ES2706501T3 - Vacunas de VIH mejoradas - Google Patents

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Abstract

Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2 y fragmentos de la SEQ ID NO:2 que comprenden 600 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia de aminoácidos induce una respuesta inmune frente al VIH.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de VIH mejoradas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas de VIH mejoradas, y vacunas para su uso en métodos mejorados para inducir respuestas inmunes, y para inmunizar profilácticamente y/o terapéuticamente individuos frente a VIH.
Antecedentes de la invención
El genoma del VIH es altamente plástico debido a una alta tasa de mutación y compensación funcional. Esta alta tasa de mutación es conducida por al menos dos mecanismos: la baja fidelidad de la transcriptasa inversa (RT) vírica dando como resultado al menos una mutación por ciclo de replicación, y los efectos dobles del gen del factor celular antiretrovírico APOBEC3G y el gen accesorio del factor de infectividad vírica Vif. Los genomas con cada posible mutación y muchas mutaciones dobles se generan durante cada ciclo de replicación, dando como resultado tremenda diversidad antigénica. Por consiguiente, se ha argumentado que una vacuna candidata derivada de un aislado individual no puede provocar suficiente reactividad cruzada para proteger frente a diversos virus de VIH circulantes. Los estudios recientes han sugerido que los inmunógenos consenso (Gao, F., y col. 2005. “Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein”. J. Virol. 79:1.154-63.; Scriba, T.J., y col. 2005. “Functionally-inactive and immunogenic Tat, Rev and Nef DNA vaccines derived from sub-Saharan subtype C human immunodeficiency virus type 1 consensus sequences”. Vaccine 23:1.158-69) o inmunógenos ancestrales (Doria-Rose, N.A., y col. 2005. “Human Immunodeficiency Virus Type 1 subtype B Ancestral Envelope Protein Is Functional and Elicits Neutralizing Antibodies in Rabbits Similar to Those Elicited by a Circulating Subtype B Envelope”. J. Virol. 79:11.214-11.224; Gao, F., y col. 2004. “Centralized immunogens as a vaccine strategy to overcome HIV-1 diversity. Expert Rev.
Vaccines 3:S161-S168; Mullins, J.I., y col. 2004. “Immunogen sequence: the fourth tier of AIDS vaccine design”. Expert Rev. Vaccines 3:S151-S159; Nickle, D.C., y col. 2003. “Consensus and ancestral state HIV vaccines”. Science 299:1.515-1.517) pueden ser útiles a este respecto. Sin embargo, los estudios iniciales de estos planteamientos mostraron mejora inmune celular relativamente modesta inducida por estos inmunógenos.
Recientemente Derdeyn y col. analizaron secuencias de glucoproteína de la envoltura del VIH-1 subtipo C en ocho parejas de transmisión heterosexual africanas y encontraron que longitud más corta de V1, V2 y V4 y menos glucanos son los rasgos comunes compartidos por las secuencias obtenidas de transmisores tempranos (Derdeyn, C.A., y col. 2004. “Envelope-constrained neutralization-sensitive HIV-1 after heterosexual transmission”. Science 303:2.019-2.022.). Estos datos sugieren que los antígenos que imitan tales virus podrían tener relevancia para los virus de transmisión temprana. Sin embargo, tales estructuras transmisores tempranos no se han observado para todos los subtipos (Chohan, B., y col. 2005. “Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels”. J. Virol. 79:6.528-6.531). Sin embargo, la incorporación de bucles V más cortos en un inmunógeno de la envoltura puede tener otros beneficios, tales como la mejora de la sensibilidad para CD4 soluble (Pickora, C., y col. 2005. “Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodificiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4”. J. Virol. 79:12.575-12.583), y se debería considerar.
Los estudios han mostrado la importancia de las respuestas de LCT específico al VIH-1 en el control de la carga vírica durante la infección aguda y asintomática y el desarrollo del SIDA. Sin embargo, no está claro si las vacunas de ADN basadas en la envoltura actuales son tan potentes como es necesario. Se han usado varios métodos para incrementar los niveles de expresión de los inmunógenos del VIH-1, tales como la optimización de codón (Andre, S., y col. 1998. “Increased immune response elicited by DNA vaccination with asynthetic gp120 sequence with optimized codon usage”. J. Virol 72:1.497-503; Deml, L., y col. A. 2001. “Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein”. J. Virol. 75:10.991-11.001), optimización de ARN (Muthumani, K., y col. 2003. “Novel engineered HIV-1 East African Clade-A gp160 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo”. Virology 314:134-46; Schneider, R., M. y col. 1997. “Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation”. J. Virol.
71:4.892-4.903) y la adición de las secuencias líderes de inmunoglobulina que tienen estructura secundaria de ARN débil (Yang, J.S., y col. 2001. “Induction of potent Th1-Type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile Virus New York Isolate (WNV-NY1999). J. Infect Diseases 184:809-816).
El documento WO2005/028625 describe inmunógenos para inducir anticuerpos que neutralizan aislados primarios de VIH y/o a un inmunógeno que induce una respuesta inmune de linfocito T.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2 y fragmentos de la SEQ ID NO:2 que comprenden 600 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia de aminoácidos induce una respuesta inmune frente a VIH.
La presente invención se refiere a construcciones de ácidos nucleicos y proteínas codificadas por las mismas que proporcionan dianas inmunogénicas frente a la cuales se puede generar una respuesta inmune anti-VIH.
La presente invención proporciona secuencias consenso para la proteína de la envoltura del VIH subtipo A.
La presente invención proporciona construcciones que codifican tales secuencias de proteínas, vacunas que comprenden tales proteínas y/o moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas.
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican tales secuencias de proteína que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1; fragmentos de la SEQ ID NO:1 que comprenden 1.890 o más nucleótidos de la SEQ ID NO:1 y secuencias que tienen al menos 90 % de similitud con la SEQ ID NO:1. La presente invención se refiere a la molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:16.
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de nucleótidos que codifican la SEQ ID NO:2; fragmentos de las secuencias de nucleótidos que codifican la SEQ ID NO:2 que comprenden 600 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia de aminoácidos induce una respuesta inmune frente a VIH. La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y el uso de la composición farmacéutica en un método de inducción de una respuesta inmune en un individuo frente a VIH.
La presente invención proporciona además vacuna recombinante que comprende tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención proporciona además patógenos atenuados vivos que comprenden tales moléculas de ácido nucleico.
La presente invención proporciona proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2, y fragmentos de la SEQ ID NO:2 que comprenden 600 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia de aminoácidos induce una respuesta inmune frente a VIH. La presente invención proporciona además proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:16.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y el uso de la composición farmacéutica en un método de inducción de una respuesta inmune en un individuo frente a VIH. La presente invención proporciona además vacuna recombinante que comprende tales proteínas.
La presente invención proporciona además patógenos atenuados vivos que comprenden tales proteínas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de EY2E1-B y EK2P-B. La secuencia líder de IgE está subrayada. Las regiones recuadradas muestran regiones variables. El * indica seis restos importantes implicados en la utilización de CCR5. El sitio de escisión está indicado por una flecha. El dominio de transmembrana se muestra por la línea de puntos.
La Figura 2 muestra relaciones filogenéticas de dos secuencias de la envoltura del VIH-1 subtipo B. Se incluyeron cuarenta y dos secuencias de la envoltura del VIH-1 subtipo B, EY2E1 -B, EK2P-B, dos secuencias del subtipo D y dos del subtipo C (grupo extraño) en el análisis filogenético. Las secuencias de la envoltura del subtipo B que representan una amplia muestra de diversidad eran de los siguientes 11 países: Argentina (1); Australia (6); China (1); Francia (4); Alemania (1); Gran Bretaña (2); Italia (1); Japón (1); Países Bajos (4); España (1); Estados Unidos (20). Las secuencias EY2E1-B y EK2P-B se muestran en recuadros negros.
La Figura 3 muestra la expresión de inmunógenos de envoltura. El panel A muestra los resultados del análisis de transferencia Western de los genes de EY2E1 -B y EK2P-B. Las células de RD se sometieron a transfección con diferentes plásmidos. 48 horas después, se recogieron los lisados celulares. Las muestras se analizaron por transferencia Western y se sondaron con monoclonal (2G12) de gp120 del VIH-1. En cuanto al control de carga, la mancha se separó y se sondó de nuevo con un anticuerpo anti-actina monoclonal. El panel B muestra los resultados del ensayo de inmunofluorescencia de los genes de EY2E1-B y EK2P-B. Las células de RD transfectadas que expresan proteínas de la envoltura mostraron fluorescencia roja típica. El anticuerpo F105 monoclonal específico a la envoltura del VIH-1 sirvió como fuente del anticuerpo primario.
La Figura 4 muestra las titulaciones totales del anticuerpo IgG en los sueros de los ratones inmunizados. El panel A muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico a la envoltura del subtipo B. El panel B muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico a la envoltura del subtipo A/E. El panel C muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico a la envoltura del subtipo C. Las respuestas inmunes humorales después de la inmunización con las construcciones de ADN pEY2E1-B y pEK2P-B se detectaron por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Cada ratón se inmunizó intramuscularmente tres veces, cada una de 100 pg de ADN a intervalos bisemanales. Los ratones de cada grupo (n=3) se sangraron una semana después de la tercera inmunización y los sueros igualmente reagrupados se diluyeron en tampón de bloqueo y se analizaron como se describe en Materiales y métodos. Los sueros reagrupados recogidos de ratones inmunizados con pVAX se usaron como control. La absorbancia (DO) se midió a 450 nm. Cada punto de dato representa tres valores de DO promedio de suero de tres ratones por grupo y los valores representan la media de ELISA obtenida en tres ensayos separados.
La Figura 5 muestra la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula por pEY2E1-B en tanto ratones BalB/C como ratones transgénicos HLA-A2. Las frecuencias de las células formadoras de mancha (SFC) de IFN-Y específico a la envoltura consenso del subtipo B por millón de esplenocitos después de la vacunación de ADN con pEY2E1-B y pEK2P-B se determinaron por ensayo ELISpot en tanto ratones BalB/C (Panel A) como ratones transgénicos (Panel C). Las frecuencias de células formadoras de mancha de IFN-y específico a la envoltura consenso del subtipo B, pobres en CD8 por millón de esplenocitos después de la vacunación de ADN con pEY2E1-B y pEK2P-B se determinaron también en tanto ratones BalB/C (Panel B) como ratones transgénicos (Panel D). Los esplenocitos se aislaron de ratones inmunizados individuales (tres ratones por grupo) y se estimularon in vitro con grupos de péptidos de la envoltura del subtipo B consenso solapados. Se incluyeron ratones inmunizados con pVAX cadena principal como control negativo. Los valores son las medias+desviaciones estándar de las medias de SFC de IFN-y . (Panel E). La caracterización de los epítopos dominantes específicos a la envoltura consenso del subtipo B. Los esplenocitos recogidos de ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B y pEK2P-B, respectivamente, se cultivaron con 29 grupos de péptido de la envoltura consenso del VIH-1 subtipo B durante 24 horas. Las células secretoras de IFN-y se determinaron por ensayo ELISpot como se describió anteriormente.
La Figura 6 muestra reactividad cruzada inducida por pEY2E1-B en tanto ratones BalB/C como ratones transgénicos HLA-A2. Las respuestas inmunes de linfocito T aditivas en ratones BalB/C inducidas por vacunación con pEY2E1-B y pEK2P-B frente a cuatro grupos de péptido individuales de péptidos de la envoltura del VIH-1 MN (Panel A), VIH-1 grupo M (Panel B), péptidos de la envoltura consenso del subtipo C (Panel C) y dos péptidos de la envoltura de aislado del subtipo C (Paneles D y E) se midieron por ensayo ELISpot de IFN-y . También se midieron las respuestas inmunes de linfocito T aditivas en los ratones transgénicos HLA-A2 inducidas por vacunación con pEY2E1-B y pEK2P-B frente a cuatro grupos de péptido individuales de péptidos de la envoltura del VIH-1 MN (Panel F), VIH-1 grupo M (Panel G), péptidos de la envoltura consenso del subtipo C (Panel H) y dos péptidos de la envoltura de aislado del subtipo C (Paneles I y J). Se incluyeron ratones inmunizados con pVAX cadena principal como control negativo.
La Figura 7 muestra la caracterización de los epítopos dominantes específicos a la envoltura del subtipo B MN en tanto ratones BalB/C (Panel A) como ratones transgénicos HLA-A2 (Panel B) inmunizados con pEY2E1-B y pEK2P-B. Los esplenocitos recogidos de los ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B y pEK2P-B y los ratones transgénicos, respectivamente, se cultivaron con 29 grupos de péptido de la envoltura del VIH-1 subtipo B MN durante 24 horas. Las células secretoras de IFN-y se determinaron por ensayo ELISpot como se describió anteriormente.
La Figura 8 muestra una representación esquemática de dominios funcionales de E72E1-B (aproximadamente 700+ aminoácidos).
La Figura 9 muestra un mapa de la construcción E72E1 -B.
Los paneles A y B de la Figura 10 muestran que una respuesta inmune celular fuerte es inducida por E72E1 -B. Los paneles A y B de la Figura 11 muestran que las respuestas inmunes celulares de reacción cruzada fuertes y amplias son inducidas por E72E1-B.
Los paneles A-D de la Figura 12 muestran que las respuestas inmunes celulares de clado cruzado fuertes son inducidas por E72E1-B.
La Figura 13 representa el inmunógeno diseñado por el estudio en el Ejemplo 2.
La Figura 14 muestra las relaciones filogenéticas: Se incluyeron treinta y seis secuencias de la envoltura del VIH-1 subtipo C, EY3E1-C, EK3P-C, dos secuencias del subtipo B, una del subtipo A y una del subtipo D (grupo extraño) en el análisis filogenético. Las secuencias de la envoltura del subtipo C que representan una amplia muestra de la diversidad eran de 12 países.
Los paneles A y B de la Figura 15 muestran los datos de los estudios de la respuesta celular provocada por pEY3E1-C.
La Figura 16 muestra los datos de los estudios de las respuestas celulares provocadas por pEY3E1-C.
Los paneles A-D de la Figura 17 muestran los datos de los estudios de las respuestas celulares de reacción cruzada provocadas por pEY3E1 -C dentro del mismo clado.
Los paneles A y B de la Figura 18 muestran los datos de los estudios de las respuestas celulares de reacción cruzada provocadas por pEY3E1-C. El panel A muestra los datos de ELISpot de IFN-y específico a env del subtipo C (Uruguay). El panel B muestra los datos de ELISpot de IFN-y específico a env del subtipo C (S. África). Los paneles A-F de la Figura 19 muestran los datos de los estudios de las respuestas celulares de reacción cruzada provocadas por pEY3E1-C entre clados.
Los paneles A-X de la Figura 20 muestran los datos de los estudios de las respuestas inmunes provocadas por construcciones consenso de gag del VIH-1.
La Figura 21 ilustra el ciclo de vida de VPH en el epitelio del tracto genital.
La Figura 22 muestra un mapa de la organización del genoma del VPH-16.
La Figura 23 ilustra el diseño inmunógeno: *se refiere a deleciones o mutaciones importantes para la unión de p53 y degradación; A se refiere a mutaciones en el sitio de unión de Rb.
La Figura 24 incluye una ilustración de la construcción genética p1667 que incluye secuencias codificantes para proteínas E6 y E7 de VPH, y pVAX, plásmido cadena principal que carece del inserto de VPH y se usa como control negativo.
Los paneles A-D de la Figura 25 muestran las respuestas inmunes celulares inducidas por el inmunógeno de ADN p1667.
La Figura 26 muestra los resultados del mapeo del epítopo inmunodominante.
La Figura 27 muestra los resultados de los experimentos profilácticos que usan la vacuna de ADN de E6/E7 para estudiar la protección en ratones C57/BL6.
La Figura 28 muestra los resultados de los experimentos de regresión de tumor usando la vacuna de ADN de E6/E7 para estudiar la protección en ratones C57/BL6.
La Figura 29 muestra los datos de los experimentos que detectan los linfocitos E7 Tetrámero positivos en bazos. La Figura 30 muestra los datos de los experimentos que detectan los linfocitos E7 Tetrámero positivos en tumores.
La Figura 31 muestra los datos de un estudio de protección por vacuna de ADN en ratones transgénicos.
La Figura 32 muestra respuestas inmunes celulares aumentadas a inmunógenos consenso del VIH-1 con inyección conjunta IM de IL-12 codificada por plásmido seguido de electroporación (EP). Los ELISpot de IFN-y se realizaron dos semanas después de la (a) primera inmunización, (b) segunda inmunización, y (c) tercera inmunización (como se ve en comparación con las otras tres). Las respuestas a env se representan como barras negras y a gag se representan como barras blancas con los datos mostrados como respuestas medias±EEM de grupo amontonadas.
La Figura 33 muestra respuestas inmunes celulares de reacción cruzada aumentadas con electroporación intramuscular. Después de tres inmunizaciones, la respuesta inmune de linfocito T total en macacos inmunizados con pEY2E1-B frente a cuatro grupos de péptido de los péptidos del VIH-1 grupo M se determinó por ELISpot de IFN-y. Los datos se muestran como medias±EEM de grupo amontonadas.
La Figura 34 muestra respuestas de memoria aumentadas a inmunógenos del VIH-1 con electroporación IM y el plásmido de IL-12. Cinco meses después de la última inmunización, los ensayos ELISpot se realizaron para determinar las respuestas memoria específicas a antígeno a gag y env en los grupos inmunizados IM y EP con y sin inmunización conjunta con el plásmido de IL-12. Los datos se muestran como respuestas medias±EEM de grupo.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Definiciones
Como se usa en el presente documento, la expresión “condiciones de hibridación estricta” o “condiciones estrictas” se refiere a las condiciones bajo las que una molécula de ácido nucleico hibridará otra molécula de ácido nucleico, pero no otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas mayores. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan por ser aproximadamente 5 °C menos que la temperatura del punto de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) al que el 50 % de las sondas complementarias a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Puesto que las secuencias diana están en general presentes en exceso, a Tm, 50 % de las sondas está ocupadas en equilibrio. Generalmente, las condiciones estrictas serán aquellas en las que la concentración de sal es menos de aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, generalmente 0,01 a 1,0 M de ion de sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas, cebadores u oligonucleótidos (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas más largas, cebadores u oligonucleótidos. Las condiciones estrictas también se pueden conseguir con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida.
La homología de secuencia para nucleótidos y aminoácidos se puede determinar usando FASTA, BLAST y BLAST con huecos (Altschul y col., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3.389) y el programa informático PAUP* 4.0b10 (D.L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). El “porcentaje de similitud” se calcula usando el programa informático PAUP* 4.0b10 (D.L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). La similitud promedio de la secuencia consenso se calcula en comparación con todas las secuencias en el árbol filogenético (véase las Figuras 2 y 14).
En resumen, el algoritmo BLAST, el cual significa “Basic Local Alignment Search Tool” (herramienta de investigación de alineamiento local básico) es adecuado para determinar la similitud de secuencia (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410). El programa informático para la realización del análisis BLAST está públicamente disponible a través del “National Center for Biotechnology information” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica la primera identificación del par de secuencia de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia consulta (query) que o bien se empareja o satisface alguna puntuación T umbral valorada positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabra de las cercanías (Altschul y col., supra). Estas coincidencias (hits) de palabra de la cercanía iniciales actúan como semillas para iniciar investigaciones para encontrar HSP que las contiene. Las coincidencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineamiento acumulativa se pueda incrementar. La extensión para las coincidencias de palabra en cada dirección se paran cuando: 1) la puntuación de alineamiento acumulativo cae en la cantidad X a partir de su máximo valor alcanzado; 2) la puntuación acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de resto de puntuación negativa; o 3) se alcanza el final de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo Blast W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa Blast usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10.915-10.919) alineamientos (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST (Karlin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5.873-5.787) y BLAST con huecos realizaron un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), lo cual proporciona una indicio de la probabilidad por la que un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos ocurriría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a otro si la probabilidad de suma más pequeña en comparación del ácido nucleico de ensayo con el otro ácido nucleico es menos de aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente menos de aproximadamente 0,001.
Como se usa en el presente documento, el término “construcción genética” se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. La secuencia codificante incluye las señales de iniciación y finalización ligadas de manera operativa a elementos reguladores que incluyen un promotor y la señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo al que se administra la molécula de ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, el término “forma expresable” se refiere a construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios operables ligados a una secuencia codificante que codifica una proteína de modo que cuando están presente en la célula del individuo, se expresará la secuencia codificante.
Resumen
La presente invención proporciona vacunas mejoradas utilizando una estrategia multifase para aumentar las respuestas inmunes celulares inducidas por inmunógenos. Se generaron las secuencias consenso modificadas para inmunógenos. También se describen modificaciones genéticas incluyendo la optimización de codón, optimización de ARN, y la adición de una secuencia líder de inmunoglobina de alta eficiencia para incrementar la inmunogenicidad de las construcciones. Los nuevos inmunógenos se han diseñado para provocar respuestas inmune celulares más fuertes y más amplias que los inmunógenos optimizados por un codón correspondientes.
La invención proporciona vacunas de VIH mejoradas proporcionando proteínas y construcciones genéticas que codifican proteínas con epítopos que las hacen particularmente eficaces como inmunógenos frente al que se puede inducir las respuestas inmunes anti-VIH. Por consiguiente, las vacunas se pueden proporcionar para inducir una respuesta inmune terapéutica o profiláctica. En algunas realizaciones, los medios para administrar el inmunógeno es una vacuna de ADN, una vacuna recombinante, una vacuna de subunidad de proteína, una composición que comprende el inmunógeno, una vacuna atenuada o una vacuna inactivada. En algunas realizaciones, la vacuna comprende una combinación seleccionada de los grupos que consisten en: una o más vacunas de ADN, una o más vacunas recombinantes, una o más vacunas de subunidad de proteína, una o más composiciones que comprenden el inmunógeno, una o más vacunas atenuadas y una o más vacunas inactivadas.
Una vacuna según la invención se administra a un individuo para modular la actividad del sistema inmune del individuo y de ese modo aumentar la respuesta inmune frente a VIH. Cuando una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína es absorbida por las células del individuo la secuencia de nucleótidos se expresa en las células y la proteína de ese modo es administrada al individuo. Según algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos que profilácticamente y/o terapéuticamente inmunizan un individuo frente a VIH.
La presente invención se refiere a composiciones para administrar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención ligada de manera operativa a elementos reguladores. Los aspectos de la presente invención se refieren a composiciones de una vacuna recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención; un patógeno atenuado vivo que codifica una proteína de la invención y/o incluye una proteína de la invención; un patógeno inactivado incluye una proteína de la invención; o una composición tal como un liposoma o vacuna de subunidad que comprende una proteína de la invención. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas inyectables que comprenden las composiciones.
VIH
La presente invención proporciona vacunas anti-VIH mejoradas utilizando una estrategia multifase para aumentar las respuestas inmunes celulares inducidas por inmunógenos de VIH. Se generaron secuencias consenso modificadas para los inmunógenos. También se describieron las modificaciones genéticas incluyendo optimización de codón, optimización de ARN, y la adición de una secuencia líder de inmunoglobina de alta eficacia para incrementar la inmunogenicidad de las construcciones. Los nuevos inmunógenos se han diseñado para provocar respuestas inmunes celulares más fuertes y más amplias que los inmunógenos optimizados por un codón correspondientes. La SEQ ID NO:1 es una construcción de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo A. La SEQ ID NO:1 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna de VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo A. La SEQ ID NO:2 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo A. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:16 es la secuencia de la proteína de la envoltura consenso del subtipo A. En algunas realizaciones, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO:16, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:16, o fragmentos de la misma. En algunas realizaciones, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas realizaciones, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO:1. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:1 comprenden 1.890 o más nucleótidos; en algunas realizaciones, 1.980 o más nucleótidos; y en algunas realizaciones, 2.070 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, los fragmentos de la SEQ ID NO:1 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunas realizaciones, los fragmentos de la SEQ ID NO:1 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:2 comprenden 600 o más aminoácidos; en algunas realizaciones, 630 o más aminoácidos; en algunas realizaciones, 660 o más aminoácidos; y en algunas realizaciones, 690 o más aminoácidos.
Otros aspectos de la descripción
La SEQ ID NO:3 es una construcción de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo B. La SEQ ID NO:3 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo B. La SEQ ID NO:4 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo B. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:17 es la secuencia de la proteína de la envoltura consenso del subtipo B. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:17, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:17, o fragmentos de la misma. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:4 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:3. Las vacunas incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:3 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:3 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 270 o más nucleótidos; en algunos aspectos 360 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 450 o más nucleótidos; en algunos aspectos 540 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 630 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 720 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 810 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 900 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 990 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.080 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.170 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.260 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.350 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.440 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.530 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.620 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.710 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.800 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.890 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.980 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.070 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.160 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.250 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.340 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.430 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.520 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 2.620 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 2.700 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:3 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:3 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 270 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 360 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 450 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 540 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 630 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 720 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 810 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 900 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 990 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.080 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.170 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.260 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.350 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.440 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.530 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.620 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.710 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.800 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.890 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.980 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.020 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.070 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.160 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.250 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.340 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.430 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.520 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.610 nucleótidos, y en algunos aspectos menos de 2.700 nucleótidos.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:4 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:4 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 90 o más aminoácidos; en algunos aspectos 120 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 150 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 180 o más aminoácidos; en algunos aspectos 210 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 240 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 270 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 300 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 330 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 360 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 390 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 420 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 450 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 480 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 510 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 540 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 570 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 600 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 630 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 660 o más aminoácidos; y en algunos aspectos, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 120 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 150 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 180 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 210 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 240 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 270 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 300 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 330 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 360 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 390 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 420 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 450 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 480 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 540 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 600 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 660 aminoácidos, y en algunos aspectos menos de 690 aminoácidos.
La SEQ ID NO:5 es una construcción de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo C. La SEQ ID NO:5 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo C. La SEQ ID NO:6 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo C. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:18 es la secuencia de la proteína de la envoltura consenso del subtipo C.
En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:18, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:18, o fragmentos de la misma. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:6 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:5. Las vacunas incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:5 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:5 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 270 o más nucleótidos; en algunos aspectos 360 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 450 o más nucleótidos; en algunos aspectos 540 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 630 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 720 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 810 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 900 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 990 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.080 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.170 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.260 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.350 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.440 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.530 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.620 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.710 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.800 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.890 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.980 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 2.070 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:5 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:5 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 270 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 360 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 450 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 540 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 630 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 720 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 810 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 900 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 990 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.080 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.170 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.260 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.350 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.440 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.530 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.620 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.710 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.800 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.890 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.980 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.020 nucleótidos, y en algunos aspectos menos de 2.070 nucleótidos.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:6 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:6 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 90 o más aminoácidos; en algunos aspectos 120 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 150 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 180 o más aminoácidos; en algunos aspectos 210 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 240 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 270 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 300 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 330 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 360 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 390 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 420 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 450 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 480 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 510 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 540 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 570 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 600 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 630 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 660 o más aminoácidos; y en algunos aspectos, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 120 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 150 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 180 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 210 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 240 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 270 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 300 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 330 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 360 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 390 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 420 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 450 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 480 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 540 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 600 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 660 aminoácidos, y en algunos aspectos menos de 690 aminoácidos.
La SEQ ID NO:7 es una construcción de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo D. La SEQ ID NO:7 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo D. La SEQ ID NO:8 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo D. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:19 es la secuencia de la proteína de la envoltura consenso del subtipo D.
En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:19, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:19, o fragmentos de la misma. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:8 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:7. Las vacunas incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:7 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:7 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 270 o más nucleótidos; en algunos aspectos 360 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 450 o más nucleótidos; en algunos aspectos 540 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 630 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 720 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 810 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 900 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 990 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.080 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.170 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.260 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.350 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.440 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.530 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.620 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.710 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.800 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.890 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.980 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 2.070 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 2.140 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:7 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:7 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 270 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 360 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 450 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 540 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 630 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 720 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 810 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 900 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 990 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.080 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.170 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.260 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.350 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.440 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.530 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.620 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.710 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.800 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.890 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.980 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.020 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 2.070 nucleótidos y en algunos aspectos menos de 2.140 nucleótidos.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:8 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:8 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 90 o más aminoácidos; en algunos aspectos 120 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 150 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 180 o más aminoácidos; en algunos aspectos 210 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 240 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 270 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 300 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 330 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 360 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 390 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 420 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 450 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 480 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 510 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 540 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 570 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 600 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 630 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 660 o más aminoácidos; y en algunos aspectos, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 120 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 150 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 180 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 210 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 240 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 270 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 300 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 330 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 360 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 390 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 420 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 450 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 480 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 540 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 600 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 660 aminoácidos, y en algunos aspectos menos de 690 aminoácidos.
La SEQ ID NO:9 es una construcción de secuencia de ADN de la envoltura consenso de Nef-Rev del subtipo B. La SEQ ID NO:9 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína Nef-Rev del subtipo B. La SEQ ID NO:10 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína Nef-Rev del subtipo B. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:20 es la secuencia consenso de la proteína Nef-Rev del subtipo B.
En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:20, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:20, o fragmentos de la misma. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:10 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:9. Las vacunas incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:9 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:9 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 270 o más nucleótidos; en algunos aspectos 360 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 450 o más nucleótidos; en algunos aspectos 540 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 630 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 720 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 810 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 900 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 990 o más nucleótidos; en algunos aspectos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:9 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:9 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 270 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 360 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 450 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 540 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 630 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 720 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 810 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 900 nucleótidos, y en algunos aspectos menos de 990 nucleótidos.
La SEQ ID NO:11 es una secuencia de ADN consenso de Gag de la construcción de secuencia del ADN del subtipo A, B, C y D. La SEQ ID NO:11 comprende la secuencia codificante para la secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína del subtipo A, B, C y D consenso Gag. La SEQ ID NO:12 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de secuencia de la vacuna del VIH que comprende una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína del subtipo A, B, C y D Gag. La secuencia líder de IgE es la SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:21 es la secuencia de la proteína del subtipo A, B, C y D Gag consenso.
En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:21, fragmento de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:21, o fragmentos de la misma. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:12 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunos aspectos, las vacunas incluyen preferentemente la SEQ ID NO:11. Las vacunas incluyen preferentemente la secuencia líder de IgE SEQ ID NO:15 o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:11 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:11 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 270 o más nucleótidos; en algunos aspectos 360 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 450 o más nucleótidos; en algunos aspectos 540 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 630 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 720 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 810 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 900 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 990 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.080 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.170 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.260 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.350 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.440 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.530 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.620 o más nucleótidos; en algunos aspectos, 1.710 o más nucleótidos; y en algunos aspectos, 1.800 o más nucleótidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:11 pueden comprender las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:11 no comprenden las secuencias codificantes para las secuencias líder de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 270 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 360 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 450 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 540 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 630 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 720 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 810 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 900 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 990 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.080 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.170 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.260 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.350 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.440 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.530 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.620 nucleótidos, en algunos aspectos menos de 1.710 nucleótidos, y en algunos aspectos menos de 1.800 nucleótidos.
Los fragmentos de la SEQ ID NO:12 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunos aspectos, los fragmentos de la SEQ ID NO:12 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 90 o más aminoácidos; en algunos aspectos 120 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 150 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 180 o más aminoácidos; en algunos aspectos 210 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 240 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 270 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 300 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 330 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 360 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 390 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 420 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 450 o más aminoácidos; en algunos aspectos, 480 o más aminoácidos; y en algunos aspectos, 510 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 120 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 150 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 180 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 210 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 240 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 270 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 300 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 330 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 360 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 390 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 420 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 450 aminoácidos, en algunos aspectos menos de 480 aminoácidos, y en algunos aspectos menos de 510 aminoácidos.
Vacunas
La invención proporciona vacunas mejoradas al proporcionar proteínas y construcciones genéticas que codifican proteínas con epítopos que las hacen particularmente eficaces como inmunógenos frente a los que se pueden inducir respuestas inmunes. Por consiguiente, se pueden proporcionar vacunas para inducir una respuesta inmune terapéutica o profiláctica. En algunas realizaciones, los medios para administrar el inmunógeno es una vacuna de ADN, una vacuna recombinante, una vacuna de subunidad de proteína, una composición que comprende el inmunógeno, una vacuna atenuada o una vacuna inactivada. En algunas realizaciones, la vacuna comprende una combinación seleccionada de los grupos que consisten en: una o más vacunas de ADN, una o más vacunas recombinantes, una o más vacunas de subunidad de proteína, una o más composiciones que comprenden el inmunógeno, una o más vacunas atenuadas y una o más vacunas inactivadas.
Según algunas realizaciones de la invención, una composición según la invención es para su uso en la modulación de la actividad del sistema inmune del individuo y de ese modo aumentar la respuesta inmune. Cuando una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína es absorbida por las células del individuo la secuencia de nucleótidos se expresa en las células y la proteína de ese modo es administrada al individuo. Los aspectos de la invención proporcionan secuencias codificantes de la proteína o molécula de ácido nucleico tal como plásmidos, como parte de las vacunas recombinantes y como parte de las vacunas atenuadas, como proteínas aisladas o parte de proteínas de un vector.
Según algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones que inmunizan profilácticamente y/o terapéuticamente un individuo.
Las vacunas de ADN se describen en las patentes americanas N.° 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637, 5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055, 5.676.594, y las solicitudes de prioridad citadas en las mismas. Además de los protocolos de administración descritos en aquellas solicitudes, los métodos alternativos de administración de ADN se describen en las patentes americanas N.° 4.945.050 y 5.036.006.
La presente invención se refiere a vacunas vivas atenuadas mejoradas, vacunas inactivadas mejoradas y vacunas mejoradas que usan vectores recombinantes para administrar genes extraños que codifican antígenos y también vacunas de subunidad y glucoproteína. Ejemplos de vacunas vivas atenuadas, aquellas que usan vectores recombinantes para administrar antígenos extraños, vacunas de subunidad y vacunas de glucoproteína se describen en las patentes americanas N.° 4.510.245; 4.797.368; 4.722.848; 4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5.110.587; 5.112.749; 5.174.993; 5.223.424; 5.225.336; 5.240.703; 5.242.829; 5.294.441; 5.294.548; 5.310.668; 5.387.744; 5.389.368; 5.424.065; 5.451.499; 5.453.364; 5.462.734; 5.470.734; 5.474.935; 5.482.713; 5.591.439; 5.643.579; 5.650.309; 5.698.202; 5.955.088; 6.034.298; 6.042.836; 6.156.319 y 6.589.529.
Cuando se absorbe(n) por una célula, la(s) construcción(es) genética(s) se puede(n) continuar presente(s) en la célula como una molécula extracromosómica en funcionamiento y/o integrarse dentro del ADN cromosómico de la célula. El ADN se puede introducir en las células donde continúa como material genético separado en forma de un plásmido o plásmidos. Alternativamente, el ADN lineal que se puede integrar dentro del cromosoma se puede introducir dentro de la célula. Cuando se introduce el ADN en la célula, se pueden añadir reactivos que promueven la integración del ADN dentro de los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también pueden estar incluidas en la molécula de ADN. Alternativamente, el ARN se puede administrar a la célula. También se puede contemplar el proporcionar la construcción genética como un minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación. Las construcciones génicas pueden quedar como parte del material genético en los microorganismo vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en las células. Las construcciones génicas pueden ser parte de los genomas de vacunas víricas recombinantes donde el material genético o bien se integra en el cromosoma de la célula o continúa extracromosómico. Las construcciones genéticas incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ácido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, y una señal de poliadenilación. Además, con frecuencia se requieren potenciadores para la expresión génica de la secuencia que codifica la proteína diana o la proteína de inmunomodulación. Es necesario que estos elementos estén ligados de manera operativa a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores estén de manera operativa en el individuo al que se administran.
En general se considera que los codones de iniciación y el codón de parada son parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al que se administra la construcción génica. Los codones de iniciación y terminación deben estar en la estructura con la secuencia codificante.
Los promotores y las señales de poliadenilación usados deben ser funcionales dentro de la células del individuo.
Ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen pero no se limitan a promotores del virus de simio 40 (VS40), promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), virus de la inmunodeficiencia humana (MV) tal como el promotor de la repetición terminal larga (LTR) de VIB, virus de Moloney, ALV, Citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV, virus de Epstein Barr (VEB), virus del sarcoma de Rous (VSR) así como promotores de los genes humanos tales como actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humana y metalotioneína humana.
Ejemplos de señales de poliadenilación útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen pero no se limitan a señales de poliadenilación de VS40 y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se usa la señal de poliadenilación de VS40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA), referida como señal de poliadenilación de VS40.
Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión de ADN, también se pueden incluir otros elementos en la molécula de ADN. Tales elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador se puede seleccionar del grupo que incluye pero no se limita a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humana y potenciadores víricos tales como aquellos de CMV, VSR y VEB.
Las construcciones genéticas se pueden proporcionar con origen de replicación mamífero para mantener la construcción extracromosómicamente y producir copias múltiples de la construcción en la célula. Los plásmidos pVAX1, pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1 la cual produce replicación episómica de alta copia sin integración.
En algunas realizaciones preferidas relacionadas con las aplicaciones de inmunización, se administra(n) molécula(s) de ácido nucleico que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican proteína de la invención, y además, genes para proteínas que aumentan más la respuesta inmune frente a tales proteínas diana. Ejemplos de tales genes son aquellos que codifican otras citoquinas y linfoquinas tales como alfa-interferón, gamma-interferón, factor del crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor del crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, c D86 y IL- 15 incluyendo la IL-15 que tiene la secuencia señal suprimida y que incluye opcionalmente el péptido señal de IgE. Otros genes que pueden ser útiles incluyen aquellos que codifican: MCP-1, MIP-1a, MIP-1 p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor del crecimiento vascular, IL-7, factor del crecimiento del nervio, factor del crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, caspasa ICE, Fos, c-junc, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactiva, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta a interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAILR3, TRAIL-R4, RANK, Ligando de RANK, Ox40, Ligando de Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos.
Se puede añadir un elemento adicional que sirve como diana para la destrucción celular si es deseable eliminar por cualquier razón células que reciben la construcción genética. Se puede incluir un gen de la timidina quinasa (tk) del herpes en una forma expresable en la construcción genética. El fármaco gangcyclovir se puede administrar al individuo y ese fármaco causará la muerte selectiva de cualquier célula que produce tk, así, produce los medios para la destrucción selectiva de las células con la construcción genética.
Para maximizar la producción proteica, se pueden seleccionar las secuencias reguladoras que están bien adaptadas para la expresión génica en las células en las que se administra la construcción. Además, se pueden seleccionar codones que son los más eficazmente transcritos en la célula. Un experto en la técnica puede producir construcciones de ADN que son funcionales en las células.
En algunas realizaciones, se pueden producir construcciones génicas en las que las secuencias codificantes para las proteínas descritas en el presente documento están ligadas al péptido señal de IgE. En algunas realizaciones, las proteínas descritas en el presente documento están ligadas al péptido señal de IgE.
En algunas realizaciones para las que se usa la proteína, por ejemplo, un experto en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, producir y aislar proteínas de la invención usando técnicas bien conocidas. En algunas realizaciones para las que se usa la proteína, por ejemplo, un experto en la técnica, usando técnicas bien conocidas, inserta moléculas de ADN que codifican una proteína de la invención en un vector de expresión comercialmente disponible para su uso en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido comercialmente disponible pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.) se puede usar para la producción de la proteína en E. coli. El plásmido comercialmente disponible pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.) se puede usar, por ejemplo, para la producción en cepas de levadura de S. cerevisiae. El sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC™ comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, Calif.) se puede usar, por ejemplo, para la producción en células de insecto. El plásmido comercialmente disponible pcDNA I o pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.) se puede usar, por ejemplo, para la producción en células mamíferas tales como las células de ovario de hámster chino. Un experto en la técnica puede usar estos vectores y sistemas de expresión comerciales u otros para producir proteína mediante técnicas rutinarias y materiales de partida fácilmente disponibles (Véase por ejemplo, Sambrook y col., “Molecular Cloning a Laboratory Manual”, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)). Por tanto, las proteínas deseadas se pueden preparar en tanto sistemas procariotas como eucariotas, dando como resultado un espectro de formas procesadas de la proteína.
Un experto en la técnica puede usar otros vectores y sistemas de expresión comercialmente disponibles o producir vectores usando métodos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias control requeridas, tales como promotores y señales de poliadenilación, y preferentemente potenciadores son fácilmente disponibles y conocidos en la técnica para una diversidad de hospedadores. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., “Molecular Cloning a Laboratory Manual”, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989). Las construcciones genéticas incluyen la secuencia codificante de proteína ligada de manera operativa a un promotor que es funcional en la línea celular que se somete a transfección con las construcciones. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen promotores de citomegalovirus o VS40. Ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores del virus de leucemia mamaria de ratón o de metalotioneína. Los expertos en la técnica pueden producir fácilmente construcciones genéticas útiles para transfección con células con ADN que codifica la proteína de la invención a partir de los materiales de partida fácilmente disponibles. El vector de expresión que incluye el ADN que codifica la proteína se usa para transformar el hospedador compatible que, a continuación, se cultiva y mantiene bajo condiciones en las que se da lugar la expresión del ADN extraño.
La proteína producida se recupera del cultivo, o bien lisando las células o del medio de cultivo como sea apropiado y conocido por los expertos en la técnica. Un experto en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, aislarla la proteína que se produce usando tales sistemas de expresión. Los métodos de purificación de proteína a partir de fuentes naturales usando anticuerpos que se unen específicamente a una proteína específica como se describió anteriormente se pueden aplicar igualmente para purificar proteína producida por la metodología de ADN recombinante.
Además de producir proteínas por técnicas recombinantes, también se pueden emplear sintetizadores peptídicos automatizados para producir proteína esencialmente pura aislada. Tales técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica y son útiles si los derivados que tienen sustituciones no previstas en la producción de proteína codificada por ADN.
Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar usando cualquiera de varias tecnologías bien conocidas incluyendo la inyección de ADN (también referida como vacunación de ADN), vectores recombinantes tales como adenovirus recombinantes, virus asociado a adenovirus recombinante y vacuna recombinante.
Las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, intranasalmente, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterialmente, intraocularmente y oral así como tópicamente, transdérmicamente, por inhalación o supositorio o a tejido mucoso tal como mediante lavado de tejido vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual. Las rutas preferidas de la administración incluyen la inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Las construcciones genéticas se pueden administrar por medios que incluyen, pero no se limitan a, jeringuillas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas, o “pistolas de bombardeo de microproyectiles”.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se administra a las células junto con la administración de un potenciador de la función de polinucleótido o un agente facilitador de vacuna genética. Los potenciadores de la función de polinucleótido se describen en el documento americano de número de serie 5.593.972, 5.962.428 y la solicitud internacional de número de serie PCT/US94/00899 presentada el 26 de enero de 1994. Los agentes facilitadores de vacuna genética se describen en el documento americano de número de serie 021.579 presentado el 1 de abril de 1994. Los coagentes que se administraron junto con moléculas de ácido nucleico se pueden administrar como una mezcla con la molécula de ácido nucleico o se pueden administrar por separado simultáneamente, antes o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. Además, otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios y que se pueden administrar conjuntamente con un GVF incluyen factores del crecimiento, citoquinas y linfoquinas tales como a-interferón, gamma-interferón, GM-CSF, factor del crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), TNF, factor del crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 y IL-15 así como factor del crecimiento de fibroblasto, agentes activos de superficie tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS incluyendo monofosforil lípido A (WL), muramil péptidos, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y ácido hialurónico también se pueden administrar junto con la construcción genética. En algunas realizaciones, se puede usar una proteína de inmunomodulación como un GVF. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se proporciona en asociación con PLG para aumentar la administración/absorción.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas según la presente invención comprenden aproximadamente 5 nanogramos a aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se formulan según el modo de administración a usar. En casos donde las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, libres de pirógeno y libres de partícula. Preferentemente se usa una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como la solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la fórmula.
Según algunas realizaciones de la invención, se proporcionan las composiciones de la invención para su uso en los métodos de inducción de respuestas inmunes. La vacuna puede ser una vacuna atenuada viva, basada en proteína, una vacuna celular, una vacuna recombinante o una vacuna de ácido nucleico o ADN. En algunas realizaciones, los métodos de inducción de una respuesta inmune en individuos frente a un inmunógeno, incluyendo métodos de inducción de respuestas inmunes mucosas, comprenden administrar al individuo uno o más de proteína CTACK, proteína TECK, proteína MEC y fragmentos funcionales de las mismas o secuencias codificantes expresables de las mismas en combinación con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de la invención y/o una vacuna recombinante que codifica proteína de la invención y/o una vacuna de subunidad de esa proteína de la invención y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna inactivada. La una o más de proteína CTACK, proteína TECK, proteína MEC y fragmentos funcionales de las mismas se puede administrar antes de, simultáneamente con o después de la administración de la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un inmunógeno; y/o vacuna recombinante que codifica un inmunógeno y/o vacuna de subunidad que comprende un inmunógeno y/o vacuna atenuada viva y/o vacuna inactivada. En algunas realizaciones, se administra al individuo una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una o más proteínas de las seleccionadas del grupo que consiste en: CTACK, TECK, MEC y fragmentos funcionales de las mismas.
Ejemplos
Ejemplo comparativo 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Secuencias de la envoltura del VIH-1 subtipo B. Para generar la secuencia de la envoltura consenso del VIH-1 subtipo B, se seleccionaron del GenBank cuarenta y dos secuencias génicas de la envoltura del subtipo B recogidas de once países para evitar el sesgo del muestreo. Cada secuencia representa un paciente diferente. Todas las secuencias usadas son no recombinantes.
Alineamiento múltiple. El procedimiento de alineamiento aplicado en el estudio filogenético incluía la aplicación de Clustal X (versión 1.81) (Thompson, J.D., y col. 1997. “The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools”. Nucleic Acids Research 25:4.876-4.882). Los parámetros de alineamiento por pares se fijaron a la programación de “ajuste lento” dinámico, usando 10 como la penalización de abertura de hueco (gap) y 0,1 como la penalización de extensión de hueco. Los parámetros de alineamiento múltiple incluyen una penalización de extensión de hueco igual a 0,2.
Construcción de la secuencia consenso de la envoltura del VIH-1 subtipo B. La secuencia de nucleótidos consenso de la envoltura del VIH-1 subtipo B se obtuvo después de la realización del alineamiento múltiple y ajuste manual final menor. Se usaron secuencias de aminoácidos deducidas para guiar la introducción de huecos de alineamiento de manera que estaban insertados entre los codones. La secuencia de aminoácidos consenso se obtuvo traduciendo la secuencia de nucleótidos consenso.
Árbol filogenético. El método de vecino más cercano (NJ) se empleó para construir el árbol filogenético de aminoácidos usando el programa PAUP* 4.0b10 (Swofford, D.L. 1999. PAUP* 4.0: “phylogenetic analysis using parsimony” (análisis filogenético usando parsimonia) (* y otros métodos), versión 4.0b2a. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.). Se usaron dos secuencias adicionales del subtipo D (K03454 y AAA44873) y dos secuencias del subtipo C (AAD12103 y AAD12112) como un grupo extraño para el enraizamiento (Kuiken, C., B.T. Korber, and R.W. Shafer. 2003. “HIV sequence databases”. AIDS Rev. 5:52-61).
Modificaciones de la secuencia consenso de la envoltura del VIH-1 subtipo B. Se realizaron varias modificaciones después de obtener la secuencia de la envoltura consenso del VIH-1 subtipo B: se acortaron las regiones V1 y V2 altamente variables, se diseñó el bucle V3 para la utilización de CCR5, se separó la región cola citoplasmática del C-terminal, se añadieron una secuencia líder y una secuencia Kozak en dirección 5’ al N-terminal, se realizó la optimización de codón y la optimización de ARN usando GeneOptimizer™ (GENEART, Alemania).
Inmunógenos de envoltura. Se sintetizó el gen que codifica la glucoproteína de la envoltura consenso del VIH-1 subtipo B transmisora temprana modificada (EY2E1-B) y la secuencia se verificó por GENEART. La EY2E1-B sintetizada se digirió con BamHI y NotI, se clonó en el vector de expresión pVAX (Invitrogen) bajo el control del promotor inmediato-temprano de citomegalovirus y esta construcción se denominó pEY2E1-B.
Se generó el inmunógeno del subtipo B primario (EK2P-B) a partir de un gen de la envoltura 6101 gp140 del aislado del subtipo B primario, sesgado por codón humano que era un regalo de M. Sidhm (Wyeth). Básicamente, el gen de envoltura 6101 optimizado se mutó separando la secuencia líder nativa y la cola citoplasmática. A continuación, la secuencia líder de IgE y la se secuencia Kozak se introdujeron diseñando cebadores específicos directos e inversos: Env-Directo: 5’-GTCGCTCCGCTAGCTTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACC-3’ (SEQ ID NO:13) Env-Inverso: 5’-GGTCGGATCCTTACTCCACCACTCTCCTTTTTGCC-3’ (SEQ ID NO:14). El producto de PCR purificado se clonó en el vector plásmido pVAX, el cual también se volvió lineal con EcoR1 y Xbal. Esta construcción se denominó pEK2P-B.
Expresión y reactividad in vivo de EY2E1-B con anticuerpos monoclonales. Se sometieron a transfección células de rabdomiosarcoma (RD) humano (2x106) en placas de 60 mm con 30 gg de plásmidos pEY2E1-B y pEK2P-B usando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche, Alemania), respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron tres veces con 1xPBS y se sometieron a lisis en 150 gl de tampón de lisis (Cell Signaling Technology). Los lisados de proteína totales (50 gg) se separaron en fracciones sobre un gel de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF (Amersham). Los análisis de inmunotransferencia se realizaron con un anticuerpo monoclonal específico a envoltura 2G12 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA) y un anticuerpo anti-actina monoclonal (Sigma-Aldrich) y se visualizaron con anti-IgG humana de cabra conjugado con HRP (Sigma-Aldrich) usando un sistema de análisis de transferencia Western ECLTM (Amersham). La actina se usó como control de carga para la transferencia Western.
Para detectar la reactividad de EY2E1-B con anticuerpos monoclonales, los lisados de proteína totales de la transfección (100 gg) se inmunoprecipitaron con 5 gg de anticuerpos monoclonales específicos a la envoltura incluyendo 2G12, 4G10 e ID6 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA). La misma cantidad de lisados de proteína totales de las células transfectadas con vector vacío pVAX se usó como control negativo. Las proteínas inmunoprecipitadas se separaron en fracciones sobre un gel de SDS-PAGE y se detectaron por transferencia Western como se describió anteriormente.
Ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para confirmar la expresión de los genes de EYE1-B y EK2P-B. Las células de rabdomiosarcoma (RD) humano se colocaron en placas en portaobjetos con cámara de cultivo de tejido (BD Biosciences), a una densidad para obtener confluencia del 60 a 70 % el día siguiente en medio DMEM completo con FBS al 10 % (GIBCO) y dejar que se adhieran durante la noche. Al día siguiente las células se sometieron a transfección con pEY2E1-B, pEK2P-B y el plásmido control pVAX (1 pg/pocillo) usando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche) según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se lavaron las células dos veces con 1XPBS frío y se fijaron sobre portaobjetos usando metanol durante 15 min. Tras la separación de los disolventes residuales de los portaobjetos, las células se incubaron con F105 monoclonal anti-env de VIH-1 de ratón (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA) durante 90 min. A continuación, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con TRITC (Sigma-Aldrich) durante 45 min. Se añadió hidrocloruro de 4’,6-diamido-2-fenilindol (Sigma-Aldrich) a la solución de anticuerpo secundario a los núcleos de contratinción para mostrar los núcleos del número total de las células disponibles en el campo dado. Los portaobjetos se montaron con medio de montaje que contenía reactivo antidecoloración (Molecular Probes). Las imágenes se analizaron usando el programa Phase 3 Pro para microscopio fluorescente (Media Cybernetics).
Determinación de anticuerpo específico a envoltura. La medición de los anticuerpos IgG específicos a la envoltura se realizó por ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) en tanto ratones inmunizados como control. Se cubrieron placas Nunc-ImmunoTM (Nalge Nunc International, Rochester, NY) con 1 pg/ml de glucoproteína del VIH-1 IIIB recombinante del clado B soluble gp160 (Immuno Diagnostics, MA), proteína de la envoltura primaria del clado A/E del VIH-1 93TH975 gp120 y proteína de la envoltura primaria del clado C del VIH-1 96ZM651 gp120 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA), respectivamente, y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se bloquearon con BSA al 3 % en PBST (1xPBS+Tween-20 al 0,05 %) durante 1 h a 37 °C. A continuación, las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con los sueros de ratón específicos, se diluyeron con BSA al 3 % en PBST durante la noche a 4 °C, seguido de incubación con una dilución 1/10.000 de anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante 1 h a 37 °C. La reacción se desarrolló con el sustrato TMB (3, 3p, 5, 5p - tetrametilbenzidina) (Sigma-Aldrich). La reacción se paró con 100 pl de ácido sulfúrico 2,5 M por pocillo y las placas se leyeron en el lector de placa EL808 (Biotech Instrument Inc.) a DO de 450 nm.
Inmunización de ratones. Se compraron ratones BALB/c de 4 a 6 semanas de vida femeninos en “The Jackson Laboratory”, Bar Harbor, ME. Las parejas de cría de ratones B6.Cg-Tg (HLA-A/H2-D)2Enge/J transgénicos se compraron en “The Jackson Laboratory” y fueron criados por el Dr. Michelle Kutzler en nuestro laboratorio. Los ratones transgénicos expresan un gen de MHC de clase I híbrido interespecie, AAD, el cual contiene los dominios alfa-1 y alfa-2 del gen HLA-A2.1 humano y los dominios transmembrana alfa-3 y citoplasmáticos del gen H-2Dd de ratón, bajo la dirección del promotor de HLA-A2.1 humano. La expresión del dominio alfa-3 de ratón aumenta la respuesta inmune en este sistema. En comparación con HLA-A2.1 no modificado, la molécula de MHC clase I HLA-A2.1/H2-Dd medió la selección positiva eficaz de linfocitos T de ratón para proporcionar un repertorio de linfocito T más completo capaz de reconocer los péptidos presentados por las moléculas HLA-A2.1 clase I. Los epítopos peptídicos presentados y reconocidos por linfocitos T de ratón en el contexto de la molécula HLA-A2.1 clase I son los mismos que aquellos presentados en seres humanos HLA-A2.1+. Los ratones transgénicos de 4 a 6 semanas de vida femeninos se usaron para el estudio adicional descrito más adelante. Su cuidado era de acuerdo con las directrices de los “National Institutes of Health” y el “University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee” (IACUC). Cada ratón se inmunizó intramuscularmente tres veces, cada una de 100 pg de ADN a intervalos bisemanales. Hay tres ratones en cada grupo y el grupo control se vacunó con ADN de pVAX. Los ratones se sacrificaron una semana después de la tercera inmunización y se extrajeron los bazos asépticamente. Las células del bazo se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis de GR para separar los eritrocitos. Después de la lisis, los esplenocitos del mismo grupo se agruparon y se resuspendieron en medio RPMI 1640 con FBS al 10 %. Las células se contaron y se prepararon para análisis.
Ensayo ELISpot de IFN-y. Se usaron placas Multiscreen™ de 96 pocillos IP de alta unión a proteína (Millipore, Bedford, MA, USA). Las placas se cubrieron con mAc para IFN-y de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) diluido en 1xPBS, durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con PBS y, a continuación, se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con 1xPBS complementado con BSA al 1 % y sacarosa al 5 %. Se añadieron esplenocitos de ratones por triplicado a un número de célula de entrada de 2x105 células por pocillo resuspendidas en medio de cultivo completo (RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y anticuerpos). Seis conjuntos de péptidos conteniendo cada uno 15 restos de aminoácidos solapados por 11 aminoácidos que representan las secuencias consenso de proteína enteras del VIH-1 subtipo B, subtipo C, grupo M y las secuencias de proteína enteras de la envoltura del VIH-1 MN (un aislado del subtipo B), HiV-1 C.UY.01.TRA3011 y C.ZA.01.J54Ma (dos aislados del subtipo C) se obtuvieron del “NIH AIDS Research and Reference Reagent Program”. Cada conjunto de péptidos de env se agruparon a una concentración de 2 pg/ml de péptido dentro de los 4 grupos como antígenos para la estimulación específica de la liberación de IFN-y. La concavalina A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a 5 g/ml, y el medio de cultivo completo se usaron como control positivo y negativo, respectivamente. Las placas se lavaron cuatro veces después de una incubación de 24 h a 37 °C, en un incubador de atmósfera de CO2 al 5 %. A continuación, se añadió un anticuerpo de detección anti-IFN-Y de ratón biotinilado, y las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron, y se siguió el desarrollo de color según las instrucciones del fabricante (ELISPOT Blue Color Module, R&D Systems, Minneapolis, MN). Las placas se secaron al aire y las manchas se contaron usando un sistema de lectura de ELISPOT automatizado (CTL Analyzers, Cleveland, OH) con el programa informático ImmunoSpot®. El número promedio de células formadoras de mancha (SFC) se ajustó a 1x106 esplenocitos para la presentación de datos. El ensayo ELISpot se repitió tres veces en tres experimentos separados.
Estudio de agotamiento de linfocito T CD8+. Los linfocitos con CD8 se sometieron a agotamiento de esplenocitos usando perlas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpo para CD8 (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del agotamiento de los linfocitos T CD8+, se realizó el ensayo ELISpot de IFN-y como se describió anteriormente.
Estudio de mapeo de epítopo. Para mapear los epítopos reactivos, se agruparon dos conjuntos de péptidos que contenían 15 restos de aminoácidos que se solapaban por 11 aminoácidos que representaban las proteínas de la envoltura enteras del consenso del VIH-1 subtipo B y VIH-1 MN en 29 grupos de 14 a 15 péptidos/por grupo, respectivamente, y se realizó el ensayo ELISpot de IFN-y como se describió anteriormente. Estos conjuntos diferentes de 29 estimuladores agrupados se usaron en un ensayo de matriz que facilita el mapeo de epítopo.
Análisis estadístico. Se usó la prueba de t de Student pareada para la comparación de la respuesta inmune celular entre ratones inmunizados con pEY2E1-B y pEK2P-B. En este estudio, p<0,05 se ha considerado estadísticamente significativo.
RESULTADOS
Construcción y diseño de un nuevo gen de la envoltura basado en consenso transmisor temprano del subtipo B. La secuencia consenso del VIH-1 subtipo B se generó a partir de 42 secuencias del subtipo B recuperadas del GenBank. Como se resumen en la Fig. 1, se llevaron a cabo varias modificaciones después de la generación de la secuencia consenso. En resumen, para producir una versión trópica de CCR5 de la envoltura del VIH-1 que imitaba los virus mucosamente transmitidos, se diseñaron seis aminoácidos importantes en el bucle V3 según las secuencias de los aislados transmisores tempranos. Además, diez aminoácidos en el bucle V1 y un aminoácido en el bucle V2 también se suprimió de la secuencia consenso. Una secuencia líder altamente eficaz se fusionó en la estructura en dirección 5’ del codón de inicio para facilitar la expresión. El dominio de transmembrana se mantuvo intacto para facilitar la expresión de superficie y el sitio de escisión se mantuvo intacto para obtener apropiado plegamiento y la escisión de proteinasa hospedadora de la proteína de la envoltura. Se separó la cola citoplasmática para prevenir el reciclado de la envoltura y para promover expresión de superficie más estable y mayor (Berlioz-Torrent, C., y col. 1999. “Interactions of the cytoplasmic domains of human and simian retroviral transmembrane proteins with components of the clathrin adaptor complexes modulate intracellular and cell surface expression of envelope glycoproteins”. J. Virol. 73:1.350-1.359; Bultmann, A., y col. 2001. “Identification of two sequences in the cytoplasmic tail of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that inhibit cell surface expression”. J. Virol. 75:5.263-5.276). Además, para tener un nivel mayor de expresión, el uso de codón de este gen se adaptó al sesgo de codón de genes de Homo sapiens (Andre, S., y col. B. 1998. “Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage”. J. Virol. 72:1.497-503; Deml, L., y col. 2001. “Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein”. J. Virol. 75:10.991 -11.001). Además, también se realizó la optimización de ARN (Schneider, R., y col. 1997. “Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation”. J. Virol. 71:4.892-4.903): se evitaron las regiones de muy alto (>80 %) o muy bajo (<30 %) contenido en GC y los motivos de secuencia de cis-actuación tales como cajas TATA, los sitios chi y los sitios de entrada ribosómica. El gen EY2E1-B modificado por ingeniería sintético se construyó y era de 2.734 pb de longitud. El gen EY2E1-B se subclonó en pVAX en los sitios BamHI y Notl para estudio adicional.
Análisis filogenético. Para valorar la distribución de la distancia desde una secuencia del subtipo B de envoltura aleatoriamente muestreada a la secuencia de EY2E1-B, se realizó un análisis filogenético. Como se muestra en la Fig. 2, había una relativa cercanía observada de la secuencia de EY2E1-B a todas las secuencias muestreadas. La secuencia de EY2E1-B, cuando se compara con la secuencia de EK2P-B de aislado primario, tiene distribuciones comparables de puntuaciones de similitud (Tabla 1). La puntuación de porcentaje de similitud promedio para EY2E1-B era de 85,7 %, mientras que era 79,4 % para EK2P-B.
Tabla 1
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Tabla 1. El promedio y el rango de puntuaciones de porcentaje de similitud entre los candidatos de vacuna de envoltura potenciales y un alineamiento de secuencias de la envoltura del subtipo B.
Expresión in vivo y determinación antigénica de EY2E1-B. Para ensayar la expresión in vivo de pEY2E1-B y pEK2P-B, se sometieron a transfección células RD con estos plásmidos como se describe en la sección de Materiales y métodos. Se extrajeron las proteínas totales de los lisados celulares después de la transfección y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal específico a envoltura 2G12 mencionado en la sección de Materiales y métodos para detectar la expresión de pEY2E1-B. Los resultados de la transferencia Western indicaron que estas dos construcciones expresaban proteína de la envoltura (Fig. 3A). La proteína de la envoltura detectada era de aproximadamente 120 KD. La Tabla 2 muestra una comparación de pEY2E1-B y pEK2P-B.
Tabla 2
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Para determinar los epítopos antigénicos, se inmunoprecipitaron las proteínas de la envoltura expresadas a partir de los lisados de célula de RD con tres anticuerpos específicos a gp120 diferentes 2G12, 4G10 e ID6. Después de la inmunoprecipitación, la transferencia Western se realizó para detectar las proteínas inmunoprecipitadas. Nuestros resultados mostraron que el inmunógeno sintético se podía unir a los anticuerpos 2G12 e ID6, pero no a 4G10. Puesto que el anticuerpo 2G12 neutraliza una gran variedad de aislados primarios y reacciona con un epítopo gp120 dependiente de carbohidrato y conformacional, y el anticuerpo ID6 se une a gp120 y gp160 y se dirige frente a los primeros 204 aminoácidos de gp120, nuestros resultados sugirieron que el inmunógeno EY2E1-B modificado por ingeniería sintético podría ser capaz de plegarse dentro de una conformación relativamente nativa y conservar algunos epítopos antigénicos nativos. Además, puesto que el anticuerpo 4G10 es un anticuerpo monoclonal de VIH-1 LAI/BRU V3 que reconoce LAI gp160, una cepa adaptada del linfocito T, nuestros datos también sugirieron que esta envoltura sintética no utilizaría el correceptor CXCR4.
Para confirmar más la expresión y determinar los epítopos antigénicos, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta usando células de RD transfectadas. Se observó alta expresión específica bajo microscopio fluorescente en las células transfectadas con pEY2E1-B y pEK2P-B. El F105 monoclonal de env del VIH-1 que reacciona con un epítopo de gp120 discontinuo, o conformacional, se usa en el ensayo. Como se indica en la Fig. 3B, las células transfectadas que expresan las proteínas Env mostraron la fluorescencia de rodamina típica, sugiriendo de nuevo que se expresaba la proteína sintética y tenía una conformación relativamente nativa. Como control, la expresión no se detectó en células de RD transfectadas con pVAX.
Inducción de la respuesta humoral. Para determinar si el inmunógeno sintético podría provocar respuesta a anticuerpo específico a envoltura de alta titulación, se recogieron sueros de ratones BalB/C inmunizados con pVAX, pEY2E1-B y pEK2P-B, y se realizó ELISA. Como se muestra en la Fig. 4A, observamos el nivel relativamente mayor de anticuerpo específico a la envoltura del clado B con sueros recogidos de ratones inmunizados con pEY2E1-B en comparación con estos en ratones inmunizados con pEK2P-B. Por el contrario, los ratones con vector solo no desarrollaron respuestas a anticuerpo específicas. Sin embargo, no hubo ninguna respuesta de anticuerpo detectable frente a proteínas del clado A/E y clado C en tanto ratones inyectados con pEY2E1-B como con pEK2P-B (Fig. 4B y AC), indicando que aunque el inmunógeno basado en consenso sintético tiene una conformación relativamente nativa y conserva epítopos antigénicos nativos, no puede ser capaz de inducir amplias respuestas inmunes de anticuerpo de clado cruzado.
Respuestas inmunes celulares fuertes y amplias medidas por ELISpot. Se inmunizaron los ratones BalB/C con pEY2E1-B y pEK2P-B y se realizó el análisis ELISpot para determinar el número de células secretoras de IFN-y específico a antígeno en respuesta a cuatro grupos de péptidos de la proteína consenso del VIH-1 subtipo B (Fig. 5A). La magnitud de la respuesta medida por el número de unidades formadoras de mancha (SFU) por millón de células osciló de 27,5 a 520 en ratones vacunados con pEY2E1-B. En comparación, los esplenocitos de ratones vacunados con pEK2P-B solamente mostraron el intervalo de manchas de 2 a 237,5 (p<0,05). La frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para todos los cuatro grupos en ratones inmunizados con pEY2E1-B era de 1.976,25+260, mientras que el número de SFU/por millón de células en ratones inmunizados con pEK2P-B era de 519+45. Las células de ratones inmunizados con vector pVAX se usaron como control negativo, mostrando solamente 60+5 SFU/por millón de esplenocitos para los grupos de péptidos B de la envoltura consenso (p<0,05). Observamos resultados similares en tres estudios separados. Por lo tanto, la construcción pEY2E1-B es hasta cuatro veces más potente en conducir respuestas inmunes mediadas por célula. También determinamos si los linfocitos CD8+ eran responsables de la secreción de IFN-y detectada en ratones BalB/C inmunizados con pEY2E1-B. Como se muestra en la Fig. 5B, el número de SFU/por millón de células se redujo a 127,5+11 después del agotamiento de CD8+, indicando que había aproximadamente 90 % de descenso en las frecuencias de células productoras de IFN-y observadas por ELISpot de agotamiento de linfocito T CD8+. La producción de IFN-y inducida por pEY2E1-B se media principalmente por linfocitos T CD8+.
Además, para modelar las respuestas inmunes del linfocito T humano a antígenos presentados a HLA-A2 e identificar aquellos antígenos, realizamos el mismo ensayo ELISpot anteriormente mencionado usando ratones HLA-A2.1/H2-Dd transgénicos. Como se muestra en la Fig. 5c , la frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para todos los cuatro grupos en ratones transgénicos inmunizados con PEYE1-B era de 2.362+257, mientras que el número de SFU/por millón de células en ratones transgénicos inmunizados con pEK2P-B era solamente de 493+57. Estos resultados indicaron que la construcción pEY2E1-B es hasta cuatro veces más potente en conducir respuestas inmunes mediadas por célula en los ratones transgénicos. Los datos de ELISpot después del agotamiento de CD8 sugirieron que la producción de IFN-y inducida por pEY2E1-B está principalmente mediada por linfocitos T CD8+ (Fig. 5D).
Además, estábamos interesados en detallar más las respuestas inmunes celulares que observábamos en el ensayo ELISpot. Por consiguiente, un conjunto adicional del ensayo ELISpot se realizó frente a genotecas de péptidos que abarcaban la proteína de la envoltura del subtipo B consenso. Un conjunto completo de péptidos 15-mero solapados por 11 aminoácidos, los cuales comprendían la proteína de la envoltura consenso del subtipo B, se usó para realizar este estudio de mapeo. El estudio ilustró que no había epítopo dominante claro inducido por la envoltura sintética. Sin embargo, el análisis ELISpot de IFN-y de esplenocitos derivados de ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B reveló que había 18 grupos de los 29 grupos que mostraban más de 50 manchas, mientras que había solamente 6 grupos en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Fig. 5E). Estos resultados ilustraron que hay un incremento significativo en la amplitud y magnitud de las respuestas inmunes celulares inducidas por el inmunógeno EY2E1 -B.
Respuestas inmunes celulares de reacción cruzada fuertes inducidas por pEY2E1-B. Para determinar si el inmunógeno EY2E1-B podría inducir respuestas inmunes celulares amplias y de reacción cruzada, se realizó ELISpot de IFN-y tanto en ratones BalB/C como transgénicos HLA-A2 usando péptidos de la envoltura del VIH-1 grupo M, subtipo C consenso, VIH-1 MN (aislado del subtipo B), del HIV-1 C.UY.01.TRA3011 y C.ZA.01.J54Ma (dos aislados del subtipo C). Estos ensayos determinarán además si los resultados observados en la Fig. 5A, C y E solo están relacionados con las dianas peptídicas o realmente son debido al incremento en la amplitud inmune. Como se muestra en la Fig. 6A, el número aditivo de SFU(por millón de esplenocitos frente a cuatro grupos de péptidos de la envoltura del VIH-1 MN en ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B era de 1.855+215,8, lo cual era aproximadamente dos veces más que aquellos en ratones BalB/C inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos era 700+168,2), indicando que pEY2E1 -B tenía reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B. Los números de manchas de IFN-y en respuesta a la estimulación con cuatro grupos de péptidos de la envoltura consenso del VIH grupo M (Fig. 6B) y subtipo C (Fig. 6C) en ratones BalB/C inmunizados con pEY2E1-B era de 1.150+191,3 y 715+116,1, respectivamente. En comparación con los números de manchas frente a los péptidos del grupo M y subtipo C los cuales eran de 635+152,3 y 345+82,3 en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B, estos datos ilustran que las respuestas inmunes de clado cruzado provocadas por pEY2E1-B es aproximadamente 45 % más fuerte que aquellas inducidas por pEK2P-B en ratones BalB/C.
Importantemente, observamos respuestas inmunes celulares de reacción cruzada mucho más fuertes inducidas por pEY2E1-B en ratones transgénicos (Fig. 6F-J). El número aditivo de SFU/por millón de esplenocitos frente a cuatro grupos de péptidos de la envoltura del VIH-1 MN en ratones transgénicos vacunados con pEY2E1-B era de 1.087+153, lo cual era aproximadamente tres veces más que aquellos en ratones HLA-A2 inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos era 316+63) (Fig. 6F), indicando que pEY2E1-B podría también provocar reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B en ratones transgénicos. Los números de manchas de IFN-y en respuesta a la estimulación con cuatro los grupos de péptidos de la envoltura consenso del VIH grupo M (Fig. 6G) y subtipo C (Fig. 6H) en ratones transgénicos inmunizados con pEY2E1-B era de 2.116+216 y 893+154, respectivamente. En comparación con los números de manchas frente a los péptidos del grupo M y subtipo C que eran de 473+50 y 266+55 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B, estos datos indicaron que las respuestas inmunes de clado cruzado provocadas por pEY2E1-B es aproximadamente tres a cuatro veces más fuerte que aquellas inducidas por pEK2P-B en ratones transgénicos. Además, dos conjuntos de péptido aislados del subtipo C que deberían servir como control estricto para evaluar la amplitud y la reactividad cruzada alcanzada por otros conjuntos de péptido se usaron para determinar además las respuestas inmunes de clado C cruzado. Aunque no había demasiadas diferencias de reactividad cruzada frente a estos dos conjuntos de aislado del subtipo C provocados por pEY2E1-B y pEK2P-B en ratones BalB/C (Fig. 6D y E), la reactividad de clado cruzada frente a estos dos conjuntos de aislado del subtipo C inducidos por pEY2E1-B es aproximadamente tres veces más fuerte que aquellas inducidas por pEK2P-B (Fig. 61 y J). Los números de manchas frente a péptidos C.ZA.01.J54Ma y C.UY.01.t Ra 3011 eran de 1.080+206 y 890+150 en ratones transgénicos vacunados con pEY2E1-B, mientras que los números eran solamente 305+38 y 310+62 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B.
Finalmente, determinamos si había también un incremento en la amplitud de las respuestas inmunes celulares de reacción cruzada frente a dianas específicas a subtipo inducidas por el inmunógeno EY2E1-B detallando las respuestas inmunes celulares frente a VIH-1 MN observadas anteriormente tanto en ratones transgénicos BalB/C como HLA-A2. Se realizó un ensayo de mapeo de epítopo frente a la genoteca de péptidos que abarcaban la proteína de la envoltura del subtipo B MN. Los resultados sugirieron que no había epítopo dominante claro inducido por la envoltura sintética en ambas cepas de ratón. Sin embargo, el análisis ELISpot de IFN-y de esplenocitos derivados de los ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B revelaron que había 14 grupos de los 29 grupos que mostraban más de 50 manchas, mientras que había solamente 9 grupos en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Fig. 7A). Igualmente, en ratones transgénicos, había 18 grupos de los 29 grupos que mostraban más de 50 manchas en ratones transgénicos inmunizados con pEY2E1-B, mientras que había solamente 6 grupos en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B (Fig. 7B). Estos datos indicaron que hay un incremento significativo en la amplitud y magnitud de las respuestas inmunes celulares de reacción cruzada inducidas por el inmunógeno EY2E1-B tanto en ratones BalB/C como transgénicos HLA-A2.
CONCLUSIÓN
Por todo el mundo los intentos de vacuna de ADN del VIH-1 se han guiado por el principio de que las respuestas de linfocito T específico a VIH pueden proporcionar alguna contribución a la protección de la infección o control de la replicación después de la infección. Las vacunas de ADN pueden impactar en la replicación vírica aunque en general no son tan potentes en la inducción inmune como los vectores víricos vivos atenuados (Almond, N., y col.
1995. “Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus-infected cells”. Lancet 345:1.342-1.344; Berman, P.W., y col. 1996. “Protection of MN-rgp120-immunized chimpanzees from heterologous infection with a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 ”. J. Infect. Dis. 173:52-9; Boyer, J., y col. 1997. “Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination”. Nat. Med. 3:526-532; Daniel, M.C., y col. 1992. “Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene”. Science 258:1.938-1.941). Por lo tanto, las estrategias reivindicadas en la mejora de la amplitud y magnitud de las respuestas inmunes celulares son importantes. La presente invención proporciona un nuevo antígeno que usa varios rasgos de inmunógenos que se han publicado en la bibliografía como planteamientos separados, pero previamente no se han reunido juntos en una modalidad de vacuna. Como prueba del concepto, se desarrolló un inmunógeno de la envoltura basado en consenso modificado por ingeniería sintético y se comparó con un inmunógeno de secuencia primaria optimizada para la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula. Los datos de expresión mostraron que este nuevo gen de la envoltura modificado por ingeniería se podía expresar eficazmente en líneas celulares mamíferas aunque los niveles de expresión de estos dos inmunógenos eran muy similares (Fig. 3A). Observamos en los estudios de inmunogenicidad que las respuestas inmunes celulares inducidas por este inmunógeno funcional presentaron diversidad incrementada y magnitud comparada con la vacuna de envoltura primaria. Los datos del mapeo de epítopo obtenidos en tanto ratones BalB/C como transgénicos HLA-A2 demostraron que esta mejora de diversidad y magnitud se mantenía a través de estos haplotipos. Para confirmar más este descubrimiento, también desarrollamos un inmunógeno de la envoltura del subtipo C basado en consenso y se comparó con un inmunógeno del subtipo C primario, de nuevo el inmunógeno de la envoltura del subtipo C basado en consenso sintético presento diversidad y magnitud aumentadas de las respuestas inmunes celulares en comparación con el inmunógeno C primario (datos no publicados).
Desde el punto de vista de la estrategia de diseño de vacuna, la homología de secuencia entre el candidato de vacuna y el virus de infección o exposición puede ser una consideración importante. Un planteamiento eficaz para minimizar el grado de la desemejanza de secuencia entre una cepa de vacuna y los virus circulantes actuales es crear secuencias artificiales que son “centrales” a estos virus. Una estrategia para diseñar tal secuencia es usar una secuencia consenso derivada del aminoácido más común en cada posición en un alineamiento. En este estudio, desarrollamos una vacuna de envoltura del subtipo B basada en consenso y pensamos que este inmunógeno sintético tendría mayor reactividad cruzada. Nuestros resultados mostraron que había una diversidad de respuestas inmunes celulares inducidas por la vacuna de pEY2E1-B. Los resultados del mapeo de péptido en tanto ratones Balb/c como transgénicos también indicaron que el inmunógeno EY2E1-B amplió las respuestas inmunes. Además, los resultados del estudio de las respuestas inmunes celulares de reacción cruzada indicaron que pEY2E1-B podía provocar respuestas inmunes celulares de reacción cruzada más fuertes y amplias. Por lo tanto, los inmunógenos de la envoltura consenso artificiales contienen más epítopos conservados que los encontrados en cualquier aislado natural individual e inducen respuestas de LCT de clado cruzado.
Una secuencia consenso teóricamente tiene ventajas y desventajas. Puesto que una secuencia consenso se genera basándose en aislados actuales, puede ser genéticamente más cercana a cepas víricas circulantes actuales que cualquier aislado de virus natural dado. Sin embargo, puesto que la secuenciación global en general está conducida con virus muestreados durante las infecciones crónicas en lugar de virus muestreados durante la infección aguda, desarrollar una respuesta de vacuna consenso sobre epítopos que en su mayoría han escapado puede ser una desventaja. Para minimizar esta desventaja, una estrategia útil para el diseño de vacuna sería para tener en cuenta secuencias transmisoras tempranas. Las proteínas de la envoltura están entre las proteínas del VIH más difíciles de construir artificialmente debido a que las regiones hipervariables en el gen de la envoltura del VIH-1 evolucionan por inserción y deleción rápida y no por mutación puntual. La diferencia de las regiones hipervariables en longitud hace difícil generar las secuencias consenso de estas regiones. Recientemente, Gao y col. (Gao, F., E y col. 2005. “Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein”. J. Virol. 79:1.154-63) generaron una secuencia de la envoltura consenso del grupo M, sin embargo, las secuencias no consenso de las correspondientes regiones de una cepa recombinante CRF08 BC se usaron en estas regiones variables. Los estudios han indicado que los virus del subtipo C que codifican las glucoproteínas de la envoltura con regiones V1, V2 y V4 más cortas se transmiten en receptores con una frecuencia significativamente mayor que lo que se esperaría por casualidad. Las secuencias de la envoltura del subtipo A de infección temprana también tenían las secuencias del bucle V1 y V2 significativamente más cortas y menos sitios de glucosilación ligados a N potenciales (Chohan, B., D. y col. 2005. “Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels”. J. Virol. 79:6.528-6.531). Por el contrario, variantes del subtipo B recientemente transmitidas no tenían bucles V1 y V2 más cortos. Sin embargo, puede ser importante indicar que los casos de infección por subtipo B eran principalmente el resultado de la transmisión homosexual o el uso de inyección de droga. Además, los estudios han sugerido que una posible consecuencia funcional de tener una región V1, V2 compacta es incrementar la exposición del dominio de unión de CD4 y, a continuación, aumentar la susceptibilidad a la neutralización (Edwards, T.G., y col. 2001. “Relationships between CD4 independence, neutralization sensitivity, and exposure of a CD4-induced epitope in a Human Immunodeficiency Virus type 1 envelope protein”. J. Virol.
75:5.230-5.239; Kolchinsky, P., y col. 2001. “Increased neutralization sensitivity of CD4-independent Human Immunodeficiency Virus variants”. J. Virol. 75:2.041-2.050; Pickora, C., y col. 2005. “Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodeficiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4”. J. Virol. 79:12.575-12.583; Puffer, B.A., y col. 2002. “CD4 independent of Simian Immunodeficiency Virus Envs is associated with macrophage tropism, neutralization sensitivity, and attenuated pathogenicity”. J. Virol. 76:2.595-2.605). Acortamos las regiones V1 y V2 cuando generamos la secuencia consenso del subtipo B.
La fase temprana de la infección por VIH-1 está dominada por virus no inductores de sincitio (NIS), los cuales se replican lentamente y usan CCR5 como su principal correceptor. Los virus inductores de sincitio (IS), los cuales surgen en aproximadamente el 50 % de los individuos infectados precedieron un declive de la célula CD4 acelerado y el trascurso clínico progresivo de la infección, usan CXCR4 como principal correceptor. Se ha demostrado un uso de correceptor diferencial de las variantes de VIH para todos los subtipos. Se ha publicado frecuentemente que los virus subtipo C parecen ser diferentes de la mayoría de otros subtipos debido a una no desrepresentación de CXCR4 usando variantes de VIH en el subtipo C. Por lo tanto, la utilización de CCR5 debería ser una consideración muy crucial para un diseño de vacuna. Informes previos mostraron que la región V3 de gp120 juega un importante papel en la utilización de correceptor. Se han identificado que seis restos en el bucle V3 son críticos para la interacción de CCR5: arginina307, lisina314, isoleucina316, arginina322, fenilalanina324 y alanina337. Sin embargo, basándose en las secuencias de transmisores tempranos del subtipo C, el resto en la posición 322 debería ser glutamina en lugar de arginina. En resumen, basándose en los estudios previos que muestran restos importantes para la utilización de CCR5 y las secuencias de transmisores tempranos, diseñamos el inmunógeno de la envoltura consenso del subtipo B que podría conducir a respuestas inmunes que pueden en teoría dirigir la utilización del correceptor CCR5.
Para maximizar la reactividad cruzada potencial, se ha creado una secuencia de la envoltura consenso del VIH-1 grupo M. Sin embargo, es posible que las vacunas consenso de envoltura específicas a subtipo puedan representar un compromiso para la similitud de secuencia general del antígeno vacuna en relación con los virus circulantes al menos al nivel de respuestas inmunes celulares. Los estudios han mostrado que había altas tasas de selección identificadas en regiones diferentes de las proteínas de la envoltura del subtipo B y C. Esto se puede causar por diferente presión inmune en diferentes regiones de la proteína de la envoltura en el subtipo B y C. Por lo tanto, puede haber ventajas en el uso de una vacuna de envoltura específica a subtipo, ya que las respuestas inmunes a la vacuna y el virus circulante compartirían dominios antigénicos. Más experimentos que comparan vacunas de envoltura específicas a grupo M y subtipo son necesarios para aclarar más este asunto.
Otra preocupación importante sobre el uso de una secuencia consenso es que su secuencia pueda asociarse a polimorfismos en combinaciones no encontradas en ningún tipo natural, así dando como resultado potencialmente conformaciones de proteína inapropiadas. Estudios previos han indicado que un inmunógeno consenso del grupo M podría plegarse dentro de la conformación nativa, conservar los epítopos antigénicos de la envoltura y provocar respuesta de anticuerpo neutralizante débil. Basándose en los hechos de que la proteína sintética podría unirse a anticuerpos 2G12, ID6 y F105, pensamos que el pEY2E1-B puede tener de alguna manera conformaciones estructurales nativas. Importantemente, nuestros datos también demostraron que el inmunógeno EY2E1-B podría inducir un anticuerpo específico a la envoltura del subtipo B de mayor titulación, indicando que este inmunógeno sintético puede conservar también más epítopos clase II. Más estudios en esta área serán importantes.
Con la generación de nuevas estrategias de vacuna del VIH-1, también hay una creciente demanda para predecir la eficacia de estas vacunas en seres humanos usando modelos preclínicos. En nuestro estudio, se usaron ratones transgénicos HLA-A2 para estudiar las respuestas inmunes celulares provocadas por el inmunógeno sintético. Los estudios han mostrado que esta cepa transgénica es un modelo preclínico importante para el diseño y ensayo de vacunas para enfermedades infecciosas implicando la estimulación óptima de linfocitos T citolíticos CD8+ humanos. En este modelo los resultados indicaron que EY2E1-B podía provocar respuestas inmunes celulares mucho más amplias y más fuertes en comparación con EK2P-B, sugiriendo que esta nueva vacuna puede tener más potencial para inducir respuestas celulares restringidas a HLA-A2. Se está planeando estudio adicional de este inmunógeno en primates no humanos.
Tomándolos juntos, nuestros resultados sugieren que EY2E1-B podría servir como un inmunógeno que incrementa tanto la magnitud como la amplitud de las respuestas de LCT como un casete de vacuna de ADN. En términos más generales, esta construcción puede ser útil en otras plataformas para la inducción de respuestas inmunes celulares más fuertes y más amplias frente a cepas de VIH en planteamientos de no vector de ADN.
Ejemplo2. Desarrollo de una nueva vacuna de ADN de la envoltura del VIH-1 clado C modificada por ingeniería que aumenta la diversidad y la amplitud de la respuesta inmune celular provocada
Las respuestas de LCT específico al VIH-1 fuertes tienen un importante papel en el manejo de la carga vírica durante la infección grave y asintomática. Sin embargo, recientes estudios sobre los inmunógenos consenso no han sido capaces de demostrar notablemente respuestas inmunes celulares mejoradas. En el presente documento ensayamos un nuevo inmunógeno de la envoltura basado en consenso del clado C modificado por ingeniería para respuesta inmune celular mejorada. La nueva vacuna (pEY3E1-C) se creó a partir de la secuencia de la envoltura consenso del VIH-1 clado C. Se realizaron varias modificaciones incluyendo el acortamiento de las regiones V1 y V2 altamente variables basándose en la secuencia transmisora temprana, retención del bucle V3 para la utilización de CCR5, separación de la región cola citoplasmática del terminal C para prevenir el reciclado de la envoltura, y retención del sitio de escisión y TMD para el plegamiento apropiado. También, se añadió una secuencia líder de IgE al terminal N. Esta vacuna de ADN consenso también estaba optimizada por ARN y optimizada por codón. La respuesta inmune celular se estudió en ratones BalB/C por ELISpot y ensayos de mapeo de epítopo. Cuando se estudió como una vacuna de ADN, en comparación con pEK3P-C (derivado de un aislado primario de env del clado C), nuestra construcción (pEY3E1-C) era más eficaz en la conducción de una respuestas inmune celular. pEY3E1-C provocó una respuesta inmune celular mayor en magnitud que pEK3P-C cuando se estimuló por péptidos del clado C consenso. Además, el inmunógeno consenso provocó un incremento en la magnitud de la respuesta inmune celular cuando se estimuló por otros dos conjuntos de péptidos de aislado primario también del clado C. Además de magnitud aumentada, se soportó amplitud aumentada de la respuesta de LCT por la capacidad de pEY3E1-C de inducir al menos 15 de los 29 grupos de péptido fuertemente reactivo (que tienen más de 50 manchas/por millón de esplenocitos), mientras que pEK3P-C solamente indujo 3 de los 29 grupos y 9 de los 29 grupos con reactividad fuerte en respuesta a dos conjuntos de péptido de aislado primario, los cuales se seleccionaron por su singularidad y capacidad de servir como un control estricto para evaluar la amplitud. Además, pEY3E1-C provocó una respuesta inmune celular de clado cruzado más fuerte cuando se estimuló con péptidos del clado B. El inmunógeno consenso pEY3E1-C aumentó tanto la magnitud como la amplitud de las respuestas de LCT como un casete de vacuna de ADN, sugiriendo que el potencial para los inmunógenos consenso sirve como un antígeno componente en un examen adicional de méritos de cóctel de vacuna del VIH.
Con la gran diversidad genética, rápida mutación, y recombinación de las cepas existentes, la dificultad de generar una vacuna eficaz es tremenda. Una vacuna de ADN candidata derivada de un aislado individual no puede ser capaz de provocar la reactividad cruzada necesaria para la protección frente a las diversas cepas circulantes del VIH-1.
Además, se ha publicado de que las vacunas de ADN que expresan la glucoproteína de la envoltura del VIH-1 no son muy inmunógenas.
Hemos usado una estrategia multifase para incrementar el potencial de la respuesta de LCT provocada por la vacuna de ADN para proporcionar posiblemente protección frente a las cepas circulantes del virus.
Recientes estudios han mostrado que un inmunógeno consenso puede superar la diversidad de obstáculo creada por el virus VIH-1 de evolución rápida.
Derdeyn y col. encontraron que una región V1-V4 más corta es característica de virus subtipo C de transmisión temprana y nuestra construcción se ha diseñado para llevar este rasgo que podría ser útil en la producción de una respuesta inmune resultante de virus transmitidos tempranos.
Además, los niveles de expresión de nuestra vacuna de ADN se han aumentado por optimización de codón, optimización de ARN, y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina.
Las respuestas de LCT específico al VIH-1 han mostrado que son importantes en el control de la carga vírica durante la infección aguda y asintomática y el desarrollo del SIDA, por tanto los siguientes datos se centran en las respuestas de LCT provocadas por nuestro nuevo inmunógeno.
La Figura 13 representa el diseño del inmunógeno para el desarrollo de una nueva vacuna de ADN de la envoltura del VIH-1 clado C modificada por ingeniería que aumenta la diversidad y la amplitud de las respuestas inmunes celulares provocadas.
La Figura 14 muestra relaciones filogenéticas: se incluyeron treinta y seis secuencias de la envoltura del VIH-1 subtipo C, EY3E1 -C, EK3PC, dos secuencias del subtipo B, una del subtipo A y una del subtipo D (grupo extraño) en el análisis filogenético. Las secuencias de la envoltura del subtipo C que representan una amplia muestra de diversidad eran de 12 países.
La Tabla 3 muestra el promedio y el intervalo de las puntuaciones del porcentaje de similitud entre los candidatos de vacuna de envoltura potenciales y un alineamiento de las secuencias de envoltura del subtipo C.
Tabla 3
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Se inmunizaron tres de grupos de tres ratones Balb/C con 100 gg de ADN 3 veces con dos semanas entre inmunizaciones. A la séptima semana, se extrajeron los bazos para los estudios celulares.
Como se muestra en los paneles A y B de la Figura 15, respuesta celular fuerte provocada por pEY3E1-C.
La Figura 16 muestra respuestas celulares fuertes y amplias provocadas por pEY3E1-C. Cuando se estimuló con 29 grupos de péptidos de env C consenso: los ratones vacunados con pEY3E1-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 23 grupos; los ratones vacunados con pEK3P-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 2 grupos.
Los Paneles A-D de la Figura 17 muestran respuestas celulares de reacción cruzada fuertes provocadas por pEY3E1-C en el mismo clado.
Los Paneles A y B de la Figura 18 muestran respuestas celulares de reacción cruzada fuertes y amplias provocadas por pEY3E1-C. El panel A muestra los datos de ELISpot de IFN-y específico a env del subtipo C (Uruguay). Cuando se estimularon con 29 grupos de péptidos de env del clado C (Uruguay): los ratones vacunados con pEY3E1-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 12 grupos; los ratones vacunados con pEK3P-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 3 grupos. El Panel B muestra los datos del ELISpot de IFN-y específico a env del subtipo C (S. África). Cuando se estimularon con 29 grupos de péptidos de env del clado C (S. África): los ratones vacunados con pEY3E1-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 13 grupos; los ratones vacunados con pEK3P-C provocaron más de 50 manchas/millón de esplenocitos de 5 grupos. Los paneles A-f de la Figura 19 muestran respuestas celulares de reacción cruzada fuertes provocadas por pEY3E1-C entre clados.
Hay un incremento significativo en la amplitud y la magnitud de las respuestas inmunes celulares inducidas por el inmunógeno EOC. La reactividad de clado cruzado más amplia aparece como un beneficio adicional de este inmunógeno.
Ejemplo comparativo 3:
Eficacia de una nueva vacuna de ADN del VPH-16 modificada por ingeniería que codifica una proteína de fusión E6/E7
El inmunógeno se ha diseñado para expresarse como una poliproteína por lo cual las secuencias de E6 y E7 se separan por un sitio de escisión proteolítico. La poliproteína también se expresa con una secuencia líder de IgE. El diseño de la poliproteína incluye deleciones o mutaciones en la secuencia de E6 que son importantes para la unión y degradación de p53 y mutaciones en el sitio de unión de Rb en la proteína E7. La Figura 23 proporciona una ilustración del diseño del inmunógeno.
Las secuencias codificantes que codifican la poliproteína se insertaron en el vector pVAX para producir el plásmido p1667. La Figura 24 muestra los mapas de pVax y p1667.
Las células tumorales TC1 se inmortalizaron con E7 del VPH-16 y se transformaron con el oncogen c-Ha-ras. Estas células expresan bajos niveles de E7 y son muy tumorígenas.
En el estudio de inmunogenicidad en ratones, a 3 ratones/por grupo de ratones C57BL6 se administraron 100 gg de ADN/por ratón. Los grupos incluían 1) control a los que se administraron con pVAX-vector control y 2) ensayo a los que se administraron con p1667. Los ratones se vacunaron los días 0, 14 y 28. El día 35, se sacrificaron los ratones y se realizó ELISPOT (Centrado en IMC).
Los datos para las respuestas inmunes celulares inducidas por el inmunógeno de ADN p1667 se muestran en la Figura 25. Los péptidos de E6 y E7 consenso del VPH 16 (37, 15-meros solapados por 9 aminoácidos) se usaron en dos grupos- grupo 1: 18 péptidos; grupo 2: 19 péptidos. Los paneles A y C muestran los datos de los esplenocitos totales. Los paneles B y D muestran los datos de las muestras con agotamiento de CD8.
La figura 26 muestra los resultados del mapeo de epítopo inmunodominante. Se indican dos secuencias.
En los experimentos profilácticos en ratones, a 5 ratones/por grupo de ratones C57BL6 se administraron 100 gg de ADN/ratón. Los grupos incluían 1) no tratados (inyectado con PBS), 2) control a los que se administraron con pVAX-vector control y 3) ensayo a los que se administraron con p1667. Los ratones se vacunaron los días 0, 14 y 28. El día 35, los ratones se expusieron a células TC-1 y después se realizaron las mediciones del tamaño del tumor. Los resultados se muestran en la Figura 27. También se muestran los datos de un grupo en el que se administró conjuntamente la construcción IL-15.
En los experimentos de regresión tumoral en ratones, a 5 ratones/por grupo de ratones C57BL6 se administraron 100 pg de ADN/ratón. Los grupos incluían 1) no tratados (inyectados con PBS), 2) control a los que se administraron con pVAX-vector control y 3) ensayo a los que se administraron con p1667. Los ratones se expusieron a 5x104 células TC-1 el día 0. A los ratones se administraron la vacuna de ADN los días 3, 10 y 17. Los tumores se midieron empezando el día 8. Los resultados se muestran en la Figura 28. También se muestran los datos de un grupo en el que se administró conjuntamente la construcción IL-15.
Se determinó el nivel de linfocitos E7 tetrámero positivos en los bazos. La Figura 29 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos E7 tetrámeros positivos. La vacuna de ADN p1667 induce la activación de linfocitos T CD8+ específicos a E7 que son CD62Lbajo dentro de los bazos.
Se determinó el nivel de linfocitos E7 tetrámero positivos en tumores. La Figura 30 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos E7 tetrámeros positivos. La vacuna de ADN p1667 induce la activación de linfocitos T CD8+ específicos a E7 que son CD62Lbajo dentro de los tumores.
Se emprendió un estudio de protección de la vacuna de ADN de E6/E7 en ratones transgénicos. Se realizó una comparación entre no tratados, pVAX, p1667, p1667+IL-15 y E7/HisB. Los datos se muestran en la Figura 31. p1667 y p1667+IL-15 protegió completamente.
Los datos presentados en el presente documento soportan las siguientes conclusiones. La construcción p1667 induce una fuerte respuesta inmune celular capaz de inducir linfocitos CD8+ específicos a E7 que median las respuestas de IFN-g elevadas. Hemos identificado tanto nuevos epítopos de VPH-16 subdominantes como dominantes frente a los que se generan LCT específico a antígeno después de la administración de la construcción de ADN. La construcción p1667 es capaz de prevenir el crecimiento tumoral y causar la regresión de los tumores en tanto ratones C57/BL6 como transgénicos. La vacuna de ADN p1667 muestra gran potencial para una nueva estrategia terapéutica para dirigir el cáncer asociado a VPH microscópico.
Ejemplo 4
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias consenso de env del VIH se pueden administrar como vacunas de ADN en combinación con secuencias de ácidos nucleicos que codifican otras varias proteínas del VIH tales como Gag, Pol, Gag/Pol, Nef, Vif, y Vpr usando, por ejemplo, tecnología de electroporación para la administración intramuscular o intradérmica. Las construcciones de vacuna del VIH multivalente/polivalente pueden proporcionar respuestas inmunes aumentadas y ser particularmente útiles. En algunas realizaciones, se proporcionan además las secuencias codificantes de IL-12. La publicación de la solicitud de patente americana número 20070106062, describe una vacuna de ADN de Vif del VIH. La publicación de la solicitud de patente americana número 20040106100, describe vacunas del VIH que comprenden proteínas accesorias del VIH así como las secuencias de tales proteínas que se pueden usar para preparar construcciones de vacuna adicionales. Las patentes americanas N.° 6.468.982, 5.817.637, y 5.593.972 describen las vacunas de ADN incluyendo construcciones de gag del HIV, pol del HIV y gag/pol del HIV. La electroporación se describe en la patente americana N.° 7.245.963. La solicitud PCT PCT/US97/19502, describe las construcciones de IL-12. La publicación de la solicitud americana N.° 20070041941 describe construcciones que codifican IL-15
Ejemplo 15
Dos grupos de macacos se inmunizaron IM tres veces con construcciones de gag y env plásmido optimizadas con o sin plásmido de IL-12. Se usó la misma estrategia de inmunización para dos grupos adicionales pero los plásmidos se administraron con o sin electroporación in vivo.
Las respuestas celulares se determinaron por ELISpot de IFNy después de cada inmunización y cinco meses después para respuestas memoria. Por todo el estudio se evaluaron las respuestas humorales por ELISA de p24 y gp160 recombinante. La capacidad proliferativa de los linfocitos T específicos a antígeno se determinaron por tinción por CFSE. La tinción de citoquina intracelular se hizo para caracterizar más las características funcionales de la respuesta de linfocito T inducida.
El plásmido de IL-12 aumentó las respuestas celulares a nuestras construcciones optimizadas. Sin embargo, el uso de electroporación para aumentar la administración de los plásmidos era capaz de mejorar tanto la respuesta celular como humoral en comparación con la inmunización IM con plásmido de IL-12. La combinación del plásmido de IL-12 y la electroporación dio como resultado las mejores respuestas inmunes, tanto primarias como de memoria, medido por una diversidad de parámetros.
Se compararon las construcciones de ADN optimizadas que codificaban gag y env del VIH en macacos rhesus en presencia o ausencia de plásmido de IL-12 como un adyuvante de ADN. IL-12 podía básicamente incrementar las respuestas del linfocito T 5 veces en un formato de ELISpot cuantitativo dando como resultado básicamente mejores respuestas de linfocito T memoria. Sin embargo, el ADN administrado EP era más eficaz para generar respuestas de linfocito T y memoria que eran 2 veces mayores en comparación con la vacuna de ADN con adyuvante IM con IL-12.
Las mejores respuestas se observaron en el grupo de tratamiento de combinación de EP+adyuvante IL-12. Las respuestas memorias en este grupo de tratamiento eran 10 veces mayores que el ADN IM solo y casi 2 veces mayores que EP solo. También observamos expansión inmune 4 veces mejor por CFSE en el grupo de tratamiento EP+IL-12 en comparación con EP solo. La presencia de linfocitos T polifuncionales también sugirió que el grupo de tratamiento de ADN+citoquina+EP es más eficaz.
Materiales y métodos
Animales:
Los macacos rhesus (Macaca mulatta) se alojaron en BIOQUAL, Inc. (Rockville, MD), de acuerdo con los patrones de la “American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care”. Los animales se dejaron aclimatar durante al menos 30 días en cuarentena antes de cualquier experimentación.
Inmunización
Se inmunizaron cinco macacos rhesus en las semanas 0, 4 y 11 con 1,0 mg de pGag4Y y pEY2E1-B. El ADN en cada momento de inmunización se administró dentro de dos sitios de inyección, uno en cada cuádriceps. Tres de los macacos se sometieron a electroporación después de la inyección IM. Otro grupo de cincos macacos se inmunizaron en las semanas 0, 4 y 8 con 1,0 mg de pGag4Y, pEY2E1-B, y WLV104. De los cincos animales, dos animales recibieron la inmunización por inyección IM y tres animales se sometieron a electroporación después de inyección IM. Todos los procedimientos de electroporación se realizaron usando el dispositivo Cellectra™ de corriente constante (VGX Immune Therapeutics Division de VGX Pharmaceuticals, The Woodlands, TX). Las condiciones de electroporación eran 0,5 Amps, 3 pulsos, 52 ms de longitud de pulso con 1 s entre pulsos. Este dispositivo controlado por programa informático se diseñó para medir la resistencia de tejido inmediatamente antes de la administración del plásmido y la generación de pulsos de onda cuadrada de corriente constante, eliminando el riesgo de administración fuera del tejido muscular y pérdida de plásmido potencial.
Recogida de sangre:
Se sangraron animales cada dos semanas durante la duración del estudio. Se recogieron 10 ml de sangre en tubos EDTA. Se aislaron CMSP por centrifugación Ficoll-hypaque convencional y, a continuación, se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con 2 mM/l de L-glutamina complementado con 10 % de suero fetal bovina inactivado por calor, 100 UI/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina, y 55 pM/l de p-mercaptoetanol) los GR se sometieron a lisado con tampón de lisis ACK (Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ).
Plásmidos y productos de plásmido:
Gag4Y contiene un casete de expresión que codifica una secuencia consenso de la proteína gag de los clados A, B, C y D del VIH con varias modificaciones incluyendo: la adición de una secuencia kozak, una secuencia líder de IgE sustituida, optimización de codón y ARN para la expresión en células mamíferas (SEQ ID NO:11 describe la secuencia consenso de Gag del VIH). El gen Gag4Y se subclonó dentro del vector de expresión, pVax, para estudio adicional. pEY-2E1-B contiene un casete de expresión que codifica una secuencia consenso de la envoltura del VIH clado B. (SEQ ID NO:3 describe la secuencia consenso de Env del VIH) WLV104M es un plásmido que codifica un gen IL-12 de rhesus. Los plásmidos se produjeron en Aldevron (Fargo, ND), y se reformularon en VGX Immune Therapeutics (The Woodlands, TX), en agua estéril para la inyección con peso molecular bajo 0,1 % de sal de poli-L-glutamato de sodio.
CFSE de CMSP crioconservadas
Se descongelaron rápidamente CMSP crioconservadas en un baño de agua a 37 °C y se lavaron con medios completos. Las células se incubaron durante la noche en una incubadora a 37 °C y los recuentos celulares se obtuvieron el siguiente día. Las células se precipitaron y resuspendieron en 1 ml de CFDA SE (Molecular Probes, Eugene, OR) en PBS (1:2.000 dilución). Las células se incubaron a 37 °C durante 10 min. Las células se lavaron con medios completos y se resuspendieron a una concentración de 1x106 células/100 ul y se colocaron en placas de fondo redondo de 96 pocillos con 100 ul de 2 gg/ml de p24 o gp120 del VIH-1 recombinante (ImmunoDiagnostics, Woburn, MA) más grupos de péptido. 5 gg/ml de concavalina A (positivo) y medios completos (negativo) se usaron como controles. Los cultivos se incubaron durante 5 días. Primero las células se tiñeron con tinte violeta Vivid, un marcador de célula viva/muerta, durante 15 min sobre hielo. Las células se lavaron una vez con PBS. A continuación, las células se tiñeron usando anti-CD3-PE humano (clon SP34-2) (BD Pharmingen) y anti-CD4-PerCP humano (clon L200), anti-CD8-APC humano (SK1) durante 1 hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 1 % de paraformaldehído. Los datos se recogieron usando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Se analizaron los datos de la citometría de flujo usando el programa informático FlowJo (Tree Star, Ashland, OR), selección por ventana de análisis (gating) sobre linfocitos CD3+. Se recogieron treinta a cincuenta mil linfocitos CD3+ por muestra.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA):
Se cubrieron noventa y seis placas durante la noche con 100 ng/pocillo de p24 o g120 del VIH-1 IIIB recombinante (ImmunoDiagnostics) para determinar las respuestas de gag y env del VIH respectivamente. Las placas cubiertas con 100 ng/pocillo de albúmina bovina de suero sirvieron como control negativo. Las placas se bloquearon con PBST con BSA al 3 % durante 1 hora a 37 °C. A continuación, las placas se incubaron con cuatro veces diluciones de suero en serie durante 1 hora a 37 °C. A continuación, se añadió anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-IgG de mono a una dilución 1:10.000 (MP Biomedicals, Aurora, OH) a las placas y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se usó tetrametilbenzidina (R&D systems, Minneapolis, MN) para desarrollar las placas y las reacciones se pararon con H2SO42N. A continuación, se midieron las densidades ópticas (DO).
Las titulaciones finales de IgG se definieron como la dilución de suero recíproca que dio como resultado valores de DO que eran mayores que dos veces el valor de DO promedio de los pocillos con BSA.
Ensayo de inmunomancha ligado a enzima (ELISpot)
Las respuestas específicas a antígeno se determinaron restando el número de manchas en los pocillos control negativo de los pocillos que contenían péptidos. Los resultados se muestran como el valor medio (manchas/millón de esplenocitos) obtenido por pocillos por triplicado.
1. Tinción de citoquina intracelular
Reactivos de anticuerpo
Los anticuerpos directamente conjugados se obtuvieron de lo siguiente: BD Biosciences (San José, CA): IL-2 (PE), CD3 (Pacific Blue), IFN-y (PE-Cy7), y TNF-a (Alexa Fluor 700), CD8 (APC) y CD4 (PerCP).
Estimulación celular y tinción
Se resuspendieron CMSP a 1x106 células/100 ul en RPMI completo y se colocaron en placas de 96 pocillos con péptidos estimulantes 100 ul de 1:200 diluciones. Se incluyó un control no estimulado y positivo (enterotoxina B de Staphylococcus, 1 pg/ml; Sigma-Aldrich) en cada ensayo. Las células se incubaron durante 5 horas a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron (PBS) y se tiñeron con anticuerpos de superficie. Las células se lavaron y se fijaron usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen, San Diego, CA) según las instrucciones. Después de la fijación, las células se lavaron dos veces en el tampón permanente y se tiñeron con anticuerpos frente a marcadores intracelulares. Después de la tinción, las células se lavaron, fijaron (PBS que contenía 1 % de paraformaldehído), y se almacenaron a 4 °C hasta análisis.
Citometría de flujo
Las células se analizaron sobre un citómetro de flujo LSR II modificado (BD Immunocytometry Systems, San José, CA). Se recogieron cincuenta mil eventos de CD3+ por muestra. El análisis de datos se realizó usando FlowJo versión 8.4.1 (TreeStar San Carlos, CA). La selección por ventana de análisis (gating) inicial usó una gráfica de área de dispersión frontal (FSC-A) frente a altura (FSC-H) para eliminar los dobletes. Los eventos se sometieron a una ventana de análisis (gate) de linfocito por una gráfica FSC-A frente a SSC. Después de esto, los eventos se sometieron a selección por ventana de análisis secuencialmente sobre los eventos de CD3+, CD8+, y CD4- frente a IFN-y para tener en cuenta la regulación a la baja. Después de la identificación de los linfocitos T CD8+, se realizó una ventana de análisis para cada respectiva función usando combinaciones que proporcionaron separación óptima. Después de que se crearan las ventanas de análisis para cada función, usamos la plataforma de ventana de análisis Booleano para crear la matriz completa de las posibles combinaciones, igualando a 8 patrones de respuesta cuando se ensayan 3 funciones. Los datos se publicaron después de la corrección de fondo. Los umbrales para las respuestas positivas eran de 10 eventos o 0,05 %.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron usando el programa informático Prism Graphpad, y se expresaron como medias±EEM. Resultados
Análisis ELISpot
La inducción de la respuesta inmune celular se evaluó después de cada inmunización por ELISpot de IFN-y . Después de una inmunización sencilla (Figura 1), el grupo que recibía ADN plásmido por inyección IM solo mostró respuestas celulares débiles (74±29 SFU/106 CMSP). La inmunización conjunta con plásmido de IL-12 de rhesus dio como resultado una respuesta mayor (136±51,4 SFU/106 CMSP). El grupo sometido a electroporación (EP) tenía una respuesta promedio que era seis veces mayor que el grupo IM (482±181 SFU/106 CMSP). La combinación de la inmunización conjunta de IL-2 con EP dobló más el número de células productoras de IFN-y (1.030±494 SFU/106 CMSP).
Después de dos inmunizaciones (Figura 1), Los grupos IM y IM+IL-12 tenían un incremento modesto en los recuentos de ELISpot (104±67,9 SFU/106 CMSP y 223±76,6 s Fu/106 CMSP, respectivamente). El grupo EP tenía respuestas que eran casi cuatro veces mayores (1.924±417 SFU/106 CMSP) que la inmunización previa y el grupo EP+IL-12 había de nuevo doblado el número de células productoras de IFN-y (2.819±872 SfU/106 CmSP) en comparación con el grupo de tratamiento EP solo.
Después de la tercera inmunización (Figura 1), el número de células específicas a antígeno en el grupo EP era más de un log mayor que el del grupo IM (5.300±3.781 y 370±110 SFU/106 CMSP, respectivamente). El grupo IM+IL-12 también tenía un incremento drástico en las respuestas celulares con recuentos de ELISpot que eran casi un log mayor que la inmunización previa (2.042±311 SFU/106 CMSP). Como con las otras dos inmunizaciones, el grupo EP+IL-12 era el más potente de todos los grupos de vacunación (7.228±2.227 SFU/106 CMSP).
Inducción de las respuestas de la envoltura de reacción cruzada
Una vacuna del VIH con éxito requerirá la inducción de una respuesta inmune de reacción cruzada a este respecto era interesante ver si EP+IL-12 podría mejorar la magnitud de la reactividad cruzada a genotecas peptídicas divergentes. Comparamos las respuestas de LCT de reacción cruzada inducida por el antígeno env usando una genoteca peptídica de un grupo consenso M. Se observó la reactividad cruzada en todos los grupos. Sin embargo, los resultados mostraron las mismas diferencias de magnitud observadas en el análisis ELISpot del subtipo B (Figura 2). Después de 3 inmunizaciones, el grupo IM tenía la respuesta más baja a los péptidos de la envoltura del grupo M (222±EEM SFU/106 CMSP). La adición de IL-12 dobló la respuesta (540±e Em SFU/106 CMSP). Se indujeron mayores respuestas de la envoltura del grupo M con EP (830±EEM SFU/106 CMSP), las cuales se aumentaron más con la inyección conjunta de IL-12 (1.238±EEM SFU/106 CMSP).
1. Respuestas de linfocito T memoria
Un asunto importante es ser capaz de mejorar la generación de las respuestas memoria con la plataforma de ADN. Realizamos el análisis ELISpot cinco meses después de la última vacunación de ADN (Figura 3). En los grupos IM, la adición del plásmido de IL-12 dio como resultado casi un incremento de 10 veces en las células memoria (751 ±11,1 y 78,6±16,9 SFU/106 CMSP). Está claro que IL-12 puede impactar positivamente en este fenotipo de linfocito T importante. El número de células productoras de IFNy específicas a antígeno era sustancial en el grupo EP también, sin embargo, el adyuvante IL-12+EP dio como resultado la respuesta memoria más fuerte (1.231±523,5 y 3.795±1.336 SFU/106 CMSP respectivamente), una respuesta que muestra que la tecnología combinada conduce a respuestas memoria de linfocito T muy fuertes.
Respuestas inmunes humorales a vacunas de ADN
La debilidad de la tecnología de vacuna de ADN IM reside en su incapacidad de inducir respuestas de anticuerpo claras en primates no humanos y en estudios clínicos humanos. Evaluamos la capacidad de cada grupo para inducir titulaciones de anticuerpo específico a tanto gag como env del VIH-1 a antígenos p24 y gp160 recombinantes en un formato ELISA. Para ambos antígenos, los grupos IM e IM+IL-12 no mostraron titulaciones de anticuerpo significativas (<1:50 titulación final). Los grupos sometidos a electroporación presentaron titulaciones de anticuerpo gag drásticamente mayores que eran capaces de unirse a p24 recombinante. Aunque tanto los grupos EP como los EP+IL-12 tenían titulaciones finales similares en la semana 12 (22.400 y 12.800 respectivamente), el grupo EP+IL-12 generó una respuesta de anticuerpo más eficaz. Esa respuesta apareció antes en el esquema de inmunización y surgió al máximo nivel lo más rápido. Las respuestas de anticuerpo env también reflejaron los resultados que observamos con el antígeno gag, aunque con titulaciones finales menores.
Proliferación de linfocito T CD4+ y CD8+
Habiendo observado las respuestas de ELISpot sustanciales, a continuación, examinamos los parámetros adicionales de la inmunidad celular. Examinamos la capacidad de los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos a gag de proliferar in vitro después de la estimulación peptídica entre los diferentes grupos de tratamiento de inmunización. Las muestras crioconservadas, recogidas dos semanas después de la inmunización final, se estimularon y analizaron por ensayo con CFSE. La respuesta de CD4+ promedio se incrementó igual a lo observado en el ensayo ELISpot. En comparación, la inducción de proliferación de CD8 era mucho más drástica en magnitud. Observamos que la proliferación de linfocito T CD8+ incrementada por IL-12 sobre IM solo y EP era básicamente mayor. El grupo EP+IL-12 tenía el mayor porcentaje de células CD8+ que eran capaces de proliferar después de la estimulación in vitro (2,51±EEM % y 4,88±EEM %, respectivamente). Se observaron bandas de proliferación de linfocito T CD8 obvias en el grupo de tratamiento EP+IL-12, demostrando el potencial proliferativo potente de esta inmunización combinada.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2 y fragmentos de la SEQ ID NO:2 que comprenden 600 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia de aminoácidos induce una respuesta inmune frente al VIH.
2. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.
3. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de la reivindicación 1.
4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1; fragmentos de la SEQ ID NO:1 que comprenden 1.890 o más nucleótidos de la SEQ Id NO:1; y secuencias que tienen al menos 90 % de similitud con la SEQ ID NO:1.
5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95 % de similitud con la SEQ ID NO:1; una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 98 % de similitud con la SEQ ID NO:1; y una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99 % de similitud con la SEQ ID NO:1.
6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.
7. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicha molécula es un plásmido.
8. Una vacuna recombinante que comprende una proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
9. Un patógeno atenuado vivo que comprende una proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
10. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
11. Un compuesto farmacéutico inyectable que comprende una proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
12. Una composición de la reivindicación 10 o la reivindicación 11 para su uso en un método de inducir una respuesta inmune en un individuo frente al VIH.
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