CN101460622A - 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明发现了高效纯化双特异性抗体的方法：对于构成双特异性抗体的2种抗体，通过修饰存在于抗体可变区表面的氨基酸，在2种抗体的H链之间导入等电点差异，利用等电点差异，用色谱柱高效纯化双特异性抗体。还发现：向等电点有差异的抗体的恒定区整合各抗原结合部位(重链可变区)，使它们共表达，用色谱柱高效纯化双特异性抗体。

Description

用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法

技术领域

本发明涉及用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法、该双特异性抗体的分离方法、以及含有该双特异性抗体作为有效成分的药物组合物等。

背景技术

抗体在血液中的稳定性高、副作用小，因此作为药物受到人们的关注。其中有可同时识别两种抗原(抗原A和抗原B)的双特异性抗体(非专利文献1)。目前，正在进行临床实验的MDX-210是将表达Fc γRI的单核细胞等对表达HER-2/neu的癌细胞重构的IgG型双特异性抗体(非专利文献2)。抗体的制备通常大多采用基因重组技术。具体来说，是从杂交瘤、生成抗体的致敏淋巴细胞等抗体生成细胞或呈递抗体基因的噬菌体文库中克隆编码抗体的蛋白质的DNA，整合到适当的载体中，将其导入宿主细胞而生成的技术。使用基因重组技术的IgG型双特异性抗体的制备是将作为目标的两种构成IgG的H链和L链的基因、共四种基因导入到细胞中，通过共表达来分泌。上述表达中，在表达野生型H链和L链的构成基因时，随机发生两种H链的缔合或H链与L链的缔合，因此，目标双特异性抗体的比例极少。具体来说，目标双特异性抗体只是十种中的一种，生产效率降低。目标抗体的生成效率低下不仅成为目标抗体纯化的障碍，也使批次之间的差异等的不均匀性增大，导致生产成本增大。

作为用于开发双特异性抗体的有效的双特异性抗体的制备方法，有报道报告了用于获得两个H链中共通的L链的共通L链获得技术、以及用于使H链异种缔合化的Knobs-into-holes技术。具体来说，从噬菌体文库(Phage library)等中找出可对识别抗原A和抗原B的各H链保持两种抗原结合活性的共通的L链，再将存在于一种H链的CH3区域的氨基酸支链置换为更大的支链(knob，突起)，将存在于另一个H链的CH3区域的氨基酸支链置换为更小的支链(hole，空隙)，由此使突起配置在空隙内，促进H链杂合二聚体的形成，可有效地获得目标双特异性抗体(专利文献1、非专利文献3、非专利文献4)。

但是，为了获得H链杂合二聚体而使用Knobs-into-holes技术时，如非专利文献3、非专利文献4所示，通过Knobs-into-holes技术可以将目标A链B链杂合二聚体的含有率提高至最大95％程度左右，其余的5％是A链均二聚体、B链均二聚体，成为杂质。为了开发双特异性抗体作为药物，必需从使用共通L链(非专利文献3、非专利文献4)时所生成的三种分子种类(A链均二聚体、B链均二聚体、A链B链杂合二聚体)中尽可能地高纯度纯化A链B链杂合二聚体。因此，必需要除去残留的5％的杂质—A链均二聚体、B链均二聚体，将A链B链杂合二聚体纯化为可以作为药物开发的高纯度。使用共通L链而不采用Knobs-into-holes技术时，理论上A链均二聚体、A链B链杂合二聚体、B链均二聚体以1:2:1生成，必须除去50％的杂质—A链均二聚体、B链均二聚体。

在药物制造水平的色谱分离中，目前已经有几种分离A链B链杂合二聚体和A链均二聚体、B链均二聚体的方法。作为选择性地纯化A链B链杂合二聚体的方法，非专利文献5中报道了以下方法：A链使用小鼠IgG2a、B链使用大鼠IgG2b，利用蛋白A与小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的各H链的亲和性的不同，控制蛋白A的洗脱pH，由此纯化A链B链杂合二聚体，但是由于是使用小鼠和大鼠的恒定区，因此从抗原性的观点来考虑，该方法难以应用于对人的药物。该方法无法分离含有相同亚类的H链的A链B链杂合二聚体，因此其利用受到限制。

非专利文献6中报道了利用疏水相互作用色谱的A链B链杂合二聚体的纯化方法，但是含有抗CD3小鼠IgG2a和抗CD19小鼠IgG1的目标A链B链杂合二聚体难以充分进行峰的分离，另外，考虑到是使用不同的亚类的H链、利用其疏水性的不同进行分离，因此，未必可以分离含有相同亚类的H链的A链B链杂合二聚体。

非专利文献7中报道了利用嗜硫性亲和色谱纯化A链B链杂合二聚体的方法，由于是使用小鼠IgG1和大鼠IgG2a、利用该铰链区的游离半胱氨酸(硫醇基)，因此难以用作分离含有相同亚类的H链的A链B链杂合二聚体，另外游离的半胱氨酸与保存中的聚集有关，因此不适合于稳定的药物制剂的开发。

非专利文献8中报道了使用抗原的亲和色谱。但是，使用蛋白质或肽抗原的亲和色谱存在柱的成本或稳定性的课题，因此使用亲和色谱制备药物并不是常规方法。另外，为了纯化与两种抗原结合的A链B链杂合二聚体，必须实施两次亲和色谱，可以预见成本升高。还报道了只识别抗原的立体结构的抗体或低亲和性、具有目标功能的抗体，具有上述性质的抗体难以采用利用抗原的亲和色谱。因此，使用亲和色谱的双特异性抗体的纯化并不通用。

如上所述，双特异性抗体的A链B链杂合二聚体的纯化只能在有限的范围内进行，对于将含有相同H链亚类、恒定区序列的双特异性抗体的A链B链杂合体纯化至可作为药物接受的高纯度的方法尚未见报道。构成双特异性抗体的两种抗体具有相同恒定区序列时，必须只根据可变区序列的不同来分离A链B链杂合二聚体，但抗体的可变区的氨基酸序列在抗体之间的同源性非常高(非专利文献9)，只凭可变区序列的不同来将A链B链杂合二聚体纯化至可药用的高纯度是困难的。

专利文献1：国际公开第96/27011号。

非专利文献1：Marvin JS和Zhu Z，“Recombinant approaches toIgG-like bispecific antibodies.”，Acta.Pharmacol.Sin.，June 2005，Vol.26(6)，p.649-58.

非专利文献2：Segal D.M.等人.，Current Opinion in Immunology，1999，Vol.11，p.558-562.

非专利文献3：Merchant AM等7人.，“An efficient route to humanbispecific IgG.”，Nat.Biotechnol.，Jul 1998，Vol.16(7)，p.677-81.

非专利文献4：Carter P，“Bispecific human IgG by design.”，J.Immunol.Methods.，Feb 2001，Vol.248(1-2)，p.7-15.

非专利文献5：Lindhofer H等4人.，“Preferential species-restrictedheavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas.Implications for asingle-step purification of bispecific antibodies.”，J.Immunol.，Jul 1，1995，Vol.155(1)，p.219-25.

非专利文献6：Manzke O等4人.，“Single-step purification ofbispecific monoclonal antibodies for immunotherapeutic use byhydrophobic interaction chromatography.”，J.Immunol.Methods.，Oct 13，1997，Vol.208(1)，p.65-73.

非专利文献7：Kreutz FT等3人.，“Efficient bispecific monoclonalantibody purification using gradient thiophilic affinity chromatography.”，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，Sep 4，1998，Vol.714(2)，p.161-70.

非专利文献8：Gupta S和Suresh M，“Affinity chromatography andco-chromatography of bispecific monoclonal antibody immunoconjugates.”，J.Biochem.Biophys.Methods.，May 31，2002，Vol.51(3)，p.203-16.Review.

非专利文献9：Carl Branden，Introduction to Protein Structure 2ndedition，Newton Press.

发明内容

本发明针对上述状况而设，其目的在于提供用于高效地纯化双特异性抗体的抗体可变区的氨基酸修饰的方法、含有修饰的双特异性抗体的药物组合物、以及双特异性抗体药物组合物的制备方法。本发明还提供重链恒定区发生修饰的双特异性抗体、含有修饰的双特异性抗体的药物组合物、以及双特异性抗体药物组合物的制备方法。

作为可通过使用常用的色谱柱高效地纯化以往难以进行目标物纯化的双特异性抗体的方法，本发明人对于抗体可变区的氨基酸置换的方法进行了深入的研究。

结果发现，对于构成双特异性抗体的两种抗体，通过修饰存在于抗体可变区表面的氨基酸、在两种抗体的H链之间导入等电点差异、利用等电点的差异来用色谱柱高效率地纯化双特异性抗体的方法。具体来说，在抗体的H链中发现了不会使抗体的功能(活性)降低而可只控制等电点的修饰位置。本发明人还确认了通过本发明的方法获得的双特异性抗体实际保持有功能。

如上所述，作为使用常用的色谱柱高效率地纯化任意的双特异性抗体的方法，本发明人成功地开发了通过抗体可变区氨基酸置换进行的方法，从而完成了本发明。

本发明人还发现，对于构成双特异性抗体的两种H链的恒定区，通过在各个H链中使用原本等电点有差异的不同的亚类的恒定区、利用等电点的不同、可以通过色谱柱高效地纯化双特异性抗体的方法。本发明人又确认了通过本发明的方法获得的双特异性抗体实际保有功能。

本发明涉及为了使用色谱柱进行高效率纯化的抗体可变区的氨基酸置换方法、以及含有修饰的双特异性抗体的药物组合物、以及双特异性抗体药物组合物的制备方法，进一步涉及重链恒定区发生修饰的双特异性抗体、以及含有修饰的双特异性抗体的药物组合物、以及双特异性抗体药物组合物的制备方法，更具体地说，涉及以下内容：

[1]多特异性抗体的制备方法，所述多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，该制备方法包含以下步骤：

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中之一，使第1多肽与第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。

[2][1]所述的方法，其中，步骤(a)的修饰是修饰核酸，使第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

[3][1]所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

[4][3]所述的方法，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

[5][1]-[4]中任一项所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

[6][5]所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

[7][6]所述的方法，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

[8][1]所述的方法，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

[9]多特异性抗体，该多特异性抗体通过[1]所述的方法制备。

[10]多特异性抗体的纯化方法，该多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，其纯化方法如下：

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中之一，使第1多肽与第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)通过标准的色谱法从宿主细胞培养物中纯化该多特异性抗体。

[11][10]所述的方法，其中，步骤(a)的修饰是修饰核酸，使第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

[12][10]所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

[13][12]所述的方法，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

[14][10]-[13]中任一项所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

[15][14]所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

[16][15]所述的方法，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

[17][10]所述的方法，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

[18]多特异性抗体的制备方法，该方法包含通过[10]所述的方法进行纯化的步骤。

[19]多特异性抗体，该抗体通过[18]所述的方法制备。

[20]多特异性抗体，该多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，第1多肽含有重链可变区和/或重链恒定区，选自该重链可变区的按照Kabat编号的第10号、12号、23号、39号、43号和105号氨基酸残基、或者该重链恒定区的按照EU编号的第137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基具有电荷，第1多肽与第2多肽的等电点互不相同。

[21][20]所述的多特异性抗体，其中，第2多肽含有重链可变区和/或重链恒定区，选自该重链可变区的按照Kabat编号的第10号、12号、23号、39号、43号和105号氨基酸残基、或者该重链恒定区的按照EU编号的第137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基，具有与选自上述第1多肽中所含的重链可变区和/或重链可变区中的具有电荷的氨基酸残基相反的电荷、或者不具有电荷。

[22][20]所述的多特异性抗体，其中，上述具有电荷的氨基酸残基和与该氨基酸残基具有相反电荷的氨基酸残基的组合分别选自下述(a)或(b)的任意组中所含的氨基酸残基：

(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)

[23]多特异性抗体，该多特异性抗体中的第1多肽和第2多肽的等电点有差异，第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

[24][23]所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

[25][24]所述的多特异性抗体，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和上述第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

[26][23]-[25]中任一项所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

[27][26]所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

[28][27]所述的多特异性抗体，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

[29][23]所述的多特异性抗体，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

[30]组合物，该组合物含有[23]-[29]中任一项所述的多特异性抗体和可药用的载体。

[31]核酸，该核酸编码构成[23]-[29]中任一项所述的多特异性抗体的多肽。

[32]宿主细胞，该宿主细胞具有[31]中所述的核酸。

[33][23]-[29]中任一项所述的多特异性抗体的制备方法，该制备方法包含培养[32]所述的宿主细胞的步骤；从细胞培养物中回收多肽的步骤。

[34][25]所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有以下(a1)-(a7)中任一项所述的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有以下(b1)-(b3)中任一项所述的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有以下(c1)或(c2)中所述的氨基酸序列：

(a1)SEQ ID NO.7

(a2)SEQ ID NO.8

(a3)SEQ ID NO.9

(a4)SEQ ID NO.10

(a5)SEQ ID NO.11

(a6)SEQ ID NO.12

(a7)SEQ ID NO：13

(b1)SEQ ID NO.14

(b2)SEQ ID NO.15

(b3)SEQ ID NO.16

(c1)SEQ ID NO.17

(c2)SEQ ID NO.18。

[35][34]所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有SEQ IDNO.11的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有SEQ ID NO.16的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.17的氨基酸序列。

[36][34]所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有SEQ IDNO.12所述的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有SEQ ID NO.16的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.18的氨基酸序列。

[37][34]-[36]中任一项所述的多特异性抗体，其中，第1多肽和第2多肽含有人IgG4恒定区，第3多肽含有人κ恒定区。

附图说明

图1是表示对于人源化双特异性抗体(人源化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))的凝固活性进行评价的结果的图。评价结果显示了与嵌合双特异性抗体具有同等以上的凝固活性。

图2是表示使用人源化A69-H链可变区(hA69a)和人源化BBA(hAL-F123j4)、以及人源化hB26-H链可变区(hB26-F123e4)和人源化BBA(hAL-F123j4)实施抗体建模的结果的图。对于可以使表面电荷变化的氨基酸着重表示支链。编号采用Kabat数据库的序列编号(Kabat EA等人.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)。

图3是表示使用未修饰的和使可变区修饰的人源化A69抗体均二聚体、以及未修饰的和使可变区修饰的人源化B26抗体均二聚体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果确认：通过修饰，等电点发生变化。

图4是表示使用使可变区修饰的人源化A69抗体均二聚体实施阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果确认：与未修饰的抗体相比，峰发生移动。

图5是表示使用使可变区修饰的人源化B26抗体均二聚体实施阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果确认：与未修饰的抗体相比，峰发生移动。

图6是表示使用使可变区修饰的人源化双特异性抗体(H链恒定区利用knobs-into-holes技术)评价凝固活性的结果的图。评价结果显示了与未修饰的抗体同等的凝固活性。

图7是表示使用使可变区(CDR)修饰的人源化A69抗体均二聚体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果确认：与未修饰的抗体比较，条带发生移动。

图8是表示使用使可变区(CDR)修饰的人源化A69抗体均二聚体评价与作为抗原的因子IXa的结合活性的结果的图。评价结果显示，与未修饰的抗体保有同等的结合活性。

图9是表示使用人源化A69-H链—hA69a、人源化B26-H链—hB26-F123e4和人源化BBA-L链—hAL-F123j4作为未修饰抗体制备的未修饰的人源化双特异性抗体实施阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果中，两种均二聚体与双特异性抗体不分离，以一个峰的形式洗脱。

图10是表示使用人源化A69-H链修饰体—hA69-PF、和人源化B26-H链的修饰体—hA26-PF、和人源化BBA-L链—hAL-s8制备的人源化双特异性PF抗体实施阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果中，两种均二聚体与双特异性抗体分别分离，依次按照hA69-PF均二聚体、人源化双特异性PF抗体、hB26-PF均二聚体的顺序、以三个峰的形式洗脱。

图11是表示使用纯化的人源化A69抗体-PF均二聚体和人源化B26-PF抗体均二聚体、人源化双特异性PF抗体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果确认：可纯化目标双特异性抗体。

图12是表示使用纯化的人源化双特异性PF抗体(H链恒定区为野生型)评价凝固活性的结果的图。评价结果显示了与在H链恒定区利用konds-into-holes技术得到的双特异性抗体(KiH)同等的凝固活性。

图13表示使用制备中常用的柱、从含有人源化A69抗体均二聚体和人源化B26抗体均二聚体、人源化双特异性抗体三种抗体的培养上清中纯化双特异性抗体时的色谱图。

图14是表示使用用制备中常用的柱纯化的人源化双特异性抗体(H链恒定区为野生型)评价凝固活性的结果的图。评价结果显示了与人源化双特异性PF抗体同等的凝固活性。

图15是表示使用未修饰、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果中确认：通过修饰使等电点发生了变化。A表示未修饰人源化PM-1抗体、B表示IgG2化人源化PM-1抗体，C表示IgG4化人源化PM-1抗体。

图16是表示使用未修饰、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗体的各个共表达抗体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果显示，各亚类抗体和亚类杂合抗体可通过pI差分离。A表示未修饰人源化PM-1抗体/IgG2化人源化PM-1抗体共表达抗体，B表示未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体共表达抗体，C表示人源化PM-1抗体纯化品(批量)。

图17是表示使用单独表达的未修饰、IgG2化、IgG4化人源化PM-1抗体实施阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果确认：与未修饰的抗体相比，峰发生移动。

图18是表示实施未修饰、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗体的各个共表达抗体的阳离子交换色谱分析的结果的图。分析结果中，在未修饰人源化PM-1抗体/IgG2化人源化PM-1抗体的组合、以及未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体的组合中，主要可观察到各亚类的均二聚体、杂合二聚体的三个主峰。A表示未修饰人源化PM-1抗体/IgG2化人源化PM-1抗体共表达抗体，B表示未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体共表达抗体。

图19是表示通过阳离子交换色谱，从共表达未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体的抗体中纯化均二聚体、杂合二聚体的结果的图。结果，依次以三个峰的形式洗脱了IgG4化人源化PM-1抗体均二聚体、未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1杂合抗体、未修饰人源化PM-1抗体均二聚体，因此可将它们分离。箭头表示大致的组分范围。

图20是表示使用通过阳离子交换色谱纯化的未修饰人源化PM-1抗体均二聚体、未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1杂合抗体、IgG4化人源化PM-1抗体均二聚体进行二次色谱的结果的图。结果确认：可以纯化目标亚类杂合抗体。

图21是表示使用通过阳离子交换色谱纯化的未修饰人源化PM-1抗体均二聚体、未修饰/IgG4化人源化PM-1杂合抗体、IgG4化人源化PM-1抗体均二聚体实施等电聚焦电泳分析的结果的照片。分析结果确认：可以纯化目标亚类杂合抗体。A表示未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体共表达抗体，B表示未修饰人源化PM-1抗体分离组分，C表示未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1杂合抗体分离组分，D表示IgG4化人源化PM-1抗体分离组分。

图22是使用通过阳离子交换色谱纯化的未修饰人源化PM-1抗体均二聚体、未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1杂合抗体、IgG4化人源化PM-1抗体均二聚体评价人IL-6中和活性的结果的图。评价结果显示了任何抗体均与人源化PM-1纯化抗体同等的中和活性。A和B表示表达人gp130的BaF3细胞株，C和D表示共表达人gp130/人IL-6受体的BaF3细胞株。黑色圆圈(●)表示人源化PM-1抗体纯化品(批量)，白色方框(□)表示未修饰人源化PM-1抗体，白色三角(△)表示IgG4化人源化PM-1抗体，×表示未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1杂合抗体。

具体实施方式

首先，本发明提供用于制备多特异性抗体的抗体修饰方法。本发明的制备方法的优选方案是包含修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中一方，使第1多肽与第2多肽的等电点产生差异的方法。即，可以通过改变第1多肽和第2多肽的氨基酸残基的电荷，向多肽中导入等电点(pI)的差异，利用该等电点的差异制备多特异性抗体。具体来说是包含以下的(a)-(c)的步骤的制备方法。

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中一方，使第1多肽和第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。

本发明中的多肽通常是指具有10个氨基酸左右以上的长度的多肽以及蛋白质。通常是来自生物的多肽，但没有特别限定，例如也可以是含有人工设计的序列的多肽。还可以是天然多肽、或合成多肽、重组多肽等任意形式。并且，上述多肽的片段也包含在本发明的多肽中。

本发明中，“多肽的等电点产生差异”是指在两种以上的多肽中，通过进行表面氨基酸电荷的改变，使它们等电点互相不相等。等电点的差异例如可通过使用等电聚焦电泳等方法观察。本发明中，优选不改变该多肽的结构或功能(活性)地控制等电点。

即，本发明提供多特异性抗体的制备方法，该多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，所述多特异性抗体的制备方法包含以下步骤：

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中一方，使第1多肽与第2多肽的等电点的差为0.5以上，优选0.7或以上，进一步优选0.9或以上；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。

本发明还提供用于纯化多特异性抗体的抗体修饰方法。本发明的纯化方法的优选方案是包含修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中一方进行，使第1多肽和第2多肽的等电点产生差异的方法。即，通过改变第1多肽和第2多肽的氨基酸残基的电荷，向多肽中导入等电点(pI)的差异，可利用该等电点的差异纯化多特异性抗体。具体来说是含有以下的(a)-(c)的步骤的纯化方法。

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中一方，使第1多肽和第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)通过标准的色谱法，从宿主细胞培养物中纯化该多特异性抗体。

包含通过上述纯化方法进行纯化的步骤的多特异性抗体的制备方法也包含在本发明中。

本发明的核酸通常是被克隆(插入)到适当的载体中，导入到宿主细胞中。该载体只要可稳定保有插入的核酸即可，没有特别限定，例如，宿主如果使用大肠杆菌则克隆用的载体优选pBluescript载体(Stratagene制备)等，还可利用市场销售的各种载体。为了生产本发明的多特异性抗体(多肽)，使用载体时表达载体特别有效。表达载体只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，没有特别限定，例如，如果在试管内表达则优选pBEST载体(プロメガ制备)，如果在大肠杆菌中表达则优选pEP载体(Invitrogen制备)，如果在培养细胞中表达则优选pME18S-SL3载体(GenBank登记号No.AB009864)，如果在生物个体中表达则优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。本发明的DNA向载体中的插入可通过常规方法，例如可通过使用限制酶切位点的连接酶反应进行(Current protocols in Molecular Biologyedit.Ausubel等人.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section11.4-11.11)。

上述宿主细胞没有特别限定，可以根据目的使用各种宿主细胞。用于表达多肽的细胞例如有细菌细胞(例如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌)、真菌细胞(例如酵母、曲霉)、昆虫细胞(例如黑腹果蝇S2、夜蛾SF9)、动物细胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞)和植物细胞。载体对宿主细胞的导入例如可通过磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in MolecularBiology edit.Ausubel等人.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section9.1-9.9)、脂转染法、显微注射法等公知的方法进行。

为了使在宿主细胞中表达的多肽在内质网的内腔中、周质中、或者细胞外的环境中分泌，可以将适当的分泌信号整合到目标多肽中。这些信号对于目标多肽可以是内源性，也可以是不同种的信号。

上述制备方法中，对于多特异性抗体(多肽)的回收，当本发明的多肽分泌到培养基中时则回收培养基。本发明的多肽在细胞内产生时，首先溶解该细胞，然后回收多肽。

从重组细胞培养物中回收本发明的多肽并纯化时，可以采用包含磷酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱等公知的方法。

本发明还涉及含有本发明的多特异性抗体以及可药用的载体的组合物(药物)。

本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或者检查、诊断的药物。

本发明的药物组合物可以按照本领域所公知的方法制成制剂。例如，可以以与水或除此之外的可药用的液体形成的无菌性溶液或混悬剂的注射剂形式非口服使用。例如，可以与可药用的载体或介质、具体来说灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘结剂等适当组合，以通常认可的制药实施所要求的单元用量形式混合，制成制剂。这些制剂中的有效成分量设定为可获得所指示的范围的适当的容量。

用于注射的灭菌组合物可使用如注射用蒸馏水的载体，按照通常的制剂实施进行处方。

注射用的水溶液例如有：含有生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助试剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的等渗液。也可以结合使用适当的溶解助剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇80(TM)、HCO-50等)。

油性液体有芝麻油、大豆油，溶解助剂可以结合使用苯甲酸苄酯和/或苄醇。还可以配合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苄醇和苯酚)、抗氧化剂。制备的注射液通常填充在适当的安瓿瓶中。

本发明的药物组合物优选非口服给予。例如可以制成注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、透皮给予型的组合物。例如通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等可以全身或局部给予。

给予方法可根据患者的年龄、症状适当选择。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量例如可设定为每次按照1公斤体重为0.0001mg-1000mg的范围。或者例如每位患者可以是0.001-100000mg的给予量，本发明并不限于这些数值。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等变化，本领域技术人员可考虑这些条件适当设定给予量和给予方法。

还可以根据需要将本发明的多特异性抗体与其它药物成分组合，制成制剂。

本发明还提供编码构成本发明的多特异性抗体的多肽的核酸。并且，担载有该核酸的载体也包含在本发明中。

本发明进一步提供具有上述核酸的宿主细胞。该宿主细胞没有特别限定，例如有大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞例如可以以用于本发明的抗体或多肽的制备或表达的生产体系的形式使用。用于制备多肽的生产体系中有体外和体内的生产体系。体外的生产体系有使用真核细胞的生产体系和使用原核细胞的生产体系。

可作为宿主细胞使用的真核细胞例如有动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞例如有哺乳类细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney，幼鼠肾细胞)、HeLa、Vero等、两栖类细胞例如非洲爪蟾卵细胞(Valle，等人.，Nature(1981)291：338-340)、以及昆虫细胞例如Sf9、Sf21、Tn5。本发明的抗体的表达中，优选采用CHO-DD44、CHO-DX11B、COS7细胞、HEK293细胞、BHK细胞。动物细胞中，为了大量表达，特别优选CHO细胞。载体对宿主细胞的导入例如可通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子性脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim制备)的方法、电穿孔法、脂转染等方法进行。

植物细胞例如已知有来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞和浮萍(Lemma minor)作为蛋白质生产体系，通过将该细胞进行愈伤组织培养可以生产本发明的抗体。公知有使用酵母例如糖酵母(Saccharomyces)属的细胞(啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等)；和丝状菌例如曲霉(Aspergillus)属的细胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)的蛋白质表达体系，可用作本发明的抗体生成的宿主。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产体系。细菌细胞除上述大肠杆菌(E.coli)之外，还已知使用枯草杆菌的生产体系，也可用于本发明的抗体生成。

使用本发明的宿主细胞生产抗体时，可以进行宿主细胞的培养，使多核苷酸表达，其中，所述宿主细胞用含有编码本发明抗体的多核苷酸的表达载体转化。例如以动物细胞为宿主时，培养液例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，可以结合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补液，通过无血清培养进行细胞培养。培养时的pH优选约6-8。培养通常在约30-40℃下进行约15-200小时，可以根据需要进行培养基的更换、通气、搅拌。

体内生产多肽的体系中例如有使用动物的生产系统或使用植物的生产系统。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，在动物或植物的体内生成多肽并回收。本发明的“宿主”包含这些动物、植物。

使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产体系。哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUMBiotechnology Applications(1993))。使用哺乳类动物时，可以使用转基因动物。

例如将编码本发明的抗体的多核苷酸和编码如山羊β酪蛋白等乳汁中特有生产的多肽的基因以融合基因的形式制备。接着，将含有该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊的胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。从接受了胚胎的山羊所生产的转基因山羊、或其子孙所生产的乳汁中可以获得目标抗体。为了使含有由转基因山羊生产的抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊适当给予激素(Ebert等人.，Bio/Technology(1994)12：699-702)。

生产本发明的抗体的昆虫例如可以使用蚕。使用蚕时，将插入了编码目标抗体的多核苷酸的杆状病毒感染蚕，由此可从蚕的体液中获得目标抗体(Susumu等人.，Nature(1985)315：592-594)。

将植物用于本发明的抗体生产时，例如可以使用烟草。使用烟草时，将编码目标抗体的多核苷酸插入到植物表达用的载体例如pMON 530中，将该载体导入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等的细菌中。将该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)，可由该烟叶获得所需抗体(Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24：131-138)。将同样的细菌感染浮萍，进行克隆后可由浮萍的细胞中获得所需抗体(Cox K.M.等人.，Nat.Biotechnol.2006 Dec；24(12)：1591-1597)。

上述得到的抗体可从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)中分离，纯化为实质上纯粹、均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常在多肽的纯化中使用的分离、纯化方法，并没有任何限定。例如可以将色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳法、透析、重结晶等适当选择、组合，分离并纯化抗体。

色谱例如有：亲和色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤、反相色谱、吸附色谱等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人.，(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。这些色谱可以使用液相色谱例如HPLC、FPLC等液相色谱进行。亲和色谱中使用的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A的柱有：Hyper D、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)等。

还可以根据需要，在抗体的纯化前或纯化后使适当的蛋白质改性酶作用，由此可以施加任意的改性，或可部分地除去肽。蛋白质改性酶例如可使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。

如上所述，包含培养本发明的宿主细胞、由该培养物中回收多肽的步骤的本发明的多特异性抗体的制备方法也是本发明的优选方案之一。

本发明的“多特异性抗体”是可以与至少两种不同的抗原特异性结合的抗体。通过本发明的制备方法或纯化方法得到的优选的多特异性抗体有：可与两种抗原特异性结合的双特异性抗体(BsAb)(也可称为两种类特异性抗体)。

本发明中，“不同的抗原”不必是抗原本身不同，抗原决定基不同的情况等也包含在本发明的“不同的抗原”中。因此，例如单一分子内的不同的抗原决定基团包含在本发明的不同的抗原中，分别识别上述单一分子内的不同的抗原决定基的两种抗体在本发明中可作为识别不同的抗原的抗体使用。

本发明的多特异性抗体是含有与两种以上不同的抗原具有特异性的抗体或抗体片段的分子。

本发明的上述方法中，“核酸的修饰”包含修饰核酸，以得到通过使用标准的色谱法进行分析，将第1多肽和第2多肽分离形成的峰。

本发明的方法中，“修饰核酸”是指修饰核酸，与通过本发明的“修饰”而导入的氨基酸残基对应。更具体地说，对于编码原有的(修饰前)氨基酸残基的核酸，修饰为编码通过修饰导入的氨基酸残基的核酸。

通常是指对于原有的核酸进行至少一个碱基的插入、缺失或置换等基因操作或突变处理，形成编码目标氨基酸残基的密码子。即，编码原有氨基酸残基的密码子被编码通过修饰导入的氨基酸残基的密码子置换。上述核酸的修饰可使用本领域公知的技术、例如位点专一诱变法、PCR突变导入法等适当实施。

本发明中的修饰位置例如有：(1)位于多肽的表面的氨基酸残基、(2)位于可变区、优选FR区的氨基酸残基、(3)位于恒定区的氨基酸残基。

“位于多肽的表面的氨基酸”是其支链可以与溶剂分子(通常为水分子)相接触的氨基酸，不一定是整个支链都与溶剂分子接触，支链的一部分与溶剂分子接触时，该氨基酸是位于表面的氨基酸。本领域技术人员通过使用市售的软件进行的同源性建模等，可以制备多肽或抗体的同源模型，由此可以选择使适当的残基位于表面的氨基酸。

本领域技术人员可以通过由同源性建模等制备的同源性模型，适当选择抗体可变区中的表面氨基酸，例如在H链FR区，可例举H1、H3、H5、H8、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H39、H42、H43、H46、H68、H71、H72、H73、H75、H76、H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、H110、H112为表面氨基酸，但本发明并不限于此。H链的CDR区同样可通过同源性模型选择表面氨基酸，例如H97几乎整个抗体暴露在表面。在L链的FR区可以例举L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、L76、L77、L79、L80、L81、L85、L100、L103、L105、L106、L107、L108作为表面氨基酸，但本发明并不限于此。L链的CDR区同样可通过同源模型选择表面氨基酸。

本发明中，位于可变区的氨基酸残基包含位于重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的氨基酸残基，优选位于支架区(FR)的氨基酸残基。

本发明中，在CDR以外的FR区，暴露在表面的氨基酸例如有：H10、H12、H23、H39、H43、H105，但并不限于此。

本发明中，修饰核酸得到的多肽优选为第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体。例如如下述实施例所述，第1多肽的均多聚体有：人源化A69-H链与人源化BBA-L链的均二聚体，第2多肽的均多聚体有：人源化B26-H链与人源化BBA-L链的均二聚体，第1多肽和第2多肽的杂合多聚体有：人源化A69-H链以及人源化B26-H链与人源化BBA-L链的杂合二聚体，但并不限于此。

本发明的标准的色谱法有：阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水色谱、羟基磷灰石色谱、疏水电荷相互作用色谱、色谱聚焦等。

本发明的上述方法中，第1多肽和第2多肽优选含有重链可变区(VH)。该可变区可含有例如互补决定区(CDR)、支架区(FR)。

本发明的方法中，供给修饰的氨基酸残基的数目没有特别限定，例如，使抗体的可变区修饰时，为了不使与抗原的结合活性降低、为了不提高抗原性，优选使实现目标多肽分离所必须的最低限度的氨基酸残基修饰。

为了不提高抗原性，还优选修饰后氨基酸序列为人序列，但本发明并不限于此。并且，还可以将突变导入到可使修饰后的FR(FR1、FR2、FR3、FR4)作为FR分别为人序列、使等电点发生变化而导入的修饰以外的位置。上述将各FR置换为人序列的方法在非专利文献(Ono K.等人.，Mol.Immunol.1999 Apr；36(6)：387-395)中有报道。为了使各FR的等电点变化，也可以修饰为等电点变化之外的人的FR(例如将FR3与等电点低的以外的人FR交换)。上述人源化方法在非专利文献(Dall’Acqua WF.，Methods.2005 May；36(1)：43-60)中有报道。

如果较少的表面电荷改变无法实现目标多肽的分离，则通过反复进行表面电荷的改变和多肽的分离的评价，可以获得所需多特异性抗体。

本发明的上述方法中，多特异性抗体优选含有含轻链可变区的第3多肽。优选第1多肽和第2多肽分别与第3多肽形成多聚体。

本发明的上述方法中，优选第1多肽和第2多肽含有重链恒定区。更优选重链恒定区中，第1多肽与第2多肽产生pI差。上述重链恒定区有：具有pI差的抗体的重链恒定区，可以使用原来具有pI差的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区，向第1和第2多肽导入pI差；还可以通过只将引起第1和第2多肽的重链恒定区中这些亚类间的等电点差异的氨基酸、或者对这些等电点没有影响的相邻氨基酸同时进行修饰，制备非野生型人恒定区，向两个恒定区导入pI差。根据H链恒定区的EU编号，用于向恒定区导入pI差的修饰位置例如有：H链的第137号、第196号、第203号、第214号、第217号、第233号、第268号、第274号、第276号、第297号、第355号、第392号、第419号、第435号。

通过除去重链恒定区的糖链可以产生pI差。因此糖链施加部位的第297号也作为用于导入pI链的修饰位置。

本发明中，对于上述第1多肽和第2多肽含有重链恒定区的方法，也包含上述第1多肽和第2多肽含有重链可变区的方法，和/或与将上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽、上述第1多肽和上述第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体的方法组合而成的方法。

通过上述方法制备的多特异性抗体也包含在本发明中。

由本发明提供的多特异性抗体中，第1多肽含有重链可变区和/或重链恒定区时，为了实现上述的“等电点产生差异”，例如可以是使该重链可变区的Kabat编号的10号、12号、23号、39号、43号和105号的氨基酸残基，或者该重链恒定区的EU编号的137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基具有电荷。上述编号中所示的第1多肽的氨基酸残基中，只要第1多肽和第2多肽的等电点有差异，具有该电荷的氨基酸残基以外的氨基酸残基可以是与具有该电荷的氨基酸残基为同种电荷，也可以不具有电荷，还可以具有相反的电荷。

本发明的上述多特异性抗体优选的特征在于：第2多肽具有与第1多肽的具有电荷的氨基酸残基为相反的电荷，或者不具有电荷。具体有以下的多特异性抗体：第2多肽含有重链可变区和/或重链恒定区，选自该重链可变区的Kabat编号的10号、12号、23号、39号、43号和105号的氨基酸残基、或该重链恒定区的EU编号的137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基与上述第1多肽中所含的重链可变区和/或重链恒定区中的具有电荷的氨基酸残基具有相反的电荷，或不具有电荷。上述编号所示的第2多肽的氨基酸残基中，只要第1多肽和第2多肽有等电点差异，则具有该电荷的氨基酸残基以外的氨基酸残基可以与具有该电荷的氨基酸残基为同种电荷，也可以不具有电荷，或具有相反的电荷。

为了使等电点降低，例如优选137号采用IgG2或IgG4序列、196号采用IgG1或IgG2或IgG4的序列、203号采用IgG2或IgG4的序列、214号采用IgG2的序列、217号采用IgG1或IgG3或IgG4的序列、233号采用IgG1或IgG3或IgG4的序列、268号采用IgG4的序列、274号采用IgG2或IgG3或IgG4的序列、276号采用IgG1或IgG2或IgG4的序列、355号采用IgG4的序列、392号采用IgG3的序列、419号采用IgG4的序列、435号采用IgG1或IgG2或IgG4的序列。为了使等电点升高，例如优选137号采用IgG1或IgG3的序列、196号采用IgG3的序列、203号采用IgG1或IgG3的序列、214号采用IgG1或IgG3或IgG4的序列、217号采用IgG2的序列、233号采用IgG2的序列、268号采用IgG1或IgG2或IgG3的序列、274号采用IgG1的序列、276号采用IgG3的序列、355号采用IgG1或IgG2或IgG3的序列、392号采用IgG1或IgG2或IgG4的序列、419号采用IgG1或IgG2或IgG3的序列、435号采用IgG3的序列。

这些序列的应用只要可以使两个H链产生足够的等电点差异即可，未必采用所有的序列。

氨基酸中已知有带有电荷的氨基酸。通常带有正电荷的氨基酸(正电荷氨基酸)有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。带有负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸)已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。

上述“具有电荷的氨基酸残基”优选从以下的(a)或(b)的任意一组中所含的氨基酸残基中适当选择，没有特别限定。

(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)

上述抗体中，“具有同种电荷”是指例如重链可变区的上述Kabat编号的氨基酸残基、或重链恒定区的上述EU编号的氨基酸残基的任意一种具有上述(a)或(b)中任意一组所含的氨基酸残基。

“具有相反的电荷”是指例如具有重链可变区和/或重链恒定区的第2多肽中，上述Kabat编号或上述EU编号的氨基酸残基的至少一种氨基酸残基是第1多肽中所含的重链可变区和/或重链恒定区的对应位置的氨基酸残基，具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基时，其余的氨基酸残基具有不同组中所含的氨基酸残基。

即，本发明提供多特异性抗体，其中，上述具有同种电荷的氨基酸残基选自上述(a)或(b)中任意一组所含的氨基酸残基。

原有的(修饰前的)氨基酸残基已经具有电荷时，修饰为不具有电荷的氨基酸残基，这也是本发明的优选方案之一。

本发明中，优选氨基酸残基进行修饰，以使第1多肽和第2多肽的等电点(pI)产生差异，通过修饰导入的氨基酸残基为多个时，这些氨基酸残基中可以以少数含有不具有电荷的氨基酸残基。

本发明还提供多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有下述(a1)-(a7)中任一项所述的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有以下(b1)-(b3)中任一项所述的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有以下(c1)或(c2)所述的氨基酸序列。

(a1)SEQ ID NO.7

(a2)SEQ ID NO.8

(a3)SEQ ID NO.9

(a4)SEQ ID NO.10

(a5)SEQ ID NO.11

(a6)SEQ ID NO.12

(a7)SEQ ID NO.13

(b1)SEQ ID NO.14

(b2)SEQ ID NO.15

(b3)SEQ ID NO.16

(c1)SEQ ID NO.17

(c2)SEQ ID NO.18

上述氨基酸序列是为了更具体地例举本发明中可用于修饰的氨基酸，并不限定为可变区为这些氨基酸的情形。

上述多特异性抗体的优选方案之一有以下多特异性抗体：第1多肽的可变区含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列、第2多肽的可变区含有SEQID NO.16的氨基酸序列、第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.17的氨基酸序列。

另外一个优选的方案之一例如有以下多特异性抗体：第1多肽的可变区含有SEQ ID NO.12的氨基酸序列、第2多肽的可变区含有SEQ IDNO.16的氨基酸序列、第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.18的氨基酸序列。

上述多特异性抗体的又一优选方案之一有以下多特异性抗体：第1多肽和第2多肽含有人IgG4恒定区、第3多肽含有人κ恒定区。

本发明中，“抗体”的术语以最广泛意义使用，只要显示所需生物学活性即可，包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体突变体(嵌合抗体、人源化抗体、低分子化抗体(也包含抗体片段)、多特异性抗体等)。本发明中，在获得这些抗体时，优选采用本发明的抗体修饰方法。

如上所述，本发明中的“抗体”包含对使氨基酸残基的电荷改变的抗体进一步通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入等使氨基酸序列发生改变的抗体。还包含对于通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入，或者嵌合化或人源化等使氨基酸序列发生了改变的抗体进一步发生氨基酸残基的电荷改变的抗体。即，可以与使小鼠抗体人源化的步骤同时修饰，或者将人源化抗体进一步修饰。

氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入，以及人源化、嵌合化等氨基酸序列的改变可按照本领域所公知的方法进行。同样，以重组抗体的形式制备本发明的抗体时所利用的抗体的可变区和恒定区也可通过氨基酸的置换、缺失、附加和/或插入，或嵌合化或人源化等来改变其氨基酸序列。

本发明的抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来自任何动物的抗体。并且，例如可以是将嵌合抗体、其中的人源化抗体等氨基酸序列进行置换的修饰抗体。还可以是结合有各种分子的抗体修饰物、抗体片段、低分子抗体等任何抗体。

“嵌合抗体”是指将来自不同的动物的序列组合制备的抗体。例如，可以是含有小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区和人抗体的重链、轻链的恒定(C)区的抗体。嵌合抗体的制备是公知的，例如可以将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入宿主并生成，由此可获得嵌合抗体。

“人源化抗体”也称为重构(reshaped)人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR所得。鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人.，Sequence of Proteinsof Immunological Interest(1987)，National Institute of Health，Bethesda，Md.；Chothia等人.，Nature(1989)342：877)。另外，其常规的基因重组方法也是公知的(欧洲专利申请公开编号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。因此，通过公知的方法，可以确定例如小鼠抗体的CDR，获得编码该CDR与人抗体的支架区(FR)连接而得的抗体，通过使用通常的表达载体所得的系统生产人源化抗体。上述DNA可以使用制备的在CDR和FR两者的末端区具有重叠部分的多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法合成(参照WO98/13388号公报所述方法)。经由CDR连接而成的人抗体的FR可以进行选择，使CDR形成良好的抗原结合部分。还可根据需要使抗体可变区中的FR的氨基酸修饰，以使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等人.，Cancer Res.(1993)53：851-856)。可修饰的FR中的氨基酸残基包含与抗原直接、或以非共价键结合的部分(Amit等人.，Science(1986)233：747-53)、对于CDR的结构有影响或作用的部分(Chothia等人.，J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)以及与VH-VL相互作用相关的部分(EP239400号专利公报)。

本发明的抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，这些抗体的C区优选使用来自人抗体的区。例如，H链可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、L链可以使用Cκ、Cλ。为了改善抗体或其生产的稳定性，可以根据需要修饰人抗体C区。本发明中的嵌合抗体优选含有来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的恒定区。人源化抗体优选含有来自人以外的哺乳动物的抗体的CDR、以及来自人抗体的FR和C区。来自人抗体的恒定区是每种IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等同型中具有特有的氨基酸序列。本发明的人源化抗体中使用的恒定区可以是属于任意同型的抗体的恒定区。优选使用人IgG的恒定区，但并不限于此。另外，在人源化抗体中所利用的来自人抗体的FR也没有特别限定，可以是属于任意同型的抗体。

本发明的嵌合抗体和人源化抗体的可变区和恒定区在可显示原有抗体的结合特异性的范围内，可以通过缺失、置换、插入和/或附加等进行修饰。

利用来自人的序列得到的嵌合抗体和人源化抗体中，在人体内的抗原性降低，因此可根据治疗目的等给予人。

低分子化抗体从体内动力学的性质角度考虑，以及从可使用大肠杆菌、植物细胞等以低成本制备考虑，可用作抗体。

抗体片段是低分子化抗体的一种。低分子化抗体包含将抗体片段作为其结构的一部分的抗体。本发明中的低分子化抗体只要具有与抗原的结合能力即可，对其结构、制备方法等没有特别限定。低分子化抗体中也存在比全长抗体具有更高活性的抗体(Orita等人.，Blood(2005)105：562-566)。本说明书中，“抗体片段”只要是全长抗体(例如全长IgG等)的一部分即可，没有特别限定，优选含有重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。优选的抗体片段的例子例如有：Fab、F(ab＇)2、Fab＇、Fv等。抗体片段中的VH或VL的氨基酸序列可以通过置换、缺失、附加和/或插入进行修饰。并且只要保持与抗原的结合能力即可，可以使VH和VL的一部分缺损。例如，上述抗体片段中的“Fv”是含有完全的抗原识别部位和结合部位的最小抗体片段。“Fv”是一个VH和一个VL通过非共价键强力结合的二聚体(VH-VL二聚体)。根据各可变区的三个互补链决定区(CDR)，可以在VH-VL二聚体的表面形成抗原结合部位。六个CDR使抗体具有抗原结合部位。但是，一个可变区(或者为只含有抗原特异性的三个CDR的Fv的一半)，其亲和性比与全部结合部位低，但仍具有识别抗原并结合的能力。因此，上述比Fv小的分子也包含在本发明的抗体片段中。抗体片段的可变区可以进行嵌合化或人源化。

低分子化抗体优选含有VH和VL两者。低分子化抗体的例子有：利用Fab、Fab＇、F(ab＇)₂和Fv等抗体片段、以及可利用抗体片段制备的scFv(信号链Fv)等(Huston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：5879-83；Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”Vol.113，Resenburg and Moore(eds.)，Springer Verlag，New York，pp.269-315，(1994))；diabodies(Holliger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：6444-8；EP 404097；WO93/11161；Johnson等人.，Method inEnzymology(1991)203：88-98；Holliger等人.，Protein Engineering(1996)9：299-305；Perisic等人.，Structure(1994)2：1217-26；John等人.，ProteinEngineering(1999)12(7)：597-604；Atwell等人.，Mol.Immunol.(1996)33：1301-12)；sc(Fv)2(Hudson等人，J Immunol.Methods(1999)231：177-89；Orita等人.，Blood(2005)105：562-566)；triabodies(Journal ofImmunological Methods(1999)231：177-89)；tandem diabodies(CancerResearch(2000)60：4336-41)。

抗体片段可通过酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶蛋白酶等对抗体进行处理获得(参照Morimoto等人.，J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24：107-17；Brennan et al.，Science(1985)229：81)。可以以该抗体片段的氨基酸序列为基础，通过基因重组制备。

具有使抗体片段修饰的结构的低分子化抗体可以利用由酶处理或基因重组得到的抗体片段进行构建。或者可以构建编码低分子化抗体全体的基因，将其导入表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co等人.，J.Immunol.(1994)152：2968-76；Better和Horwitz，MethodsEnzymol.(1989)178：476-96；Pluckthun和Skerra，Methods Enzymol.(1989)178：497-515；Lamoyi，Methods Enzymol.(1986)121：652-63；Rousseaux等人.，Methods Enzymol.(1986)121：663-9；Bird和Walker，Trends Biotechnol.(1991)9：132-7)。

上述“scFv”是将两个可变区根据需要经由接头等结合而成的单链多肽。scFv中所含的两个可变区通常是一个VH和一个VL，也可以是两个VH或两个VL。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间含有接头，由此可以形成为了结合抗原而必须的VH和VL的成对的部分。通常，在同一分子内，为了在VH和VL之间形成成对的部分，通常是将连接VH和VL的接头制成10个氨基酸以上长度的肽接头。只要不妨碍scFv的形成，本发明的scFv的接头并不限于上述多肽接头。scFv的总论可参考Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibody”，Vol.113(Rosenburg and Moore ed.，Springer Verlag，NY，pp.269-315(1994))。

另外，“双价小抗体(diabody，Db)”是指通过基因融合构建的双价的抗体片段(P.Holliger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；EP 404,097号；WO93/11161号等)。双价小抗体是由两根多肽链构成的二聚体，多肽链是在个自、相同的链中，轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)经由短的、例如5个残基左右的接头结合在互相不能结合的位置上。被编码在同一多肽链上的VL和VH，由于它们之间的接头短，因此无法形成单链V区片段，而形成二聚体，因此双价小抗体具有两个抗原结合部位。此时，如果同时表达将两个不同的表位(a、b)所对应的VL和Vh以VLa-VHb和VLb-VHa的组合、以5个残基左右的接头连接所得，则以双特异性Db的形式分泌。

双价小抗体含有两个分子的scFv，因此含四个可变区。结果具有两个抗原结合部位。与未形成二聚体的scFv的情形不同，为了形成双价小抗体，如果通常各scFv分子内的连接VH和VL之间的接头制成多肽接头，则可以制成5个氨基酸左右。但是，形成双价小抗体的scFv的接头只要不妨碍scFv的表达、不妨碍双价小抗体的形成即可，并不限于上述肽接头。

本发明中进一步优选双特异性抗体作为多特异性抗体。

上述“双特异性抗体”是指重链可变区和轻链可变区连接成一条链的结构的抗体(例如可以是sc(Fv)2)。还可以是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接成scFv(或sc(Fv)2)、将其与Fc区(欠缺CH1结构域的恒定区)结合而成的抗体样分子(例如scFv-Fc)。含有scFv-Fc的多特异性抗体具有(scFv)2-Fc型的结构，该结构由以下形成：第1多肽为VH1-接头-VL1-Fc、第2多肽为VH2-接头-VL2-Fc。还可以是单结构域抗体与Fc区结合而成的抗体样分子(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2006，9(2)，184-93)。

本发明的方法中，编码导入突变前的抗体(本说明书中可简称为“本发明的抗体”)的H链或L链的基因可使用已知的序列，还可以按照本领域公知的方法获得。例如可以从抗体文库中获得，还可以从生产单克隆抗体的杂交瘤中克隆编码抗体的基因来获得。

关于抗体文库，已公知很多抗体文库，还公知抗体文库的制备方法，因此，本领域人员可以获得适当的抗体文库。例如对于抗体噬菌体文库可以参照Clackson等人.，Nature 1991，352：624-8；Marks等人.，J.Mol.Biol.1991，222：581-97；Waterhouses等人.，Nucleic Acids Res.1993，21：2265-6；Griffiths等人.，EMBO J.1994，13：3245-60；Vaughan等人.，NatureBiotechnology 1996，14：309-14；以及日本特表平20-504970号公报等文献。其它还可以使用将真核细胞制成文库的方法(WO95/15393号说明书)或核糖体展示法等公知的方法。并且还已知由使用人抗体文库、通过淘选获得人抗体的技术。例如，可以将人抗体的可变区制成单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。对所选择的噬菌体的基因进行分析，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果了解了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以以该序列为基础制备适当的表达载体，获得人抗体。这些方法是已知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。

由杂交瘤获得编码抗体的基因的方法基本上可以使用公知技术，可如下获得：使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，将其按照常规的免疫方法进行免疫，将所得免疫细胞通过通常的细胞融合与公知的母细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体生成细胞(杂交瘤)，使用反转录酶，从所得杂交瘤的mRNA中合成抗体的可变区(V区)的cDNA，将其与编码抗体恒定区(C区)的DNA连接。

更具体地说，用于获得编码上述H链和L链的抗体基因的致敏抗原包含具有免疫原性的完全抗原和含有不显示免疫原性的半抗原等的不完全抗原两者，但并不限于该例举。例如可以使用目标蛋白质的全长蛋白或部分肽等。除此之外还已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质可以作为抗原，本发明的抗体的抗原没有特别限定。抗原的制备可按照本领域公知的方法进行，例如可按照使用杆状病毒的方法(例如WO98/46777等)进行。杂交瘤的制备例如可按照Milstein等人.(G.Kohler和C.Milstein，Methods Enzymol.1981，73：3-46)的方法等进行。抗原的免疫原性低时，可以与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合，进行免疫。还可根据需要使抗原与其它分子结合，制成可溶性抗原。使用受体等的跨膜分子作为抗原时，可以使用受体胞外区部分作为片段，或使用在细胞表面上表达跨膜分子的细胞作为免疫原。

抗体生成细胞可使用上述适当的致敏抗原免疫动物获得。或者将可生成抗体的淋巴细胞进行体外免疫，制成抗体生成细胞。被免疫的动物可使用各种哺乳动物，通常使用啮齿目、兔目、灵长目动物。可例举小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿目。兔等兔目。食蟹猴、猕猴、狒狒、黑猩猩等的灵长目动物。除此之外还已知具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物，使用上述动物也可以获得人抗体(参照WO96/34096；Mendez等人.，Nat.Genet.1997，15：146-56)。例如体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞对人淋巴细胞致敏，将致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，以此代替上述转基因动物的使用，可以获得与抗原具有结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878号)。另外，具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物用所需抗原免疫，则可以获得所需的人抗体(参照WO93/1227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735)。

动物的免疫例如可如下进行：用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水等将致敏抗原稀释并悬浮，根据需要混合佐剂进行乳化，然后注射到动物的腹腔内或皮下。然后优选每隔4-21天给予数次混合在氟氏不完全佐剂中的致敏抗原。抗体生成的确认可通过常用的方法测定动物血清中的目标抗体效价来进行。

杂交瘤可以用常用的融合剂(例如聚乙二醇)，将从用所需抗原免疫了的动物或由淋巴细胞中得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合制备(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986，59-103)。还可根据需要培养杂交瘤细胞，使其增殖，通过免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法测定由该杂交瘤生成的抗体的结合特异性。然后根据需要将生产测定了目标特异性、亲和性或活性的生成抗体的杂交瘤通过极限稀释法等方法进行亚克隆。

接着，使用可与抗体特异性结合的探针(例如与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等)，从杂交瘤或抗体生成细胞(致敏淋巴细胞等)中克隆编码被选择的抗体的基因。还可以通过RT-PCR从mRNA中克隆。免疫球蛋白分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五个不同的类。并且这些类又分为几种亚类(同型)(例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2等)。本发明中，在抗体的制备中使用的H链和L链可以来自属于这些任意的类和亚类的抗体，没有特别限定，特别优选IgG。

这里，可以通过基因工程的方法将使编码H链和L链的基因修饰。例如对于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、绵羊抗体、骆驼抗体等抗体，为了降低与人的异种抗原性等，可以适当制备人工修饰的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。嵌合抗体是含有人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的H链、L链的可变区和人抗体的H链、L链的恒定区的抗体，可如下获得：将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入宿主并生产。人源化抗体也称为重构人抗体，如下合成：通过PCR法，由制备的末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸合成设计成连接有人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)的DNA序列由。将所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主并生成(参照EP239400，WO96/02576)。经由CDR连接的人抗体的FR选择互补决定区形成良好的抗原结合部位的FR。还可以根据需要，置换抗体的可变区的支架区的氨基酸，使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(K.Sato等人.，Cancer Res.1993，53：851-856)。

除上述人源化之外，还可以为了改善与抗原的结合性等抗体的生物学特性而进行修饰。本发明的修饰可通过位点专一性突变(例如参照Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)、PCR突变、盒突变法等方法进行。通常，生物学特性得到改善的抗体突变体与原有的抗体的可变区的氨基酸序列具有70％或以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上(例如95％以上、97％、98％、99％等)的氨基酸序列同源性和/或以类似性。本说明书中，序列的同源性和/或类似性是根据需要使序列重整以及导入缺口，使序列同源性获得最大值，然后以与原有的抗体残基相同(相同残基)或类似(通常根据氨基酸支链的特性被分类为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比例定义。通常，天然的氨基酸残基根据其支链的性质被分类为(1)疏水性：丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸；(2)中性亲水性：天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸；(3)酸性：天冬氨酸和谷氨酸；(4)碱性：精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(5)对链的取向有影响的残基：甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

通常，存在于H链和L链可变区中的全部中，六个互补决定区(超可变部；CDR)相互作用，形成抗体的抗原结合部位。已知其中的一个可变区的亲和性比含有全部结合部位的低，但是仍具有识别抗原并结合的能力。因此，对于本发明的编码H链和L链的抗体基因，只要由该基因所编码的多肽可以保持与所需抗原的结合性即可，可以编码含有H链和L链各抗原结合部位的片段部分。

根据本发明的方法，如上所述，例如可以保持实际活性，有效地获得双特异性抗体。

重链可变区如上所述，通常由3个CDR区和4个FR区构成。本发明的优选方案中，进行“修饰”的氨基酸残基可以从位于CDR区或FR区的氨基酸残基中适当选择。通常CDR区的氨基酸残基的修饰可以使其与抗原的结合能力降低。因此，本发明中，进行“修饰”的氨基酸残基并没有特别限定，优选从位于FR区的氨基酸残基中适当选择。

在人或小鼠等生物中，本领域技术人员可以利用公共数据库等适当获得可用作抗体的可变区的FR的序列。更具体地说，通过后述实施例的方法，可以获得FR区的氨基酸序列信息。

本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照原引到本说明书中。

实施例

以下通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

[实施例1]具有杂合L链的双特异性抗体的人源化

在日本特愿2005-112514中，对于含有凝血时间缩短效果最高的抗FactorIXa抗体A69-VH、抗FactorX抗体B26-VH、杂合L链(BBA)的组合的双特异性抗体如下进行人源化。

1-1人抗体的同源性检索

由一般公开的Kabat数据库(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/)获得人抗体氨基酸序列数据，使用构建的数据库，分成小鼠A69-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.19)、小鼠B26-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.20)、小鼠BBA-L链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO.21)进行同源性检索。结果可以确认：与以下所示人抗体序列具有较高的同源性，由此决定在人源化抗体的支架区(以下称为FR)使用。

(1)A69-H链可变区：KABATID-000064(Kabat数据库)

(Kipps等人.，J.Clin.Invest.1991；87：2087-2096)

(2)B26-H链可变区：EMBL登记号AB063872(IMGT数据库)

(未公开数据)

(3)BBA-L链可变区：KABATID-024300(Kabat数据库)

(Welschof等人.，J.Immunol.Method.1995；179：203-214)

将各小鼠抗体的互补性抗原决定区(以下称为CDR)移植到(1)-(3)的人抗体的FR，制备人源化抗体。

使用NCBI中一般公开的同源性检索网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，检索与(4)-(6)的人抗体的同源性高的人抗体分泌信号序列。使用检索得到的、以下所示的分泌信号序列。

(4)A69-H链可变区：Genbank登记号AF062257。

(5)B69-H链可变区：Genbank登记号AAC18248。

(6)BBA-L链可变区：Genbank登记号AAA59100。

1-2人源化抗体基因表达载体的构建

在编码由分泌信号序列至抗体可变区的氨基酸序列的碱基序列中，交互制备12条50个碱基左右的寡DNA，使3＇末端一侧有约20个碱基左右杂合。合成寡DNA设计成在5＇末端一侧编码人序列，在3＇末端一侧编码小鼠序列，或者全部碱基编码人序列。并且，在抗体可变区基因的5＇末端退火，与具有XhoI切断序列的引物一起在抗体可变区基因的3＇末端退火，制备具有SfiI切断序列且编码内含子序列的5＇末端序列的引物。

将各1μL制备成2.5μM的合成寡DNA混合，加入1×TaKaRa ExTaq缓冲液、0.4mM dNTPs、0.5单位TaKaRa Ex Taq(均为宝酒造制备)，制备成48μL反应液。在94℃下保温5分钟后，将含有94℃2分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的反应进行2个循环，实施各合成寡DNA的装配和链延伸反应。接着，添加1μL在抗体基因的5＇末端和3＇末端退火的引物(各10μM)，将含有94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟的反应进行35个循环，在72℃反应5分钟，扩增抗体可变区基因。PCR后，将反应液总量供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIA quick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书的方法纯化目标大小(约400dp)的扩增片段，用30μL灭菌水洗脱。使用pGEM-T Easy载体系统(Promega)，按照所附说明书的方法对该片段进行克隆。各DNA片段的碱基序列是使用BigDye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA测序仪或ABI PRISM 3700 DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照所附说明书的方法确定各DNA片段的碱基序列。

将插入了确认为正确的人源化抗体可变区基因序列的H链可变区片段的质粒用XhoI和SfiI、将插入了L链可变区片段的质粒用EcoRI消化，然后将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书的方法纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。然后如下制备动物细胞用表达载体。为了使H链为杂合组合的IgG4优先表达，参考IgG1的knobs-into-hole技术(Merchant AM等人.，Nature Biotechnology，1998年，Vol.16，p.677-681)，使用IgG4的CH3部分的氨基酸置换体。并为了促进H链的二聚体形成，向铰链导入氨基酸置换(-ppcpScp-→-ppcpPcp-)。在具有鸡β肌动蛋白启动子的pCAGGS(Niwa等人.，Gene，1991年，Vol.108，193-199页)中整合置换为Y39C、T366W的恒定区基因，向所得表达载体中插入人源化A69H链可变区抗体基因片段，制备人源化A69H链表达载体。另外，在pCAGGS中整合置换为E356C、T366S、L368A、Y407V的恒定区基因，向所得表达载体中插入人源化B26H链可变区抗体基因片段，制备人源化B26H链表达载体。另外，在pCAGGS中插入了野生型抗体L链恒定区得到的质粒(pCAG-gκDNA)用EcoII消化，制备插入了人源化BBA L链可变区抗体基因片段的表达载体。连接反应是使用Rapid DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)，转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺绩制备)。

1-3人源化双特异性抗体的表达

采用以下方法进行人源化双特异性抗体的表达。来自人胎肾癌细胞的人源化双特异性抗体的表达使用实施例1-2所述方法或以下方法进行。将来自人胎肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5-6×10⁵个/mL的细胞密度、以10mL接种于粘着细胞用培养皿(直径10cm，CORNING)的各皿中，在CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)内培养一昼夜，然后吸引除去培养基，添加6.9mL含有1％胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。将在1-2中制备的质粒DNA混合液(合计13.8μg)与20.7μL 1μg/mL聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μL CHO-S-SFM-II培养基混合，在室温下静置10分钟，将其加入到各培养皿的细胞中，在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内培养4-5小时。然后添加6.9mL含有1％胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基，在CO₂培养箱内培养3天。回收培养上清，然后离心(约2000g，5分钟，室温)除去细胞，进一步过0.22μm滤器MILLEX^(R)-GV(Millipore)进行灭菌，该样品在使用之前在4℃下保存。

1-4人源化双特异性抗体的纯化

向按照实施例1-2所述方法得到的培养上清中添加100μL的rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下颠倒混合4小时以上。将该溶液转移至0.22μm的滤器杯Ultrafree^(R)-MC(Millipore)，用500μL含有0.01％吐温^(R)20的TBS洗涤三次，将100μL含有0.01％吐温^(R)20的50mM乙酸钠溶液悬浮于rrProtein ASepharose^TM树脂中，使pH为3.3，静置2分钟，然后使抗体溶出。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl pH7.8进行中和。

1-5人源化双特异性抗体的浓度定量

如下所示按照两种方法进行测定。

用包被缓冲液将山羊Goat抗人IgG(Biosource International)制备成1μg/mL，固定于Nunc-Immuno板上(Nunc)。用稀释缓冲液(D.B.)进行封闭，然后添加用D.B.适当稀释的培养上清样品。同样地添加由2000ng/mL以3倍系列、用D.B.稀释为11个梯度的人IgG4(人源化抗TF抗体，参照WO 99/51743)，作为用于计算抗体浓度的标准品。洗涤3次后，使其与山羊抗人IgG、碱性磷酸酶反应(Biosource International)。洗涤5次后，以Sigma 104^(R)磷酸酶底物(Sigma-Aldrich)作为底物进行显色，通过吸光度读数仪型号3550(Bio-Rad Laboratories))、以665nm作为参照波长测定405nm的吸光度。使用微量板管理III(Bio-Rad Laboratories)软件，由标准品的校正曲线计算培养上清中人IgG的浓度。

还使用Biacore 1000(BIACORE)，使用固定有蛋白A的传感芯片CM5(BIACORE)进行定量。具体来说，按照生产商的说明书，将用10mM乙酸钠水溶液(pH4.0，BIACORE)稀释为50μg/mL的蛋白A(SIGMA)溶液以5μL/分钟在活化的传感芯片反应30分钟，然后实施封闭操作，制备固定有蛋白A的传感芯片。使用该传感芯片、使用Biacore 1000(BIACORE)，测定培养上清和纯化品的浓度。传感芯片的固定和浓度测定是使用HBS-EP缓冲液(BIACORE)。浓度测定时的标准品使用由4000ng/mL按照2倍系列用HBS-EP缓冲液稀释为6个梯度的人源化IgG4抗体(人源化抗TF抗体，参照WO99/51743)。

1-6人源化双特异性抗体的凝血活性评价

为了明确双特异性抗体对血友病A血液的凝固能力是否有改变，研究该抗体对使用乏因子VIII血浆的活化部分凝血酶时间(APTT)的影响。将50μL各种浓度的抗体溶液、50μL乏因子VIII血浆(Biomerieux)和50μL APTT试剂(Dade Behring)的混合液在37℃下加温3分钟。凝固反应是通过将50μL 20mM的CaCl₂(Dade Behring)加入到该混合液中引发。通过连接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)测定至凝固所需时间。

以乏因子VIII血浆的凝固时间为0％，以正常血浆的凝固时间为100％，制作校正曲线，使用该校正曲线，由添加了双特异性抗体时的凝固时间计算双特异性抗体的因子VIII样活性(％)。

1-7保持凝血活性的人源化双特异性抗体的获得

在上述凝血活性评价中，对于凝血能力低的人源化双特异性抗体，关注其活性的升高，使人源化抗体FR的氨基酸修饰。具体来说，使用QuikChange位点专一性突变试剂盒(Stratagene)，按照所附说明书记载的方法向人源化抗体可变区导入突变。将插入了确认为目标人源化抗体可变区基因序列的H链可变区片段的质粒用XhoI和SfiI、将插入了L链可变区片段的质粒用EcoRI消化，然后将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书记载的方法纯化目标大小(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。然后按照实施例1-2所示方法制备动物细胞用表达质粒。按照实施例1-3、1-4、1-5所示方法制备人源化双特异性抗体，按照实施例1-6所示方法评价凝血活性。

将FR序列的氨基酸修饰和血液凝固能力的评价反复进行，获得与嵌合双特异性抗体(A69/B26/BBA)具有同等活性的人源化双特异性抗体(人源化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))(图1)。将各抗体可变区序列表示为以下的SEQ IDNO。

(1)人源化A69抗体VH(hA69a)SEQ ID NO.1(碱基序列)、SEQID NO.2(氨基酸序列)

(2)人源化B26抗体VH(hB26-F123e4)SEQ ID NO.3(碱基序列)、SEQ ID NO.4(氨基酸序列)

(3)人源化BBA抗体VHL(hAL26-F123j4)SEQ ID NO.5(碱基序列)、SEQ ID NO.6(氨基酸序列)

[实施例2]为了双特异性抗体的分离而确定可变区氨基酸修饰位置在制备双特异性抗体时的表达中，使用两种H链和一种L链，则人源化A69-H链和人源化BBA-L链的均二聚体、人源化B26-H链和人源化BBA-L链的均二聚体、人源化A69-H链和人源化B26-H链与人源化BBA-L链的杂合二聚体三种抗体表达。将该三种抗体分离，为了只纯化双特异性抗体，使人源化A69H链可变区的等电点降低，使人源化B26H链可变区的等电点升高，进行氨基酸修饰。

首先，为了确认暴露在人源化A69抗体和人源化B26抗体的可变区表面的氨基酸残基，使用MOE软件(Chemical Computing Group Inc.)，通过同源性建模制备人源化A69抗体和人源化B26抗体的抗体Fv区模型。模型如图2所示，通过该模型的详细分析，在CDR以外的FR序列中，在露出于表面的氨基酸中，H10、H12、H23、H39、H43、H105(Kabat编号，Kabat EA等人.1991.Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.NIH)是不会使活性降低、而可以使等电点变化的候选氨基酸。

[实施例3]人源化双特异性抗体的可变区氨基酸的修饰

在实施例2中所选定的位置，为了制备修饰抗体而进行氨基酸修饰。具体来说，使用QuikChange位点专一性突变试剂盒(Stratagene)，按照所附说明书记载的方法制备人源化A69抗体H链可变区(hA69a，SEQ IDNO.1)和人源化B26抗体H链可变区(hB26-F123e4，SEQ ID NO.3)，向其中导入突变。将插入了确认为目标人源化抗体可变区基因序列的H链可变区的片段的质粒用XhoI和SfiI消化，然后将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照所附说明书记载的方法纯化目标大小(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。按照实施例1-2所示的方法，参考konbs-into-hole技术，将制备的DNA片段插入到置换了恒定区氨基酸的表达质粒和具有野生型恒定区的表达质粒中，制备H链表达载体。然后按照实施例1-3、1-4、1-5所示方法制备人源化双特异性抗体。修饰的人源化抗体的可变区序列如以下表1所述SEQ ID NO所示。

表1

[实施例4]修饰的人源化抗体的等电聚焦电泳分析

为了对可变区的氨基酸修饰导致的表面电荷变化进行评价，实施修饰抗体的制备以及等电聚焦电泳的分析

将人源化BBA-L链(hAL-F123j4)表达载体与使人源化A69-H链修饰得到的hA69-p18、hA69-p8、hA69-p17、hA69-p16和未修饰的hA69a的各H链表达载体组合，同时表达，由此制备由hA69、hA69a-p18、hA69-p8、hA69-p17、hA69-p16五种均二聚体构成的抗体。同样，将人源化BBA-L链表达载体与使人源化B26-H链修饰得到的hB26-p19、hB26-p15和未修饰的hB26-F123e4的各H链表达载体组合，同时表达，由此制备由hB26-F123e4、hB26-p19、hB26-p15三种均二聚体构成的抗体。等电聚焦电泳如下进行。使用Phastsystem Cassette(Amercham Bioscience制备)，用以下的溶胀液用使Phast-Gel Dry IEF(Amercham Bioscience制备)凝胶溶胀约30分钟。

20％甘油                                0.95mL

milliQ水                                0.95mL

Bio-Lyte7/9(BioRad制备)                 10μL

Bio-Lyte3/10(BioRad制备)                10μL

Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amercham Bioscience制备)   80μL

使用溶胀的凝胶，通过Phastsystem(Amercham Bioscience制备)，按照以下程序进行电泳。样品是在步骤2添加到凝胶中。pI标志使用pl校正曲线试剂盒(Amersham Biosciences)。

步骤1：2000V   2.5mA  3.5W  15℃  75Vh

步骤2：200V    2.5mA  3.5W  15℃  15Vh

步骤3：2000V   2.5mA  3.5W  15℃  410Vh

电泳后的凝胶用20％TCA固定，然后用Silver staining试剂盒、蛋白质(Amersham Biosciences)，按照试剂盒所附的说明书进行银染。染色后，由pI标志的已知等电点计算样品的等电点。

未修饰和修饰的人源化A69抗体的均二聚体、人源化B26抗体的均二聚体的分析结果如图3所示。通过表面电荷的改变，在等电聚焦电泳中观察到条带的移动。以pI标志为参考推测的各抗体的等电点是相对于未修饰的hA69a均二聚体的8.8，修饰的hA69-p18约为8.4，hA69-p17约为8.2，hA69-p8约为8.1，通过修饰可以产生最大约0.7的等电点差。人源化B26均二聚体也同样，相对于未修饰的hB26-F123e4的9.1，修饰的hB26-p19约为9.3，hB26-p15约为9.4，通过修饰产生了最大约0.3的等电点差。本研究显示，将所选择的可变区H12、H23、H39、H43、H105的表面氨基酸进行电荷改变，可以使等电点发生变化。

[实施例5]修饰的人源化抗体的阳离子交换色谱分析

使用在实施例4中制备的修饰抗体，按照以下方法进行阳离子交换色谱的分析，评价修饰对两种抗体分离带来的影响。阳离子交换色谱分析条件如下，计算人源化A69抗体的均二聚体、人源化B26抗体的均二聚体的保留时间。

柱：ProPac WCX-10，4 x 250mm，(Dionex)

流动相：A：10mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH6.25

B：10mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，500mmol/L NaCl，pH6.25

流速：1.0mL/min

梯度：10％B(5分钟)→(40分钟)→60％B→(5分钟)→100％B(5分钟)

检测：220nm

未修饰和修饰的五种人源化A69抗体的均二聚体的分析结果如图4所示，未修饰和修饰的三种人源化B26抗体的均二聚体的分析结果如图5所示。未修饰人源化A69抗体的均二聚体和人源化B26抗体的均二聚体的保留时间均为25分钟左右，无法进行两种均二聚体的分离、乃至目标双特异性抗体的分离。发生了使未修饰抗体等电点降低的改变所得的人源化A69抗体与未修饰的抗体相比，可观察到峰的移动，伴随着改变的数目，保留时间缩短为约22.4分钟、约21.2分钟、约20.2分钟。进行使可变区等电点升高的改变所得的人源化B26抗体与未改变的抗体比较可观察到峰的移动，伴随着改变的数目不同，保留时间延长至约28.4分钟、约29.4分钟。通过本研究中所选择的可变区H12、H23、H39、H43、H105的表面氨基酸电荷的改变，两种抗体表面电荷发生变化，由此可使保留时间改变。

根据实施例4中所测定的等电点，未修饰的hA69a均二聚体和未修饰的hB26-F123e4均二聚体的pI有0.3的差异，但两者的保留时间均为25分钟左右，无法分离(图9)，而未修饰的hA69均二聚体与hB26-p19的pI有0.5的差异，结果两者以保留时间约2.6分钟的差异分离，hA69-p18和hB26均二聚体的pI有0.7的差异，结果两者以保留时间约3.4分钟的差异分离，最大的是hA69-p16和hB26-p15的pI有1.3的差异，结果保留时间以约9.2分钟的差异分离。这样，通过修饰使两种均二聚体分离首次成为可能。

[实施例6]修饰的人源化双特异性抗体的凝固活性评价

通过实施例4、实施例5的分析，我们可以观察到表面电荷的变化，使修饰的两种人源化抗体H链(hA69-p8、hB26-p15)和人源化L链(hAL-F123j4)表达，制备人源化双特异性抗体。为了有效地促进杂合二聚体，H链载体使用整合了利用konbs-into-holes技术的IgG4恒定区的表达载体。使用制备的人源化双特异性抗体，按照以下所示方法评价凝固活性。

为了明确双特异性抗体是否可改变血友病A血液的凝固能力，研究该抗体对使用乏因子VII血浆的活化部分凝血酶时间(APTT)的影响。将50μL各种浓度的抗体溶液、50μL乏因子VIII血浆(Biomerieux)和50μLAPTT试剂(Dade Behring)的混合液在37℃下加温3分钟。凝固反应是通过将50μL 20mM的CaCl₂(Dade Behring)加入到该混合液中引发。通过连接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)测定至凝固所需时间。

以乏因子VIII血浆的凝固时间为0％，以正常血浆的凝固时间为100％，制作校正曲线，使用该校正曲线，由添加了双特异性抗体时的凝固时间计算双特异性抗体的因子VIII样活性(％)。

活性评价结果如图6所示。使可变区修饰的人源化双特异性抗体与未修饰的人源化双特异性抗体显示同等的凝固活性，因此显示本实施例的可变区的修饰对于抗体的活性没有影响。

[实施例7]使CDR修饰的人源化抗体的制备和评价

对实施例2制备的人源化抗A69抗体的模型进行分析，结果确认H97是暴露于表面的氨基酸。表1所示的抗体中，人源化A69-H链的hA69-N97R具有将存在于CDR3的第97号天冬酰胺修饰为精氨酸的序列。按照实施例1-2的方法制备具有hA69-N97R的表达载体，与人源化BBA-L链—hAL-F123j4一起表达，制备修饰抗体。对该抗体的表面电荷的变化进行评价，按照实施例4的方法进行等电聚焦电泳。如图7所示，未修饰的抗体(hA69a/hAL-F123j4)的等电点为8.9，而修饰抗体(hA69a-N97R/hAL-F123j4)为9.1，在CDR的氨基酸置换中观察到表面电荷的变化。

为了评价修饰抗体的功能，按照以下方法评价与抗原—因子IXa的结合活性。将用包被缓冲液(100mM二碳酸钠，pH 9.6，0.02％叠氮化钠)稀释为1μg/mL的因子Ixaβ(Enzyme Research Labratories)以100μL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-Immuno^TM96MicroWell^TM MaxiSorp^TM(Nalge Nunc Interantional))，在4℃下温育过夜。用含有吐温^(R)20的PBS(-)洗涤3次，然后用稀释缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.1，1％牛血清白蛋白，1mM MgCl₂，0.15M NaCl，0.05％吐温^(R)20，0.02％叠氮化钠)将板在室温下封闭2小时。除去缓冲液，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释的纯化抗体，在室温下温育1小时。将板洗涤3次，然后添加100μL/孔用稀释缓冲液稀释为1/4000的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(BIOSOURCE)，在室温下温育1小时。将板洗涤5次，添加100μL/孔显色底物(Sigma)，在室温下温育30分钟。用微量板读板仪型号3550(Bio-Rad Laboratories)测定405nm(对照655nm)的吸光度。结果如图8所示，由于改变电荷而使CDR修饰的抗体与修饰前的抗体显示同等的结合活性。还显示：如上述改变表面电荷时，修饰的位置不只是实施例5所示的FR，也显示可以是CDR。

[实施例8]人源化双重特异性PF抗体的制备和评价

在表1所示的抗体中，使用人源化A69-H链hA69a、人源化B26-H链hB26-F123e4和人源化BBA-L链hAL-F123j4(SEQ ID NO.5)作为未修饰的抗体，制备未修饰的人源化双特异性抗体。在表1所示的抗体中，使用人源化A69-H链的修饰体hA69a-PFL、人源化B26-H链的修饰体hB26-PF和人源化BBA-L链hAL-s8(SEQ ID NO.17)作为修饰抗体，制备人源化双特异性PF抗体。H链使用具有野生型恒定区的表达载体，按照实施例1-2所示构建表达载体，按照实施例1-3、实施例1-4、实施例1-5的方法制备抗体。使用含有该两种均二聚体和双特异性抗体的混合溶液，按照实施例5所示的方法实施阳离子交换色谱分析。

未修饰的人源化双特异性抗体和人源化双特异性PF抗体分析结果如图9、图10所示。该结果中，在未修饰的人源化双特异性抗体中，两种均二聚体与双特异性抗体不分离，以一个峰的形式洗脱，而人源化双特异性PF抗体中，两种均二聚体和目标双特异性抗体分别分离，依次以hA69-PF均二聚体、人源化双特异性PF抗体、hB26-PF均二聚体的顺序洗脱出三个峰。阳离子交换色谱分析时获得三种峰，由此可以纯化两种均二聚体和人源化双特异性PF抗体。将该组分通过Amicon Ultra，MWCO 10000(Millipore)浓缩后，用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0在低温处透析过夜，进行浓度测定。

将各抗体纯化后，按照实施例4所示的方法进行等电聚焦电泳。如图1所示，进行阳离子交换色谱分析之前的抗体存在三条条带，通过阳离子交换色谱，确认可以纯化各抗体。人源化A69-PF抗体的均二聚体、人源化双特异性PF抗体、人源化B26-PF抗体的均二聚体的等电点约为7.9、约8.6、约9.2，人源化A69-PF抗体的均二聚体与人源化双重特异性PF抗体等电点的差约为0.7，人源化B26-PF抗体的均二聚体与人源化双重特异性PF抗体等电点的差约为0.6。

接着，按照实施例6所示的方法，对纯化的双特异性PF抗体的凝固活性进行评价，与以下三种抗体进行凝固活性的比较：使用利用上述knobs-into-holes技术的IgG4恒定区进行表达的双特异性抗体；含有未使可变区修饰的hA69a(SEQ ID NO.2)、hB26-F123e4(SEQ ID NO.4)、hAL-F123j4(SEQ ID NO.6)的双特异性抗体；与纯化的双特异性PF抗体相同具有可变区、使用利用knobs-into-holes技术的IgG4恒定区的双特异性抗体。评价结果如图12所示。具有利用knobs-into-holes技术的IgG4恒定区的双特异性PF抗体与具有野生型恒定区、通过离子交换色谱纯化的双特异性PF抗体的凝固活性同等，显示本实施例的H10、H12、H23、H39、H43、H105的可变区修饰对于活性没有影响，可以以高纯度纯化双特异性抗体。

[实施例8]人源化双特异性抗体表达细胞株的构建

为了制备修饰的人源化双特异性抗体，如下构建抗体表达细胞株。

以人IgG4的野生型H链恒定区基因为模板，使用与设计成编码H链恒定区的N末端一侧的两个氨基酸(Ala-Ser)的碱基序列为NheI识别序列(GCTAGC)的5＇末端一侧引物，和设计成与3＇末端一侧退火、且具有NotI识别位点的引物，PCR扩增H链恒定区，与将pBluescriptKS+载体(东洋纺)用NheI、NotI(均为宝酒造制备)消化所得的载体连接，制备pBCH4(包含IgG4恒定区基因)。使用表1所示的与人源化A69-H链抗体(hA69-KQ)和人源化B26-H链抗体(hB26-PF)的H链可变区5＇末端一侧碱基序列互补、具有Kozak序列(CCACC)和EcoII识别序列的引物，以及具有NheI识别序列的3＇末端一侧碱基序列的引物进行PCR，将所得PCR产物用EcoRI、NheI(均为宝酒造制备)消化，插入到同样用EcoRI、NheI消化的pBCH4中，连接可变区和恒定区。将制备的人源化A69-H链抗体载体用EcoRI、NotI(均为宝酒造制备)消化，克隆到同样用EcoRI、NotI消化的动物细胞用表达载体pCXND3中。

该载体pCXND3的构建流程如下所示。为了将DHFR-ΔE-γVH-PM1-f(参照WO92/19759)的抗体H链基因与载体分割，用限制酶EcoRI、SmaI位点进行消化，只回收载体一侧，然后克隆EcoRI-NotI-BamHI适配子(宝酒造制备)。将该载体命名为pCHOI。将pCHOI的DHFR基因表达位点克隆到pCXN(Niwa等人，Gene 1991，108：193-200)的限制酶HindIII位点上，将所得载体命名为pCXND3。将制备的人源化B26-H链抗体载体用EcoRI、NotI(均为宝酒造制备)消化，克隆到同样用EcoRI、NotI消化的动物细胞用表达载体pCXZD1中。pCXZD1载体是将pCXND3载体的新霉素抗性基因置换为博来酶素抗性基因得到的表达载体。使用与人源化BBA-L链抗体(hAL-AQ，SEQ IDNO.18)的L链可变区的5＇末端一侧碱基序列互补、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及与BsiWI位点的3＇末端侧碱基序列互补的合成寡核苷酸进行PCR，将所得PCR产物克隆到人kappa恒定区插入到pBluescriptKS+载体中所得的pBCL载体中。通过BsiWI位点使人L链可变区与恒定区连接。将制备的L链基因片段克隆到表达载体pUCAG中。该载体pUCAG是将pCXN(Niwa等人.，Gene 1991，108：193-200)用限制酶BamHI消化所得到的2.6kbp的片段与pUC19载体(东洋纺)的限制酶BamHI位点连接并克隆得到的载体。将L链克隆到pUCAG中，将所得的载体用限制酶BamHI消化，克隆到含有潮霉素抗性基因的表达载体pHycDHFR-4b中。将制备的三种表达载体通过限制酶制成直链连接，然后基因导入CHO-DG44细胞中，建立抗体表达细胞株。

稳定表达细胞株的制备如下进行。通过使用GenePulserII(Bio-Rad)的电穿孔法导入基因。将各抗体表达载体与0.75mL悬浮于PBS中的CHO细胞(1×10⁷细胞/mL)混合，将混合物在冰上冷却10分钟，转移到样品杯中，然后以1.5kV、25μFD的容量给予脉冲。在室温下恢复10分钟后，将电穿孔处理过的细胞悬浮于40mL以1倍浓度含有HTsupplement(Invitrogen)的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen)中。用同样的培养基制备10倍稀释液，以100μL/孔分注到96孔培养板中。在CO₂培养箱(5％CO₂)中培养24小时，然后添加0.5mg/mL遗传霉素(Invitrogen)、0.6mg/mL博来霉素(Invitrogen)、0.4mg/mL潮霉素B(Invitrogen)，培养2周。将显示抗药性的转化细胞的集落依次放大培养，使用建立的高生产细胞株进行大量的培养，得到培养上清。

[实施例9]通过制备用的常用柱对人源化双特异性抗体的分离纯化

按照以下方法，从实施例8得到的培养上清中纯化双特异性抗体。将培养上清添加到用平衡缓冲液(20mmol/L磷酸钠缓冲液、1mol/LNaCl)平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(Amersham Biosciences，50mmI.D.×9.9cmH.＝194.3mL-树脂)中，用洗涤缓冲液1(20mmol/L磷酸钠缓冲液，1mol/L NaCl，pH7.0)、洗涤缓冲液2(50mmol/L乙酸钠缓冲液，pH6.0)洗涤，然后用100mmol/L乙酸洗脱。洗脱后立即用20mmol/L乙酸钠缓冲液、pH6.0稀释3倍。

将所得纯化溶液添加到用Solvent A(20mmol/L乙酸钠缓冲液，pH6.0)平衡的制备用常用柱SP TOYOPERL 650M柱(東ソ—、26mmI.D.×22.3cm H.＝118.3mL-树脂)中。在以下所示的溶液和梯度中通过抗体表面电荷差进行分离。

溶剂A：20mmol/L乙酸钠缓冲液，pH6.0

溶剂B：20mmol/L乙酸钠缓冲液，1mol/L NaCl，pH6.0

流速：10mL/分钟(113cm/小时)只在洗脱时为5.3mL/分钟(60cm/小时)

梯度：0→15％B     台阶梯度     3柱容积(CV)冲洗液体

15→22％B   梯度      2.5CV

22→30％B   梯度      6CV

30→100％B  台阶梯度  3CV冲洗液体

洗脱的结果显示，检测出图13所示的三个峰，在使用制备常用柱时也可以分离纯化双特异性抗体。

[实施例10]修饰的人源化双特异性抗体的活性评价

对于实施例9制备的人源化双特异性抗体，按照实施例6所示的方法评价凝固活性。评价结果如图14所示。与实施例8中制备的人源化双特异性PF抗体比较，与在实施例9中纯化的人源化双特异性抗体的凝固活性同等。如hA69-PFL和hA69-KQ，可变区的氨基酸序列即使有些不同，使用制备常用的柱纯化的抗体对活性也没有影响。

以上表明，在制备双特异性抗体时，通过H链可变区的修饰，无需改变结构或抗体的功能(活性)，只改变表面电荷，即可以分离纯化目标人源化双特异性抗体和形成两种均二聚体的抗体。通过使用本方法，显示制备用常用柱也可以分离纯化双特异性抗体，由此可用作含有双特异性抗体的药物的制备方法。

[实施例11]亚类杂合抗体的制备

11-1.人IgG2抗体H链恒定区基因的克隆

为了克隆人IgG2抗体H链恒定区的基因，进行以下操作。

为了扩增cDNA片段，制备50μL的各反应液(各1μL 20μM K62引物(5＇cac cgt ctc ctc agc ctc cac caa 3＇/SEQ ID NO.22)、K63引物(5＇gtggca ctc att tac ccg gag aca3＇/SEQ ID NO.23)、5μL MTC多组织cDNA组(外周血白细胞)(Clontech制备)、4μL 5×Prime STAR缓冲液、4μL2.5mM dNTPs、1μL Prime STAR HS DNA聚合酶(以上由TaKaRa制备))，进行PCR。PCR是使用热循环GeneAmp PCR系统9700(Parkin Elmer)，在98℃下加热2分钟，然后将含有98℃10秒、60℃5秒、72℃2分钟的反应进行30个循环，最后在72℃下加热10分钟。PCR后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。按照QIAqucick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)、按照所附说明书的方法纯化目标大小(约1000bp)的扩增片段，用50μL灭菌水洗脱，然后为了在扩增片段的末端附加A(腺苷)而进行γ-Taq处理。γ-Taq处理是将所得扩增片段的10μL γTaq反应液(1μL 10×γTaq反应溶液，1μL 2.5mM dNTPs、1μL rTaq、7μL上述扩增片段)在72℃下保温30分钟。将经γ-Taq处理的片段克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)上，确定碱基序列。各DNA片段的碱基序列是使用BigDye终端3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM3730xL Genetic分析仪(Applied Biosystems)、按照所附说明书记载的方法确定。

将确定的碱基序列与Accession.No.BX640623比较，所翻译的氨基酸序列不同的碱基可以认为是在PCR扩增时由于插入而发生的突变，使用QuickChange位点专一性突变试剂盒(Stratagene)进行氨基酸置换，修饰为与BX640623的氨基酸序列相同的序列。QuickChange位点专一性突变试剂盒(Stratagene)按照所附说明书记载的方法进行。并且，为了连接人IgG2-H链恒定区基因和目标可变区基因，使其突变为人IgG2-H链恒定区的最初的两个氨基酸(Ala-Ser)为限制酶NheI识别序列(GCTAGC)。本实验中使用的人IgG2-H链恒定区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示。

11-2.亚类置换抗体的表达载体的构建

将人源化PM-1抗体的H链可变区与人IgG1、人IgG2、人IgG4、的各种H链恒定区连接而成的抗体表达载体如下制备。

使用与非专利文献(Sato K等人，Cancer Research 1993，53：851-856)所示的人源化抗人白细胞介素6受体抗体(人源化PM-1抗体)的H链可变区的5＇末端一侧碱基序列互补、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及具有限制酶NheI识别序列、与3＇末端一侧碱基序列互补的合成寡核苷酸，进行PCR，将所得PCR产物克隆到人IgG1-H链恒定区(参照SatoK等人，Cancer Research 1993，53：851-856)插入到pBluescript KS+载体(TOYOBO)所得的pB-CH载体上。将H链可变区和恒定区连接而成的H链基因片段插入到通过鸡β肌动蛋白启动子控制表达的pCAGGS载体(Niwa等人.1991 Gene，108：193-199)中。将PCR扩增的人源化PM-1抗体的H链可变区基因与人IgG4恒定区基因(参照WO99/51743)和实施例11-1中制备的人IgG2-H链基因的5＇末端的NheI连接，插入到pCAGGS载体中。各种H链表达载体是通过NheI序列使人源化PM-1抗体的H链可变区与人H链恒定区连接，表达H链。

同样，使用与人源化PM-1抗体的L链可变区的5＇末端侧碱基序列互补、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及具有与限制酶BsiWI识别序列的3＇末端一侧碱基序列互补的合成寡核苷酸进行PCR，将所得PCR产物克隆到人kappa恒定区插入到pBluescript KS+载体(TOYOBO)中得到的pB-CL载体中。将L链可变区和恒定区连接而成的L链基因片段插入到通过鸡β肌动蛋白启动子控制表达的pCAGGS载体中。通过BsiWI序列使人源化PM-1抗体的L可变区与人kappa链恒定区连接，表达L链。

11-3.亚类杂合抗体的表达

亚类杂合抗体可以分别将2种具有人IgG1、人IgG2、人IgG4的各种恒定区的人源化PM-1抗体H链表达载体组合，与人源化PM-1抗体L链表达载体一起在表达用细胞中共表达。各抗体的表达可使用实施例4-2的方法或以下方法进行。将来自人胎肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以各10mL、5-6×10⁵个/mL细胞密度接种于粘着细胞用培养皿(直径10cm，CORNING)的各皿中，在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内培养一昼夜，然后吸引除去培养基，添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。使用11-2中制备的质粒DNA，如下制备各亚类抗体表达用混合液和杂合抗体表达用的混合液(共13.8μg)。

(1)6.9μg L链表达载体、6.9μg IgG1-H链表达载体

(2)6.9μg L链表达载体、6.9μg IgG2-H链表达载体

(3)6.9μg L链表达载体、6.9μg IgG4-H链表达载体

(4)6.9μg L链表达载体、3.45μg IgG1-H链表达载体、3.45μg IgG2-H链表达载体

(5)6.9μg L链表达载体、3.45μg IgG2-H链表达载体、3.45μg IgG4-H链表达载体

(6)6.9μgL链表达载体、3.45μg IgG1-H链表达载体、3.45μg IgG4-H链表达载体

将各混合液与20.7μL 1μg/mL聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μL CHO-S-SFMII培养基混合，在室温下静置10分钟，将所得加入到各培养皿的细胞中，在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内培养4-5小时。然后添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基，在CO₂培养箱内培养3天。回收培养上清，然后离心(约2000g，5分钟，室温)除去细胞，再过0.22μm滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌。该样品在使用之前保存在4℃下。

11-4.亚单元杂合抗体的纯化

在实施例11-3中所述的方法得到的培养上清中添加100μLrProteinA Sepharose^TMFast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下颠倒混合4小时以上。将该溶液转移至0.22μm的滤杯Ultrafree^(R)-MC(Millipore)中，用500μL TBS洗涤3次，然后悬浮于rProtein A Sepharose^TM树脂的100μL的50mM乙酸钠水溶液、pH3.0中，静置2分钟，然后洗脱抗体。立即加入6.7μL 1.5M Tris-HCl、150mM NaCl，pH8.0，进行中和。所得抗体溶液如果作为活性测定用则用PBS透析、如果作为DSC测定用则用含有150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液pH6.0透析，置换缓冲液。以下，将具有纯化的人IgG1的H链恒定区的抗体称为“未修饰人源化抗PM-1抗体”，将具有人IgG2的H链恒定区的抗体称为“IgG2化人源化抗PM-1抗体”，将具有人IgG4的H链恒定区的抗体称为“IgG4化人源化抗PM-1抗体”。

11-5.亚类杂合抗体的浓度定量

将2μL含有实施例11-4所得抗体的溶液供给ND-1000光谱仪(NanoDrop)，或将50μL供给分光光度计DU-600(BECKMAN)，测定280nm下的吸光度。用以下算式，由所得值计算抗体浓度。空白是使用PBS或含有150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液，pH为6.0。

抗体浓度(mg/mL)＝吸光度×稀释倍率÷14.6×10

[实施例12]亚类杂合抗体的分析

12-1.亚类杂合抗体的等电聚焦电泳分析

为了对恒定区置换导致的表面电荷的变化进行评价，通过等电聚焦电泳进行分析。

等电聚焦电泳如下进行。使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience制备)，用以下的溶胀液用使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience制备)凝胶溶胀约30分钟。

20％甘油                                  1.5mL

Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amercham Bioscience制备)   100μL

使用溶胀的凝胶，通过Phastsystem(Amercham Bioscience制备)，按照以下程序进行电泳。样品是在步骤2添加到凝胶中。pI标志使用pl校正曲线试剂盒(Amersham Biosciences)。

步骤1：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh

步骤2：200V  2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh

步骤3：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh

电泳后的凝胶用20％TCA固定，然后用Silver staining试剂盒、蛋白质(Amersham Biosciences)，按照试剂盒所附的说明书进行银染。染色后，由pI标志的已知等电点计算样品的等电点。

未修饰、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗体的分析结果如图15所示。通过亚类的置换，在等电聚焦电泳中观察到条带的移动。以pI标志为参考推测的各抗体的等电点是相对于未修饰人源化PM-1抗体的9.3，IgG2化人源化PM-1抗体约为8.9，IgG4化人源化PM-1抗体约为8.7，通过置换可以产生最大约0.7的等电点差。本研究显示，通过置换抗体亚类的恒定区，可以使等电点发生变化。

未修饰、IgG2化人源化PM-1抗体，以及未修饰、IgG4化人源化PM-1抗体的共表达抗体分析结果如图16所示。由此，任何组合中，各亚类的均二聚体、杂合二聚体都可以3个主条带的形式观察到，以pI标志为参考推测的各抗体的等电点是相对于未修饰人源化PM-1/IgG2化人PM-1抗体的9.2，未修饰人源化PM-1/IgG2化人PM-1的杂合抗体为9.0。本研究中显示，通过将各亚类抗体的表达载体组合共表达，可以制备亚类杂合抗体，它们通过等电点进行分离。

12-2.亚类杂合抗体的阳离子交换色谱分析

使用在实施例11中制备的亚类杂合抗体，按照以下方法进行阳离子交换色谱的分析，评价亚类置换对分离的影响。阳离子交换色谱分析条件如下，计算未修饰人源化PM-1抗体、IgG2化人源化PM-1抗体、IgG4化人源化PM-1抗体，以及未修饰人源化PM-1抗体/IgG2化人源化PM-1抗体的杂合抗体、未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体的杂合抗体的保留时间。

柱：ProPac WCX-10，4 x 250mm，(Dionex)

流动相：A：25mmol/L MES/NaOH，pH6.1

B：25mmol/L MES/NaOH，250mmol/L NaCl，pH6.1

流速：0.5mL/min

梯度：10％B(5分钟)→(105分钟)→67％B→(1分钟)→100％B(5分钟)

检测：280nm

单独表达的未修饰、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗体的分析结果如图17所示。未修饰人源化PM-1抗体、IgG2化人源化PM-1抗体和IgG4化人源化PM-1抗体的保留时间分别约为60.2分钟、30.5分钟和30.3分钟，通过亚类置换，保留时间变化了稍低于30分钟。另一方面，等电聚焦电泳中，可见pI差异的IgG2化人源化PM-1抗体和IgG4化人源化PM-1抗体的保留时间大致相同。未修饰、IgG2化，以及未修饰、IgG4化人源化PM-1抗体共表达抗体分析结果如图18所示。在未修饰人源化PM-1抗体/IgG2化人源化PM-1抗体的组合，以及未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1抗体的组合中，观察到了各亚类的均二聚体、杂合二聚体的三个主峰。关于保留时间，未修饰人源化PM-1/IgG2化人源化PM-1的杂合抗体约为43.8分钟，未修饰人源化PM-1/IgG4化人源化PM-1的杂合抗体约为45.1分钟，以10分钟以上的保留时间差与各均二聚体分离。本研究显示，通过将各亚类抗体的表达载体组合共表达，可以制备亚类杂合抗体，它们可以通过离子交换色谱分离。

[实施例13]亚类杂合抗体通过阳离子交换色谱的分离纯化

将实施例1所得的抗体溶液用Amicon-Ultra4(Amicon)浓缩，封装到EasySep(トミ—精工)中，用5mM柠檬酸缓冲液(pH6.5)进行透析，置换缓冲液，按以下条件纯化亚类杂合抗体。

柱：Poly GAT A，4.6×100mm，粒径3μm，孔径150nm(Poly LC)

流动相：A：25mmol/L MES/NaOH，pH6.1

B：25mmol/L MES/NaOH，250mmol/L乙酸钠，pH6.1

流速：1.0mL/min

梯度：35％B(5分钟)→(54分钟)-65％B→(1分钟)→100％B(5分钟)

检测：280nm

每次注入约100-200μg，制备未修饰人源化PM-1抗体、未修饰人源化PM-1抗体/IgG4化人源化PM-1亚类杂合抗体、IgG4化人源化PM-1抗体峰。制备时的色谱谱如图19所示。将多次的峰的制备组分分别混合，用Amicon-Ultra4(Amicon)浓缩后封装到EasySep(トミ—精工)中，如果是测定活性用则用PBS透析、如果是DSC测定用则用含有150mMNaCl的20mM乙酸缓冲液、pH6.0透析，置换缓冲液。制备峰在上述同样的条件下进行重分析，结果如图20所示。由此显示亚类杂合抗体可通过离子交换色谱法制备纯化。

本技术可利用pI值不同的亚类的恒定区分离具有共通的H链可变区的抗体，因此即使是没有pI差的不同的H链可变区，通过与pI值不同的亚类的H链恒定区连接，也可以通过离子交换色谱分离双特异性抗体。另外，具有不同的H链可变区时，通过与实施例9所示的向可变区导入突变的技术组合，可以使分子间的pI差进一步增大，可以更容易地分离纯化。难以向H链可变区导入突变时，可以将它们变换为天然存在的IgG亚类序列，无需考虑抗原性而可以通过离子交换色谱分离纯化双特异性抗体。

[实施例14]亚类杂合抗体制备纯化品的等电聚焦电泳

为了评价制备品的纯度，通过等电聚焦电泳实施分析。

等电聚焦电泳如下进行。使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience制备)，用以下的溶胀液用使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience制备)凝胶溶胀约30分钟。

MilliQ水                                   1.5mL

Pharmalyte 5-8 for IEF(Amercham Bioscience制备)    50μL

Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amercham Bioscience制备) 50μL

使用溶胀的凝胶，通过Phastsystem(Amercham Bioscience制备)，按照以下程序进行电泳。样品是在步骤2添加到凝胶中。pI标志使用pl校正曲线试剂盒(Amersham Biosciences)。

步骤1：2000V   2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh

步骤2：200V    2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh

步骤3：2000V   2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh

电泳后的凝胶用20％TCA固定，然后用Silver staining试剂盒、蛋白质(Amersham Biosciences)，按照试剂盒所附的说明书进行银染。

亚类杂合抗体制备纯化品的分析结果如图21所示。通过离子交换色谱，可以纯化至几乎不含有各亚类的均二聚体。

[实施例15]亚类杂合抗体制备纯化品的活性评价

15-1.表达人gp130的BaF3细胞株、共表达人gp130/人IL-6受体的BaF3细胞株的建立

为了获得显示依赖IL-6的增殖性的细胞株，如下所示，建立表达人gp130的BaF3细胞株。

通过PCR扩增全长人gp130 cDNA(Hibi等人，Cell 1990，63：1149-1157(GenBank#NM_002184))，除去pCHOI的DHFR基因表达位点，克隆到插入了博来霉素抗性基因表达位点的表达载体pCOS2Zeo上，构建pCOS2Zeo/gp130。

将10μg pCOS2Zeo/gp130与悬浮在PBS中的BaF3细胞(0.8×10⁷个细胞)混合，用GenePulser(Bio-Rad)、以0.33kV、950μFD的容量施加脉冲。通过电穿孔处理导入基因的BaF3细胞在含有0.2ng/mL小鼠白细胞介素-3(Peprotech)、10％胎牛血清(以下称为FBS，HyClone)的RPMI16540培养基(Invitrogen)中培养过夜，加入10ng/mL人白细胞介素-6(R&D)、100ng/mL人白细胞介素-6可溶性受体(R&D系统)和含有10％FBS的RPMI1640培养基进行筛选，建立表达人gp130的BaF3细胞株(以下称为BaF3/gp130)。

15-2.亚类杂合抗体制备纯化品对人IL-6的中和活性的评价

使用显示IL-6依赖性增殖的BaF3/gp130，如下所示评价IL-6中和活性。将纯化的未修饰人源化PM-1抗体、未修饰/IgG4化人源化PM-1亚类杂合抗体以及IgG4化人源化PM-1抗体用含有10％FBS的RPMI1640稀释为10μg/mL，使用该溶液，制备稀释倍率3、共7个系列的稀释液，以各50μL分注到96孔板(CORINIG)的各孔中。接着，将BaF3/gp130用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，悬浮于60ng/mL人白细胞介素-6(TORAY)、60ng/mL可溶性人IL-6受体(本公司制备)和含有10％FBS的RPMI1640培养基中，浓度为5×10⁴个细胞/mL，以各50μL在各孔中混合后分注抗体样品。人可溶性IL-6受体按以下方法制备。将编码人可溶性受体IL-6受体的第1号至第344号氨基酸的基因导入到CHO细胞中，然后从培养上清中纯化并制备。在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，以20μL/孔加入用PBS稀释为2倍的WST-8试剂(Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所)，立即使用SUNRISECLASSIC(TECAN)测定450nm的吸光度(参照波长620nm)。培养2小时后再次测定450nm的吸光度(参照波长620nm)，以2小时的吸光度变化作为指标评价IL-6的中和活性。

结果如图22所示，制备纯化的未修饰人源化PM-1抗体、未修饰/IgG4化人源化PM-1亚类杂合抗体、以及IgG4化人源化PM-1抗体与人源化PM-1抗体纯化品(批量)的中和活性同等。以上显示，亚类杂合抗体未丧失原来的抗原结合能力，并具有中和抗体的功能。

产业实用性

本发明的方法中，氨基酸的置换数为少数即可不使其结构、功能(活性)改变，可以控制等电点，由此，通过使用常用的色谱柱，可以高效地且达到作为药物开发的高纯度地纯化双特异性抗体，在开发双特异性抗体作为药物方面的有用性非常高。

通过使用本发明的方法，可以高效地获得实际保持活性的双特异性抗体。

序列表

<110>中外制药株式会社

<120>用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法

<130>C1-A0603Y1P

<150>JP 2006-097795

<151>2006-03-31

<150>JP 2006-275804

<151>2006-10-06

<160>25

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>354

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

<400>1

<210>2

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

<400>2

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

<400>3

<210>4

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<212>PRT

<213>人工序列

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<400>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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<400>5

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<211>106

<212>PRT

<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

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<223>人工合成的序列

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<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

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<223>人工合成的序列

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<223>人工合成的序列

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<212>PRT

<213>人工序列

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<223>人工合成的序列

<400>14

<210>15

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的序列

<400>15

<210>16

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的序列

<400>16

<210>17

<211>106

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的序列

<400>17

<210>18

<211>106

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的序列

<400>18

<210>19

<211>119

<212>PRT

<213>小鼠

<400>19

<210>20

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠

<400>20

<210>21

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>21

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>22

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>23

<210>24

<211>981

<212>DNA

<213>人

<400>24

<210>25

<211>326

<212>PRT

<213>人

<400>25

Claims (37)

1.多特异性抗体的制备方法，所述多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，该制备方法包含以下步骤：

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中之一，使第1多肽与第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。

2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)的修饰是修饰核酸，使第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

3.权利要求1所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

4.权利要求3所述的方法，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

6.权利要求5所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

7.权利要求6所述的方法，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

8.权利要求1所述的方法，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

9.多特异性抗体，该多特异性抗体通过权利要求1所述的方法制备。

10.多特异性抗体的纯化方法，该多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，其纯化方法如下：

(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和编码第2多肽的氨基酸残基的核酸两者或其中之一，使第1多肽与第2多肽的等电点产生差异；

(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；

(c)通过标准的色谱法从宿主细胞培养物中纯化该多特异性抗体。

11.权利要求10所述的方法，其中，步骤(a)的修饰是修饰核酸，使第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

12.权利要求10所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

13.权利要求12所述的方法，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

14.权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

15.权利要求14所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

16.权利要求15所述的方法，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

17.权利要求10所述的方法，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

18.多特异性抗体的制备方法，该方法包含通过权利要求10所述的方法进行纯化的步骤。

19.多特异性抗体，该抗体通过权利要求18所述的方法制备。

20.多特异性抗体，该多特异性抗体含有第1多肽和第2多肽，第1多肽含有重链可变区和/或重链恒定区，选自该重链可变区的按照Kabat编号的第10号、12号、23号、39号、43号和105号氨基酸残基、或者该重链恒定区的按照EU编号的第137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基具有电荷，第1多肽与第2多肽的等电点互不相同。

21.权利要求20所述的多特异性抗体，其中，第2多肽含有重链可变区和/或重链恒定区，选自该重链可变区的按照Kabat编号的第10号、12号、23号、39号、43号和105号氨基酸残基、或者该重链恒定区的按照EU编号的第137号、196号、203号、214号、217号、233号、268号、274号、276号、297号、355号、392号、419号、435号氨基酸残基的至少一种氨基酸残基，具有与选自上述第1多肽中所含的重链可变区和/或重链可变区中的具有电荷的氨基酸残基相反的电荷、或者不具有电荷。

22.权利要求20所述的多特异性抗体，其中，具有上述电荷的氨基酸残基和与该氨基酸残基具有相反电荷的氨基酸残基的组合分别选自下述(a)或(b)的任意组中所含的氨基酸残基：

(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

23.多特异性抗体，该多特异性抗体中的第1多肽和第2多肽的等电点有差异，第1多肽的均多聚体、第2多肽的均多聚体、以及第1多肽与第2多肽的杂合多聚体通过使用标准的色谱法进行分析而形成分离的峰。

24.权利要求23所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链可变区。

25.权利要求24所述的多特异性抗体，其中，上述多特异性抗体含有含轻链可变区的第3多肽，上述第1多肽和上述第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体。

26.权利要求23-25中任一项所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重链恒定区。

27.权利要求26所述的多特异性抗体，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重链恒定区是等电点互不相同的重链恒定区。

28.权利要求27所述的多特异性抗体，其中，上述等电点不同的重链恒定区是IgG1和IgG4、或IgG1和IgG2。

29.权利要求23所述的多特异性抗体，其中，上述多特异性抗体是双特异性抗体。

30.组合物，该组合物含有权利要求23-29中任一项所述的多特异性抗体和可药用的载体。

31.核酸，该核酸编码构成权利要求23-29中任一项所述的多特异性抗体的多肽。

32.宿主细胞，该宿主细胞具有权利要求31中所述的核酸。

33.权利要求23-29中任一项所述的多特异性抗体的制备方法，该制备方法包含培养权利要求32所述的宿主细胞的步骤；从细胞培养物中回收多肽的步骤。

34.权利要求25所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有以下(a1)-(a7)中任一项所述的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有以下(b1)-(b3)中任一项所述的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有以下(c1)或(c2)中所述的氨基酸序列：

(a1)SEQ ID NO.7

(a2)SEQ ID NO.8

(a3)SEQ ID NO.9

(a4)SEQ ID NO.10

(a5)SEQ ID NO.11

(a6)SEQ ID NO.12

(a7)SEQ ID NO：13

(b1)SEQ ID NO.14

(b2)SEQ ID NO.15

(b3)SEQ ID NO.16

(c1)SEQ ID NO.17

(c2)SEQ ID NO.18。

35.权利要求34所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有SEQ ID NO.16的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.17的氨基酸序列。

36.权利要求34所述的多特异性抗体，其中，第1多肽的可变区含有SEQ ID NO.12所述的氨基酸序列，第2多肽的可变区含有SEQ IDNO.16的氨基酸序列，第3多肽的可变区含有SEQ ID NO.18的氨基酸序列。

37.权利要求34-36中任一项所述的多特异性抗体，其中，第1多肽和第2多肽含有人IgG4恒定区，第3多肽含有人κ恒定区。

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