡワクチンを使用した腫瘍退縮実験による結果を示す。 図２９は、脾臓の中のＥ７テトラマー陽性リンパ球を検出する実験によるデータを示す。 図３０は、腫瘍の中のＥ７テトラマー陽性リンパ球を検出する実験によるデータを示す。 図３１は、トランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチン防御実験によるデータを示す。 図３２は、プラスミドによってコードされるＩＬ−１２のＩＭ同時注射、それに続くエレクトロポレーション（ＥＰ）を用いた、ＨＩＶ−１コンセンサス免疫原に対する細胞性免疫応答の増強を示す。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔｓを、（ａ）最初の免疫化、（ｂ）２回目の免疫化、および（ｃ）３回目の免疫化の２週間後に行った（他の３つと比較して見た場合）。ｅｎｖに対する応答を黒色の棒として示し、ｇａｇは、白色の棒として示し、データは積み重ねたグループの平均の応答±ＳＥＭとして示した。 図３３は、筋肉内エレクトロポレーションを用いた交差反応性の細胞性免疫応答の増強を示す。３回の免疫化の後、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂを免疫化したアカゲザルにおける、ＨＩＶ−１グループＭペプチドの４つのペプチドプールに対する全Ｔ細胞免疫応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。データは、積み重ねたグループの平均±ＳＥＭとして示す。 図３４は、ＩＭエレクトロポレーションおよびプラスミドＩＬ−１２を用いた場合の、ＨＩＶ−１免疫原に対するメモリー応答の増強を示す。最後の免疫化の５ヶ月後に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行って、ＩＬ−１２プラスミドを用いて同時免疫を行った、および同時免疫をしなかった、ＩＭおよびＥＰで免疫化したグループにおける、ｇａｇおよびｅｎｖに対する抗原特異的メモリー応答を決定した。データは、グループの平均応答±ＳＥＭとして示す。
好ましい実施形態の詳細な説明
定義
本明細書中で使用される場合は、表現「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、核酸分子が別の核酸分子にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な状況において異なるであろう。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントンな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列についての融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブのうちの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。標的配列は、一般的には過剰量で存在するので、Ｔｍでは、プローブのうちの５０％が平衡状態で占有される。通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、通常は、約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、１０から５０ヌクレオチド）については、少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって得られる場合もある。
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９，これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）、ならびに、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して決定することができる。「類似性の割合（％）」は、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して計算される。コンセンサス配列についての類似性の平均は、系統樹のすべての配列と比較して計算される（図２および１４を参照のこと）。
簡単に説明すると、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（これは、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを意味する）が配列類似性の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されている。このアルゴリズムには、データベース配列中の同じ長さの言語とアラインメントされた場合にいくつかの陽性な値のスコア閾値Ｔと適合するかまたはそれを満たす、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の中の長さＷの短い言語を同定することにより、最初に高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することが含まれる。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードのヒットを、ＨＳＰが含まれているものを見つけるための検索を開始するための種とする。ワードのヒットは、累積アルゴリズムスコアを増大させることができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸張させられる。それぞれの方向でのワードのヒットの伸張は、以下の場合に停止する：１）累積アルゴリズムスコアが、その最大達成値よりも量Ｘ下がった時；２）１つ以上の陰性にスコアされる残基のアラインメントの蓄積が原因で、累積スコアがゼロまたはそれ未満になった時；あるいは、３）配列のいずれかの末端に到達した時。ＢｌａｓｔアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。Ｂｌａｓｔプルグラムでは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９を参照のこと、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較が使用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）と、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、２つの配列間での類似性の統計学的分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確立（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これにより、２つのヌクレオチド配列間での適合が偶然に起こる確立の目安が提供される。例えば、核酸は、他の核酸に対する試験の比較において最小合計確立が約１未満、好ましくは、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満である場合に、別のものに対して類似であると考えられる。
本明細書中で使用される場合は、用語「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞の中で発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに対して動作可能であるように連結させられた、開始および終結シグナルが含まれる。
本明細書中で使用される場合は、「〜から発現させることができる」は、個体の細胞の中に存在する場合には、コード配列が発現させられるように、タンパク質をコードするコード配列に対して動作可能であるように連結させられた必須の調節エレメントを含む遺伝子構築物をいう。
概要
本発明により、免疫原によって誘導される細胞性の免疫応答を増強させるための多段階のストラテジー（ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を利用することによる、改良されたワクチンが提供される。免疫原についての改変されたコンセンサス配列が作成された。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および構築物の免疫原性を高めるための高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子の改変もまた開示される。新規の免疫原は、対応するコドン最適化された免疫原よりも、強く、そして幅広い細胞性の免疫応答を誘発するように設計されている。
本発明により、改良されたＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、およびガンワクチンが提供される。これは、それぞれ、それに対して抗ＨＩＶ、抗ＨＰＶ、抗ＨＣＶ、抗インフルエンザ、および抗ｈＴｅｒｔ免疫応答を誘導することができる免疫原として、それらを特に有効にするエピトープを含むタンパク質、ならびにそのようなタンパク質をコードする遺伝子構築物を提供することによる。したがって、治療的または予防的免疫応答を誘導するためのワクチンを提供することができる。いくつかの実施形態においては、免疫原を送達するための手段は、ＤＮＡワクチン、組み換え体ワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチン、または死滅ワクチンである。いくつかの実施形態においては、ワクチンには、以下からなる群より選択される組み合わせが含まれる：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換え体ワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、および１つ以上の死滅ワクチン。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、本発明のワクチンは、個体の免疫系の活性を調節し、それにより、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、またはｈＴＥＲＴに対する免疫応答を増進するために、個体に送達される。タンパク質をコードする核酸分子が個体の細胞によって取り込まれると、ヌクレオチド配列が細胞の中で発現され、それにより、タンパク質が個体に送達される。本発明の複数の態様により、核酸分子（例えば、プラスミド）上のタンパク質のコード配列を、組み換え体ワクチンの一部として、そして弱毒化ワクチンの一部として、単離されたタンパク質として、またはベクターのタンパク質部分として送達する方法が提供される。
本発明のいくつかの態様にしたがうと、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、およびガンに対して個体を予防的ならびに／または治療的に免疫化する組成物と方法が提供される。
本発明は、調節エレメントに動作可能であるように連結させられた本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている核酸分子を送達するための組成物に関する。本発明の複数の態様は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれている組成物組み換え体ワクチン；本発明のタンパク質をコードする、および／または本発明のタンパク質を含む生の弱毒化された病原体；本発明のタンパク質を含む死滅させられた病原体；あるいは、本発明のタンパク質を含むリポソームまたはサブユニットワクチンのような組成物に関する。本発明はさらに、複数の組成物が含まれている注射することができる薬学的組成物に関する。
ＨＩＶ
本発明により、ＨＩＶ免疫原によって誘導される細胞性免疫応答を増進するための多段階のストラテジーを利用することによる、改良された抗ＨＩＶワクチンが提供される。免疫原についての改変されたコンセンサス配列が作成された。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および構築物の免疫原性を高めるための高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子の改変もまた開示される。新規の免疫原は、対応するコドン最適化された免疫原よりも、強く、そして幅広い細胞性の免疫応答を誘発するように設計されている。
配列番号１は、サブタイプＡのコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物である。配列番号１には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、サブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号２には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、サブタイプＡのエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号１６は、サブタイプＡのコンセンサスエンベロープタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１６、その断片、配列番号１６をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号２またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号１の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１１７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１３５０個またはそれ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１５３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１７１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１９８０個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０未満のヌクレオチド、そしていくつかの実施形態においては、２０７０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号２の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号２の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施態様においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸：いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６６０個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、６９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、６９０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
配列番号３は、サブタイプＢのコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物である。配列番号３には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、サブタイプＢエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号４には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、サブタイプＢのエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号１７は、サブタイプＢのコンセンサスエンベロープタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１７、その断片、配列番号１７をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号４またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号３の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１１７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１３５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１５３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１７１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１９８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２１６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２２５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２３４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２４３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２５２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、２７００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２０７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２２５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２３４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２５２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２６１０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、２７００個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号４の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号４の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６６０個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、６９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、６９０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
配列番号５は、サブタイプＣのコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物である。配列番号５には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、サブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号６には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、サブタイプＣのエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号１８は、サブタイプＣのコンセンサスエンベロープタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１８、その断片、配列番号１８をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号６またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号５が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号５の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号５の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１１７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１３５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１５３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１７１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１９８０個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号５の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号５の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、２０７０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号６の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号６の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６６０個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、６９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、６９０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
配列番号７は、サブタイプＤのコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物である。配列番号７には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、サブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号８には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、サブタイプＤのエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号１９は、サブタイプＤのコンセンサスエンベロープタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１９、その断片、配列番号１９をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号８またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号７が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号７の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号７の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１１７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１３５０個またはそれ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１５３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１７１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１８９０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１９８０個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチド；、そして、いくつかの実施形態においては、２１４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号７の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号７の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２０７０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、２１４０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号８の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号８の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、５７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、６６０個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、６９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、６９０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
配列番号９は、サブタイプＢ Ｎｅｆ−ＲｅｖのコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物である。配列番号９には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、サブタイプＢ Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号１０には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、サブタイプＢ Ｎｅｆ−Ｒｅｖのタンパク質についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号２０は、サブタイプＢ Ｎｅｆ−Ｒｅｖのコンセンサスタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号２０、その断片、配列番号２０をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１０またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号９が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号９の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号９の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号９の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号９の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号２の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号２の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。
配列番号１１は、サブタイプＡ、Ｂ，Ｃ、およびＤのＤＮＡ配列構築物のＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列である。配列番号１１には、ＨＩＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、ＧａｇコンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質のコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。配列番号１２には、ＨＩＶワクチン配列構築物のアミノ酸配列が含まれる。これには、ＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質のコンセンサス配列に対して連結させられたＩｇＥリーダー配列が含まれる。ＩｇＥリーダー配列は配列番号１５である。配列番号２１は、コンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質配列である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号２１、その断片、配列番号２１をコードする核酸分子、またはその断片が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１２またはそれをコードする核酸分子が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号１１が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号１５、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。
配列番号１１の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１１の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、５４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、６３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、７２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、８１０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９００個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、９９０個またはそれ以上のヌクレオチド：いくつかの実施形態においては、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１１７０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１３５０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１５３０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチド；いくつかの実施形態においては、１７１０個またはそれ以上のヌクレオチド；そして、いくつかの実施形態においては、１８００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１１の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１１の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５３０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７１０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号１２の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号１２の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては；１５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、１８０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２１０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２４０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、２７０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３００個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３３０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、３６０個またはそれ以上のアミノ酸：いくつかの実施形態においては、３９０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４２０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４５０個またはそれ以上のアミノ酸；いくつかの実施形態においては、４８０個またはそれ以上のアミノ酸；そして、いくつかの実施形態においては、５１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、５１０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
ＨＰＶ
配列番号２２には、ＨＰＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、ＩｇＥリーダー配列、タンパク質分解的切断される配列によりＨＰＶ Ｅ７についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＨＰＶ Ｅ６についてのコンセンサス配列が含まれる。ＨＰＶ Ｅ６についてのコンセンサス配列には、配列番号２４に示される免疫優勢エピトープが含まれる。ＨＰＶ Ｅ７についてのコンセンサス配列には、配列番号２５に示される免疫優勢エピトープが含まれる。ＨＰＶ Ｅ６についてのコンセンサス配列は配列番号２６である。ＨＰＶ Ｅ６についてのコンセンサス配列は配列番号２７である。ＩｇＥリーダー配列は配列番号２８である。２つのコンセンサス配列を連結させるために有用なタンパク質分解的切断される配列は配列番号２９である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号２４および／または配列番号２５、あるいは、それらの両方のうちの一方をコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、配列番号２７および／または配列番号２８、あるいは、それらの両方のうちの一方をコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、配列番号２９のようなタンパク質分解的切断される配列によって配列番号２８に連結させられた配列番号２７、または融合タンパク質をコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号２８、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、配列番号２３、または配列番号２２の中の核酸配列が含まれることが好ましい。
いくつかの実施形態においては、タンパク質には、配列番号２３の断片が含まれる。いくつかの実施形態においては、タンパク質は、配列番号２３の断片からなる。いくつかの実施形態においては、核酸には、配列番号２２の断片が含まれる。いくつかの実施形態においては、核酸は、配列番号２２の断片からなる。
配列番号２２の断片には、３０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、４５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、７５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、１２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、１５０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、２１０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、２４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、２７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、３６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、４２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、４８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、６００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、６６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、７２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、７８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号２２の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７５個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、７８０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号２３の断片には、１５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、１８個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、２１個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、２４個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、３６個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、４２個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、４８個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、５４個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、１８個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、７２個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、１２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、１５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、１８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、２１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、２４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、２６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号２３の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、２４個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７２個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、２６０個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
ＨＣＶ
配列番号３０には、ＨＣＶワクチン配列のコード配列が含まれる。これには、ＩｇＥリーダー配列、タンパク質分解的切断される配列によってＨＣＶ Ｅ２についてのコンセンサス配列に対して連結させられたＨＣＶ Ｅ１についてのコンセンサス配列が含まれる。ＨＣＶ Ｅｌについてのコンセンサス配列は配列番号３２である。ＨＣＶ Ｅ２についてのコンセンサス配列は配列番号３３である。
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３２および／または配列番号３３、またはそれらの両方のうちの一方をコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、配列番号２９のようなタンパク質分解的切断される配列によって配列番号３３に連結させられた配列番号３２、または融合タンパク質をコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、ＩｇＥリーダー配列である配列番号２８、またはそれをコードする核酸配列が含まれることが好ましい。本発明のワクチンには、配列番号３１、または配列番号３０の中の核酸配列が含まれることが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３０、ならびに、配列番号３４、配列番号３５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸配列、またはそれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。
配列番号３０の断片には、３０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、４５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、７５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１５０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、２１０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、２４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、２７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、３６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、４２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、４８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、６００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、６６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、７２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、７８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、８４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、９００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、９６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１０２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１１４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１２００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１３２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１３８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１５００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１５６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１６８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、１７４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３０の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７５個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６８０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、１７４０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号３１の断片には、１５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、４５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、７５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、１０５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、１２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、１５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、１８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、２１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、２４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、２７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、３００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、３６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、４２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、４８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、５４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３１の断片には、５７５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。断片には、３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７５個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、５７５個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
ｈＴＥＲＴ
ｈＴＥＲＴはヒトテロメラーゼ逆転写酵素であり、これは、テロメラーゼの末端上にＴＴＡＧＧＧタグを合成して、染色体が短くなることが原因である細胞死を防ぐ。ｈＴＥＲＴの異常な高発現を行っている過剰増殖性の細胞は、免疫治療により標的化される場合がある。最近の実験はまた、ＨＣＶまたはＨＰＶに感染した過剰増殖性の細胞の異常なｈＴＥＲＴ発現をサポートしている。したがって、ＨＰＶおよびＨＣＶの両方に対する免疫療法は、異常なレベルでｈＴＥＲＴを発現する細胞を標的化することによって増強できる場合がある。
最近の実験は、ｈＴＥＲＴ遺伝子でトランスフェクトされた樹状細胞の中でのｈＴＥＲＴの発現がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ、そして抗原特異的様式でＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発できることを明らかに示している。したがって、老化を遅らせ、そして選択された抗原を提示するそれらの能力を維持するための、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中でのｈＴＥＲＴ発現の使用は、新しい免疫療法の方法の開発において魅力的である。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫原に対して個体の中で免疫応答を誘導する方法には、ｈＴＥＥＲタンパク質およびその機能的断片またはその発現され得るコード配列を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて、個体に対して投与する工程が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、本発明のワクチンには、配列番号３０と、以下からなる群より選択される核酸配列またはそれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる：配列番号３４、配列番号３５、およびそれらの任意の組み合わせ。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３４または配列番号３５が含まれる。配列番号３４にはｈＴＥＲＴをコードする核酸配列が含まれる。配列番号３５にはｈＴＥＲＴのアミノ酸配列が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号２２と、配列番号３４または配列番号３５が含まれる。ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、および／またはｈＴＥＲＴのタンパク質を、ＨＰＶ免疫原と組み合わせて使用することにより、ＨＰＶに感染した細胞に対する細胞媒介性免疫応答が増強される。
配列番号３４の断片には、３０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、４５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号１の断片には、７５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１５０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２１０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、４２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、４８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、６００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、６６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、７２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、７８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、８４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、９００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、９６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１０２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１１４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１２００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１３２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１３８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１５００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１５６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１６８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１７４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１８００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１８６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１９２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、１９８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２０４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２１００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２１６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２２２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２２８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２３４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２４００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２４６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２５２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２５８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２６４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２７００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２７６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２８２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２８８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。
いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、２９４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３０００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３０６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３１２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３１８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３２４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３３６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３４２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、３４８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３４の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７５個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１７４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１９８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２０４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２２２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２２８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２３４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２５２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２５８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２６４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２８２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２８６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２９４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３０００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３０６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３１２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３２４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３３００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３４２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３４８０個未満のヌクレオチド、そして、３５１０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号３５の断片には、１５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１８個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、２１個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、２４個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３６個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、４２個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、４８個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、５４個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６６個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、７２個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、２１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、２４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、２７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、３９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、４２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、４５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、４８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、５１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、５４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、５７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、６９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、７２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、７５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、７８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、８１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、８４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、８７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、９００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、９３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、９６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、９９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１０２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１０５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１０８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１１１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１１４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１１７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１２００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１２３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１２６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１２９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１３２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１３５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１３８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１４１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。
いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１４４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１４７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、１５００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合があり、これには、免疫優勢エピトープをコードする配列が含まれることが好ましい。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３５の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。断片には、２４個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７２個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、８００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、８３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、８６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、８９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１０１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１０４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１０７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１３２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１３５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１３８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１４１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１４７０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、１５００個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
インフルエンザ
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫原に対して個体の中で免疫応答を誘導する方法には、インフルエンザ株Ｈ５Ｎ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質およびその機能的断片またはその発現され得るコード配列を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて、個体に対して投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、インフルエンザワクチン組成物および方法には、複数のインフルエンザウイルス種に由来するＨＡタンパク質をコードする核酸配列の使用が含まれる。いくつかの実施形態においては、インフルエンザワクチン組成物および方法には、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ５由来のＨＡをコードする核酸配列と、以下からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質をコードする核酸配列の使用が含まれる：配列番号３８、配列番号４０、および配列番号４２。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３６または配列番号３７が含まれる。配列番号３６には、インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ５ ＨＡをコードする核酸配列が含まれる。配列番号３７には、インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ５ ＨＡのアミノ酸配列が含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３８または配列番号３９が含まれる。配列番号３８には、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ ＮＡコンセンサス配列をコードする核酸配列が含まれる。配列番号３９には、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ ＮＡコンセンサス配列のアミノ酸配列が含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号４０または配列番号４１が含まれる。配列番号４０には、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ Ｍ１コンセンサス配列をコードする核酸配列が含まれる。配列番号４１には、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ Ｍ１コンセンサス配列のアミノ酸配列が含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号４２または配列番号４３が含まれる。配列番号４２には、インフルエンザＨ５Ｎ１ Ｍ２Ｅ−ＮＰコンセンサス配列をコードする核酸配列が含まれる。配列番号４３には、インフルエンザＨ５Ｎ１ Ｍ２Ｅ−ＮＰコンセンサス配列のアミノ酸配列が含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、配列番号３６と、以下の群より選択される配列が含まれる：配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、およびそれらの任意の組み合わせ。インフルエンザウイルス株Ｈ５Ｎ１ ＨＡについてのコンセンサス配列には、配列番号３６に示される免疫優勢エピトープが含まれる。配列番号３６によってコードされるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ ＨＡのアミノ酸配列は配列番号３７である。インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１ ＮＡについてのコンセンサス配列には、配列番号３８に示される免疫優勢エピトープが含まれる。配列番号３８によってコードされるインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１ ＮＡのアミノ酸配列は配列番号３９である。インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１ Ｍｌについてのコンセンサス配列は、配列番号４０に示される免疫優勢エピトープが含まれる。配列番号４０によってコードされるインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１ Ｍｌアミノ酸配列は配列番号４１である。インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ Ｍ２Ｅ−ＮＰについてのコンセンサス配列には、配列番号４２に示される免疫優勢エピトープが含まれる。配列番号４２によってコードされるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ Ｍ２Ｅ−ＮＰのアミノ酸配列は配列番号４３である。本発明のワクチンには、上記で定義された核酸分子によってコードされるタンパク質産物、または任意のタンパク質断片が含まれる場合がある。
配列番号３６の断片には、３０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、４５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、７５個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、９０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１５０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、２１０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、２４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、２７０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、３６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、４２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、４８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、６００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、６６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、７２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、７８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、８４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、９００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、９６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１０２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１０８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１１４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１２００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１２６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１３２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１３８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１４４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１５００個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１５６０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１６２０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１６８０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、１７４０個またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３６の断片には、ＩｇＥリーダー配列のコード配列は含まれない。配列番号３６の断片には、６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７５個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、６６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、７８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、８４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、９６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１０８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１１４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１２６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１３８０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１４４０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５００個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１５６０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６２０個未満のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、１６８０個未満のヌクレオチド、そして、いくつかの実施形態においては、１７４０個未満のヌクレオチドが含まれる場合がある。
配列番号３７の断片には、１５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、３０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、４５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、７５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、９０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、１０５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、１２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、１５０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、１８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、２１０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、２４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、２７０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、３００個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、３６０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、４２０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、４８０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、５４０個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３７の断片には、５６５個またはそれ以上のアミノ酸が含まれる場合がある。配列番号３７の断片には、３０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４５個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、７５個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、９０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１５０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、１８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２１０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２４０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、２７０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３００個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、３６０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４２０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、４８０個未満のアミノ酸、いくつかの実施形態においては、５４０個未満のアミノ酸、そして、いくつかの実施形態においては、５６５個未満のアミノ酸が含まれる場合がある。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫原に対して個体の中で免疫応答を誘導する方法には、インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１のＨＡタンパク質、ならびに、その機能的断片またはその発現され得るコード配列を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて、個体に対して投与する工程が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫原に対して個体の中で免疫応答を誘導する方法には、インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１のＭ１タンパク質、ならびに、その機能的断片またはその発現され得るコード配列を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて、個体に対して投与する工程が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫原に対して個体の中で免疫応答を誘導する方法には、インフルエンザ株Ｈ５Ｎ１のＭ２Ｅ−ＮＰタンパク質、およびその機能的断片またはその発現され得るコード配列を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて、個体に対して投与する工程が含まれる。
ワクチン
本発明により、それに対する免疫応答を誘導することができる免疫原としてそれらを特に有効にするエピトープを含むタンパク質、ならびにそのようなタンパク質をコードする遺伝子構築物を提供することにより、改良されたワクチンが提供される。したがって、治療的または予防的免疫応答を誘導するためのワクチンを提供することができる。いくつかの実施形態においては、免疫原を送達するための手段は、ＤＮＡワクチン、組み換え体ワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチン、または死滅ワクチンである。いくつかの実施形態においては、ワクチンには、以下からなる群より選択される組み合わせが含まれる：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換え体ワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、および１つ以上の死滅ワクチン。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、本発明のワクチンは、個体の免疫系の活性を調節し、それにより、免疫応答を増進するために個体に送達される。タンパク質をコードする核酸分子は個体の細胞によって取り込まれると、ヌクレオチド配列が細胞の中で発現され、それにより、タンパク質が個体に送達される。本発明の複数の態様により、核酸分子（例えば、プラスミド）上のタンパク質のコード配列を、組み換え体ワクチンの一部として、そして弱毒化ワクチンの一部として、単離されたタンパク質として、またはベクターのタンパク質部分として送達する方法が提供される。
本発明のいくつかの態様にしたがうと、個体を予防的および／または治療的に免疫化する組成物と方法が提供される。
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、およびその中で引用されている先行出願に記載されている。これらはそれぞれが引用により本明細書中に組み入れられる。これらの出願の中に記載されている送達プロトコールに加えて、ＤＮＡの別の送達方法が、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されている。これらはいずれも引用により本明細書中に組み入れられる。
本発明は、改良された弱毒化生ワクチン、改良された死滅ワクチン、ならびに、抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換え体ベクターを使用する改良されたワクチン、ならびに、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンに関する。外来抗原を送達するために組み換え体ベクターを使用する弱毒化生ワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンの例は、以下の米国特許に記載されている：
これらはそれぞれが引用により本明細書中に組み入れられる。
細胞によって取り込まれると、遺伝子構築物（単数または複数）は、機能性の染色体外分子として細胞の中に留まる場合も、そして／または細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込まれる場合もある。ＤＮＡは、これがプラスミド（単数または複数）の形態で別の遺伝的材料として留まる場合には、細胞に導入され得る。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖状ＤＮＡは細胞に導入することができる。細胞内にＤＮＡが導入される場合には、染色体へのＤＮＡの組み込みを促進する試薬が加えられる場合がある。組み込みを促進させるために有用なＤＮＡ配列もまた、ＤＮＡ分子に含められる場合がある。あるいは、ＲＮＡが細胞に投与される場合がある。セントロメア、テロメア、および複製起点を含む直鎖状のミニ染色体として遺伝子構築物を提供することもまた意図される。遺伝子構築物は、弱毒化された生の微生物の中に遺伝的材料の一部、または細胞の中で生存している組み換え体微生物ベクターとして留まる場合がある。遺伝子構築物は、組み換え体ウイルスワクチンのゲノムの一部であり得る。この場合、遺伝的材料は、細胞の染色体に組み込まれるか、または染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝的構築物には、核酸分子の遺伝子発現に不可欠な調節エレメントが含まれる。このエレメントには、プロモーター、開始コドン、終結コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、エンハンサーが、多くの場合には、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要である。これらのエレメントが、所望されるタンパク質をコードする配列に対して動作可能であるように連結させられること、および調節エレメントが、それらが投与される個体によって動作可能であるように連結されたであることが不可欠である。
開始コドンと終結コドンは、一般的には、所望されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられる。しかし、これらのエレメントが、遺伝子構築物が投与される個体の中で機能的であることが不可欠である。開始コドンおよび終結コドンは、コード配列の中ではインフレームでなければならない。
使用されるプロモーターとポリアデニル化シグナルは、個体の細胞の中で機能的でなければならない。
本発明を実施するために、（特に、ヒト用の遺伝的ワクチンの生産において）有用なプロモーターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定はされない：シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）（例えば、ＢＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ＣＭＶ極初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびに、ヒト遺伝子（例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン）由来のプロモーター。
本発明を実施するために、（特に、ヒト用の遺伝的ワクチンの生産において）有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の中に存在しているＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（これは、（ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとも呼ばれる）が使用される。
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントもまたＤＮＡ分子に含められる場合がある。そのようなさらなるエレメントとしてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにウイルスエンハンサー（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ由来のエンハンサー）を含むがこれらに限定されない群より選択することができる。
遺伝子構築物は、構築物を染色体外に維持し、そして細胞内で構築物の複数のコピーを生じさせるための哺乳動物の複製起点を伴って提供され得る。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、およびｐＲＥＰ４には、エプスタインバーウイルスの複製起点と、核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域（これは、組み込まれずに、高コピー数のエピソーム複製を生じる）が含まれている。
免疫化の用途に関するいくつかの好ましい実施形態においては、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、加えて、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（単数または複数）が送達される。そのような遺伝子の例は、他のサイトカインおよびリンホカイン（例えば、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ−１５（シグナル配列が欠失しているＩＬ−１５、および状況に応じてＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む）をコードする遺伝子である。有用である可能性がある他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ（Ｃａｓｐａｓｅ ＩＣＥ）、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性なＮＩＫ（Ｉｎａｃｔｉｖｅ ＮＩＫ）、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片。
何らかの理由のために遺伝的構築物を受け取った細胞を排除することが所望される場合には、細胞の破壊のための標的となるさらなるエレメントが付加される場合もある。発現され得る形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を遺伝子構築物に含めることができる。薬物であるガングシクロビル（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ）を個体に投与することができ、この薬物は、ｔｋを生産する任意の細胞の選択的死滅を引き起こし、それにより、遺伝子構築物を有している細胞の選択的破壊のための手段を提供するであろう。
タンパク質の生産を最大にするためには、構築物が投与される細胞の中での遺伝子発現に十分に適している調節配列が選択され得る。さらに、細胞内で最も効率よく転写されるコドンが選択され得る。当業者は、細胞内で機能性であるＤＮＡ構築物を生産することができる。
いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載されるタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結させられた遺伝子構築物が提供され得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載されるタンパク質はＩｇＥシグナルペプチドに連結させられる。
タンパク質が使用されるいくつかの実施形態においては、例えば、当業者は、周知の技術を使用して、本発明のタンパク質を生産し、単離することができる。タンパク質が使用されるいくつかの実施形態においては、例えば、当業者は、周知の技術を使用して、周知の発現システムを使用するために、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を市販されている発現ベクターの中に挿入することができる。例えば、市販されているプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中での生産のために使用され得る。例えば、市販されているプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の中での生産のために使用され得る。例えば、市販されているＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が、昆虫細胞の中での生産のために使用され得る。例えば、市販されているプラスミドｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）の中での生産のために使用され得る。当業者は、日常的に行われている技術と、容易に入手することができる出発材料によって、タンパク質を生産するために、これらの市販されている発現ベクターおよびシステムなどを使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと、これは引用により本明細書中に組み入れられる）。したがって、所望されるタンパク質は、原核生物システムと真核生物システムのいずれにおいても調製することができ、これによりタンパク質の様々なプロセシングされた形態が生じる。
当業者は、他の市販されている発現ベクターとシステムを使用する場合があり、また、周知の方法と、容易に入手することがでる出発材料を使用して、ベクターを生産する場合もある。必要な制御配列（例えば、プロモーターとポリアデニル化シグナル、そして好ましくは、エンハンサー）が含まれている発現システムは容易に入手することができ、様々な宿主について当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。遺伝子構築物には、その構築物がトランスフェクトされる細胞株の中で機能的であるプロモーターに対して動作可能であるように連結させられたタンパク質コード配列が含まれる。構成的プロモーターの例としては、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０由来のプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、マウス乳ガンウイルス（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）またはメタロチオネインのプロモーターが挙げられる。当業者は、容易に入手することができる出発材料に由来する本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするために有用な遺伝子構築物を容易に生産することができる。タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターが、適合する宿主を形質転換するために使用され、これは次いで、培養されて、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で維持される。
生産されたタンパク質は、適切である場合には、当業者に公知であるように、培養物から、細胞を溶解させることによるかまたは培養培地からのいずれかにより、回収される。当業者は、周知の技術を使用して、そのような発現システムを使用して生産されたタンパク質を単離することができる。天然の供給源から、上記の特異的なタンパク質に特異的に結合する抗体を使用してタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ方法によって生産されたタンパク質を精製することにも同様に適用することができる。
組み換え技術によるタンパク質の生産に加えて、自動ペプチド合成もまた、単離された、原則として純粋なタンパク質を生産するために使用される場合がある。そのような技術は当業者に周知であり、置換を有している誘導体がＤＮＡによってコードされるタンパク質の生産において提供されない限りは、有用である。
核酸分子は、ＤＮＡの注入（ＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）、組み換え体ベクター（例えば、組み換え体アデノウイルス、組み換え体アデノ随伴ウイルス、および組み換え体ワクシニア）を含むいくつかの周知の技術のうちのいずれかを使用して送達される場合がある。
投与経路としては、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口、ならびに、局所、経皮、吸入による、または坐剤、あるいは、膣、直腸、尿道、口腔、および舌下組織に対する洗浄によるような粘膜組織に対しての投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下注射が挙げられる。遺伝子構築物は、従来の注射器、針なしの注射デバイス、または「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｅｓ）」を含むが、これらに限定されない手段によって投与することができる。
いくつかの実施形態においては、核酸分子は、ポリヌクレオチド機能のエンハンサー、または遺伝子ワクチン促進因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ａｇｅｎｔ）の投与と組み合わせて、細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能のエンハンサーは、米国特許出願番号５，５９３，９７２、同５，９６２，４２８、および１９９４年１月２６日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９に記載されている。これらはそれぞれ、引用により本明細書中に組み入れられる。遺伝子ワクチン促進因子は、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願番号０２１，５７９に記載されている。これは引用により本明細書中に組み入れられる。核酸分子と組み合わせて投与される共働因子（ｃｏ−ａｇｅｎｔｓ）は、核酸分子との混合物として投与される場合も、また、核酸分子の投与と同時に、その前に、もしくはその後で、別々に投与される場合もある。加えて、トランスフェクト因子および／または複製因子および／または炎症因子として機能することができ、そしてＧＶＦと同時に投与することができる他の因子としては、成長因子、サイトカイン、およびリンホカイン（例えば、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５、ならびに、線維芽細胞増殖因子、表面活性化因子、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイトの不完全なアジュバント、ＬＰＳアナログ（モノホスホリルリピッドＡ（ＷＬ）、ムラミルペプチド、キノンアナログを含む）、およびベシクル（例えば、スクワレンおよびスクワレン）が挙げられ、そして、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物と組み合わせて使用され、投与される場合がある。いくつかの実施形態においては、免疫調節タンパク質が、ＧＶＦとして使用される場合がある。いくつかの実施形態においては、核酸分子は、送達／取り込みを促進するために、ＰＬＧと組み合わせて提供される。
本発明の薬学的組成物には、約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、本発明の薬学的組成物には、約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、薬学的組成物には、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、薬学的組成物には、約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、薬学的組成物には、約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、薬学的組成物には、約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい実施形態においては、薬学的組成物には、約１００から約２００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。
本発明の薬学的組成物は、使用される投与の態様にしたがって処方される。薬学的組成物が注射可能な薬学的組成物である場合には、これらは、滅菌の、発熱物質を含まないものであり、そして、微粒子を含まないものである。等張性の処方物が使用されることが好ましい。一般的には、等張性のために加えられるものとしては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。いくつかの場合には、等張性の溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）が好ましい。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態においては、血管収縮剤が処方物に添加される。
本発明のいくつかの実施形態にしたがうと、免疫応答を誘導する方法が提供される。ワクチンは、タンパク質をベースとする、生の弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組み換え体ワクチン、または核酸もしくはＤＮＡワクチンであり得る。いくつかの実施形態においては、免疫原に対して、個体において免疫応答を誘導する方法（粘膜の免疫応答を誘導する方法を含む）には、個体に対して、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的断片、またはそれらの発現可能なコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組換え体ワクチンおよび／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または生の弱毒化ワクチンおよび／または死滅ワクチンと組み合わせて投与する工程が含まれる。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上が、免疫原をコードする単離された核酸分子；および／または免疫原をコードする組換え体ワクチン、および／または免疫原を含むサブユニットワクチン、および／または生の弱毒化ワクチン、および／または死滅ワクチンの投与の前に、それらの投与と同時に、あるいはそれらの投与の後に投与される場合がある。いくつかの実施形態においては、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびそれらの機能的断片からなる群より選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離された核酸分子が個体に投与される。
（実施例１）
材料および方法
ＨＩＶ−１サブタイプＢエンベロープ配列。ＨＩＶ−１サブタイプＢコンセンサスエンベロープ配列を作成するために、１１の国から回収された４２種類のサブタイプＢエンベロープ遺伝子の配列を、サンプリングの偏りを回避するためにＧｅｎＢａｎｋから選択した。それぞれの配列は、異なる患者を示す。使用した全ての配列は組み換え体ではない。
多重アラインメント。系統発生学的実験に適用したアラインメント手順には、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（バージョン１．８１）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９７，Ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：４８７６−４８８２）の適用を含めた。対アラインメントパラメーター（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は、ギャップ開放ペナルティーとして１０、そして伸張ペナルティーとして０．１を使用する、動的「ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ」プログラミングに設定した。多重アラインメントパラメーターには、０．２に等しいギャップ伸張ペナルティーを含めた。
ＨＩＶ−１サブタイプＢエンベロープコンセンサス配列の構築。ＨＩＶ−１サブタイプＢエンベロープコンセンサスヌクレオチド配列は、多重アラインメントと、主要ではない最終的な手作業による調整を行った後に得られた。推定されたアミノ酸配列を、コドンの間に挿入されるアラインメントギャップの導入の指針とするために使用した。コンセンサスアミノ酸配列は、コンセンサスヌクレオチド配列を翻訳することによって得た。
系統樹。プログラムＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｌ．１９９９，ＰＡＵＰ＊４．０：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ（＊および他の方法），バージョン４．０ｂ２ａ．Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）を使用する近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）ｍｅｔｈｏｄ）を、アミノ酸の系統樹の構築のために使用した。サブタイプＤに由来する２つのさらなる配列（Ｋ０３４５４およびＡＡＡ４４８７３）と、サブタイプＣに由来する２つの配列（ＡＡＤ１２１０３およびＡＡＤ１２１１２）を、ルーティングのための外周団として使用した（Ｋｕｉｋｅｎ，Ｃ．，Ｂ．Ｔ．Ｋｏｒｂｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｓｈａｆｅｒ．２００３．ＨＩＶ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ．ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．５：５２−６１）。
ＨＩＶ−１サブタイプＢエンベロープコンセンサス配列の改変。いくつかの改変を、ＨＩＶ−１サブタイプＢコンセンサスエンベロープ配列を得た後に行った：可変性の高いＶ１およびＶ２領域を短縮し、Ｖ３ループをＣＣＲ５の利用のために設計し、細胞質末端領域をＣ末端から除去し、リーダー配列と上流のＫｏｚａｋ配列をＮ末端に付加し、コドン最適化およびＲＮＡ最適化をＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＧＥＮＥＡＲＴ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより行った。
エンベロープ免疫原。改変されたＨＩＶ−１サブタイプＢアーリートランスミッター（ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）コンセンサスエンベロープ糖タンパク質（ＥＹ２Ｅ１−Ｂ）をコードする遺伝子を合成し、そして配列をＧＥＮＥＡＲＴによって確認した。合成したＥＹ２Ｅ１−ＢをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化し、発現ベクターｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、サイトメガロウイルス即時初期プロモーターの制御下にクローニングし、この構築物をｐＥＹ２Ｅ１−Ｂと命名した。
一次サブタイプＢ免疫原（ＥＫ２Ｐ−Ｂ）を、Ｍ．Ｓｉｄｈｍ（Ｗｙｅｔｈ）から譲り受けたヒトコドンに偏った一次サブタイプＢ単離物６１０１ ｇｐｌ４０エンベロープ遺伝子から作成した。基本的には、最適化した６１０１エンベロープ遺伝子を、天然のリーダー配列と細胞質末端を除去することによって変異させた。その後、ＩｇＥ−リーダー配列とＫｏｚａｋ配列を、以下の正方向と逆方向の特異的プライマーを設計することにより導入した：
精製したＰＣＲ産物をｐＶＡＸプラスミドベクターにクローニングし、これをまた、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで直鎖状にした。この構築物をｐＥＫ２Ｐ−Ｂと命名した。
ＥＹ２Ｅ１−Ｂのインビボでの発現とモノクローナル抗体との反応性。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（２×１０６）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、それぞれ、３□ｇのｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂプラスミドで６０ｍｍ皿の中でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１５０μｌの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の中に溶解させた。全タンパク質溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画させ、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移動させた。免疫ブロット分析をエンベロープ特異的モノクローナル抗体２Ｇ１２（ＮｌＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）とモノクローナル抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行い、そしてＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、ＥＣＬＴＭウェスタンブロット分析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。アクチンをウェスタンブロットのローティング対照として使用した。
ＥＹ２Ｅ１−Ｂのモノクローナル抗体との反応性を検出するために、トランスフェクションによる全タンパク質溶解物（１００μｇ）を、５μｇのエンベロープ特異的モノクローナル抗体（２Ｇ１２、４Ｇ１０、およびＩＤ６（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含む）で免疫沈降させた。空のｐＶＡＸベクターでトランスフェクトした細胞に由来する同じ量の全タンパク質溶解物を陰性対照として使用した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画し、上記に記載したようにウェスタンブロッティングによって検出した。
間接的な免疫蛍光アッセイ。ＥＹ２Ｅ１−ＢおよびＥＫ２Ｐ−Ｂ遺伝子の発現を確認するための間接的な免疫蛍光アッセイを行った。ヒト横紋筋肉種（ＲＤ）細胞を組織培養チャンバースライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、１０％のＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含む完全ＤＭＥＭ培地の中で翌日に６０〜７０％の細胞集密度が得られるような密度でプレートし、一晩付着させた。翌日、細胞をｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂ、および対照プラスミドｐＶＡＸ（１μｇ／ウェル）で、製造業者の説明書にしたがってＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を冷却した１×ＰＢＳで２回洗浄し、メタノールを使用してスライド上に１５分間かけて固定した。スライドから残った溶媒を除去し、細胞を、抗マウスＨＩＶ−１ ｅｎｖモノクローナルＦ１０５（ＮｌＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）とともに９０分間インキュベートした。その後、スライドをＴＲＩＴＣ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４５分間インキュベートした。４’，６−ジアミド−２−フェニルインドールヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を二次抗体の溶液に加えて核を対比染色して、任意の領域の中の利用することができる細胞の総数の核を示した。スライドを、フェージング防止剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む取り付け媒体を用いてマウントした。画像を、蛍光顕微鏡用のＰｈａｓｅ ３ Ｐｒｏプログラム（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して分析した。
エンベロープ特異的抗体の決定。エンベロープに特異的なＩｇＧ抗体の測定を、免疫化したマウスと対照マウスの両方において、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって行った。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＴＭ Ｐｌａｔｅｓ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を１μｇ／ｍｌのクレードＢ組換え体ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ糖タンパク質可溶性ｇｐ１６０（Ｉｍｍｕｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＭＡ）、クレードＡ／Ｅ一次エンベロープタンパク質ＨＩＶ−１ ９３ＴＨ９７５ ｇｐ１２０、およびクレードＣ一次エンベロープタンパク質ＨＩＶ−１ ９６ＺＭ６５１ ｇｐ１２０（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）でそれぞれコーティングし、室温で一晩インキュベートした。洗浄後、プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中の３％のＢＳＡで３７℃で１時間ブロックした。その後、プレートを再び洗浄し、特異的マウス血清とともにインキュベートし、ＰＢＳＴ中の３％のＢＳＡで一晩、４℃で希釈し、続いて、１／１０，０００希釈のＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。反応を、基質であるＴＭＢ（３，３□，５，５□−テトラメチルベンジジン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行った。反応を１ウェルあたり１００μｌの２．５Ｍの硫酸を用いて停止させ、プレートをＥＬ８０８プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．）で、４５０ｎｍのＯＤで読み取った。
マウスの免疫化。雌の４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ．から購入した。トランスジェニックＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Η２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊマウスの雄雌の対は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｋｕｔｚｌｅｒ博士によって本発明者らの研究室において繁殖させられた。これらのトランスジェニックマウスは、種間ハイブリッドクラスＩ ＭＨＣ遺伝子ＡＡＤを発現する。ＡＡＤには、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子のα−１ドメインとα−２ドメイン、そして、マウスＨ−２Ｄｄ遺伝子のα−３膜貫通ドメインと細胞質ドメインが、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１プロモーターの方向下に含まれる。マウスα−３ドメインの発現は、このシステムの免疫応答を促進する。未改変のＨＬＡ−Ａ２．１と比較して、キメラＨＬＡ−Ａ２．１／Ｈ２−Ｄｄ ＭＨＣ クラスＩ分子は、マウスＴ細胞の効率的な陽性選択を媒介して、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができるより完全なＴ細胞レパートリーを提供する。ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ分子の状況においてマウスＴ細胞によって提示され認識されるペプチドエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２．１＋ヒトにおいて提示されるものと同じである。雌の４〜６週齢のトランスジェニックマウスを、以下に記載するさらなる実験に使用した。それらの世話は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインにしたがった。個々のマウスを、それぞれ１００μｇのＤＮＡで、１週間に２回の間隔で３回筋肉内に免疫化した。それぞれのグループには３匹のマウスを含め、対照グループはｐＶＡＸ ＤＮＡをワクチン接種した。マウスを３回目の免疫化の１週間後に屠殺し、脾臓を無菌的に取り出した。脾臓細胞を回収し、ＲＢＣ溶解緩衝液の中に再度懸濁させて、赤血球を除去した。溶解後、同じグループに由来する脾細胞をプールし、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地の中に再度懸濁させた。分析のために細胞をカウントし、準備した。
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＩＰ ９６ウェルＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。プレートを、１×ＰＢＳの中に希釈したマウスＩＦＮ−γに対するｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１％のＢＳＡと５％のスクロースを含む１×ＰＢＳで、室温で２時間ブロックした。マウスの脾細胞を、完全培養培地（１０％のＦＢＳと抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０）の中に再度懸濁させた、１ウェルあたり２×１０５細胞の入力細胞数で、３連で加えた。ＨＩＶ−１サブタイプＢ、サブタイプＣ、グループＭのタンパク質コンセンサス配列全体、ＨＩＶ−１ ＭＮ（サブタイプＢ単離物）、ＨＩＶ−１ Ｃ．ＵＹ．０１．ＴＲＡ３０１１およびＣ．ＺＡ．０１．Ｊ５４Ｍａ（２つのサブタイプＣ単離物）エンベロープのタンパク質配列全体を提示する１１個のアミノ酸が重複している１５個のアミノ酸残基をそれぞれ含む６セットのペプチドを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。ｅｎｖペプチドのそれぞれのセットを、ＩＦＮ−γの放出の特異的刺激のための抗原として、４つのプールになるように、２μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度でプールした。５ｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と完全培養培地を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。プレートを、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーターの中での２４時間のインキュベーション後に、４回洗浄した。その後、ビオチニル化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体を添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、発色を製造業者の説明書（ＥＬＩＳＰＯＴ Ｂｌｕｅ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）にしたがって追跡した。プレートを風乾させ、スポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーシステム（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）をＩｍｍｎｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ソフトウェアとともに使用してカウントした。スポット形成細胞（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（ＳＦＣ）の平均数を、データの表示のために１×１０６個の脾細胞に調整した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、３つの別々の実験において３回繰り返した。
ＣＤ８＋Ｔ−細胞枯渇実験。ＣＤ８リンパ球を、ＣＤ８に対する抗体（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）でコーティングした免疫磁気（ｉｍｍｕｎｅ−ｍａｇｎｅｔｉｃ）ビーズを使用し、製造業者の説明書にしたがって、脾細胞から枯渇させた。ＣＤ８＋Ｔ−細胞の枯渇後、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを上記に記載したとおりに行った。
エピトープマッピング実験。反応性エピトープをマップするために、ＨＩＶ−１コンセンサスサブタイプＢおよびＨＩＶ−１ ＭＮの完全なエンベロープタンパク質を提示する１１個のアミノ酸が重複している１５個のアミノ酸残基を含むペプチドの２つのセットを、それぞれ、１４〜１５ペプチド／プールの２９のプールになるようにプールし、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを上記に記載したとおりに行った。２９のプールした刺激因子のこれらの様々なセットを、エピトープマッピングを容易にするマトリックスアッセイにおいて使用した。
統計分析。対応のあるＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したマウスとｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したマウスとの間での細胞性免疫応答の比較のために使用した。この実験では、ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えている。
結果
新規のサブタイプＢ初期トランスミッターコンセンサスをベースとするエンベロープ遺伝子の構築と設計。ＨＩＶ−１サブタイプＢのコンセンサス配列を、ＧｅｎＢａｎｋから取ってきた４２種類のサブタイプＢ配列から作成した。図１にまとめるように、いくつかの改変を、コンセンサス配列の作成後に行った。簡単に説明すると、粘膜から感染するウイルスを模倣したＨＩＶ−１エンベロープのＣＣＲ５−向性バージョンを生産するために、Ｖ３ループの中の６個の重要なアミノ酸を、初期トランスミッター単離物の配列にしたがって設計した。さらに、Ｖ１ループの中の１０個のアミノ酸とＶ２ループの中の１個のアミノ酸もまた、コンセンサス配列から欠失させた。高効率のリーダー配列を、発現を促進させるために開始コドンの上流に、インフレームで融合させた。膜貫通ドメインは、表面発現を促進させるために完全な状態のまま保ち、切断部位を、エンベロープタンパク質の適正な折り畳みおよび宿主プロテイナーゼ切断を得るために完全な状態のまま保った。細胞質末端は、エンベロープの再利用を防ぎ、そしてより安定で高度な表面発現を促進するために除去した（Ｂｅｒｌｉｏｚ−Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｃ，ら、１９９９．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌａｔｈｒｉｎ ａｄａｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３５０−１３５９；Ｂｕｌｔｍａｎｎ，Ａ．ら、２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｍｉｃ ｔａｉｌ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５２６３−５２７６）。さらに、より高レベルの発現を有するように、この遺伝子のコドン使用を、ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のコドンの偏重に合わせた（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｂ．１９９８．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：１４９７−５０３；Ｄｅｍｉ，Ｌ．ら、２００１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９１−１１００１）。加えて、ＲＮＡ最適化（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．ら、１９９７．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｌｌｏｗｓ Ｒｅｖ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇａｇ ａｎｄ Ｇａｇ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３）もまた行った：ＧＣ含有量の極めて高い（＞８０％）領域または極めて低い（＜３０％）領域と、シス作用配列モチーフ（例えば、内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、およびリボソーム侵入部位）を回避した。合成により操作したＥＹ２Ｅ１−Ｂ遺伝子を構築し、これは２７３４ｂｐの長さであった。ＥＹ２Ｅ１−Ｂ遺伝子を、さらなる実験のために、ｐＶＡＸの中のＢａｒｎＨＩとＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。
系統発生分析。無作為にサンプリングしたエンベロープサブタイプＢ配列からＥＹ２Ｅ１−Ｂ配列までの距離の分布を評価するために、系統発生分析を行った。図２に示すように、サンプリングした全ての配列に対して、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ配列の相対的な近さが観察された。ＥＹ２Ｅ１−Ｂ配列は、一次単離物であるＥＫ２Ｐ−Ｂ配列と比較すると、類似するスコアの同等の分布を有していた（表１）。ＥＹ２Ｅ１−Ｂについての平均の類似性スコアの割合（％）は８５．７％であり、一方、ＥＫ２Ｐ−Ｂについては７９．４％であった。
表１ 可能性のあるエンベロープワクチン候補とサブタイプＢエンベロープ配列のアラインメントとの間での類似性スコアの割合（％）の平均と範囲。
ＥＹ２Ｅ１−Ｂのインビボでの発現と抗原性の決定。ｐＥＹ２Ｅ１−ＢとｐＥＫ２Ｐ−Ｂのインビボでの発現を試験するために、ＲＤ細胞を材料および方法のセクションに記載したように、これらのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後に、全タンパク質を細胞溶解物から抽出し、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂの発現を検出するために、材料および方法のセクションに記載したエンベロープ特異的モノクローナル抗体２Ｇ１２で免疫ブロットした。ウェスタンブロットの結果は、これらの２つの構築物がエンベロープタンパク質を発現していたことを示していた（図３Ａ）。検出されたエンベロープタンパク質は約１２０ＫＤであった。表２は、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢとｐＥＫ２Ｐ−Ｂの比較を示す。
抗原性エピトープを決定するために、ＲＤ細胞溶解物に由来する発現されたエンベロープタンパク質を、３種類のｇｐ１２０−特異的抗体２Ｇ１２、４Ｇ１０、およびＩＤ６で免疫沈降させた。免疫沈降の後、ウェスタンブロッティングを行って、免疫沈降させたタンパク質を検出した。本発明者らの結果は、合成の免疫原は抗体２Ｇ１２とＩＤ６には結合することができたが、４Ｇ１０には結合できなかったことを示していた。抗体２Ｇ１２は多種多様な一次単離物を中和し、立体構造と炭水化物に依存性のｇｐ１２０エピトープと反応し、抗体ＩＤ６はｇｐ１２０とｇｐ１６０に結合して、ｇｐ１２０の最初の２０４個のアミノ酸に対して向けられるので、本発明者らの結果は、合成によって操作された免疫原であるＥＹ２Ｅ１−Ｂが比較的天然のままの立体構造に折り畳まれることができ、いくつかの天然の抗原性エピトープを保存していることを示唆していた。さらに、抗体４Ｇ１０がＨＩＶ−１ ＬＡＩ／ＢＲＵ Ｖ３モノクローナル抗体（ＬＡＩ ｇｐ１６０を認識する、Ｔ細胞系統適用株）であるので、本発明者らのデータはまた、この合成のエンベロープが受容体ＣＸＣＲ４を利用しないことを示唆していた。
さらに、発現を確認し、抗原性エピトープを決定するために、間接的な免疫蛍光アッセイを、トランスフェクトしたＲＤ細胞を使用して行った。高い特異的発現が、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂでトランスフェクトした細胞と、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂでトランスフェクトした細胞において、蛍光顕微鏡下で観察された。ＨＩＶ−１ ｅｎｖモノクローナルＦ１０５（不連続な、または立体構造的なｇｐ１２０エピトープと反応する）をこのアッセイにおいて使用した。図３Ｂに示すように、Ｅｎｖタンパク質を発現しているトランスフェクトされた細胞は、典型的なローダミン蛍光を示し、これもまた、合成のタンパク質が発現されたこと、そして比較的天然のままの立体構造を有していることを示唆していた。対照としての、ｐＶＡＸでトランスフェクトされたＲＤ細胞の中では、発現は検出されなかった。
体液性応答の誘導。合成の免疫原がより高い力価のエンベロープ特異的抗体応答を誘発できるかどうかを決定するために、血清を、ｐＶＡＸ、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ、およびｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウスから回収し、ＥＬＩＳＡを行った。図４Ａに示すように、本発明者らは、比較的高いレベルのクレードＢエンベロープ特異的抗体応答を、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したマウスのものと比較して、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したマウスから回収した血清を用いた場合に、観察した。対照的に、ベクターだけのマウスは、特異的抗体応答は生じなかった。しかし、クレードＡ／ＥおよびクレードＣタンパク質に対しては、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂを注射したマウスのいずれにおいても、検出可能な応答は存在しなかった（図４Ｂおよび４Ｃ）。このことは、合成のコンセンサスをベースとする免疫原は比較的天然のままの立体構造を有しており、天然の抗原性エピトープを保存しているが、広範な交差クレードの抗体免疫応答を誘導することができない場合があることを示している。
ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した強い、そして広範な細胞性免疫応答。ＢａｌＢ／Ｃマウスを、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化し、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を行って、ＨＩＶ−１コンセンサスサブタイプＢタンパク質由来のペプチドの４つのプールに対して応答した抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞の数を決定した（図５Ａ）。１００万個の細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数による測定としての応答の大きさは、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂをワクチン接種したマウスにおいては２７．５から５２０の範囲であった。比較して、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したマウスに由来する脾細胞は、わずかに、２から２３７．５のスポットの範囲を示した（ｐ＜０．０５）。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂを免疫化したマウスにおける４つのプール全てについての、１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵの付加頻度（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は、１９７６．２５＋２６０であったが、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したマウスの中での１００万個の細胞あたりのＳＦＵの数は、５１９＋４５であった。ｐＶＡＸベクターで免疫化したマウスに由来する細胞を陰性対照として使用し、これは、コンセンサスエンベロープＢペプチドプールについては、１００万個の脾細胞あたりわずか６０＋５のＳＦＵを示した（ｐ＜０．０５）。本発明者らは、３つの別々の実験において同様の結果を観察した。したがって、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ構築物は、さらに４回まで、細胞によって媒介される免疫応答を駆動する能力がある。本発明者らはまた、ＣＤ８＋リンパ球が、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウスにおいて検出されたＩＦＮ−γの分泌に応答するかどうかも決定した。図５Ｂに示すように、１００万個の細胞あたりのＳＦＵの数は、ＣＤ８＋枯渇の後には、１２７．５＋１１にまで減少した。このことは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＥＬＩＳｐｏｔによって観察されたＩＦＮ−γ生産細胞の頻度の約９０％の減少が存在することを示している。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導されたＩＦＮ−γの生産は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。
加えて、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答をモデル化し、そしてそれらの抗原を同定するために、本発明者らは、トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２．１／Ｈ２−Ｄｄマウスを使用して、上記に記載したものと同じＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。図５Ｃに示すように、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したトランスジェニックマウスにおける４つのプールの全てについて、１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵの付加頻度は、２３６２＋２５７であり、一方、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したトランスジェニックマウスの中の１００万個の細胞あたりのＳＦＵの数は、わずか４９３＋５７であった。これらの結果は、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ構築物が、トランスジェニックマウスにおいて、さらに４回まで、細胞によって媒介される免疫応答を駆動する能力があることを示していた。ＣＤ８枯渇後のＥＬＩＳｐｏｔのデータは、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導されたＩＦＮ−γの生産が主にＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されることを示唆していた（図５Ｄ）。
さらに、本発明者らは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて観察された細胞性の免疫応答をさらに詳細に分析することに興味を抱いた。したがって、さらに別のＥＬＩＳｐｏｔアッセイのセットを、コンセンサスサブタイプＢエンベロープタンパク質にまたがるペプチドのライブラリーに対して行った。サブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質を含む１１個のアミノ酸が重複している１５マーのペプチドの完全なセットを、このマッピング実験を実施するために使用した。この実験は、合成のエンベロープによって誘導された明確な優勢エピトープは存在しないことを示していた。しかし、ｐＥＹ２Ｅｌ−Ｂ−をワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスに由来する脾細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ分析は、２９のプールのうちの１８のプールが５０を超えるスポットを示し、一方、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスにおいては、わずかに６つのプールがそのようなスポットを示したことを明らかにした（図５Ｅ）。これらの結果は、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原によって誘導された細胞性の免疫応答の幅と大きさの有意な増大を示していた。
ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導された強く交差反応性の細胞性免疫応答。ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原が広範囲の交差反応性の細胞性免疫応答を誘導できるかどうかを決定するために、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔを、ＢａｌＢ／ＣトランスジェニックマウスとＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において、ＨＩＶ−１ ＭＮグループＭ、コンセンサスサブタイプＣ、ＨＩＶ−１ ＭＮ（サブタイプＢ単離物）、ＨＩＶ−１ Ｃ．ＵＹ．０１．ＴＲＡ３０１１とＣ．ＺＡ．０１．Ｊ５４Ｍａ（２つのサブタイプＣ単離物）エンベロープペプチドを使用して行った。これらのアッセイではさらに、図５Ａ、Ｃ、およびＥで観察された結果が単独で、ペプチド標的と関係しているかどうか、または免疫幅の増大が実際に原因であるかどうかを決定するであろう。図６Ａに示すように、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスにおける、ＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチドの４つのプールに対する、１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵの付加数は、１８５５＋２１５．８であった。これは、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウスにおけるもの（１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵは７００＋１６８．２であった）の約２倍であり、このことは、ｐＥＹ２Ｅｌ−Ｂが、サブタイプＢの中でｐＥＫ２Ｐ−Ｂよりも強い交差反応性を有していることを示している。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したＢａｌＢ／Ｃマウスにおける、４つのＨＩＶグループＭ（図６Ｂ）およびサブタイプＣ（図６Ｃ）コンセンサスエンベロープペプチドのプールでの刺激に応答したＩＦＮ−γスポットの数は、それぞれ、１１５０＋１９１．３および７１５＋１１６．１であった。グループＭおよびサブタイプＣペプチドに対するスポットの数（これらは、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスにおいては、６３５＋１５２．３および３４５＋８２．３であった）と比較して、これらのデータは、ｐＥＹ２Ｅｌ−Ｂによって誘発された交差クレードの免疫応答が、ＢａｌＢ／ＣマウスにおいてｐＥＫ２Ｐ−Ｂによって誘導されたものよりも、およそ４５％強いことを示している。
重要なことは、本発明者らが、トランスジェニックマウスにおいてｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導された、はるかに強い交差反応性の細胞性免疫応答を観察したことである（図６Ｆ〜Ｊ）。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂをワクチン接種したトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１ ＭＮエンベロープペプチドの４つのプールに対する１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵの付加数は１０８７＋１５３であり、これは、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂを免疫化したＨＬＡ−Ａ２マウスにおける付加数（１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵは、３１６＋６３であった）よりも約３倍大きく（図６Ｆ）、このことは、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂもまた、トランスジェニックマウスにおいてサブタイプＢの中でｐＥＫ２Ｐ−Ｂよりも強い交差反応性を誘発することができたことを示している。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したトランスジェニックマウスにおいて、４つのＨＩＶグループＭ（図６Ｇ）およびサブタイプＣ（図６Ｈ）のコンセンサスエンベロープペプチドのプールでの刺激に応答したＩＦＮ−γスポットの数は、それぞれ、２１１６＋２１６および８９３＋１５４であった。ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したトランスジェニックマウスにおいて４７３＋５０および２６６＋５５であった、グループＭおよびサブタイプＣペプチドに対するスポットの数と比較して、これらのデータは、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘発された交差クレードの免疫応答が、トランスジェニックマウスにおいては、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂによって誘導されたものよりも約３倍から４倍強かったことを示していた。さらに、他のペプチドセットによって得られる幅と交差反応性を評価するためのストリンジェントな対照とするべき、２つのサブタイプＣ単離物ペプチドのセットを、交差クレードＣ免疫応答をさらに決定するために使用した。ＢａｌＢ／Ｃマウスにおいては、ｐＥＹ２Ｅ１−ＢおよびｐＥＫ２Ｐ−Ｂによって誘発された、これらの２つのサブタイプＣ単離物のセットに対する交差反応性についてはそれほど多くの相違はなかったが（図６ＤおよびＥ）、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂによって誘導されたこれらの２つのサブタイプＣ単離物のセットに対する交差クレードの反応性は、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂによって誘導されたものよりも約３倍強かった（図６ＩおよびＪ）。Ｃ．ＺＡ．０１．Ｊ５４ＭａおよびＣ．ＵＹ．０１．ＴＲＡ３０１１ペプチドに対するスポットの数は、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂをワクチン接種したトランスジェニックにおいては、１０８０＋２０６および８９０＋１５０であったが、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したトランスジェニックマウスにおいては、数は、わずかに３０５＋３８および３１０＋６２であった。
最後に、本発明者らは、ＢａｌＢ／ＣおよびＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において上記で観察された、ＨＩＶ−１ ＭＮに対する細胞性免疫応答を詳細に実験することにより、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原によって誘導されたサブタイプ特異的標的に対する交差反応性の細胞性免疫応答の幅の増大もまた存在するかどうかを決定した。エピトープマッピングアッセイを、サブタイプＢ ＭＮエンベロープタンパク質にまがたるペプチドのライブラリーに対して行った。結果は、いずれのマウス株においても、合成のエンベロープによって誘導された明確な優勢エピトープはなかったことを示唆していた。しかし、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスに由来する脾細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ分析は、２９個のプールのうちの１４個のプールが５０を超えるスポットを示し、一方、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したＢａｌＢ／Ｃマウスにおいてはわずかに９個のプールしか５０個を超えるスポットを示さなかったことを明らかにした（図７Ａ）。同様に、トランスジェニックマウスにおいては、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで免疫化したトランスジェニックマウスにおいては、２９個のプールのうちの１８個のプールが５０個を超えるスポットを示し、一方、ｐＥＫ２Ｐ−Ｂをワクチン接種したトランスジェニックマウスにおいては、わずかに６個のプールしか、５０個を超えるスポットを示さなかった（図７Ｂ）。これらのデータは、ＢａｌＢ／ＣおよびＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのいずれにおいても、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原によって誘導された交差反応性の細胞性免疫応答の幅と大きさの有意な増大を示していた。
考察
世界的なＨＩＶ−１ ＤＮＡワクチンの努力は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答により、感染からの防御または感染後の複製の制御に対するいくらかの寄与が提供され得るという原理によって導かれている。ＤＮＡワクチンは、ウイルスの複製に影響を及ぼすことができるが、一般的には、これらは、弱毒化された生のウイルスベクターの場合の免疫の誘導ほどは強力ではない（Ａｌｍｏｎｄ，Ｎ．ら、１９９５．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３４５：１３４２−１３４４；Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、１９９６，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＮ−ｒｇｐ１２０−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７３：５２−９；Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．ら、１９９７．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ＨＩＶ−１ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：５２６−５３２；Ｄａｎｉｅｌ，Ｍ．Ｃ．ら、１９９２．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｆ ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１９３８−１９４１）。したがって、細胞性免疫応答の幅と大きさを改善することを助けるストラテジーが重要である。本発明により、別のアプローチとして文献に報告されているが、これまでには１つのワクチン様式として一緒に集められていなかった、複数の免疫原のいくつかの特徴を使用して、新規の抗原が提供される。概念の実証として、合成によって操作されたコンセンサスをベースとするエンベロープ免疫原を開発し、細胞媒介性の免疫応答の誘導のために最適化された一次配列免疫原と比較した。発現のデータは、この操作された新しいエンベロープ遺伝子が、哺乳動物の細胞株の中で効率よく発現され得るが、これらの２つの免疫原の発現レベルは極めて似ていることを示していた（図３Ａ）。本発明者らは、免疫原性の実験において、この機能性の免疫原によって誘導された細胞性免疫応答が、一次エンベロープワクチンと比較して大きな多様性と大きさを示したことを観察した。ＢａｌＢ／ＣおよびＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの両方において得られたエピトープマッピングのデータは、この多様性と大きさの改善が、これらのハプロタイプを超えて維持されることを明らかに示していた。この発見をさらに確認するために、本発明者らはまた、コンセンサスをベースとするサブタイプＣエンベロープ免疫原を開発し、これを、一次サブタイプＣ免疫原と比較した。再び、この合成のコンセンサスをベースとするサブタイプＣエンベロープ免疫原は、一次Ｃ免疫原と比較して、細胞性免疫応答の多様性と大きさの増大を示した（未公開データ）。
ワクチン設計のストラテジーの観点から、ワクチンの候補と、感染性ウイルスまたはチャレンジウイルスとの間での配列相同性は、重要な考慮事項であり得る。ワクチン株と今まさに流行しているウイルスとの間での配列相違の程度を最小にするための有効なアプローチは、これらのウイルスにとって「中枢的な」人工的な配列を作成することである。そのような配列を設計するための１つのストラテジーは、アラインメントの中のそれぞれの位置にある最も一般的なアミノ酸から導かれたコンセンサス配列を使用することである。この実験において、本発明者らは、コンセンサスをベースとするサブタイプＢエンベロープワクチンを開発し、この合成の免疫原が高い交差反応性を有すると考えた。本発明者らの結果は、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂワクチンによって誘導された多様な細胞性免疫応答が存在することを示していた。Ｂａｌｂ／ｃと、トランスジェニックマウスの両方でのペプチドマッピングの結果も、さらに、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原が免疫応答の幅を広げたことを示した。さらに、交差反応性の細胞性免疫応答実験の結果は、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂが有意に強く、幅広い交差反応性の細胞性免疫応答を誘発できたことを示していた。したがって、人工的なコンセンサスエンベロープ免疫原には、任意の個々の自然界に存在している単離物において見られるものよりも保存されているエピトープが含まれ、これらは、より幅広い交差クレードのＣＴＬ応答を誘導する。
理論的には、コンセンサス配列には利点と欠点がある。コンセンサス配列は、今流行している単離物に基づいて作成されるので、これは、任意の所定の自然界に存在しているウイルス単離物よりも今現在流行しているウイルス株に遺伝的により近い可能性がある。しかし、グローバルな配列決定は、一般的には、急性の感染の際にサンプリングされたウイルスの代わりに、慢性的な感染の際にサンプリングされたウイルスを用いて行われるので、そのほとんどの部分が回避されているエピトープに対するコンセンサスなワクチン応答が不利であり得る可能性が生じる。この欠点を最小にするために、ワクチンの設計のための１つの有用なストラテジーでは、初期トランスミッター配列が考慮され得る。エンベロープタンパク質は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子の中の超可変領域が迅速な挿入および欠失によって変異し、そして、点変異によっては変異しないという理由から、ＨＩＶタンパク質を人工的に構築することは最も困難である。超可変領域の長さの相違は、これらの領域のコンセンサス配列を作成することを難しくする。最近、Ｇａｏら、（Ｇａｏ，Ｆ．，Ｅら、２００５．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｎｉｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｒｏｕｐ ｍ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：１ １５４−６３）がグループＭコンセンサスエンベロープ配列を作成したが、ＣＲＦ０８ ＢＣ組み換え体株の対応する領域に由来するコンセンサスではない配列が、これらの可変領域において使用された。実験は、より短いＶ１、Ｖ２、およびＶ４領域を有しているエンベロープ糖タンパク質をコードするサブタイプＣウイルスが、レシピエントにおいて、偶然によって期待される頻度よりも有意に大きい頻度で感染することを示した。初期感染に由来するサブタイプＡエンベロープ配列もまた、有意に短いＶ１およびＶ２ループ配列と、より少ない可能性のあるＮ結合グリコシル化部位を有していた（Ｃｈｏｈａｎ，Ｂ．，Ｄ．ら、２００５．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔｅｒ Ｖ１−Ｖ２ ｌｏｏｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｍａｙ ｉｍｐａｃｔ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６５２８−６５３１）。対照的に、最近流行したサブタイプＢ変異体は、より短いＶ１およびＶ２ループは有していなかった。しかし、サブタイプＢ感染の症例が、主に、同性愛者間での感染または注射の使用の結果であったことに注目することが重要であり得る。さらに、実験は、コンパクトなＶ１、Ｖ２領域を有している可能性のある機能性のコンセンサスが、ＣＤ４結合ドメインの露出を大きくし、ゆえに、中和に対する感度を高めることを示唆した（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｔ．Ｇ．ら、２００１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＤ４ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ，ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ａ ＣＤ４−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５２３０−５２３９；Ｋｏｌｃｈｉｎｓｋｙ，Ｐ．ら、２００１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ４−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｎｕｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２０４１−２０５０；Ｐｉｃｋｏｒａ，Ｃ．ら、２００５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｏｓｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１２５７５−１２５８３；Ｐｕｆｆｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、２００２．ＣＤ４ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｖｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒｏｐｉｓｍ，ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２５９５−２６０５）。本発明者らは、本発明者らがサブタイプＢコンセンサス配列を作成する際には、Ｖ１およびＶ２領域を短くした。
ＨＩＶ−１感染の初期には、非合胞体形成型（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）（ＮＳｌ）ウイルスが優勢であり、これはゆっくりと複製し、それらの主要な受容体としてＣＣＲ５を使用する。合胞体形成型（Ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）（ＳＩ）ウイルス（これは、感染した個体のうちの約５０％において現われ、これには、ＣＤ４細胞の減少の加速と、進行性の感染の臨床的経過が先行する）は、主要な受容体としてＣＸＣＲ４を使用する。ＨＩＶ変異体の様々な共受容体の使用は、全てのサブタイプについて明らかにされている。サブタイプＣウイルスは、サブタイプＣのＨＩＶ変異体を使用するＣＸＣＲ４の提示不足が頻繁に報告されていることが原因で、ほとんどの他のサブタイプとは異なるようである。したがって、ＣＣＲ５の利用は、ワクチンの設計については極めて重要な考慮事項であるはずである。これまでの報告では、ｇｐ１２０のＶ３領域が受容体利用において重要な役割を担っていることが示されている。Ｖ３ループの中の６個の残基が、ＣＣＲ５相互作用に重要であることが特定されている：アルギニン３０７、リジン３１４、イソロイシン３１６、アルギニン３２２、フェニルアラニン３２４、およびアラニン３３７。しかし、サブタイプＣ初期トランスミッターの配列に基づくと、３２２位の残基は、アルギニンではなくグルタミンであるべきである。まとめると、ＣＣＲ５の利用に重要な残基を示している以前の実験と初期トランスミッターの配列に基づいて、本発明者らは、理論上、ＣＣＲ５共受容体利用を標的化し得る免疫応答を駆動することができる、サブタイプＢコンセンサスエンベロープ免疫原を設計した。
交差反応性の可能性を最大にするために、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスエンベロープ配列が作成された。しかし、サブタイプ特異的エンベロープコンセンサスワクチンが、少なくとも細胞性免疫応答のレベルで、流行しているウイルスと比較してワクチン抗原の全体的な配列類似性についての歩み寄りを示し得る可能性がある。実験は、サブタイプＢおよびＣのエンベロープタンパク質の様々な領域において高度な選択性が同定されたことを示している。これは、サブタイプＢおよびＣにおいては、エンベロープタンパク質の様々な領域に対する様々な免疫の圧力（ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によって引き起こされ得る。したがって、ワクチンと流行しているウイルスに対する免疫応答として、サブタイプ特異的エンベロープワクチンを使用することにおいては、抗原性ドメインを共有しているとの利点がある。グループＭとサブタイプの特異的エンベロープワクチンを比較するさらなる実験が、この問題点をさらに明確にするためには必要である。
コンセンサス配列を使用することについての別の重要な懸案事項は、その配列が、いずれの自然界に存在しているウイルスの中でも見られない組み合わせで多形を組み合わせており、したがって、不適切なタンパク質の折り畳みを生じる可能性があることである。これまでの実験は、グループＭコンセンサス免疫原が自然界に存在している立体構造に折り畳まれ得、エンベロープの抗原性エピトープを保存しており、弱い中和抗体応答を誘発することを示した。合成のタンパク質が抗体２Ｇ１２、ＩＤ６、およびＦ１０５に結合できるという事実に基づいて、本発明者らは、ｐＥＹ２Ｅｌ−Ｂが、いくらか自然界に存在している立体構造を有し得ると考えた。重要なことは、本発明者らのデータもまた、ＥＹ２Ｅ１−Ｂ免疫原が、高力価のサブタイプＢエンベロープ特異的抗体を誘導することができることを示したことであり、このことは、さらに、この合成の免疫原がクラスＩＩエピトープをより十分に保存している可能性があることを示している。この領域でのさらなる実験が重要であろう。
新規のＨＩＶ−１ワクチンストラテジーの作成の場合には、前臨床モデルを使用して、ヒトにおいてこれらのワクチンの効力を予想する要望もまた高まっている。本発明者らの実験においては、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを使用して、合成の免疫原によって誘発された細胞性免疫応答を実験した。実験は、このトランスジェニック株が、ヒトＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞の最適な刺激を含む感染性疾患のためのワクチンの設計および試験のための重要な前臨床モデルであることを示した。このモデルにおいては、結果は、ＥＹ２Ｅ１−Ｂが、ＥＫ２Ｐ−Ｂと比較して、はるかに幅広く、強い細胞性免疫応答を誘発できたことを示しており、このことは、この新しいワクチンがＨＬＡ−Ａ２拘束細胞性応答を誘導するより強い能力を有している可能性があることを示唆している。ヒト以外の霊長類におけるこの免疫原のさらなる実験を計画している。
まとめると、本発明者らの結果は、ＥＹ２Ｅ１−Ｂが、ＤＮＡワクチンカセットとして、ＣＴＬ応答の大きさと幅の両方を増大させる免疫原となり得ることを示唆している。より一般的な意味においては、この構築物は、ＤＮＡベクター以外のアプローチにおいて、ＨＩＶ株に対してより強く、そしてより幅広い細胞性免疫応答の誘導のための他の土台において有用である可能性がある。
（実施例２）
誘発された細胞性免疫応答の多様性および幅を増大させる新規の操作されたＨＩＶ−１クレードＣエンベロープＤＮＡワクチンの開発
強いＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ応答は、急性感染および無症候性感染の間のウイルス量の管理において重要な役割を有している。しかし、コンセンサス免疫原についての最近の実験は、改良された細胞性免疫応答を目に見えるほどに明らかにすることはできていない。ここでは、本発明者らは、改善された細胞性免疫応答について、新規の操作されたクレードＣコンセンサスをベースとするエンベロープ免疫原を試験する。新規のワクチン（ｐＥＹ３Ｅｌ−Ｃ）を、ＨＩＶ−１クレードＣコンセンサスエンベロープ配列から作成した。初期トランスミッター配列に基づいて高度に可変性のＶ１およびＶ２領域を短くすること、ＣＣＲ５の利用のためのＶ３ループの保持、エンベロープの再利用を防ぐためのＣ末端からの細胞質末端領域の除去、ならびに、適正な折り畳みのための切断部位とＴＭＤの保持を含む、いくつかの改変を行った。また、ＩｇＥリーダー配列をＮ末端に付加した。このコンセンサスＤＮＡワクチンもまた、ＲＮＡ最適化を行い、コドン最適化を行った。細胞性免疫応答を、ＥＬＩＳｐｏｔおよびエピトープマッピングアッセイによって、ＢａｌＢ／Ｃマウスにおいて実験した。ＤＮＡワクチンとして実験した場合には、ｐＥＫ３Ｐ−Ｃ（クレードＣ ｅｎｖの一次単離物に由来する）と比較して、本発明者らの構築物（ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃ）は、細胞性免疫応答を駆動することにおいてより有効であった。ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された細胞性免疫応答は、コンセンサスクレードＣペプチドによって刺激した場合には、ｐＥＫ３Ｐ−Ｃよりも大きさにおいて大きかった。加えて、コンセンサス免疫原は、これらもまたクレードＣに由来する一次単離物ペプチドの２つの他のセットによって刺激された場合には、細胞性免疫応答の大きさの増大を誘発した。大きくなった大きさに加えて、ＣＴＬ応答の幅の増大が、２９の強い反応性のペプチドのプールのうちの少なくとも１５（１００万個の脾細胞あたり５０個を超えるスポットを有している）を誘導するｐＥＹ３Ｅ１−Ｃの能力によってサポートされたが、ｐＥＫ３Ｐ−Ｃは、わずかに、２９個のプールのうちの３個、そして、２つの一時単離物ペプチドのセットに応答する強い反応性を有している２９のプールのうちの９個しか誘導しなかった。これらは、幅を評価するためのストリンジェントな対照となるそれらの独自性と能力について選択した。さらに、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃは、強い交差クレードの細胞性免疫応答を、クレードＢペプチドで刺激された場合に誘発した。コンセンサス免疫原ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃは、ＤＮＡワクチンカセットとして、ＣＴＬ応答の大きさと幅の両方を増大させ、このことは、ＨＩＶワクチン混合物において成分抗原となるコンセンサス免疫原の能力が、さらなる実験に値することを示唆している。
幅広い遺伝子多様性、迅速な変異、および既存の株の組み換えのために、有効なワクチンの作成の難しさはとてつもない。個々の単離物由来の候補のＤＮＡワクチンは、多様な流行しているＨＩＶ−１株に対する防御に不可欠な交差反応性を誘発できない可能性がある。
加えて、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を発現しているＤＮＡワクチンは、極めて免疫原性が低いことが報告されている。
本発明者らは、ＤＮＡワクチンによって誘発されたＣＴＬ応答の効力を増大させるために多工程のストラテジーを使用して、流行しているウイルス株に対する防御を提供することができた。
最近の実験は、コンセンサス免疫原が、迅速に進化しているＨＩＶ−１ウイルスによって作成される多様性の障害を克服できる可能性があることを示している。
Ｄｅｒｄｅｙｎらは、より短いＶ１〜Ｖ４領域が、初期感染性サブタイプＣウイルスの特徴であることを明らかにしており、本発明者らの構築物は、初期に感染したウイルスによって生じる免疫応答を生じることにおいて有用である可能性があるこの特徴を有するように設計されている。
さらに、本発明者らのＤＮＡワクチンの発現レベルは、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および免疫グロブリンリーダー配列の付加によって増大させられている。
ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ応答は、急性感染および無症候性感染、ならびに、ＡＩＤＳの発症の間のウイルス量を管理することにおいて重要であることが示されており、したがって、以下のデータは、本発明者らの新規の免疫原によって誘発されたＣＴＬ応答に焦点があてられる。
図１３は、誘発された細胞性免疫応答の多様性と幅を増大させる、新規の操作されたＨＩＶ−１クレードＣエンベロープＤＮＡワクチンの開発のための免疫原の設計を示す。
図１４は、系統発生学的関係を示す；３６個のＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ配列、ＥＹ３Ｅ１−Ｃ、ＥＫ３Ｐ−Ｃ、２つのサブタイプＢ、１つのサブタイプＡ、および１つのサブタイプＤ配列（外集団）を、系統発生学的分析に含めた。幅広い試料多様性を示したサブタイプＣエンベロープ配列は１２の国に由来した。
表３は、可能性のあるエンベロープワクチン候補とサブタイプＣエンベロープ配列のアラインメントとの間での類似性の割合（％）のスコアの平均と範囲を示す。
３匹のＢａｌＢ／Ｃマウスの３つのグループを、免疫化の間に２週間の間隔を空けて、１００μｇのＤＮＡで３回免疫化した。７週目に、細胞実験のために脾臓を回収した。
図１５のパネルＡおよびＢに示すように、強い細胞性応答がｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された。
図１６は、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された、強い、そして幅広い細胞性応答を示す。コンセンサスＣ ｅｎｖペプチドの２９のプールで刺激した場合には、ｐＥＹ３Ｅｌ−Ｃをワクチン接種したマウスは、２３のプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発し；ｐＥＫ３Ｐ−Ｃをワクチン接種したマウスは、２つのプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発した。
図１７のパネルＡ〜Ｄは、同じクレードにおいて、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された、強い交差反応性の細胞性応答を示す。
図１８のパネルＡおよびＢは、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された、強く、そして幅広い交差反応性の細胞性応答を示す。パネルＡは、サブタイプＣ（ウルグアイ）ｅｎｖ−特異的ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによるデータを示す。クレードＣ（ウルグアイ）ｅｎｖペプチドの２９のプールで刺激した場合には：ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃをワクチン接種したマウスは、１２個のプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発した；ｐＥＫ３Ｐ−Ｃをワクチン接種したマウスは、３つのプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発した。パネルＢは、サブタイプＣ（南アフリカ）ｅｎｖ−特異的ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによるデータを示す。クレードＣ（南アフリカ）ｅｎｖペプチドの２９のプールで刺激した場合には、：ｐＥＹ３Ｅｌ−Ｃをワクチン接種したマウスは、１３のプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発した；ｐＥＫ３Ｐ−Ｃをワクチン接種したマウスは、５のプールから、１００万個の脾細胞あたり５０個を越えるスポットを誘発した。
図１９のパネルＡ〜ｆは、クレード間で、ｐＥＹ３Ｅ１−Ｃによって誘発された、強い交差反応性の細胞性応答を示す。
ＥＯＣ免疫原によって誘導された細胞性免疫応答の幅と大きさは、有意に増大した。より幅広い交差クレードの反応性が、この免疫原のさらなる利点として現れる。
（実施例３）
Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質をコードする新規の操作されたＨＰＶ−１６ ＤＮＡワクチンの効力
免疫原を、Ｅ６とＥ７の配列がタンパク質分解的切断によって分離されるようなポリタンパク質として発現されるように設計した。ポリタンパク質はまた、ＩｇＥリーダー配列とともに発現させた。ポリタンパク質の設計には、ｐ５３の結合と分解に重要なＥ６配列の中に欠失または変異を、そしてＥ７タンパク質上のＲｂ結合部位の中に変異を含めた。図２３は、免疫原の設計の説明を提供する。
ポリタンパク質をコードするコード配列をベクターｐＶＡＸに挿入して、プラスミドｐ１６６７を得た。図２４は、ｐＶａｘとｐ１６６７のマップを示す。
ＴＣ１腫瘍細胞を、ＨＰＶ−１６Ｅ７で不死化させ、そしてｃ−Ｈａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子で形質転換した。これらの細胞は、Ｅ７を低レベルで発現し、極めて発ガン性が高い。
マウスでの免疫原性実験においては、３匹のマウス／グループのＣ５７ＢＬ６マウスに、１００μｇのＤＮＡ／マウスを投与した。グループには以下を含めた：１）ｐＶＡＸ−対照ベクターを投与した対照、および２）ｐ１６６７を投与した試験。マウスは、０日目、１４日目、および２８日目にワクチン接種した。３５日目にマウスを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴを行った（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ＣＭＩ）。
ＤＮＡ免疫原ｐ１６６７によって誘導された細胞性免疫応答についてのデータを図２５に示す。ＨＰＶ１６コンセンサスＥ６およびＥ７ペプチド（９アミノ酸が重複している３７、１５−マー）を、２つのプール−プール１：１８ペプチド；プール２：１９ペプチドにおいて使用した。パネルＡおよびＣは、脾細胞全てによるデータを示す。パネルＢおよびＤは、ＣＤ８を枯渇させた試料によるデータを示す。
図２６は、免疫優勢エピトープマッピングの結果を示す。２つの配列が記載される。
マウスでの予防的実験においては、５匹のマウス／グループのＣ５７ＢＬ６マウスに、１００μｇのＤＮＡ／マウスを投与した。グループには以下を含めた：１）未処置（ＰＢＳを注射した）、２）ｐＶＡＸ−対照ベクターを投与した対照、および３）ｐ１６６７を投与した試験。マウスは、０日目、１４日目、および２８日目にワクチン接種した。３５日目に、マウスをＴＣ−１細胞でチャレンジし、その後、腫瘍の大きさの測定を行った。結果を図２７に示す。ＩＬ−１５構築物を同時投与したグループによるデータもまた示す。
マウスでの腫瘍退縮実験においては、５匹のマウス／グループのＣ５７ＢＬ６マウスに、１００μｇのＤＮＡ／マウスを投与した。グループには以下を含めた：１）未処置（ＰＢＳを注射した）、２）ｐＶＡＸ−対照ベクターを投与した対照、および３）ｐ１６６７を投与した試験。マウスを、０日目に５×１０４のＴＣ−１細胞でチャレンジした。マウスに、３日目、１０日目、および１７日目にＤＮＡワクチンを投与した。腫瘍を、８日目に開始して測定した。結果を図２８に示す。ＩＬ−１５構築物を同時投与したグループによるデータもまた示す。
脾臓の中のＥ７テトラマー陽性リンパ球のレベルを決定した。図２９は、Ｅ７テトラマー陽性リンパ球の割合（％）としてデータを示す。ＤＮＡワクチンｐ１６６７は、脾臓の中のＣＤ６２ＬｌｏであるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。
腫瘍の中のＥ７テトラマー陽性リンパ球のレベルを決定した。図３０は、Ｅ７テトラマー陽性リンパ球の割合（％）としてデータを示す。ＤＮＡワクチンｐ１６６７は、腫瘍の中のＣＤ６２ＬｌｏであるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。
トランスジェニックマウスにおいて、Ｅ６／Ｅ７ ＤＮＡワクチン防御実験を行った。未処置のもの、ｐＶＡＸ、ｐ１６６７、ｐ１６６７＋ＩＬ−１５、およびＥ７／ＨｉｓＢの間で比較を行った。データを図３１に示す。ｐ１６６７と、ｐ１６６７＋ＩＬ−１５は完全に防御した。
本明細書中に示したデータは、以下の結論をサポートする。ｐ１６６７構築物は、ＩＦＮ−γ応答の上昇を媒介するＥ７特異的ＣＤ８＋リンパ球を誘導することができる強い細胞性免疫応答を誘導する。本発明者らは、ＤＮＡ構築物の投与後にそれに対して抗原特異的ＣＴＬが生じる、優勢、および新規のサブドミナントＨＰＶ−１６エピトープの両方を同定した。ｐ１６６７構築物は、腫瘍の増殖を妨げ、そしてＣ５７／ＢＬ６およびトランスジェニックマウスのいずれにおいても腫瘍の退縮を引き起こすことができる。ＤＮＡワクチンｐ１６６７は、ＨＰＶが関係している微視的なガンを標的化するための新規の治療ストラテジーの大きな可能性を示す。
（実施例４）
ＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサス配列をコードする核酸配列は、様々な他のＨＩＶタンパク質（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、およびＶｐｒ）をコードする核酸配列と組み合わせたＤＮＡワクチンとして、例えば、筋肉内または皮内送達のためのエレクトロポレーション技術を使用して投与することができる。多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）／多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ＨＩＶワクチン構築物は、免疫応答の増強を提供することができ、特に有用であり得る。いくつかの実施形態においては、ＩＬ−１２コード配列がさらに提供される。米国特許出願公開番号２００７０１０６０６２（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）には、ＨＩＶ Ｖｉｆ ＤＮＡワクチンが開示されている。米国特許出願公開番号２００４０１０６１００（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）には、ＨＩＶアクセサリータンパク質と、加えてさらに別のワクチン構築物を調製するために使用することができるそのようなタンパク質の配列が含まれているＨＩＶワクチンが開示されている。米国特許第６，４６８，９８２号、同第５，８１７，６３７号、および同第５，５９３，９７２号（これらは、引用により本明細書中に組み入れられる）には、ＨＩＶ ｇａｇ、ＨＩＶ ｐｏｌ、およびＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ構築物が含まれているＤＮＡワクチンが開示されている。エレクトロポレーションは、米国特許第７，２４５，９６３号（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９５０２（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）には、ＩＬ−１２構築物が開示されている。米国特許出願公開番号２００７００４１９４１（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）には、ＩＬ−１５をコードする構築物が開示されている。
（実施例５）
アカゲザルの２つのグループを、最適化したプラスミドｇａｇおよびｅｎｖ構築物を用いて、プラスミドＩＬ−１２を伴って、またはこれを伴わずに、３回ＩＭ免疫化した。同じ免疫化ストラテジーを、２つのさらに別のグループについて使用したが、プラスミドは、インビボでのエレクトロポレーションで、またはインビボでのエレクトロポレーションを用いることなく送達した。
細胞性応答を、それぞれの免疫化後と、メモリー応答については５ヶ月後に、ＩＦＮγ
ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。実験全体を通じて、体液性応答を、組み換え体ｐ２４およびｇｐ１６０ ＥＬＩＳＡによって評価した。抗原特異的Ｔ細胞の増殖能力を、ＣＦＳＥ染色によって決定した。細胞内サイトカイン染色を、誘導されたＴ細胞応答の機能的特徴をさらに特性決定するために行った。
プラスミドＩＬ−１２は、本発明者らの最適化した構築物に対する細胞性応答を増大させた。しかし、プラスミドの送達を増強するためのエレクトロポレーションの使用によって、プラスミドＩＬ−１２を用いたＩＭ免疫化と比較して、細胞性応答と体液性応答の両方を改善することができた。様々なパラメーターによって測定すると、プラスミドＩＬ−１２とエレクトロポレーションの組み合わせにより、一次応答およびメモリー応答の両方において最良の免疫応答が生じた。
アカゲザルにおいて、ＤＮＡアジュバントとしてのプラスミドＩＬ−１２の存在下およびプラスミドＩＬ−１２が存在しない条件下で、ＨＩＶ ｇａｇおよびｅｎｖをコードする最適化したＤＮＡ構築物を比較した。ＩＬ−１２は、定量的ＥＬＩＳｐｏｔ形式で、Ｔ細胞応答を実質的に５倍増大させることができ、これにより、実質的に良好なメモリーＴ細胞応答が生じた。しかし、ＥＰに由来するＤＮＡは、Ｔ細胞応答およびメモリー応答を生じることにおいてより効果的であった。これは、ＩＬ−１２ ＩＭアジュバント化ＤＮＡワクチンと比較して、２倍大きかった。最良の応答は、ＥＰ＋ＩＬ−１２アジュバントの併用療法群において観察された。この併用療法におけるメモリー応答は、ＩＭ ＤＮＡだけの場合よりも１０倍大きく、ＥＰだけの場合よりもほぼ２倍大きかった。本発明者らはまた、ＥＰだけの場合と比較して、ＥＰ＋ＩＬ−１２併用療法においてはＣＦＳＥによって４倍良好な免疫の拡大を観察した。多機能Ｔ細胞の存在もまた、ＤＮＡ＋サイトカイン＋ＥＰ併用療法が最も有効であることを示唆していた。
材料および方法
動物：
アカゲザル（Ｍａｃａｃｏ ｍｕｌａｔｔｏ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの基準にしたがって、ＢＩＯＱＵＡＬ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において飼育した。動物は、いずれの実験の前にも、少なくとも３０日間、隔離して順応させた。
免疫化：
５匹のアカゲザルは、１．０ｍｇのｐＧａｇ４ＹおよびｐＥＹ２Ｅ１−Ｂで、０週目、４週目、および１１週目に免疫化した。それぞれの免疫化の時点で、ＤＮＡを２つの注射部位（それぞれの大腿四頭筋の中に１つ）に送達した。アカゲザルのうちの３匹は、ＩＭ注射後にエレクトロポレーションした。５匹のアカゲザルの別のグループは、１．０ｍｇのｐＧａｇ４Ｙ、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ、およびＷＬＶ１０４で、０週目、４週目、および８週目に免疫化した。５匹の動物のうち、２匹の動物にはＩＭ注射によって免疫を投与し、３匹の動物にはＩＭ注射後にエレクトロポレーションを行った。全てのエレクトロポレーション手順は、定電流Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ（登録商標）デバイス（ＶＧＸ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して行った。エレクトロポレーションの条件は、０．５Ａｍｐｓ、３パルス、１秒のパルス間隔で５２ｍｓｅｃのパルス長であった。このソフトウェアによって制御されるデバイスを、プラスミドの送達と定電流方形波パルスの作成の直前に組織抵抗を測定するように設計し、それにより筋肉組織の外側への送達のリスクとプラスミドの喪失の可能性を排除した。
血液の回収：
動物を、実験の期間中、２週間ごとに採血した。１０ｍＬの血液をＥＤＴＡチューブの中に回収した。ＰＢＭＣを標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって単離し、その後、完全培養培地（１０％の熱不活化ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および５５μＭ／Ｌのβ−メルカプトエタノールを補充した、２ｍＭ／ＬのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０）の中に再懸濁した。ＲＢＣを、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）で溶解させた。
プラスミドとプラスミド産物：
Ｇａｇ４Ｙは、以下を含むいくつかの改変を有している、ＨＩＶクレードＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのｇａｇタンパク質のコンセンサス配列をコードしている発現カセットを含む：ｋｏｚａｋ配列の付加、置換されたＩｇＥリーダー配列、哺乳動物細胞の中での発現のためのコドン最適化とＲＮＡ最適化（配列番号１１に、ＨＩＶ Ｇａｇコンセンサス配列を開示する）。さらなる実験のために、Ｇａｇ４Ｙ遺伝子を、発現ベクターｐＶａｘの中にサブクローニングした。ｐＥＹ−２Ｅ１−Ｂには、ＨＩＶクレードＢのエンベロープのコンセンサス配列をコードする発現カセットが含まれる（配列番号３に、ＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサス配列を開示する）。ＷＬＶ１０４Ｍは、アカゲザルＩＬ−１２遺伝子をコードするプラスミドである。プラスミドは、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）で生産し、そしてＶＧＸ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）で、低分子量の０．ｌ％のポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩を含む注射用滅菌水の中に再度処方した。
凍結保存したＰＢＭＣのＣＦＳＥ
凍結保存したＰＢＭＣを、３７℃の水浴中で迅速に解凍し、完全培地で洗浄した。細胞を、３７℃のインキュベーターの中で一晩インキュベートし、翌日、細胞数を得た。細胞をペレットとし、ＰＢＳ中の１ｍｌのＣＦＤＡ ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（１：２０００希釈）の中に再懸濁した。細胞を、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を完全培地で洗浄し、１×１０６細胞／１００μｌの濃度になるように再懸濁し、１００μｌの２μｇ／ｍｌの組み換え体ＨＩＶ−１ ｐ２４またはｇｐ１２０（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）＋ペプチドプールを含む９６ウェル丸底プレートの中にプレートした。５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（陽性）および完全培地（陰性）を対照として使用した。培養物を５日間インキュベートした。細胞を、最初にＶｉｖｉｄ ｄｙｅ ｖｉｏｌｅｔ（生存／死滅細胞マーカー）で、氷上で１５分間染色した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞を、抗ヒトＣＤ３−ＰＥ（クローンＳＰ３４−２）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ヒトＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（クローンＬ２００）、抗ヒトＣＤ８−ＡＰＣ（ＳＫ１）を使用して、４℃で１時間染色した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドで固定した。データを、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して回収した。フローサイトメトリーのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、ＣＤ３＋リンパ球をゲートした。１つの試料あたり３万個から５万個のＣＤ３＋リンパ球を回収した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
９６ウェルプレートを、ＨＩＶ ｇａｇおよびｅｎｖ応答をそれぞれ決定するために、１００ｎｇ／ウェルの組み換え体ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ ｐ２４またはｇｐ１２０（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で一晩コーティングした。１００ｎｇ／ウェルのウシ血清アルブミンでコーティングしたプレートを、陰性対照とした。プレートを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳＴで、３７℃で１時間ブロックした。その後、プレートを、４倍希釈の血清の段階希釈物とともに、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗サルＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を、１：１０，０００希釈（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）でプレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用してプレートを発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。その後、光学密度（ＯＤ）を測定した。
ＩｇＧ終点力価（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｔｉｔｅｒ）を、ＢＳＡのウェルの平均のＯＤ値の２倍を超えるＯＤ値を生じた、血清希釈率の逆数と定義した。
酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）
抗原特異的応答を、ペプチドを含むウェルから、陰性対照であるウェルの中のスポットの数を減算することによって決定した。結果は、３連のウェルについて得られた平均値として示す（スポットの数／１００万個の脾細胞）。
１．細胞内サイトカインの染色
抗体試薬
直接結合させた抗体は以下から入手した：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）：ＩＬ−２（ＰＥ）、ＣＤ３（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＩＦＮ−γ（ＰＥ−Ｃｙ７）、およびＴＮＦ−α（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＣＤ８（ＡＰＣ）、およびＣＤ４（ＰｅｒＣＰ）。
細胞の刺激と染色
ＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩ中に１×１０６細胞ｓ／１００μｌになるように再懸濁し、１００μｌの１：２００希釈物の刺激ペプチドを含む９６ウェルプレートにプレートした。刺激していない対照と陽性対照（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、１μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれのアッセイに含めた。細胞を、３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し（ＰＢＳ）、表面抗体で染色した。細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ
ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して説明書にしたがって固定した。固定後、細胞を、パーム緩衝液で２回洗浄し、細胞性マーカーに対する抗体で染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定し（１％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）、そして分析するまで４℃で保存した。
フローサイトメトリー
細胞を、改良型ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。１つの試料あたり５万個のＣＤ３＋事象を回収した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン８．４．１（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を使用して行った。最初のゲーティングには、高さ（ＦＳＣ−Ｈ）に対する前方散乱面積（ＦＳＣ−Ａ）のプロットを使用して、二重項を除去した。事象について、ＳＳＣに対するＦＳＣ−Ａのプロットによってリンパ球のゲーテリングを行った。この後、事象を連続して、ダウンレギュレーションの原因であるＩＦＮ−γに対する、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４−事象に対してゲートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞の同定の後、ゲートを、最適な分離が提供される組み合わせを使用して個々のそれぞれの機能について作成した。それぞれの機能についてのゲートを作成した後、本発明者らは、Ｂｏｏｌｅａｎゲートプラットフォームを使用して、３つの機能を試験する場合の８個の応答パターンに等しい、可能な組み合わせについての完全なアレイを作成した。データは、バックグラウンドの補正後を報告する。陽性な応答についての閾値は、１０事象または０．０５％であった。
統計分析
データを、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して分析し、平均±ＳＥＭとして表した。
結果
ＥＬＩＳｐｏｔ分析
細胞性免疫応答の誘導を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによるそれぞれの免疫化の後に評価した。１回の免疫化後（図１）、ＩＭ注射によってプラスミドＤＮＡを投与したグループだけが、弱い細胞性応答を示した（７４±２９ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。アカゲザルのＩＬ−１２プラスミドとの同時免疫化によっては、より高い応答が生じた（１３６±５１．４ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ。エレクトロポレーションした（ＥＰ）グループは、ＩＭグループよりも６倍高い平均応答を有していた（４８２±１８１ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣｓ）。ＥＰとのＩＬ−１２の同時免疫化の組み合わせは、ＩＦＮ−γ生産細胞の数をさらに２倍にした（１０３０±４９４ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣｓ）。
２回の免疫化の後（図１）、ＩＭおよびＩＭ ＋ＩＬ−１２のグループは、ＥＬＩＳｐｏｔの数において中程度の増加を有していた（それぞれ、１０４±６７．９ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣおよび２２３±７６．６ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。ＥＰグループは、以前の免疫化よりもほぼ４倍大きく（１９２４±４１７ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）、そしてＥＰ＋ＩＬ−１２グループは、再び、ＥＰ療法だけの場合と比較して、２倍の数のＩＦＮγ生産細胞（２８１９±８７２ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）を有していた。
３回目の免疫化の後は（図１）、ＥＰグループの抗原特異的細胞の数は、ＩＭグループの抗原特異的細胞の数よりも１対数多かった（それぞれ、５３０００±３７８１、および３７０±１１０ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。ＩＭ＋ＩＬ−１２グループもまた、ＥＬＩＳｐｏｔ数を用いた細胞応答において劇的な増大を有しており、これは、以前の免疫化よりも、ほぼ１対数大きかった（２０４２±３１１ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。他の２回の免疫化を用いた場合には、ＥＰ＋ＩＬ−１２グループは、ワクチン接種を行ったグループ全てのうちで最も強力であった（７２２８±２２２７ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。
交差反応性のエンベロープ応答の誘導
良好なＨＩＶワクチンには、交差反応性の免疫応答の誘導が必要であろう。これに関しては、ＥＰ＋ＩＬ−１２が、不一致なペプチドライブラリーに対する交差反応性の大きさを改善できるかどうかを観察することに関心が集まった。本発明者らは、コンセンサスグループＭに由来するペプチドライブラリーを使用して、ｅｎｖ抗原によって誘導された交差反応性のＣＴＬ応答を比較した。交差反応性は全てのグループにおいて観察された。しかし、結果は、サブタイプＢ ＥＬＩＳｐｏｔ分析において観察されたものと同じ大きさの相違を示した（図２）。３回の免疫化の後では、ＩＭグループは、グループＭエンベロープペプチドに対して最も低い応答を有していた（２２２±ＳＥＭ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。ＩＬ−１２の添加によっては、応答が２倍になった（５４０±ＳＥＭ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。より高いグループＭエンベロープ応答は、ＥＰを用いた場合に誘導され（８３０±ＳＥＭ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）、これは、ＩＬ−１２の同時注射を用いた場合にさらに増強された（１２３８±ＳＥＭ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。
１．メモリーＴ細胞応答
重要なことは、ＤＮＡプラットフォームを用いた場合のメモリー応答の発生を改善できることである。本発明者らは、最後のＤＮＡワクチン接種の後５ヶ月間、ＥＬＩｓｐｏｔ分析を行った（図３）。ＩＭグループにおいては、プラスミドＩＬ−１２の添加によって、メモリー細胞のほぼ１０倍の増大が生じた（７５１±１１．１、および７８．６±１６．９ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）。ＩＬ−１２が、この重要なＴ細胞の表現形に対して陽性な影響を及ぼし得ることは明白である。さらに、抗原特異的ＩＦＮγ生産細胞の数は、ＥＰグループにおいては相当数存在していたが、ＩＬ−１２アジュバント＋ＥＰによっては、最も活発なメモリー応答が生じ（それぞれ、１２３１±５２３．５、および３７９５±１３３６ ＳＦＵ／１０６ ＰＢＭＣ）、応答は、複合技術によって極めて強いＴ細胞メモリー応答が駆動されたことを示している。
ＤＮＡワクチンに対する体液性免疫応答
ＩＭ ＤＮＡワクチン技術の弱さは、ヒト以外の霊長類と、ヒトでの臨床試験において、明確な抗体応答を誘導することができなかったその能力に原因がある。本発明者らは、ＥＬＩＳＡ形式において、組み換え体ｐ２４およびｇｐ１６０抗原に対するＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｅｎｖ特異的抗体力価の両方を誘導するそれぞれのグループの能力を評価した。いずれの抗原についても、ＩＭおよびＩＭ＋ＩＬ−１２のグループは、有意な抗体力価は示さなかった（＜ｌ：５０の終点力価）。エレクトロポレーションしたグループは、組み換え体ｐ２４に結合することができる劇的に高いｇａｇ抗体力価を示した。ＥＰとＥＰ＋ＩＬ−１２グループはいずれも、１２週目では、同様の終点力価を有していたが（それぞれ、２２，４００および１２，８００）、ＥＰ＋ＩＬ−１２グループは、より効率的な抗体応答を生じた。その応答は、免疫化の図式よりも速く現れ、最も迅速に最大レベルにまで上昇した。ｅｎｖ抗体応答もまた、ｇａｇ抗原を用いた場合に、より低い終点力価で作用するという本発明者らが観察した結果を反映していた。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖
相当数のＥＬＩＳｐｏｔ応答を観察したので、本発明者らは次に、細胞性免疫のさらなるパラメーターを試験した。本発明者らは、様々な免疫療法の間で、ペプチド刺激後にインビトロで増殖する、ｇａｇ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を試験した。最後の免疫化の２週間後に回収した凍結保存した試料を刺激し、ＣＦＳＥアッセイによって分析した。平均のＣＤ４＋応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて観察されたものと同様に増大した。比較すると、ＣＤ８増殖の誘導は、大きさに関してはるかに大きかった。本発明者らは、ＩＬ−１２が、ＩＭだけを用いた場合よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させ、そしてＥＰが実質的に高かったことを観察した。ＥＰ＋ＩＬ−１２グループは、インビトロでの刺激の後に増殖することができるＣＤ８＋細胞について最も高い割合（％）を有していた（それぞれ、２．５１±ＳＥＭ ％および４．８８±ＳＥＭ ％）。明白なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖のバンドが、ＥＰ＋ＩＬ−１２療法において観察され、これは、この併用免疫の強い増殖させる能力を明らかに示している。
多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答
本発明者らは、ＥＰとＩＬ−１２の同時免疫化の後の、強いＩＦＮγエフェクター応答の誘導を明らかに観察したが、本発明者らは、様々な療法における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の機能をさらに特性決定することを望んだ。最後の免疫化の３ヶ月後に採取した試料をｇａｇペプチドで刺激し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２の細胞内サイトカインの生産について染色した。全てのグループのうち、ＩＭ＋ＩＬ−１２のグループにおいてはわずかに１匹の動物、そしてＥＰだけのグループにおいても１匹の動物が、検出可能なＩＦＮγ応答を有していた。しかし、ＥＰプラスＩＬ−１２で免疫化したグループの３匹の動物のうちの２匹が、ｇａｇ特異的ＩＦＮγを生産するＣＤ８＋ Ｔ細胞を有していた。ＩＭ＋ＩＬ−１２レスポンダーは、３種類のサイトカインの全てについて染色された多機能性の細胞のうちの小さい割合を占めており、さらには、ＩＬ−２を生産するその能力を失った集団を有していた。ＥＰレスポンダーは、４つの異なる集団からなるわずかにより高度に多機能性の応答を有していた。最も劇的な応答は、第２のＥＰ＋ＩＬ−１２動物において見られた。そのＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちの２％を超えるものが３種類のサイトカインを全て生産することができ、２％が、ＩＦＮγとＴＮＦαの両方を生産することができた。明らかに、それぞれのグループの動物の数が少なく、これらの結果を確認するためのさらなる霊長類での実験が必要である。しかし、まとめると、観察された傾向は明白であるようであり、希望が得られるものである。
考察
ＤＮＡワクチンアジュバントとしてのＩＬ−１２は、ＥＬＩＳｐｏｔ応答を、プラスミドだけを用いた場合の数倍にまで改善する。加えて、増殖が明らかに増強された。ＥＰグループは、ＩＭだけのグループ、または組み合わせたＥＬＩＳｐｏｔ応答を示したＩＭ＋ＩＬ−１２療法のいずれよりも高い平均応答を示し、これは、ＩＭ＋ＩＬ−１２グループよりも３倍高かった。最良のＥＬＩＳｐｏｔ応答は、ＥＰ＋ＩＬ−１２療法において観察され、これは、ＩＭ＋ＩＬ−１２療法のほぼ４倍、ＩＭだけを用いた場合のほぼ１９倍であった。
それぞれの免疫化の後の、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによる抗原特異的応答の大きさを決定した。ＥＰグループおよびＥＰ＋ＩＬ−１２グループの動物は全て、１回の免疫化の後に検出可能な応答を有していただけではなく、これらは、３回の免疫化の後には、ＩＭグループにおいて見られた平均よりも高い平均を有していた。２回の免疫化の後では、ＥＰグループおよびＥＰ＋ＩＬ−１２グループのＩＦＮγ応答は、ウイルスベクターを使用した実験において報告されている応答に匹敵した。実質的なメモリー応答が、最後の免疫化の５ヶ月後に、ＩＭ＋ＩＬ−１２グループとＥＰグループの両方において観察された。
ＩＭ免疫化は、ＩＬ−１２を用いた場合にも、またＩＬ−１２を用いなかった場合にも、有意な量の抗体を生じることはなかった。エレクトロポレーションは、以前に報告されたように、体液性の免疫応答を増強させることができた。エレクトロポレーションを行ったグループの動物は全て、セロコンバーションしていた。ＥＰグループとＥＰ＋ＩＬ−１２グループは、３回の免疫化の後には、同様の終点力価を有していたが、抗体誘導の速度論は、ＥＰ＋ＩＬ−１２グループにおいてわずかに早かった。
ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖能力は、ＥＰとプラスミドＩＬ−１２を用いた場合に増強されることが明らかとなった。このデータは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて観察されたメモリーの拡大をサポートしており、ここでは、抗原特異的Ｔ細胞の発現は、おそらく、ＥＰ＋ＩＬ−１２療法の増殖能力の増強の結果である。

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  1. 核酸分子または薬学的組成物または組換え体ワクチンまたはタンパク質または方法。
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