MX2011000501A

MX2011000501A - Composiciones monovalentes para union a cd28 y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2011000501A
Application number: MX2011000501A
Authority: MX
Inventors: Olga Ignatovich; Murray Mckinnon; Steven G Nadler; Suzzane J Suchard; Brendan Classon; Steve Holmes; Christopher Plummer; Steve Grant
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2011-05-23
Also published as: US8168759B2; CL2012002428A1; CA2731220A1; JP2015120695A; HUE029982T2; PE20140852A1; US20130109846A1; LT2700651T; PT2700651T; ES2730727T3; WO2010009391A1; TW201336510A; RS54675B1; PT2321352E; CY1121796T1; HRP20160329T1; EP2700651A1; KR101660057B1; PL2700651T3; TW201006494A

Abstract

Se describen anticuerpos de dominio que se unen a CD28 monovalentemente. Los anticuerpos de dominio que son monovalentes para la unión a CD28 pueden inhibir la actividad de CD28. En un aspecto, un anticuerpo de dominio consiste en, o comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente y antagoniza la actividad de CD28, en un aspecto, sin agonizar sustancialmente la actividad de CD28. En otro aspecto, el anticuerpo de dominio es un anticuerpo de dominio humano. La descripción abarca además métodos para antagonizar las interacciones de CD80 y/o CD86 con CD28 en un individuo y métodos de tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen interacciones de CD80 y/o CD86 con CD28, los métodos incluyen la administración de un anticuerpo de dominio al individuo.

Description

COMPOSICIONES MONOVALENTES PARA UNION A CD28 Y METODOS DE USO Campo de la Invención Se proporcionan anticuerpos de dominio (dAbs) que se unen a CD28 y previenen la unión de CD28 a CD80 y/o CD86, en donde los dAbs no reaccionan en forma cruzada con CTLA , y métodos de uso de los mismos.

Antecedentes de la Invención Las interacciones intercelulares no específicas de antígenos entre linfocitos T y células presentadoras de antígenos (APCs) generan señales co-estimuladoras de células T que generan respuestas de células T a antígenos (Jenkins y Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol . 5:361-367). Las señales co-estimuladoras determinan la magnitud de una respuesta de célula T a antígeno y si esta respuesta activa o inactiva respuestas subsecuentes a antígenos (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:445-480) . La activación de células T en ausencia de co-estimulación se traduce en una respuesta de células T abortada o anérgica (Schwartz, R. H. (1992) Cell 71:1065-1068). Una señal co-estimuladora clave es provista por la interacción del receptor de superficie de célula T CD28 con moléculas relacionadas con B7 en células presentadoras de antígenos (por ejemplo, B7-1 y B7-2 o CD80 y CD86, respectivamente) (P. Linsley y J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:191-212) . La interacción de CD28 con REF . : 216844 moléculas co-estimuladoras B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) proporciona una gran vía de señalización para incrementar y prolongar las respuestas de células T (Freedman et al. (1987) J. Immunol. 137:3260-3267; Freeman et al. (1989) J. Immunol . 143:2714-2722; Freeman et al. (1991) J". Exp. Med. 174:625-631; Freeman et al. (1993) Science 262:909-911; Azuma et al. (1993) iVature 366:76-79; Freeman et al. (1993) J. Exp. Med. 178:2185-2192) .

CD28 es expresado constitutivamente en la superficie de células T, virtualmente todas las células T CD+ humanas, a un menor grado en células T CD8+ humanas, algunas células asesinas naturales y todas las células T de murino. CD28 es una glicoproteína de transmembrana tipo I y es un miembro de la familia de inmunoglobulinas en virtud de su único dominio extracelular tipo variable Ig el cual tiene un motivo MYPPPY (SEQ ID NO: 639) requerido para la unión a CD80 y CD86 (Peach et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2049-2058). CD28 tiene un residuo de cisteína ubicado después del dominio tipo variable de Ig, que está implicado en su homodimerización. La secuencia de proteínas de CD28 y un ácido nucleico que codifica para un CD28 humano se describen, por ejemplo, en Harper et al. J. Immunol. (1991) 147:1037-44. La secuencia de un ARNm humano que codifica para CD28 se describe también en NCBI No. de registro NM_006139, actualizada recientemente el 19 de abril de 2009, por ejemplo. La secuencia de proteínas completa de una CD28 humana también se describe en NCBI No. de registro NP_006130, actualizada por última vez el 19 de abril de 2009, por ejemplo.

CD28 transmite una señal que crea sinergia con la señal de receptor de células T (TCR) para promover la activación de células T naives (Lanzavecchia et al. (1999) Cell 96:1-4). La señalización de CD28 regula el umbral para la activación de células T y reduce significativamente el número de acoplamientos a TCR que se requieren para una activación de células T efectiva (Viola et al. (1996) Science 273:104-6). La co-estimulación de CD28 se traduce en proliferación de células T incrementada, producción de varias citocinas y receptores de citocinas, expresión incrementada de proteínas implicadas en progresión de ciclo celular, prolongación de la supervivencia de células T y expresión de ligando CD40 prolongada (CD40L) en células T (Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Quinta edición, página 396) .

Las señales de CD28 juegan un papel crítico en regular la diferenciación de células T CD4 y CD8. CD28 optimiza también las respuestas de células T previamente activadas, promoviendo la producción de IL-2 y la supervivencia de células T. La producción de IL-4 por células T naives depende altamente de la co-estimulación de B7-1/B7-2. La interrupción de la vía CD28/B7 durante la activación de células T naives deterioran la proliferación y diferenciación de células T, mientras que la interrupción de la vía CD28/B7 en células T activadas previamente disminuye la expansión de células T pero no la producción de citocinas efectoras (Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Quinta edición, páginas 393-404) .

Respuestas de anticuerpo dependientes de células T auxiliares usan la vía B7-CD28 para proporcionar señales co-estimuladoras esenciales para interacciones de células T cognadas/células B requeridas para el cambio de clase de inmunoglobulinas y formación de centros germinales. En ratones suprimidos en CD28, las células B potencialmente reactivas se acumulan dentro de los folículos linfoides después de la estimulación aritigénica, pero no son capaces de proliferar o sufrir mutación somática (Ferguson et al. (1996) J. Immunol. 156:4576-4581).

B7-1 y B7-2 son también ligandos para un segundo receptor de afinidad más alta, CTLA4 (CD152) , el cual está presente sobre la superficie de células T activadas. La co-estimulación con B7-1/B7-2 de señales inhibidoras ocurre cuando B7-1/B7-2 se unen a CTLA-4 (Brunet et al. (1987) Nature 328 :267 -270 , Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569). El resultado de una respuesta inmune incluye un equilibrio entre la activación de células T mediada por CD28 y la inhibición de células T mediada por CTLA-4..

La inhibición de la activación de células T mediada por CD28 podría inhibir respuestas de células T no deseadas que ocurren durante autoinmunidad, rechazo de transplantes o respuestas alérgicas. Por ejemplo, la inhibición de la activación de células T mediada por CD28 podría retrasar el rechazo de injertos, prevenir el rechazo de aloinjertos agudo, inducir tolerancia específica de donador y prevenir el desarrollo e interrumpir la progresión de rechazo de aloinjerto crónico, así como prevenir enfermedad de injerto contra huésped (GVH) , es decir, cuando células T transplantadas montan una vigorosa respuesta inmune contra aloantígenos tisulares del hospedero (Salama et al. (2001) J". Clin. Invest . 108. 943-48). No sólo inhibir la activación de células T mediada por CD28 reduce la respuesta celular a través de negar la señalización de activación a través de CD28, no debe impactar la interacción de CD86 y CD80 a CTLA-4, conservando de esta manera la inhibición mediada por CTLA-4 de la respuesta de células T. De esta manera, inhibir la activación de células T mediada por CD28 podría usarse para prevenir la inducción de autoinmunidad y moderar la progresión y/o severidad de enfermedades autoinmunes establecidas, incluyendo modelos de artritis inducida por colágeno, tiroiditis autoinmune, uveítis autoinmune, miastenia grave y lupus (Saloman et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19:225-252).

Lo que se requiere es una manera de inhibir la activación de células T mediada por CD28, sin la estimulación de las vías de señalización de CD28. La descripción mostrada en la presente satisface y resuelve esta necesidad.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan en la presente anticuerpos de dominio (dAbs) que se unen monovalentemente a CD28. Debido a la clara importancia de CD28 en la regulación de la respuesta de células T y la producción de anticuerpos, la interacción CD28/B7 (CD80 y CD86) y vías presentan importantes objetivos para el desarrollo de enfoques terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos que incluyen respuestas similares inadecuadas, tales como rechazo de transplantes, autoinmunidad y/o excesivas respuestas de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio que son monovalentes para la unión de CD28 pueden inhibir la actividad de CD28, amortiguando una respuesta inmune, evitando al mismo tiempo potenciales defectos no deseables que pudieran ocurrir con anticuerpos capaces de la unión divalente o multivalente de CD28. Los anticuerpos de dominio también pueden ser aplicados a cualquiera de un número de usos para los cuales también se usen anticuerpos divalentes estándares, por ejemplo, formación de imágenes in vivo y diagnóstico.

En consecuencia, en la presente se describen anticuerpos de dominio que se unen a CD28 y previenen o inhiben la unión de CD28 a CD80, CD86 y/u otros ligandos e inhiben la señalización de CD28 por CD80 y/o CD86 en ensayos de unión a receptor. Los anticuerpos de dominio descritos en la presente tampoco bloquean la interacción de CD80 y CD86 a CTLA4. En una modalidad, anticuerpos de dominio descritos en la presente no reaccionan en forma cruzada con CTLA4 , y de esta manera no se unen al motivo común en CTLA4 y CD28 que se une a CD80/86.

En una modalidad, la unión del anticuerpo de dominio a CD28 no agoniza sustancialmente la actividad de CD28. En particular, el dAb no agoniza la señalización de CD28 en combinación con señalización de receptor de células T. En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD80. En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD80, y no agoniza sustancialmente la señalización por CD28. En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD86. En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD86, y no agoniza sustancialmente la señalización por CD28. Se incluye también un dAb que interfiere con la unión de CD80 y/o CD86 a la secuencia MYPPPY (SEQ ID NO: 639) de CD28.

En un aspecto, el dAb no induce sustancialmente proliferación de células T en combinación con señalización del receptor de células T. En otro aspecto, el dAb no induce sustancialmente secreción de citocinas por células T en combinación con señalización de receptor de células T. En una modalidad, una citocina es al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IL-24, TGF , TNF-a, TNF-ß, IFN-a, IFN-ß, IFN-?.

En un aspecto, debido a que anticuerpos humanos evitarán la generación de una respuesta inmune a los anticuerpos cuando se administren a sujetos humanos para el tratamiento o prevención de enfermedad, el anticuerpo de dominio es un anticuerpo de dominio humano que se une monovalentemente a CD28, y en una modalidad ejemplar, sin agonizar sustancialmente la actividad de CD28.

En una modalidad, el anticuerpo de dominio interactúa con CD28 humana con una ¾ en la escala de 50 nM a 1 pM, inclusive, medida mediante resonancia de un plasmón en superficie. Por ejemplo, la ¾ para CD28 humana puede ser de 25 nM a 20 pM, 10 nM a 20 pM, 5 nm a 20 pM, 1 nM a 20 pM, 0.5 nM a 20 pM, 0.1 nM a 20 pM, 0.1 nM a 50 pM, 75 pM a 20 pM, o incluso 50 pM a 20 pM. En una modalidad, la Ka para CD28 humana es aproximadamente 50 pM.

En una modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD80 a CD28 con una IC50 de 50 nM o menos. En una modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD86 a CD28 con una IC50 de 50 nM o menos. En una modalidad más, el anticuerpo de dominio tiene especificidad de unión a CD28 con una constante de velocidad Koff de lxlO"3 s"1 o menos, lxlO"4 s"1 o menos, lxlO"5 s"1 o menos, o lxlO"6 s"1 o menos, según se determina por resonancia de un plasmón en superficie. En una modalidad, el anticuerpo de dominio neutraliza CD28 en un ensayo estándar con una IC50 de 50 nM o menos.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une a CD28. En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina es un dominio VH o VL. En otra modalidad, el anticuerpo de dominio comprende un homomultímero o heteromultímero de dos dominios variables, por ejemplo, un dominio VH y VL, pero uno de los dominios variables tiene la capacidad de unirse a CD28 sin la necesidad de un dominio VL o VH correspondiente. Es decir, el dAb se une a antígeno independientemente de los dominios VH o VL adicionales. Los dominios variables en estas modalidades pueden comprender tres regiones de determinación de complementariedad (CDRs) . En otra modalidad, el anticuerpo de dominio está libre de un dominio Fe. Los límites de un dominio Fe se establecen en Kabat et al. (1991, Sequences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.; incorporado en la presente a manera de referencia) . Como alternativa, un dominio Fe consiste en las regiones CH2-CH3 , incluyendo opcionalmente una región de pivote enlazada al CH2.

En un aspecto, el anticuerpo de dominio comprende una estructura universal. En este aspecto, un anticuerpo de dominio puede comprender una o más regiones estructurales que comprendan una secuencia de aminoácidos que sea igual a la secuencia de aminoácidos de una región estructural (FW) correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano, o la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones estructurales comprende colectivamente hasta 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5, diferencias de aminoácido en relación a la secuencia de aminoácidos de la región estructural correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano.

En una modalidad, el dAb comprende las secuencias de aminoácidos de FW1 , F 2 , F 3 y FW4 que corresponde a las FW1, FW2 , FW3 y F 4 de un anticuerpo humano, por ejemplo, un anticuerpo de línea germinal humano. En una modalidad más, algunas o todas las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2 , F 3 y FW4 del anticuerpo de dominio son iguales a las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpo de línea germinal humano. Por ejemplo, FW2 puede ser idéntica a la FW2 de un anticuerpo humano. En otra modalidad, las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2 , FW3 y FW4 contienen colectivamente hasta 10 diferencias de aminoácido en relación a las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales correspondientes codificadas por el segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano. En una modalidad más de las anteriores, el segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano puede seleccionarse del grupo que consiste en DP47, DP45 y DP48 y DPK9. En una modalidad, la estructura universal comprende una estructura VH seleccionada del grupo que consiste en DP47, DP45 y DP38, y/o la estructura VL es DPK9.

En un aspecto, un anticuerpo de dominio es configurado para incrementar su vida media in vivo. En particular, el anticuerpo de dominio tiene una vida media t-a o t-ß in vivo incrementada en relación al mismo anticuerpo de dominio no configurado.

En una modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa en 10% o más cuando se compara con una proteína no modificada ensayada bajo condiciones de otra manera idénticas. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio es incrementada en 50% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio es incrementada dos veces o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio es incrementada cinco veces o más, por ejemplo, 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio es incrementada en 100X, 200X, 300X, 400X, 500X, o más .

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio tiene una vida media ta de 0.25 a 6 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media ta está en la escala de 30 minutos a 12 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media ta del anticuerpo de dominio está en la escala de 1 a 6 horas.

En otra modalidad, la vida media t del anticuerpo de dominio se incrementa en 10% o más cuando se compara con una proteína no modificada ensayada bajo condiciones de otra manera idénticas. En otra modalidad, la vida media t del anticuerpo de dominio se incrementa en 50% o más. En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio se incrementa dos veces o más. En otra modalidad, la vida media tß del anticuerpo de dominio se incrementa 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida media t del anticuerpo de dominio se incrementa 50X o más.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio tiene una vida media tß de 1 hora a 744 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media t está en la escala de 12 a 48 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media tp está en la escala de 12 a 26 horas, inclusive. En otra modalidad más, la vida media t es de aproximadamente 336 horas.

Además de, o como alternativa a los criterios anteriores, una composición que contiene anticuerpo de dominio es provista la cual comprende un ligando que tiene un valor AUC (área bajo la curva) en la escala de 1 mg-min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg-min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición tiene una AUC en la escala de hasta 600 mg-min/ml. En una modalidad, el extremo superior de la escala es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg-min/ml. Adecuadamente un ligando tendrá una AUC en la escala seleccionada del grupo que consiste en las siguientes: 15 a 150 mg-min/ml, 15 a 100 mg-min/ml, 15 a 75 mg-min/ml y 15 a 50 mg-min/ml.

En una modalidad de configuración, los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden ser enlazados a albúmina de suero humana (HSA) , la cual tiene también el efecto de incrementar la vida media in vivo de la molécula. Las secuencias de codificación de albúmina sérica humana pueden obtenerse mediante PCR usando cebadores derivados de la secuencia de ADNc disponible en GenBank No. de registro NM000477. Estas secuencias de codificación pueden ser fusionadas a la secuencia de codificación para un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente, y la fusión puede ser expresada por alguien de capacidad en la técnica. En una modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio enlazada a HSA se incrementa en 10% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio enlazada a HSA está en la escala de 0.25 horas a 6 horas. En otra modalidad, la vida media t de la composición de anticuerpo de dominio enlazada a HSA se incrementa en 10% más. En otra modalidad, la vida media tp de la composición de anticuerpo de dominio enlazado a HSA está en la escala de 12 a 48 horas.

En otra modalidad, el formateo comprende PEGilación del dAb. En una modalidad, el PEG es enlazado covalentemente . En otra modalidad, el PEG es enlazado al anticuerpo de dominio es enlazado al anticuerpo de dominio en un residuo de cisteína o lisina. En otra modalidad más, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de por lo menos 24 kD. En otra modalidad más, el tamaño de PEG total es de 20 a 60 kD, inclusive. En otra modalidad más, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de por lo menos 200 kD.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene una vida media in vivo incrementada en relación a la misma composición de polipéptido que carece de polietilenglicol entrelazado. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa en 10% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa en 50% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa en dos veces o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de anticuerpo de dominio se incrementa 100X, 200X, 300X, 400X, 500X, o más .

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene una vida media ta de 0.25 a 6 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media ta está en la escala de 30 minutos a 12 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media ta del anticuerpo de dominio está en la escala de 1 a 6 horas.

En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio enlazado a PEG se incrementa en 10% o más. En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio enlazado a PEG se incrementa en 50% o más. En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio enlazado a PEG se incrementa 2X o más. En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio enlazado a PEG se incrementa 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida media tp del anticuerpo de dominio enlazado a PEG se incrementa a 50X o más .

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene una vida media t de 1 a 170 horas, inclusive: En otra modalidad, la vida media t está en la escala de 12 a 48 horas, inclusive. En otra modalidad, la vida media tß está en la escala de 12 a 26 horas, inclusive.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene un valor AUC (área bajo la curva) en la escala de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg-min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición tiene una AUC en la escala de hasta alrededor de 600 mg-min/ml. En una modalidad, el extremo superior de la escala es de aproximadamente 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg-min/ml. Adecuadamente, un ligando tendrá una AUC en la escala seleccionada del grupo que consiste en las siguientes: aproximadamente 15 a 150 mg-min/ml, alrededor de 15 a 100 mg-min/ml, aproximadamente 15 a 75 mg-min/ml, y alrededor de 15 a 50 mg-min/ml.

En otra modalidad se proporciona un anticuerpo de dominio que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica, por ejemplo, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 1-57, anticuerpo de dominio que se une de manera específica y monovalente a CD28.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 58-398 y 640, y SEQ ID NOs : 532-635, y en una modalidad ejemplar, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO >:67, SEQ ID NO: :68, SEQ ID NO: 272 , SEQ ID NO: 273 , SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: :275, SEQ ID NO :276, SEQ ID NO :534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: :536, SEQ ID NO : 537, SEQ ID NO : 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: :542, SEQ ID NO :543, SEQ ID NO : 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: :548, SEQ ID NO : 550, SEQ ID NO : 551, SEQ ID NO: 553 , SEQ ID NO: :562, SEQ ID NO :567, SEQ ID NO :570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: : 576 , SEQ ID NO : 577, SEQ ID NO :578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: :599, SEQ ID NO -.600, SEQ ID NO : 607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: :617 y SEQ ID NO ': 622.

En otro aspecto más, se proporciona un anticue dominio el cual tiene una secuencia de aminoácidos menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO::275, SEQ ID NO :276, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: :536, SEQ ID NO :537, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: :542, SEQ ID NO :543, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: :548, SEQ ID NO :550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO : 553 , SEQ ID NO: :562, SEQ ID NO :567, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: :576, SEQ ID NO :577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: :599, SEQ ID NO :600, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO :617 y SEQ ID NO: 622, polipéptido que se une de manera específica y monovalente a CD28. En otra modalidad, un anticuerpo de dominio difiere de la secuencia de aminoácido seleccionada en no más de 25 posiciones e aminoácido y tiene una secuencia que es al menos 80% idéntica a la secuencia seleccionada. En una modalidad, el anticuerpo de dominio difiere de la secuencia de aminoácido seleccionada en 25 o menos posiciones de aminoácido, 20 o menos posiciones de aminoácido, 15 o menos posiciones de aminoácido, 10 o menos posiciones de aminoácido, 5 o menos posiciones de aminoácido, 2 o menos posiciones de aminoácido, o tan poca como una posición de aminoácido. En una modalidad más, el anticuerpo de dominio es al menos 80% idéntico a la secuencia seleccionada, por ejemplo, al menos 70% idéntico, al menos 75% idéntico, al menos 80% idéntico, al menos 85% idéntico, al menos 90% idéntico, al menos 95% idéntico y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98% o 99% idéntico.

En una modalidad, un antagonista de CD28 tiene una secuencia de CDR1 que es al menos 50% idéntica a la secuencia de CDR1 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:540, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:543, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:550,.SEQ ID NO:551, SEQ ID NO:553, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:570, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 617 y SEQ ID NO: 622.

En una modalidad, la CDR1 difiere de la secuencia de aminoácidos seleccionada en todas las posiciones de aminoácido de CDR1, 5 o menos posiciones de aminoácido, 4 o menos posiciones de aminoácido, 3 o menos posiciones de aminoácido, 2 o menos posiciones de aminoácido, o tan poco como una posición de aminoácido. En una modalidad más, la CDR1 es al menos 50% idéntica a la secuencia seleccionada, por ejemplo, al menos 60% idéntica, al menos 70% idéntica, al menos 75% idéntica, al menos 80% idéntica, al menos 85% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98% o 99% idéntica.

En una modalidad, un antagonista de CD28 tiene una secuencia de CDR2 que es al menos 50% idéntica a la secuencia de CDR2 de la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272 , SEQ ID NO : 273 , SEQ ID NO :274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO :534, SEQ ID NO :535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SÉQ ID NO : 539, SEQ ID NO : 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO :545, SEQ ID NO : 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: :550, SEQ ID NO :551, SEQ ID NO :553, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: :567, SEQ ID NO :570, SEQ ID NO :575, SEQ ID NO: 576 , SEQ ID NO: :577, SEQ ID NO : 578, SEQ ID NO :580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: :600, SEQ ID NO: :607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 617 y SEQ ID NO: :622.

En una modalidad, la CDR2 difiere de la secuencia de aminoácido seleccionada en todas las posiciones de aminoácido de CDR2 , 5 o menos posiciones de aminoácido, 4 o menos posiciones de aminoácido, 3 o menos posiciones de aminoácido, 2 o menos posiciones de aminoácido o tan poco como una posición de aminoácido. En una modalidad más, la CDR2 es al menos 50% idéntica a la secuencia seleccionada, por ejemplo, al menos 60% idéntica, al menos 70% idéntica, al menos 75% idéntica, al menos 80% idéntica, al menos 85% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98% o 99% idéntica.

En una modalidad, un antagonista de CD28 tiene una secuencia de CDR3 que es al menos 50% idéntica a la secuencia de CDR2 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO :273, SEQ ID NO :274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO :534, SEQ ID NO :535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO : 539, SEQ ID NO : 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO :545, SEQ ID NO :547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: :550, SEQ ID NO : 551, SEQ ID NO : 553 , SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: :567, SEQ ID NO :570, SEQ ID NO :575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: :577, SEQ ID NO : 578, SEQ ID NO : 580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: :600, SEQ ID NO: :607, SEQ ID NO: 611, SEQ : ID NO: 617 y SEQ ID NO: :622.

En una modalidad, la CDR3 difiere de la secuencia de aminoácidos seleccionada en todas las posiciones de aminoácido de CDR3 , 5 o menos posiciones de aminoácido, 4 o menos posiciones de aminoácido, 3 o menos posiciones de aminoácido, 2 o menos posiciones de aminoácido o tan poco como una posición de aminoácido. En una modalidad más, la CDR2 es al menos 50% idéntica a la secuencia seleccionada, por ejemplo, al menos 60% idéntica, al menos 70% idéntica, al menos 75% idéntica, al menos 80% idéntica, al menos 85% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98% o 99% idéntica.

Se incluye además un dAb que comprende una secuencia de CDR1 al menos 50% idéntica a una de las secuencias de CDR1 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 529 y SEQ ID NO: 636; una secuencia de CDR2 al menos 50% idéntica a una de las secuencias de CDR2 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:485, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:491, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 530 y SEQ ID NO: 637; y una secuencia de CDR3 al menos 50% idéntica a una de las secuencias de CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 531 y SEQ ID NO: 638.

En otro aspecto, se incluye un dAb que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO:508, SEQ ID NO:511, SEQ ID NO:514, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:520, SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:529 y SEQ ID NO: 636; una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:506, SEQ ID NO:509, SEQ ID NO:512, SEQ ID NO:515, SEQ ID NO:518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO:524, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO: 530 y SEQ ID NO: 637; y una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO:489, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:495, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 531 y SEQ ID NO: 638.

En otro aspecto más, un dAb comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: :58, SEQ ID NO; :59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO: :62, SEQ ID NO: :63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO :65, SEQ ID NO: :66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272 , SEQ ID NO: :273, SEQ ID NO: :274 , SEQ ID NO :275, SEQ ID NO :276, SEQ ID NO: :472 , SEQ ID NO: :473, SEQ ID NO :474, SEQ ID NO :475, SEQ ID NO: :476 , SEQ ID NO: :477, SEQ ID NO :478, SEQ ID NO :479, SEQ ID NO: :480, SEQ ID NO: :481, SEQ ID NO :482, SEQ ID NO :483, SEQ ID NO: : 534 , SEQ ID NO: :535, SEQ ID NO :536, SEQ ID NO :537, SEQ ID NO: :539, SEQ ID NO: :540, SEQ ID NO :542, SEQ ID NO :543, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 617 y SEQ ID NO: 622. En una modalidad, un dAb comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO :62, SEQ ID NO :63, SEQ ID NO: :64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO: :68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 , SEQ ID NO: 274 , SEQ ID NO: :275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: :472 , SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: :474 , SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO; :476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: :478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: :480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: :482 , SEQ ID NO: 483 , SEQ ID NO: :534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: :536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO :539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: :542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO : 545, SEQ ID NO: :547, SEQ ID NO : 548 , SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO :551, SEQ ID NO: : 553 , SEQ ID NO :562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO : 570, SEQ ID NO: : 575, SEQ ID NO : 576 , SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO :578, SEQ ID NO: :580, SEQ ID NO :599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO :607, SEQ ID NO: :611, SEQ ID NO :617 y SEQ ID NO :622 en no más de 25 aminoácidos .

El dAb puede inhibir la unión de CD28 a CD80 y/o CD86 con una IC50 de aproximadamente 100 nM, alrededor de 50 nM, aproximadamente 1 nM, alrededor de 500 pM, aproximadamente 100 pM, alrededor de 50 pM, aproximadamente 10 pM, alrededor de 5 pM, o aproximadamente 1 pM. Por ejemplo, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD80 con una IC50 en la escala de 1 pM a 1.5 µ?, inclusive; IC50 para inhibición de la unión de CD28 a CD80. La IC50 puede estar en la escala de 1 pM a 1 µ?, 1 pM a 900 nM, 1 pM a 800 nM, 1 pM a 700 nM, 1 pM a 600 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 400 nM, 1 pM a 300 nM, 1 pM a 200 nM, 1 pM a 100 nM, 1 pM a 50 nM, 1 pM a 10 nM, 1 pM a 1 nM, 1 pM a 500 pM, 1 pM a 100 pM, 1 pM a 50 pM, 1 pM a 10 pM o 1 pM a 5 pM. Escalas aceptables adicionales incluyen, por ejemplo, 50 pM a 1 µ?, 100 pM a 500 nM, 125 pM a 250 nM, 150 pM a 200 nM, 150 pM a 100 nM y 200 pM a 50 nM.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD86 con una IC50 en la escala de 1 pM a 1.5 µ?, inclusive; IC50 para inhibición de la unión de CD28 a CD86. La IC50 puede estar en la escala de 1 pM a 1 µ?, 1 pM a 900 nM, 1 pM a 800 nM, 1 pM a 700 nM, 1 pM a 600 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 400 nM, 1 pM a 300 nM, 1 pM a 200 nM, 1 pM a 100 nM, 1 pM a 50 nM, 1 pM a 10 nM, 1 pM a 1 nM, 1 pM a 500 pM, 1 pM a 100 pM, 1 pM a 50 pM, 1 pM a 10 pM o 1 pM a 5 pM. Escalas aceptables adicionales incluyen, por ejemplo, 50 pM a 1 µ?, 100 pM a 500 nM, 125 pM a 250 nM, 150 pM a 200 nM, 150 pM a 100 nM y 200 pM a 50 nM.

Se proporciona un método para antagonizar la unión de CD80 a CD28 en un individuo, el método comprende administrar un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente al individuo, en donde el anticuerpo de dominio antagoniza la unión de CD80 a CD28 en el individuo. Un método para antagonizar la unión de CD86 a CD28 en un individuo comprende administrar un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente al individuo, en donde el anticuerpo de dominio antagoniza la unión de CD86 a CD28 en el individuo. Un método para antagonizar una actividad de CD28 en un individuo comprende administrar un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente al individuo, en donde el anticuerpo de dominio antagoniza una actividad de CD28. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediada por CD28 en un individuo que requiera de este tratamiento, comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de dominio que se une a CD28. En una modalidad, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno autoinmune. En otra modalidad, la enfermedad o trastorno está relacionado con injertos.

Se incluye también un ligando específico doble que comprende un anticuerpo de dominio que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un solo dominio variable que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD28, y en donde la unión del dominio variable individual al segundo antígeno actúa para incrementar la vida media del ligando in vivo.

En una modalidad, el ligando específico doble es una inmunoglobulina IgG de cuatro cadenas. La IgG de cuatro cadenas puede comprender dos ligandos específicos dobles, los ligandos específicos dobles siendo diferentes en sus dominios variables .

En otra modalidad, los anticuerpos de dominio son dominios VHH camélidos. En esta modalidad del ligando específico doble, el dominio variable de inmunoglobulina individual puede ser un dominio variable de la cadena pesada. En otra modalidad del ligando específico doble, el dominio variable de inmunoglobulina individual es un dominio variable de la cadena ligera. En una modalidad del ligando específico doble, ligando es provisto como una inmunoglobulina IgG que comprende cuatro dominios variables individuales de la cadena pesada o cuatro dominios variables de la cadena ligera. La cadena pesada puede comprender dominios VHH de camélido. En una modalidad más el ligando específico doble, el primero y segundo dominios se unen independientemente, de tal forma que el ligando específico doble puede unirse simultáneamente tanto al primero como al segundo antígenos. En una modalidad del ligando específico doble, el anticuerpo de dominio tiene una constante de disociación (¾) de lxlO"8 M o menos para CD28 humana, y una constante de velocidad off de lxlO"3 s"1 o menos, según se determina por resonancia de un plasmón en superficie .

En una modalidad del ligando específico doble, el dominio variable individual es específico para albúmina sérica (SA) y tiene una constante de disociación (¾) de 1 n a 500 µ?? para SA, según se determina mediante resonancia de un plasmón en superficie. En una modalidad más, el dominio variable individual se une a SA en un ensayo de unión a ligando estándar con una IC50 de 1 nM a 500 µ?. El dominio variable individual puede ser específico para SA, y comprender la secuencia de aminoácidos de MSA-16 o una secuencia que sea al menos 80% idéntica a la misma. Como alternativa, el dominio variable individual puede ser específico para SA, y comprender la secuencia de aminoácidos de MSA-26 o una secuencia que sea al menos 80% idéntica a la misma .

En una modalidad más, el anticuerpo de dominio puede comprender un sitio de unión para un ligando genérico. En una modalidad, el sitio de unión a ligando genérico se selecciona del grupo que consiste en sitio de unión a proteína A, proteína L y proteína G.

En una modalidad del ligando específico doble, el anticuerpo de dominio comprende una estructura universal. El anticuerpo de dominio de dominio también puede comprender una estructura VH seleccionada del grupo que consiste en DP47, DP45 y DP38; o una estructura VL que sea DPK9. El anticuerpo de dominio puede comprender una o más regiones estructurales que comprendan una secuencia de aminoácidos que sea igual a la secuencia de aminoácidos de una región estructural correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano, o la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones estructurales comprende colectivamente hasta 5 diferencias de aminoácido en relación a la secuencia de aminoácidos de la región estructural correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano.

En una modalidad, las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2 , F 3 y FW4 del anticuerpo de dominio son iguales a las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2 , FW3 y FW4 contiene colectivamente hasta 10 diferencias de aminoácido en relación a las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales correspondientes codificadas por el segmento génico de anticuerpo de línea germinal humano.

En una modalidad, las secuencias de aminoácidos de las FW1, F 2 y F 3 del anticuerpo de dominio son iguales a las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpo de línea germinal humano. Los segmentos génicos de anticuerpo de línea germinal humano pueden seleccionarse del grupo que consiste en DP47, DP45, DP48 y DPK9.

También se incluye un método para producir un ligando específico doble como el descrito en la presente, que comprende un anticuerpo de dominio que tiene una especificidad de unión para CD28 y un solo dominio de anticuerpo que tiene una especificidad de unión para una proteína que incrementa la vida media del ligando in vivo, el método comprende las etapas de: seleccionar un primer dominio variable por su capacidad para unirse a CD28; seleccionar un segundo dominio variable por su capacidad para unirse a la proteína que incremente la vida media del ligando in vivo; combinar los dominios variables y seleccionar el ligando específico doble por su capacidad para unirse a CD28 y la proteína. En una modalidad, el anticuerpo de dominio se selecciona para unión a CD28 en ausencia de un dominio variable complementario.

También se incluye un ácido nucleico que codifica para un ligando específico doble descrito en la presente. El ácido nucleico puede comprender la secuencia de ácido nucleico de MSA-16 o una secuencia que sea al menos 80% idéntica a la misma, o como alternativa puede comprender la secuencia de ácido nucleico de MSA-26 o una secuencia que sea al menos 70% idéntica a la misma. El ácido nucleico puede ser incorporado en un vector, el cual puede ser incorporado en una célula hospedera.

También se incluye una composición farmacéutica que comprende un ligando específico doble como el descrito en la presente y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Se incluye también un ligando específico doble que comprende primero y segundo dominios variables individuales de cadena pesada, o primero y segundo dominios variables individuales de la cadena ligera, en donde el primer dominio variable es un anticuerpo de dominio. En una modalidad, el segundo dominio variable tiene especificidad de unión para un antígeno que no es CD28. En un aspecto, el segundo dominio variable contribuye a y/o incrementa la estabilidad de un anticuerpo de dominio. A manera de un ejemplo no limitativo, el segundo dominio variable tiene especificidad de unión a albúmina sérica.

También se incluye un ligando específico doble que comprende un primer dominio variable individual que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable individual que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD28 y el segundo antígeno es un antígeno de superficie celular presentadora de antígenos o un antígeno de superficie de células T. El antígeno de superficie celular presentadora de antígenos puede seleccionarse de uno del grupo que consiste en antígenos de superficie de células dendríticas, antígenos de superficie de macrófagos activados, antígenos de superficie de células B activadas, antígenos de superficie de la vía de la señal co-estimuladora y antígenos MHC. En una modalidad, el antígeno MHC es un antígeno MHC clase II, y el antígeno clase II puede ser la cadena alfa y/o beta.

El antígeno de superficie de célula presentadora de antígenos o un antígeno de superficie de células T puede seleccionarse del grupo que consiste en CD40, CD40L, molécula co-estimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3 , CD70, ligando de molécula co-estimuladora inducible (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM (Mediador de Entrada de Virus del Herpes) y LIGHT, incluyendo uno de CD40L, molécula co-estimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, 0X40, CD45, CD69 o CD3. Un antígeno de superficie ejemplar es un antígeno de superficie de gen B7 tal como CD86 o CD80.

En otra modalidad, un ligando específico doble comprende un primer anticuerpo de dominio que tiene una especificidad de unión para un primer antígeno y un segundo dominio variable individual que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD28 y el segundo antígeno es una citocina. En modalidades particulares, la citocina puede ser GM-CSF, IL-10C, IL-?ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-28, IL-33, LIF, TGF , TNF-a, TNF-ß, IFN-a, IFN-ß, IFN-?.

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente también se pueden administrar en combinación con agentes inmunosupresores/inmunomoduladores y/o antiinflamatorios adicionales o terapias, tales como inhibidores de calcineurina, ciclosporina, citoxan, prednisona, azatioprina, metotrexato, corticoesteroides , fármacos antiinflamatorios no esteroides/inhibidores de Cox-2, hidroxicloroquina , sulfasalazopirina, sales de oro, etanercept, infliximab, anakinra, mizoribina, ácido micofenólico, micofenolato mofetil, interferón beta-la, interferón beta-lb, acetato de glatirámero, clorhidrato de mitoxantrona y/u otros biológicos tales como anti-TNF. Los anticuerpos de dominio también pueden administrarse en combinación con uno o más de los siguientes agentes para regular una respuesta inmune: CTLA4 , gp39 soluble (conocido también como ligando CD40 (CD40L) , CD154, T-BA , TRAP) , CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble, CD86 soluble, CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39, anticuerpos reactivos con CD40, anticuerpos reactivos con B7 , anticuerpos reactivos con CD28, anticuerpos reactivos con LFA-1, anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con IL-12, anticuerpos reactivos con IFN-gama, anticuerpos reactivos con CD2, anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier IGAM (por ejemplo, ICAM-2), anticuerpos reactivos con CTLA4 , anticuerpos reactivos con Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos reactivos con CD3 , anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4, anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44, anticuerpos monoclonales contra receptores de leucocitos; por ejemplo, MHC, CD2 , CD3 , CD , CDlla/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM) , OX40, 4-1BB o sus ligandos. La determinación de la combinación y dosificaciones óptimas puede determinarse y optimizarse usando métodos bien conocidos en la técnica.

Cuando se administran anticuerpos de dominio de la invención "en combinación con" otro agente o terapia inmunosupresor/inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo, como el especificado arriba, la administración puede hacerse concomitantemente o en secuencia. Cuando los dAbs son administrados concomitantemente con otro agente, tal como un agente especificado arriba, el dAb y agente pueden administrarse en la misma composición farmacéutica.

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo de dominio para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, en donde el paciente está en necesidad de un anticuerpo de dominio de unión a CD28. En una modalidad, el paciente está afligido con una enfermedad inmune .

En un aspecto, la enfermedad inmune es una enfermedad autoinmune . Una enfermedad auto-inmune incluye, pero no está limitada a, enfermedad de Addison, alergia, rinitis alérgica, espondilitis anquilosante, asma, aterosclerosis , enfermedades autoinmunes del oído, enfermedades autoinmunes del ojo, gastritis atrófica autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, parotitis autoinmune, uveítis autoinmune, enfermedad celiaca, cirrosis biliar primaria, aniitis linfocítica benigna, COPD, colitis, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I) , depresión, diabetes, incluyendo diabetes tipo 1 y/o tipo 2, epididimitis , glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre , enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , respuesta inmune a productos de fármaco recombinantes, por ejemplo, factor VII en hemofilia, artritis idiopática juvenil, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, infertilidad masculina, enfermedad de tejidos conectivos mixta, esclerosis múltiple, miastenia grave, oncología, osteoartritis, dolor, mixedema primario, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis , psoriasis, artritis psoriásica, artritis reactiva, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , oftalamia simpática, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T antiocéntrico testicular, tiroiditis, rechazo de transplantes, colitis ulcerosa, uveítis autoinmune y vasculitis. . Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, afecciones en las cuales el tejido afectado sea el objetivo primario, y en algunos casos, el objetivo secundario. Estas afecciones incluyen, pero no están limitadas a, SIDA, alergia atópica, asma bronquial, eczema, lepra, esquizofrenia, depresión hereditaria, transplante de tejidos y órganos, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Alzheimer, mal de Parkinson, infarto de miocardio, apoplejía, autismo, epilepsia, fenómeno de Arthus, anafilaxis y adicción a alcohol y drogas.

En otro aspecto, la enfermedad inmune es una enfermedad relacionada con injerto, tal como rechazo de aloinjerto, rechazo de xenoinjerto, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , rechazo de transplante agudo y rechazo de transplante crónico.

Se incluye un dAb que tiene al menos tres características seleccionadas del grupo que consiste en: a) previene la unión de CD80 y CD86 a CD28, b) no agoniza la señalización de CD28 en combinación con señalización de receptor de células T, c) tiene una Kd de aproximadamente 50 nM a alrededor de 1 pM para unirse a CD28, d) tiene una vida media ta de aproximadamente 15 segundos a alrededor de 12 horas, e) tiene una vida media t de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 336 horas, f) se une a una secuencia MYPPPY, y g) una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:484, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:496, SEQ ID N0:499, SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:505, SEQ ID NO:508, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO:514, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:520, SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO: 529 y SEQ ID NO: 636; una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO -.488, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO -.494, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:506, SEQ ID NO:509, SEQ ID NO:512, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO-.530 y SEQ ID NO-.637; y una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO:489, SEQ ID N0:492, SEQ ID NO:495, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 531 y SEQ ID NO: 638.

También se incluye un ácido nucleico que codifica para los dAbs descritos en la presente.

Se incluye un método para antagonizar CD28, que comprende administrar una cantidad efectiva para un dAb descrito, en la presente a un individuo. También se incluye un método para antagonizar la unión de CD28 que comprende administrar una cantidad efectiva del dAb descrito en la presente a un individuo, en donde el dAb antagoniza la unión de CD28 a CD80 y/o CD86 en el individuo.

Se incluye además un método para tratar, aliviar o prevenir un síntoma de una enfermedad inmune, tal como una enfermedad autoinmune o una enfermedad relacionada con injerto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un dAb descrito en la presente a un individuo que tenga o esté en riesgo de tener una enfermedad inmune. Se incluye un método para tratar, aliviar o prevenir una enfermedad inmune, que comprende administrar una cantidad efectiva de un dAb descrito en la presente a un individuo que tenga o esté en riesgo de tener una enfermedad inmune.

En la presente se incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un dAb descrito en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.

Se incluye el uso de un dAb descrito en la presente en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad inmune en un paciente que lo requiera. Se incluye también el uso de un dAb descrito en la presente en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un síntoma de una enfermedad inmune en un paciente que lo requiera. Además se incluye en la presente el uso de un dAb descrito en la presente en la preparación de un medicamento para aliviar al menos un síntoma de una enfermedad inmune en un paciente que lo requiera.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1A y la figura IB son una serie de imágenes que ilustran que los anticuerpos de dominio anti-CD28 humano mostrados en la presente no exhiben actividad agonista. La figura 1A ilustra que concentraciones cada vez más altas de varios dAbs no activan CD28, mientras que un control de anticuerpo anti-CD3 (OKT3) , añadido a PBMC, demostró la activación de CD28. Anticuerpos de dominio (dAbs) y anticuerpo fueron añadidos a una placa de 96 pocilios que fue sembrada con PBMC aisladas de sangre entera de donadores normales. La figura IB ilustra que dAbs, anti-CD28 (9.3), anti-CD3 (0KT3) , o control de isotipo fijados a una placa de fondo redondo de 96 pocilios no exhibieron actividad agonista en PBMC añadidas a los pocilios.

La figura 2 es una gráfica que ilustra que los anticuerpos de dominio anti-CD28 humano no exhiben actividad co-agonista cuando se añaden a placas de fondo plano de 96 pocilios recubiertas con anti-CD3 (G19-4, 10 ug/ml en PBS) . Cada dAb se añadió al pocilio a una concentración final de 30 ug/ml junto con células T purificadas. Como un control positivo, anti-CD28 (mAb 9.3), a una concentración final de 1 g/ml se añadió en lugar del dAb.

La figura 3 es una gráfica que ilustra la inhibición in vivo de la proliferación de células T por un anticuerpo de dominio como el mostrado en la presente.

Las figuras 4A y 4B son una serie de imágenes que ilustran los resultados de un estudio de ocupación de receptor de 9 días, usando dAb lm-74-15-40L. La figura 4A ilustra la ocupación del receptor con dosificación intraperitoneal del dAb. La figura 4B ilustra la ocupación del receptor con dosificación subcutánea del dAb.

La figura 5 ilustra la concentración en plasma de dAbs lh-99-2P40 ramificados y lh-99-2P40 lineales con el tiempo en un estudio de mono macaco.

La figura 6 muestra ELISAs de la unión a placas recubiertas con quimera CD28/Fc humana recombinante y control de Fe de clones de anticuerpos de dominio de despliegue de fagos monoclonales .

La figura 7 muestra ELISAs de anticuerpos de dominio monoclonal solubles que se unen a quimera CD28 humano recombinante/Fc y placas recubiertas con control de Fe.

La figura 8 muestra trazos BIAcore de clones dAb que se unen a un chip CM5 recubierto con 12,500 unidades de CD28-FC.

La figura 9A y 9B muestran la capacidad de clones de anticuerpos de dominio para inhibir la actividad de CD28 en ensayos "in vitro" a base de células duplicados. En los ensayos, células T CD4 positivas humanas son estimuladas con células CHO transíectadas con anti-CD3 más que expresan ya sea CD80 o CD86.

Las figuras 10A y 10B muestran que los anticuerpos de dominio anti-CD28 carecen de actividad agonista. En la figura 10A, PBMC fueron expuestas al anticuerpo de dominio anti-CD28 239-891-D70C o al anticuerpo anti-CD28 mitogénico 5.11A1. La proliferación celular fue medida mediante incorporación de 3 [H] -timidina el día 3, como se muestra en la figura 10A, y la producción de IL-2 se midió, como se muestra en la figura 10B.

Descripción detallada de la invención La presente descripción proporciona anticuerpos de dominio para antagonizar la actividad de CD28. Los anticuerpos de dominio pueden ser enlazados a polímeros para mejorar las propiedades farmacocinéticas , tales como estabilidad y vida media. En la presente se incluyen composiciones y métodos para la fijación de moléculas de polímero (por ejemplo, polietilenglicol ; PEG) a proteínas para modular las propiedades farmacocinéticas de las proteínas modificadas. Por ejemplo, la modificación con PEG de proteínas ha mostrado alterar la vida media circulante in vivo, antigenicidad, solubilidad y resistencia a proteólisis de la proteína (Abuchowski et al. (1977) J. Biol . Chem. , 252:3578; Nucci et al. (1991) Adv. Drug Delivery Reviews 6:133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology vol . 3 (Borchardt, R. T. ed.); and Stability of Protein Pharmaceuticals : in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pág. 235-263, Plenum, NY) . 1. Definiciones y abreviaturas 1.1 Definiciones De acuerdo con esta descripción detallada, aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Debe notarse que según se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de estos anticuerpos y la referencia a "la dosis" incluye la referencia a una o más dosis y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente .

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por alguien de capacidad ordinaria en la técnica. A menos que se indique lo contrario, todas las escalas descritas en la presente son inclusivas de los criterios específicos. Los siguientes términos se proporcionan abajo.

Según se usa en la presente, el término "humano" cuando se aplica a un anticuerpo de dominio o a un dominio variable de inmunoglobulina significa que el polipéptido tiene una secuencia derivada de una inmunoglobulina humana. Una secuencia se "deriva de" una secuencia de codificación de inmunoglobulina humana cuando la secuencia es ya sea: a) aislada de un individuo humano o de células o una línea de células de un individuo humano; b) aislada de una biblioteca de secuencias génicas de anticuerpos humanos clonados (o una biblioteca de secuencias de dominio V de anticuerpo humano) ; o c) cuando una secuencia génica de anticuerpo humano clonado (o secuencia de región V humana clonada (incluyendo por ejemplo, un segmento génico de línea germinal V)) se usó para generar una o más secuencias diversificadas de las que se seleccionaron después para la unión a un antígeno objetivo deseado .

Como mínimo, un anticuerpo de dominio humano tiene al menos 70% de identidad de aminoácidos idéntico, al menos 75% idéntico, al menos 80% idéntico, al menos 85% de identidad de aminoácidos (incluyendo, por ejemplo, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99%, o identidad más alta) con una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana de origen natural, por ejemplo, una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana de origen natural descrita en Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991) .

Según se usa en la presente, el término "dominio" se refiere a una estructura de proteína doblada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de proteínas, y en muchos casos pueden ser añadidos, removidos o transferidos a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.

Por "anticuerpo de dominio" se' intenta decir un dominio de polipéptido doblado que comprende una secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, constante de disociación de 500 nM o menos) . Un "anticuerpo de dominio" incluye por lo tanto dominios variables de anticuerpo completos así como dominios variables modificados, por ejemplo en los cuales una o más asas han sido reemplazadas por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones en el N-terminal o C, así como fragmentos doblados de dominios variables que conservan una constante de disociación de 500 nM o menos (por ejemplo, 450 nM o menos, 400 nM o menos, 350 nM o menos, 300 nM o menos, 250 nM o menos, 200 nM o menos, 150 nM o menos, 100 nM o menos) y la especificidad de antígeno objetivo del dominio de longitud completa. Cuando sea necesario o en caso de cualquier duda, la convención y límites de numeración mostrados por Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest , 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington,. D.C.) son aplicables a los dominios variables y constantes de inmunoglobulina mencionados en la presente.

Un "dAb" se usa indistintamente con "anticuerpo de dominio" en la presente.

Un anticuerpo de dominio, según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido de inmunoglobulina de mamífero, incluyendo dAbs humanos, pero también incluyen de roedor (por ejemplo, como el descrito en WO00/29004, los contenidos de la cual se incorporan en la presente en su totalidad) o dAbs VHH de camélido. Los dAbs de camélido son polipéptidos de un solo dominio variable de anticuerpo que se derivan de especies incluyendo camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada naturalmente libres de cadena ligera: VHH - Las moléculas VHH son aproximadamente 10X más pequeñas que las moléculas de IgG, y como polipéptidos individuales, son muy estables, resistiendo a condiciones extremas de pH y temperatura.

Los anticuerpos de camélido se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,759,808; 5,800,988; 5,840,526; 5,874,541; 6,005,079; y 6,015,695, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad. Los polipéptidos VHH de camélido humanizados son mostrados, por ejemplo en O04/041862, las enseñanzas de la cual se incorporan en la presente en su totalidad. Se entenderá por alguien de capacidad en la técnica que los polipéptidos de un solo dominio variable de anticuerpo de camélido de origen natural pueden modificarse de acuerdo con las enseñanzas de WO04/041862 (por ejemplo, sustituciones de aminoácido en las posiciones 45 y 103) para generar polipéptidos VHH de camélido humanizados. También se incluyen en la presente polipéptidos de un solo dominio variable de anticuerpo que son VHH de tiburón nodriza. Los dAbs VHH de tiburón nodriza se describen, por ejemplo, en Greenberg et al. (1995) Nature 374:168-173 y publicación de E.U.A. No. 20050043519.

Según se usa en la presente, la frase "secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es idéntica, sobre 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más o incluso 50 o más aminoácidos contiguos, a una secuencia comprendida por una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina .

Secuencias similares a o idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente también se incluyen aquí . En algunas modalidades, la identidad de secuencia a nivel de aminoácido puede ser aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más alta. Al nivel de ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más alta. Como alternativa, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico hibridaran bajo condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación de muy alta severidad) , al complemento de la hebra. Lós ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado de células o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

Según se usa en la presente, el término "identidad" se refiere al grado con el cual dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se simulan estructuralmente unas a otras. Según se usa en la presente, la "similitud" de secuencia es una medida del grado al cual las secuencias de aminoácidos comparten residuos de aminoácidos similares en posiciones correspondientes en una alineación de las secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí cuando sus cadenas laterales son similares. Específicamente, "similitud" abarca aminoácidos que son sustitutos conservadores unos de otros. Una sustitución "conservadora" es cualquier sustitución que tiene una puntuación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 89:10915-10919). Por la frase "la secuencia A es n% similar a la secuencia B" se intenta decir que n% de las posiciones de una alineación global óptima entre secuencias A y B consiste en aminoácidos idénticos o sustituciones conservadoras. Según se usa en la presente, dos secuencias son "similares" entre sí, o comparten una "identidad porcentual" , cuando son alineadas usando ya sea el algoritmo de Needleman-Wunsch o el algoritmo de "secuencias BLAST 2" descrito por 'Tatusova & Madden (1999) FEMBS Microbiol Lett . 174:247-250. Cuando secuencias de aminoácidos son alineadas usando el "algoritmo de secuencias BLAST 2", la matriz Blosum 62 es la matriz preestablecida. Alineaciones globales óptimas pueden llevarse a cabo usando los siguientes parámetros en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch: Para polipéptidos : Matriz de sustitución: blosum62.

Función de puntuación de espacio: -A-B*LG, en donde A=ll (la penalidad de espacio) , B=l (la penalidad de longitud de espacio) y LG es la longitud del espacio.

Para secuencias de nucleótidos: Matriz de sustitución: 10 para coincidencias, 0 para no coincidencias.

Función de puntuación de espacios: -A-B*LG en donde A = 50 (la penalidad de espacio) , B=3 (la penalidad de longitud de espacio) y LG es la longitud del espacio.

Usando el software AlignX, un componente de Vector TI Suite 8.0 (InforMax, Inc.), la alineación se creó usando el algoritmo Clustal W (1994) Nucleic Acid Research, 22 (22) :4673-4680. Al usar este método, una similitud bruta entre todos los. pares de secuencias es calculada, llamada una "alineación de paridades" . Estas puntuaciones se usan después para calcular un "árbol guía" o dendrograma, el cual dice la etapa de alineación múltiple el orden en el cual alinear las secuencias para la, alineación múltiple final. Habiendo calculado el dendrograma, las secuencias son alineadas en grupos cada vez más grandes hasta que las secuencias completas sean incorporadas en la alineación final.

Como alternativa, los cálculos de la identidad de secuencias de aminoácidos y ácido nucleico se determinan en la presente usando el software AlignX, con los siguientes parámetros : Uso de algoritmo FAST: INACTIVO Tamaño K-tupie: 1 Número de diagonales mejores: 5 Tamaño de ventana : 5 Penalidad de espacio: 3 Penalidad de apertura de espacio: 10 Penalidad de extensión de espacio: 0.1 Los ajustes de alineación múltiple para AlignX fueron establecidos como sigue: Penalidad de apertura de espacios: 10 Penalidad de extensión de espacios 0.05 Escala de penalidad de separación de espacios 8 Sin penalidad de separación de espacios: No seleccionado % de identidad para retraso de alineación: 40 Espacios específicos residuales apagados: No seleccionado Espacio de residuos hidrófilos: apagado: No seleccionado Ponderación de transición: 0.

Las sustituciones conservadoras típicas son intercambios entre Met, Val, Leu e lie; entre Ser y Thr; entre los residuos Asp, Glu y Asn; entre los residuos Gln, Lys y Arg o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Según se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a una unidad de estructura unida convencionalmente por un par VH/VL de inmunoglobulina . Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y representan entonces el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio, un epítopo representa la unidad de estructura a la que se une un anticuerpo de dominio en aislamiento. Es decir, el sitio de unión es provisto por un solo dominio variable de inmunoglobulina . Los epítopos pueden ser lineales o de conformación, y pueden ser tan pequeños como tres aminoácidos.

Según se usa en la presente, el término "liberación extendida" , o los términos equivalentes "liberación controlada" o "liberación lenta", se refieren a formulaciones de fármaco que liberan fármaco activo, tal como un fármaco polipéptido, durante un periodo de tiempo después de la administración a un individuo. La liberación extendida de fármacos polipéptidos , que puede ocurrir sobre una gama de tiempos deseados, por ejemplo, minutos, horas, días, semanas o más, dependiendo de la formulación de fármaco, contrasta con las formulaciones estándares en las cuales la unidad de dosis sustancialmente completa está disponible para absorción inmediata o distribución inmediata por medio del torrente sanguíneo. Las formulaciones de liberación extendida pueden dar como resultado un nivel de fármaco circulante a partir de una sola administración que se ha prolongado, por ejemplo, durante 8 horas o más, 12 horas o más, 24 horas o más, 36 horas o más, 48 horas o más, 60 horas o más, 72 horas o más, 84 horas o más, 96 horas o más, o incluso, por ejemplo, durante 1 semana o 2 semanas o más, por ejemplo, 1 mes o más.

Según se usa en la presente, "actividad de CD28" es una actividad que incluye o que resulta de la unión de CD80, CD86 y/u otro ligando a CD28, e incluye, pero no está limitada a, activación de la señalización celular mediada por CD28. La actividad de CD28 incluye también la inducción de proliferación de células T y la inducción de secreción de citocinas, por ejemplo, interleucina 2 (IL-2) , por células T.

Según se usa en la presente, el término "no agoniza sustancialmente" significa que un agente dado, por ejemplo, un anticuerpo de dominio, no activa sustancialmente una o más de las actividades de CD28 como el término "activar" se define en la presente. Específicamente, un agente que "no agoniza sustancialmente" significa que el agente no activa más del 20% de la actividad que es activada por la unión de CD80 y/o CD86 a CD28, y en un aspecto, el agente no activa más de aproximadamente 10%, 8%, 5%, 3%, o 2% o menos, incluyendo cero activación, de la actividad que es activada por la unión de CD80 y/o CD86 a CD28. A manera de un ejemplo no limitativo, un anticuerpo de dominio mostrado en la presente que no agoniza sustancialmente la actividad de CD28 no agoniza la actividad de CD28 más del 5% de la actividad obtenida después del agonismo de la actividad de CD28 por anti-CD28 mAb 9.3 (Gibson, et al. (1996) JBC, 271:7079-7083) bajo condiciones de ensayo de otra manera idénticas.

Según se usa en la presente, los términos "inhibir", "inhibe" e "inhibido" se refieren a una reducción en una actividad mesurable dada (por ejemplo, actividad de unión) de al menos 10% en relación a una referencia. Cuando se desea inhibición, esta inhibición es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más, hasta e incluyendo 100%, es decir, la inhibición completa o ausencia de la actividad dada. La inhibición de la unión de CD28 a CD80 o CD86 puede medirse como se describe en los ejemplos de trabajo en la presente. Según se usa en la presente, el término "inhibe sustancialmente" se refiere a una reducción en una actividad mesurable dada (por ejemplo, la unión de CD28 a CD80 o CD86) en al menos 50% en relación a una referencia. Por ejemplo, "inhibe sustancialmente" se refiere a una reducción en una actividad mesurable dada de al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, y hasta e incluyendo 100% en relación a una referencia. Según se usa en la presente, "inhibe la unión", con referencia a la unión de la unión de un anticuerpo de dominio a CD28, o la unión de CD80 a CD28, o la unión de CD86 a CD28, se refiere a una reducción en la unión de al menos 10% en relación a una referencia. "Inhibe la unión" se refiere a una reducción en unión de al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más, hasta e incluyendo 100%.

Según se usa en la presente, los términos "activan", "activa" y "activado" se refieren a un incremento en una actividad mesurable dada de al menos 5% en relación a una referencia, por ejemplo, al menos 10%, 25%, 50%, 75%, o incluso 100%, o más.

Según se usa en la presente, el término "antagonista de CD28" se refiere a un agente que inhibe al menos una actividad mediada por CD28, al inhibir la unión de CD80 y/o CD86 a CD28. Una actividad CD28 es "antagonizada" si la actividad se reduce en al menos 10%, y en una modalidad ejemplar, al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, o incluso 100% (es decir, ninguna actividad) en presencia, en relación a la ausencia de un antagonista. En una modalidad ejemplar, un antagonista de CD28 según se usa el término en la presente comprende un anticuerpo de dominio que se une monovalentemente a CD28. A, manera de un ejemplo no limitativo, un antagonista de CD28 como el mostrado en la presente es un agente que inhibe una parte o toda la actividad de CD28, mientras que al mismo tiempo la gente no agoniza sustancialmente la actividad de CD28 en combinación con la señalización del receptor de células T.

Según se usa en la presente, el término "inhibe preferencialmente" según se usa en una frase tal como "en donde un anticuerpo de dominio inhibe preferencialmente la unión a CD28 por CD86 en relación a la unión a CD28 por CD80", significa que el anticuerpo de dominio lleva a cabo una cantidad de inhibición más alta de la unión de CD86 a CD28 como la definida arriba, en relación a la cantidad de inhibición de la unión de CD80 a CD28 como se definió arriba.

Según se usa en la presente, el término "agonista de CD28" se refiere a un agente que activa al menos una actividad mediada por CD28, ya sea solo o cuando se combina con otro co-estimulo, en relación a una referencia. Una actividad es "agonizada" si la actividad es incrementada en al menos aproximadamente 10%, por ejemplo, 50%, en presencia, en relación a la ausencia de un agonista.

Según se usa en la presente, la inhibición de la "actividad CTLA4" incluye, pero no está limitada a, inhibición de la función de células T. Estas funciones incluyen, entre otras, señalización mediada por receptor de células T, proliferación de células T e inducción de secreción de citocinas.

Según se usa en la presente, "enfermedad inmune" se refiere a cualquier enfermedad que esté asociada con el desarrollo de una reacción inmune en un individuo, incluyendo una reacción inmune celular y/o humoral. Ejemplos de enfermedades inmunes incluyen, pero no están limitadas a, inflamación, alergia, enfermedades autoinmunes y enfermedades relacionadas con injertos.

Según se usa en la presente, "enfermedad autoinmune" se refiere a condiciones de enfermedad y estados en los que la respuesta inmune de un individuo es dirigida contra los propios constituyentes del individuo, dando como resultado una afección indeseable y comúnmente debilitante. Según se usa en la presente, "enfermedad autoinmune" intenta incluir además afecciones autoinmunes, síndromes y similares. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad de Addison, alergia, rinitis alérgica, espondilitis anquilosante, asma, aterosclerosis , enfermedades autoinmunes del oído, enfermedades autoinmunes del ojo, gastritis atrófica autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, parotitis autoinmune, uveítis autoinmune, enfermedad celiaca, cirrosis biliar primaria, aniitis linfocítica benigna, COPD, colitis, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), depresión, diabetes, incluyendo diabetes tipo 1 y/o tipo 2, epididimitis , glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre , enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopáticá, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), respuesta inmune a productos de fármaco recombinantes, por ejemplo, factor VII en hemofilia, artritis idiopáticá juvenil, lupus eritematoso sistémico, nefrits por lupus, infertilidad masculina, enfermedad de tejidos conectivos mixta, esclerosis múltiple, miastenia grave, oncología, osteoartritis, dolor, mixedema primario, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis , psoriasis, artritis psoriásica, artritis reactiva, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , oftalamia simpática, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T antiocéntrico testicular, tiroiditis, rechazo de transplantes, colitis ulcerosa, uveítis autoinmune y vasculitis. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, afecciones en las cuales el tejido afectado es el objetivo primario, y en algunos casos, el objetivo secundario. Estas afecciones incluyen, pero no están limitadas a, SIDA, alergia tópica, asma bronquial, eczema, lepra, esquizofrenia, depresión heredada, transplante de tej ios y órganos, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Alzheimer, mal de Parkinson, infarto de miocardio, apoplejía, autismo, epilepsia, fenómeno de Arthus, anafilaxis y adicción a alcohol y drogas.

Según se usa en la presente, el término "polipéptido de anticuerpo" se refiere a un polipéptido que ya sea es un anticuerpo o es parte de un anticuerpo, modificado o no modificado, que conserva la capacidad para unirse específicamente a antígenos. Así, el término polipéptido de anticuerpo incluye una cadena pesada de unión a antígeno, cadena ligera, dímero cadena pesada-cadena ligera, fragmento Fab, fragmento F(ab' )2/ dAb o un fragmento Fv, incluyendo un Fv de cadena individual (scFv) . La frase "polipéptido de anticuerpo" intenta abarcar polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptidos de anticuerpo que conserva la capacidad para unirse específicamente a antígenos en el contexto de la fusión .

Según se usa en la presente, el término "monovalente" significa que un anticuerpo de dominio . dado puede unirse sólo a una sola molécula de su objetivo. Los anticuerpos dé origen natural son generalmente divalentes, ya que tienen dos asas de unión a antígeno funcionales, cada una comprendiendo un dominio VH y uno VL. Cuando el impedimento estérico no es un aspecto, un anticuerpo divalente puede unirse a dos moléculas separadas del mismo antígeno. En contraste, un anticuerpo "monovalente" tiene la capacidad de unirse sólo a una de estas moléculas de antígeno. Según se usa el término en la presente, un anticuerpo "monovalente" también puede comprender más de un sitio de unión a antígeno, por ejemplo, dos sitios de unión a antígeno, pero los sitios de unión deben ser para antígenos diferentes, de tal manera que el anticuerpo sólo puede unirse a una molécula de CD28 a la vez. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monovalente puede comprender un dominio VH y uno VL, pero en un aspecto, comprende sólo un solo dominio variable de inmunoglobulina, es decir, un dominio VH o uno VL, que tiene la capacidad de unirse a CD28 sin la necesidad de un dominio VL o VH correspondiente. Un anticuerpo monovalente carece de la capacidad para entrelazar moléculas de un solo antígeno.

Según se usa en la presente, el término "ensayo de agregación plaquetaria estándar" significa el ensayo descrito en la sección en la presente abajo, titulado "Ensayo de Agregación Plaquetaria" .

Según se usa en la presente, los términos "dominio VH" y "dominio VL" se refiere a regiones variables de inmunoglobulina como las definidas por Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Seguences of Immunological Interest , 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.), el cual se incorpora en la presente a manera de referencia.

Según se usa en la presente, "enlazado" se refiere a la fijación de una porción polimérica, tal como PEG a un residuo de aminoácido de un anticuerpo de dominio. La fijación de un polímero de PEG a un residuo de aminoácido de un anticuerpo de dominio, por ejemplo, un anticuerpo de dominio, se conoce como "PEGilación" y puede lograrse usando varias porciones de fijación a PEG incluyendo, pero no limitadas a, éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS) , propionato de succinimidilo (SPA) , maleimida (MAL) , vinilsulfona (VS) o tiol. Un polímero PEG, u otro polímero, puede ser enlazado a un anticuerpo de dominio en cualquier posición predeterminada, o puede ser enlazado aleatoriamente a la molécula de anticuerpo de dominio. El polímero PEG puede ser enlazado a un anticuerpo de dominio en una posición predeterminada. Un polímero PEG puede ser enlazado a cualquier residuo en un anticuerpo de dominio, sin embargo, es preferible que el polímero sea enlazado ya sea a una lisina o cisteína, la cual es ya sea de origen natural en el anticuerpo de dominio o ha sido manipulada en el anticuerpo de dominio, por ejemplo, mediante mutagénesis de un residuo de origen natural en el anticuerpo de dominio ya sea a una cisteína o lisina. El enlace a PEG también puede ser mediado a través de un enlazador péptido unido a un anticuerpo de dominio. Es decir, la porción PEG puede ser fijada a un enlazador péptido fusionado a un anticuerpo de dominio, en donde el enlazador proporciona el sitio, por ejemplo, una cisteína o lisina libre, para la fijación a PEG. Según se usa en la presente, "enlazado" también se puede referir a la asociación de dos o más anticuerpos de dominio, por ejemplo, monómeros dAb, para formar un dímero, trímero, tetrámero u otro multímero. Los monómeros de anticuerpos de dominio pueden ser enlazados para formar un multímero mediante varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, expresión de los monómeros de anticuerpo de dominio como una proteína de fusión, enlace de dos o más monómeros por medio de un enlazador péptido entre monómeros, o al unir químicamente monómeros después de la traducción, ya sea unos a otros directamente, o a través de un enlazador mediante enlaces de disulfuro, o mediante enlace a una porción de enlace di-, tri- o multivalente (por ejemplo, un PEG de varios brazos) . Aunque los multímeros de dAb se contemplan específicamente en la presente, por ejemplo en el contexto de construcciones de anticuerpos de dominio dobles o multiespecíf icas , se enfatiza que para cualquier construcción de anticuerpo de dominio dada, la construcción sólo debe ser capaz de unirse a una molécula de CD28, es decir, las construcciones deben tener sólo un elemento de unión a CD28, y no deben entrelazar CD28.

Según se usa en la presente, "polímero" se refiere a una macromolécula constituida de unidades monoméricas de repetición, y se puede referir a un polímero sintético de origen natural tal como un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente o un polisacárido ramificado o no ramificado. Un "polímero" según se usa en la presente, se refiere específicamente a un poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol ) o alcohol poli (vinílico) de cadena ramificada u opcionalmente sustituido, y derivados de los mismos.

Según se usa en la presente, "PEG" o "polímero PEG" se refiere a pol ieti lengl icol , y más específicamente puede referirse a una forma derivada de PEG, incluyendo, pero no limitada a ásteres activos de N-hidroxisuccinimida (NHS) de PEG tales como propionato de succinimidilo , ésteres activos de benzotriazol , PEG derivado con maleimida, vinil sulfonas o grupos tiol. Por ejemplo, las formulaciones de PEG pueden incluir PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS ; PEG-0-CH2-NHS ; PEG-O- CH2CH2 - C02-NHS ; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS ; PEG-02CNH-CH (R) -C02-NHS ; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS ; y PEG-0-CH2 - C02 -NHS ; en donde R es ( CH2 ) 4 ) NHC02 (mPEG) . Los polímeros de PEG mostrados en la presente pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificados cuando estén presentes varias porciones de PEG en un solo polímero. Algunas conformaciones de PEG representativas incluyen, pero no están limitadas a las s iguientes : Según se usa en la presente, un "reactivo selectivo de sulfhidrilo" es un reactivo que es útil para la fijación de un polímero de PEG a un aminoácido que contenga tiol. Los grupos" tiol en el residuo de aminoácido cisteína son particularmente útiles para interacción con un reactivo selectivo de sulfhidrilo. Los reactivos selectivos de sulfhidrilo que son útiles para esta fijación incluyen, pero no están limitados a, maleimida, vinilsulfona y tiol. El uso de reactivos selectivos de sulfhidrilo para acoplamiento a residuos de cisteína se conoce en la técnica y puede adaptarse según se requiera (véase, por ejemplo, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6:150; Greenwald et al. (2000) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101; Hermán et al. (1994) Macromol. Chem. Phys . 195:203).

La fijación de PEG u otro agente, por ejemplo, HSA, a un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente en una modalidad ejemplar, no deteriorará la capacidad del polipéptido para unirse específicamente a CD28. Es decir, el anticuerpo de dominio enlazado a PEG conservará su actividad de unión en relación a una contraparte no enlazada a PEG. Según se usa en la presente, "conserva actividad" se refiere a un nivel de actividad de un anticuerpo de dominio enlazado a PEG que es al menos 10% del nivel de actividad de un anticuerpo de dominio no enlazado a PEG, incluyendo al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, y hasta 90%, incluyendo hasta alrededor de 95%, 98% y hasta 100% de la actividad de un anticuerpo de dominio no enlazado a PEG que comprenda el mismo dominio o dominios de unión a antígeno. Más específicamente, la actividad de un anticuerpo de dominio enlazado a PEG en comparación con un anticuerpo de dominio no enlazado a PEG debe determinarse sobre una base molar del polipéptido de anticuerpo; es decir los números equivalentes de moles de cada uno del anticuerpo de dominio enlazado a PEG y no enlazado a PEG se deben usar en cada prueba. Para determinar si un anticuerpo de dominio enlazado a PEG particular "conserva actividad", la actividad de un anticuerpo de dominio enlazado a PEG puede compararse con la actividad del mismo anticuerpo de dominio en ausencia de PEG.

Según se usa en la presente, el término "vida media in vivo" se refiere al tiempo que tarda la concentración en suero de un ligando (por ejemplo, un anticuerpo de dominio) para reducir en aproximadamente 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o depuración o secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden estabilizarse in vivo y su vida media incrementarse al unirse a moléculas, tales como PEG, que resistan la degradación y/o depuración o secuestro. La vida media de un anticuerpo de dominio se incrementa si su actividad funcional persiste, in vivo, durante un periodo más largo que un polipéptido de anticuerpo similar que no sea enlazado a un polímero de PEG. Típicamente, la vida media de un anticuerpo de dominio PEGilado se incrementa en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, o más en relación a un anticuerpo de dominio no PEGilado. Incrementos en la escala de 2X, 3X, 4X, 5X, 10X, 20X, 30X, 40X, 50X, o más de la vida media son posibles. Como alternativa, o además, incrementos en la escala de hasta 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X, 100X o 150X de la vida media son posibles. Como se indica en la presente, un anticuerpo de dominio enlazado a PEG tiene una vida media de entre 0.25 y 170 horas, incluyendo entre 1 y 100 horas, incluyendo además entre 30 y 100 horas, y todavía incluyendo además entre 50 y 100 horas, y hasta 170, 180, 190 y 200 horas o más.

Según se usa en la presente, "resistente a degradación" o "resiste la degradación" con respecto a un PEG u otro monómero o multímero de anticuerpo de dominio enlazado a polímero significa que el monómero o multímero de anticuerpo de dominio enlazado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de aproximadamente 10% cuando es expuesto a pepsina a un pH de 2.0 durante 30 minutos y en un aspecto, no se degrada en absoluto.

Según se usa en la presente, "tamaño hidrodinámico" se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) con base en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento, de una proteína a través de una solución puede procesarse para' derivar un tamaño aparente de la proteína, en donde el tamaño se ve por el "radio Stokes" o "radio hidrodinámico" de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación) , de tal manera que dos proteínas que tengan la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos con base en la conformación general de la proteína. El tamaño hidrodinámico se mide, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño. El tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo enlazado a PEG, por ejemplo, un anticuerpo de dominio, puede estar en la escala de aproximadamente 24 kD a 500 kD; 30 a 500 kD; 40 a 500 kD; 50 a 500 kD; 100 a 500 kD; 150 a 500 kD; 200 a 500 kD; 250 a 500 kD; 300 a 500 kD; 350 a 500 kD; 400 a 500 kD; y 450 a 500 kD. En un aspecto, el tamaño hidrodinámico de un anticuerpo de dominio PEGilado es de aproximadamente 30 a 40 kD; 70 a 80 kD o 200 a 300 kD. Cuando un anticuerpo de dominio se desee para usarse en aplicaciones de formación de imágenes, el anticuerpo de dominio debe tener un tamaño hidrodinámico de entre aproximadamente 50 y 100 kD. Como alternativa, cuando se desee un anticuerpo de dominio para aplicaciones terapéuticas, la preparación de anticuerpo de dominio debe tener un tamaño hidrodinámico de más de alrededor de 200 kD.

Según se usa en la presente, el término "IC50" se refiere a la concentración de un inhibidor necesario para inhibir una actividad dada en aproximadamente 50%. La IC50 se determina al ensayar una actividad dada, por ejemplo, la unión de CD28 a CD80 o CD86, en presencia de cantidades variables del inhibidor (por ejemplo, anticuerpo de dominio) , y graficando la concentración de inhibidor contra la actividad que se esté seleccionando. La unión de CD28 a CD80 o CD86 se mide en la presente mediante el método descrito en los ejemplos de trabajo. Como alternativa, se puede usar resonancia de un plasmón en superficie (SPR) .

Según se usa en la presente, el término "EC50" se refiere a la concentración de compuesto o anticuerpo de dominio que provoca una respuesta en un sujeto, en donde la respuesta es la mitad entre la línea de base y la respuesta máxima. Las respuestas de línea de base y máxima de un sujeto, con respecto , a un compuesto o anticuerpo de dominio, pueden determinarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica .

Según se usa en la presente, el término "fusionado a un anticuerpo de dominio" significa generalmente que un polipéptido es fusionado a un anticuerpo dado a través del uso de técnicas de ADN recombinantes , aunque la fusión puede ocurrir químicamente al nivel de proteína. Así, un anticuerpo "fusionado a" otro polipéptido, por ejemplo, a otro anticuerpo de diferente especificidad de unión, no existe en la naturaleza y se genera a través de medios recombinantes. El término "fusionado a un anticuerpo de dominio" también abarca el enlace de un polipéptido a un anticuerpo de dominio dado a través de, por ejemplo, enlaces de disulfuro u otros enlaces químicos, en donde el polipéptido fusionado no se encuentra naturalmente fusionado al anticuerpo de dominio. Los métodos recombinantes y químicos para fusionar un polipéptido a otro polipéptido, por ejemplo, a un anticuerpo, se conocen bien en la técnica.

Según se usa en la presente, el término "dominio Fe" se refiere a las secuencias de anticuerpo de región constante que comprenden dominios constantes CH2 y CH3 según se delimita de acuerdo con Kabat et al., véase arriba. La porción Fe del polipéptido de la cadena pesada tiene la capacidad de auto-asociarse, una función que facilita la formación de anticuerpos divalentes. El término "carece de un dominio Fe" significa que un anticuerpo de dominio dado carece de al menos la porción de un dominio Fe de inmunoglobulina (ya que estos dominios se definen de acuerdo con Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.) suficiente para mediar la dimerización de anticuerpos de dominio que contengan Fe. La dimerización de anticuerpos de dominio que contienen Fe se mide, por ejemplo, mediante métodos cromatográficos o mediante resonancia de un plasmón en superficie. Un anticuerpo de dominio que carezca de un dominio Fe evita interacciones Fc-plaquetas y por lo tanto evita la inducción de agregación plaquetaria.

Según se usa en la presente "tratar", "reducir", "prevenir" o "aliviar" cuando se refiere a un síntoma de enfermedad se refiere a una reducción de un síntoma de al menos 10% con base en un parámetro clínicamente mesurable, o de al menos un punto en una escala clínicamente aceptada de severidad de enfermedad o síntomas. Según se usa en la presente, el término "síntomas de lupus eritematoso sistémico" se refiere a cualquiera de los síntomas clínicamente relevantes de SLE conocidos por los expertos en la técnica. . Ejemplos no limitativos incluyen la acumulación de auto-anticuerpos de IgG (por ejemplo, contra antígenos nucleares tales como cromatina, snR Ps (especialmente Ul, Sm, Ro/SSA y La/SSB) , fosfolípidos y moléculas de superficie celular) , anemia hemolítica, trombocitopenia, leucopenia, glomerulonefritis , vasculitis, artritis y serositis) . Una reducción en uno de estos síntomas es una reducción de al menos 10% en un parámetro clínicamente mesurable, o de al menos un punto en una escala clínicamente aceptada de severidad de enfermedad.

Según se usa en la presente, la frase "se une .específicamente" se refiere a la unión de un antígeno por un anticuerpo de dominio con una constante de disociación (Ka) de 1 µ? o más baja según se mide mediante análisis de resonancia de un plasmón en superficie usando, por ejemplo, un sistema de resonancia de un plasmón en superficie BIAcore™ y software de evaluación cinética BIAcore™ (por ejemplo, versión 2.1) . La afinidad o K¿ para una interacción de unión específica, en un aspecto, es aproximadamente 500 nM o menos, y en otro aspecto, aproximadamente 300 nM o más baja.

Según se usa en la presente, un "ligando genérico" es un ligando que se une a una proporción sustancial de miembros funcionales en un repertorio dado, por ejemplo, en una biblioteca de despliegue de fagos. Así, el mismo ligando genérico puede unirse a muchos miembros del repertorio no obstante de sus especificidades del ligando objetivo. En general, la presencia de un sitio de unión a ligando genérico funcional indica que el miembro del repertorio es expresado y doblado correctamente. De esta manera, la unión del ligando genérico a su sitio de unión proporciona un método para preseleccionar polipéptidos funcionales a partir de un repertorio de polipéptidos. Los ligandos genéricos incluyen, por ejemplo, proteína A, proteína G y proteína L.

Según se usa en la presente, el término "estructura universal" se refiere a una secuencia estructural de un solo anticuerpo que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservadas en secuencia como se define por Kabat (Kabat et al. (1991) Seguences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.) o que corresponden al repertorio o estructura de inmunoglobulina de línea germinal humana como se define por Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. El uso de una sola estructura, o de un conjunto de estas estructuras, que se ha encontrado permite la derivación virtualmente de cualquier especificidad de unión a través de variación en las regiones hipervariables solas, se incluye en la presente.

El término "aproximadamente" se entenderá por las personas de capacidad ordinaria en la técnica y variará hasta cierto punto en el contexto en el cual se use. Generalmente, aproximadamente abarca una gama de valores que son más/menos 10% de un valor de referencia.

El término "corresponde a" según se usa en la presente con respecto a secuencias y/o dominios de proteínas o ácido nucleico se refiere a una secuencia o estructura análoga en una proteína separada. Por ejemplo, un dominio de unión a calcio de miosina de ratón "corresponde a" el dominio de unión a calcio de una miosina humana. 1.2 Abreviaturas La siguiente es una lista de términos y abreviaturas asociadas usadas en la presente y aplican a los términos referenciados , a menos que se indique de otra manera con términos y abreviaturas específicas. anticuerpo síndrome de inmunodeficiencia adquirida célula presentadora de antígenos área bajo la curva albúmina de suero bovino ADN complementario molécula co-estimuladora B7-1 en APCs CD86 molécula co-estimuladora B7-2 en APCs CDR región de determinación de complementariedad CTLA-4 a/k/a CD152; receptor de CD80/D86 de alta afinidad en células T CRS síndrome de liberación de citocinas dAb anticuerpo de dominio DC célula dendrítica ADN ácido desoxirribonucleico EDTA ácido etilendiaminotetraacético ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Fab región de unión a antígeno Fe región de cola de anticuerpo FCS suero de becerro fetal FW estructura HPLC cromatografía de líquidos de alto rendimiento HSA albúmina de suero humana IFN interferón IL interleucina kD kiloDalton I¾ constante de disociación mAb anticuerpo monoclonal MAL maleimida mg miligramo mi mililitro MLR reacción linfocítica mixta mM milimolar MoDC células dendríticas derivadas de monocitos MSA albúmina sérica de ratón NHS N-hidroxisuccinimida ng nanogramo nM nanomolar pg picogramo pM picomolar ARNm ácido ribonucleico mensajero PBMC células mononucleares de sangre periférica PCR reacción en cadena de la polimerasa PDB base de base de datos de proteínas PEG polietilenglicol PK farmacocinética ppm partes por millón RO ocupación de receptor RT-PCR reacción en cadena de la polimerasa- transcriptasa inversa SA albúmina de suero scFV fragmento variable de una sola cadena SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida docecil sulfato de sodio SEC-MALLS cromatografía de exclusión de tamaño- dispersión de luz láser de varios ángulos SPA propionato de succinimidilo SPR resonancia de un plasmon en superficie SRBC glóbulos rojos de borrego ti2 vida media TNF factor de necrosis tumoral t.u. unidades de título µg microgramo µ? microlitro µ? micromolar VH dominio de la cadena pesada variable VL dominio de la cadena ligera variable VS sulfato de vinilo IX· SSC NaCl 0.15 M, citrato de sodio 0.015 M, pH 7.0.

Se proporcionan anticuerpos de dominio que son monovalentes para unirse a CD28. Aunque no se desea ser limitados por ninguna teoría particular, se cree que la monovalencia para la unión a CD28 elimina la posibilidad de entrelazar receptores de superficie celular que ocurre con anticuerpos de la técnica anterior. De esta manera, en un aspecto, los anticuerpos de dominio descritos en la presente no sólo inhiben o antagonizan la unión de CD80 o CD86 a CD28, no agonizan sustancialmente la actividad de CD28.

En un aspecto, los anticuerpos monovalentes para unión a CD28 son anticuerpos de dominio humanos. Los anticuerpos de dominio humanos pueden administrarse a pacientes humanos evitando al mismo tiempo ampliamente la respuesta inmune ant i -anticuerpos comúnmente provocada por la administración de anticuerpos de otras especies, por ejemplo, ratón. Aunque anticuerpos de murino pueden ser "humanizados" al injertar dominios constantes humanos en los dominios de unión a antígeno de murino, los anticuerpos humanos como los descritos en la presente se producen sin la necesidad de manipulación genética laboriosa y consumidora de tiempo de una secuencia de anticuerpos de murino. 2. Anticuerpos de dominio monovalentes Las cadenas de polipéptidos pesada y ligera de anticuerpos comprenden regiones variables (V) que participan directamente en interacciones de antígenos, y regiones constantes (C) que proporcionan soporte estructural y funcionan en interacciones no específicas de antígenos con efectores inmunes. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional comprende dos dominios separados: un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) , el cual puede ser ya sea VK o V\) . El propio sitio de unión a antígeno se forma por seis asas de polipéptidos: tres del dominio VH (Hl, H2 y H3) y tres del dominio VL (Ll, L2 y L3) . In vivo, un repertorio primario diverso de genes V que codifican para los dominios VH y VL se produce mediante la redisposición combinatoria de segmentos génicos . Las regiones C incluyen las regiones C de la cadena ligera (conocidas como regiones CL) y las regiones C de la cadena pesada (conocidas como regiones CH1, CH2 y CH3) . Un anticuerpo de origen natural comprende generalmente dos dominios de unión a antígeno y es por lo tanto divalente.

Un número de fragmentos de unión a antígeno más pequeños de anticuerpos de origen natural han sido identificados después de digestión con proteasas . Estas incluyen, por ejemplo, el "fragmento Fab" (VL-CL/CH1-VH) , "fragmento Fab'" (un Fab con la región de pivote de la cadena pesada), y "fragmento F(ab' )2" (un dímero de fragmentos Fab' unidos por la región de pivote de la cadena pesada) . Se han usado métodos recombinantes para generar estos fragmentos y para generar fragmentos de unión a antígeno todavía más pequeños, por ejemplo, aquellos conocidos como "Fv de cadena individual" (fragmento variable) o "scFv", que consiste en VL y VH unidos por un enlazador péptido (VL-enlazador-VH) . Los fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos scFv son monovalentes para unión a antígenos, toda vez que cada uno comprende sólo un dominio de unión a antígeno que comprende un dímero VH/VL.

Un anticuerpo de dominio, o "dAb" , se une a antígenos independientemente de otros dominios V; sin embargo, un anticuerpo de dominio puede estar presente en un homo- o heteromultímero con otros dominios VH o VL en donde los demás dominios no se requieran para la unión a antígeno por el dAb, es decir, en donde el dAb se una a antígenos independientemente de los dominios VH o VL adicionales . La preparación de anticuerpos de dominio se describe y ejemplifica en la presente abajo.

Los dominios variables de un solo anticuerpo, por ejemplo, VHH son la unidad de anticuerpo de unión a antígeno más pequeña conocida. Para uso en terapia, los anticuerpos humanos son especialmente adecuados, principalmente porque no es tan probable que provoquen una respuesta inmune cuando se administra en un paciente. Las comparaciones de VHH de camélido con los dominios VH de anticuerpos humanos revelan varias diferencias clave en las regiones estructurales del dominio VHH de camélido en correspondencia con la interfaz H/ L de los dominios VH humanos. La mutación de estos residuos de VH3 humano para simular más estrechamente la secuencia VHH (específicamente Gly 44?Glu, Leu 45?Arg y Trp 47—>Gly) se ha llevado a cabo para producir dominios VH humanos "camelizados" que conservan la actividad de unión a antígeno (Davies & Riechman (1994) FEBS Lett . 339:285-290) no obstante tienen expresión y solubilidad mejoradas. (La numeración de aminoácidos de dominio variable usada en la presente) es de acuerdo con la convención de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.)) WO 03/035694 (Muyldermans) reporta que la mutación Trp 103?Arg mejora la solubilidad de dominios VH no camélidos. Davies & Riechmann (1995) Biotechnology N.Y. 13:475-479 reportan también la producción de un repertorio desplegado en fagos de dominios VH humanos camelizados y selección de clones que se unen a hapteno con afinidades en la escala de 100-400 nM, pero clones seleccionados para unión a antígenos de proteína tuvieron afinidades más débiles.

Los anticuerpos de dominio pueden generarse de varias maneras diferentes. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que se sabe se une a CD28 pueden ser manipuladas para generar un número de anticuerpos de dominio diferentes que sean monovalentes para unión a CD28. Así, dadas las secuencias que codifican para los polipéptidos de la cadena pesada y ligera que constituyen un anticuerpo y las metodologías de clonación molecular estándares, pueden generarse construcciones de polipéptidos de unión a antígenos monovalentes tales como fragmentos Fab, scFv, dAbs o incluso anticuerpos biespecíficos (es decir, anticuerpos que comprendan dos porciones de unión a antígeno diferentes y que puedan por lo tanto unirse a dos antígenos separados, y en un aspecto, simultáneamente) que sean monovalentes para CD28. 2.1. Estrategia general y métodos para diseñar anticuerpos de dominio Un medio para generar anticuerpos de dominio específicos para CD28 es el de amplificar y expresar las regiones VH y VL de las secuencias génicas de la cadena pesada y cadena ligera aisladas, por ejemplo, de un hibridoma (por ejemplo, un hibridoma de ratón) que exprese anticuerpos de dominio. Los límites de los dominios VH y VL se establecen por Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest , 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.) . La información con respecto a los límites de los dominios VH y VL de genes de la cadena pesada y ligera se usa para diseñar cebadores de PCR que amplifiquen el dominio V de una secuencia de codificación de la cadena pesada o ligera que codifiquen para un anticuerpo que se conozca se una a CD28. Los dominios V amplificados son insertados en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19.4133-4137) y expresados, por ejemplo, como una fusión del H y VL en un scFv u otro formato monovalente adecuado. El polipéptido resultante es luego tamizado para unión monovalente de alta afinidad a CD28. En conjunto con los métodos mostrados en la presente, el tamizado para unión se lleva a cabo como se conoce en la técnica o como se describe en la presente abajo.

Como alternativa, pueden usarse métodos de tamizado de bibliotecas para identificar proteínas de unión específicas de CD28 monovalentes. Tecnología de despliegue de fagos (véase, por ejemplo, Smith (1985) Science 228:1315; Scott & Smith (1990) Science 249:386, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552) proporciona un enfoque para la selección de anticuerpos de dominio que se unen a un objetivo deseado de entre grandes y diversos repertorios de anticuerpos de dominio. Estas bibliotecas de fagos-anticuerpos pueden agruparse en dos categorías: bibliotecas naturales que usan genes V redispuestos cosechados de células B humanas (Marks et al. (1991) J". Mol. Biol . , 222:581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. , 14:309) o bibliotecas sintéticas con las cuales segmentos génicos V de línea germinal u otras secuencias de codificación de anticuerpos de dominio son "redispuestas" in vitro (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Nissim et al. (1994) EMBO J. , 13:692; Griffiths et al. (1994) EMBO J. , 13:3245; De Kruif et al. (1995) J\ Mol. Biol., 248:97) o en donde CDRs sintéticas son incorporadas en un solo gen V redispuesto (Barbas et al. (1992) Proc Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:4457). Los métodos que incluyen empaques de despliegue genético (por ejemplo, despliegue de fagos, despliegue de polisomas) son muy adecuados para la selección de construcciones de anticuerpos específicos de CD28 monovalentes toda vez que generalmente expresan sólo fragmentos monovalentes, en lugar de anticuerpos divalentes enteros, sobre los empaques de despliegue. Los métodos para la preparación de bibliotecas de despliegue de fagos que despliegan varios fragmentos de anticuerpo se describen en las referencias precedentes. Estos métodos también se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,696,245, la cual se incorpora en la presente a manera de referencia. Los métodos descritos en la patente '245 incluyen generalmente la aleatorización de regiones seleccionadas de regiones de codificación de genes de inmunoglobulina, en particular las regiones de codificación VH y VL, mientras se dejan otras regiones no aleatorizadas (véase abajo). La patente '245 describe también la generación de construcciones scFv que comprenden dominios VH y VL aleatorizados individualmente.

El análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha mostrado que cinco de las seis asas de unión a antígeno (Hl, H2 , Ll , L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol . 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877). Las conformaciones de la cadena principal se determinan por (i) la longitud del asa de unión a antígeno, y (ii) residuos particulares, o tipos de residuo, en ciertas posiciones clave en el asa de unión a antígenos y la estructura del anticuerpo. Por ejemplo, el. análisis de las longitudes de asa y residuos clave ha hecho posible la predicción de las conformaciones de cadena principal de Hl, H2 , Ll, L2 y L3 codificadas por la mayoría de secuencias de anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J". Mol. Biol. 227:799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628; Williams et al. (1996) J". Mol. Biol. 264:220) . Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D) , forma también un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de asa cortas que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuo, en posiciones claves en el asa y la estructura del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399:1.

Aunque, en un enfoque, se puede añadir diversidad a repertorios sintéticos en cualquier sitio en las CDRs de las diferentes asas de unión a antígeno, este enfoque se traduce en una mayor proporción de dominios V que no se doblan adecuadamente y por lo tanto contribuyen a una menor proporción de moléculas con el potencial de unirse a antígenos. Un entendimiento de los residuos que contribuyen a la conformación de cadena principal de las asas de unión a antigeno permite la identificación de residuos específicos para diversificar en un repertorio sintético de dominios VH o VL; es decir, lá diversidad se introduce mejor en residuos que no son esenciales para mantener la conformación de la cadena principal. Como un ejemplo, para la diversificación del asa L2, el enfoque convencional sería diversificar todos los residuos en la CDR correspondiente (CDR2) como se define por Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest , 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.), algunos siete residuos. Sin embargo, para L2 , se conoce que las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos de origen natural y se observa que hacen contacto con el antígeno. Un enfoque sería el de diversificar sólo aquellos dos residuos en esta asa. Esto representa una mejora significativa en términos de la diversidad funcional requerida para crear una gama de especificidades de unión a antígeno.

Las bibliotecas de polipéptidos de inmunoglobulina pueden diseñarse adecuadamente para basarse en conformación de cadena principal de dominio variable predeterminada. Estas bibliotecas pueden construirse como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/20749, los contenidos de la cual se incorporan en la presente a manera de referencia. De esta manera, en un aspecto, un anticuerpo de dominio comprende la secuencia de aminoácidos de un segmento génico de la región V de línea germinal humana dado, por ejemplo, un segmento génico de línea germinal VH DP-47, o segmento génico de línea germinal VK DPK9. Estos polipéptidos de la región variable pueden usarse para la producción de scFvs o Fabs, por ejemplo, un scFv o Fab que comprenda (i), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) , o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprenda la secuencia de aminoácidos del segmento VH de línea germinal DP-47 y (ii) un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) , o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprenda la secuencia de aminoácidos del segmento VK de línea germinal DPK9. La diversificación de las secuencias dentro del contexto de los segmentos génicos de línea germinal de la cadena pesada y ligera seleccionados, por ejemplo, DP-47, DPK 9, DP45, DP38, etc., puede generar un repertorio de diversas secuencias de codificación de inmunoglobulina . Un enfoque para la diversificación se describe abajo en el contexto de generar una biblioteca de secuencias de anticuerpos de dominio o scFv diversificadas. Estos polipéptidos de región variable también pueden ser expresados como anticuerpos de dominio y tamizarse para la unión de alta afinidad a CD28. El repertorio puede ser clonado en o generarse en un vector adecuado para despliegue de fagos, por ejemplo, un vector de despliegue de bacteriófagos lambda o filamentosos y luego se tamiza para su unión a un antígeno objetivo dado, por ejemplo, CD28. 3. Preparación de anticuerpos de dominio Un anticuerpo de dominio es un dominio de polipéptido doblado que comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, constante de disociación de 500nM o menos) , y el cual se une a un antígeno como un solo dominio variable; es decir, hay un sitio de unión proporcionado por un anticuerpo de dominio sin un dominio variable complementario. Un anticuerpo de dominio incluye- por lo tanto dominios variables de anticuerpo completos así como dominios variables modificados, por ejemplo en los cuales una o más asas han sido reemplazadas por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones N- o extermínales, así como fragmentos doblados de dominios de anticuerpo que conservan una constante de disociación de aproximadamente 500 nM o menos (por ejemplo, alrededor de 450 nM o menos, aproximadamente 400 nM o menos, alrededor de 350 nM o menos, aproximadamente 300 nM o menos, alrededor de 250 nM o menos, aproximadamente 200 nM o menos, alrededor de 150 nM o menos, aproximadamente 100 nM o menos) y la especificidad de antígeno objetivo del dominio de longitud completa. En una modalidad ejemplar, un dominio de variable individual de anticuerpo útil en las composiciones y métodos mostrados en la presente se selecciona del grupo de VH y VL, incluyendo Vkappa y Viambda. En una modalidad ejemplar, los anticuerpos de dominio de uso en la presente son "humanos" según se define ese término en la presente. 3.1.1. Estructura de ligandos De acuerdo con un aspecto descrito en la presente, dos o más dominios de unión a epítopos no complementarios son enlazados de tal manera que estén en una conformación cerrada como la definida en la presente. Adecuadamente, pueden fijarse además a un esqueleto que puede, como una alternativa, o además de un enlazador descrito en la presente, facilitar la formación y/o mantenimiento de la conformación cerrada de los sitios de unión a epítopo unos con respecto a otros. Como alternativa, los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden construirse usando estructuras de andamiaje o esqueleto como las descritas en la presente .

Los esqueletos de ligandos pueden basarse en moléculas de inmunoglobulina o pueden ser no de inmunoglobulina en origen como se muestra en cualquier lado aquí. Los esqueletos de inmunoglobulina como los definidos en la presente pueden incluir cualquiera o más de aquellos seleccionados de los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprenda al menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprenda los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprenda los dominios CH1, CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) en conjunto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. Un dominio de región de pivote también puede ser incluido. Estas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab, o F(ab' )2- Los expertos en la técnica estarán conscientes de que ésta lista no intenta ser exhaustiva.

Cada dominio de unión a epítopo comprende una estructura de proteína y uno o más CDRs que están implicados en la interacción específica del dominio con uno o más epítopos . Adecuadamente, un dominio de unión a epítopo descrito en la presente comprende tres CDRs. Los soportes de proteína adecuados, además de aquellos a base de dominios de inmunoglobulina, también se pueden basar en soportes o esqueletos de proteínas que no sean dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, receptores bacterianos naturales tales como SPA han sido usados como soportes para el injerto de CDRs para generar ligandos que se unan específicamente a uno o más epítopos. Los detalles de este procedimiento se describen en US 5,831,012. Otros soportes adecuados incluyen aquellos a base de fibronectina y aficuerpos (Affibody, Bromma, Suecia) . Los detalles de procedimientos adecuados se describen en WO 98/58965. Otros soportes adecuados incluyen lipocalina y CTLA4 , como se describe en van den Beuken et al., (2001) J". Mol. Biol . 310:591-601, y soportes tales como aquellos descritos en WO 00/69907 (Medical Research Council) , los cuales son a base por ejemplo de la estructura de anillo de GroEL bacteriano u otros polipéptidos chaperones. Otros soportes no a base de inmunoglobulina que pueden usarse incluyen aquellos a base de la clase A del receptor de LDL, monómeros y multímeros de dominio EGF, y soportes disponibles de Biorexis (King of Prussia, PA) o Avidia (Mountain View, CA) . Otros soportes que no son de inmunoglobulina que pueden usarse se describen, por ejemplo, en WO 05/040229, WO 04/044011 y US 2005/0089932. 3.1.2. Selección de la conformación de la cadena principal Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina comparten todos un doblez similar para su cadena polipéptidos. Por ejemplo, aunque anticuerpos son altamente diversos en términos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, a diferencia de lo que se esperaba, cinco de las seis asas de unión a antígeno de anticuerpos (Hl, H2 , Ll, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol . 196:901; Chothia et al. (1989) Nature, 342:877). El análisis de las longitudes de asa y residuos clave ha por lo tanto hecho posible la predicción de las conformaciones de cadena principal de Hl, H2 , Ll, L2 y L3 encontradas en la mayoría de anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227:799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. , 14:4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264:220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D) , también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de asa cortas que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el asa y en la estructura del anticuerpo (Martin et al. (1996) J". Mol. Biol. 263:800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399:1).

Los ligandos descritos en la presente pueden seleccionarse y/o ensamblarse a partir de bibliotecas de dominios, tales como bibliotecas de dominios VH y/o bibliotecas de dominios VL. Además, los ligandos descritos en la presente pueden a su vez ser provistos en forma de bibliotecas. En un aspecto descrito en la presente, bibliotecas de ligandos y/o dominios se diseñan en las cuales ciertas longitudes de asa y residuos clave han sido seleccionados para asegurar que la conformación de la cadena principal de los miembros se conozca. Adecuadamente, éstas' son conformaciones reales de moléculas de la superfamilia de inmunoglobulina encontradas en la naturaleza, para minimizar las probabilidades de que sean no funcionales, como se describió arriba. Los segmentos génicos V de línea germinal sirven como una estructura básica ejemplar para construir bibliotecas de anticuerpos o receptores de células T; otras secuencias también son de utilidad. Pueden ocurrir variaciones a una baja frecuencia, de tal manera que un número pequeño de miembros funcionales pueda poseer una conformación de cadena principal alterada, que no afecte su función .

La teoría de las estructuras canónicas también es de utilidad para evaluar el número de diferentes conformaciones de cadena principal codificadas por ligandos, para predecir la conformación de la cadena principal con base en secuencias de ligandos y para seleccionar residuos para diversificación que no afecten la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio VK humano, el asa Ll puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el asa L2 tiene una sola estructura, canónica y que 90% de los dominios VK humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el asa L3 (Tomlinson et al. (1995) citado arriba); de esta manera, en el dominio VK solo, diferentes estructuras canónicas pueden combinarse para crear una gama de conformaciones de cadena principal diferentes. Dado que el dominio V¾, codifica para una gama diferente de estructuras canónicas para las asas Ll, L2 y L3, y que los dominios VK y V\ pueden aparearse con cualquier dominio VH que pueda codificar para varias estructuras canónicas para las asas Hl y H2 , el número de combinaciones de estructuras canónicas observado para estas cinco asas es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede ser esencial para la producción de una amplia gama de especificidades de unión. Sin embargo, al construir una biblioteca de anticuerpos con base en una sola conformación de cadena principal conocida se ha encontrado, a diferencia de lo que se esperaba, que la diversidad en la conformación de la cadena principal no se requiere para generar suficiente diversidad como para dirigirse sustancialmente a todos los antígenos. De manera todavía más sorprendente, la conformación de una sola cadena principal no tiene que ser una estructura de consenso. Una sola conformación de origen natural puede usarse como la base para una biblioteca completa. Así, en un aspecto, los ligandos descritos en la presente poseen una sola conformación de cadena principal conocida.

La conformación de cadena principal individual que se selecciona es en un aspecto, común entre las moléculas del tipo de superfamilia de inmunoglobulina en cuestión. Una conformación es común cuando un número significativo de moléculas de origen natural se observa que la adoptan. En consecuencia, en un aspecto descrito en la presente, el origen natural de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada asa de unión de un dominio de inmunoglobulina se considera separadamente y luego se selecciona un dominio variable de origen natural que posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para las diferentes asas. Si ninguna está disponible, el equivalente más cercano puede seleccionarse. Es preferible que la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para las diferentes asas se cree al seleccionar segmentos génicos de línea germinal que codifiquen para las conformaciones de cadena principal deseadas. Se prefiere más que los segmentos génicos de línea germinal seleccionados sean expresados frecuentemente en la naturaleza, y muy preferiblemente que sean los expresados más frecuentemente de todos los segmentos génicos de línea germinal naturales.

Al diseñar ligandos o bibliotecas de los mismos la incidencia de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada una de las asas de unión a antígeno puede considerarse por separado. Para Hl, H2 , Ll, L2 y L3 , una conformación dada que es adoptada por entre 20% y 100% de las asas de unión a antígeno de moléculas de origen natural es seleccionada. Típicamente, su incidencia observada está por arriba de 35% (es decir, entre 35% y 100%) y, idealmente, arriba de 50% o incluso arriba de 65%. Ya que la basta mayoría de asas H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de cadena principal que sea común entre estas asas que sí despliegan estructuras canónicas. Para cada una de las asas, la conformación que se observa más comúnmente en el repertorio natural es por lo tanto seleccionada. En anticuerpos humanos, las estructuras canónicas más populares (CS) para cada asa son las siguientes: Hl-CS 1 (79% del repertorio expresado), H2-CS 3 (46%) , Ll-CS 2 de VK (39%) , L2-CS 1 (100%) , L3-CS 1 de VK (36%) (el cálculo asume una relación ?:? de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Syp . Quant . Biol . , 48:133). Para asas H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud CDR (Kabat et al. (1991) Seguetees of proteins of immunological interest , U.S. Department of Health and Human Services) de siete residuos con un puente de sal del residuo 94 al residuo 101 parece ser la más común. Hay por lo menos 16 secuencias de anticuerpos humanas en la biblioteca de datos EMBL con la longitud H3 requerida y residuos clave para formar esta conformación y por lo menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que se pueden usar con una base para modelado de anticuerpos (2cgr y ltet) . Los segmentos génicos de línea germinal expresados más frecuentemente que esta combinación de estructuras canónicas son el segmento VH 3-23 (DP-47) , el segmento JH JH4b, el segmento VK 02/012 (DPK9) y el segmento JK J<1. Los segmentos VH DP45 y DP38 también son adecuados. Estos segmentos pueden por lo tanto usarse en combinación como una base para construir una biblioteca con la conformación de cadena principal individual deseada.

Como alternativa, en lugar de seleccionar la conformación de cadena principal individual con base en el origen natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada una de las asas de unión en aislamiento, el origen natural de las combinaciones de conformaciones de cadena principal se usa como la base para seleccionar la conformación de cadena principal individual. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, el origen natural de combinaciones de estructuras canónicas para cualquiera dos, tres, cuatro, cinco o para todas las seis asas de unión a antígeno puede determinarse. Aquí, es preferible que la conformación seleccionada sea común en anticuerpos de origen natural y más preferible que se observe más frecuentemente en el repertorio natural. Así, en anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando combinaciones naturales de las cinco asas de unión a antígeno Hl , H2 , Ll , L2 y L3 son consideradas, la combinación más frecuente de estructuras canónicas se determina y luego se combina con la conformación más popular para el asa H3 , como una base para seleccionar la conformación de cadena principal individual . 3.2 Preparación de anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio se preparan en un número de maneras. Para cada uno de estos enfoques, métodos bien conocidos para preparar (por ejemplo, amplificar, mutar, etc.) y manipular secuencias de ácido nucleico son aplicables .

Un medio para preparar un anticuerpo de dominio es el de amplificar y expresar la región VH o VL de un gen de la cadena pesada o cadena ligera para un anticuerpo clonado que se sepa se una al antígeno deseado. Es decir, el dominio VH o VL de una región de codificación de anticuerpo de dominio conocido puede amplificarse y expresarse como un solo dominio (o como una fusión de un solo dominio) y evaluarse para su unión a CD28. Los límites de los dominios VH y VL se establecen por Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5a edición. U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.). La información con respecto a los límites de los dominios VH y VL de genes de la cadena pesada y ligera se usa para diseñar cebadores de PCR que amplifican el dominio V de una secuencia de codificación de la cadena pesada o ligera clonada que codifica para un anticuerpo que se sabe se une a CD28. El dominio V amplificado se inserta en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137) y es expresado, ya sea solo o como una fusión con otra secuencia de polipéptidos .

El gen VH se produce mediante la recombinación de tres segmentos génicos, VH, D y JH. En humanos, hay aproximadamente 51 segmentos VH funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today 16:237), 25 segmentos D funcionales (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol . 268:69) y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch et al. (1981) Cell 27:583), dependiendo del haplotipo. El segmento VH codifica para la región de la cadena de polipéptidos que forma la primera y segunda asas de unión a antígeno del dominio VH (Hl y H2) , en tanto que los segmentos VH/ D y JH se combinan para formar la tercer asa de unión a antígeno del dominio VH (H3) .

El gen VL se produce mediante la recombinación de sólo dos segmentos génicos, VL y JL. En humanos, hay aproximadamente 40 segmentos VK funcionales (Scháble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Syeler 374:1001), 31 segmentos V¾. funcionales (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264:220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250), 5 segmentos JK funcionales (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:1516) y 4 segmentos J\ funcionales (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med. 172:609), dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica para la región de la cadena de polipéptidos que forma la primera y segunda asas de unión a antígeno del dominio VL (Ll y L2) , mientras que los segmentos VL y JL se combinan para formar la tercer asa de unión a antígeno del dominio VL (L3) . Los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario se cree que son suficientemente diversos como para unirse a casi todos los antígenos al menos con afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen in vivo mediante "maduración de afinidad" de los genes redispuestos , en los cuales se generan mutaciones por puntos y se seleccionan por el sistema inmunológico con base en la unión mejorada.

En un enfoque, un repertorio de dominios VH o VL, en un aspecto, dominios VH o VL humanos, es tamizado mediante, por ejemplo, despliegue de fagos, selección por afinidad contra el antígeno deseado. Los métodos para la construcción de bibliotecas de despliegue de bacteriófagos y bibliotecas de expresión de fagos lambda se conocen bien en la técnica, y se enseña, por ejemplo, por: McCafferty et al. (1990) Nature 348:552; Kang et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 88:4363; Clackson et al. (1991) Nature 352:624; Lowman t al. (1991) Biochemistry 30:10832; Burton et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 88:10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133; Chang et al. (1991) J. Immunol . 147:3610; Breitling et al. (1991) Gene 104:147; Marks et al. (1991) J". Mol. Biol. 222:581; Barbas et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:4457; Hawkins and Winter (1992) J". Immunol., 22:867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. , 267: 16007; y Lerner et al. (1992) Science, 258:1313. Las bibliotecas de despliegue de fagos Fab se enseñan, por ejemplo, por U.S. 5,922,545. Bibliotecas de fagos scFv se muestran, por ejemplo, por Huston et al. (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 87:1066-1070; McCafferty et al. (1990) citado arriba; Clackson et al. (1991) citado arriba; Marks et al. (1991) citado arriba; Chis ell et al. (1992) Trends Biotech. 10:80; y Marks et al. (1992) citado arriba. Varias modalidades de bibliotecas scFv desplegadas en proteínas de cápside de bacteriófagos han sido descritas. Refinaciones de los enfoques de despliegue de fagos también se conocen, por ejemplo como se describe en WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y O97/08320 8Morphosys, citado arriba) .

El repertorio de los dominios VH o VL puede ser un repertorio de origen natural de secuencias de inmunoglobulina o un repertorio sintético. Un repertorio de origen natural es uno que se prepara, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulina cosechadas de uno o más individuos. Estos repertorios pueden ser "naives" , es decir, preparados, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulina de fetos humanos o recién nacidos, o redisponerse , es decir, prepararse de, células B humanas adultas. Los repertorios naturales se describen, por ejemplo, por Marks et al. (1991) J. Mol. Biol . 222:581 y Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. 14:309. Si se desea, clones identificados a partir de un repertorio natural, o cualquier repertorio, para ese asunto, que se unan al antígeno objetivo son entonces sujetos a mutagénesis y tamizado adicional para de esta manera producir y seleccionar variantes con características de unión mejoradas .

Repertorios sintéticos de anticuerpos de dominio se preparan al introducir artificialmente diversidad en un dominio de clonado. Repertorios sintéticos se describen, por ejemplo, por Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J. 13:692; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245; DeKriuf et al. (1995) J. Mol. Biol. 248:97; y WO 99/20749.

En un aspecto, repertorios de dominio variable sintético se preparan en fondos VH o VK, con base en secuencias de VH o VK de línea germinal artificialmente diversificadas. Por ejemplo, el repertorio de dominio VH puede basarse en segmentos génicos VH de línea germinal clonados V3-23/DP47 (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776) y JH4b . El repertorio de dominio VK puede basarse, por ejemplo, en segmentos génicos VK de línea germinal 02/012/DPK9 (Cox et al. (1994) Eur. J. Immunol . 24:827) y J1. La diversidad se introduce en estos y otros segmentos génicos mediante, por ejemplo, mutagénesis por PCR. La diversidad puede introducirse aleatoriamente, por ejemplo, mediante PCR propensa a error (Hawkins, et al. (1992) J. Mol. Biol . 226: 889) o mutagénesis química. Sin embargo, como se describió arriba, en una modalidad la introducción de diversidad es dirigida a residuos particulares. En otra modalidad los residuos deseados son seleccionados mediante introducción del codón K usando cebadores mutagénicos (utilizando la nomenclatura de IUPAC, e donde N = G, A, T o C, y K = G o T) , que codifica para todos los aminoácidos y el codón de paro TAG. Otros codones que logran fines similares también son de utilidad, incluyendo el codón NNN (el cual lleva a la producción - de los codones de paro adicionales TGA y TAA) , codón DVT ( (A/G/T) (A/G/C) T) , codón DVC ( (A/G/T) (A/G/C) C) , y codón DVY ( (A/G/T) (A/G/C) (C/T) . El codón DVT codifica para 22% de serina y 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína, los cuales imitan más estrechamente la distribución de residuos de aminoácido para los sitios de unión a antígeno de anticuerpos humanos naturales. Los repertorios se hacen usando cebadores de PCR que tienen el codón o codones degenerados seleccionados en cada sitio que será diversificado. La mutagénesis por PCR se conoce bien en la técnica.

En un aspecto, la diversidad se introduce en la secuencia de segmentos génicos VH de línea germinal humana V3-23/DP47 (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol . 227:7768) y JH4b usando el codón NNK en los sitios H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a( H53, H55, H56 , H58, H95, H97 y H98, que corresponde a la diversidad en CDRs 1, 2 y 3, con la numeración como se usa en la patente de E.U.A. No. 6,696,245.

En otro aspecto, la diversidad se introduce también en la secuencia de segmentos génicos VH de línea germinal humana V3-23/DP47 y JH4b, por ejemplo, usando el codón NNK en los sitios H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, HlOOa y HlOOb, que corresponde a diversidad en CDRs 1, 2 y 3, con la numeración según se usa en la patente de E.U.A. No. 6,696,245.

En otro aspecto, se introduce diversidad en la secuencia de segmentos génicos VK de línea germinal humana 02/012/DPK9 y JKdl, por ejemplo, usando el codón NNK en los sitios L30, L31, L32, L34 , L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96, que corresponden a diversidad en CDRs 1, 2 y 3, con la numeración como la usada en la patente de E.U.A. No. 6,696,245.

Repertorios diversificados son clonados en vectores de despliegue de fagos como se conoce en la técnica y se describe, por ejemplo, en WO 99/20749. En general, las moléculas de ácido nucleico y construcciones de vectores requeridas para las composiciones y métodos mostrados en la presente están disponibles en la técnica y se construyen y manipulan como se muestra en manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, E.U.A. y ediciones subsecuentes.

La manipulación de ácidos nucleicos como la mostrada en la presente se lleva a cabo típicamente en vectores recombinantes . Según se usa en la presente, "vector" se refiere a un elemento discreto que se usa para introducir ADN heterólogo en células para la expresión y/o replicación de las mismas. Los métodos mediante los cuales se selecciona o construye y, posteriormente, se usen estos vectores se conocen bien por alguien de capacidad en la técnica. Numerosos vectores están disponibles públicamente, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episómicos. Estos vectores pueden usarse para clonación y mutagénesis simples; como alternativa, como es típico de vectores en los cuales los miembros de repertorios5 (o pre-repertorios) en la presente son portados, se emplea un vector de expresión génica. Un vector de uso mostrado en la presente se selecciona para recibir una secuencia de codificación de polipéptidos de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobases (kb) a 40 kb de largo. Una célula hospedera adecuada es transformada con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene varios componentes funcionales, los cuales generalmente incluyen un sitio de clonación (o "polienlazador" ) , un origen de replicación y al menos un gen marcador seleccionable . Si un vector dado es un vector de expresión, posee además uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, secuencias de terminación de transcripción y señal, cada una posicionada en las inmediaciones del sitio de clonación, de tal manera que se enlacen operativamente al gen que codifique para un miembro del repertorio de polipéptidos como el mostrado en la presente .

Los vectores tanto de clonación como de expresión contienen generalmente secuencias de ácido nucleico que hacen posible que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. Típicamente en vectores de clonación, esta secuencia es una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedero e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gran-negativas , el origen de plásmido de 2 mieras es adecuado para levadura y varios orígenes virales (por ejemplo, SV 40, adenovirus) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no se requiere para vectores de expresión de mamífero a menos que éstos se usen en células de mamífero capaces de replicarse a altos niveles de ADN, tales como células COS.

Adecuadamente, un vector de clonación o expresión contiene también un gen de selección conocido también como un marcador seleccionable . Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospederas transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contiene el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , deficiencias auxotróficas de complemento o suministro a nutrientes críticos no disponibles en los medios de crecimiento.

Debido a que la replicación de vectores en la presente es llevada a cabo muy convenientemente en E. coli, un marcador seleccionable de E. coli, por ejemplo, el gen de ß-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, es de utilidad. Estos se pueden obtener de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19. Sin embargo, otras combinaciones de microorganismos de plásmidos también se pueden sustituir razonablemente .

Los vectores de expresión contienen normalmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedero y es enlazado operablemente a la secuencia de codificación de interés. Este promotor puede ser inducible o constitutivo. El término "enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia de control "enlazada operablemente" a una secuencia de codificación es ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logre bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Los promotores adecuados para usarse con hospederos procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para usarse en sistemas bacterianos también contendrán generalmente una secuencia Shine-Dalgarno enlazada operablemente a la secuencia de codificación.

En bibliotecas o repertorios como los descritos en la presente, los vectores pueden ser vectores de expresión que hagan posible la expresión de una secuencia de nucleótidos que corresponda a un miembro de biblioteca de polipéptidos . Así, la selección se lleva a cabo mediante la propagación y expresión separadas de un solo clon que expresa el miembro de la biblioteca de polipéptidos o mediante el uso de cualquier sistema de despliegue de selección. Como se describió arriba, un sistema de despliegue de selección usa despliegue de bacteriófagos. De está manera, se pueden usar vectores de fagos o fagémidos. Los vectores pueden ser vectores fagémidos, los cuales tengan un origen de replicación de E. coli (para replicación de doble hebra) y también un origen de replicación de fagos (para la producción de ADN de una sola hebra) . La manipulación y expresión de estos vectores se conoce bien en la técnica (Hoogenboom y inter (1992) citado arriba, Nissim et al. (1994) citado arriba) . Brevemente, el vector contiene un gen marcador de ß-lactamasa u otro gen marcador seleccionable para conferir selectividad al fagémido, y un promotor lac hacia el extremo 5' de un cásete de expresión que consiste (N-terminal a C) de una secuencia líder pelB (la cual dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico) , un sitio de clonación múltiple (para la clonación de la versión de nucleótido del miembro de la biblioteca) , opcionalmente uno o más marcadores de péptidos (para detección) , opcionalmente uno o más codones de paro TAG y la proteína de fago pIII. En una modalidad, el vector codifica, en lugar de para la secuencia líder pelB, para una secuencia líder GAS1 eucariótica que sirve para dirigir la secreción del polipéptido de fusión al espacio periplásmico en E. coli o al medio en sistemas de células eucarióticas . Usando varias cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropiltio- -D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse cómo un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de biblioteca de polipéptidos únicamente, o producir fagos, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII sobre su superficie.

Un ejemplo de un vector es el vector fagémido pHENl (Hoogenboom et al. (1991) Nucí. Acids . Res. 19:4133-1437; la secuencia está disponible, por ejemplo, como SEQ ID ?0: 7 en WO 03/031611) , en el cual la producción de proteína de fusión pIII está bajo el control del promotor LacZ, el cual es inhibido en presencia de glucosa e inducido con IPTG. Cuando se cultiva en cepas supresoras de E. coli, por ejemplo, TG1, la proteína de fusión al gen III es producida y empacada en fago, en tanto que el crecimiento en cepas no supresoras, por ejemplo, HB2151, permite la secreción de proteína de fusión soluble en el periplasma bacteriano y dentro del medio de cultivo. Debido a que la expresión del gen III impide la infección posterior con fagos auxiliares, las bacterias que porten los vectores fagémidos son propagadas en presencia de glucosa antes de infección con el fago auxiliar de VCSM143 para rescate de fagos.

La construcción de vectores como la mostrada en la presente emplea técnicas de ligación convencionales. Vectores o fragmentos de ADN aislados son cortados, diseñados y religados en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, análisis de secuencia para confirmar que las secuencias correctas estén presentes en el vector construido se lleva a cabo usando métodos estándares. Los métodos adecuados para construir vectores de expresión, preparar transcritos in vitro, introducir ADN en células hospederas y llevar a cabo análisis para evaluar la expresión y función se conocen por aquellos expertos en la técnica. La presencia de una secuencia génica en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica mediante métodos convencionales, tales como análisis Southern o Northern, Western blotting, dot blotting de ADN o ARN o proteínas, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencia de moléculas de ácido nucleico o proteína. Los expertos en la técnica contemplarán fácilmente cómo estos métodos pueden ser modificados, si se desea. 3.3. Tamizado de anticuerpos de dominio para unión a antígenos Después de la expresión de un repertorio de anticuerpos de dominio sobre la superficie de fagos, se lleva a cabo selección al poner en contacto repertorio de fagos con antígeno objetivo inmovilizado, la banda para remover fago no unido y la propagación del fago unido, el proceso completo conocido frecuentemente como "selección por afinidad" . Este proceso es aplicable al tamizado de anticuerpos de dominio así como otros fragmentos de anticuerpo que pueden ser expresados sobre una biblioteca de fagos, por ejemplo, scFv, Fab, etc. Como alternativa, se pre-seleccionan fagos para la expresión de variantes de miembros adecuadamente doblados al seleccionar por afinidad contra un ligando genérico inmovilizado (por ejemplo, proteína A o proteína L) que sólo se une por miembros doblados. Esto tiene la ventaja de reducir la proporción de miembros no funcionales, incrementando de esta manera la proporción de miembros que sea probable que se unan a un antígeno objetivo. La preselección con ligandos genéricos es enseñada en WO 99/20749, por ejemplo. El tamizado de bibliotecas de anticuerpos de fagos se describe generalmente, por ejemplo, por Harrison et al. (1996) Meth. Enzymol . 267:83-109.

El tamizado se lleva a cabo comúnmente usando antígeno purificado inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo, tubos de plástico o pocilios, o sobre una matriz de cromatografía, por ejemplo, Sepharose™ (Pharmacia) . El tamizado o selección también se pueden llevar a cabo en antígenos complejos, tales como la superficie de células (Marks et al. (1993) BioTechnology 11:1145; de Kruif et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 92:3939) . Otra alternativa incluye la selección al unir antígeno biotinilado en solución, seguida por la captura en esferas recubiertas con estreptavidina .

En un aspecto, la selección por afinidad se lleva a cabo al inmovilizar antígeno (genérico o específico) sobre tubos o pocilios en una placa, por ejemplo, tiras de 8 pocilios de inmunotubos Nunc MAXISORP™. Los pocilios son recubiertos con 150 µ? de antígeno (100 ug/ml en PBS) e incubados durante la noche. Los pocilios se lavan después 3 veces con PBS y se bloquean con 400 µ? de PBS-2% de leche descremada (2% de MPBS) a 37°C durante 2 horas. Los pocilios se enjuagan 3 veces con PBS y fago se añade en 2% de MPBS. La mezcla se incuba á temperatura ambiente durante 90 minutos y el líquido, que contiene fago no unido, es removido. Los pocilios se enjuagan 10 veces con PBS-0.1% de Tween 20, y luego 10 veces con PBS para remover detergente. Los fagos unidos son eluir al añadir 200 µ? de 100 mM de trietilamina recién preparada, mezclando bien e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los fagos eluidos son transferidos a un tubo que contiene 100 µ? de Tris-HCl 1M, pH 7.4 y se vortexean para neutralizar la trietilamina. Células hospederas de E. coli de crecimiento exponencial (por ejemplo, TG1) son infectadas con, por ejemplo, 150 mi del fago eluido al incubar durante 30 minutos a 37 °C. Las células infectadas son centrifugadas, resuspendidas en medio fresco y sembradas en agarosa superior. Las placas de fagos son eluidas o recogidas en cultivos frescos de células hospederas para propagarse para el análisis o para rondas de selección adicionales. Una o más rondas de purificación de placas se llevan a cabo si es necesario para asegurar poblaciones puras de fagos seleccionados. Otros enfoques de tamizado se describen por Harrison et al. (1996) citado arriba.

Después de la identificación de fagos que expresan un anticuerpo de dominio que se une a un objetivo deseado, si un vector fagémido tal como pHENl ha sido usado, las proteínas de fusión a dominio variable se producen fácilmente en forma soluble al infectar cepas no supresoras de bacterias, por ejemplo, HB2151 que permita la secreción de proteína de fusión a gen III soluble. Si un péptido de señal de secreción GAS1 es codificado por el vector, el polipéptido de fusión puede ser secretado por células eucarióticas (por ejemplo, levadura o mamífero) o procarióticas (por ejemplo, E. coli) . Como alternativa, la secuencia de dominio V puede ser sub-clonada en un vector de expresión adecuado para producir proteína soluble de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. 3.4. Purificación y concentración de anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio secretados en el espacio periplásmico o en el medio de bacterias son cosechados y purificados de acuerdo con métodos conocidos (Harrison et al. (1996) citado arriba) . Skerra & Pluckthun (1988) Science 240:1038 y Breitling et al. (1991) Gene 104:147 describen la cosecha de anticuerpos de dominio a partir del periplasma, y Better et al. (1988) Science 240:1041 describen la cosecha del sobrenadante de cultivo. Para algunos anticuerpos de dominio, la purificación también se puede lograr al unirse a ligandos genéricos, tales como proteína A o proteína L.' Como alternativa, los dominios variables pueden ser expresados con un marcador péptido, por ejemplo, los marcadores Myc, HA o 6X-His (SEQ ID NO:644), los cuales facilitan la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Si es necesario, los anticuerpos de dominio se concentran mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ultrafiltración, diafiltración y filtración de flujo tangencial. El proceso de ultrafiltración usa membranas semipermeables y presión para separar especies moleculares con base en tamaño y forma. La presión es provista por presión de gas o por centrifugación. Los productos de ultrafiltración comerciales están ampliamente disponibles, por ejemplo, de Millipore (Bedford, MA; ejemplos incluyen los concentradores Centricon™ y Microcon™) y Vivascience (Hannover, Alemania; ejemplos incluyen los concentradores Vivaspin™) . Mediante selección de un límite de peso molecular más pequeño que el del polipéptido objetivo (normalmente 1/3 a 1/6 del peso molecular del polipéptido objetivo, aunque diferencias tan pequeñas como de 10 kD pueden usarse exitosamente) , el polipéptido es retenido cuando solvente y solutos pequeños pasan a través de la membrana. De esta manera, un límite de peso molecular de aproximadamente 5 kD es útil para la concentración de anticuerpos de dominio descritos en la presente.

La diafiltración, la cual utiliza membranas de ultrafiltración con un proceso de "lavado", se usa cuando se desee remover o intercambiar la sal o regulador de pH en una preparación de polipéptidos . El polipéptido es concentrado mediante el pasaje de solvente y solutos pequeños a través de la membrana, y las sales o regulador de pH restantes son retiradas mediante dilución del polipéptido retenido con un nuevo regulador de pH o solución salina o agua, según se desee, acompañados por ultrafiltración continua. En la diafiltración continua, regulador de pH nuevo se añade a la misma velocidad que el filtrado pasa a través de la mem rana. Un volumen de diafiltración es el volumen de la solución de polipéptidos antes del inicio de la diafiltración - usando diafiltración continua, mayor que 99.5% de un soluto completamente permeable puede removerse al lavar a través de 6 volúmenes de diafiltración con el regulador de pH nuevo.

Como alternativa, el proceso puede llevarse a cabo de una manera discontinua, en donde la muestra sea diluida repetidamente y luego filtrada de nuevo a su volumen original para remover o intercambiar sal o regulador de pH y finalmente concentrar el polipéptido. El equipo para diafiltración y metodologías detalladas para su uso están disponibles, por ejemplo, de Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) y Sartorius AG/Vivascience (Hannover, Alemania) .

La filtración de flujo tangencial (TFF) , conocida también como "filtración de flujo cruzado", usa también una membrana de ultrafiltración . Fluido que contiene el polipéptido objetivo es bombeado tangencialmente a lo largo de la superficie de la membrana. La presión causa que una porción del fluido pase a través de la membrana mientras el polipéptido objetivo es retenido sobre el filtro. En contraste con otra filtración estándar, sin embargo, las moléculas retenidas no se acumulan en la superficie de la membrana, sino que son llevadas a lo largo por el flujo tangencial. La solución que no pasa a través del filtro (que contiene el polipéptido objetivo) puede hacerse circular repetidamente a través de la membrana para lograr el grado de concentración deseado. El equipo para TFF y metodologías detalladas para su uso está disponible, por ejemplo, de Millipore (por ejemplo, el sistema ProFlux M12™ Benchtop TFF y los sistemas Pellicon™) , Pall Life Sciences (por ejemplo, el sistema de filtración de flujo tangencial Minim™) .

La concentración de proteínas se mide en un número de maneras que se conocen bien en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, análisis de aminoácidos, absorbancia a 280 nm, los métodos de "Bradford" y "Lowry" y SDS-PAGE. El método más preciso es hidrólisis total seguido por análisis de aminoácidos mediante HPLC, la concentración se determina después y luego la comparación con la secuencia conocida del dominio de anticuerpo. Aunque este método es el más preciso, es costoso y consume tiempo. La determinación de proteínas mediante la medición de la absorbancia UV a 280 nm es más rápida y mucho menos costosa, no obstante relativamente precisa y es un compromiso sobre el análisis de aminoácidos. La absorbancia a 280 nm se usó para determinar concentraciones de proteína reportadas en los ejemplos descritos en la presente.

Los ensayos de proteínas de "Bradford" y "Lowry" (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254; Lowry et al. (1951) J". Biol. Chem. 193:265-275) comparan la concentración de proteínas de muestra con una curva estándar muy comúnmente a base de albúmina sérica bovina (BSA) . Estos métodos son menos precisos, tendiendo a subestimar la concentración de anticuerpos de dominio. Su precisión podría mejorarse, sin embargo, usando un solo polipéptido de dominio VH o VK como un estándar.

Un método de ensayo de proteína adicional que puede utilizarse es el ensayo de ácido bicinchonínico descrito en la patente de E.U.A. No. 4,839,295 (incorporada en la presente a manera de referencia) y comercializado por Pierce Biotechnology (Rockford, IL) como el "Ensayo d Proteína BCA" (por ejemplo, Pierce No. de catálogo 23227) .

El método SDS-PAGE usa electroforesis en gel y tinción con azul Coomassie en comparación con los estándares de concentración conocidos, por ejemplo, cantidades conocidas de un anticuerpo de dominio. La cuantificación se puede hacer visualmente o por densitometría.

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente conservan solubilidad a alta concentración (por ejemplo, al menos 4.8 mg (-400 uM) en solución acuosa (por ejemplo, PBS) , y en un aspecto, al menos aproximadamente 5 mg/ml (-417 µ?) , 10 mg/ml (-833 µ?) , 20 mg/ml (-1.7 mM) , 25 mg/ml (-2.1 mM) , 30 mg/ml (-2.5 mM) , 35 mg/ml (-2.9 mM) , 40 mg/ml (-3.3 mM) , 45 mg/ml (-3.75 mM) , 50 mg/ml (-4.2 mM) , 55 mg/ml (-4.6 mM) , 60 mg/ml (-5.0 mM) , 65 mg/ml (-5.4 mM) , 70 mg/ml (-5.8 mM) , 75 mg/ml (-6.3 mM) , 100 mg/ml (-8.33 mM) , 150 mg/ml (-12.5 mM) , 200 mg/ml (-16.7 mM) , 240 mg/ml (-20 mM) o más). Una característica estructural que promueve alta solubilidad es el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos de dominio. Un anticuerpo de cuatro cadenas convencional de longitud completa, por ejemplo, IgG tiene un tamaño de aproximadamente 150 kD. En contraste, anticuerpos de dominio, los cuales tinen una estructura general que comprende cuatro regiones estructurales (F ) y 3 CDRs, tienen un tamaño de aproximadamente 12 kD, o menos de 1/10 del tamaño de un anticuerpo convencional. En forma similar, los anticuerpos de dominio son aproximadamente la mitad del tamaño de una molécula scFv (-26 kD) , y aproximadamente un quinto del tamaño de una molécula Fab (-60 kD) . El tamaño de una estructura que contiene anticuerpos de dominio descrito en la presente pueden ser de 100 kD o menos, incluyendo estructuras de, por ejemplo, aproximadamente 90 kD o menos, 80 kD o menos, 70 kD o menos, 60 kD o menos, 50 kD o menos, 40 kD o menos, 30 kD o menos, 20 kD o menos, hasta e incluyendo alrededor de 12 kD, o un anticuerpo de dominio en aislamiento.

La solubilidad de un anticuerpo de dominio se determina principalmente por las interacciones de las cadenas laterales de aminoácidos con el solvente circundante. Las cadenas laterales hidrófobas tienden a ubicarse internamente como un doblez de polipéptidos , lejos de las superficies de interacción con solvente del polipéptido. De manera inversa, los residuos hidrófilos tienden a ser ubicados en las superficies de interacción con solventes de un polipéptido. Generalmente, polipéptidos que tienen una secuencia primaria que permite que la molécula se doble para exponer residuos más hidrófilos al ambiente acuoso son más solubles que uno que se dobla para exponer menos residuos hidrófilos a la superficie. De esta manera, la disposición y número de residuos hidrófilos e hidrófobos es un determinante de solubilidad importante. Otros parámetros que determinan la solubilidad de un polipéptido incluyen pH de solvente, temperatura y potencia iónica. En una práctica común, la solubilidad de polipéptidos puede mantenerse o incrementarse mediante la adición de glicerol (por ejemplo, ~ 10% v/v) a la solución.

Como se describió arriba, residuos de aminoácido específicos han sido identificados en residuos conservados de dominios VH humanos que varían en los dominios VH de especies de camélidos, los cuales son generalmente más solubles que los dominios VH humanos. Estos incluyen, por ejemplo, Gly 44 (Glu en camélidos) , Leu 45 (Arg en camélidos) y Trp 47 (Gly en camélidos) . El residuo de aminoácidos 103 de VH también está implicado en solubilidad, con mutación de Trp a Arg tendiendo a conferir solubilidad de VH incrementada.

En algunos aspectos como los mostrados en la presente, los anticuerpos de dominio se basan en el segmento génico VH de línea germinal DP47 o el segmento génico VK de línea germinal DPK9. De esta manera, estos segmentos génicos de línea germinal son capaces, particularmente cuando son diversificados en ubicaciones estructurales seleccionadas descritas en' la presente, reproducir anticuerpos de dominio de unión específica que son altamente solubles. En particular, las cuatro regiones estructurales, las cuales son, en un aspecto, no diversificadas, pueden contribuir a la alta solubilidad de las proteínas resultantes.

Se espera que un anticuerpo de dominio que comparta una identidad de secuencia porcentual con uno que tenga una alta solubilidad también tenderá a ser altamente soluble. Así, como un medio de prevención o reconocimiento de que un determinado anticuerpo de dominio tendría la alta solubilidad descrita en la presente, puede compararse en la secuencia de un anticuerpo de dominio con uno o más anticuerpos de dominio que tengan solubilidad conocida. De esta manera, cuando se identifique un anticuerpo de dominio que tenga una alta afinidad de unión pero solubilidad desconocida, la comparación de su secuencia de aminoácidos con aquella de uno o más (en un aspecto más) anticuerpos de dominio que se sepa tengan alta solubilidad (por ejemplo, una secuencia de dAb descrita en la presente) puede permitir la predicción de su solubilidad. Que esto no es un predictor absoluto, cuando existe un alto grado de similitud con una secuencia altamente soluble conocida, por ejemplo, 90-95% o mayor similitud, y particularmente cuando hay un alto grado de similitud con respecto a residuos de aminoácido hidrófilos, o residuos que sea probable que sean expuestos en la interfaz del solvente, es más probable que un polipéptido de unión recién identificado tenga solubilidad similar a aquella de la secuencia altamente soluble conocida.

Software de modelado molecular también se puede usar para predecir la solubilidad de una secuencia de polipéptidos en relación con aquella de un polipéptido de solubilidad conocida. Por ejemplo, la sustitución o adición de un residuo hidrófobo en la superficie expuesta a solvente, en relación a una molécula de solubilidad conocida que tenga un residuo menos hidrófobo o incluso hidrófilo expuesto en esa posición se espera que reduzca la solubilidad relativa del polipéptido. De manera similar, la sustitución o adición de un residuo más hidrófilo en esta ubicación se espera que incremente la solubilidad relativa. Es decir, un cambio en el número neto de residuos hidrófilos o hidrófobos ubicados en la superficie de la molécula (o la naturaleza hidrófoba o hidrófila total de los residuos expuestos en superficie) en relación a una estructura de anticuerpo de dominio con solubilidad conocida puede predecir la solubilidad relativa de un anticuerpo de dominio.

Como alternativa, o en conjunto con esta predicción, se pueden determinar los límites de la solubilidad de un anticuerpo de dominio simplemente al concentrar el polipéptido. 3.5. Determinación de la afinidad Los polipéptidos que contienen anticuerpos de dominio aislados como los descritos en la presente, en un aspecto, tienen afinidades (constante de disociación, K¿ = Koff/Kon) de al menos aproximadamente 500 nM o menos, y en un aspecto, al menos aproximadamente 400 nM-50 pM, 300 nM-50 pM, 200 nM-50 pM, y en un aspecto más, al menos 100 nM-50 pM, 75 nM-50 pM, 50 nM-50 pM, 25 nM-50 pM, 10 nM-50 pM, 5 nM-50 pM, 1 nM-50 pM, 950 pM-50 pM, 900 pM-50 pM, 850 pM-50 pM, 800 pM-50 pM, 750 pM-50 pM, 700 pM-50 pM, 650 pM-50 pM, 600 pM-50 pM, 550 pM-50 pM, 500 pM-50 pM, 450 pM-50 pM, 400 pM-50 pM, 350 pM-50 pM, 300 pM-50 pM, 250 pM-50 pM, 200 pM-50 pM, 150 pM-50 pM, 100 pM-50 pM, 90 pM-50 pM, 80 pM-50 pM, 70 pM-50 pM, 60 pM-50 pM, o incluso tan bajo como 50 pM.

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD80 con una IC50 en la escala de 1 pM a 1.5 µ?, inclusive; la IC50 para la inhibición de la unión de CD28 a CD80. La IC50 puede estar en la escala de 1 pM a 1 µ?, 1 pM a 900 nM, 1 pM a 800 nM, 1 pM a 700 nM, 1 pM a 600 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 400 nM, 1 pM a 300 nM, 1 pM a 200 nM, 1 pM a 100 nM, 1 pM a 50 nM, 1 pM a 10 nM, 1 pM a 1 nM, 1 pM a 500 pM, 1 pM a 100 pM, 1 pM a 50 pM, 1 pM a 10 pM, o 1 pM a 5 pM. Escalas aceptables adicionales incluyen, por ejemplo, 50 pM a 1 µ?, 100 pM a 500 nM; 125 pM a 250 nM, 150 pM a 200 nM, 150 pM a 100 nM y 200 pM a 50 nM .

En otra modalidad, el anticuerpo de dominio inhibe la unión de CD28 a CD86 con una IC50 en la escala de 1 pM a 1.5 µ?, inclusive; IC50 para inhibición de la unión de CD28 a CD86. La IC50 puede estar en la escala de 1 pM a 1 µ?, 1 pM a 900 nM, 1 pM a 800 nM, 1 pM a 700 nM, 1 pM a 600 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 400 nM, 1 pM a 300 nM, 1 pM a 200 nM, 1 pM a 100 nM, 1 pM a 50 nM, 1 pM a 10 nM, 1 pM a 1 nM, 1 pM a 500 pM, 1 pM a 100 pM, 1 pM a 50 pM, 1 pM a 10 pM, o 1 pM a 5 pM . Escalas aceptables adicionales incluyen, por ejemplo, 50 pM a 1 µ?, 100 pM a 500 nM; 125 pM a 250 nM, 150 pM a 200 nM, 150 pM a 100 nM y 200 pM a 50 nM.

La afinidad de unión a antígeno de un anticuerpo de dominio puede medirse convenientemente mediante Resonancia de un Plasmón en Superficie (SPR) usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.). En este método, el antígeno es acoplado al chip BIAcore en concentraciones conocidas, y los polipéptidos de dominio variables son introducidos. La unión específica entre el polipéptido de dominio variable y el antígeno inmovilizado se traduce en una concentración de proteínas incrementada en la matriz del chip y en un cambio en la señal de SPR. Los cambios en la señal de SPR son registrados como unidades de resonancia (RU) y presentados visualmente con respecto al tiempo a lo largo del eje Y de un sensorgrama. La señal de línea de base se toma con solvente únicamente (por ejemplo, PBS) pasando sobre el chip. La diferencia neta entre la señal de línea de base y la señal después de la conclusión de la inyección del anticuerpo de dominio representa el valor de unión de una muestra dada. Para determinar las constantes de velocidad inactiva (Koff) , velocidad activa (Kon) y disociación (¾) , se usa software de evaluación de cinética BIAcore (por ejemplo, versión 2.1).

Así, SPR se puede usar para monitorear el antagonismo de la unión de CD28 a CD80 o CD86 por una preparación de anticuerpos de dominio al medir el desplazamiento o inhibición de unión de CD28 a CD80 o CD86 causado por la preparación de anticuerpo monovalente. SPR también se puede usar para monitorear la dimerización, o en un aspecto, la falta de dimerización, que ocurre por medio de la región Fe en preparaciones de anticuerpo como las descritas en la presente.

Alta afinidad depende de la complementariedad entre una superficie del antígeno y las CDRs del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La complementariedad se determina por el tipo y fuerza de las interacciones moleculares posibles entre porciones del objetivo y la CDR, por ejemplo, las interacciones iónicas potenciales, atracciones de van der aals, enlace a hidrógeno u otras interacciones que puedan ocurrir. CDR3 tiende a contribuir más a las interacciones de unión a antígeno que CDRs 1 y 2, probablemente debido a su tamaño generalmente más grande, que proporciona más oportunidad para interacciones en superficie favorables. (Véase, por ejemplo, Padlan et al. (1994) Mol. Immunol . 31:169-217; Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol . 196:904-917; y Chothia et al. (1985) J. Mol. Biol. 186:651-663). Alta afinidad indica pares de anticuerpo de dominio/antígeno que tienen un alto grado de complementariedad, el cual está directamente relacionado con las estructuras del dominio variable y el objetivo.

En un aspecto, un anticuerpo de dominio es enlazado a otro anticuerpo de dominio para formar un heterodímero en el cual cada anticuerpo de dominio individual sea capaz de unirse a un antígeno cognado diferente. Fusionar anticuerpos de dominio como heterodímeros en donde cada monómero se une a un antígeno objetivo diferente, puede producir un ligando específico doble capaz, por ejemplo, de puentear los antígenos objetivos respectivos. Estos ligandos específicos dobles pueden usarse para dirigirse a citocinas y otras moléculas que cooperen sinérgicamente en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. Así, se proporciona un método para establecer sinergia en la actividad de dos o más citocinas, que comprende administrar un heterodímero de anticuerpo específico doble capaz de unirse a las dos o más citocinas.

Los anticuerpos de dominio mostrados en la presente incluyen clones de anticuerpos de dominio de unión a CD28, y clones con similitud de secuencia sustancial o identidad porcentual a ellos que también se unen al antígeno objetivo con alta afinidad. Según se usa en la presente, similitud de secuencia "sustancial" o identidad es una similitud o identidad de al menos 70%.

Una medida adicional de identidad o similitud es la capacidad de hibridar bajo condiciones de hibridación altamente severas. Así, una primera secuencia que codifique para un anticuerpo de dominio es sustancialmente similar a una segunda secuencia si la primera secuencia híbrida a la segunda secuencia (o su complemento) bajo condiciones de hibridación altamente severas (tales como aquellas descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratoy press, Nueva York) . "Condiciones de hibridación altamente severas" se refieren a hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguidas por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% de SDS a 65°C. Las "condiciones de hibridación muy altamente severas" se refieren a hibridación en fosfato de sodio 0.5M, 7% de SDS a 65°C, seguidas por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1% de SDS a 65°C.

En una modalidad, los anticuerpos de dominio incluyen : lh-239-850 (SEQ ID N0:58) lh-35 (SEQ ID NO:59) lh- 36 (SEQ ID NO :60) lh- 79 (SEQ ID NO :61) lh- 80 (SEQ ID NO :62) lh- 83 (SEQ ID NO :63) lh- 108 (SEQ ID NO.-64) lh- 203 (SEQ ID NO:65) lh- 207 (SEQ ID NO:66) lh- 238 (SEQ ID NO:67) lh- 239 (SEQ ID NO:68) lh- 18- 1 (SEQ ID NO : 69 ) lh- 18- 2 (SEQ ID NO:70) lh- 18- 3 (SEQ ID NO: 71) lh- 18-4 (SEQ ID NO: 72) lh- 18- 5 (SEQ ID NO: 73) lh- 18- 6 (SEQ ID NO:74) lh- 28- 1 (SEQ ID NO:75) lh- 28- 2 (SEQ ID NO: 76) lh- 31 (SEQ ID NO :77) lh- 32 (SEQ ID NO : 78) lh- 33 (SEQ ID NO :79) lh- 34 (SEQ ID NO : 80) lh- 35 (SEQ ID NO : 81) lh- 35- 15 (SEQ ID NO:82) lh-¦35- 2 (SEQ ID NO:83) lh-¦35- 5 (SEQ ID NO:84) lh-35-7 (SEQ ID NO:85) lh-35-9 (SEQ ID NO:86) lh-36 (SEQ ID NO:87) lh-36-1 (SEQ ID NO:88) lh-36-2 (SEQ ID NO:89) lh-36-3 (SEQ ID NO:90) lh-36-4 (SEQ ID NO:91) lh-36-5 (SEQ ID NO:92) lh-36-6 (SEQ ID NO:93) lh-36-7 (SEQ ID NO:94) lh-38 (SEQ ID NO:95) lh-39 (SEQ ID NO:96) lh-69 (SEQ ID 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Ensayos para actividades de CD28 En una modalidad ejemplar, un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente se une a CD28 pero no agoniza sustancialmente la señalización de CD28. La activación de la vía de CD28 manifiesta un número de resultados diferentes que pueden medirse para evaluar de esta manera el efecto de un anticuerpo de dominio dado en la actividad de la vía. Sin embargo, para la evaluación de la función antagonista o agonista de anticuerpos de dominio descritos en la presente, puede usarse al menos uno de los siguientes ensayos de CD28.

En una modalidad, la activación de células T es medida. En el ensayo, células T CD3 positivas humanas son estimuladas con anti-CD3 más células transfectadas con CHO que expresan ya sea CD80 o CD86. Esto se traduce en la proliferación de las células T y depende de CD28 toda vez que los anticuerpos de dominio bloquean la respuesta de proliferación.

En otra modalidad, la inducción de la proliferación de células T y la inducción de secreción de citocinas es medida. El ensayo comprende la estimulación de células T CD3 positivas humanas con mAb anti-CD28 9.3 (Gibson, et al. (1996) J. Biol. Chem. , 271 : 7079j -7083 ) . Esto se traduce en la sobre -regulación de una señalización mediada por receptor de células T y la secreción de citocinas y es dependiente de CD28, toda vez que el mAb 9.3 bloquea la respuesta de proliferación. Las citocinas secretadas que pueden ser medidas incluyen, pero no están limitadas a, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IL-24, TGFP , TNF-OC, TNF-ß, IFN-Ot, IFN-ß, IFN-?. Una o más de estas citocinas pueden detectarse y/o medirse de acuerdo con la descripción mostrada en la presente.

Como se muestra en cualquier lado en la presente, un ensayo para actividad de CD28 también puede incluir la evaluación de la actividad de CTLA4. En particular, un anticuerpo de dominio de acuerdo con la presente invención no inhibe la inhibición mediada por CTLA-4 de la función de células T, incluyendo la inhibición de la señalización mediada por receptor de células T, inhibición de proliferación de células T e inhibición de secreción de citocinas .

Se entenderá, con base en la presente descripción, que anticuerpos de dominio mostrados en la presente pueden poseer varias funciones y actividades, y por lo tanto, pueden ser ensayados mediante múltiples ensayos distintos. Como se muestra en detalle en cualquier lado en la presente, anticuerpos de dominio que tienen varias características de definición (por ejemplo, afinidad de unión a CD28, identidad de dominio CDR y secuencia de aminoácidos, entre otros) , y por lo tanto, cada anticuerpo de dominio distinto puede ser caracterizado en múltiples formas y a través de múltiples parámetros. La caracterización de cada uno de estos anticuerpos de dominio, solos o en conjunto con la actividad y/o propiedades de unión a CD28 del anticuerpo de dominio, puede por lo tanto proporcionar características de identificación únicas para el anticuerpo de dominio. 5. PEGilación de anticuerpos de dominio Se proporcionan también en la presente anticuerpos de dominio PEGiládos que tienen vida media incrementada y en un aspecto, también resistencia a degradación sin una pérdida de actividad (por ejemplo, afinidad de unión) en relación a anticuerpos de dominio no PEGiládos.

La PEGilación tanto específica de sitio como aleatoria de moléculas de proteína se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Zalipsky y Lee, Poly (ethylene glicol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) pp. 347-370, Plenum, NY; Goodson y Katre (1990) Bio/Technology, 8:343; Hersfield et al. (1991) PNAS 88:7185). Más específicamente, la PEGilación aleatoria de moléculas de anticuerpo ha sido descrita en residuos de lisina y derivados tiolados (Ling and Mattiasson (1983) Immunol . Methods 59:327; Wilkinson et al. (1987) Immunol. Letters, 15:17; Kitamura et al. (1991) Cáncer Res. 51:4310; Delgado et al. (1996) Br. J. Cáncer., 73: 175; Pedley et al. (1994) Br. J. Cáncer. 70 : 1126) .

En consecuencia, los anticuerpos de dominio de acuerdo con este aspecto pueden ser acoplados, usando métodos conocidos en la técnica a moléculas de polímero (en un aspecto, PEG) útiles para lograr la vida media incrementada y propiedades de resistencia a degradación abarcadas en la presente. Las porciones de polímero que pueden ser utilizadas pueden ser sintéticas o de origen natural e incluyen, pero no están limitadas a polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada, o polisacárido ramificado o no ramificado tal como un homo- o heteropolisacárido . Ejemplos de polímeros sintéticos que pueden usarse incluyen poli (etilenglicol) (PEG), poli (propilen glicol) o alcohol poli (vinílico) de cadena recta o ramificada y derivados o formas sustituidas de los mismos. Los polímeros sustituidos útiles " incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi (polietilenglicol) . Las porciones de polímero de origen natural que pueden usarse en la presente además de o en lugar de PEG incluyen lactosa, amilosa, dextrano o glicógeno, así como derivados de los mismos que serían reconocidos por alguien de capacidad en la técnica. Las formas derivadas de moléculas poliméricas como las mostradas en la presente incluyen, por ejemplo, derivados que tienen porciones adicionales o grupos reactivos presentes en las mismas para permitir interacción con residuos de aminoácido de los anticuerpos de dominio descritos en la presente. Estos derivados incluyen ésteres activos de N-hidroxisuccinimida (NHS) , polímeros de propionato de succinimidilo y agentes reactivos y selectivos con sulfhidrilo tales como maleimida, vinil sulfona y tol . Los polímeros derivados incluyen, pero no están limitados a polímeros de PEG que tienen las fórmulas: PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS; PEG-0-CH2-NHS; PEG-0-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS ; PEG-02CNH-CH(R) -C02-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS ; y PEG-0-CH2-C02-NHS; en donde R es (CH2) 4NHC02 (mPEG) . Los polímeros de PEG útiles como los mostrados en la presente pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificados en donde varias porciones de PEG estén presentes en un solo polímero. Los derivados de PEG útiles incluyen, pero no están limitados a, mPEG-MAL, mPEG2 -MAL, mPEG- (MAL) , PEG de varios brazos, mPEG-SPA, mPEG2 -NHS y mPEG2 - (MAL) 2 , ilustrados a continuación: / El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS, SPA, VS, o tiol) puede ser unido directamente al polímero de PEG o puede ser fijado al PEG mediante una molécula enlazadora.

El tamaño de polímeros útiles como los mostrados en la presente pueden ser en la escala de entre aproximadamente 500 Da a 60 kD, por ejemplo, entre aproximadamente 1,000 Da y 60 kD, 10 kD y 60 kD, 20 kD y 60 kD, 30 kD y 60 kD, 40 kD y 60 kD, y hasta entre 50 kD y 60 kD. Los polímeros usados en la presente, particularmente PEG, pueden ser polímeros de cadena recta o pueden poseer una conformación ramificada. Dependiendo de la combinación de peso molecular y conformación, las moléculas de polímero útiles como las mostradas en la presente, cuando son fijadas a un anticuerpo de dominio, producirán una molécula que tenga un tamaño hidrodinámico promedio de entre aproximadamente 24 y 500 kD. El tamaño hidrodinámico de una molécula de polímero usada en la presente se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) con base en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento de una proteína a través de solución puede procesarse para derivar un tamaño aparente de la proteína, en donde el tamaño se ve por el radio Stokes o radio hidrodinámico de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de masa como de forma (conformación) , de tal manera que dos proteínas que tengan la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos con base en la conformación total de la proteína. El tamaño hidrodinámico de un anticuerpo de dominio enlazado a PEG, por ejemplo, un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente, puede estar en la escala de aproximadamente 24 kD a 500 kD; 30 a 500 kD; 40 a 500 kD; 50 a 500 kD; 100 a 500 kD; 150 a 500 kD; 200 a 500 kD; 250 a 500 kD; 300 a 500 kD; 350 a 500 kD; 400 a 500 kD, y 450 a 500 kD . En una modalidad ejemplar, el tamaño hidrodinámico de un anticuerpo de dominio PEGilado como el descrito en la presente es de aproximadamente 30 a 40 kD, 70 a 80 kD o 200 a 300 kD. El tamaño de una molécula de polímero unida a un anticuerpo de dominio puede entonces ser variado dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, cuando el anticuerpo de dominio PEGilado se diseña para dejar la circulación y entrar en tejidos periféricos, es deseable mantener el tamaño del polímero anexado bajo para facilitar la extravasación del torrente sanguíneo. Como alternativa, cuando se desee que el anticuerpo de dominio PEGilado permanezca en la circulación durante un periodo de tiempo más largo, puede usarse un polímero de peso molecular más alto (por ejemplo, un polímero de 30 a 60 kD) .

Las moléculas de polímero (PEG) útiles como las mostradas en la presente pueden ser fijadas a anticuerpos de dominio usando métodos que se conozcan bien en la técnica. La primera etapa en la fijación de PEG u otras porciones de polímero a un anticuerpo de dominio es la sustitución de los grupos extremos hidroxilo del polímero de PEG por grupos funcionales que contengan electrófilos . Particularmente, polímeros de PEG son unidos a residuos ya sea de cisteína o lisina presentes en el anticuerpo de dominio. Los residuos de cisteína y lisina pueden ser de origen natural, o pueden ser manipulados en la molécula de anticuerpo de dominio. Por ejemplo, residuos de cisteína pueden manipularse recombinantemente en el C-terminal de los anticuerpos de dominio, o residuos en ubicaciones accesibles a solvente específicas en el anticuerpo de dominio pueden ser sustituidos con cisteína o lisina. En una modalidad, una porción de PEG es fijada a un residuo de cisteína que está presente en la región de pivote en el C-terminal de un anticuerpo de dominio.

En otra modalidad una porción de PEG u otro polímero se fija a un residuo de cisteína o lisina que es ya sea de origen natural o es manipulado en el N-terminal de un anticuerpo de dominio como el mostrado en la presente. En otra modalidad más, una porción de PEG u otro polímero es fijada a otro anticuerpo de dominio como el mostrado en la presente en un residuo de cisteína o lisina (ya sea de origen natural o manipulado) que está al menos dos residuos lejos (por ejemplo, interno a) del C y/o N-terminal del anticuerpo de dominio.

En una modalidad, los polímeros de PEG son fijados a uno o más residuos de cisteína o lisina presentes en una región estructural (F s) y una o más CDRs heterólogas de un anticuerpo de dominio. CDRs y regiones estructurales (por ejemplo, CDR1, CDR3 y FW1-FW4) son aquellas regiones de anticuerpos de dominio como las definidas en la base de datos abat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.) . En una modalidad, un polímero de PEG es enlazado a un residuo de cisteína o lisina en el segmento estructural de VH DP47, o el segmento estructural de VK DPK9. Los residuos de cisteína y/o lisina de DP47 que pueden ser enlazados a PEG descritos en la presente incluyen la cisteína en las posiciones 22, o 96 y la lisina en las posiciones 43, 65, 76 ó 98 de SEQ ID NO: 641. Residuos de cisteína y/o lisina de DPK9 que pueden ser enlazados a PEG descritos en la presente incluyen los residuos de cisteína en las posiciones 23 u 88 y los residuos de lisina en las posiciones 39, 42, 45, 103 ó 107 de SEQ ID NO: 643. (La secuencia DPK9 de SEQ ID NO: 643 tiene 95 aminoácidos de largo; sin embargo, se entiende en la técnica que el residuo 103 y 107 son provistos por la secuencia codificada por el segmento génico J, cuando se fusiona a la secuencia de DPK9) . Además, residuos de cisteína o lisina específicos pueden ser enlazados a PEG en la región estructural canónica VH DP38, o DP45.

Además, sitios accesibles a solvente específicos en el anticuerpo de dominio que no sean residuos de cisteína o lisina de origen natural pueden ser mutados a una cisteína o lisina para la fijación o anexado de un polímero de PEG. Los residuos accesibles por solvente en cualquier anticuerpo de dominio dado pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica tales como análisis de la estructura cristalina del anticuerpo de dominio. Por ejemplo, usando la estructura cristalina resuelta del VH dAb HEL4 (SEQ ID NO: 399; un anticuerpo de dominio que se une a lisozima de huevo de gallina), los residuos Gln-13, Pro-14, Gly-15, Pro-41, Gly-42, Lys-43, Asp-62, Lys-65, Arg-87, Ala-88, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119 y Ser-120 han sido identificados como siendo accesibles a solvente, y descritos en la presente serían candidatos atractivos para la mutación a residuos de cisteína o lisina para la fijación de un polímero PEG. Además, usando la estructura cristalina resuelta del anticuerpo de dominio ficticio VK (SEQ ID NO: 400) , los residuos Val-15, Pro-40, Gly-41, Ser-56, Gly-57, Ser-60, Pro-80, Glu-81, Gln-100, Lys-107 y Arg-108 han sido identificados como siendo accesibles a solvente, y descritos en la presente serian candidatos atractivos para mutación a residuos de cisteína o lisina para la fijación de un polímero PEG. En una modalidad como la descrita en la presente, un polímero de PEG es enlazado a varios residuos de cisteína o lisina accesibles por solvente, o a residuos accesibles por solvente que han sido mutados a un residuo de cisteína o lisina. Como alternativa, sólo un residuo accesible a solvente es enlazado a PEG, ya sea en donde el anticuerpo de dominio particular posee sólo una cisteína o lisina accesible a solvente (o residuo modificado a una cisteína o lisina) o cuando un residuos accesible a solvente particular se selecciona de entre varios de estos residuos para PEGilación.

Secuencia de aminoácidos primaria de HEL4 (SEQ ID NO: 399) : 1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEMVSS 51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRARD TAVYYCASAL 101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS Secuencia de aminoácidos primaria ficticio de VK (SEQ ID NO: 400) : 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA 51 ASSLQSGVPS RPSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ 101 GTKVEIKR Varios esquemas de fijación a PEG descritos en la presente son provistos por la compañía Nektar (Sanearlos, CA) . Por ejemplo, cuando la fijación de PEG u otro polímero a un residuo de lisina se desee, ásteres activos de polímeros de PEG que hayan sido derivados con N-hidroxilsuccinimida, tales como propionato de succinimidilo pueden ser usados. Cuando la fijación a un residuo de cisteína se desea, los polímeros de PEG que han sido derivados con agentes selectivos de sulfhidrilo tales como maleimida, vinil sulfona o tioles pueden ser usados. Otros ejemplos de modalidades específicas de derivados de PEG que se pueden usar como se describe en la presente para generar anticuerpos PEGilados pueden encontrarse en el catálogo de Nektar (disponible en la red mundial en nektar.com). Además, varias formas derivadas de PEG pueden usarse como se describe en la presente para facilitar la fijación del polímero de PEG a un anticuerpo de dominio. Los derivados de PEG descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a PEG-succinato de succinimidilo, PEG enlazado a uretano, fenilcarbonato de PEG, PEG carbonato de succinimidilo, PEG-carboximetil azida, anhídrido dimetilmaleico PEG, PEG-derivado de ditiocarbonato, PEG-tresilatos (2, 2 , 2-trifluoroetansulfonatos) , imidoésteres de mPEG y otros como los descritos en Zalipsky y Lee, (1992) ("Use of functionalized poly (ethylene glicol)s for modification of peptides" in Poly (Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY) .

En una modalidad descrita en la presente, una composición de anticuerpos de dominio comprende un anticuerpo de dominio y polímero PEG en donde la relación de polímero PEG a anticuerpo de dominio es' una relación molar de al menos 0.25:1. En una modalidad más, la relación molar de polímero de PEG a anticuerpo de dominio es 0.33:1 o más. En otra modalidad más la relación molar de polímero de PEG a anticuerpo de dominio es de 0.5:1 o más. 6. Modificación de anticuerpos de dominio 6.1. Diversificación de la secuencia canónica Habiendo seleccionado varias conformaciones de cadena principal conocidas o, en un aspecto, una sola conformación de cadena principal conocida, los ligandos descritos en la presente o bibliotecas para usarse en la presente pueden construirse al variar el sitio de unión de la molécula para generar así un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que variantes se generan de tal manera que posean diversidad suficiente en su estructura y/o en su función como para que sean capaces de proporcionar una gama de actividades.

La diversidad deseada se genera típicamente al variar la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que serán cambiadas pueden seleccionarse aleatoriamente o en un aspecto, son seleccionadas. La variación puede lograrse ya sea mediante aleatorización, durante la cual el aminoácido residente sea reemplazado por un aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un número muy grande de variantes o al reemplazar el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes.

Se han reportado varios métodos para introducir esta diversidad. PCR propensa a error (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol . , 226:889), mutagénesis química (Deng et al. (1994) J". Biol. Chem. , 269:9533) o cepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260:359) se pueden usar para introducir mutaciones aleatorias en los genes que codifiquen para la molécula. Los métodos para mutar posiciones seleccionadas también se conocen bien en la técnica e incluyen el uso de oligonucleótidos no apareados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, varias bibliotecas de anticuerpos sintéticos han sido creadas al dirigir mutaciones a las asas de unión a antígeno. La región H3 de un Fab de unión a toxoide de tétanos humano ha sido aleatorizada para crear una gama de nuevas especificidades de unión (Barbas et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:4457). Las regiones H3 y L3 aleatorias o semi-aleatorias han sido anexadas a segmentos génicos V de línea germinal para producir grandes bibliotecas con regiones estructurales no mutadas (Hoogenboom & inter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 89:4457; Nissim et al. (1995) J. Mol. Biol., 248:97). Esta diversificación ha sido extendida para incluir algunas o todas las asas de unión a antígeno adicionales (Crameri et al. (1996) Nature Med, 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/'Technology, 13:475; Morphosys, WO97/08320, citado arriba) .

Ya que la aleatorización de asas tiene el potencial de crear aproximadamente más de 1015 estructuras para H3 únicamente y un número similarmente grande de variantes para las otras cinco asas, no es posible usando la tecnología de transformación actual o incluso usando sistemas libres de células producir una biblioteca que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes construidas hasta la fecha, 6xl010 anticuerpos diferentes, lo cual es sólo una fracción de la diversidad potencial para una biblioteca de este diseño, fueron generados (Griffiths et al. (1994) citado arriba).

En una modalidad, sólo aquellos residuos que están directamente implicados en crear o modificar la función deseada de la molécula son diversificados. Para muchas moléculas, la función será la de unirse a un objetivo y por lo tanto la diversidad debe concentrarse en el sitio de a unión a objetivo, evitando al mismo tiempo cambiar residuos que sean cruciales para el empaque total de la molécula o para mantener la conformación de cadena principal seleccionada. 6.1.1. Diversificación de la secuencia canónica en lo que aplica a dominios de anticuerpo En el caso de los ligandos descritos en la presente, el sitio de unión para el objetivo es muy comúnmente el sitio de unión a antígeno. De esta manera, en un aspecto, bibliotecas de o para el ensamble de ligandos de anticuerpo en las cuales sólo esos residuos en el sitio de unión a antígeno son variados. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpos humanos y se sabe que hacen contactos en complejos de anticuerpo-antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos de origen natural y se observa que hacen contacto con el antígeno. En contraste, el enfoque convencional hubiera sido diversificar todos los residuos en la Región de Determinación de Complementariedad correspondiente (CDR1) como se define por abat efc al. (Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Dept . Health & Human Services, Washington, D.C.), algunos siete residuos comparados con los dos diversificados en la biblioteca para usarse como se describe en la presente. Esto representa una mejora significativa en términos de la diversidad funcional requerida para crear una gama de especificidades de unión a antígeno.

En la naturaleza, la diversidad de anticuerpos es el resultado de dos procesos: recombinación somática de segmentos génicos V, D y J de línea germinal para crear un repertorio primario naive (también llamada diversidad de línea germinal y de unión) e hipermutación somática de los genes V redispuestos resultantes. El análisis de secuencias de anticuerpos humanos ha mostrado que la diversidad en el repertorio primario se enfoca en el centro del sitio de unión a antígeno mientras que la hipermutación somática dispersa la diversidad a regiones en la periferia del sitio de unión a antígeno que son altamente conservadas en el repertorio primario (véase Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol . , 256:813). Esta complementariedad probablemente ha evolucionado como una estrategia eficiente para buscar espacio de secuencia y, aunque aparentemente única para anticuerpos, se puede aplicar fácilmente a otros repertorios de polipéptidos . Los residuos que son variados son un subconjunto de aquellos que forman el sitio de unión para el objetivo. Diferentes subconjuntos (incluyendo superpuestos) de residuos en el sitio de unión a antígeno son diversificados en diferentes etapas durante la selección, si se desea.

En el caso de un repertorio de anticuerpos, un repertorio vnaive' inicial es creado cuando algunos, pero no todos, los residuos en el sitio de unión a antígenos son diversificados. Según se usa en la presente en este contexto, el término ' naive' se refiere a moléculas de anticuerpo que no tienen objetivo predeterminado. Estas moléculas simulan aquellas que son codificadas por los genes de inmunoglobulina de un individuo que no ha sido sometido a diversificación inmune, como es el caso con individuos fetales y recién nacidos, cuyos sistemas inmunitarios aún no han sido atacados por una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio es luego seleccionado contra una gama de antígenos o epítopos . Si se requiere, diversidad adicional puede ser entonces introducida fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado puede seleccionarse para función, especificidad o afinidad modificada.

En la presente se describen dos repertorios naives diferentes de dominios de unión para la construcción de ligandos, o bibliotecas de ligandos naives, en los cuales algunos o todos los residuos en el sitio de unión a antígeno son variados. La biblioteca "primaria" imita el repertorio primario natural, con diversidad restringida a residuos en el sitio de unión a antígeno que son diversos en los segmentos génicos V de línea germinal (diversidad de línea germinal) o diversificados durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) . Esos residuos que son diversificados incluyen, pero no están limitados a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96. En la biblioteca "somática", la diversidad está restringida a residuos que son diversificados durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) o son mutados de manera altamente somática) . Esos residuos que son diversificados incluyen, pero no están limitados a: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96. Todos los residuos listados arriba como adecuados para diversificación en estas bibliotecas se sabe que hacen contactos en uno o más complejos anticuerpo-antígeno . Ya que en ambas bibliotecas, no todos los residuos en el sitio de unión a antígeno son variados, diversidad adicional se incorpora durante la selección al variar los residuos restantes, si se desea hacerlo. Será aparente para alguien experto en la técnica que cualquier subconjunto de cualquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprendan el sitio de unión a antígeno) pueden usarse para la diversificación inicial y/o subsecuente del sitio de unión a antígeno.

En la construcción de bibliotecas para usarse como se describe en la presente, la diversificación de las posiciones seleccionadas se logra típicamente al nivel de ácido nucleico, al alterar la secuencia de codificación que especifica la secuencia del polipéptido de tal manera que un número de aminoácidos posibles (todos los 20 o un subconjunto de los mismos) puedan ser incorporados en esa posición. Usando la nomenclatura de la IUPAC, el codón más versátil es NNK, el cual codifica para todos los aminoácidos así como para el codón de paro TAG. El codón NNK es, en un aspecto, usado para introducir la diversidad requerida. Otros codones que logran los mismos fines también son de uso, incluyendo el codón NNN, el cual lleva a la producción de los codones de paro adicionales TGA y TAA.

Una característica de la diversidad de cadena lateral en el sitio de unión a antígeno de anticuerpos humanos es una pronunciada desviación que favorece ciertos residuos de aminoácido. Si la composición de aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH, VK y V¾ son sumadas, más de 76% de la diversidad de la cadena lateral proviene sólo de siete residuos diferentes, éstos siendo, serina (24%) , tirosina (14%) , asparagina (11%) , glicina (9%) , alanina (7%) , aspartato (6%) y treonina (6%) . Esta desviación hacia residuos hidrófilos y residuos pequeños que pueden proporcionar flexibilidad en la cadena principal probablemente refleja la evolución de superficies que están predispuestas a la unión a una amplia gama de antígenos o epítopos y podría ayudar a explicar la promiscuidad requerida de anticuerpos en el repertorio primario.

Ya que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones que serán variadas, en un aspecto, imita aquella observada en el sitio de unión a antígeno de anticuerpos. Esta desviación en la sustitución de aminoácidos que permite la selección de ciertos polipéptidos (no sólo anticuerpos de dominio) contra una gama de antígenos objetivo se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos. Hay varios métodos para desviar la distribución de aminoácidos en la posición que será variada (incluyendo el uso de mutagénesis de tres nucleótidos, véase O 97/08320), de los cuales un método adecuado, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Al comparar el perfil de aminoácidos codificados por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración individual, doble, triple y cuádruple en relaciones iguales en cada posición) con el aminoácido natural, es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT) (AGC) T , (AGT) (AGC)C, y (AGT) (AGC) (CT) son aquellos más cercanos al perfil de aminoácido deseado: codifican para 22% de serina y 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína, y en un aspecto, estos codones se usan en la construcción de una biblioteca. 6.2. Ligandos específicos dobles También se proporcionan en la presente ligandos específicos dobles que comprenden anticuerpos de dominio que cada uno tienen especificidades respectivas; es decir, el primero y el segundo epítopos unidos por el ligando específico doble son, en un aspecto, diferentes o son dos copias de los mismos epítopos, los epítopos siendo unidos por un dominio variable respectivo. En una modalidad, un "ligando específico doble" se refiere a un ligando que comprende un anticuerpo de dominio y un segundo anticuerpo de dominio como los definidos en la presente, en donde las regiones variables son capaces de unirse a dos antígenos o dos epítopos diferentes en el mismo antígeno que no son normalmente aglutinados por una inmunoglobulina monoespecífica . En otra modalidad, un "ligando específico doble" se refiere a un ligando que comprende un anticuerpo de dominio y un dominio variable de inmunoglobulina como el definido en la presente, en donde las regiones variables son capaces de unirse a dos antígenos diferentes o dos epítopos en el mismo antígeno que no son normalmente aglutinados por una inmunoglobulina monoespecífica . Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar en el mismo hapteno, no ser el mismo epítopo o suficientemente adyacentes para ser unidos por un ligando monoespecífico . Los ligandos específicos dobles descritos en la presente están compuestos de dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no contienen pares de dominios variables mutuamente complementarios que tienen la misma especificidad. Los ligandos específicos dobles pueden ser, o formar parte de, polipéptidos , proteínas o ácidos nucleicos, los cuales pueden ser de origen natural o sintéticos.

Adecuadamente, el ligando doble o multiespecífico puede comprender un primer dominio capaz de unirse a una molécula objetivo, y un segundo dominio capaz de unirse a una molécula o grupo que extienda la vida media del ligando. Por ejemplo, la molécula o grupo puede ser un agente voluminoso, tal como HSA o una proteína de matriz celular. Según se usa en la presente, la frase "molécula o grupo que extiende la vida media de un ligando" se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando es unido por un ligando específico doble como el descrito en la presente incrementa la vida media in vivo de este ligando específico doble cuando se administra a un animal, en relación a un ligando que no se une a esa molécula o grupo. Ejemplos de moléculas o grupos que extienden la vida media de un ligando se describen en la presente abajo. En una modalidad, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede ser capaz de unirse a la molécula objetivo sólo después del desplazamiento de la molécula o grupo de incremento de la vida media. Así, por ejemplo, un ligando multiespecífico de conformación cerrada se mantiene en la circulación en el torrente sanguíneo de un sujeto por una molécula voluminosa tal como HSA. Cuando una molécula objetivo es encontrada, la competencia entre los dominios de unión del ligando multiespecífico de conformación cerrada se traduce en el desplazamiento del HSA y la unión del objetivo. Las moléculas que incrementan la vida media se describen en mayor detalle arriba.

En una modalidad de la segunda configuración descrita en la presente, los dominios variables se derivan de un anticuerpo dirigido contra el primero y/o segundo antígeno o epítopo. En una modalidad, los dominios variables se derivan de un repertorio de dominios de anticuerpo variables individuales. En un ejemplo, el repertorio es un repertorio que no se crea en un animal o un repertorio sintético. En otro ejemplo, los dominios variables individuales no son aislados (al menos en parte) mediante inmunización de animales. Así, los dominios individuales pueden ser aislados de una biblioteca naive.

En otro aspecto, se describe en la presente un ligando multiespecífico que comprende un primer dominio de unión a epítopo que tiene una primera especificidad de unión a epítopo y un segundo dominio de unión a epítopo no complementario que tiene una segunda especificidad de unión a epítopo. Las primera y segunda especificidades de unión pueden ser iguales o diferentes.

En un aspecto más, se describe en la presente un ligando multiespecífico de conformación cerrada que comprende un primer dominio de unión a epítopo que tiene una primera especificidad de unión a epítopo y un segundo dominio de unión a epítopo no complementario que tiene una segunda especificidad de unión a epítopo, en donde las primera y segunda especificidades de unión son capaces de competir por la unión a epítopos de tal manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada no pueda unirse a ambos epítopos simultáneamente.

Los ligandos de acuerdo con cualquier aspecto descrito en la presente, así como monómeros de anticuerpos de dominio útiles para construir estos ligandos, se pueden disociar adecuadamente de sus objetivos cognados con una Ka de alrededor de 300 nM a 1 pM o 5 pM (es decir, 3 x 10"7 a 5 x 10~12 M) , en un aspecto, alrededor de 50 nM a 20 pM, o de 5 nM a 200 pM o 1 nM a 100 pM, 1 x 10"7 M o menos, 1 x 10"8 M o menos, 1 x 10"9 M o menos, 1 x 10"10 M o menos, 1 x 10"11 M o menos, y/o una constante de velocidad Koff de aproximadamente 5 x 10"1 a 1 x 10"7 S"1, en un aspecto, alrededor de 1 x 10"2 a 1 x 10"6 o 5 x 10"1 S"1, o menos, o 1 x 10~2 S"1 o menos, o 1 x ÍO^S"1 o menos, o 1 x ÍO^S"1 o menos, o 1 x 10"5 S"1 o menos, o 1 x 10"6 S"1 o menos según se determina mediante resonancia de un plasmón en superficie. La constante de velocidad ¾ se define como Koff/Kon. Detalles adicionales con respecto a ligandos específicos dobles pueden encontrarse en WO 03/002609, WO 04/003019 y WO 04/058821.

Además, un monómero de anticuerpo de dominio es provisto (o ligando específico doble que comprende este anticuerpo de dominio) que se une a albúmina de suero (SA) con una YL¿ de 1 nM a 500 µ? (es decir, 1 x 10"9 M a 5 x 10"4 M) , en un aspecto, 100 nM a 10 µ?. En un aspecto, para un ligando específico doble que comprende un anticuerpo de dominio anti-SA y un segundo anticuerpo de dominio a otro objetivo, la afinidad (por ejemplo, Ka y/o Koff medida mediante resonancia de un plasmón en superficie, por ejemplo, usando Biacore) del segundo dAb para su objetivo es de 1 a 100,000 veces (en un aspecto, 100 a 100,000, en un aspecto más, 1,000 a 100,000 ó 10,000 a 100,000 veces) la afinidad del primer anticuerpo de dominio para SA. Por ejemplo, el primer anticuerpo de dominio se une a SA con una afinidad de aproximadamente 10 µ?, mientras que el segundo anticuerpo de dominio se une a su objetivo con una afinidad de alrededor de 100 pM. En una modalidad ejemplar, la albúmina sérica es albúmina sérica humana (HSA) .

En una modalidad, el primer anticuerpo de dominio (o un monómero de anticuerpo de dominio) se une a SA (por ejemplo, HSA) con una ¾ de aproximadamente 50 nM, en un aspecto, alrededor de 70 nM, y en otro aspecto, alrededor de 100, 150 ó 200 nM.

También se proporcionan dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros de anticuerpo de dominio mencionados anteriormente, de acuerdo con el aspecto anterior .

Los ligandos descritos en la presente, incluyendo monómeros, dímeros y trímeros de anticuerpos de dominio, pueden ser enlazados a una región Fe de anticuerpo, que comprenda uno o ambos de los dominios CH2 y CH3 y opcionalmente una región de pivote. Por ejemplo, vectores que codifiquen para ligandos enlazados como una sola secuencia de nucleótidos a una región Fe pueden usase para preparar estos polipéptidos . Como alternativa, los ligandos descritos en la presente pueden estar liberes de un dominio Fe .

En un aspecto más se proporciona una o más moléculas de ácido nucleico que codifica al menos para un ligando doble o multiespecífico como el descrito en la presente. En una modalidad, el ligando es un ligando de conformación cerrada. En otra modalidad, es un ligando de conformación abierta. El ligando multiespecífico puede codificado en una sola molécula de ácido nucleico; como alternativa, cada dominio de unión a epítopo puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico separada. Cuando el ligando es codificado por una sola molécula de ácido nucleico, los dominios pueden ser expresados como un polipéptido de fusión, o pueden expresarse por separado y posteriormente enlazarse juntos, por ejemplo usando agentes de enlace químicos. Los' ligandos expresados a partir de ácidos nucleicos separados serán enlazados mediante medios adecuados .

El ácido nucleico puede codificar además para una señal una sola para la exportación de los polipéptidos desde una célula hospedera después de la expresión y se pueden fusionar con un componente superficial de una partícula de bacteriófago filamentoso (u otro componente de un sistema de despliegue de selección) después de la expresión. Secuencias líder, las cuales pueden usarse de expresión bacteriana y/o despliegue de fagos o fagémidos, incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla, ompT y pelA.

En un aspecto más de la segunda configuración descrita en la presente se incluye un vector que comprendec ácido nucleico.

En un aspecto más se proporciona una célula hospedera transfectada con un vector.

La expresión a partir de este vector puede configurarse para producir, por ejemplo sobre la superficie de una partícula de bacteriófago, dominios de unión a epítopos para selección. Esto permite la selección de dominios desplegados y de esta manera la selección de "ligandos multiespecíficos" usando el método descrito en la presente . 6.2.1. Estructura de ' ligandos específicos dobles' Como se describió arriba, un anticuerpo se define en la presente como un anticuerpo o fragmento (Fab, Fv, Fv enlazado a disulfuro, scFv, dicuerpo) que comprende al menos un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera, al menos dos dominios variables de la cadena pesada y o al menos dos dominios variables de la cadena ligera. Puede derivarse al menos parcialmente de cualquier especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o crearse mediante tecnología de ADN recombinante ; ya sea aislado de suero, células B, hibridomas, transíectomas , levadura o bacterias) .

En una modalidad, el ligando específico doble comprende al menos un solo dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo y un solo dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo, o dos dominios variables de la cadena pesada o ligera individuales. Por ejemplo, el ligando puede comprender un par VH/VL, un par de dominios VH o un par de dominios VL.

El primero y segundo dominios variables de este ligando pueden estar en la misma cadena de polipéptidos . Como alternativa, pueden estar en cadenas de polipéptidos separadas. En caso de que estén en la misma cadena de polipéptidos pueden ser enlazados por un enlazador, el cual puede ser una secuencia de péptidos, como la descrita arriba.

El primero y segundo dominios variables pueden ser asociados covalente o no covalentemente . En caso de que sean asociados covalentemente, los enlaces covalentes pueden ser enlaces de disulfuro.

En caso de que los dominios variables se seleccionen de repertorios de genes V seleccionados por ejemplo usando tecnología de despliegue de fagos como la descrita en la presente, entonces estos dominios variables comprenden una región estructural universal, de tal manera que puedan ser reconocidos por un ligando genérico específico como el definido en la presente. El uso de estructuras universales, ligandos genéricos y similares se describe en O 99/20749.

Cuando se usan repertorios de genes V de la variación en la secuencia de polipéptidos es, en un aspecto, ubicada dentro de las asas estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de cualquier dominio variable pueden ser alteradas mediante reclasificación de ADN o mediante mutación para poder incrementar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. La reclasificación de ADN se conoce en la técnica y se enseña, por ejemplo, por Stemmer (1994) Nature 370:389-391 y patente de E.U.A. No. 6,297,053, ambas de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia. Otros métodos de mutagénesis se conocen bien por aquellos expertos en la técnica.

En una modalidad, el 'ligando específico doble' es un fragmento Fv de cadena individual. En una modalidad alternativa, el 4 ligando específico doble' consiste en un formato Fab.

Un aspecto más descrito en la presente proporciona ácido nucleico que codifica para al menos un v ligando específico doble' como el definido en la presente.

Un experto en la técnica apreciará que, dependiendo del aspecto, ambos antígenos o epítopos pueden unirse simultáneamente a la misma molécula de anticuerpo. Como alternativa, pueden competir para la unión a la misma molécula de anticuerpo. Por ejemplo, cuando ambos epítopos son unidos simultáneamente, ambos dominios variables de un ligando específico doble son capaces de unirse independientemente a sus epítopos objetivo. Cuando los dominios compiten, uno de los dominios variables es capaz de unirse a su objetivo, pero no al mismo tiempo que el otro dominio variable se une a su objetivo cognado; o el primer dominio variable es capaz de unirse a su objetivo, pero no al mismo tiempo que el segundo dominio variable se une a su objetivo cognado.

Las regiones variables pueden derivarse de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos objetivo.

Como alternativa se pueden derivar de un repertorio de dominios de anticuerpo individuales tales como aquellos expresados sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos. La selección puede llevarse a cabo como se describe abajo.

En general, las moléculas de ácido nucleico y construcciones de vectores requeridas para rendimiento como las descritas en la presente pueden construirse y manipularse como se muestra en manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, E.U.A.

La manipulación de ácidos nucleicos útiles como los descritos en la presente se lleva a . cabo típicamente en vectores recombinantes .

Así, un aspecto más descrito en la presente proporciona un vector que comprende ácido nucleico que codifica para al menos un 'ligando específico doble' como el definido en la presente.

Según se usa en la presente, vector se refiere a un elemento discreto que se usa para introducir ADN heterólogo o en células para la expresión y/o replicación de los mismos. Los métodos mediante los cuales se selecciona o construye y, posteriormente, se usa estos vectores se conocen bien por alguien de capacidad ordinaria en la técnica. Numerosos vectores están disponibles públicamente, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episómicos. Estos vectores pueden usarse para clonación y mutagénesis simples; como alternativa el vector de expresión génica es empleado. Un vector de utilidad como el descrito en la presente puede seleccionarse para adaptarse a una secuencia de codificación de polipéptidos de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobases (kb) a 40 kb o más de largo. Una célula hospedera adecuada es transformada con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene varios componentes funcionales, los cuales incluyen generalmente un sitio de clonación (o "polienlazador" ) , un origen de replicación y al menos un gen marcador seleccionable . Si un vector dado es un vector de expresión, posee además uno -o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, secuencias de terminación de transcripción y de señal, cada una colocada en las inmediaciones del sitio de clonación, de tal manera que se enlacen operativamente al gen que codifique para un ligando como el descrito en la presente.

Vectores tanto de clonación como de expresión contienen generalmente secuencias de ácido nucleico que hacen posible que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. Típicamente en vectores de clonación, esta secuencia es una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedero e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicacion autónoma. Estas secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas , el origen de plásmido de 2 mieras es adecuado para levadura y varios orígenes virales (por ejemplo, . SV 40, adenovirus) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicacion no se requiere para vectores de expresión de mamífero a menos que éstos se usen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como células COS .

Adecuadamente, un vector de clonación o expresión puede contener un gen de selección conocido también como un marcador seleccionable . Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospederas transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contiene el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , complementan deficiencias auxotrópicas o suministran nutrientes críticos no disponibles en los medios de crecimiento. 6.2.2. Combinación de dominios variables individuales Los dominios útiles como los descritos en la presente, una vez seleccionados usando métodos ejemplificados arriba, pueden combinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos covalentes y no covalentes .

Los métodos incluyen el uso de enlazadores de polipéptidos , como los descritos, por ejemplo, en relación con moléculas scFv (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). La descripción de enlazadores adecuados se proporciona en Bird et al., Science 242:423-426; Hudson et al., (1999) J". Immunol . Methods 231:177-189; Hudson et al., Proc . Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 85:5879-5883. Los enlazadores son en un aspecto flexibles, permitiendo a los dos dominios individuales interactuar. Un ejemplo de enlazador es un enlazador de (Gly4 Ser)n, en donde n = 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 7. Los enlazadores usados en dicuerpos, los cuales son menos flexibles, pueden ser también empleados (Hollinger et al., (1993) PNAS (E.U.A.) 90:6444-6448).

En una modalidad, el enlazador empleado no es una región de pivote de inmunoglobulina .

Los dominios variables pueden combinarse usando métodos que no sean enlazadores. Por ejemplo, el uso de puentes de disulfuro, proporcionados a través de residuos de cisteína de origen natural o manipulados, puede explotarse para estabilizar dímeros VH-VH, VL-VL o VH-VL (Reiter et al. (1994) Protein Eng. 7:697-704) o al remodelar la interfaz entre los dominios variables para mejorar el "ajuste" y de esta manera la estabilidad e interacción (Ridgeway et al. (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6: 781-788) .

Otras técnicas para unir o estabilizar dominios variables de inmunoglobulinas , y en particular dominios VH de anticuerpo, pueden emplearse según sea adecuado.

Como se describe en la presente, los ligandos específicos dobles pueden estar en conformaciones "cerradas" en solución. Una configuración "cerrada" es aquella en la cual los dos dominios (por ejemplo VH y VL) están presentes en forma asociada, tal como aquella de un par VH-VL asociado que forma un sitio de unión a anticuerpo. Por ejemplo, scFv pueden estar en una conformación cerrada, dependiendo de la disposición del enlazador usado para enlazar los dominios VH y VL. Si es suficientemente flexible como para permitir que los dominios se asocien, o los mantiene rígidamente en la posición asociada, es probable que los dominios adopten una conformación cerrada.

De manera similar, los pares de dominios VH y pares de dominio VL pueden existir en una conformación cerrada. Generalmente, ésta será una función de asociación cerrada de los dominios, tal como por medio de un enlazador rígido, en la molécula de ligando. Los ligandos en una conformación cerrada serán incapaces de unirse tanto a la molécula que incrementa la vida media del ligando como a una segunda molécula objetivo. Así, el ligando típicamente sólo se unirá a una segunda molécula objetivo después de la disociación de la molécula que incrementa la vida media del ligando.

Más aún, la construcción de dímeros VH/VH, VL/VL o H/VL sin enlazadores proporciona la competencia entre los dominios.

Ligandos como los descritos en la presente pueden además estar en una conformación abierta. En esta conformación, los ligandos serán capaces de unirse simultáneamente tanto a la molécula que incrementa la vida media del ligando como a la segunda molécula objetivo. Típicamente, dominios variables en una configuración abierta son (en el caso de pares VH-VL) mantenidos lo suficientemente lejos aparte para que los dominios no interactuen y formen un sitio de unión a anticuerpo y no compitan para unión a sus epítopos respectivos. En el caso de dímeros VH/VH o VL/VL, los dominios no son forzados juntos por enlazadores rígidos. Naturalmente, estos pares de dominios no competirán para la unión a antígeno o formarán un sitio de unión a anticuerpo.

Fragmentos Fab y anticuerpos enteros existirán principalmente en la conformación cerrada, aunque se apreciará que ligandos específicos dobles abiertos y cerrados es probable que existan en una variedad de equilibrios bajo diferentes circunstancias. La unión del ligando a un objetivo es probable que desplace el balance del equilibrio hacia la configuración abierta. De esta manera, ciertos ligandos descritos en la presente pueden existir en dos conformaciones en solución,- una de las cuales (la forma abierta) pueda unirse a dos antígenos o epítopos independientemente, mientras que la conformación alternativa (la forma cerrada) sólo se pueda unir a un antígeno o epítopo; antígenos o epítopos compiten entonces para la unión al ligando en esta conformación.

Aunque la forma abierta del ligando específico doble puede entonces existir en equilibrio con la forma cerrada en solución, se contempla que el equilibrio favorecerá la forma cerrada; además, la forma abierta puede ser secuestrada mediante unión a objetivo en una conformación cerrada. En una modalidad ejemplar, por lo tanto, ciertos ligandos específicos dobles descritos en la presente están presentes en un equilibrio entre dos conformaciones (abierta y cerrada) .

Los ligandos específicos dobles descritos en la presente pueden modificarse para favorecer una conformación abierta o cerrada. Por ejemplo, la estabilización de las interacciones VH-VL con enlaces de disulfuro estabiliza la conformación cerrada. Además, los enlazadores usados para unir los dominios, incluyendo pares de dominios VH y dominio VL, pueden construirse de tal manera que la forma abierta sea favorecida; por ejemplo, los enlazadores pueden impedir estéricamente la asociación de los dominios, tal como mediante la incorporación de residuos de aminoácido grandes en lugares oportunos, o el diseño de una estructura rígida adecuada que mantendrá a los dominios separados aparte físicamente . 6.2.3. Caracterización del ligando específico doble La unión del ligando específico doble a sus antígenos o epítopos específicos puede probarse mediante métodos que serán familiares para aquellos expertos en la técnica e incluyen ELISA. En una modalidad, la unión se prueba usando ELISA de fagos monoclonales .

ELISA de fagos puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado: un protocolo ejemplar se muestra abajo.

Poblaciones de fagos producidas en cada ronda de selección pueden ser tamizadas para la unión mediante ELISA al antígeno o epítopo seleccionado, para identificar anticuerpos de fagos "policlonales" . Fagos de colonias bacterianas infectadas individuales de estas poblaciones pueden ser entonces tamizados mediante ELISA para identificar anticuerpos de fagos "monoclonales" . También es deseable tamizar fragmentos de anticuerpo solubles para unirse a antígeno o epítopo, y esto también se puede llevar a cabo mediante ELISA usando reactivos, por ejemplo, contra un marcador del C-terminal o N (véase por ejemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y referencias citadas en el mismo.

La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fagos seleccionados también se puede evaluar mediante electroforesis en gel de productos de PCR (Marks et al. (1991) citado arriba; Nissim et al. (1994) citado arriba), sondeo (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol . 227-776) o por secuenciación del ADN de vector. 7. Incremento de la estabilidad de polipéptidos 7.1. Incremento de la vida media In vivo, anticuerpos de dominio PEGilados como los descritos en la presente pueden conferir una ventaja distinta sobre anticuerpos de dominio no PEGilados, ya que las moléculas de anticuerpo PEGiladas tendrán una vida media in vivo prolongada ampliamente. Se entenderá, en el contexto de la presente invención, que una vida media particular de cualquier composición puede ser ya sea incrementada o reducida mediante la ruta de administración de la composición a un paciente.

No obstante, sin desear ser limitados a una teoría particular,, se cree que la vida media incrementada de las moléculas descritas en la presente es conferida por el tamaño hidrodinámico incrementado del anticuerpo de dominio que resulta de la fijación de polímeros de PEG. Más específicamente, se cree que dos parámetros juegan un papel importante en determinar la vida media en suero de anticuerpos de dominio PEGilados. El primer criterio es la naturaleza y tamaño de la fijación a PEG, es decir, si el polímero usado es simplemente una cadena lineal o una cadena ramificada/en forma de horquilla, en donde la cadena ramificada/en forma de horquilla da origen a una vida media más larga. El segundo es la ubicación de la porción o porciones de PEG sobre el anticuerpo de dominio en el formato final y qué tantos brazos de PEG no modificados "libres" tiene la molécula. El tamaño hidrodinámico resultante del anticuerpo de dominio PEGilado, según se calcula, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, refleja la vida media en suero de la molécula. En consecuencia, entre más grande sea el tamaño hidrodinámico de la molécula PEGilada, mayor será la vida media en suero.

Una vida media incrementada es útil para aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas , especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño, así como anticuerpos de dominio. Estos fragmentos (Fvs, Fabs, scFvs) de anticuerpos de dominio sufren de una rápida depuración del cuerpo; así, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente, y son rápidos de producir y más fáciles de manejar, sus aplicaciones in vivo han estado limitadas sólo por su breve persistencia in vivo.

En un aspecto, un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente es estabilizado in vivo mediante fusión con una porción, tal como PEG, que incrementa el tamaño hidrodinámico del anticuerpo de dominio. Los métodos para el análisis farmacocinético y determinación de la vida media serán familiares para aquellos expertos en la técnica. Detalles pueden encontrarse en Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals : A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Phar acokinetc Analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics" , M. Gibaldi & D. Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. Edición (1982), el cual describe parámetros farmacocinéticos tales como vidas media t- y t-ß y área bajo la curva (AUC) .

Típicamente, la vida media de un anticuerpo de dominio PEGiladó como el descrito en la presente se incrementa en alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más, en relación con un dAb no PEGilado (en donde el dominio de anticuerpo del anticuerpo de dominio PEGilado y anticuerpo de dominio no PEGilado son iguales) . Los incrementos en la escala de 2x, 3x, 4x, 5x, 7x, lOx, 20x, 30x, 40x y hasta 50x o más de la vida media son posibles. Como alternativa, o además, incrementos en la escala de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, lOOx, o 150x de la vida media son posibles.

Vidas medias (t¾-a y tM-ß) y AUC pueden determinarse a partir de una curva de concentración en suero de ligando contra tiempo. El paquete de análisis WinNonlin (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, E.U.A.) puede usarse, por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa) el ligando está sufriendo principalmente distribución en el paciente, con cierta eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando el ligando ha sido distribuido y la concentración en suero está bajando al ser depurado el. ligando del paciente. La "vida media ta" es la vida media de la primera fase y la "vida media t " es la vida media de la segunda fase. La "vida media" según se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, se refiere a la vida media total de un dominio variable individual de anticuerpo descrito en la presente determinado mediante modelado sin compartimientos (en contraste con modelado bifásico, por ejemplo) . La vida media beta se mide del tiempo que tarda la cantidad de monómero o multímero de anticuerpo de dominio para ser depurada del mamífero al cual se administra. De esta manera, adecuadamente, una composición que contenga anticuerpos de dominio, por ejemplo, una composición de grupos efectores de anticuerpos de dominio se contempla que tiene una vida media ta en la escala de aproximadamente 0.25 horas a 6 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1.3 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas, o 12 horas. Además o alternativamente, una composición que contenga anticuerpos de dominio tendrá una vida media ta en la escala de hasta e incluyendo 12 horas. En una modalidad, el extremo superior de la escala es aproximadamente 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de una escala adecuada es alrededor de 1.3 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.

Adecuadamente, una composición que contiene anticuerpo de dominio que comprende un ligando tiene una vida media t en la escala de alrededor de 1-170 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es aproximadamente 2.5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, o 12 horas. Además, o alternativamente, una composición que contiene anticuerpo de dominio, por ejemplo, una composición de grupo efector dAb tiene una vida media tß en la escala de hasta incluyendo 21 días. En una modalidad, el extremo superior de la escala es aproximadamente 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días.

Adecuadamente, una composición que contiene dAb descrito en la presente tendrá una vida media t en la escala de alrededor de 2-100 horas, 4-80 horas y 10-40 horas. En una modalidad más, estará en la escala de aproximadamente 12-48 horas. En una modalidad adicional, estará en la escala de aproximadamente 12-26 horas. En la presente se describe una composición que contiene anticuerpos de dominio que comprenden un ligando que tiene una vida media en la escala de 1-170 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es aproximadamente 1.3 horas, 2.5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o como alternativa, una composición que contiene anticuerpo de dominio, por ejemplo, una composición de grupo efector de dAb, tiene una vida media en la escala de hasta e incluyendo 21 días. En una modalidad, el extremo superior de la escala es aproximadamente 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días.

Además, o como alternativa para los criterios anteriores, una composición que contenga anticuerpos de dominio que comprende un ligando tiene un valor AUC (área bajo la curva) en la escala de 1 mgmin/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior de la escala es de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg-min/ml . Además, o como alternativa, un ligando o composición descrito en la presente tiene una AUC en la escala de hasta aproximadamente 600 mgmin/ml. En una modalidad, el extremo superior de la escala es aproximadamente 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg-min/ml. Ligandos ejemplares descritos en la presente tendrán una AUC en la escala seleccionada del grupo que consiste en las siguientes: aproximadamente 15 a 150 mg-min/ml.

Los ligandos descritos en la presente, incluyendo mono, dobles y multi-específicos , en una configuración de los mismos, son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden incrementar la vida media del ligando in vivo. Típicamente, estas moléculas son polipéptidos que se presentan naturalmente in vivo y que resisten la degradación o remoción por mecanismos endógenos que eliminan material no deseado del organismo.

Por ejemplo, la molécula que incrementa la vida media en el organismo puede seleccionarse de las siguientes: ¦ Proteínas de matriz extracelular; por ejemplo colágeno, lamininas, integrinas y fibronectina . Los colágenos son las principales proteínas de la matriz extracelular. Aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno se conocen actualmente, encontradas en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno tipo I (que equivale a 90% del colágeno en el cuerpo) encontrado en hueso, piel, tendones, ligamentos, córnea, órganos internos, o colágeno tipo II encontrado en cartílago, discos intervertebrales, notocorda, humor vitreo del ojo.

¦ Proteínas encontradas en sangre, incluyendo: proteínas plasmáticas tales como fibrina, a-2-macroglobulina, albúmina sérica, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína A amiloide sérica, heptaglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y ß-2-microglobulina.

¦ Enzimas e inhibidores tales como plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa- 1-antitripsina e inhibidor de tripsina pancreática. Plasminógeno es el precursor inactivo de la serina proteasa tipo tripsina plasmina. Se encuentra normalmente circulando a través del torrente sanguíneo. Cuando plasminógeno es activado y se convierte en plasmina, se desdobla un potente dominio enzimático que disuelve las fibras de fibrinógeno que enmarañan los glóbulos rojos en un coágulo de sangre. Esto es llamado fibrinólisis .

¦ Proteínas del sistema inmunológico, tales como IgE, IgG e IgM.

• Proteínas de transporte tales como proteína de unión al retinol, microglobulina oc-1.

¦ Defensinas tales como beta-defensina 1, neutrófilo defensinas 1, 2 y 3.

¦ Proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejidos neurales, tales como receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato.

¦ Proteínas de fusión a agente neurofarmacéutico de ligando específico de receptor de transferrina (véase, patente de E.U.A. No. 5,977,307); receptor de células endoteliales capilares cerebrales, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF 1) , receptor de factor de crecimiento tipo insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina.

¦ Proteínas ubicadas en el riñon, tales como policistina, colágeno tipo IV, transportador aniónico orgánico Kl, antígeno de Heymann.

¦ Proteínas ubicadas en el hígado, por ejemplo alcohol deshidrogenasa, G250.

¦ Factor de coagulación de sangre X ¦ al antitripsina ¦ HNF la ¦ Proteínas ubicadas en el pulmón, tales como componente secretor (se une a IgA) .

¦ Proteínas ubicadas en el corazón, por ejemplo HSP 27. Esta está asociada con cardiomiopatía dilatada.

¦ Proteínas ubicadas en la piel, por ejemplo queratina.

Proteínas específicas de hueso, tales como proteínas morfogénicas de hueso (BMPs) , las cuales son un subconjunto de la superfamilia de factor de crecimiento de transformación ß que demuestran actividad osteogénica.

Ejemplos incluyen BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también conocida como proteína osteogénica (OP-1) y -8 (OP-2) .

¦ Proteínas específicas de tumor, incluyendo antígeno de trofoblastos humanos, receptor de herceptin, receptor de estrógenos, catepsinas (por ejemplo, catepsina B) (encontrada en el hígado y bazo) .

¦ Proteínas específicas de enfermedad, tales como antígenos expresados sólo sobre células T activadas: incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocitos) , ligando de osteoprotegerina (OPLGL) (véase Nature 402, 304-309; 1999) ; 0X40 (un miembro de la familia del receptor de TNF, expresado sobre células T activadas y la única molécula de células T co-estimuladora conocida como siendo sobre-regulada específicamente en virus de la leucemia de células T humana tipo 1 (células productoras de HTLV-1) (véase J. Immunol . 165 (1) :263-70, 2000); metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) , incluyendo CG6512 de Drosofila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; factores de crecimiento angiogénico, incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1) , factor de crecimiento de fibroblatos básico (FGF-2) , factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF) , factor de crecimiento por transformación-a (TGF a) , factor de necrsis tumoral alfa (TNF-a) , angiogenina, . interleucina-3 (IL-3) , interleucina-8 (IL-8) , factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF) , factor de crecimiento placentario (IPIGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas de midkina BB (PDGF) , fractalcina.

¦ Proteínas de estrés (proteínas de choque térmico) . Las HSPs se encuentran normalmente intracelularmente . Cuando se encuentran extracelularmente , es un indicador de que una célula ha muerto y ha derramado sus contenidos. Esta muerte celular no programada (necrosis) sólo ocurre cuando como resultado de trauma, enfermedad o lesión, y por lo tanto in vivo, HSPs extracelulares desencadenan una respuesta del sistema inmunológico que combatirá infección y enfermedad. Un específico doble que se une a HSP extracelular puede ubicarse en un sitio de enfermedad.

¦ Proteínas implicadas en transporte de Fe, tales como : O El receptor de Brambell (conocido también como FcRB) . Este receptor Fe tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para suministro. Las funciones incluyen el transporte de IgG de la madre al hijo a través de la placenta y la protección contra IgG de la degradación prolongando de esta manera su vida media en suero de IgG. Se cree que el receptor recicla IgG a partir de endosmas (véase Holliger et al. (1997) Nat . Biotechnol . 15 :632-6) .

O Otras proteínas implicadas en transporte de Fe incluyen el receptor de Fe neonato (FcRn) descrito en Gastinel et al. (1992) PNAS 89:638; y Roopenian et al. (2003) J. Immunol. 170:3528.

¦ Ligandos descritos en la presente pueden diseñarse para ser específicos para los objetivos anteriores sin requerir ningún incremento en o incrementar la vida media in vivo. Por ejemplo, los ligandos descritos en la presente pueden ser específicos para objetivos seleccionados de los anteriores los cuales sean específicos de tejidos, haciendo posible entonces la dirección específica a tejidos del ligando específico doble, o un anticuerpo de dominio que se una a un objetivo terapéuticamente relevante específico de tejidos, no obstante cualquier incremento en vida media, aunque esto puede ser el resultado. Además, cuando el anticuerpo de ligando o dominio se dirige al riñon o hígado, esto puede redirigir el ligando o anticuerpo de dominio a una vía de depuración alternativa in vivo. Por ejemplo, el ligando puede ser dirigido lejos de la depuración hepática a la depuración renal) .

Los polipéptidos útiles para incrementar la vida media incluyen, pero no están limitados a aquellos mostrados en el anexo 1. 7.2. Incremento de la resistencia a la degradación por proteasas También se describe en la presente que los anticuerpos de dominio PEGilados y multímeros de anticuerpos de dominio descritos en la presente poseen estabilidad incrementa contra la acción de proteasas. En presencia de pepsina muchos anticuerpos de dominio se degradan totalmente a pH 2 debido a que la proteína es desdoblada bajo las condiciones ácidas, haciendo entonces a la proteína más accesible a la enzima proteasa. En la presente se proporcionan moléculas de anticuerpo de dominio PEGiladas, incluyendo multímeros de anticuerpo de dominio, en donde se cree que el polímero de PEG proporciona protección de la estructura de base del polipéptido debido a la cobertura física de la estructura de base por el polímero de PEG, evitando de esta manera que la proteasa tenga acceso a la estructura básica del polipéptido y lo corte. En una modalidad un anticuerpo de dominio PEGilado que tiene un tamaño hidrodinámico más alto (por ejemplo, 200 a 500 kD) se genera como se describe en la presente, debido a que el tamaño hidrodinámico más grande confirmará un mayor nivel de protección contra la degradación por proteasas que un anticuerpo de dominio PEGilado que tenga un tamaño hidrodinámico más bajo. En una modalidad, un monómero o multímero de dominio variable de un solo anticuerpo enlazado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando es expuesto a una o más de pepsina, tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa, en donde si la proteasa es pepsina entonces la exposición se lleva a cabo a pH 2.0 durante 30 minutos, y si la proteasa es una o más de tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa, entonces la exposición se lleva a cabo a pH 8.0 durante 30 minutos. En una modalidad, un mónómero o multímero de anticuerpo de dominio enlazado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando es expuesto a pepsina a pH 2.0 durante 30 minutos, en un aspecto, no más de 5 minutos, y en otro aspecto, no se degrada en absoluto. En otra modalidad, un multímero de anticuerpo de dominio enlazado a PEG o a otro polímero (por ejemplo, hetero u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) descrito en la presente se degrada en menos de 5%, y es, en un aspecto, no degradado en absoluto en presencia de pepsina a pH 2.0 durante 30 minutos. En una modalidad ejemplar, un monómero o multímero de anticuerpo de dominio enlazado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando es expuesto a tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa a pH 8.0 durante 30 minutos, en un aspecto no más de 5% y en un aspecto más, no se degrada en absoluto. En una modalidad ejemplar adicional, un multímero de anticuerpo de dominio enlazado a PEG o a otro polímero (por ejemplo, hetero u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) descrito en la presente se degrada en no menos de 5%, y es, en un aspecto, no degradado en absoluto en presencia de tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa a pH 8.0 durante 30 minutos .

Las relaciones relativas de proteasa : anticuerpo de dominio de PEG pueden alterarse como se describe en la presente para lograr el nivel deseado de degradación como se describió arriba. Por ejemplo, la relación de proteasa a anticuerpo de dominio PEG puede ser de alrededor de 1:30, a aproximadamente 10:40, a alrededor de 20:50, a aproximadamente 30:50, a alrededor de 40:50, aproximadamente 50:50, alrededor de 50:40, aproximadamente 50:30, alrededor de 50:20, aproximadamente 50:10, alrededor de 50:1, aproximadamente 40:1 y alrededor de 30:1.

En consecuencia, en la presente se describe un método para reducir la degradación de anticuerpos de dominio que comprende enlazar un monómero o multímero de anticuerpo de dominio a un polímero de PEG de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas en la presente. Según se describe en la presente, el anticuerpo de dominio es degradado de no más de 10% en presencia de pepsina a pH 2.0 durante 30 minutos. En particular, un multímero de dAb enlazado a PEG es degradado en no más de 5% y en un aspecto, no se degrada en absoluto en presencia de pepsina a pH 2.0 durante 30 minutos. En una modalidad alternativa, el anticuerpo de dominio se degrada en no más de 10% cuando es expuesto a tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa a pH 8.0 durante 30 minutos, en un aspecto, no más de 5%, y en otro aspecto, no se degrada en absoluto.

La degradación de monómeros y multímeros de anticuerpo de dominio enlazados a PEG como se muestra en la presente puede medirse usando métodos que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, después de la incubación de un anticuerpo de dominio enlazado a PEG con pepsina a pH 2.0 durante 30 minutos. O con tripsina, elastasa, quimiotripsina o carboxipeptidasa a pH 8.0 durante 30 minutos, las muestras de anticuerpo de dominio pueden ser analizadas mediante filtración en gel, en donde la degradación del monómero o multímero de anticuerpo de dominio es evidenciada por una banda en gel de un peso molecular más pequeño que un anticuerpo de dominio no degradado (es decir, anticuerpo de dominio de control no tratado con pepsina, tripsina, quimiotripsina, elastasa o carboxipeptidasa) . El peso molecular de las bandas de anticuerpo de dominio en el gel puede determinarse al comparar la migración de la banda con la migración de una escalera de peso molecular (véase figura 5) . Otros métodos para medir la degradación de proteínas se conocen en la técnica y pueden adoptarse para evaluar los monómeros y multímeros de anticuerpo de dominio enlazados a PEG como los descritos en la presente. 8. Usos de anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio descritos en la presente son útiles para antagonizar la actividad de CD28. Por lo tanto, los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden usarse para tratar un paciente que tenga una afección, enfermedad o trastorno mediado completamente o en parte por actividad CD28.

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos en los cuales está implicada una activación inadecuada de una vía mediada por CD28. Los anticuerpos de dominio descritos en la presente también son útiles para el tratamiento, prevención o alivio de síntomas de enfermedades o trastornos en los cuales la activación inadecuada de una vía mediada por CD28 está implicada.

En un aspecto, las enfermedades autoinmunes incluyen frecuentemente regulación o actividad inadecuada de las vías de CD28. La administración de un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente a un individuo que sufra de esta enfermedad, incluyendo una enfermedad autoinmune, puede reducir una o más síntomas de la enfermedad. Ejemplos no limitativos de enfermedades para las cuales los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden ser terapéuticamente útiles e incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad de Addison, alergia, espondilitis anquilosante, asma, aterosclerosis , enfermedades autoinmunes del oído, enfermedades autoinmunes del ojo, gastritis atrófica autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, parotitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, aniitis linfocítica benigna, colitis, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), diabetes, incluyendo diabetes tipo 1 y/o tipo 2, epididimitis , glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barre , enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), respuesta inmunitaria a productos de fármaco recombinantes , por ejemplo, factor VII en hemofilia, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, infertilidad masculina, enfermedad de tejidos conectivos mixtos, esclerosis múltiple, miastenia grave, mixedema primario, pénfigo, anemia perniciosa, polimioscitis, psoriasis, artritis psoriásica, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , oftalamia simpática, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T antiocéntrico testicular, tiroiditis, rechazo de transplantes, colitis ulcerosa, uveítis autoinmune y vasculitis. Las afecciones mediadas autoinmunológicamente incluyen, pero no están limitadas a, afecciones en las cuales el tejido afectado sea el objetivo primario, y en algunos casos, el objetivo secundario. Estas afecciones incluyen, pero no están limitadas a, SIDA, alergia atópica, asma bronquial, eczema, lepra, esquizofrenia, depresión heredada, transplante de tejidos y órganos, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Alzheimer, mal de Parkinson, infarto de miocardio, apoplejía, autismo, epilepsia, fenómeno de Arthus, anafilaxis y adicción a alcohol y drogas.

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente también pueden ser terapéuticamente útiles en enfermedades relacionadas con injertos, tales como enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , rechazo agudo de transplantes y rechazo de transplantes crónico.

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente son además útiles en la manera en la que generalmente cualquier preparación de anticuerpos es útil, por ejemplo, para usos de formación de imágenes o diagnóstico in vivo, usos de diagnóstico in vitro, etc.

Para estos y otros usos puede ser deseable marcar los anticuerpos de dominio, por ejemplo, con un marcador fluorescente, colorimétrico, enzimático o radioactivo. Los métodos para marcar anticuerpos de dominio se conocen bien en la técnica. 9. Composiciones farmacéuticas, dosis y administración Los anticuerpos de dominio mostrados en la presente pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica . comprende un anticuerpo de dominio y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. El término "portador farmacéuticamente aceptable" excluye medio de cultivo de tejidos que comprende suero de bovino o caballo. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina de pH regulado con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o reguladores de pH, los cuales incrementan la vida en anaquel o efectividad del anticuerpo de dominio.

Las composiciones descritas en la presente pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusionables) , dispersiones o suspensiones, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y la aplicación terapéutica. Las composiciones que se prefieren típicas están en forma de soluciones inyectables o infusionables, tales como composiciones similares a aquellas usadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal , intramuscular) .

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Soluciones inyectables estériles pueden prepararse al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente adecuado con una o una combinación de ingredientes enumerados arriba, según se requiera, seguida por esterilización en filtro. Generalmente, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensióactivos .

Los anticuerpos de dominio descritos en la presente pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración que se prefiere es inyección o infusión intravenosa. El polipéptido también se puede administrar mediante inyección intramuscular o subctuánea.

Como se apreciará por la persona capacitada, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un portador que proteja al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, y sistemas de suministro microencapsulados. Los anticuerpos de dominio están muy adaptados para su formulación como preparaciones de liberación extendida gracias, en parte, a su tamaño pequeño, el número de moles por dosis que puede ser significativamente más alto que la dosis de, por ejemplo, anticuerpos de tamaño completo. Polímeros biodegradables y biocompatibles pueden ser usados, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede lograrse al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Cntrolled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978: Métodos adicionales aplicables a la liberación controlada o extendida de agentes polipéptidos tales como los anticuerpos de dominio monovalentes descritos en la presente se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6,306,406 y 6,346,274, así como, por ejemplo, en las patente de E.U.A. Nos. de publicación US20020182254 y US20020051808 , todas las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia para todos los propósitos.

Los compuestos activos adicionales también pueden incorporarse en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo de dominio es co- formulado con y/o coadministrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, un anticuerpo de dominio puede ser co-formulado y/o co-administrado con uno o más anticuerpos adicionales que se unan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unan a otras citocinas o que se unan a moléculas de superficie celular), o, por ejemplo, una o más citocinas. Estas terapias de combinación pueden utilizar dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así, posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diferentes monoterapias .

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo de dominio. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de dominio puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de dominio para desarrollar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o dañino del anticuerpo o porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa inicial de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, un solo bolo puede ser administrado, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es adecuado formular composiciones parenterales en forma de dosis única para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosis única según se usa en la presente se refiere a unidades físicamente descritas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Una escala no limitativa de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo de dominio es 0.1-20 mg/kg, y en un aspecto, 1-10 mg/kg. Debe notarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la afección que será aliviada. Se debe entender además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional del médico que administre.

La eficacia del tratamiento con un anticuerpo de dominio como el descrito en la presente se juzga por el médico experto sobre la base de la mejora en uno o más síntomas o indicadores del estado de enfermedad o trastorno que se esté tratando. Una mejora de al menos 10% (incremento o reducción, dependiendo del indicador que se esté midiendo) en uno o más indicadores clínicos se considera "tratamiento efectivo", aunque mejoras mayores son incluidas, tal como aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, o incluso 100%, o, dependiendo del indicador que se esté midiendo, más del 100% (por ejemplo, dos veces, tres veces, diez veces, etc., hasta e incluyendo el logro de un estado libre de enfermedad. Los indicadores pueden ser mediciones físicas, por ejemplo, niveles de enzimas, citocinas, factores de crecimiento o metabolitos, índice de crecimiento celular o muerte celular, o la presencia o cantidad de células anormales. También se pueden medir, por ejemplo, diferencias en la cantidad de veces entre apariciones de síntomas de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, para enfermedades en remisión/recaída, tales como esclerosis múltiple) . Como alternativa, se puede confiar en las mediciones no físicas, tales como una reducción reportada en dolor o incomodidad u otro indicador de estado de enfermedad, para ponderar la efectividad del tratamiento. Cuando se hacen mediciones no físicas, varias escalas o índices clínicamente aceptables pueden ser usados, por ejemplo, el índice de actividad de enfermedad de Crohn, o CDAI (Best et al. (1976) Gastroenterology 70:439), que combina tanto indicadores físicos, tales como hematocrito y el número de líquido y el número de heces líquidas o muy blandas, entre otros, con factores reportados por pacientes tales como la severidad de dolor abdominal o calambres y bienestar general, para asignar una puntuación de enfermedad.

La eficacia del tratamiento para psoriasis, por ejemplo, se puede monitorear usando el índice de Psoriasis de Salford (SPI) o índice de Severidad de Área de Psoriasis (PASI) . El PASI es un método más comúnmente usado para evaluar la severidad de la enfermedad de psoriasis en pruebas clínicas, aunque puede ser exageradamente problemático de usar en la práctica clínica diaria. El método incluye que el peso corporal se divide en cuatro secciones (piernas, las cuales tienen el 40% de la piel de una persona; el cuerpo (área del tronco: estómago, pecho, espalda, etc.) con 30%; los brazos (20%); y la cabeza (10%)). Cada una de estas áreas es calificada por sí misma, y después las cuatro puntuaciones se combinan para dar el PASI final. Para cada sección, el porcentaje de área de piel implicado, se calcula y luego se transforma en un grado de 0 a 6 : 0% de área no implicada, grado: 0 <10% de área implicada, grado: 1 10-29% de área implicada, grado: 2 30-49% de área implicada, grado: 3 50-69% de área implicada, grado: 4 70-89% de área implicada, grado: 5 , 90-100% de área implicada, grado: 6 La severidad se calcula mediante cuatro parámetros diferentes: comezón, eritema (enrojecimiento), escaraación y grosor (la piel psoriásica es más gruesa que la piel normal) . Los parámetros de severidad se miden en una escala de 0 a 4, de ninguno a má imo .

La suma de los cuatro parámetros de severidad se calcula entonces para cada sección de piel, se multiplica por la puntuación de área para esa área y se multiplica por el peso de la sección respectiva (0.1 para cabeza, 0.2 para brazos, 0.3 para cuerpo y 0.4 para piernas). Ejemplo: ( Icabeza+Ecabeza+Scabeza+Tcabeza) x Acabeza x 0.1 Totalcabeza.

Al final del PASI total se calcula como una suma de PASIs para las cuatro secciones de piel. Medición auxiliada por computadora de área de lesión psoriásica se encontró que mejora la potencia de la prueba clínica, en comparación con el enfoque estándar. Los cálculos de los médicos sobre el área de lesión psoriásica tienden a ser exagerados. El índice PASI adaptado, en donde el área psoriásica no se convirtió en un grado de área, sino que se mantuvo como una variable continua, mejoró también la potencia de la prueba clínica. El PASI modificado que incluye medición de área auxiliada por computadora como una variable continua es llamado: Puntuación de área y severidad continua de psoriasis auxiliada por computadora cPcASI .

La eficacia del tratamiento para rechazo de transplante de órganos también puede monitorearse. Las tasas de supervivencia de pacientes de transplante de órgano (actualmente alrededor de 70-85% durante 5 años para todos los órganos transplantados) han mejorado como resultado de los avances en la conservación de órganos y tratamientos inmunosupresores . Sin embargo, el rechazo de órganos, especialmente el rechazo agudo que ocurre en las primeras pocas semanas después de la cirugía, así como rechazo de injerto crónico, es aún una de las principales causas de insuficiencia funcional de transplante de órganos. El diagnóstico actual o la confirmación de rechazo de injerto después del transplante de órganos sólidos requiere la biopsia de tejido para detectar la infiltración de células inmunes (por ejemplo, células T, macrófagos, etc.) en el injerto y otros cambios patológicos. Una biopsia tisular no sólo es invasiva, sino que también está asociada con riesgo a la salud incrementada para el paciente y es propensa a errores de muestreo que pueden llevar a resultados falsos negativos. Como alternativa se están desarrollando métodos no invasivos, tales como formación de imágenes por resonancia magnética (RMI) que pueden usarse para monitorear la acumulación de células inmunes en el órgano rechazado (Ho et al., (2004) Curr. Pharm. Biotech. , 5:551-566).

Según se usa el término en la presente, "profilaxis" llevada a cabo usando una composición como la descrita en la presente es "efectiva" si el inicio o severidad de uno o más síntomas se retrasa o se reduce en al menos 10%, o se detiene, en relación a estos síntomas en un individuo similar (modelo humano o animal) no tratado con la composición .

Mientras que los anticuerpos de dominio descritos en la presente se unen a CD28 humana, en donde uno es para evaluar su efecto en un sistema de modelo animal, el polipéptido debe reaccionar en forma cruzada con uno o más antígenos en el sistema modelo animal, en un aspecto, a alta afinidad. Alguien de capacidad en la técnica puede determinar fácilmente si esta condición es satisfecha para un determinado sistema de modelo de animal y un anticuerpo de dominio dado. Si esta condición es satisfecha, la eficacia del anticuerpo de dominio puede examinarse al administrarlo a un modelo animal bajo condiciones que imiten un estado de enfermedad y monitoreando uno o más indicadores de ese estado de enfermedad para una mejora de al menos 10%. 10. Modelos animales Anticuerpos de dominio como los descritos en la presente son útiles para el tratamiento de trastornos autoinmunes en los cuales la señalización de CD28 es inadecuadamente activa. Hay varios modelos animales en los cuales se puede evaluar la eficacia terapéutica de un anticuerpo de dominio dado, como se describe a continuación. 10.1 Modelo de enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (ratones CD4+ CD45RBhigh a SCID O Rag ") -modelo crónico Un modelo de IBD incluye usar la inmunidad en mucosa y sistema de inflamación descritos por Winter et al. (1999) Am. J. Physiol . 276 :G1317-1321. Brevemente, IBD es un trastorno inmune multifactorial de etiología incierta. Varios modelos de ratón de inflamación de mucosa que simulan IBD han proporcionado una luz a los mecanismos que rigen la función inmune mucosa tanto normal como patológica. En un aspecto, la inyección en ratones inmunodeficientes de un subconjunto de linfocitos T CD4 (+ ) , las células CD4 (+) CD45RBhigh, lleva a la inflamación del intestino. La patogénesis se debe en parte a la secreción de citocinas pro-inflamatorias. En otro aspecto, la inducción de colitis puede evitarse mediante co-transferencia de otra sub-población de CD4 ( + ) . Las células CD4 ( + ) CD45RBlow T. Esta población se comporta de manera análoga a la población CD4 (+) CD45RBhigh en términos de la adquisición de marcadores de activación y el regreso al intestino del hospedero. Sin embargo, su perfil de linfocinas cuando es activado es diferente, y las citocinas anti-inflamatorias secretadas y/o inducidas por células T CD4 (+) CD45RBlow previenen colitis. De Winter et al'. , proporcionan la descripción del modelo de transferencia adoptivo y los factores que promueven y previenen patogénesis en colitis. 10.2. Modelo de artritis espontánea en RN TCR Tg cruzado con ratones NOD - modelo crónico Un modelo de enfermedad específico de órganos provocado por autoinmunidad sistémica se proporciona por Kouskoff et al. (1996) Cell 87:811-822. La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad crónica de las articulaciones caracterizada por invasión de leucocitos y activación de sinoviocitos seguida por destrucción de cartílago y hueso. La etiología y patogénesis de RA se entienden deficientemente. Kouskoff et al., presentan un modelo de ratón espontáneo de RA, generado al cruzar una línea transgénica del receptor de células T (TCR) con la cepa NOD. Toda la progenie desarrolla una enfermedad de articulaciones altamente reminiscente de RA en el hombre. El activador para el trastorno en murinos es el reconocimiento de probabilidades de una molécula clase II de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) derivada de NOD por la TCR transgénica; la progresión a artritis implica células T CD4+, B y probablemente mieloides. 10.3. Artritis inducida por colágeno en ratón - modelo crónico Un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno es provisto por Brand et al. (2004) Methods Mol. Med. 102:295-312. Brevemente, artritis inducida por colágeno (CIA) es una enfermedad autoinmune experimental que puede ser desarrollada en cepas susceptibles de roedores (rata y ratón) y primates no humanos por inmunización con colágeno tipo II (CII), la principal proteína constituyente de cartílago articular. Después de la inmunización, los animales desarrollan una poliartritis autoinmune que comparte varias características clínicas e histológicas con RA. La susceptibilidad a CIA en roedores está ligada a las moléculas clase II del complejo de histocompatibilidad mayor (NHC) , y la respuesta inmune a CII se caracteriza tanto por la estimulación de células T específicas de colágeno como por la producción de altos títulos de anticuerpos específicos tanto para el inmunógeno (CII heterólogo) como para el autoantígeno (CII de ratón) . Histológicamente, CIA en murinos se caracteriza por una intensa sinovitis que corresponde precisamente al inicio clínico de artritis. Estos datos experimentales son útiles para evaluar CIA debido a las similitudes patológicas entre CIA y RA. 10.4. Proliferación de células T in vivo inducida por antígenos - modelo agudo El uso de transferencia adoptiva de células T-antígeno-receptor-células T transgénicas para el estudio de la activación de células T in vivo proporciona un modelo para la proliferación de células T inducida por antígenos. Pape et al., (1997) Immunol . Rev. 156:67-78 describen la transferencia adoptiva de células T transgénicas de TCR que expresan uniformemente una TCR identificable de especificidad de péptidos/MHC conocida pueden usarse para monitorear el comportamiento in vivo de células T específicas de antígenos. El sistema se usó para demostrar que células T naives son activadas inicialmente dentro de las zonas de células T de tejido linfoide secundario para proliferar de una manera dependiente de B7. Si adyuvantes o citocinas inflamatorias están presentes durante este periodo, números incrementados de células T se acumulan, migran a folículos ricos en células B, y adquieren la capacidad de producir IFN-gama y células B auxiliares producen IgG2a. Si está ausente inflamación, la mayoría de las células T específicas de antígeno activadas inicialmente desaparecen sin entrar en los folículos, y los sobrevivientes son productores deficientes de IL-2 e IFN-gama .

Ej emplos Ejemplo 1 Selección de anticuerpos de dominio de unión Selecciones de anticuerpos de dominio de unión (dAbs) se llevaron a cabo con quimera CD28/FC humana recombinante (R&D) Systems, Abingdon, Reino Unido) . La biblioteca de anticuerpos de dominio usada para selecciones se basó en una sola estructura VH humana (V3-23 aka DP47 y JH4B) y una sola estructura VL humana (012/02 alias DPK9 y JKl) . Los genes dAb fueron enlazados genéticamente a la proteína de gen III de fago fd bajo el control de la secuencia líder GAS1 en el vector pD0M4 (figura 1) que contenía todos los genes ^fd necesarios para generar partículas de fago infecciosas. La primera ronda de selección de fagos se llevó a cabo al premezclar biblioteca de fagos (4 fondos para las bibliotecas VH [VH11-13, VH14-15, VH16-17, VH18-19] y un solo fondo para la biblioteca VK) con 2% de MPBS (Solución Salina de pH Regulado con Fosfato complementada con 2% de leche en polvo descremada deshidratada Marvel) y añadiendo CD28-FC (R&D Systems, Reino Unido) hasta una concentración final de 100 nM. La mezcla se incubó durante al menos 1 hora a temperatura ambiente con mezclado extremo sobre extremo y luego los complejos antígeno-fago fueron capturados usando Protein G Dynabeads (Dynal, Suecia) y se lavaron 8 veces con 1 mi de PBST (PBS complementado con 0.1% de Tween 20) seguido por un solo lavado en 1 mi de PBS. Los fagos lavados fueron eluidos del complejo antígeno-esfera al incubar con 0.5 mi de 1 mg/ml de tripsina tipo XIII de páncreas bobino (Sigma Aldrich, Reino Unido) en PBS (complementado con 5 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mM de CaCl2) . Los fagos eluidos se usaron para infectar E. coli y los títulos de fagos de salida se determinaron como de entre lxlO4 a 1x10s unidades de título (t.u.)/ml, en donde t.u./ml es una medida de partículas de fago infecciosas por mi. Una medición de t.u. se determina a través de la infección de E. coli con fagos de una dilución dada, seguida por crecimiento de E. coli infectadas en placas de agar selectivas .

Una segunda ronda de selección se llevó a cabo usando fagos enriquecidos recuperados de la ronda de selección previa con una concentración final de 50 nM de CD28-Fc seguida por captura usando esferas de proteína G como se describió arriba. Los títulos de salida estuvieron en la escala de lxlO6 a lxlO9 t.u./ml.

Una tercera ronda de selección usando 10 nM de CD28-Fc seguida por captura usando esferas de proteína G se llevó a cabo. Los títulos de fago eluidos estaban en la escala de 2xl09 a 8xl09 t.u./ml.

ELISAs de fagos monoclonales se llevaron a cabo después de las rondas de selección 2 y 3. Todos los lavados se llevaron a cabo usando 3 lavados de 250 µ? de PBST seguidos por 3 lavados de 250 µ? de PBS . Las placas fueron recubiertas durante la noche a 4°C con 1 mg/ml y 0.6 mg/ml de CD28-FC en PBS respectivamente. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con 2% de MPBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y los sobrenadantes de fagos se añadieron a un volumen igual de 2% de MPBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y los fagos unidos se detectaron con un conjugado anti-M13 -HRP (GE Healthcare, Reino Unido) diluido 1:5000 en 2% de MPBS e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y la ELISA se reveló usando una solución de SureBlue 1-Component. TMB Micro ell Peroxidase (KPL Inc, E.U.A.). Los fagos específicos se identificaron mediante comparación con una placa recubierta con 1 mg/ml de Fe (Sigma Aldrich, Reino Unido) . Después de la ronda 2, los fagos específicos fueron identificados principalmente en los fondos de biblioteca VH14-15, VH18-19 y VK, mientras que para la ronda 3, pocos fagos específicos permanecían. Todas los 2 fondos de ronda se subclonaron en ) pD0M5 (figura 2) y se tamizaron como fagos solubles. La ELISA de fagos se muestra en la figura 3.

Ejemplo 2 Identificación de secuencias para unión a dAbs Los dAbs que se unen se identifican como sigue.

Noventa y seis colonias individuales (pD0M5) fueron recogidas de cada una de las salidas VH14-15, VH18-19 y VK y expresadas en 200 µ?? de Terrific Broth que contenía medio OnEx de autoinducción (Novagen, Reino Unido) durante la noche a 37°C con agitación a 250 rpm en grupos de cultivo de células de 96 pocilios Costar Well Cell Culture Clusters (Corning Incorporated, E.U.A.). Los cultivos se centrifugaron para sedimentar las células y los sobrenadantes se ensayaron mediante ELISA de unión a antígenos para dAbs de unión a CD28. Inmnunoplacas Maxisorp de 96 pocilios (Nunc, E.U.A.) fueron recubiertas durante la noche a 4°C con 1 mg/ml de CD28-Fc en PBS y luego lavadas. Todos los lavados fueron como se describió para la ELISA de fagos. Las placas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 µ? de PBS que contenía 1% de Tween 20 y luego se lavaron. El sobrenadante de cultivo que contenía dAb aclarado se añadió a la placa de ELISA en presencia ya sea de proteína A para VH (Sigma, Reino Unido) o proteína L para VK (Sigma, Reino Unido) para incrementar la potencia de la señal de ELISA al entrelazar los dAbs de VH y VK respectivamente. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron. dAb unido se detectó usando un proceso de dos etapas, primero 9E10 (anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, Reino Unido) diluido 1:2000 en PBST se añadió durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó, seguido por Fc-HRP anti-ratón diluido 1:2000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y la ELISA se reveló usando la solución SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase (KPL Inc, E.U.A.) y el color se dejó de revelar. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de un volumen igual de HCL 1M y la placa de ELISA se leyó a 450 nm. Los clones específicos de CD28 se identificaron mediante comparación con una placa de control recubierta con Fe solo (véase figura 4 para el ejemplo de ELISA soluble) . Todos los clones específicos fueron secuenciados en ADN e inicialmente 28 clones únicos se identificaron (véase apéndice para secuencias) . Dos placas adicionales de sobrenadantes de dAb fueron tamizados para unión a CD28-Fc mediante análisis BIAcore (GE Healthcare, Reino Unido) . A partir de este análisis, 30 secuencias únicas adicionales fueron identificadas .

Las secuencias de aminoácidos de dAb en los siguientes ejemplos no necesariamente corresponden exactamente a las secuencias de dAb descritas en el listado de secuencias. En algunos casos, las secuencias de aminoácidos de dAb pueden contener residuos de aminoácido adicionales en el N-terminal de la proteína, los cuales se introduzcan para facilitar la clonación en un vector de expresión. En los ejemplos 5, en adelante, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de dAb expresada recombinantemente puede contener una secuencia Ser-Thr en el N-terminal. Estos residuos de N-terminal adicionales no se cree que afecten la actividad biológica de los dAbs.

Ejemplo 3 Caracterización de propiedades de unión dAb Para caracterizar la actividad de unión de los dAbs secuenciados , todos los 58 clones son expresados y purificados y probados en el BIAcore contra un chip CM5 recubierto con 12,500 RU (unidades de respuesta) de CD28-Fc. Un total de 9 clones mostraron unión, incluyendo DOM21-4, DOM21-6, DOM21-18, DOM21-20, DOM21-22, DOM21-27 y DOM21-28 (véase figura 5 para trazos de BIAcore) y DOM21-38 y DOM21-44.

Las concentraciones de proteína usadas para el análisis BIAcore fueron las siguientes: DOM21-4 42.3 µ? DOM21-6 68.1 µ? DOM21-18 13.8 µ? DO 21-20 57.5 µ? D0M21-22 19.4 µ? DOM21-27 14.7 µ? DOM21-28 16.6 µ? Varios dAbs descritos y caracterizados en la presente han sido alineados para comparar la identidad de secuencia con la actividad observada: DOM21-18 (VK) y lh-239-891 (VK) son 82.4% idénticas DOM21-28 (VK) y lh-239-891 (VK) son 83.3% idénticas .

DOM21-28 (VK) y lh-239-850 (VK) son 85.2% idénticas. lh-239-891 (VK) y lh-239-850 (VK) son 96.3% idénticas .

DOM21-4 (VH) y lh-99-238 (VH) son 81.7% idénticas. DOM21-20 (VH) y lh-99-238 (VH) son 78.9% idénticas. DOM21-4 (VH) y lh-239-850 (VK) son 23.9% idénticas. 1 50 lh-239-891 (1) DIQJCTQSPSS^ DOM21-18 (1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCI^SQYIGTSLI^WYQQKPGKAPKI^TyQ 51 " " 100 lh-239-891 (51) fSRl^GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQWANPATFSQ DOM21-18 (51) ASIiQS^SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCCK-LAIiRPMTFGQ 101 lh-239-891 (101) GTKVEI R (SEQ ID NO: 476) D0M21-18 (101) GTKVEIKR (SEQ ID NO: 455) 1 50 lh-239-891 (1) DIQIOTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPI PFl^vrYQQKPGKAPKLLIYg DOM21-28 (1) DIQM QSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKliLIYy 51 100 lh-239-891 (51) TSRLRHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNBANPATFSQ D0M21-28 (51) ASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQG2TTPFTFGQ 101 lh-239-891 (101) GTKVEIKR (SEQ ID NO: 476) DOM21-28 (101) !GT VEIKR (SEQ ID NO: 456) 1 50 lh-239-850 (1) DIQMTQSPSSLSASVGDRV ITCI^SRPIWPFIjEWyQQKPG AP LLIYjj DOM21 -28 (1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLV YQQKPGKAPKLLIYgj 51 100 lh-239-850 (51) TSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNSg PATFSQ DOM21 -28 (51) ASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGjgTPFTFGQ 101 lh-239-850 (101) GTKVEIKR (SEQ ID NO: 58) DOM21 -28 (101) GTKVEIKR (SEQ ID NO: 456) 1 50 lh-99-238 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSijRLSCAÁSGFTro DOM21-4 ( 1 ) EVQLLESGGGLVQPGGSI-RLSCAASGFT SRYH^^ 51 100 lh-99-238 (51) l SGjgQT¡|YAPSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSP DOM21-4 (51) l|LGj¡QT | ADSVKGR^ 101 120 lh-99-238 (101) FGPLY^FDYRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 273) DOM21-4 (101) G gFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 401) 1 50 lh-239-850 (1) ggQ^TQSPSSLSASVGDRjTfjgjCRASRPlgP--F^E YQQKPGK g DOM21- ( i ) ^Q LES-GGGLVQPGGS2R^CAASGFT SRYH2AWVRQAPGKGLEWVg 51 100 lh-239-850 (44) PKLL|YFTgRLQSGVPSRFSGSGSG--TDFTLT|sSLQPEDFATYYCLQN DOM21-4 (50) VIDS2GLQ§YYADSVKGRF¾ISRDNSKNTLYLQ¿NSLRAEDTAVYYCAEY 101 117 lh-239-850 (92) VSMPATgSQGTKVEgKR (SEQ ID NO: 58) DOM21-4 (100) GGAFDYgGQGTLyTgSS (SEQ ID NO: 401) Ejemplo 4 Ensayo de actividad de dAb in vi tro La actividad de dAb se probó in vitro como sigue. Siete de los dAbs (DOM21-4, DOM21-6, DOM21-18, DOM21-20, DOM21-22, DOM21-27 y D0M21-28) fueron expresados y purificados en una escala más grande. Muestras de dAbs depletados de endotoxinas a una concentración general de 100 µ? se usaron para determinar si los dAbs podrían inhibir la actividad de CD28 en un ensayo in vitro a base de células similar a aquél descrito por Boulougouris , J". Immunol . 1998, 161(8): 3919-3924. Se llevaron a cabo ensayos de proliferación por triplicado en placas de 96 pocilios en un volumen final de 200 µ? por pocilio usando medio RPMI 1640 que contenía 10% de FCS y antibióticos. Células T CD4 positivas humanas (5 x 104) fueron cultivadas en presencia de 1 g/ml de anticuerpo anti-CD3 (0KT3) más células CHO transíectadas que expresaban ya sea CD80 o CD86 y dAb o anticuerpo de control a una escala de concentraciones. Los ensayos se incubaron a 37°C durante entre 18 horas a 72 horas en presencia de 1 Ci de [3H] -timidina por pocilio. Las células fueron cosechadas sobre placas de filtro de 96 pocilios usando un cosechador de 96 pocilios Packard (Meriden, CT) , y la absorción de [3H] -timidina se determinó mediante recuento por centelleo líquido. Cuatro dAbs, D0M21-4, DOM21-18, DOM21-20 y DOM21-28 mostraron actividad inhibitoria (figura 6) con D0M21-4 y DOM21-28 mostrando el mayor grado de inhibición (figura 7) .

La secuencia de ADN de los dAbs únicos identificados en el ensayo de unión a receptor como inhibiendo la unión de CD28 a CD80 o CD86 se detallan a continuación. Las secuencias de aminoácidos también se muestran abajo, con las regiones CDR para varios dAbs en negritas . >DOM21-l GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTACTCCGCAGGGTGATAGGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGCAAGCTGGTTGGAG TTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:l) >DOM21-2 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTGGATTATGAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTTCGAATGATGGCGCTGCTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATGATGCTGC TTTTGACTACTGGGGTCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCGAGCG (SEQ ID NO : 2) >DOM21-3 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGCGTATTCTATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTACGGGGAATGGTGGTTCTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGGAGGAGCC GTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO : 3) >DOM21-4 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTAGGTATCATATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTGATTGATTCTCTTGGTCTTCAGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATATGGTGGTGC GTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG (SEQ ID NO : 4) >DOM21-5 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTCATTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTACTCCGGATGGTCTTATTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCGGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTAGGTTGGT TGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG (SEQ ID NO : 5) >DOM21-6 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATTATGGTATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAATATTGGTCGGGCTGGTAGTGTTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCAGTCGTG GAGGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 6) >DOM21-7 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGCGTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGAGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATATATTGATGGGCGTGGTGCTGAGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTGATACTCT GATTTCTGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:7) >DOM21-8 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTAATTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTACTGGTCATACTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTTGGGCCTAA TAATCCTATGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:8) >DOM21-9 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGAGTTATGATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTTCGGCGGATGGTACGTTTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCTTCTTTTGA TAAGTATAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 9) >DO 21-10 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGGGGGCCGAC GTCGTCTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 10) >DOM21-ll GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGAGTATGGTATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTGATAATGTTGGTTCGGTGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTACGCCTGT TTTGCTGCCGCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 11) >DOM21-12 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATTCTTATAATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTTGAGTGGGTCTCAGCTATTGCGGCTAATGGTCGTGTGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGACGAATAT GGCGTATGGTAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 12) >DOM21-13 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCTGTATTCGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACATATTGATAGGGCTGGTATGATTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTTCTAATGC TGTTAATATGCAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID N0:13) >DOM21-14 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGTCATAGGCC TTCGACGCAGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGNCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 14) >DOM21-15 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGATTATAAGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATAAGGGTGGTATTATTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGTTTCCTAA GTTTCGGCCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG (SEQ ID NO:15) >DOM21-16 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATGGGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTAATCGTTCTGGTCTGGTTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCTGAATGG TCCTAATTTTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG (SEQ ID N0:16) >DOM21-17 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATCGTTATGCGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATGGTAATGGTCTGGTTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGACTAGGTC TCATTCTGATTCGGGTTGGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGC (SEQ ID NO:17) >DOM21-18 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGTATATTGGTACTTCGTTAAATTGGTACCAGCAGAAACCAGG GAAAGCCCCTAAGCTCCTGACCTATCAGGCTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGT 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GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATGGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTAGTCCTTCTGGTAATTATACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAATGGGTC TCTTCCGCCTCGTGGGTCTATTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGCG (SEQ ID NO:23) >DOM21-24 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGTATTACGAAGGGTGGTCGGGTGACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGGGTCCGTC GAGGATGCTTAATGAGCCGCTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGCG (SEQ ID NO:24) >DOM21-25 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGTATTATATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTGC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTGGGGCTAATGGTGCTCCTACATATTACGCA 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GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGTCTATTAGTCATTCGTTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGG GAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCTTCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAG ATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGGTATGACTACGCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACGGG (SEQ ID NO:28) >DOM21-30 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAGTTATGATATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCTGCTGATGGTCATTTTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCGGAGTAG TTTTGACT CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:29) >DOM21-31 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCT CCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGGGATTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTGATTCTCATGGTAATCGTACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC 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DOM21-6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYGMA VRQAPGKGLEWVSNIGRAGSVTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKVQS RTFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:408) DOM21-7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMGWVRQAPEKGLEWVSYIDGRGAETYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIDTLISEFDY GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:409) DOM21-8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPNYTMW VRQAPGKGLEWVSSISGTGHTTYYA DSVKGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFGPNNPMFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:410) DOM21-9 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFASYDMGWVRQAPGKGLEWVSAISADGTFTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDKY FDY GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:411) DOM21-10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKRGPTSSNFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:412) DOM21-11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYGMK VRQAPGKGLEWVSTIDNVGSVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKTTPVLLPLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:413) DOM21-12 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSY MGWVRQAPGKGLEWVSAIAA GRVTYYA DSVKGRF ISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAK TNMAYGSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:414) DOM21-13 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMAWVRQAPGKGLE VSHIDRAGMITYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSNAV MQFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID. O:415) DOM21-14 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKRHRPSTQDFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:416) DOM21-15 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYKMGWVRQAPGKGLEWVSWIDKGGIITYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMFPKFRPAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:417) DOM21-16 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSHINRSGLVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLNAPNFKFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:418) DOM21-17 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYAMG VRQAPGKGLE VSWIDGNGLVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTRSHSDSGWAFDY GQGTLVTVS S (SEQ ID NO:419) DOM21 - 19 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNY MGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSR LNEPLFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:420) DOM21-20 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLE VSTISPLGYSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDY GQGTLVTVS S (SEQ ID NO:421) DOM21-21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYDMAWVRQAPGKGLEWVSSIYAIGGNTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKLKSGMQTRLNSFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:422) DOM21-22 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFELYQMG VRQAPGKGLE VSTIMPSGNLTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMWSLNLGFHAAFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:423) DOM21-23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYGMG VRQAPGKGLEWVSGISPSGNYTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKGNGSLPPRGSIFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:424) D0M21-24 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNY MGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:425) DOM21-25 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYYMGWARQAPGKGLEWVSSIGANGAPTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKIRSLNR AEPVFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:426) DOM21-26 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYSMYWVRQAPGKGLEWVSQISPAGSFTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSKSFDYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO:427) DOM21-40 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKTYTMRWVRQAPGKGLEWVSTINSSGTLTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSYTFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:428) DOM21-41 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAMYSMKWVRQAPGKGLEWVSSISNAGDITYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESFRSRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:429) DOM21-42 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYLMGWVRQAPGKGLEWVSLIRMRGSVTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKHSLTTNLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:430) DOM21-43 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYMMAWARQAPGKGLEWVSIIGTTGTWTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTNAYESEFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:431) DOM21-44 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYTMVWVRQAPGKGLEWVSAIHFDGRTTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNE ASLKHFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:432) DOM21-45 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYMMGWVRQAPGKGLEWVSFINLPGGRTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTHGLTGYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:433) DOM21-46 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYG AWARQAPGKGLE VSSIGMHGDTTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVCGATYCNFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:434) DOM21-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYVMAWVRQAPGKGLEWVSIIDSLGSTTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGLLVHYDFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:435) DOM21-48 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEVYGMSWARQAPGKGLEWVSLIDAGGR TYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTRAYSDYFDY GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:436) DOM21-49 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYDMHWVRQAPGKGLEWVSGITTHGRRTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKSDNLNMNVDFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:437) DOM21-50 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFIKYDMC ARQAPGKGLEWVSCIESSGQNTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKCLNDSC VHFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:438) DOM21-51 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMG VRQAPGKGLE VSDIGRYGRVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKTQRMV PSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:439) DOM21-52 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSYSMGWVRQAPGKGLEWVSIISGQGTVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKSPMVFALDGRSFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:440) DOM21-53 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSEYSMGWVRQAPGKGLEWVSSITPVGVFTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRPGPHG SFRFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:441) DOM21-54 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYMMG VRQAPGKGLE VSTIDKSGYSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIDSRGLMTKFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:442) DOM21-55 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYRMAWVRQAPGKGLE VSSILSDGAVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAKPGGNAWSTRVTFDYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:443) DOM21-57 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTMYGMHWVRQAPGKGLE VSSISQYGLSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKGSMRRVFSSSDTFDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO:444) DOM21-59 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:445) DOM21-60 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMG VRQAPGKGLE VSRIDSHGNRTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA HMTGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:446) DOM21-61 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMG VRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:447) DOM21-62 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:448) DOM21-63 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:449) DOM21-64 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:450) DOM21-65 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKLGV FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:451) DOM21-66 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 452) DOM21-67 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQ VRQAPGKGLE VSRISANGHDTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 453) DOM21-68 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDY GQGTLVTVSS ( SEQ ID NO:454) DOM21-18 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:455) DOM21-28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLV YQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:456) DOM21-18 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQ PGKAPKLLTYQASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:457) DOM21-27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTTLQPFTFSQGTKVEIKR (SEQ ID NO:458) DOM21-28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:459) DOM21-58 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGDRLHWYQQKPGKAPKLLIYRISRLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFGLYPTTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:460) DOM21-30 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLE VSQISADGHFTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:461) DOM21-31 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO:462) DOM21-32 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:463) DOM21-33 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:464) DOM21-34 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:465) DOM21-35 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMI VRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO:466) DOM21-36 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGV FDY GQGTLVTVSS (SEQ ID N0:467) DOM21-37 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSI IRVPGSTTYYA DSVKGRFTISRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:468) DOM21-38 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQ VRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:469) DOM21-39 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMG VRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:470) DOM21-56 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFTYXMAWVRQAPGKGLEWVSSITPLGYNTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSDV VSPLPSFDYWGRGTLVTVS S (SEQ ID NO-.471) Los siguientes dAbs de VH y VK adicionales se prepararon, aislaron y caracterizaron. Las secuencias de aminoácidos de varis dAbs se muestran a continuación, con las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 para varios dAbs en negritas. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 para varios dAbs también se muestran por separado.

VK dAbs: lh-239-850 (SEQ ID NO:58) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR lh-35 (SEQ ID NO:59) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALS YQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-36 (SEQ ID NO:60) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR lh-79 (SEQ ID N0:61) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLA YQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR lh-80 (SEQ ID NO:62) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR lh-83 (SEQ ID NO:63) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVSSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRAAPFTFGQGTKVEIKR lh-108 (SEQ ID NO:64) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRRSHLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR lh-203 (SEQ ID NO:65) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSVLAWYQQKPGKAPKLLIYFSSILQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALRSPFTFGQGTKVEIKR lh-207 (SEQ ID NO:66) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLA YQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR lh-238 (SEQ ID NO:67) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINASLG YQQKPGKAPKLLIYWASQLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMVRTPFTFGQGTKVEIKR lh-239 (SEQ ID NO:68) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLE YQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNATNPA FGQGTKVEIKR lh-18-1 (SEQ ID NO:69) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASFLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR lh-18-2 (SEQ ID NO:70) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSR FSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR lh-18-3 (SEQ ID NO:71) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSL WYQQKPGKAPKLLTYRASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR lh-18-4 (SEQ ID NO:72) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLN YQQKPGKAPKLLAYQASLLQSGVPSR FSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR lh-18-5 (SEQ ID NO:73) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAMRPMTFGQGTKVEIK lh-18-6 (SEQ ID N0:74) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLN YQQKPGKAPKLLIYQASLLQSGVPSR FSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR lh-28-1 (SEQ ID NO:75) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIY ASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMSTPFTFGQGTKVEIKR lh-28-2 (SEQ ID NO:76) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLV YQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTAPFTFGQGTKVEIKR lh-31 (SEQ ID NO:77) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGYSLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTQRTPFTFGQGTKVEIKR lh-32 (SEQ ID NO:78) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGHGLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSLLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLSKPFTFGQGTKVEIKR lh-33 (SEQ ID NO:79) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSNIHNRLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCRQWIQPPWTFGQGTKVEIKR lh-34 (SEQ ID NO:80) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPLR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR lh-35 (SEQ ID N0:81) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-35-15 (SEQ ID NO:82) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYLQKPGKAP LLIYRASNLQSGVPSR FSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-35-2 (SEQ ID NO:83) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-35-5 (SEQ ID NO:84) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSAISWYQQKPGRAPKLLIYRASYLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVGIKR lh-35-7 (SEQ ID NO:85) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSR FSGSGYGTGFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-35-9 (SEQ ID NO:86) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNMQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR lh-36 (SEQ ID NO:87) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSR 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Ensayos de citocinas de respuesta a linfocitos mixtos Para los experimentos de MLR que miden citocinas en varis puntos de tiempo en respuesta a MoDCs como células estimuladoras, los ensayos se llevaron a cabo mediante la combinación de 1.5 x 105 células T/pocillo de una placa de 96 pocilios de fondo redondo con 1.5 x 104 MoDCs alogeneicos en un volumen total de 300 de 10% FCS-RPMI. Las titulaciones de anticuerpos de dominio CD28, abatacept o belatacept se agregaron por triplicado para medir la liberación de citocinas 24, 48 y 72 horas después del inicio de la MLR. IL-2 y TNF- fueron detectados en el sobrenadante mediante kits de revelado DuoSet ELISA (R&D Systems, Minneapolis, M ) . IFNy se midió utilizando anticuerpos apareados y citocina recombinante de Pierce Biotechnology (Rockford, IL) . Todos los kits y Abs se utilizaron según las recomendaciones del fabricante. Las placas de ensayo fueron procesadas y leídas en un espectrofotómetro SpectraMax Plus (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA) . Los datos fueron analizados utilizando el software de Softmax mediante comparación con una curva estándar generada con citocinas recombinantes a concentraciones conocidas.

Ensayo reportero de IL-2 ("Ensayo de luciferasa") Células Jurkat-CA transíectadas con el gen de luciferasa bajo el control del promotor de IL-2 se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies, Inc. en Gaithersburg, MD) , con 10% de FCS (Cumbre de Biotechnology, Fort. Collins., CO) , 1% de glutamina, 1% de piruvato de sodio, 25 mM de HEPES y 0.4 mg/ml de Geneticina (todos de Life Technologies, Inc.). Células Raji (ATCC, Rockville, MD) se cultivaron en RPMI 1640, con 10% de FCS, 1% de 1-glutamina . Para iniciar la activación de células Jurkat , tanto células Jurkat-CA como células Raji se sembraron a 1.0 x 106 células/ml en una placa de 96 pocilios opaca (Perkin Elmer, Boston, MA) . Las células combinadas se incuban junto con anti CD3 clon UCHT1 (0.1 µg/ml; BD Pharmingen, San Diego, CA) y dAbs a concentraciones variables. Después de 16-20 horas, las placas se enfriaron a la temperatura ambiente y Steady-Glo™ (Promega, Madison, WI) se agregó a las placas. Las placas fueron analizadas mediante un instrumento Topcount-NXT (Perkin Elmer) dentro de los 30 minutos de la adición de Steady-Glo.

Ensayos de reacción de linfocitos mixtos (MLR) PBMC fueron obtenidas por separación de densidad-gradiente (Medio de Separación de Linfocitos; Mediatech Inc., Herndon, VA) de sangre entera tratada con EDTA de donantes sanos normales. Las células T fueron preparadas a partir de fracciones E+ de PBMC roseteadas con SRBC (Colorado Serum Company, Denver, CO) . MoDC maduras fueron preparadas por la adhesión de monocitos a partir de fracciones E de PBMC de donantes sanos en placas de cultivo de tejidos de 6 pocilios, seguidas por extenso lavado suave para eliminar las células no adherentes. Las células adherentes se cultivaron durante 7 días en RPMI que contenía ya sea 10% de FCS junto con 100 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4, con la mitad del medio cambiada cada dos días y sustituida por medio fresco que contenía la misma concentración de citocinas. El día 7, las células fueron maduradas con LPS (1 ug/ml) durante 24 horas. Estas MoDC maduradas fueron utilizadas como células presentadoras de antígenos en las reacciones de linfocitos mixtos (MLR) .

Para los ensayos de proliferación de MLR que miden titulaciones de anticuerpos de dominio CD28, células T fueron cultivadas a 1 x 105 células/pocilio en los pocilios por triplicado, junto con 2 x 103 de MoDC alogeneicas como APC en placas de 96 pocilios de fondo redondo en un volumen total de 200 µ? de 10% de FCS-RPMI. Anticuerpos de dominio fueron añadidos a una gama de concentraciones de 100 pg/ml a 10 ng/ml, dependiendo de la potencia relativa. En el día 5 después de la iniciación de la MLR, los cultivos fueron pulsados con un µ?? de 3 [H] -timidina (PerkinEhner, Boston, MA) durante 6 horas, cosechados en un recolector de células Packard (PerkinElmer) , y sometidos a recuento de centelleo líquido usando un instrumento Packard TopCount-NXT (PerkinElmer) .

La figura 3 ilustra la inhibición de la proliferación de células T in vivo utilizando dAb lm74-15- P40L. En el día " -1", 30 x 106 células/ml de esplenocitos obtenidas de ratones receptores de células T D011 fueron inyectadas en ratones BALB/c a través de la vena de la cola. En el día cero, a los ratones se les administró por vía intraperitoneal PBS, dAb o CTLA-4 Ig. Dos horas después de la dosificación por vía intraperitoneal, los ratones fueron inyectados en la almohadilla plantar con 50 mg de ovoalbúmina de pollo emulsionada 1:1 con adyuvante completo de Freund. En los días uno y dos, fueron dosificados por vía intraperitoneal. En el tercer día, ganglios linfáticos poplíteos drenantes se recogieron para la tinción con anti-CD4 APC y anticuerpo clonotípico PE KJ-126 (Figura 3) . En la figura 3, células doble positivas CD4 y KJ126 representan las células T específicas de antígeno. Se tomó sangre de los animales para la exposición, con el fin de determinar los niveles de dAb en la sangre.

Las figuras 4A y 4B ilustran los resultados de un estudio de ocupación de receptores (RO) de nueve días usando dAb Im74-15-P40L. Ratones BALB/c naives fueron inyectados por vía intraperitoneal (Fig. 4A) o subcutánea (Fig. 4B) , ya sea con PBS o Im74-1540L a 1-, 3-, o 10 mg/kg (n=4) . Se tomó sangre de los animales en los puntos de tiempo de 1, 4, 24, 48, 72, 96, 168 y 216 horas. Para los grupos tratados con dAb, 50 µ? de sangre se utilizaron para la tinción con anti-CD4 APC y anti-CD28 PE y 50 µ? de sangre se utilizaron para la exposición. Para los grupos de PBS, 50 µ? de sangre se utilizaron para la tinción con anti-CD4 APC y anti-CD28 PE, y 50 µ? de sangre se utilizaron para la tinción con anti-CD4 y anti-CD28 PE en presencia de anticuerpo anti-CD28 no marcado excesivo para definir la unión no específica. La intensidad de fluorescencia media (MFI) se utilizó como unidad de medida de la unión de los anticuerpos. El porcentaje de ocupación de los receptores (%RO) se definió como "1- [CD28MFI (dAb) -CD28 MFI (no específico)] / [CD28MFI (PBS) -CD28 MFI (no específico) ] " .

Ensayos de co-agonista Se obtuvieron PBMC por separación de densidad-gradiente (Medio de Separación de Linfocitos; Mediatech Inc., Herndon, VA) de sangre entera tratada con EDTA de donantes sanos normales. Las células T fueron preparadas a partir de fracciones E+ de PBMC rosetéadas con SRBC (Colorado Serum Company, Denver, CO) . Las células T se cultivaron a 1 x 105 células/pocilio en un volumen total de 200 µ? de 10% de FCS-RPMI en tres pocilios de placas de 96 pocilios de fondo plano que previamente habían sido revestidas con 20 ug/ml de anticuerpo anti-CD3 (G19-4 mAb, Bristol-Myers Squibb) y se lavaron antes de la prueba. Anticuerpos de dominio fueron añadidos a una gama de concentraciones de 100 yg/ml a 0.3 mg/ml. Anti-CD28 (9.3 mAb, Bristol-Myers Squibb, Gibson et al (1996) Am Soc. Biochem. Mol. Sio. , 271:7079-7083), 1.0 Ug/ml, se utilizó como control positivo. El día 3 después del inicio del ensayo, los cultivos fueron pulsados con un µ?!? de 3 [?] -timidina (PerkinElmer, Boston, MA) durante 6 horas, recogidos en un colector de células Packard (PerkinElmer) , y sometidos a recuento por centelleo líquido un instrumento Packard TopCount NXT (PerkinElmer) .

La figura 2 ilustra que dAbs anti-CD28 humano mostrados en este documento no presentan actividad coagonista. Células T purificadas (1 X 105 células/pocilio) se agregaron a placas de 96 pocilios de fondo plano recubiertas con anti-CD3 (G19-4, 10 ug/ml en PBS) . Cada dAb, a una concentración final de 30 µg/ml, se añadió a las células en los pozos por triplicado. Como control positivo, mAb anti-CD28 (9.3) se añadió a una concentración final de 1 µg/ml en lugar del dAb. La proliferación se midió mediante incorporación de 3 [H] -timidina en el día 3 (Figura 2) .

Ensayos de agonistas PBMC fueron obtenidas por separación de densidad-gradiente (Medios de Separación de Linfocitos; Mediatech Inc., Hemdon, VA) de sangre entera tratada con EDTA de donantes sanos normales. Las PBMC se cultivaron en t X 105 células/pocilio en un volumen total de 200 µ? de 10% de FCS-RPMI en tres pocilios de placas de 96 pocilios de fondo plano. Los dAbs se añadieron en una gama de concentraciones de 100 ug/ml a 0.3 µg/ml. Anti-CD3 (OKT3) , 1 µg/ml en solución, se utilizó como control positivo para la proliferación máxima. Anti-CD28 (9.3, 10 ug/ml en solución), junto con anti-IgG de ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, utilizado a 50 µg/ml en solución) también se utilizó como elemento de comparación en algunos ensayos. El día 3 después del inicio del ensayo, los cultivos fueron pulsados con un ]iCi de 3 [H] -timidina (PerkinElmer, Boston, MA.) durante 6 horas, recogidos en un colector de células Packard (PerkinElmer) , y sometidos a recuento de centelleo líquido con un instrumento Packard TopCount X (PerkinElmer) .

Las figuras 1A y IB muestran que dAbs anti-CD28 humana mostrados en este documento no muestran actividad agonista. En un primer experimento, PBMC se aislaron de sangre entera de donantes normales y se sembraron en placas de 96 pocilios de fondo plano a 1 X 105 células/pocilio. Varios dAbs como los mostrados en este documento se añadieron a pocilios triplicados a las concentraciones finales que se indican en la figura 1A. Anti-CD3 (0?G3, 1 ug/ml de concentración final) , se incluyó como un control positivo. La proliferación se midió mediante incorporación de 3 [H] -timidina en el día 3 (Figura 1A) .

En un experimento separado, varios dAbs mostrados en este documento, anticuerpo anti-CD28 (9.3), anticuerpo anti-CD3 (0 3) , o el control de isotipo se agregaron a pocilios triplicados en una placa de 96 pocilios de fondo redondo a las concentraciones finales indicadas y se les dejó secar al aire sobre los pocilios. PBMC se agregaron (1 X 105 células/pocilio) y la proliferación se midió mediante la incorporación de 3 [H] -timidina en el día 3.

Los datos obtenidos para dAbs tanto en el ensayo reportero de IL-2 como en el ensayo de reacción de linfocitos mixtos se ensamblan para comparación en la tabla 1 abajo. Con base en los resultados de estos experimentos, así como en los resultados de los experimentos de co-agonista descritos en este documento, se demuestra que los dAbs descritos en la presente se unen con afinidad y especificidad a CD28, y que los dAbs son antagónicos con respecto a la actividad de CD28. Los dAbs también demuestran poca o ninguna actividad agonista de CD28.

Tabla 1 Resultados de los ensayos de MLR y ensayos de luciferasa usando dAbs como los mostrados en la presente dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (ECS0) (ECso) VKdAbs: lh-239-850 9 ± 6 nM 2 ± 1 nM (SEQ ID NO:58) lh-35 1.9 ±0.5 µ? 2 ± 0.5 µ? (SEQIDNO:59) lh-36 570±220nM 1.8 ± 1 µ? (SEQIDNO:60) : lh-79 3.8±0.6µ? 3.2 ±0.5 µ? ¦ (SEQIDÑO:61) - ';-';: lh-80 685 ±37 nM : 2± 0.4 µ? ' (SEQ1DN0;62) . lh-83 1.3 ± 0.5 µ? 1.7 ±1µ? (SEQIt)NO:63) lh-108 1.9±0µ? 2.7 ± 0.9 µ? (SEQ ID NO:64) lh-203 880±140nM (SEQIDNO:65) lh-207 2.6µ? (SEQ ID NO:66) lh-238 775±260nM ----- (SEQIDNO:67) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (ECS0) lh-239 1.3±0.1µ? (SEQ ID NO:68) lh-18-1 5.4 ± 0.3 µ? (SEQ IDNO:69) lh-18-3 1 ± 0 µ? (SEQ ED NO:71) lh-18-5 >7µ? (SEQ ID NO:73) lh-18-6 1.4±0.1µ? (SEQ ID NO:74) lh-31 800 ± 140 nM (SEQIDNO:77) lh-32 4.5 µ? (SEQ ID NO:78) lh-33 1.6±0.1 µ? ----- (SEQIDNO:79) lh-34 2.9±0.4µ? (SEQIDNO:80) lh-35 1.9±0.5 µ? 2 ±0.5 µ? (SEQIDNO:81) lh-35-2 279±93nM 197±72nM (SEQIDNO:83) lh-35-5 261±30nM 248 ± 16 nM (SEQIDNO:84) lh-35-7 79±9nM 270 ± 102 nM (SEQ ID NO:85) lh-35-9 278 ± l l nM 318 ± I I nM (SEQIDNO:86) lh-36 570± 220nM 1,8 ± 1 µ? (SEQIDNO:87) lh-36-6 162 ± 86 nM 260 ± 120 nM (SEQIDNO:93) lh-38 650 ± 70 nM 725 ± 204 nM (SEQIDNO:95) lh-39 1.3 ±0.5 µ? (SEQIDNO:96) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (EC50) lh-69 >7µ? (SEQIDNO:97) lh-70 6.6 µ? (SEQIDNO:98) lh-71 3.5±0.7.µ? (SEQIDNO:99) lh-72 3.4 ± 1 µ? (SEQIDNO:100) lh-73 4.9 ± 1 µ? lh-79-20 1.8±0.6µ? (SEQ ID NO: 121) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (ECS0) (ECso) lh-79-21 3± 1 µ? (SEQ ID NO: 122) lh-79-22 750±212nM (SEQ ID NO: 123) lh-79-24 331±104nM 295±115nM (SEQ ID NO: 125) lh-79-26 62±llnM 38±20nM (SEQIDNO:127) lh-79-28 40 nM 109±59nM (SEQ ID NO: 129) lh-79-29 43±9nM 150±89nM (SEQ ID NO: 130) lh-79-30 224±54nM 126±29nM (SEQ ID NO:132) lh-79-31 141 ± 62 nM 103 ± 56nM lh-80- 1 366±56nM 438 ± 370 nM (SEQ ID NO: 157) lh-80-2 62 nM 550 ± 140 nM (SEQIDN0:161) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (ECso) (ECso) lh-80-7 322 ± 42 nM (SEQ ID NO: 166) lh-81 3.3 ±2 µ? (SEQ ID NO:169) lh-82 1.9 ± 0.07 µ? (SEQ ID NO: 170) lh-83 1.3 ±0.5 µ 1.7 ± 1 µ? (SEQIDNO:171) lh-84 1.5±0.4µ? — -- (SEQ ID NO: 172) íh-85 530±150?? (SEQ ID NO: 173) lh-86 400±0?? ----- (SEQ ID NO: 174) lh-87 1.7 ±0.3 µ? —— (SEQ ID NO: 175) lh-90 1.0±0µ? (SEQ ID NO: 178) lh-108 1.9±0µ? 2.7±0.9µ? (SEQ ID NO: 180) lh-108-5 1.9 ±0µ? ·.. ~~- (SEQ ID NO: 188) lh-109 1 ± 0 µ? : - (SEQIDN0193:) lh-110 4.1 ± 1 µ? ----- (SEQ ID NO 194.) lh-112 775 ± 430 ?? 850±320?? (SEQID O:397) lh-116 2.5 "± 1.9 µ? 2.4 ±1.2 µ? (SEQIDNO:196) lh-203 880± 140?? (SEQIDNO:200) lh-207 2.6 µ? (SEQIDNO:206) lh-238 775±260?? (SEQIDNO:226) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (EC50) lh-239 1.3 ±0.1 µ? (SEQIDNO:227) lh-239-8 10±4nM 13±3nM (SEQIDNO:228) lh-239-804 5±2nM 3±2nM (SEQ ID O:229) lh-239-807 7±2nM 6±lnM (SEQID O:230) lh-239-809 6±lnM 4±lnM (SEQIDNO:231) lh-239-815 lOnM 6±4nM (SEQ ID NO:232) lh-239-816 ll±7nM 13 ± 3 nM (SEQIDNO:233) lh-239- 17 7nM 9±2nM (SEQIDNO:234) lh-239-819 13±5nM ' . ll±8nM (SEQ ID NO:235) lh-239-824 9nM 6±lnM (SEQIDNO:236) lh-239-828 8 nM 14± 6nM (SEQ ID NO:237) lh-239-829 10±3nM ll±2nM (SEQ ID NO:238) lh-239-832 12±6nM ll±6nM (SEQIDN0:239) lh-239-833 8±ínM 7 ± 0.7 nM (SEQID O:240) lh-239-837 9±lnM . 14±6nM (SEQIDNO:241) lh-239-838 4±0.6 M 3±2nM (SEQ ID NO:242) lh-239-840 9nM 10±lnM (SEQÍDNO:243) lh-239-847 8±3nM 5±3nM (SEQIDNO:244) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MI (ECso) (ECso) lh-239-849 13±4nM 10±7nM (SEQIDNO:245) lh-239-850 9 ± 6 nM 2± I nM (SEQ ED NO:246) lh-239-851 5 nM 4±0.7nM (SEQK>NO:247) lh-239-856 3 nM 1 nM (SEQ ID NO:248) lh-239-857 3 ± 0.7 nM 1 nM (SEQIDNO:249) lh-239-859 5 ± 0.6 nM 4±lnM (SÉQIDNO:250) lh-239-869 2±0nM (SEQIDNO:255) íh-239-870 3±0.7nM (SEQIDNO:256) lh-239-871 3±0nM (SEQIDN0:257) lh-239-9 27±6nM 57±13nM (SEQ IDNO-.271) lh-239-872 (SEQIDNO:258) 0.6 0.5 ± 0.2 lh-239-873 (SEQID O:259) 1.4 ±0.1 1±0 lh-239-874 (SEQIDNO:260) 2±0 lh-239-875 (SEQIDNO:261) 0.8±0;l 0.9 ±0,6 lh-239-876 · (SEQIDNO:262) 1.2 ±1 1.8 ±1.4 lh-239-877 (SEQIDNO:263) 2.2 ±0.3 2±0 lh-239-879 (SEQIDNO:264) 1±0 1.3 ±0.9 lh-239-880 (SEQIDNO:265) 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (ECso) lh-239-881 (SEQIDNO:266) 1±0 1.3 ±0.9 lh-239-882 (SEQ ID NO:267) 0.5 ±0.1 0.5 ±0.3 lh-239-883 (SEQIDNO:268) 1.5 ±0.7 1 ±0.5 lh-239-885 (SEQ ID NO:269) 1.2 ±0.4 0.9 ± 0.6 lh-239-886 (SEQ ID NO.-270) 0.8 ± 0.1 0.9 ± 0.6 lh-239-887 (SEQ ID NO:472) 0.2 1 ± 0.7 lh-239-888 (SEQ ID NO:473) 1.7 62 ±43 lh-239-889 (SEQ ID NO:474) 0,2 0.7 ±0.5 lh-239-890 (SEQIDNG:475) 0.2 0.7 ±0.5 lh-239-891 (SEQ ID NO:476) 0.2 0.5 ± 0.3 lh-239-892 ; (SEQIDNQ:477) 0.3 0.6 ± 0.2 lh-239-893 (SEQ ID O:478) 0.4 0.6 ± 0.2 •:' lh-239-894 .

(SEQIDNO:479) 0.4 0.3 ±0.3 lh-239-895 (SEQIDNO:480) 0.3 0.8 ±0.3 lh-239-896 (SEQIDNO:481) 0.2 0.5 ±0.05 lh-239-897 (SEQIDNO:482) 0.4 0.6 ±0.2 lh-239-898 (SEQIDNO:483) 0.5 0.8 ±0.2 dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (ECsd) lh-239-89103 (SEQIDNO:534) ----- 0.7 + 0:2 lh-239-89104 (SEQ1DN0:535) — - 0.8 + 0.3 lh-239-89201 (SEQIDNO:547) 0.6 ±0.1 lh-239-89202 (SEQIDNO:548) 2±0 lh-239-89204 (SEQIDNO:550) ----- 0.910.2 lh-239-89205 (SEQIDNO:551) -— 0.610.3 lh-239-89207 (SEQIDNO:553) ----- 0510.2 lh-239-89216 (SEQIDNÓ:562) — - 0.810.2 lh-239-89230 (SEQ ID NO:567) - - 1.810.3 lh-239-89233 (SEQ ID NO: 570) — - 0.810.3 lh-239-89221 : (SEQIDNO:575) ----- . 0.910.3 lh-239-89222 (SEQ ID N0.576) — - 0.910.2 lh-239-89223 (SEQIDNO:577) -— 0.910.2 lh-239-89224 (SEQIDNO:578) - - 1.610.8 lh-239-89226 (SEQIDNO:580) 0.810.3 VHdAbs lh-99-237 3 ± 0.8 nM 3 ±1.8 nM (SEQIDNO:272) lh-99-238 3±lnM 5±2nM (SEQIDN0.273) Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (ECso) (EC50) G.3±0.6µ? 1.9 ±0.8 µ? 2.8±0.9µ? 3.2±0.7µ? 3.2±0.1µ? 2.2±0.8µ? >7 µ? (SEQIDNO:281) lh-30 1.2±0µ? (SEQ ID NO:282) lh-37 1.3±0.6µ? 1.9±0.8µ? (SEQIDNO:283) lh-93 2.8 ± 0.9 µ? 3.2±0.7µ? (SEQIDNQ:287) lh-93-1 493 ±26 nM 545±224nM (SEQIDNÓ:288) lh-93-2 383 ± 80 nM 830 ± 165 nM (SEQIDNO:289) lh-93-201 182±58nM 18±8nM (SEQÍDNO:290) lh-93-204 176±79nM 1.2 ± 1.4 µ? (SEQIDNO:291) lh-99 3.2 ±0.1 µ 22±0.8µ? (SEQ ID NO:297) lh-99-1 15±0nM 19 ±14nM (SEQ ID NO:298) lh-99-2 17±2nM 13±6nM (SEQIDNO:299) lh-99-201 14±4nM 18 ±1 nM (SEQ 1DNO:300) lh-99-203 8±0nM 10±0nM (SEQIDNO:301) lh-99-2112 3± 1 nM 2± I nM (SEQIDNO:311) lh-99-2113 5±2nM 3± I nM (SEQIDNO:312) dAb o de luciferasa Ensayo de MLR (ECso) (EC50) lh-99-2114 4±1 nM 2±lnM (SEQIDNO:313) lh-99-2115 3±2nM 12±4nM (SEQIDNO:314) lh-99-2116 5±2nM 4 ± 1 nM (SEQID O:315) lh-99-217 12±2nM 15±2nM (SEQ ID NO:320) lh-99-218 10±2nM 12 ± I nM (SEQIDNO:321) lh-99-220 10± InM 12 ± 1 nM (SEQID O:323) lh-99-221 12 ± I nM 17±4nM (SEQIDNO:324) lh-99-222 16±2nM 28±16nM (SEQIDNO:325) lh-99-224 15 ± 1 nM 28±9nM (SEQ ID NO:327) lh-99-225 14±4nM 28±12nM (SEQIDNÓ:328) lh-99-226 10 ± I nM 23±2nM (SEQ ID NO:329) 1 h-99-227 18±3nM 33 ± 18 nM (SEQ ID NO:330) lh-99-228 12±8nM 46±6nM (SEQIDNO:331) ln-99-229 15±3nM 24±4nM (SEQ ID,N0:332) lh-99-230 9±1 nM 14±6nM (SEQIDNO:333) lh-99-236 21±6nM 14±9nM (SEQ ID NÓ:339) lh-99-237 3±1 nM 3±2nM (SEQIDNO:340) lh-99-238 3±lnM 5±2nM (SEQ ID O:341) dAb Ensayo de luciferasa Ensayo de MLR (EC50) (EC50) lh-99-241 17 ± 1 nM 22 nM (SEQEDNO:342) lh-99-243 4±2nM 8±lnM (SEQ ID NO:343) lh-99-245 6± 1 nM llilnM (SEQ ID NO:345) lh-99-246 3±lnM 8±lnM (SEQIDNO:346) lh-99-249 6±2nM ll±2nM (SEQ ID NO:349) lh-99-250 9 ± 0 nM 8 nM (SEQIDNO:350) lh-99-254 ll±lnM 7nM (SEQIDNO.-354) lh-99-256 9 ± 1 nM 7±4nM (SEQIDNO:356) lh-99-260 ll iOnM 13 nM (SEQIDNO:360) lh-99-262 6±2nM 8±4nM (SEQ ID NO:398) lh-99-263 . 6±lnM 4±2nM (SEQIDÑO:362) lh-99-264 5 ¿2nM 3±2nM (SEQ ID NO:363) lh-99-265 4±lnM 3±lnM (SEQI ÑO:364) lh-99-266 8±4nM 4±lnM (SEQIDNO:365) lh-99-267 6±3nM 4±lnM (SEQIDNO:366) lh-99-268 ll ±2nM 13 ± 1 nM (SEQ ID NO:367) lh-99-269 10±2nM 5±0nM (SEQ ID NO:368) lh-99-270 4 ± 2 nM 6±2nM (SEQID O:369) (SEQ IDNO:370) lh-99-276 5± 1 nM 18 ± InM (SEQ IDNO:371) lh-99-277 6±2nM 9±lnM (SEQIDNO:372) lh-99-278 12±2nM 13 ± InM (SEQIDNO:373) lh-99-297 6±lnM 6±0nM (SEQ ID NO:374) lh-100 > 7 µ? (SEQ ID NO:380) lh-114 3.1 ±1.4 µ? — - (SEQ lDNO:388) lh-115 4± 1.6 µ? > 7 µ? (SEQID O:389) lh-119 2.8 µ? -— (SEQIDNO:392) lh-212 >7µ? (SEQ ID NO:393) lh-99-23703 -— 7 ± (SEQ ID NO:599) lh-99-23704 — - 10 ±1.4 (SEQ ID NO:600) lh-99-23711 -— 11 ±2.6 (SEQ ID NO:607) lh-99-23715 — - 3.8 ±1.3 (SEQIDNO:611) lh-99-23721 ----- 6.3 ±2.8 (SEQIDN0:617) lh-99-23726 , ~— 7.8 + 3.2 (SEQ IDNO:622) E emplo 6 Modificación con polietilenglicol de dAbs La PEGilación de varios dAbs se llevó a cabo para aumentar la estabilidad, vida media, y biodisponibilidad de dAbs establecidos en este documento. Para la modificación con polietilenglicol (PEG) ("PEGilación") de la amina N-terminal de dAbs, las muestras se purificaron y dializaron en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) y los niveles de endotoxinas en la solución se redujeron a un máximo de 10 unidades de endotoxina (EU) /mg (1 EU = 100 pg de lipopolisacárido) . Las muestras fueron dializadas luego en fosfato de potasio 0.1 M pH 6.8. Las muestras fueron filtradas después de la diálisis, la concentración de proteína determinada y ajustada a 2-3mg/ml.

Para la fijación de PEG (40kD lineal, 40kD ramificada o 30 kD lineal) , un sólido de propionaldehído metoxi poli (etilenglicol ) se añadió a la solución en un exceso molar de tres veces sobre dAb y se mezcló sobre un rodillo durante 1 hora a temperatura ambiente. En ese momento, un exceso molar de 10 veces de cianoborohidruro de sodio (de 5 mg/ml de solución en fosfato de potasio 0.1 M pH 6.8) se añadió y se mezcló en un rodillo durante 5 horas a temperatura ambiente. Un exceso molar adicional de 10 veces de cianoborhiduro de sodio se añadió y la reacción se dejó continuar durante la noche a temperatura ambiente. La progresión de PEGilación fue supervisada por SDS-PAGE.

Para PEGilación de un residuo de cisteína en un dAb, ya sea en la posición C-terminal o en una posición interna (por ejemplo, la posición de aminoácido 15, 41, 60, 70, 81, o 100) , dAbs fueron purificados y dializados en PBS, y los niveles de endotoxinas se redujeron a un máximo de 10 EU/mg. Las muestras fueron filtradas después de la diálisis, y la concentración de dAb fue determinada y ajustada a 2-3 mg/ml .

Para la fijación de PEG (40kD lineal, 40kD ramificado o 30 kD lineal) , la reducción del dAb con ditiotreitol (TDT) fue empleada. Se añadió glicerol a la muestra (20% (v/v) ) y la muestra se mezcló bien antes de la reducción con ditiotreitol (5 mM) . La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 20 minutos antes del intercambio de regulador de pH por un regulador de pH de acoplamiento a PEG (20 mM de BIS-Tris pH 6.5 , 5 mM de EDTA y 10% de glicerol [v/v]) con una columna de desalación 26/10 Hi-Prep (GE Healthcare) . La concentración de proteína se midió y se ajustó a 2-3 mg/ml. Sólido de metoxi poli (etilenglicol) maleimida se añadió a la solución en un exceso molar de tres veces en el dAb y la solución fue mezclada en un rodillo entre 4 y 16 horas a temperatura ambiente. La progresión de PEGilación fue supervisada por SDS-PAGE.

La PEGilación también se llevó a cabo mediante la reducción del dAb con tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) . La muestra fue dializada en regulador de pH de acoplamiento a PEG (20 mM de BIS-Tris pH 6.5, 5 mM de EDTA y 10% de glicerol [v/v] ) con una columna de desalación 26/10 HiPrep (GE Healthcare). La concentración de dAb se midió y se ajustó a 2-3 mg/ml . La reducción se llevó a cabo utilizando TCEP, agregado en una concentración de 5 mM, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Un sólido de metoxi poli (etilenglicol ) maliemida se añadió a continuación, en un exceso molar de tres veces en el dAb y se mezcló en un rodillo durante 4-16 horas a temperatura ambiente. La progresión de PEGilación fue supervisada por SDS-PAGE.

Cuando sea necesario, maleimida se utiliza para bloquear los residuos de cisteína. Muestras de proteína se purificaron y dializaron en PBS y los niveles de endotoxinas se redujeron a un máximo de 10 EU/mg.

Las muestras fueron filtradas después de la diálisis, y la concentración de la proteína determinada y ajustada a 2-3 mg/ml. Para la adición de PEG, se añadió glicerol a la muestra (20% (v/v) y se mezcló bien antes de la reducción con ditiotreitol (DTT 5mM) . La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de la diálisis en regulador de pH de acoplamiento a PEG (20 mM de BIS-Tris pH 6.5 , 5 mM de EDTA y glicerol al 10% [v/v]), con columna de desalación 26/10 Hi-Prep (GE Healthcare) . La concentración de proteína se midió y se ajustó a 2-3 mg/ml. Sólido de maleimida se añadió en un exceso molar de 3 veces en dAb y se mezcló con un rodillo durante 4-16 horas a temperatura ambiente. El grado de la reacción se controló mediante SDS-PAGE.

El método utilizado para la purificación de dAbs PEGilados depende del punto isoeléctrico (pl) del dAb. Para dAbs. con un pl inferior a 7, se usó intercambio de aniones, mientras que para los dAbs con un pl superior a 7, intercambio catiónico fue aprop i ado .

Para la purificación, dAbs se diluyeron por primera vez 1:5 con regulador de pH A (20 mM de Tris pH 8 para el intercambio de aniones y 20 mM de acetato de sodio pH 4 para el intercambio de cationes) y el pH se revisó. Columnas Resource Q (intercambiador de aniones) y S (intercambiador de cationes), o HiTrap Q o S Fast Flow (GE Healthcare) fueron utilizadas. Las columnas se lavaron con 10 volúmenes de columna de NaOH 0.5M, seguidas por 10 volúmenes de columna de regulador de pH B (20 mM de Tris pH 8, usando NaCl 1 M para el intercambio de aniones y acetato sódico 20 mM pH 4, con NaCl 1 M para el intercambio de cationes) . Las columnas se equilibraron con regulador de pH A antes de la carga de la muestra diluida. La elución de la muestra se llevó a cabo en los gradientes siguientes: 0-30% del regulador de pH B sobre 30 volúmenes de columna, 30-100% del regulador de pH B sobre 10 volúmenes de columna, 100% de regulador de pH B en 5 volúmenes de columna .

Cualquier exceso de PEG libre o maliemida pasó a través de la columna y se mantuvo en el flujo continuo. La muestra PEGilada eluyó generalmente en el primer gradiente y se separó tan bien del segundo gradiente, cuando la muestra restante no PEGilado eluyó. Fracciones de dos mililitros fueron recolectadas a través de cada gradiente y se analizaron por SDS-PAGE. Las columnas se lavaron finalmente con NaOH 0.5 M para enjuagar cualquier resto de material. Las fracciones apropiadas se reunieron y, en el caso de dAbs de alto pl , el pH se ajustó a la posición neutra mediante la adición de Tris 1 M, pH 8.

Las tablas 2 y 3 demuestran que dAbs PEGilados mantienen la actividad de unión y la actividad biológica en los ensayos utilizados en la presente .

' Tabla 2 Tabla 3 Actividad de dAb de ratón PEGilado Ejemplo 7 Estudios de reactividad cruzada en animales con dAbs La capacidad de los dAbs establecidos en presente para reaccionar con células no humanas y polipéptidos fue examinada. En un estudio de reactividad cruzada, dAb lh-79-807 demostró actividad contra células tanto humanas como de ratón que expresaban CD28. Para el estudio de células humanas, los ensayos de luciferasa y MLR fueron utilizados, como se describió anteriormente. Para el estudio de células de ratón, ensayos de MLR y esplenocitos del ratón fueron usados. En los ensayos, dAb lh-79-807 exhibió una potencia de 31 +/- 12 nm (ensayo de esplenocitos) y una potencia de 38 +/- 6 nM (ensayo MLR) .

Para los ensayos MLR en ratón, suspensiones unicelulares se hicieron de los ganglios linfáticos de un ratón BALB/c y bazos de un ratón DBA\2 utilizando un homogeneizador de tejidos Tenbroeck. Los glóbulos rojos se retiraron de ambas poblaciones a través de lisis usando regulador de pH de lisis de glóbulos rojos (SIGMA, St . Louis, Mo) , seguido de dos lavados en medio completo [ (RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , 10% suero de ternera fetal (Summit) , 1% de 1-glutamina (Invitrogen) , 1% de piruvato de sodio (Invitrogen) , 100 mg/ml de gentamicina (Invitrogen) , 5xl0"5 M 2-mercaptoetanol (SIGMA)]. Después del último lavado, los sedimentos de células se- resuspendieron en 2 mi de medio completo, se cargaron en columnas individuales de lana de nylon pre-equilibradas ( AKO, Richmond, VA) , y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Las células T, ya sea de los ganglios linfáticos de BALB/c y bazos DBA\2 se eluyeron de la columna por la adición de 25 mi de medio callente. Las células T de los bazos DBA\2 fueron descartadas, y la población de APC fue eluida de la columna con la adición de 25 mi medio completo helado (descrito arriba) . Las células T de BALB\c o los APCs de DBA\2 se centrifugaron a 400xg durante 10 minutos, se resuspendieron en medio completo, y las células se contaron con un hemocitómetro . Ambas poblaciones de células se diluyeron a l.OxlO6 células/ml en medio completo. DBA\2 APCs (0.25xl06/ml) se combinaron con células T de T BALB\c (0.5xl06/ml) en una placa de 96 pocilios de fondo redondo (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , y diluciones seriadas de dAb, o agente de control, se añadieron a los pocilios. Las placas se incubaron a 37°C en 5% de C02 durante 96 horas. 3H-timidina (1 µ??; PerkinElmer, Waltham, MA) se añadió a los pocilios 6 horas antes de la finalización del periodo de incubación. Las placas se cosecharon a través de placas de filtro GF/c (PerkinElmer), se secaron, luego 50 µ? de Microscint-20 (PerkinElmer) se añadieron a cada pocilio, y se contó la radiactividad en un TopCount (Packard, Meriden, CT) . Los datos fueron analizados utilizando el programa ExcelFit (Microsoft, Redmond, WA) .

Para el ensayo de esplenocitos de ratón, suspensiones unicelulares fueron generadas a partir de bazos de ratones BALB\c usando un homogeneizador de tejidos Tenbroeck. Los glóbulos rojos fueron separados de otra materia homogeneizada por la incubación en regulador de pH de lisis de la glóbulos rojos, seguida de dos lavados en medio completo [RPMI 1640 (Invitrogen) , 10% suero de ternera fetal (Cumbre), 1% de 1-glutamina (Invitrogen) , 1% de piruvato de sodio (Invitrogen) , 100 mg/ml de gentamicina (Invitrogen) , 5xl0~5M de 2 -mercaptoetanol (SIGMA) ] . Después del último lavado, el precipitado celular se resuspendió en medio completo y los esplenocitos se contaron usando un hemocitómetro . Los esplenocitos se diluyeron a l.OxlO6 células/ml en medio completo, y 500 µ? fueron añadidos a placas de 96 pocilios de fondo redondo. Anticuerpo anti-CD3 (clon 145-2C11 (BMS) ) se añadió a cada pocilio a una concentración de 0.1 µg/ml . Diluciones seriadas de dAb, o agentes de control, se añadieron a los pocilios, se incubaron a 37°C en 5% de C02 durante 48 horas. 3H-timidina (1 µ??) se añadió a los pocilios 6 horas antes de la finalización del periodo de incubación, y los esplenocitos se cosecharon a través de placas de filtro GF/c (PerkinElmer) . Las placas se secaron, 50 µ? de Microscint-20 (PerkinElmer) se añadieron a cada pocilio, y se contó la radiactividad en un TopCount . Los datos fueron analizados utilizando el programa ExcelFit.

En otro estudio de reactividad cruzada, la farmacocinética (PK) de dAbs fue examinada usando monos macacos, con el fin de dilucidar la PK en relación con el tamaño y la conformación dAbs modificados con polietilenglicol (PEG) ( "PEGilados" ) . El efecto de dAb anti-CD28 humana lh 99-2 -PEG, que portaba una porción de PEG de 40 kD, fue examinado en dos grupos, cada uno con tres monos. Los monos del grupo 1 recibieron dAb lh 99-2 P40-PEG ramificado por vía subcutánea, a una concentración de 10 mg/kg. Los monos del grupo 2 recibieron dAb lh 99-2 P40-PEG lineal por vía subcutánea, a una concentración de 10 mg/kg. Todas las muestras de suero tomadas de animales fueron almacenadas a -70°C y analizadas a la conclusión del estudio. Las muestras de suero fueron analizadas mediante ELISA y MSD en varias diluciones.

Para el análisis de ELISA, biotina-CD28 monomérico fue recubierto en una placa de ELISA a una concentración de 1 µg/ml . Estándares, muestras de control de calidad, y todas las diluciones de muestra experimentales se prepararon a una concentración final de suero de 1%. Las muestras de macaco se descongelaron a temperatura ambiente y varias diluciones de las muestras se prepararon para identificar las señales en el intervalo del ensayo. Muestras de macacos se añadieron a los pocilios de la placa de ELISA y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. dAbs anti-Vh de de conejo se prepararon y aislaron a través de purificación de afinidad y un anticuerpo policlonal. HRP anti-conejo de burro se añadió a las placas, seguido por el substrato, y después de que la reacción procedió durante una cantidad medida de tiempo, la reacción se detuvo. La densidad óptica (DO) de cada reacción se midió con un lector óptico de microplacas. Una curva estándar se generó, y un ajuste logístico de cuatro parámetros de la curva estándar se utilizó para calcular las concentraciones de dAb en los pocilios sobre la base de las lecturas de OD dentro del intervalo cuantificable . Los resultados se basaron en un promedio de concentraciones a partir de diluciones múltiples.

Las tablas 4-6 describen los resultados obtenidos de la administración de dAb lh 99-2 P40-ramificado y dAb lh 99-2 P40-lineal a macacos. La figura 5 ilustra la concentración plasmática, con el tiempo, del estudio de los dAbs PEGilados en los monos.

Los resultados experimentales con dAb PEGilado ramificado difirieron de aquellos para el dAb lineal PEGilado tanto en exposición como en vida media terminal, lo que puede ser debido a la diferencia de absorción y no de disposición.

Aunque la vida media (Ti/2) del dAb ramificado (??/2 = 4.5 días) pareció ser más corta que la del dAb lineal (??/2 = 6 días) , el dAb PEG- ramificado es un mejor candidato en términos de exposición y la cobertura potencial sobre la concentración objetivo (por ejemplo, la IC50 in vitro = 3 ug/mL o 200 nM) . El AUC del dAb ramificado fue ~ 2.5 veces mayor que la del dAb lineal (factor individual Anova P = 0.017). El tiempo medio de residencia (MRT) del dAb ramificado fue ~ 1.5 veces superior al de dAb lineal.

Tras la administración subcutánea, las concentraciones máximas de ambas proteínas PEGiladas se produjo alrededor de las 24 horas. Los valores de volumen de distribución en equilibrio (Vss/F) dé los dos dAbs fueron inferiores a 100 mL/kg, lo que indica que las proteínas PEGiladas en gran parte residen en el plasma.

Tabla 4 Niveles séricos de dAb lh 99-2 P40 -Ramificado Grupo 1: lh 99-2 p40Br g/ml) Horas post dosis Mono # 1101 1102 1103 MEDIA SD 0.592 2 916 0.671 1.39 V ; 1.32 2 . 3.398 X989 2.839 , 4,74 '. ·¦; -'; :¦ 2.83 .. . " 4 28.494 17.417 12.747 19.55 8.09 75 129 61.516 40.057 .:. 58.90 17.68 12 80.598 82.753 44.651 69.33 21.40 24 174.252 144.025 107.507 141.93 33.42 96 125.813 109.162 107.421 114.13 10.15 168 71.762 111.085 49.670 77.51 31.11 240 45.573 68.400 32.332 48.77 18.25 336 22.922 45.246 16.363 28.18 15.14 504 7.441 10.925 3.379 7.25 3.78 672 2.187 5.836 1.204 3.08 2.44 840 0.810 1.861 0.747 1.14 0.63 Tabla 5 Niveles séricos de dAb lh 99-2 P40- Lineal Grupo 2: lh 99-2 P40L (µ /??1) Horas post dosis Mono # 2101 2102 2103 MEDIA SD 1 1.335 0.137 1.524 1.00 0.75 2 5.540 1.427 5.500 4.16 2.36 4 15.190 5.990 15.062 12.08 5.28 8 42.403 26.227 61.192 43.27 17.50 12 67.873 31.246 67.810 55.64 21.13 24 111.762 82.306 107.172 100.41 15.85 96 57.389 55.502 58.679 57.19 1.60 168 23.335 31.518 26.847 27.23 4.11 240 7.744 11.258 8.730 9.24 1,81 336 2.946 3.276 3.895 3.37 0.48 504 0.850 1.303 1.131 1.09 0.23 672 0.394 0.693 0.542 0.54 0.15 840 0.202 0.275 0.197 0.22 0.04 Tabla 6 Resumen de parámetros de farmacocinética (PK) para dAbs PEGilados Los datos en el ejemplo experimental 7, así como en las Tablas 4-6 demuestran que dAbs establecidos en este documento son sistemas modelo de reacción cruzada en humanos, ratón y mono. Por otra parte, los parámetros farmacocinéticos de dAbs PEGilados demuestran que los dAbs son biodisponibles y activos en sujetos vivos.

Ejemplo 8 Método para análisis SEC-MALLS de dAbs Con el fin de estimar el tamaño de la solución y la estructura oligomérica de dAbs, dispersión de luz láser multi-ángulos se utilizó junto con cromatografía de exclusión por tamaño. Muestras de polipéptidos se purificaron y dializaron en regulador de pH apropiado (es decir, PBS) . Las muestras fueron filtradas después de la diálisis, la concentración determinada y ajustada a 1 mg/ml. BSA fue comprado de Sigma y utilizado sin purificación adicional.

Un sistema HPLC Shimadzu LC-20AD Prominencia con un inyector automático (SIL-20A) y detector UV/luz visible SPD-20A Prominence fue conectado a un detector Wyatt Mini Dawn Treos (MALLS, detector de dispersión de luz láser de varis ángulos) y Wyatt Optilab REX DRI (índice de refracción diferencial) . Los detectores se conectaron en el siguiente orden - LS-UV-RI . Ambos instrumentos RI y LS funcionaban a una longitud de onda de 488 nm. Columnas TSK2000 (Tosoh de sociedades) o BioSep2000 (Phenomenex) se utilizaron (ambas son columnas de HPLC a base de sílice con un intervalo de separación similar, 100-300 kD) con la fase móvil de 50 mM de regulador de pH de fosfato (con o sin sal) , pH 7.4 o lx PBS. Para mejorar la recuperación de la proteína de la columna, el 10% de etanol se añadió a veces. La velocidad de flujo utilizada fue 0.5 ó 1.0 ml/min, y el curso temporal de la ejecución se ajustó para reflejar diferentes velocidades de flujo (minutos 45 y 23) y no se esperaba que tuviera un impacto significativo en la separación de las moléculas. Las proteínas fueron preparadas en PBS hasta una concentración de 1 mg/ml y el volumen de inyección fue de 100 microlitros.

El detector de dispersión de luz se calibró con tolueno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La salida del detector de rayos UV y la salida del detector IR se conectaron al instrumento de dispersión de luz para que las señales de los tres detectores pudieran ser recogidas simultáneamente con el software Wyatt ASTRA. Varias inyecciones de BSA en una fase móvil de PBS (0.5 ó 1 ml/min.) se llevaron a cabo en una columna ???2000 Tosoh con señales UV, LS y RI recogidas por el software Wyatt. Los trazos son después analizados utilizando el software ASTRA, y las señales se normalizaron alinearon y corrigieron para ampliación de banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Las constantes de calibración se promediaron después e ingresaron en la plantilla que se utiliza para corridas de muestra futuras .

Cálculos de masa molar absoluta Cien microlitros de 1 mg/ml de muestra se inyectaron en una columna pre-equilibrada adecuada. Después de procesar a través de la columna SEC, la muestra pasó a través de tres detectores en línea - UV, MALLS (láser dispersión de luz láser de varios ángulos) y DRI (índice de refracción diferencial) , lo que permite la determinación absoluta de la masa molar. La dilución que tiene lugar en la columna es aproximadamente 10 veces, por lo que la concentración a la que el estado en solución se determinó fue de 100 µg/ml, o aproximadamente 8um de dAb.

La base de los cálculos en ASTRA, así como de la técnica de gráfica Zimm, que se suele aplicar en un modo de muestra por lotes es la ecuación de Zimm (1948) J. Chem. Phys. 16:1093-1099: Rd =??(T)-2A2cht2P2(e) K*C ' Ecuación 1 en donde • c es la concentración de masa de las moléculas de soluto en el solvente (g/mL) • M es la masa molar promedio en peso (g/mol) • A2 es el segundo coeficiente virial (mol mL/g2) • K* = 4p2 n02 (dn/dc) 210~4 NA- 1 es una constante óptica donde n0 es el índice de refracción del solvente a la longitud de onda de radiación incidente (vacío) , 10 es la longitud de onda de radiación incidente (vacío) , expresada en nanómetros, NA es el número de Avogadro, igual a 6.022 x 1023 mol"1, y dn/dc es el incremento en el índice de refracción diferencial de la solución de solvente-soluto con respecto a un cambio en la concentración de soluto, expresada en mL/g (este factor debe ser medido de forma independiente mediante un detector de dRI) .

• P(q) es el factor de forma derivado teóricamente, aproximadamente igual a 1 - 2i2<r2> / 3! +... , donde µ = (4p/?) sen(9/2) , y <r2> el radio medio del cuadrado. P(q) es una función del tamaño z-promedio, forma y estructura de las moléculas .

• Rq es el exceso de relación de Rayleigh (cm"1) .

Esta ecuación supone luz incidente polarizada verticalmente y es válido para orden c2.

Para realizar los cálculos con el método de ajuste Zimm, que es un ajuste a Rq/K* c vs . sen2(q/2) , tenemos que ampliar el recíproco de la ecuación 1 a primer orden en c: Para realizar los cálculos con el método de ajuste Zimm, que es un ajuste a J?q/K*c vs . sen2 (q/2) , tenemos que ampliar el recíproco de la ecuación 1 a primer orden ¿n c: Kxc = 1 + 2A2c Re ??(T) Ecuación 2 Los resultados adecuados en este caso fueron M = ([Kc/R0]-2A2c)"1 Ecuación 3 y Ecuación 4 en donde m0 = d[ xc/R0]/d[sen2(e/2)]e?o Ecuación 5 Los cálculos se realizaron automáticamente por software ASTRA, lo que resulta en una gráfica con una masa molar determinada para cada uno de los sectores de datos. Los valores de masa molar obtenidos de la gráfica para cada uno de los picos observados en el cromatograma se compararon con la masa molecular esperada de una sola unidad de la proteína. Esto permite una determinación del estado en solución de la proteína.

Tabla 7 Estado de soluciones y tamaño de dAbs dAb SEC-MALLS PM Columna y fase móvil lh-35 Equilibrio 20kD BioSep 2000, PBS pII7.4, 0.5 mí/min • monómero/dímero lh-36 Monómero 16kD BióSep 20Ó0, PBS pH7,4, 0.5 mi min lh-37 Monómero ·'" '"· \ 15kD BioSep 2000, PBS ??7.4, 0.5 ml/rnin lh-79 Equilibrio 21kD TS 2000, PBS pH 7.4 10% Etanol, ' monómero/dímero 0.5ml min' lh-80 . Equilibrio 17kD BioSep 2000, PBS pH7.4, 0.5 ml/inin monómero/dímero lh-83 Monómero 16kD BióSep 2000, PBS pH7.4, 0.5 ml/min lh-93 Monómero 16kD BioSep 2000, PBS pH7.4, 0.5 ml/miri lh-99 Equilibrio 19kD BioSep 2000, PBS pH7.4, 0.5 ml/min monómero/dímero lh-108 Monómero 17kD TSK2000, PBS pH 7.4 10% Etanol, 0.5 ml/min lh-99- Monómero 12kD TSK2000, PBS pH 7.4 10% Etanol, 237 1.0 ml/min lh-99- Monómero más 12 & TSK2000, PBS pH 7.4 10% Etanol, 238 dímero 26kD l.O ml/min lh-239- Equilibrio 21kD TSK2000, PBS pH 7.4 10% Etanol, 850 monómero/dímero 1.0 ml/min Ejemplo 9 Anti-CD28 dAbs inhiben la producción de citocinas en el contexto de un MLR conducido por PC Este ejemplo demuestra que los anticuerpos dominio anti-CD28 son capaces de inhibir la producción de citocinas en el contexto de un MLR conducido por células dendríticas .

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron obtenidas por separación de gradiente de densidad sangre entera de donantes humanos normales. Las células T fueron preparadas a partir de fracciones E+ de PBMC roseteadas con eritrocitos de oveja (Colorado Serum Company) . Las células dendríticas (DCs) fueron generadas por la adhesión de los monocitos de fracciones E" de PBMC al plástico y cultivo con GM-CSF e IL-4 (Invitrogen) durante 7 días, seguido por la adición de LPS (Sigma, 1 µg/ml) durante 24 horas para inducir la maduración. Anticuerpos de dominio anti-CD28 se titularon en diluciones logarítmicas medias para una curva de respuesta a dosis de nueve puntos para evaluar su inhibición de una proporción 1:10 de células dendríticas a la interacción de células T. La producción de citocinas se midió en el sobrenadante por ELISA comercial (R & D Systems) . IL-2 e IFNy fueron medidos el día 2 después de la estimulación, y TNFoc se midió el día 3. La proliferación se midió mediante incorporación de 3 [H] -timidina en el día 5. Los valores EC50 se generaron a partir de curvas de inhibición de cada tratamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 8. "239-891-D70C P30L PEG" y "239-891-D70C P40B PEG" abajo indican el anticuerpo de dominio VK anti-CD28 humano (dAb) lh-239-891-D70C PEGilado con un polietilenglicol lineal de 30 kDa o ramificado de 40 kDa, respectivamente.

Tabla 8 Ejemplo 10 dAbs CD28 son igualmente eficaces en la inhibición de la proliferación de células T impulsada por CD80 vs CD86 Este ejemplo demuestra que los anticuerpos de dominio anti-CD28 inhiben la proliferación de células T impulsada tanto por CD80 como por CD86.

Células T fueron preparadas a partir de fracciones E+ de PBMC roseteados con eritrocitos de oveja. Células de ovario de hámster chino (CHO) transíectadas establemente con cualquiera de CD80 o CD86 humano se combinaron con células T en presencia de 1 ug/ml de CD3 (0KT3) . Los anticuerpos de dominio anti-CD28 se titularon en diluciones logarítmicas medias para una curva de respuesta a dosis de nueve puntos para evaluar su inhibición de una proporción 1:3 de CD80 o CD86-CHO a la interacción de células T. La proliferación se midió por incorporación de 3 [H] -timidina en el día 5. Los valores EC50 se generaron a partir de curvas de inhibición de cada tratamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Ejemplo 11 CD28 dAbs inhiben la proliferación de células T Iniciada por APCs diferentes Este ejemplo demuestra que los anticuerpos de dominio anti-CD28 inhiben la proliferación de células T iniciada por diferentes células presentadoras de antígeno.

Las células T fueron preparadas a partir de fracciones E+ de PBMC roseteadas con eritrocitos de oveja (Colorado Serum Company) . Las células dendríticas (DCs) fueron generados por la adhesión de los monocitos de fracciones E" de PBMC a plástico y cultivo con GM-CSF e IL-4 (Invitrogen) durante 7 días, seguido por la adición de LPS (Sigma, 1 ug/ml) durante 24 horas para inducir la maduración. Los monocitos se prepararon de fracciones E" de PBMC por elutriación. La línea de células linfoblásticas (PM-LCL) es una línea de células B transformada con EBV de un donante sano. Las diferentes APCs se combinaron con células T alogeneicas en una proporción de 1:50. Anticuerpos de dominio anti-CD28 se titularon en diluciones logarítmicas medias para una curva de respuesta a dosis de nueve puntos para evaluar su inhibición de la proliferación, que se midió por incorporación de 3 [H] -timidina en el día 5. Los valores EC50 se generaron a partir de curvas de inhibición de cada tratamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 dAb DCs Células B LCL Monocitos 239-891 (n = 2) 0.2, 0.2 0.3, 0.1 0.2, 1.4 . 239-891 -D70C P30L PEG 0^5 ± 0.1 0.8 ± 0.3 2.3 ± 0.8 239-891-D70C P40B PEG 1.2 ± 0.1 2.4 ± 0.4 1 ± 4 .

Ejemplo 12 Los anticuerpos de dominio anti-CD28 carecen de actividad agonista Este ejemplo demuestra que los anticuerpos de dominio anti-CD28 carecen de actividad agonista.

El anticuerpo de dominio anti-CD28 239-891-D70C y el anticuerpo anti-CD28 humano mitogénico 5.11A1 se titularon por separado en diluciones logarítmicas medias en PBS, recubiertas en la parte inferior de placas de fondo redondo de 96 pocilios y dejadas secar al aire. PBMC se aislaron de sangre entera de donantes humanos normales y se añadió a pocilios que contenían los anticuerpos secados al aire. La proliferación se midió por la incorporación de 3 [H] -timidina en el día 3, como se muestra en la figura 10A, y la producción de IL-2 se midió, como se muestra en la figura 10B.

Ejemplo 13 Los anticuerpos de dominio anti-CD28 se unen a su objetivo in vivo y carecen de actividad agonista Este ejemplo demuestra que los anticuerpos de dominio anti-CD28 se unen a su objetivo in vivo y carecen de actividad agonista.

A monos macacos se les administró una sola dosis subcutánea del anticuerpo de dominio humano VK anti-CD28 (dAb) lh-239-891-D70C PEGilado ya sea con un polietilenglicol (PEG) lineal de 30 kDa o ramificado de 40 kDa .

La ocupación del receptor CD28 (RO) en células T auxiliares de sangre periférica (CD4+CD3+CD8- ) se controló a las 2, 4, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 408, 504 y 672 horas después de la dosis utilizando citometría de flujo. Hasta 100% de RO se observó y se sostuvo por un período que se correlacionó con las concentraciones plasmáticas del fármaco.

A pesar de que los primates no humanos son insensibles a síndrome de liberación de citocinas (CRS) en sí (revisado en Horvath y Milton, Toxicol . Pathol . 37(3): 372-383 (2009) ) , la presencia de aumentos moderados en las concentraciones de citocina puede ser útil para predecir el CRS en humanos. Por lo tanto, las concentraciones plasmáticas de citocinas (IL-?ß, IL-2, IL-5, IL-6, IFN-? y TNF-a) se evaluaron pre-dosis y 2, 4, 8 y 24 horas después de la dosis con un ensayo a base de esferas multiplexadas . No se observó liberación de citocinas relacionada con fármacos, con la mayoría de las concentraciones de citocinas por debajo del límite de detección. La ausencia de efectos incluso moderados de este dAb sobre las concentraciones plasmáticas de citocinas es compatible con una falta de actividad agonista .

Debido a la ausencia de CRS en primates no humanos, el seguimiento de los recuentos de células T de sangre periférica puede predecir la activación de células T no deseada y la depleción de células T en humanos (Horvath y ilton (2009) Toxicol . Pathol . 37 (3): 372-83). Por lo tanto, los recuentos de células T en sangre periférica fueron controlados a las 2, 4, 24, 48, .96, 168, 240, 336, 408, 504 y 672 horas después de la dosis mediante citometría de flujo. No hubo cambios rápidos p profundos en recuentos de células T de sangre periférica similares a los observados en humanos tras una dosis única del anticuerpo monoclonal superagonista TGN 1412 (Suntharalingam et al. (2006) New Engl . J. Med. 355 (10) : 1018-28) o en primates no humanos después de la dosificación con 0KT3 y HuM291 (revisado en Horvath y Milton, 2009) . La falta de un efecto rápido y/o profundo de este dAb en recuentos de células T de sangre periférica es compatible con una falta de actividad agonista.

La divulgación establecida en este documento ha sido mostrada y descrita particularmente con referencias a modalidades específicas del mismo. Será entendido por los expertos en la técnica que varios cambios en la forma y detalles se pueden hacer al mismo sin alejarse del alcance abarcado por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo de dominio (dAb) que se une a CD28 y previene la unión de CD28 a CD80 y/o CD86, caracterizado porque no reacciona en forma cruzada con CTLA4.

2. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la unión de CD28 a CD80 y/o CD86, en donde el dAb inhibe la unión de CD28 a CD80 y/o CD86 con una IC50 de alrededor de 100 nM, aproximadamente 50 nM, alrededor de 1 nM, aproximadamente 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 50 pM, alrededor de 10 pM, aproximadamente 5 pM, o alrededor de 1 pM.

3. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no induce sustancialmente la proliferación de células T en combinación con señalización del receptor de células T.

4. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no induce sustancialmente la secreción de citocinas por células T en combinación con señalización del receptor de células T.

5. El dAb de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la citocina es al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-6, IL-10, IL-

6. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la secuencia de aminoácidos MYPPPY de CD28.

7. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a. una secuencia de CDR1 al menos 50% idéntica a una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 529, y SEQ ID NO: 636; b. una secuencia de CDR2 al menos 50% idéntica a una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 530, y SEQ ID NO: 637, y c. una secuencia de CDR3 al menos 50% idéntica a una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 531, y SEQ ID NO: 638.

8. El dAb de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: a. una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO : 496, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 502 , SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 526, SEC ID NO: 529, y SEQ ID NO: 638; b. una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 503 , SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 527, SEC ID NO: 530, y SEQ ID NO: 637, y c. una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504 , SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528, SEC ID NO: 531, y SEQ ID NO: 638.

9. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, SEQ ID O: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID O: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID O: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID O: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO.607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 617, y SEQ ID NO: 622.

10. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID, NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 617, o SEQ ID NO: 622 por no más de 25 aminoácidos.

11. El dAb de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es configurado para aumentar su vida media in vivo.

12. El dAb de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la configuración comprende enlazar el dAb a polietilenglicol (PEG) por una reacción de PEGilación.

13.. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el PEG es enlazado a través de un residuo de cisteína o lisina.

14. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el PEG mide alrededor de 10 a aproximadamente 50 kD.

• 15. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque tiene un tamaño hidrodinámico de por lo menos aproximadamente 24 kD.

16. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque que tiene un tamaño hidrodinámico de al menos aproximadamente 200 kD.

. 17. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque tiene una vida media ta de alrededor de 15 segundos a 12 horas.

18. El dAb de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque tiene una vida media t de cerca de 12 horas a cerca de 744 horas.

19. El dAb de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende secuencias de aminoácidos de FWl, FW2, FW3 y FW4 que corresponden a la FWl, FW2 , FW3 y FW4 de un anticuerpo humano.

20. El dAb de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las secuencias de FWl, FW2 FW3 y FW4 difieren de las FWl, FW2 , FW3 y FW4 de un anticuerpo humano por no más de 10 aminoácidos.

21. El dAb de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las secuencias de FWl, FW2 , FW3 y FW4 son idénticas a las FWl, FW2 , FW3 y FW4 de un anticuerpo humano .

22. El dAb de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de FW2 es idéntica a la FW2 de un anticuerpo humano.

23. El dAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene al menos tres características seleccionadas del grupo que consiste en: a) impide la unión de CD80 y CD86 a CD28, b) no agoniza la señalización de CD28 en combinación con la señalización del receptor de células T, c) tiene una ¾ de alrededor de 50 nM a aproximadamente 1 pM para unión a CD28, d) tiene una vida media ta de aproximadamente 15 segundos a alrededor de 12 horas, e) tiene una vida media tp de aproximadamente 12 horas a alrededor de 336 horas, f) se une a una secuencia MYPPPY, y g) una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 529, y SEQ ID NO: 636, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 530, y SEQ ID NO: 637 y una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO : 504, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO.510, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 528 , SEQ ID NO: 531, y SEQ ID NO: 638.

24. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para el dAb de conformidad con la reivindicación 1.

25. Uso del anticuerpo de dominio (dAb) de conformidad con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, en donde el paciente está en necesidad de un anticuerpo de dominio de unión a CD28.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el dAb antagoniza la unión de CD28 a CD80 y/o CD86 en el individuo.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el individuo tiene o está en riesgo de tener una enfermedad inmune .

28. El uso de conformidad con la reivindicación 27 > en donde la enfermedad inmune es una enfermedad autoinmune o una enfermedad relacionada con injerto.

29. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde la enfermedad relacionada con injerto se selecciona del grupo que consiste en rechazo de aloinjerto, rechazo de trasplante de xenoinjerto, y enfermedad de injerto contra huésped.

30. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en: lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes, psoriasis, esclerodermia, aterosclerosis , enfermedad inflamatoria del intestino y colitis ulcerosa.

31. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del dAb de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

32. Un anticuerpo caracterizado porque se une el mismo epítopo que el anticuerpo de dominio (dAb) lh-239-891 (D70C) (SEQ ID NO: 543) .

33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque es un dAb.

34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el dAb es lh-239-891 (D70C) (SEQ ID NO: 543) .

35. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el dAb comprende un primer dominio variable individual que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable individual que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD28, y en donde el segundo antígeno es un antígeno que no es CD28.

36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el segundo antígeno es un antígeno de superficie de células presentadoras de antígeno o un antígeno de superficie de células T.

37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el segundo antígeno es una citocina.

38. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32.

39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende además un agente inmunosupresor/inmunomodulador y/o antiinflamatorio .