JP3701966B2 - 遺伝物質送達のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は個体の細胞内に遺伝物質を導入するための組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法は、免疫化および治療のための蛋白質を標的とする蛋白質をコードする遺伝物質を含む予防および/または治療薬の送達に使用することができる。
背景技術
正常な機能的遺伝子の生きている動物への直接的導入は、欠陥を持つ遺伝的情報を置き換える手段として研究されてきた。いくつかの研究において、ウイルス粒子または他の感染ベクターを使用することなく、生きている動物の細胞内へDNAが直接導入された。Nabel,E.G.et al.,(1990)Science 249:1285−1288、はマウスの動脈壁内へ直接的に運搬されたベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子のインビボでの部位特異的遺伝子発現を記載している。Wolfe,J.A.et al.,(1990)Science 247:1465−1468、はインビボでマウス筋肉内へ直接的に運搬された種々のレポーター遺伝子の発現を記載している。Acsadi G.,et al.,(1991)Nature 352:815−818、はDNA構築物の筋肉内注入後、マウスでのヒトジストロフィン遺伝子の発現を記載している。Wolfe,J.A.et al.,1991 BioTechniques 11(4):474−485(ここに引例として包含されている)はインビボでのげっ歯類筋肉内への直接遺伝子運搬を達成する条件を示している。Felgner,P.L.およびG.Rhodes,(1991)Nature 349:351−352、はレトロウイルスを用いることなく、精製された遺伝子の薬剤としてのインビボの直接送達を記載している。
代替の抗病原体ワクチン接種法として直接遺伝子運搬の使用が示唆されてきた。一回の注入による直接遺伝子運搬は、HIVに対する可能なワクチン接種法として示唆されている。HIV gp120をコードするプラスミドDNAの細胞内への導入により、HIV gp120に対する細胞性免疫応答が観察されていることが報告されている。1990年10月4日に公開されたPCT国際特許出願第PCT/US90/01515号は単一工程法で個体の細胞内に裸のポリヌクレオチドを直接注入することにより、病原体感染に対して個体を免疫する方法を開示している。リポフェクチン以外のトランスフェクション剤の使用は、開示された方法から特に除外されている。接種された細胞の刺激は開示されていないし、示唆されてもいない。ウイルス蛋白質gp120をコードするポリヌクレオチドの導入からなるHIVワクチンが開示されている。このワクチンの実施可能性は証明されていない。
Thomason,D.B.et al.,(1990)Cell Physiol.27:C578−581およびPCT特許出願第WO91/12329号はレトロウイルス介在遺伝子送達プロトコールの一部として、サテライト細胞増殖を誘導するための筋肉細胞へのブピバカインの投与を開示している。
発明の要約
本発明は個体の細胞内に遺伝物質を導入する方法に関する。本方法は、該個体の細胞と、好ましくは細胞によるDNAの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして所望のペプチドまたは蛋白質をコードするかまたは機能性核酸分子の鋳型として働くヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に投与することを含む。核酸分子はレトロウイルス粒子なしで投与される。所望の蛋白質とは個体中で機能するかまたは免疫応答の標的として働く蛋白質であろう。
本発明は病原体に対して個体を免疫する方法に関する。本方法は該個体の細胞と望ましくは細胞によるDNAの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして病原体抗原上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、かつ作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に投与することを含む。核酸分子は個体の細胞内で発現されることが可能である。
本発明はHIVに対してヒトを免疫する方法に関する。本方法は、HIV蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む少なくとも一つのペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子をヒトに投与する工程を含む。
本発明は、HIVに対して個体を免疫する方法に関する。本方法は、二つの異なる核酸分子を異なるヒトの細胞に投与する工程を含む。各々の核酸分子はHIV蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む少なくとも一つのペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む。異なる核酸分子の各々は、各々少なくとも1つの異なるペプチドをコードする異なるヌクレオチド配列を含み、ここで核酸はヒト細胞中で発現されることが可能である。
本発明は過増殖性疾患または自己免疫疾患に対して個体を免疫する方法に関する。本方法は、それぞれ過増殖性疾患関連蛋白質または自己免疫疾患関連蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を個体の細胞に投与する工程を含む;核酸分子は細胞中で発現されることが可能である。
本発明は疾患を持つ個体の処置法に関し、該個体の細胞と、好ましくは細胞によるDNAの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして欠陥のある遺伝子の代わりに機能するか、または個体中で治療的効果を生み出す分子をコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を個体の細胞に投与する工程を含む。核酸分子は細胞中で発現されることが可能である。
本発明は核酸分子およびポリヌクレオチド機能促進剤を含む医薬組成物に関する。本発明は核酸分子を含む容器およびポリヌクレオチド機能促進剤を含む容器を含む医薬キットに関する。
本発明は医薬として受容可能な担体または希釈剤、および作動可能なように制御配列に連結され、少なくとも一つのHIV蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードする核酸分子を含む、予防的および治療的HIVワクチンに関する。ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。
本発明は二つの接種物を含む予防的および治療的HIVワクチンに関する。第一の接種物は、医薬として受容可能な担体または希釈剤および第一の核酸分子を含む。第一の核酸分子は、各々が少なくとも一つのHIV蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含み、ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。第二の接種物は、医薬として受容可能な担体または希釈剤および第二の核酸分子を含む。第二の核酸分子は、少なくとも一つのHIV蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含み、ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。第一および第二の核酸分子は異なっており、異なるペプチドをコードする。
【図面の簡単な説明】
図1AはプラスミドpM160の作製を示しているダイアグラムである。このプラスミドは、HIV−HXB2糖蛋白質gp160をコードするPCR発生断片をプラスミドpMAMneoBlue(Clonetech)内へ挿入することにより製造された。
図1Bは、pM160プラスミドでトランスフェクトされた細胞(3G7細胞)とベクター単独でトランスフェクトされた細胞(TE671細胞)の全細胞溶解物のウエスタンブロットのオートラジオグラムの写真であり、3G7細胞においてgp120およびgp41が産生され、TE671細胞では産生されていないことを示している。
図2は125I−gp160と結合した血清抗体の免疫沈降を示しているオートラジオグラムの写真である。
図3A−3Eは、マイクロタイタープレート上に固定された種々の蛋白質への異なる血清の結合のELISAの結果を示しているグラフである。
図4Aおよび4Bは、連結的に希釈した抗血清と前もってインキュベートされた、TCID50HIV−1/IIIB細胞フリーウイルスを感染させたMT−2細胞の写真である。
図4Cは、対照血清(+=pMAMneoBlueベクター−免疫処置したマウス)および試験血清(○=pM160−免疫処置したマウス)を用いた結果からの中和値(Vn/Vo)対希釈係数を示しているグラフである。
図4D−4Gは、免疫したおよび対照動物からの血清を用いて融合細胞阻害を試験するために実験で使用されたH9/IIIB細胞の写真である。
図5は、HIVgp160−標識および非標識腫瘍細胞により試験された免疫処置および非免疫処置マウスの生存を示している表である。マウスは組換え体gp160蛋白質、ベクターDNAのみまたはgp160をコードするDNAを含むベクターで免疫処置された。SP2/0腫瘍細胞またはSP2/0−gp160(gp160をコードし、gp160を発現するDNAでトランスフェクトされたSP2/0細胞)腫瘍細胞がマウスに導入された。
図6はpGAGPOL.revのプラスミド地図である。
図7はpENVのプラスミド地図である。
図8は遺伝子構築物の製造に使用された四つのバックボーンA、B、CおよびDを示している。
図9は遺伝子構築物を製造するためにバックボーン内に挿入される四つの挿入物1、2、3および4を示している。
発明の詳細な説明
本発明は動物の細胞内へ核酸分子を導入する方法に関し、核酸分子の高いレベルの取り込みおよび機能性を提供する。本発明の方法は、個体の細胞に、炎症応答を促進しおよび/または組織における核酸分子の発現を促進させおよび/または細胞による核酸分子の取り込みを容易にする複合剤の投与と共に、ウイルス粒子、特にレトロウイルス粒子が含まれていない核酸分子を投与する工程を含む。本発明の好適な実施態様は、感染性の薬剤を使用せずに個体の細胞に核酸分子を送達する方法を提供する。
本発明に従って細胞へ送達される核酸分子は、1)予防的および/または治療的免疫処置剤として機能する蛋白質のための遺伝子鋳型;2)欠陥のある、失われたまたは機能しない遺伝子の置換コピー;3)治療的蛋白質のための遺伝子鋳型;4)アンチセンス分子のための遺伝子鋳型;または5)リボザイムのための遺伝子鋳型として働くであろう。蛋白質をコードする核酸分子の場合、核酸分子は好適には動物の細胞中での転写および翻訳に必要な制御配列を含む。核酸分子がアンチセンス分子およびリボザイムの鋳型として働く場合、そのような核酸分子は、好適にはそれらにより各々コードされているアンチセンスおよびリボザイム分子の十分なコピーの産生にために必要な制御要素に連結されている。核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、好適にはプラスミドの形のDNAとして提供される。
複合剤はここで”ポリヌクレオチド機能促進剤”または”PFE”とも称される。PFEは炎症応答を促進しおよび/または組織において核酸分子の発現を促進させおよび/または細胞による核酸分子の取り込みを促進し、および好適にはこれらの性質の2つ以上を持つ化合物または組成物である。細胞によるDNAおよびRNAの取り込みを容易にし、かつ細胞分裂および複製を刺激するポリヌクレオチド機能促進剤はまた細胞刺激剤とも称されている。本発明に従った好適な複合剤は安息香酸エステルおよびアニリドからなる群より選択される。好適な実施態様において、PFEはブピバカインである。
本発明のいくつかの態様に従うと、病原体または異常な疾患関連細胞に対して個体を予防的および/または治療的に免疫する組成物および方法が提供される。遺伝物質は、標的となる病原体または細胞に観察される免疫原性蛋白質と少なくとも一つのエピトープを共有するペプチドまたは蛋白質をコードする。遺伝物質は個体の細胞により発現されて免疫原性標的として働き、それに対して免疫応答が惹起される。得られる免疫応答は広範囲に基ずくものである:体液性免疫応答に加えて細胞性免疫応答の両方が惹起される。本発明の方法は予防的および治療的免疫を与えるのに有用である。従って、免疫処置法には病原体の攻撃または特定の細胞の存在または増殖から個体を保護する方法ならびに病原体感染、過増殖性疾患または自己免疫疾患を持つ個体を処置する両方の方法が含まれる。
本発明は標的蛋白質、すなわち病原体または個体自身の”異常な”細胞に特に関連する蛋白質に対する広い免疫応答を惹起するのに有用である。本発明は、病原体蛋白質に対する免疫応答が病原体に対する保護的免疫性を与えるように、病原体薬剤および微生物に対して個体を免疫するのに有用である。本発明は過増殖性細胞に特に関連する標的蛋白質に対する免疫応答を惹起することにより、癌のような過増殖性の病気および障害を処置するのに有用である。本発明は自己免疫状態に関与する細胞に特に関連する標的蛋白質に対する免疫応答を惹起することにより、自己免疫疾患の病気および障害を処置するのに有用である。
本発明のいくつかの態様は遺伝子治療に関するものである。すなわち、個体中の欠陥のある、失われた、非機能的なまたは部分的にしか機能しない個体の遺伝子に対応するか、または治療的蛋白質(すなわち、個体におけるその存在が個体の不全を除去する、および/またはその存在が個体に治療的効果を提供するであろう)をコードする個々の外因性の遺伝子のコピーを持つ核酸分子を細胞内へ導入するための組成物および方法に関し、それにより蛋白質投与と異なる手段により蛋白質を送達する手段が提供される。
ここで使用される術語”所望の蛋白質”とは、免疫応答の標的蛋白質として働くかまたは遺伝子治療計画における治療的または補償的蛋白質として働く本発明の遺伝子構築物によりコードされているペプチドおよび蛋白質を表している。
本発明に従うと、所望の蛋白質をコードするDNAまたはRNAが個体の細胞内へ導入され、そこで発現され、所望の蛋白質を産生する。所望の蛋白質をコードするDNAまたはRNAは、個体の細胞内での発現に必要な制御要素に連結されている。DNA発現のための制御要素にはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、コザック領域のような他の要素も遺伝子構築物中に含まれていてもよい。
ここで使用する術語”遺伝子構築物”とは、所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子を意味し、それはワクチン接種された個体の細胞内における直接的発現を可能にするプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に作動可能なように連結された開始および停止信号を含む。
ここで使用される術語”発現可能な形”とは、標的蛋白質をコードするコード配列に作動可能なように連結された必要な制御要素を含む遺伝子構築物を意味しており、そのため個体の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されるであろう。
ここで使用する術語”遺伝子ワクチン”とは。標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む医薬製剤を意味しており、治療的免疫応答を期待するのに有用な医薬製剤を含む。
ここで使用する術語”遺伝子治療”とは、治療的または補償的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む医薬製剤を意味している。
ここで使用する術語”標的蛋白質”とは、それに対して免疫応答が惹起される蛋白質を意味している。標的蛋白質は病原体または癌細胞もしくは自己免疫疾患に関与する細胞のような望ましくない細胞型からの蛋白質と少なくとも一つのエピトープを共有し、それに対する免疫化が必要とされる免疫原性蛋白質である。標的蛋白質に対して向けられる免疫応答は、標的蛋白質が関与する特定の感染または疾患に対して個体を保護し、かつ個体を治療するであろう。
ここで使用される術語”エピトープを共有する”とは、別の蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質を意味している。
ここで使用される術語”実質的に同じであるエピトープ”とは一つの蛋白質のエピトープとは同一ではないが、先の蛋白質と交差反応を起こす細胞性または体液性免疫応答を引き起こす構造を持つエピトープを意味している。
ここで使用される術語”治療的蛋白質”とはその存在が個体に治療的便宜を与えるような蛋白質を意味している。
ここで使用される術語”補償的蛋白質”とは、その存在が、不在の、欠損した、非機能的または部分的にしか機能しない内因性遺伝子のために完全に機能する蛋白質が内因的に産生されないことを補償する蛋白質を意味している。
遺伝子構築物は、所望の蛋白質をコードし、遺伝子発現に必要とされる制御要素に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。従って、生きている細胞内にDNAまたはRNA分子が取り込まれることにより、所望の蛋白質をコードするDNAまたはRNAが発現され、所望の蛋白質が生産される。
細胞により取り込まれた場合、制御要素に作動可能に連結された所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、機能的染色体外分子として細胞中に存在するかまたは、細胞の染色体DNA内へ組み込まれて残るであろう。DNAは細胞内に導入され、そこでプラスミドの形で別の遺伝物質として残るであろう。もしくは、染色体内へ組み込むことができる線状DNAが細胞内に導入されるであろう。DNAを細胞内に導入する場合、染色体内へのDNA組み込みを促進する試薬が加えられるであろう。組み込みを促進するのに有用なDNA配列をDNA分子内に含ませてもよい。もしくはRNAを細胞に投与してもよい。動原体、テロメアおよび複製起点を含む線状ミニクロモソームとして遺伝子構築物を提供することも企図される。
所望の蛋白質をコードする分子は、所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNAであろう。これらの分子はcDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはそれらのハイブリッドまたはmRNAのようなRNA分子であろう。従って、ここで使用される場合、術語”DNA構築物”、”遺伝子構築物”およびヌクレオチド配列”はDNAおよびRNA分子の両方を指すことを意味している。
DNA分子の遺伝子発現に必要な制御要素には、プロモーター、開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、エンハンサーがしばしば遺伝子発現に必要とされる。所望の蛋白質をコードする配列にこれらの要素が作動可能なように連結されていること、および制御要素はそれらが投与される個体中で作動可能であることが必要である。
開始コドンおよび停止コドンは一般的に所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられている。しかしながら、これらの要素は遺伝子構築物が投与される個体中で機能的であることが必要である。開始および停止コドンはコード配列の読み枠内に存在しなければならない。
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能的でなければならない。
本発明の実施、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例には、サルウイルス40(SV40)からのプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVロングターミナルリピート(LTR)のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、モロニーウイルス、ALV、CMV前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン−バールウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインからのプロモーターが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
本発明の実施、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルが含まれるが、それらに制限されるわけではない。特に、SV40ポリアデニル化シグナルと称される、pCEP4プラスミド(Invitrogen,San Diego CA)中のSV40ポリアデニル化シグナルが使用される。
DNA発現に必要とされる制御要素に加え、他の要素がDNA分子に含まれていてもよい。そのような付加的な要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびCMV、RSVおよびEBVからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサーから選択されるが、それらに制限されるわけではない。
遺伝子構築物は、細胞中で本構築物を染色体外に保ちかつ本構築物の多数のコピーを産生させるため哺乳類の複製開始点を含んでいてもよい。Invitrogen(San Diego CA)からのプラスミドpCBP4およびpREP4はエプスタイン−バールウイルス複製開始点および核抗原EBNA−1コード領域を含み、組込まれることなく高いコピーのエピソーム複製を行う。
いくつかの好適な実施態様において、使用されるベクターは実施例46に記載されるベクターから選択される。遺伝子治療に関連する本発明の態様においては、活性化のために必要な抗原を含む複製開始点を持つ構築物が望ましい。
免疫化応用に関するいくつかの好適な実施態様においては、遺伝子構築物は標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、さらにそのような標的蛋白質に対する免疫応答を促進する蛋白質のための遺伝子を含む。そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子(PDGF)、GC−SF、GM−CSF、TNF、上皮増殖因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10およびIL−12のようなサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。
何らかの理由により遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望まれる場合には、細胞破壊のための標的として働く追加の要素を加えてもよい。発現可能な形のヘルペスチミジンキナーゼ(tK)遺伝子を遺伝子構築物に含ませることができる。薬剤ガンシクロビルが個体に投与でき、この薬剤はtKを産生している細胞を選択的に殺すので、遺伝子構築物を持つ細胞を選択的に破壊する手段を提供することができる。
蛋白質産生を最大にするために、構築物が投与される細胞中における遺伝子発現に良く適した制御配列が選択されるであろう。さらに、細胞中でもっとも効率的に転写されるコドンが選択されるであろう。当業者は細胞中で機能的であるDNA構築物を製造することができる。
発現を試験するために、投与される細胞と同じ型の細胞の組織培養を用いて、インビトロで遺伝子構築物の発現レベルが試験できるであろう。例えば、遺伝子ワクチンがヒト筋肉細胞内へ投与されるべきものである場合、発現レベルを測定するためのインビトロモデルとして、横紋筋肉腫の充実性筋肉腫瘍細胞のような培養系で増殖する筋肉細胞を使用することができる。
本発明で使用される遺伝子構築物はレトロウイルス粒子中に取り込まれてはいない。本遺伝子構築物は、レトロウイルス粒子に取り込まれているレトロウイルスRNAを持つレトロウイルス粒子が細胞に感染する場合に起こるようなレトロウイルス粒子媒介挿入が生じることなく細胞により取り込まれる。ここで使用される術語”レトロウイルス粒子を含まない”とはレトロウイルス粒子内に取り込まれていない遺伝子構築物を示していることを意味している。ここで使用される術語”感染性仲介物から解離している”とは細胞に感染しうるウイルス、細菌または真核生物ベクター(活性でも、不活性でも、生きていてもまたは死んでいても)の一部ではない遺伝子構築物を示すことを意味している。
いくつかの実施態様において、細胞内に導入された場合に、遺伝子構築物が感染性ウイルス粒子の直接産生に不完全な遺伝的情報しか持たないように、遺伝子構築物は完全な複製可能なウイルスゲノムより少ないものから構成されている。ここで使用される術語”不完全なウイルスゲノム”とは、細胞内への遺伝子構築物の取り込みが感染性ウイルスの産生に十分な遺伝的情報の導入を与えないように完全なゲノムより少ないものを含む遺伝子構築物を示していることを意味している。
いくつかの実施態様において、弱くしたウイルスワクチンがウイルス粒子の産生を可能にする十分な遺伝子物質を含む遺伝子構築物として送達されるであろう。弱くしたワクチンを遺伝子構築物として送達することは、安全かつ純粋な活性免疫化生成物を多量に産生するためのより容易な方法である。
遺伝子構築物はマイクロプロジェクティルを使用して、または使用しないで投与することができる。本発明の遺伝子構築物は、固形粒子なしで個体の細胞へ送達されるのが望ましい。ここで使用する句”固形粒子なし”とは、細胞内への遺伝子構築物の進入の入り口を作り出すために細胞の細胞膜に穴をあけ、パンクさせまたは刺し通す手段として使用される固形マイクロプロジェクティルを含まない液体を示していることを意味している。
本発明はウイルス、原核生物および単細胞病原性微生物および多細胞寄生虫のような病原性真核微生物のすべての病原体に対して個体を免疫化するために使用することができる。本発明は、ウイルスおよびゴノロエア、リステリアおよび赤痢菌等の原核生物のような、細胞に感染しかつカプセル化されない病原体に対して個体を免疫するのに特に有用である。さらに、本発明はまた、細胞内病原体となる生活環の一つの段階を含む原生動物病原体に対して個体を免疫するのにも有用である。ここで使用される場合、術語”細胞内病原体”とは、その複製または生活環の少なくとも一部において宿主細胞内に存在し、その中で病原性蛋白質を産生または産生する原因となるウイルスまたは病原性微生物を示すことを意味している。表1は本発明に従ってそれに対するワクチンを作成しうるいくつかのウイルス群および属をリストしたものである。表にリストされた抗原のような病原性抗原上で示されるエピトープと同一のまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするDNA配列を含むDNA構築物は、ワクチンにおいて有用である。さらに、本発明はまた原核および真核原生動物病原体ならびに表2に掲げたような多核性寄生虫を含む他の病原体に対して個体を免疫するのにも有用である。
病原体感染を防御するための遺伝子ワクチンを生産するためには、防御的免疫応答を与える免疫発生蛋白質をコードする遺伝子材料が遺伝子構築物に含まれていなければならない。病原体が細胞内で(これに対し本発明は特に有用である)または細胞外から感染するにしても、すべての病原体抗原が防御応答を惹起することはありそうもない。DNAおよびRNAは両方とも比較的小さく、比較的容易に製造できるので、本発明は多数の病原体抗原のワクチン化を可能にするさらなる利点を提供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝子材料を含むことができる。例えば、単一の構築物にいくつかのウイルス遺伝子を含ませることにより多くの標的が提供される。さらに、個体において異なる細胞に送達できる多数の接種物が調製でき、いくつかの場合において、ワクチンに完全なまたは、より望ましくは完全に近い不完全な遺伝子の組が集合的に含まれている。例えば、ウイルス遺伝子の完全な組は、各々異なる部位に投与されるゲノムの異なる半分を含む二つの構築物を用いて投与することができる。従って、感染性ウイルスが組み立てられる危険性を伴うことなく各々の抗原に対する免疫応答が引き起こされるであろう。このことは2つ以上の抗原標識の導入を可能にし、防御抗原が同定される必要性をなくすことができる。
さらに、DNAおよびRNAの扱い易さおよび高価でないことにより、防御抗原のスクリーニングのより効果的な手段が可能になる。遺伝子は選別でき、蛋白質よりもっと容易に系統的に試験できる。防御のためのワクチンが生産される病原性物質および微生物が選択され、免疫原性蛋白質が同定される。表1および2は、その感染から個体を防御するために遺伝子ワクチンを調製しうるいくつかの病原性物質および微生物のリストである。いくつかの好適な実施態様において、病原体に対して個体を免疫する方法は、HIV、HTLVまたはHBVに対するものである。
本発明の別の態様は、過増殖性疾患に特徴的な過増殖性細胞に対する広範囲の防御的免疫応答を与える方法、および過増殖性疾患を持つ個体の処置方法を提供する。ここで使用される術語”過増殖性疾患”とは細胞の過増殖性により特徴付けられる疾患および障害を指すことを意味している。過増殖性疾患の例としてはすべての形の癌および乾癬が挙げられる。
免疫原性”過増殖性細胞”関連蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体の細胞内に導入することにより、個体のワクチン接種された細胞内でこれらの蛋白質が産生されることが発見されている。ここで使用される術語”過増殖性関連蛋白質”とは過増殖性疾患に関連する蛋白質を指すことを意味している。過増殖性疾患に対して免疫するため、過増殖性疾患に関連する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が個体に投与される。
過増殖性関連蛋白質が有効な免疫原性標的であるためには、正常細胞と比較して過増殖性細胞中で独占的にまたはより高い水準で産生される蛋白質でなければならない。標的抗原は、そのような蛋白質に見いだされる少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質、その断片およびペプチドを含む。ある場合には、過増殖性関連蛋白質は蛋白質をコードする遺伝子の突然変異の生成物である。変異遺伝子は正常蛋白質とほとんど同一の蛋白質をコードするが、ただし、わずかに異なるアミノ酸配列を持っており、その結果正常蛋白質には観察されない異なるエピトープを生じる。そのような標的蛋白質には、myb、myc、fynのような癌遺伝子およびトランスロケーション遺伝子bcr/abl、ras、src、p53、neu、trkおよびEGRFによりコードされる蛋白質が含まれる。標的抗原としての癌遺伝子生成物に加えて、抗癌治療および防護的計画のための標的蛋白質には、B細胞リンパ腫により作られる抗体の変異領域およびT細胞リンパ腫のT細胞受容体の変異領域が含まれ、それらはいくつかの実施態様において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用される。モノクローナル抗体17−1Aおよび葉酸結合蛋白質により認識される蛋白質を含む腫瘍細胞において高いレベルで見いだされる蛋白質のような他の腫瘍関連蛋白質を標的蛋白質として使用することができる。
本発明は、一つまたはそれ以上のいくつかの形の癌に対して個体を免疫するのに使用することができるが、一方、本発明は、特定の癌が発生し易い、または過去に癌を持っており、従って再発し易い個体の予防的免疫接種に特に有用である。遺伝学および技術ならびに疫学の発達は、個体における癌発生の確率の決定および危険度評価を可能にする。遺伝子スクリーニングおよび/または家族病歴を用いて、特定の個体がいくつかの型の一つの癌を発生する可能性を予言することができる。
同様に、すでに癌の発生がある、および癌をすでに除去する処置を受けた、または緩解期のヒトは、特に癌が再発および再出現しやすい。処置計画の一部として、再発と戦うために、そのような個体を、その個体が有していたと診断された癌に対して免疫することができる。従って個体が癌の一つの型を有していたことおよびその再発の危険性があることがわかったら、将来の癌の出現と戦うその免疫系を準備するためにその個体を免疫することができる。
本発明は過増殖性疾患を持つ個体の処置法を提供する。そのような方法においては、遺伝子構築物の導入が免疫治療剤として働き、標的蛋白質を産生する過増殖性細胞と戦うために個体の免疫系を指示および促進させる。
本発明は、細胞受容体および”自己”指示抗体を産生する細胞を含む自己免疫性に関連する標的に対する広範囲な防御的免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害を持つ個体を処置する方法を提供する。
T細胞介在自己免疫疾患には、慢性間接リュウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊髄炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェグナー肉芽肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、外因性抗原に結合し自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始するT細胞受容体により特徴付けられる。T細胞の変異領域に対するワクチン接種は、CTLを含む免疫応答を惹起し、これらのT細胞を除去するであろう。
RAにおいて、この疾患に関与するT細胞受容体(TCR)のいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのTCRにはVβ−3、Vβ−14、Vβ−17およびVα−17が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするDNA構築物によるワクチン接種は、RAに関与するT細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Hewell,M.D.,et al.,1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10921−10925;Paliard,X.,et al.,1991 Science 253:325−333;Williams,W.V.,et. al.,1992 J.Clin.Invest. 90:326−333を参照、これらの各々はここに引例として包含されている。
MSにおいては、この疾患に関与するTCRのいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのTCRにはVβ−7およびVα−10が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするDNA構築物によるワクチン接種は、MSに関与するT細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Wucherpfennig,K.W.,et al.,1990 Science 248:1016−1019;Oksenberg,J.R.,1990 Nature 345:344−346;参照、これらの各々はここに引例として包含されている。
強皮症においては、この疾患に関与するTCRのいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのTCRにはVβ−6、Vβ−8、Vβ−14およびVα−16、Vα−3C、Vα−7、Vα−14、Vα−15、Vα−16、Vα−28およびVα−12が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするDNA構築物によるワクチン接種は、強皮症に関与するT細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。
T細胞介在自己免疫疾患の患者を処置するためには、特にTCRの変異領域がまだ特徴付けられていない場合には、滑液生検を実施することができる。存在するT細胞の試料を採り、これらのTCRの変異領域を常法により同定することができる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
B細胞介在自己免疫疾患には、狼そう(SLE)、グレーブル病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発生胆汁性硬化症および悪性貧血が含まれる。これらの疾患の各々は、外因性抗原に結合し自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始する抗体により特徴付けられる。抗体の変異領域に対するワクチン接種は、CTLを含む免疫応答を惹起し、抗体を産生するB細胞を除去するであろう。
B細胞介在自己免疫疾患の患者を処置するためには、自己免疫活性に関与する抗体の変異領域を同定しなければならない。滑液生検が実施でき、炎症部位に存在する抗体の試料が採取できる。これらの抗体の変異領域を常法により同定することができる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
SLCの場合、一つの抗原はDNAであると信じられている。従って、SLCに対して免疫されるべき患者においては、その血清が抗−DNA抗体についてスクリーニングされ、血清中に観察されたそのような抗−DNA抗体の変異領域をコードするDNA構築物を含むワクチンが調製できる。
TCRおよび抗体両方の変異領域間の共通の構造的特徴はよく知られている。Kabat,et al.,1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S.Department of Health and Human Services,Bethesda MD(ここに引例として包含されている)に記載されているようなよく知られた方法に従って、特定のTCRまたは抗体をコードするDNA配列が一般的に発見できる。さらに、抗体からの機能的変異領域クローニングの一般的方法は、Chaudhary,V.K.et al.,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066(ここに引例として包含されている)を参照できる。
遺伝子治療に関する本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物は補償遺伝子または治療的蛋白質をコードする遺伝子を含む。補償遺伝子の例としては、ジストロフィンまたは機能的断片をコードする遺伝子、嚢胞性繊維症の患者の欠陥のある遺伝子を補償するための遺伝子、インスリン、ADAの患者の欠陥のある遺伝子を補償するための遺伝子およびファクターVIIIをコードする遺伝子が挙げられる。治療的蛋白質をコードする遺伝子の例としては、エリスロポエチン、インターフェロン、LDL受容体、GM−CSF、IL−2、IL−4およびTNFをコードする遺伝子が挙げられる。さらに、毒性物質に特異的に結合する一本鎖抗体成分をコードする遺伝子構築物が投与できる。
いくつかの好適な実施態様において、ジストロフィン遺伝子はミニ−遺伝子の一部として提供され、筋ジストロフィーの患者の処置に使用される。いくつかの好適な実施態様において、一部のジストロフィン蛋白質のコード配列を含むミニ−遺伝子が提供される。ジストロフィン異常は、軽ベッカー筋ジストロフィー(BMD)および重度デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の両方の原因である。BMDにおいては、ジストロフィンは作られるがサイズおよび/または量が異常である。患者は軽度から中程度に虚弱である。DMDにおいては、この蛋白質が作られず、13歳で車椅子を必要とし、通常20歳で死亡する。何人かの患者、特にBMDの患者では、本発明に従って送達されるミニ−遺伝子の発現により産生されるジストロフィン蛋白質の一部により筋機能が改良できる。
いくつかの好適な実施態様において、存在しているかまたは除去された後個体へ再導入された腫瘍細胞に、IL−2、IL−4、インターフェロンまたはTNFをコードする遺伝子が送達される。いくつかの実施態様においては、ガンマインターフェロンが多発性硬化症の患者に投与される。
アンチセンス分子およびリボザイムもまた、そのような活性物質のコピーのための鋳型として働く遺伝物質を導入することにより個体の細胞へ送達されるであろう。これらの物質は、その存在が望ましくない蛋白質をコードする遺伝子の発現を不活性化または妨害する。アンチセンス分子をコードする配列を含む構築物は、細胞内での蛋白質の産生を阻害または防止するために使用できる。従って、癌遺伝子生成物のような蛋白質の産生を排除または減少させることができる。同様に、リボザイムは蛋白質に翻訳される前にメッセンジャーRNAを選択的に破壊することにより遺伝子発現を破壊することができる。いくつかの実施態様においては、他の治療薬の投与および方法を含む治療計画の一部としてアンチセンス分子およびリボザイムをコードする構築物を用い、本発明に従って細胞が処理される。アンチセンス分子およびリボザイムをコードする遺伝子構築物は蛋白質産生が望まれる場合に使用されるベクターと同様のベクターを使用するが、ただしコード配列は蛋白質へのRNAの翻訳を始めるための開始コドンを含まない。いくつかの実施態様において、実施例46に記載されているベクター、特に複製起点および発現可能な形の適当な核抗原を含むものが好適である。
リボザイムは触媒性RNAであり、自己切断または他のRNA分子の切断ができる。ハンマーヘッド、ヘアピン、テトラヒメナグループIイントロン、アックスヘッドおよびRNアーゼPのようなリボザイムのいくつかの異なる型が本分野で知られている。(S.Edgington,Biotechnology 1992 10,256−262。)ハンマーヘッドリボザイムは、40未満のヌクレオチドのコアにマッピングされている触媒部位を有する。植物ウイロイドおよびサテライトRNAのリボザイムのいくつかは、共通の二次構造およびある種の保存ヌクレオチドを共有している。これらのリボザイムは、天然にはそれら自身の基質として役だっているが、酵素ドメインは、保存された切断部位に隣接する配列との塩基対形成を通して別のRNA基質を標的とすることができる。注文設計リボザイムに対するこの能力は、それらを配列特異的RNA切断に使用することを可能にしている(G.Paolella et al.,EMBO 1992,1913−1919)。したがって、ハンマーヘッド触媒配列のようなリボザイムの種々の型の異なる触媒配列の使用およびそれらをここに開示した方法で設計することは当業者には容易であろう。リボザイムは病原体ヌクレオチドおよび癌遺伝子配列を含む種々の標的に対して設計できる。本発明のある種の好適な実施態様では切断反応を残しながらabl−bcr融合転写体を特異的に標的とするのに十分な相補性を含む。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、細胞による遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物で細胞が処理される。本発明のいくつかの実施態様に従うと、細胞分裂を誘発し、遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物で細胞が処理される。細胞刺激化合物等の、細胞による遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物の投与により、遺伝子構築物によりコードされる標的蛋白質に対するより有効な免疫応答が得られる。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、遺伝子構築物は個体に無針注入装置を用いて投与される。本発明のいくつかの実施態様に従うと、遺伝子構築物は個体に無針注入装置を用いて皮内、皮下および筋肉内に同時に投与される。無針注入の装置はよく知られており、広く応用されている。本分野で通常の技術を持つものは本発明の教示に従って、個体の細胞への遺伝物質の送達に無針注入装置を用いる。無針注入装置はすべての組織への遺伝物質の送達に非常に適している。それらは皮膚および筋肉細胞へ遺伝物質を送達するのに特に有用である。いくつかの実施態様において、DNA分子を含む液体を個体の皮膚の表面へ発射させるために針なしの注入装置が使用されるであろう。皮膚に対する衝撃により液体が皮膚を透過するのに十分な速度で液体が発射され、液体はその下の皮膚および筋肉組織に浸透する。従って、遺伝子構築物は皮内、皮下および筋肉内に同時に投与される。いくつかの実施態様において、核酸分子を他の器官の細胞に導入するため、その器官の組織への遺伝物質の送達に無針注入装置が使用されるであろう。
本発明に従うと、遺伝子ワクチンは免疫されるべき個体内へ直接投与されるか、または個体から取り出された細胞内へ生体外で投与された後再移植されるであろう。どちらの経路にしても、遺伝物質は個体の体内に存在する細胞内へ導入される。投与方法には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、点眼および経口、ならびに経皮、吸入または座剤が含まれるが、それらに制限されるわけではない。投与の好適な経路には、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注入が挙げられる。標的蛋白質をコードする遺伝子構築物の送達は、投与の様式により免疫された個体に粘膜免疫を与えることができ、遺伝物質は粘膜を伴う組織内に存在する。従って、いくつかの実施例においては、遺伝子構築物は個体の口内の口腔に投与することにより送達される。
遺伝子構築物は、伝統的シリンジ、無針注入装置または”マイクロプロジェクティルボンバードメント遺伝子銃”を含む手段により投与されるであろうが、それらに制限されるわけではない。もしくは、遺伝子ワクチンは個体から取り出された細胞内へ種々の方法で導入されるであろう。そのような方法には例えば、生体外トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびマイクロプロジェクティルボンバードメントが含まれる。遺伝子構築物が細胞により取り込まれた後、それらは個体内へ再移植される。たとえワクチン接種された細胞が本来は別の個体から取り出されていても、遺伝子構築物が取り込まれた非免疫原細胞を移植できるように企図されている。
本発明に従う遺伝子ワクチンは、約1ナノグラムから約1000マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約10ナノグラムから約800マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約0.1から約500マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約1から約350マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約25から約250マイクログラムのDNAを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約100マイクログラムのDNAを含む。
本発明に従う遺伝子ワクチンは、使用される投与様式に従って処方される。本分野で普通の技術を持つものは、遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンを容易に処方することができる。投与様式として筋肉内注入が選ばれた場合、等張処方を使用することが望まれる。一般的に、等張性のための添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが含まれる。いくつかの場合にはリン酸緩衝化塩溶液のような等張溶液が好適である。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様においては処方に血管収縮剤が添加される。本発明に従う医薬製剤は無菌で発熱物質を含まない製剤として提供される。
本発明の遺伝子構築物は、ポリヌクレオチド機能促進剤と共に処方または投与される。本発明に従った好適な複合剤は、局所麻酔薬の一群等の、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタンおよびそれらの塩酸塩からなる群より選択される。
PFEは以下の式の一つを持つ化合物であろう:
Ar−R1−O−R2−R3
または
Ar−N−R1−R2−R3
または
R4−N−R5−R6
または
R4−O−R1−N−R7
式中:
Arはベンゼン、p−アミノベンゼン、m−アミノベンゼン、o−アミノベンゼン、置換ベンゼン、置換p−アミノベンゼン、置換m−アミノベンゼン、置換o−アミノベンゼン(ここでアミノベンゼン化合物中のアミノ基はアミノ、C1−C5アルキルアミン、C1−C5、C1−C5ジアルキルアミンであり、置換化合物中の置換基はハロゲン、C1−C5アルキルおよびC1−C5アルコキシである)であり;
R1はC=Oであり;
R2はC1−C10分岐アルキルを含むアルキルであり;
R3は水素、アミン、C1−C5アルキルアミン、C1−C5、C1−C5ジアルキルアミンであり;
R2+R3は環状アルキル、C1−C10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1−C10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、C1−C10アルキル置換複素環式(C1−C10アルキルN−置換複素環式を含む)を形成でき;
R4はAr、R2またはC1−C5アルコキシ、環状アルキル、C1−C10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1−C10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、C1−C10アルキル置換複素環式およびC1−C10アルコキシ置換複素環式(C1−C10アルキルN−置換複素環式を含む)であり;
R5はC=NHであり、
R6はAr、R2またはC1−C5アルコキシ、環状アルキル、C1−C10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1−C10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、C1−C10アルキル置換複素環式およびC1−C10アルコキシ置換複素環式(C1−C10アルキルN−置換複素環式を含む)であり;および
R7はAr、R2またはC1−C5アルコキシ、環状アルキル、C1−C10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1−C10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、C1−C10アルキル置換複素環式およびC1−C10アルコキシ置換複素環式(C1−C10アルキルN−置換複素環式を含む)である。
エステルの例としては:ピペロカイン、メプリルカインおよびイソブカインのような安息香酸エステル;プロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカインおよびクロロプロカインのようなp−アミノ安息香酸エステル;メタブタミンおよびプリマカインを含むメタ−アミノ安息香酸エステル;およびパレトキシカインのようなパラ−エトキシ安息香酸エステルが含まれる。アニリドの例にはリドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカインおよびプリロカインが含まれる。そのような化合物のその他の例にはジブカイン、ベンゾカイン、ジクロナイン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチルブピバカイン、ブタシンピクレート、フェナカイン、ジオタン、ルクカイン、イントラカイン、ヌペルカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミンおよびコカイン、シンナモイルコカイン、トルキシルリンおよびコカエチレンのような植物ー由来二環式化合物および塩酸と複合体を作ったすべてのこのような化合物が含まれる。
好適な実施態様において、PFEはブピバカインである。ブピバカインとメピバカインとの相違は、メピバカインのN−メチル基の代わりにブピバカインはN−ブチル基を持っていることである。化合物はそのNにC1−C10を持っていてもよい。化合物はプロカインおよびクロロプロカインのようにハロゲンで置換されていてもよい。アニリドは好適である。
ブピバカインは遺伝子構築物に先だって、同時にまたは後で投与される。ブピバカインおよび遺伝子構築物は同一の組成物に処方されてもよい。組織に投与された場合のその多くの特質および活性の点において、ブピバカインは細胞刺激剤として特に有用である。ブピバカインは細胞による遺伝物質の取り込みを促進しかつ容易にする。それ自体トランスフェクション剤である。ブピバカインとともに遺伝子構築物を投与すると、細胞内への遺伝子構築物の導入が容易となる。ブピバカインは細胞膜を破壊、またはさもなくばより透過し易くすると信じられている。細胞分裂および複製がブピバカインにより誘発される。従って、ブピバカインは複製試薬として作用する。ブピバカインの投与はまた組織を刺激し損傷を与える。それ自体炎症剤として作用し、投与部位への免疫細胞の移動および走化性を惹起する。投与部位に通常存在する細胞に加えて、炎症剤に応答してその部位に移動する免疫系の細胞が、投与された遺伝子構築物およびブピバカインと接触できる。トランスフェクション剤として作用するブピバカインは、免疫系のそのような細胞による遺伝物質の取り込みの促進にも利用可能である。
ブピバカインは化学的におよび薬学的にアミノアシル局所麻酔薬に関係している。それはメピバカインの同族体であり、リドカインに関係している。ブピバカインは筋肉組織をナトリウム流入に対して電位感受性となし、細胞内のイオン濃度を達成させる。ブピバカインの薬学的活性の完全な記述はRitchie,J.M.およびN.M.Greene,The Pharmacological Basis of Therapeutics、Gilman,A.G.et al.編、第8版、15章:3111(ここに引例として含まれている)にみることができる。ブピバカインおよびブピバカインと同様な機能を示す化合物が本発明の方法において望ましい。
ブピバカイン−HClは化学的には2−ピペリジンカルボキサミド、1−ブチル−N−(2,6−ジメチルフェニル)一塩酸塩、一水和物と称され、Astra Pharmaceutical Products Inc.(Westboro,MA)、Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York,NY)およびEastman Kodak(Rochester,NY)を含む多くの発売元から医薬用として広く市販品として入手可能である。ブピバカインはメチルパラベンを含んだおよび含まない形で、およびエピネフリンを含んだおよび含まない形で商業的に処方されている。そのような処方は何れを使用してもかまわない。0.25%、0.5%および0.75%の濃度で医薬として使用するためのものが商業的に入手可能であり、本発明に使用されるであろう。別の濃度、特に望ましい効果を惹起する0.05%−1.0%の間の濃度が必要に応じ調製されるであろう。本発明に従うと、約250μgから約10mgのブピバカインが投与される。いくつかの実施例では、約250μgから約7.5mgが投与される。いくつかの実施例では、約0.05mgから約5.0mgが投与される。いくつかの実施例では、約0.5mgから約3.0mgが投与される。いくつかの実施例では、約5から約50μgが投与される。例えば、いくつかの実施例では0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%メチルパラベンを含む等張医薬担体の約50μlから約2ml、好適には50μlから約1500μl、およびより好適には約1mlがワクチンが投与される前、同時にまたは後で同じ部位に投与される。同様に、いくつかの実施例では0.5%ブピバカイン−HClを含む等張医薬担体の約50μlから約2ml、好適には50μlから約1500μl、およびより好適には約1mlがワクチンが投与される前、同時にまたは後で同じ部位に投与される。ブピバカインおよびその他の同様に作用する化合物(特に、局所麻酔薬の一群に関連するもの)は細胞による遺伝子構築物取り込みの望まれる促進を提供する濃度で投与されるであろう。
本発明のいくつかの実施態様において、個体に遺伝子ワクチン接種に先だって最初にブピバカイン注射が行われる。例えば、ワクチン接種に先立つ約1週間から10日までに、個体にブピバカインが最初に注射される。いくつかの実施態様では、(ワクチン接種に先立ち)遺伝子構築物投与約1から5日前にブピバカインが個体に注射される。いくつかの実施態様では、(ワクチン接種に先立ち)遺伝子構築物投与約24時間前にブピバカインが個体に注射される。もしくは、ブピバカインはワクチン接種と同時に、数分前または数分後に注射できる。従って、ブピバカインおよび遺伝子構築物は混合物として混合され同時に注入されるであろう。いくつかの実施態様では、ブピバカインは遺伝子構築物の投与後に投与される。例えば、遺伝子構築物投与後約1週間から10日後までに、個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約24時間後に個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約1から5日後に個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約1週間から10日後に個体へブピバカインが投与される。
トランスフェクト剤、および/または複製剤および/または炎症剤として機能し、ブピバカインおよび同様に作用する化合物と同時に投与されるであろうその他の薬剤にはα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子(PDGF)、GC−SF、GM−CSF、TNF、上皮増殖因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10およびIL−12のようなレクチン、増殖因子、サイトカイン類およびリンホカイン類ならびにコラゲナーゼ、繊維芽細胞増殖因子、エストロジェン、デキサメタゾン、サポニン、免疫誘発複合体(ISCOMS)のような表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドA(MPL)を含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンのようなベシクルが含まれ、スクアレン、ヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼもまた遺伝子構築物と合わせて投与に使用されるであろう。いくつかの実施態様において、これらの薬剤の組み合わせがブピバカインおよび遺伝子構築物と合わせて投与される。例えば、ブピバカインおよびヒアルロン酸かまたはヒアルロニダーゼが遺伝子構築物と同時に投与される。
遺伝子構築物はコラーゲンと組み合わせて乳化剤として非経口で送達されてもよい。コラーゲン乳化剤はDNAの徐放性放出のための手段を提供する。50μlから2mlのコラーゲンが使用される。この処方を用いる好適な実施態様においては約100μgのDNAが1mlのコラーゲンと混ぜられる。他の徐放性放出処方が、Reminngton’s Pharmaceutical Sciences,A.Osol,(本分野で標準的な参考テキストであり、それはここに引例として包含されている)に記載されている。そのような処方には、水懸濁液、油溶液および懸濁液、乳化剤および移植、ならびに貯蔵器および経皮装置が含まれている。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物のための時間放出処方が好適である。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物は6−144時間、好適には12−96時間、より好適には18−73時間の間に時間放出される。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物は無針注入装置で注入される。無針注入装置は筋肉内、皮内および皮下に物質を同時投与するために特に有用である。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物はSanford et al.により1990年7月31日に公開された米国特許第4,945,050号(ここに引例として包含されている)により教えられているようなマイクロプロジェクティル パーティクル ボンバードメント法の手段によりPFEとともに投与される。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物はポリヌクレオチド機能促進剤とのリポソーム複合体の一部として投与される。
本発明のいくつかの実施態様においては、完全で広範囲の免疫応答を生み出すために一回のワクチン接種が行われる。本発明のいくつかの実施態様においては、完全で広範囲の免疫応答を生み出すために一連のワクチン接種が行われる。本発明のいくつかの実施態様に従うと、少なくとも2回の、および好適には4から5回の注入が一定時間にわたり行われる。注入間隔は24時間から2週間またはそれ以上であるが、好適には1週間離される。もしくは、少なくとも2つ、かつ4つまでの異なる部位で同時に別々の注入が行われる。
本発明のいくつかの実施態様において、完全なワクチン接種は一つまたはそれ以上の標的化されたエピトープをコードする配列を含む遺伝子構築物を持つ単一の接種物の注入を含む。
本発明のいくつかの実施態様において、完全なワクチン接種は異なる部位への2つまたはそれ以上の異なる接種物の注入を含む。例えば本発明に従ったHIVワクチンにおいては、ワクチンは二つの接種物を含み、各々は異なるウイルス蛋白質をコードする遺伝物質を含む。ワクチン接種のこの方法は、感染性ウイルス粒子の組立の危険を犯さずに、個体内へウイルス遺伝子の完全な組と同等のものを導入することを可能にする。従って、ワクチン接種された個体では、ウイルスのほとんどまたはすべてに対する免疫応答を引き起こすことができる。各々の接種物の注入は異なる部位、好適にはいかなる細胞も両方の遺伝子構築物を受け取ることがないことが確実な距離で実施される。さらなる安全のための予防処置として、感染性ウイルス組立の可能性を防止するためいくつかの遺伝子が欠損させられまたは改変されるであろう。ここで使用される術語”医薬キット”とは本発明で使用される複数の接種物を集合的に呼ぶことを意味している。そのようなキットには異なる接種物および/または細胞刺激剤を含む別々の容器が含まれる。これらのキットは免疫法に使用される接種物の組を含むように提供されることが意図されている。
本発明の方法はヒトおよび家畜両方の治療用医薬の分野で有用である。従って、本発明は哺乳類、鳥および魚の遺伝子免疫化に関する。本発明の方法はヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコを含む哺乳類種に対して特に有用であろう。
以下に示した実施例には本発明の態様の代表的実施例が含まれている。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを意味しているのではなく、ただ例示の目的を果たしているものである。さらに、本発明の種々の態様が以下の記述に要約できる。しかしながら、この記述は本発明の範囲を制限するものではなく、ただ本発明の種々の態様を強調するものである。当業者は本発明のさらなる態様および実施態様を容易に評価できるであろう。
実施例
実施例1
本発明は直接的遺伝子免疫処置を用いるHIVワクチンを提供する。個体の細胞内へ送達された時に発現されてHIV蛋白質を産生する遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施態様に従うと、個体の細胞中での全ウイルス構造蛋白質の産生はHIV感染を防護する防護的免疫応答が惹起される。本発明のHIVワクチンはHIV感染から非感染個体を免疫するのに用いられるであろうし、またはすでに感染した個体に対しては免疫治療剤として働くであろう。本発明のHIVワクチンは、HIV感染細胞を認識および攻撃し、およびHIV蛋白質の最も広範囲の付随物を認識するCTLを含む免疫応答を引き起こす。従って、非感染の個体がHIV感染から防護される。
いくつかの実施例において、本発明は二つの接種物を投与することによりHIVに対して個体を免疫する方法に関している。これらの二つの接種物は少なくとも二つのおよび好適には二つより多くのHIVウイルスの複数または全ての遺伝子を含んでいる。しかしながら、接種物は一緒には送達されない。従って、接種される細胞には完全な遺伝子の補体は投与されないであろう。ワクチン接種された個体は少なくとも二つの異なった、および好適には二つより多くの、より好適には複数または全ての遺伝子を受け取るであろう。HIV蛋白質標的の全補体で免疫応答が指示される。
この方法は最も有効な標的蛋白質をコードする遺伝物質がワクチンに含まれるであろう確率を増加させ、ウイルスが突然変異を行った場合に起こる一つまたはそれ以上のウイルス蛋白質の構造変化にもかかわらずに免疫応答による検出からのがれるであろうウイルス粒子を減少させる。従って、多数のおよび好適にはほとんど完全なまたは完全なウイルス蛋白質をコードしている遺伝子の補体で個体をワクチン処理するのが望ましい。
一つの細胞にウイルス遺伝子の完全な補体が提供されると、細胞内で完全な感染性ウイルスを組み立てることが可能である。従って、本発明に従った遺伝子構築物はそのような完全な遺伝子の補体では提供されない。さらに、各々は遺伝子の不完全な組を持ち、合わせるとウイルス遺伝子の完全な補体を持つ二つまたはそれ以上の接種物が異なった細胞に、望ましくはいかなる細胞も不注意に遺伝子の完全な組に曝されないことを確実にするためお互いに離れた部位で投与される。例えば、HIVのゲノムの一部が第一の構築物に挿入でき、HIVゲノムの残った部分は第二の構築物に挿入される。第一の構築物は遺伝子ワクチンとして個体の一つの腕の筋肉組織中に投与され、一方第二の構築物は遺伝子ワクチンとして個体の別の腕の筋肉組織中に投与される。個体はウイルス遺伝子の完全な組に曝されるであろう;それ故、本質的には全ウイルスに対してワクチン接種されているが、感染性ウイルス粒子か組み立てられるであろう危険性はない。
さらなる安全のための予防措置として、遺伝物質が二つまたはそれ以上の接種物により個体の体の離れた部位に送達された場合でも、感染性ウイルス粒子が形成されないことを確かにするために一つまたはそれ以上の必須な遺伝子を欠損または故意に改変できる。そのような実施態様において、個体にはウイルス遺伝子の完全で機能的な組は投与されない。
さらなる安全のための予防措置では別々の遺伝子構築物上のウイルスゲノムの非−重複部分が提供され、各々別々の接種物を作り上げる。従って、二つの遺伝子構築物間の組換えが妨げられる。
本発明のいくつかの実施態様において、構造遺伝子の全補体が提供される。HIVの構造遺伝子はgag、polおよびenvから成っている。これらの三つの遺伝子は二つの異なったDNAまたはRNA構築物で提供される。従って、一つの好適な実施態様においてはgagおよびpolが一つのDNAまたはRNA構築物上にあり、envは別のものに存在する。別の好適な実施態様においては、gagおよびenvが一つのDNAまたはRNA構築物上にあり、polは別のものに存在する。いくつかの好適な実施態様において、gagを含む構築物はgag翻訳開始コドンの上流にスプライスドナーを持っている。随意に、これらの組み合わせにおいてHIV制御遺伝子もまた存在するであろう。HIV制御遺伝子は:vpr、vif、vpu、nef、tatおよびrevである。
好適な実施態様におけるDNA構築物はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルから成っている。プロモーターは:HIV LTR、ヒトアクチン、ヒトミオシン、CMV、RSV、モロネイ、MMTV、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびEBVからなる群より選択されるであろう。エンハンサーは:ヒトアクチン、ヒトミオシン、CMV、RSV、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびEBVからなる群より選択されるであろう。ポリアデニル化シグナルは:LTRポリアデニル化シグナルおよびSV40ポリアデニル化シグナル(特にその中でもSV40マイナーポリアデニル化シグナル)からなる群より選択されるであろう。
いくつかの実施例において、二つの接種物のワクチンが個体の空間的に分離した組織に(好適には例えば右および左の腕のような異なった付属器官)筋肉内で投与された。本発明の各々の接種物は約0.1から約1000マイクログラムのDNAを含んでいるであろう。好適には各々の接種物は約25から約250マイクログラムのDNAを含んでいる。最も好適には各々の接種物は約100マイクログラムのDNAを含んでいる。
いくつかの実施例における本接種物は無菌であり、等張担体(好適にはリン酸緩衝化塩溶液または塩溶液)として存在する。
いくつかの実施態様では、ワクチン投与に先立って、ワクチンが与えられる組織に細胞増殖剤(望ましくはブピバカイン)が注入される。ブピバカイン注入はワクチン接種の約24時間前までに実施されるであろう。ブピバカイン注入はワクチン接種直前に行うことが意図された。約50μlから約2ml(好適であるのは50μlから約1500μlであり、最も好適には約1ml)の0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%メチルパラベン等張NaCl溶液がワクチンが投与されるべき部位に投与される。
他の実施態様において、細胞増殖剤(好適にはブピバカイン)が遺伝子構築物と一緒に処方に含まれている。約50μlから約2ml(好適であるのは50μlから約1500μlであり、最も好適には約1ml)の0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%メチルパラベン等張NaCl溶液がワクチンが投与されるべき部位に投与される。
従って、いくつかの実施態様は二つの接種物のワクチンから成っている:一つの接種物は二つのHIV構造遺伝子を持つDNAまたはRNA構築物を含んでおり、合わされた接種物がHIV構造遺伝子の全補体を含むように、他の接種物は第三の残りのHIV構造遺伝子を持つDNAまたはRNA構築物を含んでいる。各々のDNA構築物の構造遺伝子は作動可能なようにプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルに連結されている。同一または異なった制御配列がウイルス遺伝子の発現を制御するであろう。個体にワクチン接種する場合、二つの接種物は異なった部位に(好適には異なった腕に)筋肉内に投与される。本発明のいくつかの実施態様では、ワクチンが接種されるべき部位にブピバカインが最初に投与される。本発明のいくつかの実施態様では、ブピバカインが遺伝子構築物と一緒に処方に含まれている。
いくつかの実施態様では、ワクチン接種は少なくとも一回、好適には二または三回繰り返される。各々のワクチン接種は24時間から二ヶ月離して実施される。
いくつかの実施態様では、ワクチンは無針注入装置を用いて投与される。いくつかの実施態様では、ワクチンは無針注入装置を用いて皮下注射的に投与されて筋肉内、皮内、皮下での同時投与が行われ、物質は間質に投与される。
好適な遺伝子構築物は以下のものが含まれる。
プラスミドおよびクローニング法:
二つのプラスミドが作製された:一つはHIVgag/polを含んでおり、残りはHIVenvを含んでいる。
HIV−1ゲノムクローンpNL43はNIH AIDS Research and Reference Reagent Program(ARRRP)、Division of AIDS,NIAID,NIH、を通してMalcolm Martin博士から得られ、遺伝子構築物のためのHIV−1ウイルス遺伝子の出発材料として使用できる。もしくは、感染細胞のHIV分子クローンが、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて構築に十分なように修飾でき、HXB2クローン、MNクローン並びにSFまたはBAL−1クローンが含まれる。pNL43クローンがHIV−1プロウイルスDNAにpUC18内へクローン化された組み込みの部位から3kbの宿主配列が加わったものからなる構築物である。pNL−puro−envプラスミドの作製:このプラスミドはgag/polの発現のために作製された。pNL43の非−HIV5’隣接ヒトDNA内のStuI部位がStuIによる部分消化により破壊し、続いて大腸菌ポリメラーゼIで遊離末端を消化した。線状プラスミドを詰め込んで自己結合を起こさせ、HIVゲノム内へ特異的StuI部位を残した。このプラスミドpNLDstuは次に平滑端生成酵素StuIおよびBsaBIで切断し、gp120のコード配列の大部分を除去する。SV40プロモーターおよびピューロマイシン耐性コード領域(ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ(PAC))はEcoRIおよびClaIを用いてpBABE−puro(MorgensternおよびLand,1990 Nucl.Acids Res.18(12):3587−3596、ここに引例として包含されている、親切にもImperial Cancer Reseach FundのHartmut Land博士から提供を受けた)から単離された。この断片を平滑端化し、StuI/BsaBI切断pNLDstu内へクローン化された。HIVの3’LTRがPACメッセージのためのポリA機能を提供できるように正しい配向のSV40−puro断片でクローンが選択された。このプラスミドはpNLpuroと称された。
HIVgag polベクターからのvpr制御遺伝子の欠失のためのクローニング戦略:
特異的Pf1M1部位のすぐ上流からvif終止コドンのすぐ後ろまでの領域が、vprのアミノ酸22で非保存的アミノ酸変換(glu>val)を導入するプライマー、アミノ酸22の直後のvpr読み枠内の停止コドン、および新規停止コドンにすぐ続いたEcoRI部位を用いるPCRにより増幅された。このPCR断片はpNLpuroまたはpNL43のPf1M1−EcoRI断片と置換された。この置換によりvprの転写解読枠の122ヌクレオチドが欠失され、点突然変異法では必然的に伴われる復帰の可能性が除去される。得られたプラスミド(pNLpuroΔvpr)はvprの最初の21の天然のアミノ酸に加えてバリン、加えてHIV−1遺伝子の残りの全ておよびその天然型のスプライスジャンクションをコードしている。そのような欠失戦略はまたnef、vifおよびvpuに応用可能であり、構造遺伝子発現は可能であるが生きている組換え体ウイルスの発生を防いでいる。
エンベロープ発現のためのプラスミド作製:
HIV−1 HXB2のエンベロープ遺伝子をコードするDNAセグメントはAIDS Researchand Reference Reagent Programから得られたラムダクローン化DNAを利用し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅技術によりクローン化された。5’および3’プライマーは各々、XhoI部位を含んだ5'-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3'(配列ID番号:1)およびXbaI部位を含んだ5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3'(配列ID番号:2)でありgp160、tatおよびrevコード領域を取り巻いている。
遺伝子特異的増幅は使用説明書に従って(Perkin−Elmer Cetus Corp.)Taq DNAポリメラーゼを用いて実施された。PCR反応生成物は0.5μg/mlプロテイナーゼKで30分間37℃で処理され、続いてフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈澱が行われた。回収されたDNAはXholおよびXbalで2時間37℃で切断され、アガロースゲル電気泳動にかけた。単離され精製されたXhol−XbalPCR断片はBluescriptプラスミド(Stratagene Inc.,La Jolla,CA)内へクローン化され続いて真核発現ベクターpMAMneoBlue(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)内へサブクローン化された。得られた構築物はpM160(図1A)と称された。プラスミドDNAはCsCl濃度勾配超遠心分離で精製された。DNA構築物pM160はRSVエンハンサー要素およびプロモーターとしてのMMTV LTRの制御下HIV−1/HXB2(Fisher,A.G.,et al.,(1985)Nature 316:262−265)gp160膜結合糖蛋白質をコードしている。
HIV env−revプラスミドと称されるエンベロープ発現プラスミドの別の構築法:
revおよびvpuの二つのエキソンおよびHIV−1 HXB2のエンベロープ転写解読枠がPCRにより増幅され、発現ベクターpCNDA/neo(Invitrogen)内へクローン化された。このプラスミドはCMVプロモーターを通してエンベロープ産生を誘導する。
製造および精製
大腸菌(DH5アルファ)中のプラスミドは以下のように増殖させた:LB添加アンピシリン寒天プレートで凍結されている所望のプラスミド培養物が画線培養された。プレートは37℃で一夜(14−15時間)インキュベーションされた。プレートから一つのコロニーを採り、ペプトン調製物および50μg/mlアンピシリンを含む15mlのLB培地内へ接種された。この培養物は振とうしながら(約175rpm)37℃で8−10時間増殖させた。OD600の読みは少なくとも1.0でなければならない。ペプトンおよび50μg/mlアンピシリンを含む1リットルのLB培地内へ1.0OD培養物が接種された。これらの1−2リットル培養物は振とうしながら(175rpm)37℃で一夜増殖させた。
大腸菌(DH5アルファ株)中で増殖させたプラスミドは以下の方法により採取され精製された。細胞の溶解およびプラスミドの精製の一般的方法は”Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2ndEdition,J.Sambrook,E.f.Fritsch,and T.Maniatis,Cold Spring Harbor Press,1989、に記載されている。細胞は濃縮されグルコース−トリス−EDTApH8.0緩衝液で洗浄された。濃縮された細胞はリソザイム処理および0.2NKOHで短時間処理する事により溶解させ、次にpHを酢酸カリウム/酢酸緩衝液で5.5に調節する。不溶性物質は遠心分離により除去される。上清液に2−プロパノールを加えてプラスミドを沈澱させる。プラスミドをトリス−EDTA緩衝液に再懸濁し、さらにフェノール/クロロホルム抽出およびさらなる2−プロパノールによる沈澱により精製する。
エンドトキシンは下記のものを含む種々の方法により随意に除去できる:ポリミキシンのような固定化物質による特異的吸着(Tani et al.,Biomater.Artif.Cells Immobilization Biotechnol.20(2−4):457−62(1992);Issekutz,J.Immunol.Methds 61(3):275−81(1983));8A1およびHA−1ATMのような抗−エンドトキシンモノクローナル抗体(Centocor,Malvern,PA;Bogard et al.J.Immunol.150(10):4438−4449(1993);Rietschel et al.,Infect.Immunitypage 3863(1993));正に荷電したデプスフィルター(Hou et al.,J.Parenter.Sci.Technol.44(4):204−9(Jul−Aug 1990));ポリ(ガンマーメチル L−グルタメート)、Hirayama et al.,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)40(8):2106−9(1992));ヒスチジン(Matsumae et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.12:(2):129−40(1990));疎水的相互作用カラムおよび膜(Aida et al.,J.Immunol Methods 132(2):191−5(1990);Umeda et al:;Biomater Artif Cells Artif Organs 18(4):491−7(1990);Hou et al.,Biochem.Biophys.Acta 1073(1):149−54(1991);Sawada et al.,J.Hyg(London)97(1):103−14(1986));Brownlee Polypore Resin(Applied Biosystems,Palo Alto,Ca)のような疎水性ポリスチレン/ジビニルベンゼンまたはジビニルベンゼン樹脂を含むエンドトキシンを除去するために有用な特異的疎水性樹脂;XUS 40323.00(Dow chemical,Midland,MI);HP20,CHP20P(Mitsubishi kasei,U.s.);Hamilton PRP−1 PRP−infinity(Hamilton,Reno,NV);Jordi逆相DVB,Jordi Gel DVB,Polymer Labs PLgelTM(alltech,Deerfield,IL);Vydac PLXTM(SeparationsGroup,Hesperia,CA);他のエンドトキシンの除去物質および方法にはDetoxi−GelTMエンドトキシン除去ゲル(Pierce chemical,Rockford,IL);Application Note 206,(Pharmacia Biotech Inc,Piscataway,NJ)が含まれる。一般的にはSharma,Biotech.App.Biochem.8:5−22(1986)もまた参照されたい。好適な抗−エンドトキシンモノクローナル抗体はエンドトキシンの保存領域に結合する、好適にはエンドトキシンの最も構造的に保存された部分であるリピドAへの抗体の結合。そのような抗−リピドAモノクローナル抗体には高親和性マウスIgGモノクローナル抗体8A1およびヒト抗−リピドAIgM(K)モノクローナル抗体HA−1ATMが含まれる。HA−1ATMはヒトB大腸菌J5ワクチンHA−1ATMから誘導された。HA−1ATMは種々の細菌エンドトキシン(リポポリサッカライド)と広い交差反応性があることが報告されている。
実施例2
遺伝子ワクチンおよび蛋白質ワクチンにより惹起される免疫原性応答を比較するために計画された実験において、外来性標的蛋白質を特異的に発現する腫瘍細胞を用いて動物モデルが設計された。外来性抗原を発現する三つの免疫応答性マウスモデルが開発された。Balb/cマウス株に由来する三つのクローン化腫瘍細胞株が使用された。細胞株は:1)他の組織に有意に転移しないが8−12週で動物を殺すような大きな触知できる腫瘍を形成するリンパ腫細胞;2)いくらかの転移能力(主として肺)を持ち、百万の細胞を接種するとマウスに大きな触知できる腫瘍を発生させそれは同様に8−12週以内に動物を殺すマウスメラノーマ細胞株;および3)多数の組織に転移し動物を12またはそれ以上の週のうちに殺すマウス肺アデノカルシノーマ細胞株である。非認識形で外来性抗原を示すことができるサブクローンが選択された。トランスフェクトされた腫瘍が親マウス株に移植された場合、大多数の類似の腫瘍株と異なり、動物は示される外来抗原に対して防護的免疫応答を行わずに腫瘍が受け入れられてしまう。これらの腫瘍は本来の非トランスフェクト腫瘍のように、同じ時間枠での同じ表現形で動物を殺す。これらのモデルを用いて、抗原に対する遺伝子ワクチン接種により惹起される免疫応答が測定できる。
マウスの細胞により標的蛋白質の産生を生じる遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンでマウスをワクチン接種した場合、標的蛋白質を示している腫瘍を完全に除去する強い細胞毒性を示したが、示さない腫瘍には何の影響も与えないことが観察された。標的蛋白質それ自身を接種したマウスでは、それらにより惹起された免疫応答はより低かった。腫瘍はその大きさを減少させたが、細胞毒性がないため除去されなかった。対照として、実験にトランスフェクトされていない腫瘍が使用され、遺伝子ワクチン、サブユニットワクチンでワクチン接種されたおよびワクチン接種されていない動物の免疫応答が比較された。これらの実験は、遺伝子ワクチンがより広範囲でより有効な免疫応答を生み出し、CTLにより完全に腫瘍を除去できたことが明らかに示された。対照的に、無傷の標的蛋白質を用いた免疫接種はより範囲の狭い、より有効でない免疫応答しか生み出さなかった。
実施例3
本発明の別の実施態様では、HIVに対する遺伝子ワクチンが設計された。ウイルス蛋白質gp160(gp120およびgp41内へプロセッシングされている)が標的蛋白質であり、それに対して遺伝子ワクチンが製造された。遺伝子ワクチンは作動可能なように制御要素に連結されたgp160をコードするDNA配列を含むDNA構築物を含んでいる。個体に投与された場合、遺伝子ワクチンのDNA構築物が個体の細胞内へ取り込まれ、gp160が産生される。この蛋白質により惹起される免疫応答は広範囲のものに基づいており体液性および細胞性免疫応答の両方が含まれる。広範囲な生物学的応答は蛋白質自体が投与された場合に達成されるより優れた防護を提供する。
マウスに実施例1に記載したpM160を筋肉内に注入し、続いて抗−HIV免疫応答が分析された。このようにして免疫した動物からの抗血清は抗−HIVエンベロープ糖蛋白質免疫応答を生み出し、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫沈降アッセイで測定された。抗血清はHIV−1感染を中和し、HIV−1誘導融合細胞形成を阻害した。
観察された中和および抗−融合細胞活性は惹起された抗体のHIV−1エンベロープ蛋白質の機能的に重要な領域(なかでもgp120のV3ループ、CD4結合部位およびgp41のN−末端”免疫優性”領域のような)への反応性の結果であろう。
ここに記載した遺伝子免疫法において、BALB/cマウスの四頭筋に筋肉細胞再生の刺激および遺伝子構築物の取り込みを容易にするため100μlの0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%メチルパラベンの等張NaCl溶液が27−ゲージ針を用いて注射された。24時間後、同一の注射部位に100μgのpM160または対照プラスミドとして100μgのpMAMneoBlueが注射された(図1A)。マウスは同様の方法でしかしブピバカイン−HCl前処理なしで2週間の間隔で3回同量のDNA構築物を注射することにより追加免疫された。
組換え体gp160免疫処置では、BALB/Cマウスは最初に完全フロインドアジュバンド中の1μgのグリコシル化組換え体(HIV−1/IIIB)gp160(MicroGneneSys Inc.)で免疫され、続いて各々不完全フロインドアジュバンド中の1μgのgp160で2週間間隔で3回追加免疫された。HIV−1に対する抗体の産生はマウス血清の免疫沈降gp160への能力を試験して決定された。免疫沈降はOsther,K.,et al.,(1991)Hybridoma 10:673−683(ここに引例として包含されている)により以前に記載されているように1x106cpmの125I標識rgp160、マウス血清およびプロテイン−Gアガロースビーズ(GIBCO,Inc.)を用いて実施された。特異的沈降は10%SDS−PAGEにより分析された。レーン1は125I−gp160と反応させた1μlの免疫前マウス血清である。レーン2はpM160免疫マウスから免疫した1μlのマウス血清である。レーン3は陽性対照として、1μlのID6モノクローナル抗−gp120抗体の1:100希釈液(Ufwn,K.E.,et al.,(1992)Generation of Monoclonal AntibodiesAgainst the Amino Region of gp120 which Elicis Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity,Cold Spring Harbor Laboratory)である。矢印は特異的に免疫沈降された125I−gp160エンベロープ糖蛋白質を示している。
125I−標識gp160は特異的にpM160−免疫化動物並びに陽性対照抗−gp120モノクローナル血清(図2、レーン1)に由来する抗血清(図2、レーン2)と特異的に免疫沈降された。対照的に、免疫前血清(図2、レーン1)は最小の活性しか示さなかった。
pM160構築物で免疫された10匹の内の8匹はgp160に対する反応性が陽性であることがELISAで決定され、最も高い抗−gp160力価を持つ動物からの免疫応答が詳細に分析された。ベクターで免疫された4匹のマウスはELISAにおいてすべてgp160に対する反応性が類似の陰性を示し、これらの血清の一つが続いての実験の対照として使用された。
HIV中和抗体はgp120およびgp41中のいくつかのエピトープを特異的に標的とすることが知られており、それにはgp120のV3ループ(Goudsmit,J.et al.,(1988)AIDS 2:157−164;およびPutney,S.D.,et al.,(1989)Development of An HIV Subunit Vaccine,Montreal)、gp120のカルボキシ末端近くのCD4結合部位(Lasky,L.A.,et al.,(1987)Cell 50:975−985)ならびにN−末端融合領域のすぐ下流のgp41の免疫優性ループ(Schrier,R.D.,et al.,(1988)J.Virol.62:2531−2536)が含まれる。
これらのマウスで惹起されたどの抗−gp160抗体がこれらの重要な領域に対して反応性があるかを決定するため、エンベロープ糖蛋白質、BRU/V3ループのためのペプチド、MN/V3ループのためのペプチド、HXB2/CD4N−末端のためのペプチドまたは、HXB2/CD4結合部位のためのペプチドがマイクロタイタープレートに吸着されマウス抗血清の特異的反応性がELISAアッセイで決定された。1μgのgp160または10μgの各々のペプチドの0.1M炭酸水素塩緩衝液(pH9.5)溶液でマイクロタイタープレートを被覆し(4℃、一夜)、2%ウシ血清アルブミンのPBS溶液でブロックし、HRPO(Fisher)とコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGと37℃で1時間反応させ、暗所、室温にてTMB基質(Sigma)と10−30分顕色させた。結果は図3に報告されている。抗血清は以下のものである:(−+−)は免疫前血清であり、(−x−)はpMAMneoBlueで免疫した血清であり、(−○−)はpM160で免疫した血清であり、(−△−)はrgp160蛋白質で免疫されたマウスからのものである。図3Aはrgp160蛋白質で被覆したプレートを使用した結果を示している。図3BはBRU/V3ループペプチド(CNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK(配列ID番号:11))被覆プレートを使用した結果を示している。図3CはMN/Vループペプチド(YNKRKRIHIQRGPGRAFVTTKNIIC(配列ID番号:12))(HIV−1/IIIBからのQR配列はボールド体で示されている)で被覆したプレートを使用した結果を示している。図3DはHXB2/CD4結合部位ペプチド(CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC(配列ID番号:13))被覆プレートを使用した結果を示している。図3EはBRU/gp41免疫優性領域ペプチド(RILAVERYIKDQQLLGIWGCSKLIC(配列ID番号:14))被覆プレートを使用した結果を示している。
図3はpM160構築物免疫処置マウスからの抗血清が組換え体gp160蛋白質(rgp160)免疫処置血清より、BRUおよびMN/V3ループペプチド、CD4結合部位ペプチドおよび免疫優性gp41ペプチドに対して有意により高い反応性を持っていることを示している。rgp160免疫処置マウスからの抗血清はpM160構築物免疫処置マウスよりrgp160に対してより高い力価を持っていたが、試験されたgp160の三つの特異的中和エピトープに対してはより低い活性しか持っていなかった。
DNA免疫処置により発生した抗血清が抗ウイルス活性を持っているかどうかを決定するため、HIV感染を中和する抗血清の能力が試験された。100のTCID50での細胞フリーHIV−1/IIIBウイルスをMT−2標的細胞の感染に用いる前に連続的に希釈した抗血清とインキュベートした(Montefiori,D.C.,(1988)J.Clin.Microbio.26:231−235)。
100のTCID50HIV−1/IIIB細胞フリーウイルスを連続的に希釈した抗血清と37℃で1時間前もってインキュベートした。インキュベーション後、前処理したウイルスを4x104の標的細胞株MT−2に加え37℃で1時間トランスフェクションし、続いてMT−2細胞を3回洗浄し37℃、5%CO2でインキュベートした。3重の実験について、3日後ウェル当たりの融合細胞の数を位相差顕微鏡下で目で計数することにより定量的に融合が評価された。
結果が図4に報告されている。図4Aはベクター−免疫処置マウス血清を用いて得られた結果を示しており、pM160免疫処置血清を用いた結果を示す図4Bと比較されている。中和化値(Vn/Vo)対希釈因子(Nara,P.,(1989)Techniques In HIV Research eds.Aldovini,A.&Walkter,B.D.,77−86 M Stockton Press)は、図4Cに示されている。対照血清(−x)はpMAMneoBlueベクター免疫処置マウスからのものであった。試験血清(○)はpM160免疫処置マウスからであった。
融合細胞阻害は、Osther,K.,et al.,(1991)Hybridoma 10:673−683により記載されているように実施された。H9/IIIB細胞株を50μlの総容量で96ウェルプレートに作成された連続希釈(1:100,1:200,および1:400)抗血清と37℃、5%CO2にて前もってインキュベートした。3日後、融合はウェル当たりの融合細胞の数を位相差顕微鏡下で計数することにより定量的に評価された。図4Dは免疫前血清で処理されたHIV−1/IIIB細胞株と同時培養した標的細胞である。図4Eは図4Dと同じ物であるが、ただし対照ベクターで免疫された血清で処理されている。図4Fは図4Dと同じ物であるが、ただしrgp160で免疫された血清で処理されている。図4Gは図4Dと同じ物であるが、ただしpM160で免疫された血清で処理されている。図4Dから図4Gはこれらのアッセイにおいて1:200の希釈で融合細胞の阻害が明らかであることを示している。ベクター−免疫処置抗血清で前もってインキュベートされている無細胞HIV−1/IIIBでMT−2を感染させると容易に融合細胞をが形成された(図4A)。対して、pM160免疫処置マウス血清との前もってのインキュベーションは融合細胞形成を妨害した(図4B)。中和化動力学は中和化値(Vn/Vo)対抗血清の連続的希釈により決定された(Nara,P.,(1989)Techniques In HIV Research,eds.Aldovini,A.&Walkter,B.D.,77−86,M Stockton Press)(図4C)。pM160免疫処置マウスからの血清は1:320までの希釈で生物学的に活性な中和活性をもっていたが、一方、対照抗血清は類似の活性を示さなかった。
pM160免疫処置マウスからの血清が直接的細胞−細胞融合を通してのエンベロープ仲介ウイルス拡散を阻害できたかどうかを決定するために、融合細胞阻害アッセイが実施された。pM160免疫処置マウスからの血清はHIV−1誘導融合細胞形成を1:200の希釈で阻害した(図4G)。対照的に、免疫前血清(図4D)、rgp160免疫処置マウスからの血清(図4F)および対照ベクター免疫処置血清(図4E)は同一の希釈で融合細胞の形成を阻害しなかった。
これらの血清の中和(図4A−C)および融合細胞阻害アッセイ(図4D−G)からの観察結果はELISA反応性(図3)で観察されたものと相関している。エピトープの中和に高レベルの結合を示したpM160免疫処置マウスからの血清は同様に、高レベルの抗ウイルス活性を示した;逆に、これらのエピトープにほとんど結合しない血清は(rgp160免疫処置マウスからの血清を含んで)低い抗ウイルスしか持っていなかった。
pM160免疫処置マウスからの血清が、CD4を運ぶT細胞へのgp120の結合を阻害できるかどうかを試験するために、フルオロサイトメトリーによりモニターされる直接阻害アッセイが用いられた(Chen,Y.H.,et al.,1992)AIDS 6:533−539)。pM169免疫処置マウスからの血清がCD4を運ぶT細胞へのgp120の結合を阻害できることが観察された:1:15希釈の免疫血清がCD4+SupT1細胞へのFITC−gp120の結合を22%±2%阻害したことが(2重の実験)フローサイトメトリーにより計算された。このことは標的細胞へのHIVの侵入のためのこの領域がこの抗血清により機能的に阻害できることを示している。これらの結果はCD4結合部位ペプチドに対する抗血清のELISA反応性で観察されたことと一致している(図3c)。
イムノグロブリンのイソタイプ分類研究が市販のマウスモノクローナル抗体イソタイプ分類キット(Sigma)を用いて実施された。pM160免疫処置で惹起された抗gp160特異的抗体の内、19%がIgG1であり、51%がIgG2であり、16%がIgG3であり、10%がIgMであり、および5%がIgAであった。IgGイソタイプが優勢なことは二次の免疫応答が起こったことを示しており、さらにヘルパーT細胞が遺伝子免疫処置により惹起できることを示唆している。
pM160およびpMAMneoBlue DNAがマイクロタイタープレート上に被覆されすべての免疫処置された動物の血清を用いてELISAにより特異的結合が決定された。プラスミドDNAへの有意な結合は観察されなかった。従って、筋肉組織への接種に遺伝物質を用いても抗プラスミドDNA応答はないようである。
DNA構築物をマウス筋肉へ針による注射で導入すると、一致しない結果を生じるであろう;この技術は筋肉細胞によるDNAの取り込みを制御する手段を提供しないからである。DNA構築物単独注入(n=4)およびブピバカイン前処理動物(n=4)が比較された。二つの群で観察された免疫応答は同じではなかった、各々25%および75%の動物がELISAアッセイで応答した。パーティクルボンバードメントのような直接DNA送達システムにより効率の増加が達成されるであろう(Klein,T.M.et al.,(1992)Bio/technology 10:286−291)。
中和、融合細胞阻害、CD4−gp120結合阻害およびgp160のいくつかの重要な領域への特異的結合の証拠は、生きている動物の筋肉細胞内へのHIVgp160膜結合糖蛋白質コードDNA構築物の直接的導入は特異的体液性応答を惹起でき、生物学的に適切な抗ウイルス抗体を発生することを示している。
ワクチンが防護的免疫応答を惹起できるかどうかを試験するため、上記の動物モデルが使用された。腫瘍細胞をp160をコードするDNAでトランスフェクトし、蛋白質の発現を確認して動物内へ移植した。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫処置した動物はプラスミドpm160でワクチン処置された。対照は非ワクチン処置動物、ベクターDNAのみでワクチン処置した動物およびgp160が投与された動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。gp160蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例4
以下は本発明の方法で使用されるであろう構築物のリストである。以下にリストした構築物の多くの製造のための出発材料として使用されたベクターpBabe.puroは初めはMorgenstern,J.P.およびH.Land,1990 Nucl.Acids Res.18(12):3587−3596(ここに引例として包含されている)により構築および報告されている。pBabe.puroプラスミドは哺乳類細胞での外因性遺伝子の発現に特に有用である。発現されるべきDNA配列はモロネイマウス白血病ウイルス(MoMuLV)の制御下のクローニング部位へ挿入される。プラスミドはピューロマイシン耐性の選択可能マーカーを含んでいる。
実施例5
プラスミドpBa.Vα3はpBabe.puroのEcoRI部位内へクローン化されたL、VおよびJセグメントを含むT細胞受容体Va3領域をコードしている2.7kbEcoRIゲノム断片を含む7.8kbのプラスミドである。T細胞受容体由来標的蛋白質はT細胞仲介自己免疫疾患およびクロノタイプT細胞リンパ腫および白血病に対する免疫処置および治療に有用である。
実施例6
プラスミドpBa.gagpol−vprはpBabe.puro内へクローン化されたHIV/MNのgag/polおよびvif遺伝子を含む9.88kbのプラスミドである。vprは欠落している。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。HIV DNA配列はReiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549(ここに引例として含まれている)に報告されている。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例7
プラスミドpM160はpMAMneoBlue内にクローン化されたHIV−1/3Bエンベロープ蛋白質およびrev/tat遺伝子をコードする2.3kbPCR断片を含む11.0kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。HIV−1/3BのDNA配列はFisher,A.,1985 Nature 316:262(ここに引例として包含されている)により報告されている。この配列はGenbank番号:K03455として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例8
プラスミドpBa.VLはpBabe.puroのXbaIおよびEcoRI部位内へクローン化された抗DNA抗体のVL領域をコードするPCR断片を含む5.4kbのプラスミドである。抗体由来標的蛋白質はB細胞仲介自己免疫疾患およびクロノタイプB細胞リンパ腫および白血病に対する免疫処置および治療に有用である。抗体からの機能的変異領域のクローニングのための一般法はChaudhary,V.K.,et al.,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066(ここに引例として含まれている)に記載されている。
実施例9
プラスミドpOspA.BはpBabe.puroのBamHIおよびSalI部位内へクローン化されたボレリア ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)(ライム病の原因となるスピロヘータ)のOspAおよびOspB抗原をコードするコード領域を含む6.84kbのプラスミドである。OspAおよびOspB断片を発生させるのに使用されたPCRプライマーは5,-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3'(配列ID番号:3)および5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3'(配列ID番号:4)。Williams,W.V.,et al.1992 DNA and Cell.Biol.11(3):207(ここに引例として含まれている)参照。標的蛋白質をコードするこれらの病原体遺伝子を含むプラスミドはライム病に対する免疫処置に有用である。
実施例10
プラスミドpBa.Rb−GはpBabe.puroのBamHI部位内へクローン化された狂犬病G蛋白質をコードするPCR発生断片を含む7.10kbのプラスミドである。狂犬病G蛋白質をコードするこの病原体遺伝子含むプラスミドは狂犬病に対する免疫処置に有用である。このDNA配列はGenbank番号:M32751に記載されている(ここに引例として含まれている)。Anilionis,A.,et al.,1981 Nature 294:275(ここに引例として含まれている)もまた参照されたい。
実施例11
プラスミドpba.HPV−L1はpBabe.puroのBamHIおよびSalI部位内へクローン化されたヒト乳頭腫ウイルス(HPV)株16、18、31および33を含むHPVのL1カプシド蛋白質をコードするPCR発生断片を含む6.80kbのプラスミドである。本プラスミドはHIV感染およびそれにより起こされる癌に対する免疫処置に有用である。このDNA配列はGenbank番号:M15781に記載されている(ここに引例として含まれている)。Howley,p.,1990 Fields Virology,Volume 2,Eds.:Channock,R.M.et al.Chapter 58:1625;and Shah,K.and P.Howle,1990 Fields Virology,Volume 2,Eds.:Channock,R.M.et al.Chapter 59(ここに引例として含まれている)もまた参照されたい。
実施例12
プラスミドpBa.HPV−L2はpBabe.puroのBamHIおよびSalI部位内へクローン化されたヒト乳頭腫ウイルス(HPV)株16、18、31および33を含むHPVのL2カプシド蛋白質をコードするPCR発生断片を含む6.80kbのプラスミドである。本プラスミドはHIV感染およびそれにより起こされる癌に対する免疫処置に有用である。このDNA配列はGenbank番号:M15781に記載されている(ここに引例として含まれている)。Howley,p.,1990 Fields Virology,Volume 2,Eds.:Channock,R.M.et al.Chapter 58:1625;and Shah,K.and P.Howle,1990 Fields Virology,Volume 2,Eds.:Channock,R.M.et al.Chapter 59(ここに引例として含まれている)もまた参照されたい。
実施例13
プラスミドpBa.MNpはpBabe.puroのBamHIにクローン化されたHIV MN gag(コア蛋白質)配列を含むp7コード領域をコードしているPCR発生断片を含む5.24kbプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro. 8:1549(ここに引例として含まれている)。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例14
プラスミドpGA733−3はpCDM8ベクターのBstXI部位内に結腸直腸癌細胞株SW948からクローン化されたGA733−2腫瘍表面抗原を含む6.3kbのプラスミドである。(Seed,B.and A.Aruffo,1987 Proc.Natl.ACad.Sci.USA 84:3365、ここに引例として含まれている)。腫瘍付随標的蛋白質は癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用な標的蛋白質の例である。GA733−2抗原は結腸癌に対する有用な標的抗原である。GA733抗原はSzala,S.et al.,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3542−3546(ここに引例として含まれている)に報告されている。
実施例15
プラスミドpT4−pMV7はpMV7ベクターのEcoRI部位内にクローン化されたヒトCD4受容体をコードしているcDNAを含む11.15kbのプラスミドである。CD4標的蛋白質はT細胞リンパ腫に対する免疫処置および治療に有用である。プラスミドpT4−pMV7はAIDS Repositoryから入手可能である(カタログ番号158)。
実施例16
プラスミドpDJGA733はpBabe.puroのBamHIにクローン化されたGA733腫瘍表面抗原を含む5.1kbのプラスミドである。腫瘍付随標的蛋白質は癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用な標的蛋白質の例である。GA733−2抗原は結腸癌に対する有用な標的抗原である。
実施例17
プラスミドpBa.RASは最初にpZIPneoRASからサブクローン化され、pBabe.puroのBamHI部位にクローン化されたrasコード領域を含む6.8kbのプラスミドである。ras標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。rasクローニングの方法はWeinberg 1984 Mol.Cell.Biol. 4:1577(ここに引例として含まれている)に報告されている。rasをコードしているプラスミドは癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である;特に、膀胱、筋肉、肺、脳および骨のようなras関連の癌。
実施例18
プラスミドpBa.MNp55はpBabe.puroのBamHI部位内にクローン化されたHIV MN gag前駆体(コア蛋白質)配列を含むp55コード領域をコードするPCR発生断片を含む6.38kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549(ここに引例として含まれている)。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例19
プラスミドpBa.MNp24はpBabe.puroのBamHIおよびEcoRI部位内にクローン化されたHIV MN gag前駆体(コア蛋白質)配列を含むp24コード領域をコードするPCR発生断片を含む5.78kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549(ここに引例として含まれている)。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例20
プラスミドpBa.MNp17はpBabe.puroのBamHIおよびEcoRI部位内にクローン化されたHIV MN gag前駆体(コア蛋白質)配列を含むp17コード領域をコードするPCR発生断片を含む5.78kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549(ここに引例として含まれている)。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例21
プラスミドpBa.SIVenvはpBabe.puroのBamHIおよびEcoRI部位内にクローン化されたpBR322のSIV239を含む構築物から増幅された2.71 PCR発生断片を含む7.8kbのプラスミドである。使用されたプライマーは5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3'(配列ID番号:5)および5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3'(配列ID番号:6)である。プラスミドはAIDS Research and Reference Reagent Programから入手可能である(カタログ番号210)。
実施例22
プラスミドpcTSP/ATK.envはpcDNA1/neoベクター内へサブクローン化されたHTLV−1/TSPおよび/ATJK単離物からの完全HTLVエンベロープコード領域を含む8.29kbプラスミドである。使用されたプライマーは5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3'(配列ID番号:7)および5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3'(配列ID番号:8)である。プラスミドpcTSP/ATK.envは1988年にProc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3599(ここに引例として含まれている)に報告されている。HTLV env標的蛋白質はHTLVおよびT細胞リンパ腫に対する免疫処置および治療に有用である。
実施例23
プラスミドpBa.MNgp160はpBabe.puroのBamHIおよびEcoRI部位内にクローン化されたpsP72のMNenvを含む構築物から増幅された2.8kb PCR発生断片を含む7.9kbのプラスミドである。使用されたプライマーは5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3'(配列ID番号:9)および5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3'(配列ID番号:10)である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549,(ここに引例として含まれている)。この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。
実施例24
プラスミドpc.MNp55はpCEPベクター内にクローン化され、MN単離物のgag領域から増幅された1.4kbPCR発生断片を含む11.8kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.8:1549(ここに引例として含まれている)。
この配列はGenbank番号:M17449として入手可能である(ここに引例として含まれている)。
実施例25
プラスミドpC.NeuはLTR−2/erb2構築物から切断されpCEP4ベクター内へサブクローンされたヒトneu癌遺伝子コード領域を含む3.8kbDNA断片を含む14.2kbのプラスミドである。pC.NeuプラスミドはDiFiore 1987 Science 237:178(ここに引例として含まれている)に報告されている。neu癌遺伝子標的蛋白質は癌(特に、結腸、乳、肺および脳の癌)のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である増殖因子受容体の例である。
実施例26
プラスミドpc.RASは最初にpZIPneoRASからサブクローンされ、pCEP4のBAmHI部位内へサブクローン化されたras癌遺伝子コード領域を含む1.4kbDNA断片を含む11.7kbのプラスミドである。pc.RASプラスミドはWeinberg 1984Mol.Cell.Biol. 4:1577(ここに引例として含まれている)に報告されている。ras標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。rasをコードしているプラスミドは癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である;特に、膀胱、筋肉、肺、脳および骨のようなras関連の癌。
実施例27
プラスミドpNLpuroはHIV gap/polおよびSV40−puro挿入物を含む15kbのプラスミドである。HIV標的蛋白質をコードするこれらのHIVウイルス遺伝子を含むプラスミドはHIV感染およびAIDSに対する免疫処置および治療に有用である。
実施例28
DNA構築物がマウスにおいてのヒトCD4に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験はTリンパ腫抗原に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。従って、このモデルはTリンパ腫防護に対する遺伝子ワクチンの能力を示している。さらに、これらの実験では分子の多数のイムノグロブリンスーパーファミリーに対する有効性を試験された。CD4はヒトおよびマウス種間で非常によく保存されている。
使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はCD4をコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。動物は免疫受容性であるが、非ワクチン処置動物の移植CD4標識腫瘍に対して免疫応答は起こらなかった。
遺伝子で免疫された動物は実施例15に記載されているプラスミドpT4−pMV7でワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびCD4投与動物である。
ここに記載した遺伝子免疫法において、BALB/cマウスの四頭筋に筋肉細胞再生の刺激および遺伝子構築物の取り込みを容易にするため100μlの0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%メチルパラベンの等張NaCl溶液が27−ゲージ針を用いて注射された。24時間後、同一の注射部位に100μgのpT4−pMV7または対照プラスミドとして100μgのpMV7が注射された。マウスは同様の方法でしかしブピバカイン−HCl前処理なしで2週間の間隔で3回同量のDNA構築物を注射することにより追加免疫された。
動物は1,000,000のCD−4標識腫瘍細胞を受け取っている。非ワクチン処置動物においては大きな腫瘍が形成され、約7−10週間後に死亡した。ワクチン処置動物においては類似の致死性腫瘍は形成されなかった。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。CD4蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例29
DNA構築物がマウスにおいてのヒトGA733に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は結腸癌のようなGA733に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はGA733をコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例14に記載されているプラスミドpGA733−2でワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびGA733投与動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。GA733蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例30
DNA構築物がマウスにおいてのヒトp185neuに対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は乳、肺および脳癌のようなp185neu付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はneuをコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したような方法に従って、LTR−2のXhoI部位内へクローン化されたヒトneu癌遺伝子コード領域を含む14.3kbのプラスミドpLTR−2/erbB−2でワクチン接種された。5’−LTRおよび3’−LTRはMoleney−MuLV LTRからのものである。対照は非ワクチン接種動物およびp185neu投与動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。p185蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例31
DNA構築物がマウスにおいてのヒトRasに対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は膀胱、筋肉、肺、脳および骨癌のようなRas付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はRasをコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例17に記載されているプラスミドpBa.Rasでワクチン接種された。Ras標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。rasのクローニング法はWeinberg 1984 Mol.Cell.Biol.4:1577(ここに引例として含まれている)に報告されている。対照は非ワクチン接種動物およびRas蛋白質投与動物である。
実施例32
DNA構築物がマウスにおいてのヒト狂犬病G蛋白質抗原に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞は狂犬病G蛋白質をコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例10に記載されているプラスミドpBa.Rb−Gでワクチン接種された。狂犬病G蛋白質標的蛋白質は病原体抗原の例である。このDNA配列はGenbank番号:M32751に記載されている(ここに引例として含まれている)。対照は非ワクチン接種動物およびG蛋白質投与動物である。
実施例33
DNA構築物がマウスにおいてのライム病抗原に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はOspAおよびOspBをコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例9に記載されているプラスミドpOspA.Bでワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびOspAおよびOspB蛋白質投与動物である。
実施例34
DNA構築物がマウスにおいてのヒトT細胞受容体変異領域に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験はT細胞リンパ腫およびT細胞仲介自己免疫疾患のようなT細胞由来蛋白質付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はRasをコードするDNAでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例5に記載されているプラスミドpBa.Vα3でワクチン接種された。
実施例35
プラスミドpM160はHIVのenv部分からの一つまたはそれ以上の遺伝子の発現に有用ないくつかのプラスミドの出発材料として使用できる。pM160の構築は前に説明されている。プラスミドはgp160、tatおよびrevコード領域を包含している。nef遺伝子は欠落している。
プロモーター制御gp160/tat/rev遺伝子発現はMMTV LTRである。プロモーターは欠損させられ、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター,HIV LTRプロモーターおよびCMVプロモーターで置き換えられている。
アンピシリン耐性を与える遺伝子は欠損されているか、さもなくば不活性化されている。ネオマイシン耐性を与える遺伝子は細菌プロモーターの制御下に置かれている。
ラウス肉腫ウイルスエンハンサーはプラスミドから欠落されているであろう。RSVエンハンサーは筋肉クレアチンエンハンサーと置き換えられているであろう。
gp160/tat/rev遺伝子は異なった読み枠の同一のヌクレオチド配列に重複しおよび共有している。rev遺伝子はその開始コドンを異なったコドンに変化させることにより欠落されているであろう。同様に、tat遺伝子も同じ手段により除去されているであろう。gp160/tat/rev制御にHIV LTRプロモーターを使用しているものを除いて各々のプラスミドにおいてretかまたはtatまたはretおよびtatの両方が除去されているであろう。HIV LTRプロモーターを使用しているプラスミドにおいては、tatは存在していなければならない。
下記の表はpM160修飾プラスミドを掲げている。各々のプラスミドは不活性化アンピシリン遺伝子を持っている。いくつかはエンハンサーを持っていず(ナシ);いくつかは筋肉クレアチンエンハンサー(CME)を持っている。いくつかはHIVrev遺伝子を持っているが(アリ)、他のものでは欠落している(ナシ)。いくつかはHIVtat遺伝子を持っているが(アリ)、他のものでは欠落している(ナシ)。
RA−29からRA−56の構築物はRA−1からRA−32と各々同じであるが、ただし各々の場合においてネオマイシン遺伝子を制御しているプロモーターは細菌プロモーターである。
実施例36
プラスミドpNLpuroはHIVgag/pol遺伝子を発現するいくつかの異なったプラスミド製造の出発材料に使用されるであろう。前に説明したように、pNLpuroはgag pol発現のために構築される。プラスミドpNLpuroΔvpr(前に記載されている)はワクチン接種により導入されるべき遺伝子の組から必須の制御蛋白質を除去するためにHIVgag polベクターからvpr制御遺伝子が欠落するように設計されている。vprに加えて、標準的分子生物学技術および広く入手可能な出発材料を用いて、当業者はプラスミドpNL43puroに他の変化を与えるであろう。
HIV配列のヒト隣接配列5’および3’はいくつかの方法で除去できる。例えば、PCRを用いてHIV、SV40−puroおよびpUC18配列が増幅され再構築できる。
ウイルスのパッケージングに重要であるHIVのpsi領域がpNL43puroに基づくプラスミドから欠損できる。psi領域を欠損させるためには、pNL43puroをSacIおよびSpeIで切断する。この消化はpsi領域ならずpsiの下流にあるgag/polの上流にあり、その一部である5’LTRも除去する。欠損した非psi配列を再挿入するため、PCR増幅が実施されこれらの配列を再生する。プライマーはpsiを再生する事なくHIV配列5’および3’からpsiの部分を再生するように設計されている。プライマーは5’LTRのプラスミド5’の部分にSacI部位を再形成させる。SacI部位の上流の部位から5’末端のすぐ3’部位へ下がるプライマーは3’末端にAatI部位を発生させている。
psi領域のちょうど5’から出発するプライマーもまたAatI部位を発生させ、およびSpeIの3’から出発してもその部位を再生する。PCR発生断片をSacI、AatIおよびSpeIで消化し、SacI/SpeI消化pNLpuro−psiと一緒に連結した。HIV 5’LTRプロモーターを欠落でき、Moloneyウイルスプロモーター、MMTV LTR、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーターおよびCMVプロモータで置換できる。
HIV 3’アデニル化部位を欠落でき、SV40アデニル化部位で置換できる。
アンピシリン耐性を与える遺伝子は欠落させるか、さもなくば不活性化される。
以下のものはHIVpsiおよびvpr領域が欠落されており、およびHIV配列のヒト隣接領域5’および3’が欠落されている。
構築物LA−17からLA−32はLA−1からLA−16と同一であるが、ただし各々には少なくとも一つのヒト隣接配列が残っている。
実施例37
env遺伝子を発現するための別の構築物において、HIVのその領域は商業的に入手可能なプラスミドpCEP4(Invitrogen)内へ導入されるであろう。pCEP4はエプスタイン バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原EBNA−1コード領域を含んでいるので特に有用である。pCEP4はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。HIVenvコード領域はCMVプロモーターおよびSV40ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。HIVenvコード領域はHIV/3Bから2.3kbPCR断片として得られた(Genebank配列K03455)。得られたpCEP4に基づいたプラスミド、pRA−100、は染色体外に維持され、gp160蛋白質を産生する。
実施例38
env遺伝子を発現するための別の構築物において、HIVのその領域は商業的に入手可能なプラスミドpREP4(Invitrogen)内へ導入されるであろう。pCEP4はエプスタイン バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原EBNA−1コード領域を含んでいるので特に有用である。pREP4はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。HIVenvコード領域はRSVプロモーターおよびSV40ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。HIVenvコード領域はHIV/3Bから2.3kbPCR断片として得られた(Genebank配列K03455)。得られたpCEP4に基づいたプラスミド、pRA−101、は染色体外に維持され、gp160蛋白質を産生する。
実施例39
gag/pol遺伝子を発現するための別の構築物において、HIVのその領域は商業的に入手可能なプラスミドpCEP4(Invitrogen)内へ導入されるであろう。pCEP4はエプスタイン バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原EBNA−1コード領域を含んでいるので特に有用である。pCEP4はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。HIVgag/polコード領域はCMVプロモーターおよびSV40ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。HIVgag/polコード領域はHIV MNから得られ(Genebank配列KI7449)、vif遺伝子を含んでいる。vpr遺伝子は含まれていない。得られたpCEP4に基づいたプラスミド、pLA−100、は染色体外に維持され、GAG55、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼ蛋白質を産生する。
実施例40
gag/pol遺伝子を発現するための別の構築物において、HIVのその領域は商業的に入手可能なプラスミドpREP4(Invitrogen)内へ導入されるであろう。pREP4はエプスタイン バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原EBNA−1コード領域を含んでいるので特に有用である。pREP4はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。HIVgag/polコード領域はCMVプロモーターおよびSV40ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。HIVgag/polコード領域はHIV MNから得られ(Genebank配列KI7449)、vif遺伝子を含んでいる。vpr遺伝子は含まれていない。得られたpREP4に基づいたプラスミド、pLA−101、は染色体外に維持され、GAG55、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼ蛋白質を産生する。
実施例41
構築に続いて、ここでpGAGPOL.revと称されるものがHIVgag/polの発現に有用である。
本プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子およびDNA複製のpBR322起点を含んでいる。転写制御に提供された配列は:サイトメガロウイルス、プロモーター;ラウス肉腫ウイルスエンハンサー;およびSV40ポリアデニル化シグナルを含んでいる。pGAGPOL.rev内のHIV−1配列はgag転写解読枠のp17、p24およびp15をコードしている配列;プロテアーゼをコードしている配列;ちいさな欠損を持つ逆転写酵素をコードしている配列およびpol転写解読枠のインテグラーゼの不活性アミノ末端をコードしている配列;およびrevをコードしている配列を含んでいる。HIV配列の各々はHIV−1株HXB2から誘導される。
pGAGPOL.revにいくつかの安全措置が含まれている。これらにはCMVプロモーターおよび非レトロウイルスポリ(A)部位の使用が含まれる。さらに、φ配列の欠損はウイルスRNAパッケージの能力を制限する。さらに、逆転写酵素の多数の突然変異は酵素的に不活性な生成物を産生させる。さらに、インテグラーゼの大きな欠落により不活性な生成物を与え、カナマイシン耐性マーカーは細菌形質転換体の安定化に使用される。
プラスミドpGAGPOL.revは以下のように構築される。
工程1. Bluescript(Stratagene)内へクローン化されているHIV−1ゲノムの一部のサブクローン(HXB2)が使用された。HIV−1のサブクローンは完全5’LTRおよびヌクレオチド5795(Genebank番号付け)までのHIV−1ゲノムの一部を含んでいる。HIV−1配列はHXB2Dプラスミド(AIDS Repository)から得られた。
工程2. HXB2Dプラスミド(AIDS Repository)転写解読枠からのgagのPCR部分。PCR断片をNotIおよびSpeIで切断し、NotIおよびSpeIで制限分解した前記のHIV−1サブクローンに連結する。
工程3. プライマー配列ID番号:15および配列ID番号:16でPCRgag/polおよびHXB2Dプラスミド(AIDS Repository)からのpolコード配列の一部を結合。PCR生成物をClaIで切断し一緒に連結。連結した断片をBclIおよびSalIで切断し、BclIおよびSalIで消化された工程2からのプラスミドと連結。
工程4. 工程3からのプラスミドをBspMIおよびEcoRIで切断し、アニーリングリンカー配列ID番号:17および配列ID番号:18から形成されたアダプターと再連結。
工程5. 工程4からのプラスミドをNotIおよびSalIで切断し、pENV(下記)にために書かれた記述の4aかまたは4bからのプラスミドと連結。NotIおよびSalIでまた切断。
工程6. 工程5からのプラスミドをSalIおよびMluIで制限分解し、プライマー配列ID番号:19および配列ID番号:20でrevのPCRにより得られたPCR生成物と連結。
工程7. 工程6からのプラスミドをNotIで切断し、プライマー配列ID番号:21および配列ID番号:22でHXB2Dプラスミド(AIDS Repository)のrev応答性要素のPCRで得られた生成物と連結。
工程6および7は随意である。
実施例42
構築に続いて、ここでpENVと称されるものがHIVenvの発現に有用である。
本プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子およびDNA複製のpBR322起点を含んでいる。転写制御に提供された配列は:サイトメガロウイルス プロモーター;ラウス肉腫ウイルスエンハンサー;およびSV40ポリアデニル化シグナルを含んでいる。pENV内のHIV−1配列はvpuをコードしている配列;revをコードしている配列;gp160をコードしている配列;nefの59%をコードしている配列;vifをコードしている配列;および13のアミノ酸カルボキシ末端が欠落したvprをコードしている配列を含んでいる。vpu、rev、gp160およびnef配列はHIV−1株MNから誘導される。vifおよびvpr配列はHIV−1株HXB2から誘導される。
pGAGPOL.revにいくつかの安全措置が含まれている。これらにはCMVプロモーターおよび非レトロウイルスポリ(A)部位の使用が含まれる。さらに、tatは欠落しており,nefの50%欠落は”不活性”nef生成物が産生される。さらに、vifおよびvprは正常配列外に置かれており、vprの部分的欠落は不活性vpr生成物をさらに確かにしている。
プラスミドpENVは以下のように構築された。
工程1. HindIIIおよびEcoRIで消化したpUC18から出発。ColE1複製起点を含む得られた断片は我々の肉腫ウイルスエンハンサーを含むpMAMneoBlueからのEcoRI/HindIII断片と連結されなければならない。得られたプラスミドまたはClontech(Palo Alto,CA)からのpMAMneo−BlueはHindIIIおよびBglIで消化できる。常法を用いてgeneblokプラスミド(Pharmacia)のPCRにより得られたkan遺伝子を含む断片と連結。
工程2. もし、pMAMneo−Blueを出発プラスミドとして使用した場合、MluIおよびEcoRIで消化し、ポリメラーゼIのクレノー断片で末端を充填し、再連結。
工程3. pMAMneo−BlueまたはpUC18由来プラスミドを持つそれらをHindIIIで消化し、プライマー配列ID番号:23および配列ID番号:24でSV40ポリA部位およびpCEP4(Invitrogen,San Diego CA)のPCRにより得られた初期スプライシング領域を連結。
工程4a. BamHIで消化し、プライマー配列ID番号:25および配列ID番号:26でpCEP4(Invitrogen,San Diego CA)のPCRにより得られたCMVプロモーターと連結。
工程4b. BamHIで消化し、プライマー配列ID番号:27および配列ID番号:28でPCRにより得られたMoMLV LTRと連結。
工程5. NotIおよびMluIで消化し、プライマー配列ID番号:29および配列ID番号:30でpMN−ST1のPCRにより得られたgp160コード領域と連結。
工程6. MluIで消化し、プライマー配列ID番号:31および配列ID番号:32でvif(完全な形で)およびHXB2Dプラスミド(AIDS Repository)のCPRにより13aaカルボキシ末端が欠落したvprをコードする配列と連結。
実施例43
以下のものからなる免疫処置システムが提供される:
等張で、医薬として受容可能な溶液に溶解された約100μgのpGAGPOL.revを含む医薬組成物;および
等張で、医薬として受容可能な溶液に溶解された約100μgのpENVを含む医薬組成物。
さらに、免疫処置システムは好適には等張医薬担体中に約1mlの0.5%ブピバカイン−HClおよび0.1%のメチルパラベンを含む医薬組成物を含んでいる。
そのような好適な免疫処置システムにおいて、投与の最初の組が実施され、それではブピバカインおよび二つの医薬組成物の一つが個体に投与される(好適には腕または尻の筋肉内に)。ブピバカインおよび二つの医薬組成物の他のものは個体の異なった部位に投与される(好適には先の医薬組成物の投与部位から離れた部位に、好適には腕または尻の筋肉内に)。続いての組の投与は時間をおいて実施されるであろう(好適には48時間から2週間またはそれより後に)。
免疫治療で個体をHIV感染から防護するために、またはHIV感染個体の治療のため、個体のワクチン接種に本免疫処置システムが使用される。
実施例44
いくつかの実施態様において、本発明は単一接種物投与によりHIVに対して個体を免疫処置する方法に関している。この接種物は少なくとも一つの、好適には二つの、より好適には二つより多くのまたは多数のHIVウイルスの遺伝子またはすべての構造遺伝子を含む遺伝子構築物を含んでいる。しかしながら、接種物はすべてのHIV遺伝子の完全補体を含んではいない。もし一つの細胞にウイルス遺伝子の完全な補体が提供されたら、細胞内で完全な感染性ウイルスを組み立てる事が可能である。したがって、本発明に従った遺伝子構築物はそのような遺伝子の全補体を提供しない。安全措置として、一つまたはそれ以上の必須遺伝子を欠損でき、または感染性ウイルス粒子が形成されないことをさらに確かにするため意図的に変換されている。
本発明のいくつかの実施態様において、一つ、二つまたはすべてのHIV構造遺伝子の少なくとも一部が提供される。HIV構造遺伝子はgag、polおよびenvからなっている。これらの三つの遺伝子の少なくとも一つの一部が遺伝子構築物上に提供される。従って、いくつかの実施態様において、gagおよびpolの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され;いくつかの実施態様において、envの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され;いくつかの実施態様において、gagの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され;いくつかの実施態様において、polおよびenvの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され;いくつかの実施態様において、gagおよびenvの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され;いくつかの実施態様において、polの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供される。随意に、全遺伝子が提供される。随意に、これらの遺伝子構築物において、HIV制御遺伝子もまた存在するであろう。HIV制御遺伝子はvpr、vif、vpu、nef、tatおよびrevである。
実施例45
ここで使用される術語”発現ユニット”とは作動可能なようにポリアデニル化シグナルに連結され、作動可能なようにコード配列に連結されたプロモーターを含む核酸配列を示す事を意味している。コード配列は一つまたはそれ以上の蛋白質またはその断片をコードしているであろう。好適な実施態様において、発現ユニットはプラスミド内に存在する。ここで使用される術語”HIV発現ユニット”とは作動可能なようにポリアデニル化シグナルに連結され、作動可能なようにコード配列に連結されたプロモーターを含む核酸配列を示す事を意味しており、ここでコード配列はHIV蛋白質上に観察されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む配列をコードしている。”実質的に同じであるエピトープ”とはHIV蛋白質のエピトープと同一でない構造を持ってはいるが、それでもなおHIV蛋白質と交差反応を起こす細胞性または体液性免疫応答を引き起こすものである。好適な実施態様において、HIV発現ユニットは一つまたはそれ以上のHIV蛋白質またはその断片をコードしているコード配列を含んでいる。好適な実施態様において、HIV発現ユニットはプラスミド内に存在する。
本発明のいくつかの実施態様において、一つまたはそれ以上のHIV蛋白質またはその断片をコードしているDNA配列を含む単一HIV発現ユニットを持つ単一遺伝子構築物が提供される。ここで使用される術語”単一HIV発現ユニット構築物”とは、単一HIV発現ユニットを含む単一遺伝子構築物を示す事を意味している。好適な実施態様において、単一HIV発現ユニットはプラスミド内に存在する。
本発明のいくつかの実施態様において、単一遺伝子構築物は一つより多くのHIV発現ユニットを持つものとして提供され、ここで各々が一つまたはそれ以上のHIV蛋白質またはその断片をコードしているDNA配列を含んでいる。ここで使用される術語”多HIV発現ユニット遺伝子構築物”とは、一つまたはそれ以上のHIV発現ユニットを含む単一プラスミドを示す事を意味している。好適な実施態様において、多HIV発現ユニット構築物はプラスミドの形である。
本発明のいくつかの実施態様において、二遺伝子構築物は二つのHIV発現ユニットを持つものとして提供され、ここで各々が一つまたはそれ以上のHIV蛋白質またはその断片をコードしているDNA配列を含んでいる。ここで使用される術語”二HIV発現ユニット遺伝子構築物”とは、二つのHIV発現ユニットを含む単一プラスミドを示す事を意味している;すなわち、二つのHIV発現ユニット遺伝子構築物を含む多HIV発現ユニット遺伝子構築物。二HIV発現ユニット遺伝子構築物において、一つのHIV発現ユニット遺伝子構築物が他のHIV発現ユニットの反対の方向に働くものが好適である。好適な実施態様において、二HIV発現ユニット構築物はプラスミドの形である。
本発明のいくつかの実施態様において、HIV遺伝子ワクチンは単一遺伝子構築物を含むものとして提供される。単一遺伝子構築物は単一HIV発現ユニット遺伝子構築物、二HIV発現ユニット遺伝子構築物または二つより多くのHIV発現ユニットを含む多HIV発現ユニット遺伝子構築物であろう。
本発明のいくつかの実施態様において、一つより多くの接種物中、一つより多くの遺伝子構築物を含んだHIV遺伝子ワクチンが提供される。ここで使用される術語”多接種物”とは、一つより多くの遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンを示す事を意味しており、その各々は別々に投与される。
本発明のいくつかの実施態様において、二つの遺伝子構築物を含んだHIV遺伝子ワクチンが提供される。各々の遺伝子構築物は独立して、単一HIV発現ユニット遺伝子構築物、二HIV発現ユニット遺伝子構築物または二つより多くのHIV発現ユニットを含む多HIV発現ユニット遺伝子構築物であろう。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は単一HIV発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は二HIV発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は多HIV発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、一つの遺伝子構築物は単一HIV発現ユニット遺伝子構築物であり、他方は二HIV発現ユニット遺伝子構築物である。当業者は遺伝子ワクチンに使用された遺伝子構築物の数および各々の遺伝子構築物に存在するであろうHIV発現ユニットの数に依存して多くの変法を認識および評価するであろう。
本発明の遺伝子構築物はある種のHIV配列(特にそれが導入された細胞の染色体物質内へのHIVゲノムの取り込みに役割を果たすような)を含まないことが望まれる。本発明の遺伝子構築物はHIVからのLTRを含まないことが望まれる。同様に、本発明の遺伝子構築物はHIVからのpsi部位を含まないことが望まれる。さらに、逆転写酵素遺伝子が欠失されており、インテグラーゼ遺伝子が欠失されていることが望まれる。遺伝子を本質的に欠失させるため、コドンのいくつかのみの欠失またはコドンのいくつかを置換することが欠失に含まれる。例えば、ヌクレオチド配列を不完全および非機能的なものにするため開始コドンを欠失させるか、変化させるかまたは読み枠外に移行させる。
また本発明の遺伝子構築物はHIVからの転写可能tat遺伝子を含まないことも望まれる。tat遺伝子(rev遺伝子と重複している)はrevをコードしているコドンを他のコドン(revのために同一のアミノ酸をコードしているが、tatがコードされている読み枠内に必要とされるtatアミノ酸をコードしていない)に置換することにより完全に欠失される。もしくは、tatの開始コドンを変化させ(すなわち、本質的な欠失)および/または不完全および非機能的tatをコードするヌクレオチド配列を生じるような十分な変化(すなわち、本質的な欠失)をさせるため、いくつかのコドンが転換される。
遺伝子構築物は、HIVgag、pol、envまたはrev蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含むことが望まれる。遺伝子構築物は、HIV gag、pol、envまたはrev蛋白質またはその断片の少なくとも一つをコードするコード配列を含むことがより望まれる。遺伝子構築物はHIV gag、pol、envまたはrev蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである一つより多いエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含むことが望まれる。遺伝子構築物はHIV gag、pol、envまたはrev蛋白質またはその断片を一つより多くコードするコード配列を含むことがより望まれる。
いくつかの実施態様において、遺伝子構築物はHIV vif、vpr、vpuまたはnef蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含んでいる。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物はHIV vif、vpr、vpuまたはnef蛋白質またはその断片の少なくとも一つをコードするコード配列を含んでいる。
単一HIV発現ユニット遺伝子構築物は、HIV蛋白質またはその断片の少なくとも一つを共有する一つまたはそれ以上のペプチドのためのコード領域を、単一のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下に単一の発現ユニットに含んでいるであろう。遺伝子構築物が一つより多いHIV蛋白質またはその断片をコードしていることが望ましい。プロモーターはヒト細胞中で機能的であるプロモーターである。プロモーターはSV40プロモーターまたはCMVプロモーター(好適にはCMV前初期プロモーター)であるのが望ましい。ポリアデニル化シグナルはヒト細胞中で機能的であるポリアデニル化シグナルであろう。ポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナル(好適にはSV40副ポリアデニル化シグナル)が望ましい。一つより多くのコード領域が単一発現ユニットに提供された場合、それらはお互いにすぐ隣接してしているか、または非コード領域で分離されているであろう。適切に発現されるために、コード領域は開始コドンおよび停止コドンを持たなければならない。
二HIV発現ユニット遺伝子構築物は、二つの各々の発現ユニット上、HIV蛋白質またはその断片と少なくとも一つのエピトープを共有する一つまたはそれ以上のペプチドのためのコード領域を含んでいる。各々の発現ユニットは単一のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下にある。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物は一つより多いHIV蛋白質またはその断片をコードしていることが好適である。いくつかの実施態様において、gagおよびpolをコードしているヌクレオチド配列が一つの発現ユニットに存在し、envおよびrevをコードしているヌクレオチド配列が別の発現ユニットに存在することが好適である。プロモーターはSV40プロモーターまたはCMVプロモーター(好適にはCMV前初期プロモーター)であるのが望ましい。ポリアデニル化シグナルはヒト細胞中で機能的であるポリアデニル化シグナルであろう。ポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナル(好適にはSV40副ポリアデニル化シグナル)が望ましい。一つより多くのコード領域が単一発現ユニットに提供された場合、それらはお互いにすぐ隣接してしているか、または非コード領域で分離されているであろう。適切に発現されるために、コード領域は開始コドンおよび停止コドンを持たなければならない。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、envのMHCクラスII交差反応性エピトープが欠失されておりHIVIIからの類似の領域に置き換えられている。
遺伝子構築物がgagおよび/またはpolを含む場合、一般的にrevもまた存在することが重要である。revに加えて、これらの遺伝子の発現を増加させるためにrev応答要素がgagおよびpolと共に提供されるであろう。
遺伝子構築物が製造される場合、プラスミド1に使用されるenv遺伝子はMN、またはMNに似ている臨床単離物を含むMN様単離物から誘導されるのが好適である(好適には融合細胞を誘導しない臨床単離物、マクロファージ熱帯型初期段階臨床単離物であるもの)。
単一発現ユニットから変質スプライシングにより多数の蛋白質が産生されるであろう。スプライシングシグナルが提供され、tpが変質スプライシングを可能にし、異なった蛋白質をコードしている異なったメッセージが産生される。
実施例46
図8は四つのバックボーンA、B、CおよびDを示している。図9は四つの挿入物1、2、3および4を示している。挿入物1はgagおよびpolの発現をささえ;rev応答要素はHIVスプライスアクセプターを保存する様式でクローン化された。挿入物2はgagおよびpolの発現をささえるのは挿入物1と同じであるが、HIVスプライスアクセプターを保存することなくrev応答要素がクローン化された。挿入物3はgagおよびpolの発現をささえ、インテグラーゼ遺伝子の欠失を含んでいるがシス作用性rev応答要素が存在しない。挿入物4はrev、vpuおよびenvの発現をささえる。envは交差反応性を除去するように改造されたMHCクラスいい交差反応性エピトープを持っているであろうし、融合細胞形成の可能性を除去するためV3ループが改造されているであろう。
いくつかの実施態様において、バックボーンAは挿入物1と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpAlori+は挿入物1およびSV40複製起点を含むバックボーンAである。プラスミドpAlori−は挿入物1を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンAである。さらに、pA1ori+またはpA1ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pA1ori+int+およびpA1ori−int+が得られる。プラスミドpA1ori+、pA1ori−、pA1ori+int+およびpA1ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pA1ori+RT−、pA1ori−RT−、pA1ori+int+RT−およびpA1ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンAは挿入物2と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpA2ori+は挿入物2およびSV40複製起点を含むバックボーンAである。プラスミドpA2ori−は挿入物2を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンAである。さらに、pA2ori+またはpA2ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pA2ori+int+およびpA2ori−int+が得られる。プラスミドpA2ori+、pA2ori−、pA2ori+int+およびpA2ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pA2ori+RT−、pA2ori−RT−、pA2ori+int+RT−およびpA2ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンBは挿入物1と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpBlori+は挿入物1およびSV40複製起点を含むバックボーンBである。プラスミドpBlori−は挿入物1を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンBである。さらに、pB1ori+またはpB1ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pB1ori+int+およびpB1ori−int+が得られる。プラスミドpB1ori+、pB1ori−、pB1ori+int+およびpB1ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pB1ori+RT−、pB1ori−RT−、pB1ori+int+RT−およびpB1ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンBは挿入物2と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpB2ori+は挿入物2およびSV40複製起点を含むバックボーンBである。プラスミドpB2ori−は挿入物2を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンBである。さらに、pB2ori+またはpB2ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pB2ori+int+およびpB2ori−int+が得られる。プラスミドpB2ori+、pB2ori−、pB2ori+int+およびpB2ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pB2ori+RT−、pB2ori−RT−、pB2ori+int+RT−およびpB2ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、revを除いたバックボーンAが挿入物3と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpA/r−3ori+は挿入物3およびSV40複製起点を含むrevを除いたバックボーンAである。プラスミドpA/r−3ori−は挿入物3を含むがSV40複製起点は含まれていないrevを除いたバックボーンAである。さらに、pA/r−3ori+またはpA/r−3ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pA/r−3ori+int+およびpA/r−3ori−int+が得られる。プラスミドpA/r−3ori+、pA/r−3ori−、pA/r−3ori+int+およびpA/r−31ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pA/r−3ori+RT−、pA/r−3ori−RT−、pA/r−3ori+int+RT−およびpA/r−3ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンCは挿入物1と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpClori+は挿入物1およびSV40複製起点を含むバックボーンCである。プラスミドpClori−は挿入物1を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンCである。さらに、pC1ori+またはpC1ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pC1ori+int+およびpC1ori−int+が得られる。プラスミドpC1ori+、pC1ori−、pC1ori+int+およびpC1ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pC1ori+RT−、pC1ori−RT−、pC1ori+int+RT−およびpC1ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンCは挿入物2と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpC2ori+は挿入物2およびSV40複製起点を含むバックボーンCである。プラスミドpC2ori−は挿入物2を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンCである。さらに、pC2ori+またはpC2ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pC2ori+int+およびpC2ori−int+が得られる。プラスミドpC2ori+、pC2ori−、pC2ori+int+およびpC2ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pC2ori+RT−、pC2ori−RT−、pC2ori+int+RT−およびpC2ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンCは挿入物3と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpC3ori+は挿入物3およびSV40複製起点を含むバックボーンCである。プラスミドpC3ori−は挿入物3を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンCである。さらに、pC3ori+またはpC3ori−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々pC3ori+int+およびpC3ori−int+が得られる。プラスミドpC3ori+、pC3ori−、pC3ori+int+およびpC3ori−int+は逆転写酵素(RT)遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々pC3ori+RT−、pC3ori−RT−、pC3ori+int+RT−およびpC3ori−int+RT−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンDは挿入物4と使用される。そのような構築物は随意に、SV40複製起点を含んでいる。プラスミドpD4ori+は挿入物4およびSV40複製起点を含むバックボーンDである。プラスミドpD4ori−は挿入物4を含むがSV40複製起点は含まれていないバックボーンDである。
実施例47
いくつかの実施態様において、HIVタンパク質のエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より構築される単一発現ユニット/単一接種体遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はCMV即時初期プロモーターとSV40マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。
いくつかの実施態様において、少なくとも一つのHIVタンパク質またはその断片をコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より成る単一発現ユニット/単一接種遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はCMV即時早期プロモーターとSV40マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。HIVタンパク質はgag、pol、envとrevより構築されたグループから選択される。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも二つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードする配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも三つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードする配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片をコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。
いくつかの実施態様において、それぞれがHIVタンパク質のエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列より成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物を構成する二つの発現ユニット/単一接種体遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はCMV即時初期プロモーターとSV40マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。二つの発現ユニットはそれぞれ他と反対方向にコードされる。
いくつかの実施態様において、それぞれが少なくとも一つのHIVタンパク質またはその断片をコードするコード配列より成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る二つの発現ユニット/単一の接種遺伝子ワクチンが提供される。それぞれの発現ユニットはCMV即時早期プロモーターとSV40マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。HIVタンパク質はgag、pol、envとrevより構築されたグループから選択される。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも二つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る、そして他はgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも一つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが提供せれることが望ましい。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも三つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る、そして他はgag,pol,envとrevまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも一つのHIVタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが提供せれることが望ましい。いくつかの実施態様においてgag,pol,envとrevまたはそれらの断片をコードしたコード配列を含有し、二つの発現ユニットより成る遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが望ましい。
実施例48
遺伝子構築物、プラスミドpCMN160Δ16は抗−HIV医薬キットまたは医薬組成物として使用するために作製される。pCMN160
16は下記のように構築される:
工程1:プライマー配列ID番号:35と配列ID番号:34はHIV/MNゲノムDNAからのPCR断片を用いる。
工程2:プライマー配列ID番号:33と配列ID番号:36はHIV/MNゲノムDNAからのPCR断片を用いる。
工程3:プライマー配列ID番号:35と配列ID番号:36は工程1と工程2からの2μlの反応物を組み合わせる。
工程4:工程3からの反応産物はNot1とMlu1で切断し、Not1とMlu1で切断した実施例46に記述したバックボーンAに挿入する。
プラスミドpCMN160Δ16はこのようにバックボーンAに挿入された、rev領域とHIV−2に変化したHLA−DB領域を含有するnefの半分を持つMN株ENVタンパク質をコードするコード領域を含有して生成される。
実施例49
プラスミドpGAGPOL.rev2は下記のように作製される。最初にバックボーンが作製される。次にHIV gagとpolを持つ挿入体を生成しバックボーンに挿入する。
バックボーンは下記のように調製される。
工程1。pMAMneo(Clonetech)をBgl1で切断する。ポリメラーゼIのクレノー断片により充填する。HindIIIにより切断する。1763bp断片をゲルで精製する。
工程2。KanR遺伝子をオリゴ配列ID番号:37と配列ID番号:38とともに、プラスミドpJ4Ωkan+(Pharmacia Inc.から得られたカナマイシン耐性遺伝子が、Imperial Cancer Research Fund UKより贈与されて得られたpJ4Ωにクローニングされたもの、すなわちpJ4ΩはもともとMorgensternとLandによって構築、報告された。Morgenstern,J.P.,andH.Land,Nucl,Acids Res.18(4):1068、ここに引例として包含されている)から増幅する。PCR産物を平滑末端化する。HindIIIにより切断する。PCR断片をゲル精製する。
工程3。工程1に記述されたpMAMneoから作製したベクターバックボーンと工程2に記述されたKanR遺伝子をコードしているPCR産物とを連結する。KanR遺伝子と細菌の複製開始点とを含んだプラスミドを単離する。
工程4。得られたプラスミドをMluIにて消化し、DNAポリメラーゼのKlenow断片で充填する。SacIIのリンカー(New England Biolabs)と連結する。
工程5。工程4で得たプラスミドをAseIとSspIとで消化する。
工程6。工程3に記述されたプラスミドからのKanR遺伝子の部分とプライマー配列ID番号:39および配列ID番号:40とを用いてPCRを行う。PCR産物をSspIとAseIとで切断する。
工程7。工程5で得られた最大の断片と、工程6で得られたPCR産物とを連結する。
工程8。工程7で得られた連結産物/プラスミドをHindIIIで切断する。DNAポリメラーゼIのKlenow断片で平滑末端かする。
工程9。pCEP4(Invitrogen)をSalIで切断して、CMVプロモーター、ポリリンカー、そしてSV40ポリA部位を含むDNA断片を取り出す。この断片を精製し、DNAポリメラーゼIのKlenow断片で平滑末端化する。
工程10。工程8で得られたプラスミドと工程9で得られた断片を連結する。細菌の複製開始点、KanR遺伝子、RSVエンハンサー、CMVプロモーター、ポリリンカー、そしてSV40ポリA部位を含んだプラスミドを単離する。
工程11。工程10で得られたプラスミドをBamHIとNheIとで切断する。
工程12。オリゴヌクレオチド配列ID番号:41と配列ID番号:42とをアニーリングさせる。
工程13。工程10で得られたプラスミドと工程12で得られたアニーリングされたオリゴヌクレオチドとを連結する。工程12で含まれたアダプターを包含するプラスミドを単離する。
工程14。工程13で得られたプラスミドをSalIとMluIとで消化する。
工程15.rev 転写解読枠を、BBG35(RD Systems Inc.minneapolis,MN;pUC19におけるHIV株であるHX3Bからのrevのコード領域を含む)を鋳型として用いて、プライマー配列ID番号:43と配列ID番号:44とともにPCR増幅する。
工程16:工程14で得られたプラスミドと工程15で産生されたPCR産物とを連結する。revコード領域を含んだプラスミドを単離する。gag/pol挿入物を準備する。
工程1。Bluescript(Stratagene)の中にクローニングされたHIV−I(HXB2)ゲノムの部分のサブクローン。完全な5’LTRとHIV−1ゲノムの残りの部分からヌクレオチド5795(ジーンバンク番号)までを含むHIV−1のサブクローンを、BluescriptのXbaIとSalI制限酵素切断部位にクローニングする。HIV−1の配列はHXB2Dプラスミド(AIDS Repository)から得られた。
工程2。工程1において記述された、プラスミドの転写解読枠からgagコード領域の部分(BluescriptにクローニングされたHIV−1 HXB2の部分のサブクローン)ををプライマー配列ID番号:45とID番号:46を用いてPCR増幅する。
工程3。工程1で記述されたプラスミド(BluescriptにクローニングされたHIV−1 HXB2の部分のバックボーン)をEcoRIで消化する。pBluescriptバックボーン,5’HIV−1 LTR、gagコード領域,そしてpolコード領域の部分を含んだプラスミドを消化し、再結合する。
工程4。工程3で得られたプラスミドをNotIとSpeIで切断し、Not1とSpeIで消化された工程2に記述されたPCR断片に連結する。もともとは5’HIV−1 LTRを含んでいたNotI/SpeI断片の代わりに、PCR断片を含有したプラスミドを単離する。
工程5。工程4で得られたプラスミドをEcoR1とSalIとで消化する。工程6。オリゴヌクレオチド配列ID番号:47と配列ID番号:48とをアニールする。
工程7。工程5で得られたプラスミドを工程6で得られたアダプターを用いて連結する。EcoRI/SalI制限酵素部位へクローニングされたアダプターを含んだプラスミドを単離する。
工程8。工程7で得られたプラスミドをNdeIとEcoRIとで消化する。
工程9。プライマー配列ID番号:49と配列ID番号:50を用いて、HIV−1株HXB2からのRRE配列を含んだプラスミドから、配列決定Rev応答要素(RRE)をPCR増幅する。
工程10。工程8で得られたプラスミドと工程9で得られたPCR産物を連結させる。RRE配列を含む挿入物を含有したプラスミドを単離する。
工程11。工程10で得られたプラスミドをNotIとSalIとで消化し、gagコード領域、修飾polコード領域、そしてRRE配列を含んだ断片を単離する。
工程12。NotIとSalIで、上記のバックボーン調製のための方法の工程16で得られたプラスミドを消化する。
工程13。工程12で得られたプラスミドと工程11で得られた挿入物とを連結する。gagコード領域、修飾polコード領域、RRE配列を持つ挿入物を含んだプラスミドを単離する。
工程14。工程13で得られたプラスミドをXbaIとNheIとで消化し、平滑末端化し、再連結させる。工程13で得られたプラスミドにおいて、XbaIとNheIとの間に存在するKpnI切断部位を欠いたプラスミドを単離する。
工程15。工程14で得られたプラスミドをKpnIで消化し、最大の断片を単離する。
工程16。オリゴヌクレオチド配列ID番号:51と配列ID番号:52とをアニーリングさせる。
工程17。工程15で得られた精製されたプラスミド断片と工程16で得られたアダプターとを連結する。工程15で得られたプラスミドのKpnI切断部位に挿入されたアダプターを含んでいるプラスミドを単離する。
実施例50 調節タンパク質に対する遺伝子での遺伝子免疫処置
HIVを攻撃する上での困難さはウイルスの異常な可変性であり、そして新しい形に素早く変異する能力によるものである。概して人間の集団において発見されたHIV単離体間でかなりのタンパク質配列の変異があるだけではなく、ウイルスはあまりに素早く変異するため全てのHIV感染者が実際に多くの関連したHIVの小変異体を保持する。そのようなHIV単離体は複製効率や趨勢、無毒化に対する感受性、薬物耐性に差異を示す。薬物耐性変異体が出現すると薬物療法の有効性が色あせてしまう。AZTでは薬物耐性は一年の治療期間内に特徴的に増大する。この逃避変異体が絶えず生成されることはウイルスが制御されているように見える長い期間の後宿主の防御をついには乗り越えるHIVの能力の原因であろう。
この変異の動きはもっとも重要な中性領域であるV3ループを含むgp120エンベロープ糖タンパク質の種々の領域、及びHIVのコアタンパク質において報告されている。HIV調節タンパク質は構造タンパク質よりもより保存性が高く長く変異の動きが鈍い。そのため調節タンパク質は抗ウイルス攻撃の魅力的な標的である。
HIVは調節タンパク質と構造タンパク質の発現の顕著な時間的調節を受けていることが示されている。ウイルスの複製の早期においてはTatおよびRev,NefをコードするmRNAが優勢を占めているが、後期においてはGagやPol,Env前駆体、多くのアクセサリータンパク質を含む構造タンパク質をコードするmRNAの大きな発現が起こる。この早期から後期へのシフトはRevタンパク質があるレベルに達すると起こる。ウイルスの複製サイクルの早期でのTatおよびRev、Nefの優勢はこれらのタンパク質を抗ウイルス攻撃の好ましい標的とする。このことは特にtatとrevで顕著であり、それらはHIV遺伝子発現の転写と翻訳後調節において絶対的に必須な役割を演じ、ウイルスの複製サイクルの早期、ウイルスの構造タンパク質の転写と感染ウイルス粒子生成の前に優勢を占める。
HIV複製に必須の役割を明確に演じるtatやrevと対照的に、nefやvpr,vif,vpuのような調節タンパク質はときどき”アクセサリー”タンパク質として言及される。これらの機能はあまりよくは理解されておらず、特別の機能の消失により減少するウイルス複製の程度は著しく変動し、感染した宿主細胞に依存する。にもかかわらず、他の霊長類の免疫不全症ウイルスと同様に、種々の異なったHIV単離体の間でもそのような機能が強く保存されていることは自然の感染過程においてこれらの”アクセサリー”機能の重要性を示唆している。(Terwillinger,E.F.(1992)AIDS Research Reviews 2:3−27、W.C.Koff,F.Wong−Staal、and R.C.Kennedy,eds.(New York:Marcel Dekker,Inc.).実際,vprまたはnef、vifを欠除した霊長類の組み換えウイルスがインビボで非感染性であることはウイルスの生活環におけるこれらのアクセサリー遺伝子の重要性を開示する。
HIV遺伝子全体よりも、いくつかの調節タンパク質および/または酵素タンパク質を選択的に存在させることによりHIVに対するより高いレベルで、より防御的な免疫応答が達成される証拠がある。したがって、tatやrev,vpr,nef,vpu,vifを含む一つまたはそれ以上の調節、非構造HIVタンパク質のコード配列を用いて遺伝子免疫処置を含む焦点を捉えた免疫処置戦略が望ましい。vprのみがウイルス粒子に付着していることが見いだされており、他のtatやrev,nef、vif、vpuを含む調節タンパク質はウイルス粒子付着ではない。
いくつかの調節遺伝子を用いたHIVに対する遺伝子免疫処置の実施例において、tatやrev,nef、vif、vpu遺伝子のうち一つまたはそれ以上は実施例46に記述したバックボーンAに挿入される。tatおよび/またはrevを用いるのが望ましい。いくつかの実施例においては、tatまたはrevが実施例46に記述したバックボーンAに挿入される。いくつかの実施例においては、望ましさは劣るが標的としてnef,vpr、vif,vpuを用いる。tatとrev;tatとrev、nef;tatとrev,nef、vpr;tatとrev,nef、vpr,vif;tatとrev、nef,vpr,vif,vpu;および、tevのような他の調節遺伝子も含め、それらの組み合わせを含む一つ以上の調節遺伝子を用いることが望ましい。
Tatタンパク質はLTR方向の遺伝子発現のトランスアクチベーターである。それはHIV複製にとって絶対的に必須である。Tatはウイルスの複製の初期に生成され、機能を持つTatはGagやPol,Env,Vprの発現に必要である。Tatの主な形体は二つのエクソンmRNA由来の86アミノ酸タンパク質である。アミノ末端58アミノ酸はトランスアクチベーションに十分であるが、活性は低下する。Tatはtarと言及されるcisに働く配列に働きLTR起動の遺伝子発現の劇的な増大を生じる.Tatは一部ではRNA合成を通して働き、また一部ではRNA転写物あたりに合成されるタンパク質の量の増大によって働く。最近まで、TatはHIV−1 LTR上でのみ働くと考えられていた。しかし、JCウイルス後期プロモーターからのTat活性化発現も報告されてきた。Tatは外来因子として細胞増殖を促進し、HIv感染患者のKaposi肉腫の増殖を促進する上で重要な役割を演じているかもしれない。HIV感染および非感染者にそのような潜在的に有害な作用のため遺伝子免疫処置に用いるtat構築物は非機能的なTatを発現するよう修飾することが望ましい。TatまたはRevを不活性化する変異はトランスドミナントの変異として働きそれによってHIV感染者で生成されるすべての機能的なTatを潜在的に不活性化する。
Revはういるすの複製に必須な第二のHIVの調節タンパク質である。それは種々の多数スプライスされたmRNAに見られる二つのコードエクソンより発現される19kD(116アミノ酸)である。転写物を含むRRE(Rev応答要素)に結合する塩基性領域と、結合体のような転写物の核移行を誘発する活性ドメインの二つの異なるドメインが同定されている。自然のウイルス感染ではRevはVprとともにHIV構造タンパク質GagおよびPol,Envの発現に必要である。
Vprは、多くのウイルス株で細胞培養での度重なる継代によって著しく転写解読枠が切り詰められるが、多くのHIV−1株で15kD(96アミノ酸)のタンパク質である。vprの転写解読枠はHIV−2や多くのSIV単離体においても存在する。VprはHIVウイルス粒子に付着して見いだされた初めてのレトロウイルス調節タンパク質である。そのHIVウイルス粒子での存在はウイルスの複製サイクルの初期の点で機能を果たしていることを示唆する。VprはHIVの複製を、特に感染の初期に促進する。VprはHIV LTRへ連関したレポーター遺伝子の発現を約3倍増大させた。さらに、VprとTatはLTR連関遺伝子に関して相乗的に働くようである。VprはHIV感染者の血清から単離でき、ウイルスの新しい細胞に感染する能力を増大させるようである。Vprは細胞増殖を阻害し細胞分化を誘発することが見いだされている(Levy,D.N.et al.,Cell(1993)72:1−20)、そして初代培養の単球/マクロファージは分化が進行しているときのみインビトロで感染できるという報告は重要な発見かも知れない(Schitemaker,H.et al.,(1992)J.Clin.Invest.89:1154−1160)。HIV複製を支持できない細胞でもVprの影響で脱調節される。VprはAIDS患者に頻繁に見られる筋肉の消耗に関与しているかも知れない。Vprの潜在的に有害な活性から遺伝子免疫処置は好ましくは非機能的Vprタンパク質を発現する修飾されたvpr構築物で遂行するべきである。
Nef(古い文献では3’orfと呼ばれていた)は25−27kDのタンパク質である。NefはCD4+Tリンパ球のダウンレギュレーションに関与することが示唆されている。加えて、Nefは細胞の信号伝達に役割を演じているようだ。NefはインビボでのHIV感染の成立に重要である。Nefに特異的なCTLはインビボでのHIV感染を制御する上で重要であると信じられている。
Vifはウイルス感染性因子と呼ばれている23kDの細胞質タンパク質である。Vif欠除変異ウイルスは細胞−細胞の移行に関して緩和されるわけではないが、多くのCD4+細胞株の感染を顕著に減少させることが開示されている。Vifなしではウイルスの発芽と感染性が減少する。霊長類の研究によれば、Vifの欠除変異体はインビボでの感染の成立の能力が顕著に減少することが示される。これらの研究は宿主におけるウイルス複製におけるVifの臨床上の役割を支持する。
Vpuは15−20kD(81アミノ酸)のタンパク質である。Vpu(+)とVpu(−)ウイルスは同量のウイルスタンパク質を生成するが、こうしゃは細胞内でのウイルスタンパク質の蓄積と細胞外のウイルスの減少を示す。これはVpuがウイルスの粒子の組立および/または遊離に関与することを示唆する。
ネズミおよびトリウイルスのような単純なレトロウイルスはHIV−1やHIV−2、SIV調節タンパク質に類似のタンパク質を欠いている。そのような動物ではレトロウイルスの感染はウイルスの除去と病原性の低下に伴い自己限定的になる傾向がある。同様にTax(Tatのように働きVpr様の活性を示す)およびRex(Revのように働く)を含むHTLV−1は多くの個体で除去される。調節遺伝子による遺伝子免疫処置はHIVに対してだけではなくHBV(X遺伝子産物)とHCV、HTLV−1(Tax)と(Rex)のようなウイルスに対しても重要であると考えられる。これらのすべてのウイルスにおいて調節遺伝子はウイルスの生活環と感染の成立に重要な役割を演じていると信じられる。
実施例51 HIV−1調節プラスミド、pREGの構築
pPREGプラスミドは段階的に構築され、それぞれの中間体は構築を続行する前にタンパク質発現の試験を行うことができる。tatとrevの発現を支持する発現ベクターは二つの工程を通して構築される。最初は5’NheI部位とHIV−1主要スプライス受容部位、tatコード領域の大部分、revタンパク質アミノ末端領域をコードする領域、AvaII部位を含む増幅産物を合成鋳型より増幅する。この合成鋳型はGenBank Databaseより得たひV−1のHXB2の発表された配列を用い、tatタンパク質の22と30位のシステイン残基を変異させて作製された。これらの変異でtatは非機能的となる(Kuppuswamy,et al.(1989)Nucleic Acids Research 17(9):3551−3561)。
PCR産物はNheIとAvaIIで消化され、カナマイシン耐性遺伝子とpBR322の複製開始点を含有するベクターに連結させる。加えて、このプラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターとラウス肉腫ウイルスエンハンサー、revコード領域、SV40ポリアデニル化信号を含有する。プラスミドに存在するrev配列はHIV−1 IIIBのプロウイルスのクローンから由来した。これは完全な、しかし変異したtatコード領域と完全なrevコード領域を含有する発現ベクターを生成する。
続く工程は5’末端にAvaII部位をそして、revの81番目のアミノ酸に変異を、revの約30%のコード領域、nefの約30%のコード領域、3’末端にMluI部位を含有するPCR産物の生成のために遂行される。81番目のアミノ酸変化はrevの機能を消失することが示されており、そのため、得られるプラスミドは非機能性revタンパク質の生成するようになる(Bogard,H.and Greene,W.C.(1993)J.Virol.67(5):2496−2502)。nefコード領域の大きな欠除は非機能的nefタンパク質の生成を起こすであろう。5’AvaII部位とrevタンパク質の81番アミノ酸の変異はAvaII部位と81アミノ酸をコードするヌクレオチドの両者を含むrevのコード領域に相補的な5’プライマー上に導入される。Nefの終了を起こす63番アミノ酸の終止コドンと3’コード クローン部位3’PCRプライマーによって導入される。このPCR増幅のための鋳型はHIV−1のMN株からのrevとnefのコード領域を含有するプラスミドまたは合成鋳型である。得られたPCR産物はAvaIIとMluIで消化し、前パラグラフに記述されたtat−revプラスミドをAvaIIとMluIで消化した後に生成される小さなAvaII−MluI断片と交換する。
vprを随意、プラスミドの二つの部位の一つに加えることもできる。一つの方法としてはvpr翻訳開始コドンに至る配列の上流のMluI部位を含む5’PCRプライマーとvpr終了コドンとやはりMlu1クローニング部位を含み、それと接する配列に相補的な3’PCRプライマーを用いてvprを増幅することができる。開始コドンの上流配列はスプライス受容体を含む。PCR産物はMluIで消化し、上述したようにMluIで消化したtat rev nefプラスミドに挿入することができる。
あるいはまた、vprの増幅を他の類似した方法で行うこともでき、PCRプライマーは他のベクターへのクローニングに適した制限酵素部位を含有させ、それによって、第二の有核細胞のプロモーターの制御の下に発現される。第二のプロモーター、続いてvprコード領域そしてポリA配列を含有する、このプラスミドより由来するカセットはカセットに接する制限酵素で消化することにより遊離することができるが、その中では切断しない。得られたDNA断片はtat rev vprの発現のために必要な領域の外側に存在する、tat,rev、vprプラスミドの独自の部位にクローニングする。このようにして二つの発現ユニットを持つプラスミドが作製される。
実施例52 HCVとHTLV−1プラスミドの構築
同様な方法はウイルスの生活環および/またはこれらのウイルスの調節タンパク質に必要な酵素機能を持つHTLV−1またはHCVを発現するプラスミドを生成するために用いることができる。HTLV−1のために調節タンパク質,Taxをコードするプラスミドはプラスミドバックボーンと上述したものと同様なクローニング戦略を用いて生成される。そのような酵素タンパク質をコードしたHCV遺伝子はRNA依存RNAポリメラーゼやヘリカーゼ/プロテアーゼ機能を持つタンパク質を含有する。必要な配列は公表され,GenBankを通して得られる。HTLV−1とHCVのウイルスの構成はそれぞれCann,A.J.and Chen、I.S.Y.Virology 2nd Edition、edited by B.N.Fidder,Raven Press,Ltd.,New York,1990 andBradley,D.W.Transfusion Medicine Reviews,1(2):93−102、1992に包含される。
実施例53 酵素遺伝子での遺伝子免疫処置
HIV pol遺伝子のような酵素機能を持つタンパク質をコードする遺伝子での遺伝子免疫処置は、polのような酵素が生ウイルスの生成に必要であることから、重要な抗ウイルス戦略となる。ポリメラーゼまたはその組成が欠除すればHIVは非病原性で非感染性である。同様にHBVポリメラーゼのような他のういるすの酵素
遺伝子も遺伝子免疫処置の魅力的な標的である。Radziwill et al.,Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product:ドメイン構造とRnase H活性、J.Virol.64(2):613−620(1990)参照。
免疫標的としてのウイルス酵素が魅力ある一つの理由は、そのような酵素はそれらのアミノ酸配列を変異させて、しかも酵素機能を保持するには限界があるということである。例えば、PolはHIV−1ではAZTのようなヌクレオチドアナログへの抵抗性に付随した”回避”変異は少ないことが示されている。しかし、薬物回避変異体においてもタンパク質内に極めて多くの免疫の標的が保持されている。
実施例54 HBVポリメラーゼプラスミドの構築
本明細書に報告した実験はHBVポリメラーゼ発現がmRNA分子にコアとポリメラーゼの両者の転写解読枠が存在するときに組織培養細胞にて達成される。この条件においてコアATGの変異はポリメラーゼ発現へ影響しないことが示されている。
HBVゲノムはADW HBV株の頭部−尾部二量体を含有するペプチドから増幅される。コアではなくポリメラーゼのみの発現が望ましいことから、5’PCRプライマーはプレコアとコアの翻訳開始コドンが変異するようにデザインされた。さらに、このプライマーは複製−競合HBVゲノムRNAの生成の可能性を除去するために変異DRI配列も導入された。このPCR産物はカナマイシン耐性遺伝子とpBR322の複製開始点を含有するプラスミドに挿入された。さらに、このプラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターおよびラウス肉腫ウイルスエンハンサー、SV40ポリアデニル化信号を含有する。表面抗原とXコード領域産物に対する翻訳開始コドンはHBSとX遺伝子産物の発現を阻止するために変異されている。
HBVポリメラーゼの発現を達成するための他の方法によれば、ポリメラーゼ全コード領域をコードするPCR産物はカナマイシン耐性遺伝子とpBR322の複製開始点を含有するベクターにクローンされ増幅される。さらに、このプラスミドはサイトメガロウイルスおよびラウス肉腫ウイルスエンハンサー、SV40ポリアデニル化信号を含有する。この増幅物に対する5’PCRプライマーはクローニング部位を含有し、ポリメラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンに渡る。3’PCR産物は発現ベクターへ挿入物のクローニングのための制限酵素部位を含有し、HBVポリメラーゼ遺伝子の典型的な終止コドンとこの終止コドンに接する配列に相補正がある。このPCRさんぶつをカナマイシン耐性遺伝子とpBR322の複製開始点、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、SV40ポリアデニル化信号を含有するプラスミドに連結させた後、Hepatitis B表面抗原とX遺伝子の翻訳開始コドンはこれらの遺伝子産物の発現を抑制させるために変異させている。しかし、上記の戦略と同様の他のものも使用されるが、本実施例での3’プライマーはHBVポリA信号と、この信号に接する配列を含有する。この3’プライマーはHBVポリA信号を含有および/または、囲んだ配列が発現のために重要である場合に用いられる。変異の解析から、HBVポリメラーゼ遺伝子産物の機能は特定のヌクレオチドの変化により除去されることが示されている(Radziwell、G.et al.(1990)J.Virol.64(2):613−620)。上記のように構築されたプラスミドを使用する前に、これらの変異のうちの一つまたは類似の変異を導入することにより発現するポリメラーゼを変異することができる。
実施例55
顆粒球−マクロファージ コロニー促進因子(MG−CSF)は好中球、単球/マクロファージ、エオジン好性細胞を含む種々の細胞系譜への促進効果を示す。GM−CSFの効果は魅力的な治療モデルを与える。GC−CSFはFDAにより自家骨髄移植での使用を認可されており、種々のニュウトロペニアの処置における効力試験が開始されている。現在、GM−CSFは通常されている多回服用により投薬される必要があるタンパク質として投薬される。タンパク質では生産し、そして生成しなければならない。
他のGM−CSFタンパク質の使用法としてはbupiワクチンの投与の助けを借りてGM−CSFをコードした遺伝子を含む遺伝子構築物の直接投与によるものである。遺伝子構築物はシグナル配列を含むGM−CSF遺伝子のPCRにより構築される。遺伝子構築物はカナマイシン耐性遺伝子(アミノグリコシド3’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子)および、細菌の複製開始点、実施例46におけるバックボーンとして記述されたベクターに導入されるプラスミドが細胞の中でGM−CSFのコード領域の発現が支持される配列を含有することが望ましい。プラスミドはbupiワクチンに付随して細胞の複製により誘導される哺乳類の複製開始点を含有することが望ましい。もしEBV複製開始点を用いた場合、核抗原EBNA−1をコードする配列が適切な調節配列とともに含有される。挿入物のPCR増幅のためのプライマーは発現ベクターにクローニングができるように制限酵素部位を含有し、GM−CSFのコード配列の5’と3’末端に相補的である。PCR反応はLee et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:4360−4364に記述されているようにcDNAクローンを用いて遂行する。
実施例56
慢性骨髄性白血病(CML)はPhiladelphia染色体;染色体9と22間の転座に起因する染色体異常に付随した血液幹細胞のクローン骨髄増殖異常である。染色体22の切断点は切断点クラスター領域(BCR)と呼ばれる6kbに集まっている。一方、染色体9の切断点はc−abl エクソン2の上流90kbに渡って散在する。種々の9:22転座はK28転座とL6転座の二つに分類することができる。bcr−abl転座を通しての転写は融合mRNAの生成を生じる。bcr−abl結合点のmRNAへ標的となるアンチセンスはCML患者から得られた血液細胞のコロニー形成を阻害することが示されている。
アンチセンスをコードした遺伝子構築物はCML患者の細胞にエクスビボにbupiワクチンとともに投与する。処置した細胞は患者に再び導入される。
実施例57
HBVに対する医薬キットとワクチンの構成物に有効な遺伝子構築物は実施例46におけるバックボーンとして記述されたベクターで構築される。プラスミドはHBV構造遺伝子、特にHBVの表面抗原および/またはHBVのコア抗原および/またはHBV前コア抗原をコードする遺伝子を含有する。
実施例58
HCVに対する医薬キットとワクチンの構成物に有効な遺伝子構築物は実施例46におけるバックボーンとして記述されたベクターで構築される。プラスミドはHCV構造遺伝子、特にHCVのコア抗原および/またはHCVエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含有する。
実施例59
遺伝子構築物pREVは唯一の標的タンパク質としてHIV revをコードしたヌクレオチド配列を含有するように作製された。revのコード配列はpUC19においてHIVのHX3B株からのrevのコード領域を含むBBG35から実施例46に記述したバックボーンにクローニングされる。
gagKanR
【配列表】
配列番号1:
(i)配列の特性:
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(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
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配列番号2:
(i)配列の特性:
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配列番号3:
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配列番号7:
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配列番号8:
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(i)配列の特性:
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(i)配列の特性:
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(i)配列の特性:
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(i)配列の特性:
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(i)配列の特性:
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(ii)配列の種類:DNA
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配列番号52:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:29塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直線状
(ii)配列の種類:DNA
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Claims (46)
- ヒト以外の個体の細胞内に遺伝物質を導入する方法であって、
a)個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ;
b)個体の細胞に核酸分子を投与する
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まないことおよびポリヌクレオチド機能促進剤がブピバカインであることを特徴とする方法。 - 核酸分子が、蛋白質をコードしかつ作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む、請求項第1項記載の方法。
- 核酸分子が、それに対する免疫応答が望まれる抗原のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている、請求項第1項記載の方法。
- 病原体に対してヒト以外の個体を免疫処置する方法であって、
a)個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインとを接触させ;
b)個体の細胞に、病原体抗原のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与するが、但しヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている;
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつヌクレオチド配列は細胞中で発現されうることを特徴とする方法。 - 核酸分子がDNA分子である、請求項第4項記載の方法。
- 蛋白質が病原体抗原またはその断片である、請求項第4項記載の方法。
- 核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第4項記載の方法。
- 病原体が、ヒト免疫不全ウイルス、HIV;ヒトT細胞白血病ウイルス、HTLV;インフルエンザウイルス;A型肝炎ウイルス、HAV;B型肝炎ウイルス、HBV;C型肝炎ウイルス、HCV;ヒト乳頭腫ウイルス、HPV;単純ヘルペス1ウイルス、HSV1;単純ヘルペス2ウイルス、HSV2;サイトメガロウイルス、CMV;エプスタインバールウイルス、EBV;ライノウイルス;およびコロナウイルスからなる群より選択されるウイルスである、請求項第4項記載の方法。
- 病原体がHIVであり、核酸分子がHIV蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第4項記載の方法。
- 病原体がHIVであり、核酸分子が2つ以上のHIV構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第4項記載の方法。
- 病原体がHIVであり、核酸分子が2つ以上のHIV制御蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第4項記載の方法。
- 少なくとも二つまたはそれ以上の異なる核酸分子が個体の異なる細胞に投与され、異なる核酸分子は各々同じ病原体の一つまたはそれ以上の病原体抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第4項記載の方法。
- ポリヌクレオチド機能促進剤および核酸分子が同時に投与される、請求項第4項記載の方法。
- 病原体が免疫不全ウイルスであり;
核酸分子がDNAであり、psiを欠失したHIV構造蛋白質gagおよびpolをコードするDNA配列を含み、但しgagおよびpolをコードするDNA配列がラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されている、請求項第4項記載の方法。 - DNA配列がさらにHIVのrev応答要素を含み、そしてHIVインテグラーゼが欠損している、請求項第14項記載の方法。
- DNA配列がさらにHIVスプライスアクセプターを含む、請求項第15項記載の方法。
- DNA分子がさらにSV40プロモーター、SV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIVのrevをさらに含む配列をコードするDNA配列を含む、請求項第14項記載の方法。
- revをコードするDNA配列がさらにHIVのvpuおよびHIVのenvをコードする、請求項第17項記載の方法。
- gagおよびpolをコードするDNA配列がさらにHIVのrev応答要素を含み、かつHIVインテグラーゼを欠失している、請求項第17項記載の方法。
- gagおよびpolをコードするDNA配列がさらにHIVスプライスアクセプターを含む、請求項第19項記載の方法。
- 病原体が免疫不全ウイルスであり;
核酸分子がDNAであり、かつラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIV構造蛋白質rev,vpuおよびenvをコードするDNA配列を含む、請求項第4項記載の方法。 - 病原体が免疫不全ウイルスであり;
二つの異なるDNA分子が個体の異なる細胞に投与され;
核酸分子の一方がDNAであり、psiを欠失したHIV構造蛋白質gagおよびpolをコードするDNA配列を含み、但しgagおよびpolをコードするDNA配列がラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されており;
核酸分子の他方がDNAであり、かつラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIV構造蛋白質rev,vpuおよびenvをコードするDNA配列を含む、請求項第4項記載の方法。 - 疾患に対してヒト以外の個体を免疫処置する方法であって、
a)個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインとを接触させ;
b)個体の細胞に、作動可能なように制御配列に連結され、該疾患を特徴付ける細胞と関連する蛋白質のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する;
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつ細胞中で発現されうることを特徴とする方法。 - 疾患が過増殖性細胞により特徴付けられる、請求項第23項記載の方法。
- 疾患が自己免疫疾患である、請求項第23項記載の方法。
- 核酸分子がDNA分子である、請求項第23項記載の方法。
- 核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第23項記載の方法。
- 核酸分子が、癌遺伝子myb,myc,fyn,ras,sarc,neuおよびtrkの蛋白質生成物;転座遺伝子bcl/ablの蛋白質生成物;P53;EGRF;B細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域;およびT細胞リンパ腫のT細胞受容体の可変領域からなる群より選択される標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第23項記載の方法。
- 蛋白質がB細胞介在自己免疫疾患に関与する抗体の可変領域;およびT細胞介在自己免疫疾患に関与するT細胞受容体の可変領域からなる群より選択される、請求項第23項記載の方法。
- 医薬免疫処置キットであって、
a)i)医薬として受容可能な担体または希釈剤;および
ii)作動可能なように制御遺伝子に連結され、少なくとも一つのHIV蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸分子;但し該ヌクレオチド配列はヒト細胞中で発現されることが可能である;
を含む第一の接種物;
b)i)医薬として受容可能な担体または希釈剤;および
ii)作動可能なように制御遺伝子に連結され、少なくとも一つのHIV蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸分子;但し該ヌクレオチド配列はヒト細胞中で発現されることが可能である;
を含む第二の接種物;および
c)ブピバカインを含む第三の接種物
を含み、第一の核酸分子は第二の核酸分子と同一ではないことを特徴とするキット。 - 第一の核酸分子および第二の核酸分子が、合わせてHIV蛋白質gag,polおよびenvをコードする、請求項第30項記載の医薬キット。
- a)psiを欠失したHIV構造蛋白質gagおよびpolをコードするDNA配列を含むDNA分子、但しgagおよびpolをコードするDNA配列はラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されている;および
b)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン
を含む医薬組成物。 - DNA配列がさらにHIVのrev応答要素を含み、HIVインテグラーゼを欠失している、請求項第32項記載の医薬組成物。
- DNA配列がさらにHIVスプライスアクセプターを含む請求項第32項記載の医薬組成物。
- DNA分子がSV40プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIVのrevをさらに含む配列をコードするDNA配列をさらに含む、請求項第32項記載の医薬組成物。
- revをコードするDNA配列がさらにHIVのvpuおよびHIVのenvをコードする、請求項第35項記載の医薬組成物。
- gagおよびpolをコードするDNA配列がさらにHIVのrev応答要素を含み、HIVインテグラーゼを欠失している、請求項第36項記載の医薬組成物。
- gagおよびpolをコードするDNA配列がさらにHIVスプライスアクセプターを含む、請求項第36項記載の医薬組成物。
- a)ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIV構造蛋白質rev,vpuおよびenvをコードするDNA配列を含むDNA分子;および
b)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン
を含む医薬組成物。 - a)i)psiを欠失したHIV構造蛋白質gagおよびpolをコードするDNA配列を含むDNA分子を含み、但しgagおよびpolをコードするDNA配列はラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されている第一の医薬組成物、および
ii)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン;
を含む第一の接種物;および
b)i)ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびSV40マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にSV40複製開始点に作動可能なように連結されているHIV蛋白質rev,vpuおよびenvをコードするDNA配列を含むDNA分子を含む第二の医薬組成物;および
ii)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン;
を含む第二の接種物
を含む医薬免疫処置キット。 - 疾患を有すると疑われるヒト以外の個体を処置する方法であって、
a)個体の細胞をポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインと接触させ;
b)個体の細胞に、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質または個体に治療効果を生じさせることになる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与するが、但し該ヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている;
の工程を含み、核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつ細胞中で発現されることが可能なことを特徴とする方法。 - 核酸分子がDNA分子である、請求項第41項記載の方法。
- 核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第41項記載の方法。
- 核酸分子が、酵素、構造蛋白質、サイトカイン、リンホカインおよび増殖因子からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第41項記載の方法。
- i)病原体抗原のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質;過増殖性細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む蛋白質;自己免疫疾患を特徴付ける細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同一であるエピトープを含む蛋白質;個体において、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質;および個体に治療効果を生み出す蛋白質からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子;および
ii)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン;
を含み、レトロウイルス粒子を含まないことを特徴とする医薬組成物。 - i)病原体抗原のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質;過増殖性細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む蛋白質;自己免疫疾患を特徴付ける細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同一であるエピトープを含む蛋白質;個体において、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質;および個体に治療効果を生み出す蛋白質からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む容器;および
ii)ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインを含む容器;
を含み、レトロウイルス粒子を含まないことを特徴とする医薬キット。
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