DE69132920T2 - Methode zur Herstellung von filamentösen, antikörper-präsentierenden Bakteriophagenpartikeln durch Verwendung von Phagemiden und die daduch hergestellten Bakteriophagenpartikel - Google Patents
Methode zur Herstellung von filamentösen, antikörper-präsentierenden Bakteriophagenpartikeln durch Verwendung von Phagemiden und die daduch hergestellten BakteriophagenpartikelInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen von spezifischen Bindungspaaren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch diese Verfahren hergestellten biologischen Bindemoleküle.
- Aufgrund ihrer hohen Spezifität für ein bestimmtes Antigen, stellte das Aufkommen von monoklonalen Antikörpern (Kohler, G. and Milstein C.; 1975 Nature 256: 495) einen bedeutenden technischen Durchbruch mit wichtigen sowohl wissenschaftlichen als auch wirtschaftlichen Konsequenzen dar.
- Monoklonale Antikörper werden herkömmlicherweise hergestellt, indem eine immortalisierte Säugetierzelllinie etabliert wird, die aus einer einzelnen, Immunglobuline produzierenden Zelle, die eine Form eines biologisch funktionellen Antikörpermoleküls mit einer bestimmten Spezifität sekretiert, stammt. Da die Antikörper herstellende Säugetierzelle immortalisiert ist, sind die Eigenschaften des Antikörpers von Charge zu Charge reproduzierbar. Die Schlüsseleigenschaften monoklonaler Antikörper sind deren Spezifität für ein bestimmtes Antigen und die Reproduzierbarkeit, mit der sie hergestellt werden können.
- Strukturell umfaßt der einfachste Antikörper (IgG) vier Polypeptidketten, zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind (siehe Fig. 1). Die leichten Ketten existieren in zwei unterschiedlichen Formen, die kappa (κ) und lambda (λ) genannt werden. Jede Kette weist eine konstante Region (C) und eine variable Region (V) auf. Jede Kette ist in eine Reihe von Domänen aufgeteilt. Die leichten Ketten haben zwei Domänen, wobei eine der C-Region und die andere der V-Region entspricht. Die schweren Ketten weisen 4 Domänen auf, wobei eine der V-Region entspricht und drei Domänen (1, 2 und 3) sich in der C-Region befinden. Der Ani körper hat zwei Arme (jeder Arm stellt eine Fab-Region dar), wobei jeder davon eine VL- und eine VH-Region aufweist, die miteinander assoziiert sind. Es ist dieses Paar der V-Regionen (VL und VH), das sich von einem Antikörper zu einem anderen unterscheidet (aufgrund der Aminosäuresequenzvariationen), und welche gemeinsam für die Erkennung des Antigens und die Bereitstellung einer Antigenbindestelle (ABS) verantwortlich sind. Noch detaillierter ist jede V-Region aus drei Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR) aufgebaut, die von vier Gerüst- (framework-) Regionen (FR) getrennt werden. Die CDR's sind der variabelste Teil der variablen Regionen, und sie erfüllen die entscheidende Antigenbindefunktion. Die CDR-Regionen werden aus vielen potentiellen Keimliniensequenzen über einen komplexen Vorgang erhalten, an dem Rekombination, Mutation und Selektion beteiligt sind.
- Es zeigte sich, daß die Antigenbindefunktion von Fragmenten eines ganzen Antikörpers erfüllt werden kann. Beispiele für Bindefragmente sind (i) das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; und (vi) F(ab')&sub2;-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfaßt, die durch eine Disulfidbrücke bei der Hinge-("Scharnier")-Region verbunden sind.
- Obwohl die zwei Domänen des Fv-Fragments von verschiedenen Genen kodiert werden, wurde gezeigt, daß es durch rekombinante Verfahren möglich ist, einen synthetischen Linker herzustellen, der es ihnen ermöglicht, als einzelne Proteinkette hergestellt zu werden (bekannt als Einzelketten-Fv (scFv); Bird, R. E. et al., Science 242, 423-426 (1988) Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 5879-5883 (1988)). Diese scFv-Fragmente werden aus Genen von Monoklonalen zusammengestellt, die zuvor isoliert wurden. In dieser Anwendung beschreiben die Anmelder ein Verfahren, um scFv- Fragmente aus VH- und VL-Domänen zusammenzufügen, die nicht Teil eines Antikörpers sind, der zuvor isoliert wurde.
- Obwohl monoklonale Antikörper, deren Fragmente und Derivate enorme Vorteile mit sich brachten, gibt es nach wie vor eine Anzahl von damit verbundenen Einschränkungen.
- Erstens sind die therapeutischen Anwendungen monoklonaler Antikörper, die von menschlichen, immortalisierten Zelllinien hergestellt werden, sehr vielversprechend für die Behandlung eines weiten Bereichs von Erkrankungen (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Herausgegeben von E. S. Lennox. British Medical Bulletin 1984; veröffenlicht von Churchill Livingstone). Leider sind menschliche Zelllinien, die immortalisierte Antikörper produzieren, sehr schwierig zu erhalten und diese ergeben geringe Ausbeuten an Antikörper (etwa 1 ug/ml). Im Gegensatz dazu ergeben Nagetierzelllinien hohe Mengen an Antikörpern (etwa 100 ug/ml). Die wiederholte Verabreichung dieses fremden Nagetierproteins an Menschen kann jedoch zu schädlichen Überempfindlichkeitsreakaionen führen. Daher sind diese aus Nagetieren stammenden monoklonalen Antikörper zumeist nur eingeschränkt therapeutisch verwendbar.
- Zweitens ist es ein Schlüsselaspekt bei der Isolierung der monoklonalen Antikörper, wieviele verschiedene Klone der antikörperproduzierenden Zellen mit verschiedenen Spezifitäten praktisch etabliert und geerntet werden können, im Vergleich dazu, wieviele theoretisch geerntet werden müssen, um eine Zelle zu isolieren, die Antikörper mit den gewünschten Spezifitätseigenschaften produziert (Milstein, C., Royal Soc. Croonian Lecture, Proc. R. Soc. London, B. 239; 1-16, (1990)). Beispielweise glaubt man, daß die Anzahl der verschieden Spezifitäten, die zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Lymphozyten des Immunsystems der Maus exprimiert werden, etwa 10&sup7; ist und dies ist nur ein kleiner Teil der potentiellen Repertoires der Spezifitäten. Während der Isolierung einer typischen antikörperproduzierenden Zelle mit der gewünschten Spezifität kann der Untersucher jedoch nur von 10³ bis 10&sup4; einzelne Spezifitäten ernten. Das Problem ist beim Menschen noch größer, da dieser etwa 10¹² Lymphozytenspezifitäten aufweist und die Einschränkung besteht, daß davon lediglich 10³ oder 10&sup4; geerntet werden können.
- Dieses Problem wurde in einem gewissen Ausmaß bei Labortieren durch die Verwendung von Immunisierungsmodellen vermindert. Wenn man monoklonale Antikörper mit einer Spezifität gegen ein bestimmtes Epitop herstellen möchte, wird ein Tier mit einem Immunogen, das dieses Epitop exprimiert, immunisiert. Das Tier baut dann eine Immunreaktion gegen das Epitop auf und es gibt eine Vermehrung von Lymphozyten, die Spezifität gegen dieses Epitop aufweisen. Aufgrund dieser Vermehrung der Lymphozyten mit der gewünschten Spezifität wird es einfacher, diese im Ernteverfahren aufzufinden. Dieser Ansatz ist jedoch nicht in allen Fällen erfolgreich, da möglicherweise ein geeignetes Immunogen nicht zur Verfügung steht. Weiters ist, wenn man menschliche monoklonale Antikörper herstellen möchte (z. B. zur therapeutischen Verabreichung wie oben besprochen), solch ein Ansatz praktisch oder ethisch nicht durchführbar.
- In den letzten Jahren wurden diese Probleme zum Teil durch die Anwendung von rekombinanten DNA-Verfahren zur Isolierung und Produktion von z. B. Antikörpern und Fragmenten von Antikörpern mit Antigenbindefähigkeit, in Bakterien wie z. B. E.coli in Angriff genommen.
- Dieser einfache Ersatz von immortalisierten Zellen durch Bakterienzellen als "Fabrik" vereinfacht die Verfahren zur Herstellung großer Mengen von Bindemolekülen beträchtlich. Weiters gibt ein rekombinantes Produktionssystem Raum für die Herstellung von zurechtgeschnittenen Antikörpern und Fragmenten davon. Beispielsweise ist es möglich, chimäre Moleküle mit neuen Kombinationen von Binde- und Effektorfunktionen, "humanisierte" Antikörper (z. B. variable Regionen aus Mäusen kombiniert mit konstanten Domänen aus Menschen, oder Antikörper-CDR's aus Mäusen auf menschliche FR aufgepfropft) und neue Antigenbindemoleküle zu produzieren. Weiters weist die Verwendung der Polymerasekettenreaktions- ("polymerase chain reaction", PCR-) Amplifikation (Saiki, R. K., et al., Science 239, 487-491 (1988)) zur Isolierung von antikörperproduzierenden Sequenzen aus Zellen (z. B. Hybridome und B-Zellen) ein großes Potential zur Beschleunigung des Zeitmaßstabs, mit dem Spezifitäten isoliert werden können, auf. Amplifizierte VH- und VL-Gene werden direkt in Vektoren zur Expression in Bakterien oder Säugetierzellen kloniert (Orlandi, R., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 3833-3837; Ward, E. S., et al., 1989, s.o.; Larrick, J. W., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1250-1255; Sastry, L. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 5728-5732). Von Bakterien sekretierte lösliche Antikörperfragmente werden dann auf Bindeaktivität gescreent.
- Wie das Produktionssystem, das auf immortalisierten Zellen basiert, weist jedoch auch das rekombinante Produktionssystem noch den Nachteil des zuvor diskutierten Selektionsproblems auf und vertraut daher auf die Immunisierung, um den Anteil an Zellen mit der gewünschten Spezifität zu erhöhen. Weiters können einige dieser Verfahren die Screeningprobleme verschlimmern. Beispielsweise wurden große getrennte Bibliotheken der H- und L-Ketten aus immunisierten Mäusen hergestellt und vor dem Screenen nach einem statistischen Kombinationsverfahren miteinander kombiniert (Huse, W. D. et al., 19889, Science 246, 1275-1281, WO 90/14443; WO 90/14424 und WO 90/14430). Jedoch geht dabei die in jeder Zelle enthaltene Information, nämlich die ursprüngliche Paarung einer bestimmten L-Kette mit einer bestimmten H-Kette, verloren. Dies führt zum Verlust einiger der durch die Verwendung von Immunisierungstechniken bei Tieren erlangten Vorteile. Derzeit weisen nur Bibliotheken, die aus einzelnen VH-Domänen stammen (dAbs: Ward, E. S., et al., 1989, s.o.) diesen Nachteil nicht auf. Da jedoch nicht alle Antikörper-VH-Domänen Antigen binden können, müssen mehr gescreent werden. Zusätzlich verbleibt das zu lösende Problem, viele verschiedene Spezifitäten in Prokaryoten direkt zu screenen.
- Somit besteht ein Bedarf an einem Screeningsystem, das eines oder mehrere der obigen oder andere Probleme vermindert oder beseitigt. Das ideale System würde das Ernten einer sehr großen Anzahl an Spezifitäten (z. B. 106 und mehr), ein rasches Sortieren bei jeder Klonierungsrunde und einen raschen Transfer des für das Bindemoleküls kodierenden genetischen Materials von einer Stufe des Produktionsprozesses zur nächsten Stufe gestatten.
- Die attraktivsten Kandidaten für diesem Screeningtyp wären prokaryotische Organismen (da diese schnell wachsen, einfach handzuhaben sind und da eine große Anzahl an Klonen gebildet werden kann), die an ihrer Oberfläche eine funktionelle Bindedomäne exprimieren und aufweisen, z. B. einen Antikörper, Rezeptor, Enzym usw. Im UK-Patent GB-2137631 B werden Verfahren zur Co-Expression der Gene der variablen H- und L- Ketten von Immunoglobulinen in einer einzigen Wirtszelle geoffenbart. Doch das Protein wurde intrazellulär exprimiert und war unlöslich. Weiters erforderte das Protein eine ausgedehnte Verarbeitung, um Antikörperfragmente mit Bindeaktivität zu bilden, und dies führte zu einem Material mit nur einem Bruchteil der Bindeaktivität, die für Antikörperfragmente bei dieser Konzentration erwartet wurde. Es wurde bereits gezeigt, daß Antikörperfragmente mit dem geeigneten Signalpeptid durch bakterielle Membranen sekretiert werden können (Skerra, A. und Pluckthun, A. 1988, Science 240, 1041- 1043) mit einem darauffolgenden Anstieg der Bindeaktivität der Antikörperfragmente. Diese Verfahren erfordern das Screenen der einzelnen Klone auf Bindeaktivität in derselben Art wie die monoklonalen Antikörper aus Mäusen.
- Es wurde jedoch nicht gezeigt, wie eine funktionelle Bindedomäne, z. B. ein Antikörper, Antikörperfragment, Rezeptor, Enzym, etc., auf der Oberfläche des Bakteriums in einer Konfiguration, die das Ernten, z. B. seiner Antigenbindefragmente, und die Selektion auf Klone mit gewünschten Eigenschaften gestattet, gehalten werden kann. Zu einem großen Teil ist dies deshalb, weil die Oberfläche des Bakteriums eine komplexe Struktur aufweist, und bei den gram-negativen Organismen gibt es eine Außenwand, was die Position weiter kompliziert. Weiters wurde nicht gezeigt, daß sich z. B. eine Antikörperdomäne korrekt faltet, wenn sie als Fusion mit einem Oberflächenprotein von Bakterien oder Bakteriophagen exprimiert wird.
- Bakteriophagen sind für diesen Screeningtyp attraktive, mit Prokaryoten verwandte Organismen. Im allgemeinen weist ihre Oberfläche eine relativ einfache Struktur auf, sie können leicht in großer Zahl gezüchtet werden, sie sind der praktischen Handhabung, die bei vielen potentiellen Massenscreenprogrammen angewendet wird, leicht zugänglich, und sie tragen die genetische Information für ihre eigene Synthese innerhalb einer kleinen einfachen Verpackung. D e Schwierigkeit bestand darin, praktisch das Problem zu lösen, wie Bakteriophagen auf diese Weise verwendet werden können. Eine Genex Corporation Patentanmeldung Nr. WO 88/06630 schlug vor, daß der Bakteriophage λ ein geeignetes Vehikel für die Expression von Antikörpermolekülen ist, aber es wurde nicht gelehrt, wie diese allgemeine Idee ausgeführt werden kann. Beispielsweise zeigt die WO 80/06630 nicht, daß irgendwelche Sequenzen (a) als Fusion mit dem V-Gen exprimiert wurden; (b) auf der Oberfläche von λ exprimiert wurden; (c) so exprimiert wurden, daß das Protein biologische Aktivität beibehält. Weiters wurde nicht gezeigt, wie man nach geeigneten Fusionen screent. Da die λ-Virionen innerhalb der Zelle angeordnet werden, würde das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert und daher wurde angenommen, daß es inaktiv ist. Bass et al., Dezember 1990 (nach der frühesten Priorität der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Deletion eines Teils des Gens III des filamentösen Bakteriophagen M13 und die Insertion der Kodiersequenz des menschlichen Wachstumshormons (hGH) an der N-terminalen Stelle des Gens. Das von M13 präsentierte Wachstumshormon erwies sich als funktionell. (Bass, S., et al., Proteins, Structur, Function and Genetics (1990) 8: 309-314). Zusätzlich war immer, wenn diese Fusion exprimiert wurde, eine funktionelle Kopie des Gens III vorhanden. Eine Patentanmeldung der Protein Engineering Corporation WO 90/02809 schlägt die Insertion der Kodiersequenz des Rinderpankreastrypsininhibitors (BPTI) in das Gen VIII von M13 vor. Es zeigte sich jedoch, daß dieser Vorschlag nicht funktionierte. Beispielsweise wurde nicht gezeigt, daß die BPTI-Sequenzen als Fusionen mit dem Gen III exprimiert und an der Oberfläche von M13 gezeigt werden. Weiters lehrt dieses Dokument, daß, wenn eine Fusion mit dem Gen III durchgeführt wird, es notwendig ist, eine zweite synthetische Kopie des Gens III zu verwenden, sodaß auch unverändertes Gen III-Protein vorhanden ist. Die Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung tun dies nicht. In Ausführungsformen, in denen das Phagemid mit dem M13K07-Gen III-Deletions-Phagen gewonnen bzw. wiederhergestellt ("rescued") wird, ist kein unverändertes Gen III vorhanden.
- Die Anmeldung WO 90/02809 lehrt auch, daß Phagemide, die nicht das vollständige Genom von M13 enthalten und Wiederherstellung ("rescue") durch Co-Infektion mit einem Helferphagen erfordern, nicht für diese Zwecke geeignet sind, da die Co-Infektion zur Rekombination führen könnte.
- In allen Ausführungsformen, bei denen die vorliegenden Anmelder Phagemide verwendet haben, haben sie einen Helferphagen verwendet und die einzigen Sequenzen, die in den Phagemiden aus filamentösen Bakteriophagen stammen, sind der Replikationsursprung und die Gen III-Sequenzen.
- Die Anmeldung WO 90/02809 lehrt auch, daß deren Verfahren Information wie z. B. die Nucleotidsequenz des Startmoleküls und dessen dreidimensionale Struktur erforderte. Die Verwendung eines bereits existenten Repertoires an Bindemolekülen, um nach einem Bindebestandteil zu screenen, wie dies hierin offenbart wird, wurde nicht geoffenbart. Weiters diskutieren sie nicht die Bevorzugung der Vielfalt ihrer Bindemoleküle in natürlichen Variationsblöcken, wie z. B. CDR's von Immunglobulinen, um die Bildung von verbesserten Molekülen zu bevorzugen und unvorteilhafte Variationen zu vermeiden. Die Anmeldung WO 90/02809 schließt auch spezifisch die Anmeldung ihres Verfahrens zur Produktion von scFv-Molekülen aus.
- In jedem der oben besprochenen Patente (WO 88/06630 und WO 90/02809), ist das zur Präsentation vorgeschlagene Protein eine einzelne Polypeptidkette. Es gibt keine Offenbarung eines Verfahrens, das ein dimeres Molekül durch Expression eines Monomers als Fusion mit einem Capsidprotein und das andere Protein in freier Form präsentiert.
- WO 91/17271, zitiert gemäß Artikel 54(3) DPC nur in Bezug auf das beanspruchte Prioritätsdatum relevant, beschreibt die Insertion eines Proteins in ein Hüllenprotein eines Bakteriophagen und die Verwendung von Affinitätsreinigungsverfahren, um Phagenpartikel zu selektieren.
- WO92/06204, zitierbar ebenfalls gemäß Artikel 54(3) EPC und nur in Bezug auf das beanspruchte Prioritätsdatum relevant, schlägt das Präsentieren heteromerer Rezeptorproteine an der Oberfläche von Zellen vor, wobei filamentöse Bakteriophagen als bevorzugte Ausführungsform genannt werden.
- Eine weitere Offenbarung, veröffentlicht im Mai 1991 (nach dem frühesten Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Insertion der Kodiersequenzen einer der zwei Ketten des Fab-Abschnitts eines Antikörpers in Gen VIII von M13 mit einer Co-Expression des anderen aus einem Plasmid. Es wurde gezeigt, daß die zwei Ketten als funktionelles Fab-Fragment auf der Oberfläche des Phagen exprimiert wurden (Kang A. S. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 S. 4363-4366). Es erfolgte keine Offenbarung der Insertionsstelle in Gen VIII und der Assay auf pAb-Bindeaktivität durch ELISA benützte ein Reagens, daß für die L-Kette eines Antikörpers und nicht für einen Phagen spezifisch ist. Eine weitere Offenbarung, die im März 1991 (nach dem frühesten Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung) veröffentlicht wurde, beschreibt die Insertion eines Fragments des gag-Proteins des AIDS-Virus in den N-terminalen Abschnitt des Gen III des Bakteriophagen fd. Die Expression des gag-Proteins wurde durch immunologische Verfahren nachgewiesen, aber es wurde nicht gezeigt, ob das Protein in einer funktionellen Form exprimiert wurde (Tsunetsugu-Yokota Y. et al., (1991) Gene 99 S. 261-265).
- Das Problem, wie Bakteriophagen auf diese Weise zu verwenden sind, ist tatsächlich schwierig. Das Protein muß in den Phagen in einer Weise insertiert werden, daß die Integrität der Phagenhülle nicht verletzt wird, und das Protein selbst sollte funktionell sein und seine biologische Aktivität bezüglich der Antigenbindung beibehalten. Somit sollte, wenn das Protein der Wahl ein Antikörper ist, dieser sich korrekt und effizient falten und zur Antigenbindung präsentiert werden. Eine Lösung des Problems für Antikörpermoleküle und -fragmente würde auch ein allgemeines Verfahren für ein beliebiges Biomolekül, das ein Bestandteil eines spezifischen Bindepaares ist, z. B. Rezeptormoleküle und Enzyme, bereitstellen.
- Überraschenderweise konnten die Anmelder einen Bakteriophagen konstruieren, der an seiner Oberfläche ein großes, biologisch funktionelles Bindemolekül (z. B. Antikörperfragmente, Enzyme und Rezeptoren) exprimiert und präsentiert, und der intakt und infektiös bleibt. Die Anmelder nannten die Struktur, die ein Viruspartikel und ein Bindemolekül umfaßt, eine "Packung" ("package"). Wenn das Bindemolekül ein Antikörperderivat oder -fragment oder eine Domäne ist, die homolog zu einer Immunglobulindomäne ist, nennen die Anmelder die Packung einen "Phagenantikörper" (pAb). Es sollte jedoch, außer wenn es der Zusammenhang anders verlangt, wenn der Ausdruck Phagenantikörper allgemein verwendet wird, dieser ebenfalls so interpretiert werden, daß er sich auf eine beliebige Packung, die ein Viruspartikel und ein auf der Virusoberfläche präsentiertes, biologisch funktionelles Bindemolekül umfaßt, bezieht.
- pAbs haben einen Anwendungsbereich bei der Auswahl von Antikörpergenen, die für Antigenbindeaktivität kodieren. Beispielsweise können pAbs zum Klonieren und Auswählen von Hybridomen verwendet werden (Orlandi, R., et al., (1989) PNAS 86 S. 3833-3837), und beim Screenen von großen kombinatorischen Bibliotheken (wie z. B. jene in Huse, W. D. et al., 1989, Science 246, 1275-1281). Insbesondere können Selektionsrunden unter Verwendung von pAbs bei der Auswahl von Antikörpern mit hoher Affinität aus den letzteren Bibliotheken hilfreich sein. Es kann vorzuziehen sein, kleine Bibliotheken zu screenen, die aus Antigen-selektierten Zellen stammen (Casali, P., et al., (1986) Science 234 S. 476-479), um die ursprünglichen VH/VL-Paare, die die Fv-Region eines Antikörpers umfassen, auszuwählen. Die Verwendung von pAbs kann auch die Konstruktion von vollständig synthetischen Antikörpern gestatten. Weiters können Antikörper hergestellt werden, die einige synthetische Sequenzen, z. B. CDRs, und einige natürliche vorkommende Sequenzen aufweisen. Beispielsweise können V-Genrepertoires in vitro hergestellt werden, indem nicht erneut angeordnete V-Gene mit D- und J- Segmenten kombiniert werden. Bibliotheken von pAbs können dann durch die Bindung an Antigen ausgewählt werden, in vitro in den Antigen-bindenden Schleifen oder V-Domänengerüstregionen hypermutiert werden, und weiteren Selektions- und Mutageneserunden unterzogen werden.
- Wie bereits besprochen verlieren getrennte H- und L-Kettenbibliotheken die ursprüngliche Paarung zwischen den Ketten. Es ist schwierig, eine Bibliothek, die groß genug für eine besonders vorteilhafte Kombination von H- und L-Ketten ist, herzustellen und zu screenen.
- Beispielsweise gibt es in einer Maus etwa 10&sup7; mögliche H-Ketten und 10&sup7; mögliche L- Ketten, und um etwas wie diese Anzahl an Kombinationen zu testen, müßte man eine Bibliothek mit etwa 10¹&sup4; Klonen herstellen und screenen. Dazu gab es bisher keine praktische Möglichkeit.
- Die vorliegende Erfindung bietet eine Anzahl an Ansätzen, die dieses Problem erleichtern.
- In einem ersten Ansatz (einem statistischen kombinatorischen Ansatz, siehe Beispiele 16 und 17) wird eine größtmögliche Bibliothek gebildet, die so viele wie möglich von den 10¹&sup4; möglichen Kombinationen exprimiert. Durch die Expression der H- und L-Ketten an der Oberfläche des Phagen, ist es jedoch in vernünftigem Ausmaß durchführbar, die gewünschte Kombination aus allen gebildeten Kombinationen durch Affinitätsverfahren auszuwählen (siehe weiter unten zur Beschreibung der Selektionsformate).
- In einem zweiten Ansatz (von den Anmeldern dualer kombinatorischer Ansatz genannt), siehe Beispiel 22, wird zur Selektion der gewünschten Kombination eine große Bibliothek aus zwei kleineren Bibliotheken gebildet. Dies erleichtert das Problem weiter. Der Ansatz beinhaltet die Bildung von: (i) einer ersten Bibliothek von etwa 10&sup7; z. B. H-Ketten, die auf einem Bakteriophagen präsentiert werden (als Fusion mit dem durch Gen III kodierten Gen), die gegen z. B. Tetracyclin resistent ist; und (ii) einer zweiten Bibliothek mit etwa 10&sup7; z. B. L-Ketten, in der die Kodiersequenzen für diese leichten Ketten innerhalb eines Plasmidvektors, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen (ein Phagemid) enthält, die gegen z. B. Ampicillin resistent ist (d. h. ein unterschiedliches Antibiotikum) und die im periplasmatischen Raum eines Wirtsbakteriums exprimiert werden. Die erste Bibliothek wird dann verwendet, um die Bakterien, die die zweite Bibliothek enthalten, zu infizieren, um 10¹&sup4; Kombinationen von H- und L-Ketten auf der Oberfläche der resultierenden Phagen im bakteriellen Überstand zu liefern.
- Der Vorteil dieses Ansatzes ist, daß zwei getrennte Bibliotheken mit etwa 10&sup7; Elementen gebildet werden, um 10¹&sup4; Kombinationen herzustellen. Die Bildung einer Bibliothek mit 10&sup7; Elementen ist praktisch möglich.
- Die 10¹&sup4; Kombinationen werden dann einer Selektion unterzogen (siehe weiter unten zur Beschreibung der Selektionsformate) wie dies durch die vorliegende Anmeldung geoffenbart wird. Diese Selektion gibt dann eine Phagenpopulation, die eine bestimmte Kombination von H- und L-Ketten mit der gewünschten Spezifität zeigt. Die ausgewählten Phagen enthalten jedoch nur DNA, die für einen Bestandteil des Paars der H- und L- Ketten kodiert (stammt entweder aus dem Phagen oder aus dem Phagemid). Das Probeneluat, das die Population enthält, wird dann in zwei Teile geteilt. Ein erster Teil wird auf z. B. Tetracyclinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen auszuwählen, die DNA, die für an der Antigenbindung beteiligte H-Ketten kodiert, enthalten. Ein zweiter Teil wird auf z. B. Ampicillinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen auszuwählen, die Phagemed-DNA, die für an der Antigenbindung beteiligte H-Ketten kodiert, enthalten. Ein Koloniensatz aus einzeln isolierten Klonen, z. B. von den Tetracyclinplatten werden dann zur Infektion von spezifischen Kolonien z. B. von den Ampicillinplatten verwendet. Dies ergibt Bakteriophagen, die spezifische Kombinationen von H- und L-Ketten exprimieren, die dann auf Antigenbindung untersucht werden können.
- In einem dritten Ansatz (von den Anmeldern hierarchischer dualer Kombinationsansatz genannt) wird eine einzelne Kolonie entweder vom H- oder L-Kettenklon, die durch Züchten auf den Antibiotikaplatten ausgewählt wurde, verwendet, um eine gesamte Bibliothek von Klonen, die für die andere Kette (H oder L) kodieren, zu infizieren. Die Selektion erfolgt wie oben beschrieben. Dies bevorzugt die Isolierung der günstigsten Kombination.
- In einem vierten Ansatz (von den Anmeldern hierarchischer Ansatz genannt, siehe Beispiele 18 und 36) werden beide Ketten in denselben Vektor kloniert. Eine der Ketten, von der man weiß, daß sie gewünschte Eigenschaften aufweist, wird fixiert. Eine Bibliothek der komplementären Kette wird in denselben Vektor insertiert. Geeignete Partner für die fixierte Kette werden nach der Präsentation auf der Oberfläche des Bakteriophagen ausgewählt.
- In einem fünften Ansatz (siehe Beispiel 38) kann, um die Chancen ursprüngliche Paare zu verbessern, die Komplexität der kombinatorischen Bibliotheken reduziert werden, indem kleine B-Populationen von B-Lymphozyten, die zur Bindung an ein gewünschtes Antigen ausgewählt wurden, verwendet werden. Die Zellen bieten z. B. mRNA oder DNA zur Herstellung von Bibliotheken von Antikörpergenen zur Präsentation auf Phagen. Dieses Verfahren kann in Kombination mit den obigen vier Ansätzen zur Selektion von Antikörperspezifitäten verwendet werden.
- Phagemide wurden bereits oben erwähnt. Die Anmelder haben realisiert und gezeigt, daß Phagemide in vielen Fällen gegenüber Phagen zur Klonierung von Antikörper vorzuziehen sind, da sie einfacher zu verwenden sind, um umfassendere Bibliotheken des Immunrepertoires herzustellen. Dies ist so, weil die Phagemid-DNA etwa 100fach effizienter als Bakteriophagen-DNA bei der Transformation von Bakterien ist (siehe Beispiel 15). Die Verwendung von Phagemiden ermöglicht es auch, die Anzahl der Gen III-Bindemolekülfusionsproteine, die auf der Oberfläche des Bakteriophagen präsentiert werden, zu variieren (siehe Beispiel 13). Beispielsweise bestimmt in einem System, das eine Bakterienzelle umfaßt, die ein für ein Gen III-Fusionsprotein kodierendes Phagemid enthält, und die mit einem Helferphagen infiziert ist, die Induktion der Expression der Gen III-Fusionsproteine in unterschiedlichem Ausmaß die Anzahl der Gen III-Fusionsproteine, die nach der Superinfektion in dem zwischen der inneren und äußeren Bakterienmembran definierten Raum vorhanden sind. Dies bestimmt das Verhältnis der Gen III- Fusionsproteine zu nativem Gen III-Protein, das der zusammengesetzte Phagen zeigt.
- Die Expression eines einzelnen Fusionsproteins pro Virion kann die Selektion von Antikörperspezifitäten auf Affinitätsbasis durch die Vermeidung des "Aviditäts"-Effekts, bei dem ein Phage, der zwei Kopien eines Antikörpers mit geringer Affinität exprimiert, dieselbe offensichtliche Affinität aufweist wie ein Phage, der eine Kopie eines Antikörpers mit höherer Affinität exprimiert. In einigen Fällen ist es jedoch wichtig, alle Gen III-Moleküle, die aus der Superinfektion von Phagemid-hältigen Zelle stammen, zu zeigen, um Fusionen zu erhalten (z. B. zur Selektion von Bindemolekülen mit niedriger Affinität oder zur Verbesserung der Sensitivität bei ELISA). Ein gangbarer Weg wäre die Superinfektion mit einem Bakteriophagen, der ein defektes Gen III enthält. Die Anmelder haben daher einen Phagen entwickelt und verwendet, bei dem Gen III deletiert ist. Dies ist völlig neu.
- Die Demonstration, daß eine funktionelle Antigenbindedomäne auf der Oberfläche eines Phagen präsentiert werden kann, hat Auswirkungen auf die Konstruktion von neuen Antikörpern. Beispielsweise könnten, wenn andere Proteindomänen an der Oberfläche des Phagen präsentiert werden können, Phagenvektoren verwendet werden, um Gene durch die Bindeeigenschaften des präsentierten Proteins zu klonieren und auszuwählen. Weiters könnten Proteinvarianten, einschließlich in die Oberfläche des Proteins eingebauter Epitopbibliotheken, hergestellt werden und leicht nach Bindeaktivitäten ausgewählt werden. Andere Proteinarchitekturen könnten als "neuartige" Antikörper dienen.
- Das Verfahren bietet die Möglichkeit, Antikörper nach ersten Prinzipien zu bauen, wobei der Vorteil des strukturellen Gerüsts, in dem sich die Antigen-bindenden Schleifen falten, genützt wird. Im allgemeinen haben diese Schleifen eine begrenzte Anzahl an Konformationen, die eine Vielfalt an Bindestellen durch alternative Schleifenkombinationen und durch verschiedene Seitenketten bilden. Jüngste Erfolge bei der Modellierung von Antigenbindestellen sind für die de novo-Gestaltung vielversprechend. In jedem Fall wird eine hochauflösende Struktur des Antigens benötigt. Der Ansatz ist jedoch zur Herstellung von z. B. katalytischen Antikörpern aussichtsreich, insbesondere für kleine Substrate. Hier können Seitenketten oder Bindestellen für prostethische Gruppen eingebracht werden, nicht nur um den Übergangszustand des Substrats selektiv zu binden, sondern auch um direkt bei der Bindungsbildung und -zerstörung teilzunehmen. Die einzige Frage ist, ob der Antikörperaufbau, der auf Bindung spezialisiert ist, der beste Ausgangspunkt zur Herstellung von Katalysatoren ist. Ursprüngliche Enzymarchitekturen, wie z. B. der Triosephosphat-Isomerase- (TIM-) Rumpf, könnten besser geeignet sein. Wie Antikörper haben auch TIM-Enzyme eine Gerüststruktur (einen Rumpf aus β-Faltblattstrukturen und α-Helices) und Schleifen, um Substrat zu binden. Viele Enzyme mit einer Vielfalt an katalytischen Eigenschaften basieren auf diesem Aufbau und die Schleifen könnten unabhängig von den Gerüsten zur Gestaltung neuer katalytischer und Bindeeigenschaften manipuliert werden. Das Phagenselektionssystem gemäß der vorliegenden Offenbarung kann verwendet werden, um nach Antigenbindeaktivitäten auszuwählen und die so ausgewählten CDR-Schleifen entweder auf einem Antikörpergerüst oder auf einem TIM-Rumpfgerüst verwendet werden. Schleifen, die auf einem z. B. TIM-Rumpfgerüst angeordnet sind, könnten weiter durch Mutagenese modifiziert und weiterer Selektion unterzogen werden. Somit ist es nicht erforderlich, nach Bindeaktivitäten mit hoher Affinität in einem einzelnen Schritt zu selektieren. Die Strategie des Immunsystems, bei der sich niedere Affinität zu hoher Affinität entwickelt scheint realistischer und kann unter Verwendung dieser Erfindung imitiert werden.
- Obwohl innerhalb dieser Anmeldung die Anmelder die Möglichkeit diskutieren, Varianten von pAbs mit höherer Affinität zu screenen, erkennen sie, daß in einigen Anwendungen, beispielsweise Chromatographie mit niederer Affinität (Ohlson, S. et al., Anal. Biochem. 169, S. 204-208 (1988)), es wünschenswert sein kann, Varianten mit niederer Affinität zu isolieren.
- Die Beispiele 17 und 19 zeigen, daß die vorliegende Erfindung einen Weg bietet, Antikörper mit niedriger Affinität herzustellen (wie dies in der primären Immunantwort oder in nicht immunisierten Tieren zu sehen ist). Dies wird möglich gemacht, indem vielfache Kopien des Antikörpers auf der Phagenoberfläche in Verbindung mit dem Gen III- Protein präsentiert werden. Somit ermöglichen pAbs die Isolierung von Genen für diese Antikörper und falls nötig die Mutation, um verbesserte Antikörper bereitzustellen.
- pAbs gestatten auch die Selektion von Antikörpern mit verbesserter Stabilität. Es zeigte sich bei vielen Antikörpern, daß die Ausbeute und Stabilität verbessert werden, wenn die Antikörper bei 30ºC und nicht bei 37ºC exprimiert werden. Wenn pAbs bei 37ºC präsentiert werden, sind nur jene zur Affinitätsselektion verfügbar, die stabil sind. Wenn Antikörper in vivo zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verwendet werden, würde eine erhöhte Stabilität die Halbwertszeit der Antikörper im Blutkreislauf erhöhen.
- Es ist oft notwendig, die Vielfalt einer Population von Genen, die kloniert wurden, um deren Proteine auf Phagen zu präsentieren oder um eine einzelne Nucleotidsequenz zu mutieren, zu erhöhen. Obwohl in vitro- oder in vivo-Mutageneseverfahren für beide Zwecke verwendet werden können, wäre die Verwendung von Mutatorstämmen ein besonders geeignetes Verfahren. Ein Mutatorstamm ist ein Stamm, der einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, daß DNA, die darin repliziert wird, bezüglich ihrer ursprünglichen DNA mutiert wird. Daher wird eine Genpopulation, wenn diese als Gen III-Fusionen in diese Stämme eingebracht wird, in ihrer Vielfalt weiter erhöht und sie kann dann, falls gewünscht, in einen nicht-Mutatorstamm zur Präsentation und Selektion transferiert werden. Beispiel 29 betrifft die Verwendung von Mutatorstämmen mit Phagenantikörpern (ein Beispiel einer in vitro-Mutagenese und Selektion von Phagenantikörpern wird in Beispiel 35 gegeben).
- Bei einer nützlichen und neuen Gruppe von Anwendungen wird das Bindeprotein auf dem Phagen genutzt, um das Phagen-Genom zu einer bestimmten Zelle oder Gruppe von Zellen zu lenken. Beispielsweise kann ein pAb, der für ein Zelloberflächenmolekül spezifisch ist, verwendet werden, um die Target-Zelle über das Oberflächenmolekül zu binden. Der Phage könnte dann entweder durch die Wirkung des Rezeptors selbst oder als Ergebnis eines anderen Ereignisses (z. B. einer elektrischen Entladung, wie bei der Elektroporationstechnik) internalisiert werden. Das Phagenom wird dann exprimiert, wenn die relevanten Steuerungssignale (für die Transkription und Translation und möglicherweise die Replikation) vorhanden sind. Das wäre besonders nützlich, wenn das Phagengenom eine Sequenz enthielte, deren Expression in der Target-Zelle erwünscht ist (gemeinsam mit der angemessenen Expressionssteuerungssequenzen). Eine nützliche Sequenz kann der Rezipientenzelle Antibiotikaresistenz verleihen oder die Zelle durch die Expression ihres Produktes markieren (beispielsweise, wenn die exprimierte Sequenz ein detektierbares Genprodukt, wie z. B. eine Luciferase ist, siehe M. White et al., Techniques 2(4), 194-201 (1990)), oder der Target-Zelle eine bestimmte Eigenschaft verleihen (z. B. wenn die Target-Zelle eine Tumorzelle ist und die neue Sequenz die Expression eines Tumorunterdrückungsgens lenkt), oder ein Antisense-Konstrukt exprimieren, das dazu bestimmt ist, ein Gen oder einen Satz von Genen in der Target-Zelle auszuschalten, oder ein Gen oder Genprodukt, das dazu bestimmt ist, in der Target-Zelle toxisch zu sein.
- Alternativ dazu kann für die Sequenz, deren Expression in der Target-Zelle gewünscht ist, auf einem Phagemid kodiert werden. Die Phagemid-DNA kann dann in einen Phagen aufgenommen werden, auf dem ein Antikörper freiliegt, der für einen Zelloberflächen-Rezeptor spezifisch ist. Beispielsweise kann die Aufnahme durch Superinfektion von Bakterien erfolgen, die das Phagemid enthalten, mit einem Helfer-Phagen, dessen Genom für das Antikörperfragment kodiert, das für die Target-Zelle spezifisch ist. Die Packung wird dann verwendet, um das Phagemid zur Target-Zelle zu lenken.
- Diese Technik des "gezielten Gentransfers" findet in der Forschung und auch in der Therapie und Diagnose vielfach Anwendung. Beispielsweise zielt Gentherapie oft darauf ab, das Ersatzgen zu einem spezifischen Zelltyp zu lenken, der Defizienz bezüglich dessen Aktivität aufweist. Targetting-pAbs stellen ein Mittel dar, das zu erreichen.
- In der Diagnose ist ein Phage, der für bestimmte Bakterien oder Gruppen von Bakterien spezifisch ist, verwendet worden, um Markergene, beispielsweise Luciferase, zum bakteriellen Wirt zu lenken (siehe beispielsweise S. Ulitzer und J. Kuhn, EPA 85303913.9). Wenn der Wirtsbereich des Phagen angemessen ist, werden nur jene Bakterien, auf die getestet wird, vom Phagen infiziert, exprimieren das Luciferasegen und werden durch das Licht detektiert, das sie aussenden. Dieses System ist eingesetzt worden, um das Vorhandensein von Salmonella zu detektieren. Ein Hauptproblem bei diesem Ansatz ist die anfängliche Isolierung eines Bakteriophagen mit dem korrekten Wirtsbereich und dann das Klonieren einer Luciferasegenkassette in diesen Phagen, so daß es funktionell ist. Das pAb-System ermöglicht es, die Luciferasekassette in ein gut charakterisiertes System (filamentösen Phagen) zu klonieren, und ermöglicht die einfache Selektion eines angemessenen Wirtsbereichs durch Modifikation der Spezifität für Antikörper (oder ein anderes Bindemolekül, für die der pAb kodiert.
- Den Anmeldern der vorliegenden Erfindung ist es auch gelungen, neue Selektionssysteme und Testformate zu entwickeln, die auf den einzigartigen Eigenschaften dieser pAbs basieren.
- Viel der in diesem Abschnitt diskutierten Terminologie wurde bereits, sofern passend, im Text erwähnt.
- Dies beschreibt ein Paar von Molekülen (wobei jedes Bestandteil eines spezifischen Bindepaares ist), die aus natürlich vorkommenden erhalten oder synthetisch hergestellt wurden. Eines Teil des Molekülpaars weist eine Fläche oder eine Höhlung an seiner Oberfläche auf, die sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär mit dieser definiert ist, sodaß das Paar die Eigenschaft besitzt, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Typen von spezifischen Bindepaaren sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, IgG-Protein A.
- Dieser Ausdruck beschreibt ein erstes Polypeptid, das sich mit zumindest einem zweiten Polypeptid assoziiert, wenn die Polypeptide in freier Form und/oder an der Oberfläche eines Substrats exprimiert werden. Das Substrat kann durch einen Bakteriophagen bereitgestellt werden. Wenn zwei assoziierte Polypeptide vorhanden sind, ist der assoziierte Polypeptidkomplex ein Dimer, wenn drei vorhanden sind, ein Trimer usw. Das Dimer, Trimer, Multimer usw. oder das multimere Element kann ein Element eines spezifischen Bindepaares umfassen.
- Beispiele für multimere Elemente sind schwere Domänen auf Basis eines Immunglobulinmoleküls, leichte Domänen auf Basis eines Immunglobulinmoleküls, T-Zellen-Rezeptor-Subeinheiten.
- Dies beschreibt ein filamentöses Bakteriophagen-Teilchen, in dem das Teilchen einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares an seiner Oberfläche präsentiert. Die Packung kann ein Bakteriophage sein, der an seiner Oberfläche eine Antigenbindedomäne präsentiert. Dieser Typ einer Packung wurde Phagenantikörper (pAb) genannt.
- Dies beschreibt entweder ein natürliches oder ein teilweise oder gänzlich synthetisch hergestelltes Immunglobulin. Der Ausdruck umfaßt auch ein beliebiges Protein mit einer Bindedomäne, die mit einer Immunglobulinbindedomäne homolog ist. Diese Proteine können aus natürlichen Quellen stammen, oder teilweise oder gänzlich synthetisch hergestellt sein. Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulinisotypen und die Fab-, F(ab¹)&sub2;-, scFv-, Fv-, dAb-, Fd-Fragmente.
- Dies beschreibt eine Familie von Polypeptiden, deren Mitglieder zumindest eine Domäne mit einer Struktur, die mit der der variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulinmolekülen verwandt ist, aufweisen. Die Domäne enthält zwei β-Faltblattstrukturen und üblicherweise eine konservierte Disulfidbindung (siehe A. F. Williams und A. N. Barclay 1988 Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405).
- Beispiele für die Mitglieder einer Immunglobulinüberfamilie sind CD4, aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktorrezeptor (PDGFR), intrazelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM). Außer wenn der Zusammenhang dies anders erfordert, umfaßt der Hinweis auf Immunglobuline und Immunglobulinhomologe in dieser Anmeldung Mitglieder der Immunglobulinüberfamilie und Homologe davon.
- Dieser Ausdruck bezeichnet Polypeptide mit denselben oder konservierten Resten an einer entsprechenden Position in deren Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur. Der Begriff umfaßt auch zwei oder mehr Nucleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptide kodieren.
- Beispiele für homologe Peptide sind die Immunglobulinisotypen.
- Bezüglich eines sbp-Bestandteils, der an der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagenpartikels präsentiert wird, bedeutet dies, daß der sbp-Bestandteil in einer gefalteten Form, in der seine spezifische Bindedomäne für seinen komplementären sbp-Bestandteil die gleiche oder fast analog zu ihrer Nativkonfiguration ist, präsentiert wird, wodurch dieser ähnliche Spezifität bezüglich des komplementären sbp-Bestandteils aufweist. Diesbezüglich unterscheidet sich dieser von den Peptiden von Smith et al., s.o., die keine definierte gefaltete Konfiguration aufweisen und eine Vielzahl an Konfigurationen annehmen können, die durch die komplementären Bestandteile, mit denen sie in Kontakt gebracht werden können, bestimmt sind.
- In Verbindung mit sbp-Bestandteilen oder Polypeptidkomponenten davon, bezieht sich dies nicht nur auf die Vielfalt, die in der natürlichen Population von Zellen oder Mikroorganismen vorkommen kann, sondern auch auf die Vielfalt, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo gebildet wurde.
- Die Mutation in vitro kann z. B. statistische Mutagenese unter Verwendung von Oligonucleotiden mit statistischen Mutationen der Sequenz, die man variieren möchte, umfassen. Bei der in vivo-Mutagenese können z. B. Mutatorstämme von Wirtsmikroorganismen verwendet werden, um die DNA zu erhalten (siehe Beispiel 38 unten).
- Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, der in sich selbst gefaltet ist und unabhängig von den anderen Teilen des gleichen Proteins und unabhängig vom komplementären Bindebestandteil ist.
- Dies ist eine spezifische Kombination einer α-Helix- und/oder β-Faltblatt- und/oder β- Schfeifenstruktur. Domänen und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren, welche in der Primärstruktur nicht benachbart sind, zusammenbringen.
- Dies beschreibt den Zustand eines Polypeptids, das nicht von einer replizierbaren, genetischen Präsentations-Packung präsentiert wird.
- Dies beschreibt ein Gen, das ein bestimmtes Polypeptid unter einer Bedingungsanordnung nicht exprimiert, aber unter einer anderen doch. Ein Beispiel ist ein Gen, das eine "Amber"-Mutation aufweist, die in nicht-supprimierenden bzw. supprimierenden Wirten exprimiert wird.
- Alternativ dazu kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter einer Bedingungsanordung defekt ist, aber unter einer anderen nicht. Ein Beispiel ist ein Gen mit einer temperatursensitiven Mutation.
- Dies beschreibt ein Codon, das die Translation von Nucleotidsequenzen stromabwärts von dem Codon unter einer Bedingungsanordnung erlaubt, aber unter einer anderen Bedingungsanordnung die Translation an diesem Codon endet. Beispiele für unterdrückbare Translationsstopcodons sind die "Amber"-, "Ocker"- und "Opal"-Codons.
- Dies ist eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, daß darin replizierte DNA bezüglich ihrer ursprünglichen DNA mutiert ist. Beispiele für Mutatorstämme sind NR9046mutD5 und NR9046 mut T1 (siehe Beispiel 38).
- Dies ist ein Phage, der verwendet wird, um Zellen zu infizieren, die ein defektes Phagengenom enthalten, und der eine Beseitigung des Defekts bewirkt. Das defekte Phagengenom kann ein Phagemid oder ein Phage, in dem Gensequenzen für einige Funktionen entfernt wurden, sein. Beispiele für Helferphagen sind M13K07, M13K07 Gen III Nr. 3; und Phagen, die ein mit einem Capsidprotein fusioniertes Bindeprotein präsentieren oder dafür kodieren.
- Dies ist ein DNA-Molekül, das in einem Wirtsorganismus, in den ein Gen insertiert wurde, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren, repliziert werden kann.
- Dies ist ein Vektor, der aus der Modifikation eines Phagengenoms stammt und einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen, aber nicht für ein Plasmid, enthält. Phagemidvektor
- Dies ist ein Vektor, der aus der Modifikation eines Plasmidgenoms stammt und einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen sowie den Plasmidreplikationsursprung enthält.
- Dies beschreibt ein Bakteriophagenteilchen oder ein Molekül, das mit einem auf dem Bakteriophagenteilchen präsentierten Bestandteil eines sbp verbunden ist, worin der sbp-Bestandteil und/oder das Molekül gefaltet wurden, und die Packung außerhalb des zellulären Cytosols zusammengesetzt wurde.
- Eine Sammlung von natürlich vorkommenden Nucleotiden, z. B. DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulingene in einem Tier kodieren. Die Sequenzen werden durch eine in vivo-Neuordnung von z. B. V-, D-, und J-Segmenten für die H-Ketten und V- und J-Segmenten für die L-Ketten gebildet. Alternativ dazu können die Sequenzen aus einer in vitro immunisierten Zelllinie, in der die Neuordnung als Antwort auf die Immunisierung intrazellulär erfolgte, gebildet werden.
- Eine Sammlung von Nucleotid-, z. B. DNA-Sequenzen, in Klonen.
- Eine Sammlung von Nucleotid-, z. B. DNA-Sequenzen, die zur Gänze oder zum Teil aus einer Quelle stammen, die eine andere ist als die der neugeordneten Immunglobulinsequenzen aus einem Tier. Dies kann z. B. DNA-Sequenzen umfassen, die durch die Kombination von nicht neugeordneten V-Segmenten mit D- und J-Segmenten für VH-Domänen kodieren, und DNA-Sequenzen, die durch die Kombination von V- und)-Segmenten für VL-Domänen kodieren.
- Ein Teil der gesamten DNA-Sequenzen kann aus der Oligonucleotidsynthese stammen.
- Dies ist eine Sequenz von Aminosäuren, die mit dem N-terminalen Ende eines Polypeptids verbunden ist und die die Bewegung des Polypeptids aus dem Cytosol hinaus lenkt.
- Dies ist eine Lösung, die verwendet wird, um die Verbindung zwischen zwei Molekülen aufzubrechen. Die Bindung kann eine nicht kovalente oder kovalente Bindung(en) sein. Die zwei Moleküle können Bestandteile eines sbp sein.
- Dies ist eine Substanz, die von einem Polypeptid abstammt, welches von der innerhalb eines ausgewählten Bakteriophagenteilchens befindliche DNA kodiert wird. Das Derivatpolypeptid kann sich vom kodierten Polypeptid durch die Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder durch die Verbindung von anderen Molekülen mit dem kodierten Polypeptid unterscheiden. Diese Änderungen können auf der Nucleotid- oder der Proteinebene erfolgen. Z. B. kann das kodierte Polypeptid ein Fab- Fragment sein, das dann mit einem Fc-Teil aus einer anderen Quelle verbunden wird. Alternativ dazu können auch Marker wie z. B. Enzyme, Fluoreszenzgruppen usw. mit z. B. Fab-, scEv-Fragmenten verbunden werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines filamentösen Bakteriophagenpartikels bereit, das auf seiner Oberfläche ein Bindemolekül präsentiert, das für ein bestimmtes Target-Epitop oder Antigen spezifisch ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
- das Erzeugen einer Population filamentöser Bakteriophagen-Teilchen, auf deren Oberfläche eine Population von Bindungsmolekülen präsentiert wird, die eine Bandbreite von Bindungsspezifitäten aufweisen, worin die Bindungsmoleküle Fab-Antikörpermoleküle sind, die sich an das Target-Epitop oder -Antigen binden können, und worin jedes filamentöse Bakteriophagen-Teilchen ein Phagemid-Genom enthält, das Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz umfaßt, die für das Bindungsmolekül kodiert, das von der Nucleinsäure exprimiert wird und auf der Oberfläche der Teilchen präsentiert wird,
- das Selektieren bezüglich eines filamentösen Bakteriophagen-Teilchens, auf dem ein Bindungsmolekül mit einer gewünschten Spezifität präsentiert wird, durch Kontaktieren der Population filamentöser Bakteriophagen-Teilchen mit einem Target-Epitop oder -Antigen, so daß einzelne Bindungsmoleküle, die auf den filamentösen Bakteriophagen-Teilchen präsentiert werden, sich mit der gewünschten Spezifität an das Target- Epitop oder -Antigen binden.
- Das Verfahren kann einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Schritte umfassen:
- (i) das Abtrennen jeglicher gebundener filamentöser Bakteriophagen-Teilchen vom Target-Epitop oder Antigen; und
- (ii) das Gewinnen jeglicher abgetrennter filamentöser Bakteriophagen-Teilchen, die ein Bindemolekül mit einer gewünschten Spezifität präsentieren. Im Selektionsschritt kann die Nucleotidsequenz isoliert werden, die für das Bindemolekül mit der gewünschten Spezifität kodiert, da das Bindemolekül in Verbindung mit der Oberfläche des filamentösen Bakteriophagen-Teilchens exprimiert wird, in dem die kodierende Nucleinsäure enthalten ist. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eine Bindemoleküls bereit, das für ein bestimmtes Target- Epitop oder -Antigen spezifisch ist, wobei das Verfahren umfaßt:
- die Durchführung eines Verfahrens, wie im obigen Absatz dargelegt, und die obigen Schritte (i) und (ii) umfassend;
- das Isolieren von so gewonnener Nucleinsäure, die für das Bindemolekül kodiert, von abgetrennten filamentösen Bakteriophagen-Teilchen;
- das Insertieren von Nucleinsäure, die für das Bindemolekül kodiert, oder eines Fragments oder Derivats davon mit Bindungsspezifität für das Target-Epitop oder -Antigen, in einem rekombinanten System; und das Produzieren des Bindemoleküls oder Fragments oder Derivats davon mit Bindespezifität für das Target-Epitop oder -Antigen in einem rekombinanten System, das von den filamentösen Bakteriophagen-Teilchen getrennt ist.
- Ein Helfer-Phage oder ein Plasmid, das komplementierende Phagengene exprimiert, wird verwendet, um das Packen des Phagemidgenoms zu unterstützen.
- Eine Bibliothek oder genetisch vielfältige Population kann erhalten werden von:
- (i) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulingene eines Tieres, das mit dem komplementären sbp-Element immunisiert wurde,
- (ii) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulingene eines Tieres, das nicht mit dem komplementären sbp-Element immunisiert wurde,
- (iii) einem Repertoire von künstlich umgeordnetem/-en Immunglobulingens oder -genen,
- (iv) einem Repertoire von homologem/-en Immunglobulingen oder -genen; oder
- (v) einem beliebigen Gemisch aus (i), (ii), (iii) und (iv).
- Das Capsidprotein kann im Helferphagen fehlen, defekt oder bedingt defekt sein.
- Die Wirtszelle kann ein Mutatorstamm sein, der genetische Vielfalt in die sbp-Element- Nucleinsäure einführt.
- Der Wirt kann ein Bakterium sein und die Komponente des filamentösen Bakteriophagenteilchens ein Capsidprotein für den Bakteriophagen sein. Der Phage kann ausgewählt sein aus den Klasse I-Phagen fd, M13, f1, Ifl, Ike, ZJ/Z, Ff und den Klasse II-Phagen Xf, Pf1 und Pf3. Der Phage kann fd sein oder ein Derivat von fd. Das Derivat kann gegen Tetracyclin resistent sein. Der sbp-Bestandteil oder die Polypeptidkette davon kann in die N-terminale Region des reifen Capsidproteins stromabwärts von der Sekretionsleadersequenz insertiert sein. Die Sequenz kann nach der Aminosäure + 1 des reifen Proteins insertiert sein. Die Insertionsstelle kann von kurzen Nucleotidsequenzen flankiert sein, die den Sequenzen entsprechen, die an jedem Ende der zu insertierenden Nucleinsäure vorkommen. Wenn z. B. die Proteindomäne eine Immunglobulindomäne ist, kann die Insertionsstelle im Phagen von Nucleotidsequenzen flankiert sein, die für die ersten fünf Aminosäuren und die letzten fünf Aminosäuren der Ig-Domäne kodieren. Solche flankierende Nucleotidsequenzen sind in Fig. 4(2) B und C gezeigt, worin die die Stelle flankierenden Nucleotidsequenzen für die Aminosäuresequenzen QVQLQ und VTVSS, die an den beiden Enden der VH-Domäne auftreten, oder für QVQLQ und LEIKR, die an den beiden Enden der Fv-(VH + VL kombiniert)-Domäne auftreten, kodieren. Jede dieser Sequenzen, die die Insertionsstelle flankieren, kann eine geeignete Spaltungsstelle einschließen, wie in Fig. 4 gezeigt.
- Alternativ dazu können die in Fig. 4(2) B und C gezeigten und oben beschriebenen flankierenden Nucleotidsequenzen verwendet werden, um die Insertionsstelle für eine beliebige zu insertierende Nucleinsäure zu flankieren, ob diese Nucleinsäure ein Immunglobulin kodiert oder nicht.
- Der Wirt kann E.coli sein.
- Die für ein sbp-Bestandteilpolypeptid kodierende Nucleinsäure kann stromab durch ein unterdrückbares Translationsstopcodon mit einem viralen Capsidprotein verbunden sein.
- Bei einem Verfahren zur Herstellung eines Bindemoleküls wie oben definiert, wird die Gensequenz, die für das Bindemolekül mit der gewünschten Spezifität kodiert, von einer allgemeinen Population von filmalentösem Bakteriophagen-Teilchen mit einem Bereich an Spezifitäten durch die Tatsache der Bindung an ein spezifisches Ziel (z. B. ein Antigen oder Epitop) abgetrennt. Somit kann das durch diese Expression gebildete filamentöse Bakteriophagen-Teilchen ausgewählt oder gescreent werden, um einen einzelnen sbp-Bestandteil oder eine ausgewählte Mischpopulation der sbp-Bestandteile zu bieten, die in deren jeweiligen Partikeln mit Nucleinsäure, die für diesen sbp-Bestandteil oder eine Polypeptidkette davon kodiert, verbunden sind. Die Partikel können durch Affinität zu einem zu diesem sbp-Bestandteil komplementären Bestandteil ausgewählt werden.
- Beliebige, an diesen zweiten Bestandteil gebundene Teilchen können durch Waschen mit einem Eluens gewonnen werden. Die Waschbedingungen können variiert werden, um Teilchen mit verschiedenen Bindeaffinitäten für das Epitop zu erhalten. Alternativ dazu kann, um z. B. Partikel mit hoher Affinität zu erhalten, der komplementäre Bestandteil (z. B. ein Epitop) der Population von Teilchen (z. B. pAbs), die bereits an einen Bindebestandteil gebunden sind, präsentiert werden, wobei in diesem Fall pAbs mit höherer Affinität für das Epitop die bereits gebundenen Bindebestandteile verdrängen. Somit kann das Eluens ein Molekül enthalten, das mit dem Teilchen um den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert. Das Teilchen kann dem komplementären sbp-Bestandteil in Gegenwart eines Moleküls, das mit der Packung um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert, zugegeben werden. Nucleinsäure, die von einem ausgewählten oder gescreenten Bakteriophagenteilchen stammt, kann verwendet werden, um den sbp-Bestandteil oder ein Fragment oder Derivat davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus zu exprimieren. Nucleinsäure aus einem oder mehreren Teilchen kann genommen und dazu verwendet werden, Nucleinsäure in einem weiteren Verfahren bereitzustellen, um einzelne sbp-Bestandteile oder eine Mischpopulation von sbp-Bestandteilen, oder dafür kodierende Nucleinsäure zu erhalten. Das Expressionsendprodukt kann modifiziert werden, um ein Derivat davon herzustellen.
- Das Expressionsendprodukt oder ein Derivat davon kann verwendet werden, um ein therapeutisches oder prophylaktisches Medikament oder ein Diagnoseprodukt herzustellen.
- Gemäß vorliegender Erfindung kann ein Helfer-Phage eingesetzt werden, dessen Genom Nucleinsäure fehlt, die für eines seiner Capsidproteine kodiert, oder dessen dafür kodierende Nucleinsäure bedingt defekt ist, oder die für das Capsidprotein in defekter oder bedingt defekter Form kodiert.
- Für die vorliegende Erfindung kann rekombinantes E.coli TG1 M13K07 glII Nr. 3 (NCTC 12478) eingesetzt werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein filamentöses Bakteriophagen-Teilchen bereit, das auf seiner Oberfläche ein Bindemolekül präsentiert, das ein Fab- oder Einzelketten- Fv-Antikörper-Molekül ist, das eine Bindedomäne umfaßt, die zur Bindung von Target- Epitop oder -Antigen fähig ist, wobei die Sequenz für das Bindemolekül kodiert, das aus der Nucleinsäure exprimiert und vom Teilchen an seiner Oberfläche präsentiert wird.
- Bei den obigen Verfahren kann das Bindemolekül entweder natürlich oder synthetisch abgeleitet oder eine Kombination aus beiden sein.
- Die vorliegende Erfindung stellt filamentöse Bakteriophagen-Teilchen wie oben definiert bereit, sowie eine Population derartiger filamentöser Bakteriophagen-Teilchen, die eine Population der Bindemoleküle mit einer Bandbreite von Bindespezifitäten präsentieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Fab-Antikörper- Molekülen, Fragmenten und Derivaten davon bereit. Die Derivate können Elemente des spezifischen Bindungspaares umfassen, die an ein anderes Molekül, wie z. B. ein Enzym oder einen Fc-Schwanz, fusioniert sind.
- Für die vorliegende Erfindung können Sets zur Durchführung ihrer Verfahren eingesetzt werden. Die Sets umfassen die erforderlichen Vektoren. Ein derartiger Vektor weist typischerweise einen Replikationsursprung für einsträngigen Bakteriophagen auf und enthält entweder die sbp-Element-Nucleinsäure oder weist eine Restriktionsstelle für seine Insertion in die 5'-Endregion der reifen Kodierungssequenz eines Phagencapsidproteins auf, und mit einer Sekretionsleader-Kodierungssequenz stromauf von dem Ort, der eine Fusion des exogenen Capsidoprotein-Polypeptids zum periplasmatischen Raum lenkt.
- Die Restriktionsstellen in den Vekoren sind vorzugsweise jene von Enzymen, die nur selten in Proteinkodierungssequenzen schneiden.
- Das Set umfaßt vorzugsweise einen Phagemidvektor, der die obigen Eigenschaften aufweisen kann und sbp-Element-Nucleinsäure für die Expression des kodierten Polypeptids in freier Form enthalten oder eine Insertionsstelle dafür aufweisen kann.
- Das Set enthält auch Hilfskomponenten, die zur Durchführung des Verfahrens erforderlich sind, wobei die Beschaffenheit derartiger Komponenten natürlich von dem im Speziellen eingesetzten Verfahren abhängt.
- Nützliche Hilfskomponenten können Helfer-Phagen, PCR-Primer sowie Puffer und Enzyme verschiedener Art sein.
- PCR-Primer und damit verbundene Reagentien zur Verwendung, wenn die sbp-Bestandteile Antikörper sind, können die folgenden Eigenschaften aufweisen:
- (i) Primer mit Homologie zum 5'-Ende des Sense- oder Antisense-Strangs der Sequenzen, die für Antikörperdomänen kodieren; und
- (ii) Primer einschließlich der tag-Sequenzen 5' von diesen homologen Sequenzen, die Restriktionsstellen beinhalten, um eine Insertion in Vektoren zu ermöglichen; zusammen mit Sequenzen, die das Zusammensetzen der amplifizierten VH- und VL-Regionen ermöglichen, um die Expression als Fv-, scFv-, oder Fab- Fragmente zu ermöglichen.
- Puffer und Enzyme werden typischerweise gemäß den hierin beschriebenen Strategien verwendet, um die Herstellung der Nucleotidsequenzen, die für die von neugeordneten oder nicht neugeordneten Immunglobulingenen erhaltenen Fv-, scFv- oder Fab-Fragmente kodieren, zu ermöglichen.
- Die Anmelder haben die filamentösen F-spezifischen Bakteriophagen als Beispiel für den Phagentyp ausgewählt, der als Vehikel für die Präsentation von Bindemolekülen, z. B. Antikörpern und Antikörperfragmente und Derivate davon, auf deren Oberfläche dienen könnte und die darauffolgende Selektion und Manipulation erleichtern könnte.
- Die F-spezifischen Phagen (z. B. f1, fd und M13) haben eine Methode zur Vermehrung entwickelt, das die Wirtszelle nicht tötet, und sie werden üblicherweise als Vehikel für rekombinante DNA verwendet (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1980). Das einzelsträngige DNA-Genom (etwa 6,4 Kb) von fd wird durch die bakterielle Membran extrudiert, wo es Capsid-Untereinheiten absondert, um reife Virionen zu bilden. Diese Virionen weisen eine Durchmesser von 6 nm und eine Länge von 1 um auf und jedes enthält etwa 2800 Moleküle des Haupthüllenproteins, das vom viralen Gen VIII kodiert wird, und 4 Moleküle des Adsorptionsmolekül-Gen III-Proteins (g3p), wobei sich das letztere an einem Ende des Virions befindet. Diese Struktur wurde von Webster et al., 1978 in The Single Stranded DNA Phages, 557-569, Cold Spring Harbour Press erläutert. Das Gen III-Produkt ist bei der Bindung des Phagen an den bakteriellen F-Pilus beteiligt.
- Obwohl diese Phagen ihre Wirte während der normalen Replikation nicht töten, kann die Zerstörung einiger ihrer Gene zum Zelltod führen (Kornberg, A., 1980, s.o.). Dies beschränkt zum Teil ihre Verwendung. Die Anmelder haben erkannt, daß das Gen III des Phagen fd eine attraktive Möglichkeit zur Insertion von fremden, biologisch aktiven Sequenzen ist. Es gibt jedoch auch andere ausssichtsreiche Sequenzen, einschließlich z. B. das Gen VIII und das Gen VI.
- Das Protein selbst ist nur ein Nebenbestandteil der Phagenhülle und die Unterbrechung des Gens führt nicht zum Zelltod (Smith, G. 1988 Virology 167: 156-165). Weiters ist es möglich, einige Fremdsequenzen (mit keiner biologischen Funktion) an verschiedenen Positionen innerhalb dieses Gens zu insertieren (Smith, G. 1985 Science 228: 1315- 1317., Parmley, S. F. and Smith, G. P. Gene 73 (1988) S. 305-318). und de 1a Cruz, V. F., et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 4318-4322). Smith et al., beschrieben die Präsentation von Peptiden an der äußeren Oberfläche des Phagen, aber die Präsentation von Proteindomänen wurde von ihnen nicht beschrieben. Peptide können einen Bereich von Strukturen annehmen, die sich unterscheiden können, wenn sie sich frei in Lösung befinden gegenüber dem Fall, wenn sie an z. B. einen Antikörper gebunden sind oder wenn sie einen Teil eines Proteins bilden (Stanfield, R.I. et al., (1990), Science 248, 5.712-719). Proteine haben im allgemeinen eine wohl definierte Tertiärstruktur und erfüllen ihre biologische Funktion nur, wenn sie diese Struktur annehmen. Beispielsweise wurde die Struktur des Antikörpers D1.3 in freier Form und in an Antigen gebundener Form aufgeklärt (Bhat, T. N. et al., (1990) Nature 347, S. 483-485). Die Grundstruktur des Proteins ist in jedem Fall mit nur geringfügigen Variationen rund um die Bindungsstelle für das Antigen identisch. Andere Proteine zeigen bei der Bindung eines Liganden deutlichere Konformationsänderungen, beispielsweise die Enzyme Hexokinase und Pyruvat-Dehydrogenase während ihrem katalytischen Zyklus, aber sie behalten ihr Gesamtfaltmuster bei. Diese strukturelle Integrität weisen ganze Proteine nicht auf, aber sie wird von Proteindomänen gezeigt. Dies führt zum Konzept einer gefalteten Einheit, die Teil eines Proteins ist, oft eine Domäne, die eine wohl definierte Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur aufweist und die dasselbe Gesamtfaltmuster aufweist, ob sie sich an einen Bindepartner bindet oder nicht. Die einzige Gensequenz, die Smith et al., beschrieben und die eine ausreichende Größe aufweist, um für eine Domäne zu kodieren (ein Minimum von etwa 50 Aminosäuren), war ein 335 bp-Fragment einer β-Galactosidase, die den Nucleotiden 861-1195 in der β-Glaktosidasegensequenz entspricht (Parmley, S. + Smith, G. P. 188, s.o.). Diese würde für 112 Aminosäuren der viel größeren, 380 Aminosäuren aufweisenden Domäne kodieren. Daher wurde vor der vorliegenden Anmeldung keine im wesentlichen vollständige Domäne oder gefaltete Einheit auf Phagen präsentiert. In diesen Fällen konnten, obwohl die Infektiosität des Phagen zerstört war, die insertierten Sequenzen auf der Phagenoberfläche durch die Verwendung von z. B. Antikörpern detektiert werden.
- Das durch das Gen III kodierte Protein weist mehrere Domänen auf (Pratt, D., et al., 1969 Virology 39: 42-53; Grant, R. A. et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 539-546 und Armstrong, J., et al., FEBS Lett. 135: 167-172, (1981)) einschließlich: (i) einer Signalsequenz, die das Protein zur Zellmembran lenkt und die dann abgespalten wird; (ii) einer Domäne, die das reife Protein in der bakteriellen Zellmembran (und ebenso in der Phagenhülle) verankert; und (iii) einer Domäne, die sich spezifisch an den Phagenrezeptor, den F-Pilus des Wirtsbakteriums, bindet. Kurze Sequenzen, die von Proteinmolekülen stammen, wurden an zwei Stellen innerhalb des reifen Moleküls insertiert (Smith, G., 1985, s.o., und Parmley, S. F. and Smith, G. P., 1988, s.o.), nämlich in die Region zwischen den Domänen und auch zwischen die Aminosäuren 2 und 3 am N-Terminus. Bei den Insertionsstellen am N-Terminus zeigte sich erfolgreich, daß die strukturelle Integrität des Gen III-Proteins aufrechterhalten werden konnte und daß die Peptide an der Oberfläche des Phagen präsentiert wurden. Durch die Verwendung von für die Peptide spezifischen Antisera wurde gezeigt, daß sich die Peptide, die an dieser Stelle insertiert wurden, auf der Oberfläche des Phagen befinden. Diese Autoren konnten auch, unter Verwendung dieser Eigenschaft, den Phagen reinigen. Die vom Phagen exprimierten Peptide wiesen jedoch keine eigenen, meßbaren biologischen Funktionen auf.
- Es ist schwierig, die biologische Funktion eines Moleküls, das in einem gegenüber seinem natürlichen Zustand völlig anderen Zusammenhang exprimiert wird, beizubehalten. Die Anforderungen an die Struktur des Moleküls sind hoch. Im Gegensatz dazu ist die Beibehaltung der Fähigkeit, von spezifischen Antisera gebunden zu werden, ein passiver Vorgang, der wesentlich weniger strenge Anforderungen an die Struktur das Moleküls stellt. Beispielsweise ist es die Regel und nicht die Ausnahme, daß polyklonale Antisera völlig denaturierte und biologisch inaktive Proteine in Western Blots erkennen (siehe z. B. Harlow, E. and Lane, D., Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1988). Daher zeigt die Insertion von Peptiden in eine Region, die ihrer Struktur ermöglicht, von Antisera mittels einer Sonde erkannt zu werden, nur, daß die Region es den Peptiden gestattet, dargestellt zu werden, aber sie zeigt nicht, daß die Region für die Insertion darzustellender großer Sequenzen, wobei strukturelle Zwänge für die Präsentation eines Moleküls mit einer biologischen oder Bindefunktion erforderlich sind, geeignet ist. Insbesondere zeigt sie nicht, daß Domänen oder gefaltete Einheiten von Proteinen von in diese Region insertierten Sequenzen präsentiert werden können.
- Diese Erfahrung mit Western Blots ist eine anschauliche praktische Demonstration, die zeigt, daß das Beibehalten der Fähigkeit, durch spezifische Antisera gebunden zu werden, wesentlich weniger strenge Anforderungen an die Struktur eines Polypeptids stellt, als dies das Falten zur Beibehaltung der biologischen Aktivität tut.
- Es wurden Studien durchgeführt, in denen E.coli manipuliert wurde, um das β-adrenergische Rezeptor-Protein als Fusion mit dem äußeren Membranprotein IamB zu exprimieren. Der β-adrenergische Rezeptor wurde in einer funktionellen Form exprimiert, was durch das Vorhandensein von Bindeaktivität bestimmt wurde. Wenn jedoch eine äquivalente Antikörperfusion mit IamB gemacht wurde, war die Antikörperfusion für die Wirtszelle toxisch.
- Die Anmelder haben die Möglichkeit untersucht, die Genkodiersequenz für biologisch aktive Antikörperfragmente in die Gen III-Region von fd zu insertieren, um ein großes Fusionsprotein zu exprimieren. Wie aus der vorhergehenden Diskussion offensichtlich ist, stellt dieser Ansatz große Anforderungen an die Funktionellität des Fusionsproteins. Die Insertion ist groß und kodiert für Antikörperfragmente von zumindest 100-200 Aminosäuren; die vom Antikörper stammende Domäne muß sich effizient und korrekt falten, um Antigenbindung zu zeigen; und die meisten Funktionen des Gen III müssen beibehalten werden. Der Ansatz der Anmelder zur Konstruktion des Fusionsmoleküls wurde so gestaltet, daß das Risiko, diese Funktionen zu unterbrechen, minimiert wurde. In einer Ausführungsform der Erfindung war der verwendete Anfangsvektor fd-tet (Zacher, A. N., et al., 1980, Gene, 9, 127-140) eine gegenüber Tetracyclin resistente Version des fd-Bakteriophagen, die als dem infizierten E.coli-Wirt Tetracyclinresistenz verleihendes Plasmid vermehrt werden kann. Die Anmelder entschlossen sich aus mehreren Gründen, nach der Signalsequenz des fd-Gen III zu insertieren. Insbesondere entschlossen sie sich, nach der Aminosäure 1 des reifen Proteins zu insertieren, um die Umgebung für die Signalpeptidasespaltung beizubehalten. Um die Struktur und Funktion des Gen III selbst beizubehalten, wird der Großteil der ursprünglichen Aminosäuresequenz nach den insertierten Immunglobulinsequenzen synthetisiert. Die insertierten Immunglobulinsequenzen wurden so gestaltet, daß sie Reste aus der Schaltregion ("switch region"), die VH-VL mit CH1-CL verbindet, umfassen (Lesk, A., and Chothia, C., Nature 335, 188-190, 1988).
- Überraschenderweise konnten die Anmelder bei der Manipulation des Gen III des Bakteriophagen fd einen Bakteriophagen konstruieren, der an seiner Oberfläche große biologisch funktionelle Antikörper-, Enzym- und Rezeptormoleküle präsentiert, wobei er intakt und infektiös bleibt. Weiters können die Phagen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität aufweisen, aus einem Hintergrund von Phagen, die diese Spezifität nicht zeigen, ausgewählt werden.
- Die Sequenzen, die für eine Population von Antikörpermolekülen und für die Insertion in den Vektor zur Expression von Antikörperbindefunktionen auf der Phagenoberfläche kodieren, können aus einer Vielzahl an Quellen gewonnen werden. Beispielsweise aus immunisierten und nicht immunisierten Nagetieren oder Menschen, oder aus Organen wie z. B. Milz oder peripheren Blutlymphozyten. Die Kodiersequenzen können aus diesen Quellen mittels dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden (Orlandi, R., et al., 1989, s.o.; Larrick,).W., et al., 1989, s.o.; Chiang, Y. L., et al., 1989, Bio Techniques 7, S. 360-366; Ward, E. S., et al., 1989, s.o.; Sastry, L., et al., 1989, s.o.) oder durch in den Beispielen 12, 16, 30 und 32 beschriebene neue Verbindungsstrategien. In den Beispielen 7, 21, 26 und 30 werden neue Strategien zum Präsentieren dimerer Moleküle, z. B. Fab- und Fv-Frgmente auf der Oberfläche eines Phagen beschrieben. Jeder einzelne pAb in der resultierenden Bibliothek von pAbs exprimiert Antikörper oder von Antikörper abstammende Fragmente, die bezüglich ihrer Antigenbindeeigenschaften monoklonal sind.
- Die vorliegende Offenbarung der Anmelder ist wichtig und stellt einen bemerkenswerten Durchbruch in der Technologie, die mit der Herstellung von biologischen Bindemolekülen, ihren Fragmenten und Derivaten durch die Verwendung von rekombinanten Verfahren verbunden ist, dar.
- In rekombinanten Standardverfahren zur Herstellung von Antikörpern wird ein Expressionsvektor, der die für die Antikörperketten kodierenden Sequenzen enthält, zur Transformation von E.coli verwendet. Die Antikörperpolypeptide werden exprimiert und durch die Verwendung von Standardscreeningsystemen detektiert. Wenn beim Screenen ein Antikörperpolypeptid detektiert wird, muß man zu dem speziellen, transformierten E.coli, der das gewünschte Antikörperpolypeptid exprimiert, zurückkehren. Weiters muß dann der Vektor, der die Kodiersequenz für das gewünschte Antikörperpolypeptid enthält, aus E.coli isoliert werden, damit er in weiteren Verarbeitungsschritten verwendet werden kann.
- In der vorliegenden Erfindung jedoch ist das gewünschte Antikörperpolypeptid, wenn es exprimiert wird, bereits mit seiner Genkodiersequenz zusammengepackt. Dies bedeutet, daß, wenn ein Antikörperpolypeptid mit der gewünschten Spezifität ausgewählt wird, man nicht zur ursprünglichen Kultur zur Isolierung dieser Sequenz zurückkehren muß. Weiters mußte bei bisherigen Verfahren in Standardrekombinationstechniken jeder Klon, der Antikörper exprimiert, einzeln gescreent werden. Die vorliegende Anmeldung ermöglicht die Selektion von Klonen, die Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften exprimieren, und erfordert dazu nur das Screenen von Klonen aus einem angereicherten Pool.
- Da das sekretierte Bakteriophagentelichen ein Element eines spezifischen Bindepaares an der Oberfläche einer relativ einfachen replizierbaren Struktur präsentiert, die auch die für diesen Bestandteil kodierende genetische Information enthält, können Teilchen, die sich an den komplementären Bestandteil des spezifischen Bindepaares (Antigen) binden, sehr effizient entweder durch die Elution des komplementären Bestandteils mittels z. B. Diethylamin, hoher Salzkonzentration, usw. und das Infizieren geeigneter Bakterien oder durch das Denaturieren der Struktur und das spezifische Amplifizieren der für diesen Bestandteil kodierenden Sequenzen mittels PCR gewonnen werden. D. h. es ist nicht notwendig, zum ursprünglichen bakteriellen Klon, aus dem der pAb entstand, zurückzukehren.
- Für einige Zwecke, z. B. Immunfällung und einige diagnostische Tests, ist es vorteilhaft, polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente zu verwenden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht dies entweder durch die Selektion eines angereicherten Pools von pAbs mit den gewünschten Eigenschaften oder durch das Mischen von einzeln isolierten Kloren mit den gewünschten Eigenschaften. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können dann, falls erforderlich, in löslicher Form exprimiert werden. Solch eine ausgewählte polyklonale pAb-Population kann aus Phagenstämmen, Phagemid enthaltenden Bakterien oder Bakterien, die die aus der ausgewählten polyklonalen Population stammenden löslichen Fragmente exprimieren, gezüchtet werden. Somit wird ein zu einem polyklonalen Antiserum äquivalentes Reagens gebildet, das repliziert werden kann und routinemäßig ohne die Verwendung von Tieren in Kultur hergestellt werden kann.
- Einzelne filamentöse Bakteriophagenteilchen, die die gewünschte Spezifität, z. B. für ein Antigen, exprimieren, können unter Verwendung von herkömmlichen Screeningverfahren aus der komplexen Bibliothek isoliert werden (z. B. laut der Beschreibung in Harlow, E., and Lane, D., 1988, s.o.; Gherardi, E. et al., 1990. J. Immunol. Meth. 126, S. 61-68).
- Die Anmelder haben auch eine Reihe von neuen Selektionsverfahren entwickelt, die nur aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der filamentösen Bakteriophagenteilchen praktikabel sind. Die allgemeinen Grundzüge einiger Screenigvorschriften sind in Fig. 2 dargestellt.
- Die Population/Bibliothek von zu screenenden pAbs kann aus immunisierten oder anderen Tieren gebildet werden; oder kann in vitro durch Mutagenisieren bereits existierender Phagenantikörper (unter Anwendung bekannter Techniken, wie z. B. Oligonucleotidgerichteter Mutagenese (Sambrook, J., et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press)) erzeugt werden. Diese Population kann in einem oder mehreren der weiter unten mit Hinweis auf Fig. 2 beschriebenen Formate gescreent werden, um jene einzelnen pAbs zu erhalten, deren Antigenbindeeigenschaften sich von Probe c unterscheiden.
- Fig. 2(i) zeigt Antigen (ag), das an ein feste Oberfläche (s) gebunden ist, wobei diese feste Oberfläche (s) von einer Petrischale, von Chromatographieperlen, magnetischen Perlen und dergleichen bereitgestellt werden kann. Die Population/Bibliothek von pAbs wird dann über das ag geschickt, und jene einzelnen p, die sich daran binden, werden nach dem Waschen zurückgehalten, und gegebenenfalls mit dem Detektionssystem d nachgewiesen. Ein auf Anti-fd-Antisera basierendes Detektionssystem wird weiter unten in Beispiel 4 detaillierter dargestellt. Wenn Proben der gebundenen Population p unter ansteigend rauheren Bedingungen entfernt werden, steigt die in jeder Probe vorhandene Bindeaffinität an. Verschärfte Bedingungen können z. B. durch Erhöhen der Weichzeit, oder Ändern des pH-Werts der Weichlösung, etc. erhalten werden.
- Bezugnehmend auf Fig. 2(ii) kann Antigen ag an einen festen Träger s gebunden werden und bis zur Sättigung durch das ursprüngliche Bindemolekül c gebunden werden. Wenn eine Population eines mutanten pAb (oder ein Satz nicht verwandter pAbs) dem Komplex angeboten wird, werden sich nur jene binden, die eine höhere Affinität für das Antigen ag aufweisen als c. In den meisten Beispielen wird nur ein geringer Teil der Population c durch Individuen aus der Population p verdrängt. Wenn c ein herkömmliches Antikörpermolekül ist, kann das gesamte gebundene Material gewonnen werden und das gebundene p kann durch das Infizieren von geeigneten Bakterien und/oder durch die Anwendung von Standardverfahren wie z. B. PCR gewonnen werden.
- Es ist eine vorteilhafte Anwendung, wenn ag ein Antikörper ist und c sein Antigen. Die gewonnene gebundene Population p ist dann ein anti-idiotypischer Antikörper, wobei diese zahlreiche Verwendungen in der Forschung und der pharmazeutischen und diagnostischen Industrie finden.
- Derzeit ist es schwierig, direkt anti-idiotypische Antikörper auszuwählen. pAbs gäben die Möglichkeit, dies direkt durch das Binden von pAb-Bibliotheken (z. B. eine native Bibliothek) an B-Zellen (die Antikörper an ihrer Oberfläche exprimieren) und das Isolieren der gut gebundenen Phagen zu tun.
- In einigen Fällen kann es sich als vorteilhaft erweisen, die Population p vorzuselektieren. Beispielsweise in dem Anti-Idiotyp-Beispiel oben kann p an einen verwandten Antikörper adsorbiert werden, der das Antigen nicht bindet.
- Wenn c jedoch ein pAb ist, dann können jeweils eines oder beide von c und p vorteilhafterweise auf einige Arten markiert werden, um gebundenes p gegenüber gebundenem c sowohl zu unterscheiden wie auch auszuwählen. Dieses Markieren kann physikalisch erfolgen z. B. durch das Vormarkieren von p mit Biotin; oder noch vorteilhafter genetisch. Beispielsweise kann c mit einer EcoB-Restriktionsstelle markiert sein, während p mit einer EcoK-Restriktionsstelle markiert sein kann (siehe Carter, P. et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13, 4431-4443). Wenn die gebundenen p+c vom Antigen eluiert werden und zur Infektion von geeigneten Bakterien verwendet werden, gibt es eine Restriktion (und damit kein Wachstum) der Population c (d. h. Bakterien, die EcoB- Restriktion aufweisen in diesem Beispiel). Alle gewachsenen Phagen wären stark mit jenen Individuen von p mit höheren Bindeaffinitäten angereichert. Alternativ dazu kann die genetische Markierung durch das Markieren mit neuen Sequenzen, die verwendet werden können, um unter Verwendung von PCR spezifisch p aus einem Gemisch zu amplifizieren, erreicht werden.
- Da die gebundenen pAbs unter Verwendung von z. B. PCR oder bakterieller Infektion amplifiziert werden können, ist es auch dann möglich, die gewünschte Spezifität zu erzielen, wenn nicht ausreichende Individuen gebunden sind, um die Detektion über herkömmliche Verfahren zu ermöglichen.
- Das bevorzugte Verfahren zur Selektion eines Phagen, der ein Proteinmolekül mit der gewünschten Spezifität oder Affinität präsentiert, ist oft die Elution von einer Affinitätsmatrix mit einem Liganden (siehe z. B. Beispiel 17). Die Elution mit ansteigenden Ligandenkonzentrationen sollte Phagen, die Bindemoleküle mit ansteigender Affinität präsentieren, eluieren. Wenn sich jedoch z. B. ein pAb an sein Antigen mit hoher Affinität oder Avidität bindet (oder ein anderes Protein an seinen Bindungspartner), kann es sein, daß es nicht möglich ist, den pAb aus der Affinitätsmatrix mit einem dem Antigen verwandten Molekül zu eluieren. Alternativ dazu kann es sein, daß es kein geeignetes eluierendes Molekül gibt, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das nicht für z. B. den Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist. Einige der allgemein verwendeten, nicht spezifischen Elutionsverfahren verringern die Lebensfähigkeit des Phagen, beispielsweise nimmt die Phagenlebensfähigkeit bei pH 12 mit der Zeit ab (Rossomando, E. F. und Zinder N. D. J. Mol. Biol. 36, 387-399). Es kann Wechselwirkungen zwischen z. B. Antikörper und Affinitätsmatrizen geben, die nicht unterbrochen werden können, ohne die Phageninfektiosität vollständig zu entfernen. In diesen Fällen ist ein Verfahren zur Elution des Phagen notwendig, das sich nicht der Zerstörung der z. B. Antikörper-Antigen- Wechselwirkung bedient. Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, das die Elution gebundener pAbs unter schonenden Bedingungen (Reduktion einer Dithiol-Gruppe mit Dithiothreitol), die die Phagenstruktur nicht zerstören, ermöglicht (Beispiel 37).
- Dieses Elutionsverfahren ist nur ein Beispiel eines Elutionsverfahrens unter schonenden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren wäre es, eine Nucleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, welche eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hochspezifische Protease bilden, zwischen dem fremden, insertierten Gen, in diesem Fall ein Gen für ein Antikörperfragment, und dem Rest des Gen III einzubringen. Beispiele solch hochspezifischer Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach dem Binden des Phagen an die Affinitätsmatrix und der Elution, um nichtspezifisch bindende Phagen zu entfernen, würde der bzw. die stark gebundene(n) Phage(n) durch das Waschen der Säule mit Protease unter Bedingungen, die die für die Spaltung an der Spaltungsstelle geeignet sind, entfernt werden. Dies würde das Antikörperfragment vom Phagenpartikel abspalten und den Phagen eluieren. Es ist zu erwarten, daß dieser Phage infektiös ist, da die einzige Proteasestelle die spezifisch eingebrachte sein sollte. Der stark bindende Phage könnte dann durch das Infizieren von z. B. E.coli TG1-Zellen wiedergewonnen werden.
- Ein zum obigen alternatives Verfahren ist es, die Affinitätsmatrix, die die stark gebundenen pAbs zurückgehalten hat, zu nehmen und die DNA z. B. durch Kochen in SDS-Lösung zu extrahieren. Die extrahierte DNA kann dann dazu verwendet werden, direkt E. coll-Wirtazellen zu transformieren, oder alternativ dazu können die für den Antikörper kodierenden Sequenzen amplifiziert werden, beispielsweise mittels PCR mit geeigneten Primern, wie z. B. jene die hierin geoffenbart sind, und dann zur Expression als löslicher Antikörper für weitere Untersuchungen oder als pAb für weitere Selektionsrunden in einen Vektor insertiert werden.
- Ein weiteres bevorzugtes Selektionsverfahren nach der Affinität wäre die Bindung an eine Affinitätsmatrix, die geringe Mengen an Liganden enthält.
- Wenn man aus einer Proteinmoleküle präsentierenden Phagenpopulation nach hoher Affinität für den Liganden auswählen will, ist es eine bevorzugte Strategie, eine Phagenpopulation an eine Affinitätsmatrix, die geringe Mengen an Liganden enthält, zu binden. Es gibt um die Bindung des Liganden Konkurrenz zwischen Phagen, die Proteine mit hoher und mit niedriger Affinität präsentieren. Phagen, die Protein mit hoher Affinität präsentieren, werden vorzugsweise gebunden und Protein mit niedriger Affinität wird ausgewaschen. Das Protein mit hoher Affinität wird dann durch Elution mit dem Liganden oder durch andere Verfahren, die den Phagen von der Affinitätsmatrix eluieren (Beispiel 25 zeigt dieses Verfahren), gewonnen.
- Zusammenfassend kann zur Wiedergewinnung der gepackten DNA aus dem Affinitätsschritt die Packung einfach eluiert werden, sie kann in Vorhandenseins eines homologen sbp-Bestandteils, der mit dieser Packung um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert, eluiert werden; diese könnte durch Kochen entfernt werden, sie könnte durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden; und andere Verfahren, z. B. das Zerstören der Bindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Bestandteil, um die gepackte DNA und den sbp-Bestandteil freizusetzen, sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich. Jedenfalls ist es das Ziel, die DNA aus der Packung zu erhalten, sodaß diese direkt oder indirekt verwendet werden kann, um den dadurch kodierten sbp-Bestandteil zu exprimieren.
- Die Effizienz dieses Selektionsverfahrens für pAbs und die Möglichkeit, große Bibliotheken herzustellen, bedeutet, daß die Immunisierungsverfahren, die entwickelt wurden, um den Anteil der gescreenten Zellen, die den Antikörper von Interesse produzieren, erhöht wird, keine absolute Notwendigkeit sind. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Isolation von Bindespezifitäten, z. B. Antigen-Bindespezifitäten, einschließlich jenen, die durch herkömmliche Verfahren schwierig oder sogar nicht zu erhalten wären, z. B. katalytische oder anti-idiotypische Antikörper. Der Verzicht auf das Tier ist im gesamten nun möglich, wenn einmal eine vollständige Bibliothek des Immunrepertoires konstruiert wurde.
- Die neuartige Struktur des pAb-Moleküls kann in einer Anzahl von anderen Anwendungen verwendet werden, wobei einige Beispiele davon die folgenden sind:
- pAbs vereinen, indem sie selbst als eine neuartige molekulare Einheit funktionieren, die Fähigkeit, sich an ein spezifisches Molekül, z. B. ein Antigen, zu binden, mit der Amplifikation, wenn das Haupthüllenprotein verwendet wird, um eine andere Gruppe daran zu binden. Diese Gruppe kann durch immunologische, chemische und beliebige andere Mittel befestigt werden, und dann z. B. verwendet werden, um den Komplex zur Verwendung in vitro oder in vivo mit Detektionsreagentien oder zytotoxischen Molekülen zu markieren.
- Die Größe der pAbs kann als Marker verwendet werden, insbesondere hinsichtlich physikalischer Detektionsverfahren wie z. B. Elektronenmikroskopie und/oder einige Biosensoren, z. B. Oberflächenplasmonresonanz.
- Die pAbs haben auch vorteilhafte Verwendungen in Diagnoseassays, insbesondere wo eine Trennung aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften bewirkt werden kann, z. B. Zentrifugation, Filtration etc.
- Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nun Ausführungsformen mit Hinweis auf die weiter unten beschriebenen Figuren genauer beschrieben, wobei diese Beispiele der Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken. Die Präsentation der Fab-Fragmente ist nicht Teil der Erfindung. Die Erwähnung solcher Fragmente in diesem Dokument dient nur dem Zweck der Veranschaulichung.
- Bei allen Ausführungsformen der Erfindung werden filamentöse Bakteriophagen-Teilchen eingesetzt, die ein Phagemidgenom enthalten. Die Präsentation an der Oberfläche von Teilchen, die ein Phagengenom enthalten, ist nicht Teil der Erfindung, und dessen Erwähnung im vorliegenden Dokument, einschließlich der Versuchsbeispiele, dient der Veranschaulichung.
- Fig. 1 zeigt die Grundstruktur des einfachsten Antikörpermoleküls IgG.
- Fig. 2 zeigt schematisch die Selektionsverfahren, die die einzigartigen Eigenschaften der pAbs einsetzen; 2i) zeigt ein Binde /Elutionssystem; und (2ii) zeigt ein Konkurrenzsystem (p = pAb; ag = Antigen, an das sich pAb binden soll; c = Konkurrenzpopulation z. B. Antikörper, pAb, Ligand; s = Substrat (z. B. Kunststoffperlen etc.); d = Detektionssystem.
- Fig. 3 zeigt den Vektor fd-tet und ein Schema zur Konstruktion von Vektoren, fdTPs/Bs (zur Insertion von VH-Kodiersequenzen) und fdTPs/Xh zur Insertion von scFv-Kodiersequenzen.
- Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenzen für die Oligonucleotide und Vektoren. Alle Sequenzen sind von 5' nach 3' aufgezeichnet und gemäß Beck et al., 1978, Nucl. Acid. Res. 5: 4495-4503 numeriert. 4.1 zeigt die zur Mutagenese (oligo's 1 und 2) und zum Sequenzieren (oligo 3) verwendeten Sequenzen. Die präsentierten Sequenzen wurden auf einem Oligonucleotidsynthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert und sind zur einsträngigen Form von fd-tet komplementär (sie sind bezüglich Gen III in der Antisense-Form). 4.2 zeigt die Sequenzen der verschiedenen Konstrukte rund um die Gen III-Insertionsstelle. Diese Sequenzen sind in Sense-Richtung bezüglich Gen III aufgezeichnet; (A) fd-tet (und fdTBBst) (B) fdTPs/Bs und (C) fdTPs/Xh. Die Schlüsselrestriktionsstellen sind gemeinsam mit den durch die Vektoren beigetragenen Immunglobulinaminosäuren gezeigt, (der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren wird verwendet, siehe Harlow, E. und Lane, D. 1988, s.o.).
- Fig. 5 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für scFv im Vektor scFvD1.3 myc. Dies ergibt die Sequenz des aus Einzelketten bestehenden Anti-Lysozym-Fv und die umgebenden Sequenzen in scFvD1.3 myc, wobei die N-terminale pel b-Signalpeptidsequenz und die C-terminale myc tag-Sequenz gezeigt wird (Ward, E. S., et al., 1989, s.o.). Es ist auch die Peptidsequenz gezeigt, die die VH- und VL-Regionen verbindet. Die Aminosäuresequenz ist über der Nucleotidsequenz mit dem Ein-Buchstaben-Code dargestellt, siehe Harlow, E. und Lane, D. 1988, s.o.).
- Fig. 6 zeigt die Bindung von pAbs an Lysozym und die Wirkung der Variation der Menge des Überstandes. Jeder Punkt ist der Mittelwert einer Doppelprobe. Lysozym wurde mit 1 mg/ml in 50 mm NaHCO&sub3; beschichtet.
- Fig. 7 zeigt die Wirkung der Variation der Beschichtungskonzentration von Lysozym oder Rinderserumalbumin (BSA) auf die Bindung von pAbs an Lysozym in graphischer Form. Jeder Punkt ist der Mittelwert einer Doppelprobe.
- Fig. 8 zeigt die Sequenz rund um die Klonierstelle in Gen III von fd-CAT2. Restriktionsenzymstellen werden dargestellt sowie die Aminosäuren, die durch von Antikörper stammende Sequenzen kodiert werden. Diese werden am 5'-Ende vom Gen III-Signalpeptid und am 3'-Ende von 3 Alaninresten (durch die NotI-Restriktionsstelle kodiert) und vom Rest des reifen Gen III-Protein flankiert. Der Pfeil zeigt die Spaltungsstelle zum Abschneiden des Signalpeptids.
- Fig. 9 zeigt die Bindung von pAb (1.3) an Lysozyme. Bindung von Phagen, wie mittels ELISA detektiert wurde, an (a) Hühnereiweißlysozym (HEL), (b) Puteneiweißlysozym (TEL), (c) menschliches Lysozym (HUL), (d) Rinderserumalbumin (BSA). Ein weiterer Vergleich von (e) fdTPs/Bs an HEL.
- Fig. 10 zeigt eine Karte von FabD1.3 in pUC19.
- Fig. 11 zeigt die ELISA-Ergebnisse, die einen Vergleich der Lysozymbindung durch Phagen-Fab und Phagen scFv bieten. Vektor = fdCAT2 (Beispiel 5); fdscFv (OX) = pAbNQ- 11 (Beispiel 9); fdVHCH1 (D1.3) = Wachstum in normalen Zellen (d. h. keine L-Kette, siehe Beispiel 7); fdFab(D1.3) d. h. fdVHCH1 (D1.3), gezüchtet in Zellen, die die D1.3 L-Kette enthalten; fdscFv (D1.3) = pAbD1.3.
- Fig. 12 zeigt die Oligonucleotidsondierung von mittels Affinität gereinigten Phagen. 10¹² Phagen in Verhältnis von 1 pAb (D1.3) in 4 · 10&sup4; fdTPs/Bs wurden mittels Affinität gereinigt und mit einem Oligonucleotid sondiert, das spezifisch für pAb (D1.3) ist. A ist ein Filter nach einer Affinitätsreinigungsrunde (900 Kolonien gesamt) und B ist ein Filter nach zwei Runden (372 Kolonien gesamt).
- Fig. 13 zeigt die Sequenz des Anti-Oxazolon-Antikörperfragments NQ11 scFv. Die vom Linker beigesteuerte Sequenz ist in Kleinbuchstaben gezeigt. Die Sequenz für VH ist vor der Linkersequenz und die Sequenz für VL ist nach dem Linker.
- Fig. 14 zeigt die ELISA-Ergebnisse für die Bindung von pAb NQ11 und pAb D1.3 und Vektor fdTPs/Xh an die angegebenen Antigene.
- Fig. 15 zeigt die Sequenz rund um die phoA-Insertion in fd-phoAla166. Die zur Klonierung verwendeten Restriktionsstellen sind gezeigt, sowie die durch phoA kodierten Aminosäuren rund um die Insertionsstellen. Die ersten fünf Aminosäuren der reifen Fusion kommen aus dem Gen III.
- Fig. 16(1) zeigt die Struktur von Gen III und die native BamHI-Stelle, in die eine scFv- Kodierseduenz in Beispiel 11 insertiert wurde und Fig. 16(2) zeigt die natürlichen Peptidlinkerstellen A und B zur möglichen Insertion von scFv-Kodiersequenzen.
- Fig. 17 zeigt schematisch die Arbeitsvorschrift für die PCR-Assemblierung von Mäuse- VH- und VLK-Repertoires zur in Beispiel 12 beschriebenen Phagenpräsentation.
- Fig. 18 zeigt Beispiele der mit der Vorschrift in Beispiel 12 erhaltenen Endprodukte. Die Spuren a und b zeigen die Produkte der Beginn-PCR unter Verwendung von Primern der schweren bzw. leichten Kette; Spur C zeigt das vollständig assemblierte 700 bp-Produkt vor der Endspaltung mit Not1 und ApaL1; M1, M2 Marker Φ174 Hae-Spaltung bzw. 123 bp-Leiter ("ladder") (BRL Limited, P. O. Box 35, Washington Road, Paisley, Scotland).
- Fig. 19 zeigt die Ergebnisse eines ELISA der Lysozymbindung durch pCAT-3 scFv D1.3- Phagemid im Vergleich zum pCAT-3-Vektor (beide durch M13K07 wiederhergestellt) und zu fdCAT2 scFv D1.3 wie in Beispiel 13 beschrieben. Der ELISA wurde wie in Beispiel 6 beschrieben mit Modifikationen, die in Beispiel 14 detailliert erklärt sind, durchgeführt.
- Fig. 20 zeigt das Spaltmuster, das zu sehen ist, wenn einzelne Klone, die statistisch aus einer Bibliothek von Einzelketten-Fv-Antikörpergenen, die aus einer immunisierten Maus stammen, ausgewählt wurden, mit BstN1 gespalten werden.
- Fig. 21 zeigt VH- und VK-Gensequenzen, die aus der kombinatorischen Bibliothek in Beispiel 17 und der hierarchischen Bibliothek in Beispiel 18 stammen.
- Fig. 22 zeigt eine Matrix von ELISA-Signalen für Klone, die aus einer statistischen kombinatorischen Bibliothek stammen. Die Bezeichnung der Klone ist wie in Fig. 21. Die Anzahl der mit jeder Kombination gefundenen Klone ist durch die Zahlen angegeben.
- Fig. 23 zeigt a) das Phagemid pHENI, ein Derivat von pUC119, der in Beispiel 20 beschrieben ist; und b) die Klonierstellen im Phagemid pHEN.
- Fig. 24. Die Antikörperkonstrukte, die zur Präsentation auf der Oberfläche des Phagen in fd-CAT2 und pHEN1 kloniert wurden. Die Konstrukte I, II, III und IV wurden sowohl in fd-CAT2 (als ApaLI-NotI-Fragmente) als auch in PHEN1 (als SfiI-NotI-Fragmente) und in PHEN1 (als Sfil-NotI-Fragmente). Alle Konstrukte enthielten die variablen Regionen der schweren Kette (VH) und der leichten Kette (VL) des aus Mäusen stammenden AntiphOx-Antikörpers NQ10.12.5. Die konstanten Domänen waren menschliches CK und CH1 (γ 1-Isotyp).
- Fig. 25. Drei Arten der Präsentation von Antikörperfragmenten auf der Phagenoberfläche durch Fusion mit dem Gen III-Protein.
- Fig. 26. Western-Blot des Überstands, der aus pHEN1-II(+)- oder pHEN1(-)-Kulturen von E.coli HB2151 entnommen wurde, wobei dieser die Sekretion nur von PHEN1-II zeigt. Der anti-menschliche Fab detektiert sowohl H- als auch L-Ketten. Aufgrund der Befestigung von c-myc tag, ist die L-Kette, die sowohl durch anti-c-myc tag- als auch durch anti-menschliche CK-Antisera markiert bzw. hervorgehoben ist, etwas größer (berechnetes Mr 24625) als die H-Kette (berechnetes Mr 23145).
- Fig. 27 ist ein Graph, der die Wirkung der Lysozymverdünnung auf das Verhältnis der ELISA-Signale, die unter Einsatz von pAbD1.3 oder löslichem scFv D1.3 erhalten wurden, zeigt.
- Fig. 28 ist ein Graph, der die Wirkung der Lysozymverdünnung auf die ELISA-Signale, die unter Einsatz von fdTscFvD1.3 oder löslichem scFv D1.3 erhalten wurden, zeigt.
- Fig. 29 ist ein Graph, der positive Ergebnisse aus einem ELISA-Screen von Phagen, die scFv-Fragmente präsentieren, die aus der Zelllinie 013 stammen, welche einen gegen Östriol gerichteten Antikörper exprimiert, zeigt.
- Fig. 30 ist ein Graph, der positive Ergebnisse aus einem ELISA-Screen von Phagen, die scFv-Fragmente präsentieren, die aus der Zelllinie 014 stammen, welche einen gegen Östriol gerichteten Antikörper exprimiert, zeigt.
- Fig. 31. Elektrophorese von Proben aus Stufen einer Fab-Assemblierung. Proben von unterschiedlichen Stufen im PCR-Fab-Assemblierungsverfahren, wie in Beispiel 26 beschrieben, wurden Elektrophorese auf einem 1%igen TAE-Agarosegel unterzogen. Proben von einem vergleichbaren scFv-Assemblierungsverfahren (wie in Beispiel 14) werden zum Vergleich gezeigt. Die Proben von links nach rechts sind:
- M = Marker
- VHCHI = durch PCR amplifizierte Sequenzen, die für VHCH1-Domänen kodieren
- VKCK = durch PCR amplifizierte Sequenzen, die für VKCK-Domänen kodieren
- -L = Fab-Assemblierungsreaktion, in Abwesenheit von Linker durchgeführt
- +L = Produkt der Fab-PCR-Assemblierungsreaktion VHCHI plus VKCK plus Linker
- M = Marker
- VK = durch PCR amplifizierte Sequenzen, die für VK-Domänen kodieren
- VL = durch PCR amplifizierte Sequenzen, die für VH-Domänen kodieren
- -L = scFv-Assemblierungsreaktion in Abwesenheit von Linker
- +L = scFv-Assemblierungsreaktion in Gegenwart von Linker
- M = Marker
- Fig. 32. Vergleich der ELISA-Signale mit scFv D1.3, der in fd-CAT2 (fd) oder pCAT-3 kloniert wurde, pCAT-3 scFv1.3 wurde mit M13K07 (K07) wiederhergestellt. M13K07ΔgIII Nr. 3 (gIII Nr. 3) oder M13K07 gIIIΔNr.2 (g111 Nr. 2). Die Phagenantikörper sind in 10fachen (10x), 1 fachen (1x) oder 0,1fachen (0,1x) Konzentrationen relativ zur Konzentration im Überstand nach Wachstum über Nacht verglichen. Die Signale der nicht rekombinanten Vektoren fdCAT2 und pCAT-3 waren < 0,01 bei 10facher Konzentration. M13K07 gIIIΔNr. 1 ergänzte ("rescued") überhaupt nicht, was sich daraus ergibt, daß es in diesem ELISA kein Signal über dem Hintergrund gibt.
- Fig. 33. Western-Blot von mit PEG gefällten Phagen, die in dem mit Anti-g3p sondierten ELISA verwendet wurden. Freie g3p- und die g3p-scFvD1.3-Fusionsbanden sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
- Probe 1 - fd scFvD1.3
- Probe 2 - pCAT3-Vektor
- Probe 3 - pCAT3 scFvD1.3, wiederhergestellt mit M13K07, kein IPTG
- Probe 4 - pCAT3 scFvD1.3, wiederhergestellt mit M13K07, 50 uM IPTG
- Probe 5 - pCAT3 scFvD1.3, wiederhergestellt mit M13K07, 100 uM IPTG
- Probe 6 - pCAT3 scFvD1.3, wiederhergestellt mit M13K07 gIIIΔNr.3 (kein IPTG)
- Probe 7 - pCAT3 scFvD1.3, wiederhergestellt mit M13K07 gIIIΔNr.2 (kein IPTG)
- Die Proben von Feld A enthalten pro Spur das 8 ul-Äquivalent des Phagemidkulturüberstandes, und 80 ul des fd-Überstandes (10fach geringere Phagenausbeute als das Phagemid). Die Phagemidproben von Feld B sind die in Feld A verwendeten bei einer 5fach höheren Probenbeladung (äquivalent zu 40 ul Kulturüberstand pro Spur), um die Fusionsbanden in den Proben, die mit ursprünglichem M13K07 wiederhergestellt wurden, sichtbar zu machen.
- Fig. 34 ist ein Graph, der die fdCAT2scFvD1.3-Anreicherung zeigt, die sich aus einem Gemisch von fdCAT2scFvD1.3 und fdCAT2TPB4 durch eine Panningrunde ergibt.
- Fig. 35 ist ein Graph, der die fdCAT2scFvD1.3-Anreicherung zeigt, die sich aus einem Gemisch von fdCAT2scFvD1.3 und fdCAT2TPB1 durch eine Panningrunde ergibt.
- Fig. 36 zeigt die DNA-Sequenz von scFv B18 (anti-NP).
- Fig. 37 zeigt eine schematische Darstellung von Schritten, die an der PCR- Assemblierung von Nucleotidsequenzen beteiligt sind, die für Human-Fab-Fragmente kodieren. Details sind Beispiel 30 zu entnehmen.
- Fig. 38 zeigt A. eine Karte von Plasmid pJM1-FabD1.3, das für die Expression von löslichen Human-Fab-Fragmenten und als Templat für die Synthese von Linker-DNA für die Fab-Assemblierung verwendet werden. B. eine schematische Darstellung von Sequenzen, die für ein Fab-Konstrukt kodieren. C. Die Sequenz von DNA-Templat für die Synthese von Linker-DNA für die Fab-Assemblierung.
- Fig. 39 zeigt eine schematische Darstellung der Schritte, die an der PCR-Assemblierung der für die menschlichen scFv-Fragmente kodierenden Nucleotidsequenzen beteiligt sind. Die Details sind in Beispiel 32 zu finden.
- Fig. 40. ELISA-Assay von Phagenantikörpern unter Verwendung von mit Puteneilysozym beschichteten Platten. Die zwei Klone B1 und A4, die durch Mutagenese und Selektion von pAbD1.3 erhalten wurden, sind gezeigt (Beispiel 35). Die Konzentration (x-Achse) bezieht sich auf die Konzentration der Phagen für jede Probe relativ zur Konzentration im Kulturüberstand. B1 zeigt, verglichen mit D1.3, eine Bindung an Puteneilysozym. A4 weist, verglichen mit D1.3, eine verringerte Bindung an Hühnereilysozym auf.
- Fig. 41. ELISA von Phagenantikörpern, die sich an HEL und TEL binden. Klon 1 ist fdCAT2scFvD1.3. Die Klone 2 bis 10 wurden aus der Bibliothek (Beispiel 36) nach Selektion erhalten. Die Hintergrundwerte, die sich aus der Bindung dieser Klone an BSA ergeben, wurden subtrahiert.
- Fig. 42 zeigt die DNA-Sequenz der leichten Ketten D1.3 M1F und M21, die durch Selektion aus einer hierarchischen Bibliothek in Beispiel 36 erhalten wurden.
- Fig. 43 zeigt einen Fv-λ-Expressionsvektor (Beispiel 38), der aus pUC119 erhalten wurde. Er enthält die neugeordneten λ1-Keimliniengene. Die Kassetten der schweren und leichten Ketten enthalten jeweils stromaufwärts vom pel B-Leader eine Ribosomenbindestelle (Restriktionsstellen sind gezeigt als: H = Hind III; Sp = SphI; B = BamHI, E = EcoRI.
- Die folgenden von den Anmeldern verwendeten Vorschriften sind in Sambrook, J. et al., 1989, s.o. beschrieben: Restriktion, Spaltung, Ligation, Herstellung von kompetenten Zellen (Hanahan-Verfahren), Transformation, Analyse der Restriktionsenzymspaltprodukte auf Agarosegelen, Reinigung von DNA mittels Phenol/Chloroform, 5'-Endmarkierung von Oligonucleotiden, Filterscreening von bakteriellen Klonen, Herstellung von 2xTY-Medium und -Platten, Herstellung von Tetracyclin-Stammlösungen, PAGE von Proteinen, Herstellung von Phosphat-gepufferter Salzlösung.
- Alle Enzyme wurden von New England Biolabs (CP Laboratories, PO Box 22, Bishop's Stortford, Herts., England) geliefert und, wenn dies nicht anders erwähnt ist, gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
- Der Vektor fd-tet (Zacher, A. N. et al., 1980, s.o.) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 37.000) erhalten und in kompetente TG1-Zellen (Genotyp: K12δ (lac-pro), sup E, thi, hsdD5/F traD36, pro A+B+, Lac 1q, lac δM15) transformiert.
- Virale Partikel wurden hergestellt, indem TG1-Zellen, die das gewünschte Konstrukt enthalten, in 10-100 ml 2xTY-Medium mit 15 pg/ml Tetracyclin 16-24 Stunden lang gezüchtet wurden. Der Kulturüberstand wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min in einem 8 · 50 ml-Rotor, Sorval RC-5B Zentrifuge, gesammelt. Die Phagenpartikel wurden durch die Zugabe von 1/5 des Volumens an 20%igem Polyethylenglykol (PEG)/2,5 M NaCl und 1-stündiges Stehenlassen bei 4ºC gefällt. Diese wurden 15 Minuten lang wie oben beschrieben zentrifugiert und die Pellets wiederum in 10 mM Tris/HCl pH 8, 1 mM EDTA in 1/100 des ursprünglichen Volumens aufgelöst. Der Bakterienrückstand und nicht aufgelöstes Material wurden durch 2-minütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge entfernt. Einsträngige DNA zur Mutagenese und Sequenzierung wurde aus der konzentrierten Phagenlösung gemäß Sambrook, J. et al., 1989, s.o., hergestellt.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion von zwei Derivaten des Phagenvektor fd-tet: a) fdTPs/Bs für die Insertion von VH-Kodiersequenzen; und b) fdTPs/Xh für die Insertion von scFv-Kodiersequenzen. Die Derivatvektoren weisen eine neue BstEII-Stelle zur Insertion von Sequenzen auf.
- Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus einem Anti-Lysozym-Antikörper D1.3 stammen, in fdTPs/Xh, um das Konstrukt fdTscFvD1.3 zu ergeben.
- Dieses Beispiel betrifft die Insertion von VH-Kodiersequenzen, die aus einem Anti-Lysozym-Antikörper D1.3 stammen, in fdPs/Bs, um das Konstrukt fdTVHD1.3 zu ergeben.
- Dieses Beispiel untersucht die Bindespezifitäten der Konstrukte fdTscFvD1.3 und fd- TVHD1.3.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion des Derivats fdCAT2 des Phagenvektors fdTPs/Xh. Das Derivat hat Restriktionsstellen für Enzyme, die DNA nicht häufig schneiden.
- Dieses Beispiel zeigt die Bindung von pAb fdTscFvD1.3 an Lysozym durch ELISA.
- Dieses Beispiel betrifft die Präsentation eines Antikörper-Fab-Fragment an der Phagenoberfläche. Die VH-CH1-Kette wirddurch fdCAT2 exprimiert. Die VL-CL-Kette wird durch pUC19 in einer bakteriellen Wirtszelle exprimiert, die ebenfalls mit fdCAT2 infiziert wurde.
- Dieses Beispiel zeigt, wie ein Phage (z. B. fdTscFvD1.3), der ein Bindemolekül präsentiert, von Vektorphagen durch Affinitätsverfahren isoliert werden kann.
- Beispiel 9 Konstruktion von pAb, die Anti-Hapten-Aktivität exprimieren Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus dem Anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 stammen, in fdTPs/Xh, um das Konstrukt pAbNQ11 zu bilden. Das Beispiel zeigt die Bindung von pAbNQ11 an Oxazolon durch ELISA.
- Dieses Beispiel zeigt, wie ein Phage (z. B. pAbD1.3), der eine Sorte von Bindemolekül präsentiert, durch Affinitätsverfahren von Phagen (z. B. pAbNQ11), die eine andere Sorte von Bindemolekülen präsentieren, isoliert werden kann.
- Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus a) dem Anti-Lysozym-Antikörper D1.3; und b) dem Anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 stammen, in eine BamHI-Stelle von fdTPs/Xh, um die Konstrukte fdTBam1 mit einem NQ11-Insert zu ergeben.
- Dieses Beispiel betrifft ein System für die Präsentation aller durch eine Maus kodierten VH- und VLK-Repertoires auf Phagen. Das System beinhaltet die folgenden Schritte. 1) Herstellung von RNA aus Milz. 2) Herstellung von cDNA aus der RNA. 3) Einsatz von Primern, die für Antikörpersequenzen spezifisch sind, um mittels PCR alle VH- und VLK-cDNA-Kodiersequenzen zu amplifizieren. 4) Einsatz der PCR, um ein Linkermolekül aus verbindenden Paaren der VH- und VLK-Sequenzen zu bilden. 5) Einsatz der PCR, um kontinuierlich DNA-Moleküle, von denen jedes eine VH-Sequenz, einen Linker und eine VLK-Sequenz umfaßt, zu assemblieren. Die spezifische VHNLK-Kombination wird statistisch erhalten. 6) Einsatz der PCR, um Restriktionstellen einzubringen.
- Diese Beispiel betrifft die Konstruktion von zwei Phagemiden, die auf pUC119 basieren und die das Gen III von fdCAT2 und die Gen III-Fusion fdCAT2scFvD1.3 getrennt enthalten, um pCAT2 bzw. pCAT3 scFvD1.3 zu bilden.
- Dieses Beispiel betrifft die Ergänzung der Kodiersequenz für die Gen IIIscFv-Fusion von pCAT3scFvD1.3 durch das Wachstum des M13K07-Helferphagen, wobei durch ELISA gezeigt wird, daß die Phagen scFv Anti-Lysozym-Aktivität präsentieren.
- Dieses Beispiel vergleicht die Wirksamkeit der Phagemide pUC119, pCAT-3 und pCAT- 3scFvD1.3 und des Phagen fdCAT2 bei der Transformation von E.coli.
- Dieses Beispiel betrifft ein System für die Phagenpräsentation von scFv (umfaßt VH und VL) aus einer immunisierten Maus unter Verwendung der Grundtechniken, die in Beispiel 11 erklärt sind (cDNA-Herstellung und PCR-Assemblierung der VH- und VLK-Repertoires aus Mäusen) und die Ligation der PCR-assemblierten Sequenzen in fdCAT2, um eine Phagenbibliothek mit 10&sup5; Klonen zu bilden. Die Untersuchung von 500 Klonen zeigte, daß keiner Spezifität gegen phOx zeigte.
- Dieses Beispiel zeigt, daß Phagen, die aus einer in Beispiel 16 aufgestellten Bibliothek gezüchtet wurden, einer Affinitätsselektion unter Verwendung von phOx unterzogen werden können, um jene Phagen auszuwählen, die scFv mit der gewünschten Spezifität präsentieren.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion von hierarchischen Bibliotheken, in denen eine bestimmte VH-Sequenz mit dem gesamten VLK-Repertoire kombiniert wird und eine bestimmte VLK-Sequenz mit dem gesamten VH-Repertoire kombiniert wird und die Selektion neuer VH- und VL-Paarungen aus diesen Bibliotheken.
- Dieses Beispiel betrifft die Trennung von Phagen, die scFv-Fragmente mit verschiedenen Bindeaffinitäten für ein bestimmtes Antigen präsentieren, mittel Affinitätstechniken.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion des Phagemids pHEN1, das aus pUC119 erhalten wurde. pHEN1 weist die in Fig. 26 gezeigten Merkmale auf.
- Dieses Beispiel beschreibt die Präsentation eines scFv- und Fab-Fragments mit einer Spezifität gegen phOx auf der Oberfläche eines Bakteriophagen. Zur Präsentation von scFv umfaßt das Phagemid pHEN1 die für scFv (VH und VL) kodierenden Sequenzen zur Ergänzung durch einen der Phagen VSM13 oder fdCAT2. Zur Präsentation von Fab umfaßt der Phage fdCAT2 die Sequenz für die H- oder die L-Kette alsFusion mit g3p, und das Phagemid pHEN1 umfaßtdie Sequenz für den entsprechenden H- oder L-Kettenpartner.
- Dieses Beispiel umfaßt die Verwendung von Phagen-Antikörpern, die für die Antikörper- Schwer- oder -Leichtkette kodieren zur Gewinnung eines Phagemids, das für eine Gen 3-Proteinfusion mit der komplementären Kette kodiert, und den ELISA-Test bezüglich auf Phagen präsentierter Fab-Fragmente. Der Einsatz dieser Technik bei der Herstellung einer dualen kombinatorischen Bibliothek wird erörtert.
- Dieses Beispiel betrifft die Bildung von löslichen scFv- und Fab-Fragmenten aus Gen III- Fusionen mit für diese Fragmente kodierenden Sequenzen durch Expression der Klone in pHEN1 in einem E.coli-Stamm, der "amber"-Mutationen nicht unterdrückt.
- Dieses Beispiel betrifft die Verwendung von fdTscFvD1.3 im ELISA und zeigt, daß mit dem Phagenantikörper fdTscFvD1.3 kleinere Lysozymmengen als mit dem löslichen scFvD1.3 nachgewiesen werden können.
- Dieses Beispiel betrifft die Präsentation von zwei Klonen, die direkt von Zellen, die gegen Östriol gerichtete monoklonale Antikörper exprimieren, erhalten wurden, auf Phagen als funktionelle scFv-Fragmente. Die Funktionalität beider Klone wurde unter Einsatz von ELISA ermittelt.
- Dieses Beispiel umfaßt die Konstruktion eines DNA-Inserts, das für ein Fab-Fragment kodiert, durch getrennte Amplifizierung von Schwer- und Leichtketten-DNA-Sequenzen gefolgt von der Assemblierung. Das Konstrukt wurde dann in den Phagenvektor fdCAT2 und den Phagemidvektor pHEN1 insertiert, und es wurde die Funktionalität des auf der Oberfläche präsentierten Fab-Fragments gezeigt.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion eines Helferphagen, der aus M13K07 durch Deletion von Sequenzen in Gen III erhalten wurde. Die Ergänzung von pCAT3-scFvD1.3 ist beschrieben. Der scFvD1.3 wird auf hohem Niveau als Fusion unter Verwendung des Deletionsphagen exprimiert, äquivalent zur Expression unter Verwendung von fdCAT2- scFvD1.3.
- Dieses Beispiel betrifft die Selektion von Bakteriophagen gemäß der Affinität des gegen Lysozym gerichteten scFv-Fragments, das auf deren Oberfläche exprimiert wird. Phagen mit verschiedenen Affinitäten wurden an mit Lysozym beschichtete Petrischalen gebunden und nach dem Waschen die gebundenen Phagen mittels Triethylamin eluiert. Es wurden Bedingungen gefunden, bei denen eine beträchtliche Anreicherung für einen Phagen mit einer 5fach höheren Affinität als jene des Phagen, mit dem er vermischt war, erhalten werden konnte.
- Diese Beispiel betrifft das Einbringen von Mutationen in ein Gen für einen Antikörper, der in Phagen durch Züchten des Phagen in Stämmen, die statistisch die DNA aufgrund eines Defekts in der DNA-Replikation mutieren, kloniert wurde. Verschiedene Mutationen werden in den Phagen eingebracht, die vom ursprünglichen Phagen ausgewählt werden können.
- Dieses Beispiel zeigt Verfahren für die Assemblierung von Fab-Fragmenten aus Genen für Antikörper. Beispiele sind für Gene für gegen Rhesus-D gerichtete Antikörper in einer Human-Hybridom- und einer polyklonalen lymphoblastischen Zellinie angeführt.
- Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion eines Phagemids, das für ein gegen das Rhesus D-Antigen gerichtetes Human-Fab-Fragment kodiert, und die Präsentation von Phagen- Antikörpern davon. Phagen, die dieses Antigen präsentieren, wurden dann auf Basis der Bindung an Rhesus D-positive rote Blutkörperchen über einem Hintergrund von Phagen, die scFvD1.3-Antilysozym präsentieren, Affinitätsselektion unterzogen.
- Diese Beispiel beschreibt die Bildung von schi-Fragment-Bibliotheken, die aus einem nichtimmunisierten Menschen erhalten wurden. Es werden Beispiele der Herstellung von Bibliotheken in Phagemiden zur Phagenpräsentation der scFv-Fragmente, die aus den IgG- und IgM-Sequenzen stammen, gezeigt.
- Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von Klonen für Phagenantikörper, die gegen BSA, Lyszym und Oxazolon gerichtet sind, aus der Bibliothek der scFv-Fragmente, die aus den lgM-Genen eines nicht immunisierten Menschen stammen. Die Selektion erfolgte durch Panning oder durch Affinitätschromatographie und Analyse der Bindespezifitäten durch ELISA. Die Sequenzierung der Klone zeigte, daß diese menschlichen Ursprungs sind.
- Diese Beispiel betrifft die Isolierung von Klonen für Phagenantikörper, die spezifisch für Thyroglobulin und Oxazolon sind, aus der Bibliothek der aus den IgM-Genen eines nichtimmunisierten Menschen stammenden scFv-Fragmente. In diesem Beispiel erfolgte die Ergänzung mit M13K07gIII Nr. 3 (NCTC12478), einem Helferphagen, dem das Gen III fehlt. Es zeigte sich, daß für eine Phagemidbibliothek, die mit diesem Phagen ergänzt wurde, in Vergleich zu einer, die mit M13K07 wiederhergestellt wurde, weniger Selektionsrunden notwendig sind.
- Dieses Beispiel betrifft die in vitro-Mutagenese von pCATscFvD1.3 durch den statistischen Austausch mit Aminosäuren von Resten, von denen bekannt ist, daß sie bei der bevorzugten Erkennung von Hühnereilysozym gegenüber Puteneilysozym durch scFv- D1.3 wichtig sind. Nach der Selektion nach Phagenantikörpern, die Puteneilysozym erkennen, durch Affinitätschromatographie, wurden die Klone auf ihre Spezifität mittels ELISA analysiert. Es wurden zwei Gruppen von Klonen mit gleicher Erkennung von Hühner- und Putenlysozym, eine mit erhöhtem ELISA-Signal mit dem Putenenzym und eine mit verringertem Signal für das Hühnerenzym gefunden.
- Diese Beispiel zeigt, daß der Austausch der VL-Domäne von scFvD1.3, das spezifisch für Hühnereiweißlysozym (HEL) ist, durch eine Bibliothek von VL-Domänen die Selektion der scEv-Fragmente, die sich auch an Puteneiweißlysozym binden, ermöglicht. Die scFv-Fragmente wurden aus Phagen präsentiert und die Selektion erfolgte durch Panning in mit TEL beschichteten Röhrchen. Die Analyse mittels ELISA zeigte Klone mit im Vergleich zu HEL verstärkter Bindung an TEL. Jene mit der stärksten Bindung an TEL wurden sequenziert.
- Dieses Beispiel betrifft die Verwendung einer spaltbaren Bindung im Affinitätsselektionsverfahren um die Freisetzung von gebundenen Phagen unter schonenden Bedingungen zu ermöglichen. pAbNQ11 wurde aus einem Gemisch mit pAbD1.3 durch die Selektion unter Verwendung von biotinyliertem Ox-BSA, das an magnetische Perlen gebunden ist, etwa 600fach angereichert. Die Spaltung einer Bindung zwischen BSA und dem Biotin ermöglicht die Elution des Phagen.
- Dieses Beispiel betrifft die Anwendung von Zellselektion, um einen angereicherten Pool von Genen, die für gegen 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure gerichtete Antikörper kodieren, herzustellen, und beschreibt, wie dieses Verfahren angewendet werden könnte, um die Komplexität der Antikörperrepertoires, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden, zu verringern.
- Der Vektor fd-tet hat zwei BstEII-Restriktionsstellen, die die Tetracyclinresistenzgene flankieren (Fig. 3). Da es die Strategie zur Insertion der VH-Fragmente war, diese in eine neu innerhalb von Gen III insertierte BstEII-Stelle zu ligieren, war es vorteilhaft, die ursprünglichen BstEII-Stellen aus fd-tet zu löschen. Dies wurde erreicht, indem fd-tet mit dem Restriktionsenzymen BstEII gespalten wurde, die 5'-Überstände aufgefüllt und erneut ligiert wurde, um den Vektor fdTBBst zu bilden. Die Spaltung von fd-tet mit BstEII (0,5 Units/pl) wurde in IxKGB-Puffer (100 mM Kaliumglutamat, 23 mM Tris-Acetat (pH 7,5), 10 mM Magnesiumacetat, 50 ug/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM Dithiothreitol (Sambrook, J., et al., 1989, s.o.)) mit DNA bei einer Konzentration von 25 ng/,ul durchgeführt. Die 5'-Überstände wurden unter Verwendung von 2xKGB-Puffer, jeweils 250 pM dNTP'S (Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsummer Bolevark, Milton Keynes, Bucks., UK.) und 0,04 Units/ul Klenow-Fragment (Amersham International, Lincoln Place, Green End, Aylesbury, Bucks., UK) aufgefüllt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur, wurde die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefäl It.
- Die Ligationen wurden bei einer DNA-Konzentration von 50 ng/ul durchgeführt. Die Ligationen wurden in kompetente TG1-Zellen transformiert und auf TY-Platten, die mit 15 ug/ ml Tetracyclin versetzt waren, ausplattiert. Dies selektiert Vektoren, bei denen während des Ligationsschrittes das Gen für das Tetracyclinresistenzprotein wieder in den Vektor insertiert wurde. Die Kolonien wurden in 25 ml 2xTY-Medium, das mit 15 ug/ml Tetracyclin versetzt war, gegeben und über Nacht bei 37ºC gezüchtet.
- Doppelsträngige DNA wurde unter Verwendung des Gene-Clean II Sets (Bio101 Inc., PO Box 2284, La Jolla, California, 92038-2284, USA.) aus den resultierenden Klonen und gemäß der darin beschriebenen Vorschrift zur schnellen DNA-Isolierung im kleinen Maßstab gereinigt. Die Orientierung von 5 der resultierenden Klone wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI geprüft. Es wurde ein Klon ausgewählt, der dasselbe Restriktionsmuster durch ClaI aufwies wie fd-tet, der aber keine BstEII-Stellen hatte.
- Die in vitro-Mutagenese von fdTδBst wurde benützt, um Vektoren mit geeigneten Restriktionsstellen, die das Klonieren von Antikörperfragmenten stromabwärts vom Gen III-Signalpeptid und im Rahmen mit der Gen III-Kodiersequenz erleichtern, zu bilden. Das auf Oligonucleotide gerichtete Mutagenesesystem in der Version 2 (Amersham International) wurde mit oligo 1 (Fig. 4) verwendet, um fdTPs/Bs zu bilden (um das Klonieren der VH-Fragmente zu erleichtern). Die Sequenz offdTPs/Bs (Fig. 4) wurde unter Einsatz cles Sequenase Sets Version 2 (USB Corp., PO Box 22400, Cleveland, Ohio, 11422, USA.) mit oligo 3 (Fig. 4) als Primer bestätigt.
- Ein zweiter Vektor fdTPs/Xh (um das Klonieren der Einzelketten-Fv-Fragmente zu erleichtern) wurde durch das Mutagenisieren von fdTPs/Bs mit oligo 2 gemäß dem Verfahren von Venkitaraman, A. R., Nucl. Acid. Res. 17, S. 3314 gebildet. Die Sequenz von fdTPs/Xh (Fig. 4) wurde unter Einsatz des Sequenase Sets Version 2 (USB Corp.) mit oligo 3 als Primer bestätigt.
- Alternative Konstrukte werden für den Fachmann auf dem Gebiet natürlich klar sein. Beispielsweise M13 und/oder seine Wirtsbakterien könnte(n) so modifiziert werden, daß sein Gen III ohne das Auftreten von exzessivem Zelltod unterbrochen werden könnte.
- Darüber hinaus wird erfindungsgemäß ein Plasmid eingesetzt, das einen einsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthält, wie pUC119, so daß dort, wo das modifizierte fd- Gen III, oder ein anderes modifiziertes Protein, in das Plasmid eingebaut wird, die Superinfektion mit dem modifizierten Phagen, wie z. B. K07, dann die Einkapselung des Phagenantikörpergenoms in eine Hülle, die zum Teil vom Helferphagen und zum Teil vom Phagenantikörper-Gen III-Konstrukt stammt, ergibt.
- Die detaillierte Konstruktion eines Vektors, wie z. B. fdTPs/Bs, ist nur ein Weg, das Ziel eines Phagenantikörpers zu erreichen. Beispielsweise können Verfahren, wie z. B. die "Sticky feet"-Klonierung/Mutagenese (Clackson, T. and Winter, G. 1989, Nucl. Acids. Res., 17, S. 10163-10170) eingesetzt werden, um die Anwendung von Restriktionsenzymspaltungen und/oder Ligationsschritten zu vermeiden.
- Das Plasmid scFv D1.3 myc (zur Verfügung gestellt von G. Winter und A. Griffiths) enthält VH- und VL-Sequenzen aus dem Antikörper D1.3, die über eine Peptidlinkersequenz fusioniert sind, um eine Einzelketten-Fv-Version des Antikörper D1.3 zu bilden. Die Sequenz des scFv und die umgebenden Sequenzen in scFvD1.3 myc sind in Fig. 5 gezeigt.
- Der D1.3-Antikörper ist gegen Hühnerei-Lysozym gerichtet (M. Harper, et al., 1987, Molec. Immunol. 24, 97-108), und die in E.coli exprimierte scFv-Form weist die gleiche Spezifität auf (persönliche Mitteilung von A. Griffiths und G. Winter).
- Die Spaltung von scFv D1.3 myc mit PstI und XhoI (diese Restriktionsstellen sind in Fig. 5 gezeigt) schneidet ein 693 bp-Fragment, das für den Hauptteil von scFv kodiert, heraus. Die Ligation dieses Fragments in fdTPs/Xh, der mit PstI und XhoI gespalten wurde, ergab das Konstrukt fdTscFvD1.3, das für das Gen III-Signalpeptid und die erste Aminosäure, die an den vollständigen D1.3 scFv fusioniert ist, gefolgt von dem reifen Gen III- Protein ab Aminosäure 2, kodiert.
- Der Vektor fdTPs/Xh wurde für die Ligation durch 2-stündige Spaltung mit PstI und XhoI, gefolgt von einer 30-minütigen Spaltung mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (Böhringer Mannheim UK Ltd, Beil Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) mit einem Unit/ul bei 37ºC. Frische alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 Units/pl zugegeben und weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionslösung wurde 3mal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst. Das Insert wurde aus scFvD1.3 myc mit den geeigneten Restriktionsenzymen (PstI und XhoI) ausgeschnitten, 2mal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser aufgelöst. Die Ligationen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer daß sowohl Vektor- als auch die Insertproben jeweils eine Endkonzentration von 5 ng/ul aufwiesen. Die Bildung des richtigen Konstruktes wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch Sequenzieren bestätigt.
- Um zu zeigen, daß Proteine mit der erwarteten Größe hergestellt wurden, wurden die Virionen durch PEG-Fällung wie oben beschrieben konzentriert. Die Proben wurden gemäß der Vorschrift in Sambrook, J. et al., s.o. vorbereitet. Äquivalente von 2 ml des Überstandes wurden auf ein 18%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgegeben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 15 Minuten lang in Gellaufpuffer (50 mM Tris, 380 mM Glycin, 0,1% SDS) mit 20% Methanol geweicht. Der Transfer auf Nitrocellulosefilter erfolgte in frischem 1xLaufpuffer/20% Methanol unter Verwendung von TE70 Semi Phor, einem "halb-trocken"-Blotting-Gerät ("semi-dry blotting apparatus"; Höffer, 654 Minnesota Street, Box 77387, San Francisco, California 94107, USA.).
- Nach dem Transfer, wurden die Filter durch 1-stündige Inkubation in einer 2%igen Milchpulver-Lösung (Marvel) in Phosphat-gepufferter Salzlösung blockiert. Der Nachweis der scFv- und VH-Proteinsequenzen in den Phagenantikörperfusionsproteinen erfolgte durch 1-stündiges Weichen des Filters mit einer 1/1000-Verdünnung (in 2% Milchpulver) eines polyklonalen Kaninchenantiserums gegen Affinitäts-gereinigtes, bakteriell exprimiertes scFv-Fragment (von G. Winter zur Verfügung gestellt). Nach dem Waschen mit PBS (3 · 5 Minuten-Waschungen) wurde gebundener primärer Antikörper mit 1-stündiger Verwendung eines an Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörpers (Sigma, Fancy Road, Poole, Dorset, BH17 7NH, UK.) nachgewiesen. Die Filter wurden in PBS/0,1% Triton-X100 gewaschen und mit 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), 0,02% Kobaltchlorid, und 0,03% Wasserstoffperoxid in PBS entwickelt.
- Die Ergebnisse zeigten, daß mit den Klonen fdTVHD1.3 (aus Beispiel 3, beinhaltet für VH kodierende Sequenzen) und fdTscFvD1.3 (beinhaltet für scFv kodierende Sequenzen) ein Protein zwischen 69.000 und 92.500 Dalton durch das Anti-Fv-Serum detektiert wird. Das ist die für die konstruierten Fusionsproteine erwartete Größe. Dieses Produkt wird in von fd-tet, fdδBst oder fdTPs/Xh gewonnenen Überständen nicht beobachtet.
- Das VH-Fragment aus D1.3 wurde aus dem Plasmid pSW1-VHD1.3-TAG1 (Ward, E. S. et al., 1989, s.o.) gebildet. Die Spaltung dieses Plasmids mit PstI und BstEII ergibt das in Fig. 5 zwischen den Positionen 113 und 432 gezeigte Fragment. Die Klonierung dieses Fragments in die PstI- und BstEII-Stellen von fdTPs/Bs ergab das Konstrukt fdTVHD1.3, das für ein Fusionsprotein mit einer vollständigen VH-Domäne, die zwischen die erste und dritte Aminosäure des reifen Gen III-Proteins (Aminosäure 2 wurde gelöscht) insertiert wurde, kodiert.
- Die eingesetzten Verfahren waren genau wie in Beispiel 2, außer daß der verwendete Vektor fdITPs/Bs war, der mit PstI und BstII gespalten wurde.
- Die Bindung der spezifischen Phagenantikörper an das spezifische Antigen, Lysozym, wurde mit ELISA-Verfahren analysiert. Die Phagenantikörper (z. B. fdTVHD1.3 und fdTscIFvD1.3) wurden in E.coli gezüchtet und Phagenantikörperteilchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben mit PEG gefällt. Die gebundenen Phagenantikörperteilchen wurden mittels polyklonalen Schafsserums gegen den nahe verwandten Phagen M13 nachgewiesen.
- ELISA-Platten wurden durch die Beschichtung von 96-Napf-Platten (Falcon Microtest III flexible Platte. Falcon: Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, California, 93030, USA) mit 200 pl einer Lysozymlösung (1 mg/ml, wenn nicht anders erwähnt) in 50 mM NaHCO&sub3; für 16-24 Stunden vorbereitet. Vor der Verwendung wurde diese Lösung entfernt, die Platte mehrere Male in PBS gespült und mit 200 ul 2% Milchpulver/PBS eine Stunde lang inkubiert. Nach mehreren Spülungen mit PBS wurden 100 ul der Testproben zugegeben und eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen (3 Spülungen in 0,05% Tween 20/PBS, gefolgt von 3 Spülungen in PBS alleine). Die gebundenen Phagenantikörper wurden durch die Zugabe von 200 ul pro Napfeiner 1/1000-Verdünnung von polyklonalem Anti-M13-Schafsserum (von G. Winter zur Verfügung gestellt, obwohl ein gleichwertiger Antikörper unter Anwendung von Standardverfahren von einem Fachmann auf dem Gebiet leicht hergestellt werden kann) in 2% Milchpulver/PBS und 1-stündige Inkubation nachgewiesen. Nachdem wie oben gewaschen wurde, wurden die Platten mit biotinyliertem Anti-Schaf-Antikörper (Amersham International) 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit dem Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex (Amersham International) inkubiert. Nach einer abschließenden Waschung (wie oben) wurden 0,5 mg/ml ABTS-Substrat in Citratpuffer zugegeben (ABTS: 2'2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure); Citratpuffer = 50 mM Zitronensäure, 50 mM Trinatriumcitrat in einem Verhältnis von 54 : 46. Wasserstoffperoxid wurde auf eine Endkonzentration von 0,003% zugegeben und die Platten 1 Stunde lang inkubiert. Die optische Dichte bei 405 nm wurde in einem Titersek Multiskan-Plattenlesegerät abgelesen.
- Fig. 6 zeigt die Wirkung der Variation der Phagenantikörpermenge. 100 ul verschiedener Verdünnungen von mit PEG gefällten Phagen wurden aufgegeben und die Menge als ursprüngliches Kulturvolumen, aus dem er gewonnen wurde, ausgedrückt. Die Signale, die sowohl vom scFv enthaltenden Phagenantikörper (fdTscFvD1.3) als auch vom VH enthaltenden Phagenantikörper (fdTVHD1.3) erhalten wurden, waren stärker als jene, die vom Phagenantikörpervektor (fdTPs/Xh) erhalten wurden. Das höchste Signal/Rausch-Verhältnis tritt bei der Verwendung des Äquivalents von 1,3 ml der Kultur auf.
- Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Beschichtung der Platten mit variierenden Konzentrationen an Lysozym oder Rinderserumalbumin (BSA). Das Äquivalent von 1 ml des ursprünglichen Phagenantikörperkulturüberstandes wurde. Die Signale von den Überständen, die mit fdTscFvD1.3 erhalten wurden, waren wieder stärker als jene, die mit fdTPs/Xh erhalten wurden, wenn mit Lysozym beschichtete Näpfe verwendet wurden. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Typen von Überständen, wenn die Platten mit BSA beschichtet waren. Allgemein gesagt ist der Signalwert auf den Platten proportional zur beschichteten Lysozymmenge. Diese Ergebnisse zeigen, daß die detektierte Bindung spezifisch für Lysozym als Antigen ist.
- Es wäre nützlich, Vektoren zu konstruieren, die die Verwendung von die DNA selten schneidenden Restriktionsenzymen ermöglichen, und somit die unerwünschte Spaltung der Antikörpergeninserte innerhalb ihrer Kodiersequenz vermeiden. Insbesondere Enzyme mit einer Erkennungssequenz von 8 Basen sind in diesem Zusammenhang nützlich, beispielsweise NotI und SfiI. Chaudhary (PNAS 87, S. 1066-1070, 1990) identifizierten allgemein eine Anzahl von Restriktionsstellen, die im den variablen Genen von Antikörpern selten vorkommen. Die Anmelder haben als Beispiel, wie dieser Enzymtyp verwendet werden kann, einen Vektor gestaltet und konstruiert, der zwei dieser Stellen verwendet. Die für die Enzyme ApaLI und NotI notwendigen Stellen wurden in fdTPs/Xh eingebracht, um fdCAT2 zu bilden.
- Das folgende Oligonucleotid wurde synthetisiert: 5'-ACT TTC AAC AGT TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG TTG GAC CTG TGC ACT GTG AGA ATA GAA-3' (siehe Beschreibung der Fig. 4) und benützt, um fdTPs/Xh unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets von Amersham International, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu mutagenisieren um fd-CAT2 zu bilden. Die Sequenz von fd-CAT2 wurde rund um die Manipulationsstelle durch DNA-Sequenzieren überprüft. Die endgültige Sequenz rund um den Insertionspunkt innerhalb von Gen III ist in Fig. 8 gezeigt.
- N. B. fdCAT2 wird hierin auch durch die alternativen Begriffe fd-tet-DOG1 und fd- DOG1 bezeichnet.
- Die Bindung von pAb D1.3 (fdTscFvD1.3 aus Beispiel 2) an Lysozym wurde mittels ELISA weiter analysiert.
- Mit Phagen transduzierte Bakterienkulturen wurden in 10-100 ml 2xTY-Medium mit 15 ug/ml Tetracyclin hergestellt und unter Schütteln bei 37ºC 16-24 Stunden lang wachsen gelassen. Der Phagenüberstand wurde durch Zentrifugation der Kultur (10 Minuten bei 10.000 U/min. 8 · 50 ml Rotor, Sorval RC-5B Zentrifuge) gewonnen. Auf dieser Stufe war der Phagentiter 1-5 · 10¹&sup0;/ml transduzierende Einheiten. Die Phagen wurden durch Zugabe von 1/5 des Volumens an 20% PEG in 2,5 M NaCl, 1 Stunde lang Stehenlassen bei 4ºC und Zentrifugieren (siehe oben) gefällt. Die Phagenpellets wurden in 10 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA pH 8,0 in 1/100 des ursprünglichen Volumens erneut suspendiert, und die Bakterienreste und aggregierten Phagen durch 2-minütiges Zentrifugieren in einer Tisch-Mikrozentrifuge entfernt.
- Die Platten wurden mit Antigen (1 mg/ml Antigen) beschichtet und wie in Beispiel 4 blockiert. 2 · 10¹&sup0; Phagen transduzierende Einheiten wurden den mit Antigen beschichteten Platten in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 2% Magermilchpulver (MPBS) enthält, zugegeben. Die Platten wurden zwischen jedem Schritt durch 3 Spülungen mit 0,5% Tween-20 min PBS, gefolgt von 3 Spülungen mit PBS, gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden durch Inkubation mit Anti-M13-Antiserum aus Schafen entwickelt und mit an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem Anti-Ziegen-Serum (Sigma, Poole, Dorset, UK), das auch Schafsimmunglobuline detektiert, und ABTS (2'2'-Azinobis(3- ethylbenzthiazolinsulphonsäure)) nachgewiesen. Die Ablesungen bei 405 nm erfolgten nach einem geeigneten Zeitraum. Die Ergebnisse (Fig. 9) zeigen, daß der den Antikörper aufweisende Phage dasselbe Reaktivitätsmuster aufwies wie der ursprüngliche D1.3-Antikörper (Harper, M., Lema, F., Boulot, G., and Poljak, F. J. (1987) Molec. Immunol. 24, 97-108), und sich an Hühnereiweißlysozym, aber nicht an Puteneiweißlysozym, menschliches Lysozym oder Rinderserumalbumin band. Die Spezifität des Phagen wird insbesondere durch das Fehlen der Bindung an Puteneiweißlysozym, das sich von Hühnereiweißlysozym durch nur 7 Aminosäuren unterscheidet, veranschaulicht.
- Das Ziel dieses Beispiels bestand darin zu zeigen, daß das in Beispiel 2 verwendete scFv-Format nur eine Möglichkeit zur Präsentation von Antikörperfragmenten im pAb- System war. Ein häufiger verwendetes Antikörperfragment ist das Fab-Fragment (Fig. 1), und dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines pAb, der ein Fab-artiges Fragment auf seiner Oberfläche exprimiert, und zeigt, daß es sich spezifisch an sein Antigen bindet. Die Anmelderin hat sich entschlossen, die Schwerkette des Antikörperfragments zu exprimieren, das aus den VH- und CH1-Domänen von Kodierungssequenzen innerhalb des pAb selbst besteht, und die Leichtkette in der mit dem pAb infizierten bakteriellen Wirtszelle zu co-exprimieren. Die VH- und CH1-Regionen von Anti-Lysozym-Antikörper D1.3 wurden in fd CAT2 kloniert, und die entsprechende Leichtkette in Plasmid pUC19 kloniert. Die Arbeit von Skerra und Pluckthun (Science 240, S. 1038-1040 (1988) und Better et al., 1988, s.o., zeigte, daß multimere Antigen-Bindefragmente des Antikörpermoleküls unter Einsatz geeigneter Signalsequenzen in funktioneller Form in das Periplasma der bakteriellen Zelle sekretiert werden können. In diesen Publikationen wurden jedoch spezielle Maßnahmen beschrieben, die den Ausführungen zufolge erforderlich sind, um das Bindeprotein aus der Zelle zu gwinnen, beispielsweise mussten Skerra und Pluckham das Fv-Fragment durch Affinitätschromatographie aus dem Periplasma gewinnen. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gezeigt, daß es möglich ist, das Bindemolekül auf einem Phagenteilchen an die Außenseite der Zelle zu lenken, ein Verfahren, für das mehrere Ereignisse eintreten müssen: Assoziation der Ketten des Bindemoleküls; korrektes Assemblieren des Phagenteilchens; und der Export des intakten Phagenteilchens aus der Zelle.
- Alternativ dazu ist es jedoch möglich, die Leichtkette von innerhalb des pAb-Genoms beispielsweise durch Klonierung einer Expressionskassette in eine geeignete Stelle im Phagengenom zu exprimieren. Eine derartige geeignete Stelle wäre die Intergen-Region, in der sich die Multiklonierungsstelle befinden, die durch Engineering in Derivate des verwandten Phagen M13 eingebracht wurden (siehe beispielsweise C. Yanisch-Perron, et al., Gene 33, 103-119 (1985)).
- Der Ausgangspunkt für dieses Beispiel war der Klon Fab D1.3 in pUC19, dessen Karte in Fig. 10 gezeigt wird. Die mit den nachstehenden Oligonucleotiden KSJ6 und -7 hybridisierenden Regionen sind in Fig. 10 unterstrichen gezeigt. Die für die VH-CH1-Region kodierende Sequenz (an den 5'- und 3'-Rändern durch die nachstehenden Oligonucleotide KS)6 und -7 begrenzt) wurde aus Fab D1.3 in pUC19 unter Einsatz der Oligonucleotide KSJ 6 und 7 PCR-amplifiziert, die die Pstl-Stelle am 5-Ende beibehalten und eine Xho I-Stelle am 3'-Ende einführen, um das Klonieren in fd CAT2 zu erleichtern. Die Sequenzen für diese Oligonucleotide KS)6 und 7 sind nachstehend gezeigt. Die unterstrichene Region von KS)7 zeigt den Abschnitt, der mit der Sequenz für D1.3 hybridisiert.
- KSJ6: 5' AGG TGC AGC TGC AGG AGT CAG G 3'
- KSJ7: 5' GGT GAC CTC GAG TGA AGA ITT GGG CTC AAC TTT C 3'
- Die PCR-Bedingungen waren wie in Beispiel II beschrieben, mit der Ausnahme, daß 30 Zyklen PCR-Amplifizierung mit Denaturierung bei 92ºC für 45 s, Annelieren bei 55ºC für 1 min und Extension bei 72ºC: für 1 min durchgeführt wurden. Das verwendete Templat war DNA aus TG1-Zellen, die Fab D1.3 in pUC19 enthielten, resuspendiert in Wasser und aufgekocht. Die Templat-DNA wurde aus den Kolonien hergestellt, indem etwas Koloniematerial in 100 ul destilliertem H&sub2;O aufgenommen und für 10 min gekocht wurde. 1 ul dieses Gemisches wurde in einer 20 ul-PCR verwendet. Diese Vorgangsweise führte zur Amplizierung des erwarteten Fragments mit etwa 600 bp. Dieses Fragment wurde mit Pst I und Xho I geschnitten, auf Agarosegel gereinigt und in Pst 1/ Xho 1-geschnittenes fdCAT2 ligiert. Das PCR-Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt (Sambrook et al., oben), bevor es mit Pstl und Xho1 (New England Biolabs) nach den Empfehlung der Hersteller verdaut wurde. Das Fragment wurde auf 1% Tris-Acetat-EDTA-Agarosegel (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, Kalifornien, USA) gelöst.
- fd-CAT2-Vektor-DNA wurde nach den Empfehlungen der Hersteller mit Pst 1 und Xho 1 verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt (Sambrook et al., s.o.).
- 75 ng Pst 1/Xho 1-verdaute Vektor-DNA wurde an 40 ng PCR-amplifiziertes Pstl/Xho 1- verdautes hEGF-R-Fragment in 12 ul Ligationspuffer (66 mM TrisHCl (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, (100 ug/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM ATP, 0,5 mM Spermidin) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England BioLabs) für 16 h bei 16 ºC ligiert.
- 2 ul des Ligationsgemisches wurden in 200 ul kompetente E.coli MC1061-Zellen transformiert, auf 2TY-Agar plattiert, das 15 ug/ml Tetracyclin enthielt, und bei 20ºC für 20 h inkubiert. Ein Abschnitt des Ligationsreaktionsgemisches wurde in E.coli MC1061 transformiert (beispielsweise erhältlich von Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien, USA), und Kolonien durch Hybridisierung mit dem Oligonucleotid D1.3CDR3A identifiziert wie in Beispiel 10 beschrieben. Das Vorhandensein des VHCH1-Genfragments wurde ebenfalls durch PCR bestätigt, wobei die Oligonucleotide KSJ6 und -7 verwendet wurden. Ein repräsentativer Klon erhielt die Bezeichnung fd CAT2VHCH1 D1.3. Die Schwerkette wurde von Fab D1.3 in pUC19 durch Sph I-Spaltung von Fab D1.3- Plasmid-DNA deletiert. Das pUC 19 2,7Kb-Fragment, das das Leichtkettengen enthielt, wurde aus einem TAE-Agarosegel gereinigt, und 10 ng dieser DNA Eigenligation unterzogen und in kompetente E.coli TG1 transformiert. Die Zellen wurden auf 2TY Agar ausplattiert, das Ampicillin (100 ug/ml) enthielt, und bei 30ºC über Nacht inkubiert. Die resultierenden Kolonien wurden verwendet, um Miniprep-DNA herzustellen (Sambrook et al., s.o.), und das Fehlen der Schwerkettengens durch Verdauung mit Sph I und Hind III bestätigt. Ein repräsentativer Klon erhielt die Bezeichnung Lcd1.3 DHC.
- Eine Kultur von fd CAT2VHCH.3-Zellen über Nacht wurde bei 13.000 · g 10 min lang mikrozentrifugiert, und 50 ul des Überstands, der Phagenteilchen enthielt, zu 50 ul einer Über-Nacht-Kultur von LCD1.3 DHC-Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37ºC 10 min lang inkubiert und auf 2TY-Agar plattiert, das Ampicillin (100 ug/ml) und 15 ug/ml Tetracyclin enthielt. Phagen wurden aus einigen der resultierenden Kolonien hergestellt und auf ihre Fähigkeit getestet, Lysozym zu binden, wie in Beispiel 6 beschrieben.
- Die Ergebnisse (Fig. 11) zeigten, daß sich der pAb an Lysozym band, wenn die Schwer- und Leichtketten-Fab-Derivate vom ursprünglichen Antikörper D1.3 vorhanden waren.
- Der fd VHCh1-Fragment bindende pAb band sich nur dann an Lysozym, wenn er in Zellen gezüchtet wurde, die auch die Leichtektte exprimieren. Das zeigt, daß ein funktionelles Fab-Fragment durch eine Assoziation der freien Leichtkette mit VHCH1-Fragment erzeugt wurde, das an Gen III fusioniert war, und auf der Oberfläche des pAb exprimiert wurde.
- Die Anmelder reinigten pAb (D1.3) (ursprünglich in Beispiel 2 als fdTscFvD1.3 bezeichnet) aus Gemischen unter Einsatz von Affinitätssäulen. pAb (D1.3) wurde mit dem Vektor fd-Phagen (siehe Tabelle 1) gemischt und etwa 10¹² Phagen über eine Lysozym-Sepharose-Säule geschickt (aus mit Bromcyan aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, UK) gemäß den Anleitungen der Produzenten hergestellt). TG1-Zellen wurden mit geeigneten Verdünnungen der Eluate infiziert und die erhaltenen Kolonien durch den Einsatz einer Oligonucleotid-Sonde, die nur den pAb (D1.3) nachweist, analysiert, siehe Tabelle 1 und Fig. 12. Eine eintausendfache Anreicherung von pAb(D1.3) wurde bei einem einzigen Säulendurchgang beobachtet. Durch das Züchten der angereicherten Phagen und deren erneuten Durchgang durch die Säule wurden Anreicherungen bis hinauf zu einer Million beobachtet.
- Die Anreicherung wurde auch unter Verwendung rein immunologischer Kriterien gezeigt. Beispielsweise wurden 10¹² Phagen (bei einem Verhältnis von 1 pAb (D1.3) auf 4 · 10&sup6; fdTPs/Bs) zwei Affinitätsselektionsrunden unterzogen und dann 26 Kolonien genommen und über Nacht gezüchtet. Die Phagen wurden dann mittels ELISA (wie Beispiel 6) auf Lysozymbindung untersucht. Fünf Kolonien zeigten Phagen mit Lysozymbindeaktivitäten, siehe Tabelle 1, und es wurde mittel PCR-Screenen (Beispiel 13, bei Verwendung von 30 Zyklen mit 1 Minute bei 92ºC, 1 Minute bei 60ºC, 1 Minute bei 72ºC und mit CDR3PCR1 und oligo 3 (Fig. 4) als Primer) gezeigt, daß diese für scFv (D1.3) kodieren.
- Somit können sehr seltene pAbs aus großen Populationen herausgefischt werden, indem Antigen zur Selektion verwendet wird und dann die Phagen gescreent werden.
- In diesem Beispiel wurden die Affinitätschromatographie von pAbs und der Einsatz der Oligonucleotidsonde wie unten beschrieben durchgeführt.
- Etwa 10¹² Phagenteilchen in 1 ml PBS wurden auf eine 1 ml Lysozym-Sepharose-Affinitätssäule, die in MPBS vorgewaschen wurde, aufgegeben; die Säule wurde nacheinander mit 10 ml PBS; dann 10 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 7,5; dann 10 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 8,5; dann 5 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 9,5 (mit Triethylamin eingestellt) gewaschen und dann mit 5 ml 10 mM Triethylamin eluiert. Das Eluat wurde mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer pH 6,8 neutralisiert und die Phagen zur Analyse ausplattiert. Für eine zweite Affinitätschromatographierunde, wurde das erste Säuleneluat auf etwa 30.000 Kolonien pro Petrischale ausplattiert. Nach dem Wachstum über Nacht, wurden die Kolonien dann in 5 ml 2xTY-Medium gekratzt, und eine 20 jA Aliquote in 10 ml frischem Medium verdünnt und über Nacht gezüchtet. Die Phagen wurden mit PEG, wie oben beschrieben, gefällt, in 1 ml MPBS erneut suspendiert und auf die Säule aufgebracht, gewaschen und wie oben eluiert.
- Die synthetisierten Oligonucleotide waren:
- CDR3PCR1 5'-TGA GGA C(A oder T) C(A oder T) GC CGT CTA CTA CTG TGC-3'
- 40 pMol des Oligonucleotids VH1 FOR (Ward, W. S., et al., (1989) Nature 341, 544- 546), der für pAb (D1.3) spezifisch ist, wurde mit 100 pCi a-32P ATP phosphoryliert, an Nitrozellulosefilter bei 67ºC in 6 · Natriumcitratsalzlösungs-(SSC) (Sambrook et al., s.o.)-Puffer 30 Minuten lang hybridisiert (1 pMol/ml) und 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, sowie 3 · 1 Minute bei 60ºC in 0,1 · SSC gewaschen.
- Oxazolon ist ein Hapten, das herkömmlicherweise zur Untersuchung der Details der Immunantwort verwendet wird. Der Anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 wurde bereits be schrieben (E. Gherardi, R. Pannell, C. Milstein, J. Immunol. Method 126, 61-68). Ein Plasmid, das die VH- und VL-Gene von NQ11 enthält, wurde in eine scFv-Form umgewandelt, indem das BstEIIISacI-Fragment von scFvD1.3 myc (die Nucleotide 432-499 in Fig. 5) zvvischen die VH- und VL-Gene insertiert wurde, um pscFvNQ11 zu bilden, dessen Sequenz in Fig. 13 dargestellt ist. Dieser scFv wurde in die PstI/XhoI-Stelle von FdTPs/Xh kloniert (wie früher beschrieben), um pAb zu bilden. NQ11 hat eine innere PstI-Stelle und daher war es notwendig, eine vollständige Spaltung von pscFvNQ11 mit XhoI zu machen, gefolgt von einer teilweisen Spaltung mit PstI.
- Die spezifische Bindung von pAb NQ11 wurde mittels ELISA bestätigt. ELISA-Platten wurden bei 37ºC bei einer Proteinkonzentration von 200 ug/ml in 50 mM NaHCO&sub3; beschichtet. Die Platten wurden entweder mit Hühnereilysozym (HEL), Rinderserumalbumin (BSA) oder mit an Oxazolon konjugiertem (Konjugationsverfahren in Makela O., Kartinen M., Pelkonen J. L. T., Karfalainen K. (1978) J. Exp. Med. 148, 1644) BSA (OX- BSA) beschichtet. Die Vorbereitung der Phagen, die Bindung an ELISA-Platten, das Waschen und die Detektionwaren wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Proben wurden in Doppelversuchen untersucht und die durchschnittliche Absorption nach 10 Minuten ist in Fig. 14 dargestellt.
- Dieses Ergebnis zeigt, daß der pAb NQ11 sich an das richtige Antigen bindet. Fig. 14 zeigt auch, daß pAb D1.3 und pAb NQ11 sich nur an jenes Antigen binden, gegen das der ursprüngliche Antikörper gerichtet war.
- 3 · 10¹&sup0; Phagen in 10 ml PBSM in den in Tabelle 2 gezeigten Verhältnissen von pAb D1.3 zu pAb NQ11 wurden über eine 1 ml Sepharosesäule geschickt. Das Waschen, die Elution und die anderen Verfahren waren wie in Beispiel 8 beschrieben, wenn nicht anders erwähnt. Die Eluate aus den Säulen wurden zur Infektion von TG1-Zellen verwendet, die dann ausplattiert wurden. Die Kolonien wurden mit einer Sonde untersucht, die zwischen pAb D1.3 und pAb NQ11 unterscheidet. Die Sequenz dieses Oligonucleotids (D1.3CDR3A) ist: 5'- GTA GTC AAG CCT ATA ATC TCT CTC - 3'. Tabelle 2 zeigt die Daten aus diesem Experiment. Eine Anreicherung von zumindest 1000fach wurde in einer Runde und einer Anreicherung von über 1 Million-fach in zwei Reinigungsrunden erreicht. Dies gleicht dem in Beispiel 8 beschriebenen Ergebnis.
- Die Verfügbarkeit einer alternativen Stelle zur Insertion von Bindemolekülen im Phagen würde die Möglichkeit eröffnen, leichter mehr als ein Bindemolekül, z. B. ein Antikörperfragment, in einem einzigen pAb exprimieren zu können. Dies kann verwendet werden, um einzelne oder vielfache Bindespezifitäten zu bilden. Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bindeaktivitäten auf einem einzelnen Molekül erhöht die Nützlichkeit und Spezifität dieses Moleküls beträchtlich. Dieses kann bei der Bindung von Viren mit einer hohen Mutationsrate, wie z. B. der menschliche Immunschwäche-Virus ("human immunodeficiency virus", HIV), nützlich sein. Zusätzlich kann es verwendet werden, um Antigene in unmittelbare Nähe (z. B. Arzneimitteldesign ("drug targetting") oder Zellenfusion) zu bringen oder es kann als "molekulare Klammer" ("molecular clamp") in chemischen, immunologischen und enzymatischen Verfahren wirken.
- Der Vektor fd-tet und die hierin beschriebenen Derivate haben eine einzelne BamHI- Stelle in Gen III. Das wurde bereits zur Expression von Peptidfragmenten auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen verwendet (Smith GP. (1985) Science 228, S. 1315-1317 und de la Cruz et al., (1988) J. Biol. Chem. 263, S. 4318-4322). Dies bietet eine möl; liche alternative Stelle zur Insertion von Antikörperfragmenten.
- DNA-Fragmente, die für scFv's aus D1.3 oder NQ11 kodieren, wurden durch PCR unter Verwendung der unten gezeigten Primer hergestellt. Die Primer waren so gestaltet, daß sie ein Fragment mit BamHI-Stellen in der Nähe der beiden Enden aufweisen, um das Klonieren in die BamHI-Stelle von Gen III zu ermöglichen (siehe Fig. 16(1)). Die verwendeten Oligonucleotide stellen ebenfalls sicher, daß dem resultierenden PCR-Produkt PstI- und XhoI-Restriktionsstellen fehlen, die normalerweise verwendet werden, um die scFv's zu manipulieren (siehe Fig. 16(1)). Dies erleichtert die nachfolgende Manipulation eines zweiten Antikörperfragments in der herkömmlichen Weise am N-Terminus von Gen III. Die verwendeten Oligonucleotide waren:
- G3Bam1 5'- TTT AAT GAG GAT CCA CAG GTG CAG CTG CAA GAG - 3'
- G3Bam2 5'- AAC GAA TGG ATC CCG ITT GAT CTC AAG CTT - 3'.
- Die PCR-Reaktion wurde in einer 80 ul-Reaktion wie in Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung von 1 ng/ul Templat und 0,25 UIpl Taq-Polymerase und einer Zyklusabfolge von: 94ºC 1 Minute lang, 60ºC 1 Minute lang und 70ºC 2 Minuten lang über 30 Zyklen durchgeführt. Das Templat war entweder pscFvNQ11 (Beispiel 9) oder scFvD1.3 myc (Beispiel 2). Die Reaktionsprodukte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt, in Wasser gelöst und mit BamHI gemäß den Angaben des Herstellers gespalten. Die Spalltlösung wurde erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt und in Wasser gelöst.
- Der Vekkor fdTPs/Xh wurde mit BamHI gespalten und mit Kalbsdarmphosphatase behandelt und wie in Beispiel 2 gereinigt. Die Ligationen wurden mit einer Vektorkonzentration von etwa 6 ng/pl und einer PCR-Insertkonzentration von etwa 3 nglpl angesetzt. Diese wurden 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur vor der Transformation in kompetente Zellen und dem Ausplattieren auf TY-tet-Platten ligiert. Die resultierenden Kolonien wurden wie in Beispiel 8 beschrieben sondiert. Aus einer Anzahl von Kolonien wurde die DNA isoliert und die korrekte Ausrichtung und Insertgröße durch Restriktionsspaltung mit HindIII alleine oder in Kombination mit BamHI bestätigt. (Eine Hind- III-Stelle wird von einem der Primer beigetragen und die andere vom Vektor).
- Zwei Klone, die ein D1.3-Insert enthalten (fdTBaml und fdTBam²) und einer der ein NQ11-Insert enthält (NQ11 Baml) wurden gezüchtet und die Phagen wie bereits früher beschrieben isoliert. ELISA's wurden wie in Beispiel 6 durchgeführt. Es wurde für keinen dieser Klone ein spezifisches Signal gefunden, das vermuten läßt, daß die natürliche BamHI-Stelle keine geeignete Stelle zur Insertion eines funktionellen Antikörpers ist (die Ergebnisse sind nicht gezeigt).
- Es kann möglich sein, in alternative Stellen zu klonieren, um die Bindeaktivität beizubehalten. Die in Gen III vorhandenen Peptidwiederholungen können solch eine Stelle bieten (Fig. 16 Block A und B). Dies kann durch Insertion einer BamHI-Stelle und Verwendung des oben beschriebenen PCR-Produktes erfolgen. Um dies zu erleichtern, wurde die natürliche BamHI-Stelle durch Mutagenese mit dem unten gezeigten Oligonucleotid G3mutδBam (unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham International)) entfernt:
- G3mutδBam 5'- CA AAC GAA TGG GTC CTC CTC ATT A-3'.
- Der unterstrichene Rest ersetzt einen A-Rest, wodurch die BamHI-Stelle entfernt wurde. Die DNA wurde aus einer Anzahl von Klonen isoliert und einige Mutanten ohne Bam- HI-Stellen durch Restriktionsspaltung identifiziert.
- Das Oligonucleotid G3 Bamlink wurde konstruiert, um eine BamHI-Stelle an einer Anzahl von möglichen Stellen innerhalb der Peptidlinkerstellen A und B einzubringen, siehe Fig. 16(2). Die Sequenz des Linkers ist:
- Bamlink 5'- CC (G oder A) CC ACC CTC GGA TCC (G oder A) CC ACC CTC - 3'
- Seine Beziehung zu den Peptidwiederholungen in Gen III ist in Fig. 16 gezeigt.
- Das Prinzip ist in Fig. 17 veranschaulicht. Die Details werden in den Abschnitten A bis F geboten, aber die grobe Richtlinie wird zuerst besprochen.
- 1. cDNA wird aus Milz-RNA aus einer geeigneten Maus hergestellt und die VH- und VLK-Repertoires einzeln amplifiziert. Getrennt werden zu VH1FOR-2 (Domäne 1) und VLK1BACK (Domäne 2) umgekehrte und komplementäre Primer verwendet, um eine existierende scFv enthaltende DNA durch PCR zu amplifizieren. (Der Ausdruck FOR bezieht sich z. B. auf einen Primer zur Amplifikation von Sequenzen auf dem Sense-Strang, wodurch sich Antisense-Kodiersequenzen ergeben. Der Ausdruck BACK bezieht sich z. B. auf einen Primer zur Amplifikation von Sequenzen auf dem Antisense-Strang, wodurch sich Sense-Kodiersequenzen ergeben.). Dies ergibt ein "Linker"-Molekül, das für den Linker mit der Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) (GGGGS)&sub3;, der mit den zwei primären (VH und VLK) PCR-Produkten überlappt, kodiert.
- 2. Die getrennt amplifizierten VH-, VLK- und Linkersequenzen müssen jetzt in ein kontinuierliches DNA-Molekül durch die Verwendung einer "Assemblierungs"- PCR angeordnet werden. In der zweiten "Assemblierungs"-PCR werden die VH-, VLK- und Linkerbanden kombiniert und aufgrund des oben bezüglich Überlappungen erwähnten assembliert. Dies ergibt ein assembliertes DNA-Fragment, das die Expression der VH- und einer VLK-Domäne lenkt. Die spezifische VH/VLK-Kombination wird statistisch aus den oben erwähnten getrennten VH- und VLK-Repertoires erhalten.
- Die Assemblierungs-PCR wird in zwei Stufen durchgeführt. Zuerst 7 Zyklenrunden nur mit den in der PCP vorhandenen Banden, gefolgt von weiteren 20 Runden in Gegenwart der flankierenden Primer VH1BACK (bezieht sich auf Domäne 1 von VH) und VLK- FOR. Die Oligonucleotidsequenzen für diese Oligonucleotidprimer werden im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Dieses Zweistufen-Verfahren vermeidet das mögliche Problem der bevorzugten Amplifikation der ersten zu assemblierenden Kombinationen.
- Zur Klonierung in das Phagensystem müssen die assemblierten Repertoires mit den geeigneten Restriktionsstellen "markiert" werden. Im weiter unten dargestellten Beispiel wird dies durch das Vorsehen einer ApaLI-Restriktionsstelle am VH-Ende des kontinuierlichen DNA-Moleküls und einer NotI-Stelle am VLK-Ende des Moleküls veranschaulicht. Dies wird durch eine dritte Stufe der PCR unter Verwendung von "markierten" Primern durchgeführt. Die Nucleotidsequenzen für diese Oligonucleotidprimer werden unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" ängeführt. Es gibt jedoch 4 mögliche κ- Sequenzen der leichten Kette (wohingegen eine einzige Konsensussequenz der schweren Kette verwendet werden kann). Daher werden 4 Oligonucleotidsequenzen für VLK vorgesehen.
- In dieser dritten Stufe der PCR wurden Sets von Primern, die eine neue Restriktionsstelle bilden und weitere 10 Nucleotide auf der 5'-Seite der Restriktionsstelle aufweisen, verwendet. Lange "Markierungen" ergeben jedoch ein besseres Schneidergebnis, wobei Überstände mit 15-20 Nucleotiden verwendet werden können.
- Vorschriften für äußerst sauberes Arbeiten müssen zu jeder Zeit während der PCR eingehalten werden, um Kontamination zu vermeiden. Es müssen immer Blindvergleiche ohne DNA eingeschlossen werden, um Kontaminationen festzustellen. Die Gelboxen müssen von Purin befreit werden. Ein dafür vorgesehenes Geneclean Set (B10 101, Geneclean, La. Jolla, San Diego, California, USA) kann gemäß den Angaben der Hersteller verwendet werden, um DNA aus einem Agarosegel zu extrahieren. Die Perlen, Nal und die NEW-Waschung sollten in aliquoten Anteilen eingesetzt werden.
- Alle Enzyme wurden von CP Eaboratories, P. O. Box 22, Bishop's Stortford, Herts CM20 3DH, erhalten und die von den Herstellern empfohlenen und gelieferten Puffer wurden, wenn nicht anders erwähnt, verwendet.
- RNA kann durch viele den Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Arbeitsvorschriften isoliert werden. Beispielsweise ergibt die folgende Arbeitsvorschrift (Triton X-100-Lyse, Phenol/SDS-RNase-Inaktivierung) hervorragende Ergebnisse mit Milz- und Hybridomzellen (die Zugabe von VRC ("veronal ribosyl complex", Veronal-Ribosom-Komplex) als RNase-Hemmer ist für Milzzellen erforderlich). Guanidin/lsothiocyanadCsCl-Arbeitsvorschriften (wobei die gesamte zelluläre RNA erhalten wird) geben ebenfalls gute Ergebnisse, sind aber zeitaufwendiger.
- 1. 1-5 · 10&sup7; Zellen werden durch 10-minütige Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 800 g und 4ºC geerntet. Diese werden erneut in 50 ml kaltem PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen werden wieder bei 800 g und 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- 2. Auf Eis wird 1 ml eiskalter Lysepuffer dem Pellet zugegeben und mit einer 1 ml-Gilsonpipette durch sanftes Auf- und Abpipettieren erneut suspendiert. Dies wird 1 Minute auf Eis stehen gelassen.
- 3. Nach der Lyse werden die Zellenreste durch Zentrifugation bei 1300 U/min fünf Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC in vorgekühlten Röhrchen entfernt.
- 4. 0,5 ml Überstand werden jeweils in zwei Eppendorfgefäße, die 60 ul 10% (Gew./ Vol.) SDS und 250 ul Phenol (zuvor mit 100 mM Tris-HCl pH 8,0 äquilibriert) enthalten, übergeführt. Es wird 2 Minuten stark gevortext, dann fünf Minuten bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge (13.000 U/min) zentrifugiert. Die obere, wäßrige Phase wird in ein frisches Röhrchen übergeführt.
- 5. Die obere wäßrige Phase wird erneut fünfmal mit 0,5 ml Phenol extrahiert.
- 6. Mit 1/10 des Volumens 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina Ethanol wird über Nacht bei 20ºC oder 30 Minuten mit Trockeneis/Isopropanol gefällt.
- 7. Das RNA-Pellet wird gewaschen und in 50 ul erneut suspendiert, um die Konzentration durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm zu prüfen und 2 ug werden auf einem Agarosegel geprüft. 40 ug RNA wurden von aus einer Maus stammenden Milzzellen erhalten.
- Der Lysepuffer [10 mM Tris-HC. pH 7,4, 1 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 10 mM VRC (New England Biolabs), 0,5% (Gew./Vol.) Triton X-100] wird frisch hergestellt.
- cDNA kann durch viele den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannte Arbeitsvorschriften isoliert werden. Beispielsweise kann die folgende Arbeitsvorschrift verwendet werden:
- 1. Es wird das folgende Reverse-Transkription-Gemisch hergestellt:
- ul
- H&sub2;O (mit DEPC behandelt) 20
- 5 mM dNTP 10
- 10 · Erststrang-Puffer 10
- 0,1 M DTT 10
- FOR-Primer (10 umol/ul) 2 (jeweils) (siehe unten)
- RNasin (Promega; 40 U/ul) 4
- NB
- i.) DEPC ist Diethylpyrocarbonat, dessen Funktion die Inaktivierung aller Enzyme ist, die DNA oder RNA abbauen könnten
- ii.) dNTP ist Desoxynucleotidtriphosphat
- iii.) DTT ist Dithiothreitol, dessen Funktion die eines Antioxydans ist, um eine für die Enzymfunktion erforderliche reduzierende Umgebung zu schaffen.
- iv.) RNasin ist ein Ribonucleaseinhibitor, der von Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin, USA, erhalten wurde
- 2. Es wurden 10 ug RNA auf 40 ul Endvolumen mit mit DEPC behandeltem Wasser verdünnt. Dann wurde 3 Minuten lang bei 65ºC wärmebehandelt und eine Minute auf Eis gehalten (um die Sekundärstruktur zu entfernen).
- 3. Der RNA wurde das Reverse-Transkription-Gemisch (58 ul) sowie 4 ul klonierte Reverse Transkriptase "Super RT" (Anglian Biotech Ltc., Whitehall House, Whitehall Road, Colchester, Essex) zugegeben und bei 42ºC eine Stunde fang inkubiert.
- 4. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Minuten gekocht, eine Minute auf Eis gekühlt und dann in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Zellreste als Pellet zu erhalten. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen übergeführt.
- 10x Erststrang-Puffer ist [1,4 M KCl, 0,5 M Tris-HCl pH 8,1 bei 42ºC 80 mM MgCl&sub2;].
- Die Primer annelieren an das 3'-Ende. Beispiele für Primer für leichte Ketten vom κ-Typ sind MJK1 FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5FONX (unter "Primersequenzen" unten angegeben) und Beispiele für Primer für die schweren Ketten sind MIGG1, 2 (CTG GAC AGG GAT CCA GAG TTC CA) und MIGG3 (CTG GAC AGG GCT CCA TAG TTC CA), die an CH1 annelieren.
- Alternativ dazu können beliebige Primer, die sich an das 3'-Ende der variablen Regionen VH, VLK, VL, oder an die konstanten Regionen CH1, CK, oder CL binden, verwendet werden.
- Für jede PCR und jeden Blindvergleich, wurden die folgenden Reaktionen angesetzt (z. B. eine Reaktion für jede der vier VLK- und der vier VH-PCRs). In der Folge wurde die Vent-DNA Polymerase, die von C. P. Laboratories Ltd. (New England Biolabs, Adresse weiter oben) verkauft wird, verwendet. Die Puffer sind die durch C. P. Laboratories bereitgestellten.
- ul
- H&sub2;O 32,5
- 10 · Vent-Puffer 5
- 20 · Vent-BSA 2,5
- 5 mM dNTPs 1,5
- FOR-Primer (10 pMol/ul) 2,5
- BACK-Prümer (10 pMol/ul) 2,5
- Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Für VH ist der FOR-Primer VH1 FOR-2 und der BACK-Primer VH1- BACK. Für VLK sind die FOR-Primer MJK1 FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5- FONX (für die 4 jeweiligen leichten Ketten vom κ-Typ) und der BACK-Primer ist VK1- BACK. Es ist nur ein BACK-Primer für die leichte Kette vom κ-Typ erforderlich, da die Bindung an eine Nucleotidsequenz erfolgt, die den 4 leichten Ketten vom κ-Typ ähnlich ist.
- Dieses Gemisch wird 5 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt. Es werden 2,5 ul cDNA- Präparat (aus B; weiter oben), und 2 Tropfen Paraffinöl (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, UK) zugegeben. Dann wird dies auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock z. B. einen PHC-2, der von Techne Ltd., Duxford, UK, hergestellt wurde, gegeben, wobei dieser bereits auf 94ºC eingestellt ist. Es wird 1 ul Vent-DNA-Polymerase unter das Paraffin zugegeben. Dann wird mit 25 Zyklen mit 94ºC 1 Minute, 72ºC 2 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60ºC erfolgt 5 Minuten lang.
- Dies wird auf einem 2% Imp- ("low melting point", niedrigschmelzendem/TAE(Tris- Acetat EDTA-) Gel gereinigt und die DNA in 20 ul Wasser pro ursprünglicher PCR unter Verwendung des Geneclean Sets (siehe oben) gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert.
- In größerer Menge ansetzen (z. B. 10fach).
- ul
- H&sub2;O 34,3
- 10 · Vent-Puffer 5
- 20 · Vent-BSA 2,5
- 5 mM dNTPs 2
- LINKFOR-Primer (10 pMol/ul) 2,5
- LINKBACK-Primer (10 pMol/ul) 2,5
- DNA aus scEv D1.3 (Beispiel 2) 1
- Vent-Enzym 0,2
- Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Der FOR-Primer ist LINKFOR und der BACK-Primer BACKFOR. Es wird mit Paraffinöl überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, siehe oben, mit 94ºC gegeben. Dann wird mit 25 Zyklen mit 94ºC 1 Minute, 65ºC 1 Minute, 72ºC 2 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60ºC erfolgt 5 Minuten lang.
- Dies wird auf einem 2% Imp/TAE-Gel gereinigt (unter Verwendung eines Ladefarbstoffes ohne Bromphenolblau, da ein 93 bp-Fragment gewünscht ist) und mit SPIN-X die Säule (Costar Limited, 205 Broadway, Cambridge, Ma.,USA) eluiert und gefällt. Pro PCR-Reaktion wird dies in 5 ul H&sub2;O aufgenommen.
- Ein Viertel jedes PCR-Reaktionsprodukts (5 ul) wird für jede Assemblierung verwendet. Das Gesamtvolumen beträgt 25 ul.
- Für jeden der vier VLK-Primer wird folgendes angesetzt:
- ul
- H&sub2;O 4,95
- 10 · Vent-Puffer 2,5
- 20 · Vent-BSA 1,25
- 5 mM dNTPs 0,8
- Dieses Gemisch wird 5 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt. Dann werden jeweils 5 ul der VH- und VLK-Bande aus der primären PCR und 1,5 ul Linker, der aus den präparativen Gelen isoliert und wie oben in C und D beschrieben mittels des Geneclean Sets extrahiert wurde, zugegeben. Dies wird mit Paraffin überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, der auf 94ºC vorgeheizt ist, gegeben. Es wird mit 7 Zyklen mit 94ºC 2 Minuten, 72ºC 4 Minuten amplifiziert. Dann wird die Temperatur wieder auf 94ºC eingestellt.
- Es werden jeweils 1,5 ul VH1BACK und der geeignete VLKFOR-Primer MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX oder MJKSFONX (10 pMol/ul) bei 94ºC zugegeben. Der Primer sollte wie oben mit UV behandelt sein. Es wird mit 20 Zyklen mit 94ºC 1,5 Minuten, 72ºC 2,5 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60ºC erfolgt 5 Minuten lang. Dies wird auf einem 2% Imp/TAE-Gel gereinigt und die DNA in 20 ul H&sub2;O pro Assemblierungs-PCR unter Verwendung eines Geneclean Sets (siehe oben) gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert.
- Für jede Assemblierung und jeden Vergleich wird folgendes angesetzt:
- ul
- H&sub2;O 36,5
- 10 · Taq-Puffer 5
- 5 mM dNTPs 2
- FOR-Primer (10 pMol/ul) 2,5
- BACK-Primer (10 pMol/ul) 2,5
- Assemblierungsprodukt 1
- Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Der FOR-Primer ist ein beliebiger aus JK1NOT10, JK2NOT10, JK4- NOT10 oder JK5NOT10 (für die jeweiligen vier leichten Ketten vom κ-Typ) um eine Not1-Restriktionsstelle am VLK-Ende anzubringen. Der BACK-Primer ist HBKAPA10, um eine ApaL1-Restriktionsstelle am VH-Ende anzubringen.
- Dies wird mit Paraffin überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, der auf 94ºC vorgeheizt ist, gegeben. Dann werden 0,5 ul Cetus-Taq-DNA-Polymerase (Cetus/Perkin-Elmer, Beaconsfield, Bucks, UK) unter das Paraffin zugegeben. Die Amplifikation wird mit 11-15 Zyklusrunden (von der Effizienz abhängig) bei 94ºC 1 Minute, 55ºC 1 Minute, 72ºC 2 Minuten durchgeführt. Die 5-minütige Nachbehandlung erfolgte bei 60ºC.
- 10 · Taq-Puffer ist [0,1 M Tris-HCl pH 8,3 bei 25ºC, 0,5 M KCl, 15 mM MgCl&sub2;, 1 mg/ml Gelatine].
- Es wird einmal mit Chloroform/IAA (Isoamylalkohol), einmal mit Phenol, einmal mit Chloroform/IAA gereinigt und alles nachextrahiert, um minimale Verluste zu gewährleisten. Es wird mit 70% Ethanol gefällt und zweimal gewaschen. Dies wird in 70 ul H&sub2;O gelöst.
- Über Nacht wird mit NotI bei 37ºC gespalten:
- ul
- DNA (verbundene Sequenz) 70
- NEB NotI-Puffer · 10 10
- NEB BSA · 10 10
- NotI (10 U/ul) 10
- "DNA (verbundene Sequenz)" oben bezieht sich auf die assemblierte DNA-Sequenz, die in 5'-3'-Richtung folgendes umfaßt:
- ApaL1-Restriktionsstelle
- VH-Sequenz
- Linker-Sequenz
- VLK-Sequenz
- Not1-Restriktionsstelle
- Die VLK-Sequenz kann eine der vier möglichen Kettensequenzen vom κ-Typ sein.
- Die Enzyme Not 1 (oben), ApaL1 (unten) und die Puffer NEB Not 1, NEB BSA (oben) und der NEB Puffer 4 (unten) können von den C. P. Laboratories, New England Biolabs, s.o., erhalten werden.
- Es wird erneut gefällt, und in 80 ul H&sub2;O aufgenommen. Dazu werden 10 ul NEB Puffer 4 und 10 ul ApaL 1 gegeben.
- Das Enzym ApaL 1 wird in Aliquoten über den Tag verteilt zugegeben, da es eine kurze Halbwertszeit bei 37ºC hat.
- Dies wird auf einem 2% Imp/FAE-Gel gereinigt und die DNA unter Verwendung eines Geneclean Sets gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert. Wenn notwendig, wird erneut gespalten.
- Das DNA-Endprodukt ist ein etwa 700 bp umfassendes Fragment mit ApaL1- und Not1- kompatiblen Enden, das aus durch einen Linker verbundenen, statistisch angeordneten Sequenzen der schweren und der leichten Kette besteht. Ein für diese Art typisches Molekül ist das in fdsdFvD1.3 inkorporierte scFvD1.3-Molekül, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Diese Moleküle können dann in geeignete, aus fd gewonnene Vektoren, z. B. fdCAT2 (Beisspiel 5), unter Verwendung von Standardverfahren ligiert werden.
- Primäre PCR-Oligonucleotide (die Restriktionsstellen sind unterstrichen):
- Mehrdeutige Codes M = A oder C, R = A oder G, S = G oder C, W = A oder T PCR-Oligos zur Linkerherstellung:
- Für die Hinzufügung der Restriktionsstellen:
- Es wäre nützlich, die Transfektionseffizienz des Phagen-bindenden Molekülsystems zu verbessern und auch über die Möglichkeit, verschiedene Anzahlen und Spezifitäten der Bindemoleküle auf der Oberfläche desselben Bakteriophagen zu präsentieren, zu verfügen. Die Anmelder haben ein Verfahren entwickelt, das beide Ziele erreicht.
- Der Ansatz kommt aus dem Phagemidsystem, das auf pUC119 [Vieira, J. and Messing, J. (1987) Methods Enzymol. 153: 3] basiert. Kurz gesagt, wurde das Gen III aus fd-CAT2 (Beispiel 5) und die Gen IIIscFv-Fusion aus fd-CAT2 scFv D1.3 (Beispiel 2) stromab vom lac-Promotor in getrennte Proben von pUC119 kloniert, damit das insertierte Gen III und die Gen III-Fusion durch den M13M07-Helferphagen (Vieira, J. and Messing, J., s.o.), der gemäß Sambrook et al., 1989, s.o., hergestellt wurde, wiederhergestellt werden können. Es wäre zu erwarten, daß die Mehrheit der wiederhergestellten Phagen ein vom plJC119-Plasmid stammendes Genom enthält, das die Bindemolekül-Gen III-Fusion enthält und verschiedene Anzahlen des Bindemoleküls auf der Oberfläche bis hinauf zum normalen Maximum von 3-5 Molekülen von Gen III auf der Oberfläche des Phagen vom Wildtyp exprimieren sollte. Das System wurde unten unter Verwendung eines Antikörpers als Bindemolekül beispielhaft ausgeführt.
- Ein fdCAT2, der die Einzelketten-Fv-Form des D1.3 Anti-Lysozym-Antikörpers enthält, wurde durch Spaltung von fdTscFvD1.3 (Beispiel 2) mit Pstl und Xhol, Reinigung des das scFv-Fragment enthaltenden Fragments und Ligieren desselben in einen mit Pstl und Xho1 gespaltenen fdCAT2 gebildet. Der geeignete Klon, mit der Bezeichnung fd- CAT2 scFvD1.3, wurde nach dem Ausplattieren auf 2xTY-Tetracyclin (15 ug/ml) ausgewählt und durch Restriktionsenzym- und Sequenzanalyse bestätigt.
- Gen III aus fd-CAT2 (Beispiel 5) und die Gen III-Fusion aus fd-CAT2 scFvD1.3 wurde mit den unten gezeigten Primern A und B PCR-amplifiziert.
- Primer A: TGC GAA GCT TTG GAG CCT TTT TTT TTG GAG ATT TTC AAC G
- Primer B: CAG TGA ATT CCT ATT AAG ACT CCT TAT TAC GCA GTA TGT TAG C
- Primer A anneliert an das 5'-Ende des Gen III, das die Ribosomenbindestelle umfaßt und beinhaltet eine HindIII-Stelle. Primer B anneliert an das 3'-Ende des Gen III am C- Terminus und beinhaltet zwei UAA-Stopcodons und eine EcoRI-Stelle. 100 ng fd-CAT2 und fd-CAT2 scFv D1.3 wurden als Template zur PCR-Amplifikation in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ul, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet, außer daß 20 Amplifikationszyklen durchgeführt wurden: 94ºC 1 Minute, 50ºC 1 Minute, 72ºC 3 Minuten. Dies ergab die Amplifikation des erwarteten 1,2 Kb-Fragments aus fd-CAT2 und ein 1,8 Kb-Fragment aus fd-CAT2 scFv D1.3.
- Die PCIR-Fragmente wurden mit EcoRI und HindIII gespalten, auf einem Gel gereinigt und in eine mit EcoRI und HindIII geschnittene und dephosphorylierte pUC119-DNA ligiert und unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., s.o.) in E.coli TG1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf SOB-Agar (Sambrook et al., 1989, s.o.), der 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, ausplattiert. Die resultierenden Klone vvurden mit pCAT-3 (aus fd-CAT2 erhalten) und pCAT-3 scFv D1.3 (aus fd-CAT2 scFv D1.3 erhalten) bezeichnet.
- Einzelne pCAT-3- und pCAT-3 scFv D1.3-Kolonien wurden in 1,5 ml 2TY, das 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, überführt und 6 Stunden bei 30ºC gezüchtet.
- 30 ul dieser stationären Zellen wurden zu 6 ml 2TY, das 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, in 50 ml Polypropylenröhrchen (Falcon, Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, Ca., USA) zugegeben und 1,5 Stunden bei 30ºC in einem New Brunswick Kreisschüttler (New Brunswick Scientific Ltd., Edison House 163 Dixons Hill road, North Mimms, Hatfield, UK) bei 380 U/min gechüttelt. Die Zellen wurden durch 25-minütige Zentrifugation bei 5.000 g zu einem Pellet geformt und die Röhrchen auf Löschpapier getrocknet. Die Zellpellets wurden dann in 6 ml 2TY, das 1,25 · 10&sup9; p.f.u. (Plaque forming units, Plaque-bildende Einheiten)/ml zugegebene M13K07-Bakteriophagen enthält, suspendiert. Das Gemisch wurde 5 Minuten auf Eis gelassen und dann 45 Minuten lang bei 450 U/min und 35ºC wachsen gelassen. Es wurde dann ein Cocktail zugegeben, der 4 ul 100 ug/ml Ampicillin, 0,5 ul 0,1 M IPTG und 50 ul 10 mg/ml Kanamycin enthält, und die Kulturen über Nacht bei 35ºC und 450 U/min wachsen gelassen.
- Am darauffolgenden Tag wurden die Kulturen zentrifugiert und die Phagenpartikel wie in Beispiel 6 mit PEG gefällt. Die Phagenpellets wurden in 100 ul TE (Tris-EDTA, siehe Beispiel (6) erneut suspendiert und die Phagen auf E.coli TG1 titriert. Aliquote der infizierten Zellen wurden auf 2TY, das entweder 100 ug/ml Ampicillin zur Selektion nach pUC119-Phagenpartikel oder 50 ug/ml Kamamycin zur Selektion nach M13K07-Helferphagen enthält, ausplattiert. Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert und die Antibiotika-resistenten Kolonien gezählt:
- Dies zeigt daß die ampR-Phagenpartikel infektiös sind und in der "ergänzten" Phagenpopulation in einem 100fachen Überschuss gegenüber dem kanR-M13K07-Helferphagen vorhanden sind.
- Die Phagen wurden mittels ELISA wie in Beispiel 6 beschrieben auf Anti-Lysozym-Aktivität untersucht, wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden:
- 1) Die ELISA-Platten wurden 3 Stunden lang mit 2% Marvel/PBS geblockt.
- 2) 50 ul Phagen, 400 ul 1xPBS und 50 ul Marvel wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur durch dauerndes Umdrehen gemischt, bevor jedem Napf 150 ul zugegeben wurden.
- 3) Den Phagen wurde bei Raumtemperatur ein Zeitraum von zwei Stunden zur Bindung gelassen.
- 4) Alle Waschungen nach der Phagenbindung waren:
- 2 schnelle Spülungen PBS/0,5% Tween 20
- 3 · 2 Minuten Waschung PBS/0,5% Tween 20
- 2 schnelle Spülungen PBS ohne Tensid
- 3 · 2 Minuten Waschung PBS ohne Tensid
- Das Ergebnis dieses ELISA ist in Fig. 19 gezeigt und demonstriert, daß die Antikörperspezifität tatsächlich effizient "wiederhergestellt" werden kann.
- Es scheint eine Grundregel in der bakteriellen Genetik zu sein, daß, wenn mutante Proteine und Proteine vom Wildtyp in derselben Zelle co-exprimiert werden, das Protein vom Wildtyp bevorzugt verwendet wird. Dies ist analog zur obigen Situation, worin die mutanten Proteine (d. h. Antikörperfusion) und die Gen III-Proteine vom Wildtyp (aus M13K07) in Konkurrenz um die Assemblierung als Teil des pUC119-Phagemidpartikels stehen. Man steht daher der Tatsache gegenüber, daß die Mehrheit der resultierenden pUC119-Phagemidteilchen weniger Gen III-Antikörper-Fusionsmoleküle auf deren Oberfläche aufweisen, als dies bei reinen Phagensystem, wie z. B. in Beispiel 2 beschrieben, der Fall ist. Solche Phagemidantikörper binden daher wahrscheinlich Antigen mit einer niedrigeren Avidität als fd-Phagenantikörper mit drei oder mehr Kopien der Antikörperfusion auf deren Oberfläche (es gibt in dem beschriebenen System, z. B. in Beispiel 2, kein Gen III vom Wildtyp), und sie bieten einen Weg zur Herstellung von Phagenteilchen mit verschiedenen Anzahlen desselben Bindemoleküls (und daher verschiedenen,Aviditäten für Ligand/Antigen) oder - durch den Einsatz von Helferphagen wie z. B. M13K07, um Zellen, die zwei oder mehr Gen III-Antikörper-Fusionen exprimieren, zu "ergänzen" - mit mehreren verschiedenen Bindespezifitäten auf deren Oberfläche.
- Es ist auch möglich, Helferphagen zu erhalten, die in deren Genomen für kein funktionelles Gen III kodieren (z. B. durch die Deletion der Gen III-Sequenz oder eines Abschnitts davon oder durch den Einbau einer "amber"-Mutation innerhalb des Gens). Diese defekten Phagen wachsen nur auf geeigneten Zellen (z. B. solche, die ein fuktionelles Gen III in trans bieten, oder ein "amber"-Suppressor-Gen enthalten), aber wenn diese verwendet werden, um Phagenantikörper zu ergänzen, bauen diese nur die vom Phagemid kodierte Gen III-Antikörperfusion in die freigesetzten Phagenteilchen ein.
- Die DNA's der Plasmide pUC 19, pCAT-3 und pCAT-3 scFvD1.3 sowie die DNA des Phagen fdCAT2 wurden isoliert und zur Transformation von E.coli TG1 verwendet. Die pCAT-3- und pCAT-3 scFvD1.3-Transformationen wurden auf SOB-Agar, der 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die fdCAT-2-Transformationen wurden auf 15 ug/ml enthaltendem TY-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Transformationseffizienzen sind als Kolonien pro ug eingebrachter DNA angegeben.
- pUC 19 1.10&sup9;
- pCAT-3 1.10&sup8;
- pCAT-3 scFvD1.3 1.10&sup8;
- fdCAT-2 8.10&sup5;
- Wie erwartet ist die Transformation des Phagemidvektors etwa 100fach effizienter als der ursprüngliche fdCAT-2-Vektor. Weiters beeinträchtigt die Gegenwart eines scFv-Antikörperfragments die Effizienz nicht. Diese Verbesserung der Transformationseffizienz ist bei der Bildung von Phagenantikörperbibliotheken, die große Repertoires an verschiedenen Bindespezifitäten aufweisen, von praktischem Nutzen.
- Um die Nützlichkeit des Phagen zur Selektion von Antikörpern aus Repertoires zu zeigen, ist es zuerst notwendig, eine vielfältige, repräsentative Bibliothek des Antikörperrepertoires eines Tieres herstellen und dieses Repertoire auf der Oberfläche des Bakteriophagen fd präsentieren zu können.
- Zytoplasma-RNA wurde wie in Beispiel 12 aus den vereinten Milzorganen von fünf Balb/c-Mäusen, die 8 Wochen nach der primären Immunisierung mit 2-Phenyl-5-oxazolon (ph OX), das an Hühnerserumalbumin gekuppelt ist, aufgefrischt wurden, isoliert. Die cDNA-Herstellung und PCR-Assemblierung der κ-Repertoires der VHs und VLs aus Mäusen zur Phagenpräsentation war wie in Beispiel 12. Die so erhaltenen Moleküle wurden in fdCAT2 ligiert.
- Der Vektor fdCAT2 wurde gründlich mit Not1 und ApaL1 gespalten, durch Elektroelution gereinigt (Sambrook et al., 1989, s.o.) und 1 ug (5 ug für die hierarchischen Bibliotheken, siehe Beispiel 18) an 0,5 ug der assemblierten scFv-Gene in 1 ml mit 8.000 Units T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 16ºC durchgeführt. Das gereinigte Ligationsgemisch wurde in 6 Aliquoten in MC1061- Zellen (W. J. Dower, J. F. Miller & C. W. Ragsdale, NucI. Acids Res. 16, 6127-6145, 1988) elektroporiert und auf NZY-Medium (Sambrook et al., 1989, s.o.) mit 15 ug/ml in 243 · 243 mm Platten (Nung) ausplattiert: 90-95% der Klone enthielten scFv-Gene mittels PCR-Screening.
- Rekombinante Kolonien wurden mittels PCR (Bedingungen wie in Beispiel 7) unter Verwendung der Primer VH1BACK und MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5- FONX (siehe Beispiel 12) gescreent, gefolgt von einer Spaltung mit dem häufig schneidenden Enzym BstN1 (New England Biolabs, gemäß dem Herstellerangaben verwendet). Die Bibliothek der 2 · 10&sup5; Klone schien vielfältig, wie dies durch die Vielfalt der Spaltmuster, die in Fig. 20 zu sehen sind, zu beurteilen ist, und das Sequenzieren zeigte das Vorhandensein der meisten VH-Gruppen (R. Dildrop, Immunol. Today, 5, 85-86, 1984) und VK-Untergruppen (Kabat. E. A. et al., s.o.)(keine Daten angegeben). Keiner der 568 untersuchten Klone band sich an phOx, wie durch einen ELISA wie in Beispiel 8 nachgewiesen wurde.
- Somit ist die Fähigkeit, Antikörper auszuwählen, die durch die Verwendung von Phagenantikörpern (wie in Beispiel 17) geboten wird, notwendig, um leicht Antikörper mit Antigenbindeaktivität aus statistisch kombinierten VH- und VL-Domänen zu isolieren. Sehr aufwendiges Screenen wäre notwendig, um Antigenbindefragmente zu isolieren, wenn der statistische kombinatorische Ansatz von Huse et al., 1989 (s.o.) verwendet würde.
- Die in Beispiel 16 hergestellte Bibliothek wurde verwendet, um diese Fähigkeit des Phagensystems, Antikörper auf der Basis ihrer Antikörperspezifität auzuwählen, zu demonstrieren.
- Keiner der 568 Klone, die aus der nicht selektierten Bibliothek untersucht wurden, band sich an phOx, wie mittels ELISA nachgewiesen wurde.
- Das Screenen nach der Bindung des Phagen an Hapten wurde mittels ELISA durchgeführt: 96-Napf-Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 10 ug/ml phOx-BSA oder 10 ug/ml BSA in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) beschichtet. Die Beimpfung mit Kolonien der mit Phagen transduzierten Bakterien erfolgte in 200 ul 2 · TY mit 12,5 ug/ml Tetracyclin in 96-Napf-Platten ("cell wells", Nuclon); diese wurden 24 Stunden lang bei 37ºC unter Schütteln (300 U/min) wachsen gelassen. Auf dieser Stufe waren die Kulturen gesättigt und die Phagentiter reproduzierbar (10¹&sup0; TU/ml). Dann wurden 50 ul Phagenüberstand, gemischt mit 50 ui PBS, das 4% Magermilchpulver enthält, den beschichteten Platten zugegeben. Weitere Details waren wie in Beispiel 9.
- Die Phagenbibliothek wurde über eine phOx-Affinitätssäule geschickt (Tabelle 3A) und mit Hapten eluiert. Die Kolonien aus der in Beispiel 18 hergestellten Bibliothek wurden in 50 ml 2 · TY-Medium gekratzt und bei 37ºC 30 Minuten lang geschüttelt. Die freigesetzten Phagen wurden zweimal mit Polyethylenglykol gefällt und erneut auf 10¹² TU (transduzierende Einheiten)/ml Wasser suspendiert (Titer wie in Beispiel 8 bestimmt). Zur Affinitätsselektion wurde eine 1 ml phOx-BSA-Sepharose-Säule (O. Makela, M. Kaartinen, J. L. T. Pelonen and K. Karjalainen, J. Exp. Med. 148, 1644-1660, 1978) mit 300 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), und 20 ml PBS, die 2% Magermilchpulver enthält (MPBS), gewaschen. Die Säule wurden mit 10¹² TU Phagen in 10 ml PBS beladen, mit 10 ml MPBS und abschließend mit 200 ml PBS gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit 5 ml 1 mM 4-ε-Amino-capronsäuremethylen-2-phenyl-oxazol-5-on (phOx-CAP: O. Makela et al., 1978, s.o.) eluiert. Etwa 10&sup6; TU eluierte Phagen wurden mittels Infektion von 1 ml in der log-Phase befindlichem E.coli-TG1 amplifiziert und wie oben ausplattiert. Für eine weitere Selektionsrunde wurden die Kolonien in 10 ml 2 · TY-Medium gekratzt und dann wie oben verarbeitet. Man stellte fest, daß sich nach der ersten Selektionsrunde von den eluierten Klonen 13% an phox banden, wobei die mittels ELISA nachgewiesene Bindung von schwach bis stark reichte.
- Um die Klone zu sequenzieren, wurde Templat-DNA aus den Überständen von 10 ml Kulturen, die 24 Stunden gewachsen waren, isoliert und unter der Verwendung des Didesoxy-Verfahrens und eines Sequenase Sets (USB), mit dem Primer LINKFOR (siehe Beispiel 12) für die VH-Gene und dem Primer fdSEQ1 (5'-GAA TTT TCT GTA TGA GG) für die Vk-Gene sequenziert. 23 dieser Haptenbindenden Klone wurden sequenziert und 8 verschiedene VH-Gene (A bis H) wurden in einer Vielfalt von Paarungen mit sieben verschiedenen Vk-Genen (a bis g) (Fig. 21) gefunden. Die meisten Domänen, wie z. B. VH-B und Vk-d waren "promiskuiv", und konnten Hapten mit jedem dieser Partner binden.
- Die Sequenzen der V-Gene waren mit jenen verwandt, die in der Sekunkärantwort auf phOx zu sehen waren, aber mit Unterschieden (Fig. 21). So setzen die phOx-Hybridome aus der sekundären Antwort somatisch mutierte Derivate der drei Typen an Vk-Genen - Vkoxl., "Vkox.-ähnliche" und Vk45.1-Gene (C. Berek, G. M. Griffiths & C. Milstein, Nature 316, 412-418 (1985)) - ein. Diese können sich mit VH-Genen aus einigen Gruppen paaren, wobei jene aus Vkox herkömmlicherweise eher mit dem VHoxl-Gen (VH-Gruppe 2. R. Dildrop, s.o.) ein Paar bilden. Vkoxl-Gene werden immer, und Vkoxähnliche Gene oft, in Verbindung mit schweren Ketten (einschließlich Vhoxl) gefunden und enthalten einen kurzen Fünferrest CDR3, mit der Grundsequenz Asp-X-Gly-X-X, worin das zentrale Glycin zur Bildung einer Kavität für phox notwendig ist. In der sta- tistischen kombinatorischen Bibliothek gehören jedoch fast alle VH-Gene zu Gruppe 1, und viele der Vk-Gene waren ox-ähnlich und mit VH-Domänen mit einem Fünferrest mit der Sequenz Asp/Asn-X-Gly-X-X (Fig. 21) verbunden. Vkoxl und Vhoxl wurden nur einmal gefunden (Vk-f und VH-E), und nicht miteinander kombiniert. Bei Vk-f fehlt das Trp91, das bei der phöx-Bindung beteiligt ist, und es bildete mit einem VH (VH-C) mit einem Sechserrest-CDR3 ein Paar.
- Eine Matrixkombination der VH- und VK-Gene wurde bei phOx-bindenden Klonen, die aus dieser statistischen kombinatorischen Bibliothek ausgewählt wurden, identifiziert. Die Anzahl der mit jeder Kombination gefundenen Klone ist in Fig. 22 gezeigt. Es zeigte sich, daß die Bindung an phOx-BSA bei Beurteilung mittels ELISA-Signal variierte (durch Schattierung in Fig. 22 hervorgehoben). Es zeigte sich keine Bindung an BSA alleine.
- Eine zweite Selektionsrunde aus der ursprünglichen statistischen kombinatorischen Bibliothek aus immunen Mäusen ergab, daß 93% der eluierten Klone phOx banden (Tabelle 3). Die meisten dieser Klone waren Vk-d-Kombinationen und banden sich beim ELISA stark an phOx (die Daten sind nicht gezeigt). Einige schwach Bindende waren zu sehen. Dies läßt vermuten, daß die Affinitätschromatographie nicht nur die Bindenden angereichert hat, sondern auch die am besten Bindenden.
- Mittels Fluoreszenzquerichtitrationen wurde der Kd von VH-B/Vk-d für phOx-GABA mit 10&supmin;&sup8; M (siehe Beispiel 19) bestimmt, was zeigt, daß Antikörper mit Affinitäten, die repräsentativ für die Sekundärantwort sind, aus der Sekundärantwort ausgewählt werden können; nur zwei (von 11 untersuchten) sekretieren Antikörper mit einer höheren Affinität als VH-BNk-d (C. Berek et al., 1985, s.o.). Der Kd von VH-B/Vk-b für phOx-GABA wurde mit 10&supmin;&sup5; M bestimmt (Beispiel 19). Es können also Phagen, die scFv-Fragmente mit schwachen Affinitäten aufweisen, mit Antigen selektiert werden, wahrscheinlich aufgrund der Avidität mehrerer Antikörperköpfe auf den Phagen.
- Dieses Beispiel zeigt, daß Antikörperspezifitäten aus Bibliotheken, die von immunisierten Mäusen gewonnen wurden, isoliert werden können. Es wird oft notwendig sein, diese Antikörper in einer löslichen Form für weitere Untersuchungen und zur Verwendung in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen zu exprimieren. Beispiel 19 zeigt die Bestimmung der Avidität der löslichen scFv-Fragmente, die mittels Phagenantikörper selektiert wurden. Beispiel 23 zeigt, daß lösliche Frgmente ähnliche Eigenschaften aufweisen wie jene die auf Phagen präsentiert werden. Für viele Zwecke ist es notwendig, ein Antikörpermolekül zu konstruieren und zu exprimieren, das die Fc-Abschnitte der schweren Kette enthält, und vielleicht den Immunglobulin-Isotyp zu variieren. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, die Antigenbindestellen, die mittels des Phagenselektionssystems identifiziert wurden, in einen Vektor zur Expression in Säugetierzellen zu subklonieren, wobei ähnliche Verfahren verwendet werden wie jene, die von Orlandi et al., (1989, s.o.) beschrieben wurden. Beispielsweise können die VH- und VL-Gene mittels PCR mit Primern, die geeignete Restriktionsstellen enthalten, getrennt amplifiziert und in Vektoren insertiert werden, wie z B. in pSV-gpt HuIgG1 (L. Riechmann et al., Nature 332, 323-327, 1988), der die Expression der VH-Domäne als Teil des IgG1-Isotyps mit schwerer Kette ermöglicht, und pSV-hyg HuCK, der die Expression der an die Konstantregion der leichten Kette vom κ-Typ befestigten VL-Domäne ermöglicht. Weiters können Fusionen der VH- und VL-Domänen mit Genen, die für nicht Immunglobulinproteine kodieren, beispielsweise Enzymen, durchgeführt werden.
- Weitere Antikörperspezifitäten können aus der in den Beispiel 16 und 17 hergestellten und gescreenten Bibliothek unter Verwendung eines hierarchischen Ansatzes gewonnen werden.
- Die Promiskuität der VH-B- und Vk-d-Domänen veranlaßte die Anmelder weitere Paarungen zu bewirken, indem diese Gene mit dem gesamten Repertoire, sowohl Vk- als auch VH-Genen, aus der gleichen immunisierten Maus assembliert wurden. Die resultierenden "hierarchischen" Bibliotheken, (VH-B x Vk-rep und VH-rep x Vk-d), mit jeweils 4 · 10&sup7; Bestandteilen, wurden einer Selektionsrunde unterzogen und die Haptenbindenden Klone isoliert (Tabelle 3). Wie mittels ELISA gezeigt wurde, waren die meisten stark bindend. Indem 24 Klone aus jeder Bibliothek sequenziert wurden, identifizierten die Anmelder vierzehn neue Partner für VH-B und dreizehn für Vk-d (Fig. 21). Abgesehen von VH-B und Vk-c wurde keiner der vorherigen Partner (oder andere Klone) aus der statistischen kombinatorischen Bibliothek erneut isoliert. Wieder waren die Vk- Gene hauptsächlich ox-ähnlich und die VH-Gene hauptsächlich aus Gruppe 1 (wie in Dildrop R., s.o. definiert), aber die einzigen Beispiele von Vkoxl (Vk-h, -p, -q und -r) hatten Trp91 und die VH-CDR3-Sequenz Asp-X-Gly-X-X herrscht nun vor. Somit scheinen einige Merkmale der phOx-Hybridome stärker in der hierarchischen Bibliothek in Erscheinung zu treten. Die neuen Partner unterscheiden sich voneinander hauptsächlich durch kleine Änderungen in den CDRs, was anzeigt, daß viel von der feinen Vielfalt vom statistischen kombinatorischen Ansatz ungenützt geblieben ist. Allgemeiner gesagt, wurde gezeigt, daß ein Spektrum an verwandten Antikörpern hergestellt werden kann, indem ein Partner fixiert wird und der andere variiert wird, und dies könnte sich als unbezahlbar für die Feinabstimmung der Antikörperaffinität und -spezifität erweisen.
- Daher ermöglichen Phagenantikörper wiederum, daß ein größerer Bereich von Antikörpermolekülen auf gewünschte Eigenschaften untersucht wird.
- Dieses Beispiel und Beispiel 17 zeigen die Isolierung von einzelnen Antikörperspezifitäten durch die Präsentation auf der Phagenoberfläche. Für einige Zwecke kann es gewünscht sein, ein Gemisch an Antikörpern zu haben, äquivalent zu einem polyklonalen Antiserum (beispielsweise zur Immunfällung). Um ein Antikörpergemisch herzustellen, könnte man Klone vermischen und lösliche Antikörper oder Antikörperfragmente exprimieren oder alternativ dazu Klone aus einer Bibliothek selektieren, um einen stark angereicherten Pool an Genen, die für gegen einen Liganden von Interesse gerichtete Antikörper kodieren, zu erhalten und die Antikörper aus diesen Klonen zu exprimieren.
- Die in Beispiel 17 gezeigten ELISA-Daten lassen vermuten, daß die Affinitätschromatographie nicht nur die Bindenden angereichert hat, sondern auch die am besten Bindenden. Um dies zu bestätigen, wurden die Bindungsaffinitäten eines stark bindenden und eines schwach bindenden Phagen bestimmt und dann gezeigt, daß sie voneinander mittels Affinitätschromatographie getrennt werden können.
- Die Klone VH-BNk-b und VH-BNk-d wurden mit MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4- FONX, MJK5FONX (siehe Beispiel 12) und VH1 BACK-Sfil (5'-TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(G/C) AGG T(C/G)(A/C) A(A/G)C TGC AG(C/G) AGT C(A/T)G G), einem Primer der eine SfiI-Stelle (unterstrichen) am 5'-Ende des VH-Gens einbringt, erneut amplifiziert. VG-B/Vk-d wurde in ein Phagemid, z. B. pJMI (von A. Griffiths und J. Marks zur Verfügung gestellt), als SfiI-NotI-Kassette, stromabwärts vom pelB-Leader zur periplasmatischen Sekretion (M. Better et al., s.o.), mit einer C-terminalen Peptidmarkierung zur Detektion (siehe Beispiel 20 und Figur), und unter der Steuerung eines λ-PL-Promotors (H. Shimatake & M. Rosenberg Nature 292, 128-132, 1981) kloniert. Das Phagemid sollte die folgenden Merkmale besitzen: a) einzige SfiI- und NotI-Restriktionsstellen stromab von einem pelB-Leader; b) eine Sequenz, die für eine C-terminale Peptidmarkierung zur Detektion kodiert; und c) einen λ-PL-Promotor, der die Expression steuert. 10 Liter jedes Phagemid beinhaltende Kulturflüssigkeit von E.coli N4830-1 (M. E. Gottes- mann, S. Adhya & A. Das J. Mol. Biol. 140, 57-75, 1980) wurden wie in K. Nagai & H. C. Thogerson (Methods Enzymol. 153, 461-481, 1987) induziert und die Überstände mit 50%igem Ammoniumsulfat ausgefällt. Das erneut suspendierte Präzipitat wurde gegen PBS + 0,2 mM EDTA (PBSE) dialysiert, damit eine 1,5 ml phOx-Sepharose-Säule beladen und die Säule nacheinander mit 100 ml PBS; 100 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,0; 10 ml 50 mM Citrat, pH 5,0; 10 ml 50 mM Citrat, pH 4,0; und 20 ml 50 mM Glycin, pH 3,0 gewaschen. Die scFv-Fragmente wurden mit 50 mM Glycin, pH 2,0 eluiert, mit Tris-Base neutralisiert und gegen PBSE dialysiert. VH-B/Vk-b wurde in einen auf pUC119 basierenden Phagenvektor geklont, der für mit pJM1 identische Signal- und Tag-Sequenzen kodierte, und die Expression bei 30ºC in einer 10 Liter-Kultur von E.coli TG1, der das Phagemid wie in D. de Bellis & I. Schwartz (1980 Nucl. Acid Res. 18, 1311) beinhaltet, induziert. Die geringe Affinität des Klon VH-B/Vk-b machte seine Reinigung auf phOx-Sepharose unmöglich. Daher wurde nach Konzentrierung durch Ultrafiltration (Filtron, Flowgen) der Überstand (100 ml von 600 ml) auf eine 1 ml Säule mit an Protein A-Sepharose gekuppeltem (E. Harlow & D. Lane, s.o.) monoklonalen Antikörper 9E10 (Evan, G. I. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3610-3616, 1985), der die Peptidmarkierung erkennt, aufgebracht. Die Säule wurde mit 200 ml PBS und 50 ml PBS, 0,5 MNaCl gewaschen. Die scFv-Fragmente wurden mit 100 ml 0,2 M Glycin, pH 3,0, eluiert, wobei die Neutralisierung und Dialyse wie zuvor erfolgten.
- Der Kd (1,0 ± 0,2 · 10&supmin;&sup8; M) für den Klon VH-B/Vk-d wurde durch Fluoreszenzquerichtitration mit 4-E-Aminobuttersäuremethylen-2-phenyl-oxazol-5-on (phOx-GABA Co. Makela et al., 1978, s.o.) bestimmt. Die Anregung erfolgte bei 280 nm, die Emmision wurde bei 340 nm überwacht und der Kd berechnet. Der Kd des Klons VH-BNk-b mit niedriger Affinität wurde mit 1,8 ± 0,3 · 10&supmin;&sup5; M bestimmt (nicht gezeigt). Um die durch die Absorption aufgrund der höheren Konzentrationen von phOx-GABA erforderliche Lichtmenge zu minimieren, erfolgte die Anregung bei 260 nm und die Überwachung der Emission bei 304 nm. Zusätzlich wurden die Fluoreszenzwerte durch jene aus einer parallelen Titration des Lysozym-bindenden Fragments D1.3 dividiert. Der Wert wurde wie in H. N. Eisen Meth. Med. Res. 10, 115-121, 1964 berechnet. Ein Gemisch der Klone VH-B/Vk-b und VH-B/Vk-d, 7 · 10¹&sup0; TU Phagen im Verhältnis 20 VH-B/Vk-b : 1 VH- B/Vk-d, wurde in 10 ml PBS auf die phOx-BSA-Sepharose-Säule aufgebracht und wie oben eluiert. Die eluierten Phagen wurde verwendet, um E.coli TG1 erneut zu infizieren, und die Phagen hergestellt und wie zuvor geerntet. Etwa 10¹¹ TU Phagen wurden auf eine zweite Affinitätssäule aufgebracht und der Vorgang wiederholt, um gesamt drei Säulendurchgänge zu erhalten. Verdünnungen der eluierten Phagen wurden auf jeder Stufe doppelt ausplattiert und getrennt mit für Vk-b (5'-GAG CGG GTA ACC ACT GTA CT) oder Vk-d (5'-GAA TGG TAT AGT ACT ACC CT) spezifischen Oligonucleotid-Sonden untersucht. Nach diesen zwei Runden waren im wesentlichen alle eluierten Phagen VH-BNk-d (Tabelle 3). Daher können Phagenantikörper auf der Basis der Antigenaffinität des präsentierten Antikörpers selektiert werden.
- Das Phagemid pHEN1 (Fig. 23) ist ein Derivat von pUC119 (Vieira,). & Messing, J. Methods Enzymol 153, S. 3-11, 1987). Die Kodierregion von g3p aus fdCAT2 wurde durch PCR, unter Verwendung der Primer G3FUF0 und G3FUBA (weiter unten gezeigt) (die EcoRI- bzw. HindIII-Stellen enthalten), amplifiziert, und als HindIII-EcoRI-Fragment in pUC119 kloniert. Das HindIII-NotI-Fragment, das für die g3p-Signalsequenz kodiert, wurde durch ein pelB-Signalpeptid (Better, M. et al., Science 240, 1041-1043, 1988) mit einer internen SfiI-Stelle ersetzt, was die Klonierung von Antikörpergenen as SfiI-NotI- Fragmente ermöglicht. Eine Peptidmarkierung, c-myc, (Munro, S. & Pelham, H., Cell 46, 291-300, 1986) wurden direkt nach der NotI-Stelle durch Klonieren einer Oligonucleotid-Kassette eingebracht, und darauffolgend ein "Amber"-Codon durch Stellen-gerichtete Mutagenese unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham International) eingebracht (Fig. 23b).
- Ein Bereich von Konstrukten (siehe Fig. 24) wurde aus einem Klon (im wesentlichen Konstrukt II in pUC19) hergestellt, der zur Expression eines löslichen Fab-Fragments (Better et al., 199, s.o.) aus dem Anti-phOx (2-Phenyl-5-oxazolon)-Antikörper NQ- 10.12.5 (Griffiths, G. M. et al., Nature 312, 271-275, 1984) in Bakterien konstruiert war. Im Konstrukt II stammen die V-Regionen aus NQ10.12.5 und sind an menschlichen Ck- und CH1- (γ1-Isotyp) Konstantdomänen befestigt. Die C-terminalen Cysteinreste, die normalerweise zwischen den leichten und schweren Ketten des Antikörpers eine kovalente Bindung bilden, sind aus beiden Konstantdomänen gelöscht worden. Um die Gene der schweren und leichten Ketten zusammen als Fab-Fragmente (Konstrukt II) oder als getrennte Ketten (Konstrukte III und IV) zur Phagenpräsentation zu klonen, wurde DNA aus dem Konstrukt II durch PCR amplifiziert, um eine NotI-Restriktionsstelle am 3'-Ende und entweder eine ApaLI-Stelle (zum Klonieren in fdCAT2) oder eine SfiI-Stelle (zum Klonieren in pHEN1) einzubringen. Die Primer FABNOTFOK mit VH1BACKAPA (oder VH1 BACKSF115) wurden zur PCR-Amplifikation von Genen, die für Fab-Fragmente (Konstrukt II) kodieren, verwendet, die Primer FABNOTFOH mit VH1 BACKAPA (oder VH1BACKSF115) für schwere Ketten (Konstrukt III), und die Primer FABNOTFOK und MVKBAAPA (oder MVKBASFI) für leichte Ketten (Konstrukt IV).
- Die Einzelketten-Fv-Version von NQ10.12.5 (Konstrukt I) weist die variablen Domänen der schweren (VH) und der leichten Kette (Vakuum) durch einen flexiblen Linker (Gly&sub4;Ser)&sub3; (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 5879-5883, 1988) verbunden auf und diese wurde aus Konstrukt II durch "Spleißen durch überlappende Erweiterung" wie in Beispiel 12 konstruiert. Die assemblierten Gene wurden mit den Primern VK3F2NOT und VH1BACKAPA (oderVH1BACKSF115) erneut amplifiziert, um Restriktionsstellen zum Klonieren in fd-CAT2 (ApaLI-NotI) onder pHEN1 (SfiI-NotI) anzuhängen.
- Restriktionsstellen sind unterstrichen.
- Die Konstrukte I-IV (Fig. 24) wurden sowohl in fd-CAT2 als auch in pHEN1 eingebracht. Der Phage fd-CAT2 (und fd-CAT2-I, II, III oder IV) wurden aus dem Überstand von infiziertem E.coli TG1, nachdem diese über Nacht bei 37ºC in 2xTY-Medium mit 12,5 ug/ml Tetracyclin geschüttelt wurden, entnommen und direkt im ELISA verwendet. Das Phagemid pHEN1 (und pHEN1-I und II) in E.coli TG1 (supE) wurden über Nacht in 2 ml 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose (ohne Glucose verhindert die Expression von g3p die spätere Superinfektion durch den Helferphagen) gezüchtet. 10 ul des Überstandes wurden verwendet, um 2 ml 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose zu beimpfen, und diese wurden bei 37ºC 1 Stunde geschüttelt. Die Zellen wurden gewaschen, und in 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin erneut suspendiert und die Phagemidteilchen durch die Zugabe von 2 ul (10&sup8; pfu) VCSM13-Helferphagen (Stratagene) wiederhergestellt. Nach einstündigem Wachstum wurden 4 ul Kanamycin (25 mg/ml) zugegeben und die Kultur über Nacht wachsen gelassen. Die Phagemidteilchen wurden mittels Fällung mit Polyethylenglykol für den ELISA 10fach konzentriert.
- Die Detektion der Phagenbindung an 2-Phenyl-5-oxazolon (phOx) wurde wie in Beispiel 9 durchgeführt. 96-Napf-Platten wurden mit 10 ug/ml phOx-BSA oder mit 10 ug/ml BSA in PBS über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet, und mit PBSS, die 2% Magermilchpulver enthält, blockiert. Phagen (Phagemid)-Überstand (50 ul), der mit 50 ul 4% Magermilchpulver enthaltender PBS vermischt war, wurde den Näpfen zugegeben und untersucht. Um die Bindung der löslichen scFv- oder Fab-Fragmente, die aus pHEN1 ausgeschieden werden, nachzuweisen, wurde die c-myc-Peptidmarkierung, das von Munro und Pelham 1986, s.o., beschrieben wurde, unter Verwendung des monoklonalen Antimyc 9-E10 (Evan, G. I. et al., Mol. Cell. Biologisch. 5, 3610-3616, 1985) detektiert, gefolgt von der Detektion mit an Peroxidase konjugiertem Anti-Maus-Ziegenimmunglobulin. Die anderen Details waren wie in Beispiel 9.
- Die Konstrukte in fdCAT2 und pHEN1 präsentieren Antikörperfragmente auf der Oberfläche von filamentösen Phagen. Der Phagenvektor, fd-CAT2 (Fig. 8) basiert auf dem Vektor fd-tet (Zacher, A. N. et al., Gen 9, 127-140, 1980) und weist Restriktionsstellen (ApaLI und NotI) zum Klonieren von Antikörpergenen (oder anderen Proteingenen) zur Expression als Fusionen mit dem N-Terminus des Phagenhüllenproteins g3p auf. Die Transkription der Antikörper-g3p-Fusionen in fd-CAT2 wird vom Gen III-Promotor gesteuert, und das Fusionsprotein aufgrund des g3p-Leaders in das Periplasma gelenkt. Es wurde durch ELISA (Tabelle 4) gezeigt, daß Fab- und scFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Präsentation in fd-CAT2 kloniert wurden, sich an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden. Es wurde angenommen, daß sich die Phagen binden, wenn die A405 der Probe zumindest 10fach höher war als der Hintergrund im ELISA.
- Der Phagemidvektor, pHEN1 (Fig. 23) basiert auf pUC119 und enthält Restriktionsstellen (SfiI und NotI) zum Klonieren der Fusionsproteine. Hier wird die Transkription der Antikörper-g3p-Fusionen vom induzierbaren IacZ-Promotor gesteuert und das Fusionsprotein aufgrund des pelB-Leaders in das Periplasma gelenkt. Das Phagemid wurde mit dem VCSM13-Helferphagen in 2xTY-Medium ohne Glucose oder IPTG wiederhergestellt: unter diesen Bedingungen gibt es eine ausreichende Expression des Antikörperg3p. Es wurde mittels ELISA (Tabelle 4) gezeigt, daß Fab- und scFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Präsentation in pHEN1 kloniert wurden, sich an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden, wobei dasselbe Kriterium wie oben verwendet wurde.
- Eine alternative Methodik zur Herstellung von Bilbiotheken von Fab-Fragmenten, die auf der Oberfläche des Phagen exprimiert sind, wäre folgende:
- 1. Herstellen einer Bibliothek von Phagen, die Schwerketten (VHCH)-Gene exprimieren, aus Inserts im Phagengenom.
- 2. Herstelllen einer Bibliothek von Leichtkettengenen in einem Plasmidexpressionsvektor in E.coli, vorzugsweise einem Phagemid, und Isolieren der löslichen Protein-Leichtketten, die aus dieser Bibliothek exprimiert werden.
- 3. Binden der löslichen Protein-Leichtketten aus der Bibliothek an die auf Phagen präsentierte Schwerketten-Bibliothek.
- 4. Selektieren von Phagen mit den gewünschten Eigenschaften bezüglich Affinität und Spezifität.
- 5. Isolieren der Leichtketten-Gene, die für Leichtketten kodieren, die geeignete Antigenbindungsstellen bilden, in Kombination mit den gewählten Schwerketten, vorzugsweise unter Einsatz von Bakterien-Superinfectin, das Phagemid enthält, das die Leichtkette exprimiert, mit Phagen, die die ausgewählte Schwerkette exprimieren (wie in Beispiel 20 beschrieben) und dann das Testen bezüglich Antigenbindung.
- Bei zufälligen kombinatorischen Bibliotheken gibt es aufgrund der Transformationseffizienz bakterieller Zellen eine Beschränkung der potentiellen Vielfat präsentierter Fab- Fragmente. Hier wird eine Strategie (duale kombinatorische Bibliotheken) beschrieben, die die Anzahl an überprüften Phagen um einen Faktor von 10&sup7; erhöht.
- Zur Assemblierung von Schwer- und Leichtketten-Expressionsprodukten aus verschiedenen Vektoren wurde Phagemid (pHEN1-III oder IV) in E.coli HB2151 (einem Nicht-Suppressor-Stamm) gezüchtet, um die Produktion löslicher Ketten zu ermöglichen, und wie oben (Beispiel 23) gewonnen, mit der Ausnahme, daß Helfer-Phagen, die Partnerketten als Fusionen zu g3p (10&sup9; Tu fd-CAT2-IV bzw. III) exprimieren, und 2 ul Tetracyclin (12,5 mg/ml) anstelle von Kanamycin verwendet wurden.
- Für die Schwer- und Leichtketten von Fab-Fragmenten kann gemeinsam in demselben Vektor (Beispiel 21) oder in unterschiedlichen Vektoren kodiert werden. Um das zu zeigen, wurde diese Schwerkette (Konstrukt III) in pHEN1 (um lösliche Fragmente bereitzustellen), und die Leichtkette (Konstrukt IV) in fd-CAT2 (um die Fusion mit g3p zu erzeugen) kloniert. Das in E.coli HB2151 (Nicht-Supressor) gezüchtete Phagemid pHEN1-III wurde mit fd-CAT2-IV-Phage und Phage(mid) gewonnen, von dem gezeigt wurde, daß er bzw. es sich an phOx: BSA, nicht aber an BSA bindet (Tabelle 4). Das zeigt, daß die lösliche Leichtkette korrekt mit der am g3p verankerten Schwerkette assoziiert wird, da weder Schwerkette noch Leichtkette allein Antigen bindet (Tabelle 4).
- Ähnliche Ergebnisse wurden im umgekehrten Versuch (mit Phagemid pHEN-1-IV und fd-CAT2-III-Phage) erzielt, bei dem die Schwerkette als ein lösliches Molekül erzeugt und die Leichtkette an g3p verankert wurde (Tabelle 4). So wird ein Fab-Fragment an der Phagenoberfläche durch Fesion von Schwer- oder Leichtkette an g3p assembliert, mit der Maßgabe, daß die andere Kette unter Verwendung des gleichen oder eines anderen Vektors sekretiert wird (Fig. 25).
- Die resultierende Phagenpopulation ist ein Gemisch aus Phage und wiederhergestelltem Phagemid. Das Verhältnis zwischen den beiden Teilchen-Typen wurde durch Infizieren von log-Phasen-E.coli TG1 und Ausplattieren auf TYE-Platten entweder mit 15 ug/ml Tetracyclin (um bezüglich fd-CAT2 zu selektieren) oder 100 ug/ml Ampicillin (um bezüglich pHEN1 zu selektieren) bewertet. Der Titer von fd-CAT2-Phage war 5 · 10¹ TE/ml, und der Titer von pHEN1 2 · 10¹&sup0; war TE/ml, was auf ein Packungsverhältnis von 25 Phagen pro Phagemid hinweist.
- Hier gezeigt wird eine alternative Strategie, die die Präsentation des heterodimeren Antikörper Fab-Fragments auf der Oberfläche von Phagen umfaßt. Eine der Ketten wird an g3p fusioniert, und die andere wird in löslicher Form in den periplasmischen Raum von E.coli sekretiert, wo sie sich nicht-kovalent mit der g3p-Fusion assoziiert, und bindet sich spezifisch an Antigen. Entweder die Leicht- oder die Schwerkette kann an g3p fusioniert werden: sie werden auf dem Phagen als Fab-Fragmente präsentiert und binden Antigen (Fig. 25). Beschreiben werden sowohl Phagen- als auch Phagemid-Vektoren zur Oberflächen-Präsentation. Phagemid- sind Phagen-Vektoren vermutlich überlegen, was die Schaffung großer Phagenpräsentationsbibliotheken betrifft. Besonders in Hinblick auf ihre höheren Transfektionseffizienzen (zwei bis drei Größenordnungen darüber), was die Konstruktion größerer Bibliotheken ermöglicht. Der Phagemidvektor, pHEN1, ermöglicht auch die Expression löslicher Fab-Fragmente in Nicht-Suppressor E.coli.
- Hier ebenfalls gezeigt wird, daß Schwer- und Leichtketten, für die auf demselben Vektor (Konstrukt II) oder auf verschiedenen Vektoren (Konstrukte III und IV) kodiert wird, als Fab-Fragmente präsentiert werden können. Das ermöglicht zwei verschiedene Arten der Bildung zufälliger kombinatorischer Bibliotheken für die Präsentation. Bibliotheken von Schwer- und Leichtkettengenen, die durch PCR amplifiziert sind, können zufällig durch ein "PCR-Assemblierungs"-Verfahren (Beispiel 12) verbunden werden, das auf "Spleißen durch Überlappungsverlängerung" basiert, in Phage(mid)-Präsentationsvektoren kloniert und aus demselben Promotor als Teil des gleichen Transkripts wie oben (Kosntrukt' II) exprimiert werden, oder tatsächlich aus verschiedenen Promotoren als getrennte Transkripte. Hier kodiert und präsentiert der Phage(mid)-Vektor beide Ketten. Bei einer kombinatorische Bibliothek aus 10&sup7; Schwerketten und 10&sup7; Leichtketten ist die potentielle Vielfalt der präsentierten Fab-Fragmente (10¹&sup4;) durch die Transfektionseffizienz bakterieller Zellen durch den Vektor begrenzt (bestenfalls etwa 10&sup9; Klone pro ug an geschnittenem und ligiertem Plasmid) (W. J. Dower et al., Nucl. Acids. Res. 16 6127-6145, 1988). So hergestellte Bibliotheken sind zu dem von W. D. Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989) beschriebenen Verfahren der zufälligen kombinatorischen Bibliothek analog, weisen aber das wichtige zusätzliche Merkmal auf, daß Präsentation auf der Oberfläche von Phagen ein wirkungsvolles Verfahren zum Selektieren von Antikörper- Spezifitäten aus der großen Anzahl erzeugter Klone ergibt.
- Alternativ dazu können Bibliotheken aus Schwer- und Leichtketten zur Expression in die gleiche Zelle in unterschiedliche Vektoren kloniert werden, wobei ein Phagenvektor für die g3p-Fusion kodiert und ein Phgemid für die lösliche Kette kodiert. Der Phage wirkt als Hefer, und die infizierten Bakterien erzeugten sowohl gepackten Phagen als auch Phagemid. Jeder Phage oder jedes Phagemid präsentiert beide Ketten, kodiert aber nur für eine Kette, und daher nur für die genetische Information für die Häflte des Antigen- Bindestelle. Die Gene für beide Antikörperketten können jedoch durch Ausplattieren auf dem selektiven Medium getrennt gewonnen werden, was ein Mittel nahelegt, durch das zueinander komplementäre Paare von Antigenbindungs- Schwer- und -Leichtketten- Kombinationen aus zufälligen kombinatorischen Bibliotheken selektiert werden könnten. Beispielsweise kann ein Leichtketten-Repertoire auf fd-Phagen verwendet werden, um Zellen zu infizieren, die eine Bibliothek löslicher Schwerketten auf dem Phagemid umfassen. Die Affinitäts-gereinigte Phagemid-Bibliothek kann dann verwendet werden, um E.coli zu infizieren, mit der Affinitäts-gereinigten Phagen-Bibliothek ergänzt wurden, und die neue kombinatorische Bibliothek einer weiteren Selektionsrunde unterzogen werden. So werden Antikörper-Schwer- und -Leichtketten-Gene nach jeder Reinigungsrunde neugeordnet. Schließlich können nach merheren Runden infizierte Bakterien ausplattiert und einzeln auf Antigen-bindenden Phagen gescreent werden. Derartige "duale" kombinatorische Bibliotheken sind potentiell vielfältiger als jene, für die auf einem einzigen Vektor kodiert wird. Durch die Kombination getrennter Bibliotheken von 10&sup7; Leichtketten-Phage(mid)en, ist die Vielfalt präsentierter Fab-Fragmente (potentiell 10¹&sup4;) nur durch die Anzahl an Bakterien (10¹² pro Liter) begrenzt. Einfacher sollte die Verwendung von zwei Vektoren auch die Konstruktion "hierarchischer" Bibliotheken erleichtem, in denen eine fixierte Schwer- oder Leichtkette mit einer Bibliothek oder Partnern gepaart ist (Beispiel 18), was ein Mittel zur "Feinabstimmung" von Antikörper-Affinität und -Spezifität darstellt.
- Weitere Untersuchungen der Antikörper, die auf der Oberfläche des Phagen exprimiert wurden, würden sehr erleichtert werden, wenn es einfach ist, zur Expression in Lösung umzuschalten.
- E.coli HB2151 wurde mit pHEN-Phagemid (pHEN1-I oder -II) infiziert und auf YTE-Platten mit 100 ug/ml Ampicillin ausplattiert. Kolonien wurden bei 37ºC in 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose bis zu einer optischen Dichte von OD&sub5;&sub5;&sub0; = 0,5-1,0 geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, einmal in 2xTY-Medium gewaschen, in Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) erneut suspendiert und weiter 16 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand, der die sekretierten Ketten enthält, direkt im ELISA verwendet.
- Das Phagemid pHEN1 hat gegenüber dem Phagen fd-CAT2 den Vorteil, daß der Antikörper enweder zur Phagenpräsentation (durch Wachstum in supE-Stämmen von E.coli) oder als mit einer Markierung markiertes lösliches Fragment (durch Wachstum in Nicht- Suppressor-Stämmen) hergestellt werden kann, da eine Peptidmarkierung (Beispiel 20) und ein "Amber"-Codon zwischen den Antikörper und g3p eingebracht wurde. Die Sekretion von löslichen Fab-Fragmenten aus pHEN1-II oder von scFv-Fragmenten aus pHEN1-I wurde nach Wachstum in E.coli HB2151 und Induktion mit IPTG mittels Western-Blots nachgewiesen. Zur Detektion der ausgeschiedenen Proteine wurden 10 ul Überstand von induzierten Kulturen einer SDS-PAGE unterzogen und die Proteine durch Elektroblotten auf lmmobilon-P (Millipore) übertragen. Lösliche leichte und schwere Ketten wurden mit polyklonalem anti-menschlicher Fab-Antiserum aus Ziegen und mit an Peroxidase konjugiertem Anti-Ziegen-Immunglobulin aus Kaninchen (jeweils in einer Verdünnung von 1 : 1000) nachgewiesen. Die mit dem Anhängsel versehene VK-Domäne wurde mit 9E10-Antikörper (1 : 1000) und an mit an Peroxidase konjugiertem Anti- Maus-Immunglobulin aus Kaninchen (für Fc spezifisch) (1 : 1000) (Sigma) oder mit einem mit einer Peroxidase markiertem anti-menschlicher CK-Antiserum (Dako) detektiert. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma) wurde als Peroxidase-Substrat verwendet (Harlow, E. et al., 1988, s.o.). Mit scFv wurden die Fragmente unter Verwendung des 9E10 Antimyc tag-Antikörpers detektiert (keine Daten gezeigt). Mit Fab wurden, wie erwartet, nur die leichten Ketten durch 9E10 (oder anti-menschlicher CK)-Antikörper nachgewiesen, während das anti-menschlicher Fab-Antiserum sowohl schwere als auch leichte Ketten detektierte. Die Bindung der löslichen scFv- und Fab-Fragmente an phOx-BSA (aber nicht an BSA) wurde ebenfalls mittels ELISA (Tabelle 4B) gezeigt. Somit können scFv- und Fab-Fragmente auf Phagen präsentiert werden oder als lösliche Fragmente aus demselben Phagemidvektor sekretiert werden.
- Prinzipiell sollte die Verwendung von Phagenantikörpern die Durchführung von empfindlicheren Immungssays als mit löslichen Antikörpern ermöglichen. Phagenantikörper kombinieren die Fähigkeit ein spezifisches Antigen zu binden mit der Möglichkeit zur Amplifikation durch das Vorhandensein vielfacher (etwa 2800) Kopien des Haupthüllenproteins (g8p) auf jedem Virion. Dies würde die Befestigung einiger Antikörpermoleküle, die gegen M13 gerichtet sind, an jedem Virion, gefolgt von der Befestigung einiger Moleküle von an Peroxidase konjugiertem Anti-species-Antikörper (Anti-Schaf-IgG im unteren Fall), ermöglichen. Somit gibt es für jeden Phagenantikörper, der an Antigen gebunden ist, die Möglichkeit einige Peroxidasemoleküle zu befestigen, wohingegen bei der Verwendung eines löslichen Antikörpers als primärer Antikörper diese Amplifikation nicht stattfindet.
- ELISA-Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Verwendung von 200 ul von 10fach-Verdünnungen des Hühnereilysozyms (1000, 100, 10, 1, 0,1 und 0,01 ug/- ml) in 50 mM NaHCO&sub3;, pH 9,6 beschichtet. Der ELISA wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, außer daß (i) die Inkubation mit Anti-Lysozym-Antikörper entweder mit FDTscFvD1.3 (pAb; 1011 Phagen pro Napf; 1,6 nMol) oder mit Affinitäts-gereinigtem scFvD1.3 (18 ug pro Napf; 0,7 nMol) erfolgte; (ii) die Inkubation mit dem zweiten Antikörper mit einer 1/100-Verdünnung von Anti-M13-Schafsserum für FDTscFvD1.3-Proben oder mit einer 1/100-Verdünnung von Anti-scFvD1.3-Kaninchenserum (von S. Ward) für lösliche scFvD1.3-Proben erfolgte; (iii) an Peroxidase konjugiertes Anti-Ziegeri-Kaninchenimmunglobulin (Sigma; 1/5000) für FDTscFvD1.3-Proben verwendet wurde und an Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen- Ziegenimmunglobulin (Sigma; 1/5000) für lösliche scFvD1.3-Proben verwendet wurde. Die Absorption bei 405 nm wurde wurde nach 15 Stunden gemessen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 30 und 31 gezeigt. In diesen Figuren sind die zum Beschichten verwendeten Lysozymkonzentrationen auf einer logarithmischen Verdünnungsskala relativ zu 1 ug/ml gezeigt (d. h. log = -3 = 1 mg/ml; log = 2 = 0,01 ug/ml).
- Mit FDTscFvD1.3 wurden bei allen Lysozymkonzentrationen höhere Signale erhalten (Fig. 28), aber der Unterschied war bei den größten Verdünnungen, wo die Antigenquantitäten am meisten limitierend sind (Fig. 27 und 28), sehr deutlich. Dies läßt vermuten, daß die Phagenantikörper für Assays vom Sandwichtyp, wo das Einfangen von geringen Antigenmengen durch den primären Antikörper ein amplifiziertes Signal erzeugt, besonders wertvoll sein können, wenn die Phagenantikörper, die gegen ein unterschiedliches Epitop gerichtet sind, als der zweite Antigen-bindende Antikörper verwendet werden.
- Das Prinzip ist jenem in Beispiel 12 beschriebenen sehr ähnlich. Es besteht aus der PCR-Assemblierung von Einzelketten-Antikörpern aus cDNA, die aus Monoklonalen aus Mäuse hergestellt wurde. Als Beispiel wird die Ergänzung und Expression zweier solcher Antikörper aus Monoklonalen, die Antikörper gegen das Steroidhormon Östriol exprimieren, beschrieben.
- RNA kann mit vielen im Fachgebiet gut bekannten Verfahren isoliert werden. In diesem Beispiel ergab die Verwendung von Triton X-100-Lyse, Phenol/SDS-RNase-lnaktivierung hervorragende Ergebnisse.
- 1. Die hier verwendeten monoklonalen Mäusezellen waren durch Zentrifugation geerntet worden und in Serumfreiem Medium erneut suspendiert worden. Sie wurden dann zentrifugiert und in Salzlösung erneut suspendiert und nach einem abschließenden Zentrifugationsschritt in sterilem Wasser bei 1 · 10&sup7; Zellen pro ml erneut suspendiert. (Normalerweise würden die Zellen in PBS-Puffer gewaschen und abschließend erneut suspendiert werden, aber diese speziellen Zellen wurden an die Anmelder, wie beschrieben, in Wasser gefroren geliefert).
- 2. Zu 750 ul Zellen wurden 250 ul eiskalter 4xLysepuffer (40 mM Tris-HCl ph 7,4/4 mM MgCl&sub2;/600 mM NaCl/40 mM VRC (Veronyl-Ribosyl-Komplex)/2% Triton X-100) zugegeben. IDie Suspension wurde gut vermischt und auf Eis 5 Minuten stehen gelassen.
- 3. Die Zentrifugation erfolgte bei 4ºC in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten lang bei 13.000 U/min.
- Der Überstand wird dann dreimal mit Phenol, dreimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und und schließlich wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben mit Ethanol gefäillt. Der Niederschlag wird in 50 ul Wasser erneut suspendiert.
- 4. Die optische Dichte der RNA bei 260 nm wurde mit einer 2,5 ul-Probe in 1 ml Wasser gemessen. Die RNA wurde durch Elektrophorese einer 2 ug-Probe auf einem 1%- Agarosegel überprüft. RNA im Bereich von 32 ug bis 42 ug wurde durch dieses Verfahren erhalten.
- Das verwendete Verfahren ist das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene. Zwei cDNA-Herstellungen wurden durchgeführt. Diese erfolgten aus RNA, die aus den Monoklonalen, die als Zelllinien 013 und 014 bekannt sind, wobei beide Antikörper gegen das Steroidhormon Östriol exprimieren.
- Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 14 beschriebene. Die VH-Region wurde mit den Primern VH1 BACK und VH1 FOR-2 amplifiziert. Für die κ-Region wurden vier getrennte Reaktionen unter Verwendung des Primers VK2BACK und mit MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX oder MJK5FONX durchgeführt. Die Proben (5 ul) wurden auf einem 1,5%-Agarosegel überprüft. Dabei wurde beobachtet, daß für cDNA, die aus den zwei Östriol-Monoklonalen hergestellt wurde, die Primer VK2BACK und MJK1 FONX die beste Amplifikation der V-κ-Region ergaben. Die VH-Banden und die V-κ-Banden, die mit VK2BACK/MJK1FONX amplifiziert wurden, wurden auf 2%-Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt für alle Monoklonalen gereinigt. Die DNA-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines dafür vorgesehenen Geneclean Sets wie in Beispiel 121 gereinigt.
- Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 12 beschriebene. In diesem Fall wurde die amplifizierte Linker-DNA auf einem 2% -Agarosegel gereinigt und aus dem Gel mit einem dafür vorgesehenen "Mermaid"-Set (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA) gemäß den Herstellerangaben gewonnen.
- Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 12 beschriebene. In diesem Fall wurde das assemblierte PCR-Produkt auf einem 2% -Agarosegel gereinigt und aus dem Gel mit einem dafür vorgesehenen "Mermaid"-Set gewonnen.
- Das assemblierte Produkt wurde mit ApaLI- und NotI-Restriktionsstellen "markiert" bzw. an den Enden versehen. Die DNA wurde dann mit ApaLI und NotI gespalten, um adhäsive Enden zum Klonierenzu bilden, und dann auf einem 2%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und unter Verwendung eines Geneclean Sets extrahiert. Das angewendete Verfahren ist das gleiche wie das in Beispiel 12 beschriebene.
- Die Gesamtmenge von 15 ug mit CsCI gereinigter fd-CAT2-DNA wurde mit 100 Units des Restriktionsenzyms NotI (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 200 ul 1xNEB-NotI-Puffer mit IxNEB-acetyliertem BSA für einen Zeitraum von 3 Stunden bei 37ºC gespalten. Die Vektor-DNA wurden dann zweimal mit 15 ul Strataclean (einem im Handel erhältlichen Harz zur Entfernung von Protein) gemäß den Herstellerangaben (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, California, USA) behandelt. Die DNA wurde dann mit 100 Units des Restriktionsenzyms ApaLI (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 200 ul 1x NEB-Puffer 4 über Nacht bei 37ºC gespalten. Der Vektor wurde dann mit einer Chroma Spin 1000-Säule gemäß den Angaben der Hersteller (Clontech Laboratories Inc. 4030 Fabian way, Palo Alto, California, USA) gereinigt. Dieser Schritt entfernt das ApaLI/NotI-Fragment, um geschnittene Vektor-DNA für eine maximale Ligationseffizienz zu erhalten.
- Die Ligationsreaktionen wurden mit 2,5-10 ng des DNA-Inserts und 10 ng Vektor in einem Gesamtvolumen von 10 ul 1xNEB-Ligasepuffer mit 1 ul NEB-Ligase (New England Biolabs) bei 16ºC über Nacht (etwa 16 Stunden) durchgeführt.
- Der E.coli-Stamm TG1 wurde kompetent gemacht und mit der rekombinanten fdCAT2- DNA wie von Sambrook et al., 1989, s.o., transformiert. Die Zellen wurden auf LBtet- Platten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 15 g Bacto-agar pro Liter mit 15 ug/ul Tetracyclin, die erst kurz vor dem Plattengießen zugegeben werden, ausplattiert und über Nacht wachsen gelassen.
- 10 ml LBtet-Nährlösung (LB-Medium mit 15 ug/ul Tetracyclin) wurden dann in 50 ml Röhrchen mit aus einzelnen Näpfen isolierten Kolonien beimpft. Nach dem Wachstum über Nacht bei 35ºC/350U/min in einer Tischzentrifuge. Die Überstände wurden in 15 ml Zentrifugenröhrchen übertragen und jedem 2 ml 20% PEG 8000/2,5 M NaCl zugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten wurde der rekombinante Phage durch Zentrifugation bei 9000 U/min in einem SM24-Rotor für 30 Minuten pelletiert. Der PEG-Überstand wurde verworfen. Noch verbliebenes PEG wurde mit einer Pasteurpipette nach einem kurzen (2 Minuten) Zentrifugationsschritt entfernt. Dieser letzte Schritt wurde wiederholt, um sicherzugehen, daß kein PEG verbleibt. Das Phagenpellet wurde dann in 500 ul PBS-Puffer erneut suspendiert. Dies wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei 13.000 U/min zentrifugiert, um übriggebliebene Zellen zu entfernen. Der Phagenüberstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen.
- Die Rekombinanten des Bakteriophagen fd wurden auf die Expression eines Antikörpers gegen Östriol mittels ELISA gescreent. Dieses Verfahren ist in Beispiel 6 bechrieben. In diesem Fall sind die folgenden Änderungen relevant:
- 1. Die Mlikrotiterplatten wurden über Nacht mit 40 ug/ml Östriol-6-carboxymethyloxim- BSA (Steraloids, 31 Radcliffe Road, Croydon, CRO 5QJ, England) beschichtet.
- 2. Der erste Antikörper war der mutmaßliche Anti-Östriol-Phagenantikörper. 50 ul Phagen in einem Endvolumen von 200 ul steriler PBS mit 0,25% Gelatine wurden jedem Napfzugegeben.
- 3. Der zweite Antikörper war ein Anti-M13-Schafsantikörper bei einer Verdünnung von 1 : 1000.
- 4. Der dritte Antikörper war an Peroxidase konjugiertes Anti-Ziegen-Kaninchenimmunglobulin.
- Die Rekombinanten, die funktionelle Antikörper exprimieren, wurden durch Inkubation mit dem chromogenen Substrat 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 29 und 30 dargestellt.
- Beispiel 21 zeigte, daß Gene, die für Fab-Fragmente kodieren, in die Vektoren fdCAT2 und pHEN1 subkloniert und die Proteindomänen auf der Oberfläche von Phagen präsentiert werden können, wobei Bindefunktion beibehalten wird. Dieses Beispiel zeigt, daß die VHCH- und VKCK-Domänen getrennt amplifiziert und dann durch einen Linker verbunden werden können, der die Expression der Leichtkette als Gen III-Proteinfusion und des VHCH-Fragments als lösliches Molekül zulässt. Ein funktionelles Fab-Fragment wird dann durch Assoziation dieser Domänen auf Phagen präsentiert. Der in diesem Beispiel beschriebene Vorgang des Assemblierens ist für die Präsentation einer Bibliothek von Fab-Fragmenten erforderlich, die vom Immunrepertoire stammen, wenn innerhalb eines einzelnen Vektors sowohl für Schwer- als auch Leichtketten-Domänen kodiert werden soll.
- Die VHCH1- und VKCK-Domänen eines Konstrukts (Beispiel 21; Konstrukt II und pUC- 19), die von Antikörper NQ10 12.5 stammen, der gegen 2-Phenyl-5-oxazolon gerichtet ist, wurden unter Einsatz von PCR amplifiziert. Zum Klonieren in den Vektor fdCAT2 wurden die Oligonucleotide VH1BACKAPA (Beispiel 21) und HuIgGI-4 CHIFOR (Beispiel 30) verwendet, um die VHCh1-Domänen zu amplifizieren. Zum Klonieren in pHEN1 ersetzte für diese Amplifizierung VH1 BACKSFHS (Beispiel 21) VH1 BACKAPA. Zum Klonieren in beide Vektoren wurden die VKCK-Domänen unter Einsatz von VK2- BACK (Beispiel 21) und CKNOTFOR (Beispiel 30) amplifiziert. Ein Linker-Oligonucleotidfragment, das den Bakteriophgen fd-Gen 8-Termintor und den fd Gen 3-Promotor enthielt, durch Amplifizierung der sie enthaltenden Region aus dem Vektor vdCAT2 durch PCR unter Einsatz der Oligonucleotide hergestellt.
- VK-TERM-FOR
- 5' TGG AGA CTG GGT GAG CTC AAT GTC GGA GTG AGA ATA GAA AGG 3' (überlappend mit VK2BACK [Beispiel 12])
- und
- CH 1-TERM-BACK
- 5' AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT AGC TGA TAA ACC GAT ACA ATT AAA GGC 3' (überlappend mit HuIgG1-4 CH1-FOR)
- Die Assemblierung des Fab-Fragments von den amplifizierten VHCH1- und VKCK-Domänen und des wie oben hergestellten Linkers erfolgte wie in Beispiel 12E beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Primer VH1 BACKAPA (beim Klonieren in fdCAT2) oder VH1BACKSFH5 (beim Klonieren in pHEN1) und CKNOTFOR für die abschließende Reamplifizierung verwendet wurden, wodurch Restriktionsstellen zum Klonieren in fdCAT 2 (Apall-Notl) oder pHEN1 (Sfil-Notl) eingeführt wurden. Das zusammengestellte Fab- Fragment wird in Fig. 31 gezeigt. In Abwesenheit von Linker ist kein assembliertes Produkt festzustellen. Ein nach Beispiel 12 hergestelltes zusammengestelltes scFv wird zum Vergleich gezeigt.
- Phagen-Antikörper wurden wie in Beispiel 21 hergestellt, und ELISA wurde mit Oxazolon als Antigen nach Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse waren für Fab-Fragmente, sowohl in fdCAT2- als auch in pHEN1-Proben kloniert, wie erwartet; Phagen-Teilchen banden sich an Oxazolon, was durch ein positives ELISA-Signal ermittelt wurde.
- Um das Potential des Phagemidkloniersystems vollständig zu verwirklichen, ist ein Helferphage, dem das Gen III fehlt, wünschenswert. Die Ergänzung von Gen III-Fusionen mit einem solchen Helferphagen würde ergeben, daß alle Phagemid-"Nachkommen" eine Gen III-Fusion auf deren Capsid aufweisen, da es keine Konkurrenz mit dem Wildform-Molekül gibt.
- Die Steuerung der Anzahl an Fusionsmolekülen auf jedem Phagen ist besonders nützlich. Beispielsweise kann ein Helferphage, dem das Gen III fehlt, verwendet werden, um Antikörper mit geringer Affinität aus einem nativen Repertoire zu ergänzen, in dem eine hohe Avidität notwendig ist, um jene Phagen zu isolieren, die die korrekte Antikörperspezifität aufweisen. Der nicht mutierte Helferphage kann dann verwendet werden, wenn Versionen mit höherer Affinität konstruiert werden, wodurch die Aviditätskomponente verringert wird und die Selektion rein auf Basis der Affinität ermöglicht wird. Es zeigt sich, daß dies eine überraschenderweise erfolgreiche Strategie zur Isolierung und Affinität reifung von Antikörpern aus nativen Bibliotheken darstellt.
- Die zur Konstruktion des Helferphagen gewählte Vorgehensweise war die teilweise Deletion des Gen III von M13K07 unter Verwendung der Exonuclease Ba131. Phagen, denen das Gen III fehlt, sind jedoch nicht infektiös, daher wurde ein E.coli-Stamm konstruiert, der Gen III exprimiert. M13-Gen III vom Wildtyp wurde mit den Primern gIIIFUFO und gIIIFUBA PCR amplifiziert, genauso wie dies in Beispiel 20 beschrieben ist. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und in einen mit EcoRI und Hind- III geschnittenen pUC19 (kein Phagemid, da ihm der Ursprung der SS-DNA- Replikation des filamentösen Phagen fehlt) unter der Steuerung des lac-Promotors insertiert. Das Plasmid wurde in E.coli TG1 transformiert und der resultierende Stamm mit TG1/pUC- 19gIII bezeichnet. Dieser Stamm stellt dem Helferphagen gIII-Protein in trans bereit.
- Es gibt in M13K07 eine einzelne, einzigartige BamHI-Stelle, die sich etwa in der Mitte von gIII befindet. Doppelsträngige M13K07-DNA wurde durch alkalische Lyse und CsCI-Zentrifugation (Sambrook et al., 1989, s.o.) isoliert; 20 ug DNA wurden mit BamHI geschnitten, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, dann in 50 ul Bal31-Puffer (600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2; und 1 mM EDTA) erneut suspendiert und 4 Minuten lang mit 1 Unit Ba131 (New England Biolabs) gespalten. Diese Behandlung entfernt etwa 1 Kb DNA. EGTA wurde auf 20 mM zugegeben und die Reaktionslösung mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, bevor die Reinigung des geschnittenen Genoms auf einem Agarosegel erfolgte. Die DNA wurde mit Klenow-Enzym repariert und mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit sich selbst ligiert.
- Aliquoten der Ligationsreaktionslösung wurden in kompetente TG1/pUC19gIII-Zellen transformiert und auf SOB-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin ausplattiert. Die Kolonien wurden auf das Vorhandensein einer Deletion mittels PCR mit den Primern gIIIFUBA und KSJ12 (CGGAATACCCAAAAGAACTGG) gescreent.
- KSJ12 anneliert an Gen VI, das sich unmittelbar stromabwärts von gilT im Phagengenom befindet, wodurch sich gilT auf dem Helferphagen von jenem, das auf dem Plasmid resident ist, unterscheidet. Drei Klone ergaben geschnittene PCR-Produkte, die Deletionen von etwa 200, 400 und 800 bp entsprechen. Diese Klone wurden mit M13K07 gIIIΔNr. 1, 2 bzw. 3 bezeichnet. Keine Klone wurden von den früheren Bal 31-Zeitpunkten erhalten, was vermuten läßt, daß diese auf irgendeine Art für die Wirtszelle tödlich sind. Einige Klone wurden von späteren Zeitpunkten isoliert, aber keiner von diesen ergab ein PCR-Produkt, was anzeigt, daß die Deletionsreaktion zu weit fortgeschritten war.
- M13K07 gIIIΔNr.1, 2 und 3 wurden kultiviert und die resultierenden Helferphagen auf ihre Fähigkeit, eine Antikörper-gilT-Fusion (scFv D1.3) zu ergänzen, mittels ELISA untersucht, genau wie dies in Beispiel 14 beschrieben wurde. Wie in Fig. 32 gezeigt ist, wurde nur ein Klon M13K07 gIIIΔNr.3 gefunden, der den Antikörper gut wiederherstellte; das Signal mit diesem Helferphagen war stärker als jenes mit dem ursprünglichen M1307. Mit M13K07 gIIIΔNr.3 wiederhergestellte Phagemide sollten eine viel höhere Dichte von Antikörperfusionen auf ihren Oberflächen aufweisen. Es wurde gezeigt, daß dies wirklich der Fall ist, indem der in diesem ELISA verwendete Phage durch Western- Blotten mit Anti-gilT Protein-Antiserum analysiert wurde (Fig. 33). Diese Analyse ermöglicht eine Abschätzung der Menge an glil-Fusionsprotein gegenüber dem freien gIII-Protein, das auf den Phagen(Phagemid)-teilchen vorhanden ist.
- Nur eine Minutenfraktion des glil-Proteins auf dem mit M1307 wiederhergestelltem Material ist als intakte Fusion vorhanden (Fig. 33). Die Fusionsproteinbande wird durch IPTG induziert, sie ist daher unbestreitbar die durch das Phagemid synthetisierte. Wie erwartet, herrscht gIII-Protein vom Wildtyp mit einer kleineren Kopienanzahl und von einem schwächeren Promotor gesteuert vor, sogar wenn die durch den lac-Promotor gesteuerte gull-Fusionsproteinsynthese voll induziert ist (100 uM IPTG). Dies steht im Gegensatz zu dem Muster, das durch denselben mit M13K07 gIIIΔNr.3 ergänzten Klon gebildet wurde, und zu dem Muster, das durch fd CAT2-scFv D1.3 gebildet wurde. In diesen beiden letzteren Fällen gibt es keine Konkurrenz mit dem gIII der Wildform und die Fusionsproteinbande ist entsprechend stärker.
- Es ist bemerkenswert, daß die Konstruktion von M13K07 gIIIΔNr.3 sehr uneffizient war: ein Klon aus 20 ug Ausgangs-DNA. Darüberhinaus ist die Ausbeute von gIII-Helferphagen aus Über-Nacht-Kulturen mit etwa 106 cfu/ml extrem klein, verglichen mit etwa 10¹¹ cfu/ml für den ursprünglichen Phagen. Abgesehen davon ergänzt M13K07 gIIIΔ- Nr. 3 das Phagemid ebenso wie den ursprünglichen Phagen, wie durch die Anzahl der Phagemidpartikel, die nach dem Wachstum über Nacht hergestellt wurden, festgestellt werden kann. Dies deutet darauf hin, daß die trans-Replikation und die Verpackungsfunktionen des Helferphagen intakt sind und läßt vermuten, daß seine eigene Replikation defekt ist. Daher kann es sein, daß die Inaktivierung von gIII normalerweise toxisch für die Nirtszelle ist und daß M13K07 gIIIΔNr.3 aufgrund einer kompensierenden Mutation, die z. B. die Replikation betrifft, isoliert wurde. Der Phage fd-tet ist dahingehend ungewöhnlich, daß er Mutationen in Strukturgenen toleriert, die normalerweise für die Wirtszelle tödlich sind, da er einen Replikationsdefekt aufweist, der die Akkumulierung von toxischen Phagenprodukten verlangsamt; M13K07 gIIIΔNr.3 könnte ebenfalls einen solchen Defekt aufweisen.
- M13K07 gIIIΔNr.3 wurde am 28. Juni 1991 gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NN9 6HT, UK (Zugangsnr. NCTC 12478) hinterlegt. Er enthält eine Deletion des M13-Genoms von den Basen 1979 bis inklusive 2768 (siehe Van Wezenbeek, P. G. M. F. et al., Gene II, S. 129-148, 1980 für die DNA-Sequenz des M13-Genoms).
- Zur Isolierung eines Antikörpers mit einer gewünscht hohen Affinität ist es notwendig, einen Antikörper mit einer Affinität, die nur um ein geringes Vielfaches höher ist als der Rest der Population, auswählen zu können. Dies ist insbesondere wichtig, wenn ein Antikörper mit einer nicht ausreichenden Affinität z. B. aus einem Repertoire, das aus einem immunisierten Tier stammt, isoliert wurde, und die statistische Mutagenese verwendet wird, um Derivate mit möglicherweise erhöhter Affinität herzustellen. In diesem Beispiel wurden Gemische von Phagen, die Antikörper mit verschiedenen Affinität, die gegen Hühnereilysozym gerichtet sind, exprimieren, einem Panningverfahren unterzogen. Es wurde gezeigt, daß Phagenantikörper die Fähigkeit verleihen, einen Antikörper mit einem Kd von 2 nM gegenüber einem mit einem Kd von 13 nM zu selektieren.
- Die in cliesem Beispiel verwendeten Oligonucleotide sind in der folgenden Liste angeführt: OLIGONUCLEOTIDE
- Phagen, die gegen Lysozym gerichtete scFv-Fragmente präsentieren, wurden aus in Plasmiden klonierten Fab-Fragmenten gewonnen.
- Variable Regionen der schweren und leichten Kette wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chaim reaction) aus Plasmiden, die "humanisierte", zur Herstellung von Fab-Fragmenten geeignete VH-CH1- und VK-CK-Inserte (von J. Foote zur Verfügung gestellt) amplifiziert. Die Dissoziationskonstante, Kd für verschiedene Kombinationen der zwei Plasmide, die als Fabs kombiniert werden, sind weiter unten gezeigt:
- Die primäre PCR der variablen Regionen wurde durchgeführt, indem folgendes kombiniert wurde:
- 36,5 ul Wasser
- 5 ul PCR-Puffer (lOx)
- 2 ul dNTP (5 mM)
- 2,5 ul Back oligo (10 pMol/ul) (VHBHD13APA oder VKBHD13)
- 2,5 Forward oligo (10 pMol/ul) (VHFHD13 oder VKFHD13NOT)
- Die Reaktionslösung wird durch 5-minütige UV-Bestrahlung dekontaminiert, um fremde DNA zu zerstören, und 1 ul Plasmid-DNA zugegeben (0,1 ug/pl). Das PCR-Gemisch wurde mit 2 Tropfen Paraffinöl überschichtet und 5 Minuten lang auf einen PCR-Block mit 94ºC gegeben, bevor 0,5 ul Taq-Polymerase unter das Paraffin zugegeben wurden. Die verwendeten Zyklusbedingungen waren 94ºC 1 Minute, 40ºC lMinute, 72ºC 1,5 Minuten bei 17 Zyklen.
- Der Linker (Gly4-Ser)3 wurde aus dem Anti-phOx (2-Phenyloxazol-5-on)-Klon fd-CAT2- scFv NQ11 unter Verwendung der Oligos HD13BLIN und HD13FLIN3 mit 0,1 ug Plasmid-DNA amplifiziert. Die verwendeten PCR-Zyklen waren 94ºC 1 Minute, 25ºC 1,5 Minuten bei 17 Zyklen.
- Die amplifizierte DNA wurde durch das Trennen der Proben auf einem 2%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt bei 90 mA, Ausschneiden der geeigneten Banden und Extrahieren der DNA mittels des Geneclean II Sets (BIO 101 Inc.) für VH und VK, oder durch den Einsatz von Spin-X-Filtern (Costar) für den Linker. Ein Endvolumen von 10 ul wurde verwendet, um die extrahierte DNA erneut zu suspendieren.
- Die Assemblierung der vier "humanisierten" Einzelketten-Fv D1.3 (scEv HuD1.3)-Konstrukte erfolgte durch den Vorgang der "Assemblierung durch überlappende Erweiterung" gemäß Beispiel 12.
- Es wurden folgendes kombiniert:
- 34,5 ul Wasser
- 5 ul PCR-Puffer (1 Ox)
- 2 ul dNTP (5 mM)
- 2,5 ul Back oligo (10 pMol/ul) (VHBHD13APA)
- 2,5 ul Forward oligo (10 pMol/ul) (VKFHD13NOT)
- Wiederum wird die Reaktionslösung wird durch 5-minütige UV-Bestrahlung dekontaminiert, bevor 1 ul der primären PCR-Produkte; VH-1 oder VH-2, VK-3 oder VK-4, sowie die Linker-DNA; zugegeben wird. Die Reaktionslösung wurde mit 2 Tropfen Paraffinöl überschichtet und 5 Minuten lang auf einen PCR-Block mit 94ºC gegeben, bevor 0,5 ul Taq-Polymerase zugegeben wurden. Die verwendeten Zyklusbedingungen waren 94ºC 1 Minute, 60ºC 1,5 Minuten, 72ºC 2,5 Minuten bei 20 Zyklen.
- Die wäßrige Schicht unter dem Paraffin wurde einmal mit Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform, einmal mit Ether extrahiert, mit Ethanol gefällt, und in 36 ul Wasser erneut suspendiert. Dazu wurden 5 ul 10xPuffer für NotI, 5 ul 1 mg/ml BSA und 4 ul (40 U) NotI (New England Biolabs) gegeben. Die Restriktion wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert.
- Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und in 36 ul Wasser erneut suspendiert; dazu wurden 5 ul lOxNEB-Puffer 4,5 ul lmg/ml BSA und 2 ul (40 U) ApaLI (New England Biolabs) gegeben. Dies wurde 5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert; weitere 2 ul ApaLI wurden zugegeben und die Reaktion bei 37ºC über Nacht inkubiert.
- Die geschnittene DNA wurde durch Gelreinigung auf einem 1,3%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt extrahiert, und dann mit Geneclean gehandelt, um die Insert- DNA zur Klonierung zu erhalten.
- Der Vektor fd CAT2 (wie in Beispiel 16 hergestellt und mit ApaLI und NotI gespalten) und die scFv-DNA wurden wie in Beispiel 16 ligiert.
- Die Kolonien aus den Ligationen wurden zuerst mittels PCR-Screenen auf Inserte gescreent. Das PCR-Gemisch wurde in größerem Menge hergestellt, indem 14,8 ul IxPCR- Puffer, 1 ul dNTP (5 mM), 1 ul Back oligo (FDPCRBAK), 1 ul Forward oligo (FDPCR- FOR), und 0,2 ul Taq-Polymerase pro gescreenter Kolonie kombiniert wurden. 20 ul-Aliquoten dieses PCR-Gemisches wurden in eine 96-Napf-Techneplatte gegeben. Die Koloniespitze wurde mit einem Zahnstocher berührt und schnell im PCR-Gemisch gedreht und die Kolonie erhalten, indem der Zahnstocher in eine Cellwell-Platte (Nung), die 250 ul 2xTYMedium enthielt, gegeben wurde. Das PCR-Gemisch wird mit 1 Tropfen Paraffin überschichtet und die Platte auf einen Block mit 94ºC 10 Minuten lang gegeben, bevor die Zyklen 94ºC 1 Minute, 60ºC 1 Minute, 72ºC 2,5 Minuten durchgeführt.
- Die so erhaltenen Klone wurden wie unten angegeben bezeichnet. Die Affinität der scFv-Fragmente, die von den Fab-Fragmenten erhalten wurden, wurde nicht bestimmt, aber ältere Ergebnisse lassen vermuten, daß diese nahe daran liegen, jedoch nicht notwendigerweise identisch sind (R. E. Bird & B. W. Walker TIBTECH 9, 132-137, 1991).
- Die Herstellung der Phagen und die ELISA waren wie in Beispiel 6 beschrieben. Es wurde gezeigt, daß die in fd CAT2 gebildeten Klone, wie erwartet, Lysozym binden.
- Es wurden Mischexperimente durchgeführt, in denen der Phage fd-CAT2 scFvD1.3 (Beispiel 15) entweder mit fd-CAT2 TPB1, fd-CAT2 TPB2 oder mit fd-CAT2 TKPB4 gemischt wurde, und in einer Anreicherungsrunde verwendet wurde.
- Das allgemein angewandte Verfahren zur Affinitätselektion durch Anreicherung ist das unten genau beschriebene. Jede Abweichung von dieser Arbeitsvorschrift wird am jeweiligen Punkt beschrieben. Die Anreicherungsplatten wurden zwischen den Manipulationen auf eine Schüttelplattform gestellt.
- Falcon-35 mm-Gewebekulturplatten wurden über Nacht mit 1 ml Lysozym (verschiedene Konzentrationen), das in 50 mM NaHCO&sub3; pH 9,6 gelöst war, beschichtet und mit 2 ml 2% MPBS bei Raumtemperatur für 2 Stunden blockiert. Die Phagen wurden in 1 ml 2% MPBS vorbereitet und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Die Platten wurden 5 Minuten lang mit 2 ml der folgenden Lösungen gewaschen: 5 mal mit PBS, PBS-Tween, 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5; 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 9,5; 500 mM NaCl, 50 mM NaHCO&sub3; pH 9,6; 500 mM NaCl.
- Die Elution der Phagen erfolgte dann durch Zugabe von 1 ml 100 mM Triethylamin und 5-minütiges Schütteln vor dem Entfernen des Eluats, das mit 100 ul 1,0 M Tris-HCl pH 7,4 neutral isiert wurde.
- Die Platten wurden über Nacht mit Lysozym mit der unten angegebenen Konzentration besch icfntet.
- Die Kolonien aus einzelnen Anreicherungsrunde wurden entweder mit der Sonde MURDSEQ (für dfCAT scFvD1.3) oder mit der Sonde HUMD13SEQ (für fdCAT2 TPB- Konstrukte) untersucht.
- Nitrocellulosekreise (Schleicher & Schüll, BA 85, 0,45 um) wurden mit Bleistift markiert, sanft auf die Kolonien, die aus den Anreicherungsexperimenten erhalten wurden, gelegt und eine Minute liegen gelassen. Die Filter wurden dann schnell von einer Kante weggezogen und 5 Minuten lang mit der Kolonieseite nach oben auf ein Stück 3MM-Papier (Whatman), das in Denaturierlösung geweicht war (500 mM NaOH; 1,5 M NaCl), gelegt. Sie wurden dann auf 3MM, das in Neutralisierlösung (3,0 M NaCl; 500 mM Tris- HCl, pH 7,5) geweicht war, für 1 Minute überführt, und dann 1 Minute auf 3MM, das in 5xSSC; 250 mM Ammoniumacetat geweicht war. Die Filter wurden dann an der Luft getrocknet, bevor sie in einem Vakuumofen mit 80ºC 30 Minuten lang getrocknet wurden.
- Die Oligonucleotidsonde wurde durch Kombinieren der folgenden Lösungen hergestellt:
- 2 ul Oligonucleotid (1 pMol/ul)
- 2 ul γ-³²P-ATP (3000 Ci/mMol) (Amersham International plc)
- 2 ul 10xKinasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl&sub2;; 10 mM DTT)
- 12 ul Wasser
- 2 ul Polynucleotid-Kinase (20 Units)
- Dies wurde 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert.
- Die Hybridisierung wurde im Techne HB-1-Hybridisierer durchgeführt. Die getrockneten Filter wurden bei 37ºC in 40 ml Hybridisierungspuffer (10 ml 100 mM Natriumpyrophosphat; 180 ml 5,0 M NaCl; 20 ml 50xDenhardt-Lösung; 90 ml 1,0 M Tris-HCl pH 7,5; 24 ml 250 mM EDTA; 50 ml 10% NP40; mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt 60,3 mg rATP; 200 mg Hefe-RNA (Sigma)) 15 Minuten lang vorhybridisiert und dann wurden 20 ul des kinasierten Oligonucleotids zugegeben. Die Filter wurden bei 37ºC zumindest eine Stunde lang inkubiert, und dann 3mal 10 Minuten lang mit 50 ml 6xSSC bei 37ºC gewaschen (Waschung mit geringer Stringenz). Die Filter wurden luftgetrocknet, mit Saran-Umhüllung bedeckt und über Nacht einem Kodak X-AR-Film ausgesetzt.
- Fig. 34 faßt die Ergebnisse aus den Anreicherungsexperimenten mit einem Gemisch des Phagen fd-CAT2 scFv D1.3 mit hoher Affinität (Kd-2 nM) und mit dem Konstrukt fd- CAT2 TF'B4 (Kd-52 nM) zusammen.
- Bei einer Beschichtungskonzentration von 3000 ug/ml Lysozym konnte nur wenig oder keine Anreicherung erhalten werden. Es war jedoch möglich, eine Anreicherung für den scFv D1.3-Phagen zu erhalten, wenn eine niedrigere Lysozymkonzentration verwendet wurde, um die Platten zu beschichten. Der beste Anreicherungswert, der erhalten wurde, war von 1,5% fd-CAT2 scFvD1.3 in Anfangsgemisch auf 33% fd-CAT2 scFvD1.3 in der eluierten Fraktion, auf einer Platte, die über Nacht mit 30 ug/ml Lysozym beschichtet worden war.
- Die Anreicherung für den scFv D1.3-Phagen mit hoher Affinität gegenüber dem fd-CAT2 TPB1-Phagen (Kd-13 nM) konnte nur bei Experimenten gezeigt werden, bei denen die Platten über Nacht mit geringen Lysozymkonzentrationen geschichtet wurden, wie in Fig. 35 dargestellt ist.
- Zusammenfassend wurden Einzelketten-Fv-Versionen einer Reihe von humanisierten D1.3-Antikörpern im Phagen fd konstruiert. Durch Affinitätsselektion von fd-CAT2-Phagengemischen, durch Anreicherung in kleinen Petrischalen, wurde gezeigt, daß der scFv D1.3-Phage mit hoher Affinität bevorzugt gegenüber einem Hintergrund von scFv HuD1.3-Phagen mit geringerer Affinität selektiert werden kann.
- Es ist manchmal wünschenswert, die Vielfalt eines in Phagen klonierten Genpools, z. B. ein Antilkörpergenpool, zu erhöhen oder ein größere Anzahl an Varianten eine einzelnen klonierten Gens herzustellen. Es gibt viele geeignete in vitro-Mutagenese-Verfahren. Ein attraktives Verfahren, insbesondere zur Herstellung einer vielfältigeren Population einer Antikörpergenbibliothek, ist jedoch die Verwendung von Mutatorstämmen. Dies hat den Vorteil, daß eine sehr große Anzahl von Mutanten hergestellt wird, die im wesentlichen nur durch die handhabbare Anzahl der Phagen beschränkt wird. Das Phagenpräsentationssystem ermöglicht die volle Ausnützung dieser Anzahl, um verbesserte oder veränderte Klone zu isolieren.
- Nucleotidsequenzen, die für ein gegen 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP) gerichtetes scFv-Antikörperfragment, scFvB18, kodieren, das wie in Beispiel 12 aus einem monoklonalen Antikörper gegen NP gewonnen wurde, wurden wie in Beispiel 11 mittels ApaLI- und NotI-Restriktionsstellen in fdCAT2 kloniert, um fdCAT1scFvB18 zu bilden, oder unter Verwendung von PstI- und NotI-Restriktionsstellen in fdDOGKan (fdCAT2, worin seine Tetracyclinresistenzgene entfernt und durch Kanamycinresistenzgene ersetzt wurden), um fdDOGKanscFvB18 zu bilden oder in den Phagemidvektor pHEN1 mit den Restriktionsstellen SfiI und NotI als Fusionsprotein mit Gen III, um pHENlscFv- B18 zu bilden.
- Die folgenden Mutatorstämme (R. M. Schaaper & R. L. Dunn). Mol. Biol. 262, 1627- 16270, 1987; R. M. Schaaper Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 8126-8130, 1988) wurden verwendet:
- wurden von Dr. R. M. Schaaper zur Verfügung gestellt (Department of Health & Human Services, N1H, P0 Box 12233, Research Triangle Park, N. C. 27709)
- NR9046mutD5: NR9046 mutD5::Tn10
- NR9046mutT1: NR9046 mutT1::Tn10
- wurden gemäß Standardverfahren durch P1-Transduktion konstruiert. Die Mutatorstämme wurden mit fdCAT2scFvB18 oder fdDOGKanscFvB18 transfiziert und die Transfektanten nach ihrer Antibiotikaresistenz ausgewählt. Die Transfektanten wurden 24 Stunden lang bei 37ºC wachsen gelassen, bevor die mutanten Phagen durch PEG-Fällung gewonnen wurden. Die mutanten Phagen wurden auf einer 1 ml NIP- (4-Hydroxy-3-iod- 5-nitrophenylessigsäure-) BSA-Sepharose-Affinitätssäule (die nach den Herstellerangaben hergestellt wurde), die mit 200 ml PBS vorgewaschen und mit 20 ml MPBS blockiert wurde, selektiert. Die Phagen wurden in 10 ml MPBS auf die Säule aufgebracht und nicht gebundenes Material erneut aufgegeben um eine vollständige Bindung sicherzustellen. Die Säule wurde nacheinander mit 10 ml MPBS und 500 ml PBS gewaschen. Die an die Affinitätsmatrix gebundenen Phagen wurden mit 5 Säulenvolumina 0,33 mM NIP-Cap (Beispiel 38) eluiert.
- Das Phageneluat wurde 30 Minuten bis 1 Stunde mit E.coli-Mutatorstämmen in der log- Phase (2 · 10&sup8; Zellen/ml) ohne Antibiotikaselektion inkubiert. Die infizierten Zellen wurden dann in 2xTY 1 : 100 verdünnt und 24 Stunden lang mit Antibiotikaselektion gezüchtet (15 ug/ml Tetracyclin oder 30 ug/ml Kanamycin für fdCAT2scFvB18 bzw. fdDOG- KanscFvB18). Die Phagen aus dieser Kultur wurden für eine weitere Affinitätsselektions- und Mutationsrunde verwendet.
- Die Bindung der Phagenantikörper wurde mittels ELISA wie in Beispiel 9 untersucht, außer daß die ELISA-Platten mit NIP-BSA (4-Hydroxy-3-iodo-5-nitrophenylacetysl-BSA; 0,4 mg/ml) beschichtet wurden. Die Kulturüberstände wurden nach dem Wachstum in Cellwells wie in Beispiel 17 beschrieben vorbereitet und 20 ul Kulturüberstand jedem Napfzugegeben und mit MPBS auf 200 ul verdünnt.
- Die Phagenproben, die im ELISA ein Signal ergaben, das mehr als das Doppelte des Hintergrunds betrug, wurden untersucht. Der ELISA erfolgte wie oben für die nicht spezifische Bindung an Lysozym, BSA oder Ox-BSA (Beispiel 9). Die Spezifität für NIP wurde weiters durch einen ELISA bestätigt, in dem Reihenverdünnungen von NIP-Cap zusammen mit Phagenantikörpern zugegeben wurden. Die Zugabe erhöhter Konzentrationen von NIP-Cap verringerte das Signal auf den Hintergrundwert.
- Phagen, die im ELISA positive Signale ergaben, wurden sequenziert und 2 verschiedene Mutanten in das Phagemid pHEN1 subkloniert und in HB2151 zur löslichen Expression und in TG1 zur Phagenpräsentation transformiert (Beispiel 23).
- Zur Expression der löslichen scFv-Fragmente wurden die Transformanten in E.coli HB- 2151 bei 37ºC in einem Liter 2xTY mit 0,2% Glucose, 0,1 mg/ml Ampicillin bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1 gezüchtet und die Expression der löslichen scFv-Fragmente durch die Zugabe von IPTG auf 1 mM induziert. Die Kulturen wurden bei 30ºC 16 Stunden lang geschüttelt.
- Die löslichen scFvB18 wurden aus dem rohen bakteriellen Überstand in einer FLOW- GEN-Ultrazentrifugationseinheit auf ein Volumen von 200 ml eingeengt.
- Das Konzentrat wurde zweimal über eine 2 ml NIP-BSA-Sepharose-Säule geschickt, die mit 200 ml PBS vorgewaschen wurde. Die Säule wurde mit 500 ml PBS und 200 ml 0,1 M Tris pH 7,5, 0,5 m NaCl gewaschen und die Phagenantikörper mit 50 mM Citratpuffer pH 2,3 eluiert. Das Eluat wurde sofort mit 1 M Tris pH 8 neutralisiert. Das Eluat wurde mit zweimaligem Austausch gegen 1 Liter PBS, 0,2 mM EDTA dialysiert. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation bei 10.000 g entfernt und die Proteinausbeute durch Messung der Absorption des Überstands bei 280 nm bestimmt.
- Nach 4 Mutations- und Selektionsrunden wurden die isolierten Klone gescreent und in einem oder zwei seltenen Beispielen wurden stark positive ELISA-Signale von Phagenantikörpern, die aus der Mutation sowohl von fdCAT2scFvB18 als auch fdDOGKanscFv- B18 stammten, im ELISA erhalten. Diese Phagenantikörper, die stark positive ELISA-Signale ergaben, wurden in weiteren Runden um einen Faktor von etwa 2,5 pro Runde angereichert. Vierzig Phagenantikörper, die stark positive Signale ergaben, wurden sequenziert und sie zeigen jeweils einzelne Mutationen an sechs verschiedenen Stellen in den scFvB18-Nucleotidsequenzen, wobei sich fünf davon in der leichten Kette befinden. Mehr als 70% der Mutationen traten an den Positionen 724 und 725 auf, wobei das erste Glycin im J-Segment der leichten Kette (Gerüst 4) zu Serin (in 21 Fällen) oder Aspartat (in 3 Fällen) geändert wurde. Die Sequenz von scFvB18 ist in Fig. 36 gezeigt.
- Die Nucleotidsequenzen, die für die scFv-Fragmente einer Gerüstmutante mit der obigen Glycin-zu-Serin-Mutation kodieren, sowie eine Mutante, worin Tyr in der CDR3 der leichten Kette zu Aspartat mutiert wurde, wurden durch PCR aus den Phagenantikörperklonen amplifiziert und in das Phagemid pHEN1 subkloniert (im wesenlichen wie in Beispiel 20). Damit vermeidet man mögliche Probleme mit durch die Mutatorstämme verursachten Gen III-Mutationen. Dasselbe ELISA-Signalmuster war zu sehen, wenn die Mutanten nach dem Ergänzen des Phagemids mit dem Helferphagen (wie in Beispiel 21) auf Phagen präsentiert wurden, wie wenn die Mutanten untersucht wurden, wenn diese wie oben aus dem Phagengenom exprimiert wurden.
- Die scFv-Fragmente aus scFvBl8 und die scFv-Fragmente, die die Glycin-zu-Serin- bzw. die Tyrosin-zu-Aspartat-Mutationen enthalten, wurden bei 30ºC in Lösung exprimiert (nach der Transformation in E.coli HB2151 wie in Beispiel 23). Sie zeigten keine Unterschiede in den ELISA-Signalen zwischen B18 vom Wildtyp und der Gerüstmutante. Das Signal, das vom Phagenantikörper mit der Mutation von Tyrosin zu Aspartat in CDR3 von scFv erhalten wurde, war etwa 10mal stärker. Es zeigte sich, daß die Expressionsausbeuten vergleichbar waren, wie durch Western-Blotten unter Verwendung eines Antiserums gegen g3p (wie oben beschrieben) festgestellt wurde. Affinitätsmessungen wurden mittels Fluoreszenzquenchen wie in Beispiel 19 durchgeführt. Die Affinitätsmessung von mit Affinität gereinigten scFv-Fragmenten zeigte jedoch, daß scFvB18 und die scFvB18- (Gly→Ser) und scFvB18- (Tyr→Asp) Mutanten eine vergleichbare Affinität von 20 nM für NIP-Cap aufweisen.
- Ein Westernblot unter Einsatz eines Anti-Gen III-Antikörpers zeigte, daß die Gerüstmutante deutlich weniger der proteolytischen Spaltung ausgesetzt war als scFvB18.
- Daher ergibt die Verwendung von Mutatorstämmen einen vielfältigen Bereich von Mutanten in Phagenantikörpern, wenn diese als Wirte für Klone zur Gen III-Fusion verwendet werden. In diesem Fall zeigen einige der Klone wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Stabilität gegenüber proteolytischem Angriff höhere ELISA-Signale. Die Mutatorstämme können daher verwendet werden, um Vielfalt in einen Klon oder eine Klonpopulation zu bringen. Diese Vielfalt sollte sollte Klone mit den gewünschten Eigenschaften, wie z. B. einer höheren Affinität oder Spezifität, ergeben. Solche Klone können dann nach der Präsentation der Proteine auf Phagen selektiert werden.
- Dieses Beispiel beschreibt eine Technik auf PCR-Basis zum "Assemblieren" von Human- Fabs durch Vespleißen der Schwer- und der Leichtketten-DNA mit einem getrennten Stück "Linker"-DNA. Es wird ein Gemisch aus universellen Primern verwendet, was die Technik auf alle Human V-Gene anwendbar machen sollte.
- Es wird die allgemeine Technik zur PCR-Assemblierung von Human V-Genen zur Schaffung eines Fab-Konstrukts beschrieben. Die Effizienz dieser Technik wurde durch "Assemblieren", Klonieren und Exprimieren eines Human-Anti-Rhesus-D-(-Rh-D-) Fab von einem rnonoklonalen IgG-K-Hybridom bewertet. Es wurde auch das Potential gezeigt, monoklonale Human-Antikörper durch Zusammenbauen, Klonieren, Exprimieren und Isolieren eines monoklonalen IgG-λ-anti-Rh-d-Fab von einer polyklonalen Lymphoblasten-Zellinie (LCL) aus polyklonalen Zellpopulationen zu gewinnen.
- Die Gesamtstrategie für die PCR-Assemblierung wird in Fig. 37 gezeigt und ist nachstehend detaillierer beschrieben. Für die Fab-Assemblierung werden die VH-CH1- und VK- CK- oder V λ-C λ-Leichtketten von Erststrang-cDNA amplifiziert und gelgereinigt. Schwer- und Leichtketten-DNA werden dann gemeinsam mit Linker-DNA und flankierenden Oligonucleotiden in einer neuen PCR-Reaktion kombiniert. Das ergibt ein Fab- Konstrukt voller Länge, da das 5'-Ende der Linker-DNA zum 3-Ende der CH1-Domäne komplementär ist und das 3'-Ende des Linkers zum 5'-Ende der Leichtketten-Domäne komplementär ist. Die Linker-DNA enthält terminale Reste der Human-CH1-Domäne, die bakterielle Leadersequenz (pelB) für die Leichtkette und die ersten Reste der VK- oder V-λ-Leichtkette (Fig. 2). Schließlich wird das Fab-Konstrukt nach der Gelreinigung mit Flankierungsoligonucleotiden reamplifiziert, die Restriktionsstellen zur Klonierung enthalten.
- Oligonucleotid-Primer: Um die PCR-Klonierung von Human V-Genen zu entwickeln, war es notwendig, einen neuen Bereich spezifischer Human-Oligonucleotid-Primer zu entwickeln.
- Die PCR-Primer am 5'-Ende des VH- und VK- und Vλ-Gen-Exons (BACK-Primer) basieren auf Sequenzdaten, die aus der Kabat-Datenbank (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl.. US Department of Health and Human Services. 1987), der EMBL-Datenbank, der Literatur (P. Chuchana et al., Eur. J. Immunol. 1990. 20.1317) und unveröffentlichten Daten entnommen wurden. Die Sequenzen der VH-, VK- und Vλ-Primer sind in Tabelle 1 angeführt. Außerdem wurden auch verlängerte VH-Primer mit Sfil-Stellen am 5'-Ende bezeichnet (Tabelle 6), um nach dem Assemblieren eine Restriktionsstelle hinzuzufügen.
- Tabelle 6 zeigt auch die 3'-Primer (FORWARD-Primer), die für die Klonierung von Human V-Genen auf PCR-Basis konstruiert wurden. Es gibt zwei Sätze davon, je nachdem, ob ein Fab oder ein scFv hergestellt werden soll. Für die Fab-Assemblierung basierte der Forward-Primer am 3'-Ende der CH&sub1;-Domäne, CK-Domäne und cλ-Domäne. außerdem wurden die CK- und C2-FORWARD-Primer auch als verlängerte Versionen mit Notl- Stellen an ihren 5'-Enden synthetisiert.
- Zu den CH1-Forward-Primern und den VκK- und Vλ-Back-Primern komplementäre Primer wurden synthetisiert, um die Erzeugung von Linker-DNA durch PCR-Amplifizierung eines Plasmidtemplats zu ermöglichen, das den Fab-Linker enthält (Tabelle 6). Um adäquate Amplifizierung zu gewährleisten, wurden die Primer zu tatsächlichen Linkersequenzen verlängert.
- Dabei handelt es sich im Wesentlichen um das gleiche Verfahren wie in Beispiel 12 beschrieben, wobei jedoch Material menschlichen Ursprungs verwendet wurde. In den in diesem Beispiel angeführten Ergebnissen wurden Human-Hybridom- und polyklonale Human-Lymphoblasten-Zellinien verwendet.
- Etwa 4 pg Gesamt-RNA in 20 ul Wasser wurde für 3 min auf 65ºC erhitzt, auf Eis abgeschreckt und zu 30 ul Reaktionsgemisch hinzugefügt, was ein 50 ul-Reaktionsgemisch ergab, das 140 mM KCl, 50 mM Tris, HCl (pH 8,1 @ 42ºC), 8 mM MgCl2, 10 mM DTT, 500 uM Desoxythymidintriphosphat, 500 uM Desoxycytosintriphosphat, 500 uM Desoxyadenosintriphosphat und 500 uM Desoxyguanosintriphosphat, 80 Einheiten Human-Plazenta-RNAse-lnhibitor und 10 pMol des geeigneten Forward-Primers (HuIgG1- 4CH1FOR, HuIgMFOR, HuCKFOR, HuCLFOR) enthielt. 2 ul (50 Einheiten) Vogel-Myelobastose-Virus- (AMV-) Reverse Transkriptase wurde hinzugefügt, die Reaktion bei 42 ºC für 1 h inkubiert, für 3 minauf 100ºC erhitzt, auf Eis abgeschreckt und für 5 min zentrifugiert.
- Für die primären PCR-Amplifizierungen wurde ein äquimolares Gemisch aus den auf Basis der Familie geeigneten BACK- und FORWARD-Primern verwendet (siehe die spezifischen Beispiele 30a und 30b, die weiter unten in diesem Beispiel angeführt sind). Es wurde ein Reaktionsgemisch mit 50 ul hergestellt, das 5 ul des Überstands von der cDNA-Synthese, 20 pMol Gesamtkonzentration der FORWARD-Primer, 250 uM dNTPs, 50 mM KCl, 100 mM Tris. HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 175 ug/ml BSA und 1 ul (5 Einheiten) Thermus aquaticus- (Taq-) DNA-Polymerase (Cetus, Emeryville, CA, USA) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Paraffinöl bedeckt und 30 Ampflizierungszyklen unterzogen, wobei ein Techne Thermalzykler eingesetzt wurde. Der Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Dentaturierung), 57ºC für 1 min (Annelierung) und 72ºC für 1 min (Extension). Das Produkt wurde analysiert, idnem 5 ul auf einem 2%-igen Agarosegel laufen gelassen wurden. Der Rest wurde zweimal mit Ether, zweimal mit Phenol/Chloroform, extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 50 ul H&sub2;O resuspendiert.
- Um die Fab-Linker-DNA herzustellen, wurden 13 getrennte PCR-Reaktionen unter Einsatz von HuIgGl-4CHIFOR und jedes der Umkehr-VK- oder Vλ-Oligonucleotide durchgeführt. Das Templat war etwa 1 ng pJM-1 Fab D1.3 (Fig. 38). Die PCR-Reaktionsreagenzien wren wie oben beschrieben und der Zyklus bestand auf 94º: 1 min. 45º: 1 min und 72º: 1 min. Die Linker wurden auf einem 4%-Agarosegel analysiert, auf einem 2%- Agarosegel gereinigt, aus Gel auf einer Spin-X-Säule eluiert und mit Ethanol gefällt.
- Für PCR.-Assemblierung eines Human-Fab wurden etwa 1 > ug einer primären Schwerketten-Amplifizierung und 1 pg einer primären Leichtketten-Amplifizierung mit etwa 250 ng der entsprechenden Linker-DNA in einem PCR-Reaktionsgemsich ohne Primer gemischt und 7 Zyklen unterzogen (94º: 2 min. 72º: 2,5 min), um die Fragmente zu verbinden. Das Reaktionsgemsich wurde dann für 25 Zyklen (94º: 1 min. 68-72º: 1 min. 72º: 2,5 min) amplifiziert, nachdem 20 pMol der entsprechenden flankierenden BACK- und FORWARD-Primer hinzugegeben worden waren.
- Die assemblierten Produkte wurden Gelreinigung unterzogen und für 25 Zyklen (94º: 1 min. 55º: 1 min. 72º: 25 min) mit den flankierenden Oligonucleotiden reamplifiziert, die angehängten Restriktionsstellen enthielten. PCR-Puffer und NTPs waren wie zuvor beschrieben.
- a. PCR-.Assemblierung eines Fab von einem Human-Hybridom: die monoklonale Human-anli-Rh-D-Zellinie Fog-1 (IgG-)9 wurde durch EBV-Transformation der PBLs eines Rh-D-negativen Blutspenders erhalten, der mit Rh-D-positivem Blut immunisiert war und bereits beschrieben worden ist (M. D. Melamed, eta J. Immunological Methods, 1987. 104: 245) (N. C. Hughes-Jones, et al., Biochem. J. 1990. 268: 135) (B. D. Gorick, et al., Vox. Sang. 1988, 55 : 165). Gesamt-RNA wurde aus etwa 10&sup7; Hybridomzellen hergestellt. Erststrang-cDNA-Synthese wurde durchgeführt, wie oben beschrieben, indem die Primer HuIgGl-4CH2FOR und HuCKFOR verwendet wurden. Primäre PCRs wurden für VH-CH1 unter Verwendung eines Gemisches ausden 6 HuVHBACK-Primern und Hu- IgGL-4CG1 FOR und für VK-CK unter Verwendung eines Gemisches aus den 6 HuVK- BACK-Primern und HuCKFOR durchgeführt. Ein Fab-Konstrukt wurde assembliert wie oben beschrieben, mit Sfil und Notl restrigiert, Gelreinigung unterzogen und in pJM- 1 Fab D1.3 ligiert, das mit Sfil und Notl restrigiert war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um kompetente E.coli E. M. G.-Zellen zu transformieren. 96 Klone wurden mit Zahnstochern in Medien in Mikrotiterplatten-Näpfe übertragen, bis zur mid-log-Phase bei 30ºC gezüchtet, und dann wurde Expression des Fab durch Wärmeschockbehandlung bei 42ºC für 30 min. gefolgt von Züchten für 4 h bei 37ºC, herbeigeführt. Die 96 Klone wurden dann auf Anti-Rh-D-Aktivität gescreent wie nachstehend beschrieben.
- b. Assemblierung von Human-Fabs aus einer polyklonalen (LCL): Ein polyklonales LCL "OG" wurde aus EBV-Transformation von etwa 70&sup7; peripheren Blutlymphozyten (PBLs) von einem Rh-D-negativen Donor erhalten, der mit Rh-D-positiven roten Blutkörperchen immunisiert wurde. Die Zellen wurde in einer Konzentration von etwa 10&sup5; Zellen pro Napfausplattiert. Positive Näpfe wurden durch Screenen der geernteten Zellen identifiziert und dann einmal subkloniert. Typisierung des Napfs zeigt an, daß ein IgG- λ-Antikörper erzeugt wurde. In diesem Stadium wurde Gesamt-RNA aus etwa 10&sup6; Zellen hergestellt. Erststrang-cDNA-Synthese wurde wie oben beschrieben unter Verwendung der Primer HuIgGI-4CG1 FOR und HuCLFOR durchgeführt. Primäre PCRs wurden für VH-CHI unter Verwendung eines Gemisches aus den 6 HuVHBACK2-Primern und HuIgGI-4CG1 FOR und für V λ-C-λ unter Verwendung eines Gemisches aus den 7 HuV BACK-Primern und HuC FOR durchgeführt. Restriktion, Klonierung und Screenen fand wie beschrieben statt. Um die Vielfalt der Klone zu bestimmen, wurden die VH- und Vλ-Gene von 15 Klonen PCR amplifiziert, mit dem häufig schneidenden Restriktionsenzym BsIN1 gespalten und auf einem 4%-Agarosegel analysiert (siehe Beispiel 16).
- Test auf Anti-Rh-D-Aktivität und Demonstration der Spezifität: Ein 5 Vol.-% -Suspension von entweder Rh-D-positiven (OR2R2) oder Rh-D-negativen (ORR) Erythrozyten in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,3) wurde mit einer Papainlösung für 10 min bei 37ºC inkubiert. Der Erythrozyten wurden dreimal in PBS gewaschen, und eine 1 Vol.-%-Suspenspension von Erythrozyten wurde in PBS hergestellt, die mit 1 Vol.-% Rinderserumalbumin (BSA) ergänzt war. 50 ul einer Papain-behandelten Erythrozyten-Suspension und 50 ul Phagen-Überstand wurden in die Näpfe von Mikrotiterplatten mit rundem Boden gefüllt, und die Platten wurden für 2 min auf einen Titertek-Plattenrüttler gestellt. Nach 15 min Inkubation bei 37ºC wurde jedem Napf 100 ul PBS/BSA hinzugefügt. Die Platten wurden mit 200 g für 1 min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die Erythrozyten wurden im verbleibenden PBS/BSA resuspendiert, und die Fab-Fragmente wurden durch die Zugabe von monoklonalem 9E10-Antikörper (50 ul einer 1 ug/ml Lösung in PBS/BSA) vernetzt, der gegen die myc-Peptid-Markierung gerichtet war (E. S. Ward, et al., Nature 1989, oben). Die Platten wurden bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis Sedimenation stattgefunden hatte. Agglutination der Erythrozyten ergab einen diffusen Erythrozyten-Knoten, und die Ergebnisse wurden makroskopisch bewertet. Die Spezifität wurde mit einer (wie oben) vorpapainisierten Standard- Reihe aus 9 Erythrozyten-Suspensionen in PBS (alle Suspensionen Blutgruppe 0,4 D positiv und 5 D negativ) bestätigt, von denen bekannt war, daß die homozygote Expression aller der klinisch relevanten Erythrozyten-Blutgruppen-Alloantigene aufwiesen. Die Anzahl an Kopien des D-Antigens auf den D-positiven Zellen variierte je nach dem Rh- Genotyp zwischen 10.000 und 20.000 pro Erythrozyt. Kurz zusammengefaßt wurde 50 ul Phagenüberstand in PBS, ergänzt mit 2 Vol.-% Magermilch, mit 50 ul einer 2%igen Erythrozyten-Suspension in PBS in Glasröhrchen vermischt und für 15 min bei 37ºC inkubiert. Nach einer Wäsche mit PBS/BSA wurden die Erythrozyten pelletiert und in 50 ul Esel-Anti-Human-λ-Leichtkette resuspendiert (Sigma L9527, verdünnt 1 : 40 in PBS/- BSA). Die Röhrchen wurden für 1 min mit 200g zentrifugiert, und Agglutination wurden makroskopisch unter Einsatz des "Tip-and-Roll"-Verfahrens abgelesen.
- PCR-Assemblierung eines Fab von einem Human-Hybridom: Eine einzelne Bande mit korrekter Größe wurde nach der Amplifizierung erhalten. 38 von 96 Klonen (40%), die spezifisch gescreent wurden, agglutinierten spezifisch RhD-positive, nicht aber Rh-D-negative rote Blutkörperchen. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Frequenz erfolgreichen Spleißens im Assemblierungsverfahren und das Potential dieser Technik für einstufige Klonierung von Human-Hybridomen.
- b. Assemblierung von Human-Fabs aus einer polyklonalen Lymphoblasten-Zellinie (LCL): Analyse der Vielfalt der Klone zeigte, daß 3 verschiedene Schwerkettenfamilien und 2 verschiedene Leichtkettenfamilien vorhanden waren. Aus 96 gescreenten wurden 5 Anti-Rh-D-spezifische Klone identifiziert. Die VH- und Vλ-Ketten wiesen identische Nucleotidsequenzen in jedem Klon auf und waren typisch für Anti-Rh-D V-Gene (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Ergebnisse zeigen das Potential dieser Technik für das Assemblieren, Klonieren und Isolieren von Human-Antikörper-Fragmenten aus polyklonalen Zel Ipopulationen (siehe auch den Abschnitt über Isolation spezifischer Bindungsaktivitäten von einer "unimmunisierten" Human-Bibliothek (Beispiele 32 und 33)).
- Eine große Anzahl wichtiger Antigene sind integrale Komponenten von Zelloberflächen- Membranen, d. h. sie sind Zelloberflächen-Antigene. Dazu gehören Tumor-spezifische Antigene und Oberflächen-Antigene roter und weißer Blutkörperchen. In vielen Fällen wäre es wichtig, Antikörper gegen diese Antigene zu isolieren. Beispielsweise werden Antikörper, die gegen das Rhesus D-(Rh-D)-Antigen auf roten Blutkörperchen gerichtet sind, sowohl diagnostisch als als auch therapeutisch verwendet. Viele dieser Antigene sind schwer zu reinigen, und einige, wie Rh-D, sind nicht biologisch aktiv, wenn sie von der Membran isoliert sind. Daher wäre es nützlich, Antikörper-Fragmente, die auf der Oberfläche von Bakteriophage präsentiert werden, direkt auf Zelloberflächen-Antigenen Affinitätsreinigung unterziehen zu können. Um die Durchführbarkeit der Affinitätsreinigung auf Zelloberflächen-Antigenen zu tsten, wurde monoklonaler Anti-Rh-D- Human-Antikörper Fog-B als Fab-Fragment auf der Oberfläche von Bakteriophage fd präsentiert. Das präsentierte Fog-B-Fab-Fragment band Antigen, wie durch Agglutinationstest bestimmt, und konnte auf der Basis seiner Bindung auf der Oberfläche der Rh- D-positiven roten Blutkörperchen, nicht aber der Rh-D-negativen roten Blutkörperchen, Affinitätsreinigung unterzogen werden.
- Das Human-Hybridom Fog-B ist bereits beschrieben worden (N. C. Hughes-Jones et al., Biochern, J. 268 135 (1990). Es erzeugteinen IgG-1/λ-Antikörper, der sich an das Rh-D- Antigen bindet. RNA wurde aus 10&sup7; Hybridomzellen hergestellt, wobei ein modifiziertes Verfahren von Cathala eingesetzt wurde (wie in Beispiel 12 beschrieben) und Erststrang-cDNA-synthetisiert wurde, indem spezifische Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten-Primer (HuVH1 FOR [Beispiel 40] und HuCλFOR (5'-GGA ATT CTT ATG AAG ATT CTG TAG GGG CCA C-3')) verwendet wurden, wie in Beispiel 14 beschrieben. Das VH-Gen wurde daraufhin von einer Aliquote der Erststrang-cDNA unter Verwendung von HuVH4aBACK und HuVH1 FOR amplifiziert. Das Vλ-Gen wurde unter Verwendung eines Vλ-Primers amplifiziert, der für Fog-B spezifisch war (VλFog-B, 5'-AAC CAG CCA TGG CC AGT CTG TGT TGA CGC AGC C-3'). Die PCR-Bedingungen waren wie in E3eispiel 40 beschrieben. Die PCR-Produkte wurden analysiert, indem 5 ul über 2%-Agarosegel geschickt wurden. Der Rest wurde zweimal mit Ether, zweimal mit Phenol/Chloroform, extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 50 ul H&sub2;O resuspendiert. Die amplifizierte VH-DNA wurde mit Pstl und BstEll verdaut, und die amplifizierte Vλ-Cλ-DNA mit Ncol und EcoRl. Die Fragmente wurden auf einem 2%-Agarosegel gereinigt, unter Verwendung von Geneclean extrahiert und daraufhin in den löslichen Expressionsvektor pJM-1 Fab D1.3 ligiert (Fig. 38). Klone, die das korrekte Insert enthielten, wurden zunächst durch Restriktionsanalyse identifiziert und durch Test von exprimiertem löslichem Fab verifiziert (Induktionsbedingungen siehe Beispiel 19). Die Fog-B-Fab-Kassette wurde aus pJM-1 durch PCR amplifiziert, indem HuVH4BACK-Sfi und Hu Cλ-Not verwendet wurde, mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und in pHEN1 ligiert. Klone, clie das korrekte Insert enthielten, wurden zunächst durch Restriktionsanalyse und daraufhin durch Test identifiziert (Induktionsbedingungen siehe Beispiel 21).
- Ein Test auf das lösliche exprimierte Fab wurde mit unkonzentriertem E.coli-Überstand durchgeführt. Ein Test auf auf der Phagen-Oberfläche präsentiertes Fog-B wurde auf Phagen durchgeführt, die durch PEG-Fällung 10-fach eingeengt und dann in PBS resuspendiert worden waren. Die Tests bezüglich der Aktivität und Spezifität erfolgten wie im Beispiel beschrieben.
- Gereinigter Fog-B-Phage wurde mit gereinigtem Phagen Fd-Tet CAT-1, der das Anti-Lysozym scFv D1.3 (pAbD1.3) präsentiert, in einem Verhältnis von etwa 1 Fog-B : 50 scFvD1.3 vermischt. Vorpapainisierte Erythrozyten (OR2R2 [Rhesus-positiv] oder Orr [Rhesus-negativ] wurden in PBS, die mit 2% Magermilchpulver ergänzt war, in einer Konzentration von 4 · 10&sup7;/ml suspendiert. 1 ml dieser Suspension wurde mit 10¹¹ Phagen vermischt, die in 2 ml PBS, ergänzt mit 2% Magermilch, suspendiert waren, und für 30 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlicher Rotation inkubiert. Die Erythrozyten wurden dreimal mit einem Überschuss an eiskalter PBS (10 ml pro Wäsche) gewaschen und daraufhin pelletiert. Die Phagen wurden aus den Zellen durch Resuspendieren in 200 ul 76 mM Zitronensäure, pH 2,8, in PBS 1 min lang eluiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren für 1 min mit 3.000 U/min pelletiert, und der Überstand, der den eluierten Phagen enthielt, wurde durch Zugabe von 200 ul 240 mM Tris-Base, 22 mM Dinatriumwasserstoffphosphat in 1% (Gew./Vol.) Alubmin neutralisiert. Reihenverdünnung des Eluats wurde eingesetzt, um TG1-Zellen zu infizieren. Fog-B-Fab-Phagen wurden auf Ampicillin-Platten selektiert, und scFvD1.3-Phagen auf Tetracyclin-Platten, uncl der Titer jedes davon vor der Selektion, nach der Selektion auf Rhesus-D-negativen Zellen und nach der Selektion auf Rhesus-D-positiven Zellen bestimmt.
- Fog-B-Fragment, das auf der Oberfläche des Phagen präsentiert wurde, der vom Phagemid pHEN-Klon stammte, agglutinierte spezifisch Rhesus-D-positive, nicht aber Rhesus D-negative rote Blutkörperchen. Affinitätsreinigung desFog-1 Fab-Phagemids auf Rh-Dpositiven roten Blutkörperchen führte zur Anreicherung von 1 : 50 bis 1.500 : 1 (Fog-B FabacFvD1.3), während Reinigung auf Rh-D-negativen roten Blutkörperchen im Wesentlichen keine Anreicherung zeigte (10fach).
- Die Assemblierung menschlicher scFv ist der in Beispiel 12 beschriebenen Assemblierung von scFvs aus Mäusen ähnlich. Um die PCR-Klonierung von menschlichen V-Genen zu entwickeln, war es notwendig, einen neuen Bereich der für den Menschen spezifischen Oligonucleotidprimer zu konstruieren (Tabelle 6). Die Verwendung dieser Primer für die Erzeugung von Human-Fabs wird in Beispiel 30 beschrieben. Die Assemblierung der menschlichen scFvs ist im wesentlichen dieselbe, erfordert aber ein Set an FORWARD-Primern, die komplementär zu den J-Segmenten der VH-, VK- und Vλ-Genen sind. (Für Fabs werden FORWARD-Primer verwendet, die komplementär zur Konstantregion sind.) Die für das)-Segment spezifischen Primer wurden basieren auf den veröffentlichten JH-,JK- und)λ-Sequenzen (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4.Ausgabe. US-Department of Health and Human Services. 1987) konstruiert.
- Zusätzlich wird ein anderer Linker für die scFvs benötigt als für Fabs, daher wurde für die menschlichen scFvs ein neues Set von Primern benötigt, um den Linker herzustellen. Primer, die komplementär zu den JH-Forward-Primern und den VK- und Vλ-Back- Primern sind, wurden synthetisiert, um die Bildung von Linker-DNA durch PCR-Amplifikation eins Plasmidtemplats, das den scFv-Linker enthält (Tabelle 6, Fig. 39), zu ermöglichen. Um eine ausreichende Amplifikation sicherzustellen, wurden die Primer in die tatsächliche Linkersequenz erweitert. Unter Verwendung dieser Primer zur Herstellung der Linker-DNA, wurden 52 getrennte PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei jeder der vier umgekehrten JH-Primer in Kombination mit jedem der 13 umgekehrten VK- und Vλ-Oligonucleotide verwendet wurde. Das Templat war etwa 1 ng pSW2scD1.3 (Ward, E. S. 19889, s.o.), das das kurze Peptid (GIy&sub4;Ser)&sub3; enthält (Huston, J. S. et al., Gene, 1989, 77: 61).
- Dieses Beispiel beschreibt die Bildung einer menschlichen Bibliothek von scFvs, die aus einem nicht immunisiertem Menschen erzeugt wurde:
- 500 ml Blut, die etwa 10&sup8; B-Zellen enthalten, wurden von einem gesunden, freiwilligen Blutspender erhalten. Die weißen Blutkörperchen wurden auf Ficoll abgetrennt und die RNA wie in Beispiel 12 beschrieben isoliert.
- 20% der RNA, die das genetische Material von etwa 2 · 10&sup7; B-Zellen enthalten, wurden zur cDNA-Isolierung verwendet, wie in Beispiel 30 beschrieben. Die schweren Ketten, die aus IgG- oder IgM-Antikörpern stammen, wurden getrennt gehalten, indem die cDNA-Synthese entweder mit einem IgG-spezifischen Primer (HuIgG1-4CH1FOR) oder mit einem IgM-spezifischen Primer (HuIgMFOR) geprimt wurde. Aliquoten der cDNA wurden verwendet, um vier getrennte scFv-Bibliotheken zu bilden (IgG-K, IgG-λ, IgM-K und IgM-λ), wie in Beispiel 30 beschrieben. Die resultierenden Bibliotheken wurden auf 1,5%-Agarose gereinigt, elektroeluiert und mit Ethanol gefällt. Zum nachfolgenden Klonieren wurden die K- und λ-Bibliotheken kombiniert, wodurch sich getrennte IgG- und IgM-Bibliotheken ergaben.
- Klonieren der Bibliothek: Die gereinigten scFv-Fragmente (1-4 ug) wurden mit den Restriktionsenzymen NotI und entweder SfiI oder NcoI gespalten. Nach der Spaltung wurden die Fragmente mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die gespaltenen Fragmente wurden in entweder mit SfiI-NotI oder mit NcoI-NotI gespalten, durch Agarosegelelektrophorese gereinigte pHEN1-DNA (6 ug) (siehe Beispiel 20) in einem 100 ul Ligationsgemisch mit 2.000 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Das Ligationsgemisch wurde durch Phenolextraktion gereinigt uncl mit Ethanol gefällt. Die ligierte DNA wurde in 10 ul Wasser erneut suspendiert und 2,5 ul-Proben in E.coli TG1 (50 ul) elektroporiert. Die Zellen wurden in 1 ml SOC 1 Stunde lang wachsen gelassen und dann auf 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose (AMP-GLU) in 243 · 243 mm-Platten (Nung) ausplattiert. Nach Wachstum über Nacht wurden die Kolonien zur Lagerung bei -70ºC als Stammbibliothek von den Platten in 10 ml 2xTY gekratzt, das AMP-GLU und 15% Glycerin enthält.
- Das Klonieren in mit SfiI-NotI und mit NcoI-NotI gespaltenes pHEN1 ergab Bibliotheken von 10&sup7; bzw. 2 · 10&sup7; Klonen für die lgM-Bibliotheken und etwa 5 · 10&sup7; Klonen für jede der beiden IgG-Bibliotheken.
- Die Fähigkeit, Bindeaktivitäten aus Bibliotheken menschlicher Antikörper, die auf der Oberfläche von Phagen präsentiert werden, zu selektieren, könnte sich als noch wichtiger erweisen als die Isolierung von Bindeaktivitäten aus Mäusebibliotheken. Dies ist so, weil der Standardweg zur Bildung von Antikörpern über die Hybridomtechnik mit menschlichen Antikörpern nicht denselben Erfolg hatte wie jene bei Mäusen. Während es in einigen Fällen möglich ist, Bibliotheken aus immunisierten Menschen zu erhalten, zeigt es sich, daß es in vielen Fällen aufgrund der Toxizität oder der Nicht-Verfügbarkeit eines geeigeneten Immunogens oder aus ethischen Überlegungen nicht möglich ist, zu immunisieren. Alternativ dazu können Bindeaktivitäten aus Bibliotheken isoliert werden, die aus Individuen mit Krankheiten hergestellt wurden, in denen therapeutische Antikörper durch die Immunreaktion gebildet wurden. In vielen Fällen befinden sich die Antikörper-produzierenden Zellen jedoch in der Milz und sind nicht im im Kreislauf befindlichen Pool der peripheren Lymphozyten (das am leichtesten zugängliche Material zur Bildung einer Bibliothek) verfügbar. Zusätzlich kann es sein, daß in Krankheiten in Verbindung mit Immunsuppression keine therapeutischen Antikörper hergestellt werden.
- Ein alternativer Ansatz wäre es, die Bindeaktivitäten aus einer Bibliothek die aus einem nicht immunisiertem Individuum hergestellt wurde, zu isolieren. Dieser Ansatz basiert auf Schä tzungen, daß ein primäres Repertoire von 10&sup7; verschiedenen Antikörpern mehr als 99% der Epitope mit einer Affinitätskonstante von 10&sup5; M&supmin;¹ oder einer besseren erkennen sollte. Da es sein kann, daß dies keine Antikörper mit hoher Affinität ergibt, kann die Affinität durch die Mutation der V-Gene und/oder durch die Verwendung der isolierten VH-Domäne in einem hierarchischen Ansatz mit einer Bibliothek von leichten Ketten (oder umgekehrt) erhöht werden. In diesem Abschnitt zeigen die Anmelder die Durchführbarkeit dieses Ansatzes durch die Isolierung von spezifischen Antigenbindeaktivitäten gegen drei verschiedene Antigene aus einer Bibliothek von scFvs aus einem nicht immunisierten Menschen.
- Die in diesem Beispiel beschriebene Bildung der menschlichen scFv-Bibliothek, die für die Isolierung der Bindeaktivitäten verwendet wird, ist ausführlich in Beispiel 32 erklärt. Schätzung der Vielfalt der ursprünglichen und der selektierten Bibliotheken: Rekombinante Klone wurden vor und nach der Selektion durch PCR (Beispiel 16) mit den Primern LMB3 (der sich 5' von der pelB-Leadersequenz anordnet und identisch mit dem umgekehrten Sequenzierprimer (-40n) von pUC19 ist) und fd-SEQ1 gescreent; dann folgte die Spaltung mit dem häufig schneidenden Enzym BstNI. Die Analyse von 48 Klonen aus jeder nicht selektierten Bibliothek zeigte, daß 90% der Klone Inserts hatten und die Bibliotheken schienen gemäß der Beurteilung durch das BstNI-Restriktionsmuster extrem vielfältig zu sein.
- Gewinnung der Phagemidbibliotheken für Anreicherungsexperimente: Um Phagemidteilchen aus der Bibliothek zu gewinnen, wurden 100 ml 2xTY, das AMP-GLU (siehe Beispiel 32) enthält, mit 10&sup9; Bakterien, die aus der Bibliothek (in Beispiel 32 hergestellt) entnommen wurden (etwa 10 ul), inokuliert und unter Schütteln bei 37ºC 1,5 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden abzentrifugiert (IEC-Zentrifuge, 4 K, 15 Minuten) und in 100 ml vorgewärmtem (37ºC) 2xTY-AMP-Medium (siehe Beispiel 31) erneut suspendiert, 2 · 10¹&sup0; pfu VCS-M13 (Stratagene)-Teilchen zugegeben und bei 37ºC 30 Minuten lang ohne Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden dann in 900 ml 2xTY mit Ampicillin (100 ug/ml) und Kanamycin (25 ug/ml) (AMP-KAN) überführt und über Nacht unter Schütteln bei 37ºC wachsen gelassen. Die Phagenpartikel wurden durch drei PEG-Fällungen (siehe Materialien und Verfahren) gereinigt und konzentriert und in PBS auf 10¹³ TU/ml (Ampicillin-resistente Klone) erneut suspendiert.
- Anreicherung von phOx : BSA-Bindern durch Selektion in Röhrchen: Zur Anreicherung wurde ein 75 · 12 mm Nung-Immunröhrchen (Maxisorb; Cat.Nr. 4-44202) über Nacht bei Raumtemperatur mit 4 ml phOx : BSA (1 mg/ml; 14 phOx pro BSA in 50 mM NaHCO&sub3;-Puffer pH 9,6) beschichtet. Nach drei Waschungen mit PBS wurde das Röhrchen 2 Stunden lang bei 37ºC mit PBS, die 2% Marvel enthält, (2% MPBS) zum Blockieren inkubiert. Nach 3 Waschungen mit PBS wurden die Phagemidteilchen (10¹³ TU) in 4 ml 2% MPBS zugegeben, 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Drehtisch inkubiert und dann weitere 1,5 Stunden stehen gelassen. Die Röhrchen wurden dann mit 20 Waschungen mit PBS, 0,1% Tween 20 und 20 Waschungen mit PBS (jeder Waschschritt wurde durchgeführt, indem der Puffer hinein- und sofort wieder herausgegossen wurde) gewaschen. Die gebundenen Phagenpartikel wurden vom Röhrchen durch die Zugabe von 10 ml 100 mM Triethylamin pH 11,5 und 15-minütiges Drehen eluiert. Das eluierte Material wurde sofort durch die Zugabe von 0,5 ml 1,0 M Tris-HCl pH 7,4 neutralisiert und gevortext. Die Phagen wurden bei 4ºC gelagert.
- Die eluierten Phagen (in 1,5 ml) wurden verwendet, um 8 ml logarithmisch wachsende E.coli TG1-Zellen in 15 ml 2xTY-Medium zu infizieren, und auf AMP-GLU-Platten wie oben ausplattiert, wobei sich durchschnittlich 10&sup7; mit Phagen infizierte Kolonien ergaben.
- Zur Selektion von phOx-Bindern wurde der Ergänzung-Röhrchenanreicherung-Ausplattieren-Zyklus 4mal wiederholt, wonach die Phagemidklone mittels ELISA auf Bindung untersucht wurden.
- Anreicherung von Lysozymbindern durch Anreichern ("panning") und auf Säulen: Eine Petrischale (35 · 10 mm Falcon 3001 Gewebekulturschale) wurde zur Anreicherung durch "I'anning" verwendet. Während aller Schritte wurden die Platten auf einer A600 Schüttelplatte (Raven Scientific) geschüttelt. Die Platten wurden über Nacht mit 1 ml Puteneiweißlysozym (3 mg/ml) in 50 mM NaHCO&sub3; (pH 9,6) beschichtet, 3mal mit 2 ml PBS gesachen und mit 2 ml 2% MPBS bei Raumtemperatur 2 Stunden lang blockiert. Nach 3 IPBS-Waschungen wurden etwa 10¹² TU Phagenteilchen in 1 ml 2% MPBS zugegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur schütteln gelassen. Die Platten wurden 5 Minuten lang mit 2 ml der folgenden Lösungen gewaschen: Smal PBS, PBS-Tween (0,02% Tween-20), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) + 500 mM NaCl, und abschließend 50 mM NaHCO&sub3; (pH 9,6). Die gebundenene Phagenpartikel wuden dann durch die Zugabe von 1 ml 100 mM Triethylamin pH 11,5 und 5-minütiges Schütteln eluiert, und dann mit 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert (wie oben). Alternativ dazu wurden 1 ml Puteneiweißlysozym-Sepharose-Säulen zur Affinitätsreinigung verwendet (McCafferty, J., et al., Nature 1990, 348: 552). Die Säulen wurden gründlich mit PBS gewaschen, mit 15 ml 2% MPBS blockiert, und die Phagen (10¹² TU) in 1 ml 2% MPBS aufgebracht. Nach dem Waschen mit 50 ml PBS, 10 ml PBS- Tween (PBS + 0,02% Tween 20), 5 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 500 mM NaCl, 5 ml Tris-HCl (pH 8,5) + 500 mM NaCl, 5 ml 50 Tris-HCl (pH 9,5) + 500 mM NaCl und abschließend 5 ml 50 mM NaHCO&sub3; pH 9,6. Die gebundenen Phagen wurden mit 1,5 ml 100 mM Triethylamin und mit 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert.
- Zur Selektion von Puteneiweißlysozym-Bindern wurde der Ergänzung-RöhrchenanreicherungAusplattieren-Zyklus oder der Ergänzung-Säule-Ausplattieren-Zyklus 4-mal wiederholt, wonach die Phagemidklone mittels ELISA auf Bindung untersucht wurden.
- Gewinnung von einzelnen Phagemidklonen für ELISA: Mit Klonen, die aus nach 4 Anreicherungsrunden eluierten, erneut infizierten und ausplattierten Phagenteilchen resultieren, wurden 150 ul 2xTY-AMP-GLU in 96-Napf-Platten (Cell wells, Nunclon) beimpft und über Nacht bei 37ºC unter Schütteln (250 U/min) wachsen gelassen. Ein 96-Napf- Platten-Replicator ("Plunger") wurde verwendet, um mit etwa 4 ul der Über-Nacht-Kulturen auf der Anfangsplatte ("master plate") 200 ul frisches TY-AMP-GLU zu beimpfen. Nach 1 Stunde wurden 50 ul 2x TY-AMP-GLU mit 10&sup8; pfu VCS-M13 jedem Napfzugegeben, und die Platte 45 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und dann eine Stunde lang bei 37ºC geschüttelt. Die Glucose wurde dann durch Abzentrifugieren der Zellen (4K, 15 Minuten) und Belüften mittels einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernt. Die Zellen wurden in 200 ul 2xTY-AMP-KAN (Kanamycin 50 ug/ml) erneut suspendiert und unter Schütteln bei 37ºC 20 Stunden wachsen gelassen. Der nicht konzentrierte, Phagenhältige Überstand wurde zur Analyse durch ELISA genommen.
- Die Analyse auf Bindung an phOX : BSA, BSA oder Lysozym wurde mittels ELISA (siehe Beispiel 9) durchgeführt, wobei 100 ug/ml phOX : BSA oder BSA, oder 3 mg/ml Puteneiweißlysozym zur Beschichtung verwendet wurden. Die Bestimmung der Kreuzreaktivität der isolierten Klone mit nicht verwandten Antigenen wurde ebenfalls mittel ELISA auf Platten, die mit 100 ug/ml eines nicht relevanten Antigens (Schlüssellochnapfschneckenhärnocyanin (KLH), Eialbumin, Chymotrypsinogen, Cytochrom C, Thyroglobulin, GAP-DH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase), oder Trypsininhibitor) beschichtet wurden, durchgeführt.
- Charakterisierung von ELISA-positiven Klonen: Alle isolierten Antigen-spezifischen Klone wurden gegen ein Anzahl von nicht relevanten Antigenen wie oben beschrieben auf Kreuzreaktivität untersucht. Die Vielfalt der Klone wurde wie oben beschrieben mittels PCR-Screenen bestimmt und zumindest zwei Klone aus jedem Restriktionsmuster wurden mit dem Didesoxykettenabbruch-Verfahren sequenziert.
- Isolierung und Charakterisierung von phOx : BSA-Bindern: Nach 4 Selektionsrunden wurden die für phOx : BSA ELISA-positiven Klone isoliert. Alle Klone stammten aus der IgM- Bibliothek. Von den 96 analysierten Klonen banden sich 43 Klone sowohl an phOx : BSA wie auch an BSA mit optischen Dichten im Bereich von 0,4 bis 1,3 (Hintergrund 0,125). Diese Klone werden als BSA-Binder bezeichnet. Die Bindung an BSA schien spezifisch zu sein, da keiner der 11 analysierten Klone ein Signal über dem Hintergrund ergab, wenn er in einem ELISA mit KLH, Eialbumin, Chymotrypsin, Cytochrom c, Lysozym, Thyroglobulin, GAP-DH oder Trypsininhibitor verwendet wurde. Alle Klone, die sich an BSA binden, hatten dasselbe BstNI-Restriktionsmuster und 14 Klone wurden vollständig sequenziert. Dreizehn der vierzehn Klone hatten dieselbe Sequenz, VH stammte aus einen menschlichen Gen der VH3-Familie und VL aus einem menschlichen Gen der Vλ3-Familie (Tabelle 1). Der andere BSA-Binder stammte aus einem menschlichen Gen der VH4-Familie und einem menschlichen Gen der Vk1-Familie (keine Daten gezeigt).
- Es wurde ein Klon isoliert, der sich nur an phOx : BSA (OD 0,3) band, und der gebundene Phage konnte durch die Zugabe von 0,02 mM 4-ε-Aminocapronsäuremethylen-2- phenyl-oxazol-5-on (phOx-CAP) als Konkurrent ("competitor") vollständig verdrängt werden. Es wurde ebenfalls keine Bindung an die verschiedenen, nicht relevanten, oben beschriebenen Proteine über dem Hintergrund detektiert. Die Sequenz ergab ein VH aus einem menschlichen Gen der VH1-Familie und ein VL aus eine menschlichen Gen der Vλ1-Familie (Tabelle 7).
- Isolierung und Charakterisierung von Lysozym-Bindern: Nach 4 Selektionsrunden wurden für Putenlysozm 50 ELISA positive Klone isoliert. Die Mehrheit der Klone, nämlich mehr als 95%, stammten aus der IgM-Bibliothek. Die Bindung an Lysozym schien spezifisch zu sein, da keiner der 11 analysierten Klone ein Signal über dem Hintergrund ergab, wenn er in einem ELISA mit KLH, Eialbumin, Chymotrypsin, Cytochrom C, Lysozym, Thyroglobulin, GAP-DH oder Trypsininhibitor verwendet wurde. Die Lysozymbindenden Klone hatten 3 verschiedene BstNI-Restriktionsmuster und zumindest 2 Klone aus jedem Restriktionsmuster wurden vollständig sequenziert. Die Sequenzen zeigten das Vorhandensein von 4 einzigartigen menschlichen VH-VL-Kombinationen (Tabelle 7).
- Die Ergebnisse zeigen, daß Antigenbindeaktivitäten aus Repertoires von scFvs, die aus lgM-cDNA von menschlichen Freiwilligen, die nicht spezifisch immunisiert worden waren, isoliert werden kann.
- Dieses Beispiel beschreibt die Ergänzung von Gen 3-Fusionen aus einer menschlichen Bibliothek unter Verwendung eines Helferphagen mit einer Gen 3-Deletion.
- 100 ul der bakteriellen Stammlösung der IgM-Phagemidbibliothek, die wie beschrieben hergestellt wurde (Beispiel 32) und 5 · 10&sup8; Bakterien enthält, wurden verwendet, um 100 ml 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose (TY/Amp/Glu) zu beimpfen. Die wurde bei 37ºC 2,5 Stunden wachsen gelassen. 10 ml dieser Kultur wurden 90 ml vorgewärmtem TY/Amp/Glu zugegeben und die Infektion durch die Zugabe von 10 ml eines 200fachen Konzentrats des K07-Helferphagen, dem das Gen 3 fehlt (M13- K07gIIIΔNr.3) (Beispiel 27) und 1-stündiger Inkubation bei 37ºC ohne Schütteln durchgeführt. Die Herstellung von M13K07gIIIΔNr.3 war wie in Beispiel 27 beschrieben. Nach der 10-minütigen Zentrifugation bei 4.000 U/min wurden die Bakterien erneut in 100 ml 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin (ohne Glucose) suspendiert. Die Titration der Kultur an diesem Punkt ergab, daß es 1,9 · 10&sup8; Bakterien gab, wie aufgrund ihrer Fähigkeit, auf Platten zu wachsen, die sowohl Ampicillin (100 ug/ml) wie auch Kanamycin (50 ug/ml) enthalten, festgestellt wurde. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde unter Schütteln fortgesetzt, bevor die Bakterien in 2,5 Liter 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin, die sich in 5 2,5 Liter-Kolben befinden, überführt wurde. Diese Kultur wurde 16 Stunden inkubiert und der Überstand durch Zentrifugation gewonnen (10-15 Minuten bei 10.000 U/min in einer Sorvall RCSB-Zentrifuge bei 4ºC). Die Phagenpartikel wurden durch die Zugabe von 1/5 des Volumens an 20% Polyethylenglykol, 2,5 M NaCl, dann bei 4ºC 30 Minuten Stehenlassen und wie oben Zentrifugieren geerntet. Das resultierende Pellet wurde erneut in 40 ml 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4 suspendiert und die bakteriellen Zellreste durch Zentrifugation wie oben entfernt. Das Präparat der verpackten Phagemide wurde dann erneut gefällt, wie oben gesammelt und erneut in 10 ml 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4 suspendiert. Der Liter dieses Präparats enthielt 4,1 · 10¹³ transduzierende Einheiten/ml (Ampicillinresistenz).
- Mit OX-BSA beschichtete Röhrchen wurden wie in Beispiel 35 zum Panning der Phagemidbibliothek aus Beispiel 32 hergestellt. Die ergänzte Bibliothek wurde auch durch mit Rindlerthyroglobulin (Sigma) beschichtete Röhrchen angereichert. Diese wurden über Nacht bei 37ºC mit mit einer Konzentration von 1 mg/ml Thyroglobulin in 50 mM NaCO&sub3; pH 9,6 beschichtet. Die Röhrchen wurden mit PBS, die 2% Milchpulver (PBS/M) blockiert und 3 Stunden lang mit 1 ml der ergänzten Phagenbibliothek (dem Äquivalent von 250 ml Kulturüberstand), gemischt mit 3 ml PBS/M, inkubiert. Waschen, Elution, Neutralisation und Infektion waren wie in Beispiel 35.
- Die erste Panningrunde mit OX-BSA ergab 2,8 · 10&sup6; Phagen. Eine große Bakterienplatte mit 1,4 · 10&sup6; Kolonien, die aus diesem Eluat erhalten wurde, wurde in 10 ml 2xTY, 20% Glycerin geschabt, 10 Minuten geschüttelt und gelagert. Dies wurde auch verwendet, um eine frische Kultur zur Ergänzung mit M13K07gIIIΔNr.3 zu beimpfen. (Bakterien und ergänzte Phagen, die aus der ersten Panningrunde mit OX-BSA stammen, werden mit OXIPAN1 bezeichnet. Bakterien oder ergänzte Phagen, die aus der zweiten und dritten Panningrunde stammen, werden mit OXPAN2 bzw. OXPAN3 bezeichnet.) Die Ergänzung der Phagen mit M13K07gIIIΔNr.3 nach jeder Panningrunde war im wesentlichen wie oben beschrieben, aber unter Verwendung von 5 ml-Volumina für die Anfangskulturen in TY/Amp/Glu, unter Einsatz von 1 ml Helferphagen und mit der Überführung in 100-500 ml 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 50 > ug/ml Kanamycin. Die zweiten und dritten Panningrundenschritte waren wie oben für die erste beschrieben, aber unter Einsatz von 0,8-1,0 ml 100fach konzentrierten Phagen (das Äquivalent von 80-100 ml Kulturüberstand). Das Eluat aus der zweiten Panningrunde enthielt 8 · 10&sup8; infektiöse Partikel und das Eluat aus der dritten Panningrunde enthielt 3,3 · 10&sup9; infektiöse Partikel.
- Die erste Panningrunde mit Thyroglobulin ergab 2,52 · 10&sup5; infektiöse Partikel. Die Hälfte des Eluats wurde verwendet, um 1,26 · 10&sup5; bakterielle Klone auf einer großen Platte zu bilden. Diese Kolonien wurden in 10 ml 2xTY, 20% Glycerin gekratzt, 10 Minuten geschüttelt, aliquotiert und gelagert. Diese Bakterien und daraus stammende ergänzte Phagen werden mit THYPAN1 bezeichnet, und verwendet, um eine frische Kultur zur Ergänzung mit M13K07gIIIΔNr.3 zu beimpfen, um ein polyklonales ergänztes Phagenpräparat zu ergeben. Material, das auf ähnliche Weise aus Pannings der zweiten und dritten Runde stammt, wurde mit THYPAN2 bzw. THYPAN3 bezeichnet. Die Pannings mit Thyroblobulin in der zweiten und dritten Runde waren wie oben für die zweite und dritte Runde des Pannings mit OX-BSA beschrieben. Das Eluat aus der zweiten Panningrunde enthielt 8 · 10&sup7; transduzierende Einheiten, und das Eluat aus der dritten Panningrunde enthielt 6 · 10&sup7; infektiöse Partikel.
- 40 Kolonien, die aus der dritten Panningrunde mit Thyroglobulin (THYPAN3) stammten, wurden in eine 96-Napf-Platte gegeben und über Nacht bei 37ºC in TY/Amp/Glu wachsen gelassen. In ähnlicher Weise wurden 48 Kolonien aus zwei und 48 Kolonien aus drei Panningrunden mit OX-BSA gezüchtet (OX-PAN2 und OX-PAN3). Zur selben Zeit wurden polyklonale Phagen hergestellt. Am nächsten Tag wurden 5 ul aus jeder Kultur in 100 ul frisches vorgewärmtes TY/Amp/Glu überführt, 1,5 Stunden wachsen gelassen und Ml 3K07gIIINr.3 (2 · 10&sup5; infektiöse Phagen pro Napfin 100 jA TY/Amp/Glu) zugegeben. Diese wurden eine Stunde lang ohne Schütteln bei 37ºC inkubiert, mit 4.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, erneut in 150 ul 2xTY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin suspendiert und eine weitere Stunde unter Schütteln inkubiert, bevor 2 ml Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin zugegeben wurden. Nachdem die Kulturen über Nacht gewachsen waren, wurden sie mit 4.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, und die Überstände gesammelt. Die zum Screenen der THYPAN3-Klone verwendeten ELISA-Platten wurden bei 37ºC über Nacht mit 200 ug/ml Thyroglobulin in 50 mM NaCO&sub3; pH 9,6 beschichtet. Die für OXPAN2 und OXPAN3 verwendeten Platten wurden über Nacht bei 37ºC mit 200 ug/ml OX-BSA in PBS beschichtet.
- 120 ul des Kulturüberstandes wurden mit 5xPBS, 10% Milchpulver gemischt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Die ELISAs wurden wie in Beispiel 14 durchgeführt.
- Für Thyroglobulin waren 18 von 40 Klonen positiv (0,3-2,0 O.D. nach 30 Minuten). (Ein Phagenvergleich (Vektor pCAT3) ergab einen Wert von 0,07 O.D.). Zusätzlich waren positive Signale auch in den polyklonalen Phagenpräparaten THYPAN1 (0,314 O.D.) und THYPAN2 (0,189 O.D.) zu sehen, verglichen mit den aus der ursprünglichen, nicht gepannten Bibliothek stammenden Phagen (0,069 O.D.). Alle polyklonalen Phagen wurden mit PEG gefällt und in 10facher Konzentration verwendet.
- Die PCR-Reaktionen und BstN1-Spaltungen wurden mit den positiven Klonen wie oben beschrieben durchgeführt und sechs verschiedene DNA-Fragmentmuster erhalten, was zeigt, daß zumindest sechs verschiedene Klone isoliert worden waren.
- Bei OX-BSA waren nach zwei Panningrunden 30 von 48 Klonen im ELISA positiv und nach drei Runden 42 von 48. In einem getrennten Experiment wurde nach 30 Minuten ein positives Signal von den polyklonalen Phagenpräparaten OXPAN1 (0,988 O.D.) und OXPAN2 (1,717 O.D.) erhalten, verglichen mit den aus der ursprünglichen, nicht gepannten Phagemidbibliothek stammenden Phagen (0,186 O.D.).
- Selektierte Klone (11 Anti-Thyroglobulin, 5 Anti-OX-BSA), wobei jeder ein unterschiedliches BstNI-Restriktionsspaltmuster darstellt, wurden auf ihre Bindung an nicht relevante Antigene untersucht. ELISA-Platten wurden mit Antigen (100 ug/ml in 50 mM NaCO&sub3; pH 9,6) durch Inkubation bei 37ºC über Nacht beschichtet. Die Liste der Antigene besteht aus Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin, Hühnereilysozym, Rinderserumalbumin. Eiallbumin, Chymotrypsinogen, Cytochrom c, GAP-DH (Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase), Trypsininhibitor, Rinderthyroglobulin und Oxazolon-BSA. Doppelproben des Phagenüberstandes (80 ul + 20 ul 5xPBS, 10 Milchpulver) wurden jedem Antigen zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der ELISA wurde wie in Beispiel 14 durchgeführt.
- Jeder der Thyroglobulin-spezifischen Klone (11 von 11) war für Thyroglobulin positiv (O.D. 0,12-0,76), zeigte aber nach 60 Minuten keine Bindung (O.D. < 0,03) an eines der nicht relevanten Antigene. In ähnlicher Weise hatten 3 der 5 OX-BSA-spezifischen Klone eine O.D. von 0,07-0,52, im Vergleich zu O.D.s < 0,02 für die nicht relevanten Antigene. Keiner der 5 Klone zeigte irgendeine Bindung an 8SA alleine.
- Somit können positive Klone nach nur 2 Panningrunden durch Ergänzen mit M13K07- gIIIΔNr.3 isoliert werden. Zusätzlich gibt es mit diesem Helferphagen eine höhere Wahrscheinlichkeit für die Bildung von Phagenpartikel mit mehr als einem intakten Antikörpermolekül. Die erhöht möglicherweise die Avidität des Phagenantikörpers und ermöglicht die Isolierung von Klonen mit schwacher Affinität.
- Der D1.3-Antikörper bindet sich an Hühnereilysozym (HEL) mit einer Affinitätskonstante von 4,5 · 10&sup7; M&supmin;¹, hingegen bindet er sich an Puteneilysozym (TEL) mit einer Affinitätskonstante von < 1 x 10&sup5; M&supmin;¹ (Harper et al., 1987, Molecular Immunology 24, 5.97-108, Amit et al., (1986) Science 233, S. 747-753).
- Es wurde vermutet, daß der Grund dafür ist, daß der an der Position 121 von HEL vorhandene Glutaminrest (gln121) durch einen Histidinrest an derselben Stelle in TEL ersetzt ist. Somit kann die Mutagenisierung der D1.3-Antikörperreste, die mit gln121 von HEL in Wechselwirkung stehen, die Bindung an TEL erleichtern.
- Gemäß Amit et al., s.o., gibt es eine Wechselwirkung zwischen Tyrosin an der Position 32, Phenylalanin an der Position 91 und Tryptophan an der Position 92 der leichten Kette mit gln121 von HEL. Zusätzlich gibt es auch eine Wechselwirkung von Tyrosin an der Poslition 101 der schweren Kette. Es wird von keinem dieser Reste erwartet, daß er bei der Bestimmung der Hauptkettenkonformation der variablen Regionen des Antikörpers beteiligt ist. (Chothia and Lesk (1987), Journal of Molecular Biology 196, S.901- 917).
- Die Oligonucleotide mutL91,92 wurden hergestellt, um Phenylalanin an der Position 91 (L91) und Tryptophan an der Position 92 (L92) der leichten Kette statistisch abzuwandeln. Die Oligonucleotide mutL32 wurden hergestellt, um Tyrosin an der Position 32 der leichten Kette (L32) statistisch abzuwandeln, und die Oligonucleotide mut101 wurden hergestellt, um Tyrosin an der Position 101 der schweren Kette (H32) statistisch abzuwandeln.
- (N stellt eine statistische Insertion gleicher Mengen von A, C, G oder T dar). Die in vitro-Mutagenese des Phagemidvektors pCAT3scFvD1.3 (Beispiel 13) mit dem Oligonucleotid rnutL91,92 wurde unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham) durchgeführt. Die resultierende DNA wurde durch Elektroporation mit einem Bio-Rad- Elektroporator in TG1-Zellen transformiert. Es wurden 78.000 Klone erhalten und diese in 15 ml 2xTY/20% Glycerin gekratzt. Dieser Pool wurde D1.3L91 L92 genannt. Einsträngige DNA wurde durch Ergänzen mit M13K07 wie in Sambrook et al., 1989, s.o., hergestellt und mit dem Primer FDTSEQ1, unter Verwendung eines Sequenase-Sequenziersets (United States Biochemical Corporation) sequenziert.
- Dies zeigte, daß die DNA erfolgreich mutagenisiert wurde, durch das Vorhandensein von Banden in allen vier DNA-Sequenzierspuren an den Nucleotidpositionen, die für L91 und L92 kodieren, bestimmt wurde. Diese mutagenisierte einsträngige DNA wurde wie oben einer weiteren Mutageneserunde mit den Nucleotiden entweder mutL32 oder mutH101 unterzogen. Die Mutagenese mit mut32 ergab 72.000 Klone (der Pool wurde D1.3L32 genannt), während mutH101 102.000 Klone ergab (der Pool wurde D1.3H101 genannt). Diese Klone wurden in 2xTY/20% Glycerin gekratzt. Einzelstrang-DNA aus jedem Pool wurde mit den Oligonucleotiden D1.3L40 bzw. LINKSEQ1 sequenziert, wie oben beschrieben, und es wurde gezeigt, daß diese korrekt statistisch abgewandelt war.
- D1.3L40:
- 5'- CAG GAG CTG AGG AGA TTT TCC -3'
- LINKSEQ1:
- 5'- TCCGCC TGA ACC GCC TCC ACC -3'
- 10-20 ul Bakterien, die aus jedem mutagenisiertem Pool stammen (von Platten abgeschabt), wurden zum Beimpfen von 5 ml TY/Amp/Glu verwendet. Alle Bakterien wurden bei 37ºC wachsen gelassen. Nach 2-3 Stunden Wachstum wurde 1 ml zur Verdünnung in 5 ml vorgewärmtes TY/Amp/Glu gegeben und durch die Zugabe des in Beispiel 27 beschriebenen M13K07gIIIΔNr.3-Präparats infiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Kulturen bei 4.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, erneut in 2xTY mit 100 ug/ml Ampicillin suspendiert, eine weitere Stunde inkubiert, dann in 500 ml 2xTY mit 100 ug/rnl Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin überführt und dies 16 Stunden wachsen gelassen. Die verbleibenden Phagenherstellungsschritte waren wie in Beispiel 34. Die Phagen wurden schließlich in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4 in1/100 des ursprünglichen Kulturvolumens gelöst.
- 100 ml Puteneilysozym mit einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 M NaCl pH 8,3 wurden mit demselben Volumen an gequollener, mit Bromcyan aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) gemischt, kovalent gebunden und gemäß den Herstellerangaben gewaschen. Vor der Verwendung wurde diese Matrix (TEL-Sepharose) mit 100 Volumina PBS, gefolgt von 10 Volumina PBSM gewaschen. Die TEL-Sepharose wurde im gleichen Volumen PBSM erneut suspendiert, und 1 ml zu 1 ml eines 50fachen Phagenkonzentrats in PBSM gegeben und auf einer rotierenden Plattform 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die tatsächlich in diesem Schritt eingesetzten Phagen wurden hergestellt, indem gleiche Volumina der unabhängigen Präparate der drei statistisch abgewandelten Pools (D1.3L9L92, D1.3H101 und D1.3L32) vermischt wurden. Nach diesem Bindeschritt wurden die Suspensionen auf eine wegwerfbare Polypropyllen-Säule (Poly-Prep-Säulen, Bio-Rad) aufgegeben und mit 200 Volumina PBS mit 0,1% Tween 20 gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit 1 ml 100 mM Triethylamin eluiert und mit 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert. Aus dem Eluat wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt und zur Infektion von TG1-Zellen verwendet, die dann auf TY-Platten mit 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glucose ausplattiert wurden. Die Platten, die etwa 10&sup6; Kolonien aufwiesen, wurden in 3 ml 2xTY mit 20% Glycerin geschabt und bei -70ºC gelagert. 10 ul davon wurden zum Starten einer zweiten Kultivierungsrunde verwendet, die wie oben beschrieben mit M13K07gIIIΔNr.3 wiederhergestellt wurden (mit einem Endvkulturvolumen von 100 ml). Die zweite und dritte Runde von Affinitätssäulenreinigungsschritten wurden wie oben für die erste beschrieben durchgeführt.
- 40 Kolonien, die aus der dritten Säulenreinigungsrunde auf TEL-Sepharose stammen, wurden in eine 96-Napf-Platte gegeben und über Nacht bei 37ºC in 200 ul TY/Amp/Glu gezüchtet. Die Phagemidteilchen wurden wiederhergestellt und für den ELISA wie in Beispiel 13 beschrieben vorbereitet. Die ELISA-Platten wurden über Nacht bei 37ºC mit Hühnereilysozym (HEL) oder Puteneilysozym (TEL) mit einer Konzentration von 200 ug/ml in 50 mM NaCO&sub3; pH 9,6 beschichtet. Die ELISAs wurden wie in Beispiel 14 durchgeführt.
- Nach 15-minütiger Inkubation in Substrat, zeigte sich, daß 13 Klone negativ waren (O.D. < 0,05 bei HEL und TEL). Bei allen positiven wurde ein Signal von 0,1-0,78 bei HEL erzielt mit Ausnahme von einem, wo das Signal bei HEL 0,078 betrug, jedoch brachte das Signal bei TEL (O.D. 0,169) diesen in die positive Gruppe. Das Vergleichsphagemidpräparat hatte ein prozentuelles Signalverhältnis TEL : HEL von 22%. Es wurde angenommen, daß die Klone eine unveränderte Bindung aufweisen, wenn das Verhältnis TEL : HEL weniger als 40% betrug. 9 Klone fielen in diese Kategorie. Es wurden 18 Proben gefunden, die eine veränderte Bindung mit einem Signalverhältnis von zwischen 40-200% aufwiesen.
- Es wurden Verdünnungsreihen von 10 Klonen hergestellt, die mittels ELISA untersucht wurden. In 6 dieser Klone war das Bindungsprofil an HEL dasselbe wie im ursprünglichen Klon (pCAT2SCFvD1.3), während das Signal mit TEL verstärkt war (siehe Fig. 39, Klon B1). In den verbleibenden 4 Klonen wurde das mit TEL verstärkte Signal von einem Signalabfall mit HEL (siehe Fig. 40, Klon A4) begleitet.
- Alle isolierten Klone behielten die Bindung an HEL in verschiedenem Ausmaß. Um zu bestimmen ob ein lösliches Antigen mit dem immobilisierten in Konkurrenz treten kann, wurde wie oben ein Parallelexperiment durchgeführt, aber vor der Inkubation mit dem Phagenpräparat wurde zur TEL-Sepharose Hühnereilysozym (1 mg/ml) zugegeben. Dieses Experiment wurde mit 3 Säulenreinigungsrunden durchgeführt und 40 Kolonien erhalten. Keiner dieser Klone band HEL oder TEL, was zeigt, daß das lösliche Antigen durch Konkurrenz erfolgreich die Bindung an das immobilisierte Antigen unterbunden hatte.
- Wenn eine Antikörperspezifität isoliert wird, ist es oft wünschenswert, einige der Eigenschaften zu verändern, insbesondere seine Affinität oder Spezifität. Dieses Beispiel zeigt, daß die Spezifität eines Antikörpers durch die Verwendung einer unterschiedlichen VL-Domäne, die aus einem Repertoire solcher Domänen stammt, geändert werden kann. Dieses Verfahren unter Verwendung der Präsentation auf Phagen wäre für die Verbesserung sowohl von existierenden monoklonalen Antikörpern wie auch von Antikörperspezifität, die von Phagenantikörper erhalten wurden, anwendbar. Dieses Beispiel zeigt, daß der Austausch der VL-Domäne von scFvD1.3, der spezifisch für Hühnereiweißlysozym (HEL) ist, mit einer Bibliothek von VL-Domänen die Selektion von scFv- Fragmenten, die sich auch an Puteneiweißlysozym (TEL) binden, ermöglicht. Allgemeiner gesagt zeigt dieses Beispiel, daß Antikörperspezifitäten durch den Austausch einer variablen Domäne modifiziert werden können, und gibt ein weiteres Beispiel des hierarchischen Ansatzes zur Isolierung von Antikörperspezifitäten.
- Die schwere Kette von D1.3 wurde aus einem bestehenden Konstrukt (pSW1-VHD1.3, Ward et al., 1989, s.o.) mittels PCR unter Verwendung der Primer VH1 BACK und VH1FOR amplifiziert, die Bibliothek der leichten Kette wurde aus der aus der Milz einer nicht immunisierten Maus erhaltenen cDNA-Bibliothek, die unter Verwendung der MJK- FONX-Primer 1, 2, 4, 5 für den ersten Strang wie in Beispiel 12 synthetisiert wurde, amplifiziert. Die nachfolgende Amplifikation wurde mit denselben "Forward"- (Vorwärts-) Primern und dem VK2BACK-Primer durchgeführt. Die PCR-Assemblierung der schweren Kette von D1.3 mit der Bibliothek der leichten Kette wurde durch den Signalketten-Fv- Linker wie in Beispiel 12 beschrieben vermittelt.
- Die Klonierung der assemblierten PCR-Produkte (scFv-Sequenzen) wurden nach einem zusätzlichen PCR-Schritt ("pull-through") unter Verwendung eines BACK-Primers, der eine ApaLI-Stelle bereitstellt, und von forward-Primern, die wie in Beispiel 12 eine NotI- Stelle enthalten, durchgeführt. Mit ApaLI/NotI gespaltene PCR-Fragmente wurden in den ebenso gespaltenen Vektor fdCAT2 kloniert. Nach Elektroporation der Ligationsreaktion in MC1061-Zellen wurden 5 · 10&sup5; Transformationen erhalten.
- Das Screenen der Phagenbibliothek nach TEL-Bindern wurde durch Panning durchgeführt. Falcon 2058-Polystyrolröhrchen wurden (16 Stunden lang) mit 2 ml TEL-PBS (3 mg/ml) beschichtet und mit 4 ml MPBS (PBS mit 2% Magermilchpulver) blockiert. Aus der Bibliothek erhaltene Phagen (5 · 10'º transduzierende Einheiten) in 2 ml MPBS (2%) wurden 2 Stunden lang in diesen Röhrchen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden 3x mit PBS, 1x mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 0,5 M NaCl; 1x mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) 0,5 M NaCl; 1x mit 50 mM Tris-HCl (pH 9,5) 0,5 M NaCl gewaschen. Schließlich wurden die Phagen mit 100 mM Triethylamin eluiert. Die eluierten Phagen wurden verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren, die Zellen wurden auf 2xTY-Platten mit 15 ug/ml Tetracyclin ausplattiert und 16 Stunden lang wachsen gelassen. Die Kolonien wurden in 25 ml 2xTY-Medium gekratzt und die Phagen durch PEG-Fällung erhalten. Nach einer zweiten Selektionsrunde auf TEL-Binder wurden wie in Beispiel 2 beschrieben ELISAs durchgeführt.
- Die Analyse von 100 Klonen aus der Bibliothek durch ELISA auf mit TEL beschichteten Platten zeigte vor der Affinitätsselektion keine Binder. Im Gegensatz dazu zeigten etwa 10% der Phagenklone nach zwei Selektionsrunden auf TEL-bindende Phagen positive ELISA-Signale. Die ELISA-Signale galten als positiv, wenn die Werte um zumindest das Zweifache höher als die des fdCAT2-Vektors ohne Insert waren. Eine genauere Analyse der Bindeeigenschaften der TEL-bindenden Phagen ist in Fig. 41 gezeigt.
- Wie in Fig. 41 gezeigt wurden einige Klone gefunden, die sich im Gegensatz zum ursprünglichen D1.3 scFv, der sich fast ausschließlich an HEL bindet, in gleichem Ausmaß an TEL und HEL binden. Keiner der Klone band sich an BSA. Diese Entdeckungen zeigen, daß die Spezifität dieser scFvs im Vergleich zu D1.3 breiter ist, da beide Lysozyme (TEL und HEL) erkannt werden, daß aber die Spezifität für Lysozym beibehalten wurde, da BSA nicht erkannt wurde. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen (durch DNA-Sequenzieren erhalten) von zwei leichten Ketten aus den Klonen MF1 und M21, die den Klonen 3 und 9 in Fig. 41 entsprechen, sind in Fig. 42 dargestellt.
- Im Fall von isolierten Antikörpern kann der in dieser Untersuchung beschriebene Ansatz besonders nützlich sein, wenn die Erkennung eines weiteren Bereich verschiedener, aber eng verwandter Antigene gewünscht ist. Beispielsweise sind monoklonale Antikörper gegen virale Antigene wie die V3-Schleife des HIV1-gp 120 in den meisten Fällen aufgrund der Variabilität in diesem Teil des HIV1-env-Gens ziemlich spezifisch für ein bestimmtes Virusisolat. Die Modifikation solcher Antikörper auf die in diesem Beispiel beschriebene Weise könnte zu Antikörpern führen, die mit einem größeren Bereich von HIV-1-Isolaten kreuzreagieren, und wäre daher möglicherweise von hohem Wert für die Therapie und Diagnose.
- Ein ähnlicher Ansatz könnte durchgeführt werden, bei dem die variable Region der leichten Kette mit den gewünschten Eigenschaften fixiert gehalten wird und mit einer Bibliothek von variablen Domänen der schweren Kette kombiniert wird. Eine schwere Ketten, beispielsweise VHD1.3 behalten ihre Bindeaktivität als Einzeldomänen. Dies könnte zu einer Strategie führen, worin VH-Domänen, wenn sie auf Phagen exprimiert werden, auf Bindeaktivität gescreent werden, und dann die bindenden Domänen mit einer Bibliothek von VL-Domänen zur Selektion von geeigneten Leichtkettenpartnern kombiniert werden.
- Wenn sich ein Phagenantikörper mit hoher Affinität oder Avidität an sein Antigen bindet, kann es sein, daß es nicht möglich ist, den Phagenantikörper mit einem dem Antigen verwandten Molekül von der Affinitätsmatrix zu eluieren. Alternativ dazu kann es sein, daß es kein geeignetes spezifisches Molekül zur Elution gibt, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das nicht für den Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist. Leider zerstören einige der nicht spezifischen Elutionsverfahren die Phagenstruktur, beispielsweise nimmt die Phagenlebensfähigkeit bei pH 12 mit der Zeit ab (Rossomando, E. F. and Zinder, N. D. J. Mol. Biol. 36, 387-399, 1968). Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, das die Elution von gebundenen Phagenantikörpern unter schonenden Bedingungen (Reduktion einer Dithiol-Gruppe mit Dithiothreitol), die die Phagenstruktur nicht: zerstören, ermöglicht.
- Das Zielantigen wurde mit einem spaltbaren Biotinylierungsreagens biotinyliert. Mit 2- Phenyl-5-oxazolon (O. Makela et al., s.o.) konjugiertes BSA wurde unter Verwendung eines Biotinylierungsreagens mit einer spaltbaren Dithiol-Gruppe (Sulfosuccinimidyl-2- (biotinarnido)ethyl-1,3-dithiopropionat von Pierce) gemäß den Herstellerangaben modifiziert. Diese biotinylierte Antigen wurde an mit Streptavidin beschichtete magnetische Perlen (Dynal) gebunden und der Komplex verwendet, um Phagen zu binden. Die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen wurden mit Antigen vorbeschichtet, indem 650 ug biotinyliertes OX-BSA in 1 ml PBS mit 200 ul Perlen zumindest eine Stunde lang beü Raumtemperatur vermischt wurde. Ein Vierzigstel des Komplexes (äquivalent mit 5 ul Perlen und einem Input von 17,5 ug OX-BSA) wurden zu 0,5 ml Phagen in PBSM (IPBS mit 2% Magermilchpulver) mit 1,9 · 10¹&sup0; Phagenteilchen gegeben, und in den in Tabelle 8 gezeigten Verhältnissen von pAbD1.3, der gegen Lysozym (Beispiel 2) gerichtet ist, zu pAbNQ11, der gegen 2-Phenyl-5-oxazolon gerichtet ist, vermischt.
- Nach 1-stündiger Inkubation unter Mischen bei Raumtemperatur wurden die magnetischen Perlen unter Verwendung einer Dynal MPC-E Magnettrennvorrichtung wiedergewonnen. Sie wurden dann in PBS mit 0,5% Tween 20 (3 · 10 Minuten, 2 · 1 Stunde, 2 · 10 Minuten) gewaschen und die Phagen durch 5-minütige Inkubation in 50 ul PBS mit 10 rnM Dithiothreitol eluiert. Das Eluat wurde verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren und die resultierenden Kolonien wurden mit dem Oligonucleotid NQ11 CDR3 (5'- AAACCAGGCCCCGTAATCATAGCC-3'), das aus CDR3 des NQ11-Antikörpers (dieser hybridisiert mit pAbNQ11, aber nicht mit pAb D1.3) stammte.
- Eine 670fache Anreicherung von pAbNQ11 (Tabelle 8) wurde von einem Hintergrund von pAbD1.3 in einer einzigen Panningrunde unter Verwendung des Äquivalents von 17,5 ug biotinyliertem OX-BSA erreicht.
- Dieser Elutionsvorgang ist nur ein Beispiel eines Elutionsvorgangs unter schonenden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren wäre der Einbau einer Nucleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, welche eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hochspezifische Protease darstellen, zwischen den fremden, insertierten Gen, in diesem Fall ein Gen für ein Antikörperfragment, und der verbleibenden Sequenz des Gen III. Beispiele für solch hochspezifische Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach der Bindung des Phagen an die Affinitätsmatrix und der Elution zur Entfernung von nicht spezifisch bindenden und schwach bindenden Phagen würde der stark bindende Phage durch das Waschen der Säule mit einer Protease unter Bedingungen, die zur Spaltung der Spaltstelle geeignet sind, entfernt werden. Dies würde das Antikörperfragment vom Phagenpartikel abspalten und den Phagen eluieren. Es wäre zu erwarten, daß diese Phagen infektiös sind, da die einzige Proteasestelle die eine spezifisch eingebaute sein sollte. Die stark bindenden Phagen könnten dann durch Infektion von z. B. E.coli TG1-Zellen wiedergewonnen werden.
- Es gibt etwa 10¹&sup4; verschiedene Kombinationen der leicht und schweren Ketten, die aus der Milz einer immunisierten Maus stammen. Wenn der statistische kombinatorische Ansatz verwendet wird, um Fragmente der schweren und leichten Ketten in einen einzelnen Vektor zur Präsentatoin von scFv-, Fv- oder Fab-Fragmenten auf Phagen kloniert werden, ist es kein praktischer Vorschlag, alle 10¹&sup4; Kombinationen zu präsentieren. Ein Ansatz zur Reduktion der Komplexität, der in diesem Beispiel beschrieben ist, ist es, nur Gene aus nach Antigen selektierten Zellen zu klonieren. (Ein alternativer Ansatz, der sich mit der Komplexität auseinandersetzt, ist die duale kombinatorische Bibliothek, wie in Beispiel 22 beschrieben).
- Das Immunsystem nützt die Bindung von Antigen durch Oberflächenimmunglobuline, um die Zellenpopulation auszuwählen, die mit der Herstellung spezifischer Antikörper reagiert. Dieser Ansatz zur Auswahl Antigen-bindender Zellen wurde untersucht, um die Anzahl der kombinatorischen Möglichkeiten zu verringern und so die Chance, die ursprüngliche Kombination von schweren und leichten Ketten zu erhalten, zu erhöhen.
- Die Immunreaktion auf das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP) wurde ausführlich untersucht. Da die primäre Immunreaktion auf NP nur eine einzige leichte Kette nützt, konnten die Anmelder die Verwendung des kombinatorischen Verfahrens mit einer fixierten leichten Kette und einer Bibliothek von schweren Ketten untersuchen, um die Häufigkeiten der Gene, die für Antikörper, die sich an NIP (4-Hydroxy-3-iod-5-nitrophenylessigsäure) binden, zu untersuchen. Die Anmelder nutzten somit dieses System, um die Vorteile der Auswahl von Zellpopulationen vor der Herstellung kombinatorischer Bibliotheken zur Präsentation auf Phagen zu untersuchen.
- Hühner-γ-Globulin (CGG, Sigma, Poole, UK) und Rinderserumalbumin (BSA, Böhringer- Mannheim, Deutschland) wurden mit NP-O-Succinimid oder NIP-Capronat-O-succinimid (Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK) basierend auf dem Verfahren, das von Brownstone (Brownstone, A. Mitchison, N. A. and Pitt-Rivers, R. Immunology 1966, 10: 465-492) beschrieben wurde, konjugiert. Die aktivierten Verbindungen wurden in Dimethylformamid gelöst und zu Proteinen in 0,2 M NaHCO&sub3; zugegeben. Diese wurden unter konstantem Rühren 16 Stunden lang vermischt und dann unter mehrfachem Wechseln gegen 0,2 M NaHCO&sub3; dialysiert. Sie wurden schließlich gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert (PBS). Die hergestellten Konjugate waren NP&sub1;&sub2;CGG, NIP&sub1;&sub0;BSA. Das NIP&sub1;&sub0;BSA-Derivat wurde darauffolgend unter Verwendung eines von Amersham gelieferten Biotinylierungssets (Amersham International, Amersham, UK) biotinyliert.
- Mäuse des Stammes C57BL/6 wurden durch intraperitoneale Injektion von 100 ug NP- CGG in vollständigem Freund-Adjuvans im Alter von 10 Wochen immunisiert.
- Sieben Tage nach der Immunisierung wurden die Milzzellen wie von Galfre und MIIstein (Galfre, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 1981. 73: 3-46) beschrieben, aufgearbeitet. Die roten Blutkörperchen wurden mit Ammoniumchlorid (Boyle, W., Transplantation 1968. 6: 71) lysiert und nach der Durchführung der Zellenselektion wurden tote Zelllen nach dem Verfahren von Böhmer und Shortman (Böhmer, H., and Shortman, K., J. Immunol. Methods 1973. 1: 273) entfernt. Die Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1% Rinderserumalbumin, 0,01% NaN&sub3; suspendiert; die Zellen wurden während des gesamten Zellselektionsvorganges in diesem Medium auf 4ºC gehalten.
- Biotinyliertes NIP-BSA wurde an mit Streptavidin gekuppelte magnetische Perlen (Dynabeads M280 Streptavidin, Dynal, Oslo, Norwegen) gekuppelt, indem 10&sup8; Perlen mit 100 ug biotinyliertem Protein eine Stunde lang mit gelegentlichem Rühren inkubiert wurden und dann fünfmal gewaschen wurden um ungebundenes Antigen zu entfernen. Die gekuppelten Perlen wurden bis zur Verwendung in Medium bei 4ºC aufbewahrt. Zur Selektion der Antigen-bindenden Zellen wurden die Zellen (2-4 · 10&sup7;/ml) zuerst 30 Minuten mit nicht gekuppelten Perlen in einem Perlen : Zellen-Verhältnis von 1 : 1 inkubiert. Die Perlen wurden dann getrennt, indem das Röhrchen für 3-5 Minuten in eine Magnetvorrichtung (MPC-E Dynal) gegeben wurde. Die ungebundenen Zellen wurden entfernt und dann mit an NIP-BSA gekuppelten magnetischen Perlen in einem Per- Ien : Zellen-Verhältnis von 0,1 : 1 60 Minuten lang mit gelegentlichem Rühren inkubiert. Die Perlen und die rosettenförmigen Zellen wurden wie oben beschrieben getrennt. Die Perlen vvurden dann in 1 ml Medium erneut suspendiert und die Trennung wiederholt; dieser Vorgang wurde 5-7mal wiederholt, bis bei der Zählung mit einem Hämozytometer keine Zellen mehr nachgewiesen werden konnten.
- Zur Ablösung der Zellen mit Oberflächenimmunglobulin wurden die Zellen mit 20 mg biotinylüertem mehrwertigem Anti-Maus-Immunglobulin aus Ziegen (Sigma, Poole, UK) inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit Medium gewaschen und mit einem Perlen : Zellen-Verhältnis von 30 : 1 zu an Streptavidin gekuppelte magnetische Perlen zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Perlen und die rosettenförmigen Zellen durch 3maligen Gebrauch der Magnetvorrichtung getrennt, wobei jedesmal der Überstand genommen wurde.
- DNA wurde durch ein einfaches Proteinase-K-Spaltverfahren, das insbesondere für geringe Zellzahlen günstig ist (PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications. Hrsg. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J. und Whit T. J., Academic Press), isoliert. Die RNA- Isolierung und nachfolgende cDNA-Synthese wurden wie von Gherardi et al. (Gherardi, E., Pannell, R. und Milstein, C., J. Immunol. Methods, 1990. 126: 61-68) durchgeführt. Die PCR; und das Klonieren der Bibliotheken der schweren Kette wurden unter Verwendung der von Ward et al. (Ward, E. S., Güssow, D., Griffiths, A. D., Jones, P. T. and Winter, G., Nature, 1989. 341: 544-546) beschriebenen Primer und Bedingungen durchgeführt. Die verwendeten VH- und Fv-Expressionsvektoren wurden den bereits von Ward et al. beschriebenen angepasst. Sie wurden beide in pUC119 (Vieira and Messing, siehe weiter unten) subkloniert und der Fv-Expressionsvektor wurde dahingegend modifiziert, daß er eine leichte Kette der Keimlinie λ-1 (von T. Simon zur Verfügung gestellt (ursprünglich von Siegfried Weiss, Basel, Immunologie-Institut, kloniert)) umfaßt. Der Vektor ist in Fig. 53 gezeigt.
- Zum Screenen wurden einzelne Kolonien in einzelne Näpfe von Mikrotiterplatten (Bibby) in 200 ul 2xTY/100 ug/ml Ampicillin/0,1% Glucose gegeben und dann unter Rühren 5-6 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, Sigma, Poole, UK) wurde dann auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation für weitere 16 Stunden bei 16ºC fortgesetzt, bevor die Überstände geerntet wurden. Die Näpfe von Falcon-ELISA-Platten (Becton Dickinson, N. J., USA) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit NIP&sub1;&sub0;-BSA (40 1ug/ml in PBS) beschichtet und dann mit 2% Magermilchpulver in PBS 2 Stunden lang blockiert. Die bakteriellen Überstände wurden zugegeben, und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden die Platten dreimal mit PBS blockiert. An Peroxidase konjugierte Anti-Maus-λ-Kette aus Ziegen (Southern Biotechnology, Birmingham, USA) wurde zugegeben und erneut 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach sechs Waschungen mit PBS und die Entwicklung mit 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma, Poole, UK) als Peroxidasesubstrat erfolgen. Die optische Dichte bei 405 nm unter Einsatz eines Thermomax-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, Menlo Park, USA) nach 30 Minuten abgelesen. Western-Blotten erfolgte unter Verwendung des C-terminalen myc tag wie in Beispiel 23.
- Die Ergebnisse der Antigenselektion sind in Tabelle 9 gezeigt. Weniger als 1% der Zellen binden sich an mit NIP-BSA beschichtete Perlen und die nicht spezifische Bindung ist sehr gering. Die Bestimmung des Anteils der exprimierten Gene aus jeder VH-Bibliothek mittels Western-Blot zeigte, daß VH-Domänen in der vollen Länge in 95% aller Klone exprimiert wurden, wenn RNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde, aber nur 60% (12/20) der Klone, wenn DNA (entweder selektierte Zellen oder von der ganzen Milz) als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Dieser Unterschied resultiert wahrscheinlich aus der Tatsache, daß viele neugeordnete Pseudogene mit den Primern der Anmelder amplifiziert werden könnten und es schein so zu sein, daß es auf der Ebene der Transkription einen gewissen Selektionsgrad nach funktionellen Genen geben muß.
- Eine variable Anzahl an Klonen aus jedem Bibliothekstyp wurde zur Herstellung von Fv- Fragmenten, die sich an NIP banden, gescreent. Es wurden zu Beginn Screen-ELISAs durchgeführt und die positiven genommen, um jene mit einer optischen Dichte von zumindest dem Zweifachen des Hintergrunds zu umfassen. Die anfangs Positiven wurden erneut tiransformiert und die Bindung doppelt überprüft; es wurde bestätigt, daß die Bindung für NIP spezifisch war und für BSA nicht. Die Häufigkeit von bestätigten, NIP-bindenden positiven Klonen ist für jedes Ausgangsmaterial in Tabelle 10 gezeigt. Die Verwendung von DNA als Ausgangsmaterial zur PCR-Amplifikation ist etwa äquivalent zum Probennehmen von Zellen, da es nur ein funktionelles, neugeordnetes Gen der schweren Kette und zumeist ein neugeordnetes Pseudogen pro B-Zelle gibt. Das Amplifizieren aus der RNA eines Tieres beeinflußt das Repertoire in Richtung der reagierenden Zellen, und in einem kurz davor immunisierten Tier würde man erwarten, daß dies einige Nachteile für das Antigen ergibt. Aus den Daten in Tabelle 10 geht klar hervor, wie wirkungsvoll diese Selektion mit der Anzahl der Antigen-spezifischen Gene ist, welche um zumindest das 96fache angereichert werden, wenn RNA, die eine Woche nach der primären Immunisierung hergestellt wurde, als Ausgangsmaterial verwendet wird. Die Daten zeigen auch, daß die Selektion nach Antigen-bindenden Zellen ein alternatives wirkungsvolles Selektionsverfahren für das erforderliche genetische Ausgangsmaterial ist.
- Um die zelluläre Basis der durch die Verwendung von RNA als Ausgangsmaterial erreichten Selektion zu untersuchen, wurde die Milz von Oberflächenimmunglobulin-positiven Zellen unter Verwendung von biotinyliertem anti-mehrwertigen Immunglobulin und von mit Streptavidin konjugierten magnetischen Perlen. die vorherige FACS-Analyse hatte gezeigt, daß dieses Verfahren mehr als 96% der Oberflächenimmunglobulin-positiven Zellen entfernt. RNA wurde sowohl aus Fraktionen, denen das Oberflächenimmunglobulin abgelöst wurde, als auch von abgelösten Fraktionen einer Milz isoliert und aus jeder VH-Bibliotheken hergestellt. Die ELISA-Ergebnisse (Tabelle 10) zeigen die Anzahl von Positiven durch diese Ablösung sicher nicht abnimmt, was vermuten läßt, daß der Hauptteil der selektiven Wirkung der Verwendung von RNA aus Oberflächenimmunglobulin-negativen G-Zellen (wahrscheinlich Plasmazellen) kommen kann.
- Die Anmelder haben die Wichtigkeit der Amplifikation von spezifischer RNA, die durch Immunisierung hergestellt wurde, gezeigt, um zu ermöglichen, daß Bindeaktivität mit beliebiger, annehmbarer Häufigkeit aus einer kombinatorischen Bibliothek erhalten wird. Die Anmelder zeigten auch eine alternative Strategie, die jene des Immunsystems selbst imitiert. Die Verwendung eines einfachen Verfahrens zur Selektion nach Antigenbindenden Zellen ergab eine vergleichbare Anreicherung und hat den zusätzlichen Vorteil, daß ein größerer Bereich von Genen eingesetzt wird. Auf den ersten Blick scheint es aufgrund der gewaltigen Vielfalt der Immunglobulingene unwahrscheinlich, daß der statistische kombinatorische Ansatz die ursprüngliche Komination der schweren und leichten Kette ergibt. Die Anmelder zeigen hier jedoch, daß nach der Immunisierung, mit einem guten Antigen, 10% der VH-Gene aus der gesamten isolierten RNA der Milz aus den Antigen-spezifischen Zellen kommen, sodaß die wirksame Größe des Repertoires stark reduziert wird. Dies zusammen mit der Tatsache, daß Promiskuität der schweren und leichten Ketten auftritt (Beispiel 17 und 18), erklärt die Tatsache, daß das kombinatorische System Antigen-bindende Klone mit annehmbarer Frequenz ergibt. Die Daten lassen auch vermuten, daß der Hauptteil der Antigen-spezifischen RNA aus Oberflächenimmunglobulin-negativen Zellen, die sehr wahrscheinlich Plasmazellen sind, stammt.
- Die Daten zeigen auch, daß dieses einfache Verfahren zur Antigenselektion bei der Reduktion der Komplexität der kombinatorischen Bibliothek nützlich sein kann. In diesem Fall wurde eine zumindest 56fache Anreicherung von Antigen-spezifischen Genen erreicht, was im Normalfall, wenn schwere und leichte Ketten nicht bekannt sind, eine Verringerung der Komplexität der kombinatorischen Bibliothek um einen Faktor von mehr als 3000 ergeben würde. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von Antigen-selektierten Zellen (und dem Amplifizieren von DNA, um allfällige Nachteile aufgrund des Zustands der Zellen zu verringern) ist es, daß dies einen größeren Bereich von amplifizierten Antikörpergenen ergibt. Es kann sein, daß eine einfache Zellenselektion, wie z. B. jene, die die Anmelder hier beschrieben haben, in Kombination mit der Phagenselektion ideal wäre. Aus diesem Beispiel ist zu sehen, daß durch die Kombination von Zellen- und Phagenselektionsverfahren vernünftigerweise erwartet werden kann, daß man alle Kombinationen der schweren und leichten Ketten (etwa 4 · 10¹&sup0;) screent und somit in der Lage wäre, alle Bindekombinationen zu screenen, obwohl dies zur Zeit nicht aus der ganzen Milz (etwa 4 · 10¹&sup4; Kombinationen, mit der Annahme von 50% B- Zellen) möglich wäre. Tabelle 1. Anreicherung von pAb (D1.3) aus der Vektorpopulation
- Fußnoten: a Etwa 10¹² Phagen mit dem angegebenen Verhältnis von pAb (D1.3) FDTPs/B5 wurden auf 1 ml Lysozym-Sepharose-Säulen aufgebracht, gewaschen und eluiert. b TG1-Zellen wurden mit dem eluierten spezifisch bindenden Phagen infiziert und auf TY-tet-Platten ausplattiert. Nach der Inkubation bei 30-37ºC über Nacht, wurden die Platten durch Hybridisierung an das ³²P-markierte Oligonucleotid VH1 FOR (Ward et al., s.o.), der spezifisch für pAb D1.3 ist, analysiert. C Einzelne Kolonien aus den Über- Nacht-Platten wurden gezüchtet, die Phagen gereinigt und auf Lysozymbindung untersucht. d Die Anreicherung wurde aus den Oligonucleotidsondierungsdaten berechnet. Tabelle 2 Anreicherung von pAb (D1.3) aus der gemischten pAb-Population
- Bemerkungen:
- 1. 10¹&sup0; Phagen wurden auf die Lysozymsäule wie in Tabelle 1 aufgebracht.
- 2. Das Ausplattieren der Zellen und das Sondieren mit Oligonucleotid erfolgte wie in Tabelle 1, außer daß das Oligonucleotid D1.3CDR3A war. Tabelle 3. Affinitätsselektion von Hapten-bindenden Phagen
- # im Abschnitt C beziehen sich die Zahlen auf VH-BNK-d-Kolonien
- * Zahlen nach drei erneuten Infektionen und Wachstumzyklen. Dieser Vergleich, der die Säulenschritte ausläßt, bestätigt, daß nicht ein verfälschtes Wachstum oder ein Infektiösitätsvorteil für die Anreicherung von Klon VH-B/Vκ-d verantwortlich sind. Tabelle 4
- Überblick der phOx-BSA-ELISA-Ergebnisse der Phagen- und Phagemidkonstruktionen.
- * Bei Phagen wurden als Bindung betrachtet, wenn OD&sub4;&sub0;&sub5; zumindest 10fach größer als der Hintergrund im ELISA war; E.coli
- TG1 wurde zum Züchten des Phagen verwendet, außer es ist speziell die Verwendung von E.coli HB2151 angegeben; # Die Information ist aus der genetischen Struktur abgeleitet und stimmt mit den Bindungsdaten überein;
- § Das Ergebnis wurde experimentell durch Western-Blot bestätigt (für Fab, siehe Fig. 26).
- Tabelle 5 Mutationen in scFvB18, die nach dem Wachstum in Mutatorstämmen durch Präsentation auf Phagen selektiert wurden. Tabelle 6(i) Oligonukleotidprimer, die zur PCR der menschlichen Immunglobulingene verwendet wurden
- Primer für die Konstantregion der menschlichen schwere Kette Tabelle 6(ii)
- Primer für die menschliche κ-Konstantregion Tabelle 6(iii)
- Primer für die menschliche κ-Konstantregion Tabelle 6(iv) Tabelle 6(v) Tabelle 7 Abgeleitete Proteinsequenzen der schweren und leichten Ketten, die aus einer nicht immunisierte Bibliothek selektiert wurden. Tabelle 8 Anreicherung von pAbNQ11 aus einem pAbD1.3-Hintergrund durch Affinitätsselektion unter Verwendung von biotinyliertem Ox-BSA mit einem spaltbaren Reagens und Bindung; an Streptavidinmagnetperlen
- ¹ 1,9 · 10¹&sup0; Phagen in 0,5 ml wurde 1 Stunde mit 5 ul zuvor mit Antigen (OX-BSA)- beschichteten Streptavidinmagnetperlen
- ² Die Kolonien wurden mit dem Oligonucleotid NQ11CDR3 sondiert. Tabelle 9: Ergebnisse der Antigen-Zellenselektion Tabelle 10: Ergebnisse der Fv-NIP-bindenden ELISAs aus selektierten Zeilpopulationen
- * Anreicherungsgrad, verglichen mit Gesamt-DNA
Claims (8)
1. Filamentöses Bakteriophagen-Teilchen, auf dessen Oberfläche ein
Bindungsmolekül präsentiert wird, das ein Fab- oder Einzelketten-Fv-Antikörpermolekül ist, das eine
Bindungsdomäne umfasst, die sich an Target-Epitop oder -Antigen binden kann, wobei
das Teilchen ein Phagemid-Genom enthält, das Nucleinsäure mit einer
Nucleotidsequenz umfasst, die für das Bindungsmolekül kodiert, das von der Nucleinsäure
exprimiert wird und auf der Oberfläche des Teilchens präsentiert wird.
2. Filamentöses Bakteriophagen-Teilchen nach Anspruch 1, worin das
Bindungsmolekül ein scFv-Antikörpermolekül ist.
3. Filamentöses Bakteriophagen-Teilchen nach Anspruch 1, worin das
Bindungsmolekül ein Fab-Antikörpermolekül ist.
4. Population von filamentösen Bakteriophagen-Teilchen nach einem der
Ansprüche 1 bis 3, auf denen eine Population der Bindungsmoleküle präsentiert wird, die eine
Bandbreite von Bindungsspezifitäten aufweisen.
5. Verfahren zur Herstellung eines filamentösen Bakteriophagen-Teilchens, auf
dessen Oberfläche ein Bindungsmolekül präsentiert wird, das für ein bestimmtes Target-
Epitop oder -Antigen spezifisch ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
das Erzeugen einer Population filamentöser Bakteriophagen-Teilchen, auf deren
Oberfläche eine Population von Bindungsmolekülen präsentiert wird, die eine
Bandbreite von Bindungsspezifitäten aufweisen, worin die Bindungsmoleküle
Fab-Antikörpermoleküle sind, die sich an das Target-Epitop oder -Antigen binden können, und
worin jedes filamentöse Bakteriophagen-Teilchen ein Phagemid-Genom enthält, das
Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die für das Bindungsmolekül kodiert,
das von der Nucleinsäure exprimiert wird und auf der Oberfläche der Teilchen
präsentiert wird,
das Selektieren bezüglich eines filamentösen Bakteriophagen-Teilchens, auf dem
ein Bindungsmolekül mit einer gewünschten Spezifität präsentiert wird, durch
Kontaktieren der Population filamentöser Bakteriophagen-Teilchen mit einem Target-Epitop
oder -Antigen, so dass einzelne Bindungsmoleküle, die auf den filamentösen
Bakteriophagen-Teilchen präsentiert werden, sich mit der gewünschten Spezifität an das Target-
Epitop oder -Antigen binden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, das zusätzlich das Abtrennen gebundener
filamentöser Bakteriophagen-Teilchen vom Target-Epitop oder -Antigen umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, das zusätzlich das Gewinnen abgetrennter
filamentöser Bakteriophagen-Teilchen umfasst, auf denen ein Bindungsmolekül mit der
gewünschten Spezifität präsentiert wird.
8. Verfahren zur Herstellung eines Bindungsmoleküls, das für ein bestimmtes
Target-Epitop oder -Antigen spezifisch ist, wobei das Verfahren umfasst:
die Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7;
das Isolieren von Nucleinsäure, die für das Bindungsmolekül kodiert, von
abgetrennten filamentösen Bakteriophagen-Teilchen, die nach dem Verfahren nach Anspruch
7 gewonnen wurden;
das Insertieren von Nucleinsäure, die für das Bindungsmolekül kodiert, oder
eines Fragments oder Derivats davon mit Bindungsspezifität für das Target-Epitop oder
-Antigen, in einem rekombinanten System; und
das Erzeugen des Bindungsmoleküls oder Fragments oder Derivats davon mit
Bindungsspezifität für das Target-Epitop oder -Antigen im rekombinanten System,
getrennt von den filamentösen Bakteriophagen-Teilchen.
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