KR100328195B1 - 유전자물질전달용조성물및전달방법 - Google Patents
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Abstract
개체의 세포에 유전자 물질을 도입하는 방법 및 그 방법을 실시하기 위한 조성물 및 키트가 개시되어 있다. 이 방법은 개체의 세포와 폴리뉴클레오티드 기능 강화제를 접촉시키는 단계 및 그 세포에 레트로바이러스 입자가 없는 핵산 분자를 투여하는 단계로 이루어진다. 그 핵산 분자는 병원체 항원 또는 과증식성 또는 자기 면역 질환을 앓고 있는 항원의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질, 또는 결여되거나, 비기능적이거나 또는 부분적으로 기능하는 유전자로 인해 개체로부터 결어된 다른 단백질, 또는 개체에 대해 치료 효과를 나타내는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. HIV에 대해 개체를 예방학적 또는 치료학적으로 면역시키는 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 제약 조성물 및 키트도 개시되어 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 개체의 세포에 유전자 물질을 도입하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 면역화를 위한 단백질 표적 및 치료 단백질을 코딩하는 유전자 물질을 포함한 보호 및(또는) 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다.
발명의 배경
정상적인, 기능적 유전자를 생존 동물에 직접 도입하는 방법은 결함이 있는 유전 정보를 대체하기 위한 수단으로서 연구되어 왔다. 몇몇 연구에서는 DNA를 바이러스 입자 또는 다른 감염 벡터를 사용하지 않고 생존 동물의 세포에 직접 도입하였다. 네이벨 등의 문헌[Nabel. E.G., et al., (1990) Science 249: 1285-1288]에서는 마우스에서 동맥벽에 직접 전달된 베타-갈락토시다제 유전자의 생체내에서의 부위 특이적 유전자 발현에 대해 개시하고 있다. 울프 등의 문헌[Wolfe, J.A. et al., (1990) Science 247: 1465-1468]에서는 생체내에서 마우스 근육에 직접 전달된 각종 리포터 유전자의 발현에 대해 개시하고 있다. 아크사디 등의 문헌 [Acsadi G., et al., (1991) Nature 352: 815-818]에는 DNA 구조물의 근육내 주사후에 마우스에서의 인간 디스트로핀 유전자의 발현에 대해 개시하고 있다. 울프 등의 문헌[Wolfe, J. A. et al., (1991) BioTechniques 11(4): 474-485]에서는 생체내에서 설치류 근육으로의 유전자 직접 전달에 영향을 미치는 조건에 대해 기재하고 있다. 펠그너 및 로데스의 문헌[Felgner, P.L. and G. Rhodes, (1991) Nature 349: 351-352]에서는 정제된 유전자를, 레트로바이러스를 사용하지 않고 생체내에서 약제로서 직접 전달하는 것에 대해 기재하고 있다.
항병원체 백신 접종법의 대체법으로서 유전자를 직접 전달하는 방법이 제안되어 있다. 1회 주사에 의한 직접 유전자 전달을 이용하는 것이 HIV에 대한 가능한 백신 접종법으로 제안되어 있다. HIV gp120에 대한 세포 면역 반응은 그것을 코딩하는 플라스미드 DNA를 세포에 도입한 결과 이루어진 것으로 보고되어 있다. PCT 국제 출원 번호 제PCT/US90/01515호 (1990년 10월 4일에 공개됨)는 한 단계 방법으로 개체의 세포에 피막이 없는 폴리뉴클레오티드를 직접 주사함으로써 병원체 감염에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 대해 기재하고 있다. 리포펙틴 이외의 형질 감염제의 사용은 기재된 방법으로부터 특히 제외된다. 접종된 세포의 자극은 개시되지도 제안되지도 않았다. HIV 백신 접종법은 바이러스 단백질 gp120을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것으로 이루어진다. 이 백신의 작동 가능성은 입증된 바 없다.
토마슨 등의 문헌[Thomason, D. B. et al., (1990) Cell Physiol. 27: C578-581] 및 PCT 특허 출원 공개 제WO91/12329호는 레트로바이러스 매개된 유전자 전달 절차의 일부로서 부수체(付隨體) 세포 증식을 유도하기 위하여 근육 세포에 부피바카인을 투여하는 방법이 기재되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 개체의 세포에 유전자 물질을 도입하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 개체의 세포화, 세포에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 하기나 또는 염증 반응을 강화시키는 제제인 것이 바람직한 폴리뉴클레오티드 기능 강화제를 접촉시키는 단계 및 세포에, 목적하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하거나 또는 기능성 핵산 분자에 대한 주형으로서 제공되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자를 투여하는 단계로 이루어진다. 이 핵산 분자는 레트로바이러스 입자를 사용하지 않고 투이된다. 목적하는 단백질은 개체내에서 기능하는 단백질일 수 있거나 또는 그것은 면역 반응에 대한 표적으로서 작용할 수 있다.
본 발명은 병원체에 대해 개체를 면역시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 개체의 세포와, 세포에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 하거나 또는 면역 반응을 강화시키는 제제인 것이 바람직한 폴리뉴클레오티드 기능 강화제를 접촉시키는 단계 및 세포에, 병원체 항원 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하며, 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자를 투여하는 단계로 이루어진다. 이 핵산 분자는 개체의 세포내에서 발현될 수 있다.
본 방법은 HIV에 대해 인간을 면역시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, HIV 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 1종 이상의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 HIV에 대해 인간을 면역시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 2개의 다른 핵산 분자를 인간의 다른 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 각 핵산 분자는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, HIV 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 1종 이상의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 다른 핵산 분자는 각각 다른 1종 이상의 펩티드를 코딩하며 각각 인체 세포에서 발현될 수 있는 다른 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 발명은 과증식성 질환 또는 자기 면역 질환에 대해 개체를 면역시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 개체의 세포에, 각각 과중식성 질환 관련 단백질 또는 자기면역 질환 관련 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하며 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열로 이루이지며, 세포에서 발현될 수 있는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 개체의 세포와, 세포에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 하거나 또는 염증 반응을 강화시키는 제제인 것이 바람직한 폴리뉴클레오티드 기능 강화제를 접촉시키는 단계 및 개체의 세포에, 결함이 있는 유전자 대신에 기능하거나 또는 개체에서 치료 효과를 나타내는 분자를 코딩하고 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어지며 세포에서 발현될 수 있는 핵산 분자를 투여하는 단계로 이루어진다.
본 발명은 핵산 분자 및 폴리뉴클레오티드 기능 강화제로 이루어진 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 핵산 분자를 함유하는 용기 및 폴리뉴클레오티드 기능 강화제를 함유하는 용기로 이루어진 제약 키트에 관한 것이다.
본 발명은 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 및 각각 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 1개 이상의 HIV 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 1종 이상의 펩티드를 코딩하며 인체 세포에서 발현될 수 있는 핵산 분자로 이루어진 예방 및 치료용 HIV 백신에 관한 것이다.
본 발명은 2개의 접종물로 이루어진 예방 및 치료용 HIV 백신에 관한 것이다. 제1 접종물은 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 및 제1 핵산 분자로 이루어진다. 제1 핵산 분자는 각각 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 1개 이상의 HIV 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 1종 이상의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지며 인체 세포에서 발현될 수 있다. 제2 접종물은 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 및 제2 핵산 분자로 이루어진다. 제2 핵산 분자는 각각 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 1개 이상의 HIV 단백질 상에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 에피토프를 적어도 포함하는 1종 이상의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지며 인체 세포에서 발현될 수 있다. 제1 및 제2 핵산 분자는 다르며 다른 펩티드를 코딩한다.
제1A도는 HIV-HXB2 당단백질 gp160을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 플라스미드 pMAMneoBlue (Clonetech)에 삽입함으로써 생성된 플라스미드 pM160의 구조를 나타내는 도면이다.
제1B도는 3G7 세포에서는 gp120 및 gp41을 생성하고 TE671 세포에서는 생성하지 않는 것을 나타내는, pM160 플라스미드로 형질감염된 세포(3G7 세포)와 벡터 만으로 형질감염된 세포(TE671 세포)의 전세포 용해물의 웨스턴 블롯의 방사선 사진이다.
제2도는125I-gp160에 결합한 혈청 항체의 면역침전을 나타내는 방사선 사진이다.
제3A도 내지 3E도는 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 각종 단백질에 대한 다른 혈청의 결합이 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.
제4A도 및 4B도는 항혈청의 연속 희석법으로 예비 인큐베이션시킨 TCID50HIV-1/III8세포 유리 바이러스로 감염시킨 MT-2 세포의 사진이다.
제4C도는 대조 혈청(x = pMAMneoBlue 벡터-면역된 마우스) 및 시험 혈청(o = pM16-면역된 마우스)을 이용한 결과로부터 얻은 희석 인자에 대한 중화값(Vn/Vo)을 예시하는 그래프이다.
제4D도 내지 4G도는 면역된 동물 및 대조 동물로부터 얻은 혈청을 이용한 합포체 억제를 시험하기 위한 실험에서 시용된 H9/III8세포의 사진이다.
제5도는 HIV gp160-표지 및 비표지된 종양 세포로 챌린지된 면역 및 비면역 마우스의 생존 결과를 나타내는 챠트이다. 마우스는 재조합 gp160 단백질, 벡터DNA 단독 또는 gp160을 코딩하는 DNA로 이루어진 재조합 벡터로 면역되었다. SP2/O 종양 세포 또는 SP2/O-gp160 종양 세포(gp160을 코딩하고 gp160을 발현하는 DNA로 형질감염된 SP2/O 세포)는 마우스에 도입되었다.
제6도는 pGAGPOL.rev의 플라스미드 지도이다.
제7도는 pENV의 플라스미드 지도이다.
제8도는 유전자 구조물을 형성하는데 사용된 4개의 골격 A, B, C 및 D를 나타낸다.
제9도는 유전자 구조물을 형성하기 위해 골격에 삽입된 4개의 삽입물 1,2,3 및 4를 나타낸다.
본 발명은 핵산 분자의 고도의 흡수 및 기능을 제공하는 동물 세포에 핵산 분자를 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 바이러스 입자, 특히 레트로 바이러스 입자 없이 핵산 분자를, 염증 반응을 강화시키고 (또는) 조직에서의 핵산 분자의 발현을 강화시키고 (또는) 세포에 의한 핵산 분자의 흡수를 용이하게 하는 동시 투여제와 함께 개체의 세포에 투여하는 단계로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 감염제를 사용하지 않고 핵산 분자를 개체의 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서 세포에 전달되는 핵산 분자는 1) 예방 및(또는) 치료 면역화제로서 기능하는 단백질, 2) 결함이 있거나, 상실되거나 또는 비기능적인 유전자의 대용 카피, 3) 치료 단백질에 대한 유전자 주형, 4) 안티센스 분자에 대한 유전자 주형 또는 5) 리보자임에 대한 유전자 주형으로서 제공된다. 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 경우에, 핵산 분자는 바람직하게는 동물의 세포에서의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 포함한다. 안티센스 분자 및 리보자임에 대한 주형으로서 제공되는 핵산 분자의 경우에, 그러한 핵산 분자는 각각 코딩되는 안티센스 및 리보자임 분자의 충분한 카피 생산에 필요한 조절 요소에 결합되는 것이 바람직하다. 핵산 분자는 레트로바이러스 입자를 함유하지 않으며 바람직하게는 플라스미드의 형태인 DNA로서 제공된다.
동시 투여제는 본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드 기능 강화제" 또는 "PFE"로서도 칭해진다. PFE는 염증 반응을 강화시키고 (또는) 조직에서의 핵산 분자의 발현을 강화시키고 (또는) 세포에 의한 핵산 분자의 흡수를 용이하게 하고 바람직하게는 이들 특성을 1가지 이상 갖는 화합물 또는 조성물이다. 세포에 의한 DNA 및 RNA 흡수를 용이하게 하고 세포 분열 및 복제를 자극하는 폴리뉴클레오티드 기능 강화제는 세포 자극제로서도 칭해진다. 본 발명에 따른 바람직한 동시 투여제는 벤조산 에스테르 및 아닐리드로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 실시태양에서 PFE는 부피바카인이다.
본 발명의 몇가지 측면에 따라서, 병원체 또는 이상, 질환 관련 세포에 대해 개체를 예방 및(또는) 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 유전자 물질은 표적화될 병원체 또는 세포에서 발견되는 면역 단백질과 1개 이상의 에피토프를 공유하는 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 유전자 물질은 개체의 세포에 의해 발현되며 면역 반응이 일어나는 것에 대한 면역원 표적으로서 제공된다. 면역반응은 광범위하며 액소성 면역 반응 이외에 세포 면역 반응의 양체계가 있다. 본 발명의 방법은 예방 및 치료학적 면역성을 제공하는데 유용하다. 따라서, 면역 방법에는 병원체 챌린지, 또는 특이적 세포의 발생 또는 증식으로부터 개체를 보호할 뿐만 아니라 병원체 감염, 과증식성 질환 또는 자기면역 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법이 포함된다.
본 발명은 표적 단백질, 즉 병원체 또는 개체 소유의 "이상" 세포에 특이적으로 관련된 단백질에 대한 광범위한 면역 반응을 일으키는데 유용하다. 본 발명은 병원체 단백질에 대한 면역 반응이 병원체에 대한 보호 면역성을 제공하도록 병원성 약제 및 유기체에 대해 개체를 면역시키는데 유용하다. 본 발명은 과증식성 세포에 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대한 면역 반응을 일으킴으로써 암과 같은 과증식성 질환 및 이상을 방지하는데 유용하다. 본 발명은 자기면역 질환에 관련된 세포에 특이적으로 관련된 표적 단백질에 대한 면역 반응을 일으킴으로써 자기 면역 질환 및 이상을 방지하는데 유용하다.
본 발명의 몇가지 측면은 유전자 요법에 관한 것이다. 즉, 개체 중의 결함이 있거나, 상실되거나, 비기능적이거나 또는 부분적으로 기능하는 유전자에 해당하거나 또는 치료 단백질, 즉 개체 중에 존재함으로써 개체 중의 결여성을 제거하고 (또는) 개체에 대한 치료 효과를 제공함으로써 단백질 투여로부터 얻은 다른 수단에 의해 단백질을 전달하는 수단을 제공하게 될 단백질을 코딩하는 유전자의 외인성 카피의 핵산 분자를 개체의 세포에 도입하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 "목적하는 단백질"이란 용어는 면역 반응을 위한 표적단백질로서 또는 유전자 요법에서 치료 또는 보충 단백질로서 작용하는, 본 발명의 유전자 구조물에 의해 코딩된 펩티드 및 단백질을 의미한다.
본 발명에 따라서, 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는 발현될 개체의 세포에 도입됨으로써 목적하는 단백질을 생산한다. 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는 개체의 세포에서 발현되는데 필요한 조절 요소에 결합된다. DNA 발현을 위한 조절 요소로는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 들 수가 있다. 또한, 코작(Kozak) 영역과 같은 다른 요소도 유전자 구조물에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "유전자 구조물"이란 용어는 목적하는 단백질을 코딩하며 백신 접종된 개체의 세포에서 직접 발현할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는 개시 및 종결 시그날을 포함한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "발현 형태"란 용어는 개체의 세포에 존재한 경우 코딩 서열이 발현되도록 표적 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유한 유전자 구조물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "유전자 백신"이란 용어는 치료 면역 반응을 일으키는데 유용한 제약 제제를 비롯한 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자 제조물을 함유하는 제약 제제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "유전자 치료제"란 용어는 치료 또는 보충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자 제조물을 함유하는 제약 제제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "표적 단백질"이란 용어는 그에 대해서 면역 반응이 일어날 수 있는 단백질을 의미한다. 표적 단백질은 그에 대해 면역화가 요구되는 암세포 또는 자기면역 질환에 관련된 세포와 같은 불필요한 세포형 또는 병원체로부터 얻은 단백질가 1개 이상의 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질이다. 표적 단백질에 대해 직접 일어나는 면역 반응은 표적 단백질과 관련된 특이적 감염 또는 질환으로부터 개체를 보호하고 치료할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "에피토프를 공유하는"이란 용어는 다른 단백질의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "실질적으로 유사한 에피토프"란 용어는 단백질의 에피토프와 동일하지 않은 구조를 갖지만 그럼에도 불구하고 그 단백질과 상호 반응하는 세포 또는 액소성 면역 반응을 일으키는 에피토프를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "치료 단백질"이란 용어는 존재함으로써 개체에 치료 잇점을 부여하는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "보충 단백질"이란 용어는 존재함으로써 상실되거나, 결함이 있거나, 비기능적이거나 또는 부분적으로 기능하는 내인성 유전자로 인해 완전히 기능하는 내인성 생산 단백질의 부재를 보충하는 단백질을 의미한다.
유전자 구조물은 유전자 발현에 필요한 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는, 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 따라서, DNA 또는 RNA 분자를 생존 세포에 삽입하면 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA가 발현되고, 따라서 목적하는 단백질이 생산된다.
세포에 의해 흡수될 경우, 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는, 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자 구조물은 기능하는 염색체외 분자로서 세포에 잔류하거나 또는 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. DNA는 그것이 별개의 유전자 물질로서 잔류하는 세포에 플라스미드 형태로 도입될 수 있다. 또한, 염색체에 통합될 수 있는 직쇄 DNA가 세포에 도입될 수도 있다. DNA를 세포에 도입하는 경우, 염색체로의 DNA 통합을 촉진시키는 약제가 첨가될 수 있다. 통합을 촉진시키는데 유용한 DNA 서열이 DNA 분자에 포함될 수도 있다. 별법으로 RNA가 세포에 투여될 수도 있다. 또한, 센트로머, 텔로머 및 복제 기원을 포함한 직쇄 미니염색체로서 유전자 구조물을 제공하는 것도 예상된다.
목적하는 단백질을 코딩하는 분자는 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 분자는 cDNA, 게놈성 DNA 합성된 DNA 또는 그의 하이브리드 또는 mRNA와 같은 RNA 분자일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "DNA 구조물", "유전자 구조물" 및 "뉴클레오티드 서열"이란 용어는 DNA 및 RNA 분자 모두에 관해 사용된다.
DNA 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소로는 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날을 들 수가 있다. 또한, 인헨서가 유전자 발현에 종종 필요하다. 이러한 조절 요소들은 목적하는 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되고 그들이 투여된 개체에서 작동 가능할 필요가 있다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다. 그러나, 이들 요소는 유전자 구조물이 투여될 개체에서 기능적일 필요가 있다. 개시 및 종결 코돈은 코딩 서열을 가진 프레임내에 있어야 한다.
사용된 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포내에서 기능적이어야 한다.
본 발명을 실시하는데 유용한, 특히 인간을 위한 유전자 백신을 생산하는데 유용한 프로모터의 예로는 시미안 바이러스 40 (SV40), 마우스 유선암 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV 말단 반복 배열 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바아러스(CMV), 예를 들면 CMV 초기 프로모터, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스(EBV), 라우스 가계 육종 바이러스(RSV)로부터 얻은 프로모터 뿐만 아니라 인체 액틴, 인체 미오신, 인체 헤모글로빈, 인체 근육 크레아틴 및 인체 메탈로티오네인과 같은 인체 유전자로부터 얻은 프로모터를 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 실시하는데 유용한, 특히 인간을 위한 유전자 백신을 생산하는데 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날을 들 수가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로서 칭해지는, pCEP4 플라스미드 (Invitrogen사 제품, San Diego, CA 소재)에 있는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 사용된다.
DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에, 다른 요소가 DNA 분자에 함유될 수도 있다. 그러한 추가의 요소로는 인헨서를 들 수가 있다. 인센서는 인체 액틴, 인체미오신, 인체 헤모글로빈, 인체 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV와 같은 바이러스 인헨서로 이루어진 군에서 선택될 수는 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자 구조물은 구조물을 염색체외적으로 유지하고 세포 중에서 구조물의 다중 카피를 생산하기 위해 포유류 복제 기원을 가질 수 있다. 플라스미드 pCEP4 및 pREP4(Invitrogen사 제품, San Diego, CA 소재)는 엡스타인 바르 바이러스 복제 기원, 및 통합 없이 다수의 카피 에피좀 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 사용된 벡터는 실시예 46에 기재된 것으로 부터 선택된다. 유전자 요법에 관한 본 발명의 측면에서, 활성화에 필요한 항원을 비롯한 복제 기원을 가진 구조물이 바람직하다.
면역화 이용에 관한 일부 바람직한 실시태양에서, 유전자 구조물은 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 또한 그러한 표적 단백질에 대한 면역 반응을 강화하는 단백질에 대한 유전자를 포함한다. 그러한 유전자의 예로는 싸이토킨 및 림포킨, 예를 들면 α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12를 코딩하는 것을 들 수가 있다. 일부 실시태양에서는, GM-CSF에 대한 유전자가 조성물을 면역시키는데 사용된 유전자 구조물에 포함되는 것이 바람직하다.
이떠한 이유로 유전자 구조물을 수용하는 세포를 제거할 필요가 있는 경우, 세포 파괴를 위한 표적으로서 제공되는 추가의 요소가 첨가될 수 있다. 발현 형태중의 헤르페스 티미딘 키나제(tk) 유전자가 유전자 구조물에 포함될 수 있다. 약물 강시클로비르는 개체에 투여될 수 있으며, 그 약물은 임의의 세포 생산 tk의 선택적인 사멸을 일으킬 것이며, 따라서 유전자 구조물을 가진 세포의 선택적인 파괴를 위한 수단을 제공한다.
단백질 생산을 최대화하기 위하여, 조절 서열은 구조물이 투여되는 세포에서 유전자 발현하기에 아주 적합한 것으로 선택될 수 있다. 또한, 코돈은 세포에서 가장 효율적으로 전사되는 것으로 선택될 수 있다. 당업계의 통상의 기술을 가진자는 세포에서 기능적인 DNA 구조물을 생산할 수 있다.
발현을 시험하기 위하여, 유전자 구조물은 투여될 것과 동일한 유형의 세포의 조직 배양물을 사용하여 시험관 내에서 발현 정도에 대해 시험될 수가 있다. 예를 들어, 유전자 백신이 인체 근육 세포에 투여되는 경우, 횡문근육종의 고체 근육 종양 세포와 같은 배양물에서 성장하는 근육 세포는 시험관 모델로서 사용되어 발현 정도를 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 유전자 구조물은 레트로바이러스 입자 내에 삽입되지 않는다. 유전자 구조물은 레트로바이러스 입자에 삽입된 레트로바이러스 RNA를 가진 레트로바이러스 입자가 세포를 감염시키는 경우에 일어나는 것과 같은 레트로바이러스 입자 매개된 삽입 없이 세포에 의해 흡수된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "레트로바이러스 입자 없이"란 용어는 레트로바이러스 입자 내에 삽입되지 않는 유전자 구조물을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감염제로부터 분리된"이란 용어는 세포를 감염시킬 수 있는, 활성, 불할성, 생존 또는 사멸된 바이러스, 박테리아 또는 진핵 생물 벡터의 일부가 아닌 유전자 물질을 의미한다.
일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 세포에 도입될 때 유전자 구조물이 감염성 바이러스 입자의 직접적인 생산에 대한 불충분한 유전 정보를 갖도록 하기 위해 완전하지 못한 복제가능한 바이러스 게놈을 구성한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "불완전한 바이러스 게놈"이란 용어는 그러한 유전자 구조물의 세포내 삽입이 감염성 바이러스 생산에 대한 충분한 유전 정보를 도입하지 않도록 하는 불완전한 게놈을 함유하는 유전자 구조물을 의미한다.
일부 실시태양에서, 약독화 바이러스 백신은 바이러스 입자를 생산하도록 하기에 충분한 유전자 물질을 함유하는 유전자 구조물로서 전달될 수 있다. 유전자 구조물로서 약독화 벡신을 전달하는 것은 안전하고 순수한 활성 면역화 생성물을 더욱 용이하게 대량으로 생산하는 방법이다.
유전자 구조물은 미세 분출물을 사용하거나 또는 사용하지 않고 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 구조물은 고상 입자 없이 개개의 세포에 전달될 수 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "고상 입자를 함유하지 않는"이란 문구는 유전자 물질을 도입하는 입구를 세포에 형성하기 위하여 세포의 세포막을 천공하거나, 구멍을 뚫거나 또는 찌르는 수단으로서 사용된 임의의 고상 분출물을 함유하지 않는 액체를 의미한다.
본 발명은 모든 병원체, 예를 들면 바이러스, 원핵 생물 및 병원성 진핵 생물 예를 들면 단세포 병원체 및 다세포 기생충에 대해 개체를 면역시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 바이러스, 및 원핵 생물, 예를 들면 임균(gonorrhoea),리스테리아(listeria) 및 쉬겔라(shigella)와 같은, 세포를 감염시키고 캡슐화되지 않은 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 생활 사이클에 그들이 세포내 병원체인 단계를 포함하는 원생 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 사용될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포내 병원체"란 용어는 그의 재생 또는 생활 사이클의 적어도 일부가 숙주 세포내에 존재하고 그안에 병원성 단백질을 생산하거나 또는 생산하도록 하는 바이러스 또는 병원체를 의미한다. 표 1은 본 발명에 따른 백신이 생산될 수 있는 바이러스 과 및 속의 일부의 목록을 나타낸다. 상기 표에 기록된 항원과 같은 병원체 항원 상에 나타난 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 구조물인 백신에 유용하다. 또한, 본 발명은 또한 표 2에 기록된 것과 같은 원핵 및 진핵 원생 병원체뿐만 아니라 다세포 기생충을 포함한 다른 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 유용하다.
병원체 감염으로부터 보호하는 유전자 백신을 생산하기 위해서는, 그에 대하여 보호 면역 반응이 형성될 수 있는 면역 단백질을 코딩하는 유전자 물질은 유전자 구조물에 포함되어야 한다. 병원체가 세포내적으로 감염시키든 (본 발명이 특히 유용함) 또는 세포외적으로 감염시키든 간에, 모든 병원체 항원은 보호 반응을 일으키기가 쉽지 않을 것이다. DNA 및 RNA가 모두 비교적 작고 비교적 용이하게 생산될 수 있기 때문에, 본 발명은 다수 병원체 항원에 의한 백신화를 가능케 하는 추가의 잇점을 제공한다. 유전자 백신에 사용된 유전자 구조물은 많은 병원체 항원을 코딩하는 유전자 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 바이러스 유전자는 단일구조물에 포함될 수 있으며, 따라서 다중 표적이 형성된다. 또한, 개체 중에 다른 세포를 전달할 수 있는 다중 접종물은 총체적으로 몇몇 경우에서 백신에 완전한, 또는 더욱 바람직하게는 거의 완전한 유전자 세트와 같은 불완전한 유전자 세트를 포함하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 완전한 세트의 바이러스 유전자는 각각 다른 부위에서 투여되는 게놈의 다른 절반을 함유하는 2가지 구조물을 사용하여 투여될 수 있다. 따라서, 면역 반응은 감염성 바이러스가 집합될 위험 없이 각 항원에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이로써 1개 이상의 항원 표적을 도입하는 것이 가능하고 보호 항원이 동정될 필요성을 제거할 수 있다.
DNA 및 RNA는 조작의 용이함 및 저렴성으로 인해 보호 항원을 더욱 효율적으로 스크리닝하는 수단이 된다. 유전자는 단백질 보다 더욱 용이하게 분류될 수 있고 조직적으로 시험될 수 있다. 그로부터 보호하기 위하여 백신이 생산되는 병원성 액제 및 생물이 선택되고 면역성 단백질이 확인된다. 표 1 및 2는 그들에 의한 감염으로부터 개체를 보호하기 위해 유전자 백신이 생산될 수 있는 병원성 약제 및 생물 일부의 목록을 나타낸다. 일부 바람직한 실시태양에서, 병원체에 대해 개체를 면역시키는 방법은 HIV, HTLV 또는 HBV에 대해 기재되어 있다.
본 발명의 다른 면은 과증식성 질환에 특징이 있는 과중식성 세포에 대하여 광범위한 보호 면역 반응을 부여하는 방법 및 과증식성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "과증식성 질환"이란 용어는 세포의 과증식에 의해 특징지워지는 질환 및 이상을 의미한다. 과증식성 질환이 예로는 모든 형태의 암 및 건선을 들 수가 있다.
면역성 "과증식성 세포" 관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 유전자 구조물을 개체의 세포에 도입한 결과 개체의 백신화된 세포에서 그러한 단백질이 생산된다는 것이 발견되었다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이. "과증식 관련 단백질"이란 용어는 과증식성 질환과 관련이 있는 단백질을 의미한다. 과증식성 질환에 대해 면역시키기 위해, 과증식성 질환 관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자 구조물을 개체에 투여한다.
과증식 관련 단백질이 효과적인 면역원 표적이 되도록 하기 위해서는 그것은 정상 세포에 비해 과증식성 세포에서 유일하게 또는 높은 수준으로 생산되는 단백질이어야 한다. 표적 항원으로는 그러한 단백질, 그의 단편 및 그러한 단백질 상에서 발견된 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 들 수가 있다. 몇몇 경우에서, 과증식성 질환 관련 단백질은 단백질을 코딩하는 유전자의 변이 생성물이다. 변이 유전자는, 그것이 정상 단백질에서 발견되지 않는 다른 에피토프를 이루는 약간 다른 아미노산 서열을 갖는다는 것을 제외하고는 정상 세포와 거의 동일한 단백질을 코딩한다. 그러한 표적 단백질로는 암유전자 myb, myc, fyn 및 전좌 유전자
bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 코딩되는 단백질을 들 수가 있다. 표적 항원으로서의 암유전자 생성물 이외에도 항암 치료 및 보호 양생을 위한 표적 단백질로는 일부 실시태양에서, 자기면역 질환을 위한 표적 항원으로서 사용되는, B 세포 임파종에 의해 형성된 항체의 가변 영역: 및 T 세포 임파종의 T 세포 수용체의 가변 영역을 들 수가 있다. 다른 종양 관련 단백질은 모노클로날 항체 17-1A 및 엽산 결합 단백질에 의해 인지된 단백질을 포함한 종양 세포에서 고농도로 발견되는 단백질과 같은 표적 단백질로서 사용될 수 있다.
본 발명은 여러 형태의 암 중 한가지 이상에 대하여 개체를 면역시키는데 사용될 수 있고, 본 발명은 특히 특정 암이 발병되기 쉽거나 과거에 암을 가진 경험이 있어서 재발되기 쉬운 개체를 예방학적으로 면역시키는데 튼히 유용하다. 유전학 응용 과학 뿐만 아니라 유행병학의 발전은 개체에 암이 발병될 가능성 측정 및 위험도 평가를 가능하게 한다. 유전자 검사 및(또는) 가족력을 이용하여, 특정 개체에서 몇가지 유형의 암 중의 하나가 발명할 가능성을 예측할 수가 있다.
마찬가지로, 암이 이미 발병되었고 치료하여 암을 제거하였거나 또는 소강 상태에 있는 개체는 특히 재발 및 재출현되기 쉽다. 치료 양생법의 일부로서 그러한 개체는 재발을 방지하기 위하여 행해져 왔던 바와 같이 진단되었던 암에 대해 면역될 수 있다. 따라서, 일단 개체가 암의 유형을 가졌었고 재발할 위험이 있다는 것이 알려지면, 그들은 미래의 암 발명을 방지하는 그들의 면역 시스템을 형성하기 위해 면역될 수 있다.
본 발명은 과증식성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 유전자 구조물의 도입은 표적 단백질을 생산하는 과증식성 세포를 제거하기 위해 개체의 면역 시스템을 지도하고 촉진시키는 면역 치료법으로서 제공 된다.
본 발명은 "자기" 항체를 생산하는 세포 수용체 및 세포를 포함한 자기면역성과 관련 있는 표적에 대한 광범위한 보호 면역 반응을 부여함으로써 자기면역 질환 및 이상을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
T 세포 매개 자기면역 질환으로는 류머티스성 관절염 RA), 다발성 경화증 (MS), 쇼그렌(Sjogren's) 증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자기면역 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 공피증, 다근염, 피부근염, 건선, 맥관염, 베그너(Wegener's) 육아종증, 크론(Crohn's) 병 및 궤양성 대장염을 들 수가 있다. 이들 질환은 각각 내인성 항원에 결합하여 자기면역 질환과 관련 있는 염증성 캐스케이드를 개시하는 T 세포 수용체에 의해 특징지워진다. T 세포의 가변 영역에 대한 백신 접종은 그러한 T 세포를 제거하기 위해 CTLs를 비롯한 면역 반응을 일으킬 것이다.
RA에서는, 이 질환에 관련된 T 세포 수용체(TCRs)의 몇가지 특정 가변 영역에 특징이 있다. 이리한 TCRs로는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17을 들 수가 있다. 따라서, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코딩하는 DNA 구조물에 의한 백신 접종은 RA에 관련된 T 세포를 표적으로 할 면역 반응을 일으킬 것이다[Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253; 325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. invest. 90: 326-333 참조; 이들 각각은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용됨].
MS에서는, 이 질환에 관련된 TCRs의 몇가지 특정 가변 영역에 특징이 있다. 이러한 TCRs로는 Vβ-7 및 Vα-10을 들 수가 있다. 따라서, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코딩하는 DNA 구조물에 의한 백신 접종은 MS에 관련된 T 세포를 표적으로 할 면역 반응을 일으킬 것이다[Wucherpfennig K.W., et al., 1990 Science 248; 1016-1019; Oksenberg, J. R., et al., 1990 Nature 345; 344-346 참고; 이들 각각은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용됨].
공피증에서는, 이 질환에 관련된 TCRs의 몇가지 특정 가변 영역에 특징이 있다. 이러한 TCRs로는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-30, Va-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12를 들 수가 있다. 따라서, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코딩하는 DNA 구조물에 의한 백신 접종은 공피중에 관련된 T 세포를 표적으로 할 면역 반응을 일으킬 것이다.
T 세포 매개 자기면역 질환 특히 TCR의 가변 영역에 특징이 있는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위하여, 활막 생검법이 실시될 수 있다. 존재하는 T 세포의 시료를 취하여 표준 기술을 이용하여 이러한 TCRs의 특정 가변 영역을 확인할 수 있다. 유전자 백신은 이러한 정보를 이용하여 제조될 수 있다.
B 세포 매개 자기면역 질환으로는 낭창(SLE), 그레이브(Grave's) 병, 근무력증, 자기면역 용혈성 빈혈, 자기면역 혈소판 감소증, 천식, 한성 글로불린증, 1차 담낭 경화증 및 악성 빈혈을 들 수가 있다. 이들 질환은 각각 내인성 항원에 결합하고 자기면역 질환과 관련 있는 염증성 캐스케이드를 개시하는 항체에 의해 특징지워진다. 항체의 가변 영역에 대한 백신 접종은 그러한 항체를 생산하는 B 세포를 제거하기 위해 CTLs를 포함한 면역 반응을 일으킬 것이다.
B 세포 매개 자기면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위하여, 자기면역 활성에 포함된 항체의 가변 영역이 확인되어야 한다. 생검법이 실시될 수 있으며 염증 부위에서 존재하는 항체의 시료를 취할 수 있다. 이러한 항체의 가변 영역은 표준 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 유전자 백신은 이러한 정보를 이용하여 제조될 수 있다.
SLE의 경우에 한 항원이 DNA인 것으로 생각된다. 따라서, SLE에 대하여 면역된 환자에서, 그들의 형청은 항-DNA 항체에 대해 검사될 수 있으며 혈청에서 발견되는 그러한 항-DNA 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 구조물을 포함한 백신이 제조될 수 있다.
TCRs 및 항체의 가변 영역 중에서 공통적인 구조적 특징은 잘 알리져 있다. 특정 TCR 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열은 일반적으로 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Kabat, et al., 1987 Sequence of Proteins of immunological Interest U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD]에 기재된 바와 같은 잘 알려진 방법에서 발견될 수 있다. 또한, 항체로부터 기능적인 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 방법은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87; 1066]에서 발견될 수 있다.
유전자 요법에 관련된 본 발명의 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 보충 유전자 또는 치료 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. 보충 유전자의 예로는 디스트로핀 또는 기능적 단편을 코딩하는 유전자, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자의 결핍 유전자를 보충하는 유전자, ADA를 앓고 있는 환자의 결핍 유전자를 보충하는 유전자 및 VIII 인자를 코딩하는 유전자를 들 수가 있다. 치료 단백질을 코딩하는 유전자의 예로는 에리트로포이에틴, 인터페론, LDL 수용체, GM-CSF, IL-2, IL-4 및 TNF를 코딩하는 유전자를 들 수가 있다. 또한, 독성 물질에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체 성분을 코딩하는 유전자 구조물이 투여될 수 있다.
일부 바람직한 실시태양에서, 디스트로핀 유전자는 미니-유전자의 일부로서 제공되고 근이영양증을 앓고 있는 개체를 치료하는 데 사용된다. 일부 바람직한 실시태양에서, 부분적인 디스트로핀 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 미니 유전자가 제공된다. 디스트로핀 이상은 경미한 베커(Becker's) 근이영양증(BMD) 및 심각한 뒤시엔느 (Duchenne's) 근이영양증(DMD)의 원인이 된다. BMD에서는 디스트로핀이 만들어지긴 하지만, 크기 및(또는) 양에는 이상이 생긴다. 환자는 적당히 약해질 때까지는 경증이다. DMD에서는 단백질이 만들어지지 않고 환자는 13세 까지 걸을 수 없으며 20세 까지는 일반적으로 사망한다. 몇몇 환자 특히 BMD를 앓고 있는 환자의 경우는, 본 발명에 따라서 전달되는 미니-유전자의 발현에 의해 생산되는 부분적인 디스트로핀 단백질이 근육 기능을 개선시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, IL-2, IL-4, 인터페론 또는 TNF를 코닝하는 유전자는 존재하거나 또는 제거된 종양 세포에 전달되고, 이어서 개체에 재도입된다. 일부 실시태양에서, γ-인터페론을 코딩하는 유전자는 다발성 경화증을 앓고 있는 환자에게 투여된다.
안티센스 분자 및 리보자임은 활성 약제의 카피에 대한 주형으로서 기능하는 유전자 물질을 도입함으로써 개체의 세포에 전달될 수도 있다. 이러한 약제는 존재할 필요가 없는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 불활성화시키거나 또는 방해한다. 안티센스 분자를 코딩하는 서열을 함유하는 구조물은 세포내의 단백질의 생성을 억제하거나 또는 방지하는데 사용될 수 있다. 따라서, 암유전자 생성물과 같은 생성 단백질은 제거되거나 또는 감소될 수 있다. 마찬가지로, 리보자임은 그것이단백질로 해독되기 전에 메신저 RNA를 선택적으로 파괴함으로써 유전자 발현을 분열시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 다른 치료약의 투여 및 절차를 포함한 치료 양생법의 일부로서 안티센스 및 리보자임을 코딩하는 구조물을 이용하는 본 발명에 따라 처치될 수 있다. 안티센스 분자 및 리보자임을 코딩하는 유전자 구조물은, 코딩 서열이 RNA의 단백질로의 해독을 개시하기 위해 출발 코돈을 함유하지 않는 것을 제외하고는, 단백질 생성을 필요로 하는 경우 사용된 것과 같은 유사한 백터를 사용한다. 일부 실시태양에서, 실시예 46에 기재된 벡터, 특히 적절한 핵 항원의 복제 기원 및 발현 형태를 함유하는 것이 바람직하다.
리보자임은 자기 분열 또는 다른 RNA 분자의 분열을 가능케 하는 촉매 RNAs이다. 다른 몇몇 유형의 리보자임, 예를 들면 해머헤드, 헤어핀, 테트라히메나 그룹 I 인트론, 엑스헤드 및 RNase P가 당업계에 공지되어 있다[S. Edgington, Biotechnology 1992 10, 256-262 참조]. 해머헤드 리보자임은 40 뉴클레오티드 미만의 코어에 위치된 촉매 부위를 갖는다. 식물 비로이드 및 부수체 RNAs 중의 몇가지 리보자임은 공통의 2차 구조물 및 보존된 임의의 뉴클레오티드를 공유한다. 이러한 리보자임이 자연적으로 그들 소유의 기질로서 제공되긴 하지만, 효소 도메인은 보존된 분열 부위를 플랭킹하는 서열을 가진 염기쌍을 통해 다른 RNA 기질로 표적화될 수 있다. 리보자임을 디자인하는 이러한 능력은 그들을 서열 특이적 RNA 분열을 위해 사용되도록 할 수 있다[G. Paolella et al., EMBO 1992, 1913-1919 참조]. 그러므로, 해머헤드 촉매 서열과 같은, 각종 유형의 리보자임으로부터 다른 촉매 서열을 사용하고 본 명세서에 사용된 방법으로 그들을 디자인하는 것은 당업계의 숙련인에 의해 실시될 수 있다. 리보자임은 병원체 뉴클레오티드 서열 및 암 유전자 서열을 포함한 각종 표적에 대해 디자인될 수 있다. 본 발명의 임의의 바람직한 실시태양에서는 분열 반응의 효능을 유지하면서 abl-bcr 융합 전사를 특이적으로 표적화하기에 충분한 상보성을 가져야 한다.
본 발명의 일부 실시태양에 따라서, 세포는 그 세포에 의한 유전자 구조물의 흡수를 용이하게 하는 화합물로 처리된다. 본 발명의 일부 실시태양에 따라서, 세포는 세포 분열을 자극하고 유전자 구조물의 흡수를 용이하게 하는 화힙물로 처리된다. 화합물을 자극하는 세포를 비롯한 세포들에 의해 유전자 구조물의 흡수를 용이하게 하는 화합물을 투여한 결과 유전자 구조물에 의해 코딩되는 표적 단백질에 대한 더욱 효율적인 면역 반응이 일어난다.
본 발명의 일부 실시태양에 따라서, 유전자 구조물은 바늘 없는 주사 기구를 이용하여 개체에 투여된다. 본 발명의 일부 실시태양에 따라서, 유전자 구조물은 바늘 없는 주사 기구를 이용하여 개체에 피내, 경피 및 근육내 경로로 동시 투여될 수 있다. 바늘 없는 주사 기구는 잘 알려져 있고 널리 시판되고 있다. 당업계의 통상의 기술을 가진 자는 본 명세서에 기재된 기술에 따라서 바늘 없는 주사 기구를 이용하여 개체의 세포에 유전자 물질을 전달할 수 있다. 바늘 없는 주사 기구는 모든 조직에 유전자 물질을 전달하는데 아주 적합하다. 이들은 피부 및 근육 세포에 유전자 물질을 전달하는데 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 바늘 없는 주사 기구는 개체의 피부 표면을 향해 DNA 분자를 함유하는 액체를 추진시키는 데 사용될 수 있다. 이 액체는 피부와 충돌할 때에 피부의 표면을 관통하는 액체가 피부와 바로 밑의 조직에 침투하기에 충분한 속도로 추진된다. 따라서 유전자 물질은 피내, 경피 및 근육내 경로로 동시 투여된다. 일부 실시태양에서 비늘 없는 주사 기구는 핵산 분자를 다른 기관의 세포에 도입하기 위하여 유전자 물질을 다른 기관의 조직에 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 유전자 백신은 면역될 개체에 직접 투여되거나 또는 투여 후 재이식되는 개체의 제거된 세포에 생체외 투여될 수 있다. 또다른 경로에 의해, 유전자 물질은 개체의 체내에 존재하는 세포에 도입된다. 투여의 경로로는 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내 안내 및 경구 및 경피 경로 또는 흡입제 또는 좌제에 의한 것을 들 수가 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 투여 경로로는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사를 들 수가 있다. 표적 단백질을 코딩하는 유전자 구조물을 전달함으로써 그 물질이 점막 면역성과 관련 있는 조직에 존재하는 투여 방식에 의해 면역된 개체에 점막 면역성을 제공할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 유전자 구조물은 개체의 입내에 구강 투여에 의해 전달된다.
유전자 구조물은 통상적인 시린지, 바늘 없는 주사 기구 또는 "미세 분출물 충격 유전자 총"을 비롯한 수단에 의해 투여될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 별법으로 유전자 백신은 개체로부터 제거된 세포에 각종 수단에 의해 도입될 수 있다. 그러한 수단으로는, 예를 들면 생체외 형질 감염, 전기 천공법, 미세 주입법 및 미세 분출물 충격법을 들 수가 있다. 유전자 구조물이 세포에 의해 흡수된 후에, 그들은 개체에 재이식된다. 백신 접종된 세포를 다른 개체로부터 원래 얻었다 하더라고 그안에 유전자 구조물이 삽입된 다른 비면역성 세포가 개체에 이식될수 있다는 것을 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 백신은 약 1 ng 내지 약 1000 ㎍의 DNA로 이루어진다. 일부 바람직한 실시태양에서 백신은 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 백신은 약 0.1 ㎍ 내지 약 500 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 백신은 약 1 ㎍ 내지 약 350 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 백신은 약 25 ㎍ 내지 약 250 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 백신은 약 100 ㎍의 DNA를 함유한다.
본 발명에 따른 유전자 백신은 사용될 투여 방식에 따라 제제화된다. 당업계의 숙련인은 유전자 구조물을 함유하는 유전자 백신을 쉽게 제제화할 수 있다. 선택된 투여 방식이 근육내 주사법인 경우, 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로 등장성을 위한 첨가제로는 염화 나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 들 수가 있다. 몇몇 경우에서, 인산염 완충 염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제로는 젤라틴 및 알부민을 들 수가 있다. 일부 실시태양에서는 혈관수축제가 제제에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 제약 제제는 멸균 및 무 발열물질 상태로 제공된다.
본 발명의 유전자 구조물은 폴리뉴클레오티드 기능 강화제와 함께 제제화되거나 또는 투여된다. 본 발명의 바람직한 동시 투여제는 국소 마취제의 일종인 베조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 그의 염산염으로 이루어진 군에서 선택된다.
PFE는 다음 일반식 중의 하나를 갖는 화합물일 수 있다.
Ar -R1- O - R2- R3
또는 Ar - N - R1- R2- R3
또는 R4- N - R5- R6
또는 R4- O - R1- N - R7
여기서, Ar은 벤젠, p-아미노벤젠, m-아미노벤젠, o-아미노벤젠, 치환된 벤젠, 치환된 p-아미노벤젠, 치환된 m-아미노벤젠, 치환된 o-아미노벤젠(여기서, 아미노벤젠 화합물 중의 아미노기는 아미노, C1-C5알킬아민, C1-C5, C1-C5디알킬아민이고 치환된 화합물 중의 치환체는 할로겐, C1-C5알킬 및 C1-C5알콕시임)이고;
R1은 C=0이고;
R2는 분지된 알킬을 비롯한 C1-C10알킬이고;
R3은 수소, 아민, C1-C5알킬아민, 또는 C1-C5, C1-C5디알킬아민이고;
R2+ R3은 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 비롯한 C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클이고;
R4는 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 비롯한 C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클이고;
R5는 C=NH이고;
R6은 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 비록산 C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클이고;
R7은 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 비록산 C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클이다.
에스테르의 예로는 피페로카인, 메프릴카인 및 이소부카인과 같은 벤조산 에스테르: 프로카인, 테트라카인, 부테타민, 프로폭시카인 및 클로로프로카인과 같은파라-아미노벤조산 에스테르; 메타부타민 및 프리마카인을 비롯한 메타-아미노벤조산 에스테르; 및 파라에톡시카인과 같은 파라-에톡시벤조산 에스테르를 들 수가 있다. 아닐리드의 예로는 리도카인, 에티도카인, 메피바카인, 부피바카인, 피로카인 및 프릴로카인을 들 수가 있다. 그러한 화합물의 다른 예로는 디부카인, 벤조카인, 다이클로닌, 프라목신, 프로파라카인, 부타카인, 베녹시네이트, 카르보카인, 메틸 부피바카인, 부타신 피크레이트, 페나카인, 디오탄, 루카인, 인트라카인, 누페르카인, 메타부톡시카인, 피리도카인, 비펜아민 및 식물학적 유래 비시클릭계, 예를 들면 코카인, 신나모일코카인, 트룩실린 및 코카에틸렌 및 그러한 모든 화합물의 염산염과의 혼합물을 들 수가 있다.
바람직한 실시태양에서, PFE는 부피바카인이다. 부피바카인 및 메피바카인 사이의 차이점은 부피바카인이 메피바카인의 N-메틸기 대신에 N-부틸기를 갖는다는 점이다. 화합물은 N에서 C1-C10을 갖는다. 화합물은 프로카인 및 클로로프로카인과 같은 할로겐에 의해 치환될 수 있다. 아닐리드가 바람직하다.
부피바카인은 유전자 구조물 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 부피바카인 및 유전자 구조물은 동일한 조성물에 제제화될 수 있다. 부피바카인은 조직에 투여될 때의 많은 특성 및 활성 면에서 세포 자극제로서 특히 유용하다. 부피바카인은 세포에 의한 유전자 구조물의 흡수를 촉진시키고 용이하게 한다. 그것은 또한 그 자체로서 형질 감염제이다. 부피바카인과 함께 유전자 구조물을 투여하는 경우, 유전자 구조물의 세포로의 유입이 용이해진다. 부피바카인은세포막을 파괴하거나 또는 좀더 침투가능하게 하는 것으로 생각된다. 세포분열 및 복제는 부피바카인에 의해 자극된다. 따라서, 부피바카인은 복제화제로서 기능한다. 부피바카인의 투여는 또한 조직을 자극하고 손상시킨다. 그것은 그 자체로서 면역 세포의 투여 부위로의 이동 및 화학 주성을 유발하는 염증 촉진제로서 기능한다. 투여 부위에서 정상적으로 존재하는 세포 이외에도, 염증 촉진제에 대한 반응시에 부위로 이용하는 면역 시스템의 세포는 투여된 유전자 구조물 및 부피 바카인과 접촉할 수 있다. 형질 감염제로서 기능하는 부피바카인은 또한 면역 시스템의 그러한 세포에 의한 유전자 구조물의 흡수를 촉진시키는데 이용될 수 있다.
부피바카인은 아미노아실 국소 마취제와 화학적으로 또한 약리학적으로 관련이 있다. 그것은 메피바카인의 유사체이며 리도카인과 관련이 있다. 부피바카인은 근육 조직을 나트륨 챌린지에 대해 전압 민감성이 되도록 하며 세포내에서의 이온 농도에 영향을 미친다. 부피바카인의 약리학적 활성의 완전한 설명은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Ritchie, J. M. and N. M. Greene., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds, : Gilman, A. G. et al., 8th Edition, Chapter 15: 3111]에 기재되어 있다. 부피바카인 및 부피바카인과 유사한 기능을 나타내는 화합물이 본 발명의 방법에 바람직하다.
부피바카인-HCl은 2-피페리딘카르복스아미드, 1-부틸-N-(2,6-디메틸페닐)-일염산염, 일수화물로서 화학적 명칭으로 칭해지며, 아스트라 파마슈티칼 프로덕츠인크.(Astra Pharmaceutical Products Inc.; Westboro, MA) 및 사노피 윈트롭 파마슈티칼스(Sanofi Winthrop Pharmaceuticals: New York, NY)를 비롯한 많은 회사들로부터 제약 용도로 시판되고 있다. 부피바카인은 메틸파라벤을 첨가하거나 첨가하지 않고 또한 에피네프린을 첨가하거나 첨가하지 않고 상업적으로 제조된다. 그러한 임의의 제제가 사용될 수도 있다. 그것은 본 발명에 사용될 수 있는 0.25% 0.5% 및 0.75% 농도로 제약 용도를 위해 시판된다. 필요시에는, 다른 농도, 특히 바람직한 효과를 나타내는 0.05% - 1.0% 사이의 농도로 제조될 수 있다. 본 발명에 따라서, 약 250 ㎍ 내지 약 10 mg의 부피바카인이 투여된다. 일부 실시태양에서, 약 250 ㎍ 내지 약 7.5 mg이 투여된다. 일부 실시태양에서, 약 0.05 mg 내지 약 5.0 mg이 투이된다. 일부 실시태양에서, 약 0.5 mg 내지 약 300 mg이 투여된다. 일부 실시태양에서, 약 5 내지 50 ㎍이 투여된다. 예를 들면, 일부 실시태양에서는 등장성 제약학상 담체 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml를 백신 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 백신과 동일한 위치에서 투여한다. 마찬가지로 일부 실시태양에서는, 등장성 제약학상 담체 중의 0.5% 부피바카인-HCl 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml를 백신 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 백신과 동일한 위치에서 투여한다. 부피바카인 및 임의의 다른 유사한 기능이 화합물, 특히 국소 마취제의 일종인 것은 세포에 의한 유전자 구조물의 흡수를 목적하는 정도로 용이하게 하는 농도로 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 개체는 근육내 주사에 의한 유전자 백신 접종전에 먼저 부피바카인을 주사한다. 즉, 예를 들면 백신 접종 약 1 주일 내지 10일전까지 개체에 부피바카인을 먼저 주사한다. 일부 실시태양에서는, 백신 접종 전에 개체에 유전자 구조물을 투여하기 약 1 내지 5일 전에 부피바카인을 주사한다. 일부 실시태양에서는, 백신 접종하기 전에, 개체에 유전자 구조물 투여하기 약 24시간 전에 부피바카인을 주사한다. 별법으로, 부피바카인을 백신 접종과 동시에, 접종 수분 전에 또는 후에 주사할 수 있다. 따라서, 부피바카인 및 유전자 구조물은 혼합될 수 있으며 혼합물로서 동시에 주사될 수 있다. 일부 실시태양에서는, 부피바카인은 유전자 구조물 투여 후에 투여된다. 예를 들면, 유전자 구조물의 투여 후 약 1 주일 내지 10일 까지 개체에 부피바카인을 주사한다. 일부 실시태양에서는 개체에 백신을 접종한 지 약 24시간 후에 부피바카인을 주사한다. 일부 실시태양에서는, 개체에 백신을 접종한 지 약 1 내지 5일 후에 부피바카인을 주사한다. 일부 실시태양에서는, 개체에 백신을 접종한 지 약 1 주일 내지 10일 후까지 부피바카인을 투여한다.
형질 감염제 및(또는) 복제화제 및(또는) 염증 촉진제의 기능을 할 수 있는 다른 제제가 부피바카인과 동시에 투여될 수 있으며 유사한 기능을 하는 화합물로는 렉틴, 성장 인자, 싸이토킨 및 림포킨, 예를 들면 α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12 및 콜라게나제, 섬유아세포 성장 인자, 에스트로겐, 덱사메타손, 사포닌, 계면 활성제, 예를 들면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보조액, 모노포스포릴 지방 A(MPL)를 비롯한 LPS, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌과 같은 소포를 들 수가 있으며, 히아루론산및 히아루로니다제가 유전자 구조물과 동시에 투여될 수도 있다. 일부 실시태양에서는, 이들 약제의 혼합물이 부피바카인 및 유전자 구조물과 동시에 투여된다. 예를 들면 부피바카인 및 히아루론산 또는 히아루로니다제 중 하나가 유전자 구조물과 동시에 투여된다.
유전자 구조물은 에멀젼으로 작용하는 콜라겐과 혼합될 수 있으며 비경구적으로 전달된다. 콜라겐 에멀젼은 DNA의 서방 수단을 제공한다. 콜라겐 50 ㎕ 내지 2 ml가 사용된다. 이러한 제제를 사용하는 바람직한 실시태양에서는 약 100 ㎍의 DNA가 1 ml의 콜라겐과 혼합된다. 당업계의 표준 참고 문헌으로서 본 명세서에서 인용한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 4. Osol]에 기재된 것과 같은 다른 서방성 제제도 이용될 수 있다. 그러한 제제로는 수성 현탁액, 오일 용액 및 현탁액, 에멀젼 및 충전물 뿐만 아니라 저장소 및 경피 기구를 들 수가 있다. 일부 실시태양에서는, 유전자 구조물을 위한 지효성 제제가 바람직하다. 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 6 내지 144 시간, 바람직하게는 12 내지 96 시간, 더욱 바람직하게는 18 내지 72 시간 사이에 효과가 지속된다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 바늘 없는 주사 기구로 주사된다. 바늘 없는 주사 기구는 물질을 근육내, 피내 및 경피 경로로 동시 투여하는데 특히 유용하다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 본 명세서에서 참고로 인용한 신포드(Sanford) 등의 미합중국 특허 제4,945,050호(1990. 7. 31자로 특허됨)에 제시된 미세 분출물 입자 충격 수단에 의해 PFE와 함께 투여된다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 폴리뉴클레오티드 기능 강화제와의 리포좀 복합체의 일부로서 투여된다.
본 발명의 일부 실시태양에서는, 개체에 완전하고 광범위한 면역 반응을 일으키는 1회의 백신 접종을 행한다. 본 발명의 일부 실시태양에서는 개체에 완전하고 광범위한 면역 반응을 일으키는 연속적인 백신 접종을 행한다. 본 발명의 일부 실시태양에 따라서, 2회 이상, 바람직하게는 4 내지 5회의 주사를 일정 기간에 걸쳐 실시한다. 주사 사이의 시간 간격은 24 시간 내지 2주 또는 그 이상이며, 바람직하게는 1주일이다. 별법으로, 2회 이상 및 4회 까지의 개별적인 주사가 다른 부위에서 동시에 행해진다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 완전한 백신 접종은 1개 이상의 표적화된 에피토프를 코딩하는 서열을 포함한 유전자 구조물을 함유하는 단일 접종물의 주사로 이루어진다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 완전한 백신 접종은 2개 이상의 다른 접종물을 다른 부위에 주사하는 것으로 이루어진다. 예를 들면, 본 발명에 따른 HIV 백신에서 이 백신은 각각 다른 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자 물질로 이루어지는 2개의 접종물로 이루어진다. 이러한 백신 접종법은 감염성 바이러스 입자를 집합시킬 위험 없이 개체에 가능한한 많은 완전한 세트의 바이러스 유전자를 도입하도록 한다. 따라서, 대부분 또는 모든 바이러스에 대한 면역 반응은 백신 접종된 개체에서 일어날 수 있다. 각 접종물의 주입은 다른 부위에서, 바람직하게는 세포가 두 유전자 구조물을 모두 수용하지 않도록 하는 거리에서 수행된다. 또다른 안전성 예방책으로서, 몇몇 유전자를 결실시키거나 또는 변형시켜 감염성 바이러스의 집합 능력을 방해한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "제약 키트"란 용어는 총체적으로 본 발명에 사용된 다중 접종물을 의미한다. 그러한 키트로는 다른 접종물 및(또는) 세포 자극제를 함유하는 분리 용기를 들 수가 있다. 이리한 키트는 면역법에 사용되는 1 세트의 접종물을 포함하는 것으로 제공된다.
본 발명의 방법은 인간 의학 및 수의학 분야에 유용하다. 따라서, 본 발명은 포유 동물, 조류 및 어류의 유전적 면역화에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이 종을 비롯한 포유류 종에 특히 유용하다.
하기 실시예는 본 발명의 일면의 대표적인 예를 포함한다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시적인 목적으로 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 면은 다음 설명에 의해 요약될 수 있다. 그러나, 이들 설명은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 본 발명의 여러 면을 강조하려는 것이다. 당업계의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 또다른 면 및 실시태양을 쉽게 이해할 수 있다.
실시예
실시예 1
본 발명은 직접적인 유전자 면역화를 이용하여 HIV 백신을 제공한다. 개체의 세포에 전달될 때 발현되어 HIV 단백질을 생산하는 유전자 구조물이 제공된다. 일부 실시태양에 따라서, 개체의 세포 중의 모든 바이러스 구조 단백질의 생산은 HIV감염으로부터 보호하는 보호 면역 반응을 일으킨다. 본 발명의 HIV 백신은 HIV 감염으로부터 비감염된 개체를 면역시키는데 사용될 수 있거나 이미 감염된 개체에 대한 면역 치료제로서 제공될 수 있다. 본 발명의 HIV 백신은 HIV 감염된 세포를 인지하고 공격하고 HIV 단백질의 가장 광범위한 부수적인 것을 인지하는 CTLs를 포함한 면역 반응을 일으킨다. 따라서, 비감염된 개체는 HIV 감염으로부터 보호된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 2개의 접종물을 투여함으로서 HIV에 대해 개체를 면역시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 2개의 접종물은 2개 이상, 바람직하게는 2개를 넘는, 다수의 또는 모든 HIV 바이러스 유전자로 이루어진다. 그러나, 접종물은 함께 전달되지 않는다. 따라서, 접종된 세포에는 완전한 유전자 보체가 투여되지 않을 것이다. 백신 접종된 개체는 2개 이상, 바람직하게는 2개를 넘는, 더욱 바람직하게는 다수 또는 모든 바이러스 유전자를 수용할 것이다. 면역 반응은 HIV 단백질 표적의 전체 보체에서 이루어절 수 있다.
이러한 방법은 가장 효율적인 표적 단백질을 코딩하는 유전자 물질이 백신에 포함될 가능성을 증가시키고 바이러스가 변이될 때 일어나는 1개 이상의 바이러스 단백질의 구조적인 변화에도 불구하고 바이러스 입자가 면역 반응에 의해 검출되는 것을 피할 가능성을 감소시킨다. 따라서, 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자의 다중, 및 바람직하게는 거의 완전한 또는 완전한 보체로 개체를 백신 접종하는 것이 바람직하다.
단일 세포에 완전한 바이러스 유전자 보체가 제공된다면, 완전한 감염성 바이러스가 세포내에 집합될 가능성이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 구조물에는 유전자의 완전한 보체가 제공되지 않는다. 또한, 각각은 불완전한 세트의 유전자를 갖고, 혼합된 것은 적어도 완전한 바이러스 유전자 보체를 갖는 2개 이상의 접종물은 다른 세포에, 바람직하게는 백신 접종된 세포가 완전한 세트의 유전자에 부주의하게 노출되지 않도록 서로 떨어진 위치에서 투여된다. 예를 들면, HIV 게놈의 일부는 제1 구조물에 삽입되고 HIV 게놈의 잔류 부분은 제2 구조물에 삽입된다. 제1 구조물은 한 팔의 근육 조직에 유전자 백신으로서 개체에 투여되고 제2 구조물은 개체의 다른 팔의 근육 조직에 유전자 백신으로서 개체에 투여된다. 개체는 완전한 세트의 바이러스 유전자에 노출될 수 있고, 따라서 감염성 바이러스 입자가 집합될 위험성 없이 전체 바이러스에 대해 필수적으로 백신 집종된다.
또다른 안전 예방책으로서, 유전자 물질을 개체의 떨어진 부분에서 2개 이상의 접종물에 의해 전달할 때에도, 1개 이상의 필수적인 유전자를 결실시키거나 또는 계획적으로 변형시켜 감염성 바이러스 입지가 형성될 수 없도록 한다. 그러한 실시태양에서, 개체에는 완전 기능 세트의 바이러스 유전자가 투여되지 않는다.
또다른 안전 예방책은 각각 별개의 접종물을 제조하는 별개의 유전자 구조물 상에 바이러스 게놈의 비중첩부를 제공한다. 따라서, 2개의 유전자 구조물 사이의 재조합이 방지된다.
본 발명의 일부 실시태양에서는, 구조 유전자의 완전한 보체가 제공된다. HIV의 구조 유전자는 gag, pol 및 env로 이루어진다. 이러한 3가지의 유전자는 2가지의 다른 DNA 또는 RNA 구조물 상에 제공된다. 따라서, 한 바람직한 실시태양에서, gag 및 pol은 하나의 DNA 또는 RNA 구조물 상에 있고 env는 다른 구조물 상에 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, gag는 하나의 DNA 또는 RNA 구조물 상에 있고pol 및 env는 다른 구조물 상에 있다. 또다른 바람직한 실시태양에서, gag 및 env는 하나의 DNA 또는 RNA 구조물 상에 있고 pol은 다른 구조물 상에 있다. 일부 바람직한 실시태양에서, rev를 함유하는 구조물은 rev에 대한 출발 코돈의 스플라이스 수용체 업스트림을 갖는다. 일부 바람직한 실시태양에서는 gag을 함유하는 구조물은 gag 해독 출발 코돈의 스플라이스 공여체 업스트립을 갖는다. 임의로, 이러한 혼합물에서는 HIV 조절 유전자가 또한 존재할 수 있다. HIV 조절 유전자는 vpr, vif, vpu, nef, tat 및 rev이다.
바람직한 실시태양에서의 DNA 구조물은 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 시그날로 이루어진다. 프로모터는 HIV LTR, 인체 액틴, 인체 미오신, CMV, RSV, 몰로니, MMTV, 인체 헤모글로빈, 인체 근육 크레아틴 및 EBV로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 인헨서는 인체 액틴, 인체 미오신, CMV, RSV, 인체 헤모글로빈, 인체 근육 크레아틴 및 EBV로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 폴리아데닐화 시그날은 LTR 폴리아데닐화 시그날 및 SV40 폴리아데닐화 시그날, 특히 SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서는, 2개의 접종물 백신이 개체의 격리된 조직에서, 바람직하게는 예를 들면 오른팔 및 왼팔과 같은 다른 부속 기관에서 근육내로 투여된다. 본 발명의 각 접종물은 약 0.1 내지 약 1000 ㎍의 DNA를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 각 접종물은 약 1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 각 접종물은 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는, 각 접종물은 약 100 ㎍의 DNA를 함유할 수 있다.
일부 실시태양에서의 접종물은 무균 등장성 담체, 바람직하게는 인산염 완충염수 또는 식염수이다.
일부 실시태양에서는, 백신 투여 전에, 백신 접종될 조직에 세포 증식제, 바람직하게는 부피바카인을 주사한다. 부피바카인 주사는 백신 접종하기 약 24 시간 전까지 실시할 수 있다. 부피바카인 주사는 백신 접종 직전에 실시할 수도 있다. 등장성 NaCl 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 약 50 ㎕ 내지 약 2ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml를 백신이 투여될 위치에 투여한다.
다른 실시태양에서, 세포 증식제, 바람직하게는 부피바카인은 유전자 구조물과 함께 제제에 포함된다. 등장성 NaCl 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml를 백신이 투여될 위치에 투여한다.
따라서, 일부 실시태양은 2개의 접종물 백신으로 이루어진다. 하나의 접종물은 2개의 HIV 구조 유전자를 갖는 DNA 또는 RNA 구조물로 이루어지고, 다른 접종물은 혼합된 접종물이 HIV 구조 유전자의 완전한 보체를 함유하도록 남아있는 제3의 HIV 구조 유전자를 갖는 DNA 또는 RNA 구조물로 이루어진다. 각 DNA 구조물 상의 구조 유전자는 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 시그날에 작동 가능하게 연결된다. 동일하거나 또는 상이한 조절 요소는 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 개체에 백신 접종할 때 2개의 접종물은 다른 부위에, 바람직하게는 다른 팔에 근육내 경로로 투여된다. 본 발명의 일부 실시태양에서는, 부피바카인이 접종물을투여될 부위에 먼저 투여된다. 본 발명의 일부 실시태양예서는, 부피바카인이 유전자 구조물과 함께 제제에 포함된다.
일부 실시태양에서, 백신 접종 절차는 1회 이상, 바람직하게는 2 또는 3회 반복된다. 각 백신 접종 절차는 24시간 내지 2개월 간격으로 실시된다.
일부 실시태양에서, 백신은 바늘 없는 주사 기구를 사용하여 투여된다. 일부 실시태양에서는, 백신을 바늘 없는 주사 기구를 사용하여 피하 투여하여 동시에 근육내, 피내, 피하 투여할 수 있으며 또한 물질을 간질 세포 경로로 투여할 수 있다.
바람직한 유전자 구조물로는 다음과 같은 것이 있다.
폴리스미드 및 클로닝 방법:
2개의 플라스미드를 제조하였다. 하나는 HIV gag/pol을 함유하고 다른 하나는 HIV env를 함유하였다.
HIV-1 게놈 클론 pNL43은 NIH AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리에이전트 프로그램(ARRRP), 디비젼 오브 AIDS, NIAID, NIH (Dr. Malcolm Martin)를 통해 얻었고, 그것은 유전자 구조물을 위한 HIV-1 바이러스 유전자의 출발 물질로서 사용될 수 있다. 별법으로, HXB2 클론 및 MN 클론 뿐만 아니라 SF 또는 BAL-1 클론을 비롯한 감염된 세포의 임의의 HIV 분자 클론은 폴리머라제 연쇄 반응법을 이용하여 유전자 제조를 위해 충분하게 변형될 수 있다. pNL43 클론은 pUC18에 통합 클로닝된 부위로부터 얻은 HIV-1 프로바이러스 DNA + 3 kb의 숙주 서열로 이루어진 구조물이다.
pNL-puro-env 플라스미드의 제조:
이 플라스미드를 gag 및 pol의 발현을 위해 제조하였다. pNL43의 비-HIV 5'플랭킹 인간 DNA 내의 StuI 부위는 StuI에 의한 부분 분해에 이어서 이. 콜리 폴리머라제 1에 의한 유리 말단의 분해에 의해 파괴되었다. 선형 플라스미드는 채워지고, 자기 결합하여 HIV 게놈 내에 고유의 StuI 부위가 형성되었다. 이 플라스미드 pNLDstu는 gp120에 대한 코딩 서열의 상당 부분이 제거된 평활화 효소 StuI 및 BsaBI에 의해 분해되었다. SV40 프로모터 및 푸로마이신 내성 코딩 영역(푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC))을 EcoRI 및 ClaI를 사용하여 pBABE-puro (Morgenstern and Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12): 3587-3596; 본 명세서에서 참고로 인용됨: by Dr. Hartmut Land of the Imperial Cancer Research Fund)로부터 분리하였다. 이 단편은 평활화되었으며, StuI/BsaBI-분해된 pNLDstu에 클로닝되었다. 클론은 HIV의 3' LTR이 PAC 메시지를 위한 폴리 A의 기능을 제공할 수 있도록 정확한 방향에 있는 SV40-puro 단편을 갖는 것으로 선택되었다. 이 플라스미드는 pNLpuro로 칭해졌다.
HIV gag pol 백터로부터 vpr 조절 유전자를 결실시키는 클로닝 방법:
고유의 pflMI 부위의 인접한 업스트림으로부터 vif 종결 코돈 직후까지의 영역은 vpr의 아미노산 22에서 비보존적인 아미노산 변화(glu →val)를 도입한 프라이머, 아미노산 22 직후의 vpr 리딩 프레임 내의 정지 코돈, 및 새로운 정지 코돈에 바로 뒤이은 EcoRI 부위를 이용한 PCR를 통해 증폭되었다. 이 PCR 단편은 pNLpuro 또는 pNL43의 PflMI-EcoRI 단편 대신 사용되었다. 이러한 치환 결과 vpr의 오픈리딩 프레임의 122 뉴클레오티드가 결실되고, 따라서 포인트 변이 방법이 일으키는 복귀 가능성이 제거된다. 형성된 플라스미드 pNLpuroΔvp은 vpr의 첫번째 21 천연 아미노산 + 발린 + 다른 모든 잔류 HIV-1 유전자 및 천연 형태의 스플라이스 접합물을 코딩한다. 그러한 결실 방법은 또한 nef, vif 및 vpu에 이용되고 구조 유전자 발현을 가능하게 하지만, 생활 재조합 바이러스의 발생을 방지할 것이다.
엔벨럽 발현을 위한 플라스미드 제조:
HIV-1 HXB2의 엔벨럽 유전자를 코딩하는 DNA 세그먼트는 AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리에이전트 프로그램으로부터 얻은 람다 클로닝된 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 기술에 의해 클로닝되었다. 5' 및 3' 프라이머의 서열은 각각 gp160, tat 및 rev 코딩 영역을 수반하는, XhoI 부위가 삽입된 5' -AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3' (SEQ ID NO:1) 및 XbaI 부위가 삽입된 5' - TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3' (SEQ ID NO:2)이다. 유전자 특이적 증폭은 제조업자의 지시(Perkin-Elmer Cetus Corp.)에 따라 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 수행되었다. PCR 반응 생성물을 37 ℃에서 30분 동안 단백질 가수분해 효소 K 0.5 ㎍/ml로 처리하고, 이어서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켰다. 회수된 DNA를 37 ℃에서 2시간 동안 XhoI 및 XbaI로 분해시키고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 분리 및 정제된 XhoI-XbaI PCR 단편을 블루스크립트 플라스미드(Stratagene Inc. La Jolla, CA)에 클로닝시키고 진핵 생물 발현 벡터 pMAMneoblue(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)에 서브클로닝시켰다. 생성된 구조물은 pM160(제1A도)으로 칭하였다. 플라스미드 DNA는 CsCl 구배 초원심분리법으로 정제하였다. DNA구조물 pM160은 프로모터로서 MMTV LTR과 함께 RSV 인헨서 요소의 조절하에HIV-1/HXB2(Fisher, A.G., et al., (1985) Nature 316: 262-265) gp160 막 결합 당단백질을 코딩한다.
HIV-1 env-rev 플라스미드로 칭해지는 또다른 앤벨럽 발현 플라스미드 제조:
HIV-1 HXB2의 rev 및 vpu의 2개의 엑손 및 엔벨럽 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 영역을 PCR을 통해 증폭시키고 발현 벡터 pCNDA/neo (Invitrogen)에 클로닝시켰다. 이 플라스미드는 CMV 프로모터를 통해 엔벨럽 생성을 유도한다.
생산 및 정제:
이. 콜리 중의 플라스미드(DH5 알파)는 다음과 같이 성장되었다. LB + 암피실린 아가 플레이트에 동결된 원료로부터 얻은 목적하는 플라스미드 배양물을 스트리킹시켰다. 이 플레이트를 37 ℃에서 철야(14-15 시간) 인큐베이션시켰다. 플레이트로부터 단일 콜로니를 취하여 펩톤 제제 및 암피실린 50 ㎍/ml를 함유한 LB 배지 15 ml에 접종시켰다. 이 배양물을 37 ℃에서 성장시키고 8 내지 10 시간 동안 진탕시켰다(약 175 rpm). 펩톤 및 암피실린 50 ㎍/ml를 함유한 LB 배지 1 리터를 OD 1.0의 배양물로 접종시켰다. 이러한 1-2 리터의 배양물을 진탕시키면서(175 rpm) 37 ℃에서 철야로 성장시켰다.
이. 콜리에서 성장된 플라스미드(균주 DH5 알파)를 다음의 방법에 의해 수확하고 정제하였다. 세포 용해 및 플라스미드의 정제에 대한 일반적인 방법은 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재되어 있다. 세포를 농축시키고, 글루코오스-tris-EDTA pH 8.0 완충액으로 세척하였다. 농축된세포를 리소자임으로 처리하여 용해시키고, 0.2 N KOH로 간단하게 처리하고, pH를 아세트산 칼륨/아세트산 완충액으로 5.5로 조정하였다. 불용성 물질은 원심분리시켜 제거하였다. 상징액에 2-프로판올을 첨가하여 플라스미드를 침전시켰다. 이 플라스미드를 트리스-EDTA 완충액에 다시 용해시키고, 페놀/클로로포름 추출시켜 더 정제하고 2-프로판올로 침전시켰다.
내독소를 다음의 방법을 비롯 여러 방법으로 선택적으로 제거할 수 있다. 폴리믹신과 같은 고정화 물질에 의한 특이적 흡수(Tani et al., Biomater Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20(2-4): 457-62 (1992); Issekutz, J. Immunol, Methods 61(3): 275-81 (1983)); 8A1 및 HA-1ATM과 같은 항-내독소 모노클로날 항체(Centocor, Malvern, PA; Bogard et al., J. Immunol. 150(10): 4438-4449 (1993); Rietschel et al., Infect. Immunity page 3868 (1993)); 양하전된 뎁쓰 필터(Hou et al., J. Parenter. Sci Technol. 44(4): 204-9 (Jul-Aug 1990)); 폴리(감마-메틸 L-글루타메이트)(Hirayama et al., Chem. Pharm. Buil. (Tokyo) 40(8): 2106-9 (1992)); 히스티딘 (Matsumae et al., Bioteohnol. Appl. Biochem. 12:(2):129-40 (1990)); 소수 상호작용 컬럼 및 막(Aida et al., J. Immunol Methods 132(2): 191-5 (1990); Umeda et al., Biomater Artif Cells Artif Organs 18(4): 491-7 (1990); Hou et al., Biochem. Biophys. Acta 1073 (1) : 149-54 (1991); Sawada et al., J. Hyg. (London) 97(1): 103-14(1986)); 브라운리 폴리포어(Brownlee Polypore) 수지와 같은 소수성 폴리스티렌/디비닐벤젠 도는 디비닐벤젠 수지를 포함한 내독소를 제거하는데 유용한 특이적 소수성 수지(Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, MI); HP20, CHP20P (Mitsubishi Kasei, U.S.); Hamilton PRP-1, PRP-infinity (Hamilton, Reno, NV); 조르디 역상 DVB, 조르디 겔 DVB, 폴리머 랩스 PLgelTM(Alltech, Deerfield, IL); Vydac PLxTM(Separations Group, Hesperial, CA)이 있으며, 기타 내독소 제거 물질 및 방법으로는 Detoxi-GelTM내독소 제거 겔(Pierce Chemical Rockford, IL); 어플리케이션 노트 206 (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ)이 있다[일반적인 것은 Sharma, Biotech. App. Biochem. 8: 5-22 (1986) 참조]. 바람직한 항-내독소 모노클로날 항체는 내독소의 보존된 도메인에 결합하고, 바람직하게는 내독소의 구조적으로 가장 잘 보존된 부분인 지방 A에 대한 항체이다. 그러한 항-지방 A 모노클로날 항체로는 고친화성 마우스 IgG 모노클로날 항체 8A1 및 인간 항-지방 A IgM(k) 모노클로날 항체 HA-1ATM을 들 수가 있다. HA-1ATM은 인간 B 이. 콜리 J5 백신으로부터 유도되었다. HA-1ATM은 여러 박테리아 내독소(리포폴리사카라이드)와 광범위하게 상호 반응성인 것으로 알려져 있다.
실시예 2
유전자 백신 접종 및 단백질 백신 접종에 의해 일어나는 면역 반응을 비교하기 위해 설계된 실험에서, 이종 표적 단백질을 특이적으로 발현하는 종양 세포를 사용하여 동물 모델을 설계하였다. 이종 항원을 발현하는 3가지의 면역 경쟁 마우스 모델을 만들었다. Balb/c 마우스 균주로부터 유도된 3가지의 종양 세포주를 사용하였다. 세포주는 다음과 같다: 1) 다른 조직에 그다지 많이 전이되지는 않지만 8 내지 12주 내에 동물을 죽이는 것으로 보이는 촉진 가능한 거대한 종양을 형성하는 임파 유사 세포주; 2) 대부분 폐로 전이하는 능력을 갖고 거기서 백만개의 세포로 접종되어 마찬가지로 10 내지 12주 내에 동물을 죽이는, 촉진 가능한 거대한 종양을 마우스에 발생시키는 원인이 되는 유사 세포주; 및 3) 여러 조직에 전이되고 12주 이상내에 동물을 죽이는 마우스 폐 선암 페포주. 인지되지 않은 형태의 이종항원을 나타낼 수 있는 서브클론이 선택되었다. 형질감염된 종양이 모 마우스 균주에 이식될 때, 대부분의 유사한 마우스 종양 세포주와는 다르게, 동물은 표시된 이종 항원에 대한 보호 면역 반응을 나타내지 않고 종양은 허용되지 않는다. 이들 종양은 원래 형질 감염되지 않은 종양과 동일한 타임 프레임에 동일한 표현형을 가진 동물을 죽인다. 이러한 모델을 사용하여, 항원에 대한 유전자 백신 접종에 의해 유발되는 면역 반응을 측정할 수 있다.
마우스의 세포에 의해 표적 단백질을 생산시키는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신으로 접종된 마우스가 표적 단백질을 나타내는 종양을 완전히 제거하는 강한 세포 독성을 포함한 면역 반응을 일으키지만, 그렇지 않은 종양에 대한 효과는 없는 것으로 관찰되었다. 표적 단백질 자체로 접종된 마우스에서, 일어난 면역 반응은 효과가 아주 약했다. 종양의 크기는 감소하지만, 세포 독성 반응이 없으므로 종양이 제거되지는 않았다. 대조군으로서, 비감염된 종양은 유전자 백신, 서브 유닛 백신으로 접종된 동물 및 백신 접종되지 않은 동물의 면역 반응을 비교하는실험에 사용하였다. 이러한 실험은, CTL's로써 종양을 완전히 제거할 수 있는 더 광범위하고 더욱 효과적인 면역 반응을 형성한다는 것을 명확하게 입증하는 것이다. 대조적으로, 완전한 표적 단백질을 사용한 면역화는 더욱 제한되고, 덜 효과적인 면역 반응을 일으켰다.
실시예 3
본 발명의 다른 실시태양에서, HIV에 대한 유전자 백신을 설계하였다. gp120 및 gp41로 가공된 바이러스 단백질 gp160은 그에 대하여 유전자 백신이 생산된 표적 단백질이다. 유전자 백신은 작동 가능하게 연결되어 있는, 조절 요소인 gp160을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 구조물을 함유한다. 그것이 개체에 투여될 때, 유전자 백신의 DNA 구조물은 개체의 세포에 삽입되고 gp160이 생산된다. 단백질에 의해 일어나는 면역 반응은 광범위하며 액소성인 것과 세포 면역 반응의 양체계가 있다. 광범위한 생물학적 반응은 단백질 자체를 투여할 때 얻는 것 보다 우수한 보호 작용을 제공한다.
실시예 1에 기재된 pM160을 마우스에 근육내 투여하고, 이어서 항-HIV 면역 반응에 대해 분석하였다. 이러한 방법으로 면역된 동물로부터 얻은 항혈청은 효소 결합 면역흡착 검사법(ELISA) 및 면역 침전 검사법에 의해 측정된 바와 같이 항 HIV 엔벨럽 당단백질 면역 반응을 형성한다. 항혈청은 HIV-1 감염을 중화시키고 HIV-1 유도된 합포체 형성을 억제한다.
관찰된 중화 및 항-합포체 활성은 gp120의 V3 루프, CD4 결합 부위 및 gp41의 N 말단 "면역우세" 영역과 같은 HIV-1 엔벨럽 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대해 유도된 항체의 반응성의 결과일 수 있다.
본 명세서에 기재된 유전자 면역 방법에서, BALB/c 마우스의 사두 근육에 27-게이지 바늘을 이용하여 등장성 NaCl 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 100 ㎕를 주사하여 근육 세포 재형성을 자극하고 유전자 구조물의 흡수를 용이하게 하였다. 24시간 후에, 동일한 주사 부위에 대조군 플라스미드로서 pM160 100 ㎍ 또는 pMAMneoBlue 100 ㎍을 주사하였다(제1A도). 마우스에 동일한 양의 DNA 구조물을 동일한 방법으로 2주 간격으로 3회 추가 접종하였지만 부피바카인-HCl로 예비 처리하지는 않았다.
제조합 gp160 면역화를 위해, BALB/c마우스를 먼저 완전한 프로인트 보조액 중의 글리코실화된 재조합 (HIV-1/III8) gp160 (MicroGeneSys Inc.) 1 ㎍으로 면역시키고 이어서 불완전 프로인트 보조액 중의 각각 gp160 1 ㎍을 2주 간격으로 3회 추가 접종하였다. HIV-1 gp160에 대한 항체의 생산은 마우스 혈청의 gp160 면역침전 능력에 대해 시험함으로써 결정하였다. 면역 침전법을 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Osther. K., et al., (1991) Hybridoma 10: 673-683]에 기재된 바와 같이125I 표지된 rgp160 1 ×106cpm, 마우스 혈청 및 단백질-G 아가로스 비드(GIBCO, Inc.)를 사용하여 실시하였다. 10% SDS-PAGE로 특정 침전물을 분석하였다. 레인 1은125I-gp160과 반응된 1 ㎕의 예비면역 마우스 혈청에 대한 것이다. 레인 2는 pM160 면역된 마우스로부터 면역된 1 ㎕의 마우스 혈청에 대한 것이다. 레인 3은 양성 대조군으로서 ID6 모노클로날 항-gp120 항체(Ugen, K.E. et al., (1992)Generation of Monoclonal Antibodies Against the Amino Region of gp120 which Elicits Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, Cold Spring Harbor Laboratory)의 1:100 희석액 1 ㎕에 대한 것이다. 화살표는 특이적으로 면역침전된125I-gp160 엔벨럽 당단백질을 나타낸다.
125I-표지된 gp160은 pM160-면역된 동물(제2도, 레인 2) 뿐만 아니라 양성 대조군 항-gp120 모노클로날 항체, ID6(제2도, 레인 3)으로부터 유도된 항혈청으로 특이적으로 면역침전되었다. 대조적으로, 예비면역 혈청(제2도, 레인 1)만이 동일한 분석에서 최소의 활성을 나타내었다.
pM160 구조물로 면역된 10 마리중 8 마리는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 gp160에 대한 양성 반응을 나타내었고, 가장 높은 항-gp160 타이터를 가진 동물의 면역 반응을 상세히 분석하였다. 대조군 벡터로 면역된 4마리의 마우스는 모두 ELISA 분석에서 gp160에 대해 음성 반응을 나타내었고, 이 혈청 중 하나는 후속 실험에 대조군으로서 사용되었다.
HIV 중화 항체는 gp120 및 gp41의 몇개의 에피토프, 예를 들면 gp120중의 V3 루프(Goudsmit, J. et al., (1988) AIDS 2: 157-164: and Putney, S. D., et al., (1989) Development of An HIV Subunit Vaccine, Montreal, gp120의 카르복시 말단 부근의 CD4 결합 부위(Lasky, L.A., et al., (1987) Cell 50: 975-985) 및 N-말단 융합 영역의 인접 다운스트림에 있는 gp41의 면역 공여 루프(Schrier, R.D., et al., (1988) J. Virol. 62: 2531-2536)에 특이적으로 표적화되는 것으로 밝혀졌다.
이러한 마우스에서 유발된 항-gp160 항체가 엔벨럽 당단백질의 이러한 중요한 영역에 반응성이 있는지를 측정하기 위하여, BRU/V3 루프에 대한 펩티드, MN/V3 루프에 대한 펩티드, HXB2/gp41 N-말단에 대한 펩티드 또는 HXB2/CD4 결합 부위에 대한 펩티드를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시키고, 마우스 항혈청의 특이적 반응성을 ELISA 분석법으로 측정하였다. gp160 1 ㎍/ml 또는 각 펩티드 10 ㎍/ml를 4 ℃에서 0.1 M 중탄산염 완충액(pH 9.5) 중의 마이크로타이터 플레이트에 철야로 코팅시키고, PBS 중의 2% 소 혈청 알부민으로 블로킹시키고, HRPO(Fisher)로 접합된 염소 항-마우스 IgG와 37 ℃에서 1시간 동안 반응시키고 실온의 어두운 곳에서 10-30분 동안 TMB 기질(Sigma)과 함께 전개시켰다. 결과를 제3도에 나타내었다. 항혈청은 다음과 같다: (-+-)는 에비면역 혈청이고, (-×-)는 pMAMneoBlue 벡터 면역된 혈청이고, (-O-)는 pM160 면역된 혈청이고, (-Δ-)는 rgp160 단백질로 면역된 마우스로부터 얻은 것이다. 제3A도는 rgp160 단백질 코팅된 플레이트를 사용한 결과를 나타낸 것이다. 제3B도는 BRU/V3 루프 펩티드(CNTRKRIRIQRGPGRAPVTIGK (SEQ ID NO:11) 코팅된 플레이트를 사용한 결과를 나타낸 것이다. 제3C도는 굵은 글씨로 표시된 HIV-1/III8로부터 얻은 QR 서열을 가진 MN/V 루프 펩티드 (YNKRKRIHIQRGPGRAFYTKNIIC (SEQ ID NO:12))로 코팅된 플레이트를 사용한 결과를 나타낸 것이다. 제3D도는 HXB2/CD4 결합 부위 펩티드 (CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC (SEQ ID NO:13))로 코팅핀 플레이트를 사용한 결과를 나타낸 것이다. 제3E도는 BRU/gp41 면역공여 영역 펩티드(RILAVERYIKDQQLLGIWGCSGKLIC (SEQ ID NO:14))로 코팅된 플레이트를 사용한 결과를 나타낸 것이다.
제3도는 pM160 구조물 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청은 재조합 gp160단백질(rgp160) 면역된 혈청 보다 BRU 및 MN/V3 루프 펩티드, CD 결합 부위 펩티드 및 면역 공여 gp41 펩티드에 대해 훨씬 더 큰 반응성을 갖는다는 것을 나타낸다. rgp160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청은 pM160 면역된 항혈청 보다 rgp60에 대해 훨씬 더 높은 타이터를 갖지만, 시험된 gp160의 3개의 특이적 중화 에피토프에 대해서는 더 낮은 활성을 갖는다.
DNA 면역화에 의해 생산된 항혈청이 항바이러스 활성을 갖는지를 결정하기 위하여, HIV-1 감염을 중화시키는 항혈청의 능력을 시험하였다. 100 TCID50에서 무세포 HIV-1/III8바이러스를 MT-2 표적 세포를 감염시키는데 사용하기 전에 항혈청의 연속 희석액과 함께 인큐베이션시켰다[Montefiori, D.C., (1988) J. Clin. Microbio. 26: 231-235 참조].
100 TCID50HIV-1/III8세포 유리 바이러스를 37 ℃에서 1시간 동안 항혈청의 연속 희석액과 함께 예비 인큐베이션시켰다. 인큐베이션에 이어서, 미리 처리된 바이러스를 37 ℃에서 1시간 동안 4 ×104표적 세포주, MT-2 상에 플레이팅시키고, 감염에 이어서 MT-2 세포를 3회 세척하고 5% CO2분기하에 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 3일 후에, 위상차 현미경으로 3회 실험에서 웰 당 합포체의 수를 육안으로계수하여 융합을 정량적으로 평가하였다.
결과를 제4도에 나타내었다. 제4A도는 pM160 면역된 혈청을 이용한 결과를 나타내는 제4B도와 비교하여 백터 면역된 마우스 혈청을 이용한 결과를 나타내는 것이다. 희석 인자에 대한 중화 값(Vn/Vo)(Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research eds. Aldovini. A. & Walkter, B.d., 77-86 M Stockton Press)을 제4C도에 예시하였다. 대조 혈청(-×)은 pMAMneoBlue 벡터 면역된 마우스로부터 얻은 것이다. 시험 혈청(-O-)은 pM160 면역된 마우스로부터 얻은 것이다.
합포체 억제는 문헌[Osther, K., et al., (1991) Hybridoma 10: 673-683]에 기재된 바와 같이 실시하였다. 5% CO2분위기하에 37 ℃에서 30분 동안 총 용적 50 ㎕중의 96 웰 플레이트에서 제조된 항혈청의 연속 희석액(1:100, 1:200 및 1:400)과 함께 H9/III8세포주를 예비 인큐베이션시켰다. 3일 후에, 위상차 현미경으로 웰당 합포체의 수를 육안으로 계수하여 융합을 정량적으로 평가하였다. 제4D도는 예비면역 혈청으로 처리된 HIV-1/III8세포주와 함께 배양된 표적 세포에 대한 것이다. 제4E도는 제4D도와 동일하지만, 벡터 대조군 예비면역 혈청으로 처리된 것을 나타낸다. 제4F도는 제4D도와 동일하지만, rgp160 면역된 혈청으로 처리된 것을 나타낸다. 제4G도는 제4D도와 동일하지만, pM160 면역된 혈청으로 처리된 것을 나타낸다. 제4D도 내지 4G도는 여러 분석 중에서 1:200으로 희석한 경우에서 합포체의 억제가 분명하게 일어났음을 나타낸다. MT-2 세포를, 합포체를 쉽게 형성한 벡터 면역된 항혈청과 예비 인큐베이션된 무세포 HIV-1/III8로 감염시켰다(제4A도). 대조적으로 pM160 면역된 마우스 혈청과 예비 인큐베이션한 것은 합포체 형성을 억제하였다(제4B도). 중화 동력학을 항혈청이 연속 배양에 대한 Vn/Vo(Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research, eds. Aldovini, A. & Walker, B.D., 77-86, M Stockton Press)에 의해 측정하였다(제4C도). pM160 면역된 마우스로부터 얻은 혈청은 1:320 까지의 희석에서 생물학적 활성이 있는 중화 활성을 가지며 대조 항혈청은 유사한 활성을 나타내지 않는다.
pM160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청이 직접적인 세포 대 세포 융합을 통하여 엔벨럽-매개된 바이러스 스프레드를 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 합포체 억제 분석을 실시하였다. pM160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청은 1:200의 희석에서 HIV-1 유도된 합포체 형성을 억제하였다(제4G도). 대조적으로, 예비 면역 혈청(제4D도). rgp160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청(제4F도) 및 대조 벡터 -면역된 동물로부터 얻은 항혈청(제4E도)은 동일한 희석비에서 합포체 형성을 억제하지 못했다.
이러한 혈청의 중화 관찰(제4A-C도) 및 합포체 억제 분석(제4D-G도)은 관찰된 ELISA 반응성과 관련이 있다(제3도). 중화 에피토프에 높은 결합력을 나타내는 pM160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청은 높은 항바이러스 활성을 나타내고, 반대로 rgp160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청을 포함한, 이러한 에피토프에 거의 결합하지 않는 혈청은 낮은 항바이러스 활성을 갖는다.
pM160 면역된 마우스로부터 얻은 항혈청이 CD4 보유 T-세포에 대한 gp120의결합을 억제할 수 있는지를 시험하기 위하여, 형광 혈구계산에 의해 모니터되는 직접적인 억제 분석법을 이용하였다[Chen, Y.H. et al., (1992) AIDS 6: 533-539 참조]. pM160 구조물 면역된 마우스로부터 얻은 혈청이 CD4 보유 T-세포에 대한 gp120의 결합을 억제할 수 있으며, 면역 혈청의 1:15 희석액이 유동 혈구 계산에 의해 평가된 바와 같이 중복 실험에서 CD4+SupT1 세포에 대한 FITC-gp120의 결합을 22 ±2%까지 억제하였음을 관찰하였다. 이는 표적 세포르의 HIV 유입에 대한 영역이 이러한 항혈청에 의해 기능적으로 억제될 수 있음을 나타낸다. 이러한 데이타는 CD4 결합 부위 펩티드에 대해 관찰된 항혈청의 ELISA 반응성과 일치한다(제3C도).
면역글로불린 이소타입 연구는 시판되는 마우스 모노클로날 항체 이소타이핑키트(Sigma)를 사용하여 실시하였다. pM160 면역화에 의해 유발되는 항-gp160 특이적 항체 중에서 19%는 IgG1이고, 51%는 IgG2이고, 16%는 IgG3이고 10%는 IgM이고 5%는 IgA이다. IgG 이소타입이 우세한 것은 2차 면역 반으이 일어나는 것을 의미하며 이것은 헬퍼 T-세포가 유전자 면역에 의해 유발될 수 있음을 암시하는 것이다.
pM160 및 pMAMneoBlue DNAs는 마이크로타이터 플레이트 위에 코팅되며 특이적 결합도를 모든 혈청 면역된 동물을 이용하여 ELISA법에 의해 측정하였다. 플라스미드 DNA에 대한 확실한 결합이 관찰되지 않았다. 따라서, 근육 조직에 접종하기 위해 유전자 물질을 사용한 결과 항-플라스미드 DNA 반응을 일으키기가 쉽지 않은 것으로 나타났다.
DNA 구조물을 바늘 주사에 의해 마우스 근육에 도입함으로써 이러한 기술이근육 세포에 의한 DNA 흡수를 조절하는 수단을 제공하지 않는 것과 같이 일치되지 않는 결과를 야기할 수 있다. DNA 구조물 만을 주사한 동물(n4)과 부피바카인으로 예비 처리한 동물(n4)을 비교하였다. 2가지 그룹에서 관찰된 면역 반응은 각각 ELISA 분석법에서 반응하는 동물이 25% 및 75%로서 상이하였다. 효능은 입자 충격과 같은 직접적인 DNA 전달 시스템을 이용하여 증가시킬 수 있다[Klein, T.M. et al., (1992) Bio/technology 10: 286-291].
중화, 합포체 억제, CD4-gp120 결합 및 gp160 상의 몇가지 중요한 영역에 대한 특이적 결합의 증거는 HIV gp160 막 결합 당단백질을 코딩하는 DNA 구조물을 생존 동물의 근육 세포에 직접적으로 도입함으로써 특이적 액소성 반응을 일으킬 수 있으며 생물학적으로 관련있는 항바이러스 항체를 생성할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
백신이 보호 면역 반응을 유발할 수 있는지를 시험하기 위하여, 상기에 기재된 동물 모델을 사용하였다. 종양 세포를, p160을 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물을 플라스미드 pM160으로 백신 접종하였다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물, 벡터 DNA 만으로 백신 접종된 동물 및 gp160 단백질을 투여한 동물이 있다.
그 결과는 유전학적으로 백신 접종된 마우스의 면역 반응이 형질감염된 종양을 완전히 제거하기에 충분한 반면 형질감염되지 않은 종양에는 효과가 없다는 것을 입증한다. gp160 단백질 백신 접종은 형질감염된 종양 크기를 형질감염되지 않은 것에 비해 다소 감소시키긴 하였지만 사망율에는 영향을 미치지 못했다. 백신 접종되지 않은 동물은 형질감염 및 형질감염되지 않은 종양 모두에 대해서 유사한 사망율을 나타냈다.
실시예 4
다음은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 구조물의 목록이다. 하기한 많은 구조물을 생산하는데 출발 물질로서 사용된 벡터 pBabe.puro는 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Morgenstern, J. P., and H. Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18 (12): 3587-3596]에 기재한 바와 같이 처음부터 제조하였다. pBabe.puro 플라스미드는 포유 동물에서 외인성 유전자를 발현시키는데 특히 유용하다. 발현될 DNA 서열은 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMuLV) 말단 반복 배열(LTR)프로모터의 제어하에 클로닝 위치에서 삽입되었다. 이 플라스미드는 푸로마이신 내성에 대한 선택기능한 마커를 함유한다.
실시예 5
플라스미드 pBa.Vα3은 pBabe.puro의 EcoRI 부위에 클로닝된 L, V 및 J 세그먼트를 함유하는 T 세포 수용체 Vα3 영역을 코딩하는 2.7 kb의 EcoRI 게놈 단편을 함유하는 7.8 kb 플라스미드이다. T 세포 수용체 유도된 표적 단백질은 T 세포 매개 자기면역 질환 및 클로노타입 T 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 6
플라스미드 pBa.gagpol-vpr은 pBabe.puro에 클로닝된 HIV/MN으로부터의 gag/pol 및 vif 유전자를 함유하는 9.88 kb 플라스미드이다. vpr 유전자는 결실되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다. HIV DNA 서열은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549]에 공지되어 있다. 이 서열은 진뱅크(Genbank) No. M17449에서 입수할 수 있다.
실시예 7
플라스미드 pM160은 HIV-1/3B 엔벨럽 단백질을 코딩하는 2.3kb의 PCR 단편 및 pMAMneoBlue에 클로닝된 rev/tat 유전자를 함유하는 11.0 kb 플라스미드이다. nef 영역은 결실되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다. HIV-1/3B의 DNA 서열은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Fisher, A., 1985 Nature 316: 262]에 공지되어 있다. 이 서열은 진뱅크 No. K03455에서 입수할 수 있다.
실시예 8
플라스미드 pBa.VL은 pBabe.puro의 XbaI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 항-DNA 항체의 VL 영역을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 5.4 kb 플라스미드이다. 항체 유도된 표적 단백질은 B 세포 매개 자기면역 질환 및 클로노타입 B 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. 항체로부터 기능적인 가변 영역을 클로닝하기 위한 일반적인 방법은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066]에 기재되어 있다.
실시예 9
플라스미드 pOspA.B는 pBabe.puro의 BamHI 및 SalI 부위에 클로닝된, 라임(Lyme's) 질환의 원인이 되는 스피로헤타균인 보렐리아 부르그도페리의 OspA 및 OspB 항원을 코딩하는 코딩 영역을 함유하는 6.84 kb 플라스미드이다. OspA 및 OspB 단편을 생산하는데 사용된 PCR 프라이머는 5'-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3' (SEQ ID NO:3) 및 5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3' (SEQ ID NO:4)이다[Williams, W.V., et al., 1992, DNA and Cell. Biol. 11(3): 207 참조]. 표적 단백질을 코딩하는 병원체 유전자를 함유하는 이 플라스미드는 라임 질환에 대한 면역화에 유용하다.
실시예 10
플라스미드 pBa.Rb-G는 pBAbe.puro의 BamHI 부위에 클로닝된 광견병 G 단백질을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 7.10 kb 플라스미드이다. 광견병 G 단백질을 코딩하는 병원체 유전자를 함유하는 이 플라스미드는 광견병에 대한 면역화에 유용하다. DNA 서열을 진뱅크 No. M32751에서 입수할 수 있다[Anilionis, A., at al., 1981 Nature 294:275 참조].
실시예 11
플라스미드 pBa HPV-L1은 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된, 인간 유두종 바이러스(HPV) 균주 16, 18, 31 및 33을 포함한 HPV의 L1 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 6.80kb 플라스미드이다. 이 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인해 발생되는 암의 면역화에 유용하다. DNA 서열은 진뱅크 No. M15781에서 입수할 수 있다[Howley, P., 1990 Fields Virology, Volume 2, Eds.: Channock, R.M. et al., Chapter 58: 1625; and Shah, K. and P., Howley, 1990 Fields Virology, Volume 2, Eds.: Channock, R.M. et al. Chapter 59 참조].
실시예 12
플라스미드 pBa.HPV-L2는 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된, 인간 유두종 바이러스(HPV) 균주 16, 18, 31 및 33을 포함한 HPV의 L2 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 6.80 kb 플라스미드이다. 이 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인해 발생되는 암을 면역화하는데 유용하다. DNA 서열은 진뱅크 NO. M15781에서 입수할 수 있다[Howley, P., 1990 Fields Virology, Volume 2, Eds.: Channock, R.M. et al., Chapter 58: 1625: and Shah, K. and P. Howley, 1990 Fields Virology, Volume 2, Eds.: Channock, R.M. et al. Chapter 59 참조].
실시예 13
플라스미드 pBa.MNp7은 pBabe,puro의 BamHI 부위에 클로닝된, HIV MN gag (코딩 단백질) 서열을 포함한 p7 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 5.24 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 이러한 플라스미드는 HPV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549 참조]에 공지되어 있다. 이서열은 진뱅크(Genbank) No. M17449에서 입수할 수 있다.
실시예 14
플라스미드 pGA733-2는 결장 직장암 세포주 SW948부터 pCDM8 벡터의 BstXI 부위에 클로닝된 GA733-2 종양 표면 항원을 함유하는 6.3 kb 플라스미드이다[B. and A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365 참조]. 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질환에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733-2 항원은 결장 암에 대해 유용한 표적 항원이다. GA733 항원은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Szala, S. et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3542-3546 참조]에 기재되어 있다.
실시예 15
플라스미드 pT4-pMV7은 pMV7 벡터의 EcoRI 부위에 클로닝된 인간 CD4 수용체를 코딩하는 cDNA를 함유하는 11.15 kb 플라스미드이다. 이 CD4 표적 단백질은 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다. 플라스미드 pT4-pMV7은 AIDS 레포지터리 카탈로그 No. 158로부터 입수할 수 있다.
실시예 16
플라스미드 pDJGA733은 pBabe.puro의 BamHI 부위에 클로닝된 GA733 종양 표면 항원을 함유하는 5.1 kb 플라스미드이다. 이 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질환에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733 항원은 결장 암에 대해 유용한 표적 항원이다.
실시예 17
플라스미드 pBa.RAS는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고 pBabe.puro의 BamHI 부위에 클로닝된 ras 코딩 영역을 함유하는 6.8 kb 플라스미드이다. ras 표적 단백질은 세포질 시그날링 분자의 예이다. ras를 클로닝하는 방법은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. 플라스미드를 코딩하는 Ras는 암, 특히 방광, 근육, 폐, 뇌 및 뼈 암과 같은 과증식성 질환과 같은 ras 관련 암에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 18
플라스미드 pBa.MNp55는 pBabe.puro의 BamHI 부위에 클로닝된 HIV MN gag 전구체(코어 단백질) 서열을 포함한 p55 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성된 단펀을 함유하는 6.38 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다[Reiz M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549]. 이 서열은 진뱅크 No. M17449에서 입수할 수 있다.
실시예 19
플라스미드 pBa.MNp24는 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 전체 HIV MN gag 코딩 영역을 포함한 p24 코딩 영역을 코딩하는 pMN-SF1 주형으로부터의 PCR 생성된 단편을 함유하는 5.78 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549]. 이 서열은 진뱅크 No. M17449에서 입수할 수 있다.
실시예 20
플라스미드 pBa.MNp17은 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 HIV MN gag(코어 단백질) 서열을 포함한 p17 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 5.5 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549]. 이 서열은 진뱅크 No. M17449에서 입수할 수 있다.
실시에 21
플라스미드 pBa.SIVenv는 pBR322 중에 SIV 239를 함유하는 구조물로부터 증폭되고 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.71 kb의 PCR 생성된 단편을 함유하는 7.8 kb 플라스미드이다. 사용된 프라이머는 5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3' (SEQ ID NO:5) 및 5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3' (SEQ ID NO:6)이다. 이 플라스미드는 AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리에이젼트 프로그램 카탈로그 No. 210으로부터 입수할 수 있다.
실시예 22
플라스미드 pcTSP/ATK.env는 pcDNAl/neo 벡터에 서브클로닝된, HTLV-1/TSP 및 ATK 단리물로부터의 완전한 HTLV 엔벨럽 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성된 단편을 함유하는 8.92 kb 플라스미드이다. 사용된 프라이머는 5-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3' (SEQ ID NO:7) 및 5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3' (SEQ ID NO:8)이다. 플라스미드 pcTSP/ATK.env는 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3599]에 보고되어 있다. HTLV env 표적 단백질은 HTLV 및 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 23
플라스미드 pBa.MNgp160은 pSP72 중에 MNenv를 함유하는 구조물로부터 증폭되고 pBabe.puro의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.8 kb PCR 생성된 단편을 함유하는 7.9 kb 플라스미드이다. 사용된 프라이머는 5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3' (SEQ ID NO:9) 및 5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3' (SEQ ID NO:10)이다[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retor. 8: 1549]. 이 서열은 진뱅크 No. M17449에서 입수할 수 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 24
플라스미드 pC.MNp55는 MN 단리물의 gag 영역으로부터 증폭되고 pCEP4 벡터에 클로닝된 1.4 kb의 PCR 생성된 단편을 함유하는 11.8 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다[Reiz. M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549]. 이 서열은 진뱅크 No. M17449에서 이수할 수 있다.
실시에 25
플라스미드 pC.Neu는 LTR-2/erbB-2 구조물로부터 절단되고 pCEP4 벡터에 서브 클로닝된 인간 neu 암유전자 코딩 영역을 함유하는 3.8 kb의 DNA 단편을 함유하는 14.2 kb 플라스미드이다. pC.Neu 플라스미드는 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Difiore 1987 Science 237:178]에 보고되어 있다. neu 암유전자 표적 단백질은 암, 특히 결장, 유방, 폐 및 뇌 암과 같은 과증식성 질환에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용한 표적 단백질로서 유용한 성장 인자 수용체의 예이다.
실시예 26
플라스미드 pC.RAS는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고 pCEP4의 BamHI 부위에 서브클로닝된 ras 암유전자 코딩 영역을 함유하는 1.4 kb의 DNA 단편을 함유하는 11.7 kb 플라스미드이다. pC.RAS 플라스미드는 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. ras 표적 단백질은 세포질 시그날링 분자의 예이다. 플라스미드를 코딩하는 Ras는 암, 특히 방광 근육, 폐, 뇌 및 뼈 암과 같은 ras 관련 암과 같은 과증식성 질환에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 27
플라스미드 pNLpuro는 HIV gag/pol 및 SV40-puro 삽입물을 함유하는 15 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이러한 HIV 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 그의 치료에 유용하다.
실시예 28
마우스에서의 인간 CD4에 대한 유전자 백신의 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 이 실험은 T 임파종 항원으로부터 보호하는 백신의 능력을 시험하기 위해 계획하였다. T 세포 임파종에서 CD4는 종양 특이성 항원이다. 따라서,이러한 모델은 T 임파종으로부터 보호하는 유전자 백신의 능력을 입증하는 것이다. 또한, 이 실험에서 분자의 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하는 것에 대한 효능을 시험하였다. CD4는 인간과 마우스종 사이에 잘 보존되어 있다.
사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, CD4를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다. 동물들은 면역 적응성이 있긴 하지만, 면역 반응은 백신 접종되지 않은 동물중의 이식된, CD4-표지된 종양에 대해 직접적인 것은 아니다.
유전학적으로 면역된 동물을 실시예 15에 기재된 플라스미드 pT4-pMV7로 백신 접종하였다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 CD4 단백질을 투여한 동물이있다.
본 명세서에 기재된 유전자 면역 방법에서, BALB/c 마우스의 사두 근육에 27-게이지 바늘을 이용하여 등장성 NaCl 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 100 ㎕를 주사하여 근육 세포 재형성을 자극하고 유전자 구조물의 흡수를 용이하게 하였다. 24시간 후에, 동일한 주사 부위에 대조군 플라스미드로서 pT4-pMV7 100 ㎍ 또는 pMV7 100 ㎍을 주사하였다. 마우스에 동일한 양의 DNA 구조물을 동일한 방법으로 2주 간격으로 3회 추가 접종하였지만 부피바카인-HCl로 예비 처리하지는 않았다.
동물에 1,000,000 CD4-표지핀 종양 세포를 넣었다. 백신 접종되지 않은 동물에서 약 7 내지 10주 후에 큰 종양이 형성되고 그 동물들은 사망하였다. 백신 접종된 동물에서는 유사한 치명적인 종양이 형성되지 않았다.
결과는 유전학적으로 백신 접종된 마우스의 면역 반응이 형질감염된 종양을 완전히 제거하기에 충분한 반면 형질감염되지 않은 종양에는 효과가 없다는 것을 입증한다. CD4 단백질 백신 접종은 형질감염된 종양 크기를 형질감염되지 않은 것에 비해 다소 감소시키긴 하였지만 사망율에는 영향을 미치기 못했다. 백신 접종되지 않은 동물은 형질감염 및 형질감염되지 않은 종양 모두에 대해서 유사한 사망율을 나타냈다.
실시예 29
마우스에서의 인간 GA733에 대한 유전자 백신의 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 이 실험은 결장 암과 같은 GA733 관련 암으로부터 보호하는 백신의 능력을 시험하기 위해 계획하였다. 사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를 GA733을 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포구를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물을 상기 방법에 따라서 실시예 14에 기재된 플라스미드 pGA733-2로 백신 접종하였다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 GA733단백질을 투여한 동물이 있다.
결과는 유전학적으로 백신 접종된 마우스의 면역 반응이 형질감염된 종양을 완전히 제거하기에 충분한 반면 형질감염되지 않은 종양에는 효과가 없다는 것을 입증한다. GA733 단백질 백신 접종은 형질감염된 종양 크기를 형질감염되지 않은 것에 비해 다소 감소시키긴 하였지만 사망율에는 영향을 미치지 못했다. 백신 접종되지 않은 동물은 형질감염 및 형질감염되지 않은 종양 모두에 대해서 유사한 사망율을 나타냈다.
실시예 30
마우스에서의 인간 p185neu에 대한 유전자 백신의 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 이 실험은 유방, 폐 및 뇌 암과 같은 p185neu 관련 암으로 부터 보호하는 백신의 능력을 시험하기 위해 계획하였다. 사용된 동굴 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, neu를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물은 상기 방법에 따라 LTR-2 벡터의 XhoI 부위에 클로닝된 인간 neu 암유전자 코딩 영역을 함유하는 14.3 kb의 플라스미드인 프라스미드 pLTR 2/erbB-2로 백신 접종되었다. 5'LTR 및 3'LTR는 몰로니-MuLV LTR로부터 얻은 것이다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 p185neu 단백질을 투여한 동물이있다.
결과는 유전학적으로 백신 접종된 마우스의 면역 반응이 형질감염된 종양을 완전히 제거하기에 충분한 반면 형질감염되지 않은 종양에는 효과가 없다는 것을 입증한다. p185 단백질 백신 접종은 형질감염된 종양 크기를 형질감염되지 않은 것에 비해 다소 감소시키긴 하였지만 사망율에는 영향을 미치지 못했다. 백신 접종되지 않은 동물은 형질감염 및 형질감염되지 않은 종양 모두에 대해서 유사한 사망율을 나타냈다.
실시예 31
마우스에서의 인간 Ras에 대한 유전자 백신의 효능은 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 이 실험은 방광, 근육, 페, 뇌 및 뼈 암과 같은 Ras 관련 암으로부터 보호하는 백신의 능력을 시험하기 위해 계획하였다. 사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, Ras를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물은 상기한 백신 접종법에 따라 실시예 17에 기재된 플라스미드 pBa.RAS로 백신 접종되었다. ras 표적 단백질은 세포질 시그날링 분자의 예이다. ras를 클로닝하는 방법은 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 Ras 단백질을 투여한 동물이 있다.
실시예 32
마우스에서 인간 광견병 G 단백질 항원에 대한 유전자 백신의 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, 광견병 G 단백질을 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물은 상기한 백신 접종법에 따라 실시예 10에 기재된 플라스미드 pBa.Rb-G로 백신 접종되었다. 광견병 G 표적 단백질은 병원체 항원의 예이다. DNA 서열은 진뱅크 No. M32751에 기재되어 있다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 G 단백질을 투여한 동물이 있다.
실시예 33
마우스에서의 라임 질환 항원에 대한 유전자 백신이 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, OspA 및 OspB를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물은 실시예 9에 기재된 플라스미드 pOspA. B로 백신 접종되었다. 대조군에는 백신 접종되지 않은 동물 및 OspA 및 OtpB 단백질을 투여한 동물이 있다.
실시예 34
마우스에서의 인간 T 세포 수용체 가변 영역에 대한 유전자 백신의 효능을 시험하기 위해 DNA 구조물을 설계하였다. 이 실험은 T 세트 임파종 및 T 세포 매개 자기면역 질환과 같은 T 세포 수용체 유도된 단백질 관련 암으로부터 보호하는 백신의 능력을 시험하기 위해 계획하였다. 사용된 동물 모델은 상기한 바와 같다. 종양 세포를, Ras를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 단백질 발현을 확인하고 동물에 이식하였다. 대조군에는 형질감염되지 않는 종양 세포주를 포함시켰다.
유전학적으로 면역된 동물은 상기한 백신 접종법에 따라 실시예 5에 기재된 플라스미드 pBa.Vα3로 백신 접종되었다.
실시예 35
플라스미드 pM160은 HIV의 env 부분으로부터 1개 이상의 유전자를 발현시키는 데 유용한 몇개의 플라스미드의 출발 물질로서 사용될 수 있다. pM160의 제조법은 상기한 바와 같다. 플라스미드는 gp160, tat 및 rev 코딩 영역을 포함한다. nef유전자는 존재하지 않는다.
gp160/rev/tat 유전자 발현을 조절하는 프로모터는 MMTV LTR이다. 이 프로모터는 제거될 수 있으며, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, HIV LTR 프로모터 및 CMV 프로모터로 대체될 수 있다.
암피실린 내성 부여 유전자는 결실되거나 또는 불활성화될 수 있다. 네오마이신 내성 부여 유전자는 박테리아 프로모터의 제어를 받을 수 있다.
라우스 가계 육종 바이러스 인헨서는 플라스미드로부터 제거될 수 있다. RSV인헨서는 근육 크레아틴 인헨서로 대체될 수 있다.
gp160/rev/tat 유전자는 다른 리딩 프레임에서 동일한 뉴클레오티드와 겹치거나 공유한다. rev 유전자는 그의 개시 코돈을 다른 코돈으로 변화시킴으로써 결실될 수 있다. 마찬가지로, tat 유전자는 동일한 수단에 의해 제거될 수 있다. 각 플라스미드에서 gp160/rev/tat를 조절하기 위해 HIV LTR 프로모터를 사용하는 것을 제외하고는 rev, tat 또는 rev 및 tat 모두가 제거될 수 있다. HIV LTR 프로모터를 사용하는 플라스미드에서 tat는 존재해야 한다.
다음 표는 pM160 변형된 플라스미드의 목록이다. 각 플라스미드는 불활성화된 암피실린 유전자를 갖는다. 각각에서 RSV 인헨서를 제거하였다. 몇가지는 인헨서를 갖지 않으며(no), 몇가지는 크레아틴 근육 인헨서를 갖는다(CME). 몇가지 경우에서는 HIV rev 유전자를 가지며(yes), 다른 경우에서는 그것이 제거되었다(no).몇가지는 HIV tat 유전자를 가지며(yes), 다른 경우에서는 그것이 제거되었다(no).
구조물 RA-29 내지 RA-56은 각 경우에서 네오마이신 유전자를 조절하는 프로모더가 박테리아 프로모터인 것을 제외하고는 RA-1 내지 RA-32와 동일하다.
실시예 36
플라스미드 pNLpuro는 HIV gag/pol 유전자를 발현하는 몇가지 다른 플라스미드를 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, pNLpuro는 gag pol의 발현을 위해 제조되었다. 상기한 플라스미드 pNLpuroΔvpr은 백신 접종에 의해 도입될 유전자 세트로부터 필요한 조절 단백질을 제거하기 위하여 HIV gag pol 벡터로부터 vpr 조절 유전자를 결실시키는 것으로 계획되었다. vpr 이외에도, 표준 분자 생물학 기술 및 시판되는 출발 물질을 이용하여 통상의 기술을 가진 자에 의해 플라스미드 pNL43puro에 대한 다른 변화가 이루이질 수 있다.
HIV 서열의 인간 플랭킹 서열 5' 및 3'은 몇가지 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들면, PCR을 이용하여 HIV, SV40-puro 및 pUC18 서열이 증폭되고 재구성될 수 있다.
바이러스의 패키징에 중요한 HIV의 psi 영역은 pNL43puro-기재 플라스미드로부터 제거될 수 있다. psi 영역을 제거하기 위하여, pNLpuro 플라스미드는 SacI 및 SpeI로 전달될 수 있다. 이러한 분해 결과 psi 영역 뿐만 아니라 psi의 업스트림인 5' LTR 및 psi의 다운스트림인 gag/pol 영역의 일부를 제거한다. 제거된 비-psi 서열을 재삽입하기 위하여, 이러한 서열을 재생산하는 PCR 증폭을 실시하였다. psi를 재생산하지 않고 psi에 HIV 서열 5' 및 3'의 일부를 재생시키는 것으로 설계되었다. 이 프라이머는 5' LTR의 플라스미드 5' 부분에 SacI 부위를 재형성시킨다. 이 플라스미드는 SacI 부위의 업스트림으로부터 psi 영역의 5' 의 바로 3' 부위까지 다운스트림으로 향하여 3' 말단에 AatI 부위를 형성시킨다. psi 영역의 바로 5'에서 출발하는 프라이머는 또한 AatI 부위를 생성시키고, SpeI 부위의 3'에서 출발하는 프라이머는 그 부위를 재형성시킨다. PCR 형성된 단편은 SacI, AatI 및 SpeI로 분해되고 SacI/SpeI 분해된 pNLpuro-psi 단편과 함께 연결된다. HIV 5'LTR 프로모터는 제거될 수 있으며, 몰로니 바아러스 프로모터, MMTV LTR, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터 및 CMV 프로모터로 대체될 수 있다.
HIV 3'LTR 폴리아데닐화 부위는 제거될 수 있으며 SV40 폴리아데닐화 부위로 대체될 수 있다.
암피실린 내성 부여 유전자는 결실되거나 또는 불활성화될 수 있다.
다음 표는 HIV psi 및 vpr 영역이 제거되고 HIV 서열의 인간 플랭킹 영역 5' 및 3'이 제거되는 pNLpuro-기재 구조물의 목록이다.
구조물 LA-17 내지 LA-32 각 경우에서 인간 플랭킹 서열 중 적어도 하나가 남아 있는 것을 제외하고는 각각 LA-1 내지 LA-16과 동일하다.
실시예 37
env 유전자를 발현하는 또다른 구성에서, HIV의 그 영역은 시판되는 플라스미드 pCEP4(Invitrogen)에 삽입될 수 있다. pCEP4 플라스미드는, 그것이 엡스타인 바르 바이러스의 복제 기원 및 통합 없이 다수의 배체 복체를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 함유하기 때문에 특히 유용하다. pCEP4는 또한 티미딘 키나제 프로모터 및 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있는 하이그로마이신 마커를 함유한다. HIV env 코딩 영역은 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있다. HIV env 코딩 영역은 2.3 kb PCR 단편 형태 HIV/3B(진뱅크 서열 K03455)로서 얻어진다. 생성된 pCEP4-기재 플라스미드 pRA-100은 염색체외적으로 유지되고 gp160 단백질을 생산한다.
실시예 38
env 유전자를 발현하는 또다른 구성에서, HIV의 그 영역은 시판되는 플라스미드 pREP4(Invitrogen)에 삽입될 수 있다. pREP4 플라스미드는, 그것이 엡스타인바르 바이러스의 복제 기원 및 통합 없이 다수와 배체 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 함유하기 때문에 특히 유용하다. pREP4는 또한 티미딘 키나제 프로모터 및 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있는 하이그로마이신 마커를 함유한다. HIV env 코딩 영역은 RSV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있다. HIV env 코딩 영역은 2.3 kb PCR 단편 형태 HIV/3B(진뱅크 서열K03455)로서 얻어진다. 생성된 pCEP4-기재 플라스미드 pRA-101은 염색체외적으로 유지되고 gp160 단백질을 생산한다.
실시예 39
gag/pol 유전자를 발현하는 또다른 구성에서, HIV의 그 영역은 시판되는 플라스미드 pCEP4(Invitrogen)에 삽입될 수 있다. pCEP4 플라스미드는, 그것이 엡스타인 바르 바이러스의 복제 기원 및 통합 없이 다수의 베체 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 함유하기 때문에 특히 유용하다. pCEP4는 또한 티미딘 키나제 프로모터 및 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있는 하이그로마이신 마커를 함유한다. HIV gag/pol 코딩 영역은 CMV 포로모터 및 SV40 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있다. HIV gag/pol 코딩 영역은 HIV MN(진뱅크 서열 M17449)으로부터 얻어지고 vif 유전자를 포함한다. vpr 유전자는 포함되지 않는다. 생성된 pCEP4-기재 플라스미드 pLA-100은 염색체외적으로 유지되고 GAG55, 역전사 효소, 프로테아제 및 인테그라제 단백질을 생산한다.
실시예 40
gag/pol 유전자를 발현하는 또다른 구성에서, HIV의 그 영역은 시판되는 플라스미드 pREP4(Invitrogen)에 삽입될 수 있다. pREP4 플라스미드는, 그것이 엡스타인 바르 바이러스의 복제 기원 및 통합 없이 다수의 배체 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 함유하기 때문에 특히 유용하다. pREP4는 또한 티미딘 키나제프로모터 및 폴리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있는 하이그로마이신 마커를 함유한다. HIV gag/pol 코딩 영역은 CMV 프로모터 및 SV40 플리아데닐화 부위의 조절적 제어하에 있다. HIV gag/pol 코딩 면역은 HIV MN(진뱅크 서열 M17449)으로부터 얻어지고 vif 유전자를 포함한다. vpr 유전자는 포함되지 않는다. 생성된 pREP4-기재 플라스미드 pLA-101은 염색체외적으로 유지되고 GAG55, 역전사 효소, 프로테아제 및 인테그라제 단백질을 생산한다.
실시예 41
pGAGPOL.rev로서 본 명세서에 언급된 다음의 구조물은 HIV gag/pol 유전자를 발현하는데 유용하다.
이 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자 및 pBR322 DNA 복제 기원을 포함한다. 전사 조절에 제공된 서열에는 사이토메갈로바이러스 프로모터; 라우스 육종 바이러스 인헨서; 및 SV40 폴리아데닐화 시그날이 있다. pGAGPOL.rev에 포함된 HIV-1 서열에는 gag 오픈 리딩 프레임의 p17, p24 및 p15를 코딩하는 서열; 프로테아제를 코딩히는 서열; 작은 결실부를 함유하는 역전사 효소를 코딩하는 서열 및 pol 오픈 리딩 프레임의 인테그라제의 불활성 아미노 말단을 코딩하는 서열; 및 rev를 코딩하는 서열이 있다. 각각의 HIV 서열은 HIV-1 균주 HXB2으로부터 유도된다.
pGAGPOL.rev에는 몇가지 안정성 특징이 있다. 이것의 예로는 CMV 프로모터 및 비-레트로바이러스 폴리(A) 부위의 용도가 포함된다. 또한, Ψ 서열의 삭제는 바이러스 RNA를 패키징하는 능력을 제한한다. 또한, 역전사 효소의 다중 변이는 효소적으로 불활성인 생성물을 생산하게 된다. 또한, 많은 인테그라제의 삭제는 불활성 생성물을 생산하며 카나마이신 내성 마커가 박테리아 형질 변형체를 안정화하는데 유용하다.
플라스미드 pGAGPOL.rev를 다음과 같이 제조하였다.
단계 1: Bluescript (Stratagene) 내로 클로닝된 HIV-1(HXB2) 게놈의 일부의 서브클론을 제조하였다. HIV-1의 서브클론은 뉴클레오티드 5795(Genebank 번호)까지의 HIV-1 게놈의 나머지 및 완전한 5'LTR을 함유한다. HIV-1 서열은 HXB2D 플라스미드 (AIDS Repository)로부터 얻었다.
단계 2: HXB2D 플라스미드(AIDS Repository)의 오픈 리딩 프레임으로부터의 gag 일부를 PCR시켰다. NotI 및 SpeI로 PCR 단편을 절단하고, NptI 및 SpeI로 제한된 상기한 HIV-1 서브클론과 연결하였다.
단계 3: gag/pol 연결점 및 HXB2D 플라스미드 (AIDS Repository)로부터 얻은 pol-코딩 서열 일부를 프라이머 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16을 이용하여 PCR시켰다. PCR 생성물을 ClaI로 절단하고 함께 연결시켰다. 연결된 단편을 BclI 및 SalI로 절단하고 BclI 및 SalI로 분해된 단계 2에서 얻은 플라스미드와 연결시켰다.
단계 4: 단계 3에서 얻은 플라스미드를 BspMI 및 EcoRI로 절단시키고 링커 SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:18을 어닐링시켜 형성한 어댑터와 재연결하였다.
단계 5: 단계 4에서 얻은 플라스미드를 NotI 및 SalI로 절단하고 pENV에 대한 설명(하기함) 4a 또는 4a로부터 얻은 플라스미드와 연결시켰다. NotI 및 SalI로 다시 절단시켰다.
단계 6: 단계 5에서 얻은 플라스미드를 SalI 및 MiuI로 제한시키고 프라이머 SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20을 이용한 rev의 PCR에 의해 얻은 PCR 생성물과 연결시켰다.
단계 7: 단계 6에서 얻은 플라스미드를 NotI로 절단시키고 프라이머 SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22를 이용한 HXB2D 플라스미드(AIDS Repository) 중의 rev 반응 요소의 PCR에 의해 얻은 PCR 생성물과 연결시켰다.
단계 6 및 7은 선택적이다.
실시예 42
pENV로서 본 명세서에 언급된 다음의 구조물은 HIV env 유전자를 발현하는데 유용하다.
이 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자 및 pBR322 DNA 복제 기원을 포함한다. 전사 조절에 제공된 서열에는 사이토메갈로바이러스 프로모터; 라우스 육종 바이러스 인헨서; 및 SV40 폴리아데닐화 시그날이 있다. pENV에 포함된 HIV-1 서열에는 vpu를 코딩하는 서열; rev를 코딩하는 서열; gp160을 코딩하는 서열; nef의 50%를 코딩하는 서열; vif를 코딩하는 서열; 및 13 아미노산 카르복시 말단 결실부를 가진 vpr을 코딩하는 서열이 있다. vpu, rev, gp160 및 nef 서열은 HIV-1 균주 MN으로부터 유도된다. vif 및 vpr 서열은 HIV-1 균주 HXB2로부터 유도된다.
pGAGPOL.rev에는 몇가지 안정성 특징이 있다. 이것의 예로는 CMV 프로모터 및 비-레트로바이러스 폴리(A) 부위의 용도가 포함된다. 또한, tat는 결실되어 있고 nef의 50% 결실부는 "불활성" nef 생성물을 생산한다. 또한, vif 및 vpr은 보통 서열에서 벗어나 있으며 vpr의 부분적인 삭제는 불활성 vpr 생성물을 생산하게한다.
플라스미드 pENV를 다음과 같이 제조하였다.
단계 1: HindIII 및 EcoRI로 분해된 pUC18을 출발 물질로 하였다. ColE1 복제 기원 및 laci 유전자를 함유하는 생성된 단편은 육종 바이러스 인헨서를 함유하는 pMAMneoBlue로부터 얻은 EcoRI/HindIII 단편과 연결되어야 한다. 생성된 플라스미드 또는 클론테크(Clontech; Palo Alto, CA)사로부터 얻은 pMAMneo-Blue는 HindIII 및 BgII로 분해될 수 있다. 표준 기술을 이용하여, 진블럭 플라스미드 (Pharmacia)의 PCR에 의해 얻은 kan 유전자를 함유하는 단편과 연결시켰다.
단계 2: pMAMneo-Blue가 출발 플라스미드로서 사용되는 경우, MluI 및 EcoRI로 분해시키고, 폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 말단을 채우고 재연결시켰다.
단계 3: pMAMneo-Blue 및 pUC18-유도된 플라스미드를 HindIII로 분해시키고 SV40 폴리A 부위 및 프라이머 SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24를 이용한 pCEP4(Invitrogen, San Diego CA)의 PCR에 의해 얻은 초기 스플라이싱 영역과 연결시켰다.
단계 4a: BamHI로 분해시키고 프라이머 SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:26을 이용한 pCEP4(Invitrogen, San Diego CA)의 PCR에 의해 얻은 CMV 프로모터와 연결시켰다.
단계 4b: BamHI로 분해시키고 프라이머 SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:28을 이용한 PCR에 의해 얻은 MoMLV LTR과 연결시켰다.
단계 5: NotI 및 MluI로 분해시키고 프라이머 SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:30을 이용한 pMN-ST1의 PCR에 의해 얻은 GP160 코딩 영역과 연결시켰다.
단계 6: MluI로 분해시키고 프라이머 SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32를 이용한 HXB2D 플라스미드(AIDS Repository)에 의해 얻은 온전한 vif 및 13aa 카르복시 말단 결실부를 가진 vpr을 코딩하는 서열과 연결시켰다.
실시예 43
등장성 제약학상 허용되는 용액 중의 pGAGPOL.rev 약 100 ㎍으로 이루어진 제약 조성물; 및 등장성 제약학상 허용되는 용액 중의 pENV 100 ㎍으로 이루어진 제약학상 제제로 이루어지는 면역화 시스템이 제공된다. 또한, 이 면역 시스템은 바람직하게는 등장성 제약학상 허용되는 담체 중의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤 약 1 ml로 이루어진 제약 조성물로 이루어진다.
그러한 바람직한 면역화 시스템에서, 첫번째 세트의 투여에서는 부피바카인 및 2가지 제약 조성물 중 1가지를 개체의 근육내로, 바람직하게는 팔 또는 엉덩이의 근육에 투여된다. 부피바카인 및 2가지 제약 조성물 중 다른 1가지를 개체의 다른 부위에서 근육내로, 바람직하게는 1가지 제약 조성물이 투여된 부분으로부터 멀리 떨어진 부분에, 바람직하게는 다른 팔 또는 엉덩이의 근육에 투여된다. 연속적인 투여는 일정 시간 후에, 바람직하게는 48 시간 내지 2주 이상 후에 실시할 수 있다.
이 면역화 시스템은 개체를 HIV 감염으로부터 예방하거나 또는 HIV 감염된 개체를 면역 치료제로 치료하기 위하여 개체를 백신 접종하는데 사용될 수 있다.
실시예 44
일부 실시태양에서, 본 발명은 개체에 단일 접종물을 투여하여 HIV에 대해 면역화하는 방법에 관한 것이다. 이 접종물로는 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더욱바람직하게는 2개를 초과하는 다수의 HIV 바이러스 유전자 또는 모든 구조 유전자로 이루어진 유전자 구조물을 들 수가 있다. 그러나, 접종물은 모든 HIV 유전자의 완전한 보체를 함유하지 않는다. 단일 세포에 바이러스 유전자의 완전한 보체가 제공되는 경우, 완전한 감염성 바이러스가 세포내에 집합될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 구조물에는 유전자의 그러한 완전한 보체가 제공되지 않는다. 안정성 예방책으로서, 1개 이상의 필수 유전자를 결실시키거나 또는 고의적으로 변화시켜 감염성 바이러스 입자가 형성될 수 없도록 한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 1개, 2개 또는 모든 HIV 구조 유전자의 적어도 일부가 제공된다. HIV의 구조 유전자는 gag, pol 및 env로 이루어진다. 이러한 3개의 유전자 중 적어도 하나의 일부가 유전자 구조를 상에 제공된다. 따라서, 일부 실시태양에서는, gag 및 pol 각각이 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공되고; 일부 실시태양에서는, env의 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공되며; 일부 실시태양에서는, gag의 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공되고; 일부 실시 태양에서는, pol 및 env 각각의 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공되며 일부 실시태양에서는, gag 및 env 각각의 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공되고; 일부 실시태양에서는, pol의 적어도 일부가 유전자 구조물 상에 제공된다. 임의로는 유전자 전체가 제공된다. 임의로는, 이러한 구조물에서, HIV 조절 유전자가 제공될 수도 있다. HIV 조절 유전자로는 vpr, vif, vpu, nef, tat 및 rev가 있다.
실시예 45
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현 단위"란 용어는 폴리아데닐화 시그날에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 코딩 서열은 1개 이상의 단백질 또는 그의 단편을 코딩할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 발현 단위는 플라스미드 내에 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "HIV 발현 단위"란 용어는 코딩 서열이 HIV 단백질에서 발견되는 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 폴리아데닐화 시그날에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. "실질적으로 유사한 에피토프"란 용어는 HIV 단백질의 에피토프와 동일하지 않은 구조를 갖지만 HIV 단백질에 상호 반응하는 세포 또는 액소성 면역 반응을 일으키는 에피토프를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, HIV 발현 단위는 1개 이상의 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, HIV 발현 단위는 플라스미드 내에 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 단일 HIV 발현 단위를 갖는 단일 유전자 구조물이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단일 HIV 발현 단위"란 용어는 단일 HIV 발현 단위를 함유하는 단일 유전자 구조물을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 단일 HIV 발현 단위 구조물은 플라스미드의 형태이다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 각각 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 1개 이상의 HIV 발현 단위를 갖는 단일 유전자 구조물이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "다중 HIV 발현 단위 유전자구조물" 이란 용어는 1개 이상의 HIV 발현 단위를 함유하는 단일 플라스미드를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 다중 HIV 발현 단위 구조물은 플라스미드의 형태이다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 각각 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 2개의 HIV 발현 단위를 갖는 단일 유전자 구조물이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물"은 2개의 HIV 발현 단위를 함유하는 단일 플라스미드를 의미한다. 즉, 2개의 HIV 발현 단위 유전자 발현 단위를 함유하는 다중 HIV 발현 단위 유전자 구조물을 의미한다. 2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물에서, 1개의 HIV 발현 단위는 다른 HIV 발현 단위의 반대 방향에서 작동하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에서, 2개의 HIV 발현 단위 구조물은 플라스미드의 형태이다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 단일 유전자 구조물을 함유하는 HIV 유전자 백신이 제공된다. 단일 유전자 구조물은 단일 HIV 발현 단위 유전자 구조물, 2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물 또는 2개 이상의 HIV 발현 단위를 함유하는 다중 HIV 발현 단위 유전자 구조물일 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 단일 접종물에 1개 이상의 유전자 구조물을 함유하는 HIV 유전자 백신이 제공된다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 1개 이상의 접종물에 1개 이상의 유전자 구조물을 함유하는 HIV 유전자 백신이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "다중 접종물"이란 용어는 각각 별도로 투여되는, 1개 이상의 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신을 의미한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 2개의 유전자 구조물을 함유하는 HIV 유전자 백신이 제공된다. 각 유전자 구조물은 독립적으로 단일 HIV 발현 단위 유전자 구조물, 2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물 또는 2개 이상의 HIV 발현 단위를 함유하는 다중 HIV 발현 단위 유전자 구조물일 수 있다. 일부 실시태양에서, 두 유전자 구조물은 단일 HIV 발현 단위 유전자 구조물이다. 일부 실시태양에서, 두 유전자 구조물은 2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물이다. 일부 실시태양에서, 두 유전자 구조물은 다중 HIV 발현 단위 유전자 구조물이다. 일부 실시태양에서, 1개의 유전자 구조물은 단일 HIV 발현 단위 유전자 구조물이고 다른 것은 2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물이다. 당업계의 통상의 기술을 가진자는 유전자 백신에 사용된 유전자 구조물의 수 및 각 유전자 구조물에 존재할 수 있는 HIV 발현 단위의 수에 따라서 많은 변화가 일어날 수 있음을 쉽게 인지하고 이해할 수 있다.
본 발명의 유전자 구조물은 임의의 HIV 서열, 특히 도입될 세포의 염색체 물질에 대한 HIV 게놈의 통합에 역할을 하는 것을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 유전자 구조물은 HIV로부터 얻은 LTRs를 함유하지 않는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 본 발명의 유전자 구조물은 HIV로부터 얻은 psi 부위를 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 역전사 효소 유전자를 결실시키고 인테그라제 유전자를 결실시키는 것이 바람직하다. 결실에는 유전자를 반드시 결실시키기 위하여 코돈의 일부 막을 결실시키거나 또는 코돈의 일부를 대체하는 것을 포함한다. 예를 들면, 개시 코돈은 프레임에서 제거, 변화 또는 이동되어 코딩하는 뉴클레오티드서열이 불완전하고 비기능적으로 된다.
또한, 본 발명의 유전자 구조물은 HIV로부터 얻은 전사 가능한 tat 유전자를 함유하지 않는 것이 바람직하다. rev유전자와 겹치는 tat 유전자는 rev를 코딩하는 코돈을 rev에 대한 동일한 아미노산을 코딩하지만 tat가 코딩되는 리딩 프레임에서 필요한 tat 아미노산을 코딩하지 않는 다른 코돈으로 대체함으로써 완전히 제거될 수 있다. 별법으로, tat에 대한 개시 코돈을 변화, 즉 반드시 결실시키기 위해 및(또는) 불완전하고 비기능적인 tat를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 형성하기에 충분한 코돈을 변화, 즉 반드시 결실시키기 위해 코돈의 일부만을 변환시킨다.
유전자 구조물은 HIV gag, pol, env 및 rev 단백질로부터의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 유전자 구조물은 1개 이상의 HIV gag, pol, env 및 rev 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 유전자 구조물은 HIV gat, pol, env 및 rev 단백질로부터의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 유전자 구조물은 1개 이상의 HIV gag, pol, env 및 rev 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 HIV vif, vpr, vpu 또는 ref 단백질로부터의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 코딩 서열로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 1개 이상의 HIV vif, vpr, vpu 또는 nef 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어진다.
단일 HIV 발현 단위 유전자 구조물은 단일 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어 하에 있는 단일 발현 단위에 있는 HIV 단백질 또는 그의 단편과 1개 이상의 에피토프를 공유하는 1개 이상의 펩티드에 대한 코딩 영역으로 이루어질 수 있다. 유전자 구조물은 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 것이 바람직하다. 프로모터는 인간 세포에서 임의의 프로모터 기능성일 수 있다. 프로모터로는 SV40 프로모터 또는 CMV프로모터가 있으며, CMV 초기 프로모터가 바람직하다. 폴리아데닐화 시그날은 인간 세포에서 임의의 폴리아데닐화 시그날 기능성일 수 있다. 폴리아데닐화 시그날로는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 있고, SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날이 바람직하다. 1개 이상의 코딩 영역이 단일 발현 단위에 제공된다면, 그들은 서로 아주 인접하거나 또는 코딩되지 않는 영역에 의해 분리될 수 있다. 적당히 발현되도록 하기 위하여, 코딩 영역은 개시 코돈 및 종결 코돈을 가져야 한다.
2개의 HIV 발현 단위 유전자 구조물은 각각 2개의 발현 단위 상의 HIV 단백질 또는 그의 단편과 1개 이상의 에피토프를 공유하는 1개 이상의 펩티드에 대한 코딩 영역으로 이루어질 수 있다. 각 발현 단위는 단일 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어하에 있다. 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 1개 이상의 HIV단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, gag 및 pol을 코딩하는 뉴클레오티트 서열은 하나의 발현 단위 상에 존재하며 env 및rev를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다른 발현 단위 상에 존재하는 것이 바람직하다. 프로모터는 인간 세포에서 임의의 프로모터 기능성일 수 있다. 프로모터로는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터가 있으며, CMV초기 프로모터가 바람직하다. 폴리아데닐화 시그날은 인간 세포에서 임의의 폴리아데닐화 시그날 기능성일 수 있다. 폴리아데닐화 시그날로는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 있고, SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날이 바람직하다. 1개 이상의 코딩 영역이 발현 단위에 제공된다면, 그들은 서로 아주 인접하거나 코딩되지 않는 영역에 의해 분리될 수 있다. 적당히 발현되도록 하기 위하여, 코딩 영역은 개시 코돈 및 종결 코돈을 가져야 한다.
본 발명의 일부 실시태양에 따라서, env 내의 MHC 클래스 II 상호 반응성 에피토프는 결실되고 HIV II로부터의 유사한 영역으로 교체된다.
유전자 구조물이 gag 및(또는) pol을 함유하는 경우, 일반적으로 rev가 존재하는 것이 중요하다. rev이외에도, rev 반응 요소에는 이러한 유전자 발현의 증가를 위해서 gag 및 pol이 제공될 수 있다.
유전자 구조물이 생성될 때, 플라스미드 1에 사용된 env 유전자는 MN 또는 MN과 유사한 임상 단리물, 바람직하게는 합포체 형성을 유도하지 않는 임상 단리물, 바람직하게는 초기 단계 임상 단리물로부터 대식 세포 주성인 것을 포함한 MN형 단리물로부터 유도되는 것이 바람직하다.
다중 단백질은 교대 스플라이싱에 의해 단일 발현 단위로부터 생산될 수 있다. 스플라이싱 시그날은 다른 단백질을 코딩하는 다른 메시지를 생산하는 교대 스플라이싱을 가능하게 한다.
실시예 46
제8도는 4개의 골격 A, B, C 및 D를 나타낸다. 제9도는 4개의 삽입물 1, 2, 3 및 4를 나타낸다. 삽입물 1은 gag 및 pol의 발현을 지지하고, rev 반응 요소는 HIV 스플라이싱 수용체를 보존하는 방법으로 클로닝된다. 삽입물 2는 삽입물 1과 유사하여, rev 반응 요소가 HIV 스플라이싱 수용체를 보존하지 않고 클로닝되는 것을 제외하고는 그것도 역시 gag 및 pol의 발현을 지지한다. 삽입물 3은 gag 및 pol의 발현을 지지하고, 인테그라제 유전자의 결실부를 포함하고 cis 작용 rev 반응 요소가 존재하지 않는다. 삽입물 4는 rev, vpu 및 env의 발현을 지지한다. env는 변화된 MHC 클레스 II 상호 반응성 에피토프를 가져서 상호 반응성을 제거하고 V3 루프는 변화되어 합포체 형성 가능성을 제거할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 A에는 삽입물 1이 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pAlori+는 삽입물 1 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 A이다. 플라스미드 pAlori-는 삽입물 1은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 A이다. 또한, pAlori+ 또는 pAlori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pAlori+int+ 및 pAlori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pAlori+, pAlori-, pAlori+int+ 및 pAlori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pAlori+RT-, pAlori-RT-, pAlori+int+RT- 및 pAlori-int+RT-를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 A에는 삽입물 2가 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pA2ori+는 삽입물 2 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 A이다. 플라스미드 pA2ori-는 삽입물 1은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않는 골격 A이다. 또한 pA2ori+ 또는 pA2ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pA2ori+int+ 및 pA2ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+및 pA2ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- 및 pA2ori-int+RT-를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서 골격 B에는 삽입물 1이 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pB1ori+는 삽입물 1 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 B이다. 플라스미드 pB1ori-는 삽입물 1은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 B이다. 또한, pB1ori+ 또는 pB1ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pB1ori+int+ 및 pB1ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ 및 pB1ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pB1ori+RT-, pB1ori-RT-, pB1ori+int+RT- 및 pB1ori-int+RT-를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 B에는 삽입물 2가 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pB2ori+는 삽입물 2 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 B이다. 플라스미드 pB2ori-는 삽입물 1은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 B이다. 또한, pB2ori+ 또는 pB2ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pB2ori+int+ 및 pB2ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ 및 pB2ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT 및 pB2ori-int+RT를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, rev가 마이너스된 골격 A 에는 삽입물 3이 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pA/r-3ori+는 삽입물 2 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 A이다. 플라스미드 pA/r-3ori-는 삽입물 3은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 rev가 마이너스된 골격 A이다. 또한 pA/r-3ori+ 또는 pA/r-3ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pA/r-3ori+int+ 및 pA/r-3ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ 및 pA/r-3ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- 및 pA/r-3ori-int+RT-를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 C에는 삽입물 1이 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pC1ori+는 삽입물 1 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 C이다. 플라스미드 pC1ori-는 삽입물 1은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 C이다. 또한, pC1ori+ 또는 pC1ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pC1ori+int+ 및 pC1ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ 및 pC1ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pC1ori+RT-, pC1ori-RT-, pC1ori+int+RT- 및 pC1ori-int+RT-를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 C에는 삽입물 2가 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pC2ori+는 삽입물 2 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 C이다. 플라스미드 pC2ori-는 삽입물 2는 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 C이다. 또한, pC2ori+ 또는 pC2ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pC2ori+int+ 및 pC2ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ 및 pC2ori-int+에서 각각 역전사 효소 (RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pC2ori+RT, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- 및 pC2ori-int+RT를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 C에는 삽입물 3이 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pC3ori+는 삽입물 3 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 C이다. 플라스미드 pC3ori-는 삽입물 3은 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 C이다. 또한, pC3ori+ 또는 pC3ori-에 각각 인테그라제를 포함시켜 pC3ori+int+ 및 pC3ori-int+를 생산할 수 있다. 플라스미드 pC3ori+, pC2ori-, pC3ori+int+ 및 pC3ori-int+에서 각각 역전사 효소(RT) 유전자를 기능적으로 결실시킴으로써 더 변형시켜 pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- 및 pC3ori-int+RT를 생산할 수 있다.
일부 실시태양에서, 골격 D 는 삽입물 4가 사용된다. 그러한 구조물은 임의로 SV40 복제 기원을 함유한다. 플라스미드 pC4ori+는 삽입물 4 및 SV40 복제 기원을 함유한 골격 D이다. 플라스미드 pC4ori-는 삽입물 4는 함유하고 SV40 복제 기원은 함유하지 않은 골격 D이다.
실시예 47
일부 실시태양에서, HIV 단백질의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상이 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 단일 발현 단위/단일 접종물 유전자 백신이 제공된다. 이 코딩 서열은 CMV 초기 프로모터 및 SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어 하에 있다.
일부 실시태양에서, 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 단일 발현 단위/단일 접종물 유전자 백신이 제공된다. 그 코딩 서열은 CMV 초기 프로모터 및 SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어 하에 있다. HIV 단백질은 gag, pol, env 및 rev로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시태양에서, gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신이 제공되는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서는, gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 3개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신이 제공되는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신이 제공되는 것이 바람직하다.
일부 실시태양에서, 각각 HIV 단백질의 에피토프와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 코딩 서열로 이루어진 2개의 발현 단위를 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 이중 발현 단위/단일접종물 유전자 백신이 제공된다. 코딩 서열은 CMV 초기 프로모터 및 SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어 하에 있다. 2개의 발현 단위는 서로 반대 방향으로 코딩된다.
일부 실시태양에서, 각각 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어진 2개의 발현 단위를 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 이중 발현 단위/단일 접종물 유전자 백신이 제공된다. 각각의 발현 단위는 CMV 초기 프로모터 및 SV40 마이너 폴리아데닐화 시그날의 조절적 제어 하에 있는 코딩 서열로 이루어진다. HIV 단백질은 gag, pol, env 및 rev로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 2개의 발현 단위를 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신이 제공되는데, 그중 적어도 하나는 gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지고, 다른 하나는 gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 2개의 발현 단위를 포함하는 유전자 구조물로 이루어진 유전자 백신이 제공되는데, 그중 적어도 하나는 gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 3개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지고, 다른 하나는 gag, pol, env 및 rev 또는 그의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 2개의 발현 단위를 포함하는 유전자 구조물로 이루어직, gag, pol, env 및 rev 또는그의 단편을 코딩하는 코딩 서열로 이루어진 유전자 백신이 제공되는 것이 바람직하다.
실시예 48
유전자 구조물인 플라스미드 pCMN160Δ16을 항HIV 제약 키트 또는 제약 조성물에 사용하기 위해 제조하였다. pCMN160Δ16을 다음과 같이 제조하였다:
단계 1: 프라이머 SEQ ID NO:35 및 SEO ID NO:34를 HIV/MN 게놈 DNA로부터의 PCR 단편과 사용하였다.
단계 2: 프라이머 SEQ ID NO; 33 및 SEQ ID NO:36을 HIV/MN 게놈 DNA로부터의 PCR 단편과 사용하였다.
단계 3: 프라이머 SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36을 단계 1 및 2의 반응 물질 2 ㎕와 합하였다.
단계 4: 단계 3의 반응 생성물을 Not1 및 Mlu1로 절단하고 실시예 46에 기재한 골격 A를 Not1 및 Mlu1로 절단한 것 내에 삽입시켰다.
이렇게 하여, 골격 A에 대한 삽입물로서 MN 균주 ENV 단백질을 코딩하는 코딩 영역과 rev 영역을 함유하고 HLA-DB 영역을 찾는 nef의 절반이 HIV-2로 변하는 플라스미드 pCMN160Δ16이 형성되었다.
실시예 49
플라스미드 pGAGPOL.rev2를 다음과 같이 제조하였다. 먼저 골격을 제조하였다. 이어서, HIV gag 및 pol을 갖는 삽입물을 생성시켜 골격 내에 삽입시켰다.
골격은 다음과 같이 제조하였다.
단계 1 : pMAMneo(Clonetech)을 Bgl1으로 분해시켰다. 폴리머라제 1의 Klenow 단편으로 채우고 HindIII로 절단시켰다. 1763 bp 단편을 겔 정제하였다.
단계 2 : 플라스미드 pJ4Ωkan+으로부터의 KanR유전자(Pharmacia Inc.로부터 입수한 카나마이신 내성 유전자를 Imperial Cancer Research Fund(UK)로부터 무상으로 얻은 pJ4Ω 내로 클로닝시킴; pJ4Ω는 Morgenstern, J. P. 및 H. Land에 의해 최초로 제조되어, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한 문헌[Nucl. Acids Res. 18(4): 1068]에 보고되어 있음)를 올리고 SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:38으로 증폭시켰다. PCR 생성물을 평활 말단화하였다. HindIII로 절단하였다. PCR 단편을 겔 정제하였다.
단계 3 : 단계 1에서 기재한, pMAMneo로부터 생성된 벡터 골격을 단계 2에서 기재한 KanR유전자를 코딩하는 PCR 생성물과 연결시켰다. KanR유전자 및 박테리아성 복제 기원을 함유하는 플라스미드를 단리시켰다.
단계 4 : 생성된 플라스미드를 MluI로 분해시키고, DNA 폴리머라제 1의 Klenow 단편을 채워 넣었다. SacII 링커(New England Biloabs)와 연결시켰다.
단계 5 : 단계 4에서 얻은 플라스미드를 Ase I 및 Ssp I로 분해시켰다.
단계 6 : 단계 3에 기재한 플라스미드로부터 얻은 KanR유전자 부분을 프라이머 SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:40을 사용하여 PCR시켰다. PCR 생성물을 SspI 및 Ase I로 절단시켰다.
단계 7 : 단계 5에서 얻은 최대 단편을 단계 6에서 얻은 PCR 생성물과 연결시켰다.
단계 8 : 단계 7에서 얻은 연결 생성물/플라스미드를 HindIII으로 절단시켰다. DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 평활 말단화시켰다.
단계 9 : pCEP4(Invitrogen)를 SalI로 절단하여 CMV 프로모터, 폴리링커 및 SV40 폴리 A 부위를 함유하는 DNA 단편을 유리시켰다. 이 단편을 정제시키고 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 평활 말단화하였다.
단계 10 : 단계 8에서 얻은 플라스미드 및 단계 9에서 얻은 단편을 연결시켰다. 발테리아성 복제 기원 KanR유전자, RSV 인헨서, CMV 프로모터, 폴리링커 및 SV40 폴리링커 및 SV40 폴리 A 부위를 함유하는 플라스미드를 단리시켰다.
단계 11 : 단계 10에서 얻은 플라스미드를 Bam HI 및 Nhe I로 절단시켰다.
단계 12 : 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:42를 어닐링시켰다.
단계 13 : 단계 10에서 얻은 플라스미드를 단계 12에서 얻은 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 연결시켰다.
단계 14 : 단계 13에서 얻은 플라스미드를 SalI 및 MluI로 분해시켰다.
단계 15 : 주형으로서 BBG 35(RD Systems Inc.(미합중국 미네소타주 미네아폴리스 소재); pUC19 내에 HIV 균주 HX3B로부터의 rev에 대한 코딩 영역을 함유함) 및 프라이머 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44를 사용하여 rev 오픈 리딩 프레임을 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 SalI 및 MluI로 분해시켰다.
단계 16 : 단계 14에서 얻은 플라스미드를 단계 15에서 제조된 PCR 생성물과 연결시켰다. rev 코딩 영역을 함유하는 플라스미드를 단리시켰다.
gag/pol 삽입물의 제조
단계 1 : Bluescript(Stratagene) 내로 클로닝된 HIV-1(HXB2) 게놈 일부의 서브클론을 제조하였다. HIV-1의 서브클론은 Bluescript의 XbaI 및 SalI 부위 내로 클로닝된 뉴클레오티드 5795(Genbank numbering)까지의 HIV-1 게놈의 나머지 및 완전한 5' LTR을 함유한다. HIV-1 서열은 HXB2D 플라스미드(AIDS Repository)로부터 얻었다.
단계 2 : 단계 1에서 기재한 플라스미드(Bluescript 내로 클로닝된 HIV-1 HXB2 게놈의 일부의 서브클론)의 오픈 리딩 프레임으로부터의 gag 코딩 영역의 일부를 프라이머 SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46을 사용하여 PCR시켰다.
단계 3 : 단계 1에서 기재한 플라스미드(Bluescript 내로 클로닝된 HIV-1 HXB2 게놈의 일부의 서브클론)를 EcoRI로 분해시켰다. pBluescript 골격, 5' HIV-1 LTR, gag 코딩 영역 및 pol 코딩 영역의 일부를 함유하는 플라스미드를 정제하고 재연결시켰다.
단계 4 : 단계 3에서 얻은 플라스미드를 Not I 및 Spe I로 절단시키고, NotI 및 SpeI로 분해시킨 후의 단계 2에서 기재한 PCR 단편과 연결시켰다. 5' HIV-1 LTR을 함유하는 원래의 NotI/SpeI 단편 대신 PCR 단편을 함유하는 플라스미드를 단리시켰다.
단계 5 : 단계 4에서 얻은 플라스미드를 EcoRI 및 SalI로 분해시켰다.
단계 6 : 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48을 어닐링시켰다.
단계 7 : 단계 5에서 얻은 플라스미드를 단계 6에서 얻은 어댑터와 연결시켰다. EcoRI/SalI 부위내로 클로닝시킨 어댑터를 함유하는 플라스미드를 단리시켰다.
단계 8 : 단계 7에서 얻은 플라스미드를 NdeI 및 EcoRI로 분해시켰다.
단계 9 : HIV-1 균주 HXB2로부터의 RRE 서열을 함유하는 플라스미드로부터의 Rev Response Element(RRE)를 프라이머 SEQ ID NO:49 및 ID NO:50 을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 NdeI 및 EcoRI로 분해시켰다.
단계 10 : 단계 8에서 얻은 플라스미드를 단계 9에서 얻은 PCR 생성물과 연결시켰다. RRE 서열을 갖는 삽입물을 함유하는 플라스미드를 단리하였다.
단계 11 : 단계 10에서 얻은 플라스미드를 NotI 및 SalI로 분해시키고, gag 코딩 영역, 변형된 pol 코딩 영역 및 RRE 서열을 함유하는 단편을 단리하였다.
단계 12 : 상기한 골격 제조용 프로토콜의 단계 16에서 얻은 플라스미드를 NotI 및 SalI로 분해시켰다.
단계 13 : 단계 12에서 얻은 플라스미드를 단계 11에서 얻은 삽입물과 연결시켰다. gag 코딩 영역, 변형된 pol 코딩 영역 및 RRE 서열을 함유하는 삽입물을 함유하는 플라스미드를 단리하였다.
단계 14 : 단계 13에서 얻은 플라스미드를 XbaI 및 NheI로 분해시키고, 말단을 평활화시키고 재연결시켰다. 단계 13에서 얻은 플라스미드 중의 XbaI 및 NheI 부위 사이에 존재하는 KpnI 부위가 없는 플라스미드를 단리하였다.
단계 15 : 단계 14에서 얻은 플라스미드를 Kpn I로 분해하고, 최대 단편을 단리하였다.
단계 16 : 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:51 및 SEQ ID NO:52를 어닐링시켰다.
단계 17 : 단계 15에서 얻은 정제시킨 플라스미드 단편을 단계 16에서 얻은 어댑터와 연결시켰다. 단계 15에서 얻은 플라스미드의 KpnI 부위에 삽입된 어댑터를 함유하는 플라스미드를 단리하였다.
실시예 50
조절 단백질에 대한 유전자를 이용한 유전자 면역화
HIV의 박멸이 어려운 것의 일부는 바이러스의 놀라운 변이성 및 새로운 형태로 신속하게 돌연변이되는 그의 능력에 기인한다. 전체적인 인간 집단에서 발견되는 HIV 단리물 중에는 상당한 단백질 서열 변화가 있을 뿐만 아니라, 바이러스는 매우 신속하게 돌연변이되어 HIV-감염된 모든 개체가 실제로 다수의 관련 HIV 미생물 변이체를 갖는다. 상기 HIV 단리물은 상이한 복제 효능, 굽성(tropism), 중화용이성 및 약물 내성을 나타낸다. 약물 내성 돌연변이체가 나타나면 약물 치료의 이익은 사라진다. AZT의 경우, 약물 내성은 통상적으로 치료 5년 내에 발생한다. 이러한 도피성 돌연변이체의 지속적인 생성 때문에 바이러스를 막아내고 있다고 생각되는 오랜 기간 후에 HIV가 결국에는 숙주 세포의 방어 능력을 압도할 수 있게된다.
이러한 돌연변이 부동은 V3 루우프의 주요 중화 도메인을 비롯한 gp120 엔벨롭 당단백질의 각종 영역에서 및 또한 HIV 코어 단백질에서 보고되었다. HIV 조절 단백질은 구조 단백질보다 훨씬 잘 보존되고 또는 시간에 따른 돌연변이 부동도 덜 나타낸다. 따라서, 조절 단백질은 바이러스 공격 방지용으로 유력한타겟을 제공한다.
HIV는 조절 단백질 대 구조 단백질의 발현에 대한 일시적 제어가 뛰어나다. 바이러스 복제의 초기에는 조절 단백질 Tat Rev 및 Nef를 코딩하는 mRNA가 우세한 반면, 후기에는 Gag, Pol 및 Env 전구체를 비롯한 구조 단백질 및 많은 보조 단백질을 코딩하는 mRNA가 더 많이 발현된다. 이러한 초기로부터 후기로의 이동은 Rev 단백질이 특정 수준에 도달할 때 시작된다. 바이러스 복제 주기에서 초기의 Tat Rev 및 Nef의 우세는 또한 이들 단백질이 바이러스 공격 방지용 타겟에 적합하도록 만든다. 이러한 사실은 특히, HIV 유전자 발현의 전사 및 후번역 조절에 절대적으로 중요한 역할을 하는 tat 및 rev의 경우 두드러져서, 이들은 감염성 바이러스 입자의 생성 및 바이러스 구조 단백질의 전사 전의 바이러스 복제 주기 초기에 우세하다.
명백하게 HIV 복제에 중요한 역할을 하는 tat 및 rev와는 대조적으로, nef, vpr, vif 및 vpu와 같은 다른 조절 단백질은 종종 "보조" 단백질로도 언급된다. 이들의 작용은 잘 알려져 있지 않고, 특정 작용의 손실에 의해 바이러스, 복제가 감소되는 정도도 상당히 가변적이고, 감염된 숙수 세포에 따라 다르다. 그럼에도 불구하고, 매우 다양한 HIV 단리물 뿐만 아니라 다른 영장류 면역결핍 바이러스들 중에서 상기한 작용의 강한 보존성은 자연 감염 방법에서 이들 "보조" 작용의 중요성을 암시한다[일반적으로, Terwilliger, E. F., (1992) AIDS Research Reviews 2:3-27, W. C. Koff, F. Wong-Staal, 및 R. C. Kennedy, 편집(New York:Marcel Dekker, Inc.) 참조], 사실상, vpr, nef 또는 vif가 삭제된 영장류 재조합 바이러스는 생체내에서 비병원성이므로, 바이러스의 생활 주기에 있어서의 이들 보조 유전자의 중요성을 또한 논증하고 있다. 전체의 완전한 HIV 유전자 보다는 수개의 선택적 조절 및(또는) 효소 단백질을 제공함으로써 HIV에 대한 보다 높은 수준의 보다 보호적인 면역 반응이 달성될 수 있다는 증거가 다수 있다. 따라서, 주목을 받고 있는 면역화 전략은 바람직하게는 HIV 구조 단백질이 아닌, tat, rev, vpr, nef, vpu 또는 vif를 비롯한 1종 이상의 조절 단백질의 코딩 서열을 사용한 유전자 면역화의 관계이다. 단지 vpr만이 바이러스 입자와 관련된 것으로 밝혀진 반면 다른 조절 단백질, 예를 들면 tat, rev, nef, vif 및 vpu는 비리온 관련성이 아니다.
조절 유전자를 사용한 HIV에 대한 유전자 면역화의 일부 실시태양에서는 tat, rev, nef, vif 및 vpu 유전자 중 1종 이상을 실시예 46에 기재한 골격 A 내에 삽입시킨다. tat 및 (또는) rev를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서는 tat 또는 rev를 실시예 46에 기재한 골격 A 내에 삽입시킨다. 일부 실시태양에서 타겟으로서의 바람직한 면에 있어서 다음으로 좋은 것은 nef, vpr, vif 및 vpu의 순이었다. 바람직하게는, 1종 이상의 조절 유전자를 사용할 수 있는데, 이들의 예로는 tat 및 rev; tat, rev 및 nef; tat, rev, nef 및 vpr; tat, rev, nef, vpr 및 vif; tat, rev, nef, vpr, vif 및 vpu; 뿐만 아니라 이들의 조합물 및 임의로 tev와 같은 추가의 조절 유전자를 들 수 있다.
Tat 단백질은 LTR-유래 유전자 발현의 트랜스 작용 인자이다. 이것은 HIV 복제의 절대적으로 필요하다. Tat 바이러스 복제 주기에서 초기에 제조되고, 관능성 Tat는 Gag, Pol, Env 및 Vpr의 발현에 필요하다. Tat의 우세형은 2개의 엑손 mRNA로부터 유도된 86-아미노산 단백질이다. 아미노-발단 58 아미노산은 감소된 활성을 갖긴 하지만 트랜스 작용화에 충분하다. Tat은 tar로 명명되는 cis-작용 서열 상에 작용하여 LTR 유도 유전자 발현을 크게 증가시킨다. Tat은 부분적으로는 증가된 RNA 합성을 통해 및 부분적으로는 RNA 전사체 당 합성되는 단백질의 양을 증가시킴으로서 작용할 수 있다. 최근까지, Tat은 HIV-1 LTR 상에만 작용하는 것으로 알려졌다. 그러나, JC 바이러스 최근 프로모터로부터의 Tat-활성화 발현이 또한 보고되었다. Tat은 또한 외인성 인자로서 세포 증식을 자극할 수 있고, HIV-감염된 개체에서의 카포시 육종의 성장을 촉진시키는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. HIV-감염된 및 HIV-감염되지 않은 개체 모두에 있어서의 이러한 잠재적으로 유해한 효과 때문에, 유전자 면역화에 사용되는 바람직한 tat 제조물은 단지 비관능성 tat만을 발현하도록 변형된다. Tat 또는 Rev를 불활성화시킬 수 있는 돌연변이는 또한 트랜스우성 돌연변이로서 작용하므로 HIV-감염된 개체에서 제조되는 임의의 관능성 Tat를 잠재적으로 불활성화시킨다.
Rev는 바이러스 복제에 필수적인 HIV의 2차 조절 단백질이다. 이것은 각종의 다중적으로 슬라이스된 mRNAs에서 발견되는 2개의 코딩 엑손으로부터 발현되는 19 kD(116 아미노산) 단백질이다. 2개의 별개의 도메인이 동정되었는데, 전사체를 함유하는 RRE(Rev-반응-요소)와 결합하는데 관여하는 염기성 영역과 결합의 결과로상기 전사체의 핵 엑스포트를 유도하는 "활성화" 도메인이다. 자연적 바이러스 감염 과정에서 Rev는 HIV 구조 단백질 Gag, Pol 및 Env 뿐만 아니라 Vpr의 발현에도 필요하다.
Vpr은 비록 Vpr 오픈 리딩 프레임이 세포 배양에서 널리 계대되는 많은 바이러스 균주에서 광범위하게 잘라지긴 하지만 대부분의 HIV-1 균주에서 15kD 단백질(96 아미노산)이다. Vpr 오픈 리딩 프레임은 또한 HIV-2 및 대부분의 SIV 단리물중에 존재한다. Vpr은 HIV 바이러스 입자와 관계 있는 것으로 밝혀진 최초의 레트로바이러스 조절 단백질이다. 그의 HIV 비리온 내의 존재는 그것이 바이러스 복제 주기의 다소 초기 지점에서 작용을 할 수 있음을 암시한다. Vpr은 특히 감염 초기에 HIV 복제를 가속화시킨다. Vpr은 HIV LTR에 연결된 리포터 유전자의 발현 수준을 약 3배 증가시킨다. 게다가, Vpr 및 Tat는 LTR 연결된 유전자에 대해 상승적으로 작용하는 것 같다. Vpr은 HIV-감염된 개체의 혈청으로부터 단리될 수 있으며 새로운 세포를 감염시키는 바이러스의 능력을 증가시킬 수 있다. Vpr은 또한 세포 증식을 억제하고 세포 분화를 유도하는 것으로 알려져 있으며(Levy, D. N. 등 Cell(1993) 72:1-20 참조). 이러한 발견은 1차 단핵세포/대식세포가 단지 분화를 실시하는 동안에만 시험관내 감염될 수 있다는 보고(Schuitemaker, H. 등,(1992) J. Clin, Invest, 89:1154-1160 참조)의 관점에서 중요할 수 있다. HIV 복제를 지지할 수 없는 세포 조차 Vpr의 효과에 의해 조절되지 않을 수 있다. 예를 들면, Vpr은 AIDS 환자에서 주로 관찰되는 근육 수척을 야기시킬 수 있다. Vpr의 잠재적으로 해가되는 활성 때문에, 유전자 면역화는 바람직하게는 비관능성 Vpr 단백질을발현시키게 되는 변형된 vpr 제조물과 함께 수행해야 한다.
Nef(오래된 문헌에서는 3' orf라고도 언급됨)은 25-27kD 단백질이다. Nef는 CD4 T 임파 세포의 다운레귤레이션(downregulation)에 관여할 수 있는 것으로 제시되었다. Nef는 세포 시그날링에 역할을 할 수 있다. Nef는 생체내 HIV 감염의 확립에 있어서 중요하다. Nef 특이성 CTL은 생체내 HIV 감염을 제어하는데 있어서 중요한 것으로 생각된다.
Nif는 "바이러스 전염성 인자"로 명명되는 23kD 세포질 단백질이다. 비록 Nif-결핍 돌연변이 바이러스가 세포 대 세포 전파에 관하여 의심되는 것은 아니지만, 이들은 많은 CD4+ 세포주를 감염시키는 능릭을 상당히 감소시켰다. Vif 없이도 바이러스의 버딩(budding) 감소 및 전염성 감소가 있다. 영장류 연구에서, Vif 삭제 돌연변이는 생체내 감염을 확립하는 능력을 심각하게 감소시켰다. 이들 연구는 숙주에서의 바이러스 복제에 있어서의 Vif에 대한 임상학적 역할을 지지한다.
Vpu는 15-20kD(81 아미노산) 단백질이다. 비록 Vpu(+) 및 Vpu(-) 바이러스가 동일한 양의 바이러스성 단백질을 생산하지만, 후자의 것이 세포의 바이러스 감소와 함께 바이러스성 단백질의 세포내 축적의 증가를 나타낸다. 이것은 Vpu가 바이러스 입자의 조립 및(또는) 유리에 관여할 수 있음을 제시한다.
쥐 및 조류의 바이러스와 같은 단순 레트로바이러스는 HIV-1 HIV-2 및 SIV 조절 단백질과 유사한 단백질이 없다. 상기 동물에서는, 레트로바이러스 감염이 자가-제한적(self-limiting)인 경향이 있어 바이러스가 명확하고 병원성이 감소된다. 유사하게, Tax(Tat과 매우 유사하게 작용하고 또한 vpr 유사 활성을 나타냄) 및Rex(Rev와 매우 유사하게 작용함)만을 포함하는 HTLV-1은 많은 개체에서 명백하다. 조절 유전자를 이용한 유전자 면역화는 HIV에 대해서 뿐만 아니라 HBV(X 유전자 생성물) 및 HCV, 및 HTLV-1(Tax) 및 (Rex)와 같은 바이러스에 대해서도 적절한 것으로 생각된다. 이들 모든 바이러스에서, 조절 유전자는 바이러스 생활 주기 및 감염의 확립에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각된다.
실시예 51
HIV-1 조절 플라스미드, pREG의 제조
pREG 플라스미드를 단계별 방식으로 제조하고, 각각의 중간체를 계속 제조하기 전에 단백질 발현에 대해 시험하였다. tat 및 rev의 발현을 지지하는 발현 벡터는 2단계를 통해 제조된다. 먼저, 5' NheI 부위, HIV-1주 슬라이스 공여체 부위 대부분의 tat 코딩 영역, rev 단백질의 아미노 말단 영역은 코딩하는 영역 및 AvalI 부위를 함유하는 증폭 생성물을 합성 주형으로부터 증폭시켰다. 이 합성 주형은 진뱅크 데이타베이스로부터 입수한 HIV-1의 HXB2 균주의 공지된 서열을 사용하여 생성시키고, tat 단백질의 22 및 30 위치에서 시스테인 잔기를 돌연변이시키도록 변화시켰다. 이러한 돌연변이는 tat을 비관능성으로 만드는 것으로 나타났다 (Kuppuswamy 등, (1989) Nucleic Acids Research 17(9):3551-3561 참조).
PCR 생성물을, NheI 및 AvalI로 분해되고 카나마이신 내성 유전자 및 pBR322 복제 기원을 함유하는 벡터 내로 연결시켰다. 또한, 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 인헨서, rev 코딩 영역 및 SV40 폴리아데닐화 시그날로 함유한다. 플라스미드 내에 존재하는 rev 서열은 HIV-1 IIIB의 프로바이러스 클론으로부터 유래되었다. 이것은 완전하지만 돌연변이된 tat 코딩 영역 및 완전한 rev 코딩 영역을 함유하는 발현 벡터를 생성시키게 된다.
후속 단계를 실시하여 5' 말단에 Ava II 부위, rev의 81 위치 아미노산에 돌연변이, 약 30%의 rev 코딩 영역, 약 30 % nef 코딩 영역 및 3' 말단에 MluI 부위를 함유하는 PCR 생성물을 생성시켰다. 81 위치에서의 아미노산 변화는 rev 작용을 제거하는 것으로 나타났으므로, 생성된 플라스미드는 비관능성 rev 단백질의 생산을 이끌게 된다(Bogard, H. 및 Greene, W. C. (1993) J. Virol. 67(5); 2496-2502 참조). nef 코딩 영역의 중요한 삭제는 비관능성 nef 단백질을 생산시키는 것으로 가정하였다. rev 단백질의 81 위치 아미노산에서의 돌연 변이 및 5' AvaI 부위는 walI 부위 및 아미노산 81을 코딩하는 뉴클레오티드를 모두 함유하는 rev의 코딩 영역에 대해 상보성인 5' PCR 프라이머 상에 도입된다. 3' 코딩 클로닝 부위 Mlui 및 아미노산 위치 63에서 Nef의 종료를 일으키는 정지 코돈은 3' PCR 프라이머에 의해 도입될 것이다. 이 PCR 증식에 대한 주형은 HIV-1의 MN 균준로부터의 rev 및 nef 코딩 영역을 함유하는 합성 주형 또는 플라스미드이다. 생성된 PCR 생성물은 AvalI 및 MluI로 분해되어, 바로 앞 단락에서 기재한 tat-rev 플라스미드를 Ava II 및 Mlu I로 분해시킨 후에 생성되는 보다 작은 AvalI-MluI 단편을 대체하는 데 사용된다.
임의로, vpr은 2개의 부위 중 하나에서 이 플라스미드에 첨가될 수 있다. 한방법에서는, vpr은 vpr 번역 개시 코돈 및 vpr 정지 코돈에 상보성인 3' PCR 프라이버에 걸친 서열 및 이것과 플랭킹되는, Mlu I 클로닝 부위를 또한 함유하는 서열의 업스트림 MluI 부위를 함유하는 5' PCR 프라이머를 시용하여 증폭될 수 있다.
개시 코돈의 업스트림 서열은 스플라이스 수용체를 함유한다. PCR 생성물을 MluI로 분해시켜 상기한 tat rev nef 플라스미드를 MluI로 분해시킨 것에 삽입시켰다.
별법으로, vpr 증폭은 유사한 방식으로 수행될 수 있으나, PCR 프라이머는 2치 진핵세포 프로모터의 조절하에 발현되도록 다른 벡터 내로 클로닝될 수 있는 제한 부위를 함유해야 한다. 2차 프로모터에 이어 vpr 코딩 영역에 이어 폴리A 서열을 함유하는, 이 플라스미드로부터 유래된 카세트는 이 카세트와 플랭킹하지만 그것 내에서 절단하지 않는 제한 효소로 분해시킴으로써 유리될 수 있다. 생성된 DNA 단편은 tat rev vpr의 발현에 필요한 영역 밖에 해당하는 tat, rev, vpr 플라스미드의 독특한 부위 내로 클로닝된다. 이러한 방식으로, 2개의 발현 단위를 갖는 플라스미드가 형성된다.
실시예 52
HCV 및 HTLV-1 플라스미드의 제조
유사한 방법을 사용하여 바이러스 생활 주기 및(또는) 이들 바이러스의 조절 단백질에 필요한 효소 작용을 갖는, HTLV-1 또는 HCV가 코딩하는 단백질을 발현시키는 플라스미드를 생성시켰다. HTLV-1의 경우 조절 단백질 TAX를 코딩하는 플라스미드는 상기한 바와 유사한 클로닝 전략 및 플라스미드 골격을 사용하여 생성하였다. 효소 단백질을 코딩하는 HCV 유전자는 RNA-의존성 RNA-폴리머자제, 헬리카제/프로테아제 작용을 갖는 단백질을 포함한다. 필요한 서열은 공지되이 있으며, GenBnk를 통해 입수할 수 있다. HTLV-1 및 HCV의 바이러스 형성은 각각 문헌[Cann, A. J. 및 Chen, I. S. Y. Virology 제2판, B. N. Fiddr 편집. Raven Press, Ltd., 뉴욕, (1990)] 및 문헌[Bradley, D. W. Transfusion Medicine Reviews, 1(2):93-102, 1992]으로 반포되어 있다.
실시예 53
효소 유진자를 이용한 유전자 면역화
효소 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면 HIV pol 유전자를 이용한 유전자 면역화는 또한 Pol과 같은 효소가 살아있는 바이러스의 생산에 필요하기 때문에 중요한 항바이러스 전략일 수 있다. 폴리머라제 또는 그의 임의의 성분의 작용 없이는 HIV는 비병원성 및 비전염성이다. 유사하게, 다른 바이러스의 효소 유전자, 예를 들면 HBV 폴리머라제는 유전자 면역화에 있어서 유리한 타겟이다(예를 들면, Radziwill 등, Mutational Analysis of Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Viro, 64(2):613-620 (1990)참조).
바이러스 효소가 면역학적 타겟으로서 유리한 한 이유는 상기 효소가 그들의 아미노산 서열을 돌연변이시키지만 그들의 효소 기능은 계속해서 유지할 수 있는 능력이 제한되어 있기 때문이다. 예를 들면, HIV-1의 경우, Pol은 AZT와 같은 뉴클레오티드 유사체에 대한 내성과 관계있는, 제한된 수의 "도피" 돌연변이를 나타낸다. 그러나, 단백질 내의 면역학적 타겟의 대부분은 약물 도피 돌연변이에서 조차 보존된다.
실시예 54
HBV 폴리머라제 플라스미드의 제조
문헌에 보고된 실험은 코어 및 폴리머라제 오픈 리딩 프레임이 모두 mRNA 분자에 존재할 때 조직 배양 세포에서 HBV 폴리머라제 발현이 탄성될 수 있음을 보여준다. 이러한 상황 하에서, 코어 ATG의 돌연변이는 폴리머라제 발현에 영향을 미치지 않는다고 또한 논증되었다.
HBV 게놈은 ADW HBV 균주의 헤드-대-테일 다이머를 함유하는 플라스미드로부터 증폭된다. 코어가 아닌 폴리머라제만의 발현이 요망되기 때문에, 5' PCR 프라이머는 프레코어 및 코어 번역 개시 코돈을 돌연 변이시키도록 디자인된다. 또한, 이 프라이머는 복제 경쟁적 HBV 게놈 RNA의 생성 가능성을 배제시키기 위해 돌연변이 DR1 서열도 도입하였다. 이 PCR 생성물을 카나마이신 내성 유전자 및 pBR322 복제 기원을 함유하는 플라스미드 내에 위치시켰다. 또한 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 인헨서, 및 SV40 폴리아메닐화 시그날을 함유한다. 표면 항원에 대한 번역 개시 코돈 및 X 코딩 영역의 생성물을 돌연변이시켜 HBS 및 X 유전자 생성물의 발현을 막았다.
HBV 폴리머라제를 발현시키기 위한 다른 방법에 따르면, 폴리머라제 코딩 영역 전체를 코딩하는 PCR 생성물을 증폭시켜 카나마이신 내성 유전자 및 pBR322 복제 기원을 함유하는 벡터 내로 클로닝시켰다. 또한, 이 플리스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 인헨서, 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 함유한다. 이 증폭에 대한 5' PCR 프라이머는 클로닝 부위를 함유하고 폴리머라제 유전자의 번역 개시 코돈에 걸쳐 있다. 3' PCR 생성물은 삽입물을 발현 벡터 내로 클로닝시키기 위한 제한 부위를 함유하고, 또한 HBV 폴리머라제 유전자의 전통적 정지 코돈 및 이 정지 코돈과 플랭킹하는 서열에 대해 상보적이다. 카나마이신 내성 유전자, pBR322 복제 기원, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 인헨서 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 플라스미드 내로 PCR 생성물을 연결시킨 후, X 유전자 및 B형 간염 표면 항원에 대한 번역 개시 코돈을 돌연변이시켜 이들 유전자 생성물의 발현을 방지하였다. 상기한 바와 유사하게 별법의 전략을 사용하였으나 이번 경우에서는 3' PCR 프라이머는 HBV 폴리A 시그날 및 이 시그날과 플랭킹하는 서열을 포함한다. 이 경우에서 사용된 HBV 폴리A 시그날을 포함하고(하거나) 둘러싸는 서열인 3' 프라이머는 발현에 중요하다. 돌연변이적 분석은 HBV 폴리머라제 유전자 생성물의 작용은 특정 뉴클레오티드 변화에 의해 제거될 수 있음을 증명하였다[Radziwell, G. 등(1990) J. Virol. 64(2):613-620 참조]. 상기한 바와 같이 제조된 플라스미드를 사용하기 전에, 이들 돌연변이 중 하나 또는 유사한 다른 것을 도입시켜 발현된 폴리머라제를 돌연변이시킬 수 있다.
실시예 55
과립구-대식세포 콜로니 자극 인자는 호중구, 단핵세포/대식세포 및 호산구를 포함하는 세포계의 다양성에 자극적 효과를 나타낸다. GM-CSF의 효과 때문에 이것은 유리한 치료 모델이 된다. GM-CSF,는 FDA에 의해 자신의 골수 이식에 사용할수 있는 것으로 승인되었으며, 각종의 호중구감소증 치료에서의 효능을 시험하기 위해 임상적 시도가 개시되었다. 현재, GM-CSF는 단백질로서 투여되며, 통상 다중 투여로 투여되어야 할 필요가 있다. 단백질은 제조되어 정제되어야 한다.
GM-CSF 단백질의 사용에 대한 별법은 부피바카인의 투여와 함께 GM-CSF를 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 제조물을 직접 투여하는 것이다. 유전자 제조물은 시그날 서열을 포함하는 GM-CSF 유전자의 PCR에 의해 제조된다. 유전자 제조물은 바람직하게는 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 유전자). 박테리아 복제 기원 실시예 46에서 골격으로 기재된 벡터와 같은 플라스미드가 도입된, 세포 내에서 GM-CSF 코딩 영역의 발현을 지지하는 서열을 함유한다. 플라스미드는 바람직하게는 부피바카인 투여와 관련된 세포 복제에 의해 유도된 포유동물 복제 기원을 함유한다. EBV 복제 기원을 사용하는 경우, 핵 항원 EBNA-1을 코딩하는 서열은 또한 적절한 조절 서열과 함께 포함된다. 삽입물의 PCR증폭에 대한 프라이머는 발현 벡터 내로의 클로닝을 가능하게 하는 제한 효소 부위를 함유하고, GM-CSF 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에 상보적이다. PCR 반응은 문헌[Lee 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:4360-4364]에 기재된 바와 같은 cDNA 클론과 함께 수행된다.
실시예 56
만성 골수성 백혈병(CML)은 필라델피아 염색체와 관련된 조혈 간세포의 클론성 골수증식성 질환(염색체 9 및 22 사이의 전위에 기인한 염색체 이상)이다. 염색체 22 상의 절단점(breakpoint)은 절단점 클러스터 영역(BCR)로 명명되는 6kb 영역내에 응집되어 있는 반면, 염색체 9 상에서는 절단점이 c-abl 엑손 2로부터 90kb 업스트림 영역에 걸쳐 흩어져 있다. 생성되는 각종의 9:22 전위는 2가지 유형 k28 전위 및 L6 전위로 나눌 수 있다. bcr-abl 전위를 통한 전사는 융합 mRNA를 생성시킨다. mRNA의 bcr-abl 연결을 표적으로 하는 비전사는 CML 환자로부터 얻은 조혈 세포의 콜로니 형성 능력을 감소시키는 것으로 증명되었다.
비전사를 코딩하는 유전자 제조물은 CML을 앓는 개체의 세포로 부피바카인과 함께 생체외 투여된다. 이어서 처리된 세포를 개체 내로 재도입시킨다.
실시예 57
HBV의 치료 및 HBV에 대한 백신화용 제약 키트 및 조성물에 유용한 유전자 제조물은 실시예 46에서 골격으로 기재한 벡터와 함께 제조하였다. 플라스미드는 HBV 구조 유전자, 특히 HBV 표면 항원 및(또는) HBV 코어 항원 코어 및(또는) HBV 프레코어 항원을 코딩하는 유전자를 함유한다.
실시에 58
HCV의 치료 및 HCV에 대한 백신화용 제약 키트 및 조성물에 유용한 유전자 제조물은 실시예 46에서 골격으로 기재한 벡터와 함께 제조하였다. 플라스미드는 HCV 구조 유전자, 특히 HCV 코어 단백질 및(또는) HCV 엔벨롭 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다.
실시예 59
유일의 타겟 단백질로서 HIV rev를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 유전자 제조물 pREV를 디자인하였다. rev의 코딩 서열을 pUC19 내에 HIV 균주 HN3B로부터의 코딩 영역을 함유하는 BBG35(RD Systems Inc.; 미합중국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터의, 실시예 46에서 기재한 골격 A 내로 클로닝시켰다.
[표 1]
[표 2]
Claims (14)
- a) 사람 이외의 개체의 세포와 부피바카인을 접촉시키는 단계; 및b) 상기 사람 이외의 개체의 세포에 레트로바이러스 입자가 없는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 사람 이외의 개체의 세포에 유전 물질을 도입하는 방법.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자가, 면역 응답이 필요한 항원의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질을 코딩하며, 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있고, 상기 세포에서 발현될 수 있는 DNA 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, DNA 서열이 병원체 항원의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 과다증식성 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 및 자가면역 질환을 특정화하는 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 병원체가 사람 면역결핍 바이러스 (HIV); 사람 T 세포 백혈병 바이러스 (HTLV); 인플루엔자 바이러스; A형 간염 바이러스; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스; 사람 유두종 바이러스 (HPV); 단순 포진 바이러스 1 (HSV1); 단순 포진 바이러스 2 (HSV2); 사이토메갈로바이러스 (CMV); 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV); 리노바이러스; 및 코로나 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스이고; 면역 응답이 상기 바이러스에 대하여 일어나는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 부피바카인과 핵산 분자를 동시에 투여하는 방법.
- 제2항에 있어서, 동일한 병원체의 1개 이상의 병원체 항원을 코딩하는 DNA 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 상이한 핵산 분자를 사람 이외의 개체에 투여하는 방법.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자가 개체에 존재함으로써 결여되거나, 비기능적이거나, 부분적으로 기능하는 단백질을 보상하는 단백질 또는 개체에서 치료 효과를 나타내는 단백질을 코딩하는, 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있고 상기 세포에서 발현될 수 있는 DNA 서열을 포함하는 것인 방법.
- i) 사람 이외의 포유 동물의 세포와 부피바카인을 접촉시키는 단계; 및ii) 상기 사람 이외의 포유 동물의 세포에, 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있고, 상기 세포에서 발현될 수 있으며, 질환을 특정화하는 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 에피토프를 포함하는 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 레트로바이러스 입자가 없는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환에 대한 사람 이외의 포유 동물의 면역화 방법.
- a) 1개 이상의 HIV 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 코딩하는, 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있고 사람 세포에서 발현될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 핵산 분자를 제약적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중에 포함하는 제1 접종물,b) 1개 이상의 HIV 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 코딩하는, 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있고 사람 세포에서 발현될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 분자와 동일하지 않은 제2 핵산 분자를 제약적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중에 포함하는 제2 접종물, 및(c) 제1 접종물 및(또는) 제2 접종물과의 혼합물의 형태로, 또는 별도의 용기에 제공되는 부피바카인을 제약적으로 허용가능한 담체 중에 포함하는 제3 접종물을 포함하는, HIV에 대하여 사람을 면역화하기 위한 레트로바이러스 입자가 없는 제약 면역화 키트.
- a) psi가 결실된 HIV 단백질 Gag 및 Pol을 코딩하며 라우스가계 육종 바이러스 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 (immediate early) 프로모터 및 SV40 부 폴리아데닐화 신호 및 임의로 SV40 복제 기원에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자; 및b) 부피바카인을 포함하고 레트로바이러스 입자가 없는, HIV에 대하여 사람을 면역화하기 위한 제약 조성물.
- a) 라우스 가계 육종 바이러스 인핸서, 사이토메갈로바아러스 초기 프로모터, SV40 부 폴리아데닐화 신호 및 임의로 SV40 복제 기원에 작동 가능하게 연결된, HIV 단백질 Rev, Vpu, 및 Env를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자; 및b) 부피바카인을 포함하고 레트로바이러스 입자가 없는, HIV에 대하여 사람을 면역화하기 위한 제약 조성물.
- a) psi가 결실된 HIV 단백질 Gag 및 Pol을 코딩하며, 라우스가계 육종 바이러스 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터, SV40 부폴리아데닐화 신호 및 임의로 SV40 복제 기원에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 및 부피바카인을 포함하는 제약 조성물을 포함하는 제1 접종물; 및b) HIV 단백질 Rev, Vpu 및 Env를 코딩하고 라우스 가계 육종 바이러스 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로머터, SV40 부 폴리아데닐화 신호 및 임의로 SV40 복제 기원에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 및 부피바카인을 포함하는 제약 조성물을 포함하는 제2 접종물을 포함하는, HIV에 대하여 사람을 면역화하기 위한 레트로바이러스 입자가 없는 제약 면역화 키트.
- a) 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있고 포유 동물의 세포에서 발현될 수 있는, 병원체 항원의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 과다증식성 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 자가면역 질환을 특정화하는 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 개체에 존재함으로써 결여되거나, 비기능적이거나, 부분적으로 기능하는 단백질을 보상하는 단백질; 및 개체에서 치료 효과를 나타내는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산분자; 및b) 부피바카인을 포함하고 레트로바이러스 입자가 없는 제약적으로 허용가능한 제형의, 감염성 질환, 암 및 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물.
- a) 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있고 포유 동물의 세포에서 발현 될 수 있는, 병원체 항원의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질, 과다증식성 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질, 자가면역 질환을 특정화하는 세포와 관련된 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 1개 이상의 에피토프를 포함하는 단백질; 개체에 존재함으로써 결여되거나, 비기능적이거나, 부분적으로 기능하는 단백질을 보상하는 단백질, 및 개체에서 치료 효과를 나타내는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자; 및b) 부피바카인을 포함하는 용기를 포함하는, 감염성 질환, 자가면역 질환, 유전병 및 단백질 요법을 사용하여 치료할 수 있는 증상을 에방 또는 치료하기 위한 레트로바이러스 입자가 없는 제약 키트.
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