CN108472360B - 从亲代同源二聚抗体种类中纯化异源二聚多特异性抗体的方法 - Google Patents

从亲代同源二聚抗体种类中纯化异源二聚多特异性抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了从包含目标多特异性抗体(MAI)和亲代同源二聚抗体种类的组合物中纯化所述MAI的方法以及可用于实践所述方法的试剂，所述MAI共接合至少两种不同的抗原或表位(也称为靶标，通篇可互换使用)。

Description

从亲代同源二聚抗体种类中纯化异源二聚多特异性抗体的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月10日提交的美国临时专利申请序列号62/146,116和2015年10月30日提交的美国临时专利申请序列号62/249,180的权益，这些专利的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表并且在此以引用的方式整体并入。在2016年4月7日创建的所述ASCII副本的名称是2009186-0170_SL.txt并且大小是145,072个字节。
发明领域
本发明尤其涉及从同源二聚种类(如亲代同源二聚种类)中分离和纯化多特异性抗体的方法以及适用于进行所述方法的试剂。
发明背景
在本文中引用的所有参考文献(包括通篇引用的专利、专利申请、以及非专利公布)据此出于所有目的以引用的方式全部明确地并入。
抗体和基于抗体的分子代表有吸引力的候选物作为诊断工具和治疗剂。迄今为止已批准超过30种治疗性单克隆抗体用于并成功地应用在不同的适应症领域，包括癌症、器官移植、自身免疫和炎性病症、感染性疾病及心血管疾病。
然而，大多数这些抗体是单特异性抗体，其识别单一表位并且可被选择以便通过此单一表位激活或抑制靶分子的活性。但，许多生理反应需要有待触发的两种或更多种不同蛋白质或蛋白质亚基的或之间的交联、“串话”或共接合。一个重要的实例是异聚细胞-表面受体复合物的活化。对于这些受体复合物，活化通常通过配体与不同蛋白质上的多个结构域的相互作用而实现，由此造成一种或两种受体组分的接近相关的活化。
多特异性抗体，如双特异性抗体，代表作为解决并且治疗性地利用一些更复杂的生理过程及与此相关的疾病状态的手段的有吸引力的分子，因为它们可共接合多个表位或抗原。
生成双特异性抗体的一种方法必须使用抗体片段来制造双特异性。因为抗体可变区(Fv)的相当大的多样性使得可能产生识别实际上任何抗原或表位的Fv，所以基于片段的多特异性抗体产生的典型方法为在例如单链可变片段(scFv)、串联scFv、Fab、双抗体、链双抗体、Fab2双特异性抗体等的情形下引入新的可变区；参见，例如Chames等人,Br.J.Pharmacol,第157(2)卷:220-233(2009))，或包括这种片段的非天然形式。因为这种片段缺乏全长抗体的复杂四级结构，所以可变轻链和重链在单个基因构建体中可为连接的。虽然这些形式在细菌中经常可以高水平表达并且可归因于其小尺寸而具有有利的渗透益处，但它们在体内快速清除并且可存在与其产生和稳定性有关的制造障碍。这些缺点的主要原因是在于抗体片段通常缺乏具有其相关功能特性的抗体的恒定区，相关功能特性包括较大的尺寸、高稳定性及与在血清中保持长半衰期的各种Fc受体和配体(即新生的Fc受体FcRn)的结合或充当用于纯化的结合位点(即蛋白A和蛋白G)。
最近的研究致力于通过对向全长抗体样形式中的双重结合进行工程改造解决基于片段的双特异性抗体的缺点(Wu等人,2007,Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297；美国序列号12/477,711(公开为US 2009/0311253)；Michaelson等人,2009,mAbs 1[2]:128-141；PCT/US2008/074693(公开为WO 2009/032782)；Zuo等人,2000,ProteinEngineering 13[5]:361-367；美国序列号09/865,198；Shen等人,2006,J Biol Chem 281[16]:10706-10714；Lu等人,2005,J Biol Chem 280[20]:19665-19672；PCT/US2005/025472(公开为WO 2006/020258)。
其他研究还致力于生成呈天然IgG形式(即，含有如自然界中所见在相同方向上相互作用的两条重链和两条轻链(即“野生型”)IgG的双特异性抗体。然而，产生双特异性抗体(在单个细胞中表达两种抗体)的最直接方法除目标种类之外还产生多个种类，因为各自的重链形成同源二聚体和异源二聚体两者，并且两条各自的轻链可与任一条重链配对。
人们投入了很多精力致力于解决此异质性问题，通过以下任一种方法：工程改造将突变引入一条或多条免疫球蛋白链中以驱使链之间的所需异源二聚化，或以便实现纯化方案，该方案促进所需异源二聚抗体从其他不希望有的抗体种类中分离。
US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,642,228和US 7,695,936、及其他等价物描述包含具有不同抗原特异性的两条不同重链和一条共同轻链的异源多聚抗体的生成，其中各自的重链已被修饰以便工程改造将异二聚体相互作用界面引入Fc区中。所述修饰包括工程改造将靶突变引入各自重链的CH3结构域中，其中在一条重链中生成空隙且在另一条重链中生成互补突起，以使得该突起接合并插入空隙内，由此驱使两条重链的异源二聚化。
WO2013/136186描述包含具有不同抗原特异性的两条不同重链的异源多聚抗体的生成，其中至少一条重链已被修饰以减少或消除至少一条重链的CH1区与
Figure BDA0001498648680000031
IgG-CH1亲和性试剂的结合。然而，此方法的最终结果为生成含有非天然氨基酸序列的抗体，由此相对于不含所述非天然氨基酸序列的抗体，大大地提高生成具有以下性质的抗体的可能性：提高的免疫原性增加的风险、不合需要改变的Fc效应子功能及其他不当的缺点。
WO 2007/114325和相应的申请公布号US 2009/0263392教导了某些双特异性抗体的纯化，所述抗体包含已通过工程改造抗体的每个重链恒定区中的特定氨基酸突变而修饰的共同轻链，以便增大每条重链之间的等电点(pI)的差异。工程改造的异源二聚双特异性抗体则经受离子交换色谱法并且基于由异二聚种类的两条重链中的工程改造的pI差异增大的突变造成的pI差异的增大而与同源二聚亲代种类的分离。然而，如同WO 2013/136186中所公开的方法一样，在WO 2007/114325和US 2009/0263392中所公开的方法需要将非天然氨基酸序列引入到Fc区中，最终结果是相对于不含所述非天然氨基酸序列的抗体，生成具有以下性质的抗体：提高的免疫原性增加的风险、不合需要改变的Fc效应子功能及其他不当的缺点。
WO 2014/078729教导了如单克隆抗体的蛋白质在水性环境中在表面处具有主要带电和极性的氨基酸，并且这些表面残基可经受多重化学和酶修饰，由此产生特征为其静电表面上的差异的蛋白质变体污染物的异质混合物。该参考文献还教导了通过在离子交换色谱操作(参见其中的实施例)中使用pH和离子强度梯度分析单个抗体种类是否存在种类的这种污染变体的方法。在所例示的方法中使用的洗脱缓冲液包括哌嗪、Tris和咪唑。该参考文献未说明目标多特异性重链-异源二聚抗体(MAI)从包含MAI和MAI重链所来源于的两种亲代重链-同源二聚抗体种类的组合物中的纯化。另外，Hefti等人,Anal Biochem.,第295(2)卷,第180-185页(2001)教导咪唑在蛋白质组合物中的存在常造成蛋白质聚集物的生成，且因此潜在地复杂化任何色谱过程，其中当试图从包含多种抗体种类的组合物中分离或纯化个别抗体种类时咪唑被纳入加样或洗脱缓冲液中。
Gramer等人(mAbs,第5(6)卷,第962-973页(2013))报道通过控制Fab-臂交换制造呈IgG1形式的稳定双特异性抗体。所述方法涉及将突变引入到亲代重链的CH3区中，在两种亲代种类的还原之后这驱使两条不同重链的异源二聚化(如下所述)；突变的亲代同源二聚单特异性抗体的表达；亲代同源二聚抗体的纯化；使所表达的亲代同源二聚抗体样品经受适当的还原条件，以使得重链间二硫键被还原，同时维持重链与轻链之间的二硫键；使还原的抗体经受(再)氧化条件以便促进两条不同亲代重链之间的二硫键形成；将异源二聚抗体种类从剩余的亲代同源二聚种类(及其他杂质)中分离。Gramer还教导了“因为任何同源二聚体对的性质可相当显著地变化，所以阳离子交换色谱法一般不可能应用于”所需异源二聚种类从亲代同源二聚种类中的分离或纯化。
因此，仍需要提供由包含MAI和亲代同源二聚抗体种类的组合物制备和/或纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，这无需工程改造MAI(或亲代抗体)以便促进目标异源二聚抗体由亲代同源二聚种类的纯化的形成。此需要对于以下情况尤其重要：其中目标多特异性抗体呈天然(即“野生型”)形式，如天然IgG同种型形式(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其杂合体)。
发明概述
本发明尤其提供从包含目标多特异性抗体(MAI)和至少两种相应的亲代同源二聚抗体种类的组合物中纯化MAI(通篇可与“多特异性抗体”、“重链-异源二聚抗体”、“目标多特异性抗体”、“多特异性抗体类似物”、“类似物”或“抗体类似物”互换提及)的方法，所述抗体有利地共接合至少两种不同抗原或表位(也称为“靶标”，通篇可互换使用)，所述MAI包含异源二聚体，该异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽。在一些实施方案中，第一这种亲代同源二聚抗体种类包含一个拷贝的含有第一HC可变区的第一多肽，且第二这种亲代同源二聚抗体种类包含一个拷贝的含有第二HC可变区的第二多肽。在一些实施方案中，第一这种亲代同源二聚抗体种类包含两个拷贝的含有第一HC可变区的第一多肽，且第二这种亲代同源二聚抗体种类包含两个拷贝的含有第二HC可变区的第二多肽。在一些实施方案中，第一这种亲代同源二聚抗体种类包含超过两个拷贝(即三个或更多个拷贝)的含有第一HC可变区的第一多肽，且第二这种亲代同源二聚抗体种类包含超过两个拷贝(即三个或更多个拷贝)的含有第二HC可变区的第二多肽。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，包含MAI和至少两种相应的同源二聚种类的组合物是由宿主细胞群表达，如原核宿主细胞或真核宿主细胞；细菌宿主细胞；酵母宿主细胞；哺乳动物宿主细胞；昆虫宿主细胞；毕赤氏酵母细胞；酿酒酵母酵母宿主细胞；等等。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，包含MAI和至少两种相应的同源二聚种类的组合物是由包含已用编码至少两种同源二聚种类的核酸转化的这种宿主细胞的宿主细胞群表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括抗体。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括免疫球蛋白。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括IgG。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括Ig同种型杂合体。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括IgG1/IgG2杂合体、和IgG1/IgG3杂合体、或IgG1/IgG4杂合体。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI包括IgG1/IgG4杂合体。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，所述异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一重链多肽和含有第二HC可变区的第二重链多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：
i)获得包含MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类的组合物，所述第一亲代同源二聚抗体种类包含第一重链多肽的至少一个拷贝或第一重链多肽的至少两个拷贝，且所述第二亲代同源二聚抗体种类包含第二重链多肽的至少一个拷贝或第二重链多肽的至少两个拷贝；及
ii)执行色谱法，借此从所述第一和第二亲代同源二聚抗体种类中分离MAI；
由此纯化所述MAI。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述执行步骤ii)包括：
使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及
进行洗脱步骤，其中色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代同源二聚抗体种类的洗脱液的样品接触。在某些实施方案中，不同的等电点为实际的等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为计算的等电点。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液包含至少两种缓冲剂，所述至少两种缓冲剂各自具有不同的负对数酸解离常数(pKa)。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明方法还包括在执行所述洗脱步骤之前在所需初始pH下在洗脱液的第一样品中制备或平衡：
所述组合物；或
所述组合物-色谱材料复合物。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明方法还包括使一定体积在所需终末pH下制备的洗脱液的第二样品流动通过色谱材料-组合物复合物。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明方法包括当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生的pH梯度，其中所述pH梯度包含分步pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度，其中所述pH梯度包含线性pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度，其中所述pH梯度包含分步pH梯度相和线性pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度，其中所述pH梯度各自包含两个或更多个分步pH梯度相和线性pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述pH梯度包含在线性pH梯度相之前的分步pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述pH梯度包含在线性pH梯度相之后的分步pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述pH梯度包括基本上线性的pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述pH梯度为基本上线性的pH梯度相。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类各自是以基本上可区别的洗脱体积从色谱材料中洗脱。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类各自是以pH依赖性方式从色谱材料中洗脱。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含：
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；
至少六种；
至少七种；或
八种；
以下缓冲剂：N环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸及甲酸；或者
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；或
至少六种；以下缓冲剂：甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)及羟胺。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液包含：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液包含：
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；
至少六种；
至少七种；或
八种；
以下缓冲剂：N环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸及甲酸；
限制条件为所述洗脱液不包括以下任一者：咪唑；哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液基本上是由以下组成：(i)CAPS；CHES；TAPS；HEPPSO；MOPSO；MES；乙酸；和甲酸；及任选至少一种盐。或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液是由以下组成：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液包含至少一种选自由以下组成的组的盐：NaCl、KCl及Na2SO4。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的每个样品包含在选自由以下组成的组的浓度范围内的至少一种盐：0mM至约100mM；0mM至约60mM；0mM至约50mM；0mM至约40mM；0mM至约30mM；0mM至约20mM；0mM至约10mM；0mM至约5mM；约10mM至约200mM；约10mM至约100mM；约10mM至约50mM；约10mM至约40mM；约10mM至约30mM；约10mM至约20mM；约20mM至约200mM；约20mM至约100mM；约20mM至约50mM；约20mM至约30mM；约30mM至约200mM；约30mM至约100mM；和约30mM至约50mM；及约5mM至约15mM。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的至少一种盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的NaCl。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，来源于第一重链亲代同源二聚抗体种类的第一重链多肽的实际等电点与来源于第二重链亲代同源二聚抗体种类的第二多肽的实际等电点之间的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，第一抗体、如第一免疫球蛋白、第一IgG或第一亲代同源二聚抗体种类的实际等电点与第二抗体、如第二免疫球蛋白、第二IgG或第二亲代同源二聚抗体种类的实际等电点之间的差：小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，第一亲代同源二聚抗体种类的实际等电点与第二亲代同源二聚抗体种类的实际等电点之间的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，来源于第一重链亲代同源二聚抗体种类的第一重链多肽的计算等电点与来源于第二重链亲代同源二聚抗体种类的第二多肽的计算等电点之间的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，第一抗体、如第一免疫球蛋白、第一IgG或第一亲代同源二聚抗体种类的计算等电点与第二抗体、如第二免疫球蛋白、第二IgG或第二亲代同源二聚抗体种类的计算等电点之间的差：小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，第一亲代同源二聚抗体种类的计算等电点与第二亲代同源二聚抗体种类的计算等电点之间的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所需初始pH小于9.0；小于8.5；小于8.0；小于7.5；小于7.0；小于6.5；小于6.0；小于5.5；小于5.0；小于4.5；小于4.0；小于3.5；或小于3.0；或介于任何前述值之间的pH值。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所需终末pH大于7.0；大于7.5；大于8.0；大于8.5；大于9.0；大于9.5；大于10.0；大于10.5；或大于11.0；大于11.5；大于12.0；大于12.5；大于13.0；大于13.5；或介于任何前述值之间的pH值。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含至少两种缓冲剂且其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)在约3与11之间。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)是在选自由以下组成的组的范围内：约3.25至约3.85；约4.5至约4.85；约6.0至约6.45；约6.60至约7.0；约7.5至约8.15；约8.35至约8.55；约9.25至约9.65；以及约10.00至约11.5。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)在选自由以下组成的组的不同范围内：约3.25至约3.85；约4.5至约4.85；约6.0至约6.45；约6.60至约7.0；约7.5至约8.15；约8.35至约8.55；约9.25至约9.65；以及约10.00至约11.5。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)选自由以下组成的组：约3.75；约4.76；约6.10；约6.90；约8.04；约8.44；约9.39；以及约10.50。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述MAI还包含含有第一轻链可变区的第三多肽。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述MAI还包含第三多肽和第四多肽，其中所述第三多肽和第四多肽各自包含第二轻链可变区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一轻链可变区与第二轻链可变区是相同的。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第三多肽与第四多肽是相同的。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含野生型Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含IgG1同种型Fc区、IgG3同种型Fc区、IgG3同种型Fc区或IgG4同种型Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含IgG1同种型Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含未经工程改造以改变第一亲代同源二聚抗体种类、第二亲代同源二聚种类或MAI的pI的Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含未经工程改造以改变第一亲代同源二聚抗体种类、第二亲代同源二聚种类或MAI的pI的IgG1同种型Fc区。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述MAI呈天然抗体形式；至少第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；至少第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式且第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；或者所述MAI呈天然抗体形式，第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式且第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，其中：所述MAI；所述第一亲代同源二聚抗体种类；所述第二亲代同源二聚抗体种类；所述第一亲代同源二聚抗体种类和所述第二亲代同源二聚抗体种类；或者所述MAI、所述第一亲代同源二聚抗体种类和所述第二亲代同源二聚抗体种类；呈IgG1形式、和IgG2形式、和IgG3形式、或IgG4形式、或杂合形式。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱法在基本上相同的离子强度下进行。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的离子强度在整个洗脱步骤期间保持基本上相同。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的第一样品和洗脱液的第二样品各自具有基本上相同的离子强度。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱法为离子交换色谱法。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱法选自由以下组成的组：阳离子交换色谱法；阴离子交换色谱法；多模态色谱法；及混合模式色谱法。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱材料是选自由以下组成的组：阴离子交换剂和阳离子交换剂。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱材料是选自由以下组成的组：强阳离子交换剂；强阴离子交换剂；多模态交换剂；及混合模式交换剂。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱材料是选自由以下组成的组：强阳离子交换剂和强阴离子交换剂。在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱法还包括使用选自由以下组成的组的色谱材料：Mustang S、Sartobind S、S03Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、HS20、SPSFF、Porors GoPure HS、Poros GoPure XS、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto Q ImpRes、Capto SP ImpRes、Capto S、Capto MMC、Fractogel Se HiCap、Fractogel S03、Fractogel COO、Poros HQ 50、Poros PI 50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、UNOshere S、Macro-Prep High S、DEAE、Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、Mono S 10/100GL、SP Sepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、及Source 30Q。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，色谱法还包括使用选自由以下组成的组的色谱材料：Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q5/50GL、SP Sepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、和Source 30Q、及MonoS 10/100GL。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述色谱材料为离子交换色谱材料。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述色谱材料是选自由以下组成的组：阳离子交换色谱材料；阴离子交换色谱材料；多模态色谱材料；及混合模式色谱材料。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mustang S、Sartobind S、S03Monolith、SCeramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、HS20、SPSFF、Porors GoPure HS、Poros GoPure XS、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto Q ImpRes、Capto SP ImpRes、Capto S、Capto MMC、Fractogel Se HiCap、Fractogel S03、FractogelCOO、Poros HQ 50、Poros PI 50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、UNOshere S、Macro-Prep High S、DEAE、Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、Mono S 10/100GL、SP Sepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、及Source30Q。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述离子交换色谱材料是选自Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、SP SepharoseHP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、和Source 30Q、及Mono S 10/100GL。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，第一重链可变区或第二重链可变区是通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述第一重链可变区和第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述第一重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得且所述第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述第一重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得且所述第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述文库中的至少一个还包含至少一条轻链。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽和所述第二多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽和所述第二多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽及所述第四多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，每个所编码的多肽是由宿主细胞表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述组合物是由宿主细胞表达。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，基本上每个宿主细胞都已经用所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽及所述第四多肽转化或转染。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，基本上每个宿主细胞都表达所述MAI、所述第一亲代抗体种类、和所述第二亲代抗体种类。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述宿主细胞是选自由以下组成的组：真核细胞；真菌细胞；酵母细胞；昆虫细胞；哺乳动物细胞；酿酒酵母细胞；巴斯德毕赤氏酵母细胞；哺乳动物细胞；COS细胞；人胚肾(HEK)细胞；及CHO细胞。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述离子交换洗脱液包括阳离子交换洗脱液或阴离子交换洗脱液，其是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种包含以下的离子交换洗脱液：CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐，所述洗脱液是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种包含以下的离子交换洗脱液：CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及NaCl，所述洗脱液是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种包括阴离子交换洗脱液的离子交换洗脱液，其是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种阴离子交换洗脱液，其包含：甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐，所述洗脱液是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种包含以下的阳离子交换洗脱液：CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及NaCl，所述洗脱液是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种包括阴离子交换洗脱液的离子交换洗脱液，其是用于从亲代同源二聚种类中分离MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述阳离子交换洗脱液不包括TRIS、哌嗪或咪唑。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种离子交换洗脱液，其基本上是由以下组成：CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供一种离子交换洗脱液，其是由以下组成：CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述盐选自由以下组成的组：NaCl、KCl或Na2SO4。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，本发明提供根据以上任一项的离子交换洗脱液，其中所述洗脱液被用于从包含MAI和亲代同源二聚抗体种类的组合物中纯化MAI。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述洗脱液包含在选自由以下组成的组的浓度范围内的至少一种盐：0mM至约100mM；0mM至约60mM；0mM至约50mM；0mM至约40mM；0mM至约30mM；0mM至约20mM；0mM至约10mM；0mM至约5mM；约10mM至约200mM；约10mM至约100mM；约10mM至约50mM；约10mM至约40mM；约10mM至约30mM；约10mM至约20mM；约20mM至约200mM；约20mM至约100mM；约20mM至约50mM；约20mM至约30mM；约30mM至约200mM；约30mM至约100mM；和约30mM至约50mM；及约5mM至约15mM。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的至少一种盐。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，所述盐为NaCl。
在可单独或与本文所公开的任何其他实施方案组合使用的某些实施方案中，洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的NaCl。
如技术人员将理解，在上文及通篇所公开的任何及所有实施方案可以任何组合形式实践，且因此，涵盖所有这类组合，并且据此公开和包括在本发明的范围内。
附图说明
图1A和1B提供了如实施例中所述的示例性洗脱液(缓冲剂和盐)的组成。提供了示例性洗脱液中每个列出的组分(缓冲剂和盐)的最终浓度，以及每个列出的缓冲剂的酸解离常数(pKa)。图1A提供了为阳离子交换操作(但如实施例中所述也用于某些阴离子交换操作)设计的示例性洗脱液组成。图1B提供了如在一些实施例中使用的示例性阴离子交换洗脱液组成。
图2提供了如实施例1中所述的阳离子交换色谱实验的示意图，其中Mono S 5/50GL柱被用于从两种相应的重链同源二聚抗体种类和两个拷贝的相同轻链(即，“共同的轻链”)分离包含两种不同重链多肽(重链“A”和重链“B”)的目标多特异性抗体。两条不同重链的计算等电点(pI)相差0.68个pH单位(“HCΔpI:0.68”)。两种相应的亲代同源二聚抗体种类(分别为“mAb A同源二聚体”和“mAb B同源二聚体”)的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位(“mABΔpI:1.33”)。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点的差；mL＝以毫升为单位的洗脱体积。所有抗体(MAI和亲代同源二聚种类)都呈IgG1形式。
图3提供了盐梯度(即离子强度梯度)阳离子交换色谱法与pH梯度阳离子交换色谱法分离四种不同的目标多特异性抗体(MAI)的能力的比较，每种MAI包含：来自包含两种相应的亲代同源二聚抗体种类的四组中的一组的两种不同重链多肽；和两个拷贝的相同轻链(即，“共同的轻链”)。两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)分别相差1.33、0.26、0.11和0.1个pH单位，如图中所示且如实施例5中所述。用于实验中的树脂和缓冲剂组成提供于图3的上表中。
图4A至4C提供了如实施例2中所述的独立阳离子交换色谱实验的示意图，其中Mono S 5/50GL柱(图4A和图4B)或Mono S 10/100GL柱(图4C)被用于从两种相应的重链亲代同源二聚种类中分离包含两种不同的重链多肽(重链“A”和重链“B”)和两个拷贝的相同轻链(即，“共同的轻链”)的多特异性抗体。两条不同重链的计算pI相差0.25个pH单位；两种相应的亲代同源二聚种类的计算pI相差0.59个pH单位。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点(PI)的差；mL＝以毫升为单位的洗脱体积。图4A描绘了0.228毫克(mg)总蛋白材料在指示的pH范围(大约pH 6.6-pH8.2；参见y轴)上经线性梯度的分离。图4B描绘了1.57mg总蛋白材料在指示的pH范围(大约pH 6.9-pH7.9；参见y轴)上经线性梯度的分离。图4C描绘了8.88mg总蛋白材料在指示的pH范围(大约pH6.9-pH 7.9；参见y轴)上经线性梯度的分离。所有抗体(MAI和亲代同源二聚抗体种类)都呈天然的IgG1形式。
图5A至5E提供了如实施例3中所述的独立阳离子交换色谱实验的示意图，其中Mono S 10/100柱被用于从两种相应的重链同源二聚种类中分离包含两种不同的重链多肽(重链“A”和重链“B”)和两个拷贝的相同轻链(即，“共同的轻链”)的多特异性抗体。图5A描绘了异源二聚和亲代种类的分离；其中两条重链之间的计算pI的差为0.68个pH单位；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位。图5B描绘了异源二聚和亲代种类的分离，其中两条重链之间的计算pI的差为0.43个pH单位；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.48个pH单位。图5C描绘了异源二聚和亲代种类的分离，其中两条重链之间的计算pI的差为0.25个pH单位；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.59个pH单位。图5D描绘了异源二聚和亲代种类的分离，其中两条重链之间的计算pI的差为0.24；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位。图5E描绘了异源二聚和亲代种类的分离，其中两条重链之间的计算pI的差为0.21；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.38个pH单位。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点的差；运行持续时间＝以毫升(mL)为单位的洗脱体积。所有抗体(MAI和亲代同源二聚抗体种类)都呈天然的IgG1形式。
图6A至6G提供了如实施例6中所述的独立阳离子交换色谱实验(图6A至6G)的示意图。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点的差；运行持续时间＝以毫升(mL)为单位的洗脱体积。所有抗体(MAI和亲代同源二聚抗体种类)都呈天然的IgG1形式。序列按照出现的次序分别公开为SEQ ID NOS40-43。
图7示出了本文所公开的方法，其提供当所述种类在其重链VH区中相差少至一个氨基酸时从包含MAI及其亲代同源二聚抗体种类的组合物中分离MAI的能力。IAEY为SEQ IDNO:40；IAQY为SEQ ID NO:41；ISKY为SEQ ID NO:42；VAKH为SEQ ID NO:43。
图8A至8C提供了如实施例4中所述的独立阳离子交换色谱实验的示意图，其中比较使用每种强阳离子交换剂Mono S 5/50GL或Mono S 10/100GL的具有计算的pI差为0.09(两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算的等电点(pI)相差0.10个pH单位)的重链的IgG1形式的抗体种类的纯化度。色谱条件如实施例4中所述。所有抗体(MAI和亲代同源二聚抗体种类)都呈天然的IgG1形式。图8A描绘了异源二聚与亲代种类的分离，其中所用的交换剂为Mono S 5/50GL(柱体积为1mL)，且pH梯度从pH 4.0运行至pH 11.0(pH梯度范围＝7.0个pH单位)。图8B描绘了异源二聚与亲代种类的分离，其中所用的交换剂为Mono S 10/100GL(柱体积为8mL)，且pH梯度从pH 6.65运行至7.65(pH梯度范围＝1.0个pH单位)。图8C描绘了异源二聚与亲代种类的分离，其中所用的交换剂为Mono S 10/100GL(柱体积为8mL)，且pH梯度从pH 6.87运行至7.27(pH梯度范围＝0.4个pH单位)。
图9A至9F示出了实施例7中所述的实验结果。
图10A和10B示出了实施例8中所述的实验结果。
图11A和11B、12A和12B、13A和13B、14A和14B、15A和15B、16A和16B、及17A和17B示出了实施例9中所述的实验结果。
图18A至18D提供了如实施例10中所述的独立阳离子交换色谱实验的示意图。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点的差；运行持续时间＝以毫升(mL)为单位的洗脱体积。所有抗体(MAI和亲代同源二聚抗体种类)都呈天然的IgG4形式。
图19A和19B提供了如实施例11中所述的独立阳离子交换色谱实验的示意图。A280＝在280nm的波长下测量的吸光度单位；ΔpI＝两条不同重链之间的计算等电点的差；运行持续时间＝以毫升(mL)为单位的洗脱体积。MAI呈杂合的天然IgG1/天然IgG4形式，第一亲代同源二聚抗体种类呈天然IgG1形式且第二亲代同源二聚抗体种类呈天然IgG4形式。
图20A和20B、21A和21B、及22A和22B示出了实施例13中所述的实验结果。
图23示出了实施例13中所述的实验结果。
图24示出了实施例14中所述的实验结果。
图25A和25B示出了实施例15中所述的实验结果。
图26A和26B共同提供了适于根据所公开和要求保护的方法使用的示例性色谱材料(“树脂”和“基质”)的列表及其某些特征。
发明详述
本发明尤其提供用于从至少两种不同的亲代同源二聚抗体种类(在本文及通篇可与“亲代抗体种类”、“同源二聚亲代抗体种类”、“重链-同源二聚亲代抗体种类”、“重链-同源二聚亲代种类”等互换提及)中分离、分辨及纯化目标多特异性抗体(MAI)(在本文及通篇可与“异源二聚抗体种类”或“重链-异源二聚抗体”、替代的单数和复数形式的该术语等互换提及)的方法。有利的是，所公开的方法不需要工程改造或引入突变到任何同源二聚亲代抗体种类中，以便提高MAI从所述亲代抗体种类中的分离、分辨或纯化。
所述方法尤其包括获得包含每个上述种类的组合物且用所述组合物执行色谱法，例如离子交换色谱法，借此从第一亲代抗体种类和第二亲代抗体种类各自中分离MAI。在某些实施方案中，MAI包含含有第一重链(HC)可变区和第二重链可变区的第一多肽，其中第一与第二可变区具有不同抗原特异性和不同等电点(pI)。在某些实施方案中，不同等电点是不同的实际等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为不同的计算等电点。在某些其他实施方案中，MAI还包含含有第一轻链可变区的第三多肽。在某些其他实施方案中，所述MAI还包含第三多肽和第四多肽，其中所述第三多肽和第四多肽各自包含第二轻链可变区。在某些其他实施方案中，所述第一轻链可变区与所述第二轻链可变区是相同的。在某些其他实施方案中，第三多肽与第四多肽是相同的(即，它们构成“共同的轻链”)。
如技术人员应理解且通篇所公开，“特异性”是指抗体能够与目标抗原的一个或多个抗原决定簇、如一个或多个表位反应，而不与目标抗原的其他表位或其他目标抗原反应的性质。如本领域中所理解，抗体特异性取决于表位和/或抗体的结合位点的化学组成、物理力、能量偏好、位阻及分子结构或拓扑结构。
如技术人员应理解且如通篇所公开，“亲和力”是指抗体-表位相互作用的强度或稳定性。对表位具有较佳亲和力的抗体相对严格和/或稳定地与表位结合，而对表位具有不良亲和力的抗体相对较弱和或较不稳定地结合。
如技术人员应理解且如通篇所公开，“收集”或“收集到”对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的抗体是指将具有这种特异性的抗体与不具有这种特异性的那些抗体区分(或区分开)。收集或收集到对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的抗体不一定需要将抗体与不具有这种特异性的那些抗体进行物理分离以便区分。然而，在某些实施方案中，收集对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的抗体包括将所述抗体与不具有这种特异性的那些抗体进行物理分离。用于收集抗体的示例性方法和手段是本领域中已知的，且包括例如流式细胞术、荧光激活细胞分选术(FACS)、磁性激活细胞分选术(MACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等、及其组合。
本领域中的任何测定这种特异性的手段都可用于根据通篇所公开的方法测定这种特异性，且包括例如用可检测的标记来标记所述抗体；检测可检测的标记；检测抗体与抗原的一个或多个表位的结合的功能结果，如与已知对所述一个或多个表位具有特异性的另一抗体的竞争；调节目标抗原与已知的蛋白质相互作用配偶体或配体之间的蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用。
如本文及通篇所用，“共同的轻链”包含含有轻链可变区的多肽，所述轻链可变区能够稳定且独立地与至少两种不同的重链多肽配对且由此在各独立的情况下生成包含每种重链多肽的重链可变区及轻链可变区的抗原结合结构域。因此，两个拷贝的共同轻链各自能够与第一重链多肽和第二重链多肽稳定地配对，以使得多特异性(例如双特异性)异源二聚抗体MAI呈天然形式，如IgG同种型形式、如IgG1形式、IgG2形式、IgG3形式和/或IgG4形式，其中MAI对两种不同抗原具有特异性。
如本文及通篇所用，“稳定对”意指在重链多肽与轻链多肽(如共同的轻链)之间形成天然或类似天然的相互作用，其中MAI是以化学及功能上相关的和稳定的方式。
如本文及通篇所用，“稳定的”意指相对固定和或永久的。因此，例如，“稳定的”MAI或一对“稳定的”相关多肽为可以稳定形式收集和/或分离以使得该形式基本上被保留且由此可观察到稳定形式的化学和/或功能性质的多肽。
如本文及通篇所用，“天然的”、“野生型”描述了结构或实体，如分子、多肽、抗体、形式、免疫球蛋白、免疫球蛋白恒定区、Fc区、重链、轻链、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、MAI、亲代同源二聚抗体种类、来自亲代同源二聚抗体种类的重链等，其以一种形式存在于天然环境中，如在动物或动物种类中，如人或人物种中。这种“天然的”或“野生型”结构或实体不具有或含有已出于以下目的而被工程改造为这种结构或实体的突变：例如，提高或增强从非工程改造的结构或实体中分辨、分离或纯化这种工程改造的结构或实体的能力。举例来说，“天然的”或“野生型”MAI、亲代同源二聚抗体种类、来自亲代同源二聚抗体种类的重链等未被工程改造以具有增加或增大不同形式的所述MAI、亲代同源二聚抗体种类、来自亲代同源二聚抗体种类的重链之间的实际等电点或计算等电点的差的突变，以便提高或增强所述不同形式根据本文及通篇所公开的方法通过执行色谱法而分离、分辨或纯化的能力。
如本文及通篇所用，“类似天然的”描述具有天然形式的所述结构或实体的相当大量的性质或被设计来在物理和/或功能上以相当大的程度类似或模拟相应的天然结构或实体的结构或实体。
在某些实施方案中，提供一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，该异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：i)获得包含MAI、含有一个拷贝的第一多肽的第一亲代抗体种类及含有一个拷贝的第二多肽的第二亲代抗体种类的组合物；以及ii)进行色谱法，借此从所述第一和第二亲代抗体种类中分离MAI；由此纯化所述MAI。在某些实施方案中，不同等电点是不同的实际等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为不同的计算等电点。在某些实施方案中，所述执行步骤ii)包括：a使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及b.执行洗脱步骤，其中使色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代抗体种类的洗脱液的样品接触。
在某些实施方案中，提供一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，该异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：i)获得包含MAI、含有两个拷贝的第一多肽的第一亲代抗体种类及含有两个拷贝的第二多肽的第二亲代抗体种类的组合物；以及ii)进行色谱法，借此从所述第一和第二亲代抗体种类中分离MAI；由此纯化所述MAI。在某些实施方案中，不同等电点是不同的实际等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为不同的计算等电点。在某些实施方案中，所述执行步骤ii)包括：a.使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及b.执行洗脱步骤，其中使色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代抗体种类的洗脱液的样品接触。
关于本发明方法的开发，申请者令人惊讶地发现与先前许多方法相反，本发明方法的成功实践不要求MAI(或亲代抗体种类)的Fc区(或任何其他部分，在这方面)以经设计来或出于增强异源二聚MAI从相应的亲代同源二聚抗体种类中的亲和力-或离子交换-介导的分辨、分离或纯化的目的的方式被工程改造、诱变、取代或在其他方面改变。所公开和要求保护的方法因此有利地提供MAI的制备和纯化，所述MAI不具有免疫原性、PK及其他与MAI(所述非天然突变已被工程改造到其中)有关的缺点中的许多项。
因此，在某些实施方案中，提供一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，该异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：i)获得包含MAI、含有一个拷贝的第一多肽的第一亲代抗体种类及含有一个拷贝的第二多肽的第二亲代抗体种类的组合物；以及ii)进行色谱法，借此从所述第一和第二亲代抗体种类中分离MAI；由此纯化MAI，其中第一多肽和第二多肽中的至少一个呈天然形式，如天然IgG形式、如天然IgG1形式、天然IgG2形式、天然IgG3形式、天然IgG4形式、天然IgG1/IgG2杂合形式、天然IgG1/IgG3杂合形式、或天然IgG1/IgG4杂合形式。在某些实施方案中，不同等电点是不同的实际等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为不同的计算等电点。在某些实施方案中，所述执行步骤ii)包括：a.使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及b.执行洗脱步骤，其中使色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代抗体种类的洗脱液的样品接触。
因此，在某些实施方案中，提供一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，该异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：i)获得包含MAI、含有两个拷贝的第一多肽的第一亲代抗体种类及含有两个拷贝的第二多肽的第二亲代抗体种类的组合物；以及ii)进行色谱法，借此从所述第一和第二亲代抗体种类中分离MAI；由此纯化MAI，其中第一多肽和第二多肽中的至少一个呈天然形式，如天然IgG形式、如天然IgG1形式、天然IgG2形式、天然IgG3形式、天然IgG4形式、天然IgG1/IgG2杂合形式、天然IgG1/IgG3杂合形式、或天然IgG1/IgG4杂合形式。在某些实施方案中，不同等电点是不同的实际等电点。在某些其他实施方案中，不同的等电点为不同的计算等电点。在某些实施方案中，所述执行步骤ii)包括：a.使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及b.执行洗脱步骤，其中使色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代抗体种类的洗脱液的样品接触。
如本文及通篇所用，“纯化”意指将一个种类、如异源二聚MAI，与其他种类、如一个或多个亲代同源二聚种类分离，以便关于来自包含MAI和一个或多个亲代同源二聚种类的异质组合物的MAI生成基本上同源的样品。
如本文及通篇所用，“获得”意指发现、接收或以其他方式拥有材料，如MAI、亲代同源二聚抗体种类、重链可变区、轻链可变区、包含重链可变区的重链多肽、包含轻链可变区的轻链多肽、包含上述任一者的MAI、包含上述任一者的亲代同源二聚抗体种类、包含上述任一者的组合物和/或包含上述任一者的色谱材料-组合物复合物。此外，获得可指的是通过通过使用抗原查询包含这种材料的变体的文库发现这种材料以鉴别这种材料对所述抗原具有特异性。获得还可或替代地包含接收来自另一来源或人员的这种材料，如另一先前鉴别或表征的抗体或抗体序列。
如本文及通篇所用，“组合物”意指流体，如液体，其含有许多种类，如异源二聚MAI及两种相应的亲代同源二聚抗体种类。这种组合物是通过表达第一和第二多肽及任选第三和第四多肽(其可包含相同的轻链可变区)而产生。
目标异源二聚多聚抗体(通篇可与“异源MAI”或“MAI”互换使用)意指目标抗体种类，其包含含有第一重链(HC)可变区的第一多肽和含有第二HC可变区的第二多肽，其中第一与第二重链可变区在氨基酸序列方面不同并且具有不同的抗原特异性。第一和第二多肽在一些实施方案中包含在和/或衍生自两种不同的亲代同源二聚抗体种类的重链多肽。在某些实施方案中，MAI还包含含有第一轻链可变区的第三多肽。在其他实施方案中，MAI还包含含有第二轻链可变区的第四多肽。在某些实施方案中，第一与第二轻链可变区是相同的。在仍然另一些实施方案中，第三与第四多肽是相同的(即它们构成“共同的轻链”)。
“亲代同源二聚抗体种类”(可与“同源二聚亲代抗体种类”、“亲代抗体种类”、“同源二聚亲代种类”、“同源二聚抗体种类”等通篇互换使用)意指包含以下的抗体种类：至少一个拷贝的具有两种抗原特异性中的一种的重链，由所述特异性获得或衍生出MAI的特异性且由此产生MAI；至少两个拷贝的具有两种抗原特异性中的一种的重链，由所述特异性获得或衍生出MAI的特异性且由此产生MAI。在某些实施方案中，包含第一和第二重链可变区的每个亲代同源二聚抗体种类的多肽是在宿主细胞中连同包含第一和第二轻链可变区的第三和第四多肽一起表达。在一些实施方案中，第一与第二轻链可变区在氨基酸序列方面是相同的。在某些实施方案中，第三与第四多肽在氨基酸序列方面是相同的(即，第三和第四多肽构成“共同的轻链”)。在某些实施方案中，亲代同源二聚种类包含两个拷贝的具有两种抗原特异性中的一种的重链，由所述特异性获得或衍生出MAI的特异性且由此产生MAI。
如本文及通篇所用，“色谱法”在其广泛意义上是指用于将目标种类从包含目标种类以及其他种类的组合物中分离或纯化的本领域中可用的实验室套组。组合物与色谱材料接触，以使得组合物的各种成分可吸附到色谱材料上，由此形成色谱材料-组合物复合物。随后，洗脱液与色谱材料-组合物复合物接触，并且吸附的种类的差别去除或“洗脱”作为在洗脱液存在下每个种类对色谱材料的亲和力的函数而发生。
色谱法可为制备型或分析型。制备型色谱法的目的是分离混合物的组分以供更高级的使用(且因此呈纯化形式)。分析型色谱法通常用较少量的材料进行并且是用于测量分析物在混合物中的相对比例。两者并不互相排斥。
如本文及通篇所用，“接触”意指物理上互相作用，如通过共价或非共价相互作用。非共价相互作用包括疏水性、亲水性、离子、阳离子、阴离子、极性、双极性、范德华力等。“接触”或已经“接触”的材料在物理上彼此接触。在某些实施方案中，如色谱材料的材料与包含抗体种类(如MAI和相应的同源二聚亲代抗体种类等)的组合物的接触造成色谱材料-组合物复合物的生成，其中组合物中的至少两种、或许三种或或许更多种、或所有抗体种类在物理上相互作用并且保持附着于色谱材料。
“色谱材料-组合物复合物”意指通过先前未曾接触或互相作用的两种材料或更多种材料之间的物理相互作用生成的多组分材料。物理相互作用可为两种类型的分子实体之间和/或见于每种相应的相互作用材料上的某些官能团或部分之间的物理化学相互作用，如共价或非共价相互作用。色谱材料-组合物复合物可包含组合物的一个或多个抗体种类，一旦组合物与色谱材料接触或在组合物与色谱材料接触之后所述抗体种类被吸附到色谱材料上/中，这种吸附是由色谱材料上的官能团与抗体种类的某些区域或部分之间的有吸引力的物理化学力或相互作用引起。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，色谱材料是阳离子交换材料。在一些实施方案中，阳离子交换材料为带负电且具有自由阳离子以便当经过或通过固相时与水溶液中的阳离子交换的固相。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料可为膜、整块料或树脂。在一些实施方案中，阳离子交换材料可为树脂。阳离子交换材料可包含羧酸官能团或磺酸官能团，如但不限于磺酸根、羧酸根、羧甲基磺酸根、磺基异丁基、磺乙基、羧基、磺基丙基、磺酰基、次硫酸乙基或正磷酸根。在上述一些实施方案中，阳离子交换色谱材料是阳离子交换色谱柱。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，色谱材料是阴离子交换材料。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料为带正电且具有自由阴离子以便当经过或通过固相时与水溶液中的阴离子交换的固相。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换材料可为膜、整块料或树脂。在一个实施方案中，阴离子交换材料可为树脂。在一些实施方案中，阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团、或二乙氨基乙基官能团。在上述一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱柱。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，离子交换材料可利用常规色谱材料或对流色谱材料。常规色谱材料包括例如易散发的材料(例如，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和易扩散的材料(例如交联的琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可为Poros树脂。在一些实施方案中，交联的琼脂糖树脂可为磺基丙基-琼脂糖Fast Flow(“SPSFF”)树脂。对流色谱材料可为膜(例如聚醚砜)或整块材料(例如交联聚合物)。聚醚砜膜可为Mustang。交联聚合物整块材料可为交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙酯)。
在本发明的任何方法的一些实施方案中，色谱材料呈色谱柱；例如，阳离子交换色谱柱或阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，色谱柱是用于液相色谱法。在一些实施方案中，色谱柱是用于高效液相色谱法(HPLC)。在一些实施方案中，色谱柱是HPLC色谱柱；例如，阳离子交换HPLC柱或阴离子交换HPLC柱。
阳离子交换色谱材料的实例是本领域中已知的并且包括但不限于：Mono S、PorosHS、Source 30S、Mustang S、Sartobind S、S03Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、Poros GoPure XS、Poros GoPure HS、SP Sepharose FF、SPSepharose HP、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S、UNOsphereS、Macro-prep High S、Capto SP ImpRes、Fractogel Se HiCap、Fractogel S03、Fractogel COO、ProPac WCX-10及ProPac WCX-10HT。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料是Poros HS50。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，Poros HS树脂可为Poros HS 50μm或Poros HS 20μm粒子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono S、SP Sepharose FF、Macro-prepHigh S、Poros GoPure XS、Poros GoPure HS、Capto SP ImpRes、SP Sepharose HP及Sourse 30S。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono S、Poros HS、SP Sepharose HP及Source 30S。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono S、SP Sepharose HP及Source 30S。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono S、Poros HS及Source 30S。
阴离子交换色谱材料的实例是本领域中已知的并且包括但不限于：Mono Q、PorosHQ 50、Poros PI 50、Poros D、Poros XQ、Poros HQ、Capto Q ImpRes、Q HP、Source 30Q、Mustang Q、Q Sepharose FF、Dionex ProPac 10SAX和Tosoh GSKgel Q STAT 7μΜWAX及DEAE Sepharose。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono Q、Poros XQ、Poros HQ、Capto Q ImpRes、Q HP及Source 30Q。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mono Q、Sourse 30Q及Q HP。多模态离子交换色谱材料的一个实例是Capto MMC。
如本文及通篇所用，“洗脱液”(可与“洗提液”互换使用)包括流体，如液体溶液，其是用于除去吸附到色谱材料上的物质。根据所公开和要求保护的方法使用的洗脱液包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种不同的缓冲剂。数量和化学身份的选择可基于所需pH范围根据技术人员所希望生成的基本线性pH梯度来进行。此pH范围的选择又可如本文及通篇所公开基于对第一重链多肽与第二重链多肽的实际等电点或计算或理论等电点的差(“ΔpI”)的确定来进行。或者，如果需要的话，技术人员又可如本文及通篇所公开基于对第一亲代同源二聚抗体种类与第二亲代同源二聚抗体种类的实际等电点或计算或理论等电点的差(“ΔpI”)的确定来选择。因此，技术人员可决定选择具有充分覆盖与多肽的pI(以及它们pI的差异)有关的pH范围的pKa的缓冲剂。
如本文及通篇所用，“等电点”(在本文及通篇中也称为“pI”)是多肽或蛋白质、如重链多肽、亲代同源二聚抗体种类、MAI、抗体、免疫球蛋白、IgG等不具有净电荷时的pH，且一般表示为pH值。等电点可为“计算的(或理论的)等电点”或“实际”(凭经验确定的)等电点。
如本文及通篇所用，“计算的等电点”(或“理论等电点”)为通过使多肽或蛋白质的一级序列经受算法、程序、编码等而报告或测定的等电点值，这些手段被设计来基于有关多肽或蛋白质(或其组成氨基酸)和/或溶剂组分或其可能暴露于的其他化学物种的化学和物理性质的某些假定的定义参数提供预测或理论pI值；预测二级结构特点和拓扑结构；预测某些可离子化基团的溶剂暴露；等等。用于计算pI的工具和方法的非限制性实例包括以下文献中所公开的那些：Bas等人,Protein,第72(3)卷,第765-783页(2008)；Stothard P,Biotechniques,第28(6)卷,第1102-1104页(2000)；和the Sequence Manipulation Site(SMS)，例如在万维网上在hypertext protocol transfer bioinformatics.org/sms2/处。在任何情况下，不希望被任何理论约束并且如技术人员将理解，当计算重链多肽、亲代同源二聚抗体种类、MAI、抗体、免疫球蛋白、IgG等的pI时，可优选例如考虑某些半胱氨酸残基，如可参与二硫键的那些，作为非可离子化，和/或考虑推测的N端糖基化位点作为非可离子化。
如本文及通篇所用，“实际等电点”(或“实际等电点”)是通过使用本领域中可用的方法和工具测量多肽或蛋白质、如重链多肽、亲代同源二聚抗体种类、MAI、抗体、免疫球蛋白、IgG等的物理样品(或含有所述样品的组合物，如溶液)的pI所报告或测定的等电点值。
如本文及通篇所用，“缓冲剂”为酸或碱，通常为弱酸或弱碱，其被用于维持溶液的酸度(pH)，如在添加另一种酸或碱之后接近所选值的洗脱液。也就是说，缓冲剂的作用是防止当酸或碱添加到溶液中时pH的急剧变化。缓冲剂具有可变的性质—一些比其他的更可溶；一些为酸性，而其他为碱性。使给定缓冲剂能最好地缓冲溶液的有效pH大致为所述缓冲剂的酸解离常数(“pKa”)的负对数。酸缔合常数的(负对数)为酸在溶液中的强度的数量测度。每种酸具有不同的pKa。其为在酸-碱反应的情形下称为解离的化学反应的平衡常数。Ka值越大，分子在溶液中的解离越多且由此酸越强。因此，强酸倾向于比弱酸更容易去质子化。
在某些实施方案中，洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的pKa介于约3与约11之间。
在某些实施方案中，洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的pKa在选自由以下组成的组的范围内：约3.25至约3.85；约4.5至约4.85；约6.0至约6.45；约6.60至约7.0；约7.5至约8.15；约8.35至约8.55；约9.25至约9.65；以及约10.00至约11.5。
在某些实施方案中，洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)选自由以下组成的组：约3.75；约4.76；约6.10；约6.90；约8.04；约8.44；约9.39；及约10.50。
如本文及通篇所用，“pH依赖性方式”意指以随pH的变化而改变的方式表现。举例来说，如果洗脱液能够产生pH梯度的话，那么具有不同pI的种类将在不同的和可区别的时间和体积的所述洗脱液中从柱上洗脱。在某些实施方案中，通过在所需初始pH下制备洗脱液的样品并在所需终末pH下制备洗脱液的另一样品产生这种pH梯度。在某些实施方案中，所需初始pH小于7.0；小于6.5；小于6.0；小于5.5；小于5.0；小于4.5；小于4.0；小于3.5；或小于3.0；或介于任何前述值之间的pH值。在某些实施方案中，所需终末pH大于7.0；大于7.5；大于8.0；大于8.5；大于9.0；大于9.5；大于10.0；大于10.5；或大于11.0；大于11.5；大于12.0；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，MAI的第一多肽的计算等电点与第二多肽的计算等电点之间的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.10个pH单位；0.05个pH单位；小于0.025个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
在某些实施方案中，第一抗体、如第一免疫球蛋白、第一IgG或第一亲代同源二聚抗体种类的计算等电点；与第二抗体、如第二免疫球蛋白、第二IgG或第二同源二聚抗体种类的计算等电点之间的差：小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.10个pH单位；0.05个pH单位；小于0.025个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
根据本文所公开和要求保护的方法，洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物以便从色谱材料中洗脱MAI和/或亲代同源二聚抗体种类。在某些实施方案中，洗脱种类被洗脱为基本上同源样品的个别溶液，其中每个样品含有一个种类，如MAI，且基本上不含可感知量的其他种类，如亲代同源二聚抗体种类。在其他实施方案中，种类被从色谱材料上洗脱以便一个种类(如MAI)在一系列溶液体积中洗脱，其中一些包含MAI的基本上同源的样品，且其中一些包含主要种类的MAI以及变化的较少量的一种或多种亲代同源二聚抗体种类。在这种实施方案中，技术人员可常规地选择保留包含MAI的基本上同源样品的那些体积并丢弃其他体积。
因此，如技术人员将理解，本发明方法允许MAI和亲代同源二聚抗体种类从色谱材料上洗脱以便这些种类基本上可彼此区分开。如本文及通篇所用，“基本上可区分开”意指所述种类通过色谱法充分分离以便可收集每个种类的样品，其基本上不含其他种类。这种分离可以色谱迹线来观察，其允许对监测例如作为时间、洗脱体积等的函数从柱上洗脱的蛋白质材料的浓度的其他手段的目测。这种可区分的分离可包括其中基本上所有各个种类都彼此分离的洗脱，或其中出现两个或更多个种类洗脱体积之间的一定量的重叠的洗脱。在如技术人员将理解如上所述出现一定重叠的实施方案中，可收集据观察不包含或基本上不包含重叠的洗脱液体积，且由此实现根据要求保护的方法的分离。
如本文及通篇所用，“流动”(和替代地，“流动的”)意指足量的洗脱液施于和/或通过色谱材料和/或色谱材料-组合物复合物，以便材料和/或复合物与洗脱液接触。如技术人员应理解，可使适于这种流体/溶液的若干或多个柱体积流动以便在洗脱步骤之前平衡材料或基质并且当进行洗脱步骤时使适合的多个体积流动。这可以变化以增加或减小pH梯度的斜率及由此洗脱柱上所吸附的各个种类所需的总洗脱体积。
然而，有利的是，另外发现可制备以如本文所公开的适当浓度包含许多缓冲剂的洗脱液，以使得洗脱液可用于制备包含以下的pH梯度：线性pH梯度相；在线性pH梯度相之前的至少一个分步pH梯度相；在线性pH梯度相之后的至少一个分步pH梯度相；仅线性pH梯度相；基本线性的pH梯度相；等等，在如技术人员所需且如本文及通篇所述的大多数pH标度中，以便大部分MAI可从包含所述MAI和亲代同源二聚抗体种类的组合物中纯化，而不考虑重链多肽的pI或pI差。例如，发现洗脱单一蛋白质混合物中的某些模型蛋白的一种示例性洗脱液(参见Kroner等人,J.Chromatog.,第1285卷,第78-87页(2013))有效地从大约pH 3缓冲至大约pH 11，以便可在此范围内产生基本线性的pH梯度，所述洗脱液含有：N环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸、甲酸及NaCl。惊人地发现尤其适合于所公开和要求保护的方法的某些实施方案的另外的洗脱液包含甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。已发现，如本文及通篇所公开，这些洗脱液还从包含MAI和亲代同源二聚抗体种类的组合物中有效纯化多种MAI，如通篇所公开和要求保护的方法中所提供。由于这些洗脱液有效产生在大约3至大约11的pH范围内的基本线性pH梯度，所以在某些实施方案中，本发明提供用于从包含MAI和亲代同源二聚抗体种类组分的组合物中纯化MAI的方法，而不考虑或不用先前已知MAI的第一和第二重链多肽(及由此相应的亲代同源二聚抗体种类中的重链)的pI。
如本文及通篇所用，“线性pH梯度相”或“线性pH梯度”在通篇可互换使用，意指展现每单位体积的洗脱物大体上或基本上平稳的恒定变化速率的pH梯度，所述洗脱物在相对较大的洗脱液体积上或相对较多数量的连续柱洗脱液级分上流动或流动通过色谱材料和/或色谱材料-组合物复合物。
如本文及通篇所用，“分步pH梯度相”或“分步pH梯度”在通篇可互换使用，意指展现相对急剧变化的pH的pH梯度，以便较大的pH变化可在洗脱液在相对较小的洗脱液体积上或相对较少数量的连续柱洗脱液级分上流动或流动通过色谱材料和/或色谱材料-组合物复合物时在洗脱液中出现。虽然这种分步pH梯度相实际上展现每单位洗脱液体积可观察的变化速率，但如本文及通篇所用，所述分步pH梯度相仍可同线性pH梯度相区分开。在某些实施方案中，这种分步pH梯度相被认为相对于线性pH梯度相展现每单位洗脱液体积基本上瞬时的pH变化速率。
然而，另外，已惊人地发现分步pH梯度相还可在使用本文所述的洗脱液和其中这种分步pH梯度相可需要并适于包括在目的为从MAI-亲代同源二聚亲代种类混合物中分离某些MAI的色谱程序中的情形期间采用。
在某些实施方案中，洗脱液不包括以下试剂：咪唑、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
在某些实施方案中，洗脱液基本上是由以下组成：CAPS；CHES；TAPS；HEPPSO；MOPSO；MES；乙酸；和甲酸；及任选至少一种盐。
在其他实施方案中，洗脱液是由以下组成：CAPS；CHES；TAPS；HEPPSO；MOPSO；MES；乙酸；和甲酸；及至少一种盐。
本发明方法提供通过选择多种盐浓度视需要调节或操纵洗脱液的离子强度的能力。因此，在某些实施方案中，盐浓度可选自由以下组成的组：0mM至约100mM；0mM至约60mM；0mM至约50mM；0mM至约40mM；0mM至约30mM；0mM至约20mM；0mM至约10mM；0mM至约5mM；约10mM至约200mM；约10mM至约100mM；约10mM至约50mM；约10mM至约40mM；约10mM至约30mM；约10mM至约20mM；约20mM至约200mM；约20mM至约100mM；约20mM至约50mM；约20mM至约30mM；约30mM至约200mM；约30mM至约100mM；和约30mM至约50mM；及约5mM至约15mM。
在某些实施方案中，洗脱液包含至少一种选自由以下组成的组的盐：NaCl、KCl及Na2SO4。
在某些实施方案中，洗脱液包含在约10mM浓度下的NaCl。
根据本文及通篇所公开和要求保护的本发明方法，申请者还发现促进MAI从所述组合物中的便利纯化的加样缓冲液和洗脱液组分，并且进一步发现可适宜采用相同的缓冲液组成(在本文及通篇称为“洗脱液”)作为加样缓冲液和洗脱缓冲液-仅需要制备在第一pH(“加样pH”)下的缓冲液组分的第一样品和在第二pH(“洗脱pH”)下的缓冲液组分的第二样品，其中加样pH和洗脱pH是由技术人员选择用于通过本发明方法的洗脱步骤产生基本上线性每小时pH梯度。所需pH范围(基本上线性的pH梯度应在此范围上施用)的确定可基于例如对包括在MAI中的每条重链的预期pI的计算而实现。类似地，待施用的梯度的斜率的确定可通过测定包括在MAI中的每条重链之间的pI单位的差(ΔpI)而得知。
如本文及通篇所公开，本发明方法提供MAI的纯化及用于进行所述方法的试剂如缓冲剂、洗脱液等。
术语“抗体”在本文中以其广泛的意义使用并且具体包括至少单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及抗体片段。抗体为包含一种或多种基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白质。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。
“抗体”还指的是免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其衍生物，其具有经由在抗原上存在的表位特异性结合至抗原的能力，抗体可为例如：蛋白质；多肽；肽；激素；细胞因子；趋化因子；生长因子；神经递质；含碳水化合物的生物分子；含脂质或脂肪酸的生物分子；或其他生物分子。
如本文及通篇所用的“抗体”还指的是包含抗体的一个或多个可变区或可变结构域的多肽，其中所述可变区或可变结构域能够接合并结合至一种或多种抗原的一个或多个表位。
如本文所用的“多肽”或“蛋白质”意指至少两个共价附着的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，或可为合成的肽模拟物结构，即“类似物”，如肽。
抗体(可与“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白分子”互换使用)可为单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等，并且可包括一类在结构上相关的蛋白质，其是由两对多肽链组成：一对轻链(LC)和一对重链(HC)，全部都通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经充分表征。参见，例如Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编著,第2版Raven Press,N.Y.(1989))。
传统的天然抗体结构单元通常包括四聚体。每个四聚体通常包含两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有几个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因此，如本文所用的“同种型”意指由其恒定区的化学和抗原特征所定义的免疫球蛋白的任何类别和亚类。已知的人免疫球蛋白同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。这些抗体类别之间的区别特征是它们的恒定区，但在可变区中也可存在细微差异。
轻链和重链各自由称为可变区和恒定区的两种不同区构成。IgG重链是由四个免疫球蛋白结构域构成，从N端到C端以VH-CH1-CH2-CH3的顺序连接，分别指的是“可变重链结构域”(也称为“重链可变结构域”，通篇可互换使用)、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2和重链恒定结构域3(也称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别指的是可变重链结构域、恒定γ1结构域、恒定γ2结构域和恒定γ3结构域)。IgG轻链是由两个免疫球蛋白结构域构成，从N端到C端以VL-CL的顺序连接，分别指的是“可变轻链结构域”(也称为“轻链可变结构域”，通篇可互换使用)和轻链恒定结构域。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生物化学事件。构成抗体的天然生物形式(包括可变区和恒定区)的结构在本文中被称为“全长抗体”。在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，IgG同种型的全长抗体为四聚体并且由两个相同对的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含VL和CL，且每条重链包含VH、CH1、CH2和CH3。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，IgG抗体可仅由两条重链组成，每条重链包含附着于Fc区的可变结构域。
重链恒定区通常包含三种结构域，即CH1、CH2和CH3，并且CH1与CH2结构域是由绞链区相连。每条轻链通常包含轻链可变结构域(在本文中缩写为“VL”或“VL”)和轻链恒定结构域。VH和VL结构域可进一步再分成高变区域(或高变区，其可在序列和/或结构上定义的环形式上高变)，也称为互补决定区(CDR)，它们散布在更保守的区域中，这些区域称为框架区(FR)。VH和VL通常各自包含三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常，在此区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat(参见，例如Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版,U.S.Department of Health and Human Services,1992)中所述的方法进行。使用此编号系统，肽的实际线性氨基酸序列对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入可含有较少或额外的氨基酸。举例来说，重链可变结构域可在VH CDR2的残基52之后包括单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)且可在重链FR残基82之后包括插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c)。对于给定的抗体，残基的Kabat编号可通过与“标准”Kabat编号序列在抗体的同源序列区域处的比对而确定。
术语“可变”、“可变结构域”或“可变区”各自可互换地指代免疫球蛋白结构域的部分，这些部分在它们的序列上展现可变性并且参与了决定具体抗体的特异性和结合亲和力(即，“可变结构域”)。可变性不均匀地分布在抗体的可变结构域中；其集中在重链和轻链可变区各自的亚结构域中。这些亚结构域被称作“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高变)部分被称作“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，大体上采用β-折叠构型，由三个高变区相连，由此连接形成环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。在每条链中的高变区通过FRM紧密保持在一起并且与来自另一链的高变区一起促成抗原结合位点的形成(参见Kabat等人Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991，以引用的方式整体并入)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但展现各种效应子功能，例如像抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体激活。
术语“框架区”是指存在于更趋异的(即高变的)CDR之间的抗体可变区的技术领域公知的部分。这种框架区通常被称为框架1至4(FRM1、FRM2、FRM3和FRM4)并且提供用于在三维空间中呈递六个CDR(三个来自重链且三个因为轻链)以形成抗原结合表面的支架。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环采用的主链构象。由比较结构研究发现六个抗原结合环中有五个只有有限的可用的构象库。每个规范结构可具有多肽主链的扭转角的特征。抗体之间的相应环因此可具有极类似的三维结构，尽管在环的大部分中有高氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196:901；Chothia等人,Nature,1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol,1996,263:800。此外，在所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在一定关系。特定规范类别的构象是由环长度和驻留在环内以及保守框架内(即环外)的关键位置处的氨基酸残基决定。对特定规范类别的分配因此可基于这些关键氨基酸残基的存在而作出。
如本文所用的“位置”意指在蛋白质或核酸序列中的位置。蛋白质位置可按顺序或根据已确立的形式，例如用于抗体可变区的Kabat索引或用于抗体恒定区的EU索引来编号。例如，位置297为在人抗体IgG1中的位置。相应位置如上所述来确定，一般通过与其他亲本序列的比对。
如本文所用“残基”意指在蛋白质中的位置及其相关氨基酸身份。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297，还称为N297)是在人抗体IgG1中的残基。在一些实施方案中，其还可指的是核酸碱基。
术语“规范结构”还可包括关于抗体的线性序列的考量，例如，如由Kabat所编目(Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版,U.S.Department of Health and Human Services,1992)。Kabat编号方案是一种以一致的方式为抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的普遍采用的标准。另外的结构考量也可用于确定抗体的规范结构。举例来说，通过Kabat编号不能充分反映的那些差异可由Chothia等人的编号系统描述和/或通过其他技术，例如结晶学和二维或三维计算建模来揭示。因此，可将给定抗体序列置于规范类别中，这尤其允许鉴别适当的构架序列(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)。在文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号及如Chothia等人所述的结构考量以及其解释抗体结构的规范方面的意义。
如本文所用的“Fc”或“Fc区”意指包含抗体排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的恒定区的多肽。因此，“Fc区”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域；及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域；以及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及介于Cgamma1(Cγ1)与Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。因此且不背离以上所述，“Fc区”还可被定义为包含“CH2结构域或其变体”和“CH3结构域或其变体”。尽管Fc区的范围可变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat中的EU索引进行。Fc可指的是分离中的此区域或在Fc多肽(例如抗体)的情形下的此区域。如本文所用的“Fc多肽”意指包含所有或一部分Fc区的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合物、分离的Fc及Fc片段。
本发明多价抗体类似物的可变轻链(VL)和相应的可变重链结构域(VH)包含结合结构域，通篇还与同抗原相互作用的“抗原结合位点”互换提及。因此，本发明多价抗体类似物的“第一可变轻链结构域”和“第一可变重链结构域”共同形成“第一抗原结合位点”。类似地，本发明多价抗体类似物的“第二可变轻链结构域”和“第二可变重链结构域”共同形成“第二抗原结合位点”。本发明多价抗体类似物的“第三可变轻链结构域”和“第三可变重链结构域”共同形成“第三抗原结合位点”，以此类推。
根据本发明使用的抗原结合位点(包括VH、VL和/或包含这些的CDR)可获自或衍生自所述的任何来源，如技术人员应理解。因此，这种抗原结合位点、VH、VL和/或CDR可获自或衍生自：杂交瘤细胞，其表达针对由此识别的靶标的抗体；来自免疫供体的B细胞，其表达针对由此识别的靶标的抗体；已被刺激以表达针对由此识别的靶标的抗体的B细胞；和或对已通过筛选包含多个用于抗原结合抗体(或其抗原结合片段)的多核苷酸或多肽的文库所鉴别的抗体或抗体片段的鉴别。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，其抗原结合区的一个或多个部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体、及由完整抗体和抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的“scFv”意指由两个通过接头序列连接的可变区组成的多肽；例如，“接头”(也称为“接头部分”，通篇可互换使用)在下文中更详细地描述。
如本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。通常，VH和CH1结构域包含一种多肽及包含另一种多肽的VL和CL结构域，其中两种多肽经由至少一个多肽间二硫键彼此连接。Fab可指的是分离中的此区域，或在全长抗体或抗体片段的情形下的此区域。
“人源化抗体”一般是指以可变结构域框架区交换人抗体中所见的序列的非人抗体。一般在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体是由人来源的多核苷酸编码或与除其CDR内之外的这样一种抗体相同。CDR(其中的一个、一些或所有由起源于非人有机体的核酸所编码)被移植到人抗体可变区的框架中以产生抗体，其特异性是由移植的CDR决定。这种抗体的产生描述于例如WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中。经常需要所选的受体框架残基“回复突变”为相应的供体残基，由此恢复在初始移植构建体中丢失的亲和力(参见，例如美国专利号5,693,762)。人源化抗体最好还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的，且由此通常将包含人Fc区。对非人抗体进行人源化、整形和表面重构的多种技术和方法是本领域中公知的(参见，Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)及其中引用的参考文献)。在某些变型中，使用以下文献中所述的方法降低抗体的免疫原性：Lazar等人,2007,Mol Immunol44:1986-1998及2004年12月3日提交的名称为“Methods of GeneratingVariant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof”的美国序列号11/004,590。
“完整抗体”为包含全长重链和轻链及Fc区的抗体。完整抗体也被称为“全长异源二聚”抗体或免疫球蛋白。
术语“可变的”是指免疫球蛋白结构域的部分，这些部分在它们的序列上展现可变性并且参与了决定具体抗体的特异性和结合亲和力(即，“可变结构域”)。可变性不均匀地分布在抗体的可变结构域中；其集中在重链和轻链可变区各自的亚结构域中。这些亚结构域被称作“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高变)部分被称作“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，大体上采用β-折叠构型，由三个高变区相连，由此连接形成环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。在每条链中的高变区通过FRM紧密保持在一起并且与来自另一链的高变区一起促成抗原结合位点的形成(参见Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991，以引用的方式整体并入)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但展现各种效应子功能，例如像抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和补体激活。
本发明的“构架(chassis)”表示抗体重链可变(IGHV)或轻链可变(IGLV)结构域分别不为CDRH3或CDRL3部分的一部分。本发明的构架被定义为抗体可变区从FRM1的首个氨基酸起始且以FRM3的末个氨基酸结束的部分。在重链的情况下，构架包括从约Kabat位置1至约Kabat位置94的氨基酸。在轻链(κ和λ)的情况下，构架被定义为包括约Kabat位置1至约Kabat位置88。本发明的构架可含有相对于本文提供的或公共数据库中可获得的相应生殖系可变结构域序列的某些修饰。这些修饰可为工程改造过的(例如，以除去N-连接的糖基化位点)或为天然存在的(例如，考虑到等位基因变异)。例如，在本领域中已知免疫球蛋白基因库为多态性的(Wang等人,Immunol.Cell.Biol,2008,86:111；Collins等人,Immunogenetics,2008,DOI10.1007/s00251-008-0325-z，在线发表，各自以引用的方式整体并入)；代表这些等位基因变体的构架、CDR(例如，CDRH3)及恒定区也由本发明所涵盖。在一些实施方案中，在本发明的具体实施方案中使用的一种或多种等位基因变体可基于在不同患者群中存在的等位基因变异来选择，以便例如鉴别在这些患者群中没有免疫原性的抗体。在某些实施方案中，本发明抗体的免疫原性可取决于患者群的主要组织相容性复合体(MHC)基因中的等位基因变异。在本发明文库的设计中也可考虑到这种等位基因变异。在本发明的某些实施方案中，构架和恒定区包含在载体上，且CDR3区经由同源重组引入它们之间。在一些实施方案中，一个、两个或三个核苷酸可跟在重链构架之后，由此形成部分(如果一个或两个的话)或完整(如果三个的话)密码子。当存在完整密码子时，这些核苷酸编码称为“尾”并占据位置95的氨基酸残基。
在某些实施方案中，以下一者或多者是通过针对一个或多个来自一个或多个包含任何上述抗体组分或区域的独特成员的文库的抗原执行一次或多次选择而获得：第一重链可变区；第二重链可变区；第一轻链可变区；第二轻链可变区；包含于可变区中的一个或多个CDR；第一多肽；第二多肽；第三多肽；第四多肽；一种或多种亲代同源二聚抗体种类；和/或MAI。
在某些实施方案中，抗体(如MAI)的第一重链可变区或第二重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
在某些实施方案中，抗体(如MAI)的第一重链可变区和第二重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
在某些实施方案中，抗体(如MAI)的第一重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得并且第二重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
在某些实施方案中，抗体(如MAI)的第一重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得并且第二重链可变区通过针对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
在某些实施方案中，文库中的至少一个还包含至少一条轻链。
如技术人员应理解，术语“文库(library)”与“多个(plurality)”(以及“文库(libraries)”与“多个(pluralities)”)可容易互换使用。然而，在通篇所公开的本发明的情形下，“多个”物品，如抗体、编码抗体的核酸或宿主细胞可包含许多或大多数基本上相同的成员，而物品的“文库”，如抗体、编码抗体的核酸或宿主细胞包含许多或大多数独特的成员。
在某些实施方案中，一个或多个幼稚文库被用于根据要求保护的方法的选择中。“幼稚文库”是指未曾查询过是否存在对具体抗原具有特异性的抗体的多核苷酸(或由这种多核苷酸编码的多肽)的文库。“幼稚文库”还指的是不局限于或相反偏向或富含对任何抗原组或具体抗原具有特异性的抗体序列的文库。幼稚文库因此不同于“受限文库”和“成熟文库”(例如像“亲和力成熟文库”)，这两者都在下文中描述。
幼稚文库还可包含“免疫前”文库，其指的是具有类似于天然存在的抗体序列(如人抗体序列)的序列多样性和长度多样性的文库，之后这种天然存在的序列经受阴性选择和/或体细胞超变。这种免疫前文库可被设计和制备以便反映或模拟免疫前库，和/或可基于由人V、D和J基因的集合以及人重链和轻链序列的其他大数据库获知的合理设计来设计和制备(例如，公知的生殖系序列；来自Jackson等人,J.Immunol Methods,2007,324:26的序列，以引用的方式整体并入；来自Lee等人,Immunogenetics,2006,57:917的序列，以引用的方式整体并入；以及为重排的VK和Vλ编译的序列。附加信息可见于例如以下文献中：Scaviner等人,Exp.Clin.Immunogenet.,1999,16:234；Tomlinson等人,J.Mol.Biol,1992,227:799；以及Matsuda等人,J.Exp.Med.,1998,188:2151，各自以引用的方式整体并入。在本发明的某些实施方案中，代表人库中所见的可能的V、D和J多样性以及连接多样性(即，N1和N2)的盒是作为单链或双链DNA寡核苷酸从头合成。示例性所述免疫前文库及构成其的多核苷酸序列(和由这些多核苷酸序列编码的多肽序列)的设计和组成进一步描述于例如Lee等人(Immunogenetics,2006,57:917)；Martin等人,Proteins,1996,25:130；WO 2009/036379；及WO 2012/09568中。
在用于实践所公开的发明的抗体的情形下，这种抗体的文库(或多个抗体)将包含许多或大多数成员，其各自具有独特的一级酸序列；然而，所述文库(或多个抗体)还可包括具有相同氨基酸序列的成员。在某些实施方案中，所述成员的可变区将包含这些成员之间的氨基酸序列的许多差异。
在用于实践所公开的发明的宿主细胞的情形下，多个这种宿主细胞(或这种宿主细胞的文库)将包含宿主细胞成员，其中许多各自表达独特的抗体；然而，多个这种宿主细胞(或宿主细胞文库)还可包括表达相同抗体序列的成员。在某些实施方案中，这种宿主细胞还将载有共同编码抗体文库的核酸，所述抗体文库共同由宿主细胞表达。
如技术人员应理解且如通篇所公开，“多样性”是指多样化或显著的异质性。术语“序列多样性”是指多种序列，其共同代表序列的几种可能性，例如见于天然人抗体中的那些。例如，重链CDR3(CDRH3)序列多样性可指的是将已知的人DH与H3-JH段(包括N1和N2区)组合以形成重链CDR3序列的多种可能性。轻链CDR3(CDRL3)序列多样性可指的是将促成CDRL3的天然存在的轻链可变区(即L3-VL)与连接(即L3-JL)段组合以形成轻链CDR3序列的多种可能性。如本文所用，H3-JH是指促成CDRH3的IGHJ基因的部分。如本文所用，L3-VL和L3-JL分别是指促成CDRL3的IGLV和IGLJ基因(κ或λ)的部分。
如本文所用的术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在本发明的某些实施方案中，抗体文库被设计得足够小以便在化学上合成和物理上获得，但足够大以编码具有识别任何抗原的潜能的抗体。在某些实施方案中，抗体文库包含约107至1020个不同的抗体和/或编码文库抗体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，文库被设计以包括103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或1020个不同的抗体和/或编码抗体的多核苷酸序列。在某些实施方案中，文库可包含或编码约103至约105、约105至约107、约107至约109、约109至约1011、约1011至约1013、约1013至约1015、约1015至约1017、或约1017至约1020个不同的抗体。在某些实施方案中，文库的多样性可以表征为大于或小于以上列举的多样性中的一个或多个，例如大于约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或1020；或小于约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或1020。在本发明的某些其他实施方案中，目标抗体以具有如上列举的大小的文库的物理实现形式存在的概率为至少约0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％(关于具体序列以文库的物理实现形式存在的概率的更多信息，参见详细说明中的文库抽样)。
如技术人员应理解且如通篇所公开，根据所公开的方法适用的抗体文库可通过本领域中可用的任何方法来设计和制备，如例如WO2009036379；WO2012009568；WO2010105256；US 8,258,082；US 6,300,064；US 6,696,248；US 6,165,718；US 6,500,644；US 6,291,158；US 6,291,159；US 6,096,551；US 6,368,805；US 6,500,644等中所公开。
举例来说，文库可被设计和制备以便反映或模拟免疫前库，和/或可基于由人V、D和J基因的集合以及人重链和轻链序列的其他大数据库获知的合理设计来设计和制备(例如，公知的生殖系序列；来自Jackson等人,J.Immunol Methods,2007,324:26的序列，以引用的方式整体并入；来自Lee等人,Immunogenetics,2006,57:917的序列，以引用的方式整体并入；以及为重排的VK和Vλ编译的序列-参见与此同时提交的附录A和B)。附加信息可见于例如以下文献中：Scaviner等人,Exp.Clin.Immunogenet.,1999,16:234；Tomlinson等人,J.MoI.Biol,1992,227:799；以及Matsuda等人,J.Exp.Med.,1998,188:2151，各自以引用的方式整体并入。在本发明的某些实施方案中，代表人库中所见的可能的V、D和J多样性以及连接多样性(即，N1和N2)的盒是作为单链或双链DNA寡核苷酸从头合成。在本发明的某些实施方案中，将编码CDR序列的寡核苷酸盒连同含有重链或轻链构架序列的一个或多个受体载体一起引入酵母中。不采用基于引物的PCR扩增或来自哺乳动物cDNA或mRNA的模板导向的克隆步骤。通过标准同源重组，受体酵母将所述盒(例如CDR3)与含有一个或多个构架序列和恒定区的一个或多个受体载体重组，以生成适当排序合成的、全长人重链和/或轻链免疫球蛋白文库，其可遗传地增殖、表达、展示并筛选。本领域普通技术人员将容易认识到包含于受体载体中的构架可被设计以产生除全长人重链和/或轻链以外的构建体。例如，在本发明的某些实施方案中，构架可被设计以编码多肽编码抗体片段或抗体片段亚基的部分，以便当含CDR的寡核苷酸盒与受体载体重组时产生编码抗体片段或其亚基的序列。在某些实施方案中，本发明提供一种合成的、免疫前人抗体库，其包含约107至约1020个抗体成员，其中所述库包含：
(a)所选的人抗体重链构架(即，重链可变区的氨基酸1至94，使用Kabat定义)；(b)CDRH3库，基于人IGHD和IGHJ生殖系序列来设计，CDRH3库包含以下：
(i)任选的一个或多个尾区；
(ii)一个或多个N1区，其包含约0至约10个选自由以下组成的组的氨基酸：少于20个优选通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)的作用编码且在功能上由人B细胞表达的氨基酸类型；
(iii)基于一个或多个所选的IGHD段的一个或DH段及其一个或多个N端或C端截短；
(iv)一个或多个N2区，其包含约0至约10个选自由以下组成的组的氨基酸：少于20个优选通过TdT的活性编码且在功能上由人B细胞表达的氨基酸；及
(v)基于一个或多个IGHJ段的一个或多个H3-JH段及其一个或多个N端截短(例如，下至XXWG)；(c)一个或多个所选的人抗体κ和/或λ轻链构架；以及
(b)基于人IGLV和IGLJ生殖系序列设计的CDRL3库，其中“L”可为κ或λ轻链。用于制备这种文库的手段和方法公开于例如WO2009036379；WO2012009568；WO2010105256中。
如技术人员应理解且通篇所公开，“特异性”是指抗体能够与目标抗原的一个或多个抗原决定簇、如一个或多个表位反应，而不与目标抗原的其他表位或其他目标抗原反应的性质。如本领域中所理解，抗体特异性取决于表位和/或抗体的结合位点的化学组成、物理力、能量偏好、位阻及分子结构或拓扑结构。
如技术人员所理解并如通篇所公开，“亲和力”指的是抗体-表位相互作用的强度或稳定性。对表位具有较佳亲和力的抗体相对严格和/或稳定地与表位结合，而对表位具有不良亲和力的抗体相对较弱和或较不稳定地结合。
如技术人员应理解且如通篇所公开，对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的“收集”或“收集的”抗体是指具有来自不具有所述特异性的那些抗体的所述特异性的区分(或区分的)抗体。收集或收集到对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的抗体不一定需要将抗体与不具有这种特异性的那些抗体进行物理分离以便区分。然而，在某些实施方案中，收集对目标抗原的一个或多个表位具有特异性的抗体包括将所述抗体与不具有这种特异性的那些抗体进行物理分离。用于收集抗体的示例性方法和手段是本领域中已知的，且包括例如流式细胞术、荧光激活细胞分选术(FACS)、磁性激活细胞分选术(MACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等、及其组合。
本领域中的任何测定这种特异性的手段都可用于根据通篇所公开的方法测定这种特异性，且包括例如用可检测的标记来标记所述抗体；检测可检测的标记；检测抗体与抗原的一个或多个表位的结合的功能结果，如与已知对所述一个或多个表位具有特异性的另一抗体的竞争；调节目标抗原与已知的蛋白质相互作用配偶体或配体之间的蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用。
经常需要包括一个或多个成熟文库选择作为抗体发现过程的一部分。这种成熟文库选择，如亲和力成熟文库选择，可有利地并入本文所公开的方法中。
“成熟文库”是指经设计以增强或改进在查询文库(如幼稚文库或免疫前文库)是否存在对抗原具有特异性的抗体序列后鉴别的抗体序列的至少一种特征的文库。这种成熟文库可通过将对应于以下的核酸序列并入经设计以进一步体外或体内诱变产生具有在初始抗体前导物的情形下引入的多样性的文库的文库中而产生：一个或多个CDR；一个或多个抗原结合区；一个或多个VH或VL区；和/或一条或多条重链或轻链；获自或在幼稚文库(本文中称为“抗体前导物”)的查询中鉴别。这种成熟文库及其制造方法提供于例如WO 2009/036379(例如在第75至77页处)；和WO 2012/09568(例如在第69至72页处)中，并且包括：其中进行多样化的成熟文库，其中目标CDRH3保持不变，且重链框架区、CHRH1和/或CHDH2区被多样化；其中目标CDRL3保持不变且轻链框架区、CHRL1和/或CHDL2区被多样化的文库；其中预制的、多样化轻链与一条或多条目标重链合并的文库。
“受限文库”是指包含以下的文库：一条或多条独特的重链、一条或多条独特的轻链、或一条或多条独特的重链和一条或多条独特的轻链，其已经通过就对一种目标抗原具有特异性的抗原结合区从例如幼稚文库进行选择而获得或鉴别；并且被用于获得或鉴别对另一种目标抗原具有特异性的抗原结合区。这种受限文库通常包含许多重链或轻链，数量分别远超过轻链或重链的数量。在某些实施方案中，独特的重链的数量为至少105、至少106、至少107、108、或至少109或更多且独特的轻链的数量为1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200、500或1000。在某些实施方案中，独特的重链的数量在107与108之间，且独特的轻链的数量小于10、优选大约5。
在某些实施方案中，通篇所公开的方法可包括使用多个宿主细胞，其成员共同载有集体编码抗体文库的核酸，其中这种宿主细胞集体表达针对与目标抗原的结合物查询的抗体文库。当所述多个宿主细胞根据通篇所公开的方法制备和使用时，表达对目标抗原具有特异性的抗体的那些宿主细胞是从被查询的多个宿主细胞中收集；或者可收集由这种宿主细胞编码的抗体。在某些实施方案中，抗体在宿主细胞表达并分泌它们之后收集。
根据宿主细胞在通篇所公开的方法中的使用，通过本文所述的任何技术或其他合适技术产生的多核苷酸文库可引入所述宿主细胞中并且由此表达并筛选以鉴别具有所需结构和/或活性的抗体。可例如使用无细胞提取物(和例如，核糖体展示)、噬菌体展示、原核宿主细胞(例如，细菌展示)或真核宿主细胞(例如，酵母展示、哺乳动物细胞展示)进行抗体的表达。在本发明的某些实施方案中，由酵母表达和/或编码抗体文库。在某些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。在其他实施方案中，所述酵母为巴斯德毕赤氏酵母。
在其他实施方案中，多核苷酸被工程改造以充当可在无细胞提取物中表达的模板。可使用如例如美国专利号5,324,637；5,492,817；5,665,563(各自以引用的方式整体并入)中所述的载体和提取物并且许多都是可商购获得的。可使用将多核苷酸(即基因分型)与多肽(即表型)相连的核糖体展示及其他无细胞技术，例如ProfusionTM(参见，例如美国专利号6,348,315；6,261,804；6,258,558；和6,214,553，各自以引用的方式整体并入)。
或者，本发明的多核苷酸可在大肠杆菌表达系统中表达，如由Pluckthun和Skerra所述。(Meth.Enzymol.,1989,178:476；Biotechnology,1991,9:273,各自以引用的方式整体并入)。可表达突变蛋白以便分泌于细菌的介质和/或胞质中，如由Better和Horwitz,Meth.Enzymol.,1989,178:476(以引用的方式整体并入)所述。在一些实施方案中，编码VH和VL的单结构域各自附着于编码信号序列(如ompA、phoA或pelB信号序列)的序列的3'端(Lei等人,J.Bacteriol,1987,169:4379，以引用的方式整体并入)。这些基因融合物被组装到双顺反子构建体，以便它们可由单个载体表达，并分泌到大肠杆菌的周质间隙中，在其中它们将重折叠并可以活性形式回收。(Skerra等人,Biotechnology,1991,9:273，以引用的方式整体并入)。例如，抗体重链基因可与抗体轻链基因同时表达以产生抗体或抗体片段。
在本发明的其他实施方案中，使用如例如US20040072740；US20030100023；和US20030036092(各自以引用的方式整体并入)中所述的分泌信号和脂化部分在原核生物(例如大肠杆菌)的膜表面上表达抗体序列。
高等真核细胞，如哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞(例如NS/0细胞)、杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)及人胚肾(HEK)细胞也可用于表达本发明的抗体。通常，在哺乳动物细胞中表达的抗体被设计来分泌到培养基中或表达于细胞表面上。抗体或抗体片段可例如作为完整抗体分子或作为单独的VH和VL片段、Fab片段、单结构域或者作为单链(scFv)产生(Huston等人,PNAS,1988,85:5879，以引用的方式整体并入)。
或者，可通过如例如Jeong等人,PNAS,2007,104:8247(以引用的方式整体并入)中所述的锚定周质表达(APEx 2-杂合表面展示)或通过如例如Mazor等人,NatureBiotechnology,2007,25:563(以引用的方式整体并入)中所述的其他锚定方法表达和筛选抗体。
在本发明的其他实施方案中，可使用哺乳动物细胞展示选择抗体(Ho等人,PNAS,2006,103:9637，以引用的方式整体并入)。
来源于本发明文库的抗体的筛选可通过任何适当手段进行。例如，结合活性可通过标准免疫测定和/或亲和色谱法评估。用于催化功能(例如蛋白水解功能)的本发明抗体的筛选可使用标准测定完成，例如美国专利号5,798,208(以引用的方式整体并入)中所述的血红蛋白空斑测定。确定候选抗体结合治疗性靶标的能力可使用例如BIACORETM仪器在体外分析，该仪器基于表面等离子体共振测量抗体与给定靶标或抗原的结合速率。体内测定可使用许多动物模型中的任一个来进行，然后视情况而定在人中测试。还预期基于细胞的生物测定。
如上所提及，本发明方法不需要异源二聚化基序的设计或工程改造，以便获得所需MAI的有意义的量和纯度。然而，本发明方法可适于包括所述基序。异源二聚对或包含所述异源二聚对的所公开的多特异性抗体类似物之间的相互作用可通过以下在异源二聚对界面处得以促进：在所述界面处形成腔中突起互补区；在所述界面处形成非天然存在的二硫键；在所述界面处形成亮氨酸拉链；在所述界面处形成疏水性区；和/或在所述界面处形成亲水性区。“突起”是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建。与突起相同或类似大小的补偿“腔”任选地在第二多肽的界面上通过用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而形成。当适当定位和定尺寸的突起或腔存在于第一或第二多肽的界面处时，仅需要在相邻界面处分别工程改造相应的腔或突起。非天然存在的二硫键通过用游离的含硫醇的残基(如半胱氨酸)取代第一多肽上的天然存在的氨基酸来构建，以使得游离的硫醇与第二多肽上游离的含硫醇残基相互作用以便在第一与第二多肽之间形成二硫键。示例性异源二聚对及根据本发明制造其的方法在本领域中可获得并且公开于例如US 2011/0054151；US 2007/0098712等中。
在某些实施方案中，异源二聚体对包含在本发明多特异性抗体类似物的Fc区内。含有这种异源二聚体对的Fc区被称为“异源二聚Fc区”。
因此，在某些实施方案中，多特异性抗体类似物包含CH2和/或CH3结构域变体，其中：a)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个突起且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的腔；或者CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个腔且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的突起。在某些其他实施方案中，多特异性抗体类似物包含CH2和/或CH3结构域变体，其中：a)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个取代的带负电的氨基酸且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的带正电的氨基酸；或b)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个取代的带正电的氨基酸且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的带负电的取代氨基酸。
关于“天然”抗体(即，经由天然生物抗体合成由天然B细胞在体内生成的那些抗体)中的Fc功能，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，由此赋予一系列重要的称为效应子功能的功能能力。对于IgG Fc区，Fc包含Ig结构域Cγ2和Cγ3及产生Cγ2的N端铰链。IgG类别的Fc受体的一个重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统的细胞组之间的通信(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ravetch等人,2001,Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人中，此蛋白质家族包括FcγRI(CD64)，包括同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、及FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)及FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57-65)。这些受体通常具有介导与Fc的结合的细胞外结构域、跨膜区、及可介导细胞内的一些信号传导事件的细胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞及γδT细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点，通常造成细胞内的信号传导事件及重要的后续免疫应答，如炎症介质的释放、B细胞活化、胞吞、吞噬及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体借此破坏靶细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后导致靶细胞溶解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ghetie等人,2000,Annu RevImmunol 18:739-766；Ravetch等人,2001,Annu Rev Immunol 19:275-290)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后导致靶细胞的吞噬的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。
“天然”抗体的Fc区的具体特征为在N297处出现的保守N-连接的糖基化。此碳水化合物或有时所称的寡糖对抗体发挥关键的结构和功能作用，并且为必须使用哺乳动物表达系统产生抗体的主要原因之一。Fc与FcγR和C1q的有效结合需要此修饰，并且在N297碳水化合物的组成或其消除中的改变影响与这些蛋白质的结合。
在一些实施方案中，本文所公开的本发明多特异性抗体类似物包含Fc变体。Fc变体相对于亲本Fc多肽包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰提供一种或多种优化性质。Fc变体还包含CH2结构域变体、CH3结构域变体、或CH2结构域变体和CH3结构域变体两者。本文中的“修饰”意味着在蛋白质、多肽、抗体、本发明的多特异性抗体类似物或免疫球蛋白的物理、化学或序列性质上的改变。氨基酸修饰可为在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一氨基酸替代亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸。例如，取代Y349T是指变体多肽，在此情况下，是指恒定的重链变体，其中在位置349处的酪氨酸被苏氨酸替代。如本文所用中的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸的加入。如本文所用中的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸的移除。
本文所公开的Fc变体在氨基酸序列方面借助于至少一个氨基酸修饰不同于其亲本。本文所公开的本发明多特异性抗体类似物与亲本相比可具有多于一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约一个至五十个氨基酸修饰，例如约一个至十个氨基酸修饰、约一个至约五个氨基酸修饰等。因此，Fc变体的序列与亲本Fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的变体Fc变体序列与亲本Fc变体序列具有约80％同源性，例如至少约90％同源性、至少约95％同源性、至少约98％同源性、至少约99％同源性等。本文所公开的修饰还包括糖型修饰。修饰可使用分子生物学手段在遗传上制得或可以酶促或化学方式制得。
本文所公开的Fc变体是根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，取代Y349T是指变体多肽，在此情况下，是指恒定的重链变体，其中在位置349处的酪氨酸被苏氨酸替代。同样，Y349T/T394F定义了相对于亲本Fc多肽具有取代Y349T和T394F的Fc变体。WT氨基酸的身份可未特别指明，在此情况下，上述变体被称为349T/394F。注意到提供取代的顺序为任意的，也就是说，例如，349T/394F为与394F/349T相同的Fc变体。除非另作说明，本文论述的恒定区和Fc位置是根据EU索引或EU编号方案进行编号(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda)。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引指的是EU抗体的数量(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA63:78-85)。
在某些实施方案中，本文所公开的Fc变体是基于人IgG序列，且因此，人IgG序列用作其他序列以此比较的“基础”序列，包括但不限于来自其他生物体的序列，例如啮齿动物和灵长类动物序列。免疫球蛋白还可包含来自其他免疫球蛋白类别的序列，如IgA、IgE、IgD、IgM等。可以预期，尽管本文所公开的Fc变体在一种亲本IgG的情形下被工程改造，但变体在另一、第二亲本IgG的情形下也可被工程改造或“转移”到其中。这可通过测定第一与第二IgG之间的“等价”或“相应”残基和取代来完成，通常是基于第一与第二IgG序列之间的序列或结构同源性。为了确定同源性，将本文所述的第一IgG的氨基酸序列与第二IgG的序列直接比较。在使用本领域中已知的一种或多种同源性比对程序(例如，使用保守残基作为中间物种)比对序列(允许必需的插入和缺失以便维持比对(即，避免了通过任意的缺失和插入所致的保守残基的消除))之后，定义了等价于第一免疫球蛋白的一级序列中的具体氨基酸的残基。保守残基的比对可保留100％这种残基。然而，超过75％或低至50％的保守残基的比对也足以定义等价残基。等价残基还可通过测定第一与第二IgG之间的结构同源性来定义，所述IgG的三级结构水平已经确定。在此情况下，等价残基被定义为亲本或前体的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N上的N、CA上的CA、C上的C及O上的O)在比对之后在约0.13nm内的残基。在另一实施方案中，等价残基在比对之后在约0.1nm内。在最佳模型已经定向并定位以得到蛋白质的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后实现比对。不管等价或相应残基如何测定且不管其中产生IgG的亲本IgG的身份，这意味着如本文所公开发现的Fc变体可被工程改造到与Fc变体具有显著的序列或结构同源性的任何第二亲本IgG中。因此，举例来说，如果通过使用如上所述的方法或用于确定等价残基的其他方法产生变体抗体，其中亲本抗体为人IgG1，那么变体抗体可被工程改造到结合不同抗原的另一IgG1亲本抗体中，人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体等。再次如上所述，亲本Fc变体的情形不影响本文所公开的Fc变体转移到其他亲本IgG的能力。
包含如上所述的CH3结构域变体或为CH3结构域变体的Fc变体可在选自由以下组成的组的CH3结构域中的位置处包含至少一个取代：349、351、354、356、357、364、366、368、370、392、394、395、396、397、399、401、405、407、409、411及439，其中编号是根据Kabat中的EU索引。在一个优选实施方案中，CH3结构域变体每重链包含至少一个选自由以下组成的组的CH3结构域取代：349A、349C、349E、349I、349K、349S、349T、349W、351E、351K、354C、356K、357K、364C、364D、364E、364F、364G、364H、364R、364T、364Y、366D、366K、366S、366W、366Y、368A、368E、368K、368S、370C、370D、370E、370G、370R、370S、370V、392D、392E、394F、394S、394W、394Y、395T、395V、396T、397E、397S、397T、399K、401K、405A、405S、407T、407V、409D、409E、411D、411E、411K及439D。这些变体各自可单独或以任何组合形式用于每个重链Fc区。如本领域技术人员应理解，每条重链可包含不同数目的取代。举例来说，构成Fc区的两条重链都可包含单个取代，一条链可包含单个取代且另一条可包含两个取代，两者都可含有两个取代(尽管每条链将含有不同取代)等等。
在一些实施方案中，CH2和/或CH3结构域变体是以组合形式产生，亦即，每重链Fc结构域两个或更多个变体选自以上所列举的组。
可在本发明的多特异性抗体类似物的设计和制备中使用的有利于异源二聚化的其他CH2和/或CH3结构域变体提供于例如以下文献中：Ridgeway等人,1996,ProteinEngineering 9[7]:617-621；美国专利号5,731,168；Xie等人,2005,J Immunol Methods296:95-101；Davis等人,2010,Protein Engineering,Design&Selection 23[4]:195-202；Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem 285[25]:1937-19646；及PCT/US2009/000071(公开为WO 2009/089004)。
可出于改善或减少与Fc受体或Fc配体的结合而优化本文所公开的Fc变体。如本文所用的“Fc受体”或“Fc配体”意指来自任何生物体的分子、优选多肽，所述分子结合至抗体的Fc区以形成Fc-配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγR(如上所述，包括但不限于FcγRIIIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRI及FcRn)、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G及病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族。Fc配体可包括结合Fc的未被发现的分子。
本发明的多特异性抗体类似物可被设计来优化性质，包括但不限于提高或降低对Fc受体的亲和力。如本文所用，与亲本Fc多肽相比“更大的亲和力”或“改善的亲和力”或“提高的亲和力”或“更佳的亲和力”意指当在结合测定中变体与亲本多肽的量基本上相同时Fc变体以比亲本Fc多肽显著更高的缔合平衡常数(KA或Ka)或较低的解离平衡常数(KD或Kd)结合至Fc受体。举例来说，具有改善的Fc受体结合亲和力的Fc变体与亲本Fc多肽相比在Fc受体结合亲和力上可展示约5倍至约1000倍，例如约10倍至约500倍的改善，其中Fc受体结合亲和力是例如通过本文所公开的结合法(包括但不限于Biacore)由本领域技术人员来测定。因此，如本文所用，与亲本Fc多肽相比“降低的亲和力”意指Fc变体以比亲本Fc多肽显著更低的KA或更高的KD结合Fc受体。较大或较小的亲和力也可相对于绝对水平的亲和力来定义。
如本领域普通技术人员应理解，术语“抗体”在本文中以其广泛的意义使用并且具体包括至少单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体片段及其衍生物。抗体为包含一种或多种基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白质。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。“抗体”还指的是免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其衍生物，其具有经由在抗原上存在的表位特异性结合至抗原的能力，抗体可为例如：蛋白质；多肽；肽；激素；细胞因子；趋化因子；生长因子；神经递质；含糖的生物分子；含脂质或脂肪酸的生物分子；或其他生物分子。
抗体(可与“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白分子”互换使用)可为单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等，并且可包括一类在结构上相关的蛋白质，其是由两对多肽链组成：一对轻链(LC)和一对重链(HC)，全部都通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经充分表征。参见，例如Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编著,第2版Raven Press,N.Y.(1989))。
传统的天然抗体结构形式通常包括四聚体。每个四聚体通常包含两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有几个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因此，如本文所用的“同种型”意指由其恒定区的化学和抗原特征所定义的免疫球蛋白的任何类别和亚类。已知的人免疫球蛋白同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。这些抗体类别之间的区别特征是它们的恒定区，但在可变区中也可存在细微差异。
轻链和重链各自由称为可变区和恒定区的两种不同区构成。IgG重链是由四个免疫球蛋白结构域构成，从N端到C端以VH-CH1-CH2-CH3的顺序连接，分别指的是“可变重链结构域”(也称为“重链可变结构域”，通篇可互换使用)、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2和重链恒定结构域3(也称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别指的是可变重链结构域、恒定γ1结构域、恒定γ2结构域和恒定γ3结构域)。IgG轻链是由两个免疫球蛋白结构域构成，从N端到C端以VL-CL的顺序连接，分别指的是“可变轻链结构域”(也称为“轻链可变结构域”，通篇可互换使用)和轻链恒定结构域。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生物化学事件。构成抗体的天然生物形式(包括可变区和恒定区)的结构在本文中被称为“全长抗体”。在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，IgG同种型的全长抗体为四聚体并且由两个相同对的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含VL和CL，且每条重链包含VH、CH1、CH2和CH3。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，IgG抗体可仅由两条重链组成，每条重链包含连接于Fc区的可变结构域。
重链恒定区通常包含三种结构域，即CH1、CH2和CH3，并且CH1与CH2结构域是由绞链区相连。每条轻链通常包含轻链可变结构域(在本文中缩写为“VL”或“VL”)和轻链恒定结构域。VH和VL结构域可进一步再分成高变区域(或高变区，其可在序列和/或结构上定义的环形式上高变)，也称为互补决定区(CDR)，它们散布在更保守的区域中，这些区域称为框架区(FR)。VH和VL通常各自包含三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常，在此区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat(参见，例如Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版,U.S.Department of Health and Human Services,1992)。使用此编号系统，肽的实际线性氨基酸序列对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入可含有较少或额外的氨基酸。举例来说，重链可变结构域可在VH CDR2的残基52之后包括单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)且可在重链FR残基82之后包括插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c)。对于给定的抗体，残基的Kabat编号可通过与“标准”Kabat编号序列在抗体的同源序列区域处的比对而确定。
术语“可变”、“可变结构域”或“可变区”各自可互换地指代免疫球蛋白结构域的部分，这些部分在它们的序列上展现可变性并且参与了决定具体抗体的特异性和结合亲和力(即，“可变结构域”)。可变性不均匀地分布在抗体的可变结构域中；其集中在重链和轻链可变区各自的亚结构域中。这些亚结构域被称作“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高变)部分被称作“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，大体上采用β-折叠构型，由三个高变区相连，由此连接形成环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。在每条链中的高变区通过FRM紧密保持在一起并且与来自另一链的高变区一起促成抗原结合位点的形成(参见Kabat等人Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991，以引用的方式整体并入)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但展现各种效应子功能，例如像抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和补体激活。
术语“框架区”是指存在于更趋异的(即高变的)CDR之间的抗体可变区的技术领域公知的部分。这种框架区通常被称为框架1至4(FRM1、FRM2、FRM3和FRM4)并且提供用于在三维空间中呈递六个CDR(三个来自重链且三个因为轻链)以形成抗原结合表面的支架。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环采用的主链构象。由比较结构研究发现六个抗原结合环中有五个只有有限的可用的构象库。每个规范结构可具有多肽主链的扭转角的特征。抗体之间的相应环因此可具有极类似的三维结构，尽管在环的大部分中有高氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196:901；Chothia等人,Nature,1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol,1996,263:800。此外，在所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在一定关系。特定规范类别的构象是由环长度和驻留在环内以及保守框架内(即环外)的关键位置处的氨基酸残基决定。对特定规范类别的分配因此可基于这些关键氨基酸残基的存在而作出。
术语“规范结构”还可包括关于抗体的线性序列的考量，例如，如由Kabat所编目(Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版,U.S.Department of Health and Human Services,1992)。Kabat编号方案是一种以一致的方式为抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的普遍采用的标准。另外的结构考量也可用于确定抗体的规范结构。举例来说，通过Kabat编号不能充分反映的那些差异可由Chothia等人的编号系统描述和/或通过其他技术，例如结晶学和二维或三维计算建模来揭示。因此，可将给定抗体序列置于规范类别中，这尤其允许鉴别适当的构架序列(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)。在文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号及如Chothia等人所述的结构考量以及其解释抗体结构的规范方面的意义。
如本文所用的“Fc”或“Fc区”意指包含抗体排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的恒定区的多肽。因此，“Fc区”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域；及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域；以及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及介于Cgamma1(Cγ1)与Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。因此且不背离以上所述，“Fc区”还可被定义为包含“CH2结构域或其变体”和“CH3结构域或其变体”。尽管Fc区的范围可变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat中的EU索引进行。Fc可指的是分离中的此区域或在Fc多肽(例如抗体)的情形下的此区域。如本文所用的“Fc多肽”意指包含所有或一部分Fc区的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合物、分离的Fc及Fc片段。
本发明的目标多特异性抗体的可变轻链(VL)和相应的可变重链结构域(VH)包含结合结构域，通篇还与同抗原相互作用的“抗原结合位点”互换提及。因此，本发明的目标多特异性抗体的“第一可变轻链结构域”和“第一可变重链结构域”共同形成“第一抗原结合位点”。类似地，本发明的目标多特异性抗体的“第二可变轻链结构域”和“第二可变重链结构域”共同形成“第二抗原结合位点”。本发明的目标多特异性抗体的“第三可变轻链结构域”和“第三可变重链结构域”共同形成“第三抗原结合位点”，以此类推。
根据本发明使用的抗原结合位点(包括VH、VL和/或包含这些的CDR)可获自或衍生自所述的任何来源，如技术人员应理解。因此，这种抗原结合位点、VH、VL和/或CDR可获自或衍生自：杂交瘤细胞，其表达针对由此识别的靶标的抗体；来自免疫供体的B细胞，其表达针对由此识别的靶标的抗体；已被刺激以表达针对由此识别的靶标的抗体的B细胞；和或对已通过筛选包含多个用于抗原结合抗体(或其抗原结合片段)的多核苷酸或多肽的文库所鉴别的抗体或抗体片段的鉴别。关于用于鉴别和获得根据本发明使用的抗原结合位点的这种文库的设计、制备、展示和实施，参见，例如WO 2009/036379；WO2012009568；WO2010105256；US 8,258,082；US 6,300,064；US 6,696,248；US 6,165,718；US 6,500,644；US 6,291,158；US 6,291,159；US 6,096,551；US 6,368,805；US 6,500,644；等等。
本发明的目标多特异性抗体的抗原结合位点、VH、VL或CDR中的任何一种或多种及其组合可包含来自多种物种的序列。在一些实施方案中，这种抗原结合位点、VH、VL或CDR及其组合可获自非人来源，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼及猴。在一些实施方案中，支架和/或框架区可为来自不同物种的混合物。因而，根据本发明的目标多特异性抗体可包含嵌合抗体和/或人源化抗体。一般说来，“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指其中来自多于一个物种的区已经合并的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠或其他非人物种的一个或多个可变区及来自人的一个或多个恒定区。
“人源化抗体”一般是指以可变结构域框架区交换人抗体中所见的序列的非人抗体。一般在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体是由人来源的多核苷酸编码或与除其CDR内之外的这样一种抗体相同。CDR(其中的一个、一些或所有由起源于非人有机体的核酸所编码)被移植到人抗体可变区的框架中以产生抗体，其特异性是由移植的CDR决定。这种抗体的产生描述于例如WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525，Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536。经常需要所选的受体框架残基“回复突变”为相应的供体残基，由此恢复在初始移植构建体中丢失的亲和力(参见，例如U.S.Pat.No.5,693,762)。人源化抗体最好还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的，且由此通常将包含人Fc区。对非人抗体进行人源化、整形和表面重构的多种技术和方法是本领域中公知的(参见，Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)及其中引用的参考文献)。在某些变型中，使用以下文献中所述的方法降低抗体的免疫原性：Lazar等人,2007,Mol Immunol44:1986-1998及2004年12月3日提交的名称为“Methods of GeneratingVariant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof”的美国序列号11/004,590。
因此，构成本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的任何一个或多个抗原结合位点，或一个或多个VH、VL、CDR或其组合可来源于非人物种和/或由非人抗体或抗体片段的人源化产生。当包括在本文所公开的本发明多特异性类似物中时获自或源自非人物种的这种VH、VL和/或CDR被称为“人源化的”所述区和/或结构域。
本文所公开的本发明的抗体类似物优选包含各自含有绞链区的第一和第二多肽，其中每个绞链区包含至少一个硫醇基，该硫醇基能够参与分子间二硫键以便第一和第二多肽由于二硫键的形成而共价连接。如本领域中所理解，化学修饰可引入这种绞链区内的某些残基中(或上)，由此实现所述硫醇基的引入以便二硫键的形成。或者，硫醇基可由绞链区内存在的半胱氨酸残基提供。所述半胱氨酸可由天然铰链多肽序列提供或可通过诱变引入编码绞链区的核酸中。如本文所用，本发明抗体类似物的“铰链”或“绞链区”可组成或构成如见于例如免疫球蛋白(如IgG、IgM、IgA、IgE等)中的天然或天然的绞链区，而所述铰链或绞链区也可组成或构成其取代的形式。此外，在某些实施方案中，所述铰链或绞链区也可组成或构成如通篇所公开的“接头部分”。在其他实施方案中，铰链或绞链区可构成如上所公开的天然或天然的绞链区及如通篇所公开的接头部分。
在某些实施方案中，本文所公开的本发明抗体类似物包含一个或多个接头或接头部分。这种接头或接头部分可包括肽接头部分或非肽接头部分。术语“接头”和“接头部分”等意指又共价地键结至多肽的二价物质(-L-)，该多肽具有键结至构成本发明的目标多特异性抗体的氨基酸可利用的化合价，所述氨基酸具有键结可利用的化合价。可利用的键结位点可方便地包含氨基酸的侧链(例如，赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸侧链、及其同系物)。在一些实施方案中，在类似物中可利用的键结位点为赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链。在一些实施方案中，在类似物中可利用的键结位点为构成类似物的多肽的N端胺。在一些实施方案中，在类似物中可利用的键结位点为构成类似物的多肽的C端羧基。在一些实施方案中，在类似物中可利用的键结位点为构成类似物的多肽的主链原子(例如，c-α碳原子)。
优选地，接头部分被用于将VH或VL共价地连接到抗体类似物的CH3结构域的C端。接头部分还可用于将第一VH或第一VL分别共价地连接到第二VH或第二VL。接头部分还可用于将第一VH或第一VL分别共价地连接到第二VL或第二VH。接头部分还可用于将单链抗原结合位点(如scFv)的VH共价地连接到所述单链抗原结合位点的VL，反之亦然。接头部分还可用于将所述单链抗原结合位点(如scFv)的VH或VL连接到CH3结构域或其变体的C端。接头部分还可用于将VH连接到CL结构域的N端或CH2的N端。接头部分也可用于将VL连接到CL结构域的N端或CH2结构域的N端。如应理解，前述用法的组合和/或多个前述用法可用于制备本文所公开的任何目标多特异性抗体，以使得多个抗原结合位点可包括在任选具有多重特异性的这种类似物中。因此，目标多特异性抗体可通过以下方式产生：采用一个或多个接头以将一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个VL、VH和/或单链抗原结合位点(如scFv)共价地附着于第一多肽、第二多肽、附着于第一多肽或第二多肽的VH或VL等，以便生成具有二、三、四、五、六、七或八价等和/或两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种特异性等的抗体类似物。
因此，在某些实施方案中，目标多特异性抗体包含第一VL，其经由接头部分共价地附着于类似物的第一重链的CH3结构域或其变体，由此形成第二抗原结合位点。在另一些实施方案中，目标多特异性抗体包含第一VH，其经由接头部分共价地附着于类似物的Fc区的CH3结构域或其变体，由此形成第二抗原结合位点。
在其他实施方案中，目标多特异性抗体包含第三抗原结合位点，其中第三抗原结合位点经由接头部分共价地连接到第一VL或第一VH。在更进一步的实施方案中，第三抗原结合位点包含单链抗原结合位点，所述单链可变区(scFv)，其中scFv包含第二VL，所述第二VL经由接头部分共价地附着于第二VH或其中第二VL经由接头部分共价地附着于第二VH。
在其他实施方案中，本发明的目标多特异性抗体进一步包含另外的结合位点，如第四抗原结合位点、第五抗原结合位点、第六抗原结合位点等，其中所述一个或多个可包含单链抗原结合位点，如scFv，其经由接头部分附着于目标多特异性抗体的其他VL和/或VH。
在某些实施方案中，接头部分包含选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸及谷氨酸的氨基酸。在又一实施方案中，接头部分是由大部分无空间位阻的氨基酸组成，如甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸。在某些实施方案中，接头部分是由选自下组的序列组成：[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:1)；[Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:2)；[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:3)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:4)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:5)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:6)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:7)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ IDNO:8)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:9)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:10)；及其组合；其中n为选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及75。
这种接头可包括：酸性接头、碱性接头、及结构基序、或其组合；聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、或聚(Gly-Ser)；(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:11)、或(Gly)5(SEQ ID NO:12)；(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:13)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:14)、(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:15)、或GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:16)、[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:1)、[Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:2)、[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:3)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:4)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:5)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:6)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ IDNO:7)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:8)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:9)、或[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly]n(SEQ ID NO:10)；[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:17)、[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:18)、[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:19)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:20)、[Gly-Asp]n(SEQ ID NO:21)；[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:22)、[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQID NO:23)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:24)；其中n为选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及75。
在某些实施方案中，采用带电的接头部分。这种带电接头部分可含有相当多的酸性残基(例如，Asp、Glu等)，或可含有相当多的碱性残基(例如，Lys、Arg等)，以使得接头部分分别具有小于7或大于7的pi。如技术人员应理解，且所有其他条件都相同，酸性或碱性残基在给定接头部分中的相对量越大，接头部分的pI将分别越低或越高。这种接头部分可对本文所公开的目标多特异性抗体赋予以下优点，如在特定的pH、如生理pH(例如介于H 7.2与pH 7.6之间，包括端点)或包含这种类似物的药物组合物的pH下所述多肽的改善的溶解性和/或稳定性特征；以及允许如经由接头部分附着的类似物的结构域和/或区的旋转和翻译灵活性的特征的优化。所述特征可有利地被技术人员优化和设计以用于任何给定的多特异性类似物。
举例来说，“酸性接头”为具有以下pI的接头部分：小于7；介于6与7之间，包括端点；介于5与6之间，包括端点；介于4与5之间，包括端点；介于3与4之间，包括端点；介于2与3之间，包括端点；或介于1与2之间，包括端点。类似地，“碱性接头”为具有以下pi的接头部分：大于7；介于7与8之间，包括端点；介于8与9之间，包括端点；介于9与10之间，包括端点；介于10与11之间，包括端点；介于11与12之间，包括端点；或介于12与13之间，包括端点。在某些实施方案中，酸性接头将含有选自由以下组成的组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:17)；[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:18)；[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:19)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:20)；[Gly-Asp]n(SEQ ID NO:21)；[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:22)；[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:23)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:24)；及其组合；其中n为选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及75。在某些实施方案中，碱性接头将含有选自由以下组成的组的序列：[Gly-Lys]n(SEQ ID NO:25)；[Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:26)；[Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:27)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:28)；[Gly-Arg]n(SEQ ID NO:29)；[Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:30)；[Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:31)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:32)；及其组合；其中n为选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及75。
另外，可采用具有某些结构基序或特征(如α螺旋)的接头部分。例如，这种接头部分可含有选自由以下组成的组的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQ ID NO:33)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及75：例如，[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3(SEQ ID NO:34)、[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4(SEQ ID NO:35)或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5(SEQ ID NO:36)，诸如此类。
在更进一步的实施方案中，用于所公开的目标多特异性抗体中的每个接头部分独立地包含：聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)或聚(Gly-Ser)、(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:11)、及(Gly)5(SEQ ID NO:12)、(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:13)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:14)、(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:15)、及GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:16)、Gly与Ala的组合、Gly与Ser的组合、Gly与Glu的组合、Gly与Asp的组合、Gly与Lys的组合、或其组合。
在某些实施方案中，本发明的目标多特异性抗体包含例如CH2结构域变体和/或CH3结构域变体，其中这种变体各自独立地包含至少一个不同的氨基酸取代，以便生成异源二聚结构域对，从而使得本发明的目标多特异性抗体的第一和第二多肽的异源二聚化优先于同源二聚化。
关于本文通篇所用的目标多特异性抗体的结构域或区的“变体”，这样一种变体是指包含所述结构域或区并且由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。亲本多肽序列可为天然存在的或野生型(WT)多肽序列，或可为修饰形式的WT序列。优选地，与亲本多肽、区或结构域相比，变体具有至少一个氨基酸修饰，例如约一个至约十个氨基酸修饰，且优选与亲本相比约一个至约五个氨基酸修饰。本文中的变体多肽序列优选与亲本序列具有至少约80％同源性，且最优选至少约90％同源性、更优选至少约95％同源性。
如本文所用的“亲本多肽”、“亲本多肽序列”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指未被修饰的多肽或多肽序列，其随后被修饰以生成变体多肽或多肽序列。所述亲本多肽可为天然存在的多肽、或天然存在的多肽的变体或工程改造形式。亲本多肽可指的是多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码其的氨基酸序列。
如本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc序列的Fc序列。Fc变体可仅包括Fc区，或可存在于抗体、Fc融合物、分离的Fc、Fc片段或基本上由Fc编码的其他多肽的背景中。Fc变体可指的是Fc多肽本身、包含Fc变体多肽的组合物、或编码其的氨基酸序列。
如本文所用的“Fc多肽变体”或“变体Fc多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc多肽的Fc多肽。如本文所用的“Fc变体抗体”或“抗体Fc变体”意指由于Fc区中的至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体。
如本文所用的“蛋白变体”或“变体蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白的蛋白质。如本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体。如本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG的抗体。如本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。
异源二聚对或包含所述异源二聚对的所公开的目标多特异性抗体之间的相互作用可通过以下在异源二聚对界面处得以促进：在所述界面处形成腔中突起互补区；在所述界面处形成非天然存在的二硫键；在所述界面处形成亮氨酸拉链；在所述界面处形成疏水性区；和/或在所述界面处形成亲水性区。“突起”是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建。与突起相同或类似大小的补偿“腔”任选地在第二多肽的界面上通过用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而形成。当适当定位和定尺寸的突起或腔存在于第一或第二多肽的界面处时，仅需要在相邻界面处分别工程改造相应的腔或突起。非天然存在的二硫键通过用游离的含硫醇的残基(如半胱氨酸)取代第一多肽上的天然存在的氨基酸来构建，以使得游离的硫醇与第二多肽上游离的含硫醇残基相互作用以便在第一与第二多肽之间形成二硫键。示例性异源二聚对及根据本发明制造其的方法在本领域中可获得并且公开于例如US2011/0054151；US 2007/0098712等中。
在某些实施方案中，异源二聚体对包含在本发明目标多特异性抗体的Fc区内。含有这种异源二聚体对的Fc区被称为“异源二聚Fc区”。
因此，在某些实施方案中，目标多特异性抗体包含CH2和/或CH3结构域变体，其中：a)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个突起且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的腔；或者CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个腔且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的突起。在某些其他实施方案中，目标多特异性抗体包含CH2和/或CH3结构域变体，其中：a)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个取代的带负电的氨基酸且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的带正电的氨基酸；或b)CH2结构域变体和CH3结构域变体各自独立地在第一多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个取代的带正电的氨基酸且在第二多肽的CH2结构域或CH3结构域中包含至少一个相应的带负电的取代氨基酸。
关于“天然”抗体(即，经由天然生物抗体合成由天然B细胞在体内生成的那些抗体)中的Fc功能，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，由此赋予一系列重要的称为效应子功能的功能能力。对于IgG Fc区，Fc包含Ig结构域Cγ2和Cγ3及产生Cγ2的N端铰链。IgG类别的Fc受体的一个重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统的细胞组之间的通信(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ravetch等人,2001,Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人中，此蛋白质家族包括FcγRI(CD64)，包括同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、及FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)及FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57-65)。这些受体通常具有介导与Fc的结合的细胞外结构域、跨膜区、及可介导细胞内的一些信号传导事件的细胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞及γδT细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点，通常造成细胞内的信号传导事件及重要的后续免疫应答，如炎症介质的释放、B细胞活化、胞吞、吞噬及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体借此破坏靶细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后导致靶细胞溶解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ghetie等人,2000,Annu RevImmunol 18:739-766；Ravetch等人,2001,Annu Rev Immunol 19:275-290)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后导致靶细胞的吞噬的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。
不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和力，其中IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4基本上更好地结合至受体(Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57-65)。FcγR以不同亲和力结合IgG Fc区。FcγRIIIa和FcγRIIIb的胞外结构域为96％相同；然而，FcγRIIIb不具有胞内信号传导结构域。此外，FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa为免疫复合物触发的激活的正调节物，特征为具有胞内结构域，该结构域具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；而FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)且因此为抑制性的。因此，前者被称为激活受体，而FcγRIIb被称为抑制性受体。尽管在亲和力和活性上有这些差异，但所有FcγR都结合Fc上的Cγ2结构域和前铰链的N末端处的同一区域。
Fc上的重叠但分开的位点充当补体蛋白C1q的界面。以同Fc/FcγR结合介导ADCC相同的方式，Fc/C1q结合介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc上介于Cγ2与Cγ3结构域之间的位点介导与新生受体FcRn的相互作用，其结合将内吞抗体从核内体再循环回到血流中(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ghetie等人,2000,Annu RevImmunol 18:739-76)。此过程连同由于全长分子的大尺寸所致的肾脏过滤的排除一起造成在1至3周范围内的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合也在抗体转运中发挥关键作用。FcRn在Fc上的结合位点也是细菌蛋白A与G结合的位点。这些蛋白质的紧密结合通常被用作在蛋白质纯化期间通过采用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体的手段。这些区域、补体与FcRn/蛋白A结合区的保真度对于抗体的临床性质及其开发来说很重要。
“天然”抗体的Fc区的特定特征为在N297处出现的保守N-连接的糖基化。这种糖或有时所称的寡糖对抗体发挥关键的结构和功能作用，并且为必须使用哺乳动物表达系统产生抗体的主要原因之一。Fc与FcγR和C1q的有效结合需要此修饰，并且在N297糖的组成或其消除中的改变影响与这些蛋白质的结合。
在一些实施方案中，本文所公开的本发明目标多特异性抗体包含Fc变体。Fc变体相对于亲本Fc多肽包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰提供一种或多种优化性质。Fc变体还包含CH2结构域变体、CH3结构域变体、或CH2结构域变体和CH3结构域变体两者。本文中的“修饰”意味着在蛋白质、多肽、抗体、本发明的目标多特异性抗体或免疫球蛋白的物理、化学或序列性质上的改变。氨基酸修饰可为在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一氨基酸替代亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸。例如，取代Y349T是指变体多肽，在此情况下，是指恒定的重链变体，其中在位置349处的酪氨酸被苏氨酸替代。如本文所用中的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸的加入。如本文所用中的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的一个氨基酸的移除。
本文所公开的Fc变体在氨基酸序列方面借助于至少一个氨基酸修饰不同于其亲本。本文所公开的本发明目标多特异性抗体与亲本相比可具有多于一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约一个至五十个氨基酸修饰，例如约一个至十个氨基酸修饰、约一个至约五个氨基酸修饰等。因此，Fc变体的序列与亲本Fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的变体Fc变体序列与亲本Fc变体序列具有约80％同源性，例如至少约90％同源性、至少约95％同源性、至少约98％同源性、至少约99％同源性等。本文所公开的修饰还包括糖型修饰。修饰可使用分子生物学手段在遗传上制得或可以酶促或化学方式制得。
本文所公开的Fc变体是根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，取代Y349T是指变体多肽，在此情况下，是指恒定的重链变体，其中在位置349处的酪氨酸被苏氨酸替代。同样，Y349T/T394F定义了相对于亲本Fc多肽具有取代Y349T和T394F的Fc变体。WT氨基酸的同一性可未特别指明，在此情况下，上述变体被称为349T/394F。注意到提供取代的顺序为任意的，也就是说，例如，349T/394F为与394F/349T相同的Fc变体。除非另作说明，本文论述的恒定区和Fc位置是根据EU索引或EU编号方案进行编号(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda)。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引指的是EU抗体的数量(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA63:78-85)。
在某些实施方案中，本文所公开的Fc变体是基于人IgG序列，且因此，人IgG序列用作其他序列以此比较的“基础”序列，包括但不限于来自其他生物体的序列，例如啮齿动物和灵长类动物序列。免疫球蛋白还可包含来自其他免疫球蛋白类别的序列，如IgA、IgE、IgGD、IgGM等。可以预期，尽管本文所公开的Fc变体在一种亲本IgG的情形下被工程改造，但变体在另一、第二亲本IgG的情形下也可被工程改造或“转移”到其中。这可通过测定第一与第二IgG之间的“等价”或“相应”残基和取代来完成，通常是基于第一与第二IgG序列之间的序列或结构同源性。为了确定同源性，将本文所述的第一IgG的氨基酸序列与第二IgG的序列直接比较。在使用本领域中已知的一种或多种同源性比对程序(例如，使用保守残基作为中间物种)比对序列(允许必需的插入和缺失以便维持比对(即，避免了通过任意的缺失和插入所致的保守残基的消除))之后，定义了等价于第一免疫球蛋白的一级序列中的具体氨基酸的残基。保守残基的比对可保留100％这种残基。然而，超过75％或低至50％的保守残基的比对也足以定义等价残基。等价残基还可通过测定第一与第二IgG之间的结构同源性来定义，所述IgG的三级结构水平已经确定。在此情况下，等价残基被定义为亲本或前体的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N上的N、CA上的CA、C上的C及O上的O)在比对之后在约0.13nm内的残基。在另一实施方案中，等价残基在比对之后在约0.1nm内。在最佳模型已经定向并定位以得到蛋白质的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后实现比对。不管等价或相应残基如何测定且不管其中产生IgG的亲本IgG的身份，这意味着如本文所公开发现的Fc变体可被工程改造到与Fc变体具有显著的序列或结构同源性的任何第二亲本IgG中。因此，举例来说，如果通过使用如上所述的方法或用于确定等价残基的其他方法产生变体抗体，其中亲本抗体为人IgG1，那么变体抗体可被工程改造到结合不同抗原的另一IgG1亲本抗体中，人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体等。再次如上所述，亲本Fc变体的情形不影响本文所公开的Fc变体转移到其他亲本IgG的能力。
包含如上所述的CH3结构域变体或为CH3结构域变体的Fc变体可在选自由以下组成的组的CH3结构域中的位置处包含至少一个取代：349、351、354、356、357、364、366、368、370、392、394、395、396、397、399、401、405、407、409、411及439，其中编号是根据Kabat中的EU索引。在一个优选实施方案中，CH3结构域变体每重链包含至少一个选自由以下组成的组的CH3结构域取代：349A、349C、349E、349I、349K、349S、349T、349W、351E、351K、354C、356K、357K、364C、364D、364E、364F、364G、364H、364R、364T、364Y、366D、366K、366S、366W、366Y、368A、368E、368K、368S、370C、370D、370E、370G、370R、370S、370V、392D、392E、394F、394S、394W、394Y、395T、395V、396T、397E、397S、397T、399K、401K、405A、405S、407T、407V、409D、409E、411D、411E、411K及439D。这些变体各自可单独或以任何组合形式用于每个重链Fc区。如本领域技术人员应理解，每条重链可包含不同数目的取代。举例来说，构成Fc区的两条重链都可包含单个取代，一条链可包含单个取代且另一条可包含两个取代，两者都可含有两个取代(尽管每条链将含有不同取代)等等。
在一些实施方案中，CH2和/或CH3结构域变体是以组合形式产生，亦即，每重链Fc结构域两个或更多个变体选自以上所列举的组。
可在本发明的目标多特异性抗体的设计和制备中使用的有利于异源二聚化的其他CH2和/或CH3结构域变体提供于例如以下文献中：Ridgeway等人,1996,ProteinEngineering 9[7]:617-621；U.S.Pat.No.5,731,168；Xie等人,2005,J Immunol Methods296:95-101；Davis等人,2010,Protein Engineering,Design&Selection 23[4]:195-202；Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem 285[25]:1937-19646；及PCT/US2009/000071(公开为WO 2009/089004)。
可出于改善或减少与Fc受体或Fc配体的结合而优化本文所公开的Fc变体。如本文所用的“Fc受体”或“Fc配体”意指来自任何生物体的分子、优选多肽，所述分子结合至抗体的Fc区以形成Fc-配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγR(如上所述，包括但不限于FcγRIIIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRI及FcRn)、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G及病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族。Fc配体可包括结合Fc的未被发现的分子。
本发明的目标多特异性抗体可被设计来优化性质，包括但不限于提高或降低对Fc受体的亲和力。如本文所用，与亲本Fc多肽相比“更大的亲和力”或“改善的亲和力”或“提高的亲和力”或“更佳的亲和力”意指当在结合测定中变体与亲本多肽的量基本上相同时Fc变体以比亲本Fc多肽显著更高的结合平衡常数(KA或Ka)或较低的解离平衡常数(KD或Kd)结合至Fc受体。举例来说，具有改善的Fc受体结合亲和力的Fc变体与亲本Fc多肽相比在Fc受体结合亲和力上可展示约5倍至约1000倍，例如约10倍至约500倍的改善，其中Fc受体结合亲和力是例如通过本文所公开的结合法(包括但不限于Biacore)由本领域技术人员来测定。因此，如本文所用，与亲本Fc多肽相比“降低的亲和力”意指Fc变体以比亲本Fc多肽显著更低的KA或更高的KD结合Fc受体。较大或较小的亲和力也可相对于绝对水平的亲和力来定义。
在一个实施方案中，本发明尤其有用的Fc修饰为减少或除去与一种或多种FcγR和/或补体蛋白的结合的变体，由此降低或消除Fc介导的效应子功能，如ADCC、ADCP及CDC。这种变体在本文中也被称为“敲除变体”或“KO变体”。减少与FcγR和补体的结合的变体适用于减小由Fc区介导的不希望有的相互作用并且适用于调整本发明的目标多特异性抗体的选择性。优选的敲除变体描述于2007年10月31日提交且名称为“Fc Variants withOptimized Properties”的美国序列号11/981,606中。优选修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325及328处的取代、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。优选取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中编号是根据EU索引。优选变体包含236R/328R。变体可在任何IgG同种型或IgG同种型Fc区的情形下使用，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4及其组合。用于减少FcγR和补体结合并降低Fc介导的效应子功能的优选IgG Fc区为IgG2和IgG4Fc区。杂合同种型也可适用，例如如US 2006-0134105中所述的杂合IgG1/IgG2同种型。用于减小FcγR与补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V，以及通过突变或酶促手段或通过在不糖基化蛋白质的生物体如细菌中的产生除去位置297处的糖基化。这些及其他修饰综述于Strohl,2009,CurrentOpinion in Biotechnology 20:685-691中。
改善与FcγR和/或补体的结合的Fc修饰也适于并入本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的设计和制备中。这种Fc变体可增强Fc介导的效应子功能，如ADCC、ADCP和/或CDC。改善FcγR和补体结合的优选修饰描述于例如US 8,188,231和US 2006-0235208中。优选修饰包含在选自由以下组成的组的位置处的取代：236、239、268、324及332，其中编号是根据EU索引。优选取代包括但不限于236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。优选变体包括但不限于239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于以下取代：298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。这些及其他修饰综述于Strohl,2009,同上中。
在一个实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可合并有提高对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。这种变体可提供具有与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)有关的免疫调节活性的本发明的目标多特异性抗体。在一个实施方案中，相对于一种或多种激活受体，Fc变体提供针对FcγRIIb选择性提高的亲和力。改变与FcγRIIb的结合的修饰描述于2008年5月30日提交且名称为“Methods and Compositions forInhibiting CD32b Expressing Cells”的U.S.8,063,187中。具体说来，改善与FcγRIIb的结合的Fc变体可包括一个或多个在选自由以下组成的组的位置处的修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332，根据EU索引。提高FcγRIIb亲和力的优选取代包括但不限于234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。更优选地。取代包括但不限于235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。增加与FcγRIIb的结合的优选Fc变体包括但不限于235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。
在一些实施方案中，本文所公开的本发明目标多特异性抗体可合并有改善FcRn结合的Fc变体。这种变体可增强本发明目标多特异性抗体的体内药代动力学性质。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的优选变体包括但不限于在位置259、308、428及434处的取代，包括但不限于例如2591、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y、434M、428L/434S、2591/308F和2591/308F/428L(以及其他描述于2008年12月22日提交且名称为“FcVariants with Altered Binding to FcRn”的美国序列号12/341,769中的取代)。增加Fc与FcRn的结合的其他变体包括但不限于：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall’Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180，Dall’Acqua等人,2006,Journalof Biological Chemistry 281:23514-23524)。调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人,2010,J Immunol,182:7663-7671中。
本文所公开的本发明目标多特异性抗体可将Fc修饰并入任何IgG同种型或IgG同种型Fc区(包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4)的背景中。IgG同种型可被选出以改变FcγR和/或补体介导的效应子功能。杂合IgG同种型可同样适用。例如，美国专利公布号2006-0134105描述了可应用于特定发明中的许多杂合IgG1/IgG2恒定区。在本发明的一些实施方案中，本发明的目标多特异性抗体可包含用于同种型修饰的手段，即亲本IgG中修饰为替代IgG中的氨基酸类型。例如，IgG1/IgG3杂合变体可通过取代手段，用来自在两种同种型不同的位置处的IgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构建。因此，可构建包含一个或多个以下取代手段的杂合变体IgG抗体：例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F。在本发明的其他实施方案中，IgG1/IgG2杂合变体可通过取代手段，用来自在两种同种型不同的位置处的IgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构建。因此，可构建包含一个或多个取代手段的杂合变体IgG抗体，例如，一个或多个以下氨基酸取代：233E、234L、235L、-236G(指的是在位置236处甘氨酸的插入)及327A。
所有的抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物。每个抗体同种型具有不同种类的N-连接的碳水化合物结构。除了附着于重链的碳水化合物以外，高达30％的人IgG具有糖基化Fab区。IgG在CH2结构域的Asn297处具有单一的N-连接双触角碳水化合物。对于来自血清或在杂交瘤或工程改造的细胞中离体产生的IgG，IgG相对于Asn297连接的碳水化合物为异质的。对于人IgG，核心寡糖通常由GlcNAc2Man3GlcNAc与不同数量的外部残基组成。
本文中的本发明的目标多特异性抗体还可包含碳水化合物部分，这些部分将参考用于说明寡糖的通常使用的命名来描述。使用此命名的碳水化合物化学的综述见于Hubbard等人1981,Ann.Rev.Biochem.50:555-583中。此命名包括例如，Man，代表甘露糖；GlcNAc，代表2-N-乙酰氨基葡萄糖；Gal，代表半乳糖；Fuc，代表岩藻糖；以及Glc，代表葡萄糖。唾液酸以如下简化符号来描述，NeuNAc表示5-N-乙酰神经氨酸且NeuNGc表示5-乙醇酰神经氨酸。
术语“糖基化”意指寡糖(含有两个或更多个连接在一起的单糖的碳水化合物，例如2个至约12个连接在一起的单糖)连接到糖蛋白上。寡糖侧链通常经由N或O键连接到糖蛋白的主链。本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的寡糖一般附着于Fc区的CH2结构域上作为N-连接的寡糖。“N-连接的糖基化”是指在糖蛋白链中碳水化合物部分与天冬酰胺残基的连接。熟练技术人员将认识到，例如，鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD CH2结构域各自具有供残基297处的N-连接的糖基化的单个位点。
为了本文的目的，“成熟核心碳水化合物结构”是指附着于Fc区上的加工过的核心碳水化合物结构，其一般是由双触角寡糖所典型的以下碳水化合物结构GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2组成。成熟核心碳水化合物结构附着于糖蛋白的Fc区，一般经由N-键附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。“等分GlcNAc”为附着于成熟核心碳水化合物结构的α1,4甘露糖上的GlcNAc残基。等分GlcNAc可通过α(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III酶(GnTIII)被酶促附着于成熟核心碳水化合物结构上。CHO细胞通常不表达GnTIII(Stanley等人,1984,J.Biol.Chem.261:13370-13378)，但可被工程改造以实现表达(Umana等人,1999,Nature Biotech.17:176-180)。
本文描述了包含修饰的糖型或工程改造的糖型的目标多特异性抗体。如本文所用的“修饰的糖型”或“工程改造的糖型”意指共价附着于蛋白质(例如抗体)上的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学上不同于亲本蛋白质。工程改造的糖型可适用于多种目的，包括但不限于增强或减弱FcγR介导的效应子功能。在一个实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体被修饰以控制共价地附着于Fc区上的岩藻糖化和/或等分寡糖的水平。
用于产生修饰的糖型的多种方法在本领域中是公知的(Umana等人,1999,NatBiotechnol 17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473；美国序列号12/434,533)。这些技术通过以下手段控制共价附着于Fc区上的岩藻糖化和/或等分寡糖的水平：例如通过在各种生物体或工程改造的或另外的细胞系(例如，Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG，通过调节糖基化途径中所涉及的酶(例如，FUT8[α-1,6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III[GnTIII])，通过在已经表达IgG之后修饰一种或多种碳水化合物，或通过在作为酶促抑制剂的岩藻糖类似物存在下表达抗体。用于修饰本文所公开的本发明目标多特异性抗体的糖型的其他方法包括使用以下糖工程改造的菌株：酵母(Li等人,2006,Nature Biotechnology 24(2):210-215)、苔藓(Nechansky等人,2007,Mol Immunol 44(7):1826-8)及植物(Cox等人,2006,NatBiotechnol 24(12):1591-7)。产生修饰的糖型的具体方法的使用不意图将实施方案限于那种方法。更确切地说，本文所公开的实施方案包括具有修饰的糖型的本发明目标多特异性抗体，不管它们是如何产生的。
在一个实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体被糖工程改造以改变唾液酸化的水平。在免疫球蛋白G分子中较高水平的唾液酸化Fc聚糖可不利地影响官能团(Scallon等人,2007,Mol.Immunol.44(7):1524-34)，并且Fc唾液酸化水平的差异可导致改变的抗炎活性(Kaneko等人,2006,Science 313:670-673)。因为抗体在Fc核心多糖的唾液酸化之后可获得抗炎性质，所以为了实现更多或更少的Fc唾液酸含量对本文所公开的本发明目标多特异性抗体进行糖工程改造可为有利的。
“工程改造的糖型”通常是指不同的碳水化合物或寡糖；因此，例如，免疫球蛋白可包含工程改造的糖型。在一个实施方案中，本文所公开的组合物包含具有Fc区的糖基化的本发明目标多特异性抗体，其中组合物中约51-100％的糖基化抗体，例如80-100％、90-100％、95-100％等的抗体包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。在另一实施方案中，组合物中的抗体包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构并且在Fc区中另外包含至少一个氨基酸修饰。在一个替代实施方案，组合物包含具有Fc区的糖基化的本发明目标多特异性抗体，其中组合物中约51-100％的糖基化抗体、80-100％或90-100％的抗体包含缺乏唾液酸的成熟核心碳水化合物结构。在另一实施方案中，组合物中的抗体包含缺乏唾液酸的成熟核心碳水化合物结构并且在Fc区中另外包含至少一个氨基酸修饰。在又一实施方案中，组合物包含具有Fc区的糖基化的本发明目标多特异性抗体，其中组合物中约51-100％的糖基化抗体、80-100％或90-100％的抗体包含含有唾液酸的成熟核心碳水化合物结构。在另一实施方案中，组合物中的抗体包含含有唾液酸的成熟核心碳水化合物结构并且在Fc区中另外包含至少一个氨基酸修饰。在另一实施方案中，工程改造的糖型与氨基酸修饰的组合提供Fc受体与抗体的最佳结合性质。
本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可包含一个或多个提供额外的优化性质的修饰。所述修饰可为氨基酸修饰或可为以酶促或化学方式制造的修饰。这种修饰可能在本发明的目标多特异性抗体中提供一定改进，例如对其稳定性、溶解性、功能或临床使用的提高。本文公开了可通过将本文所公开的本发明的目标多特异性抗体与另外的修饰结合所得到的多种改进。
在一个实施方案中，本文所公开的目标多特异性抗体的至少一个可变区可为亲和力成熟的，也就是说，氨基酸修饰已在VH和/或VL结构域中进行以增强抗体与其靶抗原的结合。这种类型的修饰可改善与靶抗原结合的缔合和/或解离动力学。其他修饰包括对比替代靶标改善对靶抗原的选择性的那些。这些包括对比非靶细胞改善对在靶标上表达的抗原的选择性的修饰。本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可包含一个或多个修饰，这些修饰提供本发明的目标多特异性抗体的减少或增加的内化。
在其他实施方案中，进行修饰以改善本文所公开的本发明目标多特异性抗体的生物物理性质，包括但不限于稳定性、溶解性及寡聚状态。修饰可包括例如在本发明的目标多特异性抗体中提供更有利的分子内相互作用以得到更大稳定性的取代，或用极性氨基酸对暴露的非极性氨基酸的取代以得到更高的溶解性。本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的其他修饰包括使得能特异性形成同源二聚或同源多聚分子的那些修饰。这种修饰包括但不限于工程改造的二硫化物以及化学修饰或聚集方法。
在其他实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体包含除去蛋白水解降解位点的修饰。这些可包括例如降低生产产量的蛋白酶位点以及在体内降解所施用的蛋白质的蛋白酶位点。在一个实施方案中，进行另外的修饰以除去共价降解位点，如脱酰胺基(即，谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱酰胺基为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基)、氧化和蛋白水解的降解位点。特别适于去除的脱酰胺基位点是具有脱酰胺基增加倾向的那些位点，包括但不限于后接有甘氨酸的天冬酰胺酰基和谷氨酰基残基(分别为NG和QG基序)。在此情况下，任一残基的取代都可显著降低脱酰胺基的倾向。常见的氧化位点包括甲硫氨酸和半胱氨酸残基。可引入或除去的其他共价修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的“-氨基的甲基化；N端胺的乙酰化；以及任何C端羧基的酰胺化。另外的修饰还可包括但不限于翻译后修饰，如N-连接或O-连接的糖基化和磷酸化。
修饰可包括改善来自通常用于生产生物制品的宿主或宿主细胞的表达和/或纯化产量的那些修饰。这些包括但不限于各种哺乳动物细胞系(例如CHO、HEK、COS、NIH LT3、Saos等)、酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。另外的修饰包括消除或降低重链形成链间二硫键的能力的修饰。另外的修饰包括消除或降低重链形成链内二硫键的能力的修饰。
本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可包含包括使用非天然氨基酸的修饰，所述非天然氨基酸是使用包括但不限于Liu&Schultz,2010,Annu Rev Biochem 79:413-444中所述的方法并入。在一些实施方案中，这些修饰使得能够操纵以上论述的各种功能、生物物理学、免疫或制造性能。在另一些实施方案中，这些修饰使得能够实现出于其他目的的另外的化学修饰。
本文也预期了其他修饰。例如，本发明的目标多特异性抗体可连接到以下多种非蛋白质聚合物中的一种上，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。可进行另外的氨基酸修饰以使得实现本发明的目标多特异性抗体的特异性或非特异性化学或翻译后修饰。这种修饰包括但不限于聚乙二醇化和糖基化。可利用以实现聚乙二醇化的特定取代包括但不限于引入新型半胱氨酸残基或非天然氨基酸以使得有效和特定的偶联化学反应可用于连接PEG或另外的聚合部分。特定的糖基化位点的引入可通过将新型N-X-T/S序列引入本文所公开的本发明的目标多特异性抗体中而实现。
降低免疫原性的修饰可包括减少衍生自亲本序列的加工过的肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如，氨基酸修饰将被工程改造以使得不存在或存在最少数量的免疫表位，这些免疫表位据预测以高亲和力结合任何普遍的MHC等位基因。鉴别蛋白质序列中的MHC结合表位的若干方法是本领域中已知的并且可用于对本文所公开的抗体中的表位进行评分。
共价修饰包括在本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的范围内，且一般但不总是在翻译后进行。例如，几种类型的共价修饰可通过使特定的氨基酸残基与能够与选定的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应而引入分子中。在一些实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的共价修饰包括添加一个或多个标记。术语“标记基团”意指任何可检测的标记。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联到本发明的目标多特异性抗体上以降低潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可用于产生本文所公开的本发明的目标多特异性抗体。
在某些实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体包含“融合蛋白”，在本文中也被称为“缀合物”。融合配偶体或缀合配偶体可为蛋白质或非蛋白质的；后者一般使用本发明的目标多特异性抗体和缀合配偶体上的官能团产生。缀合及融合配偶体可为任何分子，包括小分子化合物和多肽。例如，多种缀合物及方法描述于Trail等人,1999,Curr.Opin.Immunol.11:584-588中。可能的缀合配偶体包括但不限于细胞因子、细胞毒性剂、毒素、放射性同位素、化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂及其他治疗活性剂。在一些实施方案中，缀合配偶体更多地可被视为有效负载，也就是说，缀合物的目标为将缀合配偶体通过目标多特异性抗体靶向递送至靶细胞，例如癌细胞或免疫细胞。因此，举例来说，毒素与目标多特异性抗体的缀合靶向将所述毒素递送至表达靶抗原的细胞。如本领域技术人员将理解，融合物与缀合物的概念和定义实际上是重叠的。融合物或缀合物的命名不意图将其限于本文所公开的任何具体的实施方案。相反，这些术语用于传达广泛的概念：本文所公开的任何目标多特异性抗体可在遗传上、化学上或以其他方式与一种或多种多肽或分子连接以提供一些合乎要求的性质。
合适的缀合物包括但不限于如下所述的标记、药物和细胞毒性剂，包括但不限于细胞毒性药物(例如，化疗剂)或毒素或这种毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒A链、相思豆毒素A链、麻疯树毒素、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等等。细胞毒性剂还包括通过将放射性同位素缀合到本发明的目标多特异性抗体上或将放射性核素与已经共价附着于本发明的目标多特异性抗体上的螯合剂结合制得的放射化学试剂。另外的实施方案利用加利车霉素、奥瑞斯他汀、格尔德霉素、美登素和倍癌霉素及类似物。抗体-药物缀合物描述于Alley等人,2010,Curr Opin Chem Biol 14[4]:529-37中。
在某些实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体被融合或缀合至细胞因子。如本文所用的“细胞因子”意指由一个细胞群所释放并作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通用术语。例如，如Penichet等人,2001,J.Immunol.Methods 248:91-101中所述，细胞因子可融合至本发明的目标多特异性抗体以提供一系列所需的性质。这种细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子及传统的多肽激素。其中包括的细胞因子为生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；C5a；及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
在其他实施方案中，本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可缀合至“受体”(如链霉亲和素)以便于在肿瘤预靶向中的利用，其中向患者施用类似物-受体缀合物，接着使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用缀合至细胞毒性剂(例如，放射性核素)的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。在一个替代实施方案中，本发明的目标多特异性抗体缀合或可操作地连接至酶以便采用抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。ADEPT可通过将本发明的目标多特异性抗体与转化前药(例如，肽基化疗剂)的前药活化酶缀合或可操作地连接来使用。
本文还公开了用于产生和在实验上测试本发明的目标多特异性抗体的方法。所公开的方法不意图将实施方案限于任何特定的应用或操作理论。相反，所提供的方法意在一般说明本发明的一种或多种目标多特异性抗体可产生并在实验上测试以获得本发明的目标多特异性抗体。用于抗体分子生物学、表达、纯化及筛选的一般方法描述于AntibodyEngineering,Kontermann&Dubel编著,Springer,Heidelberg,2001；及Hayhurst&Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol 5:683-689；Maynard&Georgiou,2000,Annu RevBiomed Eng 2:339-76中。
在本文所公开的一个实施方案中，生成编码本发明的目标多特异性抗体的核酸，并且如果需要的话，可随后将其克隆到宿主细胞(如酵母细胞或哺乳动物细胞)中，表达并测定。因此，可制造编码每个蛋白质序列的核酸且尤其是DNA。使用公知的操作进行这些实践。例如，可应用于产生本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的多种方法描述于Molecular Cloning—A Laboratory Manual,第3版(Maniatis,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,2001)及Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)中。存在可用于有效地产生编码本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的DNA的多种技术。这种方法包括但不限于基因组装方法、基于PCR的方法和使用PCR的变型的方法、基于连接酶链反应的方法、合并寡聚物法(如用于合成改组的那些方法)、易错扩增法和使用具有随机突变的寡聚物的方法、典型的定点诱变法、盒诱变及其他扩增和基因合成法。如本领域中已知，存在用于基因组装、诱变、载体亚克隆等的多种可商购获得的试剂盒和方法，且这种商业产品应用于产生编码本发明的目标多特异性抗体的核酸。
本文所公开的本发明的目标多特异性抗体可通过在诱导或造成多肽表达的适当条件下培养用以下核酸转化的宿主细胞而产生，例如，含有编码本发明的目标多特异性抗体的第一和第二多肽的核酸的表达载体。适于表达的条件将随表达载体和宿主细胞的选择而变化并且将容易由本领域技术人员通过常规实验弄清。可使用广泛多种适当的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母细胞及植物细胞。例如，可应用于产生本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的多种细胞系描述于可从美国典型培养物保藏中心处获得的
Figure BDA0001498648680001011
细胞系目录中。
在某些实施方案中，本发明的目标多特异性抗体在哺乳动物表达系统中表达，包括其中使用病毒如逆转录病毒或腺病毒将表达构建体引入哺乳动物细胞中的系统。可使用任何哺乳动物细胞，例如人、小鼠、大鼠、仓鼠及灵长类动物细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3、CHO、BHK、COS、HEK293、PER C.6、HeLa、Sp2/0、NS0细胞及其变体。在一个替代实施方案中，文库蛋白质在细菌细胞中表达。细菌表达系统在本领域中是公知的，并且包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酪链球菌(Streptococcus cremoris)及浅青紫链球菌(Streptococcuslividans)。在替代实施方案中，本发明的目标多特异性抗体在昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，粉纹夜蛾Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如酿酒酵母、毕赤氏酵母等)中产生。在一个替代实施方案中，使用无细胞翻译系统在体外表达本发明的目标多特异性抗体。来源于原核(例如大肠杆菌)和真核(例如小麦胚芽、兔网织红细胞)细胞的体外翻译系统是可获得的并且可基于目标蛋白质的表达水平和功能性质进行选择。例如，如本领域技术人员所理解，一些展示技术(例如核糖体展示)需要体外翻译。另外，本发明的目标多特异性抗体可通过化学合成方法产生。转基因表达系统还来自动物(例如，母牛、绵羊或山羊乳、含胚鸡蛋、整个昆虫幼虫等)和植物(例如，玉米、烟草、浮萍等)
编码本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的第一和第二多肽的核酸可视情况而定并入一种或多种表达载体中，以便表达所编码的多肽。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包含自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。表达载体被构建成与宿主细胞类型相容。因此，应用于产生本文所公开的本发明的目标多特异性抗体的表达载体包括但不限于能使蛋白质在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母细胞及体外系统中表达的那些载体。如本领域中已知，多种表达载体可从商业途径或其他方式获得，其可用于表达本文所公开的本发明的目标多特异性抗体。
表达载体通常包含有待表达的蛋白质或多肽，其可操作地与控制或调节序列、可选择的标记物、任何融合配偶体和/或另外的元件连接。在本文中“可操作地连接”意指将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中。一般说来，这些表达载体包括转录及翻译调控核酸，其与编码本发明的目标多特异性抗体的核酸可操作地连接且通常适合用于表达蛋白质的宿主细胞。转录及翻译调控序列一般可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或活化子序列。还如本领域中已知的，表达载体通常含有选择基因或标记物以允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域中公知的且将随所用的宿主细胞而变化。
本发明的第一和第二多肽可各自独立地与融合配偶体可操作地连接以实现所表达的多肽和/或目标多特异性抗体的靶向、纯化、筛选、展示等。融合配偶体可经由接头序列与本发明的目标多特异性抗体序列连接。接头序列一般将包含少量氨基酸，通常小于十个，但也可使用更长的接头。通常，选择有柔性和抗降解性的接头序列。如本领域技术人员将理解，广泛多种序列中的任一种可用作接头。例如，常见的接头序列包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:37)。融合配偶体可为将本发明的目标多特异性抗体及任何相关融合配偶体引导至所需细胞位置或细胞外培养基处的靶序列或信号序列。如本领域中已知，某些信号传导序列可将待分泌至生长培养基或壁膜间隙中的蛋白质靶向细胞的内膜与外膜之间。融合配偶体还可为编码使得能够纯化和/或筛选的肽或蛋白质的序列。这种融合配偶体包括但不限于多组氨酸标签(His-tag)(例如，H6(SEQ ID NO:38)和H10(SEQ ID NO:39)或其他标签供固定金属亲和色谱法(IMAC)系统(例如Ni+2亲和柱)使用)、GST融合物、MBP融合物、Strep-标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列、以及抗体所靶向的表位标签(例如，c-myc标签、flag-标签等)。如本领域技术人员将理解，这种标记可适用于纯化、筛选或这两者。举例来说，本发明的目标多特异性抗体可使用His-标签通过将其固定在Ni+2亲和柱上来纯化，然后在纯化之后，相同的His-标签可用于将抗体固定于Ni+2包被过的板上以便进行ELISA或其他结合测定(如下所述)。融合配偶体可使得能够使用选择法来筛选本发明的目标多特异性抗体(参见下文)。使能进行多种选择法的融合配偶体是本领域中公知的。
例如，通过将本发明的目标多特异性抗体文库的成员与基因III蛋白融合，可采用噬菌体展示。融合配偶体可实现对本发明的目标多特异性抗体的标记。或者，融合配偶体可与表达载体上的特定序列结合，使得融合配偶体及相关本发明的目标多特异性抗体能够与编码它们的核酸共价或非共价地连接。将外源性核酸引入宿主细胞中的方法在本领域中是公知的，且将随所用宿主细胞而变化。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、多核苷酸在脂质体中的包裹、以及直接显微注射DNA到核中。在哺乳动物细胞的情况下，转染可为瞬时的或稳定的。
额外的非限制性示例性实施方案如下：
实施方案1.一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，所述异源二聚体包含含有第一重链(HC)可变区的第一重链多肽和含有第二HC可变区的第二重链多肽，其中所述第一和第二可变区具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：
i)获得包含MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类的组合物，所述第一亲代同源二聚抗体种类包含第一重链多肽的至少一个拷贝或第一重链多肽的至少两个拷贝，且所述第二亲代同源二聚抗体种类包含第二重链多肽的至少一个拷贝或第二重链多肽的至少两个拷贝；及
ii)执行色谱法，借此从所述第一和第二亲代同源二聚抗体种类中分离MAI；
由此纯化所述MAI。
实施方案2.实施方案1的方法，其中所述执行步骤ii)包括：
使所述组合物与色谱材料接触，由此形成组合物-色谱材料复合物；及
执行洗脱步骤，其中使所述色谱材料-组合物复合物与能够以pH依赖性方式洗脱MAI和亲代同源二聚抗体种类的洗脱液的样品接触。
实施方案3.实施方案2的方法，其中所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，所述至少两种缓冲剂各自具有不同的负对数酸解离常数(pKa)。
实施方案4.根据实施方案2或实施方案3的方法，还包括在执行所述洗脱步骤之前在所需初始pH下在洗脱液的第一样品中制备或平衡：
所述组合物；或
所述组合物-色谱材料复合物。
实施方案5.根据实施方案2至4中任一项的方法，还包括使一定体积在所需终末pH下制备的洗脱液的第二样品流动通过所述色谱材料-组合物复合物。
实施方案6.根据实施方案2至5中任一项的方法，其中当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度。
实施方案7.根据实施方案2至6中任一项的方法，其中当洗脱液流动通过色谱材料-组合物复合物时产生pH梯度，且其中所述pH梯度包含：
(i)在线性pH梯度相之前的分步pH梯度相；
(ii)在线性梯度相之后的分步pH梯度；
(iii)没有分步pH梯度相的线性pH梯度相。至少一个线性pH梯度相；或
(iv)基本上线性的pH梯度相。
实施方案8.根据实施方案2至7中任一项的方法，其中所述MAI、所述第一亲代同源二聚抗体种类及所述第二亲代同源二聚抗体种类是以基本上可区别的洗脱体积从色谱材料中洗脱。
实施方案9.根据实施方案2至8中任一项的方法，其中所述洗脱液包含：
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；
至少六种；
至少七种；或
八种；
以下缓冲剂：N环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸及甲酸；或者
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；或
至少六种；的以下缓冲剂：甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)及羟胺。
实施方案10.根据实施方案2至9中任一项的方法，其中所述洗脱液包含：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸及甲酸；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)及羟胺。
实施方案11.根据实施方案2至10中任一项的方法，其中所述洗脱液包含：
至少两种；
至少三种；
至少四种；
至少五种；
至少六种；
至少七种；或
八种；
以下缓冲剂：N环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸及甲酸；
限制条件为所述洗脱液不包括以下任一者：咪唑；哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
实施方案12.根据实施方案2至11中任一项的方法，其中所述洗脱液基本上由以下组成：
(i)CAPS；CHES；TAPS；HEPPSO；MOPSO；MES；乙酸；和甲酸；及任选至少一种盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
实施方案13.根据实施方案2至12中任一项的方法，其中所述洗脱液是由以下组成：
(i)CAPS；CHES；TAPS；HEPPSO；MOPSO；MES；乙酸；和甲酸；及至少一种盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐及任选至少一种盐。
实施方案14.根据实施方案2至13中任一项的方法，其中所述洗脱液包含至少一种选自由以下组成的组的盐：NaCl、KCl及Na2SO4。
实施方案15.根据实施方案2至14中任一项的方法，其中所述洗脱液的每个样品包含在选自由以下组成的组的浓度范围内的至少一种盐：0mM至约100mM；0mM至约60mM；0mM至约50mM；0mM至约40mM；0mM至约30mM；0mM至约20mM；0mM至约10mM；0mM至约5mM；约10mM至约200mM；约10mM至约100mM；约10mM至约50mM；约10mM至约40mM；约10mM至约30mM；约10mM至约20mM；约20mM至约200mM；约20mM至约100mM；约20mM至约50mM；约20mM至约30mM；约30mM至约200mM；约30mM至约100mM；和约30mM至约50mM；及约5mM至约15mM。
实施方案16.根据实施方案2至15中任一项的方法，其中所述洗脱液的每个样品包含在约10mM的浓度下的至少一种盐。
实施方案17.根据实施方案2至16中任一项的方法，其中所述洗脱液的每个样品包含在约10mM的浓度下的NaCl。
实施方案18.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中：
a.所述第一重链多肽的实际等电点与所述第二重链多肽的实际等电点的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值；
b.所述第一亲代同源二聚种类的实际等电点与所述第二亲代同源二聚种类的实际等电点的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值；
c.所述第一重链多肽的计算等电点与所述第二重链多肽的计算等电点的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值；或
d.所述第一亲代同源二聚种类的计算等电点与所述第二亲代同源二聚种类的计算等电点的差小于7.0个pH单位；小于6.5个pH单位；小于6.0个pH单位；小于5.5个pH单位；小于5.0个pH单位；小于4.5个pH单位；小于4.0个单位；小于3.5个pH单位；小于2.5个pH单位；小于2.4个pH单位；小于2.3个pH单位；小于2.2个pH单位；小于2.1个pH单位；小于2.0个pH单位；小于1.9个pH单位；小于1.8个pH单位；小于1.7个pH单位；小于1.6个pH单位；小于1.5个pH单位；小于1.4个pH单位；小于1.3个pH单位；小于1.2个pH单位；小于1.1个pH单位；小于1.0个pH单位；小于0.95个pH单位；小于0.90个pH单位；小于0.85个pH单位；小于0.80个pH单位；小于0.75个pH单位；小于0.70个pH单位；小于0.65个pH单位；小于0.60个pH单位；小于0.55个pH单位；小于0.50个pH单位；小于0.45个pH单位；小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
实施方案19.根据实施方案4至18中任一项的方法，其中所需初始pH小于9.0；小于8.5；小于8.0；小于7.5；小于7.0；小于6.5；小于6.0；小于5.5；小于5.0；小于4.5；小于4.0；小于3.5；或小于3.0；或介于任何前述值之间的pH值。
实施方案20.根据实施方案5至19中任一项的方法，其中所需终末pH大于7.0；大于7.5；大于8.0；大于8.5；大于9.0；大于9.5；大于10.0；大于10.5；或大于11.0；大于11.5；大于12.0；大于12.5；大于13.0；大于13.5；或介于任何前述值之间的pH值。
实施方案21.根据实施方案2至20中任一项的方法，其中所述洗脱液包含至少两种缓冲剂且其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)在约3与11之间。
实施方案22.根据实施方案2至21中任一项的方法，其中所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)是在选自由以下组成的组的范围内：约3.25至约3.85；约4.5至约4.85；约6.0至约6.45；约6.60至约7.0；约7.5至约8.15；约8.35至约8.55；约9.25至约9.65；以及约10.00至约11.5。
实施方案23.根据实施方案2至22中任一项的方法，其中所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)在选自由以下组成的组的不同范围内：约3.25至约3.85；约4.5至约4.85；约6.0至约6.45；约6.60至约7.0；约7.5至约8.15；约8.35至约8.55；约9.25至约9.65；以及约10.00至约11.5。
实施方案24.根据实施方案2至23中任一项的方法，其中所述洗脱液包含至少两种缓冲剂，其中每种缓冲剂的酸解离常数(pKa)选自由以下组成的组：约3.75；约4.76；约6.10；约6.90；约8.04；约8.44；约9.39；以及约10.50。
实施方案25.根据实施方案1至24中任一项的方法，其中所述MAI还包含含有第一轻链可变区的第三多肽。
实施方案26.根据实施方案1至25中任一项的方法，其中所述MAI还包含第三多肽和第四多肽，其中所述第三多肽和第四多肽各自包含第二轻链可变区。
实施方案27.根据实施方案26的方法，其中所述第一轻链可变区与所述第二轻链可变区是相同的。
实施方案28.根据实施方案26或实施方案27的方法，其中所述第三多肽与所述第四多肽是相同的。
实施方案29.根据实施方案1至28中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含Fc区。
实施方案30.根据实施方案1至29中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含野生型Fc区。
实施方案31.根据实施方案1至30中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含IgG1同种型Fc区、IgG3同种型Fc区、IgG3同种型Fc区或IgG4同种型Fc区。
实施方案32.根据实施方案1至31中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含IgG1同种型Fc区。
实施方案33.根据实施方案1至32中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含未经工程改造以改变所述第一亲代同源二聚抗体种类、所述第二亲代同源二聚种类或所述MAI的pI的Fc区。
实施方案34.根据实施方案1至33中任一项的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含未经工程改造以改变所述第一亲代同源二聚抗体种类、所述第二亲代同源二聚种类或所述MAI的pI的IgG1同种型Fc区。
实施方案35.根据实施方案1至34中任一项的方法，其中：所述MAI呈天然抗体形式；至少第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；至少第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式且第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式；或者所述MAI呈天然抗体形式，第一亲代同源二聚抗体种类呈天然形式且第二亲代同源二聚抗体种类呈天然形式。
实施方案36.根据实施方案1至35中任一项的方法，其中：所述MAI；所述第一亲代同源二聚抗体种类；所述第二亲代同源二聚抗体种类；所述第一亲代同源二聚抗体种类和所述第二亲代同源二聚抗体种类；或者所述MAI、所述第一亲代同源二聚抗体种类和所述第二亲代同源二聚抗体种类；呈IgG1形式、和IgG2形式、和IgG3形式、或IgG4形式、或杂合形式。
实施方案37.根据实施方案1至36中任一项的方法，其中所述色谱法在基本上相同的离子强度下进行。
实施方案38.根据实施方案2至37中任一项的方法，其中所述洗脱液的离子强度在整个洗脱步骤期间保持基本上相同。
实施方案39.根据实施方案4至38中任一项的方法，其中所述洗脱液的所述第一样品和所述洗脱液的所述第二样品各自具有基本上相同的离子强度。
实施方案40.根据实施方案1至39中任一项的方法，其中所述色谱法为离子交换色谱法。
实施方案41.根据实施方案1至40中任一项的方法，其中所述色谱法选自由以下组成的组：阳离子交换色谱法；阴离子交换色谱法；多模态色谱法；及混合模式色谱法。
实施方案42.根据实施方案1至41中任一项的方法，其中所述色谱法还包括使用选自由以下组成的组的色谱材料：Mustang S、Sartobind S、S03Monolith、S CeramicHyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、HS20、SPSFF、Porors GoPure HS、PorosGoPure XS、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto Q ImpRes、CaptoSP ImpRes、Capto S、Capto MMC、Fractogel Se HiCap、Fractogel S03、Fractogel COO、Poros HQ 50、Poros PI 50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、UNOshere S、Macro-Prep High S、DEAE、Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、Mono S 10/100GL、SP Sepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、及Source30Q。
实施方案43.根据实施方案1至42中任一项的方法，其中所述色谱法还包括使用选自由以下组成的组的色谱材料：Mono S、Mono S5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、SPSepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、和Source 30Q、及Mono S 10/100GL。
实施方案44.根据实施方案2至43中任一项的方法，其中所述色谱材料为离子交换色谱材料。
实施方案45.根据实施方案2至44中任一项的方法，其中所述色谱材料选自由以下组成的组：阳离子交换色谱材料；阴离子交换色谱材料；多模态色谱材料；及混合模式色谱材料。
实施方案46.根据实施方案2至45中任一项的方法，其中所述离子交换色谱材料选自由以下组成的组：Mustang S、Sartobind S、S03Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、HS20、SPSFF、Porors GoPure HS、Poros GoPure XS、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto Q ImpRes、Capto SP ImpRes、Capto S、Capto MMC、Fractogel Se HiCap、Fractogel S03、Fractogel COO、Poros HQ 50、Poros PI 50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、UNOshere S、Macro-Prep High S、DEAE、Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、Mono S 10/100GL、SP Sepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、及Source 30Q；或
选自由以下组成的组：Mono S、Mono S 5/50GL、Mono Q、Mono Q 5/50GL、SPSepharose HP、Source 30S、Poros XQ、Poros HQ、Q HP、和Source 30Q、及Mono S 10/100GL。
实施方案47.根据实施方案1至46中任一项的方法，其中所述第一重链可变区或所述第二重链可变区是通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
实施方案48.根据实施方案1至47中任一项的方法，其中所述第一重链可变区和第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得。
实施方案49.根据实施方案1至48中任一项的方法，其中所述第一重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得且所述第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
实施方案50.根据实施方案1至49中任一项的方法，其中所述第一重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第一文库的第一抗原执行第一选择而获得且所述第二重链可变区通过对来自包含独特重链可变区的第二文库的第二抗原执行第二选择而获得。
实施方案51.根据实施方案1至50中任一项的方法，其中所述文库中的至少一个还包含至少一条轻链。
实施方案52.根据实施方案1至51中任一项的方法，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽和所述第二多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
实施方案53.根据实施方案25至23中任一项的方法，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽和所述第二多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
实施方案54.根据实施方案26至53中任一项的方法，所述组合物是由其中各自已引入了编码所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽及所述第四多肽的核酸序列的原核宿主细胞或真核宿主细胞表达。
实施方案55.根据实施方案52至54中任一项的方法，其中每个所编码的多肽是由宿主细胞表达。
实施方案56.根据实施方案52至55中任一项的方法，其中所述组合物是由宿主细胞表达。
实施方案57.根据实施方案52至56中任一项的方法，其中基本上每个宿主细胞都已经用所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽及所述第四多肽转化或转染。
实施方案58.根据实施方案52至57中任一项的方法，其中基本上每个宿主细胞都表达所述MAI、所述第一亲代抗体种类、和所述第二亲代抗体种类。
实施方案59.实施方案52至58中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：真核细胞；真菌细胞；酵母细胞；昆虫细胞；哺乳动物细胞；酿酒酵母细胞；巴斯德毕赤氏酵母细胞；哺乳动物细胞；COS细胞；人胚肾(HEK)细胞；及CHO细胞。
实施方案60.一种离子交换洗脱液，其包含：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
实施方案61.一种离子交换洗脱液，其包含CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及NaCl。
实施方案62.根据实施方案60或实施方案61的离子交换洗脱液，限制条件为所述洗脱液不包括TRIS、哌嗪或咪唑。
实施方案63.一种离子交换洗脱液，其基本上是由以下组成：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
实施方案64.一种离子交换洗脱液，其是由以下组成：
(i)CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及盐；或
(ii)甲胺、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(bis-tris)、和羟胺及任选至少一种盐。
实施方案65.根据实施方案61至64中任一项的离子交换洗脱液，其中所述盐选自由以下组成的组：NaCl、KCl或Na2SO4。
实施方案66.根据实施方案60至65中任一项的离子交换洗脱液，其中所述洗脱液被用于从包含MAI和亲代同源二聚抗体种类的组合物中纯化MAI。
实施方案67.根据实施方案61至66中任一项的离子交换洗脱液，其中所述洗脱液包含在选自由以下组成的组的浓度范围内的至少一种盐：0mM至约100mM；0mM至约60mM；0mM至约50mM；0mM至约40mM；0mM至约30mM；0mM至约20mM；0mM至约10mM；0mM至约5mM；约10mM至约200mM；约10mM至约100mM；约10mM至约50mM；约10mM至约40mM；约10mM至约30mM；约10mM至约20mM；约20mM至约200mM；约20mM至约100mM；约20mM至约50mM；约20mM至约30mM；约30mM至约200mM；约30mM至约100mM；和约30mM至约50mM；及约5mM至约15mM。
实施方案68.根据实施方案61至67中任一项的离子交换洗脱液，其中洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的至少一种盐。
实施方案69.根据实施方案61至68中任一项的离子交换洗脱液，其中所述盐为NaCl。
实施方案70.根据实施方案61至69中任一项的离子交换洗脱液，其中洗脱液的每个样品包含在约10mM浓度下的NaCl。
实施例
材料和方法
在计算机控制的
Figure BDA0001498648680001191
avant 150制备型色谱系统(GE Healthcare LifeSciences)上进行实施例中提出的所有色谱分离，该系统配备有集成的pH电极，使得能够在每次色谱实验期间进行在线pH监测。Mono S 5/50GL、Mono Q 5/50GL及Mono S 10/100GL柱各自购自GE Healthcare Life Sciences。所有其他柱是购自如图26A和26B各自的标题为“树脂”的栏中所列的供应者。乙酸和氯化钠是来自VWR，CAPS、MOPSO和TAPS是来自Sigma，CHES和甲酸是来自EMD，HEPPSO来自于MP Biomedicals，且MES来自于Calbiochem。甲胺(H2O中40％)、1,2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪及羟胺(H2O中50％)是购自Sigma，bis-tris是购自Affymetrix，且氯化钠是购自VWR。pH梯度形成溶液是在每次实验之前通过将缓冲剂溶解于水中并将溶液分成两个相等部分来新鲜制备。除非另作说明，洗脱液组成如图1中所列。一半使用氢氧化钠将pH调节至4(缓冲液A)，而另一半也使用氢氧化钠将pH调节至11(缓冲液B)。
除非另外指出，以下操作被用于进行实施例中描述的所有纯化。大约0.2mg至2mg(对于Mono S 5/50GL、Mono Q 5/50GL、及用于下文实施例中所有其他类似尺寸的柱)或大约5mg至10mg(对于Mono S 10/100柱及用于下文实施例中的所有其他类似尺寸的柱)有待分离的MAI-亲代同源二聚抗体种类组合物被缓冲液交换为初始pH缓冲液并且通过0.2μm过滤器来过滤。在每次分离之前，将柱用10个柱体积的初始缓冲液(缓冲液A、缓冲液B、或缓冲液A与缓冲液B的适当混合物)平衡。然后将蛋白质组合物经由毛细管环加样到柱上，并用另外10个柱体积的初始缓冲液洗涤该柱以除去未结合的材料。随后，将由缓冲液A与缓冲液B的适当混合物组成的20个柱体积的线性pH梯度用于分离共同的轻链双特异性抗体混合物。或者，在缓冲液A和B的更窄梯度用于洗脱之前进行15个柱体积的分步洗脱。
共同的轻链抗体(即亲代同源二聚抗体种类)是使用体外酵母选择系统及相关方法从全长人IgG1抗体文库中分离(参见，例如WO 2009/036379；WO 2010/105256；及WO2012/009568)。靶结合mAb是通过将生物素标记抗原与表达抗体的酵母细胞在不同浓度下孵育来富集，然后在FACSAria II细胞分类器(BD Biosciences)上采用链霉亲和素二级试剂在连续几轮筛选中进行磁珠筛选(Miltenyi,Biotec)和荧光激活细胞分选。最后一轮富集之后，将酵母细胞分选并铺于琼脂板上，通过DNA测序分析克隆并用于IgG产生。在几轮连续筛选循环中使用较低浓度的抗原饵进行抗体的较高亲和力的优化，其中通过轻链改组产生亚文库，进行重链的CDR1和CDR2的定向诱变及重链或轻链的可变区的ePCR。例如，其中采用除IgG1同种型形式以外的IgG同种型形式，从如上所述的文库中分离的可变结构域被改换形式为所示的替代IgG同种型形式(例如IgG4等)。
包含每个实施例中描述并测试的每种抗体(重链-异源二聚MAI和两个亲代重链同源二聚种类)的组合物是获自载有并瞬时表达编码第一重链多肽、第二重链多肽及第三轻链多肽各自的核酸序列的哺乳动物宿主细胞(HEK细胞)。转染的细胞在本领域中已知的标准条件下培养，并且收集包含抗体的上清液并使其经受基于蛋白A的亲和纯化以便获得包含存在于上清液中的所有抗体种类的组合物。取决于由如下所述的每个实施例的核酸编码的抗体的同种型形式，所述抗体种类(MAI和/或亲代同源二聚抗体)是呈IgG1形式(描述于例如实施例1至9及实施例14和15中)、IgG4形式(描述于例如实施例10至13中)或杂合IgG1/IgG4同种型形式(描述于例如实施例11中)。
实施例中测试的组合物及形式
在实施例1至9和实施例14中测试的组合物包含以下抗体种类：
方案A：
呈天然人IgG1同种型形式的MAI，其包含呈IgG1同种型形式的第一重链多肽、呈IgG1同种型形式的第二重链多肽及两个拷贝的在氨基酸序列上相同的轻链多肽，其中第一重链多肽和第二重链多肽的可变区具有不同的氨基酸序列和不同的抗原特异性(且因此通过第一和第二重链多肽可变区各自与两个拷贝的轻链多肽(即“共同的轻链”)中的一个的每个配对形成的抗原结合区具有两种不同的抗原特异性)；
呈天然人IgG1同种型形式的第一亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第一重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第一重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)；以及
呈天然人IgG1同种型形式的第二亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第二重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第二重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的第二重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)。
实施例10中测试的组合物包含以下抗体种类：
方案B：
呈天然人IgG4同种型形式的MAI，其包含呈IgG4同种型形式的第一重链多肽、呈IgG4同种型形式的第二重链多肽及两个拷贝的在氨基酸序列上相同的轻链多肽，其中第一重链多肽和第二重链多肽的可变区具有不同的氨基酸序列和不同的抗原特异性(且因此通过第一和第二重链多肽可变区各自与两个拷贝的轻链多肽(即“共同的轻链”)中的一个的每个配对形成的抗原结合区具有两种不同的抗原特异性)；
呈天然人IgG4同种型形式的第一亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第一重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第一重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)；以及
呈天然人IgG4同种型形式的第二亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第二重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第二重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的第二重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)。
实施例11中测试的组合物包含以下抗体种类：
方案C：
呈杂合IgG1/IgG4同种型形式(天然人IgG1同种型形式/人天然IgG4同种型形式)的MAI，其包含呈IgG1同种型形式的第一重链多肽、呈IgG4同种型形式的第二重链多肽及两个拷贝的在氨基酸序列上相同的轻链多肽，其中第一重链多肽和第二重链多肽的可变区具有不同的氨基酸序列和不同的抗原特异性(且因此通过第一和第二重链多肽重链可变区各自与两个拷贝的轻链多肽(即“共同的轻链”)中的一个的每个配对形成的抗原结合区具有两种不同的抗原特异性)；
呈天然人IgG1同种型形式的第一亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第一重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第一重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)；以及
呈天然人IgG4同种型形式的第二亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第二重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第二重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的第二重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)。
实施例12和实施例13中测试的组合物包含以下抗体种类：
方案D：
呈天然人IgG4同种型形式的MAI，其包含呈IgG4同种型形式的第一重链多肽、呈IgG4同种型形式的第二重链多肽、一个拷贝的第一轻链多肽氨基酸序列(其中引进第一工程改造的异源二聚化基序以有助于相对于第二重链多肽二聚化的第一重链多肽的优先二聚化)、以及一个拷贝的第二轻链多肽氨基酸序列(其中引进第二工程改造的异源二聚化基序以有助于相对于第一重链多肽二聚化的第二重链多肽的优先二聚化)，其中第一重链多肽和第二重链多肽的可变区具有不同的氨基酸序列和不同的抗原特异性(且因此通过第一重链多肽重链可变区与第一轻链多肽的每个配对形成的抗原结合区具有与通过第二重链多肽重链可变区与第二轻链多肽的配对形成的抗原结合区不同的特异性；
呈天然人IgG4同种型形式的第一亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第一重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)；以及
呈天然人IgG4同种型形式的第二亲代重链-同源二聚抗体种类，其包含如上1)中的两个拷贝的第二重链多肽和两个拷贝的轻链多肽，其中通过一个拷贝的第二重链多肽与一个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区具有单一抗原特异性(且因此通过每个拷贝的第二重链多肽与每个拷贝的轻链多肽的配对形成的抗原结合区各自具有相同的单一抗原特异性)。
实施例1
在强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱上使用线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离，这两个种类在重链pI上具有0.68个pH单位的计算差(HC1的计算pI＝9.73；HC2的计算pI＝9.05；两个相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。起始缓冲液A：15.6mMCAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液B：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mMHEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 11.0流率：1ml/min，从0％B至100％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。
图2中描绘的结果显示，尽管有相对陡峭的pH梯度和小规模的柱，两条重链的pI差(以及MAI的两条不同重链由此衍生的两个相应的亲代同源二聚种类的pI差)仍足以在两个同源二聚体种类与所需异源二聚体之间产生基线分辨，且由此实现异源二聚体(MAI)的纯化(图2)。
实施例2
在强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱或强阳离子交换剂Mono S10/100GL柱上使用各种线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离，这两个种类在重链pI上具有0.25个pH单位的计算差(HC1的计算pI＝9.46；HC2的计算pI＝9.21；两个相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.59个pH单位)。图4A：在Mono S 5/50GL柱(柱体积：1mL)上分离0.228mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从0％B至100％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。图4B：在Mono S 5/50GL柱(柱尺寸：1mL)上分离1.57mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 11.0。流率：1ml/min，从32.5％B至55％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。图4C：在Mono S10/100GL柱(柱尺寸：8ml)上分离8.88mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mMTAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从32.5％B至55％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。
图4A至4C中的洗脱图显示相对于图4A中所示产生的线性梯度使线性梯度更窄(即，产生包括如图4B和4C中所示更窄的pH范围的pH梯度范围)以及增加样品材料量(质量)及随之样品在柱上的停留时间都造成分辨率增加。此外，显示在经20个柱体积具有从0％B至100％B的完整梯度的1ml Mono S 5/50GL柱上的仅部分分辨的样品是通过对于Mono S10/100GL柱增加柱体积至8ml并使梯度更窄(32.5％B至55％B，经20个柱体积)来分辨。因此，结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，这两种抗体种类的计算pI差为大约0.59个pH单位。另外，结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，所述亲代同源二聚种类的重链的计算pI差为大约0.25个pH单位。
实施例3
使用强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和具有以下的线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及具有重链pI的不同计算差的两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mMHEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从32.5％B至55％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。图5A：重链pI的计算差为0.68个单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.73；HC2的计算pI＝9.05；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。图5B：重链pI的计算差为0.43个pH单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.00；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。图5C：重链pI的计算差为0.25个单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算l pI＝9.46；HC2的计算tpI＝9.21；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.59个pH单位)。图5D：重链pI的计算差为0.24的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算理论pI＝9.18；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位)。图5E：重链pI的计算理论差为0.21的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.54；HC2的计算pI＝9.33；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.38个pH单位)。实现两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)的差相差0.26个pH单位的共同轻链双特异性同型二聚体与异源二聚体的混合物在强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和相对较窄的线性pH梯度上的基线分辨。因此，结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，这两种抗体种类的计算pI差为约1.33至小到约0.26个pH单位。另外，结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，所述亲代同源二聚种类的重链的计算pI差为约0.7个pH单位至低到约0.26个pH单位。
实施例4
在强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱或强阳离子交换剂Mono S10/100GL柱上使用各种线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离，这两个种类在重链pI上具有0.09的计算差(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.33；两个相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.10个pH单位)。图8A：在Mono S 5/50GL柱上分离0.421mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mMNaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mMMOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从0％B至100％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。图8B：在Mono S 10/100GL柱上分离7.57mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mMMES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从35％B至53％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。图8C：在MonoS 10/100GL柱上分离6.69mg总材料：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从37％B至43％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。在图8C所示的实验中观察到的MAI的回收相对于图8B中所观察到的回收增加了64％。
结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，这两种抗体种类的计算pI差低至约0.10个pH单位的可接受的程度(即，由此使得可选择级分体积以便MAI被纯化至基本上同质，尽管产量有适度损失)。另外，结果表明MAI是从两种不同的亲代同源二聚抗体种类中纯化，所述亲代同源二聚种类的重链的计算pI差为大约0.9个pH单位。此外，结果表明采用较窄的pH梯度(即，缩小pH梯度的pH范围)以及增加柱体积(且由此增加施加于柱上的蛋白质组合物的停留时间)可增加MAI从亲代同源二聚种类中的分离程度并提高MAI的回收率。
实施例5
使用Mono S 10/100GL强阳离子交换剂树脂和如图3上部的表中示出的缓冲液组成，将包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离与使用线性盐梯度的相同组合物的分离进行比较。简言之，起始缓冲液A：15.6mMCAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0。最终缓冲液B：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mMHEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0流率：1ml/min，从0％B至100％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。
对于pH梯度实验和盐梯度实验两者，比较具有以下计算差的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体：重链pI的计算差为0.68个单位(HC1的计算pI＝9.73；HC2的计算pI＝9.05；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)；重链pI的计算差为0.24个单位(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.18；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位)；重链pI的计算差为0.11(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.32；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.11个pH单位)；以及重链pI的计算差为0.09(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.34；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.1个pH单位)。
结果表明，与盐梯度洗脱相比，MAI当经受pH梯度洗脱时与相应的亲代同源二聚抗体种类测试组合物更好地分离。
实施例6
希望进一步探究不同亲代同源二聚抗体种类的计算pI差实现MAI从包含MAI及两种不同的亲代同源二聚抗体种类的组合物中分离的能力的程度。
使用强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱和具有以下的线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及具有重链pI的不同计算差的两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mMCAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：1ml/min，从0％B至100％B的线性梯度形成的长度：20个柱体积。
图6A：重链pI的计算差为0.68个单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.73；HC2的计算pI＝9.05；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。图6B：重链pI的计算差为0.43个pH单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.00；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.48个pH单位)。图6C：重链pI的计算差为0.25个单位的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.46；HC2的计算pI＝9.21；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.59个pH单位)。图6D：重链pI的计算差为0.21的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.54；HC2的计算理论pI＝9.33；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.38个pH单位)。图6E：重链pI的计算理论差为0.24的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.18；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位)。图6F：重链pI的计算理论差为0.11的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.32；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.11个pH单位)。图6G：重链pI的计算理论差为0.09的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.33；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.10个pH单位)。
结果表明，容纳于包含MAI及其亲代同源二聚抗体种类的组合物中的每种MAI的成功分离与所述亲代同源二聚抗体种类的pI的计算差很好地相关，并且与包含于MAI的重链多肽所来源于的亲代同源二聚抗体种类中的重链多肽的pI的计算差相当好地相关。
结果还表明，如图7中所示，当不同亲代同源二聚种类的重链序列彼此相差仅一个氨基酸时，本文中进行的方法适于将MAI以可接受的程度从相应的亲代同源二聚抗体种类中分离。
实施例7
希望探究阴离子交换树脂实现MAI从包含MAI及两种不同的亲代同源二聚抗体种类的组合物中分离的能力。因此，如下所述进行分离，其中将示例性阳离子交换树脂的性能与示例性阴离子交换树脂的性能相比较。
使用强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱和具有以下的线性pH梯度进行包含共同轻链IgG1双特异性异源二聚体(“MAI”)及具有重链pI的不同计算差的两种不同亲代同源二聚抗体种类中的每个(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述的形式)的组合物的线性pH梯度分离：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mMCAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0；或者使用强阴离子交换剂Mono Q 5/50GL柱和具有以下的线性pH梯度：起始缓冲液B：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mMNaCl，pH4.0。图9A：在MONO S 5/50GL上分离的重链pI的计算差为0.68的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.73；HC2的计算理论pI＝9.05；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。图9B：在MONO S 5/50GL上分离的重链pI的计算理论差为0.24的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.18；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位)。图9C：在MONO S 5/50GL上分离的重链pI的计算理论差为0.11的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.32；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.11个pH单位)。图9D：在MONO Q 5/50GL上分离的重链pI的计算差为0.68的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算理论pI＝9.73；HC2的计算pI＝9.05；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差1.33个pH单位)。图9E：在MONO Q 5/50GL上分离的重链pI的计算差为0.24的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算理论pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.18；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.26个pH单位)。图9F：在MONO Q 5/50GL上分离的重链pI的计算差为0.11的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体(HC1的计算pI＝9.43；HC2的计算pI＝9.32；两种相应的亲代同源二聚抗体种类的计算等电点(pI)相差0.11个pH单位)。
结果表明，在类似尺寸的强阳离子交换剂Mono S 5/50GL柱不提供分辨的情况下，强阴离子交换剂Mono Q 5/50GL柱能够以可接受的程度将MAI从亲代同源二聚抗体种类中纯化(即，由此使得可选择级分体积以便MAI被纯化至基本上同质，尽管产量有适度损失)。
实施例8
需要进一步比较阳离子交换树脂与阴离子交换树脂在将MAI从包含给定的MAI及其亲代同源二聚抗体种类的组合物中分离的能力方面的性能，其中在亲代同源二聚抗体种类的计算pI上具有较大的样品差异。然而，在此情况下，如以上实施例中所述制备pH梯度，但产生更窄的梯度(覆盖更窄的pH范围)，如图10A和图10B中所示。因此，将8mL Mono S柱用于图10A中且8mL Mono Q柱用于图10B中，并且使用两种树脂各自测试MAI-亲代同源二聚抗体种类组合物，其中亲代同源二聚抗体种类的计算pI的差分别为1.33、0.26、0.11及0.1，如实施例6中所述制备和表征。
如图10A和10B中所示，结果表明对于测试的所有组合物，MonoQ阴离子交换树脂以比阳离子Mono S交换树脂更大的程度实现每种MAI从其相应的亲代同源二聚抗体种类中的分离。
实施例9
需要确定所公开的方法是否可用工业规模树脂使用。因此，在第一期实验中，进行一系列小规模(1mL柱)探究性实验，其中使用完整的pH梯度(即，pH 4至pH 11)测试一系列阳离子和阴离子交换树脂实现组合物分离的能力，其中亲代同源二聚抗体种类的计算pI差分别为1.33和0.26，如实施例6中所述制备和表征。在第二期实验中，使用更大的柱(8mL和更窄的梯度来评价这些最佳运行的树脂分离组合物的能力，其中亲代同源二聚抗体种类的计算pI的差低至大约0.1个pH单位)装载来自第一期的三个最佳运行的阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
图11A和11B中描绘的亲代同源二聚抗体种类之间的pI差为1.33个pH单位的组合物的第一期阳离子交换实验的结果表明，Mono S、Source 30S及SP HP阳离子交换树脂实现测试组合物的最佳分离(即“1.33”组合物)。图12A、12B、13A及13B中描绘的亲代同源二聚抗体种类之间的pI差分别为1.33个pH单位和0.26个pH单位的组合物的第一期阴离子交换实验的结果表明，Mono Q、Source 30Q及Q HP阴离子交换树脂实现测试组合物的最佳分离(即“1.33”组合物和“0.26”组合物)。然而，为了使用最佳运行的阳离子树脂和阴离子树脂实现更好的分辨，进行一系列进一步的探究性实验，但使用更窄的pH梯度(即更窄的pH范围)。如图14A和14B中所描绘，在具有所示较窄梯度的小柱(1mL)上分别测试阳离子树脂和阴离子树脂将MAI从亲代同源二聚抗体种类之间的pI差为1.33个pH单位的组合物中分离的能力。
因此，对于第二期实验，较窄梯度与大柱(8mL)一起使用并且测试它们将MAI从亲代同源二聚抗体种类的计算pI差分别为0.26、0.11和0.10个pH单位的组合物中分离的能力。如图15A和15B中所描绘，在具有所示较窄梯度的大柱(8mL)上分别测试阳离子树脂和阴离子树脂将MAI从亲代同源二聚抗体种类之间的pI差为0.26个pH单位的组合物中分离的能力。如图16A和16B中所描绘。在具有所示较窄梯度的大柱(8mL)上分别测试阳离子树脂和阴离子树脂将MAI从亲代同源二聚抗体种类之间的pI差为0.11个pH单位的组合物中分离的能力。如图17A和17B中所描绘。在具有所示较窄梯度的大柱(8mL)上分别测试阳离子树脂和阴离子树脂将MAI从亲代同源二聚抗体种类之间的pI差为0.1个pH单位的组合物中分离的能力。
结果表明，两组最佳运行的阳离子和阴离子树脂以足够优异的程度分离大多数组合物，其中较佳分离发生在亲代同源二聚抗体种类的pI差更大的情况下。一般说来，阴离子交换树脂实现比由阳离子树脂所实现的更佳的MAI分离。
实施例10
使用强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和具有以下的线性pH梯度进行包含共同的轻链IgG4双特异性异源二聚体及具有重链pI的不同理论差的亲代同源二聚抗体种类(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案B中所述的形式)的混合物的线性pH梯度分离：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mMMES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：4ml/min。图18A：使用32％B的15个柱体积的分步梯度、然后从32％B至71％B的20个柱体积的线性梯度、最后保持在71％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为1.68(HC1的计算理论pI＝7.05；HC2的计算理论pI＝8.73)的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体。图18B：使用22％B的15个柱体积的分步梯度、然后从22％B至75％B的20个柱体积的线性梯度、随后保持在75％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为1.99(HC1的计算理论pI＝6.74；HC2的计算理论pI＝8.73)的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体。图18C：使用25％B的15个柱体积的分步梯度、然后从25％B至83％B的20个柱体积的线性梯度、随后保持在83％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为1.77(HC1的计算理论pI＝7.27；HC2的计算理论pI＝9.04)的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体。图18D：使用21％B的15个柱体积的分步梯度、然后从21％B至75％B的20个柱体积的线性梯度、随后保持在75％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为1.94(HC1的计算理论pI＝6.74；HC2的计算理论pI＝8.68)的共同轻链双特异性同源二聚体与异源二聚体。
结果表明IgG4同种型形式的MAI在所测试的所有pI差下容易从亲代同源二聚IgG4同种型种类中纯化。
实施例11
使用强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和具有以下的线性pH梯度对包含共同轻链双特异性IgG1/IgG4杂合异源二聚体、及具有重链pI的不同理论差的IgG1和IgG4同源二聚抗体种类(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案C中所述的形式)的混合物进行线性pH梯度分离：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mMMOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。流率：4ml/min。图19A：使用24.5％B的15个柱体积的分步梯度、然后从24.5％B至51％B的20个柱体积的线性梯度、随后保持在51％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为2.2(HC1的计算理论pI(IgG4)＝7.05；HC2的计算理论pI(IgG1)＝9.22)的共同轻链双特异性IgG1和IgG4同源二聚体与IgG1/IgG4异源二聚体。图19B：使用24.5％B的15个柱体积的分步梯度、然后从24.5％B至58％B的20个柱体积的线性梯度、随后保持在58％B的15个柱体积纯化重链pI的计算理论差为2.4(HC1的计算理论pI(IgG4)＝7.05；HC2的计算理论pI(IgG1)＝9.46)的共同轻链双特异性IgG1和IgG4同源二聚体与IgG1/IgG4异源二聚体。IgG1与IgG4主链之间的较大pI差造成IgG1和IgG4同源二聚体与异源二聚体的优良分离。
结果表明杂合IgG1/IgG4同种型形式的MAI在所测试的所有pI差下容易从亲代同源二聚IgG4同种型种类中纯化。
实施例12
在某些情况下，已观察到极宽的洗脱曲线，如图20A和20B中所示，其描绘了亲代同源二聚种类及相应的MAI(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案D中所述的形式)的两种不同混合物各自的洗脱曲线。梯度和洗脱液组成如实施例1至9中所述。在图20A所描绘的实验中，使完整IgG pI的计算理论差为1.81(IgG4同源二聚亲代种类A的计算理论pI＝7.41；IgG4同源二聚亲代种类B的计算理论pI＝9.22)的两种不同的IgG4同源二聚体(同源二聚亲代种类)及计算的完整IgG4pI为8.87的相应MAI经受使用强阳离子交换剂Mono S5/50GL柱和具有以下的线性pH梯度的阳离子交换色谱：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mMNaCl，pH4.0；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mMMOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH11.0。如图20A中在第一混合物中的各个不同种类洗脱时观察到的pH为7.30(同源二聚亲代种类A)、9.73(同源二聚亲代种类B)及9.14(MAI(异源二聚亲代种类))。图20B描绘了使用不同IgG4同源二聚亲代种类A和B(但其一致具有与针对图20A中所示的亲代种类所计算的相同的计算理论pI)的类似实验的结果。图20B中所示的MAI具有的计算pI＝8.76。如图20B中在第一混合物中的各个不同种类洗脱时观察到的pH为7.43(同源二聚亲代种类A)、9.77(同源二聚亲代种类B)及9.18(MAI(异源二聚亲代种类))。
如前面的实施例中，制备用于图20A和20B所描绘的研究中的所有样品和柱并在pH4下平衡。因此需要确定某些修改的洗脱条件和组分是否可能在基于给定混合物中的种类性质而观察到或预期这种宽洗脱曲线的混合物中更好地分辨或分离。
因此，使用用于生成图20A和20B中所绘数据的相同同源二聚亲代种类和MAI进行实验，例外的是分步pH梯度相被纳入洗脱部分中，其中在极少洗脱液体积内(即，非常少的洗脱级分内)洗脱液的pH从约pH 4增加到约pH 6.5。另外，制备含有同源二聚亲代种类和异源二聚MAI(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案D中所述的形式)两者的样品混合物并且在产生分步梯度之前在pH 6下在柱上平衡，其洗脱出pI最低的同源二聚种类。这就允许通过使用更窄的线性梯度相(如在图21A中从pH 7.8至pH 9.65，和在图21B中从pH7.94至pH 9.68)将剩余的MAI与第二同源二聚种类分辨开和分离。
如图22A和22B中所描绘，将用于生成图21A和图21B中的数据的相同的两种样品混合物用于两个相似的双重相(即，分步pH梯度接着线性pH梯度的方案)洗脱实验中；一个从pH 4开始，另一个从pH 6开始。图22A和22B中所示的结果表明从较温和的pH(例如pH6对比pH 4)处开始的MAI从其相应的同源二聚亲代种类中的洗脱、分辨、分离和洗脱相对于从更极端的pH(即，从pH 4对比pH 6开始)处开始的洗脱是增加的。
实施例13
然后需要确定采用样品混合物的较温和的起始pH(例如，pH 6对比更低的pH)和更窄的线性pH梯度(即，在相对较大的洗脱液体积上施加的梯度(大量级分/级分体积))是否将造成MAI从计算和/或实验pI值彼此接近的相应的同源二聚亲代种类中的分辨和分离。
因此，制备含有同源二聚亲代种类与异源二聚MAI(如以上实施例中测试的组合物及形式的方案D中所述的形式)两者(其中每个同源二聚亲代种类的计算理论的整体IgG4pI分别为8.97和8.99，且MAI的计算理论的整体IgG4pI为8.98)的样品混合物并且在pH 6.0下平衡该柱，然后使其经受使用强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和具有以下的线性pH梯度的阳离子交换色谱：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mMHEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH8.34；和最终缓冲液：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH9.86。如图20A中在第一混合物中的各个不同种类洗脱时观察到的pH为7.30(同源二聚亲代种类A)、9.73(同源二聚亲代种类B)及9.14(MAI(异源二聚亲代种类经受图23中所绘的洗脱条件。
结果表明，与每个相应的亲代同源二聚种类相差低至0.01个pH单位的MAI可使用所公开的方法从两种所述同源二聚亲代种类中分辨出和分离。
实施例14
已观察到，对于某些样品混合物，单独的阳离子交换或阴离子交换都不足以将MAI从其同源二聚亲代种类中分离至令人满意的纯度。然后需要评价所述MAI的分辨和纯化是否可以通过使一组对应于阳离子交换操作的MAI-洗脱峰的合并级分经受后续的阴离子交换操作而改进的令人满意，每个操作如上实施例1-9中所述且如图24中所示。
更具体地，将两个不同的10毫克如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述形式的MAI/同源二聚亲代种类混合物的样品等分试样注入到阳离子交换柱中以产生足够用于后继阴离子交换操作的洗脱物。每种同源二聚亲代种类的计算理论的整体IgG pI分别为9.19和9.09，且MAI的计算理论的整体IgG1pI为9.09。制备样品混合物并且使柱在pH6.0下平衡，然后经受使用强阳离子交换剂Mono S 10/100GL柱和具有以下的线性pH梯度的阳离子交换色谱：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 6.87；和最终缓冲液：15.6mMCAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 7.27。将含有推定的异源二聚体(MAI)-含有如图24的左边部分中所描绘的中间峰的合并物收集，合并，然后注入到阴离子交换柱中，并且使用具有以下的线性pH梯度洗脱：起始缓冲液A：9.8mM甲胺、9.1mM 1,2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1,4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺及10mM氯化钠，pH＝9.57；和最终缓冲液B：9.8mM甲胺、9.1mM 1,2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1,4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺及10mM氯化钠，pH＝8.07。推定的MAI-含有来自初始阳离子交换操作的合并物的样本的质谱分析揭示，该峰含有大量的同源二聚亲代种类中的一种。推定的MAI-含有从后续阴离子交换柱上洗脱的峰的质谱分析揭示，对应于此峰的合并级分含有MAI并且基本上不含任一种同源二聚亲代种类。
结果表明，对于某些混合物，依次使用阳离子交换和阴离子交换两者可增强MAI从它们相应的同源二聚亲代种类中的分辨和分离。
实施例15
然后需要确定对于某些MAI和相应的同源二聚亲代种类混合物，采用不同的缓冲液系统或洗脱液是否可为有利的，所述缓冲系统和洗脱液更具体地被设计以供阴离子交换树脂使用。
因此，设计以下实验，其中使如以上实施例中测试的组合物及形式的方案A中所述形式的MAI/同源二聚亲代种类混合物在图25A中所示的条件下经受使用以下阳离子交换缓冲系统的阴离子交换色谱：起始缓冲液A：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mMHEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 9.20；和最终缓冲液B：15.6mM CAPS、9.4mM CHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11mM MES、13mM乙酸、9.9mM甲酸、10mM NaCl，pH 8.20。图25A中所示的所有三个峰通过质谱法来分析以确定峰组成，观察到该峰如图25A中所示。然后使相同的MAI/同源二聚亲代种类混合物的单独的等分试样在图25B中所示的条件下经受使用以下阴离子交换缓冲液系统的阴离子交换色谱：起始缓冲液A：9.8mM甲胺、9.1mM 1,2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1,4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺及10mM氯化钠，pH＝9.34；和最终缓冲液B：9.8mM甲胺、9.1mM 1,2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1,4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺及10mM氯化钠，pH＝7.53。图25B中所示的所有三个峰通过质谱法来分析以确定峰组成，观察到该峰如图25B中所示。
结果表明，对于某些MAI/同源二聚亲代种类混合物，当采用阴离子交换色谱操作时使用阴离子交换缓冲液系统或洗脱液可将MAI从同源二聚亲代种类中分辨和分离至相对于当采用阴离子交换色谱操作时使用阳离子交换缓冲液系统或洗脱液所观察到的显著改善的纯度水平。
可以与上述实施例中所说明类似的结果采用的其他色谱材料提供于图26A和图26B中。
尽管以上为了说明目的已经描述了本发明的具体实施方案，对于本领域技术人员应理解，在不脱离所附权利要求中限定的发明的情况下，可以进行本发明细节的多种变动。
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Claims (16)

1.一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，所述异源二聚体包含含有第一重链可变区(VH1)的第一重链多肽(HC1)和含有第二重链可变区(VH2)的第二重链多肽(HC2)，其中所述VH1和所述VH2具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：
i)获得包含所述MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类的组合物，所述第一亲代同源二聚抗体种类包含所述HC1的至少两个拷贝，且所述第二亲代同源二聚抗体种类包含所述HC2的至少两个拷贝；及
ii)执行离子交换色谱法，借此从所述第一和所述第二亲代同源二聚抗体种类中分离所述MAI，其中所述步骤ii)中的执行包括：
ii-a.使所述组合物与色谱材料接触，由此形成色谱材料-组合物复合物；及
ii-b.执行洗脱步骤，其中：
(ii-b-1)离子交换色谱在色谱材料-组合物复合物上进行，方法是通过一个或几个洗脱步骤，在强阳离子交换剂或强阴离子交换剂上施加pH梯度，所述洗脱包括使色谱材料-组合物复合物与洗脱液接触，所述洗脱液是缓冲剂组合物，其包含N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙酸、甲酸及氯化钠(NaCl)，其中：
(ii-b-1-i)所述离子交换色谱包括阳离子交换色谱，其用强阳离子交换剂进行分离，其中当进行所述阳离子交换色谱时，缓冲剂中CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及NaCl的相对量产生递增的pH梯度；或者
(ii-b-1-ii)所述离子交换色谱包括阴离子交换色谱，其使用强阴离子交换剂进行，其中当进行所述阴离子交换色谱时，缓冲剂中CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸及NaCl的相对量产生递减的pH梯度；
其中使用所述洗脱液，所述阳离子交换色谱步骤(ii-b-1-i)或阴离子交换色谱步骤(ii-b-1-ii)会导致MAI从来自色谱材料-组合物复合物的第一和第二亲代同源二聚抗体种类中pH介导地分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(ii-b)中所用的洗脱液由CAPS、CHES、TAPS、HEPPSO、MOPSO、MES、乙酸、甲酸、NaCl和水组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(ii-b)中所用的洗脱液包含15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11.0mM MES、13.0mM乙酸及9.9mM甲酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(ii-b)中所用的洗脱液包含15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11.0mM MES、13.0mM乙酸、9.9mM甲酸及10mM NaCl。
5.根据权利要求1所述的方法，其中(ii-b)中所用的洗脱液由15.6mM CAPS、9.4mMCHES、4.6mM TAPS、9.9mM HEPPSO、8.7mM MOPSO、11.0mM MES、13.0mM乙酸、9.9mM甲酸、10mMNaCl及水组成。
6.一种纯化目标多特异性抗体(MAI)的方法，其中所述MAI包含异源二聚体，所述异源二聚体包含含有第一重链可变区(VH1)的第一重链多肽(HC1)和含有第二重链可变区(VH2)的第二重链多肽(HC2)，其中所述VH1和所述VH2具有不同的抗原特异性和不同的等电点，所述方法包括：
i)获得包含所述MAI、第一亲代同源二聚抗体种类和第二亲代同源二聚抗体种类的组合物，所述第一亲代同源二聚抗体种类包含所述HC1的至少两个拷贝，且所述第二亲代同源二聚抗体种类包含所述HC2的至少两个拷贝；及
ii)执行阴离子交换色谱法，借此从所述第一和所述第二亲代同源二聚抗体种类中分离所述MAI，其中所述步骤ii)中的执行包括：
ii-a.使所述组合物与色谱材料接触，由此形成色谱材料-组合物复合物；及
ii-b.执行至少一个洗脱步骤，其中：
(ii-b-1)所述阴离子交换色谱在包含强阴离子交换剂的色谱材料-组合物复合物上进行，方法是通过至少一个洗脱步骤，对色谱材料-组合物复合物施加pH梯度，所述洗脱步骤包括使色谱材料-组合物复合物与洗脱液接触；并且
(ii-b-2)所述洗脱液是缓冲剂组合物，其包含甲胺、1，2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1，4-二甲基哌嗪、bis-tris、羟胺及氯化钠，其中当用所述洗脱液使所述阴离子交换色谱作用于所述色谱材料-组合物复合物时，缓冲剂组合物中的相对量产生递减的pH梯度；
借此当用(ii-b-2)中的洗脱液进行阴离子交换色谱步骤(ii-b-1)时，MAI从来自色谱材料-组合物复合物的第一和第二亲代同源二聚抗体种类中pH介导地分离。
7.根据权利要求6所述的方法，其中(ii-b)中所用的洗脱液成分由甲胺、1，2-乙二胺、1-甲基哌嗪、1，4-二甲基哌嗪、bis-tris、羟胺、NaCl及水组成。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗脱液包含9.8mM甲胺、9.1mM 1，2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1，4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris及7.7mM羟胺。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗脱液包含9.8mM甲胺、9.1mM 1，2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1，4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺以及10mM NaCl。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗脱液由9.8mM甲胺、9.1mM 1，2-乙二胺、6.4mM 1-甲基哌嗪、13.7mM 1，4-二甲基哌嗪、5.8mM bis-tris、7.7mM羟胺、10mM NaCl以及水组成。
11.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述MAI、所述第一亲代同源二聚抗体种类及所述第二亲代同源二聚抗体种类是以基本上可区别的洗脱体积从所述色谱材料中洗脱。
12.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述洗脱液的离子强度在整个洗脱步骤期间保持基本上相同。
13.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述步骤ii-a还包括在所需初始pH下在所述洗脱液的第一样品中制备或平衡：
i)所述组合物；或
ii)所述组合物-色谱材料复合物。
14.根据权利要求1或6所述的方法，其中：
(i)所述第一亲代同源二聚种类的实际等电点与所述第二亲代同源二聚种类的实际等电点的差小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值；和/或
(ii)所述第一亲代同源二聚种类的计算等电点与所述第二亲代同源二聚种类的计算等电点的差小于0.40个pH单位；小于0.35个pH单位；小于0.30个pH单位；小于0.25个pH单位；小于0.20个pH单位；小于0.15个pH单位；小于0.14个pH单位；小于0.13个pH单位；小于0.12个pH单位；小于0.11个pH单位；小于0.10个pH单位；小于0.09个pH单位；小于0.08个pH单位；小于0.07个pH单位；小于0.06个pH单位；小于0.04个pH单位；小于0.03个pH单位；小于0.025个pH单位；小于0.02个pH单位；或介于任何前述值之间的pH值。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述所需初始pH小于9.0；小于8.5；小于8.0；小于7.5；小于7.0；小于6.5；小于6.0；小于5.5；小于5.0；小于4.5；小于4.0；小于3.5；或小于3.0；或介于任何前述值之间的pH值。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述所需终末pH大于7.0；大于7.5；大于8.0；大于8.5；大于9.0；大于9.5；大于10.0；大于10.5；或大于11.0；大于11.5；大于12.0；大于12.5；大于13.0；大于13.5；或介于任何前述值之间的pH值。
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