CN111138543A - 异二聚体蛋白 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明提供了异二聚体抗体，所述异二聚体抗体包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含第一重链恒定结构域和第一抗原结合结构域，所述第一重链恒定结构域包含第一变体Fc结构域；所述第二单体包含第二重链恒定结构域和第二抗原结合结构域，所述第二重链恒定结构域包含第二变体Fc结构域。在其他的方面，异二聚体抗体包含第一单体，所述第一单体包含重链，所述重链包含第一Fc结构域和结合第一抗原的单链Fv区(scFv)，其中所述scFv包含带电荷的scFv接头。所述异二聚体抗体进一步包含第二单体，所述第二单体包含第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第二Fc结构域和第一可变重链。

Description

异二聚体蛋白
本申请是申请号为201480014664.1的中国专利申请的分案申请。
本申请是于2014年1月14日提交的国际专利申请号 PCT/US14/11549、于2014年1月14日提交的美国专利申请号 14/155,334、于2014年3月11日提交的14/205,248和于2014年3月 12日提交的14/207,489的部分继续申请。此外，本申请要求于2013 年5月1日提交的美国专利申请号61/818,513、于2013年5月1日提交的61/818,344、于2013年3月15日提交的61/794,896、于2013年 5月1日提交的61/818,401、于2013年12月9日提交的61/913,879、于2013年12月9日提交的61/913,832、于2014年2月10日提交的 61/938,095和于2013年12月9日提交的61/913,870的优先权，所有这些申请均特别地通过引用整体地并入，特别地用于本文公开的所有附图和图例，并且用于本文公开的氨基酸变体。
发明背景
已经成功地使用基于抗体的疗法来治疗多种疾病，包括癌症和自身免疫/炎性病症。然而对此类药物仍然需要改进，特别是关于增强它们的临床效力。正在探究的一条道路是将额外的和新型的抗原结合位点改造成基于抗体的药物使得单个免疫球蛋白分子共同接合两种不同的抗原。接合两种不同的抗原的这种非天然或替代的抗体形式经常被称为双特异性抗体(bispecifics)。因为抗体可变区(Fv)的相当大的多样性使得有可能产生实际上识别任何分子的Fv，产生双特异性抗体的典型方式是将新的可变区引入至抗体中。
已经开发了许多替代的抗体形式用于双特异性靶向(Chames& Baty,2009,mAbs 1[6]:1-9；Holliger&Hudson,2005,Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136；Kontermann,mAbs 4(2):182(2012),
所有这些文章均特别地通过引用并入本文)。开始，通过融合两个细胞系来制备双特异性抗体，所述细胞系各自产生单一的单克隆抗体 (Milstein等人,1983,Nature 305:537-540)。尽管得到的杂交的杂交瘤或四源杂交瘤的确产生双特异性抗体，但它们仅是微小的群体，并且需要大量的纯化来分离所需的抗体。对此的工程解决方案是利用抗体片段来制备双特异性抗体。因为这样的片段缺少全长抗体的复杂四级结构，因此轻链和重链可变区可以连接在单个遗传构建体中。已经生成了许多不同形式的抗体片段，包括双抗体、单链抗体、串联scFv’s、和Fab2双特异性抗体(Chames&Baty,2009,mAbs 1[6]:1-9；Holliger&Hudson,2005,Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136；特别地通过引用并入本文)。尽管这些形式可以在细菌中以高水平表达并且由于它们的小尺寸而可以具有有利的渗透益处，但它们在体内快速清除并且可能呈现与它们的生产和稳定性相关的制造障碍。这些缺点的主要原因在于抗体片段典型地缺少抗体的恒定区及其相关的功能特性，包括较大的尺寸、高稳定性以及与在血清中保持长的半衰期的各种Fc受体和配体(即，新生Fc受体FcRn)的结合或充当纯化的结合位点(即，蛋白A和蛋白G)。
更多最近的工作已经尝试通过将双重结合改造成全长抗体样的形式来解决基于片段的双特异性抗体的缺点(Wu等人,2007,Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297；USSN12/477,711；Michaelson等人, 2009,mAbs 1[2]:128-141；PCT/US2008/074693；Zuo等人,2000, Protein Engineering 13[5]:361-367；USSN09/865,198；Shen等人,2006, JBiol Chem 281[16]:10706-10714；Lu等人,2005,J Biol Chem 280[20]:19665-19672；PCT/US2005/025472；通过引用特别地并入本文)。这些形式克服了抗体片段双特异性抗体的一些障碍，主要是因为它们含有Fc区。这些形式的一个明显的缺点是，因为它们在同源二聚体恒定链的顶部构建了新的抗原结合位点，因而与新抗原的结合总是双价的。
对于有吸引力作为治疗性双特异性抗体形式中的共同靶标的许多抗原，所需的结合是单价的而不是双价的。对于许多免疫受体，通过单价结合相互作用的交联来实现细胞激活。交联的机制典型地通过抗体/抗原免疫复合物来介导，或经由效应细胞与靶细胞接合。例如，低亲和性Fcγ受体(FcγRs)诸如FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa与抗体 Fc区单价结合。单价结合不会激活表达这些FcγRs的细胞；然而，在免疫络合或细胞-细胞接触中，受体被交联并且聚集在细胞表面上，导致激活。对于负责介导细胞杀伤的受体，例如，自然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIa，当效应细胞以高度亲和(avid)的形式接合靶细胞时发生受体交联和细胞激活(Bowles&Weiner,2005,J Immunol Methods 304:88-99,特别地通过引用并入)。同样，在B细胞上，仅当其与细胞表面B细胞受体(BCR)接合成免疫复合物时，抑制性受体FcγRIIb下调B细胞激活，一种由可溶的IgG与被BCR识别的相同抗原的免疫络合所介导的机制(Heyman 2003,Immunol Lett 88[2]:157-161；Smith 和Clatworthy,2010,Nature Reviews Immunology 10:328-343；特别地通过引用并入)。作为另一个实例，T细胞的CD3激活仅当在高度亲和的细胞-细胞突触中其相关的T细胞受体(TCR)接合抗原递呈细胞上的抗原负载的MHC时才发生(Kuhns等人,2006,Immunity 24:133-139)。事实上使用抗CD3抗体对CD3的非特异性二价交联引起了细胞因子风暴和毒性(Perruche等人,2009,JImmunol 183[2]:953-61；Chatenoud&Bluestone,2007,Nature Reviews Immunology 7:622–632；特别地通过引用并入)。因此，对于实际的临床应用，用于对靶细胞的重定向杀伤的CD3共接合的优选模式是单价结合，其在与共接合的靶标接合时仅导致激活。
因此，尽管由抗体片段生成的双特异性抗体遇到了生物物理和药代动力学的障碍，但具有全长抗体样格式的那些构建体的缺点在于在缺少主要靶抗原的情况下，它们多价地接合共同靶抗原，导致非特异性激活和潜在的毒性。本发明通过引入一组新的双特异性抗体形式来解决这个问题，所述双特异性抗体形式能够多价地共同接合不同的靶抗原。另外，本发明提供了新的异二聚体化变体，其允许更好地形成和纯化异二聚体蛋白，包括抗体。
发明简述
在一个方面，本发明提供了异二聚体抗体，所述异二聚体抗体包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含第一重链恒定结构域和第一抗原结合结构域，所述第一重链恒定结构域包含第一变体Fc结构域；所述第二单体包含第二重链恒定结构域和第二抗原结合结构域，所述第二重链恒定结构域包含第二变体Fc结构域。
在其他的方面，异二聚体抗体包含第一单体，所述第一单体包含重链，所述重链包含第一Fc结构域和结合第一抗原的单链Fv区 (scFv)，其中所述scFv包含带电荷的scFv接头。所述异二聚体抗体进一步包含第二单体，所述第二单体包含第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第二Fc结构域和第一可变重链。在其他的方面，此带电荷的接头带有3-8的正电荷或带有3-8的负电荷，且选自由图9中所绘的那些接头组成的组。
在进一步的方面，本发明提供了异二聚体抗体组合物，其包含第一单体，所述第一单体包含第一重链序列和第二重链序列，所述第一重链序列包含相比于人Fc结构域的第一变体Fc结构域；和结合第一抗原的第一抗原结合结构域；所述第二重链序列包含：相比于人Fc 结构域的第二变体Fc结构域；和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；其中所述第一和第二变体Fc结构域包含选自由图3中所绘的氨基酸组组成的组的一组氨基酸置换。
在其他的方面，本发明提供了异二聚体抗体组合物，其包含：第一单体，所述第一单体包含第一重链序列和第二重链序列，所述第一重链序列包含相比于人Fc结构域的第一变体Fc结构域；和结合第一抗原的第一抗原结合结构域；所述第二重链序列包含相比于人Fc结构域的第二变体Fc结构域；和结合CD19的第二抗原结合结构域。所述第二抗原结合结构域包含可变重链结构域和可变轻链，如图21中所绘的，所述可变重链结构域包含H1.227的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)，所述可变轻链选自由下列各项组成的组：L1.198的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)和1.199的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)。
在进一步的方面，本发明提供了异二聚体抗体组合物，其包含第一单体，所述第一单体包含第一重链序列，所述第一重链序列包含相比于人Fc结构域的第一变体Fc结构域；和第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含抗-CD3可变区，所述抗-CD3可变区具有包含vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的序列，所述vhCDR1具有序列T-Y-A-M-Xaa1,其中Xaa1是N、S或 H(SEQ ID NO:435)；所述vhCDR2具有序列 R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G，其中 Xaa1是Y或A，Xaa2是N或S，Xaa3是Y或A且Xaa4是D或A (SEQ ID NO:436)；所述vhCDR3具有序列 H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y,其中Xaa1是N、D或Q且 Xaa2是A或D(SEQ ID NO:437)，所述vlCDR1具有序列Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N，其中Xaa1是G、R 或K，Xaa2是T或S，Xaa3是S或G且Xaa4是N或H，(SEQ ID NO:438)；所述vlCDR2具有序列Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3,其中Xaa1是G或D，Xaa2是K或N,且Xaa3是P或S(SEQ ID NO:439)；且所述vlCDR3具有序列Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V,其中Xaa1是 A或L且Xaa2是L或H(SEQ ID NO:440)。所述异二聚体抗体进一步包含第二单体，所述第二单体包含第二重链序列，所述第二重链序列包含相比于人Fc结构域的第二变体Fc结构域；和抗CD19抗原结合结构域，所述抗CD19抗原结合结构域包含可变重链结构域和可变轻链，如图21中所绘的，所述可变重链结构域包含H1.227的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)，所述可变轻链选自由下列各项组成的组： L1.198的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)和1.199的氨基酸序列(SEQ ID NO:X)。
在其他的方面，本发明提供了异二聚体抗体，其包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含重链，所述重链包含第一变体Fc结构域；和结合第一抗原的单链Fv区(scFv)，其中所述scFv包含带电荷的 scFv接头；所述第二单体包含第一重链，所述第一重链包含第二变体 Fc结构域和第一可变重链，且所述第二单体还包含第一轻链，其中所述第一和第二变体Fc结构域包含选自由图7中所绘的那些组成的组的氨基酸置换(一个或多个)。
在进一步的方面，本发明提供了异二聚体抗体组合物，其包含第一单体，所述第一单体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含抗-CD3可变区，所述抗-CD3可变区具有包含vhCDR1、 vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的序列，所述 vhCDR1具有序列T-Y-A-M-Xaa1,其中Xaa1是N、S或H(SEQ ID NO:435)；所述vhCDR2具有序列 R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G，其中 Xaa1是Y或A，Xaa2是N或S，Xaa3是Y或A且Xaa4是D或A (SEQ ID NO:436)；所述vhCDR3具有序列 H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y,其中Xaa1是N、D或Q且 Xaa2是A或D(SEQ ID NO:437)，所述vlCDR1具有序列Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N，其中Xaa1是G、R 或K，Xaa2是T或S，Xaa3是S或G且Xaa4是N或H，(SEQ ID NO:438)；所述vlCDR2具有序列Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3,其中Xaa1是G或D，Xaa2是K或N,且Xaa3是P或S(SEQ ID NO:439)；且所述vlCDR3具有序列Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V,其中Xaa1是 A或L且Xaa2是L或H(SEQ ID NO:440)。所述第一单体还包含第一重链序列，所述第一重链序列包含相比于人Fc结构域的第一变体 Fc结构域。所述异二聚体抗体还包含第二单体，所述第二单体包含第二抗原结合结构域；和第二重链序列，所述第二重链序列包含相比于人Fc结构域的第二变体Fc结构域，并且其中所述第一和第二变体Fc 结构域具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗-CD3可变区包含vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，所述vhCDR1具有序列T-Y-A-M-Xaa1,其中Xaa1是N、S或H(SEQ ID NO:435)；所述vhCDR2具有序列 R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G，其中 Xaa1是Y或A，Xaa2是N或S，Xaa3是Y或A且Xaa4是D或A (SEQ IDNO:436)；所述vhCDR3具有序列 H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y,其中Xaa1是N、D或Q且 Xaa2是A或D(SEQ ID NO:437)，所述vlCDR1具有序列 Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N，其中Xaa1是G、R 或K，Xaa2是T或S，Xaa3是S或G且Xaa4是N或H，(SEQ ID NO:438)；所述vlCDR2具有序列Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3,其中 Xaa1是G或D，Xaa2是K或N,且Xaa3是P或S(SEQ ID NO:439)；且所述vlCDR3具有序列Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V,其中Xaa1是 A或L且Xaa2是L或H(SEQ ID NO:440)。
在进一步的方面，本发明提供了异二聚体蛋白，其包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含第一变体重链恒定区和第一融合伴侣；所述第二单体包含第二变体重链恒定区和第二融合伴侣，其中所述第一和第二恒定区的Fc区包含来自图3和12的一组氨基酸置换。在一些情况下，第一单体包含第三融合伴侣并且任选地第二单体包含第四融合伴侣。所述融合伴侣独立地选自由下列各项组成的组：免疫球蛋白成分、肽、细胞因子、趋化因子、免疫受体和血液因子。在一些情况下，免疫球蛋白成分选自由下列各项组成的组：Fab、VH、VL、scFv、 scFv2、dAb。
在许多方面，第一和第二变体Fc结构域中的一个包含选自由图6、 7和/或12中所绘的那些组成的组的氨基酸置换(一个或多个)。在一些方面，第一抗原结合结构域是与第一重链恒定结构域共价连接的 scFv。在其他的方面，异二聚体抗体具有选自图1B-1L和2A-2M的结构的结构。在进一步的方面，异二聚体抗体的第一和/或第二Fc结构域进一步包含选自由下列各项组成的组的氨基酸置换(一个或多个)：434A,434S,428L,308F,259I,428L/434S,259I/308F,436I/428L, 436I或V/434S,436V/428L,252Y,252Y/254T/256E,259I/308F/428L, 236A,239D,239E,332E,332D,239D/332E,267D,267E,328F, 267E/328F,236A/332E,239D/332E/330Y,239D,332E/330L,236R, 328R,236R/328R,236N/267E,243L,298A和299T。在一些方面，第一和第二变体Fc结构域中的一个包含氨基酸置换364K/E357Q，且另一个包含氨基酸置换368D/370S。这些抗体可以进一步包含选自由图7 中所列举的那些组成的组的氨基酸置换(一个或多个)。
在其他的方面，本发明提供了将产生本发明的异二聚体蛋白和抗体的核酸、表达载体和宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了制备本发明的异二聚体蛋白的方法，所述方法通过在产生所述异二聚体的条件下培养包含编码本发明的异二聚体蛋白和抗体的核酸的宿主细胞并回收所述异二聚体来实现。
在进一步的方面，本发明提供了制备本发明的异二聚体抗体的方法，所述方法包括：提供编码第一重链的第一核酸，所述第一重链包含：第一Fc结构域；和结合第一抗原的单链Fv区(scFv)；其中所述 scFv包含带电荷的接头；以及提供编码第二重链的第二核酸，所述第二核重链包含：第二Fc结构域；第一可变重链；以及提供包含轻链的第三核酸。所述方法另外包括在宿主细胞中表达第一、第二和第三核酸以分别产生第一、第二和第三氨基酸序列；将第一、第二和第三氨基酸序列加样到离子交换柱上；以及收集异二聚体级分。
在其他的方面，本发明提供了治疗需要所述治疗的个体的方法，所述方法通过施用本文的异二聚体抗体或蛋白来实现。
附图简述
异二聚体化形式和变体
图1A-1M描绘了许多异二聚体蛋白形式，包括异二聚体Fc融合蛋白以及异二聚体抗体。图1A显示了具有4个可能的融合伴侣A,B, C和D的二聚体Fc区的基本概念。A,B,C和D任选地和独立地选自免疫球蛋白结构域(例如Fab,vH,vL,scFv,scFv2,scFab,dAb,等),肽,细胞因子(例如IL-2,IL-10,IL-12,GCSF,GM-CSF,等),趋化因子 (例如RANTES,CXCL9,CXCL10,CXCL12,等),激素(例如FSH,生长激素),免疫受体(例如CTLA-4,TNFR1,TNFRII,其他TNFSF,其他TNFRSF,等)和血液因子(例如因子VII,因子VIII,因子IX,等)。如本文所概述的，填充以实心白色或实心黑色的结构域利用异二聚体化变体进行工程化。图1B描绘了“F三联体”形式(有时也称为“开瓶器”构型，如下面所讨论的)。图1C显示了具有连接至Fab单体的另一个 scFv的“F三联体”构型(这一个，连同图1F，也具有较大的分子量差)。图1D描绘了具有连接到scFv单体的另一个scFv的“F三联体”。图 1E描绘了“三个scFv”形式。图1F描绘了连接到Fab单体的额外的 Fab。图1G描绘了勾住scFv单体中的一个的Fab。图1H-1L显示了“F三联体”形式的其他多种“较高多特异性”实施方案，所有这些实施方案具有一个包含scFv的单体(并且所有这些都具有可以被开发用于纯化异二聚体的分子量差)。图1H显示了“Fab-Fv”形式，其结合到两种不同的抗原，图1I描绘了“Fab-Fv”形式，其结合到单个抗原(例如，与抗原1的双价结合)。图1J和1K描绘了“Fv-Fab”形式，其具有类似的额外的双价或单价抗原结合。图1L描绘了一个单体，其具有连接到第二scFv的CH1-CL。图1M描绘了双scFv形式。在一些实施方案中，F三联体形式不是优选的。
图2A-2U描绘了大量的多特异性(例如异二聚体化)形式和可以在本发明中使用的不同类型的异二聚体化变体的组合(这些有时在本文中称作“异二聚体骨架”)。另外注意所有这些形式可以包括Fc区中的附加变体，如下面更充分讨论的那样，包括“消除”或“敲除”变体(图 7)，为改变FcγR(FcγRIIb,FcγRIIIa,等)结合的Fc变体，为改变与 FcRn受体的结合的Fc变体，等。图2A显示了双scFv-Fc形式，对于本文的所有异二聚体化形式，其可以包括异二聚体化变体诸如pI 变体、孔中旋钮(KIH,在本文中也称为位阻变体或“偏斜”变体),电荷对(位阻变体的亚组变体)，等排变体，和SEED体(“链交换工程化结构域”；参见Klein等人,mAbs 4:6 653-663(2012)和Davis等人, Protein Eng Des Sel 2010 23:195-202)，这依赖于下面的事实：人IgG 和IgA的CH3结构域不彼此结合。图2B描绘了双特异性IgG，再次具有多种异二聚体化变体的选项。图2C描绘了“单臂”版本的DVD-Ig，其利用两个不同的可变重链和可变轻链结构域。图2D是相似的，不同之处在于不是“空臂”，可变重链和可变轻链在相对的重链上。图2E 通常称为“mAb-Fv”。图2F描绘了多-scFv形式；如本领域技术人员要理解的，类似于本文所讨论的“A,B,C,D”形式，可以存在任意数目的相关scFv(或，就此而言，任何其他结合配体或官能团)。因此，图2F 可以具有1,2,3或4个scFv(例如对于双特异性抗体，scFv可以是“顺式的”或“反式的”，或都在分子的一个“末端”上)。图2G描绘了异二聚体FabFc，其中Fab由两个不同的重链形成，一个含有重链Fab 序列，另一个含有轻链Fab序列。图2H描绘了“单臂Fab-Fc”,其中一个重链包含Fab。图2I描绘了“单臂scFv-Fc”,其中一个重链Fc包含scFv，而另一个重链是“空的”。图2J显示了scFv-CH3,其中仅使用重链CH3区，各自具有它们自己的scFv。图2K描绘了mAb-scFv, 其中分子的一端与抗原双价接合，使用一个重链上的scFv单价接合。图2L描绘了相同结构，不同之处在于两个重链包含额外的scFv,其可以结合相同的抗原或不同的抗原。图2M显示了“CrossMab”结构，其中通过在Fab部分切换序列解决了由于两个不同的轻链造成的多路形成的问题。图2N描绘了scFv,图2O是通过如本文所概述的接头连接的“BiTE”或scFv-scFv，图2P描绘了DART,图2Q描绘了TandAb，图2R显示了双抗体。图2S、2T和2U描绘了在本发明中有用的其他的可选的骨架形式。
图3描绘了用于本发明的异二聚体蛋白中的许多合适的异二聚体化变体,包括偏斜/位阻变体,等排变体,pI变体,KIH变体,等。对于本文的所有异二聚体结构，这些异二聚体化变体中的各组可以在任何异二聚体骨架中组合，任选地和独立地以任意的组合。单体1列表的末端处的变体为等排pI变体,其通常不用于对或组中。在这种情况下，一个单体被改造以增加或减小pI而不改变另一个单体。因此，尽管在“单体1”列表中所绘，但这些可以掺入至合适的单体中，保留“链型”。即，尽管在位阻列表中列为“单体1”变体的变体可以与pI列表中的“单体2”变体交叉，但重要的是单体对的“链型”仍然完整。即，任意组可以与任何其他组组合，无论它们相关的“单体”列表如何(如下面更充分地讨论的，在其中pI的改变用来纯化异二聚体蛋白的情况下，也保留“pI链型”；例如，如果存在有碰巧改变电荷的偏斜变体，则它们与正确链上的pI变体配对；导致pI增加的偏斜变体被添加到已经增加了pI变体的单体，等。这类似于带电荷的scFv接头的添加；在该情况下，如本文更充分地描述的那样，带正确电荷的scFv接头被添加到正确的单体以保留pI差。另外，各对氨基酸变体(或在其中存在有被工程化的单个单体的情况下)可以任选地和独立地被任何异二聚体蛋白包括或不包括，以及可以任选地和独立地组合。
图4A,4B和4C描绘了在本发明中特别有用的图3的异二聚体化变体亚组。
图5描绘了图3的异二聚体化变体亚组。
图6描绘了同种型和等排变体抗体恒定区和它们各自的置换的列表。pI_(-)表示较低pI变体，而pI_(+)表示较高pI变体。这些可以任选地和独立地与本发明的其他异二聚体化变体组合。
图7描绘了许多合适的减少与一些或所有FcγR受体的结合的“敲除”(“KO”)变体。由于适用于许多(如果不是全部的话)本文的变体，这些KO变体可以独立地和任选地，均在图35中所述的组范围内，并且与本文概述的任意异二聚体化变体(包括位阻变体和pI变体)组合。例如，E233P/L234V/L235A/G236del可以与来自所述列表的任何其他单个或两个变体组合。另外，尽管在一些实施方案中优选的是两个单体均含有相同的KO变体，但有可能在不同的单体上组合不同的KO 变体，以及仅一个单体包含KO变体。还参照USSN 61/913,870的附图和图例，其全部都特别地通过引用整体地并入，因为它涉及“敲除”或“消除”变体。
图8描绘了许多抗-CD3 scFv改造的二硫化物。
图9描绘了许多带电荷的scFv接头，它们用于增加或减小利用一个或多个scFv作为成分的异二聚体蛋白的pI。具有单一电荷的单个现有技术scFv接头标为“Whitlow”，其来自Whitlow等人，Protein Engineering 6(8):989-995(1993)。应当注意到此接头用于减少scFv的聚集并增强蛋白水解稳定性。
图10A和10B是用于本发明中的潜在异二聚体化变体的附加列表，包括同种型变体。
图11描绘了异二聚体化形式、异二聚体化变体(分成pI变体和位阻变体(其包括电荷对变体))、Fc变体、FcRn变体和组合的可能组合的矩阵。图例A是合适的FcRn变体:434A,434S,428L,308F,259I, 428L/434S,259I/308F,436I/428L,436I或V/434S,436V/428L,252Y, 252Y/254T/256E和259I/308F/428L。即，图1B的F三联体形式可以在任一个单体或两个单体序列上具有这些FcRn变体中的任一个。为了清楚起见，由于各个重链是不同的，因此FcRn变体(以及Fc变体) 可以存在于一个或两个单体上。图例B是合适的Fc变体：236A，239D, 239E,332E,332D,239D/332E,267D,267E,328F,267E/328F, 236A/332E,239D/332E/330Y,239D,332E/330L,236R,328R, 236R/328R,236N/267E,243L,298A和299T。(注意，其他合适的Fc 变体参见US 2006/0024298的图41，该申请的该图和图例整体地通过引用合并于此)。在如本文所述的一些情况下，使用“敲除”或“消除”变体，诸如图7中所绘，并且它们包括在Fc变体的定义中。对于FcRn 变体，Fc变体可以存在于任一股链上。图例C是合适的pI变体，并且为了简明，这些从图3和12中输入，再次要理解的是对pI变体存在“链型”。图例D是合适的位阻变体(包括电荷对变体)；再次地，为了简明，从图3和12中输入，再次要理解的是对位阻变体存在“链型”。图例E反映了下面的可能组合，再次地，来自合适的来源图例的每个变体独立地和任选地组合在一起：1)pI变体加FcRn变体；2)pI变体加Fc变体；3)pI变体加FcRn变体加Fc变体；4)位阻变体加FcRn 变体；5)位阻变体加Fc变体；6)位阻变体加FcRn变体加Fc变体；7)pI变体加位阻变体加FcRn变体；8)pI变体加位阻变体加Fc变体； 9)pI变体加位阻变体加FcRn变体加Fc变体；和10)pI变体加位阻变体。注意这些组合中的任一个或所有组合可以任选地包括或不包括任一个或两个单体中的敲除/消除变体。
图12A-12J描绘了其他的异二聚体化变体对。
本发明的具体序列
图13描绘了在本发明中使用的野生型恒定区以及IgG1/G2融合体的氨基酸序列。
图14A-14YY描绘了优化了稳定性的人源化抗CD3变体scFv的氨基酸序列，可变重链和可变轻链序列。(还要注意第一序列是为了便于纯化的组氨酸标记的版本)。CDR用下划线标出。应当理解的是优化的可变链和优化的轻链(以及scFv链)的增加的稳定性可以归因于构架区以及CDR。因此，应当理解的是整个可变区的公开包括对构架区的公开，尽管它们不单独地编号。另外，scFv接头以灰色显示。每个 scFv接头可以用带电荷的scFv接头替换，如图5中所绘。即，任何带电荷的scFv接头，不管是带正电荷的还是带负电荷的，包括图5 中所绘的那些，可以替换图14A-14YY中的高亮区。
图15A-15I描绘了在本发明中有用的所有CD3 vhCDR1-3和 vlCDR1-3序列的排序规则。共有CDR的序列显示在图的末端。图6 描绘了
图16显示了XENP13790的序列，其是添加了带电荷的接头的 XENP12912(CD3 scFv+二硫化物)。
图17A,17B和17C。图17A描绘了两个不同的F三联体实施方案。图17B和17C显示了图17A的F三联体实施方案的序列。
图18描绘了本发明的优选实施方案的序列。可变区标以下划线，且带电荷的scFv接头为灰色。
图19A和19B。优化了稳定性的人源化抗-CD19变体scFv的Tm 和Tm改变。氨基酸编号规则为Kabat编号系统。图19A为通过DSF(差示扫描荧光法)在0.2mg/ml的浓度下完成的对稳定性的人源化抗 -CD19变体scFv的测定，图19B在0.4mg/ml完成。
图20A-20K。优化了稳定性的人源化抗CD19变体scFv，可变重链和可变轻链序列的氨基酸序列。(还要注意第一序列是为了便于纯化的组氨酸标记的版本)。应当理解的是优化的可变链和优化的轻链 (以及scFv链)的增加的稳定性可以归因于构架区以及CDR。因此，应当理解的是整个可变区的公开包括对构架区的公开，尽管它们不单独地编号。
图21描绘了稳定化的抗-CD19 Fv区。
图22A和22B描绘了双-scFv构建体(例如如图1M中所示)。
图23A和23B描绘了“开瓶器”构建体(例如如图1B中所示)。
图24A–24K显示了本发明的其他序列包括等排异二聚体化变体。
数据资料
图25。稳定化的抗-CD19可变区——与标记的抗-CD19 IgG1@1 μg/mL竞争结合。
图26显示了双scFv-Fc形式、抗-CD3/抗-CD19对与“BiTE”形式 (使用相同的scFv但没有Fc区)的表征和比较。如所示的那样，双 scFv-Fc不如BiTE形式有效，但添加Fc区在小鼠中将半衰期增加了 10倍。
图27描绘了在RTCC测试中scFv部分各自与食蟹猴抗原交叉反应。即，各种形式之间(双scFv-Fc相对于BiTE)的功效差异转化到了食蟹猴中。
图28显示了半衰期差异也转化到食蟹猴中，如两种形式之间那样。如显示的，双scFv-Fc抗体以三个不同的浓度进行试验。
图29描绘了在猴中药代动力学的预测，双scFv-Fc形式的血清浓度大于EC50时的持续时间长于BiTE，2-3周相比于2-3天。
图30显示了利用双scFv-Fc双特异性形式的较大程度的和延长的 B细胞杀伤。此形式的较长PK能够将B细胞缺乏延长至14天。
图31描绘了抗-CD3/抗-CD19 scFv-Fc scFv部分的稳定性改造。通过识别和替换稀有氨基酸，识别并替换具有不常见的接触残基的氨基酸，接头改造并转换至VL-VH方向，实现了稳定性的大幅提高。
图32描绘了对于抗CD19稳定化，由于稳定化在小鼠中引起的 PK提高，导致小鼠中半衰期提高一倍。
图33显示了“F三联体”或“开瓶器”(或在一些附图中称作 Fab-scFv-Fc)的制备和纯化。
图34显示了对抗-CD19/抗-CD3 F三联体形式的表征,其表现出皮摩尔细胞毒性，仅单价结合至靶抗原。
图35显示了用Fab替换双scFv-Fc的一个scFv导致的小鼠中PK 提高。用Fab替换抗-CD19 scFv使BL/6小鼠中的半衰期从3天加倍至6天。
图36描绘了F三联体形式的“即插即用平台”的方案。来自任何现有mAb的Fab可以与抗-CD3 scFv-Fc双特异性形式组合。
图37A和37B描绘了对现有抗体与F三联体形式的组合的“即插即用”组合的表征。图37A显示了抗-CD38 Fab与抗-CD3 scFv成为F 三联体形式，图37B显示了Her2/CD3组合。
图38描绘了使用本发明的变体显著地朝向异二聚体化“偏斜”。与不含Fc变体的相同分子相比，使用具有L368E/K370T的一个单体和具有S364K的另一个单体实现了超过95％的异二聚体化。
图39显示了与BiTE形式相比，使用双scFv形式在食蟹猴淋巴结和脾脏中的B细胞缺乏。
图40.贝伐珠单抗、仅Fc和含有等排pI置换的抗-CD19xCD3异二聚体的列表。指示了每个期望蛋白种类的pI值。
图41.显示含有等排改造的恒定区的贝伐珠单抗的异二聚体种类的纯化的阳离子交换色谱。
图42.显示含有等排改造的恒定区的仅Fc变体的异二聚体种类的纯化的阳离子交换色谱。
图43.显示含有等排改造的恒定区的抗-CD19xCD3双特异性抗体的异二聚体种类的纯化的阳离子交换色谱。还显示了蛋白A纯化的物质以及分离的异二聚体双特异性抗体的IEF凝胶。
图44.贝伐珠单抗和含有等排pI置换的仅Fc变体的列表以及由 DSF获得的Tm值。
图45.含有带正电荷的接头和带负电荷的接头的抗-CD3和抗 -CD19 scFvs的列表。还显示了DSF Tm值。
图46.来自纯化的具有带有正电荷的接头的scFvs的实例SEC色谱图。
图47.含有带正电荷的接头的抗-CD3 scFv与CD4+T细胞(左) 或来自PBMCs的CD20+细胞(以检查非特异性结合；右)的直接结合。
图48.含有带正电荷的接头的抗-CD3 scFv与来自PBMCs的 CD20+细胞(左)或293E细胞(右)的直接结合。
图49.XENP13124的实例阳离子交换纯化，XENP13124是靶向 CD19和CD3的Fab-scFv-Fc形式双特异性抗体。抗-CD3 scFv含有带正电荷的接头(GKPGS)4从而能够实现纯化。
图50.在不同浓度下孵育的纯化的靶向CD19和CD3的 Fab-scFv-Fc形式双特异性抗体的实例SEC色谱图。XENP13121(左) 含有标准的(GGGGS)4接头而XENP13124(右)含有(GKPGS)4带电荷的接头。带电荷的接头具有出人意料的减少存在的高分子聚集体的量的特性。
图51.利用PBMC和含有不同的scFv接头的Fab-scFv-Fc形式双特异性抗-CD19xCD3抗体的RTCC测定。接头对RTCC活性的影响很小，除了带高电荷的接头(GKGKS)3以外，其具有较低的活性。
图52A-52O显示了包含带电荷的scFv接头的本发明的序列以及相应的对照。
多方面的其他材料
图53.20种氨基酸的文献pI。应当注意所列举的pI作为游离氨基酸计算；在蛋白的情况下任意侧链的实际pI是不同的，并且因此为了本发明的目的此列表用来显示pI趋势且不是绝对的数字。
图54A、54B和54C.由IgG1-4的同种型置换形成的所有可能的 pI减小的变体的列表。显示了三种期望的种类的pI值以及异二聚体和当可变重链用IgG1-WT重链转染时存在的两个均二聚体种类之间的平均ΔpI。
图55.由IgG1-4的同种型置换形成的所有可能的pI增加的变体的列表。显示了三种期望的种类的pI值以及异二聚体和当可变重链用IgG1-WT重链转染时存在的两个均二聚体种类之间的平均ΔpI。
图56显示了CK和Cλ轻链恒定区的氨基酸序列。对较高的pI(K, R和H)或较低的pI(D和E)有贡献的残基用粗体高亮标出。对于降低 pI的修饰的优选位置以灰色显示。对于含有一个或多个轻链的骨架，这些变化可以用来改变一个单体或两个单体的pI，并且可以独立地和任选地与所有重链变体组合。
图57A-57E描绘了许多二硫化物构建体的序列；第一个序列是包含便于纯化的His(6)标记的scFv构建体，第二个序列是没有标记的 scFv构建体，第三个序列是单独可变重链，第四个序列是单独可变轻链序列。CDR用下划线标出。
发明详述
WO/2013/055809的图66-80、序列和附带的图例具体地通过引用并入本文。来自USSN 13/648,951的图2-111和它们的图例具体地通过引用并入本文。
I.对异二聚体化蛋白的综述
本发明涉及提供异二聚体蛋白的新型构建体，所述异二聚体蛋白允许结合于多于一个的抗原或配体，例如，以允许多特异性结合。所述异二聚体蛋白构建体基于抗体的重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。通过改变每个单体的氨基酸序列制备异二聚体蛋白，如下面更充分讨论的。因此，本发明总体上涉及形成异二聚体蛋白(包括抗体)，其可以以数种方式共同接合抗原，依赖于恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体在各个链上不同以促进异二聚体形成和/或允许相对于均二聚体更容易的纯化异二聚体。如下面更充分讨论的，异二聚体蛋白可以是抗体变体或基于Fc融合蛋白。通常，异二聚体抗体是讨论的焦点，但如本领域技术人员要理解和下面更充分地描述的那样，所述讨论同样地适用于异二聚体蛋白。
因此，本发明提供了双特异性抗体(或，如下所讨论的，也可以制备三特异性或四特异性抗体)。抗体技术中一直存在的问题是需要与两种(或更多种)不同抗原同时结合的“双特异性”(和/或多特异性)抗体，通常因此允许不同的抗原接近并且产生新的功能性和新的疗法。通常，通过将每个重链和轻链的基因包含进宿主细胞中来制备这些抗体。这通常导致所需的异二聚体(A-B)、以及两个均二聚体(A-A和B-B)的形成。然而，形成多特异性抗体的主要障碍是难以从均二聚体抗体中纯化异二聚体抗体和/或在均二聚体的形成中偏向于形成异二聚体。
有许多机制可以用来生成本发明的异二聚体。另外，如本领域技术人员要理解的，这些机制可以组合起来以确保高度异二聚体化。因此，导致产生异二聚体的氨基酸变体被称作“异二聚体化变体”。如下面所讨论，异二聚体化变体可以包括位阻变体(例如下面所述的“旋钮和孔”或“偏斜”变体以及下面所述的“电荷对”变体)以及“pI变体”, 其允许将均二聚体与异二聚体纯化分开。
一种机制通常在本领域中被称为“旋钮和孔”(“KIH”),或在本文中有时称为“偏斜”变体，是指形成位阻影响以有利于异二聚体的氨基酸工程且也可以任选地使用不利于均二聚体形成的氨基酸工程；这有时被称为“旋钮和孔”,如在USSN 61/596,846和USSN 12/875,0015, Ridgway等人,Protein Engineering 9(7):617(1996)；Atwell等人,J.Mol.Biol.1997 270:26；US专利号8,216,805，US 2012/0149876中所述，所有文献均整体地通过引用并入本文。附图标识了许多“单体A–单体B”对，这些对包括“旋钮和孔”氨基酸置换。另外，如Merchant等人,Nature Biotech.16:677(1998)中所述，这些“旋钮和孔”突变可以与二硫键组合以使形成向异二聚体化偏斜。
在异二聚体的生成中有用的一个其他机制有时称为“静电转向(electrostaticsteering)”或“电荷对”，如在Gunasekaran等人,J.Biol. Chem.285(25):19637(2010)中所述，该文整体地通过引用并入本文。这有时在本文中称为“电荷对”。在此实施方案中，使用静电使形成向异二聚体化偏斜。如本领域技术人员将理解的是，这些也可以对pI 并且因此对纯化具有作用，并且因此在一些情况下也可以被认为是pI 变体。然而，由于这些被生成用于强制异二聚体化并且不被用作纯化工具，因此它们被归类为“位阻变体”。这些包括，但不限于， D221E/P228E/L368E与D221R/P228R/K409R配对(例如，这些是“单体对应组)以及C220E/P228E/368E与C220R/E224R/P228R/K409R配对以及附图中显示的其他变体。
在本发明中，在一些实施方案中，pI变体用来改变一个单体或两个单体的pI并且因此允许等电纯化A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。
在本发明中，存在几种基本机制可以导致容易地纯化异二聚体蛋白；一个依赖于使用pI变体，使得每个单体具有不同的pI，由此允许A-A、A-B和B-B二聚体蛋白的等电位纯化。可选地，一些骨架形式，诸如“F三联体”形式，也允许基于尺寸的分离。如下面进一步概述的，也能够使异二聚体的形成偏斜超过均二聚体。因此，位阻异二聚体化变体和pI或电荷对变体的组合特别地适用于本发明中。另外，如下面更充分地概述的那样，利用scFv的骨架诸如F三联体形式可以包括带电荷的scFv接头(带正电的或带负电的)，其提供进一步的pI升高用于纯化目的。如本领域技术人员要理解的是，一些F三联体形式正是具有带电荷的scFv接头且不需要额外的pI调整而是有用的，尽管本发明也确实提供了使用具有带电荷的scFv接头的偏斜变体(以及Fc,FcRn和KO变体的组合)。
在利用pI作为分离机制以允许纯化异二聚体蛋白的本发明中，可以将氨基酸变体引入至一个或两个单体多肽中；即，一个单体(在本文中为了简单称为“单体A”)的pI可以被改造远远不同于单体B，或单体A和B均可以被改变，单体A的pI增加而单体B的pI减小。如下面更充分地详述的那样，任一单体或两个单体的pI变化可以通过如下方式来完成：去除或添加带电荷的残基(例如，天然氨基酸被带正电荷的或带负电荷的氨基酸残基替换，例如，甘氨酸替换成谷氨酸)，将带电荷的残基从带正电荷或带负电荷改变为相反的电荷(天冬氨酸至赖氨酸)或将带电荷的残基改变为中性残基(例如，丢失电荷；赖氨酸至丝氨酸)。许多这样的变体显示在附图中。
因此，在本发明的此实施方案中提供了在至少一个单体中形成足够的pI变化使得可以将异二聚体与均二聚体分离。如本领域技术人员要理解的是，并且如下面进一步所讨论的那样，这可以通过以下方式来完成：使用“野生型”重链恒定区和可变区，所述可变区已经被改造成增加或减小其pI(wt A-+B或wt A--B),或增加一个区并减少另一个区(A+-B-或A-B+)。
因此，通常，本发明的一些实施方案的组分是抗体的恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及改变二聚体蛋白的单体中的至少一个(如果不是两个的话)的等电点(pI)从而通过将氨基酸置换(“pI变体”或“pI置换”)加入至单体中的一个或两个中来形成“pI异二聚体”(当蛋白是抗体时，这些被称为“pI抗体”)。如本文所示，如果两个单体的 pI相差少至0.1个pH单位，可以实现将异二聚体与两个均二聚体分离，在本发明中两个单体的pI相差0.2、0.3、0.4和0.5以上均可使用。
如本领域技术人员要理解的是，要包括在每个或两个单体上以获得良好的分离的pI变体的数目将部分取决于目的scFv和Fab的起始 pI。即，为了确定那个单体要改造或其中的“方向”(例如，正电性更大或负电性更大)，计算两个靶抗原的Fv序列，并由其作出决定。如本领域中已知的，不同的Fv将具有不同的起始pI，本发明中利用所述不同的起始pI。通常，如本文所概述，改造pI从而使每个单体的总 pI差为至少约0.1logs,如本文所概述的优选0.2-0.5。
此外，如本领域技术人员要理解和本文所概述的，可以基于尺寸将异二聚体与均二聚体分离。例如，如图1和2中所示，具有两个scFv 的异二聚体可以通过“F三联体”形式和双特异性mAb的那些分离。这可以进一步以较高的价使用额外的抗原结合位点进行利用。例如，如另外所示，一个单体将具有两个Fab片段，另一个单体将具有一个scFv, 产生了尺寸的差异并且因此产生了分子量的差异。
另外，如本领域技术人员要理解和本文所概述的，本文概述的形式可以进行扩展从而也提供三特异性和四特异性抗体。在此实施方案中，其一些变化形式描绘在图1A中，要认识到有可能一些抗原二价结合(例如，两个抗原结合位点与单个抗原结合；例如，A和B可以是典型的双价缔合的一部分，且C和D可以任选地存在且任选地相同或不同)。要理解，可以利用Fab和scFv的任意组合来获得所需的结果和组合。
在其中使用pI变体来实现异二聚体化的情况下，通过使用重链的恒定区，提供了设计和纯化多特异性蛋白，包括抗体的更为模块化的方式。因此，在一些实施方案中，异二聚体化变体(包括偏斜和纯化异二聚体化变体)不包括在可变区中，使得必须改造每个单个抗体。另外，在一些实施方案中，通过从不同的IgG同型中输入pI变体使得pI发生改变而不会引入显著的免疫原性而显著减少由pI变体引起的免疫原性的可能性。因此，要解决的另外的问题是阐明具有高人序列含量的低pI恒定结构域，例如，最小化或避免在任何特定位置处的非人残基。
可以发生这种pI改造的附带益处也是延长了血清半衰期和增加的FcRn结合。即，如USSN 13/194,904(整体地通过引用并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合体中见到的那些)的pI可以导致体内较长的血清滞留。用于增加血清半衰期的这些pI变体也有助于用于纯化的pI改变。
另外，应当注意异二聚体化变体的pI变体对双特异性抗体的分析学和质量控制过程提供了附加的益处，特别是在CD3抗体的情况下，消除、最小化和区分何时存在均二聚体的能力是显著的。类似地，可靠地检测异二聚体蛋白产生的可重复性的能力是重要的。
除了所有或部分的变体重链恒定结构域，一个或两个单体可以含有一个或两个融合伴侣，使得异二聚体形成多价蛋白。如在附图中大体描绘的，且具体是图1A，融合伴侣被描绘为A、B、C和D，包括所有可能的组合。通常，选择A、B、C和D使得异二聚体在其与另外的蛋白相互作用的能力方面至少是双特异性的或双价的。
如本领域技术人员要理解和下面更充分地讨论的那样，本发明的异二聚体融合蛋白可以采取大量的构型，如图1和2中大体所描绘的。一些图描绘了“单端”构型，其中在分子的一个“臂”上具有一种类型的特异性，在另一个“臂”上具有不同的特异性。其他图描绘了“双端”构型，其中在分子的“顶部”具有至少一种类型的特异性，在分子的“底部”具有一个或多个不同的特异性。此外，如所示的那样，这两种构型可以组合，其中基于特定的组合可以存在三种或四种特异性。因此，本发明提供了“多特异性”结合蛋白，包括多特异性抗体。因此，本发明涉及新的免疫球蛋白组合物，其共接合至少第一和第二抗原。本发明的第一和第二抗原在本文中分别称为抗原-1和抗原-2。
在本发明中具有特殊用途的一个异二聚体骨架是“F三联体”或“开瓶器”骨架形式。在此实施方案中，抗体的一条重链包含单链Fv (“scFv”,如下面所定义)，且另一条重链是“规则的”FAb形式，其包含可变的重链和轻链。这种结构有时在本文中被称为“F三联体”形式 (scFv-FAb-Fc)或“开瓶器(bottle-opener)”形式，因为粗略的图像类似于开瓶器(参见图1B)。两条链通过使用恒定区(例如，Fc结构域和/或铰链区)中的氨基酸变体连在一起，如下面更充分地描述的那样所述氨基酸变体促进异二聚体抗体的形成。
本发明的“F三联体”形式存在几个明显的优势。如本领域中已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物经常具有稳定性和聚集问题，这些问题可以在本发明中通过添加“规则的”重链和轻链配对而减轻。另外，与依赖于两条重链和两条轻链的形式相反，不存在重链和轻链不正确配对的问题(例如，重链1与轻链2配对，等等)。
除了所有或部分的变体重链恒定结构域，一个或两个单体可以含有一个或两个融合伴侣，使得异二聚体形成多价蛋白。如在USSN 13/648,951的图64(其附带的图例通过引用并入本文)中大体描绘的那样，融合伴侣被描绘为A、B、C和D，包括所有可能的组合。通常，选择A,B,C和D使得异二聚体在其与另外的蛋白相互作用的能力方面至少是双特异性的或双价的。在本发明的“F三联体”形式的情况下，通常A和B是scFv和Fv(要理解，任一单体可以含有scFv，且另一个可以含有Fv/Fab)，和接着任选地一个或两个另外的融合伴侣。
此外，如本文所概述的那样，可以将另外的氨基酸变体引入至本发明的双特异性抗体中，以增加额外的功能性。例如，可以加入Fc 区内的氨基酸改变(加到一个或两个单体上)以促进增加的ADCC或 CDC(例如，改变的与Fcγ受体的结合)；允许添加毒素和药物(例如，用于ADC)或增加添加毒素和药物的收率,以及增加与FcRn的结合和 /或增加所得分子的血清半衰期。如本文进一步所述且如本领域技术人员要理解的是，本文概述的任一和所有变体可以任选地和独立地与其他变体组合。
类似地，另一类功能性变体是“Fcγ消除变体”或“Fc敲除(FcKO 或KO)变体。在这些实施方案中，对于一些治疗性应用，合乎需要的是减少或去除Fc结构域与一个或多个或所有Fcγ受体(例如，FcγR1、 FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa,等)的正常结合以避免其他的作用机制。即，例如，在许多实施方案中，特别是在单价结合CD3且另一个结合肿瘤抗原(例如，CD19、her2/neu,等)的双特异性抗体的使用中，通常合乎需要的是去除FcγRIIIa结合以消除或显著减少ADCC活性。
定义
为了更完全地理解本申请，下面给出了一些定义。这些定义意在包括语法上的等效形式。
在本文中“消除(ablation)”意指减少或去除活性。因此，例如，“消除FcγR结合”意指Fc区氨基酸变体与不含有特异性变体的Fc区相比具有小于50％的起始结合，优选活性丧失小于70-80-90-95-98％，并且通常，在Biacore测定中活性在可检测结合水平以下。在消除FcγR 结合中特别有用的是在图7中所示的那些。
“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”当在本文中使用时意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞的裂解。ADCC和与FcγRIIIa 的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性的增加。
“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用当在本文中使用时意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后导致对靶细胞的吞噬作用。
“修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸置换、插入、和/或缺失或对与蛋白化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是改变的与蛋白附接的糖或PEG结构。“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸置换、插入、和/或缺失。为了清楚起见，除非另外注明，则氨基酸修饰总是被DNA编码的氨基酸，例如，在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
“氨基酸置换”或“置换”在本文中意指用不同的氨基酸替代亲代多肽序列中特定位置处的氨基酸。具体地，在一些实施方案中，置换为不是该特定位置处天然存在的氨基酸，也不是该生物体或任何生物体内天然存在的氨基酸。例如，置换E272Y是指一种变体多肽，在此情况下是一种Fc变体，其中位置272处的谷氨酸被酪氨酸替代。为了清楚起见，已经被改造改变了核酸编码序列但没有改变起始氨基酸的蛋白(例如，将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)不是“氨基酸置换”；即，尽管形成了编码相同蛋白的新基因，但如果该蛋白在其开始的特定位置处具有相同的氨基酸，则其不是氨基酸置换。
“氨基酸插入”或“插入”当在本文中使用时意指在亲代多肽序列中的特定位置处加入氨基酸序列。例如，-233E或233E是指谷氨酸插入在位置233后和234前。另外，-233ADE或A233ADE是指将AlaAspGlu 插入到位置233后和位置234前。
“氨基酸缺失”或“缺失”当在本文中使用时意指在亲代多肽序列中的特定位置处去除氨基酸序列。例如，E233-或E233#或E233()是指位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#是指在位置 233处的序列GluAspAla的缺失。
“变体蛋白”或“蛋白变体”、或“变体”当在本文中使用时意指与亲代蛋白的差异在于至少一个氨基酸修饰的蛋白。蛋白变体可以指蛋白本身，包含该蛋白的组合物，或编码其的氨基酸序列。优选地，与亲代蛋白相比，蛋白变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲代相比，约1-约70个氨基酸修饰，并且优选地约1-约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲代多肽，例如Fc亲代多肽，是人野生型序列，诸如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，尽管具有变体的人序列也可以充当“亲代多肽”，例如图13的IgG1/2杂交体。在本文中蛋白变体序列将优选地与亲代蛋白序列具有至少约80％的同一性，最优选至少约90％同一性，更优选至少约95-98-99％同一性。变体蛋白可以指变体蛋白本身，包含蛋白变体的组合物，或编码其的 DNA序列。因此，“抗体变体”或“变体抗体”当在本文中使用时意指与亲代抗体的差异在于至少一个氨基酸修饰的抗体，“IgG变体”或“变体IgG”当在本文中使用时意指与亲代IgG(再次，在许多情况下，来自人IgG序列)的差异在于至少一个氨基酸修饰的抗体，以及“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”当在本文中使用时意指与亲代免疫球蛋白序列的差异在于至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白序列。“Fc变体”或“变体Fc”当在本文中使用时意指包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白。本发明的Fc变体根据构成它们的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲代Fc多肽具有在位置434处的置换丝氨酸的Fc变体，其中编号规则依照EU索引。同样， M428L/N434S定义了相对于亲代Fc多肽具有置换M428L和N434S 的Fc变体。WT氨基酸的同一性可以不指定，在这种情况下上面提到的变体被称为428L/434S。注意提供置换的次序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体，等等。对于本发明中讨论的与抗体相关的所有位置，除非另外注明，否则氨基酸位置编号规则均依照EU索引。EU索引或如在Kabat或EU编号方案中的EU索引是指对EU抗体的编号规则(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85,其通过引用整体地并入本文)。修饰可以是添加、缺失或置换。置换可以包括天然存在的氨基酸，并且，在一些情况下，包括合成的氨基酸。实例包括美国专利号6,586,207；WO 98/48032；WO03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002), ChemBioChem 11:1135-1137；J.W.Chin,等人,(2002),PICAS United States ofAmerica 99:11020-11024；和L.Wang,&P.G.Schultz, (2002),Chem.1-10,所有都通过引用整体地并入。
当在本文中使用时，“蛋白”在本文中意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。肽基可以包括天然存在的氨基酸和肽键，或合成的拟肽结构，即，“类似物”，诸如类肽(参见Simon 等人,PNAS USA 89(20):9367(1992),通过引用整体地并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，不是由DNA编码的氨基酸)；如本领域技术人员所理解的那样。例如，同型-苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是用于本发明的目的的合成氨基酸，并且可以利用 D-和L-(R或S)两种构象的氨基酸。本发明的变体可以包括这样的修饰，其包含使用利用，例如，由Schultz及同事开发的技术掺入的合成氨基酸，所述技术包括但不限于由Cropp&Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30,Anderson等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71,Zhang等人,2003,303(5656):371-3，和Chin等人, 2003,Science 301(5635):964-7所述的方法，所有这些文献均通过引用整体地并入。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生作用，糖基化，PEG化，环状排列，环化，与其他分子的接头，与蛋白或蛋白结构域的融合，以及添加肽标记或标签。
“残基”当在本文中使用时意指蛋白中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，天冬酰胺297(也称作Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
“Fab”或“Fab区”当在本文中使用时意指包含VH、CH1、VL和 CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指孤立的此区，或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的情况下的此区。“Fv”或“Fv片段”或“Fv 区”当在本文中使用时意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。
“IgG亚类修饰”或“同型修饰”当在本文中使用时意指将一个IgG 同型的一个氨基酸转变成不同的、比对的IgG同型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2 包含苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y置换被认为是IgG亚类修饰。
“非天然存在的修饰”当在本文中使用时意指为非同型的氨基酸修饰。例如，因为没有一个IgG包含位置434处的丝氨酸，因此IgG1, IgG2,IgG3,或IgG4(或其杂交体)中的置换434S被认为是非天然存在的修饰。
“氨基酸”和“氨基酸身份”当在本文中使用时意指被DNA和RNA 编码的20个天然存在的氨基酸中的一个。
“效应器功能”当在本文中使用时意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应器功能包括但不限于ADCC、 ADCP和CDC。
“IgG Fc配体”当在本文中使用时意指来自任何生物体的分子，优选多肽，其与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγRIs,FcγRIIs,FcγRIIIs,FcRn,C1q,C3,甘露糖结合凝集素,甘露糖受体,葡萄球菌蛋白A,链球菌蛋白G，和病毒 FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH),其是与FcγR同源的Fc 受体家族(Davis等人,2002,Immunological Reviews 190:123-136,通过引用整体地并入)。Fc配体可以包括未发现的结合Fc的分子。特殊的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。“Fc配体”当在本文中使用时意指来自任意生物体的分子，优选多肽，其与抗体的Fc区结合异以形成 Fc/Fc配体复合物。
“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcqammaR”当在本文中使用时意指结合 IgG抗体Fc区并且被FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，此家族包括但不限于FcγRI(CD64),包括同种型FcγRIa、FcγRIb和 FcγRIc；FcγRII(CD32),包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和 R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及 FcγRIII(CD16),包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158) 和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis 等人,2002,Immunol Lett 82:57-65,通过引用整体地并入),以及任何未发现的人FcγRs或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγRs包括但不限于FcγRI(CD64),FcγRII(CD32),FcγRIII(CD16),和FcγRIII-2 (CD16-2),以及任何未发现的小鼠FcγRs或FcγR同种型或同种异型。
“FcRn”或“新生Fc受体”当在本文中使用时意指结合IgG抗体 Fc区并且至少部分地被FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中已知的，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，经常称作重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白且重链被FcRn基因编码。除非在本文中另外注明，否则FcRn 或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。多种用来增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下增加血清半衰期的FcRn变体在图83的附图图例中显示。
“亲代多肽”当在本文中使用时意指随后被修饰以生成变体的起始多肽。亲代多肽可以是天然存在的多肽，或变体或天然存在的多肽的改造形式。亲代多肽可以指多肽本身，包含该亲代多肽的组合物，或编码其的氨基酸序列。因此，“亲代免疫球蛋白”当在本文中使用时意指被修饰以生成变体的未修饰的免疫球蛋白多肽，且“亲代抗体”当在本文中使用时意指被修饰以生成变体抗体的未修饰的抗体。应当注意“亲代抗体”包括如下面所概述的已知的市售、重组产生的抗体。
“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”在本文中意指包含Fc区的蛋白，其通常连接(任选地通过接头部分，如本文中所述)到不同的蛋白，诸如与靶蛋白的结合部分，如本文中所述。在一些情况下，异二聚体蛋白的一个单体包含抗体重链(包含scFv或进一步包含轻链)且另一个单体是Fc融合物，包含变体Fc结构域和配体。在一些实施方案中，这些“半抗体-半融合蛋白”被称作“融合体(fusionbodies)”。
“位置”当在本文中使用时意指蛋白的序列中的定位。位置可以被连续编号，或依照已制定的格式编号，例如用于抗体编号的EU索引。
“靶抗原”当在本文中使用时意指被给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白、糖类、脂质或其他化学化合物。下面描述了大量数目的合适的靶抗原。
“链型(strandedness)”在本文中本发明的异二聚体蛋白的单体的情况下意指：类似于“匹配”的DNA的两股链(strand)，异二聚体化变体被合并到每个单体中以便保留“匹配”的能力以形成异二聚体。例如，如果一些pI变体被改造成单体A(例如，使pI更高)，则为可以被利用的“电荷对”以及不干扰pI变体的位阻变体，例如，使pI更高的电荷变体被放到同一股“链”或“单体”上以保留两种功能性。
“靶细胞”当在本文中使用时意指表达靶抗原的细胞。
“可变区”当在本文中使用时意指包含一个或多个Ig结构域的免疫球蛋白区，其基本上分别由构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座位的 V.kappa.、V.lamda.和/或VH基因中的任一个编码。
“野生型或WT”在本文中意指在自然界中见到的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。“分离的”当用来描述本文公开的各种多肽时，意指已经被鉴定并从表达其的细胞或细胞培养物中分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体。
“特异性结合”或“特异性地结合至”特定抗原或表位，或对特定抗原或表位“特异”意指可测量到的不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以，例如，通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，所述对照分子通常是具有类似结构但不具有结合活性的分子。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来测定。
对特定抗原或表位的特异性结合可以表现为，例如，对抗原或表位的KD为至少约10-4M，至少约10-5M，至少约10-6M，至少约 10-7M，至少约10-8M，至少约10-9M，可选地至少约10-10M，至少约10-11M，至少约10-12M或更高的抗体，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，特异性结合抗原的抗体的KD 将相对于抗原或表位的对照分子大20-,50-,100-,500-,1000-,5,000-, 10,000-或更多倍。
此外，对特定抗原或表位的特异性结合可以表现为，例如，对抗原或表位的KA或Ka相对于对照的表位大至少20-,50-,100-,500-, 1000-,5,000-,10,000-或更多倍的抗体，其中KA或Ka是指特定抗体- 抗原相互作用的解离速率。
异二聚体蛋白
本发明涉及生成多特异性、特别是双特异性结合蛋白，并且具体地，多特异性抗体。本发明总体上依赖于使用改造的或变体Fc结构域，以及产生和纯化这样的异二聚体蛋白的方法，所述改造的或变体Fc 结构域可以在生产细胞中自组装以产生异二聚体蛋白。
抗体
本发明涉及多特异性抗体、通常是治疗性抗体的生成。如下面所讨论的，通常使用术语“抗体”。能用于本发明中的抗体可以采取如本文所述的多种形式，包括传统抗体以及下面描述的抗体衍生物、片段和模拟物。通常，术语“抗体”包括包含至少一个恒定结构域的任意多肽，所述恒定结构域包括但不限于CH1、CH2、CH3和CL。
传统的抗体结构单元典型地包括四聚体。每个四聚体典型地由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”(典型地具有约25kDa的分子量)和一个“重链”(典型地具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被归类为κ和λ轻链。本发明涉及IgG类型，其具有数个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此“同种型”当在本文中使用时意指由其恒定区的化学和抗原特性所定义的免疫球蛋白的任一亚类。应当理解治疗性抗体也可以包括同种型和/或亚类的杂交体。例如，如US公开号2009/0163699(通过引用并入)中所示，本发明涵盖了对 IgG1/G2杂交体的pI改造。
每条链的氨基-末端部分包括约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别，在本领域和本文中通常称作“Fv 结构域”或“Fv区”。在可变区中，对重链和轻链的每个V结构域聚集成三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文称作“CDR”),其中氨基酸序列的变化最显著。“可变的”是指下面的事实：可变区的某些区段的序列在抗体之间广泛地变化。可变区内的变异性并不均匀分布。而是，由称为构架区(FR)的相对不变的15-30个氨基酸的伸展序列间隔以称为“超变区”的具有极度变异性的较短区域构成 V区，所述“超变区”的长度各自为9-15个氨基酸或更长。
每个VH和VL由三个超变区(“互补决定区”、“CDR”)和4个FR 构成，它们以下列的顺序从氨基-末端至羧基-末端排列： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
超变区通常包括来自轻链可变区中的大约氨基酸残基24-34 (LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和 95-102(HCDR3)左右的氨基酸残基；Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINSOF IMMUNOLOGICAL INTEREST(免疫学感兴趣的蛋白的序列),第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)和/或轻链可变区中形成超变环的那些残基(例如，残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)； Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述了本发明的具体CDR。
在整个本说明书中，当提到可变结构域中的残基时通常使用 Kabat编号系统(大概地，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)和用于Fc区的EU编号系统(例如，Kabat等人，见上(1991))。
CDR促进抗体的抗原结合位点(或更具体地，表位结合位点)的形成。“表位”是指与已知为抗体决定簇的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是分子诸如氨基酸或糖侧链的集聚并且通常具有特定的结构特性，以及特定的电荷特性。单个抗原可以具有一个以上的表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称表位的免疫显性成分)和其他氨基酸残基，所述其他氨基酸残基不直接参与结合，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，所述氨基酸残基在特异性抗原结合肽的占用空间内。
表位可以是构象的或线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位可以被区分为在变性溶剂的存在下与前者的结合而不是与后者的结合丧失。
表位典型地包括处于独特的空间构象的至少3个氨基酸，且更通常地，至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中进行验证，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力，例如，“竞争(binning)”。
每条链的羧基-末端部分限定恒定区，恒定区主要负责效应器功能。Kabat等人收集了大量的重链和轻链的可变区的一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个的一级序列归类为CDR和框架序列，并且做了其列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(免疫学感兴趣的序列),第5版，NIH publication,No. 91-3242,E.A.Kabat等人,通过引用整体地并入)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，在重链中存在数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有独特的三级结构的免疫球蛋白区域。在本发明中感兴趣的是重链结构域，包括，恒定重链 (CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情况下，IgG同种型各自具有三个CH区域。因此，在IgG的情况下“CH”结构域如下：依照如在Kabat中的EU索引“CH1”是指位置118-220。依照如在Kabat中的EU索引“CH2”是指位置237-340，且依照如在Kabat中的EU索引“CH3”是指位置341-447。如本文所示和下面所述，pI变体可以处于一个或多个CH区，以及铰链区中，下面会讨论。
应当注意本文描绘的序列在CH1区，位置118开始；除了注明以外，不包括可变区。例如，SEQ ID NO:2的第一氨基酸，在序列表中标注为位置“1”，对应于CH1区的位置118，依照EU编号规则。
重链的Ig结构域的另一类型是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处结束，而IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此对于IgG，抗体铰链在本文中被定义为包括位置221(IgG1 中的D221)至236(IgG1中的G236),其中编号规则依照如Kabat中的 EU索引。在一些实施方案中，例如，在Fc区的情况下，包括较低的铰链，“较低的铰链”通常是指位置226或230。如本文所提到的，pI 变体也可以被制备在铰链区中。
轻链通常包括两个结构域，可变轻链结构域(含有轻链CDR以及形成Fv区的可变重链结构域)和恒定轻链区(经常称作CL或Cκ)。
用于其它的置换的感兴趣的另一区域是Fc区，在下面概述。“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”当在本文中使用时意指这样的多肽，其包含抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域，且在一些情况下包含部分铰链。因此Fc是指IgA,IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和至这些结构域的柔性铰链N-末端。对于IgA和IgM,Fc可以包括J 链。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和 Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的较低的铰链区。尽管Fc区的边界可能会变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包括残基C226或 P230至其羧基末端，其中编号规则依照如在Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，如下面更充分地描述的那样，对Fc区做出氨基酸修饰，例如，以改变与一个或多个FcγR受体或与FcRn受体的结合。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了异二聚体抗体，其依赖于使用两个不同的重链可变Fc结构域，所述重链可变Fc结构域将自组装以形成异二聚体抗体。
在一些实施方案中，抗体是全长的。“全长抗体”在本文中意指这样的结构，其构成抗体的天然生物学形式，包括可变区和恒定区，包含一个或多个如本文所概述的修饰，特别是在Fc区中以允许异二聚体化形成或纯化异二聚体与均二聚体分离。全长的异二聚体抗体是具有不同的Fc结构域的两个重链和两个轻链或共同的轻链。
可选地，抗体可以包括如附图中大体显示的多种结构，包括但不限于，抗体片段，单克隆抗体，双特异性抗体，微型抗体(minibodies)，结构域抗体，合成抗体(有时在本文中称作“抗体模拟物”),嵌合抗体，人源化抗体，抗体融合体(有时称作“抗体缀合物”)，以及分别地各自的片段。
在一个实施方案中，抗体是抗体片段，只要其含有至少一个可以被改造以产生异二聚体(诸如pI改造)的恒定结构域即可。可以使用的其他抗体片段包括含有已经被pI改造的本发明的CH1、CH2、CH3、铰链和CL结构域中的一个或多个的片段。例如，Fc融合体是Fc区(CH2和CH3,任选地具有铰链区)融合到另一个蛋白的融合体。许多 Fc融合体在本领域中是已知的，并且可以通过加入本发明的异二聚体化变体而被改进。在本发明的情况下，可以制备抗体融合体，其包含 CH1；CH1,CH2和CH3；CH2；CH3；CH2和CH3；CH1和CH3,它们的任一个或所有均可以任选地被制备具有铰链区，利用本文所述的异二聚体化变体的任意组合。
scFv实施方案
在本发明的一些实施方案中，一个单体包含重链，所述重链包含与Fc结构域连接的scFV；另一个单体包含重链，所述重链包含与Fc 结构域连接的Fab，例如，“经典的”重链，和轻链。“Fab”或“Fab区”当在本文中使用时意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指孤立的此区，或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的情况下的此区。“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”当在本文中使用时意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。
本文中所述的几种异二聚体抗体实施方案依赖于使用一个或多个 scFv结构域,包含可变重链和可变轻链,使用接头共价连接，形成抗原结合结构域。一些实施方案在本文中使用“标准的”接头，通常是甘氨酸和丝氨酸的接头，如本领域中所熟知的。
本发明进一步提供了带电荷的scFv接头，以促进第一和第二单体之间的pI的分开。即，通过加入带电荷的scFv接头,带正电的或带负电的(或两者，在不同的单体上使用scFv的骨架的情况下),这允许包含带电荷的接头的单体改变pI而不会在Fc结构域中进一步制造改变。这些带电荷的接头可以被替换进含有标准接头的任何scFv中。再次，如本领域技术人员要理解的,根据所需的pI改变，在正确的“链”或单体上使用带电荷的scFv接头。例如，如本文所讨论的，为了制备 F三联体形式异二聚体抗体，计算每个所需的抗原结合结构域的Fv 区的原始pI，选择一个制备scFv，并且取决于pI,选择带正电的或带负电的结构。
另外，在抗-CD3 scFv区的情况下，可以将二硫键改造进可变重链和可变轻链中以提供额外的稳定性。在抗-CD3 scFv的背景下合适的二硫化物序列显示在图8中。
嵌合和人源化抗体
在一些实施方案中，抗体可以是来自不同物种的混合物，例如，嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”两者是指组合了来自一个以上物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统地包含来自小鼠(或在一些情况下，大鼠)的可变区(一个或多个)和来自人的恒定区(一个或多个)。“人源化抗体”通常是指已经具有交换了人抗体中存在的序列的可变结构域构架区的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除了CDR以外，整个抗体由人来源的多核苷酸编码或除了在其CDR内以外，其与这样的抗体是相同的。CDR中的一些或全部由来源于非人生物体的核酸编码，所述CDR被移植到人抗体可变区的β-片层框架中以形成抗体，该抗体的特异性由植入的CDR决定。这种抗体的形成记述在例如，WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中，所有文献通过引用整体地并入。经常需要所选的受者框架残基“回复突变”至相应的供者残基来重新获得在初始移植的构建体中丧失的亲和性(US 5530101；US 5585089；US5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213,所有专利通过引用整体地并入)。人源化抗体还最佳地将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分，并且因此典型地包含人Fc区。人源化抗体也可以使用带有遗传改造的免疫系统的小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654,通过引用整体地并入。多种人源化和重塑非人抗体的技术和方法在本领域中是熟知的 (参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science (USA)，和其中引用的参考文献，所有均通过引用整体地并入)。人源化方法包括但不限于在下面文献中所述的方法：Jones等人,1986, Nature 321:522-525；Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,J.Immunol.160: 1029-1035；Carter等人,1992,ProcNatl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等人,1998, Protein Eng11:321-8,所有均通过引用整体地并入。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法可以包括表面重塑法，如例如 Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述，该文献通过引用整体地并入。在一个实施方案中，亲代抗体已经被亲和力成熟，如本领域中已知的。可以采用基于结构的方法用于人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。可以采用基于选择的方法来人源化和/或亲和力成熟抗体可变区，包括但不限于下列文献中所述的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人, 1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol. Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759，所有均通过引用整体地并入。其他人源化方法可以涉及移植仅部分CDR，包括但不限于USSN 09/810,510；Tan等人,2002, J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol. 169:3076-3084中所述的方法，所有这些文献均通过引用整体地并入。
异二聚体重链恒定区
因此，基于使用含有变体重链恒定区，且具体地是Fc结构域作为第一结构域的单体，本发明提供了异二聚体蛋白。“单体”在本文中意指异二聚体蛋白的一半。应当注意传统的抗体实际上是四聚体(两条重链和两条轻链)。在本发明的背景中，一对重链-轻链(如果适用，例如，如果单体包含Fab)被认为是“单体”。类似地，包含scFv的重链区被认为是单体。在其中Fv区是一个融合伴侣(例如，重链和轻链可变结构域)且非抗体蛋白是另一个融合伴侣的情况下，每个“一半”被认为是单体。基本上，每个单体包含足够的重链恒定区以允许异二聚体化改造，无论是所有恒定区，例如Ch1-铰链-CH2-CH3、Fc区(CH2-CH3)，还是正好CH3结构域。
变体重链恒定区可以包括所有或部分的重链恒定区,包括全长构建体，CH1-铰链-CH2-CH3，或其部分，包括例如单独CH2-CH3或 CH3。另外，每个单体的重链区可以是相同的主链(CH1-铰链 -CH2-CH3或CH2-CH3)或不同的主链。N-和C-末端截短和加长也包括在所述定义内；例如，一些pI变体包括向重链结构域的C-末端添加带电荷的氨基酸。
因此，通常，本发明的“F三联体”构建体的一个单体是scFv区- 铰链-Fc结构域)，且另一个是(VH-CH1-铰链-CH2-CH3加上相关的轻链),其中异二聚体化变体，包括位阻变体、同种型变体、电荷转向、和pI变体、Fc和FcRn变体、消除变体和其他的抗原结合结构域(具有任选的接头)包括在这些区中。
除了本文概述的异二聚体化变体(例如位阻和pI变体)以外，重链区也可以含有额外的氨基酸置换，包括如下所讨论的用于改变FcγR 和FcRn结合的变化。
另外，一些单体可以利用变体重链恒定区和融合伴侣之间的接头。对于“开瓶器”的scFv部分，可以使用本领域中已知的标准接头，或本文所述的带电荷的scFv接头。在其中制备额外的融合伴侣(例如图1 和2)的情况下，可以使用传统的肽接头，包括甘氨酸和丝氨酸的柔性接头，或图9的带电荷的接头。在一些情况下，用作单体的成分的接头与下面对ADC构建体所定义的那些不同，并且在许多实施方案中不是可裂解的接头(诸如对蛋白酶易感的那些)，尽管可裂解接头可以用于一些实施方案中。
异二聚体化变体包括许多不同类型的变体，包括，但不限于，位阻变体(包括电荷变体)和pI变体，其可以任选地和独立地与任何其他变体组合。在这些实施方案中，重要的是将“单体A”与“单体B”匹配；即，如果异二聚体蛋白依赖于位阻变体和pI变体两者，则这些需要正确地匹配至每个单体：例如起作用的位阻变体组(单体A上的1组，单体B上的1组)与pI变体组(单体A上的1组，单体B上的1组)组合，使得每个单体上的变体被设计成实现所需的功能，保持pI“链型”使得可以改变pI的位阻变体被放置在适宜的单体上。
重要的是要注意本文概述的异二聚体化变体(例如，包括但不限于图3和12中显示的那些变体),可以任选地和独立地与任何其他变体，并且在任何其他单体上组合。即，对于异二聚体化重要的是存在“多组”变体，一组用于一个单体，一组用于另一个单体。是否这些从附图1 对1地组合在一起(例如单体1列表可以相配)或切换(用单体2位阻变体更换单体1pI变体)是无关的。然而，如本文所述，当如上所概述的那样进行组合时应当保留“链型”。此外，对于其他的Fc变体(诸如用于FcγR结合，FcRn结合等)，独立地和任选地，任一单体，或两个单体，可以包括任一个列举的变体。在一些情况下，两个单体具有附加的变体，并且在一些情况下仅一个单体具有附加的变体，或它们可以组合在一起。
异二聚体化变体
本发明提供了异二聚体蛋白，包括多种形式的异二聚体抗体，其利用异二聚体变体以允许异二聚体形成和/或与均二聚体纯化分开。
位阻变体
在一些实施方案中，可以通过添加位阻变体来促进异二聚体的形成。即，通过改变每条重链中的氨基酸，不同的重链更有可能缔合以形成异二聚体结构，而不是形成具有相同Fc氨基酸序列的均二聚体。合适的位阻变体包括在图3和图12A、12B、12C、12D、12F和12G中。
一种机制在本领域中通常称作“旋钮和孔”，是指建立位阻影响以有利于异二聚体形成的氨基酸工程并且也可以任选地使用不利于均二聚体形成的氨基酸工程；这有时被称为“旋钮和孔”,如在USSN 61/596,846,Ridgway等人,Protein Engineering 9(7):617(1996)； Atwell等人,J.Mol.Biol.1997 270:26；US专利号8,216,805中所述，所有文献均整体地通过引用并入本文。附图标识了许多“单体A–单体B”对，这些对依赖于“旋钮和孔”。另外，如Merchant等人,Nature Biotech.16:677(1998)中所述，这些“旋钮和孔”突变可以与二硫键组合以使形成向异二聚体化偏斜。
在异二聚体的生成中有用的一个其他机制有时称为“静电转向”，如在Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述，该文整体地通过引用并入本文。这有时在本文中称为“电荷对”。在此实施方案中，使用静电使形成向异二聚体化偏斜。如本领域技术人员将理解的是，这些也可以对pI并且因此对纯化具有作用，并且因此在一些情况下也可以被认为是pI变体。然而，由于这些被生成用于强制异二聚体化并且不被用作纯化工具，因此它们被归类为“位阻变体”。这些包括，但不限于，D221E/P228E/L368E与D221R/P228R/K409R 配对(例如，这些是“单体对应组)以及C220E/P228E/368E与 C220R/E224R/P228R/K409R配对。
可以与其他变体组合的另外的单体A和单体B变体，任选地和独立地以任何量，诸如本文概述的pI变体或在US 2012/0149876的图 37中显示的其他位阻变体，该申请的附图和图例和SEQ ID NO特别地通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文概述的位阻变体可以任选地和独立地与任何pI变体(或其他变体诸如Fc变体、FcRn变体，等)结合至一个或两个单体中，并且可以独立地和任选地被本发明的蛋白包括或不包括。
用于异二聚体的pI(等电点)变体
通常，如本领域技术人员要理解的，存在两大类pI变体：增加蛋白的pI的那些(碱性改变)和减小蛋白的pI的那些(酸性改变)。如本文所述，可以做出这些变体的所有组合：一个单体可以是野生型，或不表现出与野生型显著不同的pI的变体，且另一个可以是更碱性的或更酸性的。可选地，每个单体被改变，一个变成更碱性且一个变成更酸性。
pI变体的优选组合显示在图3和12E中。
重链pI改变
许多pI变体显示在图54和55中。如本文所概述和在附图中显示的那样，这些改变相对于IgG1显示，但所有同种型都可以以这种方式改变，以及同种型杂交体。在其中重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
抗体异二聚体轻链变体
在基于抗体的异二聚体的情况下，例如在至少一个单体除了重链结构域以外还包含轻链的情况下，也可以在轻链中制备pI变体。用于减小轻链的pI的氨基酸置换包括，但不限于，K126E,K126Q,K145E, K145Q,N152D,S156E,K169E,S202E,K207E和在轻链的c-末端处添加肽DEDE。基于恒定λ轻链的此类改变包括在R108Q,Q124E, K126Q,N138D,K145T和Q199E处的一个或多个置换。另外，也可以增加轻链的pI。
同种型变体
另外，本发明的许多实施方案依赖于从一个IgG同种型将特定的位置处的pI氨基酸“输入”至另一个IgG同种型中，由此减小或消除不想要的免疫原性被引入至变体中的可能性。这些中的许多显示在图10A和10B中。即，出于多种原因，IgG1是用于治疗性抗体的常见同种型，所述原因包括高效应器功能。然而，IgG1的重链恒定区的pI 高于IgG2(8.10相对于7.31)。通过将特定位置处的IgG2残基引入至 IgG1主链中，所得单体的pI降低(或增加)并且另外地表现出较长的血清半衰期。例如，IgG1具有在位置137处的甘氨酸(pI 5.97)，IgG2 具有谷氨酸(pI 3.22)；输入谷氨酸将影响所得蛋白的pI。如下所述，通常需要许多氨基酸置换来显著影响变体抗体的pI。然而，如下所讨论的应当注意IgG2分子的均等变化使血清半衰期增加。
在其他实施方案中，做出非同种型氨基酸变化，以减小所得蛋白的总电荷状态(例如通过将较高pI氨基酸改变为较低pI氨基酸)，或为了稳定性而使结构发生适应性变化，等，如下面更进一步描述的那样。
另外，通过pI改造重链和轻链恒定结构域，可以看到异二聚体的每个单体中的显著变化。如本文所讨论，使两个单体的pI相差至少 0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦、或对等电点敏感的其他方法分离。
计算pI
每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和全部单体 (包括变体重链恒定结构域和融合伴侣)的pI。因此，在一些实施方案中，使用图53中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论的，要改造的那个单体通常由Fv和骨架区的固有pI所决定。可选地，可以比较每个单体的pI。
异二聚体Fc融合蛋白
除了异二聚体抗体以外，本发明提供了异二聚体蛋白，所述异二聚体蛋白包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含变体Fc区和第一融合伴侣，所述第二单体也包含变体Fc区和第二融合伴侣。多个变体Fc区如本文那样对于抗体进行改造，并且因此是不同的，并且通常第一和第二融合伴侣也是不同的。在一些情况下，在一个单体基于抗体(即，包含标准的重链和轻链或是具有scFv的Fc结构域)且另一个单体是Fc融合蛋白的情况下，得到的异二聚体蛋白称为“融合体 (fusionbody)”。
还得到较好的体内FcRn结合的pI变体
在其中pI变体降低单体的pI的情况下，它们可以具有额外的益处：提高体内血清滞留时间。
尽管仍在检验中，但相信Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在 pH6在核内体中与FcRn的结合隔离了Fc(Ghetie和Ward,1997 Immunol Today.18(12):592-598,通过引用整体地并入)。然后核内体室将Fc再循环至细胞表位。一旦该室向细胞外空间开放，则较高的 pH～7.4诱导Fc释放回血液。在小鼠中，Dall’Acqua等人证明在pH 6和pH 7.4FcRn结合增加的Fc突变体实际上具有减小的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall’Acqua等人2002,J.Immunol. 169:5171-5180,通过引用整体地并入)。在pH 7.4Fc与FcRn的增加的亲和力被认为阻止Fc释放回血液。因此，将增加Fc半衰期的Fc 突变理想地增加在较低的pH下的FcRn结合，同时仍然允许在较高的pH下Fc的释放。在6.0-7.4的pH范围内氨基酸组氨酸改变其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合体中的重要位置处发现His残基并不令人吃惊。
近年来，已经表明可变区具有较低的等电点的抗体也可以具有较长的血清半衰期(Igawa等人,2010PEDS.23(5):385-392,通过引用整体地并入)。然而，此现象的机制还尚未理解。而且，抗体与抗体之间可变区有所不同。具有减小的pI和延长的半衰期的恒定区变体将提供更模块化的方式来提高抗体的药代动力学特性，如本文所述。
能用于此实施方案中的pI变体，以及它们用于纯化优化的用途，公开在图20中。
异二聚体变体的组合
如本领域技术人员要理解的，所有提及的异二聚体化变体都可以以任何方式任选地和独立地组合，只要它们保留它们的“链型”或“单体分配”即可。另外，所有这些变体都可以组合成任一种异二聚体化形式。
在pI变体的情况下，尽管具有特定用途的实施方案显示在附图中，但可以产生其他组合，遵循改变两个单体之间的pI差以促进纯化的基本法则。
本发明的核酸
本发明进一步提供了编码本发明的异二聚体蛋白的核酸组合物。如本领域技术人员要理解的，核酸组合物将取决于异二聚体蛋白的形式和骨架。因此，例如，当所述形式需要三个氨基酸序列，诸如F三联体形式(例如，包含Fc结构域和scFv的第一氨基酸单体，包含重链和轻链的第二氨基酸单体)时，三个核酸序列可以被结合至一个或多个用于表达的表达载体中。类似地，一些形式(例如，诸如图1M中公开的双scFv形式)仅需要两个核酸；再次，它们可以被置于一个或两个表达载体中。
靶抗原
本发明的异二聚体蛋白可以实际上靶向任何抗原。“F三联体”形式特别有益于靶向两个(或更多个)不同的抗原。(如本文所概述，此靶向可以是单价和双价结合的任意组合，取决于形式)。因此，在本文中免疫球蛋白优选地共接合两个靶抗原，尽管在一些情况下，三个或四个抗原可以单价接合。每个单体的特异性可以从下面的列表中选择。尽管本文所述的F三联体免疫球蛋白特别有益于靶向不同的抗原，但在一些情况下仅靶向一个抗原可以是有益的。即，每个单体可以具有对相同抗原的特异性。
本文的异二聚体蛋白的特别合适的应用是共同靶标对，对其来说，有益的或至关重要的是单价地接合每个靶抗原。这样的抗原可以是，例如，在免疫络合过程中激活的免疫受体。许多免疫受体的细胞激活仅通过交联发生，典型地通过抗体/抗原免疫复合体，或经由靶向细胞接合的效应细胞实现。对于一些免疫受体，例如T细胞上的CD3信号传导受体，仅在与共同接合的靶标的接合过程中激活是至关重要的，因为临床背景中的非特异性交联可以引发细胞因子风暴和毒性。在治疗上，通过单价地而不是多价地接合这样的抗原，使用本文所述的免疫球蛋白，这种激活仅在主要靶抗原的微环境中仅响应于交联而发生。以不同的化合价靶向两种不同的抗原的能力是本发明的新颖的和有用的方面。可以在治疗上有益或需要单价地共同接合的靶抗原的实例包括但不限于：免疫激活受体诸如CD3,FcγRs,toll样受体(TLR)诸如 TLR4和TLR9,细胞因子，趋化因子，细胞因子受体和趋化因子受体。在许多实施方案中，抗原结合位点之一与CD3结合，且在一些实施方案中，其是含有scFv的单体。
实际上任何抗原可以被本文的免疫球蛋白靶向，包括但不限于蛋白质，亚基，结构域，基序和/或属于靶抗原的下列列表的表位：其包括可溶性因子诸如细胞因子和膜结合因子两者，包括跨膜受体：17-IA, 4-1BB,4Dc,6-酮-PGF1a,8-异-PGF2a,8-氧代-dG,A1腺苷受体,A33, ACE,ACE-2,激活素,激活素A,激活素AB,激活素B,激活素C, 激活素RIA,激活素RIA ALK-2,激活素RIB ALK-4,激活素RIIA,激活素RIIB,ADAM,ADAM10,ADAM12,ADAM15,ADAM17/TACE,ADAM8,ADAM9,ADAMTS,ADAMTS4, ADAMTS5,地址素,aFGF,ALCAM,ALK,ALK-1,ALK-7,α-1-抗胰蛋白酶,α-V/β-1拮抗剂，ANG,Ang,APAF-1,APE,APJ,APP, APRIL,AR,ARC,ART,青蒿琥酯,抗-Id,ASPARTIC,心钠素, av/b3整合素,Axl,b2M,B7-1,B7-2,B7-H,B-淋巴细胞刺激因子(BlyS), BACE,BACE-1,Bad,BAFF,BAFF-R,Bag-1,BAK,Bax,BCA-1, BCAM,Bcl,BCMA,BDNF,b-ECGF,bFGF,BID,Bik,BIM,BLC, BL-CAM,BLK,BMP,BMP-2BMP-2a,BMP-3成骨素,BMP-4 BMP-2b,BMP-5,BMP-6Vgr-1,BMP-7(OP-1),BMP-8(BMP-8a, OP-2),BMPR,BMPR-IA(ALK-3),BMPR-IB(ALK-6),BRK-2, RPK-1,BMPR-II(BRK-3),BMPs,b-NGF,BOK,铃蟾肽,骨源性神经营养因子,BPDE,BPDE-DNA,BTC,补体因子3(C3),C3a,C4,C5, C5a,C10,CA125,CAD-8,降钙素,cAMP,癌胚抗原(CEA),癌相关抗原,组织蛋白酶A,组织蛋白酶B,组织蛋白酶C/DPPI,组织蛋白酶D,组织蛋白酶E,组织蛋白酶H,组织蛋白酶L,组织蛋白酶 O,组织蛋白酶S,组织蛋白酶V,组织蛋白酶X/Z/P,CBL,CCI, CCK2,CCL,CCL1,CCL11,CCL12,CCL13,CCL14,CCL15,CCL16, CCL17,CCL18,CCL19,CCL2,CCL20,CCL21,CCL22,CCL23, CCL24,CCL25,CCL26,CCL27,CCL28,CCL3,CCL4,CCL5,CCL6, CCL7,CCL8,CCL9/10,CCR,CCR1,CCR10,CCR10,CCR2,CCR3, CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CD1,CD2,CD3,CD3E, CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD13, CD14,CD15,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD25, CD27L,CD28,CD29,CD30,CD30L,CD32,CD33(p67蛋白),CD34,CD38,CD40,CD40L,CD44,CD45,CD46,CD49a,CD52,CD54,CD55, CD56,CD61,CD64,CD66e,CD74,CD80(B7-1),CD89,CD95,CD123, CD137,CD138,CD140a,CD146,CD147,CD148,CD152,CD164, CEACAM5,CFTR,cGMP,CINC,肉毒梭菌毒素,产气荚膜梭菌毒素, CKb8-1,CLC,CMV,CMV UL,CNTF,CNTN-1,COX,C-Ret,CRG-2, CT-1,CTACK,CTGF,CTLA-4,CX3CL1,CX3CR1,CXCL,CXCL1, CXCL2,CXCL3,CXCL4,CXCL5,CXCL6,CXCL7,CXCL8,CXCL9, CXCL10,CXCL11,CXCL12,CXCL13,CXCL14,CXCL15,CXCL16, CXCR,CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4,CXCR5,CXCR6,细胞角蛋白肿瘤相关抗原,DAN,DCC,DcR3,DC-SIGN,衰变加速因子, des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1),Dhh,地高辛,DNAM-1,脱氧核糖核酸酶, Dpp,DPPIV/CD26,Dtk,ECAD,EDA,EDA-A1,EDA-A2,EDAR, EGF,EGFR(ErbB-1),EMA,EMMPRIN,ENA,内皮素受体,脑啡肽酶,eNOS,Eot,嗜酸性粒细胞趋化因子1,EpCAM,肝配蛋白B2/ EphB4,EPO,ERCC,E-选择素,ET-1,因子IIa,因子VII,因子VIIIc, 因子IX,成纤维细胞激活蛋白(FAP),Fas,FcR1,FEN-1,铁蛋白,FGF,FGF-19,FGF-2,FGF3,FGF-8,FGFR,FGFR-3,纤维蛋白,FL,FLIP, Flt-3,Flt-4,卵泡刺激素,CXXXC趋化分子(Fractalkine),FZD1, FZD2,FZD3,FZD4,FZD5,FZD6,FZD7,FZD8,FZD9,FZD10,G250, Gas 6,GCP-2,GCSF,GD2,GD3,GDF,GDF-1,GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14,CDMP-1),GDF-6(BMP-13,CDMP-2),GDF-7 (BMP-12,CDMP-3),GDF-8(肌肉生长抑制素),GDF-9,GDF-15 (MIC-1),GDNF,GDNF,GFAP,GFRa-1,GFR-α1,GFR-α2,GFR-α3, GITR,胰高血糖素,Glut 4,糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa),GM-CSF, gp130,gp72,GRO,生长激素释放因子,半抗原(NP-cap或NIP-cap), HB-EGF,HCC,HCMV gB包膜糖蛋白,HCMV)gH包膜糖蛋白, HCMVUL,造血生长因子(HGF),Hep B gp120,类肝素酶,Her2, Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3),Her4(ErbB-4),单纯疱疹病毒 (HSV)gB糖蛋白,HSV gD糖蛋白,HGFA,高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA),HIV gp120,HIV IIIB gp 120V3环,HLA,HLA-DR, HM1.24,HMFG PEM,HRG,Hrk,人心肌肌球蛋白,人巨细胞病毒(HCMV),人生长激素(HGH),HVEM,I-309,IAP,ICAM,ICAM-1, ICAM-3,ICE,ICOS,IFNg,Ig,IgA受体,IgE,IGF,IGF结合蛋白, IGF-1R,IGFBP,IGF-I,IGF-II,IL,IL-1,IL-1R,IL-2,IL-2R,IL-4, IL-4R,IL-5,IL-5R,IL-6,IL-6R,IL-8,IL-9,IL-10,IL-12,IL-13,IL-15, IL-18,IL-18R,IL-23,干扰素(INF)-α,INF-β,INF-γ,抑制素,iNOS, 胰岛素A-链,胰岛素B-链,胰岛素样生长因子1,整合素α2,整合素α3,整合素α4,整合素α4/β1,整合素α4/β7,整合素α5(αV),整合素α5/β1,整合素α5/β3,整合素α6,整合素β1,整合素β2,干扰素γ,IP-10,I-TAC,JE,激肽释放酶2,激肽释放酶5,激肽释放酶 6,,激肽释放酶11,激肽释放酶12,激肽释放酶14,激肽释放酶 15,激肽释放酶L1,激肽释放酶L2,激肽释放酶L3,激肽释放酶 L4,KC,KDR,角质细胞生长因子(KGF),层粘连蛋白5,LAMP, LAP,LAP(TGF-1),潜在TGF-1,潜在TGF-1bp1,LBP,LDGF, LECT2,Lefty,Lewis-Y抗原,Lewis-Y相关抗原,LFA-1,LFA-3,Lfo, LIF,LIGHT,脂蛋白,LIX,LKN,Lptn,L-选择素,LT-a,LT-b,LTB4, LTBP-1，肺表面活性剂,黄体生成素,淋巴毒素β受体,Mac-1, MAdCAM,MAG,MAP2,MARC,MCAM,MCAM,MCK-2,MCP, M-CSF,MDC,Mer,金属蛋白酶,MGDF受体,MGMT,MHC(HLA-DR),MIF,MIG,MIP,MIP-1-α,MK,MMAC1,MMP,MMP-1, MMP-10,MMP-11,MMP-12,MMP-13,MMP-14,MMP-15,MMP-2, MMP-24,MMP-3,MMP-7,MMP-8,MMP-9,MPIF,Mpo,MSK,MSP, 粘液素(Muc1),MUC18，缪勒管抑制物质,Mug,MuSK,NAIP,NAP, NCAD,N-钙粘附素,NCA 90,NCAM,NCAM,脑啡肽酶,神经营养因子-3,-4,或-6,Neurturin,神经元生长因子(NGF),NGFR,NGF-β, nNOS,NO,NOS,Npn,NRG-3,NT,NTN,OB,OGG1,OPG,OPN, OSM,OX40L,OX40R,p150,p95,PADPr,甲状旁腺激素,PARC, PARP,PBR,PBSF,PCAD,P-钙粘附素,PCNA,PDGF,PDGF,PDK-1,PECAM,PEM,PF4,PGE,PGF,PGI2,PGJ2,PIN,PLA2,胎盘碱性磷酸酶(PLAP),PlGF,PLP,PP14,胰岛素原,松弛素原(Prorelaxin), 蛋白C,PS,PSA,PSCA,前列腺特异性膜抗原(PSMA),PTEN,PTHrp, Ptk,PTN,R51,RANK,RANKL,RANTES,RANTES,松弛素A-链, 松弛素B-链,肾素,呼吸道合胞病毒(RSV)F,RSV Fgp,Ret,类风湿因子,RLIP76,RPA2,RSK,S100,SCF/KL,SDF-1,丝氨酸,血清白蛋白,sFRP-3,Shh,SIGIRR,SK-1,SLAM,SLPI,SMAC,SMDF,SMOH, SOD,SPARC,Stat,STEAP,STEAP-II,TACE,TACI,TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72),TARC,TCA-3,T-细胞受体(例如，T-细胞受体α/β), TdT,TECK,TEM1,TEM5,TEM7,TEM8,TERT,睾丸PLAP-样碱性磷酸酶,TfR,TGF,TGF-α,TGF-β,TGF-βPan特异性,TGF-βRI (ALK-5),TGF-βRII,TGF-βRIIb,TGF-βRIII,TGF-β1,TGF-β2, TGF-β3,TGF-β4,TGF-β5,凝血酶,胸腺Ck-1,促甲状腺激素,Tie, TIMP,TIQ,组织因子,TMEFF2,Tmpo,TMPRSS2,TNF,TNF-α, TNF-αβ,TNF-β2,TNFc,TNF-RI,TNF-RII,TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2,DR4),TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5,KILLER,TRICK-2A, TRICK-B),TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1,LIT,TRID),TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2,TRUNDD),TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R),TNFRSF11B(OPG OCIF,TR1),TNFRSF12(TWEAK R FN14),TNFRSF13B(TACI),TNFRSF13C(BAFF R),TNFRSF14 (HVEM ATAR,HveA,LIGHT R,TR2),TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA),TNFRSF18(GITR AITR),TNFRSF19(TROY TAJ,TRADE),TNFRSF19L(RELT),TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60),TNFRSF1B(TNF RII CD120b,p75-80),TNFRSF26 (TNFRH3),TNFRSF3(LTbR TNF RIII,TNFCR),TNFRSF4(OX40 ACT35,TXGP1 R),TNFRSF5(CD40 p50),TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1,CD95),TNFRSF6B(DcR3 M68,TR6),TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30),TNFRSF9(4-1BBCD137,ILA),TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2),TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1),TNFRSF25(DR3 Apo-3,LARD,TR-3,TRAMP,WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2配体,TL2),TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF,OPG配体),TNFSF12(TWEAK Apo-3配体,DR3配体),TNFSF13(APRIL TALL2),TNFSF13B(BAFF BLYS,TALL1, THANK,TNFSF20),TNFSF14(LIGHTHVEM配体,LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI),TNFSF18(GITR配体AITR配体,TL6), TNFSF1A(TNF-a Conectin,DIF,TNFSF2),TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1),TNFSF3(LTb TNFC,p33),TNFSF4(OX40配体gp34, TXGP1),TNFSF5(CD40配体CD154,gp39,HIGM1,IMD3,TRAP), TNFSF6(Fas配体Apo-1配体,APT1配体),TNFSF7(CD27配体 CD70),TNFSF8(CD30配体CD153),TNFSF9(4-1BB配体CD137配体),TP-1,t-PA,Tpo,TRAIL,TRAIL R,TRAIL-R1,TRAIL-R2, TRANCE,转铁蛋白受体,TRF,Trk,TROP-2,TSG,TSLP,肿瘤相关抗原CA 125,表达Lewis Y相关糖类的肿瘤相关抗原,TWEAK, TXB2,Ung,uPAR,uPAR-1,尿激酶,VCAM,VCAM-1,VECAD,VE- 钙粘附素,VE-钙粘附素-2,VEFGR-1(flt-1),VEGF,VEGFR, VEGFR-3(flt-4),VEGI,VIM,病毒抗原,VLA,VLA-1,VLA-4,VNR 整合素,血管假性血友病因子,WIF-1,WNT1,WNT2,WNT2B/13, WNT3,WNT3A,WNT4,WNT5A,WNT5B,WNT6,WNT7A,WNT7B, WNT8A,WNT8B,WNT9A,WNT9A,WNT9B,WNT10A,WNT10B, WNT11,WNT16,XCL1,XCL2,XCR1,XCR1,XEDAR,XIAP,XPD，以及激素和生长因子的受体。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
可以被本发明的免疫球蛋白特异性靶向的示例性抗原包括但不限于：CD20,CD19,Her2,EGFR,EpCAM,CD3,FcγRIIIa(CD16), FcγRIIa(CD32a),FcγRIIb(CD32b),FcγRI(CD64),Toll-样受体 (TLRs)诸如TLR4和TLR9,细胞因子诸如IL-2,IL-5,IL-13,IL-12,IL-23和TNFα,细胞因子受体诸如IL-2R,趋化因子,趋化因子受体，生长因子诸如VEGF和HGF，等。为了形成本发明的多特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
对于双特异性抗体特别优选的组合是对CD3的抗原-结合结构域和对CD19的抗原结合结构域；对CD3的抗原结合结构域和对CD33 的抗原结合结构域；对CD3的抗原结合结构域和对CD38的抗原结合结构域。再次，在许多实施方案中，CD3结合结构域是scFv,具有如附图中描绘的示例性序列和/或所概述的CD3 CDR。
对合适的靶抗原和共同靶标的选择取决于所需的治疗性用途。已经证明特别地经得起抗体治疗考验的一些靶标是具有信号传导功能的那些。其他治疗性抗体通过抑制受体及其同源配体之间的结合通过阻断受体的信号传导来发挥它们的作用。治疗性抗体的另一作用机制是引起受体下调。其他抗体不通过经由它们的靶抗原的信号传导发挥作用。对共同靶标的选择将取决于构成被治疗的适应症的病理学的基础的详细生物学。
单克隆抗体疗法已经作为癌症的一种重要的治疗方式出现 (Weiner等人,2010,Nature Reviews Immunology 10:317-327； Reichert等人,2005,Nature Biotechnology23[9]:1073-1078；通过引用特别地并入本文)。对于抗癌治疗，靶向一种抗原(抗原-1)同时共同靶向第二抗原(抗原-2)可以是合乎需要的，所述抗原-1的表达限于癌细胞，所述第二抗原介导一些免疫杀伤活性。对于其他治疗，共同靶向两种抗原可能是有益的，例如，两种血管形成因子或两种生长因子，它们各自已知在肿瘤增殖中具有一些作用。用于肿瘤学的示例性共同靶标包括但不限于HGF和VEGF,IGF-1R和VEGF,Her2和VEGF, CD19和CD3,CD20和CD3,Her2和CD3,CD19和FcγRIIIa,CD20 和FcγRIIIa,Her2和FcγRIIIa。本发明的免疫球蛋白可以能够结合 VEGF和磷脂酰丝氨酸；VEGF和ErbB3；VEGF和PLGF；VEGF和 ROBO4；VEGF和BSG2；VEGF和CDCP1；VEGF和ANPEP；VEGF 和c-MET；HER-2和ERB3；HER-2和BSG2；HER-2和CDCP1； HER-2和ANPEP；EGFR和CD64；EGFR和BSG2；EGFR和CDCP1；EGFR和ANPEP；IGF1R和PDGFR；IGF1R和VEGF；IGF1R和 CD20；CD20和CD74；CD20和CD30；CD20和DR4；CD20和 VEGFR2；CD20和CD52；CD20和CD4；HGF和c-MET；HGF和 NRP1；HGF和磷脂酰丝氨酸；ErbB3和IGF1R；ErbB3和IGF1,2； c-Met和Her-2；c-Met和NRP1；c-Met和IGF1R；IGF1,2和PDGFR； IGF1,2和CD20；IGF1,2和IGF1R；IGF2和EGFR；IGF2和HER2； IGF2和CD20；IGF2和VEGF；IGF2和IGF1R；IGF1和IGF2； PDGFRa和VEGFR2；PDGFRa和PLGF；PDGFRa和VEGF； PDGFRa和c-Met；PDGFRa和EGFR；PDGFRb和VEGFR2； PDGFRb和c-Met；PDGFRb和EGFR；RON和c-Met；RON和MTSP1； RON和MSP；RON和CDCP1；VGFR1和PLGF；VGFR1和RON； VGFR1和EGFR；VEGFR2和PLGF；VEGFR2和NRP1；VEGFR2 和RON；VEGFR2和DLL4；VEGFR2和EGFR；VEGFR2和ROBO4； VEGFR2和CD55；LPA和S1P；EPHB2和RON；CTLA4和VEGF； CD3和EPCAM；CD40和IL6；CD40和IGF；CD40和CD56；CD40 和CD70；CD40和VEGFR1；CD40和DR5；CD40和DR4；CD40和 APRIL；CD40和BCMA；CD40和RANKL；CD28和MAPG；CD80 和CD40；CD80和CD30；CD80和CD33；CD80和CD74；CD80和CD2； CD80和CD3；CD80和CD19；CD80和CD4；CD80和CD52；CD80和 VEGF；CD80和DR5；CD80和VEGFR2；CD22和CD20；CD22和 CD80；CD22和CD40；CD22和CD23；CD22和CD33；CD22和CD74； CD22和CD19；CD22和DR5；CD22和DR4；CD22和VEGF；CD22 和CD52；CD30和CD20；CD30和CD22；CD30和CD23；CD30和 CD40；CD30和VEGF；CD30和CD74；CD30和CD19；CD30和DR5； CD30和DR4；CD30和VEGFR2；CD30和CD52；CD30和CD4； CD138和RANKL；CD33和FTL3；CD33和VEGF；CD33和VEGFR2； CD33和CD44；CD33和DR4；CD33和DR5；DR4和CD137；DR4和 IGF1,2；DR4和IGF1R；DR4和DR5；DR5和CD40；DR5和CD137； DR5和CD20；DR5和EGFR；DR5和IGF1,2；DR5和IGFR,DR5和HER-2,以及EGFR和DLL4。其他靶标组合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一个或多个成员。
本文的免疫球蛋白可以结合的参与肿瘤性疾病的其他靶标(一个或多个)包括但不限于选自由下列各项组成的组的那些：CD52,CD20, CD19,CD3,CD4,CD8,BMP6,IL12A,IL1A,IL1B,1L2,IL24,INHA, TNF,TNFSF10,BMP6,EGF,FGF1,FGF10,FGF11,FGF12,FGF13,FGF14,FGF16,FGF17,FGF18,FGF19,FGF2,FGF20,FGF21, FGF22,FGF23,FGF3,FGF4,FGF5,FGF6,FGF7,FGF8,FGF9,GRP, IGF1,IGF2,IL12A,IL1A,IL1B,1L2,INHA,TGFA,TGFB1,TGFB2,TGFB3,VEGF,CDK2,FGF10,FGF18,FGF2,FGF4,FGF7,IGF1R, IL2,BCL2,CD164,CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C,CDKN2A, CDKN2B,CDKN2C,CDKN3,GNRH1,IGFBP6,IL1A,IL1B,ODZ1, PAWR,PLG,TGFB1I1,AR,BRCA1,CDK3,CDK4,CDK5,CDK6, CDK7,CDK9,E2F1,EGFR,ENO1,ERBB2,ESR1,ESR2,IGFBP3, IGFBP6,IL2,INSL4,MYC,NOX5,NR6A1,PAP,PCNA,PRKCQ, PRKD1,PRL,TP53,FGF22,FGF23,FGF9,IGFBP3,IL2,INHA, KLK6,TP53,CHGB,GNRH1,IGF1,IGF2,INHA,INSL3,INSL4, PRL,KLK6,SHBG,NR1D1,NR1H3,NR1I3,NR2F6,NR4A3,ESR1, ESR2,NR0B1,NR0B2,NR1D2,NR1H2,NR1H4,NR112,NR2C1, NR2C2,NR2E1,NR2E3,NR2F1,NR2F2,NR3C1,NR3C2,NR4A1, NR4A2,NR5A1,NR5A2,NR6μl,PGR,RARB,FGF1,FGF2,FGF6, KLK3,KRT1,APOC1,BRCA1,CHGA,CHGB,CLU,COL1A1, COL6A1,EGF,ERBB2,ERK8,FGF1,FGF10,FGF11,FGF13, FGF14,FGF16,FGF17,FGF18,FGF2,FGF20,FGF21,FGF22, FGF23,FGF3,FGF4,FGF5,FGF6,FGF7,FGF8,FGF9,GNRH1, IGF1,IGF2,IGFBP3,IGFBP6,IL12A,IL1A,IL1B,1L2,IL24,INHA, INSL3,INSL4,KLK10,KLK12,KLK13,KLK14,KLK15,KLK3, KLK4,KLK5,KLK6,KLK9,MMP2,MMP9,MSMB,NTN4,ODZ1, PAP,PLAU,PRL,PSAP,SERPINA3,SHBG,TGFA,TIMP3,CD44,CDH1,CDH10,CDH19,CDH20,CDH7,CDH9,CDH1,CDH10, CDH13,CDH18,CDH19,CDH20,CDH7,CDH8,CDH9,ROBO2, CD44,ILK,ITGA1,APC,CD164,COL6A1,MTSS1,PAP,TGFB1I1, AGR2,AIG1,AKAP1,AKAP2,CANT1,CAV1,CDH12,CLDN3, CLN3,CYB5,CYC1,DAB21P,DES,DNCL1,ELAC2,ENO2,ENO3, FASN,FLJ12584,FLJ25530,GAGEB1,GAGEC1,GGT1,GSTP1, HIP1,HUMCYT2A,IL29,K6HF,KAI1,KRT2A,MIB1,PART1, PATE,PCA3,PIAS2,PIK3CG,PPID,PR1,PSCA,SLC2A2,SLC33 μl,SLC43μl,STEAP,STEAP2,TPM1,TPM2,TRPC6,ANGPT1, ANGPT2,ANPEP,ECGF1,EREG,FGF1,FGF2,FIGF,FLT1,JAG1, KDR,LAMA5,NRP1,NRP2,PGF,PLXDC1,STAB 1,VEGF, VEGFC,ANGPTL3,BAI1,COL4A3,IL8,LAMA5,NRP1,NRP2, STAB 1,ANGPTL4,PECAM1,PF4,PROK2,SERPINF1,TNFAIP2, CCL11,CCL2,CXCL1,CXCL10,CXCL3,CXCL5,CXCL6,CXCL9, IFNA1,IFNB1,IFNG,IL1B,IL6,MDK,EDG1,EFNA1,EFNA3, EFNB2,EGF,EPHB4,FGFR3,HGF,IGF1,ITGB3,PDGFA,TEK, TGFA,TGFB1,TGFB2,TGFBR1,CCL2,CDH5,COL1A1,EDG1, ENG,ITGAV,ITGB3,THBS1,THBS2,BAD,BAG1,BCL2,CCNA1, CCNA2,CCND1,CCNE1,CCNE2,CDH1(E-钙粘附素),CDKN1B (p27Kip1),CDKN2A(p161NK4a),COL6A1,CTNNB1(b-连环蛋白), CTSB(组织蛋白酶B),ERBB2(Her-2),ESR1,ESR2,F3(TF),FOSL1 (FRA-1),GATA3,GSN(凝溶胶蛋白),IGFBP2,IL2RA,IL6,IL6R, IL6ST(糖蛋白130),ITGA6(a6整合素),JUN,KLK5,KRT19,MAP2K7(c-Jun),MKI67(Ki-67),NGFB(GF),NGFR,NME1(M23A), PGR,PLAU(uPA),PTEN,SERPINB5(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制因子), SERPINE1(PAI-1),TGFA,THBS1(凝血酶敏感蛋白-1),TIE(Tie-1), TNFRSF6(Fas),TNFSF6(FasL),TOP2A(拓扑异构酶Iia),TP53, AZGP1(锌-a-糖蛋白),BPAG1(网蛋白),CDKN1A(p21Wap1/Cip1), CLDN7(claudin-7),CLU(丛生蛋白(clusterin)),ERBB2(Her-2), FGF1,FLRT1(纤维连接蛋白),GABRP(GABAa),GNAS1,ID2,ITGA6(a6整合素),ITGB4(b 4整合素),KLF5(GC Box BP), KRT19(角蛋白19),KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白), MACMARCKS,MT3(金属硫蛋白-III),MUC1(粘液素),PTGS2 (COX-2),RAC2(p21Rac2),S100A2,SCGB1D2(亲脂蛋白B), SCGB2A1(乳腺珠蛋白2),SCGB2A2(乳腺珠蛋白1),SPRR1B(Spr1), THBS1,THBS2,THBS4,和TNFAIP2(B94),RON,c-Met,CD64, DLL4,PLGF,CTLA4,磷脂酰丝氨酸,ROBO4,CD80,CD22,CD40, CD23,CD28,CD80,CD55,CD38,CD70,CD74,CD30,CD138,CD56, CD33,CD2,CD137,DR4,DR5,RANKL,VEGFR2,PDGFR,VEGFR1,MTSP1,MSP,EPHB2,EPHA1,EPHA2,EpCAM,PGE2,NKG2D, LPA,SIP,APRIL,BCMA,MAPG,FLT3,PDGFRα,PDGFRβ, ROR1,PSMA,PSCA,SCD1和CD59。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
单克隆抗体疗法已经成为了治疗自身免疫病症和炎性病症的重要的治疗模态(Chan&Carter,2010,Nature Reviews Immunology 10:301-316；Reichert等人,2005,Nature Biotechnology 23[9]:1073-1078；特别地通过引用并入本文)。许多蛋白通常与自身免疫应答和炎性应答有关系，并且因此可以被本发明的免疫球蛋白靶向。自身免疫和炎性靶标包括但不限于C5,CCL1(I-309),CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子),CCL13(mcp-4),CCL15(MIP-1d),CCL16(HCC-4), CCL17(TARC),CCL18(PARC),CCL19,CCL2(mcp-1),CCL20(MIP-3a),CCL21(MIP-2),CCL23(MPIF-1),CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2),CCL25(TECK),CCL26,CCL3(MIP-1a),CCL4 (MIP-1b),CCL5(RANTES),CCL7(mcp-3),CCL8(mcp-2),CXCL1, CXCL10(IP-10),CXCL11(1-TAC/IP-9),CXCL12(SDF1),CXCL13, CXCL14,CXCL2,CXCL3,CXCL5(ENA-78/LIX),CXCL6(GCP-2), CXCL9,IL13,IL8,CCL13(mcp-4),CCR1,CCR2,CCR3,CCR4, CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CX3CR1,IL8RA,XCR1 (CCXCR1),IFNA2,IL10,IL13,IL17C,IL1A,IL1B,IL1F10,IL1F5, IL1F6,IL1F7,IL1F8,IL1F9,IL22,IL5,IL8,IL9,LTA,LTB,MIF, SCYE1(激活内皮单核细胞的细胞因子),SPP1,TNF,TNFSF5,IFNA2,IL10RA,IL10RB,IL13,IL13RA1,IL5RA,IL9,IL9R,ABCF1,BCL6, C3,C4A,CEBPB,CRP,ICEBERG,IL1R1,IL1RN,IL8RB,LTB4R, TOLLIP,FADD,IRAK1,IRAK2,MYD88,NCK2,TNFAIP3,TRADD, TRAF1,TRAF2,TRAF3,TRAF4,TRAF5,TRAF6,ACVR1,ACVR1B, ACVR2,ACVR2B,ACVRL1,CD28,CD3E,CD3G,CD3Z,CD69, CD80,CD86,CNR1,CTLA4,CYSLTR1,FCER1A,FCER2,FCGR3A,GPR44,HAVCR2,OPRD1,P2RX7,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5, TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR10,BLR1,CCL1,CCL2,CCL3, CCL4,CCL5,CCL7,CCL8,CCL11,CCL13,CCL15,CCL16,CCL17, CCL18,CCL19,CCL20,CCL21,CCL22,CCL23,CCL24,CCL25, CCR1,CCR2,CCR3,CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9, CX3CL1,CX3CR1,CXCL1,CXCL2,CXCL3,CXCL5,CXCL6, CXCL10,CXCL11,CXCL12,CXCL13,CXCR4,GPR2,SCYE1, SDF2,XCL1,XCL2,XCR1,AMH,AMHR2,BMPR1A,BMPR1B,BMPR2,C19orf10(IL27w),CER1,CSF1,CSF2,CSF3, DKFZp451J0118,FGF2,GFI1,IFNA1,IFNB1,IFNG,IGF1,IL1A, IL1B,IL1R1,IL1R2,IL2,IL2RA,IL2RB,IL2RG,IL3,IL4,IL4R,IL5,IL5RA,IL6,IL6R,IL6ST,IL7,IL8,IL8RA,IL8RB,IL9,IL9R, IL10,IL10RA,IL10RB,IL11,IL12RA,IL12A,IL12B,IL12RB1, IL12RB2,IL13,IL13RA1,IL13RA2,IL15,IL15RA,IL16,IL17, IL17R,IL18,IL18R1,IL19,IL20,KITLG,LEP,LTA,LTB,LTB4R, LTB4R2,LTBR,MIF,NPPB,PDGFB,TBX21,TDGF1,TGFA, TGFB1,TGFB1I1,TGFB2,TGFB3,TGFB1,TGFBR1,TGFBR2, TGFBR3,TH1L,TNF,TNFRSF1A,TNFRSF1B,TNFRSF7, TNFRSF8,TNFRSF9,TNFRSF11A,TNFRSF21,TNFSF4,TNFSF5, TNFSF6,TNFSF11,VEGF,ZFPM2和RNF110(ZNF144)。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
用于自身免疫病症和炎性病症的示例性共同靶标包括但不限于 IL-1和TNFα,IL-6和TNFα,IL-6和IL-1,IgE和IL-13,IL-1和IL-13, IL-4和IL-13,IL-5和IL-13,IL-9和IL-13,CD19和FcγRIIb,以及 CD79和FcγRIIb。
考虑对下列的靶标对具有特异性以治疗炎性疾病的本发明的免疫球蛋白：TNF和IL-17A；TNF和RANKL；TNF和VEGF；TNF和 SOST；TNF和DKK；TNF和αVβ3；TNF和NGF；TNF和IL-23p19； TNF和IL-6；TNF和SOST；TNF和IL-6R；TNF和CD-20；IgE和 IL-13；IL-13和IL23p19；IgE和IL-4；IgE和IL-9；IgE和IL-9；IgE和 IL-13；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-9；IL-13和IL-9；IL-13 和IL-4；IL-13和IL-23p19；IL-13和IL-9；IL-6R和VEGF；IL-6R和IL-17A；IL-6R和RANKL；IL-17A和IL-1β；IL-1β和RANKL；IL-1β和VEGF；RANKL和CD-20；IL-1α和IL-1β；IL-1α和IL-1β。
可以确定本文所述的免疫球蛋白可以结合并且可用于治疗哮喘的靶标对。在一个实施方案中，这样的靶标包括但不限于IL-13和IL-1β, 因为IL-1β也与哮喘中的炎性应答有关系；IL-13与参与炎症的细胞因子和趋化因子，诸如IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13 和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和 TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13 和SPRR2b；以及IL-13和ADAM8。本文的免疫球蛋白可以对选自由下列各项组成的组的参与哮喘的一个或多个靶标有特异性：CSF1(MCSF),CSF2(GM-CSF),CSF3(GCSF),FGF2,IFNA1,IFNB1, IFNG,组织胺和组织胺受体,IL1A,IL1B,IL2,IL3,IL4,IL5,IL6, IL7,IL8,IL9,IL10,IL11,IL12A,IL12B,IL13,IL14,IL15,IL16,IL17, IL18,IL19,KITLG,PDGFB,IL2RA,IL4R,IL5RA,IL8RA,IL8RB, IL12RB1,IL12RB2,IL13RA1,IL13RA2,IL18R1,TSLP,CCLi,CCL2, CCL3,CCL4,CCL5,CCL7,CCL8,CCL13,CCL17,CCL18,CCL19, CCL20,CCL22,CCL24,CX3CL1,CXCL1,CXCL2,CXCL3,XCLi,CCR2,CCR3,CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CX3CR1,GPR2, XCR1,FOS,GATA3,JAK1,JAK3,STAT6,TBX21,TGFB1,TNF, TNFSF6,YY1,CYSLTR1,FCER1A,FCER2,LTB4R,TB4R2,LTBR 和壳多糖酶。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
参与类风湿性关节炎(RA)的靶标对可以被本发明共同靶向，包括但不限TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-23；TNF和IL-1β；TNF 和MIF；TNF和IL-17；和TNF和IL-15。
可以被本文所述的免疫球蛋白靶向以便治疗系统性红斑狼疮 (SLE)的抗原包括但不限于：CD-20,CD-22,CD-19,CD28,CD4, CD80,HLA-DRA,IL10,IL2,IL4,TNFRSF5,TNFRSF6,TNFSF5, TNFSF6,BLR1,HDAC4,HDAC5,HDAC7A,HDAC9,ICOSL,IGBP1, MS4A1,RGSI,SLA2,CD81,IFNB1,IL10,TNFRSF5,TNFRSF7, TNFSF5,AICDA,BLNK,GALNAC4S-6ST,HDAC4,HDAC5, HDAC7A,HDAC9,IL10,IL11,IL4,INHA,INHBA,KLF6,TNFRSF7, CD28,CD38,CD69,CD80,CD83,CD86,DPP4,FCER2,IL2RA, TNFRSF8,TNFSF7,CD24,CD37,CD40,CD72,CD74,CD79A, CD79B,CR2,ILIR2,ITGA2,ITGA3,MS4A1,ST6GALI,CDIC, CHSTIO,HLA-A,HLA-DRA和NT5E；CTLA4,B7.1,B7.2,BlyS, BAFF,C5,IL-4,IL-6,IL-10,IFN-α和TNF-α。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
本文的免疫球蛋白可以靶向用于治疗多发性硬化症(MS)的抗原，包括但不限于：IL-12,TWEAK,IL-23,CXCL13,CD40,CD40L,IL-18, VEGF,VLA-4,TNF,CD45RB,CD200,IFNγ,GM-CSF,FGF,C5, CD52和CCR2。一个实施方案包括共接合抗-IL-12和TWEAK以治疗MS。
本发明的一个方面关于能够结合一个或多个参与脓毒症的靶标的免疫球蛋白，在一个实施方案中结合两个靶标，所述靶标选自由下列各项组成的组：TNF,IL-1,MIF,IL-6,IL-8,IL-18,IL-12,IL-23,FasL, LPS,Toll-样受体,TLR-4,组织因子，MIP-2,ADORA2A,CASP1, CASP4,IL-10,IL-1B,NFκB1,PROC,TNFRSFIA,CSF3,CCR3, ILIRN,MIF,NFκB1,PTAFR,TLR2,TLR4,GPR44,HMOX1,中期因子,IRAK1,NFκB2,SERPINA1,SERPINE1,和TREM1。为了形成本发明的双特异性或三特异性抗体，可以制备针对这些抗原的任意组合的抗体；即，这些抗原中的每一个可以任选地和独立地被根据本发明的多特异性抗体包括或不包括。
在一些情况下，本文的免疫球蛋白可以针对用于治疗感染性疾病的抗原。
抗原结合结构域
如本领域技术人员要理解的，存在有两种基本类型的抗原结合结构域，类似抗体抗原结合结构域的那些类型(例如，包含一组6个CDR) 和可以是配体或受体的那些类型，例如不需要使用CDR来结合靶标的那些。
修饰的抗体
除了上面概述的修饰以外，可以做出其他修饰。例如，所述分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键而被稳定化(Reiter等人, 1996,Nature Biotech.14:1239-1245,通过引用整体地并入)。另外，如下面所概述的，可以做出对抗体的多种共价修饰。
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，并且通常，但不总是，在翻译后完成。例如，使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应而将抗体的几种类型的共价修饰通过引入至分子中，所述衍生化试剂能够与所选的侧链或N-或C-末端残基反应。
半胱氨酰残基最常见地与α-卤代乙酸酯(和相应的胺，诸如氯乙酸或氯乙酰胺)反应，从而得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基也可以通过与溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸，氯乙酰基磷酸酯,N-烷基马来酰亚胺,3-硝基-2-吡啶基二硫化物,甲基2-吡啶基二硫化物,对氯汞基苯甲酸盐，2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂 -1,3-二唑等反应而被衍生化。
另外，在半胱氨酸处的修饰在抗体-药物缀合物(ADC)应用中特别有用，下面进一步描述。在一些实施方案中，抗体的恒定区可以被改造以含有一个或多个半胱氨酸(其是“巯基反应性的”)，以便允许更特异和可控地布置药物部分。参见例如美国专利号7,521,541,该专利整体地通过引用合并于此。
组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0的反应而被衍生化，因为此试剂对组氨酰侧链相对特异。也可使用对溴苯酰甲基溴；该反应优选地在0.1M二甲胂酸钠中在pH6.0进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。利用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生化含α-氨基的残基的其他合适的试剂包括亚胺酸酯诸如甲基必定亚胺甲酯；吡哆醛磷酸盐；吡哆醛；硼氢化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
精氨酰残基通过与一个或数个常规试剂的反应而进行修饰，在这些常规试剂中有苯甲酰甲醛,2,3-丁二酮,1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行，因为胍官能团具有高 pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸以及精氨酸ε-氨基的基团反应。
可以进行酪氨酰残基的特异性修饰，特别感兴趣在于通过与芳香族重氮盐化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入至酪氨酰残基中。最常见地，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用来形成O-乙酰基酪氨酰种类和和3-硝基衍生物。酪氨酰残基使用125I或131I碘化以制备标记的蛋白用于放射免疫测定，上面描述的氯胺T法是合适的。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺 (R’—N＝C＝N–R’)反应被选择性地修饰，其中R和R’任选地是不同的烷基基团，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基 -3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应而转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
利用双功能试剂的衍生化可用于将抗体交联至不溶于水的载体基质或表面上用于许多方法中，除了下面所述的方法外。常用的交联剂包括，例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷,戊二醛,N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸的酯，同型双功能亚胺酸酯,包括二琥珀酰亚胺酯诸如3,3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生化试剂诸如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙亚胺酸酯产生光激活的中间体，所述中间体能够在光的存在下形成交联。可选地，采用不溶于水的反应基质诸如在美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和 4,330,440(所有均通过引用整体地并入)中描述的cynomolgusogen溴化物-激活的糖类和反应底物进行蛋白固定化。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常分别脱酰胺基成为相应的谷氨酰基和天冬氨酰残基。可选地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺基。任一种形式的这些残基均落在本发明的范围内。
其他修饰作用包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化 (T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H. Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86[1983],通过引用整体地并入)，N-末端胺的乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
另外，如本领域技术人员要理解的，标记(包括荧光、酶、磁、放射性，等)均可以被添加至抗体(以及本发明的其他组合物)。
糖基化作用
另一种类型的共价修饰是糖基化改变。在另一个实施方案中，本文公开的抗体可以被修饰以包含一个或多个工程化糖型。“工程化糖型”当在本文中使用时意指被共价附接至抗体的糖组合物，其中所述糖组合物在化学上不同于亲代抗体的糖组合物。工程化糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或减小效应器功能。优选形式的工程化糖型是无岩藻糖基化，其已经显示与ADCC功能的增加相关，大概是通过与FcγRIIIa受体的较紧密结合。在此背景下，“无岩藻糖化 (afucosylation)”意指在宿主细胞中产生的大部分抗体基本上不含岩藻糖，例如90-95-98％的产生的抗体不具有相当量的岩藻糖作为抗体的糖部分的成分(通常附接在Fc区的N297处)。从功能上定义，无岩藻糖化(afucosylated)抗体通常表现出与FcγRIIIa受体的至少50％或更高的亲和力。
工程化糖型可以通过本领域中已知的多种方法产生(
Figure RE-GDA0002432561970000611
等人, 1999,NatBiotechnol 17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733-26740； Shinkawa等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473；US 6,602,684； USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1,所有均通过引用整体地并入；(
Figure RE-GDA0002432561970000612
technology[Biowa,Inc.,Princeton, NJ]；
Figure RE-GDA0002432561970000613
glycosylation engineering technology(糖基化工程技术)[Glycart BiotechnologyAG,Zürich,Switzerland])。这些技术中的许多基于控制与Fc区共价附接的岩藻糖化和/或平分型寡糖的水平，例如通过在多种生物体或细胞系中表达IgG，所述细胞是工程化的或其他的形式(例如Lec-13 CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞，通过调控参与糖基化途径的酶(例如FUT8[α1,6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII])，或通过在已经表达IgG后修饰一个或多个糖。例如，Seattle Genetics的“糖工程化抗体”或“SEA技术”通过添加修饰的糖来起作用，所述修饰的糖抑制生产过程中的岩藻糖化作用；参见例如20090317869,整体地通过引用并入本文。工程化糖型典型地是指不同的糖类或寡糖；因此抗体可以包括工程化糖型。
可选地，工程化糖型可以指包含不同的糖类或寡糖的IgG变体。如本领域中已知的，糖基化模式可以取决于蛋白的序列(例如，下面所讨论的，存在或不存在特殊的糖基化氨基酸残基)，或产生所述蛋白的宿主细胞或生物体两者。具体的表达系统在下面讨论。
多肽的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接是指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸,其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸，其是糖部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在形成了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向抗体添加糖基化位点方便地通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)来实现。所述改变也可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或被一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基置换来获得(对于O-连接的糖基化位点)。为了方便，优选地通过在DNA水平的变化来改变抗体氨基酸序列，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预先选择的碱基处突变使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
增加抗体上的糖部分的数目的另一种手段是通过糖苷与蛋白的化学或酶促偶联。这些程序是有利的，在于它们不需要在具有进行N- 或O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白。取决于所使用的偶联模式，一个或多个糖可以附接到(a)精氨酸和组氨酸,(b)游离的羧基,(c)游离的巯基诸如半胱氨酸的那些巯基，(d)游离的羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些羟基，(e)芳香族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法记述在WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306中，两者均通过引用整体地并入。
起始抗体上存在的糖类部分的去除(例如翻译后)可以通过化学或酶学方式完成。化学脱糖基化需要将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸，或等效的化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N- 乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖的裂解，同时保持多肽完整。化学脱糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys. 259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131描述，两者均通过引用整体地并入。多肽上的糖部分的酶促裂解可以通过使用多种内切- 和外切-糖苷酶来实现，如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol. 138:350所述，该文通过引用整体地并入。潜在糖基化位点处的糖基化作用可以通过使用化合物衣霉素来防止，如Duskin等人,1982,J. Biol.Chem.257:3105所述，该文通过引用整体地并入。衣霉素阻断蛋白-N-糖苷键的形成。
抗体的另一种类型的共价修饰包括将抗体连接至多种非蛋白性聚合物，包括但不限于，多种多元醇诸如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧化烯，以下面文献中给出的方式：例如，来自Nektar Therapeutics的 2005-2006PEG Catalog(可在Nektar网站处获得)，美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，所有均通过引用整体地并入。另外，如本领域中已知的，氨基酸置换可以在抗体内的多个位置中制成以促进聚合物诸如PEG的添加。参见，例如，美国公开号2005/0114037A1,通过引用整体地并入。
用于其他功能性的其他Fc变体
除了pI氨基酸变体以外，出于多种原因可以制备许多有用的Fc 氨基酸修饰，所述原因包括但不限于，改变与一个或多个FcγR受体的结合，改变与FcRn受体的结合，等。
因此，本发明的蛋白可以包含氨基酸修饰，包括本文所概述的异二聚体化变体，所述异二聚体化变体包括pI变体和位阻变体。每组变体可以独立地和任选地被任何特定的异二聚体蛋白包括或不包括。
FcγR变体
因此，可以制备许多有用的Fc置换以改变与一个或多个FcγR受体的结合。导致增加的结合以及减少的结合的置换可以是有用的。例如，已知与Fc RIIIa的结合增加通常导致增加的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞的裂解)。类似地，在一些情况下与FcγRIIb(抑制性受体)的结合减少也可以是有益的。在本发明中有用的氨基酸置换包括在下列文献中列举的那些氨基酸置换：USSN 11/124,620(特别是图41),11/174,287,11/396,495, 11/538,406,所有文献均特别地通过引用整体地并入本文并且特别地用于本文公开的变体。有用的具体变体包括但不限于236A,239D, 239E,332E,332D,239D/332E,267D,267E,328F,267E/328F, 236A/332E,239D/332E/330Y,239D,332E/330L,243A,243L,264A,264V 和299T。
另外，存在有其他的Fc置换，其可用于增加与FcRn受体的结合并增加血清半衰期，如在USSN 12/341,769中具体公开的，该专利通过引用整体地并入本文，所述Fc置换包括但不限于434S,434A,428L, 308F,259I,428L/434S,259I/308F,436I/428L,436I或V/434S,436V/428L和259I/308F/428L。
接头
根据需要本发明任选地提供了接头，例如，在添加附加的抗原结合位点时，如例如在图2中所绘，其中分子的“另一端”含有附加的抗原结合成分。另外，如下面所概述的，接头还任选地用于抗体药物缀合物(ADC)系统中。当用来连接中央mAb-Fv构建体的成分时，接头通常是包含由肽键连接的两个或多个氨基酸残基的多肽，并且用来连接本发明的一个或多个成分。这样的接头多肽在本领域中是公知的(参见例如，Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人(1994)Structure 2:1121-1123)。在本文所述的一些实施方案中发现多种接头可以使用。如本领域技术人员要理解的，有至少三种不同类型的接头用于本发明中。
在本文中“接头”也称作“接头序列”,“间隔区”,“栓系序列”或其语法上的等效形式。同-或异-双功能接头是为人熟知的(参见，1994 Pierce Chemical Company catalog,technical section on cross-linkers(对交联剂的技术章节),第155-200页,通过引用整体地并入)。可以使用许多策略来将分子共价连接在一起。这些策略包括，但不限于蛋白或蛋白结构域的N-和C-末端之间的多肽连接，经由二硫键的连接，以及经由化学交联试剂的连接。在此实施方案的一个方面，接头是肽键，通过重组技术或肽合成产生。接头肽可以主要地包含下列的氨基酸残基：Gly,Ser,Ala或Thr。接头肽应当具有足以连接两个分子使得它们相对于彼此呈现正确的构型从而使它们保留所需的活性的长度。在一个实施方案中，接头的长度为约1-50个氨基酸，优选长度为约1-30个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为 1-20个氨基酸的接头。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n,(GSGGS)n,(GGGGS)n,和(GGGS)n,其中n是至少1的整数，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物，和其他柔性接头。可选地，多种非蛋白性聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可以用作接头。
其他连接序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域但不是 CL/CH1结构域的所有残基的任何序列；例如，CL/CH1结构域的前 5-12个氨基酸残基。接头可以来源于免疫球蛋白轻链,例如Cκ或Cλ。接头可以来源于任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1,Cγ2, Cγ3,Cγ4,Cα1,Cα2,Cδ,Cε,和Cμ。连接序列也可以来源于其他蛋白诸如Ig-样蛋白(例如TCR,FcR,KIR),铰链区来源的序列和来自其他蛋白的其他天然序列。
抗体-药物缀合物
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体与药物缀合以形成抗体抗体-药物缀合物(ADC)。通常，ADC用于肿瘤应用中，其中使用抗体-药物缀合物用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂允许将药物部分靶向递送至肿瘤，这可以允许较高的功效，较低的毒性，等。对此技术的综述见Ducry等人,Bioconjugate Chem.,21:5-13(2010), Carter等人,Cancer J.14(3):154(2008)和Senter,Current Opin. Chem.Biol.13:235-244(2009),所有均通过引用整体地并入本文。
因此本发明提供了与药物缀合的多特异性抗体。通常，缀合通过与抗体的共价连接来完成，如下面进一步描述的，并且通常依赖于接头，经常是肽键(如下面所述，其可以被设计成在靶位点处对蛋白酶的裂解敏感或不敏感)。另外，如上所述，接头-药物单位(LU-D)的连接可以通过附接至抗体内的半胱氨酸来完成。如本领域技术人员要理解的，每个抗体的药物部分的数目可以发生变化，取决于反应条件，并且可以在1:1-10:1药物:抗体之间变化。如本领域技术人员要理解的，实际数目是平均值。
因此本发明提供了与药物缀合的多特异性抗体。如下所述，ADC 的药物可以是任何数目的药剂，包括但不限于提供细胞毒性剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的有酶活性的毒素，或其片段)，或放射性同位素(即，放射性缀合物)。在其他实施方案中，本发明还提供了使用ADC的方法。
用于本发明中的药物包括细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的那些细胞毒性药物。此类药物包括，通常，DNA损伤剂，抗代谢药，天然产品及其类似物。示例性类别的细胞毒性剂包括酶抑制剂诸如二氢叶酸还原酶抑制剂，和胸苷酸合成酶抑制剂，DNA嵌入剂，DNA切割剂，拓扑异构酶抑制剂，蒽环霉素家族药物，长春花属药物，丝裂霉素，博来霉素，细胞毒性核苷，蝶啶家族药物，二炔剂(diynenes), 鬼臼霉素，多拉司他汀，美坦生类化合物，分化诱导剂和紫杉醇。
这些类型的成员包括，例如，氨甲喋呤，甲氨蝶呤,二氯氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，阿糖胞苷，美法仑，洛诺生，异长春碱(leurosideine)，放线菌素，柔红霉素，阿霉素，丝裂霉素C，丝裂霉素A，caminomycin，氨基蝶呤，太利苏霉素，鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物诸如依托泊苷或依托泊苷磷酸酯，长春碱，长春新碱，长春地辛，紫杉烷类包括紫杉醇、泰素帝视黄酸，丁酸，N8-乙酰精胺，喜树碱，卡奇霉素，埃斯波霉素，ene-diynes，倍癌霉素A(duocarmycin A)，倍癌霉素SA，卡奇霉素，喜树碱，美坦生类化合物(包括 DM1)，单甲基阿里他汀E(monomethylauristatin E)(MMAE)，单甲基阿里他汀F(MMAF)，和美坦生类化合物(DM4)以及它们的类似物。
毒素可以用作抗体-毒素缀合物并且包括细菌毒素诸如白喉毒素，植物毒素诸如蓖麻毒素，小分子毒素诸如格尔德毒素(Mandler等人 (2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000) Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002) Bioconjugate Chem.13:786-791),美坦生类化合物(EP 1391213；Liu 等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)，和卡奇霉素 (Lode等人(1998)CancerRes.58:2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可以通过下列机制发挥它们的细胞毒性和细胞抑制效应，所述机制包括微管蛋白结合，DNA结合或拓扑异构酶抑制。
考虑多特异性抗体和一个或多个小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素诸如美坦生类化合物，海兔霉素，阿里他汀，单端孢霉烯，卡奇霉素和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
美坦生类化合物
适合用作美坦生类化合物药物部分的美登素化合物在本领域中是为人所熟知的，并且可以依照已知的方法从天然来源分离，使用基因工程技术制备(参见Yu等人(2002)PNAS 99:7968-7973)，或依照已知方法合成制备的美登醇和美登醇类似物。如下所述，可以通过加入用于缀合至抗体的功能活性基团诸如硫醇基或胺基来修饰药物。
示例性的美坦生类化合物药物部分包括具有修饰的芳香环的那些，诸如：C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基) +/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌属脱甲基或使用LAH脱氯来制备)；和C-20-脱甲氧基,C-20- 酰氧基(--OCOR),+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰基氯酰化来制备)和具有在其他位置的修饰的那些药物。
示例性的美坦生类化合物药物部分还包括具有诸如下列的修饰的那些药物：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5 的反应制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利号 4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2Oac)(美国专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号 4,364,866)(通过链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号 4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudlflora)分离)；C-18-N- 脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌属对美登醇脱甲基制备)；和4,5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
有特殊用途的是DM1(公开在美国专利号5,208,020中，通过引用并入)和DM4(公开在美国专利号7,276,497,通过引用并入)。还参见 5,416,064,WO/01/24763,7,303,749,7,601,354,USSN 12/631,508, WO02/098883,6,441,163,7,368,565,WO02/16368和WO04/1033272中的大量其他美坦生类化合物衍生物和方法,所有均特别地通过引用整体地并入。
含有美坦生类化合物的ADC，其制备方法以及它们的治疗用途公开在，例如，美国专利号5,208,020；5,416,064；6,441,163和欧洲专利 EP 0 425 235 B1，其公开内容特别地通过引用合并于此。Liu等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了含有连接到针对人结肠癌的单克隆抗体C242的被称为DM1的美坦生类化合物的ADC。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度的细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中显示抗肿瘤活性。
Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)描述了ADC，其中美坦生类化合物经由二硫化物接头缀合至结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7，或缀合至结合HER-2/neu癌基因的另一鼠单克隆抗体TA.1。在人乳腺癌细胞系SK-BR-3(其每个细胞表达3x105HER-2 表面抗原)上在体外测试了TA.1-美坦生类化合物缀合物的细胞毒性。药物缀合物所实现的细胞毒性程度类似于游离美坦生类化合物药物，可以通过增加每个抗体分子的美坦生类化合物分子的数目来增加细胞毒性程度。A7-美坦生类化合物缀合物在小鼠中显示低的全身细胞毒性。
阿里他汀和多拉司他汀
在一些实施方案中，ADC包含缀合至多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物，阿里他汀(美国专利号5,635,483；5,780,588)的多特异性抗体。已经显示多拉司他汀和阿里他汀干扰微管动力学,GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents和 Chemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌活性(美国专利号 5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或阿里他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接到抗体(WO 02/088172)。
示例性的阿里他汀实施方案包括N-末端连接的单甲基阿里他汀药物部分DE和DF,公开在“Senter等人，Proceedings of the American Association for CancerResearch,Volume 45,Abstract Number 623, presented Mar.28,2004且记述在美国专利公开号2005/0238648中，其公开内容特别地通过引用整体地并入。
一个示例性阿里他汀实施方案是MMAE(参见美国专利号 6,884,869，其特别地通过引用整体地并入)。
另一示例性阿里他汀实施方案是MMAF(参见US 2005/0238649, 5,767,237和6,124,431,特别地通过引用整体地并入)。
包含MMAE或MMAF以及多种接头成分(本文进一步描述)的其他示例性实施方案具有下列的结构和缩写(其中Ab意指抗体且p为1- 约8):
典型地，可以通过形成两个或多个氨基酸和/或肽片段之间的肽键来制备基于肽的药物部分。这种肽键可以，例如，依照在肽化学领域中众所周知的液相合成法(参见E.Schroder和K.Lubke,“The Peptides”,volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)制备。可以依照下面的方法制备阿里他汀/多拉司他汀药物部分：美国专利号5,635,483；美国专利号5,780,588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc. 111:5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277； Pettit,G.R.,等人Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem. Soc.Perkin Trans.1 5:859-863；和Doronina(2003)NatBiotechnol 21(7):778-784。
卡奇霉素
在其他实施方案中，ADC包含缀合到一个或多个卡奇霉素分子的本发明的抗体。例如，Mylotarg是第一个市售ADC药物，且利用卡奇霉素γ1作为有效载荷(参见美国专利号4,970,198,通过引用整体地并入)。其他的卡奇霉素衍生物记述在美国专利号5,264,586,5,384,412, 5,550,246,5,739,116,5,773,001,5,767,285和5,877,296中，所有专利均特别地通过引用并入。卡奇霉素家族抗生素能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。对于卡奇霉素家族的缀合物的制备，参见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710, 5,773,001,5,877,296(全部属于American Cyanamid Company)。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于,γ1I,α2I,α2I,N-乙酰基 -γ1I,PSAG和θI1(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342 (1993),Lode等人,Cancer Research58:2925-2928(1998)和上述属于 American Cyanamid的美国专利)。另一个抗体可以缀合的抗肿瘤药是 QFA，其是抗叶酸剂。卡奇霉素和QFA两者都具有细胞内作用位点并且不容易跨过质膜。因此，通过抗体介导的内化作用对这些药剂的细胞摄取极大地增强了它们的细胞毒效应。
倍癌霉素
CC-1065(参见4,169,888,通过引用并入)和倍癌霉素是在ADC中使用的抗肿瘤抗生素家族成员。这些抗生素似乎通过在小沟中腺苷的 N3处序列选择性地烷基化DNA起作用，其启动了导致凋亡的级联事件。
倍癌霉素的重要成员包括倍癌霉素A(美国专利号4,923,990,通过引用并入)和倍癌霉素SA(美国专利号5,101,038,通过引用并入)，和如美国专利号7,517,903,7,691,962,5,101,038；5,641,780；5,187,186； 5,070,092；5,070,092；5,641,780；5,101,038；5,084,468,5,475,092, 5,585,499,5,846,545,WO2007/089149,WO2009/017394A1,5,703,080,6,989,452,7,087,600,7,129,261,7,498,302,和7,507,420中所述的大量类似物，所有文献特别地通过引用并入。
其他细胞毒性剂
可以缀合至本发明的抗体的其他抗肿瘤剂包括BCNU,链脲佐菌素,长春新碱和5-氟尿嘧啶,在美国专利号5,053,394,5,770,710中所述的总称为LL-E33288复合物的药剂家族，以及埃斯波霉素(美国专利号5,877,296)。
可以使用的有酶活性的毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌),蓖麻毒素A 链,相思豆毒素A链,蒴莲根毒素A链,α-帚曲霉素,油桐蛋白,石竹素蛋白,商陆蛋白(PAPI,PAPII和PAP-S),苦瓜抑制剂,泻果素,巴豆毒素,肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂,白树毒素,丝裂吉霉素(mitogellin),局限曲菌素,酚霉素,依诺霉素和单端孢霉烯。参见，例如，公开于1993年10月28日的WO 93/21232。
本发明进一步考虑在抗体和具有溶核活性的化合物之间形成的 ADC(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNase)。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可以包含高度放射性的原子。可获得多种放射性同位素用于产生放射性缀合抗体。实例包括At211,I131, I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212以及Lu的放射性同位素。
放射性或其他标记可以以已知的方式掺入至缀合物中。例如，肽可以生物合成或可以通过使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体包括，例如，氟-19代替氢。标记诸如Tc99m 或I123,Re186,Re188和In111可以经由肽中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以经由赖氨酸残基附接。IODOGEN法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可以用来掺入碘-123。“Monoclonal Antibodiesin Immunoscintigraphy(免疫闪烁成像中的单克隆抗体)”(Chatal,CRC Press 1989)详细地描述了其他方法。
对于包含多种抗体的组合物，载药量由p表示，每个抗体的药物分子的平均数目。载药量可以为1-20药物(D)/抗体。在缀合反应的制备中每个抗体的药物的平均数目可以通过常规的手段诸如质谱法、 ELISA测定和HPLC来表征。还可以测定抗体-药物-缀合物就p而言的数量分布。
在一些情况下，可以通过诸如反相HPLC或电泳的方式实现均一抗体-药物-缀合物(其中p是来自具有其他载药量的抗体-药物-缀合物的特定值)的分离、纯化和表征。在示例性实施方案中，p是2,3,4,5, 6,7,或8或其分数。
抗体-药物缀合物化合物的产生可以通过技术人员知晓的任何技术来实现。简言之，抗体-药物缀合物化合物可以包括作为抗体单元的多特异性抗体，药物和任选地连接药物和结合剂的接头。
可利用许多不同的反应用于药物和/或接头与结合剂的共价连接。这可以通过结合剂(例如，抗体分子)的氨基酸残基的反应来实现，包括赖氨酸的胺基，谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团，半胱氨酸的巯基和芳族氨基酸的多个部分。常用的共价连接的非特异性方法是碳二亚胺反应以将化合物的羧基(或氨基)连接到抗体的氨基(或羧基)上。另外地，双功能剂诸如二醛或亚胺酸酯已经被用来将化合物的氨基连接至抗体分子的氨基。
对于药物与结合剂的连接还可用的是席夫碱反应。此方法包括含有二醇或羟基的药物的高碘酸氧化，由此形成醛，醛然后与结合剂反应。通过与结合剂的氨基形成席夫碱发生连接。也可以使用异硫氰酸酯作为将药物共价连接至结合剂的偶联剂。其他技术是技术人员已知的并且在本发明的范围内。
在一些实施方案中，作为接头的前体的中间体与药物在适当条件下反应。在其他实施方案中，在药物和/或中间体上使用反应基团。药物和中间体之间的反应产物、或衍生化的药物随后与本发明的多特异性抗体在适当的条件下反应。
要理解也可以对所需化合物进行化学修饰以便使该化合物的反应更便利地用于制备本发明的缀合物的目的。例如官能团例如胺，羟基或巯基，可以在对药物的活性或其他性质具有最小或可接受的作用的位置处附接到药物。
ADC接头单元
典型地，抗体-药物缀合物化合物包含药物单元和抗体单元之间的接头单元。在一些实施方案中，接头在细胞内或细胞外条件下是可裂解的，使得在合适的环境中接头的裂解将药物单元从抗体释放。例如，分泌某些蛋白酶的实体肿瘤可以充当可裂解接头的靶标；在其他实施方案中，其是被利用的细胞内蛋白酶。还在其他实施方案中，接头单元是不可裂解的，且例如，药物通过溶酶体内的抗体降解而被释放。
在一些实施方案中，接头可被存在于细胞内环境中的裂解剂(例如，溶酶体或内体或胞膜窖内)裂解。接头可以是，例如，肽基接头，所述肽基接头被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)裂解。在一些实施方案中，肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长或更长。
裂解剂可以包括，但不限于，组织蛋白酶B和D和纤溶酶，所有这些均已知水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内释放(参见，例如，Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。可以使用可被存在于表达CD38的细胞中的酶裂解的肽基接头，例如，可被硫醇依赖性蛋白酶，组织蛋白酶-B(其在癌组织中高度表达)裂解的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头(SEQ ID NO:X))。此类接头的其他实例例如记述在美国专利号6,214,345 中，其通过引用整体地并入并用于所有目的。
在一些实施方案中，可被细胞内蛋白酶裂解的肽基接头是Val-Cit 接头或Phe-Lys接头(参见，例如，美国专利号6,214,345,其描述了具有val-cit接头的阿霉素的合成)。
在其他实施方案中，可裂解的接头是pH-敏感性的，即，在特定 pH值时对水解敏感。典型地，pH-敏感性接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(例如，腙,缩氨基脲,缩氨基硫脲,顺式-乌头酰胺，原酸酯,乙缩醛,缩酮，等等)。(参见，例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和 Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人,1989, Biol.Chem.264:14653-14661.)这样的接头在中性pH条件下相对稳定，诸如在血液中的那些条件，但在低于pH 5.5或5.0是不稳定的，这大致是溶酶体的pH。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(诸如，例如，经由酰腙键连接到治疗剂的硫醚(参见，例如，美国专利号5,622,929)。
还在其他实施方案中，接头在还原条件下是可裂解的(例如，二硫化物接头)。许多二硫化物接头在本领域中是已知的，包括，例如，可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯),SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯),SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-,SPDB和SMPT形成的那些。(参见，例如，Thorpe 等人,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987.还参见美国专利号4,880,935.)
在其他实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等人,1995, AnticancerRes.15:1387-93),马来酰亚胺基苯甲酰接头(Lau等人, 1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
还在其他实施方案中，接头单元是不可裂解的且药物通过抗体降解而释放。(参见美国公开号2005/0238649，其通过引用整体地并入本文并用于所有目的)。
在许多实施方案中，接头是自脱落的(self-immolative)。当在本文中使用时，术语“自脱落间隔区”是指能够将两个间隔的化学部分共价连接在一起成为稳定的三体分子的双功能化学部分。如果其与第一部分的键被裂解，则其自发地与第二化学部分分离。参见例如，WO 2007059404A2,WO06110476A2,WO05112919A2,WO2010/062171, WO09/017394,WO07/089149,WO 07/018431,WO04/043493和 WO02/083180,它们针对药物-可裂解的底物缀合物，其中药物和可裂解的底物任选地通过自脱落接头连接，并且所有专利申请特别地通过引用并入。
接头经常对细胞外环境基本上不敏感。当在本文中使用时，在接头的背景下“对细胞外环境基本上不敏感”意指在当抗体-药物缀合物化合物存在于细胞外环境(例如，在血浆中)中时，抗体-药物缀合物化合物的样品中不超过约20％,15％,10％,5％,3％或不超过约1％的接头被裂解。
可以确定接头是否对细胞外环境基本上不敏感，例如，通过将血浆与抗体-药物缀合物化合物孵育预定的时期(例如，2,4,8,16或24 小时)，然后定量存在于血浆中的游离药物的量。
在其他不相互排斥的实施方案中，接头促进细胞内化。在某些实施方案中，当与治疗剂(即，在如本文所述的抗体-药物缀合物化合物的接头-治疗剂部分的背景中)缀合时接头促进细胞内化。还在其他实施方案中，当与阿里他汀化合物和本发明的多特异性抗体两者缀合时接头促进细胞内化。
本发明的组合物和方法可以使用的多种示例性接头记述在WO 2004-010957,美国公开号2006/0074008,美国公开号20050238649,和美国公开号2006/0024317中(每一篇通过引用整体地并入本文并用于所有目的)。
载药量
载药量由p表示，并且是分子中每个抗体的药物部分的平均数目。载药量(“p”)可以为每个抗体1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20或更多个部分(D),尽管平均数目常常是分数或小数。通常，1-4的载药量常常是有用的，且1-2也是有用的。本发明的 ADC包括与1-20的范围的药物部分缀合的抗体的集合。在从缀合反应制备ADC中每个抗体的药物部分的平均数目可以通过常规的手段诸如质谱法和ELISA测定表征。
还可以测定ADC就p而言的数量分布。在一些情况下，可以通过诸如电泳的方式实现均一ADC(其中p是来自具有其他载药量的 ADC的特定值)的分离、纯化和表征。
对于一些抗体-药物缀合物，p可以受到抗体上连接位点数目的限制。例如，在连接为半胱氨酸硫醇的情况下，如上面示例性实施方案，抗体可以具有仅一个或数个半胱氨酸硫醇基，或可以具有仅一个或数个充分反应性的硫醇基，接头可以通过所述硫醇基连接。在某些实施方案中，较高的载药量,例如p>5,可以导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明的ADC的载药量的范围为1-约8；约2-约6；约3-约5；约3-约4；约 3.1-约3.9；约3.2-约3.8；约3.2-约3.7；约3.2-约3.6；约3.3-约3.8；或约3.3-约3.7。实际上，已经显示对于某些ADC，每个抗体的药物部分的最佳比率可以小于8，并且可以为约2-约5。参见US 2005-0238649 A1(通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，在缀合反应期间小于理论最大值的药物部分缀合至抗体。抗体可以包含，例如，不与药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基，如下面所讨论的那样。通常，抗体不含有许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，所述半胱氨酸硫醇基可以连接到药物部分；实际上抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基残基作为二硫键存在。在某些实施方案中，抗体可以用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)在部分或全部还原条件下还原以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，使抗体接受变性条件以暴露反应性亲核基团诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载量(药物/抗体比率)可以以不同的方式控制，例如，通过： (i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)对半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件，(iv)通过重组技术改造抗体的氨基酸序列使得改变半胱氨酸残基的数目和位置以控制接头-药物连接的数目和/或位置(诸如如本文公开那样制备的和WO2006/034488(通过引用整体地并入本文)中的 thioMab或thioFab)。
要理解在多于一个亲核基团与药物-接头中间体或连接试剂反应然后与药物部分试剂反应的情况下，则得到的产物是ADC化合物的混合物，其中分布有与抗体连接的一个或多个药物部分。每个抗体的药物的平均数目可以由混合物通过双重ELISA抗体测定来计算，该测定对抗体特异且对药物特异。单个ADC分子可以在混合物中通过质谱法鉴定并通过HPLC，例如，疏水相互作用色谱法分离。
在一些实施方案中，具有单一载荷值的均一ADC可以从缀合混合物中通过电泳或色谱法分离。
测定ADC的细胞毒性效应的方法
测定药物或抗体-药物缀合物是否对细胞发挥细胞抑制和/或细胞毒性效应的方法是已知的。通常，抗体药物缀合物的细胞毒性或细胞抑制活性可以通过下列方式测量：使表达抗体药物缀合物的靶蛋白的哺乳动物细胞暴露在细胞培养基中；培养所述细胞约6小时-约5天的时期；和测量细胞活力。基于细胞的体外测定可以用来测量活力(增殖)、细胞毒性和抗体药物缀合物对凋亡的诱导(半胱天冬酶激活)。
为了测定抗体药物缀合物是否发挥细胞抑制效应，可以使用胸苷掺入测定。例如，表达靶抗原的癌细胞可以以所铺的96孔的5,000个细胞/孔的密度培养72小时的时期并且在72小时时期的最后8小时期间暴露于0.5μCi的3H-胸苷。在存在和缺少抗体药物缀合物的情况下测量培养物的细胞中3H-胸苷的掺入。
对于测定细胞毒性，可以测量坏死或凋亡(程序性细胞死亡)。坏死典型地伴有质膜的通透性增加；细胞肿胀和质膜破坏。凋亡典型地通过质膜出泡、胞质浓缩和内源性核酸内切酶的激活。对癌细胞上的这些作用中的任一项的测定表明在癌症的治疗中抗体药物缀合物是有用的。
可以通过在细胞中测定染料的摄取来测量细胞活力，所述染料诸如中性红，台盼蓝或ALAMARTM蓝(参见，例如，Page等人,1993,Intl. J.Oncology 3:473-476)。在这样的测定中，细胞在含有染料的培养基中孵育，洗涤细胞，并通过分光光度法测量反映对染料的细胞摄取的剩余染料。也可以使用蛋白结合染料磺基罗丹明B(SRB)来测量细胞毒性(Skehan等人,1990,J.Natl.Cancer Inst.82:1107-12)。
可选地，在通过检测活细胞而不是死细胞的用于哺乳动物存活和增殖的定量比色测定中使用四氮唑盐，诸如MTT(参见，例如， Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65:55-63)。
凋亡可以通过测量例如，DNA断裂来定量。可获得市售的光度测量法用于体外定量测定DNA断裂。这种测定的实例，包括TUNEL(其检测标记的核苷酸在断裂的DNA中的掺入)和基于ELISA的测定，记述在Biochemica,1999,no.2,pp.34-37(Roche MolecularBiochemicals)。
凋亡还可以通过测量细胞中的形态学变化来测定。例如，如同坏死一样，可以通过测量某些染料(例如，荧光染料诸如，例如，吖啶橙或溴化乙锭)的摄取来测定质膜整合性的丧失。一种测量凋亡细胞数目的方法已由Duke和Cohen,Current Protocols inImmunology (Coligan等人编辑,1992,pp.3.17.1-3.17.16)描述。细胞还可以用DNA 染料(例如，吖啶橙，溴化乙锭或碘化丙啶)标记并观察细胞的染色质浓缩和沿内部核膜的边集。可以测量以确定凋亡的其他形态学变化包括，例如，胞质浓缩，增加的膜出泡和细胞皱缩。
凋亡细胞的存在可以在培养物的贴壁区室和“漂浮”区室两者中测量。例如，可以通过去除上清液，胰蛋白酶消化贴壁细胞收集两个区室，在离心洗涤步骤(例如，在2000rpm10分钟)后合并制剂，并检测凋亡(例如，通过测量DNA断裂)。(参见，例如，Piazza等人,1995, Cancer Research 55:3110-16)。
在体内，本发明的多特异性抗体的治疗性组合物的作用可以在合适的动物模型中进行评价。例如，可以使用异种癌症模型，其中癌症外植体或经传代的异种组织被引入至免疫缺陷动物，如裸鼠或SCID 小鼠(Klein等人,1997,Nature Medicine 3:402-408)。可以使用测量对肿瘤形成的抑制、肿瘤消退或转移等的测定来测量功效。
在实施前述方法中使用的治疗性组合物可以被配制成包含适合用于所需的递送方法的载体的药用组合物。合适的载体包括当与治疗性组合物组合时保留所述治疗性组合物的抗肿瘤功能并且通常不与患者的免疫系统反应的任何物质。实例包括，但不限于，许多标准药用载体中的任一种诸如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液，抑菌水等(参见，通常，Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th Edition,A.Osal.,Ed., 1980)。
用于体内给药的抗体组合物
通过将具有所需程度的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980])混合制备冻干制剂或水溶液的形式的根据本发明使用的抗体的制剂用于保存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受者无毒性，并且包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵,苄索氯铵；苯酚,丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如羟苯甲酯或羟苯丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约 10个残基)多肽；蛋白诸如血清白蛋白,明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺, 组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和 /或非离子表面活性剂诸如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇 (PEG)。
本文中的制剂还可以根据所治疗的特定适应症的需要含有超过一种的活性化合物，优选不会负面地影响彼此的具有互补活性的那些。例如，提供具有其他特异性的抗体可以是合乎需要的。可选地，或另外地，所述组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/ 或小分子拮抗剂。这样的分子合适地以有效用于期望目的的量存在于组合中。
活性成分也可以装填在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别处于胶体药物递送系统(例如，脂质体,白蛋白微球,微乳液,纳米粒子和纳米胶囊)或在粗乳液中。这样的技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
要用于体内给药的制剂应当是无菌的，或几乎无菌。这容易通过经过无菌滤膜过滤来实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质为成形制品的形式,例如膜，或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2- 羟基乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号 3,773,919),L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物,不可降解的乙烯- 乙酸乙烯酯,可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，和聚 -D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够使分子释放超过100天，而某些水凝胶使蛋白释放持续较短的时期。
当包封的抗体长时间留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的水分而变性或聚集，导致生物活性的丧失和可能的免疫原性变化。可以设计合理的策略用于稳定化，取决于所涉及的机制。例如，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫化物互换形成分子间S—S键，则可以通过修饰巯基残基，从酸性溶液中冻干，控制含水量，使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
给药方式
依照已知的方法，诸如作为推注或通过在一段时间内连续输注的静脉内给药，通过肌内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径，将本发明的抗体和化疗剂施用于受试者。优选抗体的静脉内或皮下给药。
治疗方式
在本发明的方法中，使用疗法来提供关于疾病或病况的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”意指疾病或病况的改善，和/或与疾病或病况相关的症状的改善。例如，阳性治疗反应将指疾病的下列改善中的一种或多种：(1)肿瘤细胞数目的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)肿瘤细胞存活的抑制；(5)肿瘤生长的抑制(即，一定程度的延缓，优选停止)；(6)患者存活率升高；和(7)与疾病或病况相关的一个或多个症状的一些缓解。
在任何给定的疾病或病况中阳性治疗反应可以通过对该疾病或病况特异的标准化反应标准来确定。肿瘤反应可以使用筛选技术评估肿瘤形态学的变化(即，总肿瘤负荷，肿瘤尺寸，等)，所述筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描，x-射线成像，计算机断层(CT)扫描,骨扫描成像,内窥镜和肿瘤活检采样包括骨髓穿刺(BMA)和循环肿瘤细胞计数。
除了这些阳性治疗反应以外，经历疗法的受试者可以体验到与疾病相关的症状改善的有益作用。
因此，对于B细胞肿瘤，受试者可以体验到所谓B症状的减少，所述B症状即盗汗、发热、体重减轻和/或荨麻疹。对于癌前病变，利用多特异性治疗剂的疗法可以阻断相关恶性疾病的发生和/或延长发生相关恶性疾病之前的时间，例如，在患有意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)的受试者中发生多发性骨髓瘤。
疾病的改善可以表征为完全反应。“完全反应”意指缺少临床上可检测到的疾病，同时任何之前的异常射线照相研究、骨髓、和脑脊液 (CSF)或在骨髓瘤的情况下异常单克隆蛋白的正常化。
这样的反应可以在根据本发明的方法治疗后持续至少4-8周，或有时6-8周。可选地，疾病的改善可以归类为部分反应。“部分反应”意指在没有新病变的情况下，在所有可测量到的肿瘤负荷(即，在受试者中存在的恶性细胞数，或测量到的肿瘤团块体积或异常单克隆蛋白的数量)减少至少约50％，其可以持续4-8周，或6-8周。
根据本发明的治疗包括使用“治疗有效量”的药物。“治疗有效量”是指在所需要的剂量和持续时期下，有效达到所需的治疗效果所需的量。
治疗有效量可以根据许多因素发生变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及药物在个体中发挥所需反应的能力。治疗有效量也是治疗有益效应超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应的量。
对于肿瘤疗法的“治疗有效量”也可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。化合物抑制癌症的能力可以在预测在人类肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评价。
可选地，组合物的此性质可以通过技术人员已知的体外测定检验化合物抑制细胞生长或诱导凋亡的能力来评价。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤尺寸，或以其他的方式减轻受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如下列的因素确定这样的量：受试者的尺寸、受试者症状的严重性和特定的组成或所选择的给药途径。
调整用药方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，如通过治疗情况的紧急状况所指示，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分次剂量，或剂量可以成比例地减小或增加。可以以剂量单位形式配制胃肠外组合物以便于给药和剂量的均一性。当在本文中使用时，剂量单位形式是指适合作为用于被治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物以及所需的药用载体。
通过下列因素且直接依赖于下列因素书写本发明的剂量单位形式的说明书：(a)活性化合物的独特特性以及要达到的特定疗效，和(b) 在本领域中调配这样的活性化合物用于治疗个体中的敏感性所固有的限制。
对于本发明中使用的多特异性抗体的有效剂量和用药方案取决于要治疗的疾病或病况，并且可以由本领域技术人员来确定。
本发明中使用的多特异性抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，诸如约0.1-10mg/kg,例如约0.5,约诸如0.3,约1，或约3mg/kg。在另一个实施方案中，抗体以1mg/kg以上的剂量，诸如1-20mg/kg的剂量,例如5-20mg/kg的剂量，例如8mg/kg的剂量给药。
具有本领域普通技能的医疗专业人员可以容易地确定和开出所需的药用组合物的有效量。例如，临床医生或兽医可以以低于达到所需的疗效所需水平的水平开始药用组合物中采用的药物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需的效应。
在一个实施方案中，多特异性抗体通过输注以10-500mg/kg诸如200-400mg/kg的每周剂量给药。这样的给药可以重复，例如，1-8次，诸如3-5次。可以在2-24小时，诸如2-12小时的时期内通过连续输注进行给药。
在一个实施方案中，如果需要减小副作用包括毒性，多特异性抗体通过在长的时期内缓慢地连续输注来给药，所述长的时期诸如超过 24小时。
在一个实施方案中，多特异性抗体以250mg-2000mg，诸如例如 300mg,500mg,700mg,1000mg,1500mg或2000mg的每周剂量给药至多8次，诸如4-6次。所述给药可以通过在2-24小时，诸如2-12 小时的时期内通过连续输注进行。这样的方案可以根据需要重复一次或多次，例如，在6个月或12个月后。在给药后可以通过例如采集生物样品并使用靶向多特异性抗体的抗原结合区的抗独特型抗体通过测量血液中本发明的化合物的量来确定或调整剂量。
在进一步的实施方案中，多特异性抗体一周给药一次持续2-12周，诸如3-10周，诸如4-8周。
在一个实施方案中，多特异性抗体通过维持疗法给药，诸如，例如，一周一次持续6个月或更长的时期。
在一个实施方案中，多特异性抗体通过一定的方案给药，所述方案包括一次输注多特异性抗体，接着输注与放射性同位素缀合的多特异性抗体。该方案可以重复，例如，7-9天后。
作为非限制性实例，根据本发明的治疗可以作为抗体的每天剂量以每天约0.1-100mg/kg，诸如0.5,0.9,1.0,1.1,1.5,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,40,45,50,60,70,80,90或100mg/kg的量提供，在开始治疗后1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40天中的至少一个，或可选地，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19或20周中的至少一个，或其任意组合时，使用单次或每24、12、8、 6、4或2小时一次的分次剂量，或其任意组合。
在一些实施方案中，其多特异性抗体分子与一种或多种其他的治疗剂组合使用，所述其他的治疗剂例如是化疗剂。DNA损伤化疗剂的非限制性实例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康，拓扑替康，喜树碱及其类似物或代谢物，和阿霉素)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊甙，替尼泊甙，和柔红霉素)；烷化剂(例如，马法兰，苯丁酸氮芥，白消安，塞替派，异环磷酰胺，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲佐菌素，氮烯咪胺，氨甲喋呤，丝裂霉素C，和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如，顺铂，奥沙利铂，和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基生成剂诸如博莱霉素；和核苷类似物(例如，5-氟尿嘧啶，卡培他滨，吉西他滨，氟达拉滨，阿糖胞苷，巯嘌呤，鸟嘌呤，喷司他丁，和羟基脲)。
破坏细胞复制的化疗剂包括：紫杉醇，多西他赛和相关类似物；长春新碱，长春碱，和相关类似物；沙利度胺，来那度胺，和相关类似物(例如，CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)； NF-κB抑制剂，包括IκB激酶抑制剂；结合于在癌症中过表达的蛋白并且因此下调细胞复制的抗体(例如，曲妥珠单抗，利妥昔单抗，西妥昔单抗和贝伐珠单抗；和已知在癌症中上调、过表达或激活的蛋白或酶(它们的抑制下调细胞复制)的其他抑制剂。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以在利用
Figure RE-GDA0002432561970000851
(硼替佐米)治疗之前、同时或之后使用。
所有引用的文献均特别地通过引用整体地并入本文。
尽管上面已经描述了本发明的特定实施方案用于举例说明的目的，但本领域技术人员要理解的是在不偏离如所附的权利要求所述的本发明的前提下可以对细节作出大量的变化。
实施例
下面提供实施例以举例说明本发明。这些实施例不意在将本发明限于任何特定的应用或工作原理。对于在本发明中讨论的所有恒定区位置，编号规则依照如Kabat中的EU索引(Kabat等人,1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,通过引用整体地并入)。抗体领域中的技术人员会理解由在免疫球蛋白序列的特定区域中的非顺序性编号构成的这种惯例能够标准化地参照免疫球蛋白家族中的保守位置。因此，如由EU索引定义的任何给定的免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序性序列。
实施例1.减小pI的非天然电荷置换的设计
通过在恒定结构域中改造置换利用较低的pI修饰抗体恒定链。减小的pI可以通过将碱性氨基酸(K或R)置换为酸性氨基酸(D或E)来改造，其导致pI的最大减小。碱性氨基酸至中性氨基酸以及中性氨基酸至酸性氨基酸的突变也将导致pI的减小。氨基酸pK值的列表可见 Bjellqvist等人,1994,Electrophoresis 15:529-539的表1。
我们选择去开发抗体CH1(Cγ1)和CL(Ckappa或CK)区中的置换(序列显示在图13中)，因为，不像Fc区,它们不与影响抗体的药理学特性的天然配体相互作用。在决定要突变那个位置时，考虑周围环境和WT氨基酸与其近邻的接触点的数目诸如以最小化一个或一组置换对结构和/或功能的影响。使用抗体Fab结构域的相关晶体结构计算每个CH1和CK位置的溶剂可达性或暴露的分数。对Cγ1和CK的结果分别显示在USSN 13/648,951的图2和3中(附图和附带的图例特别地通过引用并入本文)。进一步通过检查CH1和CL结构域中在免疫球蛋白同种型(IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4)之间为同种型的位置来指导设计。因为这样的变化天然存在，期望这样的位置能够经得起置换。基于这样的分析，鉴定了许多减小pI但预测对结构域的生物物理性质影响最小的置换。
对于本文的所有异二聚体蛋白，在哺乳动物表达载体pTT5中构建编码抗体的重链和轻链的基因。人IgG1恒定链基因获自IMAGE 克隆并亚克隆进pTT5载体。编码抗-VEGF抗体的VH和VL基因通过商业合成(Blue Heron Biotechnologies,Bothell WA)，并亚克隆进编码适宜的CL和IgG1恒定链的载体中。使用
Figure RE-GDA0002432561970000871
定向诱变法(Stratagene,LaJolla CA)使用定向诱变构建氨基酸修饰。所有DNA 被测序以确认序列的保真度。
使用阳离子脂质体(lipofectamine)(Invitrogen,Carlsbad CA)将含有重链基因(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)的质粒与含轻链基因(VL-Cκ)的质粒共转染进293E细胞中，并使细胞在FreeStyle 293培养基(Invitrogen, Carlsbad CA)中生长。生长5天后，从培养上清液使用MabSelect树脂(GE Healthcare)通过蛋白A亲和纯化抗体。抗体浓度通过二喹啉甲酸(BCA)测定(Pierce)测定。
pI改造的mAb通常通过在Agilent Bioanalyzer上的SDS PAGE，通过尺寸排阻色谱(SEC),等电聚焦(IEF)凝胶电泳，通过Biacore与抗原结合，和差示扫描量热法(DSC)进行表征。在SDS-PAGE和SEC上所有mAb显示高纯度。IEF凝胶指示每个变体具有设计的等电点。大体Biacore上的结合分析显示pI改造的变体与抗原结合的亲和力与亲代抗体类似，表明设计的置换没有干扰mAb的功能。附图中的DSC 显示哪个变体大体上具有高的热稳定性。
根据情况在B6小鼠中进行血清半衰期的药代动力学实验，B6小鼠是敲除了鼠FcRn的纯合子和敲进了人FcRn的杂合子(mFcRn-/-, hFcRn+)(Petkova等人,2006,Int Immunol18(12):1759-69,整体地通过引用并入)，在本文中称为hFcRn或hFcRn+小鼠。
对多组4-7只通过体重(20-30g范围)随机化的雌性小鼠给予单次静脉内尾静脉注射抗体(2mg/kg)。在每个时间点从眼窝丛吸出血液 (～50ul)，加工成血清，并在-80℃保存直至分析。使用ELISA测定确定抗体浓度。使用重组抗原作为俘获试剂测量抗体的血清浓度，并利用生物素化抗-人κ抗体和铕标记的链霉亲和素进行检测。收集时间分辨的荧光信号。利用非区室模型使用WinNonLin(Pharsight Inc, Mountain View CA)对单个小鼠测定PK参数。标称时间和剂量与点的均一加权一起使用。
实施例2.恒定区pI改造的改造方式
可以使用多种方式来进行蛋白或抗体的pI减小。在最高的碱性水平，具有高pKa的残基(赖氨酸，精氨酸和在一定的程度上组氨酸)被中性或带负电残基代替，和/或中性残基被低pKa残基(天冬氨酸和谷氨酸)代替。特定的替换可以取决于许多因素，包括结构中的位置，功能中的地位和免疫原性。
因为免疫原性是一个问题，可以做出一些努力来最小化降低pI 的置换会引起免疫原性的风险。一种减小风险的方式是最小化变体的突变负荷，即，以最小数目的突变减小pI。电荷交换突变，其中K,R, 或H被D或E替换，对减小pI具有最大的影响，因此优选这些置换。另一在减小pI的同时最小化免疫原性的风险的方式是利用来自同源人蛋白的置换。因此对于抗体恒定链，IgG亚类(IgG1,IgG2,IgG3,和 IgG4)之间的同种型差异提供了低风险置换。因为免疫识别在局部序列水平发生，即，MHC II和T-细胞受体识别典型地9个残基长度的表位，pI-改变的置换可以伴有序列中近侧的同种型置换。以此方式，表位可以延长以匹配天然同种型。这样的置换因此将组成存在于其他人IgG同种型中的表位，并且因此预期将被耐受。
一种用于改造pI改变的方式是使用同种型转换，如本文所述。
另一种将较低的pI改造至蛋白和抗体中的方式是将带负电荷的残基融合至N-或C-末端。因此例如，主要由天冬氨酸和谷氨酸组成的肽可以融合至抗体重链、轻链或两者的N-末端或C-末端。因为N- 末端在结构上靠近抗原结合位点，因此优选C-末端。
基于所述的改造方式，设计许多变体以改变抗体重链(通常Fc区) 且在一些情况下轻链的等电点。
实施例3.同种型轻链恒定区变体
CK和Cλ之间的同源性不如IgG亚类之间的高，然而仍然使用存在的序列和结构同源性来指导置换以形成同种型低-pI轻链恒定区。在图56中，具有促成较高pI(K,R和H)或较低pI(D和E)的残基的位置以粗体高亮。灰色指示可以被替代的赖氨酸、精氨酸和组氨酸，优选具有天冬氨酸或谷氨酸，以降低等电点。这些变体,单独地或组合地，可以独立地和任选地与具有至少一个轻链的骨架中的所有其他重链变体组合。
实施例4.具有改变的等电点的抗体变体的纯化混合物。
改变抗体等电点的置换可以被引入至抗体变体的一个或多个链中以有助于分析和纯化。例如，异二聚体抗体诸如在US2011/0054151A1 中公开的那些可以通过改变一条链的等电点来纯化，使得表达和蛋白 A纯化后的存在的多个种类可以通过基于电荷差异分离蛋白的方法 (诸如离子交换色谱)来纯化。
作为实例，贝伐珠单抗的重链通过引入置换以降低其等电点来改变使得当WT-IgG1-HC、低pI-HC和WT-LC在293E细胞中转染时产生的三个种类之间的电荷差足够大从而有助于通过阴离子交换色谱纯化。如上所述建立克隆，且转染和通过蛋白A色谱的初步纯化也如上所述。三条链“XENP10653的重链1”,“XENP10653的重链2”,和“XENP10653的轻链”的序列在附图中。在蛋白A纯化后，获得具有几乎相同的分子量但电荷不同的三个种类。这些是 WT-IgG1-HC/WT-IgG1-HC均二聚体(pI＝8.12),WT-IgG1-HC/l低 -pI-HC异二聚体(pI＝6.89)和低-pI-HC/低-pI-HC均二聚体(pI＝ 6.20)。将混合物加样至处于20mM Tris,pH7.6中的GE HiTrap Q HP 柱，并且利用由50mM、100mM和最后是在相同Tris缓冲液中的200mM NaCl组成的NaCl的逐步梯度洗脱。洗脱通过A280监控，且每个级分在具有Novex电泳缓冲液的Invitrogen pH 3-10IEF凝胶上分析，这些结果显示在图40中。WT-IgG1-HC/WT-IgG1-HC均二聚体不结合至处于pH 7.6的阴离子交换柱，并且因此存在于流通液和洗涤液(泳道1-2)中。所需的异二聚体用50mM NaCl洗脱(泳道3),同时低-pI-HC/低pI-HC均二聚体最紧密地与柱结合并且在100(泳道4) 和200mM(泳道5)NaCl洗脱。因此所需的异二聚体变体(因为其与其他两种种类相似的分子量而难以通过其他方式纯化)通过将低pI置换引入至一条链中而被容易地纯化。这种通过改造每条链的等电点来纯化抗体的方法可以应用于纯化多种双特异性抗体构建体的方法。当混合物中的所需种类具有相似的分子量和其他的性质使得通常的纯化技术不能够以高收率分离所需的种类时这种方法特别有用。
实施例5.改变pI的非天然电荷置换的设计
通过在恒定结构域中改造置换来改变抗体恒定链的pI。减小的pI 可以通过将碱性氨基酸(K或R)置换为酸性氨基酸(D或E)来改造，其导致pI的最大减小。碱性氨基酸至中性氨基酸以及中性氨基酸至酸性氨基酸的突变也将导致pI的减小。相反，增加的pI可以通过将酸性氨基酸(D或E)置换为碱性氨基酸(K或R)来改造，其导致pI的最大增加。酸性氨基酸至中性氨基酸以及中性氨基酸至碱性氨基酸的突变也将导致pI的增加。氨基酸pK值的列表可见Bjellqvist等人,1994, Electrophoresis 15:529-539的表1。
在决定要突变哪个位置时，考虑周围环境和WT氨基酸与其近邻的接触点的数目诸如以最小化一个或一组置换对结构和/或功能的影响。使用相关晶体结构计算每个恒定区位置的溶剂可达性或暴露的分数。基于这样的分析，鉴定了许多减小或增加pI但预测对结构域的生物物理性质影响最小的置换。
如下进行蛋白pI的计算。首先，对D,E,C,H,K,R和Y氨基酸的数目以及蛋白中存在的N-和C-末端的数目进行计数。然后，通过鉴定蛋白具有0的总电荷时的pH来计算pI。这通过计算许多测试pH 值时蛋白的净电荷来完成。测试pH值以迭代的方式设定，从0的低 pH以0.001的增量升高至14的高pH直至蛋白的电荷达到或超过0。通过下列的公式计算在给定的pH时蛋白的净电荷：
Figure RE-GDA0002432561970000911
其中q蛋白(pH)是在给定的pH时蛋白上的净电荷，是蛋白上存在的氨基酸i(或N-或C-末端)的数目，且是氨基酸i(或N-或C-末端)的pK。
实施例6.具有改变的等电点的抗体变体的纯化混合物
变体首先通过蛋白A纯化，然后加样至处于50mM MES(pH 6.0) 中的GEHealthcare HiTrap SP HP阳离子交换柱上，并用NaCl梯度洗脱。洗脱后，来自每个峰的级分被加样至Lonza IsoGel IEF板上(pH 范围7-11)用于分析。在每种情况下均实现了对中间pI异二聚体的分离，当异二聚体与均二聚体具有较大的pI差时分离得到改善。
实施例7.pI等排变体的稳定性
差示扫描荧光法(DSF)用来评价含有等排pI置换的抗体的稳定性。使用Bio-RadCFX Connect实时PCR检测系统进行DSF实验。蛋白与SYPRO橙荧光染料混合，并在PBS中稀释至0.25或0.50 mg/mL。SYPRO橙的终浓度为10X。在25℃初始的10分钟孵育期后，使用1℃/min的加热速率将蛋白从25加热至95℃。每30秒获取荧光测量值。使用仪器软件计算解链温度。结果显示在图44中。结果表明等排(+)pI变体具有较低的稳定性。因此我们制备了更多的变体以减少增加的pI侧上的置换数目，但结果显示仅E269Q对稳定性具有小的效应，而E272Q和E283Q对稳定性有大的负面影响。
实施例8.能够进行含有scFv的异二聚体双特异性抗体的IEX纯化的带电荷的scFv接头的设计
我们以前已经使用同种型和等排电荷置换两者改造了异二聚体抗体的抗体恒定区以具有较高的或较低的pI。这些方法能够有效地 IEX纯化异二聚体种类，但可能由于引入非天然的置换而影响抗体的稳定性或免疫原性。对于含有scFv的异二聚体双特异性抗体(实施例显示在图1中),引入带电荷的置换的另一区域是连接scFv构建体的 VH和VL的scFv接头。使用的最常见的接头是(GGGGS)3或 (GGGGS)4,其已经显示足够柔性从而允许稳定形成scFv而没有双抗体形成。这些序列经常是非天然的，并且含有很少的对可能的免疫原性表位的序列特异性。因此，我们认为将带电荷的置换引入至scFv 接头可能是能够进行对含有scFv的异二聚体双特异性种类的IEX纯化的好策略。设计多种带正电荷和带负电荷的scFv接头并显示在9 中。所有接头是新的构建体，除了“Whitlow”接头以外，后者由Whitlow等人,(Whitlow M,Protein Eng.1993(8),989-995.)报道。从自PDB文件获得的人蛋白的非结构化区域的数据库取标为6paxA_1(+A)和 3hsc_2(-A)的接头且这些接头的长度大致与(GGGGS)3相同并且含有正电荷或负电荷。其他接头基于引入重复的Lys或Glu残基，以及被设计成减少在带正电荷的接头中蛋白水解降解几率的Lys-Pro基序。
首先评价带电荷的接头以scFv-His形式的生物物理行为，然后以后构建在抗-CD19xCD3 Fab-scFv-Fc双特异性形式中。在哺乳动物表达载体pTT5中构建编码抗-CD3抗体SP34或抗-CD19 4G7抗体的改造形式的scFv的基因。对于全长构建体，人IgG1恒定链基因获自 IMAGE克隆病并克隆进pTT5载体。scFv基因通过商业合成(Blue HeronBiotechnologies,Bothell WA)。使用
Figure RE-GDA0002432561970000921
定向诱变法 (Stratagene,LaJolla CA)使用定向诱变构建氨基酸修饰。所有DNA 被测序以确认序列的保真度。
使用阳离子脂质体(Invitrogen,Carlsbad CA)将含有scFv或重链和轻链基因的质粒转染(或对于全长形式共转染)进293E细胞中，并使细胞在FreeStyle 293培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)中生长。生长5 天后，从培养上清液使用MabSelect树脂(GEHealthcare)或使用用于 His-标记的scFv的Ni-NTA树脂通过蛋白A(全长)纯化抗体。进一步通过离子交换色谱(IEX)纯化以评估改变的pI重链实现有效纯化的能力。对于在CD3scFv中含有带正电荷的接头的抗CD19xCD3双特异性抗体进行IEX纯化的实例显示在图49中。抗体浓度通过二喹啉甲酸(BCA)测定(Pierce)测定。
pI改造的scFv或抗体通过SDS PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)、等电聚焦(IEF)凝胶电泳和/或差示扫描荧光法(DSF)进行表征。
实施例9.含有带电荷接头的scFv的稳定性和行为
评价分别含有带正电荷或带负电荷的接头的抗-CD3 scFv和抗 -CD19 scFv的SEC行为以及使用DSF评价稳定性。差示扫描荧光法 (DSF)用来评价含有带电荷的接头的scFv的稳定性。使用Bio-Rad CFX Connect实时PCR检测系统进行DSF实验。蛋白与SYPRO橙荧光染料混合，并在PBS中稀释至0.25或0.50mg/mL。SYPRO橙的终浓度为10X。在25℃初始的10分钟孵育期后，使用1℃/min的加热速率将蛋白从25加热至95℃。每30秒获取荧光测量值。使用仪器软件计算解链温度。scFv的Tm值显示在图45中。带电荷的接头对总scFv稳定性仅有略微的影响，如它们的Tm值所指示。获自纯化的 scFv的SEC色谱图显示在图4中。高度带电荷的接头具有较长的洗脱时间和引人注目的峰尾，表明太多的电荷导致scFv粘在SEC树脂上比期望的时间更长。带正电荷的抗-CD3 scFv与CD4+T细胞结合的结合结果(图88)表明大多数scFv的结合是相似的，例外是非常高度带电荷的(GKGKS)4scFv,其显示较弱的结合。当在PBMC中对CD20+ 细胞设门控时没有检测到脱靶结合。然而，当使用SP34细胞时检测到脱靶结合，利用处于最高浓度的带最高电荷的接头看到一些量的脱靶结合(图89)。
在抗-CD19xCD3 Fab-scFv-Fc构建体中抗-CD3 scFv上的带正电荷的scFv接头具有出人意料的减少高分子量聚集的量的特性(图91)。在各种浓度下孵育的两个双特异性构建体(13121–具有标准的 (GGGGS)4接头)和(13124–具有带电荷的接头(GKPGS)4)的SEC色谱图确认了此现象。
使用RTCC测定利用PBMC和含有不同的scFv接头的Fab-scFv-Fc形式双特异性抗-CD19xCD3抗体评价了抗-CD3 scFv中含有带电荷的scFv接头的抗-CD19xCD3构建体的活性(图92)。接头对RTCC活性影响很小，例外是带高度电荷的接头(GKGKS)3，其具有较低的活性。
本发明的所有构建体的序列显示在附图中。

Claims (10)

1.一种异二聚体抗体，其包含：
a)第一单体，其包含：
i)第一重链恒定结构域，所述第一重链恒定结构域包含第一变体Fc结构域；和
ii)第一抗原结合结构域；以及
b)第二单体，其包含：
i)第二重链恒定结构域，所述第二重链恒定结构域包含第二变体Fc结构域；和
ii)第二抗原结合结构域；
其中所述第一和第二变体Fc结构域中之一包含选自由图6中所绘的那些组成的组的氨基酸置换。
2.根据权利要求1所述的异二聚体抗体，其中所述第一抗原结合结构域是共价连接至所述第一重链恒定结构域的scFv。
3.根据权利要求1所述的异二聚体抗体，其中所述异二聚体抗体具有选自图1B-1L和2A-2M的结构的结构。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的异二聚体抗体，其中所述第一和/或第二Fc结构域进一步包含选自由下列各项组成的组的氨基酸置换：434A,434S,428L,308F,259I,428L/434S,259I/308F,436I/428L,436I或V/434S,436V/428L,252Y,252Y/254T/256E,259I/308F/428L,236A,239D,239E,332E,332D,239D/332E,267D,267E,328F,267E/328F,236A/332E,239D/332E/330Y,239D,332E/330L,236R,328R,236R/328R,236N/267E,243L,298A和299T。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的异二聚体抗体，其中所述第一和所述第二变体Fc结构域中之一包含氨基酸置换364K/E357Q，且所述第一和所述第二变体Fc结构域中的另一个包含氨基酸置换368D/370S。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的异二聚体抗体，其中所述第一和/或第二Fc结构域进一步包含选自由图7中所列举的那些组成的组的氨基酸置换。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体抗体，其中所述第一单体包含与scFv共价连接的重链恒定结构域，且所述第二单体包含重链和轻链。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体抗体，其中所述单体中的一个包含N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
9.一种核酸组合物，其包含编码根据权利要求1所述的第一和第二单体的核酸。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的核酸组合物。
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