JP4093507B2 - 緩衝液組成 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成、およびｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のｐＨ変動の抑制方法に関する。好ましくは酵素的測定用の組成において、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成に関するものであり、生化学分野における基本的に重要な緩衝液組成であり、被検液、例えば、生体成分における基質の測定や酵素活性の測定に重要な技術である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、緩衝液は、生化学反応、例えば酵素的な基質の測定、基質を用いる酵素活性測定や酵素をマーカーとした酵素活性測定に基づく免疫測定法などにおいて、反応媒体のｐＨの変動を押さえるべく開発され、有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液または生化学用緩衝液などの多くの緩衝液が開発されてきた。
【０００３】
有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等が挙げられる。
また、グッド緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＥＰＰＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、別名ＨＥＰＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ、Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（３−Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等が挙げられる。
【０００４】
さらに、上記以外の緩衝能を有する生化学用緩衝液としては、例えば、クエン酸−第２リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−第２リン酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−ホウ砂系、第１リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩化ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パンチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルベイン緩衝液、ハスチング−センドロイ緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、グッド緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、トリス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナール−酢酸塩緩衝液などが挙げられ、何らこれらに限定されるものではない。
【０００５】
従来の生化学検査、例えば、アルカリフォスファターゼの活性測定は、アルカリ域緩衝液としてジエタノールアミン緩衝液や２−エチルアミノエタノール緩衝液等を用いて行われてきたが（臨床化学１９（２）、ｐ２１３−２２７、１９９０年）、ｐＨの僅かな変化でも、酵素の活性値が大きく変動することが知られてきた。
【０００６】
また、アルカリ域緩衝液を開封保存した後当該アルカリ域緩衝液を用いて、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定やアルカリフォスファターゼ活性測定を行うと、胆汁酸測定値やアルカリフォスファターゼ活性値の変動が見られ、再現性に乏しい問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、緩衝液を開封保存した場合、原因は不明であるが、緩衝液のｐＨが変動し、一定のｐＨを得ることが非常に困難である。特に、アルカリ域緩衝液を開封保存した場合は、ｐＨの低下が起こり、例えば、酵素活性を測定する場合は、酵素の反応性の劣化が生じる欠点があった。従って、ｐＨ８〜１１のアルカリ緩衝液にて、例えば生体成分である基質の酵素的測定や酵素活性測定などの酵素反応を伴う酵素的測定のための酵素活性の劣化を生じさせない緩衝液の開発が本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムがｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液を用い、アルカリ域にて酵素的反応を伴う組成の酵素の反応性を安定化させること見いだした。
即ち、本発明は、アルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素の一つである３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、通常の０．２Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて胆汁酸測定を行うと、開封保存した当該緩衝液で、経時的に測定値の低下が観察されたことから、種々の検討を加えた結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを当該緩衝液に含有せしめると、胆汁酸の測定値の低下が非常に改善され、再現性の良好な測定結果が得られることを見いだした。
【０００９】
同様に、アルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素の例示としてのアルカリフォスファターゼの活性測定を０．２Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて、活性測定を行うと、開封保存した当該緩衝液で、経時的に測定値の低下が観察されたが、上記したような炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを当該緩衝液に含有せしめると、アルカリフォスファターゼの活性値の低下が劇的に軽減されることを見いだした。
【００１０】
さらに、本発明においてｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液を用いる組成において、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等の炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を用いることにより再現性良く測定し得るもので、この炭酸水素イオンを放出せしめるカルシウムやマグネシウムの炭酸化合物も同様に良好な結果を示すことを見い出し、その結果、従来の炭酸水素イオンを含有していないアルカリ域緩衝液組成に比べて開封条件下において格段に酵素的測定における再現性が向上したことを見出した。
【００１１】
本発明は上記の知見により完成されたものであって、ｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成、およびｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のｐＨ変動の抑制方法であって、例えば３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の安定的測定やアルカリフォスファターゼの活性の安定的測定などの酵素的測定用の緩衝液組成に用いることを可能となし、本発明の炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめた緩衝液組成は、酵素反応を伴う基質または酵素活性の測定のための酵素的測定用の組成として好適に使用できることを見出した。
【００１２】
本発明のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を含有する組成としては、ｐＨ領域としてｐＨが８〜１１の範囲で大いに有効であり、その緩衝液としては、例えば、ｐＨ８〜１１の間に適宜に調整できる有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液やその他に、クエン酸−第２リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−第２リン酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−ホウ砂系、第１リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩化ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パンチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルベイン緩衝液、ハスチング−センドロイ緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、トリス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナール−酢酸塩緩衝液などの生化学用緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝液以外であっても、ｐＨ８〜１１のアルカリ域にて緩衝能を有するものであれば何ら限定されない。
【００１３】
また、有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等が挙げられる。
さらに、グッド緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＥＰＰＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、別名ＨＥＰＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（３−Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等が挙げられる。
【００１４】
なお、本発明のアルカリ域緩衝液においては炭酸系緩衝液を除くものであり、この炭酸系緩衝液としては、例えば炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの緩衝液またはそれらのカリウム塩による緩衝液などであり、炭酸塩に基づく緩衝液を意味し、本発明におけるアルカリ域緩衝液とは別途に炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とするｐＨ変動抑制剤として含有せしめるものと区別する目的のものである。
【００１５】
アルカリ域緩衝液を用いる組成として、当該アルカリ域緩衝液として、有機アミン系緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜２Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、最適には２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度に調整した水性媒体として用いれば良い。また、好適な水性媒体としては水、具体的には精製水が挙げられ、適宜に補酵素、可溶性塩類、界面活性剤、安定化剤や防腐剤などを含有してもよい。
【００１６】
また、アルカリ域緩衝液を含有する組成として、当該アルカリ域緩衝液として、グッド緩衝液または生化学用緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、最適には２０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度に調整して用いれば良い。
さらに本発明における、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素としては、上記の緩衝液のｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであれば何ら限定されるものでなく、例えば酵素の至適ｐＨや安定ｐＨが酸性域にあっても目的の酵素作用をｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであってもよく、好ましくは酵素の至適ｐＨや安定ｐＨのいずれか、または両方がアルカリ域にあって目的の酵素作用をｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであり、好適には３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１１αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１６αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２１αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどのステロイドデヒドロゲナーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素の至適ｐＨや安定ｐＨのいずれか、または両方がアルカリ域にある酵素が挙げられ、さらに例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（基質：エタノール、補酵素：ＮＡＤ、緩衝液ｐＨ８．５〜８．８）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（基質：乳酸、補酵素：ＮＡＤ、緩衝液ｐＨ９〜１０）、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（基質：ガラクトース、補酵素：ＮＡＤ、至適ｐＨ８〜９）が挙げられる。
【００１７】
また当該酵素としては、例えば胆汁酸である基質の測定の目的としての酵素である３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用形態でもよく、また例えばアルカリフォスファターゼを生体内酵素活性測定の目的とする使用形態でもよく、さらに例えばアルカリフォスファターゼを免疫測定における酵素マーカーとして酵素活性測定の目的とする使用形態でもよいものである。
【００１８】
従ってまた、本発明の緩衝液組成に含有される酵素の量としては、基質の測定の目的、生体内酵素活性測定の目的、免疫測定における酵素マーカーの酵素活性測定の目的によって、適宜異なるものである。
基質の測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては、例えば、緩衝液組成中０．００１〜２００単位、好ましくは０．０５〜１００単位であり、また生体内酵素活性測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては、生体内酵素の量に依存するものであるが、例えば緩衝液組成中０．０００１〜２００単位、好ましくは０．０１〜１００単位であり、免疫測定における酵素マーカーの酵素活性測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては極めて微量であり、例えば緩衝液組成中０．０００１ｍ単位〜１単位、好ましくは０．００１ｍ単位〜０．５単位である。
【００１９】
以下に、本発明について詳しく説明するが、特に限定されるものではない。
炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物として、例えば炭酸水素ナトリウムをアルカリ域緩衝液、例えばジエタノールアミン緩衝液に加えて調整するに当たっては、下記の如く行えば良い。即ち、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）の調製は、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）（和光純薬工業社製）２０．８２７ｇを精製水に溶解させる。次いで、適宜にデヒドロゲナーゼなどの酵素的測定のための補酵素、安定化剤や防腐剤、例えば６．６ｍｍｏｌのＮＡＤＨ、１．３ｇのデキストラン、０．７ｇのＢＳＡ（牛血清アルブミン）、および０．５ｇのＮａＮ3 を添加し、さらに炭酸水素ナトリウムを０ｇ、４．２ｇ、８．４ｇ、１２．６ｇ、１６．８ｇ、あるいは２１．０ｇを添加し、３０℃でｐＨを計測しながら、１ＮのＨＣｌあるいは１ＮのＮａＯＨを加え、ｐＨを９．２に合わせ、精製水で全量を１，０００ｍｌとし、それぞれ０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）を調製する。
【００２０】
この場合、有機アミン系緩衝液の１つであるジエタノールアミン緩衝液への炭酸水素ナトリウムなどの炭酸化合物の添加濃度はモル濃度において１０ｍＭ〜１Ｍであれば良く、望ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭであれば良い。また、グッド緩衝液、例えば、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液に、同様に炭酸水素ナトリウムなどの炭酸化合物の添加濃度は１０ｍＭ〜１Ｍであり、望ましく２０ｍＭ〜５００ｍＭであれば良い。
【００２１】
このようにして作製したアルカリ域緩衝液を含有する組成物、例えば、３μｌ〜５ｍｌの適宜な量に、生体成分における基質の測定用の酵素、例えばＮＡＤやＮＡＤＰまたはそれらの還元型であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤやチオ−ＮＡＤＰまたはそれらの還元型であるチオ−ＮＡＤＨやチオ−ＮＡＤＰＨなどの補酵素を利用する種々のデヒドロゲナーゼ、好適には３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどの酵素を０．１〜１００Ｕ／ｍｌ添加し、開封保存しても、その後に例えば２０〜４０℃にてレートアッセイやエンドポイントアッセイを行なっても、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の安定的な測定が可能となる。
【００２２】
例えば、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性測定または基質の測定は以下のように行えばよい。反応液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭＮＡＤ（興人化学社製）、０．０２５％ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ；同仁化学社製）、５Ｕ／ｍｌジアホラーゼ（旭化成工業社製）、０．４％トリトンＸ−１００（米山化学社製）含む溶液）０．５ｍｌに、０．０２ｍｌの酵素液を添加し、３７℃で予備加温した後、基質溶液（メタノールで溶解した２０ｍＭアンドロステロン（シグマ社製）溶液）を０．０２５ｍｌ添加し、３７℃、５分間、反応させた後、反応停止液（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製））２．５ｍｌを添加し、反応において生成された色素を５５０ｎｍ付近の吸光度にて測定し、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性または基質であるアンドロステロンを測定できる。
【００２３】
さらに、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の例示としては、Ｒ１溶液（３０ｍＭグリシン、１．３５ｍＭチオ−ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、０．８％塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ１００および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ４．０溶液）１．３０ｍｌに、胆汁酸溶液０．０１５ｍｌを添加し、３７℃、５分間反応させた後、Ｒ２溶液（２００ｍＭジエタノールアミン、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．２溶液）０．６５ｍｌを添加し、３７℃、２分後から、レートアッセイ法にて、デヒドロゲナーゼを用いた可逆反応に基づく酵素サイクリングの反応にて生成されたチオ−ＮＡＤＨの量を４００ｎｍ付近の吸光度にて測定するか、反応にて減少したＮＡＤＨの量を３４０ｎｍ付近の吸光度にて測定などの吸光度変化量を測定すれば良い。
【００２４】
同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液（シグマ社製グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）０．０９４ｇを１００ｍｌに溶解し、その後４０倍希釈し５０μＭに調製した溶液）を測定し、既知濃度の胆汁酸溶液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出することができる。
上記の方法にて、Ｒ２溶液を、４℃にて開封保存し、酵素添加後、０（初期値）、７、１４、２１、２６、５１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性、Ｒ２溶液のｐＨ及び各種基質に対する感度を測定する。基質は、ＧＣＤＣＡ（シグマ社製）、セロノルム（第一化学薬品工業社製）、パソノルムＬ（第一化学薬品工業社製）及びパソノルムＨ（第一化学薬品工業社製）等を用いればよい。
【００２５】
また、同様にアルカリ域緩衝液としてＢｉｃｉｎｅを用いる場合は以下の様に行えば良い。即ち、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定は、Ｒ２溶液（１００ｍＭＢｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．０の溶液）に炭酸水素ナトリウムを０〜５０ｍＭ添加し、４℃にて開封保存し、添加後、０（初期値）、２１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性及び各種基質に対する感度を測定する。
【００２６】
また、ジエタノールアミン緩衝液でのアルカリフォスファターゼの活性測定は、例えば、以下の様に行う。
溶液（２００ｍＭジエタノールアミンに炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０３）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１１）、５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０８）、６００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）または８００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、保存後１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定する。アルカリフォスファターゼの活性測定は、開封保存した当該溶液１ｍｌにアルカリフォスファターゼ基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを１５ｍＭの濃度で添加し、次いでアルカリフォスファターゼ含有市販の管理血清であるセラクリアＮ（日本商事社製）２０μｌを添加する。３７℃、１分後から、レートアッセイ法にて、活性を算出する。
【００２７】
また、アルカリ域緩衝液として、グッド緩衝液、例えばＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いる場合は以下の様に行えば良い。溶液（１００ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液に炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）、１００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８１）、３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８３）、４００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）または５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を前述したように測定する。
【００２８】
炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物としては、アルカリ金属化合物やアルカリ土類金属化合物があり、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウムや炭酸水素カルシウム等が挙げられる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
つぎに実施例にもとづいて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
【実施例１】
ジエタノールアミン緩衝液の調製
ジエタノールアミン（ＤＥＡ）（和光純薬工業株式会社製）２０．８２７ｇを精製水に溶解させ、６．６ｍｍｏｌのＮＡＤＨ、１．３ｇのデキストラン、０．７ｇのＢＳＡ、および０．５ｇのＮａＮ3 を添加し、炭酸水素ナトリウムを０ｇ、４．２ｇ、８．４ｇ、１２．６ｇ、１６．８ｇ、あるいは２１．０ｇを添加し、３０℃でｐＨを計測しながら、１ＮのＨＣｌを加え、ｐＨを９．２に合わせ、精製水で全量を１，０００ｍｌとし、それぞれ０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）を調製した。
【００３１】
【実施例２】
（１）３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性測定
反応液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭＮＡＤ（興人化学社製）、０．０２５％ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ；同仁化学社製）、５Ｕ／ｍｌジアホラーゼ（旭化成工業社製）、０．４％トリトンＸー１００（米山化学社製）含む溶液）０．５ｍｌに、０．０２ｍｌの酵素液を添加し、３７℃で予備加温した後、基質溶液（メタノールで溶解した２０ｍＭアンドロステロン（シグマ社製）溶液）を０．０２５ｍｌ添加し、３７℃、５分間、反応させた後、反応停止液（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製））２．５ｍｌを添加し、５５０ｎｍの吸光度を測定し、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
（２）３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる胆汁酸測定
Ｒ１溶液（３０ｍＭグリシン、１．３５ｍＭチオ−ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、０．８％塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ４．０溶液）１．３０ｍｌに、胆汁酸溶液０．０１５ｍｌを添加し、３７℃、５分間反応させた後、Ｒ２溶液（２００ｍＭジエタノールアミン、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．２溶液）０．６５ｍｌを添加し、３７℃、２分後から、レートアッセイ法にて、吸光度変化量を測定した。
【００３２】
同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液（シグマ社製グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）０．０９４ｇを１００ｍｌに溶解し、その後４０倍希釈し５０μＭに調製した溶液）を測定し、既知濃度の胆汁酸溶液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出した。
上記の方法にて、Ｒ２溶液を、４℃にて開封保存し、酵素添加後、０（初期値）、７、１４、２１、２６、５１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性、Ｒ２溶液のｐＨ及び各種基質に対する感度を測定した。基質は、ＧＣＤＣＡ（シグマ社製）、セロノルム（第１化学薬品社製）、パソノルムＬ（第１化学薬品社製）及びパソノルムＨ（第１化学薬品社製）を使用した。
【００３３】
結果を、表１〜表６に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】
表１〜表６により、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期値に対する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、多いに向上していることが明らかとなった。かつ炭酸水素ナトリウムの適宜な添加量によって、炭酸水素ナトリウムの無添加の系の開封後のｐＨの変化に比べて、ｐＨの変動を抑制して安定化効果を奏したものであった。
【００４１】
【実施例３】
３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定
Ｒ２溶液（１００ｍＭＢｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．０の溶液）に炭酸水素ナトリウムを０〜５０ｍＭの濃度で添加し、４℃にて開封保存し、添加後、０（初期値）、２１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性及び各種基質に対する感度を実施例２と同様に測定した。結果を、表７に示した。
【００４２】
【表７】
【００４３】
表７により、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液においても、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期値に対する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、多いに向上していることが明らかとなった。
【００４４】
【実施例４】
開封保存ジエタノールアミン緩衝液溶液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
溶液（２００ｍＭジエタノールアミンに炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０３）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１１）、５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０８）、６００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）または８００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、保存後１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。
【００４５】
アルカリフォスファターゼの活性測定は、開封保存した当該溶液１ｍｌにアルカリフォスファターゼ基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを１５ｍＭの濃度で添加し、次いでアルカリフォスファターゼ含有市販の管理血清であるセラクリアＮ（日本商事社製）２０μｌを添加した。３７℃、１分後から、レートアッセイ法にて、活性を算出した。結果を、表８に示した。
【００４６】
【表８】
【００４７】
表８から、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らかとなった。
【００４８】
【実施例５】
開封保存したグッド緩衝液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
グッド緩衝液の１つとして、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。即ち、溶液（１００ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液に炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）、１００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８１）、３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８３）、４００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）または５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。アルカリフォスファターゼの活性測定は実施例４と同様に実施した。結果を、表９に示した。
【００４９】
【表９】
【００５０】
表９から、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らかとなった。
【００５１】
【実施例６】
開封保存した生化学用緩衝液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
生化学用緩衝液の１つとして、塩酸−トリスアミノメタン系緩衝液を用いた。即ち、溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ（シグマ社製、商品名Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ）緩衝液に炭酸水素カリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．２０）または３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．２０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。アルカリフォスファターゼの活性測定は実施例４と同様に実施した。
【００５２】
その結果、１００ｍＭ炭酸水素カリウム含有Ｔｒｉｓ緩衝液におけるｐＨおよびアルカリフォスファターゼの活性はそれぞれｐＨ９．２０および１１０Ｕ／Ｌ（初期値、１１１Ｕ／Ｌ）であったが、炭酸水素カリウム不含Ｔｒｉｓ緩衝液におけるｐＨおよびアルカリフォスファターゼの活性はそれぞれｐＨ８．９０および９５Ｕ／Ｌ（初期値、１１０Ｕ／Ｌ）であった。
【００５３】
従って、炭酸水素カリウムを有効成分として含む緩衝液組成物はｐＨの低下を抑制し、さらにアルカリフォスファターゼの活性が再現性良く測定できることが明らかとなった。
【００５４】
【発明の効果】
アルカリ域緩衝液を用いる組成物は、上記した３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の活性測定やアルカリフォスファターゼ活性測定等の他に、ＮＡＤＨ等を用いたデヒドロゲナーゼの活性測定またはその基質の測定、デヒドロゲナーゼを用いた可逆反応に基づく酵素サイクリングによる酵素活性測定やその基質の測定、キサンチンデヒドロゲナーゼ活性測定等に利用され、炭酸化合物を含有せしめたアルカリ域緩衝液を用いる組成物は上記の酵素的測定において再現性の良好な測定結果を与えることができ、さらに緩衝液の濃度の低減化という効能を有するとともに、開封後の組成物のｐＨを安定に維持、調整し得る。さらに、本発明の緩衝液組成物は、酵素的測定用の媒体として好適に用いられる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成、およびｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のｐＨ変動の抑制方法に関する。好ましくは酵素的測定用の組成において、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成に関するものであり、生化学分野における基本的に重要な緩衝液組成であり、被検液、例えば、生体成分における基質の測定や酵素活性の測定に重要な技術である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、緩衝液は、生化学反応、例えば酵素的な基質の測定、基質を用いる酵素活性測定や酵素をマーカーとした酵素活性測定に基づく免疫測定法などにおいて、反応媒体のｐＨの変動を押さえるべく開発され、有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液または生化学用緩衝液などの多くの緩衝液が開発されてきた。
【０００３】
有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等が挙げられる。
また、グッド緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＥＰＰＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、別名ＨＥＰＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ、Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（３−Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等が挙げられる。
【０００４】
さらに、上記以外の緩衝能を有する生化学用緩衝液としては、例えば、クエン酸−第２リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−第２リン酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−ホウ砂系、第１リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩化ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パンチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルベイン緩衝液、ハスチング−センドロイ緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、グッド緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、トリス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナール−酢酸塩緩衝液などが挙げられ、何らこれらに限定されるものではない。
【０００５】
従来の生化学検査、例えば、アルカリフォスファターゼの活性測定は、アルカリ域緩衝液としてジエタノールアミン緩衝液や２−エチルアミノエタノール緩衝液等を用いて行われてきたが（臨床化学１９（２）、ｐ２１３−２２７、１９９０年）、ｐＨの僅かな変化でも、酵素の活性値が大きく変動することが知られてきた。
【０００６】
また、アルカリ域緩衝液を開封保存した後当該アルカリ域緩衝液を用いて、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定やアルカリフォスファターゼ活性測定を行うと、胆汁酸測定値やアルカリフォスファターゼ活性値の変動が見られ、再現性に乏しい問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、緩衝液を開封保存した場合、原因は不明であるが、緩衝液のｐＨが変動し、一定のｐＨを得ることが非常に困難である。特に、アルカリ域緩衝液を開封保存した場合は、ｐＨの低下が起こり、例えば、酵素活性を測定する場合は、酵素の反応性の劣化が生じる欠点があった。従って、ｐＨ８〜１１のアルカリ緩衝液にて、例えば生体成分である基質の酵素的測定や酵素活性測定などの酵素反応を伴う酵素的測定のための酵素活性の劣化を生じさせない緩衝液の開発が本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムがｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液を用い、アルカリ域にて酵素的反応を伴う組成の酵素の反応性を安定化させること見いだした。
即ち、本発明は、アルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素の一つである３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、通常の０．２Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて胆汁酸測定を行うと、開封保存した当該緩衝液で、経時的に測定値の低下が観察されたことから、種々の検討を加えた結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを当該緩衝液に含有せしめると、胆汁酸の測定値の低下が非常に改善され、再現性の良好な測定結果が得られることを見いだした。
【０００９】
同様に、アルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素の例示としてのアルカリフォスファターゼの活性測定を０．２Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて、活性測定を行うと、開封保存した当該緩衝液で、経時的に測定値の低下が観察されたが、上記したような炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを当該緩衝液に含有せしめると、アルカリフォスファターゼの活性値の低下が劇的に軽減されることを見いだした。
【００１０】
さらに、本発明においてｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液を用いる組成において、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等の炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を用いることにより再現性良く測定し得るもので、この炭酸水素イオンを放出せしめるカルシウムやマグネシウムの炭酸化合物も同様に良好な結果を示すことを見い出し、その結果、従来の炭酸水素イオンを含有していないアルカリ域緩衝液組成に比べて開封条件下において格段に酵素的測定における再現性が向上したことを見出した。
【００１１】
本発明は上記の知見により完成されたものであって、ｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成、およびｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のｐＨ変動の抑制方法であって、例えば３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の安定的測定やアルカリフォスファターゼの活性の安定的測定などの酵素的測定用の緩衝液組成に用いることを可能となし、本発明の炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめた緩衝液組成は、酵素反応を伴う基質または酵素活性の測定のための酵素的測定用の組成として好適に使用できることを見出した。
【００１２】
本発明のアルカリ域緩衝液（但し、炭酸系緩衝液を除く）を含有する組成としては、ｐＨ領域としてｐＨが８〜１１の範囲で大いに有効であり、その緩衝液としては、例えば、ｐＨ８〜１１の間に適宜に調整できる有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液やその他に、クエン酸−第２リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−第２リン酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−ホウ砂系、第１リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩化ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パンチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルベイン緩衝液、ハスチング−センドロイ緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、トリス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナール−酢酸塩緩衝液などの生化学用緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝液以外であっても、ｐＨ８〜１１のアルカリ域にて緩衝能を有するものであれば何ら限定されない。
【００１３】
また、有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等が挙げられる。
さらに、グッド緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＥＰＰＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、別名ＨＥＰＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（３−Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等が挙げられる。
【００１４】
なお、本発明のアルカリ域緩衝液においては炭酸系緩衝液を除くものであり、この炭酸系緩衝液としては、例えば炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの緩衝液またはそれらのカリウム塩による緩衝液などであり、炭酸塩に基づく緩衝液を意味し、本発明におけるアルカリ域緩衝液とは別途に炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とするｐＨ変動抑制剤として含有せしめるものと区別する目的のものである。
【００１５】
アルカリ域緩衝液を用いる組成として、当該アルカリ域緩衝液として、有機アミン系緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜２Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、最適には２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度に調整した水性媒体として用いれば良い。また、好適な水性媒体としては水、具体的には精製水が挙げられ、適宜に補酵素、可溶性塩類、界面活性剤、安定化剤や防腐剤などを含有してもよい。
【００１６】
また、アルカリ域緩衝液を含有する組成として、当該アルカリ域緩衝液として、グッド緩衝液または生化学用緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、最適には２０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度に調整して用いれば良い。
さらに本発明における、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素としては、上記の緩衝液のｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであれば何ら限定されるものでなく、例えば酵素の至適ｐＨや安定ｐＨが酸性域にあっても目的の酵素作用をｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであってもよく、好ましくは酵素の至適ｐＨや安定ｐＨのいずれか、または両方がアルカリ域にあって目的の酵素作用をｐＨ８〜１１のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得るものであり、好適には３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１１αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１６αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２１αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどのステロイドデヒドロゲナーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素の至適ｐＨや安定ｐＨのいずれか、または両方がアルカリ域にある酵素が挙げられ、さらに例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（基質：エタノール、補酵素：ＮＡＤ、緩衝液ｐＨ８．５〜８．８）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（基質：乳酸、補酵素：ＮＡＤ、緩衝液ｐＨ９〜１０）、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（基質：ガラクトース、補酵素：ＮＡＤ、至適ｐＨ８〜９）が挙げられる。
【００１７】
また当該酵素としては、例えば胆汁酸である基質の測定の目的としての酵素である３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用形態でもよく、また例えばアルカリフォスファターゼを生体内酵素活性測定の目的とする使用形態でもよく、さらに例えばアルカリフォスファターゼを免疫測定における酵素マーカーとして酵素活性測定の目的とする使用形態でもよいものである。
【００１８】
従ってまた、本発明の緩衝液組成に含有される酵素の量としては、基質の測定の目的、生体内酵素活性測定の目的、免疫測定における酵素マーカーの酵素活性測定の目的によって、適宜異なるものである。
基質の測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては、例えば、緩衝液組成中０．００１〜２００単位、好ましくは０．０５〜１００単位であり、また生体内酵素活性測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては、生体内酵素の量に依存するものであるが、例えば緩衝液組成中０．０００１〜２００単位、好ましくは０．０１〜１００単位であり、免疫測定における酵素マーカーの酵素活性測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量としては極めて微量であり、例えば緩衝液組成中０．０００１ｍ単位〜１単位、好ましくは０．００１ｍ単位〜０．５単位である。
【００１９】
以下に、本発明について詳しく説明するが、特に限定されるものではない。
炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物として、例えば炭酸水素ナトリウムをアルカリ域緩衝液、例えばジエタノールアミン緩衝液に加えて調整するに当たっては、下記の如く行えば良い。即ち、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．２）の調製は、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）（和光純薬工業社製）２０．８２７ｇを精製水に溶解させる。次いで、適宜にデヒドロゲナーゼなどの酵素的測定のための補酵素、安定化剤や防腐剤、例えば６．６ｍｍｏｌのＮＡＤＨ、１．３ｇのデキストラン、０．７ｇのＢＳＡ（牛血清アルブミン）、および０．５ｇのＮａＮ3 を添加し、さらに炭酸水素ナトリウムを０ｇ、４．２ｇ、８．４ｇ、１２．６ｇ、１６．８ｇ、あるいは２１．０ｇを添加し、３０℃でｐＨを計測しながら、１ＮのＨＣｌあるいは１ＮのＮａＯＨを加え、ｐＨを９．２に合わせ、精製水で全量を１，０００ｍｌとし、それぞれ０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）を調製する。
【００２０】
この場合、有機アミン系緩衝液の１つであるジエタノールアミン緩衝液への炭酸水素ナトリウムなどの炭酸化合物の添加濃度はモル濃度において１０ｍＭ〜１Ｍであれば良く、望ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭであれば良い。また、グッド緩衝液、例えば、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液に、同様に炭酸水素ナトリウムなどの炭酸化合物の添加濃度は１０ｍＭ〜１Ｍであり、望ましく２０ｍＭ〜５００ｍＭであれば良い。
【００２１】
このようにして作製したアルカリ域緩衝液を含有する組成物、例えば、３μｌ〜５ｍｌの適宜な量に、生体成分における基質の測定用の酵素、例えばＮＡＤやＮＡＤＰまたはそれらの還元型であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤやチオ−ＮＡＤＰまたはそれらの還元型であるチオ−ＮＡＤＨやチオ−ＮＡＤＰＨなどの補酵素を利用する種々のデヒドロゲナーゼ、好適には３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどの酵素を０．１〜１００Ｕ／ｍｌ添加し、開封保存しても、その後に例えば２０〜４０℃にてレートアッセイやエンドポイントアッセイを行なっても、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の安定的な測定が可能となる。
【００２２】
例えば、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性測定または基質の測定は以下のように行えばよい。反応液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭＮＡＤ（興人化学社製）、０．０２５％ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ；同仁化学社製）、５Ｕ／ｍｌジアホラーゼ（旭化成工業社製）、０．４％トリトンＸ−１００（米山化学社製）含む溶液）０．５ｍｌに、０．０２ｍｌの酵素液を添加し、３７℃で予備加温した後、基質溶液（メタノールで溶解した２０ｍＭアンドロステロン（シグマ社製）溶液）を０．０２５ｍｌ添加し、３７℃、５分間、反応させた後、反応停止液（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製））２．５ｍｌを添加し、反応において生成された色素を５５０ｎｍ付近の吸光度にて測定し、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性または基質であるアンドロステロンを測定できる。
【００２３】
さらに、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の例示としては、Ｒ１溶液（３０ｍＭグリシン、１．３５ｍＭチオ−ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、０．８％塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ１００および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ４．０溶液）１．３０ｍｌに、胆汁酸溶液０．０１５ｍｌを添加し、３７℃、５分間反応させた後、Ｒ２溶液（２００ｍＭジエタノールアミン、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．２溶液）０．６５ｍｌを添加し、３７℃、２分後から、レートアッセイ法にて、デヒドロゲナーゼを用いた可逆反応に基づく酵素サイクリングの反応にて生成されたチオ−ＮＡＤＨの量を４００ｎｍ付近の吸光度にて測定するか、反応にて減少したＮＡＤＨの量を３４０ｎｍ付近の吸光度にて測定などの吸光度変化量を測定すれば良い。
【００２４】
同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液（シグマ社製グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）０．０９４ｇを１００ｍｌに溶解し、その後４０倍希釈し５０μＭに調製した溶液）を測定し、既知濃度の胆汁酸溶液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出することができる。
上記の方法にて、Ｒ２溶液を、４℃にて開封保存し、酵素添加後、０（初期値）、７、１４、２１、２６、５１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性、Ｒ２溶液のｐＨ及び各種基質に対する感度を測定する。基質は、ＧＣＤＣＡ（シグマ社製）、セロノルム（第一化学薬品工業社製）、パソノルムＬ（第一化学薬品工業社製）及びパソノルムＨ（第一化学薬品工業社製）等を用いればよい。
【００２５】
また、同様にアルカリ域緩衝液としてＢｉｃｉｎｅを用いる場合は以下の様に行えば良い。即ち、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定は、Ｒ２溶液（１００ｍＭＢｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．０の溶液）に炭酸水素ナトリウムを０〜５０ｍＭ添加し、４℃にて開封保存し、添加後、０（初期値）、２１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性及び各種基質に対する感度を測定する。
【００２６】
また、ジエタノールアミン緩衝液でのアルカリフォスファターゼの活性測定は、例えば、以下の様に行う。
溶液（２００ｍＭジエタノールアミンに炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０３）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１１）、５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０８）、６００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）または８００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、保存後１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定する。アルカリフォスファターゼの活性測定は、開封保存した当該溶液１ｍｌにアルカリフォスファターゼ基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを１５ｍＭの濃度で添加し、次いでアルカリフォスファターゼ含有市販の管理血清であるセラクリアＮ（日本商事社製）２０μｌを添加する。３７℃、１分後から、レートアッセイ法にて、活性を算出する。
【００２７】
また、アルカリ域緩衝液として、グッド緩衝液、例えばＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いる場合は以下の様に行えば良い。溶液（１００ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液に炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）、１００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８１）、３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８３）、４００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）または５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を前述したように測定する。
【００２８】
炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物としては、アルカリ金属化合物やアルカリ土類金属化合物があり、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウムや炭酸水素カルシウム等が挙げられる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
つぎに実施例にもとづいて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
【実施例１】
ジエタノールアミン緩衝液の調製
ジエタノールアミン（ＤＥＡ）（和光純薬工業株式会社製）２０．８２７ｇを精製水に溶解させ、６．６ｍｍｏｌのＮＡＤＨ、１．３ｇのデキストラン、０．７ｇのＢＳＡ、および０．５ｇのＮａＮ3 を添加し、炭酸水素ナトリウムを０ｇ、４．２ｇ、８．４ｇ、１２．６ｇ、１６．８ｇ、あるいは２１．０ｇを添加し、３０℃でｐＨを計測しながら、１ＮのＨＣｌを加え、ｐＨを９．２に合わせ、精製水で全量を１，０００ｍｌとし、それぞれ０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、１５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）、２５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム添加０．２ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ９．２０）を調製した。
【００３１】
【実施例２】
（１）３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性測定
反応液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭＮＡＤ（興人化学社製）、０．０２５％ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ；同仁化学社製）、５Ｕ／ｍｌジアホラーゼ（旭化成工業社製）、０．４％トリトンＸー１００（米山化学社製）含む溶液）０．５ｍｌに、０．０２ｍｌの酵素液を添加し、３７℃で予備加温した後、基質溶液（メタノールで溶解した２０ｍＭアンドロステロン（シグマ社製）溶液）を０．０２５ｍｌ添加し、３７℃、５分間、反応させた後、反応停止液（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製））２．５ｍｌを添加し、５５０ｎｍの吸光度を測定し、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
（２）３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる胆汁酸測定
Ｒ１溶液（３０ｍＭグリシン、１．３５ｍＭチオ−ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、０．８％塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ４．０溶液）１．３０ｍｌに、胆汁酸溶液０．０１５ｍｌを添加し、３７℃、５分間反応させた後、Ｒ２溶液（２００ｍＭジエタノールアミン、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．２溶液）０．６５ｍｌを添加し、３７℃、２分後から、レートアッセイ法にて、吸光度変化量を測定した。
【００３２】
同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液（シグマ社製グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）０．０９４ｇを１００ｍｌに溶解し、その後４０倍希釈し５０μＭに調製した溶液）を測定し、既知濃度の胆汁酸溶液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出した。
上記の方法にて、Ｒ２溶液を、４℃にて開封保存し、酵素添加後、０（初期値）、７、１４、２１、２６、５１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性、Ｒ２溶液のｐＨ及び各種基質に対する感度を測定した。基質は、ＧＣＤＣＡ（シグマ社製）、セロノルム（第１化学薬品社製）、パソノルムＬ（第１化学薬品社製）及びパソノルムＨ（第１化学薬品社製）を使用した。
【００３３】
結果を、表１〜表６に示した。
【００３４】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
表１〜表６により、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期値に対する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、多いに向上していることが明らかとなった。かつ炭酸水素ナトリウムの適宜な添加量によって、炭酸水素ナトリウムの無添加の系の開封後のｐＨの変化に比べて、ｐＨの変動を抑制して安定化効果を奏したものであった。
【００４１】
【実施例３】
３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定
Ｒ２溶液（１００ｍＭＢｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液、６．６ｍＭＮＡＤＨ、９．５Ｕ／ｍｌ３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製）および０．０５％ＮａＮ3 を含むｐＨ９．０の溶液）に炭酸水素ナトリウムを０〜５０ｍＭの濃度で添加し、４℃にて開封保存し、添加後、０（初期値）、２１日目で、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性及び各種基質に対する感度を実施例２と同様に測定した。結果を、表７に示した。
【００４２】
【表７】
表７により、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液においても、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期値に対する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、多いに向上していることが明らかとなった。
【００４４】
【実施例４】
開封保存ジエタノールアミン緩衝液溶液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
溶液（２００ｍＭジエタノールアミンに炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０３）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１１）、５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．０８）、６００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）または８００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ１０．１０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、保存後１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。
【００４５】
アルカリフォスファターゼの活性測定は、開封保存した当該溶液１ｍｌにアルカリフォスファターゼ基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを１５ｍＭの濃度で添加し、次いでアルカリフォスファターゼ含有市販の管理血清であるセラクリアＮ（日本商事社製）２０μｌを添加した。３７℃、１分後から、レートアッセイ法にて、活性を算出した。結果を、表８に示した。
【００４６】
【表８】
表８から、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らかとなった。
【００４８】
【実施例５】
開封保存したグッド緩衝液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
グッド緩衝液の１つとして、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。即ち、溶液（１００ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）緩衝液に炭酸水素ナトリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）、１００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）、２００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８１）、３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８３）、４００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８２）または５００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．８０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。アルカリフォスファターゼの活性測定は実施例４と同様に実施した。結果を、表９に示した。
【００４９】
【表９】
表９から、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らかとなった。
【００５１】
【実施例６】
開封保存した生化学用緩衝液におけるアルカリフォスファターゼの活性測定
生化学用緩衝液の１つとして、塩酸−トリスアミノメタン系緩衝液を用いた。即ち、溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ（シグマ社製、商品名Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ）緩衝液に炭酸水素カリウムを０ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．２０）または３００ｍＭ（最終的な溶液のｐＨ９．２０）を含有せしめた溶液）を４℃にて開封保存し、１４日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。アルカリフォスファターゼの活性測定は実施例４と同様に実施した。
【００５２】
その結果、１００ｍＭ炭酸水素カリウム含有Ｔｒｉｓ緩衝液におけるｐＨおよびアルカリフォスファターゼの活性はそれぞれｐＨ９．２０および１１０Ｕ／Ｌ（初期値、１１１Ｕ／Ｌ）であったが、炭酸水素カリウム不含Ｔｒｉｓ緩衝液におけるｐＨおよびアルカリフォスファターゼの活性はそれぞれｐＨ８．９０および９５Ｕ／Ｌ（初期値、１１０Ｕ／Ｌ）であった。
【００５３】
従って、炭酸水素カリウムを有効成分として含む緩衝液組成物はｐＨの低下を抑制し、さらにアルカリフォスファターゼの活性が再現性良く測定できることが明らかとなった。
【００５４】
【発明の効果】
アルカリ域緩衝液を用いる組成物は、上記した３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の活性測定やアルカリフォスファターゼ活性測定等の他に、ＮＡＤＨ等を用いたデヒドロゲナーゼの活性測定またはその基質の測定、デヒドロゲナーゼを用いた可逆反応に基づく酵素サイクリングによる酵素活性測定やその基質の測定、キサンチンデヒドロゲナーゼ活性測定等に利用され、炭酸化合物を含有せしめたアルカリ域緩衝液を用いる組成物は上記の酵素的測定において再現性の良好な測定結果を与えることができ、さらに緩衝液の濃度の低減化という効能を有するとともに、開封後の組成物のｐＨを安定に維持、調整し得る。さらに、本発明の緩衝液組成物は、酵素的測定用の媒体として好適に用いられる。
Claims (8)
- 至適ｐＨをアルカリ域に有する酵素を用いて基質の測定又は該酵素活性を測定するために用いられるアルカリ域緩衝液組成物であって、
２０ｍＭ〜２Ｍ濃度のジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液、及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミン緩衝液からなる群から選ばれた有機アミン系緩衝液、或いは２０ｍＭ〜１Ｍ濃度のＢｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、及びＣＨＥＳ緩衝液からなる群から選ばれたグッド緩衝液に１０ｍＭ〜１Ｍ濃度の炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを加えてなるｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液組成物。 - 至適ｐＨをアルカリ域に有する酵素が、デヒドロゲナーゼまたはアルカリホスファターゼである請求項１記載の緩衝液組成物。
- デヒドロゲナーゼが、基質測定用試薬に用いられるデヒドロゲナーゼであり、還元型ＮＡＤ（Ｐ）と共存してなる請求項２記載の緩衝液組成物。
- デヒドロゲナーゼが、ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項３記載の緩衝液組成物。
- 至適ｐＨをアルカリ域に有する酵素を用いて基質の測定又は該酵素活性を測定するために用いられるｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液組成物のｐＨ変動を抑制する方法であって、
２０ｍＭ〜２Ｍ濃度のジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液、及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミン緩衝液からなる群から選ばれた有機アミン系緩衝液、或いは２０ｍＭ〜１Ｍ濃度のＢｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、及びＣＨＥＳ緩衝液からなる群から選ばれたグッド緩衝液に、１０ｍＭ〜１Ｍ濃度の炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを加えることにより、該緩衝液組成物のｐＨ変動を抑制する方法。 - 至適ｐＨをアルカリ域に有する酵素が、デヒドロゲナーゼまたはアルカリホスファターゼである請求項５記載の方法。
- デヒドロゲナーゼが、基質測定用試薬に用いられるデヒドロゲナーゼであり、還元型ＮＡＤ（Ｐ）と共存してなる請求項６記載の方法。
- デヒドロゲナーゼが、ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項７記載の方法。
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