CN115380047A - Cd28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了特异性结合CD28的结合多肽。更具体地，本文提供了融合蛋白，其包括至少结合CD28的多价和/或多特异性构建体。还提供了含有所述多肽的药物组合物，编码所述多肽的核酸分子及其载体，以及所提供的CD28结合多肽用于治疗疾病和病症如癌症的使用方法和用途。

Description

CD28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月29日提交的标题为“CD28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体(CD28 SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND MULTIVALENT AND MULTISPECIFICCONSTRUCTS THEREOF)”的美国临时申请号62/967,533的优先权，出于所有目的将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用序列表并入
本申请是与电子形式的序列表一起提交的。序列表以2021年1月28日创建的名为744952001540SeqList.TXT的文件提供，其大小为327,680字节。将电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本总体上提供了特异性结合分化簇28(CD28)的结合多肽。更具体地，本公开文本涉及融合蛋白，其包括至少结合CD28的多价和/或多特异性构建体。本公开文本还提供了编码所述多肽的核酸分子及其载体，以及所提供的CD28结合多肽用于治疗疾病和病症例如癌症的使用方法和用途。
背景技术
分化簇28(CD28)是免疫球蛋白(Ig)超家族的同二聚体跨膜糖蛋白，其主要由T谱系细胞表达。CD28提供参与T细胞活化和存活的共刺激信号。T细胞对抗人类多种癌症的作用使CD28成为理想的治疗靶点。然而，一些CD28激动剂已在体内导致显著毒性。因此需要改进的靶向CD28的治疗分子。本文提供满足此类需要的实施方案。
发明内容
本文提供了具有结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb含有：具有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；具有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及具有选自SEQID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
本文还提供了具有结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
本文还提供了具有结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb含有：具有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，具有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，以及具有选自SEQ IDNO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
本文还提供了含有结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
本文还提供了含有结合CD28的至少一种单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中CD28 VHH结构域含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
本文还提供了含有结合CD28的至少一种单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb结构域包含如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
本文还提供了含有结合CD28的至少一种单域抗体(sdAb)(CD28 VHH)的CD28结合多肽，其中CD28 VHH结构域含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中的含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
本文还提供了含有结合CD28的至少一种单结构域抗体(sdAb)的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:214所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:215所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:216所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:221所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:222所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:223所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:224所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:225所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:226所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:228所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:229所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:230所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:231所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:232所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:233所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:234所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:235所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:236所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:237所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:238所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:239所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:342所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:343所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:344所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:345所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:346所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:347所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:348所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:349所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:350所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:351所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:352所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:353所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:354所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:355所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:356所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:357所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:358所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:359所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:360所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:361所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:362所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:363所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:365所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:366所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:367所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:368所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:369所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:370所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:371所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:372所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:373所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:374所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:375所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:376所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:377所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:378所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:379所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:380所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:381所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:382所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:383所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:384所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:385所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:187所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:187的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:188所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:188的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；含有SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及含有SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ IDNO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；分别为SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ IDNO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb含有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；分别为SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ IDNO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ IDNO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb含有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是一个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是一个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是一个CD28 sdAb并且所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。
在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是两个、三个或四个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是多价的。在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是两个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是两个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。在一些实施方案中，所述至少一个sdAb是两个CD28 sdAb并且所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb是相同的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述两个CD28sdAb均含有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的每一个均含有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28sdAb均含有SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的每一个均含有SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28sdAb均含有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的每一个均含有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28sdAb是不同的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的一个含有SEQ IDNO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个含有SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的一个含有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个含有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb中的一个含有SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个含有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括结合蛋白A的部分。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有降低与蛋白A的结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，根据Kabat定义的氨基酸修饰G65D在框架区3(FR3)中。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽含有免疫球蛋白Fc区。
本文还提供了含有本文所述的任何CD28结合多肽和免疫球蛋白Fc区的抗CD28sdAb-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，所述Fc区通过连接肽(LP)连接至至少一个CD28 sdAb中的至少一个。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb通过连接肽(LP)在Fc区的N末端处连接至Fc区。在一些实施方案中，所述LP是不可切割接头。在一些实施方案中，所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(CD28 sdAb)-LP-Fc。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(CD28 sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
在一些实施方案中，所述C28结合多肽是二聚体。
在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区含有选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区展现出效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有降低效应子功能的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰，所述效应分子选自Fcγ受体和C1q。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与C1q的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu234的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu235的缺失。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成。
本文提供了同二聚体Fc融合蛋白，其含有本文所述的任何抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白的两个相同拷贝。
本文还提供了异二聚体Fc融合蛋白，其含有本文所述的任何两个抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽含有一个或多个结合CD28以外的靶抗原的结合结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域是一个或多个结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括结合蛋白A的部分。
本文还提供了多特异性结合多肽，其包含任何所提供的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白以及一个或多个结合CD28以外的靶抗原的结合结构域(BD)。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD是一个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是两个、三个、四个或更多个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是两个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是三个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是四个BD。
在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)结合T细胞激活标记物。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)结合T细胞耗竭标记物。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)结合肿瘤微环境(TME)标记物。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述一个或多个结合结构域(BD)是结合TAA的单结构域抗体。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽是Fc融合蛋白，其中所述一个或多个BD中的至少一个和/或所述至少一个CD28 sdAb连接至免疫球蛋白Fc区。
本文提供了多特异性Fc融合蛋白，其包含任何所提供的多特异性结合多肽和免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽是Fc融合蛋白，其中所述一个或多个BD中的至少一个和/或所述至少一个CD28 sdAb连接至免疫球蛋白Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc融合蛋白从N末端到C末端含有：一个或多个结合CD28以外的靶抗原的BD；至少一个包含结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及Fc区。在一些实施方案中，所述一个或多个BD中的至少一个通过连接肽(LP)与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(BD)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽是二聚体。
在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区含有选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区含有展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区展现出效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有降低效应子功能的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰，所述效应分子选自Fcγ受体或C1q。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与C1q的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu234的缺失。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu235的缺失。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成。
在所提供的任何实施方案中，所述结合结构域(BD)结合选自以下的抗原：1-92-LFA-3，2B4，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，α-SMA，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD69，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD107a，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD160，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，FSP-1，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HLA-DR，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2，KISS1-R，KLRG1，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/K ATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
在一些实施方案中，所述T细胞激活标记物选自CD25、CD44、CD69、CD71、CD107a、CD137、HLA-DR和/或KLRG1。在一些实施方案中，所述T细胞耗竭标记物选自2B4、CD160、LAG3、PD-1和/或TIGIT。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境标记物选自α-SMA、EDB、FAP、FSP-1、PDGFRα和/或PDGFRβ。
在一些实施方案中，所述一个或多个TAA BD是一个TAA BD和/或所述多特异性结合多肽对于TAA是单价的。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA BD是两个、三个或四个TAA BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或个TAA是多价的。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA BD是两个TAA BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或多个TAA是二价的。在一些实施方案中，所述两个TAA BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是相同的TAA sdAb。在一些实施方案中，所述两个TAA BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是结合相同TAA的不同TAA sdAb。在一些实施方案中，所述不同的TAA sdAb结合相同TAA的不同表位。在一些实施方案中，所述两个TAA BD是单结构域抗体(sdAb)并且所述两个sdAb是结合不同TAA的不同TAA sdAb。
本文还提供了同二聚体多特异性Fc融合蛋白，其含有任何所提供的多特异性多肽的两个相同拷贝。
本文还提供了异二聚体多特异性Fc融合蛋白，其含有任何两个所提供的多特异性多肽。
在任何所提供的实施方案中，所述Fc融合蛋白含有在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与Fc区之间的连接肽。在一些实施方案中，所述Fc融合蛋白含有在所述一个或多个BD中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。在一些实施方案中，所述接头是不可切割的。在一些实施方案中，所述接头是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，含有SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、244和249中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，由SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、244和249中任一个所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个BD中的至少一个与其抗原结合。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非一个或多个BD中的每一个与其抗原结合。
本文还提供了CD28结合多肽，其从N末端到C末端含有：一个或多个含有结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)的抗原结合结构域；至少一个含有结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及Fc区。
在任何所提供的实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个通过连接肽(LP)与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(TAA sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是二聚体。在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。
本文还提供了CD28结合多肽，其从N末端到C末端含有：一个或多个具有结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)的抗原结合结构域；至少一个具有结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及Fc区，其中所述CD28结合多肽是含有同二聚体Fc区的二聚体。
在一些实施方案中，所述Fc区含有选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区展现出效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有降低效应子功能的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰，所述效应分子选自Fcγ受体或C1q。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与C1q的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu234的缺失。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu235的缺失。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成。
在任何所提供的实施方案中，所述TAA选自：1-92-LFA-3，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2，KISS1-R，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/KATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是一个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于TAA是单价的。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是两个、三个或四个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是两个TAAsdAb。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是三个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是四个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于一个或多个TAA是多价的。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb是两个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于TAA是二价的。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽对于一个或多个TAA是二价的。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb是相同的TAAsdAb。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb是结合相同TAA的不同TAA sdAb。在一些实施方案中，所述TAA sdAb结合相同TAA的不同表位。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb是结合不同TAA的不同TAA sdAb。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽含有在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽含有在所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。在一些实施方案中，所述LP是不可切割接头。在一些实施方案中，所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述LP是或含有SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、244和249中任一个所示的序列。
在任何所提供的实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。在任何所提供的实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。在任何所提供的实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的每一个均与其TAA结合。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的每一个均与其TAA结合。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的每一个均与其TAA结合。
在任何所提供的实施方案中，所述CD-28结合多肽不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述同二聚体Fc融合蛋白不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述异二聚体Fc融合蛋白不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述同二聚体多特异性结合多肽不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述异二聚体多特异性结合多肽不含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述融合蛋白不含有CD3结合区。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括CD3结合区。
本文提供了含有至少一个CD28 sdAb和CD3结合区的CD28结合多肽。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；具有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及具有选自SEQ ID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ IDNO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ IDNO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；具有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及具有选自SEQ ID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ IDNO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ IDNO:199所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ IDNO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；具有SEQID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或具有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中所含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ IDNO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:370所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:383所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中包含的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb结构域包含如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中所含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)含有：如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3：如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:214所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:215所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:216所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:221所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:222所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:223所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:224所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:225所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:226所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:228所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:229所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:230所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:231所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:232所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:233所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:234所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:235所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:236所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:237所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:238所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:239所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:342所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:343所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:344所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:345所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:346所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:347所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:348所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:349所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:350所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:351所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:352所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:353所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:354所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:355所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:356所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:357所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:358所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:359所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:360所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:361所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:362所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:363所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:365所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:366所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:367所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:368所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:369所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:370所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:371所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:372所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:373所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:374所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:375所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:376所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:377所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:378所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:379所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:380所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQID NO:381所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ IDNO:382所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:383所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:384所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:385所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:187所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:187的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下所示的序列：(i)SEQ IDNO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:188所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:188的人源化变体。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ IDNO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；分别为SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ IDNO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ IDNO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：具有SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及具有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；分别为SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ IDNO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ IDNO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方案中，所述CD28结合多肽含有CD3结合区。在一些实施方案中，所述抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述同二聚体Fc融合蛋白包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述异二聚体Fc融合蛋白包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述同二聚体多特异性结合多肽包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述异二聚体多特异性结合多肽包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述融合蛋白包括CD3结合区。
本文提供了多特异性构建体，其含有至少一种所提供的sdAb、一个或多个结合CD28以外的抗原的结合结构域(BD)、以及CD3结合区。在一些实施方案中，所述BD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述BD是单结构域抗体。
在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗CD3抗体。在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗CD3抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述CD3结合区是单价的。在一些实施方案中，所述CD3结合区是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的可变片段(Fv)。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链可变片段(scFv)。
在任何所提供的实施方案中，所述CD28结合多肽含有免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区含有选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1的。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区展现出效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有降低效应子功能的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与效应分子的结合的一个或多个氨基酸修饰，所述效应分子选自Fcγ受体和C1q。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc区含有多肽，所述多肽具有减少与C1q的结合的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu234的缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Leu235的缺失。在一些实施方案中，所述Fc区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是二聚体。在一些实施方案中，所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
在一些实施方案中，所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。在一些实施方案中，所述CD3结合区不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。在一些实施方案中，所述CD3结合区基本上不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。在一些实施方案中，所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。在一些实施方案中，所述CD3结合区不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。在一些实施方案中，所述CD3结合区基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括结合蛋白A的部分。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的氨基酸修饰G65D。
本文还提供了抗CD28单结构域抗体，其含有：具有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；含有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及含有选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
本文还提供了抗CD28 sdAb，其含有：含有选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；含有选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及含有选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有：含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或含有SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，含有SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:213所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ IDNO:214所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:215所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:216所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:221所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:222所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:223所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:224所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:225所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:226所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:228所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:229所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:230所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:231所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:232所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:233所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:234所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:235所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:236所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:237所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:238所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:239所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:342所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:343所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:344所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:345所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:346所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:347所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:348所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:349所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:350所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:351所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:352所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:353所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:354所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:355所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:356所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:357所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:358所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:359所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:360所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:361所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:362所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:363所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:365所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:366所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:367所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:368所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:369所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:370所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:371所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:372所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:373所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:374所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:375所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:376所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:377所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:378所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:379所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28sdAb含有SEQ ID NO:380所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQID NO:381所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:382所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:383所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:384所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 sdAb含有SEQ ID NO:385所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗CD28 sdAb是分离的。在一些实施方案中，所述抗CD28sdAb是纯化的。
在一些实施方案中，所述CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述至少一个CD28 sdAb包含框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的氨基酸修饰G65D。
本文提供了编码抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白和多特异性结合多肽以及本文所述的多特异性构建体中的任一种的多核苷酸。
本文还提供了多核苷酸，其含有编码本文提供的任何CD28结合多肽的第一多肽的第一核酸序列和编码所述CD28结合多肽的第二多肽的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。还提供了多核苷酸，其含有编码本文提供的任何CD28结合多肽的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。
本文还提供了多核苷酸，其含有编码本文提供的任何融合蛋白的第一多肽的第一核酸序列和编码所述融合蛋白的第二多肽的第二核酸序列。本文还提供了多核苷酸，其含有编码本文提供的任何多特异性结合多肽的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性结合多肽的第二多肽的第二核酸序列。本文还提供了多核苷酸，其含有编码本文提供的任何多特异性构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列。
在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方案中，所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
本文提供了载体，其包含本文所述的任何多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体或真核载体。在一些实施方案中，所述真核载体是哺乳动物载体。
本文提供了细胞，其含有本文所述的任何一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
本文提供了产生多肽的方法，所述方法包括将本文提供的任何一种或多种多核苷酸或本文提供的任何一种或多种载体引入细胞，并在条件下培养所述细胞以产生抗CD28sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽或多特异性构建体。在一些实施方案中，所述方法包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的多肽。
本文提供了药物组合物，其包含所描述的抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体中的任一种。在一些实施方案中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。
本文提供了刺激受试者中免疫反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体或药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述免疫反应是针对肿瘤或癌症增加的。在一些实施方案中，所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
本文还提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体或药物组合物中的任一种。
本文还提供了任何本文所述的抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体或药物组合物的用途。本文提供了任何所提供的多特异性结合多肽的用途。本文提供了任何所提供的多特异性构建体的用途。本文提供了任何所提供的药物组合物的用途。
还提供了包含本文所述的抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体或药物组合物中的任一种的组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症。本文提供了包含多特异性结合多肽的组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症。本文提供了包含多特异性缀合物的组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症。
还提供了本文所述的抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合多肽和多特异性构建体或药物组合物中的任一种，其用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物。本文提供了包含多特异性结合多肽的组合物，其用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物。本文提供了包含多特异性缀合物的组合物，其用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述受试者是人。
附图说明
图1描绘了形式为sdAb-IgG1的CD28靶向性单结构域抗体结合细胞表面CD28的能力。使用HEK293FS(293FS)细胞通过流式细胞术评估结合，所述细胞用全长人(hCD28)或食蟹猴(cyCD28)抗原(分别为图1A和1B)瞬时转染。作为阴性对照，还测试了与CD28未转染的293FS细胞的结合(图1C)。将单结构域抗体1C9使用具有降低的效应子功能的Fc结构域形式化为sdAb-xELL，并测试与Jurkat细胞或原代T细胞(从自正常供体全血中分离的PBMC中富集，二者均内源性表达CD28)的结合(分别为图1D和1E)。
图2A-2I描绘了1C9及其人源化变体结合细胞表面CD28的能力。通过流式细胞术评估与以下各项的结合：用全长人(hCD28)或食蟹猴(cyCD28)抗原转染的HEK293FS(293FS)细胞(图2A、2B、2D、2E)、未转染的HEK293FS细胞(图2C和2F)、内源性表达CD28的Jurkat细胞(图2G-2H)或从自正常供体全血中分离的PBMC中富集的原代T细胞(图2I)。
图3A和3B分别描绘了没有Fc结构域以及具有Fc结构域的示例性CD28结合多肽。
图3C-3H描绘了生成的示例性构建体结合细胞表面CD28、PDL1和/或5T4的能力。通过流式细胞术评估与以下各项的结合：用PDL1瞬时转染的HEK293FS(293FS)细胞(图3C)，内源性表达5T4的T47D细胞(图3F)，内源性表达CD28的Jurkat细胞(图3D和3G)或不表达PDL1、5T4或CD28的Raji细胞(图3E和3H)。
图4A描绘了形式为二价sdAb-IgG1的CD28靶向性单结构域抗体1C12和1F10(而不是2F11、1G7和1C9)增强基于Jurkat的报告细胞系的激活的能力，在该细胞系中，IL-2启动子通过激活抗CD3抗体驱动萤光素酶的产生。图4B描绘了交联(XL)1C9-IgG1(代表1C9的多聚体，其化合价大于2)刺激报告细胞的能力。
图4C和4D描绘了TAAxCD28双特异性蛋白以TAA依赖性方式使CD3(IL-2)Jurkat报告细胞上的CD28激动的能力。图4C描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性构建体cx694以PDL1依赖性方式使CD3(IL-2)Jurkat报告细胞上的CD28激动的能力，如通过其在PDL1阳性CHO-K1细胞(PromegaTM)存在(而不是缺乏)的情况下增加所述报告细胞的激活所证明的。与存在或不存在表达PDL1的靶细胞系的未经处理的对照相比，单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体并未显著增强报告细胞系的激活。图4D描绘了靶向5T4和CD28的双特异性构建体cx8390以5T4依赖性方式使CD3(IL-2)Jurkat报告细胞上的CD28激动的能力，如通过其在5T4阳性T47D细胞存在(而不是缺乏)的情况下增加所述报告细胞的激活所证明的。与未经处理的对照相比，仅报告细胞的处理或者T47D细胞和报告细胞与靶向CD28的单特异性蛋白(cx8394)的共同培养不会增强报告细胞系的激活。
图5描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性构建体cx694诱导PDL1+细胞系A549(图5A和5C)、但不诱导PDL1-细胞系HEK293FS(293FS)(图5B和5D)的T细胞介导细胞毒性的能力，如通过使用细胞成像系统的半胱天冬酶-3/7激活(图5A和5B)和使用CellTiter-Glo测定的细胞存活(图5C和5D)所评估的。单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体缺乏针对A549和239FS细胞两者的细胞毒性活性(图5A-5D)。
图6A-6D描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性蛋白cx694诱导CD4+(图6A-6C)和CD8+(图6D)T细胞的抗原特异性激活的能力，如通过流式细胞术分析激活标记物CD25(图6A)、CD69(图6B和6D)和CD71(图6C)所评估的。单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体在存在任何靶细胞系的情况下都不会激活任何T细胞子集。A549和293FS细胞分别用作PDL1+和PDL1-细胞。图6E描绘了用cx694处理的A549/T细胞共培养物导致IFNγ产生减少。cx5185是一种CD3刺激性蛋白质，可作为该实验的阳性对照。
图7A-7C描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性构建体共同刺激原代T细胞的能力。图7A描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性构建体cx8370增强CEF(巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒)肽池处理的PBMC产生IFNγ的能力，如通过FluoroSpot所评估的。单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx984)的单特异性构建体不会影响受刺激的PBMC产生的细胞因子水平。图7B和7C描绘了靶向PDL1和CD28的双特异性构建体cx694诱导富集的T细胞和自体未成熟树突细胞(iDC)的共培养物产生TNFα的能力。图7B和图7C描绘了两种不同的效应细胞供体Leuko Pack的反应。单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体不会诱导任何一个供体的较强细胞因子反应。
图8A和8B描绘了固定化的阳性对照抗CD3(OKT3)和抗CD28(TGN1412)抗体在预培养的高密度PBMC中诱导CD4+ T细胞产生TNFα的能力，而含有示例性sdAb 1C9(cx694、cx8370和cx984)的固定化蛋白在该细胞群中并未以高于未处理的对照样品的水平诱导TNFα的产生。图8A和图8B描绘了两种不同的PBMC供体Leuko Pack的反应。
具体实施方式
本文提供了特异性结合CD28的多肽，下文也称为CD28结合多肽。在一些实施方案中，所提供的结合多肽含有至少一种结合CD28的单结构域抗体(sdAb；例如VHH结构域)。本文提供的CD28结合多肽包括单价和多价(例如二价)构建体。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个各自单独结合CD28的VHH结构域。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有一个、两个、三个或四个结合CD28的VHH结构域。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有两个结合CD28的VHH结构域。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有一个结合CD28的VHH结构域。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有单个结合CD28的VHH结构域。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是单特异性的。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是多特异性的。例如，所提供的CD28结合多肽包括如下多肽，所述多肽可以含有至少一个结合CD28的VHH结构域和一个或多个另外的结合结构域，如一个或多个结合一个或多个CD28以外的靶抗原的另外的VHH结构域。在特定实施方案中，所述靶抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽作为Fc融合蛋白提供。在一些实施方案中，CD28结合多肽含有至少一个结合CD28的VHH结构域和Fc结构域。在一些实施方案中，CD28结合多肽含有至少一个结合CD28的VHH结构域、至少一个结合另一种靶抗原(例如TAA)的其他结合结构域(例如VHH)以及Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域在生理条件下介导CD28结合多肽的二聚化，从而形成二聚体，所述二聚体使CD28结合位点的数量加倍，也可以使其他抗原结合结构域(如果存在)的数量加倍。例如，包含一个结合CD28的VHH结构域和Fc区的结合CD28的多肽作为单体是单价的，但是在生理条件下，所述Fc区可以介导二聚化，使得所述CD28结合多肽在此类条件下作为二价二聚体存在。
CD28是免疫球蛋白(Ig)超家族的同二聚体跨膜糖蛋白，其由T细胞组成型表达。CD28的主要结合配偶体是CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，它们又可以结合多种受体，如CTLA4。Esensten等人,Immunity(2019)44(5):973-88。CD28为T细胞提供了共刺激性激活信号，该信号对T细胞的增殖和效应子功能非常重要。同上。CD28共刺激信号提供了次级信号以通过抗原受体复合物(TCR/CD3)增强初级信号传导，从而激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)，所述CD8+细胞毒性T细胞提供针对癌症的适应性免疫反应并进行肿瘤特异性免疫反应。Huff等人,International Journal of Molecular Sciences(2019)20(11):2810。此外，在CTL介导的肿瘤杀伤无效的情况下，已经鉴定出具有CD28低表达的CD8+ T细胞。同上。
典型人CD28的示例性序列如下所示(SEQ ID NO:86，例如UniProt编号P10747)：
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28的激动已显示可促进T细胞的活性，这可能产生有效的免疫疗法以激活针对肿瘤的有效免疫反应，从而治疗癌症。然而，某些CD28激动剂的问题是它们可能具有超级激动剂活性，从而导致CD28激动与TCR信号传导无关。在一些情况下，如果没有T细胞受体的其他刺激和可测量的促炎反应，这可能会导致T细胞的扩增。例如，超级激动剂单克隆抗体TGN1412导致施用其的健康人类患者的严重细胞因子风暴(Suntharalingam等人N Engl JMed 2006；355:1018-1028)。因此，需要更安全的改善的CD28激动剂。
本文提供了结合CD28但未展现出CD28激动剂活性的单特异性/二价形式的VHH结构域。此类CD28结合VHH结构域可以以多种结合形式掺入，以展现出所需的免疫活性。提供了多种CD28多肽结合形式，参见例如图3A和3B。
在所提供的CD28结合多肽中，存在能够结合并介导CD28依赖性信号传导的多肽。在一些情况下，所提供的CD28结合多肽直接接合和/或激动CD28的活性，其在一些方面可以用作增加T细胞抗肿瘤活性的治疗剂。
在特定实施方案中，本文提供了多特异性条件性CD28结合多肽，所述多肽含有至少一个结合CD28的VHH结构域和至少一个结合另一种抗原的结合结构域，所述另一种抗原如肿瘤相关抗原(TAA；例如PD-L1或5T4)或肿瘤微环境(TME)中存在的另一种抗原。在一些情况下，所述结合多肽包括对CD28和肿瘤相关抗原(TAA，如PDL1或5T4)展现出双重亲和力的多肽。在一些情况下，所述结合多肽包括对CD28和微环境中存在的另一种抗原(如T细胞耗竭标记物、T细胞激活标记物或TME标记物)展现出双重亲和力的多肽。所提供的多特异性条件性CD28结合多肽仅当与存在于细胞(例如肿瘤细胞)表面的另一种抗原结合且T细胞活性与CD3接合无关时，才展现出CD28激动剂活性。在一些方面，此类双重亲和力分子能够在结合肿瘤表达的TAA(例如PDL1或5T4)后在肿瘤部位接合或激活T细胞。在一些方面，此类双重亲和力分子能够在结合T细胞表达的激活或耗竭标记物后在肿瘤部位接合或激活T细胞。在一些方面，此类双重亲和力分子能够在结合TME中的细胞表达的抗原后在肿瘤部位接合或激活T细胞。特别地，在本文提供的此类分子中，存在展现出条件性CD28结合和/或接合的分子。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是多特异性的，并且在TAA不与所述多特异性多肽结合的情况下，其共刺激T细胞的能力被阻断或降低。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽仅当所述多特异性多肽与TAA结合时才能共刺激T细胞。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽仅当所述多特异性多肽与TME中的抗原结合时才能共刺激T细胞。
在一些实施方案中，所述多特异性条件性CD28结合分子包括对于CD28是单价的形式以及对于另一种抗原(例如TAA)是单价或多价(例如二价)的形式。在其他实施方案中，所述多特异性条件性CD28结合分子包括对于CD28是多价(例如二价)的形式以及对于另一种抗原(例如TAA)是单价或多价(例如二价)的形式。在特定实施方案中，所提供的多特异性条件性CD28结合多肽作为与Fc的融合蛋白提供，以产生两个多肽链的二聚体。
本文还提供了形式为多特异性多肽构建体的接合T细胞的融合蛋白，其含有至少一个(并且通常只有一个)结合CD28的VHH、CD3结合区以及至少另一种抗原(例如TAA)。在特定实施方案中，所提供的接合T细胞的融合蛋白以Fc区N末端结合至CD3结合区的形式提供。所提供的多特异性多肽构建体展现出受限的T细胞接合活性，因为一旦抗原经由抗原结合结构域结合，此类构建体就仅基本上与CD3结合。此独特特性允许受限CD3接合蛋白分布至存在另一种抗原(例如TAA)的位点。此形式与其他CD3接合多特异性构建体的不同之处在于不允许或消除组成型CD3结合，从而通过避免外周T细胞结合并允许优先分布至存在如由抗原结合结构域识别的抗原的一个或多个部位来提供显著益处。在一些方面，所提供的多特异性多肽构建体的受限T细胞接合活性归因于Fc区在CD3结合区的N末端的定位。在一些实施方案中，这种定位降低、减弱、阻抑和/或防止由CD3结合区进行的CD3结合。在不存在由抗原结合结构域进行的抗原结合的情况下，本文提供的多特异性多肽构建体展示出降低或消除的CD3结合和T细胞激活能力。在所提供的多特异性多肽构建体中结合CD28的VHH的存在会在CD3结合区进行CD3共接合并与其他抗原结合(例如TAA)结合之后增加或增强T细胞活性。
在任何所提供的实施方案中，Fc是展现出降低的免疫效应子活性的Fc，如经由一个或多个降低一种或多种效应子功能的突变，所述效应子功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。本文描述了示例性惰性或无效Fc。
在一些实施方案中，所提供的CD28结合多肽可用于刺激受试者的免疫反应，在一些方面，其治疗受试者的疾病或障碍(如癌症)。在一些方面，本文提供的CD28结合多肽(如多特异性条件性CD28结合多肽)可以结合表达CD28的T细胞并刺激T细胞以诱导抗肿瘤活性。在一些情况下，所述CD28激动剂刺激和由此产生的抗肿瘤活性可以导致癌细胞死亡(例如，共刺激的T细胞杀伤癌细胞)。
本文还提供了表达任何所提供的CD28结合多肽的工程化细胞，如工程化T细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞产生并分泌CD28结合多肽。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文所述或参考的技术和程序通常是本领域技术人员很好理解和使用常规方法通常使用的，例如像在以下文献中所述的广泛使用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约州CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑,(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Harlow和Lane编辑(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑,1987；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell andTissue Culture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999))；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.LippincottCompany,1993)；以及其更新版本。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另外定义，否则结合本公开文本使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求或明确指示，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。对于各种来源或参考文献之间的任何定义冲突，以本文提供的定义为准。
应理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。除非另外指示，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。在本文中术语“或”的使用并不意在暗示替代方案是相互排斥的。
在本申请中，除非本领域技术人员明确说明或理解，否则“或”的使用意指“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用回指多于一项前述独立或从属权利要求。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以可互换地使用，并且是指核苷酸的聚合物。核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指核酸分子或多核苷酸中所包含的核苷酸的线性序列。
如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成起源或其某种组合的多核苷酸，根据其起源，所述“分离的多核苷酸”(1)不与在自然界中发现其所在的多核苷酸的全部或一部分相关联，(2)可操作地连接至在自然界中其并不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，用于本公开文本的目的，“多肽”是指相对于天然序列包括修饰(如缺失、添加和取代)的蛋白质(通常在本质上是保守的)，只要所述蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
本文所提及的术语“分离的蛋白质”意指主题蛋白质(1)不含通常会在自然界中和其一起发现的至少一些其他蛋白质，(2)本质上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中和其相关联的其他材料分离，(5)与在自然界中和“分离的蛋白质”相关联的蛋白质部分不相关联(通过共价或非共价相互作用)，(6)与在自然界中和其不相关联的多肽可操作地相关联(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然界中不存在。这样的分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA编码，或者可以是合成起源的，或其任何组合。在某些实施方案中，分离的蛋白质是基本上纯的或基本上不含在其天然环境中发现的会干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或其他方式)的蛋白质或多肽或其他污染物。
如本文所用，“基本上纯的”意指目标种类是存在的主要种类(即，基于摩尔，其比组合物中的任何其他单独种类更丰富)，并且基本上纯化的级分是这样的组合物，其中目标种类占存在的所有大分子种类的至少约50％(基于摩尔)。通常，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物质的多于约80％，例如，在一些实施方案中，多于约85％、90％、95％和99％。在一些实施方案中，将目标种类纯化至本质上同质(通过常规检测方法不能检测到组合物中的污染种类)，其中组合物本质上由单一大分子种类组成。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指如此描述的组分的位置处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列表达的方式连接。
术语“特异性结合”至抗原或表位是本领域熟知的术语，并且确定这种特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果与分子和替代细胞或物质反应或相关联的情况相比，所述分子与特定细胞或物质更频繁地、更快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力反应或相关联，则称所述分子展现出“特异性结合”或“优先结合”。如果与单结构域抗体(sdAb)或含有VHH的多肽与其他物质结合的情况相比，所述抗体或多肽以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间与靶标结合，则所述抗体或多肽与所述靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性或优先与CD28表位结合的sdAb或含有VHH的多肽是这样的sdAb或含有VHH的多肽，其与其他CD28表位或非CD28表位结合相比以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合此表位。通过阅读此定义还应理解例如，特异性或优先与第一靶标结合的sdAb或含有VHH的多肽可以或可以不特异性或优先与第二靶标结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管可以包括)专一结合。通常，但并非必须，对结合的提及意指优先结合。“特异性”是指结合蛋白选择性结合抗原的能力。
如本文所用，术语“表位”是指与抗原结合分子(例如，sdAb或含有VHH的多肽)结合的在靶分子(例如，抗原，如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)上的位点。表位通常包括分子(如氨基酸、多肽或糖侧链)的化学活性表面分组，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由靶分子的连续和/或并置的非连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位可包括但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，表位的长度少于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)、少于15个残基或少于12个残基。如果两种抗体展现出对某种抗原的竞争性结合，则它们可以结合所述抗原内的相同表位。在一些实施方案中，表位可以通过与抗原结合分子上的CDR残基的一定最小距离来鉴定。在一些实施方案中，表位可以通过上述距离来鉴定，并且进一步限于参与抗原结合分子的残基与抗原残基之间的键(例如，氢键)的那些残基。表位也可以通过各种扫描来鉴定，例如丙氨酸或精氨酸扫描可以指示抗原结合分子可以与之相互作用的一个或多个残基。除非明确指出，否则作为表位的一组残基不排除其他残基为特定抗原结合分子的表位的一部分。相反，这样一组的存在表示表位的最小系列(或种类组)。因此，在一些实施方案中，鉴定为表位的一组残基表示与抗原相关的最小表位，而不是抗原上表位的残基的排他列表。
“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白内的非连续多肽、氨基酸和/或糖，对所述表位具有特异性的抗原结合分子与之结合。在一些实施方案中，残基中的至少一个将与表位的其他指出的残基不邻接；然而，残基中的一个或多个也可以与其他残基邻接。
“线性表位”包含抗原蛋白内的连续多肽、氨基酸和/或糖，对所述表位具有特异性的抗原结合分子与之结合。应注意，在一些实施方案中，并非线性表位内的每一个残基都需要由抗原结合分子直接结合(或参与键合)。在一些实施方案中，线性表位可以来自用有效地由线性表位的序列组成的肽的免疫接种，或者来自与蛋白质的其余部分相对分离的蛋白质的结构部分(使得抗原结合分子可以至少主要仅与该序列部分相互作用)。
术语“抗体”和“抗原结合分子”在最广泛的意义上可互换使用，并且涵盖包含抗体样抗原结合结构域的各种多肽，包括但不限于常规抗体(通常包含至少一条重链和至少一条轻链)、单结构域抗体(sdAb，仅包含一条链，通常与重链相似)、含有VHH的多肽(包含至少一个仅重链抗体可变结构域或VHH的多肽)、以及前述任一者的片段，只要它们展现出所需的抗原结合活性即可。在一些实施方案中，抗体包含二聚化结构域。此类二聚化结构域包括但不限于重链恒定结构域(包含CH1、铰链、CH2和CH3，其中CH1通常与轻链恒定结构域CL配对，而铰链介导二聚化)和Fc结构域(包含铰链、CH2和CH3，其中铰链介导二聚化)。
术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(如骆驼科(包括美洲驼)、鲨鱼、小鼠、人、食蟹猴等)的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性，例如单结构域抗体，如VHH。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了常规或完整抗体以外的分子，其包含常规或完整抗体的一部分，所述部分至少含有结合抗原的可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fv、单链Fv(sdFv)、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；仅包含VH区域的单结构域抗体(VHH)。
如本文所用，与结合分子有关的“单价”是指具有单个抗原识别位点的结合分子，所述单个抗原识别位点对靶抗原具有特异性。单价结合分子的例子包括例如单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质结合分子或MHC分子。单价抗体片段的例子包括但不限于Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
如本文所用，与结合分子有关的“单价”是指具有多个(多于一个)对靶抗原具有特异性的抗原识别位点的结合分子。
术语“单结构域抗体”、“sdAb”、“VHH”在本文中互换使用，是指具有单个单体结构域抗原结合/识别结构域的抗体。此类抗体包括骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。在一些实施方案中，VHH包含三个CDR和四个框架区，表示为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在一些实施方案中，VHH可以在N末端或C末端被截短，使得其仅包含部分FR1和/或FR4，或者缺少那些框架区中的一个或两个，只要VHH基本上维持抗原结合和特异性即可。
术语“含有VHH的多肽”是指包含至少一个VHH结构域的多肽。在一些实施方案中，VHH多肽包含两个、三个或四个或更多个VHH结构域，其中每个VHH结构域可以相同或不同。在一些实施方案中，含有VHH的多肽包含Fc结构域。在一些此类实施方案中，VHH多肽可以形成二聚体。含有VHH的多肽的非限制性结构包括VHH1-Fc、VHH1-VHH2-Fc、和VHH1-VHH2-VHH3-Fc，其中VHH1、VHH2和VHH3可以是相同或不同的。在此类结构的一些实施方案中，一个VHH可以通过接头连接至另一个VHH，或者一个VHH可以通过接头连接至Fc。在一些此类实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选1-20个主要由甘氨酸和任选的丝氨酸构成的氨基酸。在一些实施方案中，当含有VHH的多肽包含Fc时，它形成二聚体。因此，如果结构VHH1-VHH2-Fc形成二聚体，则认为它是四价的(即，二聚体具有四个VHH结构域)。类似地，如果结构VHH1-VHH2-VHH3-Fc形成二聚体，则认为它是六价的(即，二聚体具有六个VHH结构域)。
如本文所用，CD28结合多肽是特异性结合CD28的多肽或蛋白质。典型地，本文的CD28结合多肽是含有VHH的多肽，其含有至少一个结合CD28的VHH结构域。CD28结合多肽包括缀合物，所述缀合物包括融合蛋白。CD28结合多肽包括融合蛋白，所述融合蛋白包括含有Fc结构域的那些融合蛋白。在一些实施方案中，CD28结合多肽含有两个、三个或四个或更多个均特异性结合CD28的VHH结构域，其中每个VHH结构域可以相同或不同。在一些实施方案中，CD28结合多肽是多价的。在一些实施方案中，CD28结合多肽是多特异性的。在一些情况下，CD28结合多肽可以含有一个或多个结合CD28以外的一个或多个其他抗原的其他结构域。
术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群体中的一种抗体(包括sdAb或含有VHH的多肽)，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，单克隆抗体样品可以与抗原上的相同表位结合。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(如美国专利号4,816,567中所述)制备。例如，还可以从使用McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554中描述的技术产生的噬菌体文库中分离单克隆抗体。
术语“CDR”表示如通过本领域技术人员的至少一种鉴定方式定义的互补决定区。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区序列长度，其中通过插入字母(例如，“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的方案。
在一些实施方案中，CDR可以根据Chothia编号方案、Kabat编号方案、Kabat和Chothia的组合、AbM定义和/或接触定义中的任一种来定义。VHH包含三个CDR，表示为CDR1、CDR2和CDR3。下表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出了残基编号。FR位于CDR之间，例如其中FR-H1位于CDR-H1之前，FR-H2位于CDR-H1与CDR-H2之间，FR-H3位于CDR-H2与CDR-H3之间等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化。
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1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖如由任何上述方案所定义的一个(或特定)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VHH氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这样的CDR具有VHH内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何上述方案所定义的。在一些实施方案中，规定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述了所提供抗体的示例性CDR序列(参见例如表1)，尽管应理解所提供的抗体可以包括根据上述其他编号方案中的任一种或本领域技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而生成的化合物。例如，直接或间接地与一个或多个化学部分或多肽连接的VHH结构域是示例性缀合物。这种缀合物包括融合蛋白、由化学缀合物产生的那些融合蛋白和通过任何其他方法产生的那些融合蛋白。
免疫球蛋白Fc融合物(“Fc融合物”)，如VHH-Fc，是包含一个或多个与免疫球蛋白的Fc区可操作地连接的VHH结构域的分子。免疫球蛋白Fc区可以间接或直接地与一个或多个VHH结构域连接。各种接头是本领域已知的，并且可以任选地用于将Fc与融合配偶体连接以产生Fc融合物。在一些此类实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选1-20个主要由甘氨酸和任选的丝氨酸构成的氨基酸。相同种类的Fc融合物可二聚化以形成Fc融合物同二聚体，或使用不同种类形成Fc融合物异二聚体。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，如人Fc。
如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、铰链、CH2和CH3的区域。当然，除非另外指明，否则结构域内的非功能改变性缺失和改变涵盖在术语“重链恒定区”的范围内。非限制性的示例性的重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性的示例性的重链恒定区还包括ε和μ。每个重恒定区对应于一种抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为子类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
如本文所用的“Fc区”是指重链恒定区的包含CH2和CH3的部分。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。在各种实施方案中，当Fc区包含铰链时，所述铰链介导两个含有Fc的多肽之间的二聚化。Fc区可以属于本文讨论的任何抗体重链恒定区同种型。在一些实施方案中，Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞激活等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用各种测定进行评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A同种异型和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列，但仍保留天然序列Fc区的至少一种效应子功能。在一些实施方案中，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有在天然序列Fc区或在亲本多肽的Fc区中的至少一个氨基酸取代，例如从约一至约十个氨基酸取代，优选从约一至约五个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，与其至少约90％的序列同一性，与其至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
通常，免疫球蛋白重链或其部分(如Fc区)中残基的编号是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州(1991)中的EU索引中的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcγR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括那些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，所述受体具有主要在其胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。例如，在以下文献中对FcR进行了审查：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些。例如，术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的稳态。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。
如本文所用的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如本文所讨论的。源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，在单个抗原结合结构域(如VHH)中的全部人框架中，氨基酸变化的数量为少于10、或少于9、或少于8、或少于7、或少于6、或少于5、或少于4、或少于3。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化受体，其经由抗原结合结构域将抗原特异性引入工程化了的细胞(例如T细胞，如幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合)上，从而将抗原结合结构域的抗原结合特性与T细胞的T细胞活性(例如裂解能力和自我更新)结合起来。CAR通常包括细胞外抗原结合结构域(胞外域(ectodomain))、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常含有至少一个ITAM信号传导结构域，例如源自CD3ζ，并且任选地含有至少一个共刺激信号传导结构域，例如源自CD28或4-1BB。在本文提供的CAR中，VHH结构域形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
“亲和力”是指分子(例如，抗体或含有VHH的多肽)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力或表观亲和力通常可以分别由解离常数(KD)或KD-表观表示。可以通过本领域已知的常用方法(例如ELISA KD、KinExA、流式细胞术和/或表面等离子体共振装置)(包括本文所述的那些)测量亲和力。此类方法包括但不限于涉及
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或流式细胞术的方法。
如本文所用，术语“KD”是指抗原结合分子/抗原相互作用的平衡解离常数。当本文使用术语“KD”时，它包括KD和KD-表观。
在一些实施方案中，抗原结合分子的KD是使用表达抗原的细胞系通过流式细胞术并将在每个抗体浓度下测量的平均荧光拟合到非线性单位点结合方程(Prism Softwaregraphpad)来测量。在一些此类实施方案中，KD是KD-表观。
术语“生物活性”是指分子的任何一种或多种生物学特性(无论是在体内发现的天然存在的，还是通过重组方式提供或实现的)。生物学特性包括但不限于结合配体、诱导或增加细胞增殖(如T细胞增殖)、以及诱导或增加细胞因子的表达。
“亲和力成熟的”含有VHH的多肽是指与不具有此类改变的含有VHH的亲本多肽相比，在一个或多个CDR中具有一个或多个改变的含有VHH的多肽，此类改变导致含有VHH的多肽对于抗原的亲和力提高。
如本文所用的“人源化VHH”是指一个或多个框架区已经基本上被人框架区替代的VHH。在一些情况下，人免疫球蛋白的某些框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化VHH可以包含在原始VHH和人框架序列中均未发现的、但被包括在内以进一步改善和优化VHH或含VHH多肽性能的残基。在一些实施方案中，含有人源化VHH的多肽包含人Fc区。正如应理解的，人源化序列可以通过其一级序列来鉴定，并且不一定表示产生抗体的过程。
如本文所用，术语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个或更多个数值之间足够高的相似度，使得本领域技术人员认为这两个或更多个值之间的差异在由所述值测量的生物学特征的背景下具有很小或者没有生物学和/或统计学显著性。在一些实施方案中，两个或更多个基本上相似的值的差异不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％中的任一个。
多肽“变体”意指在比对序列和引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与天然序列多肽具有至少约80％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括例如在多肽的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％的氨基酸序列同一性。
如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列和引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域技术内的各种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括但不限于用另一种氨基酸替代多肽中的一种氨基酸。示例性取代在表2中示出。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并且筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
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可以根据常见的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一种类别。
术语“载体”用于描述可以被工程化为含有可以在宿主细胞中繁殖的一种或多种克隆的多核苷酸的多核苷酸。载体可以包括一个或多个以下元件：复制起点、调节目的多肽表达的一个或多个调节序列(例如像启动子和/或增强子)和/或一个或多个选择性标记基因(例如像抗生素抗性基因和可以用于比色测定的基因(例如，β-半乳糖苷酶))。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。
“宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞，如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性的示例性的哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、PER.
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细胞(Crucell)以及293和CHO细胞及其衍生物(如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞)。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，所述后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补序列方面)。宿主细胞包括用本文提供的一种或多种多核苷酸在体内转染的细胞。
如本文所用的术语“分离的”是指已经与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，所述多肽被称为“分离的”。在多肽在表达后由细胞分泌的情况下，将含有所述多肽的上清液与产生它的细胞物理分离，这被认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是典型地在自然界中发现的较大的多核苷酸的一部分时(例如像，在DNA多核苷酸的情况下的基因组DNA或线粒体DNA)，或例如在RNA多核苷酸的情况下与产生它的细胞的至少一些组分分离，多核苷酸被称为“分离的”。因此，在宿主细胞内的载体中所含有的DNA多核苷酸可以被称为“分离的”。
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换地用于指代动物；例如哺乳动物。术语患者包括人和兽医学受试者。在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物家畜、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些例子中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或障碍的个体或受试者。在一些实施方案中，接受治疗的受试者可以是指明如下事实的患者：受试者已经被鉴定为患有与治疗相关的障碍，或者有患上所述障碍的足够风险。在特定实施方案中，所述受试者是人，如人类患者。
如本文所用的“疾病”或“障碍”是指需要和/或期望治疗的病症。
除非另外指明，否则术语“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“癌症”、“肿瘤”和/或“瘤”在本文中可互换地使用，并且是指展现出会干扰身体器官和系统的正常功能发挥的不受控制的生长和/或异常增加的细胞存活和/或细胞凋亡的抑制的一种细胞(或多种细胞)。此定义包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠的肿瘤或微转移。
术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体癌和血液/淋巴癌，并且还涵盖恶性、恶变前和良性生长，如发育不良。此定义还包括具有不受免疫系统阻碍(例如免疫逃避和免疫逃避机制)的异常增殖的细胞(例如病毒感染的细胞)。示例性癌症包括但不限于：肾上腺癌；星形细胞瘤；基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝肿瘤；上皮内瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝脏癌症；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口、和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；脑垂体癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小非裂解细胞NHL；大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；以及华氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；以及移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)；以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生；水肿(如与脑肿瘤相关的)；以及梅格斯综合征。
如本文所用，术语“非肿瘤细胞”是指正常细胞或组织。示例性的非肿瘤细胞包括但不限于：T细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NKT)细胞，树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞，肝细胞，肾间质细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，成骨细胞，以及位于乳房、骨骼肌、胰腺、胃、卵巢、小肠、胎盘、子宫、睾丸、肾、肺、心脏、脑、肝、前列腺、结肠、淋巴器官、骨骼中的细胞，以及骨源性间充质干细胞。如本文所用的术语“位于外周中的细胞或组织”是指不位于肿瘤细胞附近和/或在肿瘤微环境内的非肿瘤细胞。
如本文所用的术语“肿瘤微环境内的细胞或组织”是指围绕和/或滋养肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管。肿瘤微环境内的示例性细胞或组织包括但不限于：肿瘤血管；肿瘤浸润性淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ECM)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞(Treg细胞)；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；髓源性抑制细胞(MDSC)和位于肿瘤附近的其他免疫细胞。用于鉴定肿瘤细胞和/或位于肿瘤微环境内的细胞/组织的方法是本领域熟知的，如下文所述。
在一些实施方案中，“增加”或“减少”分别是指统计学上显著的增加或减少。正如技术人员应清楚的，“调节”还可以涉及与相同条件但不存在测试剂的情况相比，实现靶标或抗原对其配体、结合配偶体、用于缔合为同多聚体或异多聚体形式的配偶体或底物中的一个或多个的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的变化(其可以是增加或减少)；实现靶标或抗原对存在靶标或抗原的介质或环境中的一个或多个条件(如pH、离子强度、存在辅因子等)的敏感性的变化(其可以是增加或减少)；和/或细胞增殖或细胞因子产生。这可以按任何合适的方式和/或使用本身已知的或本文所述的任何合适的测定来确定，这取决于所涉及的靶标。
如本文所用，“免疫反应”意在涵盖足以抑制或预防疾病(例如，癌症或癌症转移)的发作或改善所述疾病的症状的细胞免疫反应和/或体液免疫反应。“免疫反应”可以涵盖先天免疫系统和适应性免疫系统二者的方面。
如本文所用，疾病、障碍或病症的术语“治疗”(treating、treatment或therapy)是获得有益或期望的临床结果的一种方法。如本文所用，“治疗”包括针对哺乳动物(包括人)的疾病，对治疗剂的任何施用或施加。出于本公开文本的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的任何一个或多个：减轻一种或多种症状、降低疾病程度、预防或延迟疾病的传播(例如，转移，例如转移到肺或淋巴结)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病的进展、抑制或减缓疾病或疾病的进展、停滞疾病的发展和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还涵盖降低增殖性疾病的病理后果。本文提供的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。与上述一致，术语治疗不需要百分之百地去除障碍的所有方面。
如本文在癌症的背景下所用，术语癌症的“治疗”或“抑制(inhibit、inhibiting或inhibition)”是指以下各项中的至少一种：肿瘤生长速率的统计学上显著的降低；肿瘤停止生长；或肿瘤的大小、质量、代谢活动或体积的减少，如通过标准准则(例如但不限于实体肿瘤的反应评估准则(RECIST))测量的；或无进展存活期(PFS)或总存活期(OS)的统计学上显著的增加。
“改善”意指与不施用治疗剂相比，一种或多种症状的减轻或改进。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
疾病或障碍的“预防(preventing、prophylaxis或prevention)”是指施用单独的或与另一种化合物组合的药物组合物，以防止疾病或障碍或者疾病或障碍的一些或所有症状出现或发作，或减少疾病或障碍发作的可能性。
术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或者是指该特征的发生率、程度或可能性的减小或停止。“降低”或“抑制”是指与参考相比，活性、功能和/或量的减少、降低或阻滞。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少10％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少50％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指引起总体减少75％、85％、90％、95％或更高的能力。在一些实施方案中，在相同的时间段内，相对于对照，上述量在一段时间内被抑制或减少。
如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。除非另外说明，否则术语“降低”、“抑制”或“预防”不表示或要求在所有时间内完全预防，而只是在被测量的时间段内如此。
术语“抗癌剂”在本文中以其最广泛的意义用于指代用于治疗一种或多种癌症的药剂。此类药剂的示例性类别包括但不限于化学治疗剂、抗癌生物制剂(如细胞因子、受体细胞外结构域-Fc融合物和抗体)、放射疗法、CAR-T疗法、治疗寡核苷酸(如反义寡核苷酸和siRNA)和溶瘤病毒。
术语“生物样品”意指来自活物或曾经的活物的一定量的物质。此类物质包括但不限于血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
术语“对照”或“参考”是指已知不含有分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指含有活性成分(例如sdAb或含有VHH的多肽)的组合物当单独(即，作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合施用至患者时，对疾病进展(如例如通过改善或消除疾病症状和/或病因)产生统计学上显著的降低的量和/或浓度。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或影响，防止疾病或障碍进展，或改善患者的身体功能的量。含有活性剂的组合物的治疗有效量可以根据诸如以下等因素而变：疾病状态，个体的年龄、性别和体重，以及活性剂诱发个体的所需反应的能力。治疗有效量也是其中治疗上有益的效果超过活性剂的任何毒性或有害影响的剂量。治疗有效量可以按一次或多次施用来递送。治疗有效量是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下有效实现所需治疗和/或预防结果的量。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
术语“药物配制品”和“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式、并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。因此，它是适合于哺乳动物受试者(通常是人类)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，sdAb或含有VHH的多肽)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类配制品可以是无菌的。
“药学上可接受的载体”是指用于与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、配制助剂或本领域常规的载体，它们共同构成用于向受试者施用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与所述配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所采用的配制品。
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序依序施用。
术语“并行”在本文中用于指代两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠，或者其中一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用在很短的时间段内发生，或者其中两种药剂的治疗作用重叠持续至少一段时间。
术语“依序”在本文中用于指代两种或更多种治疗剂的施用，其在时间上不重叠，或者其中药剂的治疗作用不重叠。
如本文所用，“与……结合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式。因此，“与……结合”是指在向个体施用另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
术语“药品说明书”用于指代通常在治疗产品的商业包装中所包括的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂(例如，用于治疗疾病或障碍(例如，癌症)的药物)或用于特异性检测本文所述的生物标记物的探针的任何制造物(例如，包装或容器)或试剂盒。在一些实施方案中，所述制造物或试剂盒作为用于实施本文所述的方法的单元进行促销、分发或销售。
术语“标记”和“可检测标记”意指例如与抗体或抗原附接的部分，以使特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)可检测。所述特异性结合对的经标记的成员被称为“被可检测地标记”。因此，术语“经标记的结合蛋白”是指掺入了用于鉴定结合蛋白而提供的标记的蛋白质。在一些实施方案中，所述标记是可以产生能够通过视觉或仪器手段检测的信号的可检测标记物，例如掺入经放射性标记的氨基酸或附接至生物素基部分的多肽，所述生物素基部分的多肽可以通过标记的抗生物素蛋白检测(例如，含有可以通过光学方法或比色法检测的荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)。用于多肽的标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素基团；由第二报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和诸如钆螯合物等的磁性剂。通常用于免疫测定的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶化合物；和产生荧光的部分，例如荧光素。在这方面，所述部分本身可能没有被可检测地标记，但在与又另一部分反应时可能变得可检测。
II.结合CD28的单结构域抗体(例如VHH结构域)
本文提供了CD28结合多肽，所述多肽是含有单结构域抗体(sdAb；例如VHH)的多肽并且含有至少一个特异性结合CD28的sdAb(例如VHH结构域)。在一些实施方案中，所述sdAb是VHH。在一些实施方案中，所述VHH结构域结合人CD28。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述VHH结构域结合具有SEQ ID NO:86或其成熟形式所示序列的CD28。
在一些实施方案中，所述含有VHH的多肽包含本文提供的VHH结构域的多个拷贝。在此类实施方案中，所述含有VHH的多肽可以包含同一VHH结构域的多个拷贝。在一些实施方案中，所述含有VHH的多肽可以包含不同但识别CD28上的相同表位的VHH结构域的多个拷贝。所述含有VHH的多肽可以以多种形式(包括下文章节III中所述的任何形式)形式化。
VHH结构域是抗体片段，是能够选择性地结合特定的抗原的单个单体可变抗体结构域。VHH结构域(也称为单结构域抗体)的分子量仅为12-15kDa，远小于由两条重蛋白链和两条轻链构成的普通抗体(150-160kDa)，甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链和一条重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。
单结构域抗体是其互补决定区为单结构域多肽的一部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程化抗体、以及除源自抗体的那些以外的单结构域支架。单结构域抗体可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、羊驼、小羊驼、原驼、鲨鱼、山羊、兔和/或牛。在一些实施方案中，如本文所用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。为了清晰起见，源自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH相区分。这种VHH分子可以源自在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼、小羊驼和原驼)中产生的抗体。除了骆驼科之外的其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链抗体；此类VHH在本公开文本的范围内。
用于筛选具有针对CD28的所需特异性的VHH结构域(包括VHH结合多肽)的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶促测定、流式细胞术以及本领域内已知的其他免疫学介导的技术。
本文提供的VHH结构域中有CD28 VHH(源自美洲驼)和人源化序列，如下文所述中的任何一个。
在一些实施方案中，结合CD28的VHH结构域可以是人源化的。人源化抗体(如含有VHH的多肽)可用作治疗分子，因为人源化抗体降低或消除人对非人抗体的免疫反应，所述人对非人抗体的免疫反应可能导致对抗体治疗剂的免疫反应以及降低的治疗剂的有效性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中，并且进一步描述于以下文献中：Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,(2005)Methods 36:25-34；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述了“重新表面化(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,(2005)Methods 36:61-68和Klimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述了“用于FR改组的导向选择”)。
可用于人源化的人类框架区域包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；源自具有特定亚组重链可变区的人类抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；以及Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖框架区(参见例如，Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；以及筛选FR文库得到的框架区(参见例如，Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684以及Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。通常，将VHH的FR区替代为人FR区以制备人源化VHH。在一些实施方案中，替代人FR的某些FR残基以改善人源化VHH的一个或多个特性。具有此类替代残基的VHH结构域在本文中仍被称为“人源化的”。
本文提供了结合CD28的VHH结构域，其中所述VHH结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在选自SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个的VHH氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:189、192、195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:190、193、196和202-212中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:191、194和197中任一个所示的CDR3。
本文还提供了结合CD28的VHH结构域，其中所述VHH结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在选自SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个的VHH氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:189、192、195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:190、193、196、202-212和386-395中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:191、194、197和396-398中任一个所示的CDR3。
本文提供了结合CD28的VHH结构域，其中所述VHH结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个的VHH氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:189、192、195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:190、193、196、202和204-212中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:191、194和197中任一个所示的CDR3。
本文还提供了结合CD28的VHH结构域，其中所述VHH结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个的VHH氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ IDNO:189、192、195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:190、193、196、202、204-212和386-395中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398中任一个所示的CDR3。
在一些实施方案中，CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD28VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:186所示的VHH结构域或与SEQ ID NO:186所示的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:186所示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域是SEQ IDNO:186所示氨基酸序列的人源化变体。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:189所示的CDR1，SEQ ID NO:190所示的CDR2以及SEQ ID NO:191所示的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:187所示的VHH结构域或与SEQ ID NO:187所示的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:187所示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域是SEQ IDNO:187所示氨基酸序列的人源化变体。
在一些实施例中，本文所提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:192所示的CDR1、SEQ ID NO:193所示的CDR2以及SEQ ID NO:194所示的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:188所示的VHH结构域或与SEQ ID NO:188所示的VHH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:188所示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域是SEQ IDNO:188所示氨基酸序列的人源化变体。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:196和202-212中任一个所示的CDR2以及SEQ ID NO:197所示的CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:196、202-212和386-395中任一个所示的CDR2，以及SEQID NO:197和396-398中任一个所示的CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域含有SEQ ID NO:195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:196、202和204-212中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:197所示的CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28VHH结构域含有SEQ ID NO:195和198-201中任一个所示的CDR1，SEQ ID NO:196、202、204-212和386-395中任一个所示的CDR2，以及SEQ ID NO:197和396-398中任一个所示的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、196和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:198、196和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:199、196和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、202和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、203和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、204和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:200、196和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、196和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、205和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、206和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:195、207和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、208和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、209和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、210和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、211和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、212和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、202和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、202和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、386和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:201、387和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、202和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、202和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、206和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、206和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、388和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、389和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、206和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、206和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:201、203和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、203和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、390和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、391和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、203和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、203和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、204和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、204和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、392和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:201、393和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、204和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、204和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、196和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、394和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、395和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、196和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:201、196和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、206和396所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQID NO:195、388和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、389和197所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、206和397所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本文提供的CD28 VHH结构域分别含有SEQ ID NO:195、206和398所示的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些方面，结合CD28的VHH结构域包含CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的VHH氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些方面，结合CD28的VHH结构域包含CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的VHH氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。
在一些情况下，所提供的CD28 VHH结构域是人源化变体，所述人源化变体具有SEQID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28人源化的VHH结构域具有SEQID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些情况下，所提供的CD28 VHH结构域是人源化变体，所述人源化变体具有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28人源化VHH结构域具有SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些方面，结合CD28的VHH结构域包含CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的VHH氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。在一些方面，结合CD28的VHH结构域包含CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3含有在SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的VHH氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列中。
在一些情况下，所提供的CD28 VHH结构域是人源化变体，所述人源化变体具有SEQID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28人源化VHH结构域具有SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些情况下，所提供的CD28 VHH结构域是人源化变体，所述人源化变体具有SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-485中任一个所示的VHH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28人源化VHH结构域具有SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域具有突变以防止或减少VHH与蛋白A的结合。在一些实施方案中，所述突变是G73D。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是SEQ ID NO:280。
在一些实施方案中，至少一个CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的G65D。
在一些实施方案中，结合CD28的CD28结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个导致与CD28的单价、二价、三价、四价、五价或六价结合。在一些实施方案中，与CD28的二价结合包含两个结合CD28的相同表位的CD28结合结构域(例如单表位的)。在一些实施方案中，与CD28的二价结合包含两个结合CD28的不同表位的CD28结合结构域(例如双表位的)。在一些实施方案中，与CD28的单价结合包含一个结合CD28的一个表位的CD28结合结构域(例如单表位的)。
在一些实施方案中，CD28 VHH结构域直接或间接地与结合蛋白A的部分连接。在一些实施方案中，所述蛋白A结合部分有助于CD28 VHH结构域的纯化。
在一些实施方案中，在没有另外的结合结构域结合抗原的情况下，CD28 VHH结构域结合或接合CD28的能力被防止或降低。在一些实施方案中，另外的结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域直接或间接地与TAA抗原结合结构域连接。因此，在一些实施方案中，在没有直接或间接连接的TAA结合结构域与其抗原结合的情况下，CD28 VHH结构域结合或接合CD28的能力被防止或降低。
III.含有CD28结合多肽的融合蛋白和缀合物
本文提供了含有CD28结合多肽的融合蛋白和缀合物，所述CD28结合多肽含有至少一个特异性结合CD28的VHH结构域，CD28直接或间接地与一个或多个另外的结构域或部分连接。在一些实施方案中，本公开文本的融合蛋白或缀合物由单一多肽构成。在其他实施方案中，本公开文本的融合蛋白或缀合物由多于一种多肽构成。在一些实施方案中，本公开文本的CD28结合多肽包含至少一个特异性结合CD28的VHH结构域。在一些方面，所述CD28结合多肽对于CD28是多价的。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括两个或更多个特异性结合CD28的CD28 VHH结构域，例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或者六个或更多个特异性结合CD28的VHH结构域。
在任何所提供的实施方案中，CD28结合多肽包括Fc结构域。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括至少一个CD28 sdAb和Fc结构域。
在某些方面，所述CD28结合多肽含有一个或多个另外的结合结构域，并且对于CD28和另一种不是CD28的抗原是多特异性的。例如，在一些情况下，所述一个或多个另外的结构域可以是与一个或多个其他抗原(如肿瘤相关抗原(TAA))结合的一个或多个另外的结合结构域。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽对于所述另一种抗原是多价的。例如，在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽包括两个或更多个结合所述另外的抗原的VHH结构域。在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽进一步包括Fc结构域，使得所述多特异性CD28结合多肽进一步包括至少一个TAA sdAb、至少一个CD28 sdAB和Fc结构域。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽进一步包括CD3结合区，使得所述多特异性CD28结合多肽进一步包括至少一个TAA sdAb、至少一个CD28 sdAB、Fc结构域和CD3结合区。
在一些实施方案中，本公开文本的CD28结合多肽包括两个或更多个经由氨基酸接头可操作地连接的多肽序列。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。本公开文本的融合蛋白的GS接头可以具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。在一些实施方案中，所述GS接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:3)；GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)；以及GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，以非限制例子为例，如GG(SEQ ID NO:249)、GGG(SEQ ID NO:87)、GGGG(SEQID NO:5)、GGGGG(SEQ ID NO:6)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括GS接头和甘氨酸接头的组合。在一些实施方案中，所述接头为：(GGGGS)n，其中n是1至5(SEQ ID NO:123)；(GGGGGS)n，其中n是1至4(SEQ ID NO:124)；GGGGS(SEQ ID NO:125)；GGGGGS(SEQ ID NO:126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:128)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:129)；或PGGGG(SEQ ID NO:250)。在一些实施方案中，所述接头是GG接头。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括GS接头和甘氨酸接头的组合。
A.Fc融合物
本文提供了CD28结合多肽，其是含有至少一个结合CD28的VHH结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽含有一个、两个、三个或四个结合CD28的VHH结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有Fc结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有至少一个结合本文提供的CD28的VHH结构域和Fc结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有结合CD28的一个、两个、三个或四个VHH结构域和Fc结构域。
在一些实施方案中，将免疫球蛋白Fc区掺入融合蛋白中可以(在一些方面)由形成二聚体的两种多肽构成。在一些实施方案中，Fc结构域在生理条件下(如由细胞表达时)介导所述CD28结合多肽的二聚化，使得形成使CD28结合位点数量加倍的二聚体。例如，包含一个结合CD28的VHH结构域和Fc区的CD28结合多肽作为单体是单价的，但是所述Fc区可以介导二聚化，使得所述CD28结合多肽在此类条件下作为二价二聚体存在。在一些实施方案中，CD28 VHH结构域融合到IgG Fc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是二价的且具有两个CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，两个CD28结合结构域(2x)融合到IgGFc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是四价的且具有四个CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，三个CD28 VHH结构域(3x)融合到IgG Fc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是六价的且具有六个CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，CD28结合多肽包含IgG Fc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是二价的且具有两个CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，具有两个CD28结合结构域(2x)的CD28结合多肽包含IgG Fc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是四价的且具有四个CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，具有三个CD28 VHH结构域(3x)的CD28结合多肽包含IgG Fc区，并且在这些实施方案中，所述融合蛋白的每个分子是六价的且具有六个CD28 VHH结构域。
在一些实施方案中，所述多价CD28结合多肽是二价的。在一些实施方案中，本公开文本的二价CD28结合多肽包括具有以下结构的CD28结合多肽的两个拷贝：(CD28 VHH)-Fc。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是或含有SEQ ID NO:188、220或280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是或含有SEQ ID NO:188所示的序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是或含有SEQ ID NO:220所示的序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是或含有SEQ ID NO:280所示的序列。在一些实施方案中，所述Fc是或含有氨基酸序列SEQID NO:8或9。在一些实施方案中，所述Fc是或含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc是或含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH是或含有SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述Fc结构域是或含有SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多价CD28结合多肽是四价的。在一些实施方案中，本公开文本的四价CD28结合多肽包括具有以下结构的CD28多肽的两个拷贝：(CD28 VHH)-接头-(CD28 VHH)-Fc。在一些实施方案中，所述多价CD28结合多肽是六价的。在一些实施方案中，本公开文本的六价CD28结合多肽包括具有以下结构的CD28结合多肽的两个拷贝：(CD28VHH)-接头-(CD28 VHH)-接头-(CD28 VHH)-Fc。
在一些情况下，Fc区的CH3结构域可以用作同二聚化结构域，从而从两个相同的多肽形成所得的融合蛋白。在其他情况下，可以使Fc区的CH3二聚体连接区域突变，以实现异二聚化。例如，可以将异二聚化结构域掺入融合蛋白中，使得构建体是不对称的融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中，CD28 VHH结构域可以是如上所述的任一个。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域是结合CD28的人源化VHH结构域。
在各种实施方案中，CD28结合多肽中包括的Fc结构域是人Fc结构域，或源自人Fc结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是选自以下的IgG同种型：IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4亚类。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段是IgG同种型。例如，所述融合蛋白的免疫球蛋白Fc区是人IgG1同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0003858954760000751
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG1多肽序列。
在一些实施方案中，本公开文本的融合蛋白包括Fc多肽，所述Fc多肽被突变或修饰。在一些情况下，所述突变包括一个或多个氨基酸取代，以降低Fc多肽的效应子功能。Fc多肽突变(以改变(如降低)效应子功能)的各种例子是已知的，包括如下文所述的任一个。在一些实施方案中，除非参考特定的SEQ ID NO进行描述，否则对Fc区中的氨基酸取代的提及是根据Kabat的EU编号(也称为Kabat编号)。EU编号是已知的，并且按照最新更新的IMGTScientific Chart(
Figure BDA0003858954760000752
国际ImMunoGeneTics信息
Figure BDA0003858954760000753
http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日))以及如Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of Immunologicalinterest.第5版美国卫生和公众服务部,NIH公开号91-3242(1991)中报告的EU索引。
在一些实施方案中，展现出降低的效应子功能的Fc区对于其中需要CD28结合但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要或有害的应用而言可能是理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保所述多特异性多肽构建体和/或其切割组分缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；以及CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(PromegaTM，麦迪逊，威斯康辛州))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中)评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实所述多特异性多肽构建体或其切割组分不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在一些实施方案中，所述人IgG Fc区被修饰以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如Natsume等人,2008 Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001 J Immunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010 mAbs,2(2):181-189；Lazar等人,2006 PNAS,103(11):4005-4010；Shields等人,2001 JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen等人,2007 Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992 J Immunol,148:3461-3468中所述的；Kaneko和Niwa,2011 Biodrugs,25(1):1-11中综述的氨基酸修饰。
增强ADCC的突变的例子包括在Ser239和Ile332处的修饰，例如Ser239Asp和Ile332Glu(S239D、I332E)。增强CDC的突变的例子包括在Lys326和Glu333处的修饰。在一些实施方案中，在使用Kabat编号系统的这些位置中的一个或两个处修饰所述Fc区，例如Lys326Ala和/或Glu333Ala(K326A和E333A)。
在一些实施方案中，在以下位置中的一个或多个处改变所述融合蛋白的Fc区以降低Fc受体结合：Leu234(L234)、Leu235(L235)、Asp265(D265)、Asp270(D270)、Ser298(S298)、Asn297(N297)、Asn325(N325)、Ala327(A327)或Pro329(P329)。例如，Leu234Ala(L234A)、Leu235Ala(L235A)、Leu235Glu(L235E)、Asp265Asn(D265N)、Asp265Ala(D265A)、Asp270Asn(D270N)、Ser298Asn(S298N)、Asn297Ala(N297A)、Pro329Ala(P329A)或Pro239Gly(P329G)、Asn325Glu(N325E)或Ala327Ser(A327S)。在优选的实施方案中，所述Fc区内的修饰降低了与Fc受体-γ受体的结合，同时对与新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在一些实施方案中，人IgG1 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止所述融合蛋白的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu235(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234和235两者处被改变，例如Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)或Leu234Val和Leu235Ala(L234V/L235A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和297处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asn297Ala(L234A/L235A/N297A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和329处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro239Ala(L234A/L235A/P329A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Asp265(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Asp265Ala(D265A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Pro329(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Pro329Ala(P329A)或Pro329Gly(P329G)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸265和329两者处被改变，例如Asp265Ala和Pro329Ala(D265A/P329A)或Asp265Ala和Pro329Gly(D265A/P329G)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和265处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala(L234A/L235A/D265A)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和329处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro329Gly(L234A/L235A/P329G)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235、265和329处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala、Pro329Gly(L234A/L235A/D265A/P329G)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在Gly235处被改变以降低Fc受体结合。例如，其中从所述融合蛋白中缺失Gly235。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区在氨基酸Gly236处被修饰以增强与CD32A的相互作用，例如Gly236Ala(G236A)。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest的EU索引)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在以下位置中的一个或多个处缺乏氨基酸以降低Fc受体结合：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在以下位置Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)中的一个或多个处缺乏氨基酸，并且在Asp265(D265)、Asn297(N297)或Pro329(P329)中的一个或多个处被修饰，以降低Fc受体结合。例如，CD28结合多肽中包括的Fc区源自人Fc结构域，并且在下铰链中包含对应于IgG1 E233、L234和L235的三个氨基酸缺失。在一些方面，此类Fc多肽不接合FcγR，因此被称为“效应子沉默”或“效应子无效”。例如，这三个氨基酸的Fc缺失降低了补体蛋白C1q结合。在一些实施方案中，具有这三个氨基酸的Fc缺失的Fc区的多肽保留了与FcRn的结合，因此具有延长的半衰期以及与FcRn介导的再循环相关的转胞吞作用。这种经修饰的Fc区被称为“Fc xELL”或“Fc缺失”，并且具有以下氨基酸序列：
PAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:9)
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG1多肽序列。
在一些实施方案中，所述人IgG Fc区被修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn的结合的Fc突变的例子是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu(分别为M252Y、S254T、T256E)(Kabat编号，Dall'Acqua等人2006,J.Biol Chem第281卷(33)23514-23524)，Met428Leu和Asn434Ser(M428L、N434S)(Zalevsky等人2010Nature Biotech,第28卷(2)157-159)，或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu(分别为M252I、T256D、M428L)(Kabat等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，CD28结合多肽中包括的Fc结构域源自人Fc结构域，并且包含突变M252Y和M428V，在本文中称为“Fc-YV”。在一些实施方案中，经突变或修饰的Fc多肽包括以下突变：使用Kabat编号系统的M252Y和M428L。在一些实施方案中，此类突变在内体的酸性pH(接近6.5)下增强与FcRn的结合，而在中性pH(约7.2)下失去可检测的结合，从而允许增强的FcRn介导的再循环和延长的半衰期。
在本文所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，CD28结合多肽中包括的Fc结构域源自人Fc结构域并且包含突变以诱导异二聚化。在一些实施方案中，此类突变包括称为“杵状结构(knob)”和“臼状结构(hole)”突变的那些。例如，在CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰，当用较大体积氨基酸(例如，Try(T366W))替代时，能够优先与在位置Thr366、Leu368和Tyr407处具有较小体积氨基酸的氨基酸修饰(例如，分别为Ser、Ala和Val(T366S/L368A/Y407V))的第二CH3结构域配对。在一些实施方案中，“杵状”Fc结构域包含突变T366W。在一些实施方案中，“臼状”Fc结构域包含突变T366S、L368A和Y407V。可以通过引入二硫键，例如通过在相对的CH3结构域上将Ser354变为Cys(S354C)并将Y349变为Cys(Y349C)进一步稳定经由CH3修饰进行的异二聚化(综述于Carter,2001 Journal ofImmunological Methods,248:7-15中)。在一些实施方案中，用于异二聚化的Fc结构域包含另外的突变，如异二聚体Fc对的第一成员上的突变S354C，其与异二聚体Fc对的第二成员上的相应突变Y349C形成不对称二硫键。在一些实施方案中，异二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K以防止蛋白A结合同时维持FcRn结合。在一些实施方案中，异二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K，而异二聚体Fc对的第二成员在H435处未被修饰。在各种实施方案中，臼状Fc结构域包含修饰H435R或H435K(当修饰是H435R时，在一些情况下称为“臼状R”)，而杵状Fc结构域不包含这些。在一些情况下，臼状R突变相比于可能存在的同二聚体臼状Fc结构域改善了异二聚体的纯化。
在一些实施方案中，人IgG Fc区被修饰以防止二聚化。在这些实施方案中，本公开文本的融合蛋白是单体的。例如，在残基Thr366处修饰为带电荷残基，例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu(分别为T366K、T366R、T366D或T366E)会防止CH3-CH3二聚化。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG2同种型的，具有氨基酸序列：
PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:10)
在一些实施方案中，所述融合物或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG2多肽序列。
在一些实施方案中，所述人IgG2 Fc区在氨基酸Asn297处被修饰例如以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，所述人IgG2 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest的EU索引)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG3同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0003858954760000791
在一些实施方案中，所述抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG3多肽序列。
在一些实施方案中，所述人IgG3 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，所述人IgG3 Fc区在氨基酸435处被修饰以延长半衰期，例如Arg435His(R435H)。在一些实施方案中，所述人IgG3 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG4同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0003858954760000792
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG4多肽序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG4同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0003858954760000793
在一些实施方案中，所述抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG4多肽序列。
在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区在氨基酸235处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteinsof Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白含有源自免疫球蛋白铰链区的多肽。铰链区可以选自人IgG亚类中的任一种。例如，所述融合蛋白可以含有具有EPKSSDKTHTCPPC(SEQ IDNO:14)的序列的经修饰的IgG1铰链，其中与轻链的C末端半胱氨酸形成二硫化物的Cys220被突变为丝氨酸，例如Cys220Ser(C220S)。在其他实施方案中，所述融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:15)的截短铰链。
在一些实施方案中，所述融合蛋白具有来自IgG4的具有序列ESKYGPPCPPC(SEQ IDNO:16)的经修饰的铰链，其被修饰以防止或减少链交换，例如Ser228Pro(S228P)。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有接头多肽。在其他实施方案中，所述融合蛋白含有接头和铰链多肽。
在一些实施方案中，所述Fc区缺乏或具有减少的在N297处附接至N连接的聚糖链的岩藻糖。存在多种方式来防止岩藻糖基化，包括但不限于在FUT8缺陷型细胞系中产生；向哺乳动物细胞培养基中添加抑制剂，例如栗精胺(Castanospermine)；以及对生产细胞系进行代谢工程。
在一些实施方案中，所述Fc区被工程化为不被人类中发现的预先存在的抗体识别。在一些实施方案中，本公开文本的含有VHH的多肽通过位置11的突变和羧基末端区域的变化来修饰。在一些实施方案中，本公开文本的含有VHH的多肽通过位置Leu11的突变(例如Leu11Glu(L11E)或Leu11Lys(L11K))来修改。在一些实施方案中，本公开文本的含有VHH的多肽含有羧基末端修饰Ser112Lys(S112K)和Ser113Pro(S113P)。例如，本公开文本的单结构域抗体的人源化变体可以含有修饰Leu11Glu(L11E)以及羧基末端修饰Ser112Lys(S112K)和Ser113Pro(S113P)，因为已知这些阻止或减少针对sdAb的预先存在的ADA的识别(如US 20160207981中所述)。在其他实施方案中，本公开文本的单结构域抗体通过羧基末端区域的变化来修饰，例如，末端序列具有序列GQGTLVTVKPGG(SEQ ID NO:17)或GQGTLVTVEPGG(SEQ ID NO:18)或其修饰。
在一些实施方案中，本公开文本的融合蛋白的一种或多种多肽经由氨基酸接头可操作地连接。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。本公开文本的融合蛋白的GS接头可以具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。
在一些实施方案中，所述GS接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:3)；以及GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，以非限制例子为例，如GG(SEQ ID NO:249)、GGG(SEQ ID NO:87)、GGGG(SEQ ID NO:5)、GGGGG(SEQ ID NO:6)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，所述接头为：(GGGGS)n，其中n是1至5(SEQ ID NO:123)；(GGGGGS)n，其中n是1至4(SEQ ID NO:124)；GGGGS(SEQ ID NO:125)；GGGGGS(SEQ ID NO:126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:128)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:129)；或PGGGG(SEQ ID NO:250)。在一些实施方案中，所述接头是GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)。在一些实施方案中，所述融合蛋白可以包括GS接头和甘氨酸接头的组合。
B.缀合物
本文提供了缀合物，其含有至少一个特异性结合本文提供的CD28的VHH结构域和一个或多个另外的部分。所述另外的部分可以是治疗剂，如细胞毒性剂，或者可以是检测剂。在一些实施方案中，所述部分可以是靶向部分、小分子药物(小于500道尔顿摩尔质量的非多肽药物)、毒素、细胞抑制剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、适用于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子、前药活化酶、增加生物半衰期的试剂、或诊断或可检测的试剂。
在一些实施方案中，所述缀合物是抗体药物缀合物(ADC，也称为免疫缀合物)，其含有一个或多个与治疗剂缀合的本文提供的CD28 VHH结构域，所述治疗剂是细胞毒性剂、细胞抑制剂或者另外提供某些治疗益处。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。在一些实施方案中，本公开文本提供的抗体药物缀合物使药物部分靶向递送到肿瘤。在一些情况下，这可能导致肿瘤细胞的靶向杀伤。
在一些实施方案中，提供了结合CD28的缀合物，其包含至少一个与治疗剂缀合的本文提供的CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，所述治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187,1986)。在一些实施方案中，所述治疗剂具有细胞内活性。在一些实施方案中，所述结合CD28的缀合物被内化，并且所述治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成从而导致细胞死亡的细胞毒素。在一些实施方案中，所述治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素A及其变体。在一些实施方案中，在所述治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素时，结合CD28的缀合物必须在与靶细胞结合后内化，以使所述蛋白质对所述细胞具有细胞毒性。
在一些实施方案中，提供了结合CD28的缀合物，其包含至少一个与毒素缀合的本文提供的CD28 VHH结构域。在一些实施方案中，所述毒素包括例如细菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒素)、小分子毒素(如格尔德霉素)(Mandler等人J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))、美登木素生物碱(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))、以及卡利奇霉素(calicheamicin)(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。所述毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性作用。
在一些实施方案中，提供了结合CD28的缀合物，其包含至少一个与标记缀合的本文提供的CD28 VHH结构域，所述标记可间接或直接地产生可检测信号。这些IgSF缀合物可用于研究或诊断应用，如用于体内癌症检测。标记优选能够直接或间接地产生可检测信号。例如，所述标记可以是不透射线的或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，所述标记是用于闪烁照相研究的放射性原子(例如99Tc或123I)或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，MRI)，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并与抗体缀合，例如用于PET成像(WO2011/056983)。
所述结合CD28的缀合物可以使用本领域已知的任何方法制备。参见例如，WO2009/067800、WO 2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，附接可以是共价的或非共价的，例如，经由生物素-链霉亲和素非共价相互作用。在一些实施方案中，1、2、3、4、5或更多个可以相同或不同的部分与CD28VHH结构域缀合、连接或融合以形成结合CD28的缀合物。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的和下文描述的各种分子生物学或化学缀合和连接方法将此类部分与所述VHH结构域附接。在一些实施方案中，接头，如肽接头、可裂解接头、不可裂解接头或有助于缀合反应的接头可用于将效应子部分与变体多肽或免疫调节蛋白连接或缀合。
在一些实施方案中，CD28 VHH结构域通过接头(L)与一个或多个部分缀合，例如，每个VHH缀合约1至约20个药物部分。在一些实施方案中，所述结合CD28的缀合物包含以下组分：(VHH结构域)，(L)q和(部分)m，其中所述VHH结构域是所描述的能够特异性结合CD28的VHH结构域中的任何一个；L是将所述蛋白质或多肽连接到所述部分的接头；m至少是1；q是0或更大；并且所得的结合CD28的缀合物与CD28结合。在特定实施方案中，m是1至4并且q是0至8。
接头可以由一个或多个接头组分构成。对于抗体和药物部分的共价附接，接头通常具有两个反应性官能团，即在反应性意义上是二价的。可用于附接两个或更多个功能部分或生物活性部分(如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)的二价接头试剂是已知的，并且已经描述了它们产生缀合物的方法(Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques；Academic Press:纽约,p 234-242)。
示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-I甲酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。
在一些实施方案中，接头可以包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(如瓜氨酸)。氨基酸接头组分可以通过特定酶(例如，肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，以及纤溶酶蛋白酶)进行酶促切割来设计和优化其选择性。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备VHH结构域与细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
抗体药物缀合物可以通过多种方法(如本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂)来制备。在一个实施方案中，方法包括：(1)VHH结构域的亲核基团与二价接头试剂的反应，以经由共价键形成VHH-L，然后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂的反应，以经由共价键形成D-L，然后与VHH结构域的亲核基团反应。
包括VHH结构域的抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，以及(iv)糖羟基或氨基基团，其中所述抗体是糖基化的。胺、硫醇和羟基基团是亲核的并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键，所述接头部分和接头试剂包括：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。可以通过使赖氨酸与2-亚氨基噻戊烷(特劳特试剂)反应将其他亲核基团引入抗体中，从而导致胺转化为硫醇。可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)来将反应性硫醇基团引入抗体(或其片段)中。
缀合物(如抗体药物缀合物)还可以通过修饰抗体(如VHH结构域)以引入亲电子部分来产生，所述亲电子部分可以与接头试剂或药物上的亲核取代基反应。可以将糖基化抗体的糖氧化，例如，用高碘酸盐氧化试剂，以形成醛或酮基团，所述醛或酮基团可以与接头试剂或药物部分的胺基团相连。所得的亚胺席夫碱基团可以形成稳定的连接，或者可以例如被硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以产生蛋白质中的羰基(醛和酮)基团，所述羰基基团可以与药物上的适当基团反应。在另一个实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏高碘酸钠反应，从而产生醛代替第一种氨基酸。这种醛可以与药物部分或接头亲核试剂反应。
同样地，药物部分上的亲核基团包括但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述接头部分和接头试剂包括：(i)活性酯，如NHS酯、HOBi酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
可替代地，可以例如通过重组技术或肽合成来制造含有VHH结构域和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含编码缀合物的两个部分的各自区域，所述各自区域彼此相邻或者由编码接头肽的区域(其不会破坏缀合物的所需特性)分离。
C.多特异性形式
本文提供了CD28结合多肽，所述多肽是多特异性的，含有至少一个结合CD28的VHH结构域和一个或多个另外的结合结构域(BD)。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽接合CD28的能力是以所述一个或多个另外的结合结构域与其结合配偶体的结合为条件的。通常，所述一个或多个另外的结合结构域与CD28以外的抗原结合。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的结合结构域是针对另一种抗原(如激活的T细胞、耗竭的T细胞或肿瘤微环境(TME)中的另一类型细胞表达的抗原)具有特异性的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的结合结构域是针对另一种抗原(如肿瘤相关抗原(TAA))具有特异性的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述另外的结构域是VHH结构域，如TAA VHH(sdAb)。
在一些例子中，所述多特异性CD28结合多肽还包括Fc结构域。在一些实施方案中，包含Fc结构域允许两个CD28结合多肽的二聚化，从而使CD28 VHH和/或BD的数量加倍。在一些实施方案中，包含Fc结构域允许两个CD28结合多肽的二聚化，从而使CD28 VHH和/或TAAVHH的数量加倍。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽还包括CD3结合区。在一些实施方案中，所述CD3结合区不能或基本上不能接合CD3，除非所述一个或多个另外的结合结构域(例如TAA sdAb)与其结合配偶体(例如TAA或其他抗原)结合。
非限制性示例性多特异性CD28结合多肽如下所述。
a.条件性CD28多特异性构建体
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是多特异性CD28结合多肽，其具有至少一个CD28 VHH和一个或多个与CD28以外的抗原结合的另外的结合结构域(BD)(例如，与肿瘤相关抗原或TME中存在的其他抗原结合的单结构域抗体)。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽是条件性多特异性CD28结合多肽。例如，所述条件性多特异性CD28结合肽不能或基本上不能接合CD28，除非所述一个或多个另外的结合结构域与其结合配偶体结合。在一些实施方案中，当所述结合配偶体(例如TAA或TME中存在的其他抗原)与所述一个或多个另外的结合结构域(例如BD sdAb，如TAA sdAb)结合时，所述CD28多特异性多肽能够接合CD28。
在一些实施方案中，就接合CD28并随后刺激T细胞的能力而言，本文提供的条件性多特异性CD28结合多肽以两种状态存在：(1)当所述一个或多个抗原结合结构域中的任一个或全部未与其抗原(例如TAA)结合时，发生“无活性”状态，使得CD28结合具有条件性并且T细胞刺激被排除或降低，和(2)当所述一个或多个抗原结合结构域中的任一个或全部进行抗原结合时，发生“活性”状态，使得CD28结合区能够接合CD28并且T细胞刺激是允许的。
在一些实施方案中，就激动CD28并随后刺激T细胞的能力而言，本文提供的条件性多特异性CD28结合多肽以两种状态存在：(1)当与CD28结合时，发生“无活性”状态，但未引起信号传导并且T细胞刺激被排除或降低，(2)在构建体通过一个或多个结合CD28以外的抗原的另外的抗原结合结构域接合后，发生“活性”状态，使得CD28结合区能够激动CD28并且T细胞刺激是允许的。在一些实施方案中，CD28激动是条件性的，这意味着它取决于一个或多个结合CD28以外的抗原的结合结构域被其抗原共同接合。
a.CD28结合结构域
所述多特异性CD28结合多肽包括至少一个CD28结合结构域(如结合CD28的单结构域抗体(VHH结构域))以及一个或多个结合非CD28的抗原的另外的结合结构域(BD；例如sdAb)。在一些实施方案中，这一不同抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤微环境相关抗原(TMEAA)。在一些实施方案中，这第二种抗原是免疫调节抗原，其中所述抗原参与增强或阻抑免疫细胞中的信号传导途径。因此，在一些实施方案中，所提供的多特异性CD28结合多肽包括至少一个CD28 sdAb(VHH)和一个或多个TAA sdAb。在一些实施方案中，所提供的多特异性CD28结合多肽包括至少一个CD28 sdAb(VHH)和一个或多个结合TME中的抗原的BD。在一些实施方案中，TME中的抗原是由激活和/或耗竭的T细胞表达的抗原。在一些实施方案中，TME中的抗原是由TME中的其他T细胞表达的抗原。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽包括一个CD28 sdAb(即，所述多特异性C28结合多肽对于CD28是单价的)。如章节II所述，所述一个CD28可以是或含有任何CD28sdAb序列。在一些实施方案中，所述一个CD28 sdAb是或含有SEQ ID NO:188、220或280所示的序列。在一些实施方案中，所述一个CD28 sdAb是或含有SEQ ID NO:188所示的序列。在一些实施方案中，所述一个CD28 sdAb是或含有SEQ ID NO:220所示的序列。在一些实施方案中，所述一个CD28 sdAb是或含有SEQ ID NO:280所示的序列。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽对于CD28是多价的。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个或更多个CD28 sdAb，例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括两个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述两个CD28 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述两个CD28抗体是不同的，例如，它们与CD28的不同表位结合。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括四个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所有四个CD28 sdAb是相同的。在一些实施方案中，4个CD28 sdAb中的前两个是相同的，并且四个CD28 sdAb中的其他两个是相同的。在一些实施方案中，四个CD28 sdAb中的三个是相同的，并且四个CD28 sdAb中的第四个与其他三个是不同的。在任何所提供的实施方案中，掺入的CD28 sdAb(VHH)是或含有如章节II所述的任何CD28 VHH序列。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括至少一个具有SEQ ID NO:188所示氨基酸序列的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个具有SEQ ID NO:188所示氨基酸序列的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括四个具有SEQ ID NO:188所示氨基酸序列的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括至少一个具有SEQ ID NO:220所示氨基酸序列的CD28sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个具有SEQ ID NO:220所示氨基酸序列的CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括四个具有SEQID NO:280所示氨基酸序列的CD28 sdAb。
b.TAA结合结构域
所提供的多特异性CD28结合多肽含有一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA结合结构域是一个或多个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述TAA是如章节IIIC(c)(ii)中所述的任一个。所述一个TAA sdAb可以是或含有如章节IIIC(c)(ii)中所述的任何TAA sdAb序列。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽对于TAA是单价的，因为所述多特异性CD28结合多肽包括一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(或VHH)。
在一些实施方案中，所述TAA是PDL1。在一些实施方案中，所述TAA sdAB含有分别具有SEQ ID NO:100、101和102所示序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述TAAsdAb是或含有SEQ ID NO:99所示的序列。
在一些实施方案中，所述TAA是5T4。在一些实施方案中，所述TAA sdAB含有分别具有SEQ ID NO:241、242和243所示序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述TAAsdAb是或含有SEQ ID NO:240所示的序列。在一些实施方案中，所述TAA sdAB含有分别具有SEQ ID NO:246、247和248所示序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述TAA sdAb是或含有SEQ ID NO:245所示的序列。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽含有一个或多个TAA结合结构域，如一个或多个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个或更多个TAA VHH结构域，例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个TAAVHH结构域。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括2个TAA sdAb。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb结合相同的TAA。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb结合相同TAA的相同表位。在一些实施方案中，所述两个TAA sdAb结合相同TAA的不同表位。在某些实施方案中，所述两个TAA sdAb结合不同的TAA。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽包括四个TAA sdAb。在一些实施方案中，所有四个TAA sdAb结合相同的TAA。在一些实施方案中，4个TAA sdAb中的前两个结合第一TAA，并且四个TAA sdAb中的另外两个结合另一TAA。在一些实施方案中，四个TAA sdAb中的三个结合相同的TA，并且四个TAA sdAb中的第四个结合不同的TAA。在任何所提供的实施方案中，所述TAA是如章节IIIC(c)(ii)中所述的任一个。在任何所提供的实施方案中，掺入的TAA sdAb(VHH)是或含有如章节IIIC(c)(ii)中所述的任何TAA VHH序列。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括至少一个具有SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的TAA sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个具有SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的TAA sdAb。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括至少一种具有SEQ ID NO:240所示氨基酸序列的TAA sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两个具有SEQ ID NO:245所示氨基酸序列的TAA sdAb。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括具有SEQ ID NO:240所示氨基酸序列的TAA sdAb以及具有SEQ ID NO:245所示氨基酸序列的TAA sdAb。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(TAAsdAb)-接头-(CD28 sdAb)。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(TAA sdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-(CD28sdAb)。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端含有：(TAA sdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-(CD28 sdAb)。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包括结合蛋白A的部分。在一些实施方案中，所述结合蛋白A的部分有助于纯化多特异性多肽构建体，尤其是那些没有Fc区的那些多肽构建体。
c.Fc区
在一些实施方案中，所述条件性多特异性CD28结合多肽进一步包括免疫球蛋白Fc区，如章节IIIA或IIIC(c)(iii)中所述的任一个。
在一些实施方案中，所述Fc区经由一个或多个接头连接至所述至少一个CD28sdAb。在一些实施方案中，所述Fc区经由一个或多个不可切割接头连接至所述至少一个CD28 sdAb。在一些实施方案中，所述Fc区经由可切割接头或者一个或多个在其他方面不稳定的接头连接至所述至少一个CD28 VHH结合区。
所提供的条件性多特异性多肽构建体包括如下构型，其中所述Fc区在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个的C末端。在这样的实施方案中，所述Fc结构域和CD28 sdAb经由在所述Fc区的N末端的接头连接。在一些实施方案中，所述Fc结构域位于所述多特异性多肽构建体的羧基末端(C末端)区上。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽含有一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。在一些实施方案中，所述TAA sdAb在所述CD28 sdAb的N末端，因此所述TAA sdAb在TAA sdAb的C末端与所述CD28 sdAb连接。
因此，在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端包括：(TAAsdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(CD28sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽是由各自含有Fc的多肽形成的二聚体。
在一些实施方案中，所述条件性多特异性多肽构建体是二聚体，其中二聚化通过两条多肽链之间的共价或非共价相互作用形成。在一些实施方案中，这两条多肽链通过例如链间二硫键彼此共价键合。在一些实施方案中，所述Fc区经由链间二硫键介导二聚化。
在一些实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有同二聚体Fc区(如章节IIIA或IIIC(c)(iii)中所述的任一个)，其介导相同的CD28结合多肽链(如上文所述的任一种)的二聚化。因此，在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两条多肽链，每条多肽链从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包含两条多肽链，每条多肽链从N末端到C末端包括：(TAAsdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包含两条多肽链，每条多肽链从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(CD28sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括两条多肽链，每条多肽链从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(TAA sdAb)-接头-(CD28sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc。
在特定实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有异二聚体Fc区(如章节IIIA或IIIC(c)(iii)中所述的任一个)，其中在一些情况下，所述多特异性多肽构建体的多肽链是不同的(异二聚体)。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含异二聚体Fc区的第一Fc多肽以及任选地至少一个CD28 VHH和/或一个或多个TAA结合结构域，所述第二多肽包含异二聚体Fc区的第二Fc多肽以及任选地至少一个CD28 VHH和/或一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，所述第一和/或第二多肽包含由接头连接的至少一个CD28 VHH以及一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，所述第一多肽含有零、一、二或三个与CD28结合的sdAb。在一些实施方案中，所述第二多肽含有零、一、二或三个与CD28结合的sdAb。在一些实施方案中，所述第一多肽含有零、一、二或三个与TAA结合的TAA结合结构域。在一些实施方案中，所述第二多肽含有零、一、二或三个与TAA结合的TAA结合结构域。在一些实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有至少一个CD28 sdAb。在一些实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有至少两种CD28 sdAb。在一些实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，条件性多特异性多肽构建体含有至少两个TAA结合结构域。
在一些情况下，所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个位于所述Fc多肽的N末端。在一些情况下，所述至少一个或多个TAA结合结构域中的至少一个位于Fc多肽的N末端。在一些情况下，所述一个或多个TAA结合结构域中的至少一个位于所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个的N末端。在一些情况下，所述至少一个或多个TAA结合结构域中的至少一个和至少一个CD28 VHH结构域位于Fc多肽的N末端。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有第一TAA sdAb、CD28 VHH以及异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有第二TAA sdAb、任选地相同或不同的TAA、CD28 VHH、任选地相同或不同的VHH以及所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。与TAA结合的sdAb可以位于相对于所述异二聚体Fc的Fc多肽的氨基末端和/或相对于CD28 VHH的氨基末端。与TAA结合的sdAb可以位于相对于所述异二聚体Fc的Fc多肽的氨基末端以及相对于所述至少一个CD28 VHH中的至少一个的氨基末端。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有一个或多个TAA sdAb、至少一个CD28 VHH以及异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有至少一个CD28 VHH和异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有一个或多个TAA sdAb和所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有一个或多个TAA sdAb、至少一个CD28 VHH和异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有一个或多个TAA sdAb和所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有一个或多个TAA sdAb、至少一个CD28 VHH以及异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有至少一个CD28 VHH和所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽由两种多肽形成或包括两种多肽，所述两种多肽包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有一个或多个TAA sdAb和异二聚体Fc区的第一Fc多肽，所述第二多肽具有至少一个CD28 VHH和所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽不含有CD3结合结构域。在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽接合CD28，而与CD3无关。
b.受限CD3多特异性构建体
在任何所提供的实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽还含有CD3结合区。因此，在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽包括至少一个CD28结合结构域(例如sdAb)、一个或多个TAA结合结构域(例如sdAb)、Fc区以及CD3结合区。在一些实施方案中，所述CD3结合区在Fc区的C末端。例如，在一些实施方案中，多特异性CD28接合多肽从N末端到C末端包括：(TAA sdAb)-接头-(CD28 sdAb)-接头-Fc-CD3结合区。
在一些实施方案中，所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个TAA结合区或者所述一个或多个TAA结合区中的每一个与其抗原结合。在一些实施方案中，就结合和/或接合CD3的能力而言，本文提供的多特异性CD28结合多肽以两种状态存在：(1)当所述一个或多个抗原结合结构域中的任一个或全部未结合TAA时，发生“无活性”状态，使得CD3结合具有条件性且CD3接合被排除或降低，和(2)当所述一个或多个抗原结合结构域中的任一个或全部与TAA进行抗原结合时，发生“活性”状态，使得CD3结合区能够接合CD3。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽还包括抗CD3结合结构域的一个或多个拷贝。本公开文本的抗CD3结合结构域经由接合T细胞上的CD3或CD3复合物的成员来激活T细胞。在一些实施方案中，本公开文本的抗CD3结合结构域特异性结合CD3的ε链(也称为CD3ε)。本公开文本的抗CD3ε结合结构域经由接合T细胞上的CD3ε来激活T细胞。本公开文本的抗CD3结合结构域激动、刺激、激活和/或以其他方式增大CD3介导的T细胞激活。CD3的生物活性包括例如通过CD3与T细胞受体(TCR)的抗原结合亚基之间的相互作用进行的T细胞激活和其他信号传导。例如，本公开文本的抗CD3结合结构域经由接合T细胞上的CD3ε，通过部分或完全调节(例如，激动、刺激、激活或以其他方式增大)CD3介导的T细胞激活来完全或部分激活T细胞。
所述CD3结合结构域可以是如上所述的任一个。在特定实施方案中，所述CD3结合结构域是结合CD3ε的Fv抗体片段(在本文中称为抗CD3εFv片段)。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段是二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域对于结合CD3是单价的。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是含有可变重链(Hv，也称为VH)和可变轻链(Lv，也称为VL)的Fv抗体片段，如所述的任一种。在此类实施方案的方面中，所述免疫球蛋白Fc区是异二聚体Fc区，其含有能够在Fc异二聚体的两种多肽之间进行异二聚体缔合的两种不同的Fc多肽，如本文所述的任一种。在此类实施方案中，所述CD3结合区的可变重链(VH)和可变轻链(VL)连接在异二聚体Fc的相对链上。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是SP34的Fv或dsFv(Pessano等人The EMBOJournal.4:337-344,1985)或SP34的人源化变体(WO 2015001085)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv(如dsFv)片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述CD3结合结构域是Fv或dsFv片段，其含有至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)的VL CDR3序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv(如dsFv)片段，所述Fv片段包括选自SEQ ID NO:35-65、340、341或283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:66-84、281、338或339的轻链可变氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包含至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:252)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:286)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQID NO:252)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:286)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包含至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:252)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:286)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:304)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:288)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQID NO:252)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:286)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:304)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:288)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包含至少包括氨基酸序列GFTFSTYAMN(SEQ ID NO:302)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:303)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO:287)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:304)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:288)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFSTYAMN(SEQID NO:302)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:303)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO:287)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:304)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:288)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包含至少包括氨基酸VLWYSNRWV(SEQID NO:289)的CDR3。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸VLWYSNRWV(SEQ ID NO:289)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的CDR3。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域包括结合CD3ε的Fv抗体片段(在本文中称为抗CD3εFv片段)。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段是二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域对于结合CD3是单价的。
在一些实施方案中，所述CD3结合区不是单链抗体。例如，在一些方面，所述CD3结合区不是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是含有可变重链(Hv，也称为VH)和可变轻链(Lv，也称为VL)的Fv抗体片段，如所述的任一种。在此类实施方案的方面中，所述免疫球蛋白Fc区是异二聚体Fc区，其含有能够在Fc异二聚体的两种多肽之间进行异二聚体缔合的两种不同的Fc多肽，如章节III.C.2.b中所述的任一种。在此类实施方案中，所述CD3结合区的可变重链(VH)和可变轻链(VL)连接在异二聚体Fc的相对链上。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的组合，所述重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列包含选自SEQID NO:27、28、35-84、281、338-341和283的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括选自SEQ ID NO:27、35-65、340、341和283的重链可变区氨基酸序列和含有选自SEQ ID NO:28、66-84、281、338和339的氨基酸序列的轻链可变区氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:35-84、281、338-341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:35-84、281、338-341和283的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括选自SEQ ID NO:35-65、340、341和283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:66-84、281、338和339的轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括与选自SEQ ID NO:35-65、340、341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:66-84、281、338和339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv或dsFv片段，所述Fv或dsFv片段包括与选自SEQ ID NO:35-65、340、341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:66-84、281、338和339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3结合结构域是Fv或dsFv，所述Fv或dsFv含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3结合结构域是Fv或dsFv，所述Fv或dsFv含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:27、28、35-84、281、338-341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:27、28、35-84、281、338-341和283的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:27、35-65、340、341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:28、66-84、281、338和339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:27、35-65、340、341和283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:28、66-84、281、338和339的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:27、35-46、48-50、340、341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:28、66、68-74、76、78、80、281、338和339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:27、35-46、48-50、340、341和283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:28、66、68-74、76、78、80、338和339的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:27、35-46、48-50、340、341和283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:28、66、68-74、76、78、80、281、338和339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:27、35-46、48-50、340、341和283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:28、66、68-74、76、78、80、281,338和339的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:340的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:338的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ IDNO:340的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:338的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:340的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:338的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:340的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:338的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在特定实施方案中，所述Fv是二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)，其中VH-VL异二聚体是通过链间二硫键稳定化的。在一些实施方案中，通过VH和/或VL链的框架位置中的位置突变来工程化链间二硫键。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3Fv包含具有至Cys的突变44的抗CD3 VH和具有至Cys的突变100的抗CD3 VL。例如，在一些实施方案中，VH链含有突变G44C，并且VL链含有突变G100C，每个所述突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3 Fv包含具有至Cys的在位置105处的突变的抗CD3 VH和具有至Cys的在位置43处的突变的抗CD3 VL。
在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:47、52-65、341或283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:67、75、77、79、81-84、281或339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。在任何此类实施方案中的一些中，所述抗CD3 Fv是dsFv，其具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，各自根据kabat编号。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:47、52-65、341或283的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:67、75、77、79、81-84、281或339的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:75的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:75的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，所述抗CD3 Fv是dsFv，其具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，各自根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:341的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ IDNO:341的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，所述抗CD3 Fv是dsFv，其具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，各自根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:341的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:339的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:341的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:339的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ IDNO:283的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:339的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，所述抗CD3 Fv是dsFv，其具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，各自根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:283的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:339的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:283的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:339的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
c.多特异性形式的组分
i.CD28 VHH抗原结合结构域
本文所述的多特异性CD28结合多肽包括本文提供的任一种中的至少一个CD28VHH结构域，如章节II中所述那些中的任一个。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一个CD28 VHH是或包含SEQ ID NO:188所示的序列。在一些情况下，所述至少一个CD28 VHH是或包含SEQ ID NO:220所示的序列。在一些情况下，所述至少一个CD28 VHH是或包含SEQ ID NO:280所示的序列。
在特定实施方案中，多特异性CD28结合多肽含有至少两个CD28结构域。在特定实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽构建体含有至少三个或至少四个CD28结构域。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD28 VHH结构域包含SEQ ID NO:186-188、213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
在一些情况下，至少一个CD28 VHH结构域位于相对于至少一个TAA结合结构域的羧基末端。在一些情况下，至少一个CD28 VHH结构域位于相对于至少两个TAA结合结构域的羧基末端。在一些情况下，至少两个CD28 VHH结构域位于相对于至少一个TAA结合结构域的羧基末端。在一些情况下，至少两个CD28 VHH结构域位于相对于至少两个TAA结合结构域的羧基末端。
在一些情况下，至少一个CD28 VHH结构域位于相对于Fc区的氨基末端。在一些情况下，至少一个CD28 VHH结构域位于相对于同二聚体Fc的Fc区的氨基末端。在一些情况下，至少一个CD28 VHH结构域位于相对于异二聚体Fc的Fc区的氨基末端。在一些情况下，至少两个CD28 VHH结构域位于相对于Fc区的氨基末端。在一些情况下，至少两个CD28 VHH结构域位于相对于同二聚体Fc的Fc区的氨基末端。在一些情况下，至少两个CD28 VHH结构域位于相对于异二聚体Fc的Fc区的氨基末端。
在一些实施方案中，至少一个CD28 VHH位于相对于TAA结合结构域的羧基末端以及相对于Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，至少两个CD28 VHH位于相对于TAA结合结构域的羧基末端以及相对于Fc区的氨基末端。
在含有至少两个或含有两个CD28 VHH结构域的多特异性CD28结合多肽构建体的各个方面，CD28 VHH结构域中的每一个都可以与CD28上的相同或重叠表位结合。
在含有至少两个或含有两个CD28 VHH结构域的多肽构建体的各个方面，CD28 VHH结构域中的每一个都可以与CD28上的不同或非重叠表位结合。
在一些情况下，第一sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或其人源化变体或者展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合CD28；并且第二sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或其人源化变体或者展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合CD28。
在一些情况下，第一sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQID NO:213-239和280中任一个所示的其人源化变体；并且第二sdAb VHH结构域包含SEQ IDNO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的其人源化变体。在一些情况下，第一sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的其人源化变体；并且第二sdAb VHH结构域包含SEQ IDNO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的其人源化变体。在一些情况下，第一sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQ IDNO:213-219、221-239和280中任一个所示的其人源化变体；并且第二sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的其人源化变体。在一些情况下，第一sdAb VHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的其人源化变体；并且第二sdAbVHH结构域包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的其人源化变体。
在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ IDNO:188和SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ ID NO:280和SEQ IDNO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域包含选自SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:220的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAbVHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域包含选自SEQ IDNO:188和SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域包含选自SEQ ID NO:220和SEQ IDNO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一sdAb VHH结构域和第二sdAb VHH结构域分别包含SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
ii.结合结构域(例如TAA结合结构域)
本公开文本的多特异性CD28结合多肽包括一个或多个结合不是CD28的抗原的另外的结合结构域(BD)。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD是一个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是两个、三个、四个或更多个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是两个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是三个BD。在一些实施方案中，所述一个或多个BD是四个BD。
在一些方面，所述一个或多个BD结合T细胞激活标记物。在一些方面，所述一个或多个BD结合T细胞耗竭标记物。在一些方面，所述一个或多个BD结合肿瘤微环境标记物。
在一些实施方案中，所述T细胞激活标记物选自CD25、CD44、CD69、CD71、CD107a、CD137、HLA-DR和/或KLRG1。在一些实施方案中，所述T细胞耗竭标记物选自2B4、CD160、LAG3、PD-1和/或TIGIT。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境标记物选自α-SMA、EDB、FAP、FSP-1、PDGFRα和/或PDGFRβ。
在一些方面，所述一个或多个另外的结合结构域是结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域，如一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个TAA结合结构域。在一些方面，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个选自抗体或抗原结合片段、天然(natural或native)同源结合配偶体、抗运载蛋白(Anticalin)(工程化脂质运载蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin(工程化纤连蛋白III结构域)、半胱氨酸-杵结构域、阿菲林(Affilin)、亲和体(Affibody)或工程化CH3结构域。在一些实施方案中，所述天然同源结合配偶体包含所述TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个包括选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是单链抗体。在一些例子中，所述单链是scFv、scAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是单链抗体。在一些例子中，所述单链是scFv、scAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个包括单结构域抗体(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、工程化VH或VK结构域。VHH可以从天然骆驼科动物仅重链抗体、产生仅重链抗体的经基因修饰的啮齿动物或幼稚/合成的骆驼科动物或人源化骆驼科动物单结构域抗体库产生。VNAR可以由软骨鱼仅重链抗体产生。已经实施了各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，所述方法包括特异性种系家族的界面工程化和选择。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD或独立地所述BD中的每一个含有结合CD28以外的抗原的sdAb。在一些实施方案中，所述一个或多个BD位于相对于CD28 VHH的氨基末端。在一些实施方案中，所述一个或多个BD位于相对于Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，所述一个或多个BD位于相对于CD28 VHH和Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体仅含有一个BD，所述BD可以位于相对于CD28 VHH的氨基末端或相对于CD28 VHH的羧基末端。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽含有两个BD，所述BD位于相对于CD28 VHH的氨基末端和/或相对于CD28 VHH的羧基末端。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽构建体含有三个BD，其中两个BD位于相对于CD28 VHH的氨基末端，第三个BD位于所述多特异性CD28结合多肽构建体的另一端。
在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽的一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个含有结合TAA的sdAb。在一些实施方案中，结合TAA的一个或多个scFv或sdAb位于相对于CD28 VHH的氨基末端。在一些实施方案中，结合TAA的一个或多个sdAb位于相对于Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，结合TAA的一个或多个sdAb位于相对于CD28 VHH和Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体仅含有一个结合TAA的sdAb，所述sdAb可以位于相对于CD28 VHH的氨基末端或相对于CD28 VHH的羧基末端。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽含有两个结合TAA的sdAb，所述sdAb位于相对于CD28 VHH的氨基末端和/或相对于CD28 VHH的羧基末端。在一些实施方案中，所述多特异性CD28结合多肽构建体含有三个sdAb，其中两个sdAb位于相对于CD28 VHH的氨基末端，第三个sdAb位于所述多特异性CD28结合多肽构建体的另一端。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个含有作为单结构域抗体(sdAb)的结合结构域。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个含有多于一条链。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个含有组装成FAB的VH和VL序列。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD或独立地所述BD中的每一个是或包括所述抗原的天然(natural或native)同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述抗原的结合活性的变体。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是或包括所述TAA的天然(natural或native)同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD或独立地所述BD中的每一个结合相同的抗原。在一些实施方案中，存在多于一个结合抗原的BD，并且所述BD中的每一个结合不同的抗原。在一些实施方案中，所述BD中的每一个结合相同的抗原。在一些实施方案中，所述BD中的每一个结合不同的抗原。在一些实施方案中，所述BD中的每一个结合相同抗原上的不同表位。在一些实施方案中，所述BD中的每一个结合相同抗原上的相同表位。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个结合相同的抗原。在一些实施方案中，存在多于一个结合TAA的抗原结合结构域，并且所述抗原结合结构域中的每一个结合不同的抗原。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的每一个结合相同的肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的每一个结合不同的TAA。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的每一个结合相同TAA上的不同表位。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的每一个结合相同TAA上的相同表位。
在一些实施方案中，结合抗原的一个或多个BD或独立地所述BD中的每一个导致与所述抗原的单价、二价、三价或四价结合。在一些实施方案中，与所述抗原的二价结合包含两个结合相同抗原的相同表位的BD(例如单表位的)。在一些实施方案中，与所述抗原的二价结合包含两个结合相同抗原的不同表位的BD(例如双表位的)。在一些实施方案中，与所述抗原的单价结合包含一个结合所述抗原的一个表位的BD(例如单表位的)。
在一些实施方案中，结合TAA的一个或多个抗原结合结构域或独立地所述抗原结合结构域中的每一个导致与所述TAA的单价、二价、三价或四价结合。在一些实施方案中，与所述TAA的二价结合包含两个结合相同抗原的相同表位的抗原结合结构域(例如单表位的)。在一些实施方案中，与所述TAA的二价结合包含两个结合相同抗原的不同表位的抗原结合结构域(例如双表位的)。在一些实施方案中，与所述TAA的单价结合包含一个结合抗原的一个表位的抗原结合结构域(例如单表位的)。
在一些实施方案中，所述一个或多个BD结合的抗原选自：1-92-LFA-3，2B4，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，α-SMA，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD69，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD107a，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD160，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，FSP-1，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HLA-DR，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2)，KISS1-R，KLRG1，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/K ATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
在一些实施方案中，所述TAA选自：1-92-LFA-3，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2，KISS1-R，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/K ATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
在一些实施方案中，所述TAA是PDL1。在一些实施方案中，所述TAA是Siglec15。在一些实施方案中，所述TAA是B7H3。在一些实施方案中，所述TAA是B7H4。在一些实施方案中，所述TAA是IL1RaP。在一些实施方案中，所述TAA是IL13Ra2。在一些实施方案中，所述TAA是gpNMB。在一些实施方案中，所述TAA是间皮素。在一些实施方案中，所述TAA是EGFR。在一些实施方案中，所述TAA是cMET。在一些实施方案中，所述TAA是HER2。在一些实施方案中，所述TAA是ENPP3。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)叶酸受体α(FRα)。例如，所述抗原结合结构域含有作为结合FRα的sdAb的结合结构域。示例性FRα结合sdAb示出于SEQ ID NO:253、254和255中的任一个中。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合FRα。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)5T4。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性5T4结合sdAb示出于SEQ ID NO:240或245中的任一个中。在一些实施方案中，所述VHH含有分别如SEQ ID NO:241、242和243所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述5T4结合sdAb示出于SEQ ID NO:240中。在一些实施方案中，所述VHH含有分别如SEQ ID NO:246、247和248所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述5T4结合sdAb示出于SEQ IDNO:245中。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有结合5T4的包含Fd和LC的Fab抗体片段。示例性5T4 Fd示出于SEQ ID NO:256中，并且示例性5T4 LC示出于SEQ ID NO:257中。在一些实施方案中，所述抗体结合结构域包含如SEQ ID NO:258和259所示的VH-CH1(Fd)或VL-CL(美国专利号US 8,044,178)。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合5T4。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)PDL1。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性PDL1结合sdAb示出于SEQ ID NO:99中。在一些实施方案中，所述VHH含有分别如SEQ ID NO:100、101和102所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有结合PDL1的包含Fd和LC的Fab抗体片段。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合PDL1。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)cMET。例如，所述抗原结合结构域含有作为结合cMET的sdAb的结合结构域。示例性cMET结合sdAb示出于SEQ ID NO:260中(美国专利号9,346,884)。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合cMET。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)B7H3。例如，所述抗原结合结构域含有作为结合B7H3的scFv的结合结构域。示例性B7H3结合scFv示出于SEQ ID NO:261中。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性B7H3结合sdAb示出于SEQ ID NO:262-266中的任一个中。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有包含VH-CH1(Fd)和LC的Fab抗体片段。示例性B7H3Fd示出于SEQ ID NO:267中，并且示例性B7H3 LC示出于SEQ ID NO:268中(PCT公开号WO2017/030926)。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合B7H3。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)CD20。在一些实施方案中，这种抗原结合结构域含有SEQ ID NO:269所示的VH和SEQ ID NO:270所示的VL或展现出与SEQ ID NO:269或SEQ ID NO:270至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、98％或99％序列同一性的序列。例如，所述抗原结合结构域含有作为结合CD20的scFv的结合结构域。示例性CD20结合scFv示出于SEQ ID NO:271中(美国公开号US 2005/0123546)。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合CD20。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)DLL3。例如，所述抗原结合结构域含有作为结合DLL3的scFv的结合结构域。示例性DLL3结合scFv示出于SEQ ID NO:272和273中(美国公开号US 2017/0037130)。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性DLL3结合sdAb示出于SEQ IDNO:274或SEQ ID NO:275中的任一个中。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有结合DLL3的包含Fd和LC的Fab抗体片段。示例性DLL3 Fd示出于SEQ ID NO:276中，并且示例性DLL3 LC示出于SEQ ID NO:277中(美国专利号US 8,044,178)。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合DLL3。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)gpNMB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有包含Fd和LC链的Fab片段。示例性gpNMB Fd示出于SEQ ID NO:278中，并且示例性gpNMB LC示出于SEQID NO:279中。所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ ID NO具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合gpNMB。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域直接或经由接头间接连接至CD28VHH区和/或Fc肽。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域直接或经由接头间接连接至CD28 VHH区。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域直接或间接连接至Fc肽。在一些实施方案中，连接是经由接头。在一些实施方案中，所述接头是连接肽(LP)，其可以包括如章节IIIC(d)所述的任何柔性或刚性接头，但是通常连接所述一个或多个抗原结合结构域的肽不是可切割接头。
在一些实施方案中，所述连接肽是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述连接肽是如下肽，其是或包含SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、142、244和249中任一个所示的任何Gly-Ser接头。
iii.Fc区
在一些实施方案中，本文提供的CD28结合多肽包括免疫球蛋白Fc区。所述Fc多肽可以是如章节IIIA所述的任一种。在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在特定实施方案中，所述Fc区由Fc结构域形成，所述Fc结构域被突变或修饰以促进异二聚化，其中不同的多肽可以被二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，所述二聚体是其中所述多特异性多肽构建体的两条多肽链不同的异二聚体。
用于促进互补Fc多肽异二聚化的各种方法是已知的，参见例如，Ridgway等人,Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等人,Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；Moore等人(2011)MAbs,3:546-57；Von Kreudenstein等人MAbs,(2013)5:646-54；Gunasekaran等人(2010)J.Biol.Chem.,285:19637-46；Leaver-Fay等人(2016)Structure,24:641-51；Ha等人(2016)Frontiers in Immunology,7:1；Davis等人(2010)Protein EngDes Sel,23:195-202；公开的国际PCT申请号WO 1998/050431，WO 2009/089004，WO2011143545，WO 2014/067011，WO 2012/058768，WO 2018027025；公开的美国专利申请号US20140363426，US 20150307628，US 20180016354，US 20150239991；以及美国专利号US5731168，US 7183076，US 9701759，US 9605084和US 9650446。促进Fc链异二聚化的方法包括诱变Fc区，如通过包含一组“杵臼结构”突变或包含突变以实现Fc的静电操纵以有利于不同多肽链之间的吸引相互作用。例如，在一些实施方案中，异二聚体的Fc多肽包括突变以改变跨Fc二聚体界面的电荷极性，由此使得静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需的Fc异二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的Fc同二聚体形成(Guneskaran等人(2010)JBC,285:19637-19646)。当在细胞中共表达时，链之间的缔合是可能的，但是由于电荷排斥，链基本上不自缔合。用于产生异二聚体Fc的其他策略包括混合人IgG和IgA CH3结构域区段以产生互补CH3异二聚体，其称为SEED Fc。
用于异二聚化的方法和变体还包括在公开的国际PCT申请WO 2014/145806中所述的那些，包括“杵臼结构”突变(也称为“偏斜”变体)、与“静电操纵”或“电荷对”和pI变体有关的突变。异二聚体变体还包括美国公开的申请号US 2012/0149876或US 2018/011883中所述的任一种。
在一些实施方案中，为了促进异二聚化，所述Fc异二聚体的两种多肽均含有成对的或互补的氨基酸修饰。Fc融合物的多肽的示例性成对氨基酸修饰示出于表3中。
Figure BDA0003858954760001001
Figure BDA0003858954760001011
在一些实施方案中，修饰包括将突起(杵)引入第一Fc多肽中并将腔(臼)引入第二Fc多肽中，使得突起可位于腔中以促进第一和第二含Fc的多肽的复合。被靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突起或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰以含有突起(杵)氨基酸的第一Fc多肽包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，所述至少一个侧链从第一Fc多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(臼)中。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定产生突起的理想的替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成突起的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如像丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在一些实施方案中，被修饰以含有腔(臼)的第二Fc多肽是包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，所述至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突起。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何确定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如像酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
例如，人IgG1的CH3界面包含在位于四个反平行β链上的每个结构域上的十六个残基，所述每个结构域自每个表面插入1090
Figure BDA0003858954760001012
(参见例如，Deisenhofer等人(1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller等人,(1990)J Mol.Biol.,216,965-973；Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621；美国专利号5,731,168)。用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰例如描述于以下文献中：美国专利号5,731,168；国际专利申请WO 98/50431和WO 2005/063816；以及Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621。在一些例子中，用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰通常靶向位于两个中心反平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的突起可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体CH3结构域中的补偿腔容纳。
例如，在一些实施方案中，所述异二聚体Fc包含CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰的多肽，当用较大体积氨基酸(例如，Try(T366W))替代时，所述多肽能够优先与在位置Thr366、Leu368和Tyr407处具有较小体积氨基酸的氨基酸修饰(例如，分别为Ser、Ala和Val(T366S/L368A/Y407V))的第二CH3结构域配对。可以通过引入二硫键，例如通过在相对的CH3结构域上将Ser354变为Cys(S354C)并将Tyr349变为Cys(Y349C)进一步稳定经由CH3修饰进行的异二聚化(综述于Carter,2001 Journal of Immunological Methods,248:7-15中)。
在特定实施方案中，多特异性CD28结合多肽构建体含有能够介导Fc异二聚化的第一Fc和第二Fc，所述第一Fc和所述第二Fc包含含有突变T366W和S354C的第一Fc多肽和含有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽选自包含SEQ ID NO:328或334所示的序列的Fc多肽，并且所述第二Fc多肽选自包含SEQ ID NO:329、332或336所示的序列的Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ IDNO:103、107、115或117中任一个所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ IDNO:104、108、111、113、119或121中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc多肽展现出提供Fc介导的效应子功能的特征。在特定例子中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:328所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:329或332。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:103所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:104或111所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:107所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:108或113所示的序列。所述第一Fc多肽和第二Fc多肽可以在所述构建体的任一多肽链上形式化。
在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一种或两种还可以包括一个或多个氨基酸突变，以进一步降低一种或多种Fc效应子功能，如降低的Fc受体结合。降低Fc效应子功能的示例性突变包括所述的任一种。在一些实施方案中，修饰可以是一个或多个位置Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)的缺失，如氨基酸Glu233(E233)、Leu234(L234)和Leu235(L235)的缺失。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽选自包含SEQID NO:328或334所示的序列的Fc多肽，并且所述第二Fc多肽选自包含SEQ ID NO:329、332或336所示的序列的Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:105、109、116或118中任一个所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:106、110、112、114、120或122中任一个所示的氨基酸序列。
在特定例子中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:330所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:331或333。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQID NO:105所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:106或112所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:109所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:110或114所示的序列。所述第一Fc多肽和第二Fc多肽可以在所述构建体的任一多肽链上形式化。
在一些实施方案中，所述第一Fc多肽或第二Fc多肽还包括突变M252Y和/或M428V。在特定例子中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:334所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:336所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ IDNO:115所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:119所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:117所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:121所示的序列。在其他例子中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:335所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:337所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:116所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQID NO:120所示的序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:118所示的序列，并且所述第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:122所示的序列。所述第一Fc多肽和第二Fc多肽可以在所述构建体的任一多肽链上形式化。
可以有利于促成异二聚体的变体的另外的例子是来自以下中的第一Fc多肽和第二Fc多肽的任何组合或任何对的空间变体(例如偏斜变体)：S364K/E357Q和L368D/K370S；L368D/K370S和S364K；L368E/K370S和S364K；T411T/E360E/Q362E和D401K；L368D/K370S和S364K/E357L；K370S和S364K/E357Q；以及T366S/L368A/Y407V和T366W或366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)，其中每对代表第一Fc多肽和第二Fc多肽中的突变。在特定实施方案中，所提供的构建体包含含有突变对L368D/K370S以及S364K和E357Q的第一Fc多肽和第二Fc多肽。
可以用于产生异二聚体的另外的机制有时称为“静电操纵”，如Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述。这在本文中有时称为“电荷对”。在此实施方案中，使用静电使形成偏斜向异二聚化。如本领域技术人员将了解的，这些也可能对pI具有影响，因此对纯化具有影响，因此在一些情况下也可以认为是pI变体。然而，由于这些被产生用以迫使异二聚化并且不用作纯化工具，因此将它们归类为“空间变体”。在一个实施方案中，第一Fc多肽可以含有突变D221E/P228E/L368E，并且第二Fc多肽可以含有突变D221R/P228R/K409R。在另一个实施方案中，第一Fc多肽可以含有突变C220E/P228E/368E，并且第二Fc多肽可以含有突变C220R/E224R/P228R/K409R。
在一些实施方案中，异二聚化可以通过pI变体促进。在一些方面，pI变体可以包括增加蛋白质的pI(碱性变化)的那些。在其他方面，pI变体可以包括降低蛋白质的pI(酸性变化)的那些。在一些情况下，可以进行这些变体的所有组合，包括这样的组合，其中一种Fc多肽可以是野生型或者不显示出与野生型显著不同的pI的变体，而另一种Fc多肽可以是更具碱性或更具酸性的。可替代地，可以改变每种Fc多肽，一种改变为更具碱性的并且一种改变为更具酸性的。在一些实施方案中，至少一种Fc多肽是含有突变Q295E/N384D/Q418E/N421D的负pI变体Fc。
在一些实施方案中，可以使用空间异二聚化变体(例如杵和臼)和pI或电荷对变体的组合。
在特定实施方案中，所提供的构建体含有(a)包含偏斜变体S364K/E357Q的第一Fc多肽；以及b)含有偏斜变体L368D/K370S和pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽中的一种或两种可以含有进一步的突变以降低Fc效应子活性，如示例性突变E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。能够介导Fc异二聚化的这种第一Fc多肽和第二Fc多肽的例子包含SEQ ID NO:284和285所示的序列。所述第一Fc多肽和第二Fc多肽可以在所述构建体的任一多肽链上形式化。
所得的条件性多特异性多肽构建体可以通过任何合适的方法(例如像通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱)纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化到细胞中的情况下，将形成同二聚体和异二聚体。可以调整表达条件，使得相对于同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
基于异二聚体对亲和试剂的不同亲和力从同二聚体中回收异二聚体的技术是已知的。在一些方面，此类技术包括设计异二聚体为使得Fc多肽链之一不结合至亲和试剂蛋白A。在一些情况下，多肽链之一可以含有一个或多个氨基酸取代以消除或降低Fc异二聚体的多肽之一对蛋白A试剂的亲和力，参见例如WO 2017134440、WO 2010151792、Jendeberg等人(Jendeberg等人,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34)。在这些实施方案中的一些中，所述Fc区可以在异二聚体的一个成员上的蛋白A结合位点处被修饰，以防止蛋白A结合，从而能够更有效地纯化异二聚体融合蛋白。在此结合位点内的示例性修饰是Ile253，例如Ile253Arg(I253R)。在一些实施方案中，修饰可以是H435R或H435R/Y436F。在一些实施方案中，Fc异二聚体的Fc多肽可以含有修饰，使得其能够结合蛋白A但是不结合蛋白G(pA+/pG-)。示例性的pA+/pG-氨基酸修饰包括在位置428处含有丝氨酸、在位置434处含有丝氨酸和任选地在位置436处含有组氨酸的Fc，参照人IgGl或在人IgG 2、3或4的相应位置处包含这些残基。在一些方面，一种IgG Fc多肽中在位置428、434和任选的436处的此类氨基酸修饰降低或防止蛋白G的结合，从而增强蛋白质的纯化。
在一些实施方案中，赋予对亲和试剂的差异亲和力的任何此类修饰可以与上文所述的任何一个或多个其他氨基酸修饰组合。例如，I253R修饰可以与T366S/L368A/Y407V修饰或与T366W修饰组合。T366S/L368A/Y407V修饰的Fc能够形成同二聚体，因为不存在如同在T336W修饰的Fc的情况下二聚化界面的空间闭塞。因此，在一些实施方案中，将I253R修饰与T366S/L368A/Y407V修饰的Fc组合，从而不允许纯化可能已经形成的任何同二聚体Fc。可以通过组合T366S/L368A/Y407V和H453R来采用类似的修饰。
在一些实施方案中，所述异二聚体分子的Fc区另外可以含有一个或多个其他Fc突变，如上文所述的任一种。在一些实施方案中，所述异二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区被改变以提供降低的Fc介导的效应子功能，如经由降低的Fc受体结合，例如与FcγR结合，但是总体上没有FcRn结合。
在一些实施方案中，所述Fc区在以下位置中的一个或多个中被突变以降低Fc受体结合：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)。所述一个或多个突变可以包括E233P、L234V和/或L235A。
在特定实施方案中，用于降低Fc效应子功能(例如经由降低Fc受体与FcγR的结合)的Fc区的突变包括来自以下中的任一种的突变：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G或E233P/L234V/L235A/G236del、D265A/P329A、D265A/P329G、D265A/N297A、L234V/L235A/D265A、L234V/L235A/N297A、L234V/L235A/P329A或L234V/L235A/P329G。
在一些实施方案中，异二聚体Fc的一种Fc多肽包含SEQ ID NO:328(例如SEQ IDNO:103或107)、334(例如SEQ ID NO:115或117)中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的另一种Fc多肽含有SEQ ID NO:329(例如SEQ ID NO:104或108)、332(例如SEQ IDNO:111或113)、336(例如SEQ ID NO:119或121)中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，异二聚体Fc的一种Fc多肽包含SEQ ID NO:330(SEQ ID NO:105或109)、335(例如SEQID NO:116或118)中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的另一种Fc多肽包含SEQ ID NO:331(例如SEQ ID NO:106或110)、333(例如SEQ ID NO:112或114)、337(例如SEQID NO:120或122)中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体的Fc区展现出一种或多种效应子功能。在一些情况下，所述Fc区能够提供Fc介导的效应子功能，例如像ADCC(例如，由NK细胞释放颗粒酶B)、ADCP和/或CDC。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外，所述Fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，所述Fc区中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在其中多特异性多肽构建体含有可切割接头的一些实施方案中，接头的切割可以产生两个各自具有生物学活性的组分：能够结合并接合T细胞上的CD3的CD3结合区；可展现出靶标特异性效应子功能的连接至CD28 VHH结构域的Fc区。在本文提供的特定实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有不可切割接头，并且在一些方面可能不展现出独立的Fc介导的效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区包括被突变或修饰以改变一种或多种效应子功能的Fc多肽。因此，在一些情况下，可以在Fc中改变(如降低或增强)效应子功能，如ADCC、ADCP和/或CDC中的一种或多种，以与所提供的条件性多特异性多肽构建体一起使用。降低效应子功能的示例性突变包括上文所述的任一种。
在一些实施方案中，可以将IgG1 Fc多肽或其变体(如下文所述的任一种)制备为G1 m1或G1 m3同种异型。在一些实施方案中，所述Fc区可以含有人G1 m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358处含有Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:8所示。在一些情况下，Fc多肽可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1 m1的残基。在其他实施方案中，所述Fc区可以含有人G1 m3同种异型的氨基酸，如根据EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)，例如如SEQ ID NO:284和285所示。在一些情况下，Fc多肽可以含有氨基酸取代D356E和L358M以重构同种异型G1 m3的残基。
在一些实施方案中，多特异性CD28结合多肽不包括Fc区。
d.接头
在任何所提供的实施方案中，CD28结合多肽含有接头。在一些实施方案中，所述接头与第一组分和第二组分连接或偶联。
例如，CD28 VHH-Fc融合物含有接头，所述接头连接或偶联所述至少一个CD28sdAb中的至少一个与所述Fc区。在一些实施方案中，所述接头位于所述第一组分的C末端区的末端，因此含有所述至少一个CD28 VHH的第一组分在所述Fc区的N末端。
在任何所提供的实施方案中，含有所述一个或多个TAA sdAb和所述至少一个CD28sdAb的多特异性CD28结合多肽包括接头，所述接头连接或偶联所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个和所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个。在一些实施方案中，所述接头位于所述第一组分的C末端区的末端，因此含有所述一个或多个TAA sdAb的第一组分在所述至少一个CD28 sdAb的N末端。
在一些实施方案中，所提供的CD28结合多肽是多聚体，如含有第一多肽和第二多肽的二聚体，因此所提供的构建体包括连接第一组分和第一多肽的至少一个CD28 VHH的接头以及连接第一组分和第二多肽的至少一个CD28 VHH的接头。
在一些实施方案中，所述第一多肽包括至少一个TAA结合结构域和/或至少一个CD28 VHH以及异二聚体Fc区的第一Fc多肽，并且所述第二多肽包括至少一个TAA结合结构域和/或至少一个CD28 VHH以及所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽包括至少一个TAA结合结构域和至少一个CD28 VHH，其中所述TAA结合结构域和所述CD28 VHH通过接头连接。在一些实施方案中，所述第二多肽包括至少一个TAA结合结构域和至少一个CD28 VHH，其中所述TAA结合结构域和所述CD28 VHH通过接头连接。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽各自包括至少一个TAA结合结构域和至少一个CD28 VHH，其中每个多肽的TAA结合结构域和CD28 VHH通过接头连接。在一些实施方案中，所述条件性多特异性CD28结合多肽的第一多肽和第二多肽中存在的接头是相同的。
在一些实施方案中，条件性多特异性CD28结合多肽含有Fc结构域。在一些实施方案中，所述Cd28结合多肽含有接头，所述接头连接或偶联CD28 VHH和Fc结构域。在一些实施方案中，所述接头位于所述CD28 VHH的C末端区的末端，使得所述CD28 VHH在所述Fc结构域的N末端。应理解，由于所提供的条件性多特异性多肽构建体是多聚体，如含有第一多肽和第二多肽的二聚体，因此所提供的构建体包括连接CD28 VHH和第一多肽的Fc结构域的接头以及连接CD28 VHH和第二多肽的Fc结构域的接头。在一些实施方案中，所述第一多肽包括至少一个TAA结合结构域和/或至少一个CD28 VHH以及异二聚体Fc区的第一Fc多肽，并且所述第二多肽包括至少一个TAA结合结构域和/或至少一个CD28 VHH以及所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽包括至少一个CD28 VHH，其中所述CD28VHH和所述Fc结构域通过接头连接。在一些实施方案中，所述第二多肽包括至少一个CD28VHH，其中所述CD28 VHH和所述Fc结构域通过接头连接。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽各自包括至少一个CD28 VHH，其中所述CD28 VHH和每个多肽的Fc结构域通过接头连接。在一些实施方案中，存在于所述CD28结合多肽构建体的第一多肽和第二多肽中的接头是相同的。
用于融合蛋白中的各种多肽接头是已知的(参见例如，Chen等人(2013)Adv.Drug.Deliv.65:1357-1369；以及国际PCT公开号WO 2014/099997，WO 2000/24884；美国专利号5,258,498；美国专利号5,525,491；美国专利号5,525,491，美国专利号6,132,992)。
在一些实施方案中，本公开文本的条件性多特异性多肽构建体包括接头，所述接头连接所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个和所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个。在一些实施方案中，所述接头不是可切割接头。
在一些实施方案，本公开文本的条件性多特异性多肽构建体包括接头，所述接头连接所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个和Fc区。在一些实施方案中，所述接头不是可切割接头。
通常，所述接头也是确保所述多肽构建体正确折叠的接头，不展现出与所连接多肽的活性或功能不一致的电荷，或不与一个或多个结构域中的氨基酸残基形成将阻碍或改变所连接多肽的活性的键或其他相互作用。
在一些实施方案中，所述接头是多肽接头。所述多肽接头可以是柔性接头或刚性接头或两者的组合。在一些方面，所述接头是短的、中等或长的接头。在一些实施方案中，所述接头的长度为至多40个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头的长度为至多25个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头的长度为至少或至少约2个氨基酸。在一些方面，合适的长度是例如至少一个且通常少于约40个氨基酸残基的长度，如2-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基、8-12个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
所述接头可以是天然存在的、合成的或两者的组合。特别合适的接头多肽主要包含选自甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。例如，所述接头可以含有至少75％(基于肽接头中存在的残基的总数计算)，如至少80％、至少85％或至少90％的选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。所述接头也可以仅由Gly、Ser、Ala和/或Thr残基组成。在一些实施方案中，所述接头含有1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8-12个甘氨酸残基。在一些方面，合适的肽接头通常含有至少50％甘氨酸残基，如至少75％甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸和丝氨酸残基。
在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。在一些实施方案中，所述接头含有(GGS)n，其中n是1至10，如1至5，例如1至3，如GGS(GGS)n(SEQ ID NO:244)，其中n是0至10。在特定实施方案中，所述接头含有序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:123)，其中n是1至10或n是1至5，如1至3。在另外的实施方案中，所述接头含有(GGGGGS)n(SEQ ID NO:124)，其中n是1至4，如1至3。所述接头可以包含上述中任一种的组合，如可以组合2、3、4或5个GS、GGS、GGGGS和/或GGGGGS接头的重复。在一些实施方案中，这种接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
在一些实施方案中，所述接头是(以单字母氨基酸代码表示)：GGS(SEQ ID NO:244)、GGGGS(SEQ ID NO:125)、GGGGGS(SEQ ID NO:126)或GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)。在一些实施方案中，所述GS接头包含以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:3)；GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:4)；GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS，即(G5S)3(SEQ ID NO:127)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:129)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:128)。在一些实施方案中，所述接头是GG(SEQ ID NO:249)。在一些实施方案中，所述接头是GGS(SEQ ID NO:244)。在一些实施方案中，所述接头是GGGSGS(SEQ ID NO:90)。在一些实施方案中，所述接头是GGG(SEQ ID NO:87)。在一些实施方案中，所述接头是GGGG(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，所述接头是GGSGGS(SEQ IDNO:1)。在一些实施方案中，所述接头是GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)。在一些实施方案中，所述接头是GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)。在任何以上例子中的一些中，丝氨酸可以被丙氨酸替代(例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在一些实施方案中，所述接头包括具有氨基酸序列Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyz(SEQID NO:130)的肽接头，其中每个Xaa独立地选自丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，并且其中x、y和z各自为范围1-5的整数。在一些实施方案中，每个Xaa独立地选自Ser、Ala和Thr。在具体的变型中，x、y和z中的每一个等于3，从而产生具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:131)的肽接头，其中每个Xaa如上所述选择。
在一些实施方案中，所述接头是基于(SSSSG)y(SEQ ID NO:132)基序的重复的富含丝氨酸的接头，其中y至少是1，但y可以是2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些情况下，可能希望向所述肽接头中提供一些刚性。这可以通过在所述肽接头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基来完成。因此，在一些实施方案中，接头在所述肽接头的氨基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如，肽接头可以具有氨基酸序列，其中至少25％(例如，至少50％或至少75％)的氨基酸残基是脯氨酸残基。在一个特定实施方案中，所述肽接头仅包含脯氨酸残基。
在一些方面，肽接头包含至少一个半胱氨酸残基，如一个半胱氨酸残基。例如，在一些实施方案中，接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。在一些此类实施方案中，接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基，如仅甘氨酸残基和半胱氨酸残基。通常，每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残基的具体接头的一个例子包括具有氨基酸序列Glym-Cys-Glyn的肽接头，其中n和m各自是1-12，例如3-9、4-8或4-7的整数。在具体的变型中，这种肽接头具有氨基酸序列GGGGG-C-GGGGG(SEQ ID NO:133)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的接头是结构化接头。在特定实施方案中，所述结构化接头含有序列(AP)n或(EAAAK)n(SEQ ID NO:134)，其中n是2至20，优选4至10，包括但不限于AS-(AP)n-GT(SEQ ID NO:135)或AS-(EAAAK)n-GT(SEQ ID NO:136)，其中n是2至20，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在其他实施方案中，所述接头包含序列(GGGGA)n(SEQ ID NO:137)、(PGGGS)n(SEQ ID NO:138)、(AGGGS)n(SEQ ID NO:139)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(SEQ ID NO:140，其中n是2至20)、(ADAAP)n(SEQ ID NO:313，其中n是2至20)、(ADAAP)n-G(SEQ ID NO:314，其中n是2至20)、(GEPQG)n(SEQ ID NO:315，其中n是2至20)、(GEPQG)n-G(SEQ ID NO:316，其中n是2至20)、(AGGEP)n(SEQ ID NO:317，其中n是2至20)、((AGGEP)n-G(SEQ ID NO:318，其中n是2至20)、(AGSEP)n(SEQ ID NO:319，其中n是2至20)、(AGSEP)n-G(SEQ ID NO:320，其中n是2至20)、(GGGEQ)n(SEQ ID NO:321，其中n是2至20)、(GGGEQ)n-G(SEQ ID NO:322，其中n是2至20)。在一些实施方案中，所述接头是SSSASASSA(SEQ ID NO:141)、GSPGSPG(SEQ ID NO:142)、ATTTGSSPGPT(SEQ ID NO:143)、ADAAPADAAPG(SEQ ID NO:323)、GEPQGGEPQGG(SEQ ID NO:324)、AGGEPAGGEPG(SEQ ID NO:325)、AGSEPAGSEPG(SEQ ID NO:326)或GGGEQGGGEQG(SEQ ID NO:327)。
在一些实施方案中，此类接头由于其结构可以对蛋白水解降解更具抗性，从而在体内注射时具有优点。
在一些实施方案中，所述接头不是可切割接头，也称为不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可被蛋白酶切割的。在一些实施方案中，并非可切割接头或不可被蛋白酶切割的接头是通常对于体内递送或重组生产稳定的接头。在一些方面，不可被蛋白酶切割的接头包括不含有优选位于蛋白酶的可切割肽序列或识别位点内的至少一个肽键的那些。在特定实施方案中，不可切割接头不是蛋白酶的靶底物，使得与含有相同蛋白酶的底物识别位点的接头相比，其并不被蛋白酶优先或特异性切割。
在一些实施方案中，所述接头不含有特定蛋白酶的底物识别位点或切割位点，所述底物识别位点或切割位点是被蛋白酶切割、由蛋白酶的活性位点识别的序列。通常，例如，对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的P1-P4和P1'-P4'氨基酸组成，其中切割发生在P1位置之后。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列的长度为六个残基，以匹配许多蛋白酶的扩大的底物特异性，但是根据蛋白酶而定可以更长或更短。通常，所述接头不包括由蛋白酶识别的P1-P1'易裂键序列。在一些方面，不可切割接头或不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点的接头是其由蛋白酶的切割明显小于蛋白酶对靶底物的切割的接头。
在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些方面，可切割接头是还包含作为蛋白酶底物的序列的接头，如上文所述的任一种，所述序列因为至少一个键的存在而可以在生理条件下断裂。在一些情况下，可切割接头在体内存在的特定条件下易被切割或对切割敏感，如在暴露于细胞外蛋白酶(包括存在于体内细胞环境中的那些)之后。在一些情况下，所述蛋白酶可能存在于特定的生理微环境(如肿瘤微环境)中，从而限制可能发生切割的部位。
通常，与另一种非靶底物相比，蛋白酶对特定靶底物的切割展现出特异性或优先性。这种特异性程度可以基于序列(例如接头)的切割速率常数确定，所述切割速率常数是蛋白酶对其底物的优先性和酶效率的度量。用于确定在各种浓度的底物的存在下切割随时间增加的速率的任何方法都可以用于计算特异性常数。例如，将底物连接至荧光部分，所述荧光部分在被蛋白酶切割后被释放。通过确定在不同蛋白酶浓度下的切割速率，可以确定特定蛋白酶对特定接头的切割特异性常数(kcat/KM)。在一些实施方案中，可切割接头是能够被蛋白酶以约至少1×104M-1S-1、或至少5×104M-1S-1、至少10×104M-1S-1、至少10×105M-1S-1或更大的速率特异性切割的接头。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含可以充当蛋白酶(通常是细胞外蛋白酶)的底物的氨基酸序列。例如，所述可切割接头可以包括含有优选地位于蛋白酶的可切割肽序列内的至少一个肽键的切割序列。合适的蛋白酶包括例如基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和纤溶酶激活剂，它们在诸如类风湿性关节炎或癌症等疾病中以强化的方式形成或激活，从而导致过度的组织降解、炎症和转移。在特定实施方案中，所述蛋白酶是由肿瘤、激活的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)或肿瘤微环境中的细胞产生的蛋白酶。在一些实施方案中，所述蛋白酶是颗粒酶B、蛋白裂解酶或MMP(如MMP-2)。
所述可切割接头可以基于蛋白酶来选择，所述蛋白酶由靠近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由在组织中与所述多特异性多肽构建体的期望靶标共定位的肿瘤产生。在文献中有报道在许多癌症(例如，实体瘤)中具有已知底物的蛋白酶的水平增加。参见例如，LaRocca等人,(2004)British J.of Cancer 90(7):1414-1421。
在一些实施方案中，连接CD3和CD3受限多特异性多肽构建体的Fc结构域的可切割接头被由所述组分中的一种激活的免疫效应细胞产生的蛋白酶切割。例如，包含效应子使能或增强IgG Fc区的多特异性多肽构建体当与靶抗原接合时能够引发ADCC。ADCC的核心是颗粒酶B和穿孔素从效应细胞(即NK细胞和细胞毒性T细胞)中的释放。在释放后，颗粒酶B以穿孔素依赖性方式进入靶细胞，在其中它介导凋亡。重要的是，颗粒酶B在效应细胞与靶细胞之间的细胞外突触内具有活性。在一些实施方案中，连接CD28 VHH和多特异性多肽构建体的Fc结构域的可裂解接头被颗粒B切割。颗粒酶B在由多特异性多肽构建体的组分中的一种介导的效应细胞激活期间释放。在一些实施方案中，颗粒酶B和其他蛋白酶可以由免疫效应细胞(包括激活的T细胞或NK细胞)产生。在一些实施方案中，在多特异性多肽构建体结合TAA后通过CD3接合来激活T细胞可以释放此类蛋白酶，其然后可以切割特异性可切割接头，从而加强或增加CD3结合分子的活性以接合CD3。在一些实施方案中，切割可以放大或增加所述多特异性构建体在未切割状态下与TAA结合时所实现的活性。
示例性底物包括但不限于可被以下一种或多种酶或蛋白酶切割的底物：ADAMS、ADAMTS，例如ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5；天冬氨酸蛋白酶，例如BACE或肾素；天冬氨酸组织蛋白酶，例如组织蛋白酶D或组织蛋白酶E；半胱天冬酶，例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或半胱天冬酶14；半胱氨酸组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P；半胱氨酸蛋白酶，例如克鲁兹蛋白酶(Cruzipain)；豆荚蛋白酶(Legumain)；Otubain-2；KLK，例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14；金属蛋白酶，例如穿膜肽酶；脑啡肽酶；PSMA；BMP-1；MMP，例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26或MMP27；丝氨酸蛋白酶，例如激活蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、糜酶、凝血因子蛋白酶(例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa)、弹性蛋白酶、颗粒酶B、胍基苯甲酸酯酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、乳铁蛋白、Marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶、uPA；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)，例如DESC1、DPP-4、FAP、肝素、蛋白裂解酶-2、蛋白裂解酶、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4；及其任何组合。
在一些实施方案中，所述可切割接头被多种蛋白酶(例如，2种或更多种蛋白酶、3种或更多种蛋白酶、4种或更多种蛋白酶等等)切割。
在一些实施方案中，选择所述可切割接头与特定蛋白酶一起使用，所述蛋白酶是例如已知由靠近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与所述多特异性多肽构建体的靶标共定位的肿瘤产生的蛋白酶。
在一些实施方案中，所述可切割接头含有特定蛋白酶的底物识别位点或切割位点，所述底物识别位点或切割位点是被蛋白酶切割、由蛋白酶的活性位点识别的序列。通常，例如，对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的P1-P4和P1'-P4'氨基酸组成，其中切割发生在P1位置之后。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列的长度为六个残基，以匹配许多蛋白酶的扩大的底物特异性，但是根据蛋白酶而定可以更长或更短。通常，所述可切割接头包括由蛋白酶识别的P1-P1'易裂键序列。在一些方面，所述可切割接头被工程化以引入能够被特定蛋白酶切割的肽键，例如通过引入蛋白酶的底物识别位点序列或切割序列。
在一些实施方案中，所述可切割接头包括两个或更多个底物序列的组合。在一些实施方案中，每个底物序列被相同的蛋白酶切割。在一些实施方案中，至少两个底物序列被不同的蛋白酶切割。在一些实施方案中，所述不可切割接头包含作为颗粒酶B的底物的氨基酸。在一些实施方案中，颗粒酶B可切割接头含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I、L、Y、M、F、V或A；P3是氨基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；P2是氨基酸H、P、A、V、G、S或T；P1是氨基酸D或E；并且P1'是氨基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。在一些实施方案中，颗粒酶B可切割接头含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I或L；P3是氨基酸E；P2是氨基酸P或A；P1是氨基酸D；并且P1'是氨基酸I、V、T、S或G。
在一些实施方案中，所述颗粒酶B的底物包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)、LEPD(SEQ ID NO:147)或LEAE(SEQ ID NO:148)。在一些实施方案中，所述可切割接头含有氨基酸序列所述可切割接头包含氨基酸序列IEPDI(SEQ ID NO:149)、LEPDG(SEQ ID NO:150)、LEADT(SEQ ID NO:151)、IEPDG(SEQ ID NO:152)、IEPDV(SEQ ID NO:153)、IEPDS(SEQID NO:154)、IEPDT(SEQ ID NO:155)、IEPDP(SEQ ID NO:251)或LEADG(SEQ ID NO:144)。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为蛋白裂解酶的底物的氨基酸。在一些实施方案中，所述可切割接头包含序列P1QAR↓(A/V)(SEQ ID NO:156)，其中P1是任何氨基酸。在一些实施方案中，所述可切割接头包含序列RQAR(A/V)(SEQ ID NO:157)。在一些实施方案中，所述蛋白裂解酶的底物包含氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)。在一些实施方案中，所述可切割接头包含氨基酸序列RQARV(SEQ ID NO:159)。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的氨基酸。在一些实施方案中，所述MMP是MMP-2。在一些实施方案中，所述可切割接头含有通式P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:160)，其中P3是P、V或A；P2是Q或D；P1是A或N；并且P1'是L、I或M。在一些实施方案中，所述可切割接头含有通式P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:161)，其中P3是P；P2是Q或D；P1是A或N；并且P1'是L或I。在一些实施方案中，所述MMP的底物包含氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为颗粒酶B的底物的氨基酸序列和作为蛋白裂解酶的底物的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述可切割接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)和氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)的组合。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为颗粒酶B的底物的氨基酸序列和作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述可切割接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为蛋白裂解酶的底物的氨基酸序列和作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述可切割接头包含氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为颗粒酶B的底物的氨基酸序列、作为蛋白裂解酶的底物的氨基酸序列和作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述可切割接头包含作为颗粒酶B的底物的氨基酸序列和作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述可切割接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)、氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
所述可切割接头可以包括任何已知的接头。可切割接头的例子描述于以下文献中：Be’liveau等人(2009)FEBS Journal,276；美国公开的申请号US 20160194399、US20150079088、US 20170204139、US 20160289324、US 20160122425、US 20150087810、US20170081397；美国专利号US 9644016。
在一些实施方案中，所述可切割接头包含选自以下的氨基酸序列：TGLEADGSPAGLGRQARVG(SEQ ID NO:163)；TGLEADGSRQARVGPAGLG(SEQ ID NO:164)；TGSPAGLEADGSRQARVGS(SEQ ID NO:165)；TGPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:166)；TGRQARVGLEADGSPAGLG(SEQ ID NO:167)；TGSRQARVGPAGLEADGS(SEQ ID NO:168)；和TGPAGLGSRQARVGLEADGS(SEQ ID NO:169)；GPAGLGLEPDGSRQARVG(SEQ ID NO:170)；GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:171)；GGSGGGGLEADTGGSGGS(SEQ ID NO:172)；GSIEPDIGS(SEQ ID NO:173)；GSLEADTGS(SEQ ID NO:174)；GGSGGGGIEPDGGGSGGS(SEQ ID NO:175)；GGSGGGGIEPDVGGSGGS(SEQ ID NO:176)；GGSGGGGIEPDSGGSGGS(SEQ ID NO:177)；GGSGGGGIEPDTGGSGGS(SEQ ID NO:178)；GGGSLEPDGSGS(SEQ ID NO:179)；和GPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:180)；GGEGGGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:181)；GSSAGSEAGGSGQAGVGS(SEQ ID NO:182)；GGSGGGGLEAEGSGGGGS(SEQ ID NO:183)；GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO:184)；TGGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:185)。
D.工程化细胞
本文提供了表达任何所提供的CD28结合多肽的工程化细胞。在一些实施方案中，细胞(如免疫细胞，例如T细胞或NK细胞)被工程化以产生任何所提供的CD28结合多肽。在一些实施方案中，所述工程化细胞表达所述CD28结合多肽并且可以或能够在适合于分泌蛋白质的条件下从所述细胞分泌所述CD28结合多肽。在一个实施方案中，所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、造血干细胞和/或多能胚胎/诱导干细胞。在一些实施方案中，工程细胞是淋巴细胞，如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞或NK细胞。在一些情况下，所述细胞是T细胞，如CD4和/或CD8 T细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是从受试者(如患者)获得的原代细胞。在特定实施方案中，所述受试者是人类受试者。在一些实施方案中，所述细胞对于所述受试者是自体的。例如，在一些实施方案中，细胞(例如T细胞)可以从患者(也称为原代细胞)中分离用于工程化，例如，用编码所述CD28结合多肽的核酸构建体进行转染或转导。
在一些实施方案中，所述工程化T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞(可替代地，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞是呈CD4+或CD8+。
在一些实施方案中，所述工程化细胞表达由所述细胞分泌的CD28结合多肽。在一些实施方案中，这种CD28结合多肽由编码CD28结合多肽的核酸分子在用于分泌的信号序列的可操作控制下编码。在一些实施方案中，所编码的CD28结合多肽在由细胞表达时分泌。在一些实施方案中，所述信号肽是非天然信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽是来自免疫球蛋白(如IgG重链或IgG-κ轻链)、细胞因子(如白细胞介素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白蛋白质(例如HSA或白蛋白)、人天青杀素前蛋白信号序列、荧光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)的信号肽或能够使细胞有效分泌蛋白质的其他信号肽。
在一些实施方案中，所提供的工程化细胞还表达或被工程化以表达抗原结合受体，如重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述工程化细胞(如工程化T细胞)识别与癌症相关的所需抗原。在具体实施方案中，所述抗原结合受体含有特异性地结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合受体是CAR(嵌合抗原受体)，其含有特异性结合抗原(如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域(例如scFv)；其中所述CAR含有特异性结合抗原(如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域(例如scFv)，还含有跨膜结构域和含有激活结构域的细胞内信号传导区(胞内域)(例如CD3ζ信号传导结构域)，并且在一些情况下，共刺激结构域能够在抗原结合后诱导或介导激活信号到T细胞。在另一个实施方案中，所述工程化细胞具有TCR，如重组或工程化TCR。在一些实施方案中，所述TCR可以是天然TCR。本领域技术人员将认识到，通常天然哺乳动物T细胞受体包含参与抗原特异性识别和结合的α链和β链(或γ链和δ链)。在一些实施方案中，所述TCR是经修饰的工程化TCR。在一些实施方案中，工程化T细胞的TCR特异性地结合由主要组织相容性复合物(MHC)上的肽呈递的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，可以通过多种策略(如用于重组宿主细胞的那些)将所述CD28结合多肽掺入工程化细胞(如工程化T细胞)中。将DNA构建体引入细胞(如原代细胞，例如T细胞)中的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，采用病毒转导或质粒电穿孔。在典型实施方案中，编码所述CD28结合多肽的核酸分子或表达载体包含信号肽，所述信号肽定位CD28结合多肽以供分泌。在一些实施方案中，将编码CD28结合多肽的核酸亚克隆至容许在宿主哺乳动物细胞中表达的病毒载体(如逆转录病毒载体)中。可以将所述表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，并且在宿主细胞培养条件下，所述CD28结合多肽在所述细胞上或在所述细胞中表达，并且在一些情况下，分泌。
本文还提供了用于预防和/或治疗受试者的疾病或病症(如癌症)的方法，其包括向受试者施用本文提供的工程化细胞。通常，所述受试者需要针对所述疾病或病症的治疗，如药物活性量的细胞和/或药物活性量的本文提供的药物组合物。
IV.多肽表达和产生
提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸编码任何所提供的sdAb和CD28结合多肽，如融合蛋白和多特异性结合多肽。在一些实施方案中，所提供的核酸序列、特别是DNA序列编码本文提供的融合蛋白。在任何前述实施方案中，所述核酸分子还可以编码引导CD28结合多肽的分泌的前导序列，所述前导序列通常被切割以使其不存在于分泌的多肽中。所述前导序列可以是天然重链(或VHH)前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
可以使用本领域常规的重组DNA技术来构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适于在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
提供了包含核酸的载体，所述核酸编码CD28结合多肽，例如融合蛋白或多特异性结合多肽。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，选择被优化用于在所需细胞类型(如CHO或CHO衍生细胞、或NSO细胞)中表达多肽的载体。示例性的此类载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。
特别地，可以使用编码所需CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性结合多肽)的DNA载体来促成制备本文所述的CD28结合多肽的方法并获得显著量。所述DNA序列可以插入适当的表达载体中，即，含有用于所插入的蛋白编码序列的转录和翻译的必需元件的载体中。可以使用各种宿主-载体系统来表达所述蛋白编码序列。这些系统包括感染了病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染了病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物，如含有酵母载体的酵母或用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一个。
本公开文本还提供了产生CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性结合多肽)的方法，所述方法通过在导致所述多肽表达的条件下培养细胞而进行，其中所述细胞包含编码本文所述的CD28结合多肽的分离的核酸分子和/或包括这些分离的核酸序列的载体。
在一些实施方案中，CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性结合多肽)可以在原核细胞(如细菌细胞)中表达；或者在真核细胞(如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.
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细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，可以在酵母中表达所述CD28结合多肽。参见例如，美国公开号US2006/0270045 A1。在一些实施方案中，基于其对所述多肽进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞中产生的相同多肽的唾液酸化水平。
可以通过任何方法将一个或多个核酸(如载体)引入所需宿主细胞中，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。根据任何合适的方法，可以在所需宿主细胞中瞬时地或稳定地转染核酸。
还提供了包含本文所述的任何核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了表达本文所述的CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性结合多肽)的宿主细胞。在宿主细胞中表达的CD28结合多肽可以通过任何合适的方法进行纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱。合适的亲和配体包括CD80或CD86以及结合Fc区的药剂。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可以用于结合Fc区并且纯化包含Fc区的CD28结合多肽。疏水相互作用色谱法(例如，丁基或苯基柱)也可以适于纯化一些多肽，如抗体。离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)也可以适于纯化一些多肽，如抗体。混合模式色谱法(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可以适于纯化一些多肽，如抗体。纯化多肽的许多方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，在无细胞系统中产生CD28结合多肽，如融合蛋白或多特异性结合多肽。非限制性示例性无细胞系统描述于例如以下文献中：Sitaraman等人,MethodsMol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
在一些实施方案中，提供了通过上述方法制备的CD28结合多肽，如融合蛋白或多特异性结合多肽。在一些实施方案中，在宿主细胞中制备所述CD28结合多肽。在一些实施方案中，在无细胞系统中制备所述CD28结合多肽。在一些实施方案中，所述抗CD28 sdAb是纯化的。在一些实施方案中，所述融合蛋白是纯化的。在一些实施方案中，所述CD28结合多肽是纯化的。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽是纯化的。在一些实施方案中，提供了包含CD28结合多肽的细胞培养基。
在一些实施方案中，提供了包含通过上述方法制备的抗体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含在宿主细胞中制备的CD28结合多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含在无细胞系统中制备的CD28结合多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含纯化的CD28结合多肽，如融合蛋白或多特异性结合多肽。
V.药物组合物和配制品
本文提供了药物组合物，所述药物组合物含有抗CD28 sdAb、CD28结合多肽、融合蛋白和/或本文提供的多特异性结合多肽或表达其的工程化细胞中的任一种。在一些实施方案中，可以将CD28结合多肽(如本公开文本的融合蛋白和/或多特异性结合多肽)(本文中也称为“活性化合物”)以及其衍生物、片段、类似物和同源物掺入适于施用的药物组合物中。在一些实施方案中，可以将表达含有本文提供的CD28结合多肽的嵌合受体(如嵌合抗原受体)的工程化细胞掺入适于施用的药物组合物中。
此类组合物通常含有药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于本领域中的标准参考文本Remington'sPharmaceutical Sciences的最新版本中，将其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的合适例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在所述组合物中的使用。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
配制本公开文本的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、肿瘤内、口服(例如，吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装于明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体来制备以用作漱口剂，其中所述流体载体中的化合物经口应用并漱口，并且被吐出或被吞下。可以包含药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入进行的施用，从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送所述化合物。
全身性施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在所述配制品中使用适于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的，并且例如就经粘膜施用而言，包括洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
也可以以栓剂(例如，与常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或保留灌肠剂的形式制备所述化合物以供直肠递送。
在一个实施方案中，所述活性化合物是用保护化合物免于从身体迅速消除的载体制备的，如控制释放配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品的制备方法对本领域技术人员而言将是清楚的。所述材料也可以从Alza公司和NovaPharmaceuticals公司商购获得。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法(例如，如美国专利号4,522,811中所述)来制备。
尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体联合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果以及在复合这种活性化合物用于治疗个体的领域中固有的限制。
所述药物组合物可以与施用说明书一起包括在试剂盒、容器、包装或分配器中。这些药物组合物可以与使用说明书一起包括在诊断试剂盒中。
以有效治疗或预防特定适应证的量施用药物组合物。治疗有效量通常取决于被治疗的受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的病症的程度或被治疗的受试者的年龄。在一些实施方案中，可以以每剂量约50μg/kg体重至约50mg/kg体重的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约100μg/kg体重至约50mg/kg体重的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约0.5μg/kg体重至约20mg/kg体重的量施用所述药物组合物。
在一些实施方案中，可以以每剂量约10mg至约1,000mg的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约20mg至约500mg的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约20mg至约300mg的量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，可以以每剂量约20mg至约200mg的量施用所述药物组合物。
可以根据需要向受试者施用所述药物组合物。在一些实施方案中，一次或多次向受试者施用有效剂量的药物组合物。在各个实施方案中，每月一次、每月少于一次(例如像每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次)向受试者施用有效剂量的药物组合物。在其他实施方案中，每月多于一次(例如像每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每天一次或每天多次)施用有效剂量的药物组合物。至少一次向受试者施用有效剂量的药物组合物。在一些实施方案中，可以多次施用有效剂量的药物组合物，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时间段。在一些实施方案中，根据需要向受试者施用所述药物组合物，以减轻病症的一个或多个症状。
VI.治疗方法和用途
所述CD28结合多肽(如融合蛋白和多特异性结合多肽)或表达本文所述的这些多肽的工程化细胞可用于多种治疗、诊断和预防性指示。例如，所述CD28结合多肽或工程化细胞可用于治疗受试者的各种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如涉及向患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者施用所述分子或工程化细胞或含有它们的组合物。在一些实施方案中，以实现所述疾病或障碍的治疗的有效量施用所述分子或工程化细胞。用途包括含有CD28结合多肽(如融合蛋白和多特异性结合多肽)的分子或工程化细胞在此类方法和治疗中的以及在制备药物以进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，所述方法通过向患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用所述CD28结合多肽或工程化细胞或包含它们的组合物来进行。在一些实施方案中，所述方法由此治疗所述受试者的疾病或病症或障碍。
在一个实施方案中，CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性结合多肽)或本公开文本的工程化细胞可以用作治疗剂。此类药剂通常将用于诊断、预后、监测、治疗、缓和和/或预防受试者的疾病或病状。通过使用标准方法鉴定患有(或有风险患)障碍的受试者(例如，人类患者或其他哺乳动物)来进行治疗方案。向所述受试者施用CD28结合多肽或工程化细胞。向所述受试者施用CD28结合多肽或工程化细胞，并且其通常会由于其与一个或多个靶标的结合而具有作用。
在一些实施方案中，所提供的CD28多肽多特异性多肽构建体或工程化细胞能够调节(例如增加)当向受试者施用时的免疫反应，如通过共刺激T细胞来诱导抗肿瘤活性。在一些实施方案中，本文提供了通过施用治疗有效量的所提供的多特异性构建体或工程化细胞或其药物组合物来调节受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，调节免疫反应的方法增加或增强受试者的免疫反应。例如，增加或增强的反应可以是细胞介导的免疫性的增加。在一些例子中，所述方法增加T细胞活性，如细胞溶解性T细胞(CTL)活性。在一些实施方案中，调节的(例如，增加的)免疫反应是针对肿瘤或癌症的。
在一些实施方案中，CD28结合多肽(如CD28-Fc融合蛋白或含有Fc区的多特异性结合多肽)的施用可以经由通过所述多特异性多肽构建体的Fc区接合FcγR来激活先天免疫细胞。此类多特异性多肽构建体的施用可以激动、刺激、激活和/或增大先天免疫细胞效应子功能，包括ADCC、细胞因子释放、脱粒和/或ADCP。在条件性多特异性多肽构建体的情况下，此类多特异性多肽构建体的施用可以在结合靶细胞(例如肿瘤细胞)上的肿瘤相关抗原后激活T细胞，从而允许抗CD28结合部分结合T细胞上的CD28。在一些情况下，所述多特异性多肽构建体的施用可以激动、刺激、激活和/或增大CD28介导的T细胞激活、细胞毒性、细胞因子释放和/或增殖。
在一些实施方案中，所提供的方法用于通过施用治疗有效量的任何所提供的CD28结合多肽(如融合蛋白和多特异性结合多肽)或工程化细胞或其药物组合物来治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。通常，缓和或治疗疾病或障碍涉及减轻与所述疾病或障碍相关的一种或多种症状或医学问题。例如，在癌症的情况下，所述药物的治疗有效量可以实现以下中的一种或组合：减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减少和/或停止)癌细胞向外周器官中的浸润；抑制肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，本公开文本的组合物可以用于预防受试者(例如，人或其他哺乳动物，如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、农场动物、工作动物或动物园动物)的疾病或障碍的发作或复发。术语受试者和患者在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽或工程化细胞或其药物组合物可以用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可以包括向患有癌症的受试者施用有效量的本文所述的任何药物组合物。可以施用有效量的药物组合物以抑制、中止或逆转癌症的进展。可以在体内或离体治疗人癌细胞。在人类患者的离体治疗中，含有癌细胞的组织或流体是在体外治疗的，然后将所述组织或流体再引回所述患者体内。在一些实施方案中，通过向患者施用所述治疗性组合物来体内治疗人类患者的癌症。
疾病的非限制性例子包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如，适应证将包括白血病(包括T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL))、淋巴母细胞疾病(包括多发性骨髓瘤)和实体瘤(包括肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌(包括三阴性乳腺癌))。例如，适应证包括骨病或癌症转移，不管原发性肿瘤起源；肾上腺癌；乳腺癌，作为非限制性例子，包括基底细胞样乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌；结直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；脑癌，作为非限制性例子，如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤；头颈癌，如食道癌；肝癌；肺癌，作为非限制性例子，如非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，如骨肉瘤；肾癌，作为非限制性例子，如肾细胞癌；皮肤癌，作为非限制性例子，如鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤；和/或睾丸癌。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是脑癌，如星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，如基底细胞样乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。
在一些实施方案中，所述癌症是肾上腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。在一些实施方案中，所述癌症是肾癌。在一些实施方案中，所述癌症是肝癌。在一些实施方案中，所述癌症是睾丸癌。
在一些实施方案中，所述CD28结合多肽(如融合蛋白和多特异性结合多肽)或工程化细胞或其药物组合物可用于治疗癌症或其他赘生性病症、缓解癌症或其他赘生性病症的症状、改善癌症或其他赘生性病症和/或延迟癌症或其他赘生性病症的进展。在一些实施方案中，所述癌症是肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、结肠癌、肾癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤以及病毒相关的癌症。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
在一些实施方案中，本公开文本的CD28结合多肽(如融合蛋白或多特异性多肽构建体)的治疗有效量通常与实现治疗目标所需的量有关。通常，待施用的本公开文本的组合物的精确量可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异后确定。
在一些实施方案中，作为非限制性例子，治疗有效剂量可以是约0.01μg/kg体重至约10mg/kg体重。在一些实施方案中，作为非限制性例子，治疗有效剂量可以是约0.01mg/kg体重至约5-10mg/kg体重。常见的给药频率可以例如在每日两次至每周一次的范围内。
在一些实施方案中，施用治疗量的本公开文本的工程化细胞组合物。通常，可以说包含如本文所述的工程化细胞(例如，T细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重(如105至106个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值)的剂量施用。工程化细胞组合物(如T细胞组合物)也可以以这些剂量施用多次。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征候并相应调整治疗而容易地确定。
结合任何已知的用于诊断或治疗特定障碍的方法来确定治疗的有效性。用于筛选具有所需特异性的CD28结合多肽或含有其的工程化细胞的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其他免疫介导的技术。已知多种手段用于确定施用所提供的CD28结合多肽或工程化细胞是否通过以下方式充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫反应的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫反应的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效应的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗响应于信号的增殖或分裂(如用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3H-胸苷掺入的T细胞增殖测定和肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记物(例如，蛋白质印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分析；DNA转录、使用DNA阵列或消减杂交的分析)；通过凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，RNA印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如自身免疫性疾病、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病的改善(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如通过测量复发率或疾病严重程度。
所提供的CD28结合多肽也可用于多种诊断性和预防性配制品中。在一个实施方案中，向有患前述障碍中的一种或多种的风险的患者施用CD28结合多肽。可以使用基因型、血清学或生化标记物确定患者或器官对一种或多种障碍的易患性。
在本公开文本的另一个实施方案中，向被诊断为患有与前述障碍中的一种或多种相关的临床适应证的人类个体施用CD28结合多肽或工程化细胞。在诊断后，施用此类治疗剂以减轻或逆转所述临床适应证的影响。
组合疗法
本公开文本的CD28结合多肽(如融合蛋白和多特异性结合多肽)或工程化细胞可以单独施用或与其他治疗模式(如其他抗癌剂)组合使用。可以将它们在其他治疗模式之前、基本上同时或之后(即，并行或依序)提供。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法可以进一步包括施用：放射疗法、化学疗法、疫苗接种、靶向肿瘤疗法、CAR-T疗法、溶瘤病毒疗法、癌症免疫疗法、细胞因子疗法、手术切除术、染色质修饰、消融、冷冻疗法、针对肿瘤靶标的反义药剂、针对肿瘤靶标的siRNA剂、针对肿瘤靶标的微小RNA剂或抗癌/抗肿瘤剂、或生物制剂(如抗体、细胞因子或受体细胞外结构域-Fc融合物)。
在一些实施方案中，将本文提供的CD28结合多肽与一种或多种化学治疗剂、CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法、溶瘤病毒疗法、细胞因子疗法和/或靶向其他检查点分子(如PD1、PD-L1、LAG3、TIM3、VISTA、gpNMB、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)的药剂并行施用。
在一些实施方案中，将本公开文本的CD28结合多肽或工程化细胞与结合以下一种或多种靶标：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4或一种或多种VEGF受体、TRAIL/Apo2的其他抗肿瘤剂(如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼
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血小板源性生长因子抑制剂(例如，
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(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、CTLA4抑制剂(例如，抗CTLA抗体易伊匹单抗
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)、PD-1抑制剂(例如，抗PD1抗体，BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如，抗PDL1抗体，MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如，抗PDL2抗体)、细胞因子、拮抗剂(例如，中和抗体))以及其他生物活性剂和有机化学剂等组合使用。
在一些实施方案中，将本文提供的CD28结合多肽或工程化细胞与PD-1/PD-L1疗法并行给予。PD-1/PD-L1疗法的例子包括纳武单抗(BMS)；匹地利珠单抗(pidilizumab)(CureTech，CT-011)；派姆单抗(Merck)；德瓦鲁单抗(Medimmune/AstraZeneca)；阿特珠单抗(Genentech/Roche)；阿维鲁单抗(avelumab)(Pfizer)；AMP-224(Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514(Amplimmune)；MDX-1105(Merck)；TSR-042(Tesaro/AnaptysBio，ANB-011)；STI-A1010(Sorrento Therapeutics)；STI-A1110(Sorrento Therapeutics)；和针对程序性死亡蛋白-1(PD-1)或程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)的其他药剂。
在一些实施方案中，本公开文本的CD28结合多肽或工程化细胞可以与化学治疗剂组合使用。化学治疗剂的例子包括但不限于烷基化剂，如噻替派和
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环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如，Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达尼霉素(dynemicin)，包括达尼霉素A；双磷酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、紫苏素(aclacinomysins)、放线菌素D(actinomycin)、土霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、
Figure BDA0003858954760001191
阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲络司坦；叶酸补充剂，如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲酯(edatraxate)；去氧胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫吡坦(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0003858954760001192
多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；丙亚胺；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)和胺癸叮(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如
Figure BDA0003858954760001193
紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology，普林斯顿，新泽西州)、
Figure BDA0003858954760001194
紫杉醇的无克列莫佛的白蛋白工程化的纳米粒子配制品(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，伊利诺伊州)和
Figure BDA0003858954760001195
多西他赛(
Figure BDA0003858954760001198
Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；
Figure BDA0003858954760001196
吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；
Figure BDA0003858954760001197
长春瑞滨；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醇类，如视黄酸；卡培他滨；康普瑞丁(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(VL)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003858954760001201
)和VEGF-A的抑制剂以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其他非限制性的示例性的化学治疗剂包括起到调节或抑制对癌症的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
Figure BDA0003858954760001202
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和
Figure BDA0003858954760001203
托瑞米芬；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，所述酶调节肾上腺中的雌激素产生，所述芳香酶抑制剂例如像4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA0003858954760001204
醋酸甲地孕酮、
Figure BDA0003858954760001205
依西美坦、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA0003858954760001206
伏氯唑、
Figure BDA0003858954760001207
来曲唑和
Figure BDA0003858954760001208
阿那曲唑；和抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制参与异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如像PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的反义寡核苷酸；核酶，如VEGF表达抑制剂(例如，
Figure BDA0003858954760001209
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，如基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00038589547600012010
疫苗、
Figure BDA00038589547600012011
疫苗和
Figure BDA00038589547600012012
疫苗；
Figure BDA00038589547600012013
(阿地白介素)rIL-2；
Figure BDA00038589547600012014
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA00038589547600012015
GnRH激动剂；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，将所述CD28结合多肽和所述另外的药剂配制成单一治疗组合物，并且同时施用所述CD28结合多肽和所述另外的药剂。可替代地，所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗组合物，并且同时施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。例如，在施用所述另外的药剂之前施用所述CD28结合多肽或工程化细胞，在施用所述另外的药剂之后施用所述CD28结合多肽或工程化细胞，或者以交替的方式施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。所述CD28结合多肽和所述另外的药剂可以以单剂量或多剂量施用。
在一些实施方案中，同时施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述一种或多种另外的药剂。例如，可以将所述CD28结合多肽和所述一种或多种另外的药剂配制成单一组合物或作为两种或更多种单独的组合物施用。在一些实施方案中，依序施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述一种或多种另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间施用所述CD28结合多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ IDNO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
2.根据实施方案1所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
3.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
4.根据实施方案3所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
5.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述CD28 VHH结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:220所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或
如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
6.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)(CD28VHH)，其中所述CD28 VHH结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或
如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据实施方案1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
11.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-8和11中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
13.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
15.根据实施方案1-8、13和14中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ IDNO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。
16.根据实施方案1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
17.根据实施方案1-8、13和16中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。
18.根据实施方案1-8和13-15中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ IDNO:213-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据实施方案1-8、13-15和18中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案1-8、13、16和17中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-7、13、16、17和20中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个sdAb是一个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。
23.根据实施方案1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个sdAb是两个、三个或四个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是多价的。
24.根据实施方案1-21和23中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个sdAb是两个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。
25.根据实施方案24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是相同的CD28sdAb。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb均包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb均包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb均包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是不同的CD28sdAb。
30.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含免疫球蛋白Fc区。
34.根据实施方案33所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区通过连接肽(LP)连接至所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个。
35.根据实施方案32或实施方案32所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb通过连接肽(LP)在所述Fc区的N末端处连接至所述Fc区。
36.根据实施方案33-35中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述LP是不可切割接头。
37.根据实施方案33-36中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。
38.根据实施方案33-37中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-Fc。
39.根据实施方案33-37中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的CD28结合多肽，其是二聚体。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
42.根据实施方案38-41中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12或13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12或13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
43.根据实施方案38-42中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的。
44.根据实施方案38-43中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
45.根据实施方案38-40中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
46.根据实施方案38-45中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区展现出效应子功能。
47.根据实施方案38-45中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
48.根据实施方案47所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
49.根据实施方案47或实施方案48所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含一个或多个结合CD28以外的靶抗原的结合结构域。
51.根据实施方案50所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个结合结构域是一个或多个结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含结合蛋白A的部分。
53.一种CD28结合多肽，其从N末端到C末端包含：
一个或多个包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)的抗原结合结构域；
至少一个包含结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及
Fc区。
54.根据实施方案51-54中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个TAAsdAb中的至少一个通过连接肽(LP)与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。
55.根据实施方案51-54中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(TAA sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
56.根据实施方案50-54中任一项所述的CD28结合多肽，其是二聚体。
57.根据实施方案50-55中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
58.一种CD28结合多肽，其从N末端到C末端包含：
一个或多个包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的单结构域抗体(sdAb)的抗原结合结构域；
至少一个包含结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及
Fc区，
其中所述CD28结合多肽是包含同二聚体Fc区的二聚体。
59.根据实施方案50-59中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12或13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12或13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
60.根据实施方案50-60中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1。
61.根据实施方案50-60中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
62.根据实施方案50-55和57中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
63.根据实施方案50-62中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区展现出效应子功能。
64.根据实施方案50-62中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
65.根据实施方案64所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
66.根据实施方案64或实施方案65所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
67.根据实施方案51-66中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述TAA选自：1-92-LFA-3，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2，KISS1-R，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/K ATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
68.根据实施方案51-67中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个TAAsdAb是一个TAA sdAb和/或所述CD28结合多肽对于所述TAA是单价的。
69.根据实施方案51-67中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个TAAsdAb是两个、三个或四个TAA sdAb和/或所述CD28结合多肽对于一个或多个TAA是多价的。
70.根据实施方案51-67和69中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述一个或多个TAA sdAb是两个TAA sdAb和/或所述CD28结合多肽对于TAA是二价的。
71.根据实施方案70所述的CD28结合多肽，其中所述两个TAA sdAb是相同的TAAsdAb。
72.根据实施方案70所述的CD28结合多肽，其中所述两个TAA sdAb是结合相同TAA、任选地结合所述相同TAA的不同表位的不同TAA sdAb。
73.根据实施方案70所述的CD28结合多肽，其中所述两个TAA sdAb是结合不同TAA的不同TAA sdAb。
74.根据实施方案33-73中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。
75.根据实施方案33-74中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含在所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。
76.根据实施方案74或实施方案75所述的CD28结合多肽，其中所述LP是不可切割接头。
77.根据实施方案74-76中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。
78.根据实施方案74-77中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述LP是或包含SEQID NO:1-7、89、90、123-129、244或249中任一个所示的序列。
79.根据实施方案51-78中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与其TAA结合。
80.根据实施方案51-78中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个TAA sdAb中的每一个均与其TAA结合。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD-28结合多肽不包含CD3结合区。
82.根据实施方案50-81中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含CD3结合区。
83.一种CD28结合多肽，其包含至少一个CD28 sdAb和CD3结合区。
84.根据实施方案83所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
85.根据实施方案83或实施方案84所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
86.根据实施方案83所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
87.根据实施方案83或实施方案86所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
88.根据实施方案83-85中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb(CD288 VHH)包含：
如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:220所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
89.根据实施方案83、86和87中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)包含：
如SEQ ID NO:186所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:187所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:188所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:213所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:214所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:215所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:216所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:217所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:218所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:219所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:221所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:222所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:223所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:224所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:225所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:226所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:227所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:228所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:229所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:230所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:231所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:232所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:233所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:234所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:235所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:236所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:237所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:238所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；
如SEQ ID NO:239所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或
如SEQ ID NO:280所示VHH中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
90.根据实施方案83-85和88中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
91.根据实施方案83、86、88和89中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
92.根据实施方案83-91中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
93.根据实施方案83-92中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
94.根据实施方案83-91中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
95.根据实施方案83-91和94中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
96.根据实施方案83-91中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
97.根据实施方案83-91和实施方案96中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
98.根据实施方案83-91、96和97中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ IDNO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQID NO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。
99.根据实施方案83-91和96中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211和212中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3。
100.根据实施方案83-91、96和99中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ IDNO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；或SEQ ID NO:195、212和197。
101.根据实施方案83-91和96-98中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQID NO:213-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
102.根据实施方案83-91、96-98和101中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
103.根据实施方案83-91、96、99和100中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
104.根据实施方案83-91、96、99、100和103中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239和280中任一个所示的氨基酸序列。
105.根据实施方案82-104中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
106.根据实施方案82-105中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。
107.根据实施方案106所述的CD28结合多肽，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
108.根据实施方案82-107中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区是单价的。
109.根据实施方案82-108中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的可变片段(Fv)。
110.根据实施方案82-108中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。
111.根据实施方案82-110中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含免疫球蛋白Fc区。
112.根据实施方案111所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽是二聚体。
113.根据实施方案111或实施方案112所述的CD28结合多肽，其中所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
114.根据实施方案82-113中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个TAA sdAb中的至少一个与TAA结合。
115.根据实施方案82-114中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。
116.一种或多种多核苷酸，其编码根据实施方案1-115中任一项所述的CD28结合多肽。
117.一种多核苷酸，其包含编码根据实施方案1-115中任一项所述的CD28结合多核苷酸的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。
118.根据实施方案117所述的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同的启动子。
119.根据实施方案118所述的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
120.一种载体，其包含根据实施方案116-119中任一项所述的多核苷酸。
121.根据实施方案120所述的载体，其是表达载体。
122.根据实施方案120或实施方案121所述的载体，其是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
123.一种细胞，其包含根据实施方案116-119中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案120-122中任一项所述的一种或多种载体。
124.根据实施方案123所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
125.根据实施方案123或实施方案124所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
126.一种产生多肽的方法，所述方法包括向细胞中引入根据实施方案116-119中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案120-122中任一项所述的一种或多种载体，以及在产生所述多特异性多肽构建体的条件下培养所述细胞。
127.根据实施方案126所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。
128.一种由根据实施方案126或实施方案127所述的方法产生的多肽。
129.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-115中任一项所述的CD28结合多肽构建体。
130.根据实施方案129所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
131.根据实施方案129或实施方案130所述的药物组合物，其是无菌的。
132.一种刺激受试者中免疫反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1-115中任一项所述的CD28结合多肽构建体或根据实施方案129-131中任一项所述的药物组合物。
133.根据实施方案132所述的方法，其中所述免疫反应是针对肿瘤或癌症增加的。
134.根据实施方案132或实施方案133所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
135.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-115中任一项所述的CD28结合多肽构建体或根据实施方案129-131中任一项所述的药物组合物。
136.根据实施方案134或实施方案135所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
137.根据实施方案132-136中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
所提供的实施方案还包括：
1.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
2.根据实施方案1所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
3.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
4.根据实施方案3所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
5.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
6.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据实施方案1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
11.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-8和11中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
13.根据实施方案1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
15.根据实施方案1-8、13和14中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ IDNO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ IDNO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
16.根据实施方案1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
17.根据实施方案1-8、13和16中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ IDNO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
18.根据实施方案1-8和13-15中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据实施方案1-8、13-15和18中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案1-8、13、16和17中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-7、13、16、17和20中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb是一个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。
23.根据实施方案1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb是两个、三个或四个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是多价的。
24.根据实施方案1-21和23中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb是两个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。
25.根据实施方案24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是相同的CD28sdAb。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案24或实施方案25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是不同的CD28sdAb。
30.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案24或实施方案29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含结合蛋白A的部分。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。
35.根据实施方案34所述的CD28结合多肽，其中所述氨基酸修饰是框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的G65D。
36.一种抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其包含根据实施方案1-35中任一项所述的CD28结合多肽和免疫球蛋白Fc区。
37.根据实施方案36所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区通过连接肽(LP)连接至所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个。
38.根据实施方案36或实施方案37所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb通过连接肽(LP)在所述Fc区的N末端处连接至所述Fc区。
39.根据实施方案37或实施方案38所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述LP是不可切割接头。
40.根据实施方案37-39中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-Fc。
42.根据实施方案37-40中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其是二聚体。
44.根据实施方案36-43中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
45.根据实施方案36-44中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
46.根据实施方案36-45中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是人IgG1的。
47.根据实施方案36-46中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ IDNO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据实施方案36-43中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
49.根据实施方案36-48中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区展现出效应子功能。
50.根据实施方案36-48中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
51.根据实施方案50所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
52.根据实施方案50或实施方案51所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
53.一种同二聚体Fc融合蛋白，其包含根据实施方案33-49中任一项所述的抗CD28sdAb-Fc融合蛋白的两个相同拷贝。
54.一种异二聚体融合蛋白，其包含根据实施方案33-49中任一项所述的抗CD28sdAb-Fc融合蛋白中的两种。
55.一种多特异性结合多肽，其包含根据实施方案36-52中任一项所述的抗CD28sdAb-Fc融合蛋白和一个或多个结合CD28以外的靶抗原的结合结构域(BD)。
56.根据实施方案55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合肿瘤相关抗原(TAA)。
57.根据实施方案55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合T细胞表面标记物，所述标记物是T细胞激活标记物或T细胞耗竭标记物。
58.根据实施方案55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合细胞表面标记物，所述标记物是肿瘤微环境标记物。
59.根据实施方案55-58中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD、任选地所述一个或多个BD中的每一个，在单结构域抗体(sdAb)中。
60.根据实施方案55-59中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述多特异性结合多肽是Fc融合蛋白，其中所述一个或多个BD中的至少一个和/或所述至少一个CD28 sdAb连接至所述免疫球蛋白Fc区。
61.根据实施方案60所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc融合蛋白从N末端到C末端包含：
所述一个或多个BD；
所述至少一个包含结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及
所述Fc区。
62.根据实施方案55-61中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD中的至少一个通过连接肽(LP)与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。
63.根据实施方案55-62中任一项所述的多特异性结合多肽，其从N末端到C末端包含：(BD)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
64.根据实施方案55-63中任一项所述的CD28结合多肽，其是二聚体。
65.根据实施方案55-64中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
66根据实施方案55-65中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
67.根据实施方案55-66中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的。
68.根据实施方案55-67中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
69.根据实施方案55-64和66-68中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
70.根据实施方案55-69中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区展现出效应子功能。
71.根据实施方案55-69中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
72.根据实施方案71所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
73.根据实施方案71或实施方案72所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
74.根据实施方案55-73中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述BD结合的抗原选自：1-92-LFA-3，2B4，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，α-SMA，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD69，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD107a，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD160，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，FSP-1，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HLA-DR，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2)，KISS1-R，KLRG1，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/KATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
75.根据实施方案55-74中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是一个BD和/或所述多特异性结合多肽对于所述抗原是单价的。
76.根据实施方案55-74中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是两个、三个或四个BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或多个抗原是多价的。
77.根据实施方案55-74和76中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是两个BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或多个抗原是二价的。
78.根据实施方案77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是相同的sdAb。
79.根据实施方案77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是结合相同抗原、任选地结合所述相同抗原的不同表位的不同sdAb。
80.根据实施方案77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是结合不同抗原的不同sdAb。
81.一种同二聚体多特异性Fc融合蛋白，其包含根据实施方案55-80中任一项所述的多特异性结合多肽的两个相同拷贝。
82.一种异二聚体多特异性Fc融合蛋白，其包含根据实施方案55-80中任一项所述的多特异性结合多肽中的两种。
83.根据实施方案81或实施方案82所述的多特异性Fc融合蛋白，其包含在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的接头肽(LP)。
84.根据实施方案81-83中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽包含在所述一个或多个BD中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。
85.根据实施方案83或实施方案84所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是不可切割接头。
86.根据实施方案83-85中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。87.根据实施方案83-86中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是或包含SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、244和249中任一个所示的氨基酸序列。
88.根据实施方案55-80中任一项所述的多特异性结合多肽或根据实施方案81-87中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个BD中的至少一个与其抗原结合。
89.根据实施方案55-80中任一项所述的多特异性结合多肽或根据实施方案81-87中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个BD中的每一个均与其抗原结合。
90.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
91.根据实施方案90所述的抗CD28 sdAb，其包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
92.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
93.根据实施方案92所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
94.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
95.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
96.根据实施方案90-95中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
97.根据实施方案90-95中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
98.根据实施方案90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
99.根据实施方案90-98中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
100.根据实施方案90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
101.根据实施方案90-97和100中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
102.根据实施方案90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
103.根据实施方案90-97和102中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
104.根据实施方案90-97、102和103中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ IDNO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ IDNO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
105.根据实施方案90-97和102中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
106.根据实施方案90-07、102和105中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ IDNO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
107.根据实施方案90-97和102-104中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
108.根据实施方案90-97、102-104和107中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
109.根据实施方案90-97、102、105和106中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
110.根据实施方案90-97、102、105、106和109中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
111.根据实施方案90-110中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。
112.根据实施方案111所述的抗CD28 sdAb，其中所述氨基酸修饰是框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的G65D。
113.根据实施方案1-35中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-54和81-89中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80和88-89中任一项所述的多特异性结合蛋白；或根据实施方案90-112中任一项所述的抗CD28单结构域抗体，不包含CD3结合区。
114.根据实施方案1-35中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-54和81-89中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80和88-89中任一项所述的多特异性结合蛋白；或根据实施方案90-112中任一项所述的抗CD28单结构域抗体，包含CD3结合区。
115.一种多特异性构建体，其包含根据实施方案90-112中任一项所述的至少一个抗CD28单结构域抗体(sdAb)、一个或多个结合CD28以外的抗原的结合结构域(BD)、以及CD3结合区。
116.根据实施方案115所述的多特异性构建体，其中所述BD结合TAA。
117.根据实施方案115或实施方案116所述的多特异性构建体，其中所述BD是单结构域抗体(sdAb)。
118.根据实施方案114所述的CD28结合多肽；根据实施方案114所述的融合蛋白；根据实施方案114所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-117中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
119.根据实施方案114或实施方案118所述的CD28结合多肽；根据实施方案114或实施方案118所述的融合蛋白；根据实施方案114或实施方案118所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114或实施方案118所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-118中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。
120.根据实施方案1的实施方案120所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
121.根据实施方案114和118-120中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-120中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-120中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-120中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-120中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是单价的。
122.根据实施方案114和118-121中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-121中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-121中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-121中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-121中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的可变片段(Fv)。
123.根据实施方案114和118-121中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-121中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-121中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-121中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-121中任一项所述的多特异性构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单结构域抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。
124.根据实施方案114和118-123中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-123中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-123中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-123中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-123中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD28多肽包含免疫球蛋白Fc区。
125.根据实施方案124所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
126.根据实施方案124或实施方案125所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是人IgG1的。
127.根据实施方案124-126中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
128.根据实施方案124-127中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
129.根据实施方案中任一项所述的CD28结合多肽，根据实施方案124-128中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区展现出效应子功能。
130.根据实施方案124-128中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
131.根据实施方案130所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
132.根据实施方案130或实施方案131所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
133.根据实施方案124-132中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述CD28结合多肽是二聚体。
134.根据实施方案124-133中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
135.根据实施方案114和118-134中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-134中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-134中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-134中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-134中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个BD中的至少一个与其抗原结合。
136.根据实施方案114和118-135中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案114和118-135中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案114和118-135中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据实施方案114和118-135中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据实施方案115-135中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。
137.一种或多种多核苷酸，其编码：根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-42、45-47、49-52和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-63、66-68、70-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb。
138.一种多核苷酸，其包含第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列编码根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽，根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白，或根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽的第一多肽，所述第二核酸序列编码第二多肽，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。
139.根据实施方案138所述的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同的启动子。
140.根据实施方案138或实施方案139所述的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A和F2A。
141.一种载体，其包含根据实施方案137-140中任一项所述的多核苷酸。
142.根据实施方案141所述的载体，其是表达载体。
143.根据实施方案141或实施方案142所述的载体，其是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
144.一种细胞，其包含根据实施方案137-140中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案141-143中任一项所述的一种或多种载体。
145.根据实施方案144所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
146.根据实施方案144或实施方案145所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
147.一种产生多肽的方法，所述方法包括向细胞中引入根据实施方案137-140中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案141-143中任一项所述的一种或多种载体，以及在产生所述多肽的条件下培养所述细胞。
148.根据实施方案147所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。
149.一种由根据实施方案147或实施方案148所述的方法产生的多肽。
150.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb。
151.根据实施方案150所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
152.根据实施方案150或实施方案151所述的药物组合物，其是无菌的。
153.一种刺激受试者中免疫反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据实施方案150-152中任一项所述的药物组合物。
154.根据实施方案153所述的方法，其中所述免疫反应是针对肿瘤或癌症增加的。
155.根据实施方案153或实施方案154所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
156.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据实施方案150-152中任一项所述的药物组合物。
157.根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据实施方案150-152中任一项所述的药物组合物的用途。
158.一种组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症，其包含根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据实施方案150-152中任一项所述的药物组合物。
159.一种组合物，其用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物，其包含根据实施方案1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据实施方案36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据实施方案55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据实施方案90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据实施方案150-152中任一项所述的药物组合物。
160.根据实施方案155或实施方案156所述的方法，根据实施方案157所述的用途，或根据实施方案158或实施方案159所述的组合物，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
161.根据实施方案155或实施方案156所述的方法，根据实施方案157所述的用途，或根据实施方案158或实施方案159所述的组合物，其中所述受试者是人类。
VIII.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1：CD28 sdAb的产生
经由免疫美洲驼和羊驼产生了靶向人CD28的单结构域抗体。用如下所示的人CD28细胞外结构域(ECD；SEQ ID NO:86所示的人CD28的氨基酸19-152，例如UniProt编号P10747)的重组版本免疫了美洲驼和羊驼：
NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
在产生特异性抗CD28抗体效价后，从500mL来自经免疫动物的血液中分离出美洲驼/羊驼外周血单核细胞(PBMC)，并且使用Qiagen
Figure BDA0003858954760001611
Maxi试剂盒分离出总mRNA并且随后使用Thermo SuperScriptTM IV逆转录酶和寡聚dT引发将其转化为第一链cDNA。使用cDNA作为模板经由PCR特异性扩增出示例性单结构域抗体(sdAb；也称为VHH)序列，并且将其克隆到酵母表面展示载体中作为sdAb-Fc-AGA2融合蛋白。所述Fc是人IgG1 Fc(hFc；如SEQ ID NO:8所示)，或在一些情况下，是其具有降低的效应子功能的变体(Fc xELL；如SEQID NO:9所示)。
经由磁珠分离、之后经由荧光激活细胞分选术(FACS)使用重组形式的CD28富集了展示所述sdAb的酵母文库。将分选的酵母铺板，并且将分离的菌落挑选到96孔块中并使其在培养基中生长，所述培养基将表面展示的sdAb-Fc的表达转换为分泌到培养基中。将来自96孔酵母分泌培养物的上清液应用于CD28阳性和阴性细胞。洗涤细胞，用荧光团标记的抗人Fc第二抗体处理，并通过96孔流式细胞术进行分析。
将编码与CD28阳性细胞结合而不与CD28阴性细胞结合的sdAb的核酸序列与人Fc编码区同框克隆到哺乳动物表达载体中，并且使用聚乙烯亚胺通过瞬时转染到HEK293freestyle细胞(293FS细胞)或CHO细胞中表达。3-7天后收集上清液，通过蛋白A色谱法纯化所分泌的重组蛋白，并且由在280nm处的吸光度和消光系数计算浓度。
通过筛选鉴定出许多sdAb。基于进一步的筛选测定，鉴定了所选的克隆，所述克隆不会以针对CD28为二价的单特异性形式刺激或激动CD28(参见例如，实施例5A)。
鉴定出的示例性sdAb示于表E1中。
Figure BDA0003858954760001621
实施例2：通过流式细胞术评估sdAb与表达CD28的细胞的结合
通过流式细胞术使用表达CD28的细胞来评估已用人IgG1(hFc；例如，SEQ ID NO:8)形式化的已鉴定和纯化的CD28 sdAb(包括表E1中所述选择的那些)的特异性、相对亲和力和食蟹猴交叉反应性。将用全长人CD28或食蟹猴CD28瞬时转染的HEK293FS用作CD28阳性细胞。将未转染的HEK293FS细胞用作CD28阴性细胞。将细胞以3x103个细胞/孔接种在96孔圆底板中的FACS缓冲液中。将生成的示例性sdAb-hFc滴定到细胞上，并将测定板在4℃孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬于稀释的缀合Alexa Fluor 647的抗人IgG第二抗体(1:2000，于FACS缓冲液中)中。将测定板在4℃孵育30分钟，然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次并重悬于FACS缓冲液中，以使用Intellicyt
Figure BDA0003858954760001622
进行分析。
图1A-1C示出了生成的示例性CD28 sdAb-hFc的结果。所有测试的sdAb均展现出与表达CD28的细胞的特异性结合，并与食蟹猴CD28进行了交叉反应。
示例性CD28 sdAb 1C9还被具有降低的效应子功能的人IgG1 Fc的变体(Fc xELL；例如SEQ ID NO:9)形式化，并测试其与人T淋巴细胞细胞系Jurkat以及从PBMC富集的原代T细胞的结合。如图1D-1E所示，1C9-xELL以个位数纳摩尔亲和力结合内源表达CD28的细胞。
实施例3：示例性骆驼源性CD28 sdAb的人源化
使用人VH3-23种系作为支架使示例性骆驼源性CD28 sdAb 1C9(SEQ ID NO:188)人源化。有助于溶解度、特异性、稳定性和/或亲和力的骆驼残基保持未修饰。另外，所有人源化变体都含有Leu11Glu(L11E)的修饰以及Ser112Lys(S112K)和Ser113Pro(S113P)的羧基末端修饰，因为已知这些阻止或减少针对sdAb的预先存在的抗人sdAb抗体(ASDA)的识别(如US 20160207981中所述)。在一些情况下，人源化变体含有G73D氨基酸突变(例如1C9v8D)。
表E2示出了CD28 sdAb 1C9的示例性人源化变体。
Figure BDA0003858954760001631
Figure BDA0003858954760001641
Figure BDA0003858954760001651
测试了CD28 sdAb 1C9的人源化变体结合表达CD28的细胞的能力，并将此结合与亲本1C9 sdAb进行比较。通过流式细胞术使用不表达CD28的细胞系(293FS)、用全长人(hCD28-293FS)或食蟹猴(cyCD28-293FS)CD28瞬时转染的293FS细胞、CD28+Jurkat细胞系、或从正常供体全血中分离的原代人T细胞评估CD28-sdAb-Fc融合蛋白的结合。将所述融合蛋白的滴定系列与各种细胞系(3x103个细胞/孔，在96孔圆底板中)在96孔板中的FACS缓冲液(PBS 1％BSA，0.1％NaN3 pH 7.4)中在4℃孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于稀释的缀合Alexa Fluor 647的抗人IgG第二抗体(1:2000，于FACS缓冲液中)中，并在4℃孵育细胞30分钟。在FACS缓冲液中再洗涤两次后，经由流式细胞术(Intellicyt
Figure BDA0003858954760001652
)检测到结合的抗体。
图2A-2I示出了示例性CD28 sdAb 1C9的人源化变体的结果。测试的所有人源化变体均结合人和食蟹猴CD28。
实施例4：CD28靶向性构建体的生成和测试
生成了示例性CD28结合构建体以含有上文所述的示例性CD28 sdAb，例如1C9(SEQID NO:188)、1C9v8(SEQ ID NO:220)或1C9v8D(SEQ ID NO:280)。在一些情况下，生成了对CD28具有单特异性的各种构建体。在其他情况下，构建体被工程化以具有多特异性并另外含有至少一个肿瘤相关抗原(TAA)TAA结合结构域。例如，至少一个TAA结合结构域可以结合PDL1(例如，分别如SEQ ID NO:100、101和102所示的CDR1、CDR2、CDR3；例如，如SEQ ID NO:99所示)或5T4(例如，分别如SEQ ID NO:241、242和243或分别如SEQ ID NO:246、247和248所示的CDR1、CDR2、CDR3；例如，分别如SEQ ID NO:240或245所示)。多特异性构建体通常含有分隔CD28 sdAb和TAA结合结构域(例如sdAb)的接头。在这些构建体中，所述多肽链通常从N末端到C末端按顺序包括一个或多个TAA sdAb、接头和一个或多个CD28 sdAb。在一些情况下，所述构建体是用示例性接头GGSGGS(SEQ ID NO:1)、GGSGGGGS(SEQ ID NO:89)或GGGSGS(SEQ ID NO:90)生成的。作为对照，还生成了仅含有TAA sdAb的单特异性构建体。
另外，生成了对于CD28是单价或二价的构建体。此外，在含有至少一个TAA sdAb的双特异性构建体中，生成了对于所述TAA是二价的构建体。
在一些情况下，生成了多价形式以含有Fc结构域，从而形成了掺有同二聚体或异二聚体Fc结构域的二聚体。Fc结构域被工程化为具有降低的效应子功能的变体(xELL)。
表E3总结了生成的示例性构建体。为了生成示例性构建体，生成了编码多肽链的多核苷酸并将其克隆到质粒中以进行表达。使用聚乙烯亚胺将编码所述一个或多个多肽链的质粒瞬时转染到哺乳动物细胞(HEK293或CHO)中。对于具有异二聚体Fc结构域的构建体，使用聚乙烯亚胺将编码异二聚体CD28结合蛋白的每一条链的单独质粒以等摩尔比率瞬时转染到哺乳动物细胞(HEK293或CHO)中。3-7天后收集上清液，并且通过蛋白A色谱法、之后通过制备型尺寸排阻色谱法(SEC)或流通疏水相互作用色谱法(HIC)纯化分泌的重组蛋白。选择性纯化异二聚体蛋白，由于在位置I253R或H435R处存在设计到异二聚体Fc的一条链中的突变(通常是臼-Fc)，因此它不结合蛋白A。使用SEC(AKTA与Superdex-200树脂)或FT-HIC(AKTA与丁基/苯基琼脂糖凝胶)上的第二个色谱步骤来去除不希望的交叉配对物质，这些物质含有疏水性更强且分子量是预期的两倍的两个异二聚体Fc。所述方法允许生产异二聚体多特异性多肽构建体，所述构建体含有正确配对的异二聚体。在4℃或增加的蛋白质浓度下延长孵育时，经纯化的异二聚体CD28结合蛋白是稳定的且不积累交叉配对物质。
在一些情况下，不具有Fc结构域(例如cx8390和cx8394)的示例性构建体被工程化为含有结合蛋白A(PA)的结构域以有助于纯化。
生成的构建体是图3A和3B以及表E3所示的那些。
Figure BDA0003858954760001661
Figure BDA0003858954760001671
测试了生成的示例性构建体结合表达CD28、PDL1和/或5T4的细胞的能力。如实施例3所述，对生成的示例性构建体的结合进行了大体评估，不同之处在于使用用PDL1(PDL1-293FS)瞬时转染的CD28-293FS细胞、5T4+/CD28-细胞系(T47D)、5T4-/PDL1-/CD28+细胞系(Jurkat)或5T4-/PDL1-/CD28-细胞系(Raji)进行比较。
图3C-3H示出了生成的示例性CD28靶向性构建体的结果。如图3C所示，每个被工程化以二价形式结合PDL1的示例性构建体(cx694、cx8370和cx1204)均以剂量依赖性方式结合表达PDL1的细胞。如图3D所示，对CD28具有单特异性的示例性构建体cx984和cx698结合表达CD28的Jurkat细胞，而对CD28和PDL1具有双特异性的示例性构建体(cx694和cx8370)在缺乏PDL1的情况下不能结合表达CD28的细胞。如图3F所示，呈二价5T4结合形式的示例性构建体(cx8390)结合T47D细胞，而未用5T4 sdAb形式化的构建体(cx8394)不能结合T47D细胞。这两种构建体都不能结合Jurkat细胞，这与以下观察相一致：cx8390中的CD28 sdAb的结合以5T4 sdAb与5T4的结合为条件(图3G)。示例性构建体中没有一个能够结合充当阴性对照的Raji细胞(图3E和3H)。
实施例5：由CD28靶向性构建体激活IL-2启动子驱动的荧光素酶报告细胞
A.CD28靶向性单特异性构建体
使用基于Jurkat的报告细胞系(PromegaTM)评估了单特异性CD28靶向性构建体导致的CD28激动，所述报告细胞系被工程化以产生IL-2启动子驱动的荧光素酶。报告细胞上的CD3的激活导致荧光素酶的产生，这可以在并发的CD28激动下而增强。
实施例1中鉴定为1G7和1C9的CD28 sdAb以及另外的示例性CD28 sdAb(1C12、1F10、2F12)被形式化为具有人IgG1 Fc结构域的二价CD28单特异性构建体。将CD3(IL-2)报告细胞以105个细胞/孔接种在96孔板的各孔中。将示例性二价sdAb-hFc构建体与抗人Fc抗体一起以1:3摩尔比率在室温孵育10分钟，或在相同条件下单独孵育。然后将二价构建体与固定浓度为1μg/mL的抗CD3激活克隆OKT3一起滴定到报告细胞上。将测定板在37℃孵育6小时，然后平衡至室温。将Bio-GloTM试剂添加到所有孔中，并使用
Figure BDA0003858954760001672
L测量发光。
如图4A所示，sdAb 1C12和1F10(而不是2F12、1G7和1C9)的二价形式能够通过OKT3来增强报告基因的激活，并因此能够激动CD28。而单结构域抗体2F12、1G7和1C9当形式化为二价sdAb-IgG1时不会激动CD28，当使用抗Fc抗体(XL)交联以允许更高阶价构建体时，所有这三个克隆都能通过OKT3增强报告基因的激活，其中交联的1C9展现出最大的激活(图4B)。这些结果导致选择sdAb克隆1G7、2F11和1C9，如实施例1所述。
B.CD28靶向性双特异性构建体
如实施例4所述，使用基于Jurkat的报告细胞系(PromegaTM)评估了靶向CD28和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性构建体导致的CD28激动，所述报告细胞系被工程化以产生IL-2启动子驱动的荧光素酶。报告细胞上的CD3的激活导致荧光素酶的产生，这可以在并发的CD28激动下而增强。
为了评估二价形式的示例性PDL1xCD28双特异性构建体导致的CD28的PDL1依赖性激动，将CD3(IL-2)Jurkat报告细胞以5x104个细胞/孔接种在96孔板的各孔中，与相等数目的PDL1-CHO-K1细胞(PromegaTM)一起或不与其一起接种。后一种细胞系被工程化以不仅可以表达PDL1，还可以表达以抗原依赖性方式激活T细胞受体(TCR)的细胞表面蛋白。因此，PDL1-CHO-K1细胞和CD3(IL-2)Jurkat报告细胞的共培养导致较低水平的报告细胞激活，这可以通过添加CD28激动抗体来增强。添加示例性构建体，并将测定板在37℃孵育6小时然后平衡至室温。将Bio-GloTM试剂添加到所有孔中，并使用
Figure BDA0003858954760001684
L测量发光。
如图4C所示，PDL1xCD28双特异性蛋白(cx694)以PDL1依赖性方式激动在CD3(IL-2)Jurkat报告细胞系上的CD28，如通过在PDL1+细胞存在(而不是缺乏)的情况下报告细胞激活的增加所证明的。相对于未处理的对照，单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体并未增加报告细胞激活。
为了评估示例性5T4xCD28双特异性构建体导致的CD28的5T4依赖性激动，如实施例4所述，将CD3(IL-2)报告细胞以105个细胞/孔接种在96孔板的各孔中，与5T4阳性T47D细胞一起或不与其一起接种。分别以100nM和1g/mL的最终浓度添加示例性构建体和抗CD3激活克隆OKT3。将测定板在37℃孵育6小时，然后平衡至室温。将Bio-GloTM试剂添加到所有孔中，并使用
Figure BDA0003858954760001681
L测量发光。
如图4D所示，5T4xCD28双特异性构建体(cx8390)以5T4依赖性方式激动在CD3(IL-2)Jurkat报告细胞系上的CD28，如通过在5T4+细胞存在(而不是缺乏)的情况下报告细胞激活的增加所证明的。相对于未处理的对照，靶向CD28的单特异性蛋白(cx8394)并未增加报告细胞激活。
实施例6：PDL1xCD28双特异性构建体功能活性的评估
A.T细胞介导的细胞毒性
使用A549和未转染的HEK293FS细胞(分别作为PDL1+和PDL1-靶细胞)评估了示例性PDL1xCD28双特异性构建体(cx694)的靶标依赖性细胞毒性。将靶细胞用CytoID red进行荧光标记，并以1.5x103个细胞/孔接种在96孔平底板的各孔中的测定培养基中(RPMI，补充有10％FBS和1％抗生素-抗真菌素)。允许细胞在室温沉降以均匀分布，并在37℃孵育24小时以允许在添加其他测定组分之前贴壁。然后将示例性双特异性构建体和从PBMC负富集的原代T细胞的滴定物与绿色半胱天冬酶-3/7试剂(其对进行凋亡的细胞的核DNA进行荧光标记)一起添加到测定板中。作为对照的靶向CD28(cx698)或PDL1(cx1204)的单特异性构建体也被评估。使用
Figure BDA0003858954760001682
对测定板进行连续成像5天。通过测量总红色/绿色重叠对象面积来确定靶细胞死亡。在最终成像时间点之后，分别收集悬浮细胞和上清液以对激活标记物和细胞因子产生进行分析。将剩余的贴壁(活靶标)细胞用PBS轻轻洗涤，然后使用
Figure BDA0003858954760001683
2.0(一种基于荧光素酶的试剂，其在存在ATP(活细胞)的情况下会导致生物发光)进行分析。
如5A和5B所示，示例性PDL1xCD28双特异性构建体cx694在PDL1+A549细胞(而不是PDL1-293FS细胞)中诱导T细胞介导的半胱天冬酶-3/7激活，而单独靶向PDL1或CD28的单特异性构建体(分别为cx1204和cx698)在任一细胞类型中均不诱导半胱天冬酶-3/7激活。如5C和5D所示，由示例性PDL1xCD28双特异性构建体诱导的靶标依赖性半胱天冬酶激活与T细胞介导的靶标依赖性细胞毒性相关(如通过细胞存活所评估的)。
B.T细胞激活
为了评估T细胞激活，收集了来自T细胞介导的细胞毒性测定的细胞，并以400g离心五分钟，并丢弃上清液。将细胞重悬于含有live/dead染色剂以及缀合荧光团的抗人CD4、抗人CD8、抗人CD25、抗人CD69和/或抗人CD71抗体的FACS缓冲液中。使用Novocyte分析细胞，并通过测量CD25、CD69或CD71的表达水平或CD25+、CD69+或CD71+细胞的百分比来确定CD4+或CD8+ T细胞激活。
图6A、6B和6C分别描绘了在培养T细胞与PDL1+(A549)或PDL1-(293FS)细胞之后，在125nM的PDL1xCD28双特异性构建体(cx694)或单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体存在下，CD4+ T细胞表达CD25、CD69和CD71的结果。图6D描绘了在培养T细胞与PDL1+(A549)或PDL1-(293FS)细胞之后，在PDL1xCD28双特异性构建体(cx694)或单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx698)的单特异性构建体存在下，CD8+ T细胞表达CD69的结果。结果表明，示例性PDL1xCD28双特异性构建体诱导CD4+和CD8+ T细胞的PDL1依赖性激活，如CD25、CD69和CD71在CD4+ T细胞上的表达增加(图6A-6C)以及CD69在CD8+ T细胞上的表达增加(图6D)所证明的。
C.T细胞细胞因子产生(ELISA)
如上所述大体进行了T细胞介导的细胞毒性测定，并收集上清液，通过夹心ELISA(美国
Figure BDA0003858954760001691
)分析IFNγ含量。对于ELISA分析，遵循制造商的说明书，并且生成上清液样品的细胞因子浓度值进行内插的标准曲线。向吸光度值低于检测下限的样品分配等于最低标准浓度的一半的细胞因子浓度。如图6E所示，示例性PDL1xCD28双特异性构建体(cx694)并不引发与PDL1+或PDL1-细胞共培养的T细胞产生IFNγ。cx5185是用作阳性对照的CD3靶向性构建体，并且是测试的产生高于定量下限(LLOQ)的IFNγ值的唯一构建体。这与细胞毒性数据一起表明示例性PDL1xCD28双特异性构建体具有诱导T细胞介导的PDL1+细胞杀伤的能力，而不会导致可检测的IFNγ的产生。
D.T细胞细胞因子产生(Immunospot)
在巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒(CEF)肽池刺激测定和自体混合淋巴细胞反应(aMLR)测定中，评估了示例性PDL1xCD28双特异性构建体导致的T细胞共刺激。
CEF肽池刺激测定
通过测量用CEF肽池处理的PBMC产生的IFNγ评估了示例性PDL1xCD28双特异性构建体cx8370导致的T细胞共刺激，所述CEF肽池含有来自巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒的表位与双特异性构建体的滴定物的组合。使用Immunospot分析仪测量IFNγ的产生。
将从正常人供体的全血中分离的PBMC接种在涂覆有IFNγ捕获抗体的96孔板的各孔中。添加CEF肽池和所述双特异性构建体或单独靶向PDL1(cx1204)或CD28(cx984)的单特异性构建体的滴定物。将测定板在37℃孵育24小时，洗涤，并添加抗IFNγ检测抗体。将测定板在室温孵育2小时，洗涤，然后添加第三荧光检测抗体。将板在室温孵育一小时，洗涤，然后在室温再孵育一小时以将膜干燥。对膜进行成像，并使用Immunospot分析仪确定IFNγ斑点计数。
如图7A所示，将示例性PDL1xCD28双特异性构建体cx8370添加到CEF肽池处理的PBMC中导致了共刺激，如通过剂量依赖性IFNγ产生所证明的。分别单独靶向PDL1或CD28的单特异性构建体cx1204和cx984并不影响处理过的PBMC产生的IFNγ水平。
自体混合淋巴细胞(aMLR)测定
通过测量由富集的T细胞和自体未成熟树突细胞(iDC)的经处理共培养物产生的TNFα来评估示例性PDL1xCD28双特异性构建体cx694导致的T细胞共刺激。使用Immunospot分析仪测量TNFα的产生。
从正常人供体白细胞单采包(STEMCELL Technologies)分离的PBMC中负富集T细胞。通过使用基于贴壁的方案从PBMC分离单核细胞、然后用重组GM-CSF(500U/mL)和IL-4(250U/mL)处理6-7天来产生未成熟的树突细胞。将T细胞以3x105个细胞/孔接种在涂覆有TNFα捕获抗体的96孔板的各孔中。以1:20iDC与T细胞比率、以1.5x104个细胞/孔添加自体iDC。将示例性单特异性和双特异性构建体(10nM)和重组IL-7(5ng/mL)添加到共培养物中，并将测定板在37℃孵育4天。洗涤膜，并根据制造商的说明
Figure BDA0003858954760001701
与第二和第三检测抗体一起孵育。对膜进行成像，并使用
Figure BDA0003858954760001702
分析仪确定TNFα斑点计数。
如图7B和7C所示，将示例性PDL1xCD28双特异性构建体cx694添加到自体混合淋巴细胞培养物中导致了共刺激，如通过TNFα的产生所证明的。分别单独靶向PDL1或CD28的单特异性抗体cx1204和cx698并不影响原代细胞的共培养物产生的细胞因子水平。
实施例7：体内CRS的预测测定
TGN1412是CD28靶向性超级激动剂抗体，其在2006年的临床试验中在健康志愿者中诱导了严重和快速的细胞因子释放综合征(CRS)(参见例如，Attarwala,J.Young Pharm.(2010)2(3):332-36)。这种反应不是通过正常生理条件下培养的PBMC进行的临床前体外实验预测的。随后的方法研发产生了一种测定法，其中通过高密度预培养的PBMC测量细胞因子的产生，这种情况可以更好地模拟体内组织中的情况。在这些更改的情况下，TGN1412诱导CD4+ T细胞产生大量TNFα。该测定已成为测试T细胞激活抗体的潜在毒性的标准。
将从正常人供体白细胞单采包(STEMCELL Technologies)分离的PBMC以高密度(107个细胞/mL)在XVIVOTM-15培养基中在37℃培养2天。收集细胞，洗涤，重悬于新鲜的测定培养基中，并以10μg/mL(2x105个细胞/孔)接种在涂覆有生成的示例性单特异性和双特异性构建体的96孔板的各孔中。将测定板在37℃孵育2小时，将蛋白转运抑制剂添加到所有孔中，然后将测定板在37℃再孵育4小时。用PBS洗涤细胞，用活力染料染色，用FcR阻断试剂处理，然后用缀合荧光团的抗人CD3、CD4、CD8、CD56和CD16抗体染色。将测定板在4℃孵育20分钟，然后洗涤细胞并重悬于固定/透化缓冲液中，并在4℃孵育30分钟。用透化洗涤缓冲液洗涤细胞，并重悬于含有缀合荧光团的抗TNFα抗体的透化缓冲液中。将测定板在4℃孵育过夜，然后洗涤细胞并重悬于FACS缓冲液中，以使用Quanteon流式细胞仪进行分析。
如图8A和8B所示，固定的抗CD3抗体和抗CD28超级激动剂TGN1412抗体二者均诱导来自高密度预培养的PBMC的CD4+ T细胞产生TNFα，正如预期的那样。与TGN1412不同，示例性单特异性二价CD28 sdAb cx984并不诱导TNFα在该细胞群中以高于未处理的对照样品的水平产生。同样，PDL1xCD28双特异性构建体(cx694和cx8370，每个对于PDL1和CD28均是二价的)均未诱导TNFα在该细胞种群中以高于未处理的对照样品的水平产生。不希望受理论束缚，结果表明，生成的示例性二价单特异性和双特异性CD28靶向性构建体不会诱导CD4+T细胞大量产生TNFα，这可能表明体内CRS的风险降低。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0003858954760001711
Figure BDA0003858954760001721
Figure BDA0003858954760001731
Figure BDA0003858954760001741
Figure BDA0003858954760001751
Figure BDA0003858954760001761
Figure BDA0003858954760001771
Figure BDA0003858954760001781
Figure BDA0003858954760001791
Figure BDA0003858954760001801
Figure BDA0003858954760001811
Figure BDA0003858954760001821
Figure BDA0003858954760001831
Figure BDA0003858954760001841
Figure BDA0003858954760001851
Figure BDA0003858954760001861
Figure BDA0003858954760001871
Figure BDA0003858954760001881
Figure BDA0003858954760001891
Figure BDA0003858954760001901
序列表
<110> 印希比股份有限公司
<120> CD28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体
<130> 744952001540
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 62/967,533
<151> 2020-01-29
<160> 398
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 3
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 4
<212> PRT
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<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 5
Gly Gly Gly Gly
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
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Gly Gly Gly Gly Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc
<400> 8
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc xELL
<400> 9
Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 10
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG2 Fc
<400> 10
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG3 Fc
<400> 11
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 12
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG4 Fc
<400> 12
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG4 Fc
<400> 13
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的IgG1铰链
<400> 14
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的IgG1铰链
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的IgG4铰链
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 羧基末端序列
<400> 17
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 羧基末端序列
<400> 18
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Glu Pro Gly Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 VH
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 VL
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VH
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VH
<400> 22
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VH
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VL
<400> 24
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VL
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3人源化VL
<400> 26
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105
<210> 27
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 Hv
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 Lv
<400> 28
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR1
<400> 29
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR2
<400> 30
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR3
<400> 31
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR1
<400> 32
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR2
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR3
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH1
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH2
<400> 36
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH3
<400> 37
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH4
<400> 38
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH5
<400> 39
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH6
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH7
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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<220>
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
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85 90 95
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100 105 110
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<220>
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<400> 60
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 抗CD3 VL2
<400> 67
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<220>
<223> 抗CD3 VL3
<400> 68
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 69
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL4
<400> 69
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 70
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL5
<400> 70
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 71
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL6
<400> 71
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 72
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL7
<400> 72
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 73
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL8
<400> 73
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL9
<400> 74
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL10
<400> 75
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL11
<400> 76
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Cys Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL12
<400> 77
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 78
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL13
<400> 78
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL14
<400> 79
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 80
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL15
<400> 80
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL16
<400> 81
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 82
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL17
<400> 82
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 83
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL18
<400> 83
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 84
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL19
<400> 84
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 85
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VHH
<400> 85
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Met Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Pro Thr Glu Lys Gly Ser Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr
<210> 86
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 典型CD28序列（例如Uniprot编号P10747）
<400> 86
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 87
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 87
Gly Gly Gly
1
<210> 88
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 ECD（人CD28的aa 19-152，例如Uniprot编号P10747）
<400> 88
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro
130
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 89
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 90
Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 91
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 92
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB源性共刺激结构域
<400> 92
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 93
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28源性共刺激结构域
<400> 93
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 94
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28源性共刺激结构域2
<400> 94
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 95
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28源性共刺激结构域3
<400> 95
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
1 5 10 15
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
20 25 30
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 96
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8源性铰链和跨膜结构域
<400> 96
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70
<210> 97
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8源性铰链和跨膜结构域
<400> 97
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
50 55 60
Ser Leu Val Ile Thr
65
<210> 98
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链和跨膜结构域
<400> 98
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr
65
<210> 99
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDL1 sdAb
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
100 105 110
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 PDL1
<400> 100
Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys Pro Ile Ser
1 5 10
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 PDL1
<400> 101
Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn
1 5
<210> 102
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 PDL1
<400> 102
Phe Glu Tyr
1
<210> 103
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 103
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225
<210> 120
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 120
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220
<210> 121
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 121
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 122
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 122
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复1至5次
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(6)
<223> 重复1至4次
<400> 124
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 125
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 126
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 127
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 127
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 129
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 129
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa是A、V、L、I、M,F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、
K、R、H、D或 E
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是A、V、L、I、M,F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、
K、R、H、D或E
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(1)
<223> 重复1-5次
<220>
<221> 重复
<222> (3)...(3)
<223> 重复1-5次
<220>
<221> 重复
<222> (5)...(5)
<223> 重复1-5次
<400> 130
Gly Xaa Gly Xaa Gly
1 5
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、
K、R、H、D或E
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa是A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、
K、R、H、D或E
<400> 131
Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复1至9次
<400> 132
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 133
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 134
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 135
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (3)...(4)
<223> 重复2至20次
<400> 135
Ala Ser Ala Pro Gly Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (3)...(7)
<223> 重复2至20次
<400> 136
Ala Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 137
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 138
Pro Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 139
Ala Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 140
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (4)...(17)
<223> 重复2至20次
<400> 140
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser
20
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 141
Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ala
1 5
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 142
Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly
1 5
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 143
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是 I、L、Y、M、F、V或A
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa是A、G、S、V、E、D、Q、N或Y
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa是H、P、A、V、G、S或T
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是D或E
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa是I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A
<400> 144
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是I或L
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa是P或A
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa是I、V、T、S或G
<400> 145
Xaa Glu Xaa Asp Xaa
1 5
<210> 146
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 颗粒酶B底物
<400> 146
Leu Glu Ala Asp
1
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 147
Leu Glu Pro Asp
1
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 148
Leu Glu Ala Glu
1
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 149
Ile Glu Pro Asp Ile
1 5
<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 150
Leu Glu Pro Asp Gly
1 5
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 151
Leu Glu Ala Asp Thr
1 5
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 152
Ile Glu Pro Asp Gly
1 5
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 153
Ile Glu Pro Asp Val
1 5
<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 154
Ile Glu Pro Asp Ser
1 5
<210> 155
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 155
Ile Glu Pro Asp Thr
1 5
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa是A或V
<400> 156
Xaa Gln Ala Arg Xaa
1 5
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa是A或V
<400> 157
Arg Gln Ala Arg Xaa
1 5
<210> 158
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白裂解酶底物
<400> 158
Arg Gln Ala Arg
1
<210> 159
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 159
Arg Gln Ala Arg Val
1 5
<210> 160
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是P、V或A
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa是Q或D
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa是A或N
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是L、I或M
<400> 160
Xaa Xaa Xaa Xaa
1
<210> 161
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa是Q或D
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa是A或N
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是 L或I
<400> 161
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<210> 162
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP底物
<400> 162
Pro Ala Gly Leu
1
<210> 163
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 163
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala Gly Leu Gly Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly
<210> 164
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 164
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly
<210> 165
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 165
Thr Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly Ser
<210> 166
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 166
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly
<210> 167
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 167
Thr Gly Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 168
Thr Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 169
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 169
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu
1 5 10 15
Ala Asp Gly Ser
20
<210> 170
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 170
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Pro Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly
<210> 171
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 171
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 172
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 173
Gly Ser Ile Glu Pro Asp Ile Gly Ser
1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 174
Gly Ser Leu Glu Ala Asp Thr Gly Ser
1 5
<210> 175
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 175
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 176
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 176
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Val Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 177
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 177
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 178
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 178
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 179
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 179
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Pro Asp Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 180
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 180
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly
<210> 181
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 181
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 182
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 182
Gly Ser Ser Ala Gly Ser Glu Ala Gly Gly Ser Gly Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 183
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 183
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Glu Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 184
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 184
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Pro Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 185
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 185
Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser
<210> 186
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G7 CD28 sdAb
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Pro Arg Thr Ile Gly Leu Ile Ser
20 25 30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Ala Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Lys Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Val Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Val Asn Ala Glu Thr Ala Pro Trp Ser Arg Arg Gly Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 187
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F11 CD28 sdAb
<400> 187
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ser Phe Asn Val Val
20 25 30
Asp Met Asp Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Arg Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ala Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Arg Trp Pro Ser Arg Tyr Gln Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 188
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9 CD28 sdAb
<400> 188
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1G7)
<400> 189
Arg Thr Ile Gly Leu Ile Ser Leu Met Gly
1 5 10
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1G7)
<400> 190
Thr Ile Ile Ala Ser Gly Arg Thr Asn
1 5
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (1G7)
<400> 191
Asn Ala Glu Thr Ala Pro Trp Ser Arg Arg Gly Phe
1 5 10
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (2F11)
<400> 192
Gly Ile Ser Phe Asn Val Val Asp Met Asp
1 5 10
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (2F11)
<400> 193
Gly Ile Thr Arg Gly Gly Ala Thr Tyr
1 5
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (2F11)
<400> 194
Arg Trp Pro Ser Arg Tyr Gln Asn Tyr
1 5
<210> 195
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1C9、v1-v4、v7-v9、v12-v27)
<400> 195
Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9、v1-v6、v10、v11)
<400> 196
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 197
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (1C9、v1-v27)
<400> 197
Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1C9v5)
<400> 198
Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1C9v6)
<400> 199
Gly Arg Leu Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1C9v10)
<400> 200
Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 (1C9v11)
<400> 201
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 202
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7)
<400> 202
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Glu Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 203
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v8)
<400> 203
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v9)
<400> 204
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Asp
1 5 10
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v12)
<400> 205
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Val Ala Asp
1 5 10
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v13、16、17、22-27)
<400> 206
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp
1 5 10
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v14)
<400> 207
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Ser Asp Ala Asp
1 5 10
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v15)
<400> 208
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Thr Cys Ala Asp
1 5 10
<210> 209
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v18)
<400> 209
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Ala
1 5 10
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v19)
<400> 210
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Ser Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v20)
<400> 211
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Thr Asp
1 5 10
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v21)
<400> 212
Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Glu Ala Asp
1 5 10
<210> 213
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v1 CD28 sdAb
<400> 213
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 214
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v2 CD28 sdAb
<400> 214
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 215
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v3 CD28 sdAb
<400> 215
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 216
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v4 CD28 sdAb
<400> 216
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 217
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v5 CD28 sdAb
<400> 217
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 218
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v6 CD28 sdAb
<400> 218
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Leu Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 219
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v7 CD28 sdAb
<400> 219
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Glu Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 220
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v8 CD28 sdAb
<400> 220
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 221
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v9 CD28 sdAb
<400> 221
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 222
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v10 CD28 sdAb
<400> 222
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 223
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v11 CD28 sdAb
<400> 223
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 224
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v12 CD28 sdAb
<400> 224
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Val Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 225
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v13 CD28 sdAb
<400> 225
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 226
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v14 CD28 sdAb
<400> 226
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Ser Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 227
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v15 CD28 sdAb
<400> 227
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Thr Cys Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 228
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v16 CD28 sdAb
<400> 228
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 229
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v17 CD28 sdAb
<400> 229
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 230
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v18 CD28 sdAb
<400> 230
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 231
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v19 CD28 sdAb
<400> 231
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Ser Ser Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 232
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v20 CD28 sdAb
<400> 232
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 233
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v21 CD28 sdAb
<400> 233
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Glu Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 234
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v22 CD28 sdAb
<400> 234
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 235
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v23 CD28 sdAb
<400> 235
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 236
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v24 CD28 sdAb
<400> 236
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 237
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v25 CD28 sdAb
<400> 237
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 238
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v26 CD28 sdAb
<400> 238
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 239
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v27 CD28 sdAb
<400> 239
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 240
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 sdAb
<400> 240
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Ser Lys
20 25 30
Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Arg Trp Ile Gly Gly Ala Thr Arg Tyr Thr Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gln Ala Trp Gly Thr Lys Phe Thr Asp Tyr Ser Asp Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 241
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 5T4 sdAb
<400> 241
Gly Arg Pro Phe Ser Ser Lys Thr Met Ala
1 5 10
<210> 242
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 5T4 sdAb
<400> 242
Ala Val Arg Trp Ile Gly Gly Ala Thr Arg
1 5 10
<210> 243
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 5T4 sdAb
<400> 243
Gly Gln Ala Trp Gly Thr Lys Phe Thr Asp Tyr Ser Asp
1 5 10
<210> 244
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (4)...(6)
<223> 重复 0至10次
<400> 244
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 245
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 sdAb
<400> 245
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val
35 40 45
Ala Ala Val Ser Arg Asn Ala Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Ser Ala Ala Tyr Ser Arg Ser Ser Glu Thr Tyr Thr Glu
100 105 110
Lys His Asp Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys
115 120 125
Pro
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 5T4 sdAb
<400> 246
Gly Arg Pro Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 247
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 5T4 sdAb
<400> 247
Ala Val Ser Arg Asn Ala Gly Ser Ser Tyr
1 5 10
<210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 5T4 sdAb
<400> 248
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
1 5 10
<210> 249
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 249
Gly Gly
1
<210> 250
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 250
Pro Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 251
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 251
Ile Glu Pro Asp Pro
1 5
<210> 252
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR1
<400> 252
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 253
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 253
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Leu Val Pro Ala Cys Thr Tyr Ser Asn Gly Arg Gly Pro
100 105 110
Leu Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Lys
115 120 125
Pro
<210> 254
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 254
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp
20 25 30
Ala Thr Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ile Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 255
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 255
Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu
1 5 10 15
Thr Phe Gly Val Val Phe Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Val Thr Gly Thr Asp Thr Val Asp
35 40 45
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
85 90 95
Val Thr Val Lys Pro
100
<210> 256
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 Fd
<400> 256
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225
<210> 257
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 LC
<400> 257
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 258
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗5T4 VH
<220>
<221> 变体
<222> (97)...(97)
<223> Xaa是半胱氨酸或酪氨酸
<400> 258
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Xaa Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 259
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗5T4 VL
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1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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<220>
<223> gpNMB LC
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85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 280
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v8D CD28 sdAb
<400> 280
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 281
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL (CON)
<400> 281
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 282
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 282
Glu Ile Ile Thr Ser Asp Lys Ser Met Gly
1 5 10
<210> 283
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH33
<400> 283
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 284
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-Het-1
<400> 284
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Asp Val Ser Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 285
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-Het-2
<400> 285
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 286
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR2
<400> 286
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
1 5 10
<210> 287
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH7, VH33 CDR3
<400> 287
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL2, VL21 CDR3
<400> 288
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL8 CDR3
<400> 289
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 290
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 (C05)
<400> 290
Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn Val Met Gly
1 5 10
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 (C05)
<400> 291
Arg Ile Phe Ser Gly Gly Ser Pro Asn
1 5
<210> 292
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 (C05)
<400> 292
Leu Ile Ala Ser Arg Ala Ala Pro Gly Leu Lys Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 293
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 (E08)
<400> 293
Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Met Gly
1 5 10
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 (E08)
<400> 294
Ala Met Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn
1 5
<210> 295
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 (E08)
<400> 295
Ala Ser Arg Arg Glu Leu Tyr
1 5
<210> 296
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 (B11)
<400> 296
Gly Ala Ile Phe Ser Lys Thr Glu Val Gly
1 5 10
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 (B11)
<400> 297
Thr Ile Ser Ala Gly Asp Arg Thr Asn
1 5
<210> 298
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 (B11)
<400> 298
Arg Arg Gly Asp Thr Ile Leu
1 5
<210> 299
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 (B10)
<400> 299
Gly Ile Ile Phe Arg Glu Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 (B10)
<400> 300
Val Ile Ser Lys Thr Gly Thr Thr Ile
1 5
<210> 301
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 (B10)
<400> 301
Thr Arg Gly Gln Leu Asp Tyr
1 5
<210> 302
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH33 CDR1
<400> 302
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 303
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH33 CDR2
<400> 303
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
1 5 10
<210> 304
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL21 CDR1
<400> 304
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 305
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH 312557
<400> 305
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 306
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH 312557 G44C
<400> 306
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 307
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL 312557
<400> 307
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 308
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL 312557Q100C
<400> 308
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 309
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH-G
<400> 309
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr His Tyr Gly Leu Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 310
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH-G
<400> 310
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr His Tyr Gly Leu Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 311
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK1-39Jk5
<400> 311
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 312
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK1-39Jk5Q100C
<400> 312
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 313
Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 314
Ala Asp Ala Ala Pro Gly
1 5
<210> 315
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 315
Gly Glu Pro Gln Gly
1 5
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 316
Gly Glu Pro Gln Gly Gly
1 5
<210> 317
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 317
Ala Gly Gly Glu Pro
1 5
<210> 318
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 318
Ala Gly Gly Glu Pro Gly
1 5
<210> 319
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 319
Ala Gly Ser Glu Pro
1 5
<210> 320
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 320
Ala Gly Ser Glu Pro Gly
1 5
<210> 321
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 321
Gly Gly Gly Glu Gln
1 5
<210> 322
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)...(5)
<223> 重复2至20次
<400> 322
Gly Gly Gly Glu Gln Gly
1 5
<210> 323
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 323
Ala Asp Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Pro Gly
1 5 10
<210> 324
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 324
Gly Glu Pro Gln Gly Gly Glu Pro Gln Gly Gly
1 5 10
<210> 325
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 325
Ala Gly Gly Glu Pro Ala Gly Gly Glu Pro Gly
1 5 10
<210> 326
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 326
Ala Gly Ser Glu Pro Ala Gly Ser Glu Pro Gly
1 5 10
<210> 327
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 327
Gly Gly Gly Glu Gln Gly Gly Gly Glu Gln Gly
1 5 10
<210> 328
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 328
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 375
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
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20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 376
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
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115 120
<210> 377
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 377
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 378
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 379
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 380
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 381
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 382
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 383
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v7.28 CD28 sdAb
<400> 384
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Gly Arg Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 385
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C9v7.29 CD28 sdAb
<400> 385
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Asp Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Gly Asp Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> CDR2 (1C9v7.5)
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1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7.6)
<400> 387
Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Glu Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7.12；1C9v13.6)
<400> 388
Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Asp Ala Asp
1 5 10
<210> 389
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7.13；1C9v13.7)
<400> 389
Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Asp Ala Asp
1 5 10
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7.19)
<400> 390
Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 391
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v7.20)
<400> 391
Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 392
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Thr Ala Asp
1 5 10
<210> 393
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (C9v7.27)
<400> 393
Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Thr Ala Asp
1 5 10
<210> 394
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v11.4)
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Ala Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 395
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 (1C9v11.5)
<400> 395
Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 396
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (1C9v7.2、10、17、24；1C9v11.2；1C9v13.2、5)
<400> 396
Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 397
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (1C9v7.7、14、21、28；1C9v11.6；1C9v13.8)
<400> 397
Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Gly Arg Asp Asp Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 398
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 (1C9v7.8、15、22、29；1C9v11.7；1C9v13.9)
<400> 398
Thr Tyr Ala Gly Trp Ala Ser Ser Arg Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr
1 5 10 15

Claims (161)

1.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
2.根据权利要求1所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
3.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194和197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
4.根据权利要求3所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
5.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
6.一种CD28结合多肽，其包含结合CD28的至少一个单结构域抗体(sdAb)，其中所述至少一个CD28 sdAb(CD28 VHH)结构域包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ IDNO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-8和11中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
15.根据权利要求1-8、13和14中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ IDNO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ IDNO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
16.根据权利要求1-8和13中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
17.根据权利要求1-8、13和16中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ IDNO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
18.根据权利要求1-8和13-15中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-8、13-15和18中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-8、13、16和17中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求1-7、13、16、17和20中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb是一个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是单价的。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb是两个、三个或四个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是多价的。
24.根据权利要求1-21和23中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28sdAb是两个CD28 sdAb和/或所述CD28结合多肽对于CD28是二价的。
25.根据权利要求24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是相同的CD28sdAb。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求24或权利要求25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求24或权利要求25所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的每一个均包含SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求24所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb是不同的CD28sdAb。
30.根据权利要求24或权利要求29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQID NO:220所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求24或权利要求29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQID NO:280所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求24或权利要求29所述的CD28结合多肽，其中所述两个CD28 sdAb中的一个包含SEQ ID NO:220所示的氨基酸序列，并且所述两个CD28 sdAb中的另一个包含SEQID NO:280所示的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述CD28结合多肽包含结合蛋白A的部分。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的CD28结合多肽，其中所述至少一个CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。
35.根据权利要求34所述的CD28结合多肽，其中所述氨基酸修饰是框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的G65D。
36.一种抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其包含根据权利要求1-35中任一项所述的CD28结合多肽和免疫球蛋白Fc区。
37.根据权利要求36所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区通过连接肽(LP)连接至所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb通过连接肽(LP)在Fc区的N末端处连接至Fc区。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述LP是不可切割接头。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-Fc。
42.根据权利要求37-40中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽从N末端到C末端包含：(CD28 sdAb)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其是二聚体。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是人IgG1的。
47.根据权利要求36-46中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据权利要求36-43中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
49.根据权利要求36-48中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区展现出效应子功能。
50.根据权利要求36-48中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
51.根据权利要求50所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
53.一种同二聚体Fc融合蛋白，其包含根据权利要求33-49中任一项所述的抗CD28sdAb-Fc融合蛋白的两个相同拷贝。
54.一种异二聚体融合蛋白，其包含根据权利要求33-49中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白中的两种。
55.一种多特异性结合多肽，其包含根据权利要求36-52中任一项所述的抗CD28 sdAb-Fc融合蛋白和一个或多个结合CD28以外的靶抗原的结合结构域(BD)。
56.根据权利要求55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合肿瘤相关抗原(TAA)。
57.根据权利要求55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合T细胞表面标记物，所述标记物是T细胞激活标记物或T细胞耗竭标记物。
58.根据权利要求55所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD结合细胞表面标记物，所述标记物是肿瘤微环境标记物。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD、任选地所述一个或多个BD中的每一个，在单结构域抗体(sdAb)中。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述多特异性结合多肽是Fc融合蛋白，其中所述一个或多个BD中的至少一个和/或所述至少一个CD28 sdAb连接至所述免疫球蛋白Fc区。
61.根据权利要求60所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc融合蛋白从N末端到C末端包含：
所述一个或多个BD；
所述至少一个包含结合CD28的sdAb的CD28结合结构域；以及
所述Fc区。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD中的至少一个通过连接肽(LP)与所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个连接。
63.根据权利要求55-62中任一项所述的多特异性结合多肽，其从N末端到C末端包含：(BD)-LP-(CD28 sdAb)-LP-Fc。
64.根据权利要求55-63中任一项所述的CD28结合多肽，其是二聚体。
65.根据权利要求55-64中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
66.根据权利要求55-65中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
67.根据权利要求55-66中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的。
68.根据权利要求55-67中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
69.根据权利要求55-64和66-68中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
70.根据权利要求55-69中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区展现出效应子功能。
71.根据权利要求55-69中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
72.根据权利要求71所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
74.根据权利要求55-73中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述BD结合的抗原选自：1-92-LFA-3，2B4，5T4，α-4整合素，α-V整合素，α4β1整合素，α4β7整合素，α-SMA，AGR2，抗路易斯-Y，爱帕琳肽J受体，APRIL，B7-H3，B7-H4，BAFF，BTLA，C5补体，C-242，CA9，CA19-9(路易斯a)，碳酸酐酶9，CD2，CD3，CD6，CD9，CD11a，CD19，CD20，CD22，CD24，CD25，CD27，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD41，CD44，CD44v6，CD47，CD51，CD52，CD56，CD64，CD69，CD70，CD71，CD74，CD80，CD81，CD86，CD95，CD107a，CD117，CD123，CD125，CD132(IL-2RG)，CD133，CD137，CD138，CD160，CD166，CD172A，CD248，CDH6，CEACAM5(CEA)，CEACAM6(NCA-90)，密封蛋白-3，密封蛋白-4，cMet，胶原蛋白，Cripto，CSFR，CSFR-1，CTLA-4，CTGF，CXCL10，CXCL13，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CYR61，DL44，DLK1，DLL3，DLL4，DPP-4，DSG1，EDA，EDB，EGFR，EGFRviii，内皮素B受体(ETBR)，ENPP3，EpCAM，EPHA2，EPHB2，ERBB3，RSV的F蛋白，FAP，FGF-2，FGF8，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FLT-3，叶酸受体α(FRα)，FSP-1，GAL3ST1，G-CSF，G-CSFR，GD2，GITR，GLUT1，GLUT4，GM-CSF，GM-CSFR，GP IIb/IIIa受体，Gp130，GPIIB/IIIA，GPNMB，GRP78，HER2/neu，HER3，HER4，HGF，hGH，HLA-DR，HVEM，透明质酸酶，ICOS，IFNα，IFNβ，IFNγ，IgE，IgE受体(FceRI)，IGF，IGF1R，IL1B，IL1R，IL2，IL11，IL12，IL12p40，IL-12R，IL-12Rβ1，IL13，IL13R，IL13Ra2，IL15，IL17，IL18，IL21，IL23，IL23R，IL27/IL27R(wsx1)，IL29，IL-31R，IL31/IL31R，IL2R，IL4，IL4R，IL6，IL6R，IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)，胰岛素受体，Jagged配体Jagged 1、Jagged 2)，KISS1-R，KLRG1，LAG-3，LIF-R，路易斯X，LIGHT，LRP4，LRRC26，Ly6G6D，LyPD1，MCSP，间皮素，MRP4，MUC1，粘蛋白-16(MUC16，CA-125)，Na/KATP酶，NGF，呆蛋白，Notch受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，NOV，OSM-R，OX-40，PAR2，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGFRα，PDGFRβ，PD-1，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，P1GF，PSCA，PSMA，PSGR，RAAG12，RAGE，SLC44A4，Siglec15，鞘氨醇1磷酸酯，STEAP1，STEAP2，TAG-72，TAPA1，TEM-8，TGFβ，TIGIT，TIM-3，TLR2，TLR4，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TMEM31，TNFα，TNFR，TNFRS12A，TRAIL-R1，TRAIL-R2，转铁蛋白，转铁蛋白受体，TRK-A，TRK-B，uPAR，VAP1，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VISTA，WISP-1，WISP-2和WISP-3。
75.根据权利要求55-74中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是一个BD和/或所述多特异性结合多肽对于所述抗原是单价的。
76.根据权利要求55-74中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是两个、三个或四个BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或多个抗原是多价的。
77.根据权利要求55-74和76中任一项所述的多特异性结合多肽，其中所述一个或多个BD是两个BD和/或所述多特异性结合多肽对于一个或多个抗原是二价的。
78.根据权利要求77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是相同的sdAb。
79.根据权利要求77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是结合相同抗原、任选地结合所述相同抗原的不同表位的不同sdAb。
80.根据权利要求77所述的多特异性结合多肽，其中所述两个BD是单结构域抗体(sdAb)，并且所述两个sdAb是结合不同抗原的不同sdAb。
81.一种同二聚体多特异性Fc融合蛋白，其包含根据权利要求55-80中任一项所述的多特异性结合多肽的两个相同拷贝。
82.一种异二聚体多特异性Fc融合蛋白，其包含根据权利要求55-80中任一项所述的多特异性结合多肽中的两种。
83.根据权利要求81或权利要求82所述的多特异性Fc融合蛋白，其包含在所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与所述Fc区之间的接头肽(LP)。
84.根据权利要求81-83中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述CD28结合多肽包含在所述一个或多个BD中的至少一个与所述Fc区之间的连接肽(LP)。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是不可切割接头。
86.根据权利要求83-85中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是长度为约1至20个氨基酸的肽。
87.根据权利要求83-86中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述LP是或包含SEQ ID NO:1-7、89、90、123-129、244和249中任一个所示的氨基酸序列。
88.根据权利要求55-80中任一项所述的多特异性结合多肽或根据权利要求81-87中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个BD中的至少一个与其抗原结合。
89.根据权利要求55-80中任一项所述的多特异性结合多肽或根据权利要求81-87中任一项所述的多特异性Fc融合蛋白，其中所述至少一个CD28 sdAb不能或基本上不能结合或接合CD28，除非所述一个或多个BD中的每一个均与其抗原结合。
90.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
91.根据权利要求90所述的抗CD28 sdAb，其包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
92.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：包含选自SEQ ID NO:189、192、195、198、199、200和201的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)；包含选自SEQ ID NO:190、193、196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)；以及包含选自SEQ ID NO:191、194、197、396、397和398的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
93.根据权利要求92所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含：
包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:208所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:386所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:387所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:202所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:390所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:391所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:392所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:393所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:394所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:395所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:196所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:396所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:388所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:389所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的CDR3；
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:397所示氨基酸序列的CDR3；或
包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:398所示氨基酸序列的CDR3。
94.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:220所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ ID NO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
95.一种抗CD28单结构域抗体(sdAb)，其包含：
如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:213所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:214所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:215所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:216所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:217所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:218所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:219所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:221所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:222所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:223所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:224所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:225所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:226所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:227所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:228所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:229所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:230所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:231所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:232所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:233所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:234所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:235所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:236所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:237所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:238所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:239所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:342所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:343所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:344所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:345所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:346所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:347所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:348所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:349所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:350所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:351所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:352所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:353所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:354所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:355所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:356所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:357所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:358所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:359所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:360所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:361所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:362所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:363所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:364所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQID NO:365所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:366所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:367所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:368所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:369所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:370所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:371所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:372所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:373所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:374所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ IDNO:375所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:376所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:377所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:378所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:379所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:380所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:381所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:382所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:383所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；如SEQ ID NO:384所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3；或如SEQ IDNO:385所示氨基酸序列中含有的CDR1、CDR2和CDR3。
96.根据权利要求90-95中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
97.根据权利要求90-95中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:186、187、188、213、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、280、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384和385至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:186，(ii)SEQ ID NO:186的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:186至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含：包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的CDR3。
100.根据权利要求90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:187，(ii)SEQ ID NO:187的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:187至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
101.根据权利要求90-97和100中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列的CDR3。
102.根据权利要求90-97中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:188，(ii)SEQ ID NO:188的人源化变体，和/或(iii)展现出与SEQ ID NO:188至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
103.根据权利要求90-97和102中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:196、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
104.根据权利要求90-97、102和103中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、203和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ IDNO:195、208和197；SEQ ID NO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQID NO:201、202和398；SEQ ID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ IDNO:201、204和197；SEQ ID NO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQID NO:201、196和398；SEQ ID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
105.根据权利要求90-97和102中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含：包含SEQ ID NO:195、198、199、200和201中任一个所示氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:196、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、386、387、388、389、390、391、392、393、394和395中任一个所示氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:197、396、397和398中任一个所示氨基酸序列的CDR3。
106.根据权利要求90-07、102和105中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含以下分别所示的CDR1、CDR2和CDR3：SEQ ID NO:195、196和197；SEQ ID NO:198、196和197；SEQ ID NO:199、196和197；SEQ ID NO:200、196和197；SEQ ID NO:201、196和197；SEQ ID NO:195、202和197；SEQ ID NO:195、204和197；SEQ ID NO:195、205和197；SEQ ID NO:195、206和197；SEQ ID NO:195、207和197；SEQ ID NO:195、208和197；SEQ IDNO:195、209和197；SEQ ID NO:195、210和197；SEQ ID NO:195、211和197；SEQ ID NO:195、212和197；SEQ ID NO:201、202和197；SEQ ID NO:201、202和396；SEQ ID NO:201、386和197；SEQ ID NO:201、387和197；SEQ ID NO:201、202和397；SEQ ID NO:201、202和398；SEQID NO:201、206和197；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、388和197；SEQ ID NO:201、389和197；SEQ ID NO:201、206和397；SEQ ID NO:201、206和398；SEQ ID NO:201、203和197；SEQ ID NO:201、203和396；SEQ ID NO:201、390和197；SEQ ID NO:201、391和197；SEQ ID NO:201、203和397；SEQ ID NO:201、203和398；SEQ ID NO:201、204和197；SEQ IDNO:201、204和396；SEQ ID NO:201、392和197；SEQ ID NO:201、393和197；SEQ ID NO:201、204和397；SEQ ID NO:201、204和398；SEQ ID NO:201、196和396；SEQ ID NO:201、394和197；SEQ ID NO:201、395和197；SEQ ID NO:201、196和397；SEQ ID NO:201、196和398；SEQID NO:195、206和396；SEQ ID NO:195、388和197；SEQ ID NO:195、389和197；SEQ ID NO:195、206和397；或SEQ ID NO:195、206和398。
107.根据权利要求90-97和102-104中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
108.根据权利要求90-97、102-104和107中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
109.根据权利要求90-97、102、105和106中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
110.根据权利要求90-97、102、105、106和109中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含SEQ ID NO:213-219、221-239、280和342-385中任一个所示的氨基酸序列。
111.根据权利要求90-110中任一项所述的抗CD28 sdAb，其中所述抗CD28 sdAb包含减少与蛋白A的结合的氨基酸修饰。
112.根据权利要求111所述的抗CD28 sdAb，其中所述氨基酸修饰是框架区3(FR3)中的根据Kabat定义的G65D。
113.根据权利要求1-35中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-54和81-89中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80和88-89中任一项所述的多特异性结合蛋白；或根据权利要求90-112中任一项所述的抗CD28单结构域抗体，不包含CD3结合区。
114.根据权利要求1-35中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-54和81-89中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80和88-89中任一项所述的多特异性结合蛋白；或根据权利要求90-112中任一项所述的抗CD28单结构域抗体，包含CD3结合区。
115.一种多特异性构建体，其包含根据权利要求90-112中任一项所述的至少一个抗CD28单结构域抗体(sdAb)、一个或多个结合CD28以外的抗原的结合结构域(BD)、以及CD3结合区。
116.根据权利要求115所述的多特异性构建体，其中所述BD结合TAA。
117.根据权利要求115或权利要求116所述的多特异性构建体，其中所述BD是单结构域抗体(sdAb)。
118.根据权利要求114所述的CD28结合多肽；根据权利要求114所述的融合蛋白；根据权利要求114所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-117中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
119.根据权利要求114或权利要求118所述的CD28结合多肽；根据权利要求114或权利要求118所述的融合蛋白；根据权利要求114或权利要求118所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114或权利要求118所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-118中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。
120.根据权利要求1的权利要求120所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
121.根据权利要求114和118-120中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-120中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-120中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-120中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-120中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是单价的。
122.根据权利要求114和118-121中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-121中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-121中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-121中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-121中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的可变片段(Fv)。
123.根据权利要求114和118-121中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-121中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-121中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-121中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-121中任一项所述的多特异性构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。
124.根据权利要求114和118-123中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-123中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-123中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-123中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-123中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD28结合多肽包含免疫球蛋白Fc区。
125.根据权利要求124所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:8、10、11、12和13的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:8、10、11、12和13中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
126.根据权利要求124或权利要求125所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是人IgG1的。
127.根据权利要求124-126中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是人IgG1的，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
128.根据权利要求124-127中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
129.根据权利要求中任一项所述的CD28结合多肽，根据权利要求124-128中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区展现出效应子功能。
130.根据权利要求124-128中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc区包含含有一个或多个氨基酸修饰的多肽，所述一个或多个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体和C1q的效应分子的结合。
131.根据权利要求130所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失。
132.根据权利要求130或权利要求131所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或多个的缺失，任选地其中所述Fc区包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
133.根据权利要求124-132中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述CD28结合多肽是二聚体。
134.根据权利要求124-133中任一项所述的CD28结合多肽、融合蛋白、多特异性结合蛋白、抗CD28单结构域抗体或多特异性构建体，其中所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
135.根据权利要求114和118-134中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-134中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-134中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-134中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-134中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述一个或多个BD中的至少一个与其抗原结合。
136.根据权利要求114和118-135中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求114和118-135中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求114和118-135中任一项所述的多特异性结合蛋白；根据权利要求114和118-135中任一项所述的抗CD28单结构域抗体；或根据权利要求115-135中任一项所述的多特异性构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述至少一个CD28 sdAb中的至少一个与CD28结合。
137.一种或多种多核苷酸，其编码：根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-42、45-47、49-52和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-63、66-68、70-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb。
138.一种多核苷酸，其包含第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列编码根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽，根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白，或根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽的第一多肽，所述第二核酸序列编码第二多肽，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。
139.根据权利要求138所述的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同的启动子。
140.根据权利要求138或权利要求139所述的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A和F2A。
141.一种载体，其包含根据权利要求137-140中任一项所述的多核苷酸。
142.根据权利要求141所述的载体，其是表达载体。
143.根据权利要求141或权利要求142所述的载体，所述载体是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
144.一种细胞，其包含根据权利要求137-140中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求141-143中任一项所述的一种或多种载体。
145.根据权利要求144所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
146.根据权利要求144或权利要求145所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
147.一种产生多肽的方法，所述方法包括向细胞中引入根据权利要求137-140中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求141-143中任一项所述的一种或多种载体，以及在产生所述多肽的条件下培养所述细胞。
148.根据权利要求147所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。
149.一种由权利要求147或权利要求148所述的方法产生的多肽。
150.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb。
151.根据权利要求150所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
152.根据权利要求150或权利要求151所述的药物组合物，其是无菌的。
153.一种刺激受试者中免疫反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据权利要求150-152中任一项所述的药物组合物。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述免疫反应是针对肿瘤或癌症增加的。
155.根据权利要求153或权利要求154所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
156.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据权利要求150-152中任一项所述的药物组合物。
157.根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据权利要求150-152中任一项所述的药物组合物的用途。
158.一种组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症，其包含根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据权利要求150-152中任一项所述的药物组合物。
159.一种组合物，其用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物，其包含根据权利要求1-35和113-136中任一项所述的CD28结合多肽；根据权利要求36-55、81-89和113-136中任一项所述的融合蛋白；根据权利要求55-80、88-89和113-136中任一项所述的多特异性结合多肽；或根据权利要求90-136中任一项所述的抗CD28 sdAb；或根据权利要求150-152中任一项所述的药物组合物。
160.根据权利要求155或权利要求156所述的方法，根据权利要求157所述的用途，或根据权利要求158或权利要求159所述的组合物，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
161.根据权利要求155或权利要求156所述的方法，根据权利要求157所述的用途，或根据权利要求158或权利要求159所述的组合物，其中所述受试者是人。
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