TW201336510A

TW201336510A - 結合ｃｄ２８之單價組合物及其使用方法

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Publication number: TW201336510A
Application number: TW101147598A
Authority: TW
Inventors: 莫瑞麥可奇納恩; 史蒂芬Ｇ耐德勒; 蘇珊Ｊ蘇查德; 布蘭登克雷森; 史蒂夫荷姆斯; 歐加英格納托維奇; 克里斯多夫普朗摩; 史蒂夫葛蘭
Original assignee: 必治妥美雅史谷比公司; 多曼提斯有限公司
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2013-09-16
Also published as: PL2321352T3; CL2012002428A1; CN102159590A; SI2700651T1; ES2730727T3; CN105936648A; EA201100239A1; RS58904B1; CL2011000117A1; US9085629B2; PT2700651T; US12012452B2; DK2700651T3; CA2731220C; AU2009270726A1; AR072571A1; IL251320A0; US20120201814A1; US8454959B2; PT2321352E

Abstract

本發明揭示單價結合CD28之域抗體。結合CD28之單價域抗體可抑制CD28活性。在一態樣中，域抗體由單一免疫球蛋白可變域組成或包含單一免疫球蛋白可變域，特異性結合CD28且拮抗CD28活性，在一態樣中，實質上不促進(agonizing)CD28活性。在另一態樣中，該域抗體為人類域抗體。本發明另外涵蓋拮抗個體中CD80及/或CD86與CD28相互作用的方法，及治療涉及CD80及/或CD86與CD28之相互作用的疾病或病症的方法，該等方法涉及向該個體投與域抗體。

Description

結合CD28之單價組合物及其使用方法

本發明提供結合CD28且阻礙CD28與CD80及/或CD86結合的域抗體(dAb)(其中dAb不與CTLA4交叉反應)及其使用方法。

本申請案主張2009年3月20日申請之美國臨時申請案第61/162,121號及2008年7月18日申請之美國臨時申請案第61/082,078號之權益。

序列表

下文隨附之序列表係以引用的方式併入本文中。

T淋巴細胞與抗原呈現細胞(APC)之間的抗原非特異性細胞內相互作用產生T細胞協同刺激信號，該等T細胞協同刺激信號產生對抗原之T細胞反應(Jenkins及Johnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5：361-367)。協同刺激信號決定對抗原之T細胞反應之大小及此反應是否使對抗原之後續反應活化或失活(Mueller等人(1989)Annu.Rev.Immunol.7：445-480)。在無協同刺激情況下之T細胞活化產生中斷或無能之T細胞反應(Schwartz,R.H.(1992)Cell 71：1065-1068)。T細胞表面受體CD28與抗原呈現細胞上之B7相關分子(例如，B7-1及B7-2，或分別為CD80及CD86)之相互作用提供一種關鍵協同刺激信號(P.Linsley及J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11：191-212)。CD28與B7-1(CD80)及B7-2(CD86)協同刺激分子之相互作用提供加強及維持T細胞反應之重要信號傳導路徑(Freedman等人(1987)J.Immunol.137：3260-3267；Freeman等人(1989)J.Immunol.143：2714-2722；Freeman等人(1991)J.Exp.Med.174：625-631；Freeman等人(1993)Science 262：909-911；Azuma等人(1993)Nature 366：76-79；Freeman等人(1993)J.Exp.Med.178：2185-2192)。

CD28組成性表現於T細胞之表面上，幾乎所有人類CD4+ T細胞上，在較小程度上表現於人類CD8+ T細胞上，表現於一些自然殺手細胞及所有鼠類T細胞上。CD28為I型跨膜醣蛋白，且因其具有單一類Ig可變胞外域而為免疫球蛋白家族之成員，該類Ig可變胞外域具有結合CD80及CD86所必需之MYPPPY(SEQ ID NO：639)基元(Peach等人1994,J.Exp.Med.180：2049-2058)。CD28具有定位於類Ig可變域後之半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基參與CD28之同型二聚作用。CD28之蛋白質序列及編碼人類CD28之核酸揭示於例如Harper等人J.Immunol.(1991)147：1037-44中。編碼CD28之人類mRNA之序列亦揭示於例如2009年4月19日最後更新之NCBI寄存編號NM_006139中。人類CD28之完整蛋白質序列亦揭示於例如2009年4月19日最後更新之NCBI寄存編號NP_006130中。

CD28傳輸與T細胞受體(TCR)信號協同作用以促進原生T細胞活化之信號(Lanzavecchia等人(1999)Cell 96：1-4)。CD28信號傳導調節T細胞活化之臨限值且顯著減少有效T細胞活化所需之TCR接合之數目(Viola等人(1996)Science 273：104-6)。CD28協同刺激使得T細胞增殖增加，多種細胞激素及細胞激素受體產生，參與細胞週期進程之蛋白質之表現增加，維持T細胞存活且維持T細胞上CD40配位體(CD40L)之表現(Sharpe等人Fundamental Immunology,W.E.Paul編，第五版，第396頁)。

CD28信號在調節CD4及CD8 T細胞分化中具有重要作用。CD28亦使先前活化之T細胞之反應最佳化從而促進IL-2產生及T細胞存活。原生T細胞產生IL-4會高度依賴於B7-1/B7-2協同刺激。在原生T細胞活化期間中斷CD28/B7路徑會損害T細胞增殖及分化，而在先前活化之T細胞中中斷CD28/B7路徑會減少T細胞擴增但不減少效應細胞激素產生(Sharpe等人Fundamental Immunology,W.E.Paul編，第五版，第393-404頁)。

T輔助細胞依賴性抗體反應使用B7-CD28路徑提供對於同源T細胞/B細胞相互作用必需之協同刺激信號，該等同源T細胞/B細胞相互作用又為免疫球蛋白類型轉換及生發中心(germinal center)形成所必需。在CD28基因剔除小鼠中，抗原刺激之後，潛在反應性B細胞在淋巴濾泡內積累，但不能增殖或進行體細胞突變(Ferguson等人(1996)J.Immunol.156：4576-4581)。

B7-1及B7-2亦為活性T細胞表面上所存在之第二較高親和力受體CTLA4(CD152)的配位體。B7-1/B7-2對抑制信號之協同刺激在B7-1/B7-2結合CTLA-4時出現(Brunet等人(1987)Nature 328：267-270,Linsley等人(1991)J.Exp. Med.174：561-569)。免疫反應之結果包括CD28介導之T細胞活化與CTLA-4介導之T細胞抑制之間的平衡。

抑制CD28介導之T細胞活化可抑制在自體免疫、移植排斥反應或過敏反應期間發生之不當T細胞反應。舉例而言，抑制CD28介導之T細胞活化可延緩移植排斥反應，預防急性同種異體移植排斥反應，誘發供體特異性耐受性，及預防慢性同種異體移植排斥反應之產生及中斷慢性同種異體移植排斥之進程，以及預防移植物抗宿主疾病(GVH)，亦即在所移植之T細胞針對宿主組織同種異體抗原(alloantigen)產生劇烈免疫反應時(Salama等人(2001)J.Clin.Invest.108：943-48)。抑制CD28介導之T細胞活化不僅經由阻礙經CD28進行之活化信號傳導來抑制免疫反應，而且不應影響CD86及CD80與CTLA-4之相互作用，從而保持CTLA-4介導之對T細胞反應之抑制。因此，抑制CD28介導之T細胞活化可用於預防自體免疫誘發及緩和已形成自體免疫疾病之進程及/或嚴重性，該等自體免疫疾病包括膠原蛋白誘發之關節炎、自體免疫甲狀腺炎、自體免疫性葡萄膜炎、重症肌無力及狼瘡之模型(Saloman等人(2001)Ann.Rev.Immunol.19：225-252)。

需要一種抑制CD28介導之T細胞活化而不刺激CD28信號傳導路徑之方法。本文所闡述之揭示內容滿足且解決此需要。

本文提供單價結合CD28之域抗體(dAb)。由於CD28在調節T細胞反應及產生抗體中顯而易見之重要性，故CD28/B7(CD80及CD86)相互作用及路徑為開發治療涉及不當細胞反應(諸如移植排斥反應、自體免疫及/或過度抗體反應)之疾病及病症之治療性方法提供重要標靶。結合CD28之單價域抗體可抑制CD28活性，抑制免疫反應，同時避免能夠二價或多價結合CD28之抗體會發生之潛在不當作用。域抗體亦可應用於亦使用標準二價抗體之諸多用途中之任一者，例如活體內成像及診斷。

因此，本文描述在受體結合檢定中結合CD28且阻礙或抑制CD28與CD80、CD86及/或其他配位體結合且抑制由CD80及/或CD86達成之CD28信號傳導的域抗體。本文所述之域抗體亦不阻斷CD80及CD86與CTLA4之相互作用。在一實施例中，本文所述之域抗體不與CTLA4交叉反應，且因此不結合CTLA4及CD28上結合CD80/86之共同基元。

在一實施例中，域抗體與CD28之結合不實質上促進CD28活性。詳言之，dAb不促進CD28信號傳導以及T細胞受體信號傳導。在另一實施例中，域抗體抑制CD28與CD80之結合。在另一實施例中，域抗體抑制CD28與CD80之結合，且不實質上促進由CD28達成之信號傳導。在另一實施例中，域抗體抑制CD28與CD86之結合。在另一實施例中，域抗體抑制CD28與CD86之結合，且不實質上促進由CD28達成之信號傳導。亦包括一種dAb，其干擾CD80及/或CD86與CD28之MYPPPY(SEQ ID NO：639)序列之結合。

在一態樣中，dAb不實質上誘發T細胞增殖以及T細胞受體信號傳導。在另一態樣中，dAb不實質上誘發由T細胞達成之細胞激素分泌以及T細胞受體信號傳導。在一實施例中，細胞激素為至少一種選自由以下組成之群之細胞激素：GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-24、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

在一態樣中，因為人類抗體在向人類個體投與以治療或預防疾病時將避免對該等抗體之免疫反應的產生，故域抗體為單價結合CD28且在一例示性實施例中不實質上促進CD28活性的人類域抗體。

在一實施例中，如由表面電漿共振所量測，域抗體以在50 nM至1 pM(包括50 nM及1 pM)範圍內之K_d值與人類CD28相互作用。舉例而言，對於人類CD28之K_d值可為25 nM至20 pM、10 nM至20 pM、5 nm至20 pM、1 nM至20 pM、0.5 nM至20 pM、0.1 nM至20 pM、0.1 nM至50 pM、75 pM至20 pM或甚至50 pM至20 pM。在一實施例中，對於人類CD28之K_d值為約50 pM。

在一實施例中，域抗體以50 nM或50 nM以下之IC₅₀值抑制CD80與CD28之結合。在一實施例中，域抗體以50 nM或50 nM以下之IC₅₀值抑制CD86與CD28之結合。在另一實施例中，如由表面電漿共振所測定，域抗體具有K_off速率常數為1×10^-3 s^-1或1×10^-3 s^-1以下、1×10^-4 s^-1或1×10^-4 s^-1以下、1×10^-5 s^-1或1×10^-5 s^-1以下或1×10^-6 s^-1或1×10^-6 s^-1以下的對CD28之結合特異性。在一實施例中，在標準檢定中域抗體以50 nM或50 nM以下之IC₅₀值中和CD28。

在另一實施例中，域抗體包含結合CD28之單一免疫球蛋白可變域。在一實施例中，單一免疫球蛋白可變域為V_H或V_L域。在另一實施例中，域抗體包含兩個可變域(例如V_H及V_L域)之同型多聚物或異型多聚物，但該等可變域中之一者具有無需相應V_L或V_H域而結合CD28之能力。亦即，dAb結合抗原與其他V_H或V_L域無關。此等實施例中之可變域可包含三個互補決定區(CDR)。在另一實施例中，域抗體不含Fc域。Fc域之界限闡述於Kabat等人(1991,Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.；該文獻係以引用的方式併入本文中)中。在替代性實施例中，Fc域由CH2-CH3區組成，其視情況包括與CH2連接之鉸鏈區。

在一態樣中，域抗體包含通用構架。在此態樣中，域抗體可包含一或多個構架區，該一或多個構架區包含與人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架(FW)區之胺基酸序列相同的胺基酸序列，或一或多個該等構架區之胺基酸序列相對於人類生殖系抗體基因區段所編碼之該相應框架區之胺基酸序列總共包含至多5個(例如1個、2個、3個、4個或5個)胺基酸差異。

在一實施例中，dAb包含對應於人類抗體(例如人類生殖系抗體)之FW1、FW2、FW3及FW4的FW1、FW2、FW3及FW4的胺基酸序列。在另一實施例中，域抗體之FW1、 FW2、FW3及FW4之一些或所有胺基酸序列與人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列相同。舉例而言，FW2可與人類抗體之FW2一致。在另一實施例中，FW1、FW2、FW3及FW4之胺基酸序列相對於該人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列總共含有至多10個胺基酸差異。在上文之另一實施例中，人類生殖系抗體基因區段可選自由DP47、DP45、DP48及DPK9組成之群。在一實施例中，通用構架包含選自由DP47、DP45及DP38組成之群之V_H構架，且/或V_L構架為DPK9。

在一態樣中，域抗體經格式化以延長其活體內半衰期。詳言之，該域抗體相對於未經格式化之相同域抗體具有延長之活體內t-α或t-β半衰期。

在一實施例中，在與其他條件均相同之條件下檢定的未經修飾蛋白相比時，域抗體組合物之tα半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長50%或50%以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長2倍或2倍以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長5倍或5倍以上，例如10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或50倍以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或500倍以上。

在另一實施例中，域抗體具有0.25小時至6小時之tα半衰期(包括0.25小時及6小時)。在另一實施例中，tα半衰期在 30分鐘至12小時之範圍內(包括30分鐘及12小時)。在另一實施例中，域抗體之tα半衰期在1小時至6小時之範圍內。

在另一實施例中，在與其他相同條件下檢定的未經修飾蛋白質相比時，域抗體組合物之tβ半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，域抗體之tβ半衰期延長50%或50%以上。在另一實施例中，域抗體之tβ半衰期延長2倍或2倍以上。在另一實施例中，域抗體之tβ半衰期延長5倍或5倍以上，例如10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍或40倍以上。在另一實施例中，域抗體之tβ半衰期延長50倍或50倍以上。

在另一實施例中，域抗體具有包括1小時至包括744小時之tβ半衰期。在另一實施例中，tβ半衰期在包括12小時至包括48小時之範圍內。在另一實施例中，tβ半衰期在包括12小時至包括26小時之範圍內。在另一實施例中，tβ半衰期為約336小時。

除以上準則以外，或替代以上準則，提供含域抗體組合物，其包含一種AUC值(曲線下面積)在1 mg．min/ml或1 mg．min/ml以上範圍內之配位體。在一個實施例中，該範圍之下限為5、10、15、20、30、100、200或300 mg．min/ml。另外，或者，配位體或組合物具有在多至600 mg．min/ml範圍內之AUC。在一個實施例中，該範圍之上限為500、400、300、200、150、100、75或50 mg．min/ml。配位體之AUC有利地在選自由以下組成之群之範圍內：15至150 mg．min/ml、15至100 mg．min/ml、15 至75 mg．min/ml、及15至50 mg．min/ml。

在一個格式化實施例中，本文所述之域抗體可連接於亦具有延長該分子之活體內半衰期作用之人類血清白蛋白(HSA)。人類血清白蛋白編碼序列可由PCR使用來源於GenBank寄存編號NM000477可得之cDNA序列的引子獲得。該等編碼序列可與本文所述之域抗體之編碼序列融合，且融合物可由熟習此項技術者表現。在一個實施例中，HSA連接之域抗體組合物之tα半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，HSA連接之域抗體組合物之tα半衰期在0.25小時至6小時之範圍內。在另一實施例中，HSA連接之域抗體組合物之tβ半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，HSA連接之域抗體組合物之tβ半衰期在12小時至48小時之範圍內。

在另一實施例中，格式化包含將dAb聚乙二醇化。在一實施例中，PEG經共價連接。在另一實施例中，PEG與域抗體在半胱胺酸或離胺酸殘基處連接。在另一實施例中，PEG連接之域抗體具有至少24 kD之流體動力學尺寸。在另一實施例中，總PEG尺寸為20 kD至60 kD(包括20 kD及60 kD)。在另一實施例中，PEG連接之域抗體具有至少200 kD之流體動力學尺寸。

在另一實施例中，PEG連接之域抗體相對於缺乏連接之聚乙二醇的相同多肽組合物具有延長之活體內半衰期。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長 50%或50%以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長2倍或2倍以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長5倍或5倍以上，例如10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或50倍以上。在另一實施例中，域抗體組合物之tα半衰期延長100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或500倍以上。

在另一實施例中，PEG連接之域抗體具有0.25小時至6小時之tα半衰期(包括0.25小時及6小時)。在另一實施例中，tα半衰期在30分鐘至12小時之範圍內(包括30分鐘及12小時)。在另一實施例中，域抗體之tα半衰期在1小時至6小時之範圍內。

在另一實施例中，PEG連接之域抗體之tβ半衰期延長10%或10%以上。在另一實施例中，PEG連接之域抗體之tβ半衰期延長50%或50%以上。在另一實施例中，PEG連接之域抗體之tβ半衰期延長2倍或2倍以上。在另一實施例中，PEG連接之域抗體之tβ半衰期延長5倍或5倍以上，例如10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍或40倍以上。在另一實施例中，PEG連接之域抗體之tβ半衰期延長50倍或50倍以上。

在另一實施例中，PEG連接之域抗體具有1小時至170小時之tβ半衰期(包括1小時及170小時)。在另一實施例中，tβ半衰期在12小時至48小時之範圍內(包括12小時及48小時)。在另一實施例中，tβ半衰期在12小時至26小時之範圍內(包括12小時及26小時)。

在另一實施例中，PEG連接之域抗體之AUC值(曲線下面積)在1 mg.min/ml或1 mg.min/ml以上之範圍內。在一實施例中，該範圍之下限為約5、10、15、20、30、100、200或300 mg．min/ml。另外或其他，配位體或組合物具有在至多約600 mg．min/ml範圍內之AUC。在一實施例中，該範圍之上限為500、400、300、200、150、100、75或50 mg．min/ml。配位體之AUC宜在選自由以下組成之群之範圍內：約15至150 mg．min/ml、約15至100 mg．min/ml、約15至75 mg．min/ml及約15至50 mg．min/ml。

在另一實施例中，提供一種域抗體，其具有與具有選自由SEQ ID NO：1-57組成之群之序列的核酸分子所編碼之胺基酸序列至少85%一致，例如至少90%一致，至少95%一致且至多且包括96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該域抗體特異性且單價結合CD28。

在另一實施例中，域抗體包含選自由SEQ ID NO：58-398及640及SEQ ID NO：532-635組成之群之胺基酸序列，且在一例示性實施例中，域抗體包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。

在另一態樣中，提供一種域抗體，其具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622，該多肽特異性且單價結合CD28。在另一實施例中，域抗體與所選胺基酸序列在不超過25個胺基酸位置處不同，且具有與所選序列至少80%一致之序列。在一實施例中，域抗體與所選胺基酸序列在25個或25個以下胺基酸位置、20個或20個以下胺基酸位置、15個或15個以下胺基酸位置、10個或10個以下胺基酸位置、5個或5個以下胺基酸位置、2個或2個以下胺基酸位置或少至1個胺基酸位置處不同。在另一實施例中，域抗體與所選序列至少80%一致，例如至少70%一致，至少75%一致，至少80%一致，至少85%一致，至少90%一致，至少95%一致且至多且包括96%、97%、98%或99%一致。

在一實施例中，CD28拮抗劑具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列的CDR1序列至少50%一致的CDR1序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。

在一實施例中，CDR1與所選胺基酸序列在所有CDR1胺基酸位置、5個或5個以下胺基酸位置、4個或4個以下胺基酸位置、3個或3個以下胺基酸位置、2個或2個以下胺基酸位置或少至1個胺基酸位置處不同。在另一實施例中，CDR1與所選序列至少50%一致，例如至少60%一致，至少70%一致，至少75%一致，至少80%一致，至少85%一致，至少90%一致，至少95%一致且至多且包括96%、97%、98%或99%一致。

在一實施例中，CD28拮抗劑具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列的CDR2序列至少50%一致的CDR2序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。

在一實施例中，CDR2與所選胺基酸序列在所有CDR2胺基酸位置、5個或5個以下胺基酸位置、4個或4個以下胺基酸位置、3個或3個以下胺基酸位置、2個或2個以下胺基酸位置或少至1個胺基酸位置處不同。在另一實施例中，CDR2與所選序列至少50%一致，例如至少60%一致，至少70%一致，至少75%一致，至少80%一致，至少85%一致，至少90%一致，至少95%一致且至多且包括96%、97%、98%或99%一致。

在一實施例中，CD28拮抗劑具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列的CDR2序列至少50%一致的CDR3序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。

在一實施例中，CDR3與所選胺基酸序列在所有CDR3胺基酸位置、5個或5個以下胺基酸位置、4個或4個以下胺基酸位置、3個或3個以下胺基酸位置、2個或2個以下胺基酸位置或少至1個胺基酸位置處不同。在另一實施例中，CDR2與所選序列至少50%一致，例如至少60%一致，至少70%一致，至少75%一致，至少80%一致，至少85%一致，至少90%一致，至少95%一致且至多且包括96%、97%、98%或99%一致。

另外包括一種dAb，其包含與選自由以下組成之群之一個CDR1序列至少50%一致的CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529及SEQ ID NO：636；與選自由以下組成之群之一個CDR2序列至少50%一致的CDR2序列：SEQ ID NO：485、 SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530及SEQ ID NO：637；及與選自由以下組成之群之一個CDR3序列至少50%一致之CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531及SEQ ID NO：638。

在另一態樣中，包括一種dAb，其包含選自由以下組成之群之CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529及SEQ ID NO：636；選自由以下組成之群之CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530及SEQ ID NO：637；及選自由以下組成之群之CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531及SEQ ID NO：638。

在另一態樣中，dAb包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ ID NO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：476、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：481、SEQ ID NO：482、SEQ ID NO：483、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。在一實施例中，dAb包含與以下胺基酸序列不超過25個胺基酸不同的胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617或SEQ ID NO：622。

dAb可以約100 nM、約50 nM、約1 nM、約500 pM、約100 pM、約50 pM、約10 pM、約5 pM或約1 pM之IC₅₀值抑制CD28與CD80及/或CD86之結合。舉例而言，域抗體以在1 pM至1.5 μM範圍內(包括1 pM及1.5 μM)之IC₅₀值抑制CD28與CD80之結合，抑制CD28與CD80結合之IC₅₀值。IC₅₀值可在1 pM至1 μM、1 pM至900 nM、1 pM至800 nM、1 pM至700 nM、1 pM至600 nM、1 pM至500 nM、1 pM至400 nM、1 pM至300 nM、1 pM至200 nM、1 pM至100 nM、1 pM至50 nM、1 pM至10 nM、1 pM至1 nM、1 pM至500 pM、1 pM至100 pM、1 pM至50 pM、1 pM至10 pM或1 pM至5 pM之範圍內。其他可接受之範圍包括例如50 pM至1 μM、100 pM至500 nM、125 pM至250 nM、150 pM至200 nM、150 pM至100 nM及200 pM至50 nM。

在另一實施例中，域抗體以在1 pM至1.5 μM範圍內(包括1 pM及1.5 μM)之IC₅₀值抑制CD28與CD86之結合，抑制CD28與CD86結合之IC₅₀值。IC₅₀值可在1 pM至1 μM、1 pM至900 nM、1 pM至800 nM、1 pM至700 nM、1 pM至600 nM、1 pM至500 nM、1 pM至400 nM、1 pM至300 nM、1 pM至200 nM、1 pM至100 nM、1 pM至50 nM、1 pM至10 nM、1 pM至1 nM、1 pM至500 pM、1 pM至100 pM、1 pM至50 pM、1 pM至10 pM或1 pM至5 pM之範圍內。其他可接受之範圍包括例如50 pM至1 μM、100 pM至500 nM、125 pM至250 nM、150 pM至200 nM、150 pM至100 nM及200 pM至50 nM。

提供一種拮抗個體中CD80與CD28之結合的方法，該方法包含向該個體投與本文所述之域抗體，其中該域抗體拮抗該個體中CD80與CD28之結合。拮抗個體中CD86與CD28之結合的方法包含向該個體投與本文所述之域抗體，其中該域抗體拮抗該個體中CD86與CD28之結合。拮抗個體中CD28之活性的方法包含向該個體投與本文所述之域抗體，其中該域抗體拮抗CD28之活性。治療或預防需要治療之個體由CD28所介導之疾病或病症的方法包含向該個體投與治療有效量之包含結合CD28之域抗體的組合物。在一實施例中，該疾病或病症為自體免疫疾病或病症。在另一實施例中，該疾病或病症為移植物相關疾病或病症。

亦包括一種雙特異性配位體，其包含對第一抗原具有結合特異性之域抗體及對第二抗原具有結合活性之單一可變域，其中該第一抗原為CD28，且其中該單一可變域與該第二抗原之結合起延長配位體活體內半衰期之作用。

在一實施例中，雙特異性配位體為四鏈IgG免疫球蛋白。四鏈IgG可包含兩個雙特異性配位體，該等雙特異性配位體之可變域不同。

在另一實施例中，域抗體為駱駝V_HH域。在雙特異性配位體之此實施例中，單一免疫球蛋白可變域可為重鏈可變域。在雙特異性配位體之另一實施例中，單一免疫球蛋白可變域可為輕鏈可變域。在雙特異性配位體之一實施例中，提供包含四個重鏈單一可變域或四個輕鏈單一可變域之IgG免疫球蛋白形式的配位體。重鏈可包含駱駝V_HH域。在雙特異性配位體之另一實施例中，第一域及第二域獨立地結合以使雙特異性配位體可同時結合第一抗原與第二抗原。在雙特異性配位體之一實施例中，如由表面電漿共振所測定，域抗體對人類CD28具有1×10^-8 M或1×10^-8 M以下之解離常數(K_d)，及1×10^-3 s^-1或1×10^-3 s^-1以下之K_off速率常數。

在雙特異性配位體之一實施例中，如由表面電漿共振所測定，單一可變域對血清白蛋白(SA)具特異性且對SA具有1 nM至500 μm之解離常數(K_d)。在另一實施例中，在標準配位體結合檢定中，單一可變域以1 nM至500 μM之IC₅₀值結合SA。單一可變域可對SA具特異性，且包含MSA-16之胺基酸序列或與該胺基酸序列至少80%一致之序列。或者，單一可變域可對SA具特異性，且包含MSA-26之胺基酸序列或與該胺基酸序列至少80%一致之序列。

在另一實施例中，域抗體可包含通用配位體之結合位點。在一實施例中，通用配位體結合位點係選自由蛋白A結合位點、蛋白L結合位點及蛋白G結合位點組成之群。

在雙特異性配位體之一實施例中，域抗體包含通用構架。域抗體亦可包含選自由DP47、DP45及DP38組成之群之V_H構架；或為DPK9之V_L構架。域抗體可包含一或多個構架區，該等構架區包含與人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列相同的胺基酸序列，或一或多個該等構架區之胺基酸序列相對於人類生殖系抗體基因區段所編碼之該相應構架區之胺基酸序列總共包含至多5個胺基酸差異。

在一實施例中，域抗體之FW1、FW2、FW3及FW4之胺基酸序列與人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列相同，或FW1、FW2、FW3及FW4之胺基酸序列相對於該人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列總共含有至多10個胺基酸差異。

在一實施例中，域抗體之該FW1、FW2及FW3之胺基酸序列與人類生殖系抗體基因區段所編碼之相應構架區之胺基酸序列相同。人類生殖系抗體基因區段可選自由DP47、DP45、DP48及DPK9組成之群。

亦包括一種產生本文所述之雙特異性配位體的方法，該雙特異性配位體包含對CD28具有結合特異性之域抗體及對延長該配位體活體內半衰期之蛋白質具有結合特異性之單域抗體，該方法包含以下步驟：藉由結合CD28之能力選擇第一可變域；藉由與該延長配位體活體內半衰期之蛋白質結合之能力選擇第二可變域；將該等可變域組合；及藉由與CD28及該蛋白質結合之能力選擇雙特異性配位體。在一實施例中，選擇域抗體以供在無互補可變域的情況下與CD28結合。

亦包括編碼本文所述之雙特異性配位體之核酸。核酸可包含MSA-16之核酸序列或與該核酸序列至少80%一致之序列，或者可包含MSA-26之核酸序列或與該核酸序列至少70%一致之序列。核酸可併入載體中，該載體可併入宿主細胞中。

亦包括一種醫藥組合物，其包含本文所述之雙特異性配位體及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。

亦包括一種雙特異性配位體，其包含第一及第二重鏈單一可變域或第一及第二輕鏈單一可變域，其中該第一可變域為域抗體。在一實施例中，第二可變域對非CD28之抗原具有結合特異性。在一態樣中，第二可變域有助於及/或增強域抗體之穩定性。經由一非限制性實例，第二可變域對血清白蛋白具有結合特異性。

亦包括一種雙特異性配位體，其包含對第一抗原具有結合特異性之第一單一可變域及對第二抗原具有結合活性之第二單一可變域，其中該第一抗原為CD28且該第二抗原為抗原呈現細胞表面抗原或T細胞表面抗原。抗原呈現細胞表面抗原可選自由樹突狀細胞表面抗原、活性巨噬細胞表面抗原、活性B細胞表面抗原、協同刺激信號路徑表面抗原及MHC抗原組成之群中之一者。在一實施例中，MHC抗原為MHC II類抗原，且該II類抗原可為α鏈及/或β鏈。

抗原呈現細胞表面抗原或T細胞表面抗原可選自由以下組成之群：CD40、CD40L、誘導型協同刺激分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69、CD3、CD70、誘導型協同刺激分子配位體(ICOSL)、OX40L、CD80、CD86、HVEM(疱疹病毒進入介體)及LIGHT，包括CD40L、誘導型協同刺激分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69或CD3中之一者。例示性表面抗原為B7基因表面抗原，諸如CD86或CD80。

在另一實施例中，雙特異性配位體包含對第一抗原具有結合特異性之第一域抗體及對第二抗原具有結合活性之第二單一可變域，其中該第一抗原為CD28且該第二抗原為細胞激素。在特定實施例中，細胞激素可為GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11IL-12IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-28、IL-33、LIF、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

本文所述之域抗體亦可與諸如以下之其他免疫抑制/免疫調節及/或消炎劑或療法組合投與：鈣調磷酸酶(calcineuirin)抑制劑、環孢靈(cyclosporine)、環磷醯胺(cytoxan)、潑尼松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、皮質類固醇(corticosteroid)、非類固醇消炎藥/Cox-2抑制劑、羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulphasalazopryine)、金鹽、依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、阿那白滯素(anakinra)、咪唑立賓(mizoribine)、黴酚酸(mycophenolic acid)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、干擾素β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替美(glatiramer acetate)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)及/或其他生物製品(如抗TNF)。域抗體亦可與一或多種以下藥劑組合投與以調節免疫反應：CTLA4、可溶性gp39(亦稱為CD40配位體(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、與gp39反應之抗體、與CD40反應之抗體、與B7反應之抗體、與CD28反應之抗體、與LFA-1反應之抗體、與LFA-2反應之抗體、與IL-2反應之抗體、與IL-12反應之抗體、與IFN-γ反應之抗體、與CD2反應之抗體、與CD48反應之抗體、與任何ICAM(例如ICAM-2)反應之抗體、與CTLA4反應之抗體、與Thy-1反應之抗體、與CD56反應之抗體、與CD3反應之抗體、與CD29反應之抗體、與TCR反應之抗體、與VLA-4反應之抗體、與VCAM-1反應之抗體、與LECAM-1反應之抗體、與ELAM-1反應之抗體、與CD44反應之抗體、針對白血球受體(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD 27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或其配位體之單株抗體。可使用此項技術中熟知之方法確定且優化最佳組合及劑量。

若本發明之域抗體「與例如如上文所指定之另一免疫抑制/免疫調節或消炎劑或療法組合」投與，則可伴隨或依次進行投與。若dAb伴隨另一藥劑(諸如上文所指定之藥劑)投與，則該dAb及藥劑可在同一醫藥組合物中投與。

在一實施例中，提供一種域抗體以製備治療患者之藥物，其中該患者需要結合CD28之域抗體。在一實施例中，患者患有免疫疾病。

在一態樣中，免疫疾病為自體免疫疾病。自體免疫疾病包括(但不限於)愛迪森氏症(Addison's disease)、過敏症、過敏性鼻炎、強直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性腮腺炎、自體免疫性葡萄膜炎、乳糜瀉、原發性膽汁性肝硬化、良性淋巴細胞血管炎、COPD、結腸炎、冠心病、克隆氏症(Crohn's disease)、糖尿病(I型)、抑鬱症、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、古柏氏症候群(Goodpasture's syndrome)、葛瑞夫茲氏症(Graves' disease)、古立安-白瑞症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏症(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、發炎性腸道疾病(IBD)、對重組藥品(例如血友病中之因子VII)之免疫反應、青少年特發性關節炎、全身性紅斑狼瘡症、狼瘡性腎炎、男性不育症、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力、腫瘤、骨關節炎、疼痛、原發性黏液水腫、天疱瘡、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、風濕熱、類風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、修格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊椎關節病、交感性眼炎、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病、睪丸血管中心性T細胞淋巴瘤、甲狀腺炎、移植排斥反應、潰瘍性結腸炎、自體免疫性葡萄膜炎及血管炎。自體免疫疾病包括(但不限於)受感染組織為主要標靶，且在一些情況下為次要標靶的病狀。該等病狀包括(但不限於)AIDS、特異反應性過敏症、支氣管哮喘、濕疹、麻風、精神分裂症、遺傳性抑鬱症、組織及器官移植、慢性疲勞症候群、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、心肌梗塞、中風、自閉症、癲癇症、阿爾圖斯氏現象(Arthus's phenomenon)、強過敏及酒精及藥物成癮。

在另一態樣中，免疫疾病為移植物相關疾病，諸如同種異體移植排斥反應、異種移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GVHD)、急性移植排斥反應及慢性移植排斥反應。

包括一種dAb，其具有至少三個選自由以下組成之群之特徵：a)阻礙CD80及CD86與CD28結合，b)不促進CD28信號傳導以及T細胞受體信號傳導，c)對與CD28之結合具有約50 nM至約1 pM之K_d值，d)具有約15秒至約12小時之tα半衰期，e)具有約12小時至約336小時之tβ半衰期，f)結合MYPPPY序列，及g)選自由以下組成之群之CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529及SEQ ID NO：636；選自由以下組成之群之CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、 SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530及SEQ ID NO：637；及選自由以下組成之群之CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531及SEQ ID NO：638。亦包括一種編碼本文所揭示之dAb之核酸。

包括拮抗CD28之方法，其包含向個體投與有效量之本文所揭示之dAb。亦包括一種拮抗CD28之結合的方法，其包含向個體投與有效量之本文所揭示之dAb，其中該dAb拮抗該個體中CD28與CD80及/或CD86之結合。

另外包括一種治療、減輕或預防免疫疾病(諸如自體免疫疾病或移植物相關疾病)之症狀的方法，其包含向患有免疫疾病或有患免疫疾病之風險的個體投與有效量之本文所揭示之dAb。包括一種治療、減輕或預防免疫疾病之方法，其包含向患有免疫疾病或有患免疫疾病之風險的個體投與有效量之本文所揭示之dAb。

本文包括一種醫藥組合物，其包含治療有效量之本文所揭示之dAb及醫藥學上可接受之載劑。

包括本文所揭示之dAb之用途，其係用於製備治療或預防有需要之患者免疫疾病之藥物。亦包括本文所揭示之dAb之用途，其係用於製備治療或預防有需要之患者免疫疾病之症狀的藥物。本文另外包括本文所揭示之dAb之用途，其係用於製備減輕有需要之患者免疫疾病之至少一種症狀的藥物。

本發明提供拮抗CD28活性之域抗體。該等域抗體可與聚合物連接以改良藥代動力學特性，諸如穩定性及半衰期。本文包括將聚合物分子(例如聚乙二醇；PEG)連接於蛋白質以調節經修飾蛋白質之藥代動力學特性的組合物及方法。舉例而言，蛋白質之PEG修飾已展示可改變蛋白質之活體內循環半衰期、抗原性、溶解性及對蛋白質水解之抗性(Abuchowski等人(1977)J.Biol.Chem.,252：3578；Nucci等人(1991)Adv.Drug Delivery Reviews 6：133；Francis等人，Pharmaceutical Biotechnology，第3卷(Borchardt,R.T.編)；及Stability of Protein Pharmaceuticals：in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991，第235-263頁，Plenum,NY)。

1.定義及簡稱 1.1.定義

根據此實施方式，應用以下縮寫及定義。必須注意，除非上下文另外明確規定，否則如本文所用之單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「一種抗體」包括複數個此類抗體，且提及「該劑量」包括提及一或多個劑量及熟習此項技術者已知之其等效劑量等。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者通常所瞭解相同之意義。除非另外說明，否則本文所述之所有範圍包括特定端點。下文提供以下術語。

如本文所用之術語「人類」在應用於域抗體或免疫球蛋白可變域時意謂該多肽具有衍生自人類免疫球蛋白之序列。若序列係a)自人類個體或自人類個體之細胞或細胞株分離；b)自經選殖人類抗體基因序列文庫(或人類抗體V域序列文庫)分離，或c)若使用經選殖人類抗體基因序列(或經選殖人類V區序列(包括例如生殖系V基因區段))產生一或多個隨後選用於與所需標靶抗原結合之多樣化序列，則該序列係「衍生自」人類免疫球蛋白編碼序列。

至少，人類域抗體與天然存在之人類免疫球蛋白可變域序列(例如Kabat("Sequences of Proteins of Immunological Interest",US Department of Health and Human Services 1991)中所揭示之天然存在之人類免疫球蛋白可變域序列)具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%胺基酸一致性(包括例如87%、90%、93%、95%、97%、99%或99%以上一致性)。

如本文所用之術語「域」係指獨立於蛋白質之其餘部分保持其三級結構的摺疊蛋白質結構。一般而言，域負責蛋白質之離散功能特性，且在許多情況下可添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中移除或轉移至其他蛋白質中而不會損害蛋白質之其餘部分及/或該域之功能。

「域抗體」意謂一種摺疊多肽域，其包含免疫球蛋白可變域特有之序列且特異性結合抗原(例如解離常數為500 nM或500 nM以下)。因此「域抗體」包括完整抗體可變域，以及經修飾可變域(例如其中一或多個環經不為抗體可變域特有之序列置換，或經截短或包含N或C末端延伸之抗體可變域)，以及可變域之摺疊片段，該等片段保持500 nM或500 nM以下(例如450 nM或450 nM以下、400 nM或400 nM以下、350 nM或350 nM以下、300 nM或300 nM以下、250 nM或250 nM以下、200 nM或200 nM以下、150 nM或150 nM以下、100 nM或100 nM以下)之解離常數及全長域之標靶抗原特異性。若需要或在有任何疑問的情況下，Kabat等人(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所闡述之編號規定及界線可用於本文所提及之免疫球蛋白可變域及恆定域。

在本文中，「dAb」可與「域抗體」互換使用。

如本文所用之域抗體係指哺乳動物免疫球蛋白多肽，包括人類且包括齧齒動物(例如如WO 00/29004中所揭示，該專利之內容全部併入本文中)或駱駝V_HH dAb。駱駝dAb為抗體單一可變域多肽，其係衍生自包括駱駝(camel)、美洲駝(llama)、羊駝(alpaca)、單峰駝(dromedary)及原駝(guanaco)之物種，且包含天然無輕鏈之重鏈抗體：V_HH。V_HH分子約為IgG分子之十分之一，且作為單一多肽，其極其穩定，抵抗極端pH值及溫度條件。

駱駝抗體描述於例如美國專利第5,759,808號；第5,800,988號；第5,840,526號；第5,874,541號；第6,005,079號；及第6,015,695號中，該等專利中每一者之內容以全文引用的方式併入本文中。人類化駱駝V_HH多肽教示於例如WO04/041862中，該專利之教示以全文引用的方式併入本文中。熟習此項技術者應瞭解天然存在之駱駝抗體單一可變域多肽可根據WO04/041862之教示加以修飾(例如在位置45及103處進行胺基酸取代)以產生人類化駱駝V_HH多肽。本文亦包括為護士鯊(nurse shark)V_HH之抗體單一可變域多肽。護士鯊V_HH dAb描述於例如Greenberg等人(1995)Nature 374：168-173及美國公開案第20050043519號中。

如本文所用之短語「免疫球蛋白可變域特有之序列」係指與免疫球蛋白可變域序列所包含之序列超過20個或20個以上、25個或25個以上、30個或30個以上、35個或35個以上、40個或40個以上、45個或45個以上或甚至50個或50個以上鄰接胺基酸一致的胺基酸序列。

與本文所揭示之序列類似或一致(例如至少約70%序列一致性)之序列亦包括於本文中。在一些實施例中，胺基酸層面之序列一致性可為約70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。在核酸層面上，序列一致性可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。或者，當核酸部分在選擇性雜交條件(例如極高嚴格度雜交條件)下與該鏈之互補序列雜交時存在相當大之一致性。核酸可存在於全細胞中、細胞溶解物中，或呈部分純化或實質上純之形式。

如本文所用之術語「一致性」係指兩個核苷酸或胺基酸序列在結構上彼此類似之程度。如本文所用之序列「類似性」為在序列比對時，胺基酸序列在相應位置共有類似胺基酸殘基之程度的量度。若胺基酸側鏈類似，則該等胺基酸彼此類似。特定而言，「類似性」涵蓋互為保守性取代物之胺基酸。「保守性」取代為在blosum62取代矩陣中具有正分之任何取代(Hentikoff and Hentikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。陳述「序列A與序列B n%類似」意謂序列A與B之間的最佳總體比對位置中有n%由一致胺基酸或保守性取代組成。如本文所用，當使用尼德曼-烏尼史演算法(Needleman-Wunsch algorithm)或Tatusova & Madden(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250所述之「BLAST 2序列」演算法比對時，兩個序列彼此「類似」或共有「一致性%」。若使用「BLAST 2序列演算法」比對胺基酸序列，則Blosum 62矩陣為預設矩陣。可在尼德曼-烏尼史比對演算法中使用以下參數執行最佳總體比對：對於多肽：取代矩陣：blosum62。

間隙記分函數：-A-B*LG，其中A=11(間隙處罰)，B=1(間隙長度處罰)，且LG為間隙之長度。

對於核苷酸序列：取代矩陣：匹配為10，錯配為0。

間隙記分函數：-A-B*LG，其中A=50(間隙處罰)，B=3(間隙長度處罰)，且LG為間隙之長度。

使用軟體AlignX(Vector NTI Suite 8.0(InforMax,Inc.)之組件)，使用Clustal W演算法(1994)Nucleic Acid Research,22(22)：4673-4680進行比對。在使用此方法時，計算所有序列對之間的粗略類似性，稱作「同位比對(Parities alignment)」。接著使用此等分值來計算「引導樹」或樹形圖，該「引導樹」或樹形圖告知多序列比對階段比對序列的次序以進行最終多序列比對。計算出樹形圖之後，以愈來愈大之群組比對序列直至全部序列併入最終比對中。

或者，使用軟體AlignX確定胺基酸及核酸序列之一致性之計算，其中參數如下：

AlignX之多序列比對設置如下：

典型保守性取代在Met、Val、Leu及lle之間；在Ser及Thr之間；在殘基Asp、Glu及Asn之間；在殘基Gln、Lys及Arg之間；或在芳族殘基Phe及Tyr之間交換。

如本文所用之術語「抗原決定基」係指習知由免疫球蛋白V_H/V_L對結合之結構單元。抗原決定基界定抗體之最小結合位點，且因此表示抗體特異性之標靶。在域抗體的情況下，抗原決定基表示由經分離域抗體結合之結構單元。亦即，由一個單一免疫球蛋白可變域提供結合位點。抗原決定基可為線性或構形抗原決定基，且可小至三個胺基酸。

如本文所用之術語「延長釋放」或等效術語「控制釋放」或「緩慢釋放」係指藥物調配物在向個體投與之後經一段時間釋放活性藥物(諸如多肽藥物)。視藥物調配物而定，經一定範圍之所需時間(例如數分鐘、數小時、數日、數週或更長時間)進行之多肽藥物之延長釋放與實質上整個劑量單位可經由血流立即吸收或立即分布的標準調配物形成對比。延長釋放型調配物經由單次投藥可產生維持例如8小時或8小時以上、12小時或12小時以上、24小時或24小時以上、36小時或36小時以上、48小時或48小時以上、60小時或60小時以上、72小時或72小時以上、84小時或84小時以上、96小時或96小時以上，或甚至例如1週或2週或2週以上，例如1個月或1個月以上的循環藥物含量。

如本文所用之「CD28活性」為涉及CD80、CD86及/或另一配位體與CD28之結合或由該結合產生之活性，且包括(但不限於)CD28介導之細胞信號傳導的活化。CD28活性亦包括誘發T細胞增殖及誘發T細胞分泌細胞激素(例如介白素2(IL-2))。

如本文所用之術語「不實質上促進」意謂指定藥劑(例如域抗體)不實質上活化一或多個CD28活性，其中術語「活化」如本文所定義。特定而言，藥劑「不實質上促進」意謂該藥劑活化藉由CD80及/或CD86與CD28結合而活化之活性不超過20%，且在一態樣中，該藥劑活化藉由CD80及/或CD86與CD28結合而活化之活性不超過約10%、8%、5%、3%或2%或2%以下，包括零活化。經由一非限制性實例，本文所闡述之不實質上促進CD28活性之域抗體在其他條件均相同之檢定條件下促進CD28活性不超過在抗CD28 mAb 9.3促進CD28活性(Gibson等人(1996)JBC, 271：7079-7083)之後所獲得之活性的5%。

如本文所用之術語「抑制」係指使指定可量測活性(例如結合活性)相對於參考值降低至少10%。若需要抑制，則該抑制為至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上，至多且包括100%，亦即完全抑制或無指定活性。對CD28與CD80或CD86之結合的抑制可如本文之實施例所述量測。如本文所用之術語「實質上抑制」係指使指定可量測活性(例如CD28與CD80或CD86之結合)相對於參考值降低至少50%。舉例而言，「實質上抑制」係指使指定可量測活性相對於參考值降低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，且至多且包括100%。如本文在提及域抗體與CD28結合或CD80與CD28結合或CD86與CD28結合之結合時所用之「抑制結合」係指使結合相對於參考值降低至少10%。「抑制結合」係指使結合降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上，至多且包括100%。

如本文所用之術語「活化」係指使指定可量測活性相對於參考值增加至少5%，例如至少10%、25%、50%、75%或甚至100%或100%以上。

如本文所用之術語「CD28拮抗劑」係指藉由抑制CD80及/或CD86與CD28之結合而抑制至少一種由CD28所介導之活性的藥劑。若存在拮抗劑時相對於不存在拮抗劑時使該活性降低至少10%，且在一例示性實施例中，降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%或甚至100%(亦即無活性)，則CD28活性「經拮抗」。在一例示性實施例中，如本文所用之術語CD28拮抗劑包含與CD28單價結合之域抗體。經由一非限制性實例，本文所闡述之CD28拮抗劑為抑制一些或所有CD28活性的藥劑，同時，該藥劑不實質上促進CD28活性以及T細胞受體信號傳導。

如本文所用，如諸如「其中相對於CD80與CD28之結合，域抗體優先抑制CD86與CD28之結合」之短語中所用之術語「優先抑制」意謂相對於如上所定義之對CD80與CD28之結合的抑制量，域抗體對如上所定義之CD86與CD28之結合實現較大量之抑制。

如本文所用之術語「CD28促效劑」係指單獨或在與另一共同刺激物組合時使至少一種由CD28所介導之活性相對於參考值活化的藥劑。若活性在存在促效劑時相對於不存在促效劑時增加至少約10%(例如50%)，則活性「經促進」。

如本文所用之抑制「CTLA4活性」包括(但不限於)抑制T細胞功能。該等功能包括T細胞受體介導之信號傳導、T細胞增殖及誘發細胞激素分泌等。

如本文所用之「免疫疾病」係指與個體產生免疫反應(包括細胞及/或體液免疫反應)相關之任何疾病。免疫疾病之實例包括(但不限於)炎症、過敏症、自體免疫疾病及移植物相關疾病。

如本文所用之「自體免疫疾病」係指以下疾病病狀及病況，其中個體之免疫反應係針對個體自身組份，從而產生不合需要且通常使人虛弱之病狀。如本文所用之「自體免疫疾病」意欲另外包括自體免疫病狀、症候群及其類似疾病。自體免疫疾病包括(但不限於)愛迪森氏症、過敏症、過敏性鼻炎、強直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性腮腺炎、自體免疫性葡萄膜炎、乳糜瀉、原發性膽汁性肝硬化、良性淋巴細胞血管炎、COPD、結腸炎、冠心病、克隆氏症、糖尿病(I型)、抑鬱症、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、古柏氏症候群、葛瑞夫茲氏症、古立安-白瑞症候群、橋本氏症、溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、發炎性腸道疾病(IBD)、對重組藥品(血友病中之因子VII)之免疫反應、青少年特發性關節炎、全身性紅斑狼瘡症、狼瘡性腎炎、男性不育症、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力、腫瘤、骨關節炎、疼痛、原發性黏液水腫、天疱瘡、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、風濕熱、類風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、修格連氏症候群、脊椎關節病、交感性眼炎、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病、睪丸血管中心性T細胞淋巴瘤、甲狀腺炎、移植排斥反應、潰瘍性結腸炎、自體免疫性葡萄膜炎及血管炎。自體免疫疾病包括(但不限於)受感染組織為主要標靶，且在一些情況下為次要標靶的病狀。該等病狀包括(但不限於)AIDS、特異反應性過敏症、支氣管哮喘、濕疹、麻風、精神分裂症、遺傳性抑鬱症、組織及器官移植、慢性疲勞症候群、阿茲海默氏症、帕金森氏症、心肌梗塞、中風、自閉症、癲癇症、阿爾圖斯氏現象、強過敏及酒精及藥物成癮。

如本文所用之術語「抗體多肽」係指為抗體或抗體之一部分，經修飾或未經修飾且保持特異性結合抗原之能力的多肽。因此，術語抗體多肽包括抗原結合重鏈、輕鏈、重鏈-輕鏈二聚物、Fab片段、F(ab')₂片段、dAb或Fv片段，包括單鏈Fv(scFv)。短語「抗體多肽」意欲涵蓋重組融合多肽，其包含在融合物之情形下保持特異性結合抗原之能力的抗體多肽序列。

如本文所用之術語「單價」意謂指定域抗體僅可結合其標靶之單一分子。天然存在之抗體通常為二價抗體，因為該等抗體具有兩個功能性抗原結合環，該等環各自包含V_H及V_L域。在位阻並非問題的情況下，二價抗體可結合同一抗原之兩個獨立分子。相比之下，「單價」抗體具有僅結合一個此類抗原分子之能力。如本文所用之術語「單價」抗體亦可包含一個以上抗原結合位點(例如兩個抗原結合位點)，但該等結合位點必須針對不同抗原，以使抗體一次僅能結合一個CD28分子。單價抗體之抗原結合域可包含V_H及V_L域，但在一態樣中，僅包含單一免疫球蛋白可變域，亦即V_H或V_L域，該V_H或V_L域具有結合CD28之能力而各自無需相應V_L或V_H域。單價抗體缺乏交聯單一抗原分子之能力。

如本文所用之術語「標準血小板凝集檢定」意謂本文以下部分中所述之題為「血小板凝集檢定」之檢定。

如本文所用之術語「V_H域」及「V_L域」係指由Kabat等人(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所定義之免疫球蛋白可變區，該文獻以引用的方式併入本文中。

如本文所用之「連接」係指聚合物部分(諸如PEG)與域抗體之胺基酸殘基之連接。PEG聚合物與域抗體(例如域抗體)之胺基酸殘基之連接稱作「聚乙二醇化」，且可使用數個PEG連接部分達成，該等PEG連接部分包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活性酯、丁二醯亞胺基丙酸酯(SPA)、順丁烯二醯亞胺(MAL)、乙烯碸(VS)或硫醇。PEG聚合物或其他聚合物可與域抗體在預定位置處連接，或可與域抗體分子隨機連接。PEG聚合物可與域抗體在預定位置處連接。PEG聚合物可與域抗體中之任何殘基連接，然而，該聚合物較佳與離胺酸或半胱胺酸連接，該離胺酸或半胱胺酸天然存在於域抗體中或已例如藉由將域抗體中天然存在之殘基突變誘發為半胱胺酸或離胺酸而工程改造至域抗體中。PEG連接亦可經由與域抗體連接之肽連接子介導。亦即，PEG部分可與融合至域抗體之肽連接子連接，其中該連接子提供PEG連接之位點，例如游離半胱胺酸或離胺酸。如本文所用之「連接」亦可指兩個或兩個以上域抗體(例如dAb單體)之結合以形成二聚物、三聚物、四聚物或其他多聚物。域抗體單體可藉由此項技術中已知之數種方法連接形成多聚物，該等方法包括(但不限於)以融合蛋白形式表現域抗體單體，經由單體之間的肽連接子連接兩個或兩個以上單體，或藉由轉譯之後使單體以化學方式彼此直接接合，或經由二硫鍵之連接子接合，或藉由與二價、三價或多價連接部分(例如多臂PEG)連接。雖然dAb多聚物特別地涵蓋於本文中，例如在雙特異性域抗體構築體或多特異性域抗體構築體的情形下，但應強調，對於任何指定域抗體構築體，該構築體應僅能結合一個CD28分子，亦即，構築體應僅具有一個CD28結合元，且不應交聯CD28。

如本文所用之「聚合物」係指由重複單體單元構成之大分子，且可指合成或天然存在之聚合物，諸如視情況經取代之直鏈或分枝鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分枝鏈或無枝鏈多醣。如本文所用之「聚合物」特別指視情況經取代或分枝鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物。

如本文所用之「PEG」或「PEG聚合物」係指聚乙二醇，且更特定言之可指PEG之衍生形式，包括(但不限於)PEG之N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活性酯，諸如丁二醯亞胺基丙酸酯，苯并三唑活性酯，用順丁烯二醯亞胺、乙烯碸或硫醇基衍生化之PEG。舉例而言，PEG調配物可包括 PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS；及PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R為(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。本文所闡述之PEG聚合物可為線性分子，或可為分枝鏈分子，其中單一聚合物中存在多個PEG部分。一些代表性PEG構形包括(但不限於)以下構形：

如本文所用之「硫氫基選擇性試劑」為適用於使PEG聚合物與含硫醇胺基酸連接之試劑。胺基酸殘基半胱胺酸上之硫醇基尤其適用於與硫氫基選擇性試劑相互作用。適用於該連接之硫氫基選擇性試劑包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺、乙烯碸及硫醇。用於與半胱胺酸殘基偶合之硫氫基選擇性試劑之使用為此項技術中已知，且可視需要改適(參見例如Zalipsky(1995)Bioconjug.Chem.6：150；Greenwald等人(2000)Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17：101；Herman等人(1994)Macromol.Chem.Phys.195：203)。

在一例示性實施例中，PEG或另一試劑(例如HSA)與本文所述之域抗體之連接應不會削弱多肽特異性結合CD28之能力。亦即，PEG連接之域抗體相對於未經PEG連接之對應物應保持其結合活性。如本文所用之「保持活性」係指PEG連接之域抗體之活性水準為未經PEG連接之域抗體之活性水準之至少10%，包括包含相同抗原結合域之未經PEG連接之域抗體活性的至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及至多90%，包括至多約95%、98%及至多100%。更特定言之，PEG連接之域抗體與未經PEG連接之域抗體相比之活性應基於抗體多肽莫耳數測定；亦即各試驗中應使用等莫耳數之PEG連接之域抗體及未經PEG連接之域抗體。在判定特定PEG連接之域抗體是否「保持活性」時，可將PEG連接之域抗體之活性與不存在PEG的情況下相同域抗體之活性相比。

如本文所用之術語「活體內半衰期」係指活體內配位體(例如域抗體)之血清濃度例如由於藉由天然機制達成之配位體降解及/或配位體清除或隔離而降低約50%所用之時間。本文所述之域抗體可藉由與抗降解及/或清除或隔離之分子(諸如PEG)結合而在活體內穩定且延長其半衰期。若域抗體之功能活性在活體內持續之時段長於未與PEG聚合物連接之類似抗體多肽，則該域抗體之半衰期延長。通常，聚乙二醇化域抗體之半衰期相對於未聚乙二醇化域抗體延長至少約10%、20%、30%、40%、50%或50%以上。半衰期可能延長之範圍為2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或50倍以上。其他或另外，半衰期可能延長之範圍為至多30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或150倍。如本文所述，PEG連接之域抗體之半衰期在0.25小時與170小時之間，包括1小時與100小時之間，此外包括30小時與100小時之間，且此外包括50小時與100小時之間，且至多170小時、180小時、190小時及200小時或200小時以上。

如本文關於PEG或其他聚合物連接之域抗體單體或多聚物所用之「抗降解」意謂該PEG或其他聚合物連接之域抗體單體或多聚物在pH 2.0下暴露於胃蛋白酶30分鐘時降解不超過約10%，且在一態樣中，完全不降解。

如本文所用之「流體動力學尺寸」係指分子(例如蛋白質分子)基於該分子在水溶液中擴散的表觀尺寸。蛋白質在溶液中之擴散或運動可經處理以獲得蛋白質之表觀尺寸，其中該尺寸由蛋白質粒子之「斯托克斯半徑(Stokes radius)」或「流體動力學半徑」提供。蛋白質之「流體動力學尺寸」取決於質量與形狀(構形)二者，因此具有相同分子質量之兩個蛋白質可能基於蛋白質之整體構形而具有不同的流體動力學尺寸。舉例而言，藉由尺寸排阻層析量測流體動力學尺寸。PEG連接之抗體多肽(例如域抗體)之流體動力學尺寸可在以下範圍內：約24 kD至500 kD；30 kD至500 kD；40 kD至500 kD；50 kD至500 kD；100 kD至500 kD；150 kD至500 kD；200 kD至500 kD；250 kD至500 kD；300 kD至500 kD；350 kD至500 kD；400 kD至500 kD及450 kD至500 kD。在一態樣中，聚乙二醇化域抗體之流體動力學尺寸為約30 kD至40 kD；70 kD至80 kD或200 kD至300 kD。若域抗體意欲用於成像應用，則域抗體之流體動力學尺寸應在約50 kD與100 kD之間。或者，若域抗體意欲用於治療應用，則域抗體製劑應具有大於約200 kD之流體動力學尺寸。

如本文所用之術語「IC₅₀值」係指抑制劑抑制指定活性約50%所必需之濃度。藉由檢定在變化量之抑制劑(例如域抗體)存在下指定活性(例如CD28與CD80或CD86之結合)且將抑制劑濃度對目標活性繪製曲線來測定IC₅₀值。本文藉由實施例中所述之方法量測CD28與CD80或CD86之結合。或者，可使用表面電漿共振(SPR)。

如本文所用之術語「EC₅₀值」係指化合物或域抗體引發個體反應之濃度，其中該反應為基線反應與最大反應之間的一半。個體對於化合物或域抗體之基線反應及最大反應可藉由此項技術中已知之任何技術測定。

如本文所用之術語「與域抗體融合」通常意謂經由使用重組DNA技術使多肽與指定抗體融合，但亦可以化學方式在蛋白質層面上進行融合。因此，「與另一多肽融合」(例如與具有不同結合特異性之另一抗體融合)之抗體不存在於自然界中且係經由重組方法產生。術語「與域抗體融合」亦涵蓋多肽與指定域抗體經由例如二硫鍵或其他化學鍵連接，其中並未天然地發現該融合多肽與該域抗體融合。使多肽與另一多肽(例如與抗體)融合之重組及化學方法為此項技術中所熟知的。

如本文所用之術語「Fc域」係指如根據Kabat等人(前述)所定義包含CH2及CH3恆定域之恆定區抗體序列。重鏈多肽之Fc部分具有自我結合之能力，此為一種有助於形成二價抗體之功能。術語「缺乏Fc域」意謂指定域抗體至少缺乏免疫球蛋白Fc域(該等域係根據Kabat等人，1991,Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.定義)中足以介導含Fc域抗體二聚之部分。舉例而言，藉由層析法或藉由表面電漿共振量測含Fc域抗體之二聚。缺乏Fc域之域抗體避免Fc-血小板相互作用，且因此避免誘發血小板凝集。

如本文所用之與疾病之症狀相關之「治療」、「降低」、「預防」或「減輕」係指以臨床可量測參數計，症狀減少至少10%，或以臨床上接受之疾病或症狀嚴重性標度計減少至少一個點。如本文所用之術語「全身性紅斑狼瘡症之症狀」係指熟習此項技術者已知之SLE之任何臨床相關症狀。非限制性實例包括IgG自體抗體(例如，針對細胞核抗原(諸如染色質)、snRNP(尤其Ul、Sm、Ro/SSA及La/SSB)、磷脂及細胞表面分子之IgG自體抗體)之積累、溶血性貧血、血小板減少症、白血球減少症、絲球體腎炎、血管炎、關節炎及漿膜炎。該症狀之減少為臨床可量測參數減少至少10%，或臨床上接受之疾病嚴重性標度減少至少一個點。

如本文所用之短語「特異性結合」係指如藉由表面電漿共振分析使用例如BIAcore^TM表面電漿共振系統及BIAcore^TM動力學評估軟體(例如2.1版)所量測，域抗體以1 μM或1 μM以下之解離常數(K_d)結合抗原。在一態樣中，特異性結合相互作用之親和力或K_d值為約500 nM或500 nM以下，且在另一態樣中，為約300 nM或300 nM以下。

如本文所用之「通用配位體」為結合指定譜系中(例如噬菌體呈現文庫中)相當大比例之功能性成員的配位體。因此，同一通用配位體可結合該譜系中之多個成員而與其標靶配位體特異性無關。一般而言，功能性通用配位體結合位點之存在表明該譜系成員經正確地表現及摺疊。因此，通用配位體與其結合位點之結合提供自多肽譜系中預選功能性多肽之方法。通用配位體包括例如蛋白A、蛋白G及蛋白L。

如本文所用之術語「通用構架」係指對應於由Kabat(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所定義之序列保守之抗體區或對應於由Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗體構架序列。本文包括使用單一構架或該等構架之組合，已發現使用單一構架或該等構架之組合即使在單獨高變區發生變化的情況下亦可產生基本上任何結合特異性。

術語「約」將為一般熟習此項技術者所瞭解，且將在某種程度上視使用該術語之情形而變化。一般而言，約涵蓋加/減參考值之10%的值範圍。

如本文關於蛋白質或核酸序列及/或域所用之術語「對應於」係指另一蛋白質上之類似序列或結構。舉例而言，小鼠肌凝蛋白之鈣結合域「對應於」人類肌凝蛋白之鈣結合域。

1.2.簡稱

以下為本文所用術語及相關簡稱之清單，且除非對特定術語及簡稱另有說明，否則其適用於所提及之術語。

Ab 抗體

AIDS 後天性免疫不全症候群

APC 抗原呈現細胞

AUC 曲線下面積

BSA 牛血清白蛋白

cDNA 互補DNA

CD80 APC上之B7-1協同刺激分子

CD86 APC上之B7-2協同刺激分子

CDR 互補決定區

CTLA-4 a/k/a/CD152；T細胞上之高親和力CD80/CD86受體

CRS 細胞激素釋放症候群

dAb 域抗體

DC 樹突狀細胞

DNA 去氧核糖核酸

EDTA 乙二胺四乙酸

ELISA 酶聯免疫吸附檢定

Fab 抗原結合區

Fc 抗體尾區

FCS 胎牛血清

FW 構架

HPLC 高效液相層析

HSA 人類血清白蛋白

IFN 干擾素

IL 介白素

kD 千道爾頓

K_d 解離常數

mAb 單株抗體

MAL 順丁烯二醯亞胺

mg 毫克

ml 毫升

MLR 混合淋巴細胞反應

mM 毫莫耳濃度

MoDC 單核細胞衍生之樹突狀細胞

MSA 小鼠血清白蛋白

NHS N-羥基丁二醯亞胺

ng 奈克

nM 奈莫耳濃度

pg 皮克

pM 皮莫耳濃度

mRNA 信使核糖核酸

PBMC 周邊血液單核細胞

PCR 聚合酶鏈反應

PDB 蛋白質資料庫

PEG 聚乙二醇

PK 藥代動力學

ppm 百萬分率

RO 受體佔有率

RT-PCR 反轉錄酶聚合酶鏈反應

SA 血清白蛋白

scFV 單鏈可變片段

SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳

SEC-MALLS 尺寸排阻層析多角度雷射光散射

SPA 丁二醯亞胺基丙酸酯

SPR 表面電漿共振

SRBC 綿羊紅血球

t_½ 半衰期

TNF 腫瘤壞死因子

t.u. 力價單位

μg 微克

μl 微升

μM 微莫耳濃度

V_H 可變重鏈域

V_L 可變輕鏈域

VS 硫酸乙烯酯

1X SSC 0.15 M NaCl，0.015 M檸檬酸鈉，pH 7.0

提供與CD28結合之單價域抗體。雖然不希望受任何特定理論限制，但咸信單價結合CD28去除先前技術抗體所發生之交聯細胞表面受體之可能性。因此，在一態樣中，本文所揭示之域抗體不僅抑制或拮抗CD80或CD86與CD28之結合，且其不實質上促進CD28活性。

在一態樣中，結合CD28之單價抗體為人類域抗體。人類域抗體可向人類患者投與，同時在很大程度上避免通常由投與來自其他物種(例如小鼠)之抗體引發之抗抗體免疫反應。雖然鼠類抗體可藉由將人類恆定域接枝於鼠類抗原結合域上而「人類化」，但本文所揭示之人類抗體可在無需對鼠類抗體序列進行耗力且耗時之遺傳操作的情況下產生。

2.單價域抗體

抗體之重多肽鏈及輕多肽鏈包含直接參與抗原相互作用之可變(V)區及在與免疫效應子之非抗原特異性相互作用中提供結構支撐及功能的恆定(C)區。習知抗體之抗原結合域由以下兩個獨立域組成：重鏈可變域(V_H)及輕鏈可變域(V_L，其可為V_κ或V_λ)。抗原結合位點本身由以下六個多肽環形成：來自V_H域之三個多肽環(H1、H2及H3)及來自V_L域之三個多肽環(L1、L2及L3)。活體內，藉由基因區段之組合重排產生編碼V_H及V_L域之V基因的多樣初級譜系。C區包括輕鏈C區(稱作C_L區)及重鏈C區(稱作C_H1、C_H2及C_H3區)。天然存在之抗體通常包含兩個抗原結合域且因此為二價抗體。

已在蛋白酶消化之後鑑別天然存在抗體之諸多較小抗原結合片段。其包括例如「Fab片段」(V_L-C_L/C_H1-V_H)、「Fab'片段」(具有重鏈鉸鏈區之Fab)及「F(ab')₂片段」(由重鏈鉸鏈區接合之Fab'片段之二聚物)。已使用重組方法產生該等片段及產生甚至更小之抗原結合片段，例如由藉由肽連接子接合之V_L及V_H組成(V_L-連接子-V_H)且稱作「單鏈 Fv」(可變片段)或「scFv」之彼等抗原結合片段。Fab片段、Fab'片段及scFv片段為結合抗原之單價片段，因為其各自僅包含一個包含一個V_H/V_L二聚物之抗原結合域。

域抗體或「dAb」獨立於其他V域結合抗原；然而，域抗體可與其他V_H或V_L域一起存在於同型多聚物或異型多聚物中，其中該等其他域並不為dAb結合抗原所必需，亦即其中dAb獨立於其他V_H或V_L域結合抗原。域抗體之製備描述且例示於下文中。

抗體單一可變域(例如V_HH)為已知之最小抗原結合抗體單位。對於用於治療而言，人類抗體尤其適宜，主要因為其在向患者投與時不太可能引發免疫反應。駱駝V_HH與人類抗體之V_H域的對比揭示駱駝V_HH域中對應於人類V_H域之V_H/V_L界面的構架區中的數個關鍵差異。執行人類V_H3之此等殘基向更接近類似之V_HH序列之突變(特別Gly 44→Glu、Leu 45→Arg及Trp 47→Gly)以產生保持抗原結合活性(Davies & Riechmann(1994)FEBS Lett.339：285-290)但具有改良之表現及溶解性的「駱駝化」人類V_H域。(本文所用之可變域胺基酸編號與Kabat編號規定(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)一致)。WO 03/035694(Muyldermans)報導Trp 103→Arg突變改良非駱駝V_H域之溶解性。Davies & Riechmann(1995)Biotechnology N.Y.13：475-479亦報導駱駝化人類V_H域之噬菌體呈現譜系的產生及以100-400 nM範圍內之親和力結合半抗原之純系的選擇，但選用於與蛋白質抗原結合之純系具有較弱親和力。

可以數種不同方式產生域抗體。舉例而言，編碼已知結合CD28之抗體的重鏈及輕鏈的核酸序列可經操作以產生多個單價結合CD28之不同域抗體。由此，在指定編碼構成抗體之重鏈及輕鏈多肽的序列及標準分子選殖方法的情況下，可產生單價結合CD28之單價抗原結合多肽構築體，諸如Fab片段、scFv、dAbs或甚至雙特異性抗體(亦即包含兩個不同抗原結合部分且因此可結合兩個獨立抗原且在一態樣中同時結合兩個獨立抗原的抗體)。

2.1.設計域抗體之通用策略及方法

一種產生對CD28具特異性之域抗體的方法為擴增且表現例如自表現域抗體之融合瘤(例如小鼠融合瘤)分離之重鏈及輕鏈基因序列的V_H及V_L區。Kabat等人(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)闡述V_H及V_L域之界線。使用關於重鏈及輕鏈基因之V_H及V_L域之界線的資訊來設計自編碼已知結合CD28之抗體的重鏈或輕鏈的編碼序列擴增V域之PCR引子。將經擴增之V域插入合適表現載體(例如pHEN-1(Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137))中且例如以V_H及V_L之融合物形式以scFv或其他合適單價形式表現。隨後針對與CD28之高親和力單價結合篩選所得多肽。結合本文所述之方法，如此項技術中已知或如下文所述針對結合執行篩選。

或者，可使用文庫篩選方法鑑別單價CD28特異性結合蛋白。噬菌體呈現技術(參見例如Smith(1985)Science 228：1315；Scott & Smith(1990)Science 249：386；McCafferty等人(1990)Nature 348：552)提供一種自大型多樣域抗體譜系中選擇結合所需標靶之域抗體的方法。此等噬菌體抗體文庫可分成兩類：天然文庫，其使用自人類B細胞收集之重排V基因(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222：581；Vaughan等人(1996)Nature Biotech.,14：309)；或合成文庫，藉此生殖系V基因區段或其他域抗體編碼序列活體外「重排」(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.,227：381；Nissim等人(1994)EMBO J.,13：692；Griffiths等人(1994)EMBO J.,13：3245；De Kruif等人(1995)J.Mol.Biol.,248：97)或其中將合成CDR併入單一重排V基因中(Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4457)。涉及遺傳呈現套件(例如噬菌體呈現、多核糖體呈現)之方法極其適用於選擇單價CD28特異性抗體構築體，因為該等方法通常在呈現套件上僅表現單價片段而非整個二價抗體。製備呈現多種抗體片段之噬菌體呈現文庫的方法描述於前述參考文獻中。該等方法亦描述例如於美國專利第6,696,245號中，該專利以引用的方式併入本文中。6,696,245專利中所述之方法通常涉及免疫球蛋白基因編碼區(尤其V_H及V_L編碼區)中所選區域之隨機化，同時使其他區域保持未經隨機化(參見下文)。6,696,245專利亦描述包含個別隨機化之V_H及V_L域之scFv構築體之產生。

抗體結構及序列之分析展示六個抗原結合環中有五個(H1、H2、L1、L2、L3)具有有限數目之主鏈構形或正則結構(Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等人(1989)Nature 342：877)。主鏈構形由以下因素決定：(i)抗原結合環之長度及(ii)抗原結合環及抗體構架中特定關鍵位置處之特定殘基或殘基類型。舉例而言，分析環長度及關鍵殘基能夠預測大多數人類抗體序列所編碼之H1、H2、L1、L2及L3的主鏈構形(Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.227：799；Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628；Williams等人(1996)J.Mol.Biol.264：220)。儘管H3區之序列、長度及結構極為多樣(由於使用D區段)，但其由於較短之環長度亦形成有限數目之主鏈構形，該等主鏈構形取決於長度及環及抗體構架中關鍵位置處之特定殘基之存在或殘基類型(Martin等人(1996)J.Mol.Biol.263：800；Shirai等人(1996)FEBS Letters 399：1)。

雖然在一方法中，可於合成譜系中在多種抗原結合環之CDR中之任一位點處添加多樣性，但此方法產生較大比例之未正確摺疊之V域，且因此產生較小比例之具有結合抗原潛力之分子。對促成抗原結合環之主鏈構形的殘基的瞭解可鑑別在V_H或V_L域之合成譜系中多樣化之特定殘基。亦即，最佳於並非保持主鏈構形所必需之殘基中引入多樣性。舉例而言，為將環L2多樣化，習知方法為將由Kabat等人(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所定義之相應CDR(CDR2)中之所有殘基(大約七個殘基)多樣化。然而，對於L2而言，已知位置50及53在天然存在之抗體中多樣，且觀察到該等位置與抗原接觸。一種方法為僅將此環中之彼等兩個殘基多樣化。此代表了在產生一系列抗原結合特異性所必需之功能多樣性方面的顯著改良。

免疫球蛋白多肽文庫可適宜地經設計以基於預定可變域主鏈構形。該等文庫可如國際專利申請案WO 99/20749所述來建構，該申請案之內容以引用的方式併入本文中。因此，在一態樣中，域抗體包含指定人類生殖系V區基因區段(例如V_H生殖系基因區段DP-47或V_κ生殖系基因區段DPK9)之胺基酸序列。該等可變區多肽可用於產生scFv或Fab，例如包含以下之scFv或Fab：(i)抗體重鏈可變域(V_H)或其抗原結合片段，其包含生殖系V_H區段DP-47之胺基酸序列，及(ii)抗體輕鏈可變域(V_L)或其抗原結合片段，其包含生殖系V_κ區段DPK9之胺基酸序列。所選重鏈及輕鏈生殖系基因區段(例如DP-47、DPK9、DP45、DP38等)之情形下序列之多樣化可產生多樣免疫球蛋白編碼序列之譜系。下文在產生多樣化域抗體或scFv序列之文庫的情形下描述一種多樣化方法。此等可變區多肽亦可表示為域抗體且針對與CD28之高親和力結合進行篩選。該譜系可選殖至適用於噬菌體呈現之載體(例如λ或絲狀噬菌體呈現載體)中或於該載體中產生，且隨後針對與指定標靶抗原(例如CD28) 之結合進行篩選。

3.域抗體之製備

域抗體為一種摺疊多肽域，其包含免疫球蛋白可變域特有之序列，且其特異性結合抗原(例如解離常數為500 nM或500 nM以下)，且其以單一可變域形式結合抗原；亦即，域抗體提供一個結合位點而無任何互補可變域。因此域抗體包括完整抗體可變域，以及經修飾可變域(例如其中一或多個環經不為抗體可變域特有之序列置換，或經截短或包含N或C末端延伸之抗體可變域)，以及可變域之摺疊片段，該等片段保持約500 nM或500 nM以下(例如約450 nM或450 nM以下、約400 nM或400 nM以下、約350 nM或350 nM以下、約300 nM或300 nM以下、約250 nM或250 nM以下、約200 nM或200 nM以下、約150 nM或150 nM以下、約100 nM或100 nM以下)之解離常數及全長域之標靶抗原特異性。在一例示性實施例中，適用於本文所述組合物及方法之抗體單一可變域係選自V_H及V_L之群，包括V_κ及V_λ。在一例示性實施例中，適用於本文之域抗體為「人類」抗體，術語「人類」如本文所定義。

3.1.1.配位體之結構

根據本文所揭示之一態樣，連接兩個或兩個以上非互補抗原決定基結合域以使其呈如本文所定義之閉合構形。其可適宜地另外與骨架連接，該骨架可能作為本文所述連接子之替代物或除本文所述連接子以外而有利於抗原決定基結合位點相對於彼此之閉合構形之形成及/或維持。或者，本文所揭示之域抗體可使用本文所述之骨架構架建構。

配位體骨架可基於免疫球蛋白分子或可如本文別處所述來源於非免疫球蛋白。如本文所定義之免疫球蛋白骨架可包括選自以下之任意一或多者：至少包含(i)抗體之CL(κ或λ亞類)域，或(ii)抗體重鏈之CH1域的免疫球蛋白分子；包含抗體重鏈之CH1及CH2域的免疫球蛋白分子；包含抗體重鏈之CH1、CH2及CH3域的免疫球蛋白分子；或子集(ii)與抗體CL(κ或λ亞類)域之任意結合。亦可包括鉸鏈區域。該等域組合可例如模擬天然抗體(諸如IgG或IgM)或其片段(諸如Fv、scFv、Fab或F(ab')₂分子)。熟習此項技術者應瞭解此清單不欲為詳盡清單。

各抗原決定基結合域包含蛋白質骨架及一或多個參與該結合域與一或多個抗原決定基之特異性相互作用的CDR。本文所揭示之抗原決定基結合域宜包含三個CDR。除基於免疫球蛋白域之蛋白質骨架以外，合適蛋白質骨架亦可基於非免疫球蛋白域之蛋白質骨架。舉例而言，已使用天然細菌受體(諸如SpA)作為骨架來接枝CDR以產生與一或多個抗原決定基特異性結合之配位體。此程序之詳細說明描述於US 5,831,012中。其他合適骨架包括基於纖維結合蛋白及親和體(Affibody,Bromma,Sweden)之骨架。合適程序之詳細說明描述於WO 98/58965中。其他合適骨架包括如van den Beuken等人，(2001)J.Mol.Biol.310：591-601所述之脂質運載蛋白及CTLA4，及諸如描述於WO 00/69907 (Medical Research Council)中例如基於細菌GroEL或其他伴隨蛋白多肽之環結構的骨架。可使用之其他非免疫球蛋白基骨架包括基於A類LDL受體、EGF域單體及多聚物之骨架，及可購自Biorexis(King of Prussia,PA)或Avidia(Mountain View,CA)之骨架。可使用之其他非免疫球蛋白骨架例如描述於WO 05/040229、WO 04/044011及US 2005/0089932中。

3.1.2.主鏈構形之選擇

免疫球蛋白超家族之成員之多肽鏈均共有類似摺疊。舉例而言，儘管抗體之初級序列具高度多樣性，但序列及晶體結構之對比出乎意料地揭示抗體六個抗原結合環中有五個(H1、H2、L1、L2、L3)採用有限數目之主鏈構形或正則結構(canonical structure)(Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196：901；Chothia等人(1989)Nature,342：877)。因此，分析環長度及關鍵殘基能夠預測見於大多數人類抗體中之H1、H2、L1、L2及L3的主鏈構形(Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.,227：799；Tomlinson等人(1995)EMBO J.,14：4628；Williams等人(1996)J.Mol.Biol.,264：220)。儘管H3區之序列、長度及結構極為多樣(由於使用D區段)，但其由於較短之環長度亦形成有限數目之主鏈構形，該等主鏈構形取決於長度及環及抗體構架中關鍵位置處之特定殘基之存在或殘基類型(Martin等人(1996)J.Mol.Biol.,263：800；Shirai等人(1996)FEBS Letters,399：1)。

本文所揭示之配位體可自域文庫(諸如V_H域之文庫及/或 V_L域之文庫)選擇及/或組裝。此外，本文所揭示之配位體自身可以文庫之形式提供。在本文所揭示之一態樣中，設計出配位體及/或域之文庫，其中已選擇特定環長度及關鍵殘基以確保成員之主鏈構形已知。此等構形宜為在自然界中發現之免疫球蛋白超家族分子之真實構形以使其如上所述為非功能性之可能性降至最小。生殖系V基因區段充當建構抗體或T細胞受體文庫之一例示性基本構架；其他序列亦適用。可以低頻率發生變化，以使少量功能性成員可具有改變之主鏈構形，該改變之主鏈構形並不影響其功能。

正則結構理論亦適用於評定配位體所編碼之不同主鏈構形之數目，以基於配位體序列預測主鏈構形及選擇進行多樣化而不影響正則結構之殘基。已知在人類V_κ域中，L1環可採用四個正則結構中之一者，L2環具有單一正則結構，且90%之人類V_κ域之L3環採用四個或五個正則結構中之一者(Tomlinson等人(1995)(前述))；因此，在單獨V_κ域中，不同正則結構可組合以產生一系列不同主鏈構形。假定V_λ域編碼L1、L2及L3環之一系列不同正則結構，且V_κ及V_λ域可與可編碼H1及H2環之數個正則結構的任一V_H域配對，則對於此五個環所觀察到之正則結構組合之數目極大。此暗示產生主鏈構形多樣性可能為產生多種結合特異性所必需。然而，藉由基於單一已知主鏈構形建構抗體文庫，已出乎意料地發現並不需要主鏈構形多樣性來產生足夠多樣性以靶向實質上所有抗原。甚至更意外地，單一主鏈構形無需為共同結構。天然存在之單一構形可用作整個文庫之基礎。因此，在一態樣中，本文所揭示之配位體具有單一已知主鏈構形。

在一態樣中，所選單一主鏈構形為所討論之免疫球蛋白超家族類型分子中之常見構形。在觀察到大量天然存在之分子採用一種構形時，該構形為常見構形。因此，在本文所揭示之一態樣中，分別考慮免疫球蛋白域各結合環之不同主鏈構形之天然存在率，且隨後選擇具有不同環之所需主鏈構形組合的天然存在之可變域。若不能獲得任何可變域，則可選擇最接近之等效物。不同環之所需主鏈構形組合較佳藉由選擇編碼所需主鏈構形之生殖系基因區段產生。所選生殖系基因區段常表現於自然界中更佳，且其為所有天然生殖系基因區段中最常表現者為最佳。

在設計配位體或其文庫時，可分別考慮各抗原結合環之不同主鏈構形之發生率。對於H1、H2、L1、L2及L3而言，選擇天然存在分子中20%與100%之間之抗原結合環所採用的指定構形。通常，其所觀察到之發生率高於35%(亦即在35%與100%之間)，且理想地高於50%或甚至高於65%。因為大多數H3環不具有正則結構，故較佳選擇在呈現正則結構之環中常見之主鏈構形。對於各環而言，由此選擇天然譜系中最常觀察到之構形。在人類抗體中，各環之最普遍正則結構(CS)如下：H1-CS 1(表現譜系之79%)、H2-CS 3(46%)、V_κ之L1-CS 2(39%)、L2-CS 1(100%)、V_κ之L3-CS 1(36%)(計算假定k：λ比率為70：30，Hood等人 (1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,48：133)。對於具有正則結構之H3環而言，七個殘基之CDR3長度(Kabat等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest,U.S.Department of Health and Human Services)(其中殘基94至殘基101具有鹽橋)似乎最常見。EMBL資料文庫中存在至少16個人類抗體序列具有形成此構形所需之H3長度及關鍵殘基，且該蛋白質資料庫中存在至少兩個可用作抗體模型化之基礎之晶體結構(2cgr及1tet)。此正則結構組合之最常表現生殖系基因區段為VH區段3-23(DP-47)、J_H區段JH4b、V_κ區段O2/012(DPK9)及J_κ區段J_κ1。V_H區段DP45及DP38亦合適。因此此等區段可組合用作建構具有所需單一主鏈構形之文庫的基礎。

或者，替代基於經分離各結合環之不同主鏈構形之天然存在率選擇單一主鏈構形，使用主鏈構形組合之天然存在率作為選擇單一主鏈構形之基礎。在抗體的情況下，例如可測定任意兩個、三個、四個、五個或所有六個抗原結合環之正則結構組合之天然存在率。此處，較佳所選構形在天然存在之抗體中常見，且最佳其在天然譜系中最常觀察到。因此，在人類抗體中，例如，在考慮五個抗原結合環H1、H2、L1、L2及L3之天然組合時，測定正則結構之最常見組合，且隨後與H3環之最普遍構形組合，作為選擇單一主鏈構形之基礎。

3.2.域抗體之製備

以多種方法製備域抗體。對於此等方法之每一者而言，製備(例如擴增、突變等)及操作核酸序列之熟知方法均適用。

一種製備域抗體之方法為擴增且表現已知結合所需抗原之經選殖抗體之重鏈或輕鏈基因的V_H或V_L區。亦即，已知域抗體編碼區之V_H或V_L域可經擴增且表現為單域(或單域之融合物)，且評估與CD28之結合。Kabat等人(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)闡述V_H及V_L域之界線。使用關於重鏈及輕鏈基因之V_H及V_L域之界線的資訊來設計自編碼已知結合CD28之抗體的經選殖重鏈或輕鏈編碼序列擴增V域之PCR引子。將經擴增之V域插入合適表現載體(例如pHEN-1(Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137))中且單獨表現或以與另一多肽序列之融合物形式表現。

藉由重組三個基因區段V_H、D及J_H產生V_H基因。在人類中，視單純型而定，存在約51個功能性V_H區段(Cook及Tomlinson(1995)Immunol Today 16：237)、25個功能性D區段(Corbett等人(1997)J.Mol.Biol.268：69)及6個功能性J_H區段(Ravetch等人(1981)Cell 27：583)。V_H區段編碼形成V_H域之第一及第二抗原結合環(H1及H2)之多肽鏈區域，而V_H、D及J_H區段組合形成V_H域之第三抗原結合環(H3)。

藉由重組僅兩個基因區段V_L及J_L產生V_L基因。在人類中，視單純型而定，存在約40個功能性V_κ區段(Schäble及Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374：1001)、31個功能性V_λ區段(Williams等人(1996)J.Mol.Biol.264：220；Kawasaki等人(1997)Genome Res.7：250)、5個功能性J_κ區段(Hieter等人(1982)J.Biol.Chem.257：1516)及4個功能性J_λ區段(Vasicek及Leder(1990)J.Exp.Med.172：609)。V_L區段編碼形成V_L域之第一及第二抗原結合環(L1及L2)之多肽鏈區域，而V_L及J_L區段組合形成V_L域之第三抗原結合環(L3)。咸信選自此初級譜系之抗體具足夠多樣性以便以至少中等親和力結合幾乎所有抗原。在活體內藉由重排基因之「親和力成熟」(其中產生點突變且藉由免疫系統基於改良之結合選擇)產生高親和力抗體。

在一種方法中，藉由例如噬菌體呈現、針對所需抗原淘選來篩選V_H或V_L域之譜系，在一態樣中為人類V_H或V_L域之譜系。建構噬菌體呈現文庫及λ噬菌體表現文庫之方法為此項技術中所熟知且例如由以下文獻教示：McCafferty等人(1990)Nature 348：552；Kang等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88：4363；Clackson等人(1991)Nature 352：624；Lowman等人(1991)Biochemistry 30：10832；Burton等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：10134；Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4133；Chang等人(1991)J.Immunol.147：3610；Breitling等人(1991)Gene 104：147；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581；Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Hawkins及Winter(1992)J.Immunol.,22：867；Marks等人(1992)J.Biol.Chem.,267：16007；及Lerner等人(1992)Science,258：1313。Fab噬菌體呈現文庫例如由U.S.5,922,545教示。scFv噬菌體文庫例如由以下文獻教示：Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85：5879-5883；Chaudhary等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.87：1066-1070；McCafferty等人(1990)(前述)；Clackson等人(1991)(前述)；Marks等人(1991)(前述)；Chiswell等人(1992)Trends Biotech.10：80；及Marks等人(1992)(前述)。已描述在噬菌體鞘蛋白上呈現之scFv文庫的各種實施例。亦已知噬菌體呈現方法之改進，例如WO96/06213及WO92/01047(Medical Research Council等人)及WO97/08320(Morphosys(前述))所述。

V_H或V_L域之譜系可為天然存在之免疫球蛋白序列譜系或合成譜系。天然存在之譜系為一種例如由收集自一或多個個體之免疫球蛋白表現細胞製備之譜系。該等譜系可為「原生」譜系，亦即例如自人類胎兒或新生兒免疫球蛋白表現細胞製備，或為重排譜系，亦即例如自成人人類B細胞製備。天然譜系例如由Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581及Vaughan等人(1996)Nature Biotech.14：309描述。若需要，隨後對自天然譜系鑑別或自任何譜系鑑別(就此而言，結合標靶抗原)之純系進行突變誘發且進一步篩選以產生且選擇具有改良之結合特徵的變異體。

域抗體之合成譜系係藉由於經選殖V域中人工引入多樣性來製備。合成譜系例如由Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.227：381；Barbas等人(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Nissim等人(1994)EMBO J.13：692；Griffiths等人(1994)EMBO J.13：3245；DeKriuf等人(1995)J.Mol.Biol.248：97；及WO 99/20749描述。

在一態樣中，在V_H或V_κ背景中基於人工多樣化生殖系V_H或V_κ序列製備合成可變域譜系。舉例而言，V_H域譜系可基於經選殖之生殖系V_H基因區段V3-23/DP47(Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776)及JH4b。V_κ域譜系可基於例如生殖系V_κ基因區段O2/O12/DPK9(Cox等人(1994)Eur.J.Immunol.24：827)及J_κ1。藉由例如PCR突變誘發於此等或其他基因區段中引入多樣性。多樣性可例如藉由易錯PCR(error prone PCR)(Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889)或化學突變誘發隨機引入。如上所述，然而，在一實施例中，針對特定殘基引入多樣性。在另一實施例中，藉由使用突變誘發引子引入密碼子NNK(使用IUPAC命名法，其中N=G、A、T或C，且K=G或T)針對所需殘基引入多樣性，該密碼子NNK編碼所有胺基酸及TAG終止密碼子。達成類似目的之其他密碼子亦適用，該等密碼子包括NNN密碼子(其引起其他終止密碼子TGA及TAA之產生)、DVT密碼子((A/G/T)(A/G/C)T)、DVC密碼子((A/G/T)(A/G/C)C)及DVY密碼子((A/G/T)(A/G/C)(C/T))。DVT密碼子編碼22%絲胺酸及11%酪胺酸、天冬醯胺、甘胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸及半胱胺酸，其最接近模擬天然人類抗體之抗原結合位點的胺基酸殘基分布。使用PCR引子製備各位點具有欲進行多樣化之所選簡併密碼子的譜系。PCR突變誘發為此項技術中所熟知。

在一態樣中，於人類生殖系V_H基因區段V3-23/DP47(Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：7768)及JH4b之序列中使用NNK密碼子在位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97及H98處對應於CDR1、CDR2及CDR3之多樣性引入多樣性，其中編號係如美國專利第6,696,245號中所用。

在另一態樣中，亦於人類生殖系V_H基因區段V3-23/DP47及JH4b之序列中例如使用NNK密碼子在位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a及H100b處對應於CDR1、CDR2及CDR3之多樣性引入多樣性，其中編號係如美國專利第6,696,245號中所用。

在另一態樣中，於人類生殖系V_κ基因區段O2/O12/DPK9及J_κ1之序列中例如使用NNK密碼子在位點L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94及L96處對應於CDR1、CDR2及CDR3之多樣性引入多樣性，其中編號係如美國專利第6,696,245號中所用。

如此項技術中已知且如例如WO 99/20749所述將多樣化譜系選殖於噬菌體呈現載體中。一般而言，本文所述組合物及方法所必需之核酸分子及載體構築體可在此項技術中獲得且如標準實驗手冊(諸如Sambrook等人(1989),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,USA及後續版本)所述建構及操作。

本文所述之核酸之操作通常在重組載體中進行。如本文所用之「載體」係指用於將異源DNA引入細胞中以使該異源DNA表現及/或複製的離散元件。選擇或建構及隨後使用該等載體之方法為熟習此項技術者所熟知。諸多載體可公開獲得，該等載體包括細菌質體、噬菌體、人工染色體及游離型載體。該等載體可用於簡單選殖及突變誘發；或者，作為運載本文之譜系(或前譜系(pre-repertoire))成員之載體的典型，使用基因表現載體。本文所述之適用載體經選擇以適應具有所需尺寸(長度通常為0.25千鹼基(kb)至40 kb)之多肽編碼序列。在活體外選殖操作之後，將合適宿主細胞用載體轉型。各載體含有各種功能性組份，該等組份通常包括選殖(或「多酶切點接頭(polylinker)」)位點、複製起點及至少一個選擇性標記基因。若指定載體為表現載體，則其另外具有一或多個以下各物：各位於選殖位點附近之增強子元件、啟動子、轉錄終止及信號序列，以使其與編碼如本文所述多肽譜系成員之基因可操作地連接。

選殖載體與表現載體通常均含有使載體能夠在一或多個所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列為使載體能夠不依賴於宿主染色體DNA複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。熟知多種細菌、酵母及病毒之該等序列。來自質體pBR322之複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，2 μm質體起點適合於酵母，且各種病毒起點(例如SV 40、腺病毒)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體並不需要複製起點，除非此等表現載體用於能夠複製高水準DNA之哺乳動物細胞(諸如COS細胞)中。

選殖載體或表現載體亦適宜地含有選擇基因(亦稱作選擇性標記)。此基因編碼在選擇性培養基中生長之經轉型宿主細胞存活或生長所需之蛋白質。因此未用含有選擇基因之載體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典型選擇基因編碼賦予對抗生素及其他毒素(例如胺苄西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline))之抗性的蛋白質，補充營養缺陷或提供生長培養基中不能獲得之關鍵營養素。

因為本文載體之複製最宜在大腸桿菌(E.coli)中執行，故大腸桿菌選擇性標記(例如賦予對抗生素胺苄西林之抗性的β-內醯胺酶基因)適用。其可獲自大腸桿菌質體(諸如pBR322)或pUC質體(諸如pUC18或pUC19)。然而，其他質體微生物組合亦可進行合理替代。

表現載體通常含有由宿主生物體識別且與所需編碼序列可操作地連接之啟動子。該啟動子可為誘導型或組成型啟動子。術語「可操作地連接」係指毗連，其中所述組份呈使其可以其預期方式發揮功能之關係。與編碼序列「可操作地連接」之控制序列以一定方式接合以使得在與控制序列相容之條件下達成編碼序列之表現。

適用於原核宿主之啟動子包括例如β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac啟動子)。用於細菌系統之啟動子通常亦含有與編碼序列可操作地連接之夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)。

在本文所述之文庫或譜系中，載體可為使對應於多肽文庫成員之核苷酸序列能夠表現的表現載體。因此，藉由使表現多肽文庫成員之單一純系單獨繁殖且表現或藉由使用任何選擇呈現系統執行選擇。如上所述，一選擇呈現系統使用噬菌體呈現。因此，可使用噬菌體或噬菌粒載體。載體可為噬菌粒載體，其具有大腸桿菌複製起點(用於進行雙鏈複製)以及噬菌體複製起點(用於產生單鏈DNA)。該等載體之操作及表現為此項技術中所熟知(Hoogenboom及Winter(1992)(前述)；Nissim等人(1994)(前述))。簡言之，載體含有賦予噬菌粒以選擇性之β-內醯胺酶或其他選擇性標記基因及在表現卡匣上游之lac啟動子，該表現卡匣由以下組成(N至C末端)：pelB前導序列(其引導所表現之多肽至周質空間)、多選殖位點(用於選殖文庫成員之核苷酸形式)、視情況存在之一或多個肽標籤(用於偵測)、視情況存在之一或多個TAG終止密碼子及噬菌體蛋白pIII。在一實施例中，載體編碼真核GAS1前導序列而非pelB前導序列，該真核GAS1前導序列用以引導融合多肽分泌至周質空間(大腸桿菌中)或培養基(真核細胞系統中)中。使用大腸桿菌之各種抑制及非抑制株，且在添加葡萄糖、異丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體(諸如VCS M13)的情況下，載體能夠如質體般複製而不表現，僅產生大量多肽文庫成員或產生噬菌體，其中一些在其表面上含有多肽-pIII融合物之至少一個複本。

載體之一實例為pHEN1噬菌粒載體(Hoogenboom等人(1991)Nucl.Acids Res.19：4133-4137；序列可例如在WO 03/031611中以SEQ ID NO：7獲得)，其中pIII融合蛋白之產生處於LacZ啟動子之控制下，該LacZ啟動子在葡萄糖存在下受到抑制且由IPTG誘發。當在大腸桿菌之抑制株(例如TG1)中生長時，基因III融合蛋白產生且封裝至噬菌體中，而在非抑制株(例如HB2151)中生長使可溶性融合蛋白可分泌至細菌周質中及培養基中。因為基因III之表現阻礙後期用輔助噬菌體感染，故容有噬菌粒載體之細菌在葡萄糖存在下繁殖，隨後用VCSM13輔助噬菌體感染進行噬菌體援救。

如本文所述載體之建構使用習知接合技術。將經分離載體或DNA片段裂解、修整且再接合成產生所需載體所需之形式。若需要，使用標準方法執行序列分析以證實正確序列存在於所建構載體中。建構表現載體、製備活體外轉錄物、於宿主細胞中引入DNA及執行分析以評定表現及功能之合適方法為熟習此項技術者已知。偵測樣品中基因序列之存在，或藉由習知方法定量之該基因序列之擴增及/或表現，該等習知方法諸如南方或北方分析法(Southern or Northern analysis)，西方墨點法(Western blotting)，DNA、RNA或蛋白質之點墨法，原位雜交法，核酸或蛋白質分子之免疫細胞化學或序列分析。若需要，熟習此項技術者將易於想到此等方法可如何修改。

3.3.針對抗原結合篩選域抗體

在噬菌體表面上表現域抗體譜系之後，藉由以下步驟執行選擇：使噬菌體譜系與經固定標靶抗原接觸，洗滌移除未結合之噬菌體，及使結合之噬菌體繁殖，整個方法通常稱作「淘選」。此方法可用於篩選域抗體以及可在呈現文庫上表現之其他抗體片段，例如scFv、Fab等。或者，針對正確摺疊之成員變異體之表現，藉由針對僅由摺疊成員結合之經固定通用配位體(例如蛋白A或蛋白L)淘選來對噬菌體進行預選擇。此具有減少非功能性成員之比例從而增加可能結合標靶抗原成員之比例的優點。用通用配位體預選擇例如教示於WO 99/20749中。噬菌體抗體文庫之篩選例如由Harrison等人(1996)Meth.Enzymol.267：83-109一般性描述。

通常使用固定於固體載體(例如塑膠管或孔)上或層析基質(例如Sepharose^TM(Pharmacia))上之純化抗原執行篩選。亦可對複合抗原(諸如細胞表面抗原)執行篩選或選擇(Marks等人(1993)BioTechnology 11：1145；de Kruif等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3938)。另一替代性方法涉及藉由結合溶液狀態之生物素標記抗原，繼而捕獲在抗生蛋白鏈菌素塗布珠粒上來選擇。

在一態樣中，藉由將抗原(通用或特異性抗原)固定於板(例如Nunc MAXISORP^TM免疫管8孔板條)中之管或孔上執行淘選。用150 μl抗原(100 μg/ml於PBS中)塗布孔且培育隔夜。隨後用PBS洗滌該等孔3次，且在37℃下用400 μlPBS-2%脫脂乳(2% MPBS)阻斷2小時。用PBS沖洗該等孔3次，且添加於2% MPBS中之噬菌體。將混合物在室溫下培育90分鐘，且移除含有未結合噬菌體之液體。用PBS-0.1% Tween 20沖洗孔10次，且隨後用PBS沖洗10次以移除清潔劑。藉由添加200 μl新鮮製備之100 mM三乙胺溶離結合之噬菌體，將孔內物質混合且在室溫下培育10 min。將溶離之噬菌體轉移至含有100 μl 1 M Tris-HCl(pH 7.4)之管中且渦旋以中和三乙胺。用例如150 ml溶離之噬菌體藉由在37℃下培育30 min來感染指數式生長之大腸桿菌宿主細胞(例如TG1)。將經感染細胞離心，再懸浮於新鮮培養基中且塗於頂層瓊脂糖中。將噬菌體空斑溶離或挑選至宿主細胞之新鮮培養物中進行繁殖以作分析或另外輪次之選擇。若必要執行一或多輪空斑純化以確保所選噬菌體群為純的。其他篩選方法由Harrison等人(1996)(前述)描述。

鑑別表現結合所需標靶之域抗體的噬菌體之後，若使用噬菌粒載體(諸如pHEN1)，則易於藉由感染細菌之非抑制株(例如允許分泌可溶性基因III融合蛋白之HB2151)產生可溶形式之可變域融合蛋白。若GAS1分泌信號肽由載體編碼，則融合多肽可由真核(例如酵母或哺乳動物)或原核(例如大腸桿菌)細胞分泌。或者，可根據此項技術中已知之方法將V域序列次選殖於適當表現載體中以產生可溶性蛋白。

3.4.域抗體之純化及濃縮

根據已知方法(Harrison等人(1996)(前述))收集且純化分泌至周質空間或細菌培養基中之域抗體。Skerra & Pluckthun(1988)Science 240：1038及Breitling等人(1991)Gene 104：147描述自周質收集域抗體，且Better等人(1988)Science 240：1041描述自培養物上清液收集域抗體。對於一些域抗體而言，亦可藉由與通用配位體(諸如蛋白A或蛋白L)結合達成純化。或者，可使可變域與肽標籤(例如Myc、HA或6X-His標籤(SEQ ID NO：644))一起表現，此有利於藉由親和層析法純化。

若必要，藉由此項技術中熟知之數種方法中之任一者濃縮域抗體，該等方法包括例如超濾、透濾及切向流過濾(tangential flow filtration)。超濾法使用半透膜及壓力，基於尺寸及形狀來分離分子物質。藉由氣體壓力或藉由離心提供壓力。市售超濾產品可廣泛獲自例如Millipore(Bedford,MA；實例包括Centricon^TM及Microcon^TM濃縮器)及Vivascience(Hannover,Germany；實例包括Vivaspin^TM濃縮器)。藉由選擇小於標靶多肽之分子量截斷(通常為標靶多肽分子量之1/3至1/6，但亦可成功地使用小至10 kD之差異)保留多肽，同時溶劑及較小溶質通過膜。因此，約5 kD之分子量截斷適用於濃縮本文所述之域抗體。

若需要使用將超濾膜用於「洗滌」過程進行透濾以移除或交換多肽製劑中之鹽或緩衝液。藉由使溶劑及小溶質通過該膜來濃縮多肽，且藉由用新緩衝液或鹽溶液或水稀釋保留之多肽來移除剩餘鹽或緩衝液，視需要伴隨繼續超濾。在連續透濾過程中，以濾液通過膜之相同速率添加新緩衝液。透濾體積為開始透濾(使用連續透濾)之前多肽溶液之體積，藉由用新緩衝液以六個透濾體積洗滌可移除99.5%以上之完全可滲透溶質。或者，該方法可以不連續方式執行，其中反覆稀釋樣品且隨後過濾回其原始體積以移除或交換鹽或緩衝液且最終濃縮多肽。透濾之設備及其詳細用法可獲自例如Pall Life Sciences(Ann Arbor,MI)及Sartorius AG/Vivascience(Hannover,Germany)。

切向流過濾(TFF)(亦稱為「交叉流過濾」)亦使用超濾膜。將含有標靶多肽之流體沿膜表面切向泵送。壓力使一部分流體通過膜，而標靶多肽保留在過濾器上。然而，與標準超濾相比，保留之分子不積累於膜表面上，而是由切向流向前運載。可使未通過過濾器(含有標靶多肽)之溶液跨過膜反覆循環以達成所需濃縮程度。TFF之設備及其詳細用法可獲自例如Millipore(例如ProFlux M12^TM Benchtop TFF系統及Pellicon^TM系統)、Pall Life Sciences(例如Minim^TM切向流過濾系統)。

以此項技術中熟知之多種方法量測蛋白質濃度。此等方法包括例如胺基酸分析、280 nm下之吸光度、「布萊德(Bradford)」及「勞立(Lowry)」法及SDS-PAGE。最精確方法為安全水解，繼而藉由HPLC進行胺基酸分析，隨後測定濃度，隨後與域抗體之已知序列對比。雖然此方法最精確，但其昂貴且耗時。藉由量測280 nm下之UV吸光度進行蛋白質測定較快且廉價得多，仍相對精確且為胺基酸分析之折衷。使用280 nm下之吸光度測定本文所述實例中所報導之蛋白質濃度。

「布萊德」及「勞立」蛋白質檢定法(Bradford(1976)Anal.Biochem.72：248-254；Lowry等人(1951)J.Biol.Chem.193：265-275)將樣品蛋白質濃度與最常基於牛血清白蛋白(BSA)之標準曲線對比。此等方法不太精確，傾向於低估域抗體之濃度。然而，其精度可藉由使用V_H或V_κ單域多肽作為標準物來改良。

可使用之另一蛋白質檢定方法為美國專利第4,839,295號(以引用的方式併入本文中)中所述且由Pierce Biotechnology(Rockford,IL)以「BCA蛋白質檢定」銷售之二辛可寧酸(bicinchoninic acid)檢定(例如Pierce目錄號23227)。

SDS-PAGE法使用凝膠電泳及考馬斯藍(Coomassie Blue)染色與已知濃度標準物(例如已知量之域抗體)相比。可藉由肉眼或藉由密度測定法進行定量。

本文所述之域抗體在高濃度(例如於水溶液(例如PBS)中至少4.8 mg(約400 μM)，且在一態樣中，至少約5 mg/ml(約417 μM)、10 mg/ml(約833 μM)、20 mg/ml(約1.7 mM)、25 mg/ml(約2.1 mM)、30 mg/ml(約2.5 mM)、35 mg/ml(約2.9 mM)、40 mg/ml(約3.3 mM)、45 mg/ml(約3.75 mM)、50 mg/ml(約4.2 mM)、55 mg/ml(約4.6 mM)、60 mg/ml(約5.0 mM)、65 mg/ml(約5.4 mM)、70 mg/ml(約5.8 mM)、75 mg/ml(約6.3 mM)、100 mg/ml(約8.33 mM)、 150 mg/ml(約12.5 mM)、200 mg/ml(約16.7 mM)、240 mg/ml(約20 mM)或240 mg/ml以上)下保持溶解性。促進高溶解性之一結構特徵為域抗體相對較小之尺寸。全長習知四鏈抗體(例如IgG)之尺寸為約150 kD。相比之下，具有包含4個構架(FW)區及3個CDR之通式結構的域抗體具有約12 kD之尺寸或小於習知抗體尺寸之1/10。類似地，域抗體為scFv分子尺寸(約26 kD)之約1/2及Fab分子尺寸(約60 kD)之約1/5。本文所揭示之含域抗體結構之尺寸可為100 kD或100 kD以下，包括例如約90 kD或90 kD以下、80 kD或80 kD以下、70 kD或70 kD以下、60 kD或60 kD以下、50 kD或50 kD以下、40 kD或40 kD以下、30 kD或30 kD以下、20 kD或20 kD以下，低至且包括約12 kD之結構，或經分離域抗體。

域抗體之溶解性主要由胺基酸側鏈與周圍溶劑之相互作用決定。疏水性側鏈傾向於以多肽摺疊形式定位於內部而遠離多肽與溶劑相互作用之表面。相反地，親水性殘基傾向於定位於多肽與溶劑相互作用之表面。一般而言，具有使分子可摺疊以將較多親水性殘基暴露於水性環境之初級序列的多肽比進行摺疊以將較少親水性殘基暴露於表面的多肽可溶。因此，疏水性殘基及親水性殘基之配置及數目為溶解性之重要決定因素。決定多肽溶解性之其他參數包括溶劑pH值、溫度及離子強度。在一慣例中，可藉由向溶液中添加甘油(例如約10% v/v)來保持或增加多肽之溶解性。

如上所述，人類V_H域之保守殘基中已鑑別出在駱駝物種之V_H域中變化之特定胺基酸殘基，駱駝物種V_H域通常比人類V_H域可溶。此等胺基酸殘基包括例如Gly 44(在駱駝中為Glu)、Leu 45(在駱駝中為Arg)及Trp 47(在駱駝中為Gly)。V_H之胺基酸殘基103亦與溶解性有關，Trp突變為Arg傾向於賦予增加之V_H溶解性。

在本文所述之一些態樣中，域抗體係基於DP47生殖系V_H基因區段或DPK9生殖系V_κ基因區段。因此，此等生殖系基因區段能夠(尤其在本文所述之所選結構位置處多樣化時)產生高度可溶之特異性結合域抗體。詳言之，四個構架區(在一態樣中其未經多樣化)可促成所得蛋白質之高溶解性。

預期與具有已知高溶解性之域抗體共有序列一致性百分比的域抗體亦傾向於高度可溶。因此，作為預測或識別指定域抗體是否具有本文所述之高溶解性的一種方式，可對比域抗體之序列與一或多個具有已知溶解性之域抗體。因此，在鑑別具有高結合親和力但具有未知溶解性之域抗體時，對比該域抗體之胺基酸序列與一或多個(在一態樣中，多個)已知具有高溶解性之域抗體的胺基酸序列(例本文所揭示之dAb序列)可允許預測其溶解性。雖然其不為絕對預測者，但在與已知高度可溶性序列存在高度類似性(例如90-95%或90-95%以上類似性)時，且尤其在對於親水性胺基酸殘基或可能暴露於溶劑界面處之殘基存在高度類似性時，新鑑別之結合多肽很可能具有與已知高度可溶序列類似之溶解性。

亦可使用分子模型化軟體預測多肽序列相對於已知溶解性之多肽之溶解性。舉例而言，預期在溶劑暴露表面取代或添加疏水性殘基相對於在該位置暴露較低疏水性或甚至親水性殘基之已知溶解性之分子減小多肽之相對溶解性。類似地，預期在該位置取代或添加較高親水性之殘基增加相對溶解性。亦即，位於分子表面之親水性或疏水性殘基之淨數目(或表面暴露殘基之整體疏水性或親水性)相對於具有已知溶解性之域抗體結構的變化可預測域抗體之相對溶解性。或者，或結合該預測，可藉由簡單地濃縮多肽來確定域抗體溶解性之界限。

3.5.親和力測定

在一態樣中，本文所述之含經分離域抗體之多肽的親和力(解離常數，K_d=K_off/K_on)為至少約500 nM或500 nM以下，且在一態樣中，為至少約400 nM-50 pM、300 nM-50 pM、200 nM-50 pM，且在另一態樣中，為至少100 nM-50 pM、75 nM-50 pM、50 nM-50 pM、25 nM-50 pM、10 nM-50 pM、5 nM-50 pM、1 nM-50 pM、950 pM-50 pM、900 pM-50 pM、850 pM-50 pM、800 pM-50 pM、750 pM-50 pM、700 pM-50 pM、650 pM-50 pM、600 pM-50 pM、550 pM-50 pM、500 pM-50 pM、450 pM-50 pM、400 pM-50 pM、350 pM-50 pM、300 pM-50 pM、250 pM-50 pM、200 pM-50 pM、150 pM-50 pM、100 pM-50 pM、90 pM-50 pM、80 pM-50 pM、70 pM-50 pM、60 pM-50 pM，或甚至低至50 pM。

在另一實施例中，域抗體以在1 pM至1.5 μM範圍內(包括1 pM及1.5 μM)之IC₅₀值抑制CD28與CD80之結合(抑制CD28與CD80結合之IC₅₀值)。該IC₅₀值可在1 pM至1 μM、1 pM至900 nM、1 pM至800 nM、1 pM至700 nM、1 pM至600 nM、1 pM至500 nM、1 pM至400 nM、1 pM至300 nM、1 pM至200 nM、1 pM至100 nM、1 pM至50 nM、1 pM至10 nM、1 pM至1 nM、1 pM至500 pM、1 pM至100 pM、1 pM至50 pM、1 pM至10 pM或1 pM至5 pM之範圍內。其他可接受之範圍包括例如50 pM至1 μM、100 pM至500 nM、125 pM至250 nM、150 pM至200 nM、150 pM至100 nM及200 pM至50 nM。

在另一實施例中，域抗體以在1 pM至1.5 μM範圍內(包括1 pM及1.5 μM)之IC₅₀值抑制CD28與CD86之結合(抑制CD28與CD86結合之IC₅₀值)。該IC₅₀值可在1 pM至1 μM、1 pM至900 nM、1 pM至800 nM、1 pM至700 nM、1 pM至600 nM、1 pM至500 nM、1 pM至400 nM、1 pM至300 nM、1 pM至200 nM、1 pM至100 nM、1 pM至50 nM、1 pM至10 nM、1 pM至1 nM、1 pM至500 pM、1 pM至100 pM、1 pM至50 pM、1 pM至10 pM或1 pM至5 pM之範圍內。其他可接受之範圍包括例如50 pM至1 μM、100 pM至500 nM、125 pM至250 nM、150 pM至200 nM、150 pM至100 nM及200 pM至50 nM。

域抗體之抗原結合親和力可便利地藉由表面電漿共振(SPR)使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor,Piscataway,N.J.)量測。在此方法中，抗原與BIAcore晶片以已知濃度偶合，且引入可變域多肽。可變域多肽與經固定抗原之間的特異性結合使晶片基質上之蛋白質濃度增加且使SPR信號發生變化。SPR信號變化以共振單位(RU)記錄且相當於時間沿感應圖之Y軸呈現。在僅溶劑(例如PBS)通過晶片的情況下獲得基線信號。基線信號與完成域抗體注射之後的信號之間的淨差異表示指定樣品之結合值。為測定解離速率(K_off)、締合速率(K_on)及解離速率(K_d)常數，使用BIAcore動力學評估軟體(例如2.1版)。

因此，可使用SPR，藉由量測單價抗體製劑所引起之對CD28與CD80或CD86結合之置換或抑制來監測域抗體製劑對CD28與CD80或CD86結合之拮抗作用。亦可使用SPR來監測本文所述之抗體製劑中經由Fc區發生之二聚或在一態樣中二聚之缺乏。

高親和力取決於抗原表面與抗體或抗體片段之CDR之間的互補性。互補性係由標靶部分與CDR之間可能發生的分子相互作用之類型及強度決定，該等分子相互作用例如潛在離子相互作用、凡得瓦爾引力(van der Waals attraction)、氫鍵結或可發生之其他相互作用。與CDR1及CDR2相比，CDR3傾向於對抗原結合相互作用貢獻更多力量，可能由於其尺寸通常較大，此為有利表面相互作用提供更多機會(參見例如Padian等人(1994)Mol.Immunol.31： 169-217；Chothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：904-917；及Chothia等人(1985)J.Mol.Biol.186：651-663)。高親和力表明域抗體/抗原對具有高度互補性，此直接與可變域及標靶之結構相關。

在一態樣中，域抗體與另一域抗體連接以形成異型二聚物，其中各個別域抗體能夠結合不同同源抗原。使域抗體融合成異型二聚物(其中各單體結合不同標靶抗原)可產生例如能夠橋接各別標靶抗原之雙特異性配位體。該等雙特異性配位體可用於靶向細胞激素及在生物體內在治療情形下協同合作之其他分子。因此，提供一種協同加強兩種或兩種以上細胞激素之活性的方法，其包含投與能夠與該兩種或兩種以上細胞激素結合之雙特異性抗體異型二聚物。

本文所述之域抗體包括結合CD28之域抗體純系及與該等純系具有相當大序列類似性或一致性百分比且亦以高親和力結合標靶抗原的純系。如本文所用之「相當大」之序列類似性或一致性為至少70%之類似性或一致性。

一致性或類似性之另一量度為在高度嚴格雜交條件下雜交之能力。因此，若編碼域抗體之第一序列與第二序列(或其互補序列)在高度嚴格雜交條件(諸如由Sambrook等人，Molecular Cloning,Laboratory Manuel,Cold Spring,Harbor Laboratory press,New York所述之彼等條件)下雜交，則該第一序列與該第二編碼序列實質上類似。「高度嚴格雜交條件」係指在約45℃下在6×SSC中雜交，繼而在65℃下在0.2×SSC、0.1% SDS中洗滌一或多次。「極高度嚴格雜交條件」係指在65℃下在0.5 M磷酸鈉，7% SDS中雜交，繼而在65℃下在0.2×SSC，1% SDS中洗滌一或多次。

在一實施例中，域抗體包括：

1h-239-850(SEQ ID NO：58)

1h-35(SEQ ID NO：59)

1h-36(SEQ ID NO：60)

1h-79(SEQ ID NO：61)

1h-80(SEQ ID NO：62)

1h-83(SEQ ID NO：63)

1h-108(SEQ ID NO：64)

1h-203(SEQ ID NO：65)

1h-207(SEQ ID NO：66)

1h-238(SEQ ID NO：67)

1h-239(SEQ ID NO：68)

1h-18-1(SEQ ID NO：69)

1h-18-2(SEQ ID NO：70)

1h-18-3(SEQ ID NO：71)

1h-18-4(SEQ ID NO：72)

1h-18-5(SEQ ID NO：73)

1h-18-6(SEQ ID NO：74)

1h-28-1(SEQ ID NO：75)

1h-28-2(SEQ ID NO：76)

1h-31(SEQ ID NO：77)

1h-32(SEQ ID NO：78)

1h-33(SEQ ID NO：79)

1h-34(SEQ ID NO：80)

1h-35(SEQ ID NO：81)

1h-35-15(SEQ ID NO：82)

1h-35-2(SEQ ID NO：83)

1h-35-5(SEQ ID NO：84)

1h-35-7(SEQ ID NO：85)

1h-35-9(SEQ ID NO：86)

1h-36(SEQ ID NO：87)

1h-36-1(SEQ ID NO：88)

1h-36-2(SEQ ID NO：89)

1h-36-3(SEQ ID NO：90)

1h-36-4(SEQ ID NO：91)

1h-36-5(SEQ ID NO：92)

1h-36-6(SEQ ID NO：93)

1h-36-7(SEQ ID NO：94)

1h-38(SEQ ID NO：95)

1h-39(SEQ ID NO：96)

1h-69(SEQ ID NO：97)

1h-70(SEQ ID NO：98)

1h-71(SEQ ID NO：99)

1h-72(SEQ ID NO：100)

1h-73(SEQ ID NO：101)

1h-74(SEQ ID NO：102)

1h-75(SEQ ID NO：103)

1h-76(SEQ ID NO：104)

1h-77(SEQ ID NO：105)

1h-78(SEQ ID NO：106)

1h-79(SEQ ID NO：107)

1h-79-1(SEQ ID NO：108)

1h-79-10(SEQ ID NO：109)

1h-79-11(SEQ ID NO：110)

1h-79-15(SEQ ID NO：111)

1h-79-1505(SEQ ID NO：112)

1h-79-1512(SEQ ID NO：113)

1h-79-1519(SEQ ID NO：114)

1h-79-1520(SEQ ID NO：115)

1h-79-16(SEQ ID NO：116)

1h-79-17(SEQ ID NO：117)

1h-79-18(SEQ ID NO：118)

1h-79-19(SEQ ID NO：119)

1h-79-2(SEQ ID NO：120)

1h-79-20(SEQ ID NO：121)

1h-79-21(SEQ ID NO：122)

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1h-99-23736(SEQ ID NO：632)

1h-99-23738(SEQ ID NO：633)

1h-99-23739(SEQ ID NO：634)

1h-99-23737(SEQ ID NO：635)。

在一實施例中，域抗體可包括以下CDR中之一或多者：

1h-239-850 CDR1(SEQ ID NO：484)

1h-239-850 CDR2(SEQ ID NO：485)

1h-239-850 CDR3(SEQ ID NO：486)

1h-35 CDR1(SEQ ID NO：487)

1h-35 CDR2(SEQ ID NO：488)

1h-35 CDR3(SEQ ID NO：489)

1h-36 CDR1(SEQ ID NO：490)

1h-36 CDR2(SEQ ID NO：491)

1h-36 CDR3(SEQ ID NO：492)

1h-79 CDR1(SEQ ID NO：493)

1h-79 CDR2(SEQ ID NO：494)

1h-79 CDR3(SEQ ID NO：495)

1h-80 CDR1(SEQ ID NO：496)

1h-80 CDR2(SEQ ID NO：497)

1h-80 CDR3(SEQ ID NO：498)

1h-83 CDR1(SEQ ID NO：499)

1h-83 CDR2(SEQ ID NO：500)

1h-83 CDR3(SEQ ID NO：501)

1h-108 CDR1(SEQ ID NO：502)

1h-108 CDR2(SEQ ID NO：503)

1h-108 CDR3(SEQ ID NO：504)

1h-203 CDR1(SEQ ID NO：505)

1h-203 CDR2(SEQ ID NO：506)

1h-203 CDR3(SEQ ID NO：507)

1h-207 CDR1(SEQ ID NO：508)

1h-207 CDR2(SEQ ID NO：509)

1h-207 CDR3(SEQ ID NO：510)

1h-238 CDR1(SEQ ID NO：511)

1h-238 CDR2(SEQ ID NO：512)

1h-238 CDR3(SEQ ID NO：513)

1h-239 CDR1(SEQ ID NO：514)

1h-239 CDR2(SEQ ID NO：515)

1h-239 CDR3(SEQ ID NO：516)

1h-99-237 CDR1(SEQ ID NO：517)

1h-99-237 CDR2(SEQ ID NO：518)

1h-99-237 CDR3(SEQ ID NO：519)

1h-99-238 CDR1(SEQ ID NO：520)

1h-99-238 CDR2(SEQ ID NO：521)

1h-99-238 CDR3(SEQ ID NO：522)

1h-37 CDR1(SEQ ID NO：523)

1h-37 CDR2(SEQ ID NO：524)

1h-37 CDR3(SEQ ID NO：525)

1h-93 CDR1(SEQ ID NO：526)

1h-93 CDR2(SEQ ID NO：527)

1h-93 CDR3(SEQ ID NO：528)

1h-99 CDR1(SEQ ID NO：529)

1h-99 CDR2(SEQ ID NO：530)

1h-99 CDR3(SEQ ID NO：531)

1h-239-891 CDR1(SEQ ID NO：636)

1h-239-891 CDR2(SEQ ID NO：637)，及

1h-239-891 CDR3(SEQ ID NO：638)。

4. CD28活性檢定

在一例示性實施例中，本文所述之域抗體與CD28結合，但不實質上促進CD28信號傳導。CD28路徑之活化表現多個不同結果，該等結果可經量測以評定指定域抗體對該路徑活性之影響。然而，為評定本文所述之域抗體之拮抗劑或促效劑功能，可使用至少一種以下CD28檢定。

在一實施例中，量測T細胞之活化。在該檢定中，用抗CD3加表現CD80或CD86之經轉染CHO細胞刺激人類CD3陽性T細胞。此引起T細胞增殖且依賴於CD28，因為域抗體阻斷增殖反應。

在另一實施例中，量測T細胞增殖之誘發及細胞激素分泌之誘發。該檢定包含用抗CD28 mAb 9.3刺激人類CD3陽性T細胞(Gibson等人(1996)J.Biol.Chem.,271：7079-7083)。此引起T細胞受體介導之信號傳導上調及細胞激素分泌且依賴於CD28，因為mAb 9.3阻斷增殖反應。可量測之所分泌細胞激素包括(但不限於)GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-24、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。可根據本文所述之揭示內容偵測及/或量測一或多種該等細胞激素。

如本文別處所述，CD28活性檢定亦可包括評定CTLA4活性。詳言之，本發明之域抗體並不抑制CTLA-4介導之對T細胞功能之抑制，包括對T細胞受體介導之信號傳導之抑制、對T細胞增殖之抑制及對細胞激素分泌之抑制。

應瞭解，基於本文之揭示內容，本文所述之域抗體可具有多個功能及活性，且因此可由多個不同檢定來檢定。如本文別處詳細描述，域抗體具有多個定義特徵(例如CD28結合親和力、CDR域一致性及胺基酸序列等)，且因此各不同域抗體可以多種方式且經由多個參數表徵。因此每一此類域抗體之表徵單獨或與該域抗體之活性及/或CD28結合特性結合可提供該域抗體之獨特鑑別特徵。

5.域抗體之聚乙二醇化

本文亦提供聚乙二醇化域抗體，其相對於未聚乙二醇化域抗體具有延長之半衰期，且在一態樣中，亦抵抗降解而不損失活性(例如結合親和力)。

蛋白質分子之位點特異性聚乙二醇化與隨機聚乙二醇化均為此項技術中已知(參見例如Zalipsky及Lee,Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications(1992)，第347-370頁，Plenum, NY；Goodson及Katre(1990)Bio/Technology,8：343；Hershfield等人(1991)PNAS 88：7185)。更特定言之，已描述抗體分子在離胺酸殘基及硫醇化衍生物處進行之隨機聚乙二醇化(Ling及Mattiasson(1983)Immunol.Methods 59：327；Wilkinson等人(1987)Immunol.Letters,15：17；Kitamura等人(1991)Cancer Res.51：4310；Delgado等人(1996)Br.J.Cancer,73：175；Pedley等人(1994)Br.J.Cancer,70：1126)。

因此，可使用此項技術中已知之方法使此態樣之域抗體與適用於達成本文所涵蓋之延長之半衰期及降解抗性的聚合物分子(在一態樣中為PEG)偶合。可使用之聚合物部分可為合成或天然存在之部分，且包括(但不限於)直鏈或分枝鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物，或分枝鏈或無分枝鏈多醣(諸如均多醣或雜多醣)。可使用之合成聚合物之實例包括直鏈或分枝鏈聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物或取代形式。適用之經取代聚合物包括經取代PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。本文中可使用之除PEG以外或替代PEG的天然存在之聚合物部分包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖或肝醣以及其將為熟習此項技術者認可之衍生物。本文所述聚合物分子之衍生形式包括例如其中存在其他部分或反應基團以允許與本文所述域抗體之胺基酸殘基相互作用的衍生物。該等衍生物包括N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活性酯、丁二醯亞胺基丙酸酯聚合物及硫氫基選擇性反應劑，諸如順丁烯二醯亞胺、乙烯碸及硫醇。衍生聚合物包括(但不限於)具有下式之PEG聚合物：PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS；及PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R為(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。如本文所述適用之PEG聚合物可為直鏈分子，或可為分枝鏈分子，其中單一聚合物中存在多個PEG部分。適用之PEG衍生物包括(但不限於)下文說明之mPEG-MAL、mPEG2-MAL、mPEG-(MAL)²、多臂PEG、mPEG-SPA、mPEG2-NHS及mPEG2-(MAL)²：

反應基團(例如MAL、NHS、SPA、VS或硫醇)可與PEG聚合物直接連接或可與PEG經由連接子分子連接。

如本文所述適用之聚合物之尺寸可在以下範圍內：在約500 Da與60 kD之間，例如在約1000 Da與60 kD、10 kD與60 kD、20 kD與60 kD、30 kD與60 kD、40 kD與60 kD之間，及至多50 kD與60 kD之間。本文所用聚合物(尤其PEG)可為直鏈聚合物或可具有分枝鏈構形。視分子量與構形之組合而定，如本文所述適用之聚合物分子在與域抗體連接時將產生平均流體動力學尺寸在約24 kD與500 kD之間的分子。本文所用之聚合物分子的流體動力學尺寸係指分子(例如蛋白質分子)基於該分子在水溶液中擴散的表觀尺寸。蛋白質在溶液中之擴散或運動可經處理以獲得蛋白質之表觀尺寸，其中該尺寸由蛋白質粒子之斯托克斯半徑或流體動力學半徑提供。蛋白質之「流體動力學尺寸」取決於質量與形狀(構形)二者，因此具有相同分子質量之兩個蛋白質可能基於蛋白質之整體構形而具有不同的流體動力學尺寸。PEG連接之域抗體(例如本文所述之域抗體)之流體動力學尺寸可在以下範圍內：約24 kD至500 kD；30 kD至500 kD；40 kD至500 kD；50 kD至500 kD；100 kD至500 kD；150 kD至500 kD；200 kD至500 kD；250 kD至500 kD；300 kD至500 kD；350 kD至500 kD；400 kD至500 kD；及450 kD至500 kD。在一例示性實施例中，本文所述之聚乙二醇化域抗體之流體動力學尺寸為約30 kD至40 kD、70 kD至80 kD或200 kD至300 kD。因此，與域抗體連接之聚合物分子之尺寸可視所需應用而變化。舉例而言，若聚乙二醇化域抗體意欲離開循環且進入周邊組織，則需要保持所連接聚合物之尺寸較小以有利於自血流外溢。或者，若需要使聚乙二醇化域抗體長時間保留於循環中，則可使用較高分子量聚合物(例如30 kD至60 kD之聚合物)。

可使用此項技術中熟知之方法使如本文所述適用之聚合物(PEG)分子與域抗體連接。PEG或其他聚合物部分與域抗體連接之第一步驟為由含親電子劑之官能基取代PEG聚合物之羥基端基。特定言之，PEG聚合物與域抗體中存在之半胱胺酸或離胺酸殘基連接。半胱胺酸及離胺酸殘基可天然存在或可經工程改造至域抗體分子中。舉例而言，可在域抗體之C末端以重組方法工程改造半胱胺酸殘基，或域抗體中特定溶劑可達位置之殘基可經半胱胺酸或離胺酸取代。在一實施例中，PEG部分與存在於域抗體C末端之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基連接。

在另一實施例中，PEG部分或其他聚合物與半胱胺酸或離胺酸殘基連接，該半胱胺酸或離胺酸殘基天然存在於本文所述域抗體之N末端或工程改造至本文所述域抗體之N末端中。在另一實施例中，PEG部分或其他聚合物與本文所述域抗體在遠離該域抗體之C末端及/或N末端(例如向內)至少2個殘基的半胱胺酸或離胺酸殘基(天然存在或工程改造)處連接。

在一實施例中，PEG聚合物與存在於域抗體之構架區(FW)及一或多個異源CDR中之一或多個半胱胺酸或離胺酸殘基連接。CDR及構架區(例如CDR1-CDR3及FW1-FW4)為域抗體中如Kabat資料庫Sequences of Proteins of Immunological Interest(Kabat等人(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所定義之彼等區域。在一實施例中，PEG聚合物與V_H構架區段DP47或V_κ構架區段DPK9中之半胱胺酸或離胺酸殘基連接。可與本文所揭示之PEG連接的DP47之半胱胺酸及/或離胺酸殘基包括SEQ ID NO：641中位置22或96處之半胱胺酸及位置43、65、76或98處之離胺酸。可與本文所揭示之PEG連接的DPK9之半胱胺酸及/或離胺酸殘基包括SEQ ID NO：643中位置23或88處之半胱胺酸殘基及位置39、42、45、103或107處之離胺酸殘基(SEQ ID NO：643之DPK9序列之長度為95個胺基酸；然而，在此項技術中應瞭解，在與DPK9序列融合時，殘基103及107由J基因區段所編碼之序列提供)。另外，V_H正則構架區DP38或DP45中之特定半胱胺酸或離胺酸殘基可與PEG連接。

另外，域抗體中不為天然存在半胱胺酸或離胺酸殘基之特定溶劑可達位點可突變為半胱胺酸或離胺酸以便連接PEG聚合物。可使用此項技術中已知之方法(諸如分析域抗體之晶體結構)確定任何指定域抗體中之溶劑可達殘基。舉例而言，使用V_H dAb HEL4(SEQ ID NO：399；結合雞卵溶菌酶(hen egg lysozyme)之域抗體)已解出之晶體結構，殘基Gln-13、Pro-14、Gly-15、Pro-41、Gly-42、Lys-43、Asp-62、Lys-65、Arg-87、Ala-88、Glu-89、Gln-112、Leu-115、Thr-117、Ser-119及Ser-120已鑑別為溶劑可達，且如本文所揭示將為具吸引力的突變為半胱胺酸或離胺酸殘基以供連接PEG聚合物用之候選物。另外，使用V_κ虛擬(dummy)域抗體(SEQ ID NO：400)已解出之晶體結構，殘基Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、Ser-60、Pro-80、Glu-81、Gln-100、Lys-107及Arg-108已鑑別為溶劑可達，且如本文所揭示將為具吸引力的突變為半胱胺酸或離胺酸殘基以供連接PEG聚合物用之候選物。在本文所揭示之一實施例中，PEG聚合物與多個溶劑可達半胱胺酸或離胺酸殘基或與已突變為半胱胺酸或離胺酸殘基之溶劑可達殘基連接。或者，在特定域抗體僅具有一個溶劑可達半胱胺酸或離胺酸(或變為半胱胺酸或離胺酸之殘基)時，或在特定溶劑可達殘基係選自數個用於聚乙二醇化之該等殘基時，僅一個溶劑可達殘基與PEG連接。

HEL4(SEQ ID NO：399)之初級胺基酸序列：

V_κ虛擬(SEQ ID NO：400)之初級胺基酸序列：

本文所揭示之數個PEG連接方案由Nektar公司(SanCarlos,CA)提供。舉例而言，若需要使PEG或其他聚合物與離胺酸殘基連接，則可使用已用N-羥基丁二醯亞胺衍生之PEG聚合物之活性酯(諸如丁二醯亞胺基丙酸酯)。若意欲與半胱胺酸殘基連接，則可使用已用硫氫基選擇性試劑(諸如順丁烯二醯亞胺、乙烯碸或硫醇)衍生之PEG聚合物。可如本文所揭示用於產生聚乙二醇化抗體的PEG衍生物特定實施例的其他實例可見於Nektar目錄(可在全球資訊網於nektar.com獲得)中。另外，PEG之數種衍生形式可如本文所揭示用於促進PEG聚合物與域抗體連接。本文所揭示之PEG衍生物包括(但不限於)PEG-丁二醯亞胺基丁二酸酯、胺基甲酸酯連接之PEG、PEG苯基碳酸酯、PEG丁二醯亞胺基碳酸酯、PEG-羧甲基疊氮化物、二甲基順丁烯二酸酐PEG、PEG二硫代碳酸酯衍生物、PEG-三氟乙磺酸酯(2,2,2-三氟乙烷磺酸酯)、mPEG醯亞胺酯及如Zalipsky 及Lee,(1992)(「Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides」,Poly(Ethylene Glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications,J.Milton Harris編，Plenum Press,NY)所述之其他衍生物。

在本文所揭示之一實施例中，域抗體組合物包含域抗體及PEG聚合物，其中PEG聚合物與域抗體之比率為至少0.25：1之莫耳比。在另一實施例中，PEG聚合物與域抗體之莫耳比為0.33：1或0.33：1以上。在另一實施例中，PEG聚合物與域抗體之莫耳比為0.5：1或0.5：1以上。

6.域抗體之修飾 6.1.正則序列之多樣化

在已選擇數個已知主鏈構形或在一態樣中單一已知主鏈構形的情況下，可藉由改變分子之結合位點以產生具有結構及/或功能多樣性之譜系來建構本文所揭示之配位體或用於本文之文庫。此意謂產生變異體以使其在結構及/或功能方面具有足夠多樣性而使其能夠提供一系列活性。

所需多樣性通常藉由在一或多個位置處改變所選分子來產生。欲作改變之位置可隨機選擇或在一態樣中經選定。隨後可藉由隨機化達成變異以產生極大量之變異體，在該隨機化期間常駐胺基酸經天然或合成之任何胺基酸或其類似物置換，或藉由用已定義胺基酸子集中之一或多者置換常駐胺基酸達成變異以產生較有限量之變異體。

已報導引入該多樣性之多種方法。可使用易錯PCR (Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.,226：889)、化學突變誘發(Deng等人(1994)J.Biol.Chem.,269：9533)或細菌突變株(Low等人(1996)J.Mol.Biol.,260：359)於編碼分子之基因中引入隨機突變。使所選位置突變之方法亦為此項技術中熟知且包括在使用或不使用PCR的情況下使用錯配寡核苷酸或簡併寡核苷酸。舉例而言，已藉由使突變靶向抗原結合環來產生數個合成抗體文庫。人類破傷風類毒素結合Fab之H3區已經隨機化以產生一系列新結合特異性(Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4457)。隨機或半隨機H3及L3區已拼接於生殖系V基因區段上以產生具有未突變構架區之大文庫(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.,227：381；Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4457；Nissim等人(1994)EMBO J.,13：692；Griffiths等人(1994)EMBO J.,13：3245；De Kruif等人(1995)pppppppppp.,248：97)。該多樣化已經擴展以包括一些或所有其他抗原結合環(Crameri等人(1996)Nature Med.,2：100；Riechmann等人(1995)Bio/Technology,13：475；Morphosys,WO 97/08320(前述))。

因為環隨機化具有僅對於H3而言產生約超過10¹⁵個結構且對於其他五個環而言產生同樣大量變異體之可能性，故使用現有轉型技術或甚至藉由使用無細胞系統產生表示所有可能組合之文庫並不可行。舉例而言，在迄今為止所建構之一最大文庫中，產生6×10¹⁰個不同抗體，其僅為此設計之文庫之可能多樣性的一部分(Griffiths等人(1994)(前述))。

在一實施例中，僅將彼等直接參與產生或改變分子所需功能之殘基多樣化。對於諸多分子而言，功能將為結合標靶，且因此多樣性應集中於標靶結合位點，而避免改變對分子之整體堆積或保持所選主鏈構形至關重要之殘基。

6.1.1.正則序列在應用於抗體域時的多樣化

在本文所揭示之配位體的情況下，標靶之結合位點最常為抗原結合位點。因此，在一態樣中，抗體配位體之文庫或用於組裝抗體配位體之文庫中僅抗原結合位點中之彼等殘基改變。此等殘基在人類抗體譜系中極其多樣，且已知在高解析度抗體/抗原複合物中作為接觸點。舉例而言，在L2中，已知位置50及53在天然存在之抗體中多樣，且觀察到該等位置與抗原接觸。相比之下，與如本文所揭示使用之文庫中兩個多樣化殘基相比，習知方法使由Kabat等人(Kabat等人，1991,Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health & Human Services,Washington,D.C.)所定義之相應互補決定區(CDR)中之所有殘基(大約七個殘基)多樣化。此代表了在產生一系列抗原結合特異性所必需之功能多樣性方面的顯著改良。

在自然界中，抗體多樣性為以下兩個過程之結果：生殖系V、D及J基因區段之體細胞重組以產生原生初級譜系(所謂生殖系及連接多樣性)，及所得重排V基因之體細胞超突變。人類抗體序列分析已展示初級譜系之多樣性集中於抗原結合位點之中心，而體細胞超突變使多樣性散布至在初級譜系中高度保守之抗原結合位點周邊區域(參見Tomlinson等人(1996)J.Mol.Biol.,256：813)。此互補可能逐漸成為搜尋序列空間之有效策略，且儘管表面上為抗體所特有，但其可易於應用於其他多肽譜系。經改變之殘基為彼等形成標靶之結合位點之殘基的子集。若需要，在選擇期間之不同階段，使標靶結合位點中之殘基之不同(包括重疊)子集多樣化。

在抗體譜系的情況下，若使抗原結合位點中之一些而非所有殘基多樣化，則產生初始「原生」譜系。如本文在此情形下所用之術語「原生」係指無預定標靶之抗體分子。此等分子類似於彼等由未進行免疫多樣化，免疫系統尚未受到多種抗原刺激攻毒之個體(胎兒及新生兒個體即為此情況)的免疫球蛋白基因編碼的分子。隨後針對一系列抗原或抗原決定基對此譜系進行選擇。若需要，隨後可在初始譜系中經多樣化之區域外部引入另外多樣性。可針對變化之功能、特異性或親和力對此成熟譜系進行選擇。

本文揭示用於建構配位體或原生配位體文庫的兩個不同原生結合域譜系，其中改變抗原結合位點中之一些或所有殘基。「初級」文庫模擬天然初級譜系，其中多樣性限於抗原結合位點中心處之殘基，該等在生殖系V基因區段中為多樣的(生殖系多樣性)或在重組過程期間經多樣化(連接多樣性)。彼等經多樣化之殘基包括(但不限於)H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94及L96。在「體細胞」文庫中，多樣性限於在重組過程期間經多樣化(連接多樣性)或經高度體細胞突變之殘基。彼等經多樣化之殘基包括(但不限於)H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34及L96。已知適用於在此等文庫中多樣化之上列所有殘基在一或多個抗體-抗原複合物中作為接觸點。因為在兩個文庫中，並未改變抗原結合位點中之所有殘基，故若需要在選擇期間藉由改變其餘殘基而併入另外多樣性。對於熟習此項技術者應顯而易見，可使用任何此等殘基(或包含抗原結合位點之其他殘基)中之任何子集進行抗原結合位點之初始及/或後續多樣化。

在建構如本文所揭示使用之文庫時，所選位置之多樣化通常在核酸層面藉由改變確定多肽序列之編碼序列以便在該位置可併入多個可能胺基酸(所有20個胺基酸或其子集)來達成。使用IUPAC命名法，最通用的密碼子為NNK，其編碼所有胺基酸以及TAG終止密碼子。在一態樣中，使用NNK密碼子以引入所需多樣性。達成相同目的之其他密碼子亦適用，該等其他密碼子包括引起其他終止密碼子TGA及TAA產生的NNN密碼子。

人類抗體之抗原結合位點中側鏈多樣性之特徵為傾向於特定胺基酸殘基之顯著偏向。若總結V_H、V_κ及V_λ區中十個最多樣位置之胺基酸組成，則側鏈多樣性中超過76%來自僅七個不同殘基，其為絲胺酸(24%)、酪胺酸(14%)、天冬醯胺(11%)、甘胺酸(9%)、丙胺酸(7%)、天冬胺酸(6%)及蘇胺酸(6%)。此對於可提供主鏈可撓性之親水性殘基及小殘基之偏向可能反映易於結合多種抗原或抗原決定基之表面的演變，且可有助於解釋初級譜系中所需之抗體混雜性。

因為較佳模擬此胺基酸分布，故在一態樣中，欲作改變之位置處的胺基酸分布模擬抗體抗原結合位點中所見之胺基酸分布。允許針對一系列標靶抗原選擇特定多肽(不僅域抗體)的胺基酸取代的該偏向易於應用於任何多肽譜系。存在多種方法使胺基酸分布偏向於欲作改變之位置(包括使用三核苷酸突變誘發，參見WO 97/08320)，其中一種因易於合成而有利之方法為使用習知簡併密碼子。藉由對比簡併密碼子之所有組合(在各位置處單一、雙重、三重及四重簡併性之比率相等)所編碼的胺基酸概況與所用天然胺基酸，可計算最具代表性之密碼子。密碼子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C及(AGT)(AGC)(CT)為彼等最接近所需胺基酸概況的密碼子：其編碼22%絲胺酸及11%酪胺酸、天冬醯胺、甘胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸及半胱胺酸，且在一態樣中，使用此等密碼子建構文庫。

6.2.雙特異性配位體

本文亦提供包含各具有各別特異性之域抗體的雙特異性配位體；亦即在一態樣中，雙特異性配位體所結合之第一抗原決定基及第二抗原決定基不同或為相同抗原決定基之兩個複本，該等抗原決定基由各別可變域結合。在一實施例中，「雙特異性配位體」係指包含如本文所定義之第一域抗體及第二域抗體的配位體，其中可變區能夠與通常不為單特異性免疫球蛋白結合的兩個不同抗原或同一抗原之兩個抗原決定基結合。在另一實施例中，「雙特異性配位體」係指包含如本文所定義之域抗體及免疫球蛋白可變域的配位體，其中可變區能夠與通常不為單特異性免疫球蛋白結合的兩個不同抗原或同一抗原之兩個抗原決定基結合。舉例而言，兩個抗原決定基可在同一半抗原上，但不為同一抗原決定基或不會足夠相鄰以至於為單特異性配位體結合。本文所揭示之雙特異性配位體由具有不同特異性之可變域組成，且不含有具有相同特異性之互相互補之可變域對。雙特異性配位體可為可能天然存在或合成之多肽、蛋白質或核酸或可為該等多肽、蛋白質或核酸之一部分。

雙特異性或多特異性配位體可適宜地包含能夠結合標靶分子之第一域及能夠結合延長配位體半衰期之分子或基團的第二域。舉例而言，該分子或基團可為大物質(bulky agent)，諸如HSA或細胞基質蛋白。如本文所用之短語「延長配位體半衰期之分子或基團」係指在為本文所述之雙特異性配位體結合時，在向動物投與該雙特異性配位體時，相對於未結合該分子或基團之配位體延長該雙特異性配位體之活體內半衰期的分子或化學基團。本文在下文中描述延長配位體半衰期之分子或基團的實例。在一實施例中，閉合構形多特異性配位體可能僅能夠在置換延長半衰期之分子或基團後結合標靶分子。因此，舉例而言，由大分子(諸如HSA)使閉合構形多特異性配位體保持在個體血流之循環中。在遇到標靶分子時，閉合構形多特異性配位體之結合域之間的競爭引起HSA置換及標靶結合。上文較詳細描述延長半衰期之分子。

在本文所揭示之第二構型之一實施例中，可變域係衍生自針對第一及/或第二抗原或抗原決定基之抗體。在一實施例中，可變域係衍生自單一可變抗體域之譜系。在一實例中，該譜系為動物中未產生之譜系或合成譜系。在另一實例中，單一可變域(至少部分)並非藉由動物免疫分離。因此，單域可自原生文庫分離。

在另一態樣中，本文揭示一種多特異性配位體，其包含具有第一抗原決定基結合特異性之第一抗原決定基結合域及具有第二抗原決定基結合特異性之非互補性第二抗原決定基結合域。該第一及第二結合特異性可相同或不同。

在另一態樣中，本文揭示一種閉合構形多特異性配位體，其包含具有第一抗原決定基結合特異性之第一抗原決定基結合域及具有第二抗原決定基結合特異性之非互補性第二抗原決定基結合域，其中該第一及第二結合特異性能夠競爭結合抗原決定基以使該閉合構形多特異性配位體不能同時結合兩個抗原決定基。

本文所揭示任何態樣的配位體以及適用於建構該等配位體之域抗體單體可適宜地如表面電漿共振所測定以如下K_d值及/或如下K_off速率常數自其同源標靶解離：其中K_d值為約300 nM至1 pM或5 pM(亦即3×10^-7 M至5×10^-12 M)，在一態樣中為約50 nM至20 pM，或5 nM至200 pM或1 nM至100 pM，1×10^-7 M或1×10^-7 M以下，1×10^-8 M或1×10^-8 M以下，1×10^-9 M或1×10^-9 M以下，1×10^-10 M或1×10^-10 M以下，1×10^-11 M或1×10^-11 M以下；且K_off速率常數為約5×10^-1 至1×10^-7 S^-1，在一態樣中為約1×10^-2至1×10^-6 S^-1，或5×10^-3至1×10^-5 S^-1，或5×10^-1 S^-1或5×10^-1 S^-1以下，或1×10^-2 S^-1或1×10^-2 S^-1以下，或1×10^-3 S^-1或1×10^-3 S^-1以下，或1×10^-4 S^-1或1×10^-4 S^-1以下，或1×10^-5 S^-1或1×10^-5 S^-1以下，或1×10^-6 S^-1或1×10^-6 S^-1以下。K_d速率常數係定義為K_off/K_on。關於雙特異性配位體之其他詳情可見於WO 03/002609、WO 04/003019及WO 04/058821。

此外，提供一種域抗體單體(或包含該域抗體之雙特異性配位體)，其以1 nM至500 μM(亦即1×10^-9 M至5×10^-4 M)，在一態樣中100 nM至10 μM之K_d值與血清白蛋白(SA)結合。在一態樣中，對於包含第一抗SA域抗體及針對另一標靶之第二域抗體的雙特異性配位體而言，第二dAb對其標靶之親和力(例如藉由表面電漿共振例如使用BiaCore所量測的K_d值及/或K_off值)為第一域抗體對SA之親和力的1至100,000倍(在一態樣中為100至100,000倍，在另一態樣中為1000至100000倍或10000至100000倍)。舉例而言，第一域抗體以約10 μM之親和力結合SA，而第二域抗體以約100 pM之親和力結合其標靶。在一例示性實施例中，血清白蛋白為人類血清白蛋白(HSA)。

在一實施例中，第一域抗體(或域抗體單體)以約50 nM，在一態樣中約70 nM，且在另一態樣中約100 nM、150 nM或200 nM之K_d值結合SA(例如HSA)。

亦提供根據以上態樣之上述域抗體單體之二聚物、三聚物及聚合物。

本文所揭示之包括域抗體單體、二聚物及三聚物之配位體可與包含C_H2及C_H3域中之一者或兩者及視情況存在之鉸鏈區的抗體Fc區連接。舉例而言，可使用以單一核苷酸序列形式與Fc區連接之編碼配位體的載體製備該等多肽。或者，本文所揭示之配位體可能不含Fc域。

在另一態樣中提供一或多個至少編碼如本文所定義之雙特異性或多特異性配位體的核酸分子。在一實施例中，配位體為閉合構形配位體。在另一實施例中，其為開放構形配位體。可在單一核酸分子上編碼多特異性配位體；或者，可由獨立核酸分子編碼各抗原決定基結合域。若配位體由單一核酸分子編碼，則域可表現為融合多肽，或可經分別表現且隨後例如使用化學連接劑連接在一起。將藉由適當方法使由獨立核酸表現之配位體連接在一起。

核酸可另外編碼用於在表現之後自宿主細胞輸出多肽之信號序列，且可在表現之後與絲狀噬菌體粒子之表面組份(或選擇呈現系統之其他組份)融合。可用於細菌表現及/或噬菌體或噬菌粒呈現之前導序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla、ompT及pelA。

在如本文所揭示第二構型之另一態樣中，包括一種包含核酸之載體。

在另一態樣中，提供一種經載體轉染之宿主細胞。

自該載體表現可經組態以例如在噬菌體粒子表面上產生抗原決定基結合域以供選擇。此允許選擇所呈現之域且由此使用本文所揭示之方法選擇「多特異性配位體」。

6.2.1.「雙特異性配位體」之結構

如上所述，在本文中抗體係定義為包含至少一重鏈可變域及一輕鏈可變域、至少兩個重鏈可變域或至少兩個輕鏈可變域的抗體或片段(Fab、Fv、二硫鍵連接之Fv、scFv、雙功能抗體)。其可能至少部分衍生自天然產生抗體之任何物種，或由重組DNA技術產生；自血清、B細胞、融合瘤、轉染瘤、酵母抑或細菌分離。

在一實施例中，雙特異性配位體包含抗體之至少一單一重鏈可變域及抗體之一單一輕鏈可變域，或兩個單一重鏈或輕鏈可變域。舉例而言，配位體可包含V_H/V_L對，V_H域對或V_L域對。

該配位體之第一及第二可變域可位於同一多肽鏈上。或者其可位於獨立多肽鏈上。在其處於同一多肽鏈的情況下，其可由連接子連接，如上所述該連接子可為肽序列。

第一及第二可變域可經共價或非共價結合。在其經共價結合的情況下，共價鍵可為二硫鍵。

在可變域係選自例如使用如本文中所述之噬菌體呈現技術選擇之V基因譜系的情況下，此等可變域包含通用構架區，使得其可由如本文所定義之特異性通用配位體識別。通用構架、通用配位體及其類似物之使用描述於WO 99/20749中。

若使用V基因譜系，則在一態樣中，多肽序列變化位於可變域之結構環內。任一可變域之多肽序列可藉由DNA改組或藉由突變來改變以增強各可變域與其互補對之相互作用。DNA改組為此項技術中已知且例如由Stemmer(1994)Nature 370：389-391及美國專利第6,297,053號教示，兩者均以引用的方式併入本文中。其他突變誘發方法為熟習此項技術者所熟知。

在一實施例中，「雙特異性配位體」為單鏈Fv片段。在一替代性實施例中，「雙特異性配位體」由Fab形式組成。

本文所揭示之另一態樣提供至少編碼如本文所定義之「雙特異性配位體」的核酸。

熟習此項技術者應瞭解，視態樣而定，兩個抗原或抗原決定基均可同時與同一抗體分子結合。或者，其可競爭結合同一抗體分子。舉例而言，若同時結合兩個抗原決定基，則雙特異性配位體之兩個可變域能夠獨立地結合其標靶抗原決定基。若域進行競爭，則一可變域能夠結合其標靶，但不在另一可變域結合其同源標靶之同時；或第一可變域能夠結合其標靶，但不在第二可變域結合其同源標靶之同時。

可變區可衍生自針對標靶抗原或抗原決定基之抗體。或者，其可衍生自單一抗體域(諸如在絲狀噬菌體表面上表現之彼等域)之譜系。可如下所述執行選擇。

一般而言，本文所揭示之效能所必需之核酸分子及載體構築體可如標準實驗手冊(諸如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,USA)所述建構及操作。

如本文所揭示適用之核酸的操作通常在重組載體中進行。

因此，本文所揭示之另一態樣提供一種載體，其包含至少編碼如本文所定義之「雙特異性配位體」的核酸。

如本文所用之載體係指用於將異源DNA引入細胞中以使該異源DNA表現及/或複製的離散元件。選擇或建構及隨後使用該等載體之方法為一般熟習此項技術者所熟知。諸多載體可公開獲得，該等載體包括細菌質體、噬菌體、人工染色體及游離型載體。該等載體可用於簡單選殖及突變誘發；或者使用基因表現載體。本文所揭示之適用載體可經選擇以適應具有所需尺寸(長度通常為0.25千鹼基(kb)至40 kb或40 kb以上)之多肽編碼序列。在活體外選殖操作之後，將合適宿主細胞用載體轉型。各載體含有各種功能性組份，該等組份通常包括選殖(或「多酶切點接頭」)位點、複製起點及至少一個選擇性標記基因。若指定載體為表現載體，則其另外具有一或多個以下各物：各位於選殖位點附近之增強子元件、啟動子、轉錄終止及信號序列，以使其與編碼本文所揭示之配位體的基因可操作地連接。

選殖載體與表現載體通常均含有使載體能夠在一或多個所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列為使載體能夠不依賴於宿主染色體DNA複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。熟知多種細菌、酵母及病毒之該等序列。來自質體pBR322之複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，2 μm質體起點適合於酵母，且各種病毒起點(例如SV40、腺病毒)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體並不需要複製起點，除非此等表現載體用於能夠複製高水準DNA之哺乳動物細胞(諸如COS細胞)中。

選殖載體或表現載體可適宜地含有選擇基因(亦稱作選擇性標記)。此基因編碼在選擇性培養基中生長之經轉型宿主細胞存活或生長所需之蛋白質。因此未用含有選擇基因之載體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典型選擇基因編碼賦予對抗生素及其他毒素(例如胺苄西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)之抗性的蛋白質，補充營養缺陷或提供生長培養基中不能獲得之關鍵營養素。

6.2.2.組合單一可變域

如本文所揭示適用之域一經使用上文所例示之方法選擇即可藉由此項技術中已知之多種方法(包括共價及非共價方法)組合。

方法包括如所述使用多肽連接子，例如與scFv分子結合(Bird等人，(1988)Science 242：423-426)。Bird等人，Science 242：423-426；Hudson等人，(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；Hudson等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85：5879-5883中提供關於合適連接子之論述。在一態樣中，連接子具有可撓性以使兩個單一域可相互作用。一連接子實例為(Gly₄ Ser)_n連接子，其中n=1至8，例如2、3、4、5或7。亦可使用雙功能抗體中所用之連接子，其具有較小可撓性(Holliger等人，(1993)PNAS(USA)90：6444-6448)。

在一實施例中，所用連接子不為免疫球蛋白鉸鏈區。

可變域可使用除連接子以外的方法組合。舉例而言，可使用經由天然存在或工程改造之半胱胺酸殘基提供之二硫橋來穩定V_H-V_H、V_L-V_L或V_H-V_L二聚物(Reiter等人，(1994)Protein Eng.7：697-704)，或藉由重塑可變域之間的界面以改良「配合」且因此改良相互作用之穩定性(Ridgeway等人，(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu等人，(1997)Protein Science 6：781-788)。

可視需要使用接合或穩定免疫球蛋白可變域及尤其抗體V_H域之其他技術。

如本文所揭示，雙特異性配位體可在溶液狀態下呈「閉合」構形。「閉合」構型為兩個域(例如V_H及V_L)以結合方式存在之構型，諸如形成抗體結合位點之經結合V_H-V_L對之構型。舉例而言，scFv可視用於連接V_H及V_L域之連接子之配置而呈閉合構形。若此連接子具有允許域結合之足夠可撓性，或將域剛性地固持在結合位置，則該等域可能採用閉合構形。

類似地，V_H域對及V_L域對可以閉合構形存在。一般而言，此將與配位體分子中諸如由剛性連接子達成之域之密切結合有關。呈閉合構形之配位體將不能結合延長配位體半衰期之分子與第二標靶分子二者。因此，配位體通常將僅在與延長配位體半衰期之分子解離後結合第二標靶分子。

此外，在無連接子的情況下建構V_H/V_H、V_L/V_L或V_H/V_L二聚物提供域之間的競爭。

此外，本文所揭示之配位體可呈開放構形。呈該開放構形時，配位體應能夠同時結合延長配位體半衰期之分子與第二標靶分子二者。通常，呈開放構型之可變域(在V_H-V_L對的情況下)保持分隔足夠遠以使該等域不會相互作用且形成抗體結合位點且不會競爭結合其各別抗原決定基。在V_H/V_H或V_L/V_L二聚物的情況下，並不由剛性連接子迫使該等域結合在一起。該等域對本身將不會競爭結合抗原或形成抗體結合位點。

Fab片段及完整抗體主要以閉合構形存在，但應瞭解開放及閉合雙特異性配位體可能在不同情況下以多種平衡狀態存在。配位體與標靶之結合可能使該平衡狀態之平衡偏向開放構型。因此，本文所揭示之特定配位體可在溶液狀態下以兩種構形存在，其中一種(開放形式)可獨立地結合兩個抗原或抗原決定基，而另一構形(閉合形式)僅能結合一個抗原或抗原決定基；因此在此構形中抗原或抗原決定基競爭結合配位體。

儘管在溶液狀態下雙特異性配位體之開放形式可因此與閉合形式以平衡狀態存在，但預計該平衡狀態將傾向於閉合形式；此外，開放形式可藉由標靶結合鉗合至閉合構形中。因此，在一例示性實施例中，本文所揭示之特定雙特異性配位體以兩種(開放及閉合)構形之間的平衡狀態存在。

本文所揭示之雙特異性配位體可經修飾以傾向於開放或閉合構形。舉例而言，以二硫鍵穩定V_H-V_L之相互作用使閉合構形穩定。此外，用於接合該等域(包括V_H域及V_L域對)之連接子可經建構使便傾向於開放形式；舉例而言，連接子可諸如藉由在合適位置併入大胺基酸殘基或設計將使域保持實體上隔開的合適剛性結構而在空間上阻礙該等域之結合。

6.2.3.雙特異性配位體之表徵。

雙特異性配位體與其特異性抗原或抗原決定基之結合可藉由熟習此項技術者所熟知且包括ELISA之方法測試。在一實施例中，使用單株噬菌體ELISA測試結合。

噬菌體ELISA可根據任何合適程序執行：下文描述例示性方案。

可藉由ELISA針對與所選抗原或抗原決定基之結合來篩選在各輪選擇中產生之噬菌體群以鑑別「多株」噬菌體抗體。隨後可藉由ELISA篩選此等群體中來自單一感染菌落之噬菌體以鑑別「單株」噬菌體抗體。亦需要針對與抗原或抗原決定基之結合篩選可溶性抗體片段，且此亦可藉由ELISA，使用例如針對C或N末端標籤之試劑進行(參見例如Winter等人(1994)Ann.Rev.Immunology 12,433-55及其中所列舉之參考文獻)。

亦可藉由對PCR產物進行凝膠電泳(Marks等人(1991)(前述)；Nissim等人(1994)(前述))、探測(probing)(Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227,776)或藉由對載體DNA測序來評定所選噬菌體單株抗體之多樣性。

7.增加多肽穩定性 7.1.延長半衰期

在活體內，本文所述之聚乙二醇化域抗體可賦予優於未聚乙二醇化域抗體之顯著優點，聚乙二醇化抗體分子將具有大大延長之活體內半衰期。應瞭解在本發明之情形下任何組合物之特定半衰期可藉由向患者投與該組合物之途徑延長或縮短。

然而，在不受任一特定理論限制的情況下，咸信可藉由因連接PEG聚合物而使域抗體之流體動力學尺寸增加來賦予本文所述分子之延長半衰期。更特定言之，咸信兩個參數在決定聚乙二醇化域抗體之血清半衰期中發揮重要作用。第一準則為PEG連接之性質及尺寸，亦即所用聚合物簡單地為直鏈或分枝鏈，其中分枝鏈產生較長半衰期。第二準則為最終形式中PEG部分在域抗體上之位置及分子所具有之「游離」未修飾PEG臂之數量。例如藉由尺寸排阻層析所估算之聚乙二醇化域抗體之所得流體動力學尺寸反映該分子之血清半衰期。因此，聚乙二醇化分子之流體動力學尺寸愈大，血清半衰期愈長。

延長之半衰期適用於免疫球蛋白、尤其抗體及最尤其小尺寸抗體片段以及域抗體之活體內應用。該等片段(Fv、 Fab、scFv)及域抗體自體內快速清除；因此，雖然其能夠快速到達身體之多數部分，且快速產生且易於運用(handle)，但其活體內應用受到其活體內僅為短暫之持久性的限制。

在一態樣中，本文所述之域抗體在活體內藉由與增加域抗體流體動力學尺寸之部分(諸如PEG)融合而穩定。藥代動力學分析及測定半衰期之方法為熟習此項技術者所熟知。詳情可見於Kenneth等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinetc Analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考「Pharmacokinetics」,M.Gibaldi & D.Perron,Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)，其描述藥代動力學參數，諸如t-α及t-β半衰期及曲線下面積(AUC)。

通常，本文所述之聚乙二醇化域抗體之半衰期相對於未聚乙二醇化dAb延長約10%、20%、30%、40%、50%或50%以上(其中聚乙二醇化域抗體與未聚乙二醇化域抗體之域抗體為相同域抗體)。半衰期可能延長之範圍為2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍、20倍、30倍、40倍及至多50倍或50倍以上。其他或另外，半衰期可能延長之範圍為至多30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或150倍。

可自配位體之血清濃度對時間之曲線確定半衰期(t½-α及t½-β)及AUC。舉例而言，可使用WinNonlin分析套件(可購自Pharsight Corp.,Mountain View,CA 94040,USA)模擬該曲線。在第一相(α相)中，配位體主要在患者體內分布，伴有一定程度之消除。第二相(β相)為終末相，此時配位體已分布且血清濃度隨配位體自患者清除而降低。「tα半衰期」為第一相之半衰期，「tβ半衰期」為第二相之半衰期。除非另外說明，否則如本文所用之「半衰期」係指藉由非室體模型化(non-compartment modeling)(例如與兩相模型化相比)測定的本文所揭示抗體單一可變域之總半衰期。β半衰期為一定量之域抗體單體或多聚物自其所投與之哺乳動物清除所用時間的量度。因此，預期含域抗體組合物(例如域抗體-效應基團組合物)之tα半衰期宜在約0.25小時至6小時或6小時以上之範圍內。在一實施例中，該範圍之下限為約30分鐘、45分鐘、1小時、1.3小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。另外或其他，含域抗體組合物之td半衰期將在至多且包括12小時之範圍內。在一實施例中，該範圍之上限為約11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時或5小時。合適範圍之一實例為約1.3至6小時、2至5小時或3至4小時。

包含配位體之含域抗體組合物的tβ半衰期宜在約1-170小時或170小時以上之範圍內。在一實施例中，該範圍之下限為約2.5小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時。另外或其他，含域抗體組合物(例如dAb-效應基團組合物)之tβ半衰期在至多且包括21日之範圍內。在一實施例中，該範圍之上限為約12小時、24小時、2日、3日、5日、10日、15日或20日。本文所揭示之含dAb組合物之tβ半衰期宜在約2-100小時、4-80小時及10-40小時之範圍內。在另一實施例中，其將在約12-48小時之範圍內。在另一實施例中，其將在約12-26小時之範圍內。本文所揭示之包含配位體之含域抗體組合物的半衰期在1-170小時或170小時以上之範圍內。在一實施例中，該範圍之下限為約1.3小時、2.5小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時。另外或其他，含域抗體組合物(例如dAb-效應基團組合物)之半衰期在至多且包括21日之範圍內。在一實施例中，該範圍之上限為約12小時、24小時、2日、3日、5日、10日、15日或20日。

除以上準則以外或替代以上準則，包含配位體之含域抗體組合物之AUC值(曲線下面積)在1 mg．min/ml或1 mg．min/ml以上之範圍內。在一實施例中，該範圍之下限為約5、10、15、20、30、100、200或300 mg．min/ml。另外或其他，本文所揭示之配位體或組合物具有在至多約600 mg．min/ml範圍內之AUC。在一實施例中，該範圍之上限為500、400、300、200、150、100、75或50 mg．min/ml。本文所揭示之例示性配位體之AUC將在選自由以下組成之群之範圍內：約15至150 mg．min/ml、15至100 mg．min/ml、15至75 mg．min/ml及15至50 mg．min/ml。

本文所揭示之呈一種構型之配位體(包括單特異性、雙特異性及多特異性配位體)能夠與一或多個可延長配位體活體內半衰期之分子結合。通常，該等分子為活體內天然存在且抵抗降解或藉由自生物體移除不當物質之內源機制移除的多肽。

舉例而言，延長生物體半衰期之分子可選自以下各物：

￭來自胞外基質之蛋白質；例如膠原蛋白、層黏連蛋白、整合素及纖維結合蛋白。膠原蛋白為胞外基質之主要蛋白質。目前已知約15種存在於身體不同部分之膠原蛋白分子，例如存在於骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內部器官中之I型膠原蛋白(佔身體膠原蛋白之90%)，或存在於軟骨、椎間盤、脊索、眼睛玻璃狀液中之II型膠原蛋白。

￭存在於血液中之蛋白質，包括：血漿蛋白，諸如纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纖維蛋白原A、血纖維蛋白原B、血清澱粉樣蛋白A、結合球蛋白、肌動蛋白抑制蛋白(profilin)、泛素、子宮球蛋白及β-2-微球蛋白；

￭酶及抑制劑，諸如纖溶酶原、溶菌酶、半胱胺酸蛋白酶抑制劑C、α-1-抗胰蛋白酶及胰腺胰蛋白酶抑制劑。纖溶酶原為胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶纖溶酶之無活性前體。通常發現其經血流循環。當纖溶酶原經活化且轉化為纖溶酶時，其展開有效酶域，該有效酶域溶解將血細胞捲入血凝塊中之血纖維蛋白原纖維。此稱作纖維蛋白溶解。

￭免疫系統蛋白，諸如IgE、IgG及IgM。

￭轉運蛋白，諸如視網醇結合蛋白、α-1微球蛋白。

￭防禦素，諸如β-防禦素1、嗜中性白血球防禦素1、2及3。

￭存在於血腦障壁或神經組織中之蛋白質，諸如黑皮素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運蛋白。

￭轉鐵蛋白受體特異性配位體-神經藥劑(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(參見美國專利第5,977,307號)；腦毛細血管內皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受體。

￭位於腎臟之蛋白質，諸如多囊蛋白、IV型膠原蛋白、有機陰離子轉運蛋白K1、海曼氏抗原(Heymann's antigen)。

￭位於肝臟之蛋白質，例如醇脫氫酶、G250。

￭凝血因子X

￭α1抗胰蛋白酶

￭HNF 1α

￭位於肺之蛋白質，諸如分泌組份(結合IgA)。

￭位於心臟之蛋白質，例如HSP 27。其與擴張型心肌病有關。

￭位於皮膚之蛋白質，例如角蛋白。

￭骨特異性蛋白，諸如骨成型蛋白(BMP)，其為顯示成骨活性之轉型生長因子β超家族之子集。實例包括BMP-2、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(亦稱作成骨蛋白(OP-1))及BMP-8(OP-2)。

￭腫瘤特異性蛋白，包括人類滋養層抗原、赫賽汀受體(herceptin receptor)、雌激素受體、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B)(存在於肝臟及脾臟中)。

￭疾病特異性蛋白，諸如僅在活性T細胞上表現之抗原：包括LAG-3(淋巴細胞活化基因)、骨保護素配位體(OPGL)(參見Nature 402,304-309；1999)；OX40(TNF受體家族之成員，於活性T細胞上表現且為已知在人類T細胞白血病病毒I型(HTLV-I)產生細胞中特定上調之唯一協同刺激T細胞分子)(參見J.Immunol.165(1)：263-70,2000)；金屬蛋白酶(與關節炎/癌症有關)，包括果蠅CG6512、人類截癱蛋白(paraplegin)、人類FtsH、人類AFG3L2、鼠類ftsH；血管生成生長因子，包括酸性纖維母細胞生長因子(FGF-1)、鹼性纖維母細胞生長因子(FGF-2)、血管內皮生長因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、轉型生長因子-a(TGF a)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管生成素、介白素-3(IL-3)、介白素-8(IL-8)、血小板衍生之內皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子血小板衍生之生長因子(PDGF)、神經趨化因子(fractalkine)。

￭應激蛋白(熱休克蛋白)。HSP通常存在於細胞內。若其存在於細胞外，則此為細胞死亡且其內容物流出之指示。此非程式化細胞死亡(壞死)僅在由外傷、疾病或損傷引起時發生，且因此活體內胞外HSP觸發免疫系統對抗感染及疾病之反應。與胞外HSP結合之雙特異性可位於疾病位點。

￭參與Fc轉運之蛋白質，諸如：

￮布蘭貝爾受體(Brambell receptor)(亦稱為FcRB)。此Fc受體具有兩個功能，兩者均可適用於傳遞。該等功能包括將IgG自母親跨過胎盤轉運至孩子，及保護IgG以免降解，從而延長IgG之血清半衰期。認為該受體使IgG自內體再循環(參見Holliger等人，(1997)Nat.Biotechnol.15：632-6)。

￮參與Fc轉運之其他蛋白質包括Gastinel等人(1992)PNAS 89：638；及Roopenian等人(2003)J.Immunol.170：3528中所述之新生兒Fc受體(FcRn)。

￭本文所揭示之配位體可經設計以對以上標靶具特異性而無需活體內半衰期之任何延長或延長活體內半衰期。舉例而言，本文所揭示之配位體可對選自以上之組織特異性標靶具特異性，從而實現結合組織特異性治療相關標靶之雙特異性配位體或域抗體之組織特異性靶向，而不考慮半衰期之任何延長，但可能使半衰期延長。此外，若配位體或域抗體靶向腎或肝臟，則此可將配位體或域抗體再引導至活體內另一清除路徑(例如，配位體可經引導而離開肝臟清除到達腎清除)。

適用於延長半衰期之多肽包括(但不限於)附件I中所示之彼等多肽。

7.2.增強對蛋白酶降解之抗性

本文亦揭示本文所述之聚乙二醇化域抗體及域抗體多聚物對蛋白酶之作用具有增加之穩定性。在胃蛋白酶存在下，許多域抗體在pH 2下完全降解，因為蛋白質在酸性條件下展開，由此使蛋白酶更易接近該蛋白質。本文提供聚乙二醇化域抗體分子，包括域抗體多聚物，其中咸信PEG聚合物提供對多肽骨架之保護，因為PEG聚合物實體覆蓋該骨架，從而阻礙蛋白酶接近多肽骨架及使多肽骨架裂解。在一實施例中，如本文所揭示產生具有較大流體動力學尺寸(例如200至500 kD)之聚乙二醇化域抗體，因為與具有較小流體動力學尺寸之聚乙二醇化域抗體相比，較大流體動力學尺寸將確證較大程度之防止被蛋白酶降解。在一實施例中，PEG或其他聚合物連接之抗體單一可變域單體或多聚物在暴露於胃蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶中之一或多者時降解不超過10%，其中若蛋白酶為胃蛋白酶，則在pH 2.0下暴露30分鐘，且若蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶中之一或多者，則在pH 8.0下暴露30分鐘。在一實施例中，PEG或其他聚合物連接之域抗體單體或多聚物在pH 2.0下暴露於胃蛋白酶30分鐘時降解不超過10%，在一態樣中，不超過5%，且在另一態樣中完全不降解。在另一實施例中，本文所揭示之PEG或其他聚合物連接之域抗體多聚物(例如異型或同型二聚物、三聚物、四聚物、八聚物等)在pH 2.0下胃蛋白酶存在下30分鐘降解少於5%，且在一態樣中完全不降解。在一例示性實施例中，PEG或其他聚合物連接之域抗體單體或多聚物在pH 8.0下暴露於胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分鐘時降解不超過10%，在一態樣中，不超過5%，且在另一態樣中完全不降解。在另一例示性實施例中，本文所揭示之PEG或其他聚合物連接之域抗體多聚物(例如異型或同型二聚物、三聚物、四聚物、八聚物等)在pH 8.0下胰蛋白酶、彈性酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶存在下30分鐘降解少於5%，且在一態樣中完全不降解。

蛋白酶：PEG-域抗體之相對比率可如本文所揭示改變以達成上述所需降解程度。舉例而言，蛋白酶與PEG-域抗體之比率可為約1：30至約10：40，至約20：50，至約30：50、約40：50、約50：50、約50：40、約50：30、約50：20、約50：10、約50：1、約40：1及約30：1。

因此，本文揭示一種減少域抗體降解之方法，其包含根據本文所述之任一實施例，使域抗體單體或多聚物與PEG聚合物連接。如本文所揭示，域抗體在pH 2.0下胃蛋白酶存在下30分鐘降解不超過10%。詳言之，PEG連接之dAb多聚物在pH 2.0下胃蛋白酶存在下30分鐘降解不超過5%，且在一態樣中完全不降解。在一替代性實施例中，域抗體在pH 8.0下暴露於胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分鐘時降解不超過10%，在一態樣中，不超過5%，且在另一態樣中完全不降解。

本文所述之PEG連接之域抗體單體及多聚物之降解可使用熟習此項技術者所熟知之方法量測。舉例而言，在將 PEG連接之域抗體與胃蛋白酶在pH 2.0下培育30分鐘，或與胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶在pH 8.0下培育30分鐘之後，可藉由凝膠過濾來分析域抗體樣品，其中域抗體單體或多聚物之降解由與未降解域抗體(亦即未用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶或羧肽酶處理之對照域抗體)相比較小分子量之凝膠帶證實。凝膠上域抗體帶之分子量可藉由對比帶遷移與分子量梯遷移來測定(參見圖5)。量測蛋白質降解之其他方法為此項技術中已知且可經改適以評估本文所揭示之PEG連接之域抗體單體及多聚物。

8.域抗體之用途

本文所述之域抗體適用於拮抗CD28之活性。因此，本文所述之域抗體可用於治療患有完全或部分由CD28活性介導之病狀、疾病或病症的患者。

本文所述之域抗體適用於治療或預防涉及CD28介導路徑之不當活化之疾病或病症。本文所述之域抗體亦適用於治療、預防或減輕涉及CD28介導路徑之不當活化之疾病或病症的症狀。

在一態樣中，自體免疫疾病通常涉及CD28路徑之不當調節或活性。向患有該疾病(包括自體免疫疾病)之個體投與本文所述之域抗體可減輕該疾病之一或多個症狀。本文所述之域抗體可在治療上適用之疾病之非限制性實例包括(但不限於)愛迪森氏症、過敏症、強直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性腮腺炎、原發性膽汁性肝硬化、良性淋巴細胞血管炎、結腸炎、冠心病、克隆氏症、糖尿病(I型)、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、古柏氏症候群、葛瑞夫茲氏症、古立安-白瑞症候群、橋本氏症、溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、發炎性腸道疾病(IBD)、對重組藥品(例如血友病中之因子VII)之免疫反應、全身性紅斑狼瘡症、狼瘡性腎炎、男性不育症、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力、原發性黏液水腫、天疱瘡、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、風濕熱、類風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、修格連氏症候群、脊椎關節病、交感性眼炎、T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病、睪丸血管中心性T細胞淋巴瘤、甲狀腺炎、移植排斥反應、潰瘍性結腸炎、自體免疫性葡萄膜炎及血管炎。自體免疫介導之病狀包括(但不限於)受感染之組織為主要標靶，且在一些情況下為次要標靶之病狀。該等病狀包括(但不限於)AIDS、特異反應性過敏、支氣管哮喘、濕疹、麻風、精神分裂症、遺傳性抑鬱症、組織及器官移植、慢性疲勞症候群、阿茲海默氏症、帕金森氏症、心肌梗塞、中風、自閉症、癲癇症、阿爾圖斯氏現象、強過敏及酒精及藥物成癮。

本文所述之域抗體亦可在治療上適用於移植物相關疾病，諸如移植物抗宿主疾病(GVHD)、急性移植排斥反應及慢性移植排斥反應。

本文所述之域抗體另外適用於通常任何抗體製劑所適用之方面，例如用於活體內成像或診斷用途，活體外診斷用途等。

對於此等及其他用途而言，可能需要例如用螢光、比色標記、酶標記或放射性標記來標記域抗體。標記域抗體之方法為此項技術中所熟知。

9.醫藥組合物、劑量及投藥

本文所述之域抗體可併入適用於投與個體之醫藥組合物中。通常，該醫藥組合物包含域抗體及醫藥學上可接受之載劑。本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有生理學上相容之溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。術語「醫藥學上可接受之載劑」排除包含牛或馬血清之組織培養基。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物以及其組合中之一或多者。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之物質包括少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增加域抗體之存放期或有效性。

本文所述之組合物可呈多種形式。其包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、散劑、脂質體及栓劑。較佳形式取決於所欲投藥模式及治療應用。典型較佳組合物呈可注射溶液或可輸注溶液之形式，諸如與用其他抗體被動免疫人類之組合物類似的組合物。一種投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)投藥。

治療性組合物通常在製造及儲存條件下必須滅菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他適於高藥物濃度之規則結構。滅菌可注射溶液可由所需量之活性化合物與上文列舉之一種成份或成份組合一起併入適當溶劑中，視需要繼而過濾滅菌來製備。一般而言，分散液係由活性化合物併入含有基本分散介質及上文所列舉之所需其他成份的滅菌媒劑中製備。在用於製備滅菌可注射溶液之滅菌粉末的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，自先前滅菌過濾之溶液產生活性成份加任何其他所需成份的粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用塗料(諸如卵磷脂)，藉由在分散液情況下保持所需粒子尺寸，及藉由使用界面活性劑來保持。

本文所述之域抗體可藉由此項技術中已知之多種方法投與，但對於許多治療性應用而言，較佳投藥途徑/模式為靜脈內注射或輸注。多肽亦可藉由肌肉內或皮下注射來投與。

如由熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式應視所需結果而變化。在特定實施例中，可將活性化合物與將保護該化合物以免迅速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微膠囊化傳遞系統。域抗體部分由於其尺寸小而極適合於調配為延長釋放製劑，每劑之莫耳數可顯著高於例如完整尺寸抗體之劑量。可使用生物可降解、生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現。許多製備該等調配物之方法已獲得專利或通常為熟習此項技術者所已知。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。適用於控制或延長釋放多肽藥劑(諸如本文所揭示之單價域抗體)的其他方法例如描述於美國專利第6,306,406號及第6,346,274號中以及例如美國專利公開案第US 20020182254號及第US 20020051808號中，出於所有目的該等專利全部以引用的方式併入本文中。

其他活性化合物亦可併入組合物中。在特定實施例中，域抗體與一或多種其他治療劑一起共調配及/或共投與。舉例而言，域抗體可與一或多種結合其他標靶之其他抗體(例如結合其他細胞激素或結合細胞表面分子之抗體)或例如一或多種細胞激素一起共調配及/或共投與。該等組合療法可使用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與多種單一療法有關之可能毒性或併發症。

本文所揭示之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」之域抗體。「治療有效量」係指在所需劑量下且歷時所需時段有效達成所需治療結果的量。域抗體之治療有效量可根據以下因素改變，諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重，及域抗體引發個體所需反應的能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有利作用超過任何有毒或有害作用的量。「預防有效量」係指在所需劑量下且歷時所需時段有效達成所需預防結果的量。通常，由於預防劑量係在疾病之前或在疾病早期用於個體，故預防有效量將小於治療有效量。

給藥方案可經調整以提供最佳所需反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單次劑量，可隨時間投與數個分次劑量，或可如治療情形之緊急需要所指示按比例降低或增加劑量。宜將非經腸組合物調配成便於投藥及使劑量均一之單位劑型。如本文所用之單位劑型係指適用作待治療哺乳動物個體之單一劑量的實體離散單位；各單位含有經計算產生所需治療作用之預定量之活性化合物以及所需醫藥載劑。

域抗體之治療或預防有效量之非限制性範圍為0.1-20 mg/kg，且在一態樣中為1-10 mg/kg。應注意，劑量值可隨待減輕病狀之類型及嚴重性而改變。另外應瞭解，對於任何特定個體而言，應隨時間根據個體需要及投藥臨床醫師之專業判斷調整特定給藥方案。

本文所述域抗體之治療功效由熟習此項技術之臨床醫師基於所治療疾病病況或病症之一或多個症狀或指示物之改良來判斷。一或多個臨床指示物改良至少10%(視所量測指示物而定，增加或減少)被視為「有效治療」，但包括更大之改良，諸如約20%、30%、40%、50%、75%、90%或甚至100%，或視所量測指示物而定，超過100%(例如兩倍、三倍十倍等，至多且包括達到無病狀態)。指示物可為物理量度，例如酶、細胞激素、生長因子或代謝物含量，細胞生長或細胞死亡之速率，或異常細胞之存在或量。亦可量測例如疾病或病症(例如對於緩解型/復發型疾病(諸如多發性硬化症)而言)之症狀突然發作之間的時間量的差異。或者，可依賴於非物理量度(諸如所報導之疼痛或不適或疾病狀態之其他指示物減少)來計量治療之有效性。若進行非物理量測，則可使用多種臨床上可接受之標度或指數，例如克隆氏症活性指數或CDAI(Best等人(1976)Gastroenterology 70：439)，其將物理指示物(諸如血球比容及液體便或極軟便之數目等)與患者報導之因素(諸如腹痛或痛性痙攣之嚴重性及全身健康)組合來賦予疾病分值。

對牛皮癬之治療功效例如可使用索爾福德牛皮癬指數(Salford Psoriasis Index，SPI)或牛皮癬面積嚴重性指數(PASI)來監測。PASI為臨床試驗中評定牛皮癬疾病嚴重性之最常用方法，但其對於用於日常臨床實踐而言可能過於麻煩。該方法包括將身體分成四個部分(腿，其具有人皮膚之40%；軀體(軀幹區：胃、胸部、背等)(具有30%)；臂(20%)及頭部(10%))。每一此等區域單獨評分，且隨後將四個分值組合成最終PASI。對於各部分，估算所涉及皮膚之面積百分比，且隨後轉化為0至6之級別：

所涉及面積為0%，級別：0

所涉及面積為<10%，級別：1

所涉及面積為10-29%，級別：2

所涉及面積為30-49%，級別：3

所涉及面積為50-69%，級別：4

所涉及面積為70-89%，級別：5

所涉及面積為90-100%，級別：6

藉由以下四個不同參數估算嚴重性：發癢、紅斑(發紅)、起鱗皮及厚度(牛皮癬性皮膚比正常皮膚厚)。嚴重性參數以0至4(無至最大)之標度量測。

隨後對於各皮膚部分計算所有四個嚴重性參數之總和，乘以該區域之面積分值且乘以各別部分之權數(頭部為0.1，臂為0.2，軀體為0.3且腿為0.4)。實例：(I頭部+E頭部+S頭部+T頭部)×A頭部×0.1=總頭部。

最後，按所有四個皮膚部分之PASI之總和計算總PASI。與標準方法相比，發現電腦輔助量測牛皮癬性病變面積改良臨床試驗之效力。醫師所估算之牛皮癬性病變面積傾向於高估。改適之PASI指數(其中不將牛皮癬性面積轉化為面積級別，而保持為連續變數形式)亦改良臨床試驗之效力。涉及電腦輔助面積量測作為連續變數的經改良PASI稱作：電腦輔助牛皮癬連續面積及嚴重性分值cPcASI。

亦可監測對器官移植排斥反應之治療功效。由於器官保存及免疫抑制治療之發展，器官移植患者之存活率(目前對於所有移植器官而言，約70-85%患者可存活5年)已得以改良。然而，器官排斥反應(尤其手術之最初數週發生的急性排斥反應，以及慢性移植排斥反應)仍為器官移植功能失效的主要原因之一。目前在實體器官移植之後診斷或確認移植排斥反應需要對組織進行活組織檢查以偵測免疫細胞(例如T細胞、巨噬細胞等)至移植物中之浸潤及其他病理學變化。組織之活組織檢查不僅為侵襲性的，而且其與患者增加之健康風險相關且易於引起會產生假陰性結果之取樣誤差。正在開發替代性非侵襲性方法，諸如磁共振成像(MRI)，其可用於監測排斥器官處免疫細胞之積累(Ho等人，(20004)Curr.Pharm.Biotech.,5：551-566)。

如本文所用之術語，使用本文所述之組合物執行之「預防」在一或多個症狀之發作或嚴重性相對於未用該組合物治療的類似個體(人類或動物模型)之該等症狀延遲或減少至少10%或消除時「有效」。

然而本文所述之域抗體結合人類CD28，若將在動物模型系統中評估其作用，多肽必須與該動物模型系統中之一或多個抗原交叉反應，在一態樣中以高親和力交叉反應。熟習此項技術者可易於判定對於指定動物模型系統及指定域抗體是否滿足此條件。若滿足此條件，則可藉由在模擬疾病病況之條件下向動物模型投與域抗體且監測該疾病病況之一或多個指示物是否發生至少10%改良來檢查域抗體之功效。

10.動物模型

本文所述之域抗體適用於治療CD28信號傳導具不適當活性之自體免疫病症。如下所述，存在可用來評定指定域抗體之治療功效的數個動物模型。

10.1.發炎性腸道疾病(IBD)模型(於SCID或Rag ^-/- 小鼠中注射CD4 ⁺ CD45RB ^高 )-慢性模型

IBD模型包括使用De Winter等人(1999)Am.J.Physiol.276：G1317-1321所述之黏膜免疫及炎症系統。簡言之，IBD為病因不確定之多因性免疫病症。類似於IBD之數個黏膜性炎症小鼠模型提供對控制正常與病理性黏膜免疫功能之機制的瞭解。在一態樣中，於免疫缺陷小鼠中注射CD4(+)T淋巴細胞之子集CD4(+)CD45RB^高細胞導致腸炎症。發病機制部分歸因於前發炎性細胞激素之分泌。在另一態樣中，可藉由共傳遞另一CD4(+)亞群CD4(+)CD45RB^低T細胞來防止結腸炎之誘發。此群體與CD4(+)CD45RB^高群體在獲取活化標記及歸位至宿主腸方面之表現類似。然而，其在活化時之淋巴激素概況不同，且由CD4(+)CD45RB^低T細胞分泌及/或誘發之抗發炎性細胞激素防止結腸炎。De Winter等人提供關於接受性轉移模型及促進及阻止結腸炎發病機制之因素的描述。

10.2.與NOD小鼠雜交之KRN TCR Tg的自發性關節炎模型-慢性模型

Kouskoff等人(1996)Cell 87：811-822提供由全身性自體免疫引發之器官特異性疾病之模型。類風濕性關節炎(RA)為特徵為白血球侵襲及滑膜細胞活化繼而軟骨及骨骼破壞的慢性關節病。對RA之病因及發病機制缺乏瞭解。Kouskoff等人提供RA之自發性小鼠模型，其係藉由使T細胞受體(TCR)轉殖基因株與NOD株雜交產生。所有後代均產生高度類似於人類之RA的關節病。鼠類病症係由轉殖基因TCR偶然性識別NOD衍生之主要組織相容性複合體(MHC)II類分子觸發；進展至關節炎涉及CD4+ T、B及可能的骨髓細胞。

10.3.小鼠膠原蛋白誘發之關節炎-慢性模型

Brand等人(2004)Methods Mol.Med.102：295-312提供膠原蛋白誘發之關節炎的小鼠模型。簡言之，膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)為實驗性自體免疫疾病，其可在齧齒動物(大鼠及小鼠)及非人類靈長類動物之易感品系中藉由用II型膠原蛋白(CII)(關節軟骨之主要組成蛋白)免疫而引發。免疫之後，動物產生自體免疫性多發性關節炎，其與RA共有數個臨床及組織學特徵。齧齒動物對CIA之易感性與主要組織相容性複合體(MHC)II類分子相關，且對CII之免疫反應特徵在於刺激膠原蛋白特異性T細胞與產生高力價之對免疫原(異源CII)及自身抗原(小鼠CII)具特異性的抗體。組織學上，鼠類CIA特徵在於與關節炎之臨床發作精確對應之嚴重滑膜炎。此實驗數據由於CIA與RA之間的病理類似性而適用於評估CIA。

10.4.抗原誘發之活體內T細胞增殖-急性模型

使用T細胞-抗原-受體轉殖基因T細胞的接受性轉移來研究活體內T細胞活化提供抗原誘發之T細胞增殖的模型。Pape等人(1997)Immunol.Rev.156：67-78討論均勻表現具有已知肽/MHC特異性之可鑑別TCR的TCR轉殖基因T細胞之接受性轉移可用於監測抗原特異性T細胞的活體內行為。使用該系統顯示原生T細胞最初在次級淋巴組織之T細胞區內活化以便以B7依賴性方式增殖。若在此期間提供佐劑或發炎性細胞激素，則增加數目之T細胞積累，遷至富含B細胞之濾泡中，且獲得產生IFN-γ之能力且輔助B細胞產生IgG2a。若不存在炎症，則大多數最初經活化之抗原特異性T細胞消失而不會進入濾泡，且倖存者為IL-2及IFN-γ之不良產生者。

實例 實例1：結合域抗體之選擇

用重組人類CD28/Fc嵌合體(R&D Systems,Abingdon,UK)進行結合域抗體(dAb)之選擇。用於選擇之域抗體文庫係基於單一人類V_H構架(V3-23 aka DP47及JH4b)及單一人類V_L構架(012/02 aka DPκ9及J_κ1)。dAb基因與fd噬菌體基因III蛋白在含有產生感染性噬菌體粒子所必需之所有fd基因之pDOM4載體(圖1)中的GAS1前導序列控制下遺傳連接。藉由將噬菌體文庫(4個V_H文庫集[V_H11-13、V_H14-15、V_H16-17、V_H18-19]及單個V_κ文庫集)與2% MPBS(補充有2% Marvel脫脂奶粉之磷酸鹽緩衝生理食鹽水)預混合且添加CD28-Fc(R&D Systems,UK)至100 nM之最終濃度來執行第一輪噬菌體選擇。將混合物在室溫下培育至少1小時，同時進行翻滾式混合，隨後使用蛋白G Dynabeads(Dynal,Sweden)捕獲抗原-噬菌體複合物，且用1 ml PBST(補充有0.1% Tween 20之PBS)洗滌8次，繼而在1 ml PBS中洗滌1次。藉由與0.5 ml在PBS(補充有5 mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.1 mM CaCl₂)中之1 mg/ml來自牛胰腺之XIII型胰蛋白酶(Sigma Aldrich,UK)一起培育自抗原/珠粒複合物溶離經洗滌之噬菌體。使用經溶離之噬菌體感染大腸桿菌，且測定輸出噬菌體力價在1×10⁴至1×10⁵力價單位(t.u.)/ml之間，其中t.u./ml為每ml感染性噬菌體粒子之量度單位。t.u.之量測值係經由用指定稀釋度之噬菌體感染大腸桿菌，繼而使受感染大腸桿菌在選擇性瓊脂板上生長來測定。

使用自前一輪選擇回收之富集化噬菌體以及最終濃度為50 nM之CD28-Fc來執行第二輪選擇，繼而使用上述蛋白G珠粒捕獲。輸出力價在1×10⁶至1×10⁹ t.u./ml範圍內。

使用10 nM CD28-Fc來執行第三輪選擇，繼而使用蛋白G珠粒捕獲。經溶離噬菌體力價在2×10⁹至8×10⁹ t.u./ml之範圍內。

在第2輪及第3輪選擇之後進行單株噬菌體ELISA。所有洗滌均使用250 μl PBST洗滌3次繼而250 μl PBS洗滌3次來執行。在4℃下分別用PBS中之1 mg/ml及0.6 mg/ml CD28-Fc塗布培養板隔夜。洗滌培養板，隨後用2% MPBS在室溫下阻斷1小時。洗滌培養板，且將噬菌體上清液添加至等體積之2% MPBS中，且在室溫下培育1小時。洗滌培養板，且用於2% MPBS中1：5000稀釋之抗M13-HRP結合物(GE Healthcare,UK)偵測所結合噬菌體，且在室溫下培育1小時。洗滌培養板，且使用SureBlue單組份TMB微孔過氧化酶溶液(KPL Inc,USA)進行ELISA。藉由與用1 mg/ml Fc(Sigma Aldrich,UK)塗布之培養板相比來鑑別特異性噬菌體。第2輪之後，主要在文庫集V_H14-15、V_H18-19及V_κ中鑑別特異性噬菌體，而直至第3輪為止，剩餘少數特異性噬菌體。對於所有輪次，將2個文庫集次選殖至pDOM5(圖2)中且篩選可溶性噬菌體。噬菌體ELISA展示於圖3中。

實例2：結合dAb之序列的鑑別

如下鑑別結合dAb。自V_H14-15、V_H18-19及V_κ輸出中之每一者中挑選96個個別菌落(pDOM5)，且在37℃下在Costar 96孔細胞培養組(Corning Incorporated,USA)中於200 μL含有OnEx自動誘導培養基(Novagen,UK)之極品培養液(Terrific Broth)中在以250 rpm震盪下表現隔夜。將培養物離心以使細胞粒化，且藉由抗原結合ELISA檢定上清液之CD28結合dAb。在4℃下用於PBS中之1 mg/ml CD28-Fc塗布Maxisorp 96孔免疫板(Nunc,USA)隔夜，隨後洗滌。所有洗滌均如針對噬菌體ELISA所述。將培養板在室溫下用200 μl含有1% Tween 20之PBS阻斷1小時，且隨後洗滌。將含經淨化之含dAb培養物上清液添加至存在蛋白A(對於V_H而言)(Sigma,UK)或蛋白L(對於V_κ而言)(Sigma,UK)之ELISA板中以藉由分別交聯V_H或V_κ dAb來增強ELISA信號強度。將培養板在室溫下培育1小時，隨後洗滌。使用兩步法偵測結合之dAb：首先在室溫下添加於PBST中1：2000稀釋之9E10(抗myc IgG，Sigma-Aldrich, UK)歷時1小時隨後洗滌，繼而在室溫下添加於PBST中1：2000稀釋之抗小鼠Fc-HRP。洗滌培養板，且使用SureBlue單組份TMB微孔過氧化酶溶液(KPL Inc,USA)進行ELISA且使顏色顯現。藉由添加等體積之1 M HCL來中止比色反應，且在450 nm下讀取ELISA板。藉由與僅用Fc塗布之對照板相比來鑑別CD28特異性純系(對於可溶性ELISA之實例參見圖4)。所有特異性純系經DNA測序，且最初鑑別28個獨特純系(對於序列參見附錄)。藉由BIAcore分析(GE Healthcare,UK)針對與CD28-Fc之結合篩選dAb上清液之另外兩個培養板。由此篩選，另外鑑別30個獨特序列。

以下實例中之dAb胺基酸序列不必精確對應於序列表中所揭示之dAb序列。在一些情況下，dAb胺基酸序列可在蛋白N末端含有額外胺基酸殘基，引入該等胺基酸殘基以便於選殖至表現載體中。在實例5及以下實例中，例如重組表現dAb之胺基酸序列可在N末端含有Ser Thr序列。咸信此等額外N末端殘基不會影響dAb之生物學活性。

實例3：dAb結合特性之表徵

為表徵經定序dAb之結合活性，使所有58個純系表現且純化且在BIAcore上針對用12500 RU(反應單位)CD28-Fc塗布之CM5晶片測試。總共九個純系顯示結合，該等純系包括DOM21-4、DOM21-6、DOM21-18、DOM21-20、DOM21-22、DOM21-27及DOM21-28(對於BIAcore跡線參見圖5)及DOM21-38及DOM21-44。

用於BIAcore分析的蛋白質濃度如下：DOM21-4 42.3 μM

DOM21-6 68.1 μM

DOM21-18 13.8 μM

DOM21-20 57.5 μM

DOM21-22 19.4 μM

DOM21-27 14.7 μM

DOM21-28 16.6 μM。

本文揭示且表徵之數個dAb經比對以對比序列一致性以及所觀察之活性；DOM21-18(V_κ)與1h-239-891(V_κ)82.4%一致。

DOM21-28(V_κ)與1h-239-891(V_κ)83.3%一致。

DOM21-28(V_κ)與1h-239-850(V_κ)85.2%一致。

1h-239-891(V_κ)與1h-239-850(V_κ)96.3%一致。

DOM21-4(V_H)與1h-99-238(V_H)81.7%一致。

DOM21-20(V_H)與1h-99-238(V_H)78.9%一致。

DOM21-4(V_H)與1h-239-850(V_κ)23.9%一致。

實例4：活體外dAb活性檢定

如下活體外測試dAb活性。使七個dAb(DOM21-4、DOM21-6、DOM21-18、DOM21-20、DOM21-22、DOM21-27及DOM21-28)以較大規模表現且純化。在類似於Boulougouris,J.Immunol.1998,161(8)：3919-3924所述之細胞基活體外檢定中使用100 μM儲備濃度之去除內毒素之dAb樣品判定dAb是否會抑制CD28活性。在96孔板中以每孔200 μl之最終體積使用含有10% FCS及抗生素之RPMI 1640培養基一式三份執行增殖檢定。在1 μg/ml抗CD3抗體(OKT3)加表現CD80或CD86之經轉染CHO細胞及一系列濃度之dAb或對照抗體存在下培養人類CD4陽性T細胞(5×10⁴個)。將檢定物在37℃下在每孔1 μCi [³H]-胸苷存在下培育18小時至72小時。使用Packard(Meriden,CT)96孔收集器將細胞收集至96孔過濾板上，且經由液體閃爍計數測定[³H]-胸苷吸收。四個dAb DOM21-4、DOM21-18、DOM21-20及DOM21-28顯示抑制活性(圖6)，其中DOM21-4及DOM21-28顯示最大程度之抑制(圖7)。

下文詳細說明受體結合檢定中鑑別為抑制CD28與CD80或CD86結合之獨特dAb之DNA序列。下文亦列出胺基酸序列，其中各dAb之CDR區呈粗體。

>DOM21-1

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTACTCCGCAGGGTGATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGCAAGCTGGTTGGAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：1)

>DOM21-2

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTGGATTATGAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTTCGAATGATGGCGCTGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATGATGCTGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID N0：2)

>DOM21-3

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGCGTATTCTATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTACGGGGAATGGTGGTTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGGAGGAGCCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：3)

>DOM21-4

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTAGGTATCATATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTGATTGATTCTCTTGGTCTTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATATGGTGGTGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：4)

>DOM21-5

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTCATTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTACTCCGGATGGTCTTATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTAGGTTGGTTGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：5)

>DOM21-6

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATTATGGTATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAATATTGGTCGGGCTGGTAGTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCAGTCGTGGAGGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：6)

>DOM21-7

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGCGTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGAGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATATATTGATGGGCGTGGTGCTGAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTGATACTCTGATTTCTGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：7)

>DOM21-8

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTAATTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTACTGGTCATACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTTGGGCCTAATAATCCTATGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：8)

>DOM21-9

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGAGTTATGATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTTCGGCGGATGGTACGTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCTTCTTTTGATAAGTATAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：9)

>DOM21-10

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGGGGGCCGACGTCGTCTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：10)

>DOM21-11

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGAGTATGGTATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTGATAATGTTGGTTCGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTACGCCTGTTTTGCTGCCGCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：11)

>DOM21-12

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATTCTTATAATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTTGAGTGGGTCTCAGCTATTGCGGCTAATGGTCGTGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGACGAATATGGCGTATGGTAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：12)

>DOM21-13

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCTGTATTCGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACATATTGATAGGGCTGGTATGATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTTCTAATGCTGTTAATATGCAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：13)

>DOM21-14

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGTCATAGGCCTTCGACGCAGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGNCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：14)

>DOM21-15

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGATTATAAGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATAAGGGTGGTATTATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGTTTCCTAAGTTTCGGCCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：I5)

>DOM21-16

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATGGGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTAATCGTTCTGGTCTGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCTGAATGCTCCTAATTTTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：16)

>DOM21-17

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATCGTTATGCGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATGGTAATGGTCTGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGACTAGGTCTCATTCTGATTCGGGTTGGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：17)

>DOM21-18

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTATATTGGTACTTCGTTAAATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGACCTATCAGGCTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTTGGCGCTGCGTCCTATGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGG(SEQ ID NO：18)

>DOM21-19

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGTATTACGAAGGGTGGTCGGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGGGTCCGTCGAGGATGCTTAATGAGCCGCTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：19)

>DOM21-20

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCGGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTTCGCCGCTGGGTTATTCGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAACAGACGGCTTATTTGAATCGTGCTACGGAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：20)

>DOM21-21

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCGAAGTATGATATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCATCGATTTATGCTATTGGTGGTAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGAAGTCGGGGATGCAGACTCGGTTGAATTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：21)

>DOM21-22

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGCTGTATCAGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTAGTGGTAATCTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGTGGTCGTTGAATTTGGGGTTTCATGCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：22)

>DOM21-23

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATGGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTAGTCCTTCTGGTAATTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAAT GGGTCTCTTCCGCCTCGTGGGTCTATTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：23)

>DOM21-24

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGTATTACGAAGGGTGGTCGGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGGGTCCGTCGAGGATGCTTAATGAGCCGCTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：24)

>DOM21-25

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGTATTATATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTGGGGCTAATGGTGCTCCTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTCGTTCGCTTAATAGGTGGGCGGAGCCTGTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：25)

>DOM21-26

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTGATTATTCTATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACAGATTAGTCCGGCGGGTTCTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATTCTAAGTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEQ ID NO：26)

>DOM21-27

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTGGGACGGGTTTACGGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTATGCTCCTGATCTATCGGGCGTCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTTAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGACTCTTCAGCCTTTTACGTTCAGCCAAGGGACTAAGGTGGAAATCAAACGGG(SEQ ID NO：27)

>DOM21-28

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTCTATTAGTCATTCGTTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCTTCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGGTATGACTACGCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGG(SEQ ID NO：28)

>DOM21-30

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAGTTATGATATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCTGCTGATGGTCATTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCGGAGTAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：29)

>DOM21-31

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGGGATTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTGATTCTCATGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATATGACGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：30)

>DOM21-32

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGGGAGTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTAATGGTGTGGGTAATTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATCAGGTGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：31)

>DOM21-33

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGATTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTACGTCTGAGGGTTCGCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATACGTCTGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：32)

>DOM21-34

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGAGGTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCTGGTCCTGGTACGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATGATACGGGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：33)

>DOM21-35

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTTCTTATGCTATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGAGATTTCTCCTTATGGTAATCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGATCGGCGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO：34)

>DOM21-36

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTTCGTATGGGATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCTACTGATGGTATGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTGGGGTTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：35)

>DOM21-37

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGATTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCAATTATTCGTGTGCCTGGTTCGACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGGGTGATGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：36)

>DOM21-38

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATTCTGTATGATATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTTCTGCTAATGGTCATGATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTCCGCATTATTTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：37)

>DOM21-39

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTAAGTATTTTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACTGATTGATCCGCGTGGTCCTCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTTGGGTGAGGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：38)

>DOM21-40

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGACTTATACGATGAGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTAATTCGAGTGGTACTTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCTAGTTCTTATACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：39)

>DOM21-41

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGATGTATAGTATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCGAATGCTGGTGATATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATCGTTTAGGTCTCGTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：40)

>DOM21-42

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGATTATCTTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACTGATTCGTATGAGGGGTTCTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATTCTCTTACTACTAATCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：41)

>DOM21-43

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTGATTATATGATGGCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTGGGACTACTGGTACGTGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTAATGCGTATGAGAGTGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：42)

>DOM21-44

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCGGTATACTATGGTGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTCATTTTGATGGTCGGACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATGAGTGGGCGTCTCTTAAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：43)

>DOM21-45

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATTTATTAATCTGCCTGGTGGTCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGACTCATGGGCTGACTGGTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：44)

>DOM21-46

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTTTGTATGGTATGGCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTGGGATGCATGGTGATACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTTGTGGGGCTACGTATTGTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：45)

>DOM21-47

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAAGTATGTTATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTGATTCCTTGGGTTCTACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGGGTTTGTTGGTTCATTATGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：46)

>DOM21-48

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGTGTATGGTATGTCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATTGATTGATGCGGGTGGTCGGAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGACGACGCGTGCTTATAGTGATTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：47)

>DOM21-49

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATTATGATATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTACTACGCATGGTAGGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGATAATTTGAATATGAATGTGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：48)

>DOM21-50

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATTAAGTATGATATGTGTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGTATTGAGTCTAGTGGTCAGAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGTCTGAATGATAGTTGTAATGTTCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：49)

>DOM21-51

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGATATTGGTCGTTATGGTAGGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTCAGCGTATGGTTAATCCGTCGCCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：50)

>DOM21-52

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTTGTTAGTTATAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTTCGGGGCAGGGTACTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCCGATGGTTTTTGCTTTGGATGGGAGGTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：51)

>DOM21-53

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTGAGTATAGTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTACGCCTGTTGGTGTTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAGGCCTGGGCCGCATGGTTGGTCTTTTCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：52)

>DOM21-54

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTGATAAGTCGGGTTATAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGGGATTGATTCGCGGGGTCTGATGACTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：53)

>DOM21-55

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTCGTTATCGTATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTCTGAGTGATGGTGCGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGGGGGGAATGCGTGGTCTACTCGGGTTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：54)

>DOM21-56

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTACGTATACNATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTACGCCGCTTGGTTATAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCGTCGGATGTGAAGGTGTCTCCGCTGCCGAGTTTTGACTACTGGGGTCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：55)

>DOM21-57

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTATGTATGGTATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCTCAGTATGGTCTTTCTACATACTACGCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGTCTATGAGGCGGGTGTTTAGTAGTTCGGATACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：56)

>DOM21-58

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAATATAGGTGATCGGTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGTATTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTTTGGGCTGTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO：57)

DOM21-4

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：401)

DOM21-20

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：402)

DOM21-1

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTITPQGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQAGWSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：403)

DOM21-2

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMAWVRQAPGKGLEWVSTISNDGAATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDAAFDYWGQGALVTVSS(SEQ ID NO：404)

DOM21-3

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYSMGWARQAPGKGLEWVSWITGNGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAEEPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：405)

DOM21-4

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：406)

DOM21-5

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTHYSMGWVRQAPGKGLEWVSHITPDGLITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRLVDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：407)

DOM21-6

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYGMAWVRQAPGKGLEWVSNIGRAGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVQSWRTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：408)

DOM21-7

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMGWVRQAPEKGLEWVSYIDGRGAETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIDTLISEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：409)

DOM21-8

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPNYTMWWVRQAPGKGLEWVSSISGTGHTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFGPNNPMFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：410)

DOM21-9

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFASYDMGWVRQAPGKGLEWVSAISADGTFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDKYNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：411)

DOM21-10

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRGPTSSNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：412)

DOM21-11

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYGMKWVRQAPGKGLEWVSTIDNVGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTTPVLLPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：413)

DOM21-12

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYNMGWVRQAPGKGLEWVSAIAANGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMTNMAYGSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：414)

DOM21-13

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMAWVRQAPGKGLEWVSHIDRAGMITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSNAVNMQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：415)

DOM21-14

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHRPSTQDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：416)

DOM21-15

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYKMGWVRQAPGKGLEWVSWIDKGGIITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMFPKFRPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：417)

DOM21-16

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSHINRSGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLNAPNEKFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：418)

DOM21-17

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETFNRYAMGWVRQAPGKGLEWVSWIDGNGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTRSHSDSGWAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：419)

DOM21-19

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：420)

DOM21-20

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：421)

DOM21-21

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYDMAWVRQAPGKGLEWVSSIYAIGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLKSGMQTRLNSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：422)

DOM21-22

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFELYQMGWVRQAPGKGLEWVSTIMPSGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMWSLNLGFHAAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：423)

DOM21-23

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYGMGWVRQAPGKGLEWVSGISPSGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNGSLPPRGSIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：424)

DOM21-24

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：425)

DOM21-25

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYYMGWARQAPGKGLEWVSSIGANGAPTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIRSLNRWAEPVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：426)

DOM21-26

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYSMYWVRQAPGKGLEWVSQISPAGSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSKSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：427)

DOM21-40

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKTYTMRWVRQAPGKGLEWVSTINSSGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSYTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：428)

DOM21-41

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAMYSMKWVRQAPGKGLEWVSSISNAGDITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESFRSRYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：429)

DOM21-42

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYLMGWVRQAPGKGLEWVSLIRMRGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSLTTNLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：430)

DOM21-43

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYMMAWARQAPGKGLEWVSIIGTTGTWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTNAYESEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：431)

DOM21-44

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYTMVWVRQAPGKGLEWVSAIHFDGRTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNEWASLKHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：432)

DOM21-45

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYMMGWVRQAPGKGLEWVSFINLPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTHGLTGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：433)

DOM21-46

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYGMAWARQAPGKGLEWVSSIGMHGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVCGATYCNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：434)

DOM21-47

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYVMAWVRQAPGKGLEWVSIIDSLGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGLLVHYDEDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：435)

DOM21-48

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEVYGMSWARQAPGKGLEWVSLIDAGGRNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTRAYSDYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：436)

DOM21-49

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYDMHWVRQAPGKGLEWVSGITTHGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDNLNMNVDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：437)

DOM21-50

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFIKYDMCWARQAPGKGLEWVSCIESSGQNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKCLNDSCNVHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：438)

DOM21-51

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSDIGRYGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTQRMVNPSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：439)

DOM21-52

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSYSMGWVRQAPGKGLEWVSIISGQGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPMVFALDGRSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：440)

DOM21-53

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSEYSMGWVRQAPGKGLEWVSSITPVGVFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRPGPHGWSFRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：441)

DOM21-54

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYMMGWVRQAPGKGLEWVSTIDKSGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIDSRGLMTKFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：442)

DOM21-55

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYRMAWVRQAPGKGLEWVSSILSDGAVTYYADSVKGRETISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGGNAWSTRVTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：443)

DOM21-57

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTMYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISQYGLSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSMRRVFSSSDTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：444)

DOM21-59

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：445)

DOM21-60

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：446)

DOM21-61

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：447)

DOM21-62

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：448)

DOM21-63

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：449)

DOM21-64

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：450)

DOM21-65

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：451)

DOM21-66

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：452)

DOM21-67

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：453)

DOM21-68

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：454)

DOM21-18

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：455)

DOM21-28

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：456)

DOM21-18

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：457)

DOM21-27

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTTLQPFTFSQGTKVEIKR(SEQ ID NO：458)

DOM21-28

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：459)

DOM21-58

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGDRLHWYQQKPGKAPKLLIYRISRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFGLYPTTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：460)

DOM21-30

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：461)

DOM21-31

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：462)

DOM21-32

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：463)

DOM21-33

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：464)

DOM21-34

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：465)

DOM21-35

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：466)

DOM21-36

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：467)

DOM21-37

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：468)

DOM21-38

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：469)

DOM21-39

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYEMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：470)

DOM21-56

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFTYXMAWVRQAPGKGLEWVSSITPLGYNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSDVKVSPLPSFDYWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：471)

製備、分離且表徵以下其他V_H及V_κdAb。下文列出各dAb之胺基酸序列，其中各dAb之CDR1區、CDR2區及CDR3區呈粗體。下文亦分別列出各dAb之CDR1、CDR2及CDR3序列。

V _κ dAb：

1h-239-850(SEQ ID NO：58)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR

1h-35(SEQ ID NO：59)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR

1h-36(SEQ ID NO：60)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-79(SEQ ID NO：61)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-80(SEQ ID NO：62)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR

1h-83(SEQ ID NO：63)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRAAPFTFGQGTKVEIKR

1h-108(SEQ ID NO：64)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR

1h-203(SEQ ID NO：65)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSVLAWYQQKPGKAPKLLIYFSSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALRSPFTFGQGTKVEIKR

1h-207(SEQ ID NO：66)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR

1h-238(SEQ ID NO：67)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINASLGWYQQKPGKAPKLLIYWASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMVRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-239(SEQ ID NO：68)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNATNPATFGQGTKVEIKR

1h-18-1(SEQ ID NO：69)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-2(SEQ ID NO：70)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-3(SEQ ID NO：71)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYRASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-4(SEQ ID NO：72)

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLAYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-5(SEQ ID NO：73)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAMRPMTFGQGTKVEIKW

1h-18-6(SEQ ID NO：74)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLIYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-28-1(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMSTPFTFGQGTKVEIKR

1h-28-2(SEQ ID NO：76)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTAPFTFGQGTKVEIKR

1h-31(SEQ ID NO：77)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGYSLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTQRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-32(SEQ ID NO：78)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGHGLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLSKPFTFGQGTKVEIKR

1h-33(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSNIHNRLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCRQWIQPPWTFGQGTKVEIKR

1h-34(SEQ ID NO：80)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR

1h-35(SEQ ID NO：81)

1h-35-15(SEQ ID NO：82)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYLQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR

1h-35-2(SEQ ID NO：83)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR

1h-35-5(SEQ ID NO：84)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSAISWYQQKPGRAPKLLIYRASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVGIKR

1h-35-7(SEQ ID NO：85)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGYGTGFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR

1h-35-9(SEQ ID NO：86)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNMQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR

1h-36(SEQ ID NO：87)

1h-36-1(SEQ ID NO：88)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDILWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCARGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-36-2(SEQ ID NO：89)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDILWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAKGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-36-3(SEQ ID NO：90)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLMWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-36-4(SEQ ID NO：91)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLSWYQHKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-36-5(SEQ ID NO：92)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLSWYQQKPGRAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPETFGQGTKVEIKR

1h-36-6(SEQ ID NO：93)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQLKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-36-7(SEQ ID NO：94)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPATFGQGTKVEIKR

1h-38(SEQ ID NO：95)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSVLAWYQQKPGKAPKLLIYFSSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQALRSPFTFGQGTKVEIKR

1h-39(SEQ ID NO：96)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALHWYQQKPGKAPRLLIYLSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSALNPYTFGQGTKVEIKR

1h-69(SEQ ID NO：97)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQKIGTGLRWYQQKPGKAPKLLIYRASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTAFPPYTFGQGTKVEIKR

1h-70(SEQ ID NO：98)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWYRPYTFGQGTKVEIKR

1h-71(SEQ ID NO：99)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIGHMLNWYQQKPGKAPKLLIWFGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGRLRPPTFGQGTKVEIKR

1h-72(SEQ ID NO：100)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSINHWLDWYQQKPGKAPTLLISGVSWLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCCQPGFRPCTFGQGTKVEIKR

1h-73(SEQ ID NO：101)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTQLSWYQQKPGKAPKLLIYRGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALSPYTFGQGTKVEIKR

1h-74(SEQ ID NO：102)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGGALSWYQQKPGKAPKLLIYRASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVALVPYTFGQGTKVEIKR

1h-75(SEQ ID NO：103)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTRLSWYQQKPGKAPKLLIYNASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALSPLTFGQGTKVEIKR

1h-76(SEQ ID NO：104)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTRLVWYQQKPGKAPKLLIYQSSLLQSGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQTALVPYTFGQGTKVEIKR

1h-77(SEQ ID NO：105)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPRLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSASMPITFGQGTKVEIKR

1h-78(SEQ ID NO：106)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGHMLAWYQQKPGKAPKLLIYWGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARAAPFTFGQGTKVEIKR

1h-79(SEQ ID NO：107)

1h-79-1(SEQ ID NO：108)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPTRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-10(SEQ ID NO：109)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLFYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-11(SEQ ID NO：110)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQMLRTPFTFGHGTKVEIKR

1h-79-15(SEQ ID NO：111)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-1505(SEQ ID NO：112)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWGSWLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-1512(SEQ ID NO：113)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASVLLHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-1519(SEQ ID NO：114)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASLLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-1520(SEQ ID NO：115)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVAITCRASQPIGHSLGWYEQKPGKAPKLLIYWSSVLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-16(SEQ ID NO：116)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-17(SEQ ID NO：117)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR

1h-79-18(SEQ ID NO：118)

DIQMTQSSSSLSASVGDRVSITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPADSATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-19(SEQ ID NO：119)

DIQMTQSPSSRSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-2(SEQ ID NO：120)

DTQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-20(SEQ ID NO：121)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-21(SEQ ID NO：122)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-22(SEQ ID NO：123)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR

1h-79-23(SEQ ID NO：124)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR

1h-79-24(SEQ ID NO：125)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR

1h-79-25(SEQ ID NO：126)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR

1h-79-26(SEQ ID NO：127)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR

1h-79-27(SEQ ID NO：128)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR

1h-79-28(SEQ ID NO：129)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR

1h-79-29(SEQ ID NO：130)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR

1h-79-3(SEQ ID NO：131)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLRPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-30(SEQ ID NO：132)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR

1h-79-31(SEQ ID NO：133)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR

1h-79-32(SEQ ID NO：134)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR

1h-79-4(SEQ ID NO：135)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPRLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR

1h-79-5(SEQ ID NO：136)

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1h-79-6(SEQ ID NO：137)

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GWSGLQS

1h-36 CDR3(SEQ ID NO：492)

AQGWGRPVTFGQGTKVEIKR

1h-79 CDR1(SEQ ID NO：493)

RASQPIGHSLA

1h-79 CDR2(SEQ ID NO：494)

WASTLQS

1h-79 CDR3(SEQ ID NO：495)

QQMLRTPFT

1h-80 CDR1(SEQ ID NO：496)

RASQRIGSNLA

1h-80 CDR2(SEQ ID NO：497)

WASLLQS

1h-80 CDR3(SEQ ID NO：498)

QQTRSAPFT

1h-83 CDR1(SEQ ID NO：499)

RASQSIGHSLV

1h-83 CDR2(SEQ ID NO：500)

WASLLQS

1h-83 CDR3(SEQ ID NO：501)

QQSRAAPFTFGQGTKVEIKR

1h-108 CDR1(SEQ ID NO：502)

RASQYIGTALN

1h-108 CDR2(SEQ ID NO：503)

RRSHLQS

1h-108 CDR3(SEQ ID NO：504)

QQIALTPYT

1h-203 CDR1(SEQ ID NO：505)

RASQPIGSVLA

1h-203 CDR2(SEQ ID NO：506)

FSSILQS

1h-203 CDR3(SEQ ID NO：507)

QQALRSPFT

1h-207 CDR1(SEQ ID NO：508)

RASQYIGTSLA

1h-207 CDR2(SEQ ID NO：509)

HSSGLQS

1h-207 CDR3(SEQ ID NO：510)

QQTALRPFT

1h-238 CDR1(SEQ ID NO：511)

RASQHINASLG

1h-238 CDR2(SEQ ID NO：512)

WASQLQS

1h-238 CDR3(SEQ ID NO：513)

QQMVRTPFT

1h-239 CDR1(SEQ ID NO：514)

RASQSIYPFLE

1h-239 CDR2(SEQ ID NO：515)

FTSRLQS

1h-239 CDR3(SEQ ID NO：516)

QQNATNPAT

1h-239-891 CDR1(SEQ ID NO：636)

RASRPIWPFLE

1h-239-891 CDR2(SEQ ID NO：637)

FTSRLRH

1h-239-891 CDR3(SEQ ID NO：638)

LQNVANPAT

VH dAbs：

1h-99-237(SEQ ID NO：272)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-238(SEQ ID NO：273)

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1h-37(SEQ ID NO：274)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYKMVWVRQAPGKGLEWVSSIGPGGLDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWMTLPITGFDYRGQGTLVTVS S

1h-93(SEQ ID NO：275)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRKSSSSRTVFDYWGQGTLVTVS S

1h-99(SEQ ID NO：276)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIDDTGTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYWGQGTLVTVSS

1h-4-1(SEQ ID NO：277)

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1h-4-2(SEQ ID NO：278)

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1h-4-3(SEQ ID NO：279)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYSGAFDYWGQGTLVTVSS

1h-4-4(SEQ ID NO：280)

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1h-29(SEQ ID NO：281)

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1h-30(SEQ ID NO：282)

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1h-37(SEQ ID NO：283)

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1h-40(SEQ ID NO：284)

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1h-91(SEQ ID NO：285)

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1h-92(SEQ ID NO：286)

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1h-93(SEQ ID NO：287)

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1h-93-1(SEQ ID NO：288)

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1h-93-2(SEQ ID NO：289)

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1h-93-201(SEQ ID NO：290)

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1h-93-204(SEQ ID NO：291)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYTAEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS

1h-94(SEQ ID NO：292)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPGYTMEWVRQAPGKGLEWVSSITPLGANTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIRYTGTYNFDYWGQGTLVTVSS

1h-95(SEQ ID NO：293)

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1h-96(SEQ ID NO：294)

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1h-97(SEQ ID NO：295)

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1h-98(SEQ ID NO：296)

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1h-99(SEQ ID NO：297)

1h-99-1(SEQ ID NO：298)

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1h-99-2(SEQ ID NO：299)

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1h-99-201(SEQ ID NO：300)

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1h-99-202(SEQ ID NO：301)

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1h-99-203(SEQ ID NO：302)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYKANMSWARQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-204(SEQ ID NO：303)

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1h-99-205(SEQ ID NO：304)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-206(SEQ ID NO：305)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLHNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-207(SEQ ID NO：306)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRASNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-208(SEQ ID NO：307)

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1h-99-209(SEQ ID NO：308)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-210(SEQ ID NO：309)

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1h-99-211(SEQ ID NO：310)

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1h-99-2112(SEQ ID NO：311)

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1h-99-2113(SEQ ID NO：312)

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1h-99-2114(SEQ ID NO：313)

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1h-99-2115(SEQ ID NO：314)

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1h-99-2116(SEQ ID NO：315)

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1h-99-213(SEQ ID NO：317)

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1h-99-214(SEQ ID NO：640)

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1h-99-215(SEQ ID NO：318)

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1h-99-216(SEQ ID NO：319)

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1h-99-217(SEQ ID NO：320)

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1h-99-218(SEQ ID NO：321)

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1h-99-219(SEQ ID NO：322)

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1h-99-220(SEQ ID NO：323)

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1h-99-221(SEQ ID NO：324)

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1h-99-222(SEQ ID NO：325)

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1h-99-223(SEQ ID NO：326)

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1h-99-227(SEQ ID NO：330)

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1h-99-228(SEQ ID NO：331)

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1h-99-230(SEQ ID NO：333)

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1h-99-251(SEQ ID NO：351)

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1h-99-252(SEQ ID NO：352)

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1h-99-253(SEQ ID NO：353)

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1h-99-255(SEQ ID NO：355)

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1h-99-256(SEQ ID NO：356)

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1h-99-257(SEQ ID NO：357)

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1h-99-258(SEQ ID NO：358)

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1h-99-259(SEQ ID NO：359)

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1h-99-260(SEQ ID NO：360)

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SANMS

1h-99-237 CDR2(SEQ ID NO：518)

WIEAPGVQTFYADSVRG

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SPFGPLYGFDY

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SANMS

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WIEASGVQTFYADSVKG

1h-99-238 CDR3(SEQ ID NO：522)

SPFGPLYGFDY

1h-37 CDR1(SEQ ID NO：523)

TYKMV

1h-37 CDR2(SEQ ID NO：524)

SIGPGGLDTYYADSVKG

1h-37 CDR3(SEQ ID NO：525)

SWMTLPITGFDY

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LYEMA

1h-93 CDR2(SEQ ID NO：527)

SIMSNGIRTYYADSVKG

1h-93 CDR3(SEQ ID NO：528)

RKSSSSRTVFDY

1h-99 CDR1(SEQ ID NO：529)

SANMT

1h-99 CDR2(SEQ ID NO：530)

WIDDTGTQTYYADSVKG

1h-99 CDR3(SEQ ID NO：531)

SPFGPLYGFDY

實例5：其他dAb活性檢定

使用以下其他生物檢定來檢查dAb對CD28活性之影響。

混合淋巴細胞反應細胞激素檢定

為進行量測在各時間點回應於刺激細胞MoDC之細胞激素的MLR實驗，藉由將96孔圓底板中每孔1.5×10⁵個T細胞與1.5×10⁴個同種異體MoDC在總體積為300 μL之10% FCS-RPMI中組合來執行檢定。一式三份添加滴定量之CD28域抗體、阿巴西普(abatacept)或貝拉西普(belatacept)以量測MLR開始之後24小時、48小時及72小時之細胞激素釋放。使用Duoset ELISA顯色套組(R&D Systems；Minneapolis,MN)偵測上清液中之IL-2及TNF-α。使用配對之抗體與重組細胞激素(來自Pierce Biotechnology(Rockford,IL))量測IFNγ。所有套組及Ab均根據製造商之建議使用。處理檢定板且在SpectraMax Plus分光光度計(Molecular Devices Corp.,Sunnyvale,CA)上讀數。使用Softmax軟體藉由與使用已知濃度之重組細胞激素產生的標準曲線對比來分析數據。

IL-2報導基因檢定(「螢光素酶檢定」)

在具有FCS(Summit Bio-technology,Ft.Collins.,CO.)、1% 1-麩胺醯胺、1%丙酮酸鈉、25 mM HEPES及0.4 mg/ml遺傳黴素(均來自Life Technologies,Inc.)之RPMI 1640(Life Technologies,Inc.Gaithersburg,MD)中培養在IL-2啟動子之控制下用螢光素酶基因轉染的Jurkat-CA細胞。在具有10% FCS、1% 1-麩胺醯胺之RPMI 1640中培養Raji細胞(ATCC,Rockville,MD)。為啟始Jurkat細胞活化，Jurkat-CA細胞與Raji細胞均以每毫升1.0×10⁶個細胞各自塗於96孔不透明板(Perkin Elmer,Boston,MA)中。將經組合之細胞與抗CD3純系UCHT1(0.1 μg/ml；BD Pharmingen,San Diego,CA)及不同濃度之dAb一起培育。16-20小時之後，將培養板冷卻至室溫，且將Steady-Glo^TM(Promega,Madison,WI)添加至培養板中。在添加Steady-Glo之30分鐘內使用Topcount-NXT儀器(Perkin Elmer)分析培養板。

混合淋巴細胞反應(MLR)檢定

藉由對正常健康供體之經EDTA處理之全血進行密度-梯度分離(淋巴細胞分離介質；Mediatech Inc.,Herndon,VA)獲得PBMC。自與SRBC(Colorado Serum Company；Denver,CO)形成玫瑰花狀之PBMC之E⁺部分製備T細胞。藉由將來自正常供體PBMC之E部分的單核細胞黏著於6孔組織培養板中，繼而廣泛溫和洗滌以移除未黏著細胞來製備成熟MoDC。將黏著細胞在含有10% FCS以及100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4之RPMI中培養7日，每隔一日更換一半培養基且用含有相同濃度細胞激素之新鮮培養基替換。在第7日，用LPS(1 μg/ml)歷時24小時使細胞成熟。隨後使用此等成熟MoDC作為混合淋巴細胞反應(MLR)中之抗原呈現細胞。

為進行量測CD28域抗體滴定量之MLR增殖檢定，將T細胞以每孔1×10⁵個細胞在三個孔中與2×10³個作為APC的同種異體MoDC一起在96孔圓底板中在總體積為200 μl的10% FCS-RPMI中培養。視相對效能而定，添加濃度範圍為100 μg/ml至10 ng/ml的域抗體。在啟始MLR之後第5日，將培養物與1 μCi之³[H]-胸苷(PerkinElmer,Boston,MA)一起脈衝6小時，收集於Packard細胞收集器(PerkinElmer)上，且使用Packard TopCount-NXT儀器(PerkinElmer)進行液體閃爍計數。

圖3說明使用dAb 1m74-15-P40L抑制活體內T細胞增殖。在第「-1」日，將30×10⁶個細胞/毫升獲自DO11 T細胞受體小鼠之脾細胞經由尾靜脈注入BALB/c小鼠中。在第0日，將小鼠用PBS、dAb或CTLA-4 Ig腹膜內給藥。此腹膜內給藥之後兩小時，在小鼠腳墊中注射50 mg用完全傳氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant)1：1乳化之雞卵白蛋白。在第1日及第2日，進行腹膜內給藥。在第3日，收集引流膕淋巴結以便用抗CD4 APC及純系型(clonotypic)抗體KJ- 126 PE染色(圖3)。在圖3中，CD4及KJ126雙陽性細胞表示抗原特異性T細胞。自動物採集血液進行暴露來測定血液中dAb之含量。

圖4A及4B說明使用dAb 1m74-15-P40L之九日受體佔有率(RO)研究的結果。原生BALB/c小鼠腹膜內(圖4A)或皮下(圖4B)注射PBS或1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg之1m74-15 40L(n=4)。在1小時、4小時、24小時、48小時、72小時、96小時、168小時及216小時之時間點自動物採集血液。對於dAb處理組而言，使用50 μl血液用抗CD4 APC及抗CD28 PE染色，且使用50 μl血液進行暴露。對於PBS組而言，使用50 μl血液用抗CD4 APC及抗CD28 PE染色，且使用50 μl血液在過量未經標記之抗CD28抗體存在下用抗CD4及抗CD28 PE染色以定義非特異性結合。使用平均螢光強度(MFI)作為抗體結合之量度單位。受體佔有率%(%RO)係定義為「1-[CD28MFI(dAb)-CD28 MFI(非特異性)]/[CD28MFI(PBS)-CD28 MFI(非特異性)]」。

協同促效劑檢定

藉由對正常健康供體之經EDTA處理之全血進行密度-梯度分離(淋巴細胞分離介質；Mediatech Inc.,Herndon,VA)獲得PBMC。自與SRBC(Colorado Serum Company；Denver,CO)形成玫瑰花狀之PBMC之E⁺部分製備T細胞。將T細胞以每孔1×10⁵個細胞在總體積為200 μl 10% FCS-RPMI中在預先用20 μg/ml抗CD3抗體(G19-4 mAb，Bristol-Myers Squibb)塗布之96孔平底板的三個孔中培養，且在檢定前洗滌。添加濃度範圍為100 μg/ml至0.3 μg/ml的域抗體。使用1.0 μg/ml抗CD28(9.3 mAb，Bristol-Myers Squibb；Gibson等人(1996)Am Soc.Biochem.Mol.Bio.,271：7079-7083)作為陽性對照。在啟始檢定之後第3日，將培養物與1 μCi ³[H]-胸苷(PerkinElmer,Boston,MA)一起脈衝6 h，收集於Packard細胞收集器(PerkinElmer)上且在Packard TopCount NXT儀器(PerkinElmer)中進行液體閃爍計數。

圖2說明本文所述之抗人類CD28 dAb並不展現協同促效劑活性。將經純化T細胞(每孔1×10⁵個細胞)添加至用抗CD3(G19-4，10 μg/ml於PBS中)塗布之96孔平底板中。將最終濃度為30 μg/ml之各dAb添加至三個孔中之細胞中。作為陽性對照，替代dAb添加1 μg/ml最終濃度之抗CD28 mAb(9.3)。在第3日由³[H]-胸苷併入量測增殖(圖2)。

促效劑檢定

藉由對正常健康供體之經EDTA處理之全血進行密度-梯度分離(淋巴細胞分離介質；Mediatech Inc.,Herndon,VA)獲得PBMC。將PBMC以每孔1×10⁵個細胞在總體積為200 μl之10% FCS-RPMI中在96孔平底板之三個孔中培養。添加濃度範圍為100 μg/ml至0.3 μg/ml之dAb。使用1 μg/ml抗CD3(OKT3)溶液作為陽性對照(最大增殖)。抗CD28(9.3，10 μg/ml溶液)以及山羊抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch，使用50 μg/ml溶液)亦在一些檢定中用作對比物。在啟始檢定之後第3日，將培養物與1 μCi ³[H]-胸苷(PerkinElmer,Boston,MA)一起脈衝6 h，收集於Packard 細胞收集器(PerkinElmer)上且使用Packard TopCount NXT儀器(PerkinElmer)進行液體閃爍計數。

圖1A及1B說明本文所述之抗人類CD28 dAb並不展現促效劑活性。在第一個實驗中，自正常供體之全血分離PBMC，且以每孔1×10⁵個細胞接種於96孔平底板中。將數個本文所述dAb以圖1A指定之最終濃度添加至三個孔中。包括抗CD3(OKT3，最終濃度為1 μg/ml)作為陽性對照。在第3日由³[H]-胸苷併入量測增殖(圖1A)。在另一實驗中，將數個本文所述dAb、抗CD28抗體(9.3)、抗CD3抗體(OKT3)或同型對照以指定最終濃度添加至96孔圓底板之三個孔中且使其於孔上風乾。添加PBMC(每孔1×10⁵個細胞)且在第3日由³[H]-胸苷併入量測增殖。

下表1中匯總IL-2報導基因檢定與混合淋巴細胞反應檢定中對於dAb獲得之數據以作對比。基於此等實驗之結果以及本文所述之協同促效劑實驗之結果，表明本文所述之dAb以親和力及特異性與CD28結合，且該等dAb拮抗CD28活性。dAb亦顯示極少CD28促效活性乃至無CD28促效活性。

實例6：dAb之聚乙二醇修飾

進行各dAb之聚乙二醇化以增強本文所述dAb之穩定性，延長其半衰期且增加其生物可用性。為進行dAbN末端胺之聚(乙二醇)(PEG)修飾(「聚乙二醇化」)，將樣品純化且透析至磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中，且使溶液中之內毒素含量降至最大值為10個內毒素單位(EU)/毫克(1 EU=100 pg脂多醣)。隨後將樣品透析至0.1 M磷酸鉀(pH 6.8)中。在透析之後將樣品過濾，測定蛋白質濃度且調整為2-3 mg/ml。

為連接PEG(40 kD直鏈，40 kD分枝鏈或30 kD直鏈)，將相對於dAb 3倍莫耳過量之甲氧基聚(乙二醇)丙醛固體添加至溶液中，且在室溫下在滾筒上混合1小時。此時，添加10倍莫耳過量之氰基硼氫化鈉(來自於0.1 M磷酸鉀(pH 6.8)中之5 mg/ml儲備液)，且在室溫下在滾筒上混合5小時。再添加10倍莫耳過量之氰基硼氫化鈉，且使反應在室溫下進行隔夜。藉由SDS-PAGE監測聚乙二醇化之進程。

為在C末端位置或內部位置(例如胺基酸位置15、41、60、70、81或100)將dAb之半胱胺酸殘基聚乙二醇化，將 dAb純化且透析至PBS中，且使內毒素含量降低至最大值為10 EU/mg。在透析之後將樣品過濾，且測定dAb濃度且調整為2-3 mg/ml。

為連接PEG(40 kD直鏈，40 kD分枝鏈或30 kD直鏈)，使用二硫蘇糖醇(DTT)還原dAb。將甘油(20%(v/v))添加至樣品中，且將樣品充分混合，隨後用二硫蘇糖醇(5 mM)還原。使反應在室溫下進行20分鐘，隨後使用26/10 Hi-Prep去鹽管柱(GE Healthcare)將緩衝液交換為PEG偶合緩衝液(20 mM BIS-Tris(pH 6.5)，5 mM EDTA及10%甘油[v/v])。量測蛋白質濃度且調整為2-3 mg/ml。將相對於dAb 3倍莫耳過量之甲氧基聚(乙二醇)順丁烯二醯亞胺固體添加至溶液中，且將溶液在室溫下在滾筒上混合4至16小時。藉由SDS-PAGE監測聚乙二醇化之進程。

亦使用參(2-羧基乙基)膦(TCEP)還原dAb進行聚乙二醇化。使用26/10 HiPrep去鹽管柱(GE Healthcare)將樣品透析至PEG偶合緩衝液(20 mM BIS-Tris(pH 6.5)，5 mM EDTA及10%甘油[v/v])中。量測dAb之濃度且調整為2-3 mg/ml。使用以5 mM之濃度添加之TCEP在室溫下還原20分鐘。隨後添加相對於dAb 3倍莫耳過量之甲氧基聚(乙二醇)順丁烯二醯亞胺固體，且在室溫下在滾筒上混合4-16小時。藉由SDS-PAGE監測聚乙二醇化之進程。

需要時使用順丁烯二醯亞胺阻斷半胱胺酸殘基。將蛋白質樣品純化且透析至PBS中，且使內毒素含量降低至最大值為10 EU/mg。

在透析之後將樣品過濾，且測定蛋白質濃度且調整為2-3 mg/ml。為添加PEG，將甘油(20%(v/v))添加至樣品中且充分混合，隨後用二硫蘇糖醇(DTT 5 mM)還原。使反應在室溫下進行20分鐘，隨後使用26/10 Hi-Prep去鹽管柱(GE Healthcare)透析至PEG偶合緩衝液(20 mM BIS-Tris(pH 6.5)，5 mM EDTA及10%甘油[v/v])中。量測蛋白質濃度且調整為2-3 mg/ml。添加相對於dAb 3倍莫耳過量之順丁烯二醯亞胺固體，且在室溫下使用滾筒混合4-16小時。使用SDS-PAGE監測該反應之程度。

用於純化聚乙二醇化dAb之方法取決於dAb之等電點(pI)。對於pI小於7之dAb而言，使用陰離子交換法，而對於pI高於7之dAb而言，陽離子交換法較適當。

為進行純化，首先用緩衝液A(對於陰離子交換法為20 mM Tris(pH 8)而對於陽離子交換法為20 mM乙酸鈉(pH 4))1：5稀釋dAb且檢查pH值。使用Resource Q(陰離子交換劑)及Resource S(陽離子交換劑)或HiTrap Q或S速流管柱(GE Healthcare)。用10管柱體積0.5 M NaOH，繼而10管柱體積緩衝液B(對於陰離子交換法為20 mM Tris(pH 8)，使用1 M NaCl，而對於陽離子交換法為20 mM乙酸鈉(pH 4)，使用1 M NaCl)洗滌管柱。用緩衝液A使管柱平衡，隨後裝載經稀釋樣品。經以下梯度進行樣品溶離：0-30%緩衝液B，經30管柱體積，30-100%緩衝液B，經10管柱體積，100%緩衝液B，經5管柱體積。

任何過量之游離PEG或順丁烯二醯亞胺通過管柱且保留在通過流(flow through)中。聚乙二醇化樣品通常於第一梯度中溶離，且與溶離有剩餘未聚乙二醇化樣品之第二梯度完全分離。在各梯度之整個過程中收集兩毫升溶離份，且藉由SDS-PAGE分析。最終用0.5 M NaOH洗滌管柱以溶離任何剩餘物質。彙集適當溶離份，且在高pI dAb的情況下，藉由添加1 M Tris(pH 8)調整pH值為中性。

表2及表3顯示聚乙二醇化dAb在本文所用檢定中保留結合活性及生物學活性。

實例7：動物與dAb之交叉反應性研究

檢查本文所述dAb與非人類細胞及多肽反應之能力。在交叉反應性研究中，dAb 1h-79-807針對表現CD28之人類與小鼠細胞均顯示活性。對於人類細胞研究而言，如上所述使用螢光素酶及MLR檢定。對於小鼠細胞研究而言，使用MLR及小鼠脾細胞檢定。在該等檢定中，dAb 1h-79-807展現31+/-12 nM之效能(脾細胞檢定)及38 +/-6 nM之效能(MLR檢定)。

為進行小鼠MLR檢定，使用Tenbroeck組織均質機由BALB\c小鼠之淋巴結及DBA\2小鼠之脾臟製備單細胞懸浮液。經由使用紅血球溶解緩衝液(SIGMA,St Louis,Mo)進行細胞溶解，繼而在完全培養基[RPMI 1640(Invitrogen, Carlsbad,CA)、10%胎牛血清(Summit)、1% 1-麩胺醯胺(Invitrogen)、1%丙酮酸鈉(Invitrogen)、100 μg/ml慶大黴素(gentamicin)(Invitrogen)、5×10^-5 M 2-巰基乙醇(SIGMA)]中洗滌兩次來自兩個群體移除紅血球。在最終洗滌之後，將細胞顆粒再懸浮於2 ml完全培養基中，裝載於個別預平衡耐綸(nylon)羊毛管柱(WAKO,Richmond,VA)上，且在37℃下培育60 min。藉由添加25 ml溫培養基自管柱溶離來自BALB/c淋巴結之T細胞及DBA\2脾臟之T細胞。棄去來自DBA\2脾臟之T細胞，且添加25 ml冰冷完全培養基(前述)自管柱溶離APC群體。使BALB\c T細胞或DBA/2 APC在400×g下離心10分鐘，再懸浮於完全培養基中，且在血球計上對細胞計數。將兩個細胞群體於完全培養基中稀釋至1.0×10⁶個細胞/毫升。將DBA\2 APC(0.25×10⁶個/毫升)與BALB\c T細胞(0.5×10⁶個/毫升)在圓底96孔板(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中組合，且將dAb或對照試劑之連續稀釋液添加至孔中。將培養板在37℃下在5% CO₂中培育96小時。在培育期結束之前6小時將³H-胸苷(1 μCi；PerkinElmer,Waltham,MA)添加至孔中。將培養板經由GF/c過濾板(PerkinElmer)收集，乾燥，隨後將50 μl Microscint-20(PerkinElmer)添加至各孔中，且在TopCount(Packard,Meriden,CT)上進行放射性計數。使用ExcelFit程式(Microsoft,Redmond,WA)分析數據。

為進行小鼠脾細胞檢定，使用Tenbroeck組織均質機自BALB\c小鼠之脾臟產生單細胞懸浮液。藉由在紅血球溶解緩衝液中培育，繼而在完全培養基[RPMI 1640(Invitrogen)、10%胎牛血清(Summit)、1% 1-麩胺醯胺(Invitrogen)、1%丙酮酸鈉(Invitrogen)、100 μg/ml慶大黴素(Invitrogen)、5×10^-5 M 2-巰基乙醇(SIGMA)]中洗滌兩次使紅血球與其他均質物分離。最終洗滌之後，將細胞顆粒再懸浮於完全培養基中且使用血球計對脾細胞計數。將脾細胞於完全培養基稀釋至1.0×10⁶個細胞/毫升，且添加500 μl至圓底96孔板中。將濃度為0.1 μg/ml之抗CD3抗體(純系145-2C11(BMS))添加至各孔中。將dAb或對照試劑之連續稀釋液添加至孔中，在37℃下於5% CO₂中培育48小時。在培育期結束之前6小時將³H-胸苷(1 μCi)添加至孔中，且經由GF/c過濾板(PerkinElmer)收集脾細胞。乾燥培養板，將50 μl Microscint-20(PerkinElmer)添加至各孔中，且在TopCount上進行放射性計數。使用ExcelFit程式分析數據。

在另一交叉反應性研究中，使用獼猴檢查dAb之藥代動力學(PK)以便關於聚乙二醇(PEG)修飾(「聚乙二醇化」)dAb之尺寸及構形闡明PK。在各含有3隻猴之兩個組中檢查帶有40 kD PEG部分之抗人類CD28 dAb 1h 99-2-PEG之作用。第1組猴皮下接受濃度為10 mg/kg的dAb 1h 99-2 P40-分枝鏈PEG。第2組猴皮下接受濃度為10 mg/kg的dAb 1h 99-2 P40-直鏈PEG。將自動物採集之所有血清樣品儲存在-70℃下且在研究結束時分析。使用ELISA及MSD在數個稀釋度下分析血清樣品。

為進行ELISA分析，將濃度為1 μg/ml之生物素-單體CD28塗布在ELISA板上。在1%之最終血清濃度下製備標準物、品質對照樣品及所有實驗樣品稀釋液。在室溫下解凍獼猴樣品，且製備數個樣品稀釋液以鑑別在檢定範圍內之信號。將獼猴樣品添加至ELISA板之孔中且在室溫下培育兩小時。製備兔抗Vh dAb且使用親和純化法及多株抗體分離。將驢抗兔-HRP添加至培養板中，繼而添加受質，且在反應進行量測量之時間之後，中止反應。使用微板光學讀取器量測各反應物之光學密度(OD)。產生標準曲線，使用標準曲線之四參數邏輯擬合基於可計量範圍內之OD讀數計算孔中之dAb濃度。結果係基於多次稀釋濃度之平均值。

表4-6描述由向獼猴投與dAb 1h 99-2 P40-分枝鏈及dAb 1h 99-2 P40-直鏈獲得的結果。圖5說明猴中聚乙二醇化dAb研究中隨時間的血漿濃度。

分枝鏈聚乙二醇化dAb與直鏈聚乙二醇化dAb之實驗結果在暴露與終末半衰期方面均不同，此可能由於吸收而非處置的差異。

儘管分枝鏈dAb之半衰期(T_1/2)(T_1/2=4.5日)似乎短於直鏈dAb(T_1/2=6日)，但就暴露及對標靶濃度之潛在覆蓋率而言分枝鏈PEG dAb為較佳候選物(例如活體外IC₅₀值=3 μg/mL或200 nM)。分枝鏈dAb之AUC為直鏈dAb之約2.5倍(單因子方差分析P=0.017)。分枝鏈dAb之平均滯留時間(MRT)為直鏈dAb之約1.5倍。

皮下投藥之後，約24小時出現兩個聚乙二醇化蛋白之峰值濃度。兩個dAb之穩態分布體積(Vss/F)值均低於100 mL/kg，表明聚乙二醇化蛋白大部分存在於血漿中。

實驗性實例7以及表4-6中之數據顯示本文所述之dAb可與人類、小鼠及猴模型系統交叉反應。此外，聚乙二醇化dAb之藥代動力學參數顯示dAb在活個體中具有生物可利用性及活性。

實例8：dAb之SEC-MALLS分析方法

為估算dAb之溶液尺寸及寡聚結構，使用多角度雷射光散射以及尺寸排阻層析。將多肽樣品純化且透析至適當緩衝液(亦即PBS)中。在透析之後將樣品過濾，測定濃度且調整為1 mg/ml。BSA係購自Sigma且不作進一步純化即使用。

具有自動進樣器(SIL-20A)及SPD-20A Prominence UV/可見光偵測器之Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC系統與Wyatt Mini Dawn Treos(MALLS，多角度雷射光散射偵測器)及Wyatt Optilab rEX DRI(示差折射率)偵測器連接。偵測器按以下次序連接：LS-UV-RI。RI與LS儀器均在488 nm之波長下操作。使用TSK2000(Tosoh corporation)或 BioSep2000(Phenomenex)管柱(兩者均為二氧化矽基HPLC管柱，其具有類似分離範圍：1-300 kD)，其中移動相為50 mM磷酸鹽緩衝液(有或無鹽)(pH 7.4)或1×PBS。為改良蛋白質自管柱之回收率，有時添加10%乙醇。所用流速為0.5或1.0 ml/min，且調整運作時程以反映不同流速(45或23分鐘)且預期其不會對分子分離具有顯著影響。蛋白質在PBS中製備至1 mg/ml之濃度，且注入體積為100 μl。

根據製造商之說明用甲苯校準光散射偵測器。UV偵測器輸出及RI偵測器輸出與光散射儀器連接以便可用Wyatt ASTRA軟體同時收集所有3個偵測器之信號。於移動相PBS(0.5或1 ml/min)中之數個BSA注入物經Tosoh TSK2000管柱運作，由Wyatt軟體收集UV、LS及RI信號。隨後使用ASTRA軟體分析跡線，且根據製造商之說明針對帶變寬進行標準化校準及校正。隨後對校準常數取平均值且輸入用於未來樣品運作之模板中。

絕對莫耳質量計算

將100微升1 mg/ml樣品注入適當預平衡管柱上。經由SEC管柱處理之後，樣品通過3個在線偵測器：UV、MALLS(多角度雷射光散射)及DRI(示差折射率)，從而允許測定絕對莫耳質量。因為在管柱上進行約10倍稀釋，故確定溶液內狀態(in-solution state)之濃度為100 μg/mL或約8 μM dAb。

ASTRA計算以及通常以分批取樣模式(batch sample mode)執行之席姆圖技術(Zimm plot technique)係基於Zimm (1948)J.Chem.Phys.16：1093-1099之方程式：其中

˙c為溶劑中溶質分子之質量濃度(g/mL)

˙M為重量平均莫耳質量(g/mol)

˙A ₂為第二維里爾係數(virial coefficient)(mol mL/g²)

˙K ^*=4p² n ₀ ² (dn/dc) ² l₀ ^-4 N _A ^-1為光學常數，其中n ₀為溶劑在入射輻射(真空)波長下之折射率，l₀為入射輻射(真空)波長(以奈米表示)，N _A為阿佛加德羅常數(Avogadro's number)，等於6.022×10²³ mol^-1，且dn/dc為溶劑-溶質溶液之示差折射率關於溶質濃度變化的增量(以mL/g表示)(此因子必須獨立地使用dRI偵測器量測)。

˙P(q)為理論獲得之形態因子，約等於1-2μ²<r²>/3！+...，其中μ=(4π/λ)sin(θ/2)，且<r ²>為均方半徑。P(q)為分子z-平均尺寸、形狀及結構之函數。

˙R _q為超瑞利比(excess Rayleigh ratio)(cm^-1)此方程式假定垂直偏振入射光，且對於c ²(order c ²)有效。

為用席姆擬合法(其為R _q/K ^* c對sin²(q/2)之擬合)執行計算，需要擴展方程式1之倒數為c一次(first order in c)形式：

在此情況下適當結果為M=([K^xc/R₀]-2A₂c)^-1 (方程式3)及其中m₀=d[K^xc/R_θ]/d[sin²(θ/2)]_θ→0 (方程式5)。

藉由ASTRA軟體自動執行計算，產生針對各數據切片(data slice)測定莫耳質量的圖。將由圖獲得之針對層析圖上所觀察到的各峰的莫耳質量值與單一單位蛋白質之預期分子質量對比。此允許確定蛋白質之溶液內狀態。

實例9：抗CD28 dAb抑制DC促進之MLR之情境中的細胞激素產生

本實例顯示抗CD28域抗體能夠抑制樹突狀細胞促進之MLR之情境中的細胞激素產生。

藉由對正常人類供體全血進行密度-梯度分離獲得周邊血液單核細胞(PBMC)。自與綿羊紅血球(Colorado Serum Company)形成玫瑰花狀之PBMC之E⁺部分製備T細胞。藉由使來自PBMC E^-部分之單核細胞黏著至塑膠上且與GM-CSF及IL-4(Invitrogen)一起培養7日產生樹突狀細胞(DC)，繼而添加LPS(Sigma，1 μg/ml)歷時24小時以誘發成熟。以半對數稀釋滴定抗CD28域抗體以獲得九點劑量反應曲線來評估該等域抗體對1：10比率之樹突狀細胞與T細胞的相互作用的抑制。藉由市售ELISA(R&D Systems)量測上清液中之細胞激素產生。在刺激之後第2日量測IL-2及IFNγ，且在第3日量測TNFα。在第5日由³[H]-胸苷併入量測增殖。自各處理之抑制曲線產生EC₅₀值。結果展示於表8中。下文之「239-891-D70C P30L PEG」及「239-891-D70C P40B PEG」分別表示用30 kDa直鏈或40 kDa分枝鏈聚乙二醇聚乙二醇化的抗CD28人類V_κ域抗體(dAb)1h-239-891-D70C。

實例10：CD28 dAb在抑制CD80促進之T細胞增殖及CD86促進之T細胞增殖中同樣有效

本實例顯示抗CD28域抗體抑制CD80促進之T細胞增殖與CD86促進之T細胞增殖。

自與綿羊紅血球形成玫瑰花狀之PBMC之E⁺部分製備T細胞。將穩定轉染人類CD80或CD86之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞與T細胞在1 μg/ml αCD3(OKT3)存在下組合。以半對數稀釋滴定抗CD28域抗體以獲得九點劑量反應曲線來評估該等域抗體對1：3比率之CD80或CD86-CHO與T細胞的相互作用的抑制。在第5日由³[H]-胸苷併入量測增殖。自各處理之抑制曲線產生EC₅₀值。結果展示於表9中。

實例11：CD28 dAb抑制由不同APC引發的T細胞增殖

本實例顯示抗CD28域抗體抑制由不同抗原呈現細胞引發之T細胞增殖。

自與綿羊紅血球(Colorado Serum Company)形成玫瑰花狀之PBMC之E⁺部分製備T細胞。藉由使來自PBMC E^-部分之單核細胞黏著至塑膠上且與GM-CSF及IL-4(Invitrogen)一起培養7日產生樹突狀細胞(DC)，繼而添加LPS(Sigma，1 μg/ml)歷時24小時以誘發成熟。藉由淘析自PBMC之E^-部分製備單核細胞。淋巴母細胞細胞株(PM-LCL)為來自正常供體之EBV轉型B細胞株。將各APC與同種異體T細胞以1：50之比率組合。以半對數稀釋滴定抗CD28域抗體以獲得九點劑量反應曲線來評估該等域抗體對增殖之抑制，增殖係在第5日由³[H]-胸苷併入量測。自各處理之抑制曲線產生EC₅₀值。結果展示於表10中。

實例12：抗CD28域抗體無促效劑活性

本實例顯示抗CD28域抗體無促效劑活性。

分別以於PBS中之半對數稀釋滴定抗CD28域抗體239-891-D70C及促有絲分裂抗人類CD28抗體5.11A1，將其塗布在96孔圓底板之底部且使其風乾。自正常人類供體之全血分離PBMC且添加至含有風乾抗體之孔中。如圖10A所示，在第3日由³[H]-胸苷併入量測增殖，且如圖10B所示量測IL-2產生。

實例13：抗CD28域抗體活體內結合其標靶且無促效劑活性

本實例顯示抗CD28域抗體活體內結合其標靶且無促效劑活性。

向獼猴投與用30 kDa直鏈或40 kDa分枝鏈聚乙二醇(PEG)聚乙二醇化的抗CD28人類V_κ域抗體(dAb)1h-239-891-D70C之單一皮下劑量。

在給藥後2小時、4小時、24小時、48小時、96小時、168小時、240小時、336小時、408小時、504小時及672小時使用流式細胞儀監測周邊血液T輔助細胞(CD3+CD4+CD8-)上之CD28受體佔有率(RO)。觀察到至多100% RO且維持一段時間，此與血漿藥物濃度有關。

儘管非人類靈長類本身對細胞激素釋放症候群(CRS)不敏感(評述於Horvath及Milton,Toxicol.Pathol.37(3)：372-383(2009)中)，但細胞激素濃度存在輕微增加可適用於預測人類之CRS。因此，在給藥前及給藥後2小時、4小時、8小時及24小時使用多重珠粒基檢定評估血漿細胞激素濃度(IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IFN-γ及TNF-α)。未觀察到藥物相關之細胞激素釋放，其中大多數細胞激素濃度降至偵測極限以下。此dAb對血漿細胞激素濃度不存在甚至輕微的影響證明無促效劑活性。

由於非人類靈長類中不存在CRS，故監測周邊血液T細胞數可預測人類之不當T細胞活化及T細胞去除(Horvath及Milton(2009)Toxicol.Pathol.37(3)：372-83)。因此，在給藥後2小時、4小時、24小時、48小時、96小時、168小時、240小時、336小時、408小時、504小時及672小時使用流式細胞儀監測周邊血液T細胞數。不存在類似於超促效單株抗體TGN 1412之單次給藥之後人類中(Suntharalingam等人(2006)New Engl.J.Med.355(10)：1018-28)或用OKT3及HuM291給藥之後非人類靈長類中(評述於Horvath及Milton,2009中)所觀察到的周邊血液T細胞數之迅速或明顯變化。此dAb對周邊血液T細胞數無任何迅速及/或明顯作用證明無促效劑活性。

本文所述之揭示內容已參考其特定實施例特別展示及描述。熟習此項技術者應瞭解，在不背離隨附申請專利範圍所涵蓋之範疇的情況下可進行各種形式及細節變化。

圖1(包含圖1A及1B)為描述本文所述抗人類CD28域抗體並不展現促效劑活性的一系列圖。圖1A說明遞增濃度之各dAb並不活化CD28，而添加至PBMC中之抗CD3抗體(OKT3)對照顯示活化CD28。將域抗體(dAb)及抗體添加至96孔板中，該培養板接種有自正常供體之全血分離之PBMC。圖1B說明固定於96孔圓底板之dAb、抗CD28(9.3)、抗CD3(OKT3)或同型對照在添加至孔中之PBMC中並不展現促效劑活性；圖2為描述抗人類CD28域抗體在添加至用抗CD3(G19-4，10 μg/ml於PBS中)塗布之96孔平底板中時並不展現協同促效劑活性的圖。將各dAb以30 μg/ml之最終濃度與經純化T細胞一起添加至孔中。作為陽性對照，替代dAb添加1 μg/ml最終濃度之抗CD28(mAb 9.3)；圖3為描述本文所述之域抗體活體內抑制T細胞增殖的圖；圖4(包含圖4A及4B)為描述使用dAb 1m-74-15-40L之九日受體佔有率研究的一系列圖。圖4A說明腹膜內給與dAb的受體佔有率。圖4B說明皮下給與dAb的受體佔有率；圖5描述獼猴研究中dAb 1h-99-2P40-分枝鏈及1h-99-2P40-直鏈隨時間的血漿濃度；圖6展示單株噬菌體呈現域抗體純系與塗布重組人類CD28/Fc嵌合體及Fc對照之培養板結合的的ELISA；圖7展示可溶性單株域抗體與塗布重組人類CD28/Fc嵌合體及Fc對照之培養板結合的ELISA；圖8展示dAb純系與用12500單位CD28-Fc塗布之CM5晶片結合的BIAcore跡線；圖9A及圖9B展示在一式兩份細胞基「活體外」檢定中域抗體純系抑制CD28活性的能力。在該等檢定中，用抗CD3加表現CD80或CD86之經轉染CHO細胞刺激人類CD4陽性T細胞；及圖10展示抗CD28域抗體無促效劑活性。在圖10A中，PBMC暴露於抗CD28域抗體239-891-D70C或促有絲分裂抗CD28抗體5.11A1。如圖10A所示，在第3日由³[H]-胸苷併入量測細胞增殖，且如圖10B所示量測IL-2產生。

<110> 美商必治妥美雅史谷比公司

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<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 641

<210> 642

<211> 287

<212> DNA

<213> 智人

<400> 642

<210> 643

<211> 95

<212> PRT

<213> 智人

<400> 643

<210> 644

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列之描述：合成6xHis標籤」

<400> 644

Claims

一種域抗體(dAb)，其：(a)與CD28結合；(b)抑制CD28與CD80及/或CD86結合；(c)不與CTLA4交叉反應；及(d)包含與下列序列具有不多於20個胺基酸不同之胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ ID NO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：481、SEQ ID NO：482、SEQ ID NO：483、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617或SEQ ID NO：622。
如請求項1之dAb，其中該dAb包含與該等序列具有10或更少個胺基酸位置不同之胺基酸序列。
如請求項2之dAb，其中該dAb包含與該等序列具有5或更少個胺基酸位置不同之胺基酸序列。
如請求項3之dAb，其中該dAb包含與該等序列具有3或更少個胺基酸位置不同之胺基酸序列。
如請求項4之dAb，其中該dAb包含與該等序列具有1個胺基酸位置不同之胺基酸序列。
如請求項1之dAb，其中該dAb包含選自由下列所組成群之胺基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ ID NO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：481、SEQ ID NO：482、SEQ ID NO：483、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617及SEQ ID NO：622。
如請求項1至6中任一項之dAb，其經格式化(formatted)以延長其活體內半衰期。
如請求項7之dAb，其中該格式化包含使該dAb與聚乙二醇(PEG)藉由聚乙二醇化反應連接。
如請求項8之dAb，其中該dAb具有至少一個選自由以下所組成群之特徵：(a)PEG係經由半胱胺酸或離胺酸殘基連接；(b)PEG係經由半胱胺酸或離胺酸殘基連接，其中該PEG為約10 kD至約50 kD；(c)該dAb具有至少約24 kD之流體動力尺寸；(d)該dAb具有至少約200 kD之流體動力尺寸；(e)該dAb具有約15秒至約12小時之tα半衰期；及(f)該dAb具有約12小時至約744小時之tβ半衰期。
如請求項1至6中任一項之dAb，其中該dAb包含對第一抗原具有結合特異性的第一單一可變域及對第二抗原具有結合活性的第二單一可變域，其中該第一抗原為CD28，其中該第二抗原為非CD28之抗原。
如請求項10之dAb，其中該第二抗原為抗原呈現細胞表面抗原或T細胞表面抗原；或其中該第二抗原為細胞激素。
一種核酸，其編碼如請求項1至6中任一項之dAb。
一種如請求項1至11中任一項之dAb之用途，其係用於製備治療患者之藥物，其中該患者患有免疫疾病或具有患免疫疾病之風險。
如請求項13之用途，其中該免疫疾病為自體免疫疾病或移植相關疾病。
如請求項14之用途，其中該移植相關疾病係選自由同種異體移植排斥反應、異種移植物移植排斥反應及移植物抗宿主疾病組成之群；或其中該自體免疫疾病係選自由以下組成之群：全身性紅斑狼瘡症、多發性硬化症、類風濕性關節炎、糖尿病、牛皮癬、硬皮病、動脈粥樣硬化、發炎性腸疾病及潰瘍性結腸炎。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至11中任一項之dAb及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項16之醫藥組合物，其另外包含免疫抑制/免疫調節及/或消炎劑。