JP3225647B2 - 不飽和鉄結合能の測定試薬及び測定方法 - Google Patents
不飽和鉄結合能の測定試薬及び測定方法Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清等の不飽和鉄結合
能の測定試薬および測定方法に関する。
能の測定試薬および測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鉄は、ヒト成人の生体内では約３分の２
が赤血球内の血色素鉄として存在し、３分の１弱が貯蔵
鉄として肝臓、脾臓などの臓器中にありその総量は約４
０００ｍｇである。血清内の鉄はβ1 −グロブリンに属
するトランスフェリンと結合している。このトランスフ
ェリンは通常鉄で飽和されておらず、なお鉄を加えれば
これと結合する余地を残しているのが普通である。
が赤血球内の血色素鉄として存在し、３分の１弱が貯蔵
鉄として肝臓、脾臓などの臓器中にありその総量は約４
０００ｍｇである。血清内の鉄はβ1 −グロブリンに属
するトランスフェリンと結合している。このトランスフ
ェリンは通常鉄で飽和されておらず、なお鉄を加えれば
これと結合する余地を残しているのが普通である。
【０００３】血清中の鉄並びにトランスフェリンについ
ての臨床上の指標として、血清の有する鉄結合能全体か
らすでに血清中でトランスフェリンと結合している鉄の
分を差し引いて得られる血清の鉄結合能の余地の分を血
清不飽和鉄結合能（unsaturated iron binding capacit
y:以下ＵＩＢＣと称する）という。
ての臨床上の指標として、血清の有する鉄結合能全体か
らすでに血清中でトランスフェリンと結合している鉄の
分を差し引いて得られる血清の鉄結合能の余地の分を血
清不飽和鉄結合能（unsaturated iron binding capacit
y:以下ＵＩＢＣと称する）という。
【０００４】ＵＩＢＣは、赤血球の生産や崩壊と密接な
関係を有し、造血機能を反映するので、これらの測定は
貧血疾患の鑑別診断に不可欠なものである。このうちＵ
ＩＢＣは、鉄欠乏性貧血および慢性出血性貧血では上昇
が、再生不良性貧血では低下が認められる。
関係を有し、造血機能を反映するので、これらの測定は
貧血疾患の鑑別診断に不可欠なものである。このうちＵ
ＩＢＣは、鉄欠乏性貧血および慢性出血性貧血では上昇
が、再生不良性貧血では低下が認められる。
【０００５】ＵＩＢＣの測定で現在広く用いられている
方法は、検体血清に塩基性緩衝液および３価の鉄を加
え、検体中のトランスフェリンに対して過剰のため遊離
のままの３価の鉄をアスコルビン酸を還元剤に用いて２
価の鉄として、バソフェナンスロリンや２−ニトロソ−
５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェ
ノール等の鉄発色剤で発色させて吸光度を測定するとい
うものである。
方法は、検体血清に塩基性緩衝液および３価の鉄を加
え、検体中のトランスフェリンに対して過剰のため遊離
のままの３価の鉄をアスコルビン酸を還元剤に用いて２
価の鉄として、バソフェナンスロリンや２−ニトロソ−
５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェ
ノール等の鉄発色剤で発色させて吸光度を測定するとい
うものである。
【０００６】上記の測定方法は、クロマトグラフィーを
原理とする測定方法と異なり、遠心分離操作や除蛋白操
作が不要なので操作が簡便であり、また測定の自動化も
可能である。しかし、残念ながら還元剤のアスコルビン
酸は、水溶液中では安定性を欠き、とくに塩基性の緩衝
液中では不安定である。
原理とする測定方法と異なり、遠心分離操作や除蛋白操
作が不要なので操作が簡便であり、また測定の自動化も
可能である。しかし、残念ながら還元剤のアスコルビン
酸は、水溶液中では安定性を欠き、とくに塩基性の緩衝
液中では不安定である。
【０００７】今日の臨床検査の分野では、いっそうの作
業の簡便化が求められており、これへの対応として、各
検査項目について現在凍結乾燥品の試薬から液状試薬へ
の切り替えが進行中である。ところが、上記のＵＩＢＣ
の測定試薬では、アスコルビン酸が不安定であることか
ら中長期の保存が不可能であり、製品形態を液状試薬と
することは極めて困難である。
業の簡便化が求められており、これへの対応として、各
検査項目について現在凍結乾燥品の試薬から液状試薬へ
の切り替えが進行中である。ところが、上記のＵＩＢＣ
の測定試薬では、アスコルビン酸が不安定であることか
ら中長期の保存が不可能であり、製品形態を液状試薬と
することは極めて困難である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、液状
試薬化に耐えられる保存安定性の高いＵＩＢＣの測定試
薬及び測定方法を提供することである。
試薬化に耐えられる保存安定性の高いＵＩＢＣの測定試
薬及び測定方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために鋭意努力を重ねた結果、酸化型β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（以下β−ＮＡＤと称
する）または酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下β−ＮＡＤＰと称する）、それら
を補酵素とする脱水素酵素及び脱水素酵素の基質をアス
コルビン酸に置換することでＵＩＢＣの測定系の保存安
定性が著しく向上することを見出だし、本発明を完成し
た。
決するために鋭意努力を重ねた結果、酸化型β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（以下β−ＮＡＤと称
する）または酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下β−ＮＡＤＰと称する）、それら
を補酵素とする脱水素酵素及び脱水素酵素の基質をアス
コルビン酸に置換することでＵＩＢＣの測定系の保存安
定性が著しく向上することを見出だし、本発明を完成し
た。
【００１０】すなわち本発明は、(i) ３価の鉄を含有す
る塩基性緩衝液、(ii)酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β
−ＮＡＤＰ(iii) 酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−Ｎ
ＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素(iv)上記脱水素酵素の
基質および(v) ２価の鉄の発色剤からなる不飽和鉄結合
能の測定試薬
る塩基性緩衝液、(ii)酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β
−ＮＡＤＰ(iii) 酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−Ｎ
ＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素(iv)上記脱水素酵素の
基質および(v) ２価の鉄の発色剤からなる不飽和鉄結合
能の測定試薬
【００１１】ならびに試料検体に、その試料検体中の遊
離トランスフェリンを飽和させるに充分かつ過剰な既知
量の３価の鉄を加え、それからトランスフェリンと結合
していない過剰鉄を２価の鉄として、それを発色剤によ
り発色させて測定することによる不飽和鉄結合能の測定
方法において、該過剰鉄を３価から２価とするために酸
化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−ＮＡＤＰ、それらを補
酵素とする脱水素酵素およびその脱水素酵素の基質を用
いることを特徴とする不飽和鉄結合能の測定方法を要旨
とするものである。
離トランスフェリンを飽和させるに充分かつ過剰な既知
量の３価の鉄を加え、それからトランスフェリンと結合
していない過剰鉄を２価の鉄として、それを発色剤によ
り発色させて測定することによる不飽和鉄結合能の測定
方法において、該過剰鉄を３価から２価とするために酸
化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−ＮＡＤＰ、それらを補
酵素とする脱水素酵素およびその脱水素酵素の基質を用
いることを特徴とする不飽和鉄結合能の測定方法を要旨
とするものである。
【００１２】以下本発明を詳細に説明する。
【００１３】(i) の３価の鉄を含有する塩基性緩衝液
は、ｐＨが７．５〜９．５、好ましくは８．５〜９．０
である。緩衝剤は、トリスバッファーのほか、上記ｐＨ
の範囲で緩衝性を有するものを用いる。
は、ｐＨが７．５〜９．５、好ましくは８．５〜９．０
である。緩衝剤は、トリスバッファーのほか、上記ｐＨ
の範囲で緩衝性を有するものを用いる。
【００１４】(iii) の酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β
−ＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素とその基質を例示
すれば以下のようなものである。酵素の種類と反応のス
キームを合わせて示す。
−ＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素とその基質を例示
すれば以下のようなものである。酵素の種類と反応のス
キームを合わせて示す。
【００１５】１．ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ
１，２，１，４６） ホルムアルデヒド＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ＨＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
１，２，１，４６） ホルムアルデヒド＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ＨＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【００１６】２．グルコース脱水素酵素（ＥＣ１，１，
１，４７） β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → Ｄ−グルコノ−δ− ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
１，４７） β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → Ｄ−グルコノ−δ− ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
【００１７】３．グルコース−６−リン酸脱水素酵素
（ＥＣ１，１，１，４９） Ｄ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → Ｄ−グルコノ−δ −ラクトン−６−リン酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
（ＥＣ１，１，１，４９） Ｄ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → Ｄ−グルコノ−δ −ラクトン−６−リン酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
【００１８】４．グルタミン酸脱水素酵素（ＥＣ１，
４，１，４） Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ２−オキソグルタール酸 ＮＨ4 + ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
４，１，４） Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ２−オキソグルタール酸 ＮＨ4 + ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+
【００１９】５．グリセロール脱水素酵素（ＥＣ１，
１，１，６） グリセロール＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ジヒドロキシアセトン ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
１，１，６） グリセロール＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ジヒドロキシアセトン ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【００２０】６．グリセロール−３−リン酸脱水素酵素
（ＥＣ１，１，１，８） Ｓｎ−グリセロール−３−リン酸＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ジヒドロキシ アセトンリン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
（ＥＣ１，１，１，８） Ｓｎ−グリセロール−３−リン酸＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → ジヒドロキシ アセトンリン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【００２１】７．アルコール脱水素酵素（ＥＣ１，１，
１，１） アルコール＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → アルデヒド＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
１，１） アルコール＋ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ → アルデヒド＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【００２２】上記の脱水素酵素のうちとくに好ましいも
のは、７．のアルコール脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，
１）のうち、エタノールに作用するアルコール脱水素酵
素である。
のは、７．のアルコール脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，
１）のうち、エタノールに作用するアルコール脱水素酵
素である。
【００２３】(iv)の２価の鉄の発色剤は、とくに限定は
ないが、例示すれば、バソフェナンスロリン、２−ニト
ロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミ
ノ）フェノール、トリピリジルトリアジンおよびそれら
のアルカリ金属塩などがあげられる。
ないが、例示すれば、バソフェナンスロリン、２−ニト
ロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミ
ノ）フェノール、トリピリジルトリアジンおよびそれら
のアルカリ金属塩などがあげられる。
【００２４】(i) ３価の鉄を含有する塩基性緩衝液およ
び(iii) 酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−ＮＡＤＰを
補酵素とする脱水素酵素は１つの液体として調製でき
る。ならびに(ii)酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−Ｎ
ＡＤＰ、(iv)脱水素酵素の基質および(v) ２価の鉄の発
色剤もまた１つの液体として調製できる。
び(iii) 酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−ＮＡＤＰを
補酵素とする脱水素酵素は１つの液体として調製でき
る。ならびに(ii)酸化型β−ＮＡＤまたは酸化型β−Ｎ
ＡＤＰ、(iv)脱水素酵素の基質および(v) ２価の鉄の発
色剤もまた１つの液体として調製できる。
【００２５】本発明の測定試薬を用いる際には、まず既
知量の３価の鉄を有する標準検体とブランク検体、また
はそれらと既知量の３価の鉄を有する検体の希釈系列と
を用いて検量線を作成し、その検量線と、実際の検体に
ついて得られる吸光度の測定値を照会して検体のＵＩＢ
Ｃ測定値を求めても良いし、標準検体とブランク検体の
吸光度から直接計算して求めても良い。。
知量の３価の鉄を有する標準検体とブランク検体、また
はそれらと既知量の３価の鉄を有する検体の希釈系列と
を用いて検量線を作成し、その検量線と、実際の検体に
ついて得られる吸光度の測定値を照会して検体のＵＩＢ
Ｃ測定値を求めても良いし、標準検体とブランク検体の
吸光度から直接計算して求めても良い。。
【００２６】本発明において検体とは一般に血清を指す
が、３価の鉄を不可逆に吸着する反応系であれば原則と
してこの測定試薬及び測定方法を有効に用いることがで
きることはいうまでもない。
が、３価の鉄を不可逆に吸着する反応系であれば原則と
してこの測定試薬及び測定方法を有効に用いることがで
きることはいうまでもない。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説
明する。無論、本発明は以下の実施例のみに限定される
ものではない。
明する。無論、本発明は以下の実施例のみに限定される
ものではない。
【００２８】実施例１ 以下の２液系の試薬を調製し、血清検体のＵＩＢＣを経
日測定した。
日測定した。
【００２９】（ａ）緩衝液 硫酸第二鉄アンモニウム９ｍｇ／ｌおよびアルコール脱
水素酵素（ベーリンガー・マンハイム山之内（株）製
Ｎｏ．１０２７２５）３００ＫＵ／ｌを含むｐＨ８．５
の０．５Ｍトリス塩酸緩衝液。
水素酵素（ベーリンガー・マンハイム山之内（株）製
Ｎｏ．１０２７２５）３００ＫＵ／ｌを含むｐＨ８．５
の０．５Ｍトリス塩酸緩衝液。
【００３０】（ｂ）呈色液 ２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）フェノール０．８ｇ／ｌ、酸化型β−ＮＡＤ
（オリエンタル酵母工業（株）製 Ｎｏ．３０８−５０
４４１）１５ｍＭおよび８％エタノールの水溶液。
ルアミノ）フェノール０．８ｇ／ｌ、酸化型β−ＮＡＤ
（オリエンタル酵母工業（株）製 Ｎｏ．３０８−５０
４４１）１５ｍＭおよび８％エタノールの水溶液。
【００３１】測定操作は次の通りである。血清２０μｌ
に緩衝液（ａ）を２３０μｌを添加し、これを３７℃で
５分間加温し、７５０ｎｍ波長で吸光度（ＥS1）を測定
する。これに呈色液（ｂ）を１２５μｌ加え、やはり５
分間加温し、７５０ｎｍ波長で吸光度（ＥS2）を測定す
る。 次に血清の代わりにブランクとしての精製水２０
μｌ、および２００μｇ／ｄｌの鉄標準液２０μｌを用
いて上記血清の場合と同様の操作で呈色液を加えた後の
吸光度を測定する。
に緩衝液（ａ）を２３０μｌを添加し、これを３７℃で
５分間加温し、７５０ｎｍ波長で吸光度（ＥS1）を測定
する。これに呈色液（ｂ）を１２５μｌ加え、やはり５
分間加温し、７５０ｎｍ波長で吸光度（ＥS2）を測定す
る。 次に血清の代わりにブランクとしての精製水２０
μｌ、および２００μｇ／ｄｌの鉄標準液２０μｌを用
いて上記血清の場合と同様の操作で呈色液を加えた後の
吸光度を測定する。
【００３２】ブランクの吸光度をＥB 、鉄標準液により
得られる吸光度をＥSTとすれば、検体血清のＵＩＢＣの
値は、次の式から導出できる。 ＵＩＢＣ（μg/dl) ＝[{ＥB −( ＥS2−0.67×ＥS1) } ／ＥST−ＥB ] ×200 ただしＥS1の係数である０．６７は、液量補正のための
ものである。
得られる吸光度をＥSTとすれば、検体血清のＵＩＢＣの
値は、次の式から導出できる。 ＵＩＢＣ（μg/dl) ＝[{ＥB −( ＥS2−0.67×ＥS1) } ／ＥST−ＥB ] ×200 ただしＥS1の係数である０．６７は、液量補正のための
ものである。
【００３３】調製された緩衝液（ａ）および呈色液
（ｂ）を２５℃で、検体血清を４℃で保存し、調製日よ
り３０日間にわたって隔日で上記操作で測定した。結果
を下の表１に示す。
（ｂ）を２５℃で、検体血清を４℃で保存し、調製日よ
り３０日間にわたって隔日で上記操作で測定した。結果
を下の表１に示す。
【００３４】表１からも明らかなように、本発明の試薬
は室温で３０日以上保存しても安定で、ほぼ正確な測定
値が得られる。
は室温で３０日以上保存しても安定で、ほぼ正確な測定
値が得られる。
【００３５】比較例１ 以下の２液系の試薬を調製し、実施例１と同じ血清検体
を用いて実施例１と同様の操作でＵＩＢＣを経日測定し
た。
を用いて実施例１と同様の操作でＵＩＢＣを経日測定し
た。
【００３６】（ａ´）緩衝液 硫酸第二鉄アンモニウム９ｍｇ／ｌを含むｐＨ８．５の
０．５Ｍトリス塩酸緩衝液。
０．５Ｍトリス塩酸緩衝液。
【００３７】（ｂ´）呈色液 ２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）フェノール０．８ｇ／ｌおよびアスコルビン
酸０．５ｇ／ｌの水溶液。
ルアミノ）フェノール０．８ｇ／ｌおよびアスコルビン
酸０．５ｇ／ｌの水溶液。
【００３８】調製された緩衝液（ａ´）および呈色液
（ｂ´）を２５℃で、検体血清を４℃で保存し、調製日
より１４日間にわたって隔日で上記操作で測定した。結
果を下の表２に示す。
（ｂ´）を２５℃で、検体血清を４℃で保存し、調製日
より１４日間にわたって隔日で上記操作で測定した。結
果を下の表２に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】上の表１からも明らかなように、比較例１
のアスコルビン酸による試薬は室温で１４日保存すると
測定能力が半減し、使用できなくなる。
のアスコルビン酸による試薬は室温で１４日保存すると
測定能力が半減し、使用できなくなる。
【００４１】
【発明の効果】本発明の測定試薬及び測定方法は保存安
定性が極めて高いため、液状試薬として用いる際、非常
に有効である。
定性が極めて高いため、液状試薬として用いる際、非常
に有効である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/90 C12Q 1/32
Claims (2)
- 【請求項１】 (i) ３価の鉄を含有する塩基性緩衝液、 (ii)酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
または酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、 (iii) 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸を補酵素とする脱水素酵素 (iv)上記脱水素酵素の基質 および(v) ２価の鉄の発色剤からなる不飽和鉄結合能の
測定試薬。 - 【請求項２】 試料検体に、その試料検体中の遊離トラ
ンスフェリンを飽和させるに充分かつ過剰な既知量の３
価の鉄を加え、それからトランスフェリンと結合してい
ない過剰鉄を２価の鉄として、それを発色剤により発色
させて測定することによる不飽和鉄結合能の測定方法に
おいて、該過剰鉄を３価から２価とするために酸化型β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、そ
れらを補酵素とする脱水素酵素およびその脱水素酵素の
基質を用いることを特徴とする不飽和鉄結合能の測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31949792A JP3225647B2 (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 不飽和鉄結合能の測定試薬及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31949792A JP3225647B2 (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 不飽和鉄結合能の測定試薬及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06148196A JPH06148196A (ja) | 1994-05-27 |
| JP3225647B2 true JP3225647B2 (ja) | 2001-11-05 |
Family
ID=18110884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31949792A Expired - Lifetime JP3225647B2 (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 不飽和鉄結合能の測定試薬及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3225647B2 (ja) |
-
1992
- 1992-11-04 JP JP31949792A patent/JP3225647B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06148196A (ja) | 1994-05-27 |
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