ES2680570T3 - Anticuerpos humanizados anti-CD28 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de enlace consistente en: - un primer dominio variable (también aquí definido como "dominio variable de cadena pesada") definido por la siguiente secuencia:**Fórmula** donde dicho dominio variable puede además comprender opcionalmente un residuo Q en su extremo de terminal N; - un segundo dominio variable (también aquí definido como "dominio variable de cadena ligera") definido por la siguiente secuencia:**Fórmula** KR, donde X >= C o A.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Anticuerpos humanizados anti-CD28

La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados que se enlazan con CD28, y fragmentos monovalentes de los mismos, y sus usos terapéuticos, en particular en el contexto de regulación de activación de célula T.

La activación anormal de células T está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades autoinmunes, y también en el fenómeno de rechazo de trasplante, donde provocan una respuesta inmune dirigida contra el órgano trasplantado que se desarrollará.

Una de los sistemas más importantes para regular la activación de linfocito T es el sistema molecular B7/CD28/CTLA4. Este sistema juega, por ejemplo, un papel esencial en los mecanismos de rechazo de trasplante (WOODWARD et al., Transaplante, 55, 14-20, 1998). Las moléculas B7.1 (CDE80) y B7.22 (CD86) cargadas por APCs pueden activar el receptor CD28 y también el receptor CTLA4 de linfocitos T. La activación de CD28 envía al linfocito T una señal positiva que estimula a la célula; por otro lado, la activación de CTLA4 envía una señal negativa que lleva a una no respuesta (anergia) (FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188, 205-210, 1998).

Los linfocitos T en reposo expresan una gran cantidad de CD28 y muy poco CTLA4. Cuando hay un primer contacto cognitivo entre un APC y un linfocito T, la interacción CD28/B7 se favorece, lo que activa la célula. Es solamente varias horas después del inicio de la activación que, debido al aumento en la expresión de membrana de CTLA4, cuya afinidad para B7 es de 5 a 10 veces mayor que la de CD28, la interacción B7/CD28 se desplaza en favor de una interacción B7/CTLA4.

Los linfocitos T reguladores expresan una gran cantidad de CD28 y de CTLA4 que previenen o permiten, respectivamente, la actividad supresora de linfocitos T reguladores. En presencia de un APC que expresa un alto nivel de B7, la interacción CD28/B7 previene la actividad supresora de linfocitos T reguladores (Sansom, et al, Immunol. 24, 314-319, 2003).

La inhibición selectiva de la señal agonista dada para la célula T por CD28, que deja el sistema antagonista consistente en el par CTLA4/B7 intacto, por medio de bloqueo específico de la interacción CD28/B7, hará posible prevenir la activación de linfocito T y promover la supresión inmune mediante linfocitos T reguladores. Tal bloqueo específico de la interacción CD28/B7 puede obtenerse usando algunos anticuerpos dirigidos contra CD28.

Estos anticuerpos se usarán en una forma monovalente (por ejemplo, como fragmentos Fab o scFV), ya que cuando se usan en su forma nativa divalente, su enlace con CD28 provoca la dimerización y la activación de su receptor. Los fragmentos Fab contienen, cada uno, una cadena ligera y la primera mitad de una cadena pesada; los fragmentos scFv consisten en porciones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo matriz, conectadas entre sí por medio de un conector variables (CLACKSON, et al., Nature, 352, 624-628, 1991), formando así una proteína de cadena única. Un anticuerpo así es el anticuerpo CD28.3, producido por la línea celular de hibridoma CNCM I-2582, y desvelado en la solicitud PCT WO 02/051871. Este anticuerpo, cuando se usa en forma monovalente como los fragmentos scFV, es capaz de bloquear in vitro al receptor CD28 sin activarlo (PCT WO 02/051871; VANHOVE et al., Blood, 102, 564-70, 2003), y también ha demostrado su eficacia in vivo en modelos de trasplante de órganos en ratones y en primates (POIRIER et al., Congreso Mundial de Transplantes, Sidney, Australia, Agosto 16-21,2008; POIRIER et al., Sci Trans Med., 2:17, p17ra10, 2010).

Un inconveniente de todos los anticuerpos monoclonales derivados de fuentes murinas es su inmunogenicidad cuando se administran a sujetos humanos. Provocan una respuesta inmune anti-ratón que da como resultado una menor eficacia del tratamiento, en particular cuando se requiere una administración repetida.

Este inconveniente puede evitarse, en principio, mediante el uso de anticuerpos humanizados. El objetivo de la humanización es obtener un anticuerpo recombinante que tenga propiedades de enlace con antígeno similares a las del anticuerpo monoclonal de ratón del cual se derivaron las regiones determinantes de complementariedad (RDC), y que es mucho menos inmunogénico en humanos.

Las RDC son las porciones de los dominios variables de un anticuerpo que contactan directamente con el antígeno y determinan la especificidad de enlace con antígeno; las regiones del armazón (RA) que están situadas entre RDC en los dominios variables no contactan directamente con el antígeno, pero sirven como un andamio para mantener la estructura global de los dominios variables.

Se han presentado varias técnicas para humanización de anticuerpos. Las más usadas se basan en “injerto RDC”, que implica el trasplante de las RDC de un anticuerpo murino a RA humanas apropiadas. Sin embrago, en muchos anticuerpos, algunos residuos de RA son importantes para el enlace de antígeno, porque influyen en la conformación de RDC y por lo tanto en sus propiedades de enlace con antígeno, en particular la afinidad de enlace.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Una pérdida en la afinidad de enlace es particularmente negativa en el caso de que se pretenda usar el anticuerpo en una forma monovalente que generalmente muestra menos afinidad para el antígeno que el anticuerpo divalente nativo. Así, en la mayoría de los casos, es además necesario, con el fin de obtener una suficiente afinidad de enlace, reintroducir uno o más residuos de armazón del anticuerpo humano en las RA humanas, con el riesgo de que vuelva a aparecer de manera simultánea inmunogenicidad no deseada.

Otra técnica para humanización de anticuerpos, llamada “desinmunizacino” implica la identificación dentro de las regiones RA del anticuerpo, de célula B y epítopes de célula T reconocidos como “extraños” y por lo tanto potencialmente inmunogénicos en humanos, y retirarlos mediante sustituciones apropiadas de inmunoácidos. Esta técnica, sin embargo, también conlleva el riesgo de que se eliminen residuos de MA importantes para el enlace de antígeno. Además, algunos epítopes inmunogénicos pueden estar situados en las RDC e intentar retirarlos implica un riesgo muy alto de destruir no solamente la afinidad enlace con antígeno sino también la especificidad de enlace con antígeno del anticuerpo.

Por lo tanto, una principal preocupación en la humanización de anticuerpos es determinar qué residuos de aminoácidos son cruciales para retener las propiedades de enlace con antígeno. Se han propuesto varios métodos para predecir los sitios más apropiados para sustitución en las regiones RA. Aunque proporcionan principios generales que pueden ser de alguna ayuda en las primeras etapas de humanización, el resultado final varía en gran medida de un anticuerpo a otro. Así, para un anticuerpo dado, el muy difícil predecir qué sustituciones proporcionarán el resultado deseado. En el caso donde no sólo hay sustituciones en RA, sino también en RDC, será necesario disminuir satisfactoriamente la inmunogenicidad en humanos, el resultado final se vuelve totalmente impredecible.

Tan et al., Blood 96:11, 31a, 2000 desvela un método para producir un anticuerpo funcional anti-CD28 humanizado;

Saldanha: “Capítulo 6: Ingeniería molecular I: Humanización” en: Stephan Duebel: “Manual de Anticuerpos Terapeuticos”, Wiley-VCH, 119-144, 2007 desvela métodos de humanización de anticuerpos.

WO 2010/009391 desvela anticuerpos de dominio que consisten en o comprenden un único dominio variables de inmunoglobulina que se enlaza específicamente y antagoniza la actividad de CD28.

WO 2010/082136 desvela anticuerpos monovalentes recombinantes que son heterodímeros de una primera cadena de proteínas que comprende un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo de interés y los dominios CH1 y CH3 de una inmunoglobulina IgG y una segunda cadena de proteínas que comprende el dominio variable de la cadena ligera de dicha inmunoglobulina de interés y los dominios CH2 y CH3 de dicha inmunoblobulina IgG.

WO 2010/070047 desvela polipéptidos solubles de enlace con CD47, para su uso como un medicamento, en particular para la prevención o tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios.

Los inventores han tenido éxito en la producción de CD28.3 humanizado (a partir de ahora referidos como hCD28.3), con una baja inmunogenididad, y que, aunque tiene varias sustituciones de aminoácidos que incluyen la sustitución no conservadora K^-Q en CDR2 de la cadena pesada, conserva las propiedades de enlace con CD28 del ratón matriz CD28.3. Cuando se usa en una forma monovalente, el hCD28.3 de la invención también retiene las propiedades de enlace con CD28 del ratón matriz CD28.3.

La presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de enlace con CD28 consistente en:

- un primer dominio variable (también aquí definido como “dominio variable de cadena pesada”) definido por la siguiente secuencia:

VQLOQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIIIWIKLRSGQGLEWl

GWFYPGSNDIQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSG

YDALPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: I).

donde dicho dominio variable puede además comprender opcionalmente un residuo Q en su extremo de terminal N;

- un segundo dominio variable (también aquí definido como “dominio variable de cadena ligera”) definido por la siguiente secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCK.TNENIYSNLAWYQQK.DGKSPQLL

IYAATHLVEGVPSRFSGSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEI

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

KR, donde X = C o A.

Aquí también se desvela un anticuerpo que tiene un sitio de enlace con CD28 consistente en:

- un primer dominio variable que tiene las RDC del dominio variable de la SEQ ID NO: 1;

- un segundo dominio variables que tiene las RDC del dominio variable de la SEQ ID NO: 2.

El término “anticuerpo anti-CD28” aquí se refiere a cualquier proteína de enlace con antígeno que tiene al menos un sitio de enlace con antígeno (consistente en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada) capaces de enlazarse específicamente con CD28. Abarca anticuerpos en una forma divalente (como moléculas nativas de inmunoglobulina o fragmentos F(ab)'2) con dos sitios de enlace con CD28, así como anticuerpos en una forma monovalente que tienen un único sitio de enlace con CD28 (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', Fv y scFv). En la mayoría de los casos, se preferirán los anticuerpos en una forma monovalente.

Incluye anticuerpos recombinantes particulares que comprenden un sitio de enlace con CD28 asociado con uno o más polipéptidos heterólogos.

A modo de ejemplo, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un fragmento Fab o Fab' recombinantes que contiene el dominio constante CH1 de una inmunoglobulina humana fusionado en el extremo de la terminal C del domino variable de la SEQ ID NO: 1, y el dominio constante CL de una inmunoglobulina humana fusionado en el extremo de la terminal C del dominio variable de la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de tal fragmento Fab recombinante es un fragmento Fab con una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos 21-251 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos 21-234 e la SEQ ID NO: 6.

También, un anticuerpo hCD28.3 puede comprender, además de los dominios variables de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, definidas anteriormente, uno o más de los siguientes componentes:

-una región constante humana (Fc). Esta región constante puede seleccionarse entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y un isotipo, que incluyen, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes preferentes se seleccionan entre dominios constantes de IgG, en particular IgG4.

- una proteína que hace posible prolongar la vida media del plasma cuando se administra in vivo bajo formas monovalentes como se desvela, por ejemplo, en PCT WO 02/051871; en una realización preferente, dicha proteína es los dominios CH2-CH3 de una molécula IgG, como se desvela en PCT/IB/2010/000196; de acuerdo con esta realización, un anticuerpo monovalente hCD28.3 es un heterodímero de:

- una primera cadena de proteínas consistente esencialmente, desde su terminal N a su terminal C, en:

*una región A que tienen la SEQ ID NO: 1;

*una región B consistente en un conector peptídico y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina IgG;

- una segunda cadena de proteínas consistente, esencialmente, desde su terminal N a su terminal C, en:

*una región A' que tienen la SEQ ID NO: 2;

*una región B idéntica a la región B del primer polipéptido.

Preferentemente, el conector peptídico es la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana que tiene la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7), y los dominios CH2 y CH3 son aquellos de una inmunoglobulina de la subclase IgG4.También se puede usar una versión acortada de dicha región bisagra, que tiene la secuencia DKTHTCPPCP (SEQ ID No: 8):

De acuerdo con una realización preferente, la secuencia de polipéptido de la primera cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-368 de SEQ ID NO: 10, y la secuencia de polipéptido de la segunda cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-355 de SEQ ID NO: 12. De acuerdo con otra realización preferente, la secuencia de polipéptido de la primera cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-373 de SEQ ID NO: 14, y la secuencia de polipéptido de la segunda cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-360 de SEQ ID NO: 16.

Opcionalmente, un anticuerpo h CD28.3 de la invención puede además comprender uno o más de los siguientes componentes

- una proteína que tiene actividad farmacológica (por ejemplo, una toxina);

- uno o más polipéptidos de etiqueta.

Alternativamente, para prolongar la vida media del plasma, en particular cuando están bajo la forma de fragmentos Fab, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polímeros solubles en agua como glicol de polietileno (PEGilación). La pegilación es una manera clásica para mejorar las propiedades farmacocinéticas de polipéptidos terapéuticos, y puede conseguirse mediante técnicas conocidas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En este aspecto, los inventores descubrieron que la sustitución del residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variables del CD 28.3 nativo por un residuo de alanina o asparraguina (dando como resultado un anticuerpo que tiene una cadena ligera que contiene un dominio variables de SEQ ID NO: 2 donde X = A o N) permitió una mejor eficacia en la pegilación del anticuerpo usando glicol de polietileno activado con maleimida (residuo de cisteína reactiva objetivo), sin modificar sustancialmente su actividad de enlace, aunque la cisteína-96 está comprendido en el CDR3 de la cadena ligera del anticuerpos. El beneficio de la sustitución del residuo original de cisteína en la posición 96 del dominio variables consiste en una ramificación específica del glicol de polietileno en el residuo de cisteína C-terminal de la cadena pesada. Sin sustitución del residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variables del CD28.3 nativo, el glicol de polietileno activado con maleimida puede enlazarse con el residuo de cisteína y alterar la actividad de enlace de la molécula Faba. Los inventores también descubrieron que la adición de una extensión de di-alanina después de la cisteína en terminal C de la cadena pesada también dio como resultado una mejor eficacia de pegilación.

La invención proporciona un polinucleotido que codifica el anticuerpo de la invención.

También se desvela un polinucleótido seleccionado entre:

a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene las RDC de SEQ ID NO: 1, en particular un

polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 1;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene las RDC de SEQ ID NO: 2, en particular un

polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

c) un polinucleótido que codifica un anticuerpo hCD28.3 de la invención, como se ha definido anteriormente.

Los polinucleótidos de la invención también comprenden generalmente secuencias adicionales: por ejemplo, pueden comprender ventajosamente una secuencia que codifica una secuencia líder o péptido señal que permite la secreción de dicha cadena de proteínas.

La presente divulgación también abarca vectores recombinantes, en particular vectores de expresión, que comprenden un polinucléotido de la invención, asociados con elementos que controlan la transcripción y traslación que están activos en la célula huésped elegida. Los vectores que pueden usarse para construir vectores de expresión de acuerdo con la divulgación son conocidos por sí mismos, y se elegirán en particular como una función de la célula huésped que se pretenda usar.

La presente divulgación también abarca células huéspedes transformadas con un polinucleótido de la invención. Preferentemente, dicha células huésped se transforma con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena ligera de un anticuerpo hCD28.3 de la invención, y expresa dicho anticuerpo. Dichos polinucleótidos pueden insertarse en el mismo vector de expresión, o en dos vectores separados de expresión.

Las células huéspedes que pueden usares en el contexto de la presente invención pueden ser células procarióticas o eucarióticas. Entre las células eucarióticas que pueden usarse, se hará mención particular a las células de plantas, células de levadura, como Saccharomyces, células de insectos, como células de Drosophila o Spodoptera, y células de mamífero como células HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.

La construcción de vectores de expresión de la divulgación y la transformación de las células huéspedes puede realizarse mediante técnicas convencionales de biología molecular.

Otro objeto de la divulgación es un método para preparar un anticuerpo hCD28.3 de la invención. Dicho método comprende cultivar una célula huésped transformada con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena ligera de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.

Si el anticuerpo se secreta por la célula huésped, puede recuperarse directamente del medio de cultivo; si no es así, se realizar una lisis celular de antemano. El anticuerpo puede después purificarse el medio de cultivo o del lisado celular mediante procedimientos convencionales conocidos por sí mismos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, precipitación fraccionada, en precipitación particular con sulfato de amoniaco, electroforesis, filtración con gel, cromatografía por afinidad, etc.

Los anticuerpos hCD28.3 de la invención pueden usarse para obtener productos medicinales. Estos productos medicinales también son parte del objeto de la invención.

La presente invención también comprende una composición terapéutica que comprende un anticuerpo hCD28.3 de la invención, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Preferentemente, dicha composición es una composición para administración parenteral, formulada para permitir la administración de una dosis de desde 0,5 a 20 mg/Kg, ventajosamente de desde 5 a 10 mg/Kg de un anticuerpo hCD28.3 de la invención. La ruta de inyección de la composición puede ser preferentemente subcutánea o intravenosa.

Por ejemplo, anticuerpos hCD28.3 de la invención pueden usarse para obtener productos medicinales inmunosupresores que selectivamente bloquean el fenómeno de activación de célula T que implica el receptor CD28. Tales productos medicinales inmunosupresores que actúan mediante bloqueo selectivo de CD28 tienen aplicaciones en todas las condiciones patológicas dependientes de linfocito T, incluyendo en particular rechazo de trasplante, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocito T, como diabetes de tipo I, artritis reumatoide o esclerosis múltiples, e hipersensibilidad de tipo IV, que está incluida en fenómenos alérgicos y también en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas, en particular después de una infección con un agente patogénico (en particular, lepra, tuberculosis, leishmaniasis, listeriosis, etc.).

La presente invención se entenderá de manera más clara a partir de la siguiente descripción a continuación, que se refiere a ejemplos no limitativos de la preparación y propiedades de un anticuerpo hCD28.3 de acuerdo con la invención.

La construcción de vectores de expresión de la divulgación y la transformación de células huéspedes puede hacerse mediante técnicas estándares de biología molecular.

Un anticuerpo hCD28.3 de la invención puede obtenerse cultivando una célula huésped que contiene un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos, y recuperar dicho anticuerpo del cultivo de células huéspedes.

La presente invención se ilustrará además por la siguiente descripción adicional, que se refiere a ejemplos que ilustran las propiedades de anticuerpos hCD28.3 de la invención. Debería entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se dan únicamente a modo de ilustración de la invención y no constituyen de ninguna manera una limitación de los mismos.

Leyendas de los dibujos

Figura 1: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción Señal-VH-hCH1. Negrita: secuencia líder; Subrayado: posiciones de RDC de anticuerpo CD28.3 matriz. Cursiva: región CHI humana; Marcado y con doble subrayado: sustituciones hechas en la región VH de anticuerpo CD28.3.

Figura 2: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción Señal-VL-hCK. Negrita: secuencia líder; Subrayado: posiciones de RDC de anticuerpo CD28.3 matriz. Cursiva: región kappa c humana; Marcado y con doble subrayado: sustituciones hechas en la región VL de anticuerpo CD28.

Figura 3: A) densidad óptica a 405 nm para mayores concentraciones de FR104, hCD28.3 Fab o CD28.3 Fab en el Enlace ELISA; B) cálculo de las curvas de regresión, lo que permite la determinación de valores comparativos AC50.

Figura 4: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVHCD28.3-bisagra corta y1- hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG4 humano.

Figura 5: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVLCD28.3-bisagra corta y1- hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG4 humano.

Figura 6: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVHCD28.3-bisagra completa y1- hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG1 humano.

Figura 7: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVLCD28.3-bisagra completa y1- hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG1 humano.

Figura 8: propiedades de enlace Anti-CD28 de anticuerpos monovalentes hVH/VL CD28.3. Células COS se con-transfectaron con 2 |jg (cada una) de pSeñal-hVH- bisagra corta Y1-hY4CH2CH3 y pSeñal-hVL- bisagra corta Y1-hY4CH2CH3, o co-tranfectadas con 2 jg (cada una) de pSeñal-hVH- bisagra compoleta Y1-hY4CH2CH3 y pSeñal-hVL- bisagra completa Y1-hY4CH2CH3. Después de 6 días, los sobrenadantes se recogieron y los anticuerpos monovalentes se dosificaron usando un primer ELISA sándwich. Los sobrenadantes también se analizaron con un ELISA de enlace en moléculas diana CD28 inmovilizadas y unidas a anticuerpos monovalentes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

anti-CD28 se revelaron con anticuerpos Fc humanos etiquetados con peroxidasa. A: densidad óptica obtenida con moléculas indicadas de acuerdo con su concentración. B: tabla con curvas de regresión y el cálculo de ED50 (dosis efectiva 50), la concentración necesaria para alcanzar 50% de actividad de enlace en este ensayo.

Figura 9: anticuerpos monovalentes hVH/VL CD28.3 inhiben la secreción IL-2 por células T activadas. Las células T Jurkat se estimularon con superantígeno SEE y células que presentan antígeno Raji durante 48 horas, en presencia de concentraciones indicadas de anticuerpos monovalentes purificados hVH/VL bisagra corta y1- hY4CH2CH3. Los sobrenadantes se recogieron e IL-2 se midió con ELISA.

Figura 10: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3. Ruta 1: marcador; ruta 2: carga; ruta 3: pico 1; ruta 4: pico 2; ruta 5: pico 3.

Figura 11: Propiedades de enlace para CD28 de hCD28.3 Fabs recombinantes con o sin mutaciones C96. El gráfico muestra la actividad de enlace (eje Y) de acuerdo con la concentración de Fab (eje X).

Figura 12: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96A-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3. Ruta 1: marcadores MW; ruta 2: pre-cromatografía de proteínas pegiladas; ruta 3: pico 1 que contiene el Fab monopegilado, que representa el 41% del material de inicio.

Figura 13: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96A-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3 con una ecuencia de termina C CAA en la cadena pesada. Ruta 1: marcadores MW; ruta 2: pre-cromatografía de proteínas pegiladas; ruta 3: pico.

EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIÓTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FAB).

Cadena pesada:

La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión con la secuencia que codifica la región CH1 humana (Número de Acceso NCBI AAF03881) y con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pGA18 (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción Kpnl/BamHI y se subclonaron en los sitios Kpnl/BamHI del plásmido pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Los clones positivos se amplificaron y purificaron Midiprep libre de endotoxinas (Macherey-Nagel) para la etapa de transfección.

El plásmido resultante se designa pSeñal-VH-hCH1. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica la región CH1 humana (Número de Acceso NCBI AAF03881). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 1. También se representan como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 en el listado secuencia adjunto.

Cadena ligera:

La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica la región kappa c humana (Número de Acceso NCBI BAC01725) y con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pGA18 (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción KpnI/BamHI y se subclonaron en los sitios KpnI/BamHI del plásmido pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Los clones positivos se amplificaron y purificaron Midiprep libre de endotoxinas (Macherey-Nagel) para la etapa de transfección.

El plásmido resultante se designa pSeñal-VL-hCK. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica la región kappa c humana (Número de Acceso NCBI BAC01725). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 2. También se representan como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en el listado secuencia adjunto.

Expresión eucariótica

Las células COS se transfectaron con 2 |jg (cada una) pSeñal-VL-hCH1 y pSeñal-VH-hCH1 usando el kit de lipofección Fugene (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, dividieron en un tercio y se colocaron de vuelta en cultivo durante 3 días adicionales, después de lo cual los sobrenadantes celulares se recogieron.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La actividad del anticuerpo monovalente hCD28.3 se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 2 más abajo.

EJEMPLO 2: DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE ENLACE CON FRAGMENTO hCD28.3 FAB MEDIANTE ELISA

Las propiedades de enlace del fragmento hCD28.3 Fab se han comparado con aquellas obtenidas después de transfección de células Cos con plásmidos que codifican CD28.3 Fab (no humanizados) usando dos ensayos ELISA

*Primero (ELISA sándwich), las concentraciones de los fragmentos hCD28.3 y CD28.3 Fab en los sobrenadantes del cultivo de células COS transfectadas se han determinado usando un ELISA sándwich. En resumen, los anti-CD28 Fab contenidos en los sobrenadantes primero se capturan mediante un anticuerpo policlonal de conejo, específico para dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 (obtenidos después de inmunización de conejos con una Fv de cadena sencilla que contiene los dominios variables pesados y ligeros del CD28.3 nativo, y purificaron mediante inmunoadsorción en CD28.3 Fab-Sepharose). Las proteínas capturadas después se revelan con un anticuerpo monoclonal murino dirigido a la cadena kappa de IgG humano, seguido por un anticuerop anti-ratón de cabra policlonal etiquetado. El anticuerpo unido se reveló mediante colorimetría usando el sustrato TMB, y se leyó en 405 m.

La DO correspondiente a diferentes diluciones del sobrenadante se compara después con una curva estándar obtenida con cantidades conocidas de un CD28.3 Fab, llamado FR104, purificado del sobrenadante del cultivo de células CHO transformadas con técnicas estándares de cromatografía, y dosificadas con un ensayo BAC (ácido bisincrónico). FR104 contiene regiones VH y VL nativas (no humanizadas) del anticuerpo CD28.3. Por lo tanto, se puede evaluar la cantidad de proteínas Fab presentes en sobrenadantes celulares.

'Segundo (ELISA de enlace), para analizar la actividad de enlace de fragmentos hCD28.3 Fab comparado con CD28.3 Faba, CD28/Fc humano quimérico (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) se usó en 2 pg/ml en amortiguador de carbonato 0,05M pH 9.2 para cubrir los pocillos (50 pl/pocillo) de placas con microtítulo (Nunc Immunoplates) durante la noche a 4°C. Estas moléculas CD28 diana inmovilizadas se enlazarán solamente con moléculas inmunorreactivas con actividad anti-CD28.

Los pocillos después se lavaron 3 veces sucesivamente con 200 pL PBS-0,05% Tween, y saturaron con 100 pL PBS Tween 0,1% BSA 1% durante 2 horas a 37°C.

A continuación, después de 3 lavados con 200 pL PBS-0,05% Tween, se añadieron los sobrenadantes que contenían las concentraciones conocidas de fragmentos de CD28.3 o hCD28.3 Fab ((50 pl/pocillo) en diferentes diluciones en PBS-0,1% Tween y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de 3 lavados con 200 pL PBS- 0,05% Tween, se añadió un anticuerpo monoclonal dirigido a la cadena kappa de IgG humano (1/10000 diluciones) (1 horas, 37°C), seguido de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con peroxidasa (1/2000 diluciones), seugido de revelación colorimétrica usando el sustrato TMB y lectura a 405 nm.

Después, los resultados se muestran como la absorbancia (eje Y) medido con el ELISA de enlace, de acuerdo con la concentración de Fab (eje X), medido con el ELISA sándwich. Se determina un CA50 (Concentración de Anticuerpo 50) después de calcular la pendiente de cuerva en su rango lineal como la concentración de anti- CD28 Fab necesaria para alcanzar el 50% de la densidad óptica necesaria (DO) en el ensayo de enlace.

Los resultados se muestran en la Figura 3 y la Tabla I.

La Figura 3A muestra la densidad óptica en 405 nm para mayores concentraciones de FR104, hCD28.3 Faba o CD28.3 Fab en el ELISA de enlace.

La Figura 3B muestra el cálculo de curvas de regresión, lo que permite la determinación de valores comparativos CA50.

La Tabla I más abajo resume la DO50, la ecuación y la CA50 para FR104 estándar, y los fragmentos Fab VH-tipo salvaje + VL-tipo salvaje y Fab hCD28.3.

Tabla 1

DO50 Ecuación CA50

Std FR104

1.792 y = 1.1424Ln(x) -3.6351 115

CD28.3 Fab

1.82 y = 0.9776Ln (x) -3.2483 162

hCD28.3 Fab

1.804 y = 1.0217Ln(x) -3.2859 151

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Estos resultados muestran que el 50% de la actividad de enlace con CD28 podría alcanzarse a una concentración similar para fragmentos Fab VH-tipo salvaje + VL-tipo salvaje (CD28.3 Fab) y hCD28.3 Fab. La concentración es ligeramente inferior para el estándar, probablemente porque se purifica antes del ensayo. Así, hCD28.3 retiene las propiedades enlace con CD28 de las secuencias de CD28 VH y Vl de tipo salvaje.

EJEMPLO 3: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIOTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FV-FC) CON UNA BISAGRA CORTA y1 Y UN DOMINIO y4 CH2-CH3

Cadena pesada:

La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión de terminal C con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 8), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI

y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).

El plásmido resultante se designa pSeñal-hVH-bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura

4. También se representan como SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 en el listado secuencia adjunto.

Cadena ligera:

La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 8), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).

El plásmido resultante se designa pSeñal-hVL-bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura

5. También se representan como SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 en el listado secuencia adjunto.

Expresión eucariótica

Las células COS se transfectaron con 1 |jg (cada una) pSeñal-hVL- bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3 y pSeñal-hVH- bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3, usando el kit de lipofección Lipofectamine (Invitrongen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, tiempo después del cual los sobrenadantes celulares se recogieron. La actividad del anticuerpo monovalente se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 5 más abajo.

EJEMPLO 4: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIOTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FV-FC) CON UNA BISAGRA CORTA y1 DE LONGITUD COMPLETA Y UN DOMINIO y4 CH2-CH3

Cadena pesada:

La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión de terminal C con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 7), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI

y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El plásmido resultante se designa pSeñal-hVH-bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 6. También se representan como SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 en el listado secuencia adjunto.

Cadena ligera:

La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de longitud completa de IgG1 humano (SEQ ID NO: 7), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).

El plásmido resultante se designa pSeñal-hVL-bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica la región bisagra de longitud completa humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 7. También se representan como SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 en el listado secuencia adjunto.

Expresión eucariótica

Las células COS se transfectaron con 1 |jg (cada una) pSeñal-hVL- bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3 y pSeñal-hVH- bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3, usando el kit de lipofección Lipofectamine (Invitrongen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, tiempo después del cual los sobrenadantes celulares se recogieron. La actividad del anticuerpo monovalente se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 5 más abajo.

EJEMPLO 5: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENLACE DE ANTICUERPOS MONOVALENTES DE DOMINIOS HCD28.3-BISAGRA LONGITUD COMPLETA y1 Y4CH2-CH3 Y DOMINIOS HCD28.3-BISAGRA CORTA y1 Y4CH2-CH3 MEDIANTE ELISA

Las propiedades de enlace de los anticuerpos monovalentes hCD28.3 de dominios hCD28.3-bisagra completa y1 y4 CH2-CH3 y hCD28.3-bisagra corta y1 y4 CH2-CH3 producidos mediante células COS transfectadas se han analizado usando dos ensayos ELISA.

*Primero (ELISA sándwich), las concentraciones de los anticuerpos monovalentes hCD28.3 en los sobrenadantes del cultivo de células COS transfectadas se han determinado usando un ELISA sándwich. En resumen, los anticuerpos monovalentes contenidos en los sobrenadantes primero se capturan mediante un anticuerpo policlonal de cabra dirigido a IgG humano. Las proteínas capturadas después se revelan con un anticuerpo específico Fc, IgG anti-humano policlonal de cabra biotinilado, y después una estreptavidina conjugada con peroxidasa. El anticuerpo unido se reveló mediante colorimetría usando el sustrato TMB, y se leyó en 405 m.

La DO correspondiente a diferentes diluciones del sobrenadante se compara después con una curva estándar obtenida con cantidades conocidas de anticuerpos monovalentes hCD28.3, purificados del sobrenadante del cultivo de células CHO transformadas con técnicas estándares de cromatografía, y dosificadas con un ensayo BAC (ácido bisincrónico).

'Segundo (ELISA de enlace), para analizar la actividad de enlace de anticuerpos monovalentes hCD28.3, CD28/Fc humano quimérico (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) se usó en 2 jg/ml en amortiguador de carbonato 0,05M pH 9.2 para cubrir los pocillos (50 jl/pocillo) de placas con microtítulo (Nunc Immunoplates) durante la noche a 4°C. Estas moléculas CD28 diana inmovilizadas se enlazarán solamente con moléculas inmunorreactivas con actividad anti-CD28.

Los pocillos después se lavaron 3 veces sucesivamente con 200 jL PBS-0,05% Tween, y saturaron con 100 jL PBS Tween 0,1% BSA 1% durante 2 horas a 37°C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

A continuación, después de 3 lavados con 200 pL PBS-0,05% Tween, se añadieron los sobrenadantes que contenían las concentraciones conocidas de los anticuerpos monoclonales que se analizarán (50 pl/pocillo) en diferentes diluciones en PBS-0,1% Tween y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de 3 lavados con 200 pL PBS-0,05% Tween, se añadió (1/500 diluciones; 1 hora, 37°C) un antisuero policlonal de conejo, específico para los dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 (obtenido después de inmunización de conejos con una cadena Fv sencilla que contenía los dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 nativo, y purificado mediante inmunoadsorción en CD28.3 Fab-Sepharose). Esto fue seguido de anticuerpos anti-conejo burro conjugados con peroxidasa (1/2000 diluciones) seguido de revelación colorimétrica usando el sustrato TMB y lectura a 405 nm.

Después, los resultados se muestran como la absorbancia (eje Y) medido con el ELISA de enlace, de acuerdo con la concentración del anticuerpo monovalente (eje X), medido con el ELISA sándwich. Se determina una CA50 (Concentración de Anticuerpo 50) después de calcular la pendiente de la curva en su rango lineal como la concentración de anticuerpo monoclonal necesaria para alcanzar el 50% de la densidad óptica necesaria (DO) en el ensayo de enlace.

La Figura 8 compara las actividades de enlace de anticuerpos monovalentes de dominios hCD28.3 bisagra completa IgG1 IgG4CH2-CH3 con dominios hCD28.3 bisagra corta IgG1 IgG4CH2-CH3 en el ELISA de enlace (Figura 8A).

La Figura 8B resume la ecuación, el factor de regresión y la CA50 para anticuerpos monovalentes.

Estos resultados muestran que el 50% de la actividad de enlace con CD28 podría alcanzarse a una concentración similar para anticuerpos monovalentes de dominios hCD28.3-bisagra completa y1 y4 CH2-CH3 o dominios hCD28.3-bisagra corta y1 y4 CH2-CH3.

EJEMPLO 6: ANTICUERPOS MONOVALENTES hCD28.3 PREVIENEN LA ACTIVACIÓN DE CÉLULA T

Para verificar que el anticuerpo monovalente hCD28.3 bloquea la activación de célula T dependiente de CD28, se estimularon células T humanas (células Jurkat) con superantígeno SEE presentado por la línea celular B Raji. La endotoxina SEE, cuando se presente a la línea RJI de linfoblastoide cleular B positivo clase II, activa la línea Jurkat de célula T que expresa Vp8 para secretar IL-2 (Herman et al., 1990, J. Exp. Med. 172:709). Ya que las células Jurkat expresan un alto nivel de CD28 y las células Raji expresan CD80/86, esta reacción es parcialmente dependietne de CD28. Cuando se mide la síntesis de interleuquina-2 en este ensayo mediante ELISA (kit ELISA MaxTM Set Deluxe Human IL-2; Biolegend #431805) después de 48 horas, en presencia de mayores concentraciones de dominios hVH/VL CD28.3-bisagra corta y1 Y4CH2-CH3.

Los resultados se muestran en la Figra 9. Revelan que los anticuerpos monovalentes hCD28.3 reducen la síntesis de IL-2 por células T de una manera dependiente de dosis.

EJEMPLO 7: PREPARACIÓN DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 PEGILADO

Un fragmento hCD28.3 Fab preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1 se pegiló con PEG 40 KDa activado con maleimida usando condiciones estándares para reducción y PEGilación.

En resumen, los fragmentos de anticuerpo Fab se concentración en 1 mg/mL y después se diafiltró contra 20 mM fosfato de sodio, 2 mM EDTA y pH 7,0. Los fragmentos de anticuerpo Fab' se redujeron después por la adición de cloruro de cisteamina en una proporción equivalente molar = 30:1 a temperatura ambientes. Después de 5 horas, la solución se aplicó a una columna para desalar. Se disolvió glicol de polietileno (PEG) (Sunbright GL2 400MA, NOF Corporation) en 20 mM Fosfato, 2 mM EDTA, pH 7,0 para dar 9% (p/p) solución. La solución Fab desalada y PEG se mezclaron en una proporción equivalente molar = 1:1,5 y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la PEGilación, el Fab-peg se purificó mediante cromatografía usando medio HP SP Sepharose. La proteína diana se eluyó con un gradiente de sal de 0 a 1 M NaCl. Los picos eluidos se analizaron mediante SDS-PAGE. El pico 2 representó material monopegilado, pico 2 material no pegilado y pico 3 material polipegilado.

Los resultados se muestran en la Figura 10.

Estos resultados muestran que una parte significativa de las proteínas Fab de CD28.3 mAb presenta un perfil de pegilación perturbado que da como resultado una producción de Fabs monopegilados de aproximadamente 5% solamente (pico 1).

El CD28.3 mAb contiene un residuo de cisteína (C96) que no está acoplado en puentes de disulfuro intra o inter-cadena, en la posición 96 de la cadena ligera de dominio variables. La cisteína libre poseerá una mayor reactividad que los residuos de cisteína acoplados en los puentes de disulfuro y por lo tanto serán preferentemente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

objetivos de pegs activados con maleimida. Por lo tanto, es posible que una segunda pegilación no deseada ocurra en este residuo.

Para resolver este problema se realizó un estudio de mutación de VL-C96 para determinar si era posible sustituir el residuo C96 por otro aminoácido sin modificar las propiedades de enlace del anticuerpo.

Se construyeron códigos de plásmido para Fabs anti-CD28.3 humanizado con C96 no modificado en la cadena ligera, o con C96 para mutaciones A, G, S, V, T o R y se transfectaron a células COS mediante lipofección, como se desvela en el Ejemplo 1. Los sobrenadantes celulares primero se analizaron mediante ELISA sándwich para determinar la concentración total de Fab, como se desvela en el Ejemplo 2. Después, los sobrenadantes se analizaron mediante ELISA para determinar la actividad de enlace en CD28 recombinante inmovilizado, como se desvela en el Ejemplo 2.

Los resultados se muestran en la Figura 11. Estos resultados muestran que, a diferencia de otras sustituciones analizadas, las sustituciones con C96A dieron como resultado un anticuerpo completamente activo y que la sustitución por C96N dio como resultado solamente una reducción moderada de actividad.

La variante del fragmento Fab C96A se pegiló y purificó mediante cromatografía como se ha descrito anteriormente. La pre-cromatografía de proteínas pegiladas y los picos de elución se analizaron mediante SDS- Page. Los resultados se muestran en la Figura 12. El pico 1 representa material monopegilado.

Estos resultados muestran que el fragmento Fab C96A puede pegilarse con una eficacia que alcanza el 41% (Figura 12).

Ventaja del extremo CAA en terminal C de la cadena pesada. El medio molecular inmediato de una cisteína libre podría modificar su accesiblidad para pegilación de maleimida y por lo tanto modificar la producción de la reacción de pegilación. Una posible opción para la cisteína de terminal C es ser el último aminoácido de la cadena pesada. Otra opción es la adición de “aminoácidos sustancia” en la posición de terminal C, después de la última cisteína. Por lo tanto, se comparó la eficacia de pegilación de una molécula Fab' de la variante C96A de CD28.3 humanizado Mab con la cisteína de terminal C que es el último aminoácido de la cadena pesada (variante C; datos mostrados en la Figura 12) con una molécula similar con la última cisteína de terminal C seguida por dos alaninas (variante CAA). Los datos demostraron claramente y reproduciblemente que la variante CAA podía pegilarse con un 20% más de eficacia (Figura 13). De hecho, la producción de pegilación que fue del 41% para la variante C96A alcanzó el 52% para la variante C96A-CAA.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TcL PHARMA

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)

MARY, Caroline POIRIER, Nicolas VANHOVE, Bernard

<120> ANTICUERPOS HUMANIZADOS ANTI-CD28

<130> MJP/11 - f2173/3 WO

<150> EP 10290080.0 <151> 2010-02-18

<160> 16

<170> PatentIn Versión 3.5

<210> 1 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

i2:20>

<223> hCDÍ3.3 vil ■í400> 1

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ly£ Lys feo iLy Ala oír L 5 10 15

Vil Ly* Val Ser Cya LyS Ala Ser Gly Tyt Thr Phe Thr Glu Tyr TI*

20 25 30

IL* Ni4 Trp I1h_i _,ys lt:il Arq S-tjt Gly Gli- Gly ItV GLy Trp TI* Gly 35 40 45

Trp Fhe Tyr Pro Gly üer Asn Asp lie Glr. Tyr Aan Ala Gln Phe Lys " 5C 55 CD "

Gly Lye Ala Thr T.©u Thr Ala Aep lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met

$5 70 75 £0

Glu Leu Thr Giy Leu Thr Pro Glu Aíp Ser Ala Val Tyr p>i© Cyí Ala 0S 90 95

Arg Arg Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala leu Pro Tyr Irp Gly Gln LOO 105 1L0

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

«¡2l0>

2

<2lí>

103

<212>

PRT

<213> Secuencia Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

-=220=-

<223>

hCD£S L 3 VI

<220>

<2?~í>

MESC_ FEATVRK

<222>

(96) . . (96)

<223>

Has - Cys, a

<40Q>

2

Asp Ele Gln.

Hat Thr

13

15

Asp Arg Va.1 Thr lie Tbr Cys Lys Thr Asr. Gln Asn lis Tyr Ser Asn

20 25 30

LjH.í-.: Ala Tro Tyr Glfl GItl Lyts Asp Gly lys Sur Prp 3L:j L+y I4li Ilt 35 40 4-4

Tyr Ais Ala Thr Hi« Leu Tbl GIll Gly val Pro S*r Arg Pha Ser 50 55 6Q '

Ser Gly Ser Gly Tbr Gln Tyr Ser Leu Tbr lie Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 ea

Gl;i Asp> Fhe Gly Aen Tyr Tyr Cy& GJ n fíi* fu* Trp GLy Thr Pro Xa* 05 SO 95

Thr Phu Gly Gly Gly Thr ly( Luu Glv lio Lys Ar:j

100 105 '

<210>3

<211> 750 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Señal- VH-hCH1

<400> 3 atgga&tggt

gctggrgtctt tctcttcete ctgtcagtaa. ctgcaggtgt ecactccaag 60

gtcea&ctgc

agcagtctgg agetgagetg a&g&aacccg gggcgtcggt gaaagtctec 120

'Lacaaüycq ■_

□tggttacac cttcactgaa tatattatac actgga^aaa gctgaggtct 1B0

gg ac ag ggt e

tfegagfcggafc fcgggtggtfct taccctggaa gtaatgatat acagtacaat 24 0

gcgcaattca

agggcaaggc ca-cattgact. gc;ggar;aaai cctccagcac c-gtctatatg 300

gaacttactgr

gattgacacc cg-aggactct gcggrtctatt tttgtgcaag acgcgacgat 360

t fccfc ct ggrt t

acgacgccct tccttactgg ggccaaggga ct ctggtcac tgtctctgca 420

gctsgoacc*

aggigcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctecaag-ag- cacctctg-gg 480

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ggcacagcgg

ccctgggriug cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gaeggtgtcg 54 C

tggaactcag

gogccct-gac cagcggcgtg ciotcetter cggotgtcctz acagtcctca 600

ggact-ctact

ccctcagcag cgtggtga-cc gtgcoctcca gcagcttggg ■^acccagacc- 660

t*catotgei

aegtgaatea taageceaga ucaccugg t.ggacaagaa agttgagcec. i'J.O

asatcttgtg

eceasactca cewtgot&a 750

<210>4 <211> 251 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Señal- VH-hCH1

<4O0> 4

M*t Tío <T-y a Tr-fj. Vfel Ft,fí Iru Ph* IL*v L*u Sftt Val Thr Al» Gly

1 ' 5 " 10 15

val ]]j_3 s-er Ly3 v?.i eln leu sin Gl.i’ ser Gly Ala Glu Leu i.ya Lys

20 25 3D

Prc Gly Ala. San Val tys Val Ser Cys lya Ala Ser Gly Tyr Thr Pha 35 43 45

ThE Gilí Tyr £14 Tía Hi» Trp 1 !• Lys leu Arg Ser Gly Glfi Gly L4u

50 55 60

Glj Trp II* Gly Trp Ph* Tyt Prc Gly 5*r Asn Asp lie Glo Tyr Ain 65 70 75 EQ

Ala Gln Phe Lys Gly Lya Ala Th_r Ler Ttir Ala Aap Lys Ser Ser Ser " B5 30 35

Thr Val Tyr Met G3 v leu Thr Gly Leu Thr Pro Clu Aep Ser Ala Val 100 '-■OS 110

Tyr Phe Cya Ala Ar<g Arg Atp Asp Pile Ser Gly Tyr A*p Ala Leu Pro llh 120 12S

Tyr Trp Gly Gln. Gly Thr- leu VaL rhr Val Ser Ala Ala Ser Tlir Lya 13D 135 140

Gly Pro Ser Val Fbe Pro leu Ala Pro Ser Ser lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160

GLy Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys. Aep Tyr Phe Pro Glu Pro

165 110 115

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

Val Thr Val Sar Tro ftsn Ser Gly 180 " ’

PhG Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 195 200

Val Thr Val Pro 3er Ser Ser leu

JlO Í1Ü

Val Aan. llis _.ys Pro Ser Asa Thr 225 23Q

Lys Ser Cya Asp Lys Thr His Thr

245

Ala leu Thr Ser Gly Val His Thr 185 150

Gly leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 205

Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cye Aan

220

lys Val Asp lys Lys Val Glu Pro

235 240

Cys Ala Ala 25C

5

705

ADN

Secuencia Artificial

Señal- Vl-hCkappa

<4G0> 5 atgagtgtgc

ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt £0

gacatccaga

tgactcagtc tccatcttcc etatetgeat. ctgtgggaga cagggtcacc 12 C

atc-acgtgta

aaaeaaatga gaatatttac agtaatttag catggtatea geagaaagae ISO

ggaaaatete

ctcagctect gatetatget gcaacacact tagtagaggg tgtgccatca 240

aggttcagtg

gcagtggatc aggeae&eag tattccctca caatcagcag cctgcagcca 300

gaagattttg

ggaattatta etgtcaacac ttttggggrta □tccgtgcac gttcggaggg 300

gggaccaagc

tggaaataaa acggacggtg gctgcaccat. ctgtcttcat cttcccgcca 420

tctgatgagc

agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 4BC

cccagagagg

ccaaagtaca gtgga aggtg gataacgccc t-ccaatcggg taactcccag

gagagtgtea

eagageagga eageaaggae agcacetaea geeteageag eaeeetgaeg Í00

ctgageaaag

Gagaetacga gaaaeaeaaa gtctaegeet gcgaagtcac ceateaggge eso

etgagttcgc

ccgtcacaaa gagcttca&c aggggagagt gttaa 70 í

6

234

PRT

Secuencia Artificial

Señal- Vl-hCkappa

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de enlace consistente en:

   - un primer dominio variable (también aquí definido como “dominio variable de cadena pesada”) definido por la siguiente secuencia:

   VQLQQSGAELKK.PGASVK.VSCKASGYTFTEYIIHW1KLRSGQGLEWIGWFYP

   GSNDIQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSGY

   DALPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:l),

   donde dicho dominio variable puede además comprender opcionalmente un residuo Q en su extremo de terminal N;

   - un segundo dominio variable (también aquí definido como “dominio variable de cadena ligera”) definido por la siguiente secuencia:

   imagen1

   KR, donde X = C o A.
2. 2. Un anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monovalente.
3. 3. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 2, que es un heterodímero de:

   - una primera cadena de proteínas que tiene la secuencia de aminoácidos 21-251 de SEQ ID NO: 4;

   - una segunda cadena de proteínas que tiene la secuencia de aminoácidos 21-234 de SEQ ID NO: 6.
4. 4. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 3 donde la segunda cadena de proteínas comprende un dominio variable de SEQ ID NO: 2 donde X representa un residuo de alanina.
5. 5. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 4 que está pegilado.
6. 6. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. 7. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. 8. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento de una condición patológica seleccionad del grupo consistente en rechazo a trasplante, vasculopatía crónica de aloinjerto, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocito T, hipertensión, fenómenos alérgicos y enfermedades inflamatorias crónicas.

   1 a

   MG GAA TJ3 TGC TGG QIC ITT CTC TTC CK CTC TCA OtA ACT GGT <jtc CAC TOC AftG GTC CAA CFG CAC CAG TCT GGA GCT

   M E W 1 C W V F L F L L & V 1 r ja k ¿3 V H S K V 0 L Q Q 3 G A

   9

   Vllh RHK L10V 77

   GAG

   GTG AAG AAA ccc GCG TÍ’G GTG AAfl GTC TCC 7CC AAG GCG TCT GGT TAC AGC TTC ACT GAA TAT ATT Ata CAC tí-.;; ata AAG

   E

   - s tí P G A 3 V E V 3 C tí A 5 G Y T 7 ? h. ( i i H i tí

   3S

   Kfiiq 5 ó

   CTC

   AGG TCT GGA CAG ■GG7 CTC GAG TGG ATT GC-G TGG TTT TAC CCC GGA AGT AAr GA'i' ATA TAC ftAT gcg CAA TTC AAG c;c AAG

   T.

   13 6 G Q G L :-■ V) : C W F p G £ N D i 0 j M A { K tí G K

   67

   SHP 97

   GCC

   ACA TTG ACT GC ; GA-C A A A TCC 7 CC AGC ACC CTC TAT ATG CAA CTT ACT CCA TTG ACA CCC GAG GAC TCT GCG CTC TAT T7T TGT

   A

   T L T A D K 5 3 5 T V : K E L 7 G L T E t: D S A V Y 7 C

   X

   124

   GCA

   AQA C<;c ca;: GAT TTC TCT GGT TAC GAC GCC ctt CCT TAC TGC GGC CAA G jG ACT CTC GTC ACT TTC TCT CCA íTCT AGC ACC AAG

   A

   A

   R d D v $ G V D A L P V G Q g T L V T V 5 A A 5 T K

   1 ib

   1&3

   GtjC

   CCA TCC GTC rrc CCC CTG GCA ere TGC TCC AAS t'\GZ ACC TGT CGC GGC ACA GCG GCG ere C-GC TGC CTG GTC AAG GAC TAC T7.7

   G

   P £ V F A A p £ £ K :i T £ G G T A A L Q C i V K D Y f

   164

   107

   CCC

   GAA CCG GTG ATS GTG TCCF TGG AAC TCA GCC CCC CTG A<:¡: ÍB GEtí: gtg CAC ACC TTC ¡Tí.-G QCT GTC CTA CV.G TCC jv;.t GGA ct;.-

   P

   E r' V I V £ ;í w £ G A L T fl C V H T F i1 A V L Q s 5 G L

   1 33

   211

   TAC

   ICC CTC AGC AGC ere CTC ACC GTG CCC TCG AGC AGC TTG SCO ACG CAS ACC TAC ATC re,; ACC GTG AAT CAC AAG CCC ACC AAC

   Y

   s L ¿ 5 v y 7 7 F 7 5 5 L G T Q T V I t) 'T W H A P £

   T.¿

   231

   ACG

   AAS GTC GAC AAG AAA Stt GAG ccc aa; TCT TGT GAC rlAA Acr CAC ACA TGC fice GCA v'AA

   T

   K V D fí K V .7 p íf .7 C 0 K T IJ T C A A S í cp

   Figura 1

   - $

   at? «gt gtg CCS ict cig gtc Ct<f <jgg ttg fttg irtg ctg tgg ctt ac* g*t g-IC &<ja fcgt GAC ATC CAlG ATC ftd CAG TCT CCA

   H 5 V P I Q V L G L L L L W L . T D A & c 0 : Q M 7 Q s P

   D K’T

   C7A TCT GCA ict GTG C-GA GAC ASG -TV ACC ATC ACG 7G7 AAA ACA .-jv;1 GAS AAT ATT TAC AÍTT AAT TIA CCA TGG CAT 3? CAG

   é

   6 L S £ s V 0 £ i V T I T C K T N E H r Y 3 N L A M Y

   39 Cñ<3

   AAA CAG C-GA AAA TCT CC7 CAG CTC CTC ATC i'AT VCT SC A ACA CAC TIA 37 A GAG GGT GTG CCA TCA AYrt; AGT CGC AGT 66 GGA

   'i

   K D £ K 6 l; 0 !. L 1 v A A T 1! L V E G V P ;; p F ? 3 & c

   67 TCA

   GGC ACA CAG TAT CTC ACA ATC AGC AGC C73 CAG CCA CAA GAT TTT CCG AAT TAI TAC TCT CAA CAC T7T TGC GGT ñCT ;.'6 CCC

   3

   3

   T 0 Y 3 L T I § S L Q £ E 1) F G N Y Y C Q H F W G T r

   íf. TGC

   ACG l"l C GGA C¡t:s V!-V nc:c AAG CAA ATA AAA CGG ACG CTC TCT CCA CCA TCT GTG TTC ATC TTC CCC CCA TCT CAT CAG CAG

   C

   T F G G C 7 K I E 1 K S. T V A A P S í' : i y t> í D E 0

   L2S T'.'VT

   AAA Tl.T ■3,Vvl Af-T (TCC TCT GTT GTG TGC GTG GTG AAT AAC TTC TAT CCC ACA GAG GGC AAA GTA CAG TGG AAG gtí ; GAT AAG : 53 CC ■

   L

   K 5 G r A 3 V V C L L W W E Y r R y A K V Q h' ti V C A

   161 ere

   :'AA TCG GGT AAC TCG CAG GAG AGT GTG ACA GAG CAG GAG AC-C AAG GAC A - ■ A .■ ■ TAC AGC CTC AGC A.C A CC CTC ACG CTC 132

   L

   0 S G w 5 0 E S V T E Q n S K D r Y -S ¡. ■; T L T L 5

   183 flAA

   GCa Gfl.C TAC tíAlí Añft CA.C AAft GTG 7A.C GÍC TGC GAA GTT ACC Cat CAQ GGC ere AGT TCG CCC GTG ACA AAG AGC TTC AAC 211 AGC

   K

   A D y F K N K V Y A C E V T H Q G L S P V T ff 3 ;■ N Jí

   ¿12 214

   GGA GAG TCT TAA G E C .L'r¿:p

   Figura 2

   Enlace ELISA OD 405

   imagen2

   0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00

   Enlace ELISA >

   OD 405mm

   imagen3

   TU

   3

   ATS GAA TGG TGC TGG GTG Trc CTG TTC CTG CTG TCC GTG ACC GCT ■1 5

   1

   Me t Qlu Tr p Cya 7rp Val Fh * Leu The Leu L«u 3 o r Val Thr Ala 1 5

   ¿6

   c Ti C GTÚ CA£ TCC r. r.c Cñfi ÜTG CAG CTG CAG CACi VCT GGC GCC CAG 9 0

   16

   Gly V*1 H L h Ser ln Gln Vil G1 rt Leu G1 n Glh Ser Gly 0 1 * 7¡1 u 3 0

   91

   CTG AAC A.AG CCT CGC ccc rcc GTC fifiC GTE TCC 13 r ■ AAG etc TCC 125

   3 1

   Leu. L y a Li y 5 Pro G1 y Ala Ser Val iy> Va 1 Ser tí» Ly b ti l a Ser 4 5

   i Sí

   GGC TAC ACC TTC ACC ■GAS TAC ATC ATC CAC TGG ATC AAG CTG AGfl 185

   ■1 É

   Gly Tv r Thr Phc Tü r ílu 7 V !■ 114 I 1* Fl i £ T 1 Ld I lfl Ly i- L üT3 Re g 6 a

   1S1

   TCC GGC CAG ■GGC C 7G GAA TGG ATC GGC TGG TIC TAC CCT GGC rcc 225

   6 J

   s: y G i n ■Gly Leu Gly ■ =!■ lie G1 V _ i í' The Tíe í i i? Gly Sí-' 75

   226

   AAC i!AC 0.1 L -CAG TAC AAC Ü7 7 CAG TTC oí a ccc AAC ECC ace CTC 2?&

   7 £

   A 3 fl A 3-Jí? lie G 1 n T V r Ásrj Ala rJln Fh e Ly a Gly iy = Ala Thr Leu 90

   27 1

   ACC GCC cae AAC TCC TCC TCC fi.CC GTG TAC ATG CAA CTG ACC GGC : : i

   91

   Thr Ala a. s p Lys Ser Ser Sor Thr Val Ty r Hat 7 . u La u Thr " i 7 1 I- ü

   S 1 H

   CTG ACC CCT GAG GAC TCC GCC GTG TAC TTC TGC GCC AGG CGG GAC 360

   10 6

   Leu Thr Pro ClP A :¡ p c- 1" Ala V*1 T V i Ph. e r.'jn Ala íl'9 A 1 f| * 5 f. 12Q

   3 6 1

   GAC TTC TCT G G C TAC GAC GCC CTG CCT TAT TGG GGC CAG GGC ACC •3 fl 5

   12 1

   A-s p ?he Se c Gly T V £ A ep A la Leu ÍIC Ty e Ttp Gly Glu Gly TJlE 135

   4 0 6

   CT& a ts ACC ^vc TCC GCC ■::¿c ¿ L ÍL jí :t CAC ACA TGC CC A CCC T&C 050

   13 6

   La u V¿1 Tb £ Val Ser f. i í. . -ÍL -m ■fii. _uii £JLt _Eü ti ISO

   45 1

   c c a cea c c r EAG TTC CTG cgg cea ■CCA tc a CTC TTC CTC TfC cc c

   1 5 1

   Ala Fr& C 1 J P he Leu Gly 7. 1 V P ro Ser Val Phe Leiu Fhe Fio 1 6 5

   i 'i {

   CCA ¡A A A CCC AAG GAC ACT CTC ATC ATC rcc CGG ACC CCT GfiG CTC 54 5

   1 fcü

   Pro ¿ys Pro LJC* **E_ Thr Leu Me t lie 3er fir g Tlic Pro 7.1 H v o I 135

   5 i 1

   Ate 7 G C G T S GTG ijTC GAC g re ft-GC C AC E A A E AC ce c GAG ü '1C 7 565

   161

   Thí Cvs Ve 1 Vil Val A a í> V di Ser GlfL GlU Ase Pro Glu Val G1 n 195

   586

   TTC AAC TGG TAC GTG GAT G GC GTG CAG GTG CAT AAT GCC AAC ACA ■ülfl

   19 6

   Ph.í . As n ■ : I-I ■- V - ^V4l_*tp^ _V a_l _Glu_ V A_l_ _HlL B , i_K i_ _r h r 2 lfl

   6 J 1

   AAC CCG CCC GAG GAG CAG- TTC AAC AGC AC G TAC C C7 GTG GTC AGC 67 5

   2 11

   L y = r:n h r q 5 ! ■■- C. . :j - : n FUT #jr- Ser Til E r /_rr a r g val Val 5ír íü

   ¿.

   ere CTC ACC GTC CTG GAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC AftS GAG TAC 72 0

   226

   val Leu Thr ve 1 Leu h:í& Cln As p Leu As n .iki. Ly s 71t ,7.¿r. ¿4 0

   721

   ñ AG TGC A A íi CTC TGC AAG o o o QCC 7 r ■: C c TCC TCC *77 CAE A A A 765

9. 241

   . C il 9 Lyi Va i Se: fia n Lví Giy 11? íj Ü Sí r ser lie Glü r. 7. -, 25 5

   7 6 6

   ACC are TCC a a a GCC A. A A GCC CAE CCC CEA cae ECA CAG GTE Tac Si 0

   256

   Th c 1 L c S* E Lya A 3 a. c i / SI n Pro Ar ¡£ Glu P ro CiLn Val X V r. 27 0

   3 11

   ACC CTG CCC CC& TCC CAG CAG GfiG ATG ACC AAG AAC CAG GTC ACC 355

   2 7 1

   Thr .leu P ro Pro 5C £ r ! r. Glu r, i ii MOt T h r, tjL*. a 5 Tu 7. L n Val Ser ::ü5

   6 56

   CTG ACC 'J ü L :tü GTC A A A Ggc TTC ■| ÍIC CCC ti H t GAC ATC GCC &TG 9 00

   266

   L i i\ Thr Uí 1 i- L Val 1 y i Gly P he T y i í: 5 e i A ^ 1' lie A 1. d V d 1 305

   aúi

   CAE TCC cae ACC AAT CCG CAC gcG cae AAC aac TAC AAC acc ACE 94 5

   301

   G_l_u _ I£B c; l u_ _S_7 r ^ £ n ;-.-Ly GJ_r_ P r q _G i u__ A 5Í¡^ AJJI _T y £ __ Ly 5 Tjt_r_ _r h r 31 5

   3 46

   CCT ccc GTG CTG GAC TC C CAG GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AEG S9fl

   .H 'I

   l‘ C <; [ r ty V» J i| a i; r 5 a r r; i y 5er Pac Ph* Leu T yr S*JT_ a 3 Í0

   9 91

   CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGtí TGG CAG GAC ÜGG AAT GTC TTC TC A 1035

   33 1

   Leu Thr V a 1 A a p L y a 3er A r g Teje. Gira Glu Al ¥.. A s n Va 1 Phe Ser 3<? 5

   1 03$

   TGC re c GTG ATE GAT CAE CCT CTG CAC AAC CAC T fi 7 OCO ■CAG A A G 108 0

   34 6

   C 1 Ser Va 1 Me i H 1 9 G 1 U Ala [. -1 u Hls ; id i: i s T r Thi Gln 17 3 3 60

   i jei

   AGC CTC TCC CTG TCT CTG GGT A a a T-3A 11 t>7

   3 61

   S_í_x _ L $ u _ SíC Leu, _A*r _ Leuw Gly_ 1 y = Sod

   Figura 4

   1

   ATG TCC GTG CCT ACC CAG GTG CTG GG A CTG CTG CTG CTG TCC ::: 7 4 6

   i

   Mo t Sar va l P x o Thr G 1 Ti val. Lqu Cly Lbu L a u La u Lau Trp Lau 15

   4 6

   ACC GAC GCC AGA TGC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCC TCC TCC 90

   1 6

   i»? Al A Ara Cf> Ai? I le Gln Met 7 h r GlU :J e r p 7 O S(T ser 3 0

   9 1

   CTG 7 7 í GCG TCC GTC GGC GAC CGG c-'j ACC ATC AGC T S T AAfi ACC 1 35

   i j

   E. n 1.3 3er A 1 .i 3er V .11 G1 y k y. A r g Val Thr lie Thr Cy s l.yi Th r »1 5

   :

   AftC GAG AAC ATC TAC TCC AAC CTG GCC TGG TAT CAG CAG A RC GAC 1 en

   4 6

   A i ij GLU A J ll lie T y í Sor A. i 71 L¡ J Ala Trp Tvr üln G 1 Ti uve p. i i? t. u

   1 E L

   ÜCC A A G TCC CCT CAG ■CTG CTG ATC TAC GCC GCC ACC CAT CTG GTG 225

   b 1

   1 y l/ = 3? ST PTQ 1 r. - (! 'I L C !.3 : 7 = Ty:- Al & Ala T h. r H Leu Vil 7 5

   GAG GGC GTG CCC TCT AGA TTC TCC GGC TCC GGC TCT GGC ACC CAG i 7 0

   7 6

   =■ 11 gl y. Val Pío Ser Al q Fhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tile Gln #*>

   27 1

   TAC TCC CTG ACC ATC AGC TCC CTG C.-.ü CCT GAG GAC TTC GGC A AC 3 15

   91

   ryr 3er L E l¿ Thr J ¡ S Ser £p:r Leu ■7. r Prfi Üll3 As p Ph c El y Á 5 n 1 Ü 5

   3 i £

   TAC TAC TGC CfiG C AC TTC TGG GGC ACC CCT TGT ACC TTC GGC 5GR 1 ¿0

   10*

   t y i r y: C y 3 Gln H j S Pile Trii ci v Tíi r rr 0 CVS Thr P he Gly Gly 120

   361

   GGC AC C AAG CTG GA A ATC a as CGG GA c A A A ACT CAC ACA TGC CC A 4 0 5

   121

   G1 y The Ly s Leu G 1 1.3 lie L y s A rg ó_o ? - v.i- Tr.r Hi5_ T(i r -t£S= Pro 135

   os

   ere TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG GGG GG A CC A TC A GTC TTC CTC 400

   1 ! f.

   Alo Pro &lu Plie Leu c i V Glj Pro 3er Vá I Phe Leu ISO

   45 1

   rrc CCC CC A A.AA CCC AAG GAC ACT CTC ATG ATC TCC C GG ACC CCT 4 95

   15 1

   ?he_tro_ Jj *_ (_L_v a . P r o _ L £ e A = P _T.hr L e n H et _I_le _S e r _ - í J - TA_r_ _P ro 165

   A 9 6

   3 a ;; GTC ACG TGC 7t; GTG C7C GAC tr tg CAG (JA A GAC CCC ÜAÜ 5 40

   I S<5

   ai u Vsl Tftr _cvs va l V3 1 val AJI; val Sor Mn Gln r. j - fre í; i u 1 e <:i

   5-1 1

   GTC CÍG TTC AAC r gg TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC 565

   1 5 1

   Val Gln PUe A i n r i e T y 7 Val -3-í yai_ J¡ral_ H i 3_ AJJL _Al_a 195

   SE 6

   AaG Ai A Aag CCG 751; úk.ú GAG CAG TTC A AC ^::(7 A 7(3 T H C CÜT Gtg 63 D

   1 i t

   UL.Í. T ¡i r iy í Fro a r ¡3 r, . - i GlU 5 ! T. pne A.í Cl ■Ser rh r T y i' B ( (5. val j? 1 o

   63 1

   GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAS GAC TÜG CTG A AC GGC AAG 675

   2 1 1

   Val Ser Val Leu Thr Val Leu H1 a G L ú Aajp_ _Le_u_ A o_ GJL_y_ I ya 22 5

   57fi

   GAG TAC A AG TGC A. Jk.fi GTC TCC !■. J1 7 A 7. A GGC CTC CCG TCC TCC ATC 7 2 a

   2 2 6

   3 1 i: _7yi: CTI . Ly s Val £ e r Ji.r, n Lys 1 v Lgi3 Pro fie r Ser i 1 e 2 4 0

   2 l

   GftG A A A ACC ATC TCC Anñ GCC A A A GGG CAG CCC CG A GAG CC A CAG ^ &

   2 4 1

   Glu L V S Tñr lie a ^: -V6 Alá lYS .T-ii'. Gln. P 7 0 Al q Gilí Pro Gln 255

   7 6 6

   GTG TAC ACC CTG CCC GCA TCC CAG GAC CAG A T G P.CC AAG AñC CAG 6 10

   2 5 6

   Vi 1 T y r Thx T.ffP Pro Pra ser 7 1 n clll 51 u Ke t Thr Lyí A^r. G i E 270

   6 1 1

   GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC A. A A GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC 655

   2 7 1

   val_ Se r_ LéjJ_ _Ttir_ _C_V a Le ü_ V_fl_L L y a Phe_ Ty c P r 0; _ S A_sjp_ _I_lé 265

   5 5 6

   ÜCC GTÚ 3 ?l(; TfiG ÍJ A 7 ."i (i C AAT GGG CAG CCG l; a c a a A AC TAC kkC. 900

   2 & 6

   Al a va 1 :h U J.rP... G 1 11 3e c A 5. Tí ■.7 1 y 71 n p ro ÍH . I As 0 As n Ty r -k.Z-1 300

   #01

   ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC rrc CTC TAC 5 4 ■;

   3 Di

   TLi Thr Pió _P_ r í>_. _Va 1 _ Lí j_ _Se fc_ _-2£- G l_y_ _Sj=_r_ _PAe_ 1 h e_ L.?_u_ _T_t r 315

   9 4 e

   AGC ACG CTC ACC GTG GAC A A ü AGC A fifi 7 GG CAG GAG 3 fifi AAT GTC

   3 1 t

   3jS_r _ A r g Lo g JAr-JíiL_ A 5p “J'JL _7|_= 0 5 r u _ iep. GljL J|lú _ fi L y_ AáA Vr.i 3 30

   9 9 1

   TTC TC A TGC TCC GTG APG CAT GAC CC7 C TC CAC AAC cftc TAC ata 1015

   3 3 1

   Fhe S ? I CVS se r val Met H 1 a GlU Ala LCJ H1 a !•. 5 r> H 1 3 T y r T h r 3 i

   10 35

   CAG AAG AGC CTC TCC CTG rcr CTG GÜT AAA TGA 10 6 e

   3 46

   Glfl_ s_ Ser _L_e_ ü_ _S^e r _ Li e L3_ S e_E__ leu ^ G1 y _ -i1-3 Ertd

   Figura 5

   1

   ATG GAA TGG TGC TGG GTG TTC CTG TTC CTG CTG TCC GTG 7iCC GCT * &

   1

   Ké* t tu Trp Cy ? Trp Va 1 Pho T. 1) LL p ti e ten LHiU S ai* V a i Til r Ala. 1 :•

   4 6

   GGC GTG C AC TC C AAG CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGC G-CC GAG 99

   i 6

   ■31 y val Hls ae i: L y B Sin val G1 r. Ti Q ü SL: Cl T: Ser G ' Y Ala 31 ii 3 Ü

   3 1

   CTG A AG A kG CCT GGC GC C T CC GTC AAG GTG TC C TGC AA G GCC TCC L iS

   i i

   Leí li'S L v I Pío Slj Ala icr Val L y a Val Se; 7 y & L y £ Aid Ser 4 S

   13 6

   6GC TAC ACC TTC GAS TAC ATC ATC CAO TGG ATC AAG ÍTC AGA isa

   ■3 &

   5 1 Y T y I Thr P 1 17 T h t Glu T V T lie - 11f H i a T[¡i lie - y ^ I;1; A ; g 60

   1 B 1

   re c GGC CAG GGC CTC GAA TCC ATC ECO TGG T T C TAC CCT o o;. TCC 22 5

   E 1

   Sí r 61 y a 1 n G 1 y L BU 6 1 ii Trp 1 14 SLv T í i: Ptlfc T V í tu <; 1 Y Se; 7 5

   22 G

   AílC GA C ft'LC C AS T A:: A kC r;-::C CAO : tc A AG GGC í. Afi GCC ACO CTG 27 0

   7 i

   ñ 5 n íi * p t 1 * Si n T v r A s n ¿ 1 a <3 1 n Phs L y 5 G 1 y [■ Y 5 A 1 a T n r Leu 5 9

   2 7 7

   ACC 5 CC C A C AAG TCC TCC TCC A ■: C C'i'G TAC ATC CAA CT6 A C C MC J 1 5

   1

   Thr A 1 ,1 AS p Ser ■' r Ser Th r ■v;i 1 T y r M?t G 1 ii Leu Thr C L Y 1 9 5

   3 1 fi

   CTG ACO C C T ga;: SAC TC C ■3CG GTC L' A C TT C TCC G C C 11G6 GGG CAC 160

   1 íl ñ

   Ley r h r Pro 3 l u ?. F p Ser Al -i Val T j r P h a C y 5 Aja A V 7 Ai p 1 2 0

   3 i

   GAC T 7 C TCT GGC T A C G AC GTC CTG CT't T A T T(iG GGC GAC GGC ACO 4 (' 5

   121

   As p P .1 e Ser G 1 V T y t A = i. Ala lO'J Ft'j T y t Trp G; y Gln G1 y T ti 1 1 3 5

   ■1 0 s

   CTG 3T G AC C GTG T C C G CC G/iG ccc h A A TCT TGT GAC A A A AC T CAC 4 i.0

   1 3 6

   Ltl va 1 Thr Va 1 Sor A * ñ GTy :■ . S ■? t. =cjiá= A a n =¡yt¿= _Ihr_ tiii isa

   4 3 1

   ACA TGC c C h CCG TGC CC A GC A CCT GAG TTC CTG GGG GG A CC A TCñ 4 9 5

   15 1

   Til n C y a fu £' r íl C V.i_ P ;<? a: 7i P ÍC GLU Phe leí: C i 01 Y r tj Sé[ : 65

   ■íse

   STC TTC C T 6 TTC ccc c:s ,'lÁÁ C C c *AG 0 AC AC T C T C AT G ATC TCC 5 4 0

   16 6

   Yi 1 P h é L e ii Fue P r o ? r <> . kYA. P r o Lr? íflP Til r Luí; H<i t 1 1 * ser : ■; 0

   3 4 I

   CBS ACC C C T 0 A6 G T C ACO TGC GTC (i TE CTC GAC G T G AGC CAG CAA 58 5

   i a i

   A rq Th r Pro G 1 ii val T ¡1 T cj-s Val Va 1 v y 1 A 5 p V .1 1 5 e t C 1 r 61 ii 1 3 5

   5 £1 é

   ffAC etc 7¡G GTC CAG T T C A AC TCC T C C VC CAT GGC CT 6 CAO <: T 6 '■ 3 0

   1 9 6

   A 5 p fro tlu v a 1 G 1 n l’ b c A s n TI f. .Txí. Va 1 A 5 p d Y., 1 G i ti Ya 1 2 1 0

   ü 3 1

   A T A A T GCC AAG A CA rirlt CTC ■TGG G ^ C G A G C A G TTC AÍ'C AGC AC6 t 1 5

   ? 1 l

   H Í 5 A s n Ala L y 5 _Thr_ L y j_ _P_r_p_ Arg_ . c: y tL 1 u_ Phfl_ A 5 ri jp e_r_ 2 ? 5

   67 6

   TAC CpT CTG GTC A G C ÚTC CTC ACt CTC CTC C A C GAC PAC TGC CTG 7 20

   2 ? M

   . y V A 1 3 Val Val Ser v a 1 Lo 11 Thr V a L L-í ■; H i & Gln A :i r 'J'rp. le n 2 10

   7 2 1

   A A GGC AAG GAG TAC Añt TCC AAG G T C T C t A A 17 AA A GCC CTC CCG 7 6 5

   ?4 1

   ísn 6 1 y Y V S G L L. iíí. .^7- v fi L y a Vil Ser 7’. .o r. .bis ,Sl'J Lí'J Pro 2 5 3

   7 L &

   T CC T C C ATC GAG A A A A 3 C ATC TCC A A ■ICC A !■ ?. GGG CAG ; ce CGA 8 10

   2 3 6

   5 e r 3er lie G 1 U L ya Thr ríe Ser 1. y s Ala Lyj Gtv Gln Pro A V íl 7 TÚ

   a l i

   GAG CC A CAG GTG TAC AC C CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATS ACC e 5 5

   2 ■! 1

   Glu P t c G1 ti Val T y t Ti; Lili P 1 o ru £ lí r CIA ClU Glu He t Thr 2 3 5

   6 5 6

   h A O A AC CAÜ GTC AGC c t g Ai; c TCC CTC G ■ C AAA CGG TTC TAC ccc 30 0

   2 B 6

   Iti . A -i ii G 1 r: Vil Ser L # U T ti r ClB . Leu v .i L rJ-5. (3 1 Y pe T y r P : 0 Jt 0

   9 9 1

   A CC GAC ATC CCC ;; t 3 C ?i c T 3 G GAG AÍC A A T 0<3G C.'iC ccc GAC AAC 54 5

   39 1

   Ser A 5 ÍU II^ JAlja. _ .Val n G1 u_ _T rj:i jGl 'i _ S § r _ Ajn_ -P-U Gln Pro Gln _A 5 !1 i 1 i

   94 &

   A A C TAC AAG Í.CC ACG CCT TCC GT5 C 7 0 GAC TCC GAC GGC TCC T T G 5 0 0

   3 1 $

   ftu.SP-5.-lY£- Ly s J_hjL_ _T h 1- Pro_ Pro Val Leu sp Ser A ; [; i;ly Ser 7 íl e 13 7

   9 & 1

   TTC CTG TAC AGC AGG CTC ACC GTG GAC A A€ AGC AGG TGG CAG GAG 10 3 5

   3 3 1

   3_he _ i, -1 Zv i. Ser Aij e u T_h_r_ r-j a Se; A r g Tlí GjLJl_ 3 1U 3 4 S

   103 6

   GG G AAT GTC TTC TC A TGC TCC GTG AT G CAT GAG GC T CTG CAC AAC 1 08 Ú

   3 3 6

   3 1 V A a n val Pñe 3í r ■Iva Ser Val Me t H i a G 1 r Ala :■ p u HÍS Pi ■= n 3 69

   1 <1 3 J

   C AC TAC ACA CAG A AG AGC CTC TCC CTG T CT CTG GGT AA A TG Tk 1122

   361

   33 IB T V 7 7 1: t Gln Ser Ti e u Set Tro Ser 7, ‘7 ü ti;. L y e End

   I

   ATE T c c G 1 Q 0 0 T AC C CAG CTG CTC GG A C T 0 CTG C T C CTG TGG CTG d 5

   1

   Me t £fií Vál Pro Thr G 1 ti Val lid u Gly Leu Lau Leu Leu T rp Lau : 5

   i 6

   ncc GAC ECC REA TGC GAC ATC CAE ATG ñCC Ofiü TCC L CC T Ce 7C0 50

   1 6

   TIlI Aíp Ala Rrg Oye í lie G 1 n Me t. 'Oh r G1 n Ser nu Ser Ser JO

   5 1

   C'[ 0 1 C T GCC TCC 07 2 <3 C, c GAO CCC ¡3 l'G ACO ATO A C C 7 OiT ñ ROÍ ÍCC 13 5

   3 1

   L 4 I: ■Ser AJ ü S ü 7 Val C 1 y Asp A r q V * 1 Thr 11 e Th r 0 yi L 5 Th r i 5

   1 3 t

   A A C G AG RAC ATC TAC TCC AAC CTG GCC TGG TAT CAG C AG A AG GAC ] 8 0

   4 6

   isn O.l u A .-i II : i * T >■ Y Sil flirt Leu n 7 i1 jp 7 V r ñ 1II S 1 ¡Ti lV:ü íar bÜ

   e i

   C.r.z ARS TCC C 0 T CAO CTG CTG UTO T h c GCC GCC ACO 0 AT CT(3 GTG 22 5

   s i

   3 1 y L y 3 Ser Pro G 1 r Leu Leu ríe T y r Mí A 1 ¿i Thr h i & Leu Val 7 5

   22 6

   GAG 63 0 6T 7 ccc TCT AS A TTC TCC GGC TCC GGC T 0 T GGC AC C CAE 2 7 1)

   7 £

   G 1 U SI V Va l P r o S e r A; í Ph* Sil 0 1 V Ó* L SI y s a r 0 1 y T Oí - 61 rt 9 U

   2 7 1

   TAC ICC CTG A C C ATC AGC rcc CTG C AG CCT G AG GAC TTC O-O-C AAC 3 1 5

   9 i

   7 y r Ser Le u T ri :■ lie 5 e r Set Leu Sin Pro ti u A s p P he G 2 y A 3 n i C 5

   3 1 6

   TftC T A 0 T G C CAi.: CAO TTC TGG GCC acó C C1? T (3 T flCC T T:: <3 C OCA 3 fifi

   i a e

   T y t Tyr Cy s <3 ] n II i r, L':: c Tro SI V T h r L' - v 0 v i T h l- L' he C 1 y 0 1 y 1 ¿0

   3 t 1

   GGC ACC RRG C T G G A A ATC A AG CGG GftG CCC A A A. TCT TGT GAC AAA -05

   12 1

   Gly Th r T.y.-i Leu G lu lie Ov.-I Ar g É.Ul Pro JtX£= ¿i i -ÍJLL 1 3 5

   d 0 6

   ACT Che ACA ■L CC 0 0 A CCS T G C CCA CCA C C T (3AC T T C C l'G CCO 6 <3A i !>0

   I 3 6

   lili. Ule Th r e va Pro ÍÍ9 CVS frj Ale Pro Glu r h e Le u . ti 1> Gly: 1 5 5

   4 5 1

   CCA TC A GTC TTC CTG TTC C CC C C A A A A ccc RAG CAO ACT CTC ATG d 3 5

   i s;

   Pro Sí: Val Pric Leu ?hí P r 3 f r o Lys t r íi TiV ,=L A 3 p Th r Leu H <! 7 1 6 5

   4 9 6

   ATC TCC CGG ACO CCT GAG ETC ACG ■J 1-0 GTG G 7 G GTG GAC g:'g AGC 5 4 5

   16 6

   ríe .9 2- £ Ar q T h r P r o Glu ve i Thr lis Val Val Val A 3 P V a 1 Ser i a o

   5 i 1

   ene i o ai; CC. c QhC GTC C A G 7T0 aíc L'CC TRO 0 '[■ 0 CAT G G C CTO 5 B 5

   i 31

   C ' n _Glu_ ¡ ft 5 p_ J_i_o Glu_Val_ G 1 -. JFlie . _Asn T rp_ TJf-i -Y.ii.i2f. 1 y_ _va 1 ) 9 V

   y»

   GAG GTG CAT A A T GCC AflG ACA A AG CCG CGG GAG G AG C AG TTC AAC 9 3 7

   1 9 É

   G 1 ü Va 1 K i s A a n Ala L y a Thr L y <3 Pro Ar g Glu G 1 u G1 tt pus A s n ; i i :■

   63 1

   AGC ACG TAC C G T GTG OTO ag 3 T C C'!' 0 ftOO OTO CTG C A 0 C AG 0 AC 67 3

   2 1 i

   Ser Th r Tyr A r g Val Val Ser Val Leu Th I Val Leu His G1 n A E |D 2 2 =

   6 7 b

   TGG CTG AAC GGC A AG GAG TAC A AG TGC A AG GT C TCC AAC ARíi GGC 7 2Ch

   2 2 6

   t_1L. Lea^ Aj?jra_ JLU L’¿3 13M Tyr L y 3 C s Ljr 5 V A J Ser A 3 n t'.Y7L <3 1 y 0 1 0

   72 i

   ct o CCG TCC TCC ATC GAS A A A R CC ATC TCC A A A GCC A A A. OOG C =. r. 7 6 9

   2-11

   Leu Pro Ser Ser lie G 1 2 Lys T .. 1 7 le Ser L_YA Ala - 33 Gl ^ G 1 n 2 > a

   7 66

   ccc COA GAS C 0 a 00 ■3 T C TAC RO C CTG eco c c A TOO CAO GAO 0 AG B 1 O

   2 5 6

   Iro _ h r G 1 II jjro Gln_Val_ Tjf r Til r ^L e u P r_o_ J_ro _5 g r_ Jln^ C 3_u o i u 37 0

   6 1 i

   ATG ACO AAC AAC Chü GTC AG C CTG AC C TGC CTG 0, l'C AAA GGC TTC 815

   2 7 i

   ><<7 L Th ~ LV! Aín 0 ' n Va 1 Scí T. e i: Th t c y.- Leu V u 1 Lys .nu>-iL PLie 2S 9

   6 í 6

   TAC CC C AG 0 " AC ATG GCC GTG A G TGG GAG Ato AAT C G G C C G 90 0

   2 9 6

   T 5¿r Pro Ser A H p lie Alá Val 2 1 t Trp GlU Ser As n G ! y e_i_n P r o 3 0 0

   9 0 1

   GAS a a a AAC T^C AAC ACO ACO CCT ccc GT13 ■OTO OJIO TCC ■o,ac 13 0 0 9 4 5

   301

   G-L'I. fian A S n .j. v r LY*_ T r 7 _h_r_ Pío r:o ya_l_ _L.fl.ij_ _«3E. 5 fl L‘ R 5_p_ G_1 y 3 L 5

   9 i 6

   ICC OTO TTC CTC TAC AGC CTC ACO CTG GAC AflC A G 0 RGC TOS 9 9C

   3 16

   Ser ? 1- <i Ph 9 1:í Oyf Ser » rJ- L*V Thr y1 fl i p i-VÍ í *í h r g T i p 3 SO

   9 9 1

   CAO GAG GGC AÁT GTC TTC T C A TGC T C 0 GTG A T ü CAT GAG GOT CTG 1 0 J b

   3 3 1

   G.Lr, 0 12 Gly ---s n v a. i Píie ser c_ia. S e i Val Me t :-i 1 s G _ 11 Al a Leu i 4 5

   10 3 6

   GAC AAC C A C TAC AC A 0 A G A AC ACO CTC TOO CTC TCT CTG GGT A ¡LA 10 9 0

   3 9 ‘i

   H - S A 5 n .H i 3 Tyr T b r C 1 n -L.yr Ser T. c u 3er J. í- u Ser leu G l y L y i 3 6 0

   i o e i

   T 2 6 9 3

   361

   n n -.i

   A

   imagen4

   B_____________

   Ecuación

   R5 ACSO (ng/inl)

   hVH/VLCD28.3-bisagracompletay1-hy4CH2-CH3

   ] Y=0-83J Lji(k>I.5S 0.996 51.3

   hVH/VLCD28.3-bisagracorta y1 -hy4CH2-CH3

   1 YNMÍ72 Ln(x)-1>7» 1 ¡ 53,1

   Figura 8

   400-1

   imagen5

   0 0,01 0,02 0,05

   Concetracion de anticuerpo Monovalente /|_g.iml;

   WU 09F ao

   imagen6

   imagen7

   Figura 10
10. 3.5

    —0— VH3 + VL2_CS6 —VH3 + V1_2_C96V

    ■■■ 0- VH3 - VL2_C96A —VH3 + VL2_C96T —VH3 + VL2_C9&G —>*— VH3 + Vl_2 C9erJ

    —*— VH3 + VL2_CS6S —VH3 + VL2 C9&R

    imagen8

    2,5

    2

    .5

    1

    0,5

    OJO
11. 1 .OQ

    1QOO

    7 00,00

    1 000,00

    ng/mlFab

    imagen9

    kDa

    •rffiil ■ ■ i ■ —

    aso 1SÜ 100 75

    L.. - 1j^!- ¿ 'Jja '■l .f A :

    |ij|

    SO

    vúiMf' Liukbi

    V

    ¡s. H p l Bjp p Y ra|||.

    25 20

    ■ 3' : j

    1í

    10

    Figura 12

    imagen10