JPS62205799A - イヌリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、イヌリンを酵素的にフルクトースに変換し、
これを公・知法で測定するイヌリンの測定法並びにこの
ために好適な試薬に関する。

従来技術 腎＋４の排泄機能の正しい検量のためには、今日有利に
放射線薬学が用いられる。この際、糸球体クリアランス
の測定のためには、純粋な糸球体症過においてされたっ
ており、かつ尿細管で分泌されず、再吸収されることの
ないａ４化合物を使用する。使用する物質は更に腎外注
に排泄されるべきではなく、かつ血漿蛋白質に結合して
はならない。これらの実験のためには、特にエチレンシ
アミン四酢畝（　ｆｆＤＴＡ　）及びジエチレントリア
ミン五酢酸（　ＤＴＰＡ　）のタイプの錯化剤が特に好
適でるる。特に”Ｃｒ　−　ｇＤＴＡは時に好適である
ことが証明ちれている。

一般に腎臓病学的慣゛用伝に２いては，従来通りクレア
チニン−クリアランスが測定される。このためには血中
のクレアチニン濃度並びに多くの場合２４時間の尿採取
期間の経過で排泄賂れたクンアチニンｔを測定しなけれ
ばならない。

糸球体濾過能及び尿細管濾過能の核医学的測定は今日選
択的方法である。しかしながら、この方法の実施は比較
的高価な装ｇｔ′を必要とするので、この測定は特にこ
の丸めに設置さ１７′ｃセンターでのみ実施することが
できる。更に、一定の放射線負荷ということも考慮しな
けｎはならず、このことは特に経過チェックのために繰
シ返し行なわれる実験においては重大なことである。

クレアチニン−クリアランスはすべての臨床実験室にお
いて実施することができる。しがしながらこの方法の欠
点は特にしはしは信頼できない尿採取期間、並びに血中
のクレアチニン濃度の生理学的変動、及び尿ｉ管再吸収
の変動にある。もう１つの問題は範用されるクレアチニ
ン測定法が比較的非特異性であるということである。

糸球体クリアランスの従来からの測定用材料はイヌリン
である。該物質は薬理学的に十分に不活性に挙動し、実
質的に血漿蛋白質に納会せず、かつ完全に糸球体により
濾過てれるので、クリアランスの検量にとって着しく好
適である。

しかしながら前記の利点は、従来公知のイヌリン測定法
の作業費用が高いだけでなく、不正確性及び非特異性に
おいても著しいということにＬり相殺される。更に、イ
ヌリン−クリアランスの測定の実質的な実施は、安定し
九濃度が達成されるまで該物質を連続的に注入する必要
があるので複雑である。引キ続キ、血中のイヌリン濃度
並びに尿中に一定時間排泄されたイヌリン鎗を測定しな
ければならない。このためには、一般に患者のカテーテ
ル挿入処ｔはさけられないＣＰ、クレー？　−（Ｋｒａ
ｍｅｒ　）　等、Ｍｉｔｔ、　Ｋ１１ｎ。

Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｉｅ　、第１巻、第２６〜５９頁（
１９７４年〕〕。

生物学的試料中のイヌリンの測定の友めには植々の方法
が公知である。この測定は通常色素の形成にもとづき、
その濃度上分光測定により測定し、測定すべき試料中の
イヌリン濃度に関する尺度とする。ＶｆルシンＣＧ、Ｆ
、　シュライナー（８ｃｈｒｓｉｎｅｒ　）　着、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍａｄ、、第７４巻、第１１７４（１９５０年）〕、ジ
フェニルアミｙ　（Ｈ，Ｄ、　ハリンン（Ｈａｒｒｉｓ
ｏｎ　）著、Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｍｅｄ、、第４８巻、第１１１ｊｊ（１４９２年
）〕又はアンスロン１：　Ｗ、Ｄ、ディピッドサン（Ｄ
ａｖｉｄｓｏｎ　）等着、Ｊ。

Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｅｄ、、第６２巻、第６５１
頁（１９６３年）〕で処理する方法が公知である。

これらすべての方法は非特異的、すなわち不正確であり
、従って古い方法とみなされている□発明が解決しよう
とする問題点 前記測定法はすべて、第１の工程としてポリフルクトサ
ンであるイヌリン全酸性那水分解するが、この工程は３
７〜７５℃の温度で長い反応時間を必要とする。噴出や
、蒸発による液体の損失をなく丁ことかできないので、
この反応条件は試料処置Ｉ！：者しく複雑にする。場合
により、溶封し几ガラス製フラスコ中で作業しなければ
ならない。

加水分解′に彌酸性ＰＩ”１値で実施するので、試料ｔ
６らかじめｌ脱蛋白しなければならない。この際、蛋白
質の析出の際にイヌリンが一緒に沈殿し、測定が不正確
になるという危険かめる。

問題点全解決するための手段 従って、容易に実施可能なイヌリン測定法に対する要求
がるる。この課題は、脱蛋白を行なわずに実施すること
がでさ、かつ者しい精密さと正確さが少量の試料容量で
達せられる、完全な酵素法を開発することにより、本発
明により解決する。この方法で、放射線学的方法と同様
に高い正確性でイヌリン・クリアランス金測定すること
が可能である、測元機を備えるすべての実験室において
、簡単に実施することのできる方法が提供される。

本発明の課題は、イヌリンヲＧ＃索的にフルクトースに
変換し、場合により試料中に存在するグルコースを酵素
的に除去し、遊離したフルクトースを公知法で酵素的に
測定する、イヌリンの測定法である。

イヌリンの測定のために、ポリフルクトサンをその構成
分フルクトースに切断する。この刀日水分解全酵素的に
行なう。このために好適な酵素としては、例えばβ−フ
ルクトシダーゼ又はイヌリン濃度を使用することができ
る。フルクトースの測定のためには、多くの方法が専門
家には公知でめる。有利に、生じ定フルクトース′をＡ
ＴＰ　、！：共にヘキソキナーゼにより燐酸化し、フル
クトース−６−ホスフニートヲクルコース＝６−ホスフ
ニートーイソメラーゼで異性化し、グルコース−６−ホ
スフェートトシ、かつグルコース−６−ホスフェート’
ｉ　ＮＡＤＰ　ト共に／”ルコース−６−ホスフエート
ーデヒド口ｒす一ゼにより変換し、グルコネート−６−
ホスフェート及びＮＡＤＰＨとする。ＮＡＤＰＨの上昇
全測定する。

この上昇は測定子べき試料中に存在するイヌリンのａ度
の尺度でるる。

血清試料中に富に変動する訣度で存在するグルコース全
分離せずに測定する友めに、グルコ−スケグルコースオ
キシダーゼと過酸化水素とで酸化することができる。グ
ルコースの酸化も、イヌリンの酵素的加水分解も同じ一
値で、同じ緩衝剤系で行なうことができる。両方の反応
を同時に、平行して行なうことができる。更にこのこと
は、β−フルクトシダービ調剤中に場合により存在する
グルコースをも共に酸化し、こうして後続の測定は妨害
されないという利点をもＭしている。

本発明による完全に酵素的なイヌリン−測定法は公知技
術方法の欠点を回避している。グルコースの酸化も、イ
ヌリンの酵素的加水分解も弱酸性−値で実施される。従
って、試料のあらかじめの脱蛋白は行なわなくてよい。

更に、天然グルコースの酸化にニジ示差分析が回避され
る。血清又は血漿中の天然グルコースの濃度が測定すべ
きイヌリン鐘度のファクター１００又はそれ以上でるる
かもしれないということを考慮すると、前記のことは該
方法の正確性に者しく寄与する。こうして、最終的には
後続のフルクトースの酵素的測定により、者しく扁い特
異性が達せられる。

本発明方法の有利な実施形においてに、まず試料を（例
えば血清又は血漿ｔ１場合により生理的食塩溶液で希釈
して）好適な緩衝剤系、−４，０〜６．０．！利にクエ
ン酸＠緩衝敢、グルコースオキシダーゼ及びイヌリンを
フルクトースに加水分解する酵素並びに過ば化水索と混
合する。反応混合物を約１時間６７℃で恒温保持する。

イヌリンから酵素的加水分解により生じたフルクトース
の測定は波長６２０〜３７０　ｎｍで引キ、洸き行なう
。このためには、恒温保持配合物中に、トリエタノール
アミン緩衝ｉ中のマグネシウム［、ＮＡＤＰ及びＡＴＰ
からなる溶液を加える。十分に混合し、全混合物をキュ
ベツト中に導入する。吸光ＫＥ１に分元元度計で測定子
ゐ。引き続き、酵素ヘキソキナーゼ、グルコース−６−
ホスフニートーインメラーゼ及びグルコース−６−ホス
フェートーデに＝　ドロ’ｆｆ−ゼの混合物を添〃ｕす
ることにより、酵系的反応鎖が開始する。約１０〜２０
分段、反応で終わらせ、吸光Ｅ２　（ｉ−ａみとる。吸
光度差からフルクトース富貴ヲ測定し、こうして試料中
のイヌリンの富貴を測定する。試料自体の測定の他に、
試料のイヌリン言置の計算に；いて考慮丁べき試薬仝値
を測定することが勧められる。

本発明方法に必要なＩ＃素及び助剤を有利に一定の俗液
もしくは懸陶歇に１とめる。緩衝剤システムとしては有
利に緩衝ｍｇ、ｏ、ｏｓ〜０．５ｍｏｌ／ｌ、有利に０
．１〜０．３　ｍｏｌ　／ｌ　（Ｄ濃に］−４，０〜６
．０を有するクエン酸塩緩衝液が有利である。特に有利
であるのは一値５．０のクエン酸塩緩衝液であシ、これ
は測定において緩衝溶液０．２　ｍｏｌ　／　ｌの濃度
で利用される。グルコースオキシダーゼ及びイヌリンを
フルクトースに加水分解する酵素を有利に前記クエン酸
塩緩衝液中に浴かし、恒温保持媒体ｌとして使用する。

イヌリンをフルクトースに用水分解する酵素としては、
例えばβ−フルクトシダーゼ又はイヌリナーゼを使用す
る。恒温保持媒体ｌ甲の酵素の濃度はグルコースオキシ
ダーゼ５０〜３００ｕ／ｒｒｔｔ、’；ｖｒ利に１２５
Ｕ／ｍｊ及びイヌリナーゼ０．５〜５Ｕ／ｍ１１＊°利
に０．７５　Ｕ　／ｍｌ又はβ−フルクトシダーゼ２０
００〜１０口Ｑ　Ｑ　Ｕ　／　ｍｌ、有利に６００００
／ゴである。場合により試料中に存在するグルコースの
酸化は緩衝液中に過酸化水素０．１〜２係、有利に０．
３　％含Ｍする恒温保持媒体■により開始する。

フルクトース測定に必要な助剤、例えばＮＡＤＰ％ＡＴ
Ｐ及びマグネシウム塩、例えば硫酸マグネシウムをトリ
エタノールアミン緩衝液中の混合物として保存し、使用
することができる・使用可能であるのは、例えば０．１
〜２．　ｍＭ　。

有利に０．３　ｍＭ　トリエタノールアミン緩衝液−６
，０〜８．０である。荷に有利であるのはｐ）１７．６
の前記緩衝欣である。

この中に爵かした物質の濃度はＮＡＤＰ　Ｏ，５〜３ｍ
ｍｏｌ／ｌ、！利にｉ　ｍｍｏｌ　／　１３　、　ＡＴ
Ｐ　１．０〜５　ｍｍｏｌ　／　１．　、　ｆｊ利に２
．５　ｍｍｏｌ　／　７３及びマグネシウム塩、例えば
［２マグネシウム１．０〜Ｉ　Ｑｍｍｏｌ／ｌＳＶ利に
４　ｍｍｏｌ　／　ｌである。

フルクトースの測定に必安なＩ＃索は測定の前に同様に
混合し、試料の混合物として添即する。

この酵素混合物は硫酸アンモニウム溶液中に懸濁液とし
て存在するのが有利でるる。硫酸アンモニウム＃液の濃
度は通常６〜４、有利に６．２ｍｏｌ　／　１３である
。これはｐＨ！　５．５〜６．５　、’ｆｆ利ＶＣ６，
０ｋ弔゛する。混合物中の酵素の蹟度はへキンキナーゼ
４０〜４００Ｕ／ｄＳ有利に１４０ｙ７ｍｔ、グルコー
ス−６−ホスフェート−イソメラーゼ１００〜１０００
　Ｕ／ｍｌ、有利に３５０Ｕ／ｒｒｔｌ及Ｕクルコース
〜６−ホスフエードーテヒドロデナーゼ２０〜２００Ｕ
／ｍ、有利に７０Ｕ／ｆｆ＋７である。

更に、本発明の課題はイヌリンを加水分解してフルクト
ースとし、場合により、試料中に存在するグルコースを
分解し、遊離したフルクトースを公知法で測定すること
よりなるイヌリンの＃本釣測定用試薬である。該試薬は
フルクトースを測定するための方法に通常必要とされる
物質並びにイヌリン勿フルクトースに加水分解するＣ＃
素、例えばイヌリナーゼ又はβ−フルクトシダーゼ、並
びに場合に＝ジグルコースオキシダーゼ及び過酸化水素
を含有する。本発明において有利な試薬は欠の成分を含
Ｍする：ａ）クエン酸塩緩衝剤０．０５〜［Ｊ、５モル
／ｌを含Ｍする緩衝溶液、ｐ）１４．０〜６．［Ｊｂ）
緩衝溶液ａ）中にイヌリナーゼ０．５〜５Ｕ／ｒｄ及び
場合によりグルコースオキシダーゼ５０〜３０ＤＵ／７
ｄｔ含有する＃素溶液、Ｃ）場合により緩衝溶液ａ）中
の０．１〜２％過酸化水素溶液、 ｄ）トリエタノールアミン緩衝剤０．１〜２ｍｍｏｌ　
／　ｌ　、　ｐＨ６，０〜８．０中に、ＮＡＤＰ　　　
　　　Ｏ，５〜３ｍｍｏｌ　／　ｌ　ＸＡＴＰ　　　　
　　　１．０〜５　　　ｍｍｏｌ／ｌ、マグネシウム塩
　　　１．０〜１０　　　ｍｍｏｌ　／　１を含有する
補酵素靜液、 ｅ）　　ヘ＋　７　＊　ｆ　−−ｔ！′４０〜４０ＣＩ
　Ｕ　／’ｓグルコースー６−ホスフニートーイソメラ
ーゼ１００〜１０ＣＪＯＵ／ゴ及び グルコース−６−ホスフニートーテヒドロＩ’ｆ−−ｅ
２０〜２００　Ｕ　／ゴ、 を含有する酵素溶液。

特に有利でめるのは次の成分を有する試薬でめる： ａ〕　り：ｒ−７ｔＲ頃緩衝剤０．２　ｍｏｌ　／　ｌ
含有する緩衝＃液、ｐＨ５，０ ｂ）緩衝溶液ａ）中にイヌリナーゼ０．７５Ｕ／ｆｆ１
ｌ及び場合によりグルコースオキシダーゼ１２５Ｕ／ｄ
を含有する酵素溶液、 Ｃ）場合により緩′ｔｆＩ溶液ａ）中の［１，３％過酸
化水素溶液、 ｄ）　　０．３　ｍＭ　トリエタノールアミン緩衝液、
ｐＨ７．６中に、 ＮＡＤＰ　　　　　　　　１　　　　ｍｍｏｌ　／　ｌ
　。

ＡＴ’Ｐ　　　　　　　　２．５　　ｍｍｏｌ　／　ｌ
　。

硫酸マグネシウム　　　　４．□　　　ｍｍｏｌ　／　
ｌ、全含有する補酵素溶液、 ｅ）ヘキソキナーゼ　　　　　１４０Ｕ／ｌｒＬｌ。

グルコース−６−ホスフニートーインメラーセ３５０　
Ｕ　／ｍｌ及び グルコース−６−ホスフニートーテヒドロｒ−ｔ　−セ
フ０Ｕ／ゴ を含有する酵素溶液。

イヌリナーゼのかわりに、該試薬はβ−フルクトシダー
ゼ２０００〜１００ＯＯＵ／ｍ、有利に６０［ＪＯＴＪ
／ｄβ−フルクトシダーゼを含有していてもよい。

実施例 次に実施例につき本発明の詳細な説明する二側　　１ イヌリンの測定 Ａ）溶液の製造 ａ）りｘ７酸塩緩衝液（Ｊ、２　Ｍ　、　ｐＨ５，０ク
エンｆｆ　（Ｃ，Ｈ８０７Ｘ　Ｈ２０）　４．２　、ｌ
ｉ’　ｅ水１ｃ浴カＬ、全１００Ｍとする。

クエンＭナトリウム（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３０’７　Ｘ　２Ｈ
２０）５．８８９に水中に解かし、全１００７ｄとする
。

クエン酸ナトリウム溶液６０ゴをクエン戚溶液２５７ｄ
と混合する；該混合物上−５，０に調節する。

ｂ）恒温保持媒体 恒温保持媒体１ クエン酸塩緩衝液０．２Ｍ、ｐＨ５，０ｉｏ、ｏｙ。

グルコースオキシダーゼ（約２５０　Ｕ１ｍ９　）５．
０　Ｉｎ９、 イヌリナーゼ（約３７Ｕ／ｄ）　　　［１，２ｍｌ〔ノ
ボチウム（Ｎｏｖｏｚｙｍ　）　ＳＰ　２３０、ＥＣ３
，２，１，７，ノボ産業（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｖｉ
ｃ　）、注文番号８１１２２１） もしくは β−フルクトシダーゼ（約３００　Ｕ／ダ）　　２００
．０ＩＡ９ＣＥＣ５，２，１，２６、ベーリンガー・マ
ンハイム社、注文番号　１０４９１４　） 恒温保持媒体■ クエン酸塩緩衝液０．２Ｍ、ｐＨ５，０５，０ｒｎｌ。

過酸化水素、６０％水溶液　　　　０，０５ゴｃ）　　
フルクトース測定用試薬 溶液１ トリエタノールアミン緩衝液０．６飢へｐ）１７．６、
ＭｇＳＯ３（４，Ｏｍｍｏｌ　／　ｌ　）ＮＡＤＰ　　
（１，０ｍｍｏｌ　／　ｌ　）ＡＴＰ　　　（２，５ｍ
ｍｏｌ　／　ｌ　）溶液２ ヘキソキナーゼ（約１４００／ゴ） グルコース−６−ホスフニートーインメラーゼ（約３５
ＤＵ／ｍＪ） グルコース−６−ホスフニートーテヒドロデナーゼ（約
７００／ゴ） を硫酸アンモニウム溶液３．２　ｍｏｌ　／　ｌ　、　
ｐＨ６，０中の懸濁液として Ｂ）測定の実施 ａ）試料容量 人の実験においては血清又は血漿Ｑ、１ＴｎＩ！の単一
試料容量で処理することができる。こうして、例えば被
験者あたり５Ｉの静脈内投与の後、投与後約４時間の間
、イヌリンの排泄動力学を確実に把握する。この際、腎
臓のＭ來な被験者に２いて血清濃度は約１　ｒｎ９／ｍ
ｌ　〜０．０９−ｎ９／ｒｒｔｌの範囲で変動する。

小さい動物種での実験においては、一般に比較的高いイ
ヌリン投与量で処理する。従って、測定範囲を越えない
ように、分配相の間（投与後、約６０分筐で）試料を生
理食塩溶液で１：１０に希釈することが勧められる。こ
れに対して、比較的迅速に低一度となる直線的排泄相の
間は試料を希釈せずに使用すべきである。

ｂ）酸化及び刀日水分解 反応配合物： 大実験　　動物実験 試料　　　　　　　０−１　ｍ　　　０．０５　ｍＪ恒
温保持媒体Ｉ　　Ｏ１２ゴ　　０．１０ゴ恒ａ保持媒体
Ｉｆ　　　Ｑ、１ｍ／　　　０．０５ｍ反応反応物金混
合し、３７℃で約６０分間恒温保する。

Ｃ）フルクトースの測定 測定を波長３３４　ｎｍで行なう。

恒温保持配合物中にピペットで測り入れる：浴ｇ１　　
　　　１・０ゴ これを十分に混合し、かつ全混合物七半微貸キュベツト
中に入れる。Ｅ　１　ｉｓみ取る。

酵素混合物の添加 溶液２　　　　　　［Ｊ、０２　ＩＩＬｌ混合して、反
応終了（約１０〜２０分）を待つ。Ｅ２を読み取る。

試薬空値金無視するべきでない場合には、計算の際にこ
れを考慮する。

Ｅｌ−］３：２−ｇ９値　−４フルクトースＣ）計算 ａ）入試料 試料容ｆ　　　　　　　　Ｏ１１ゴ キュベット容量　　　　　１．４２ｒＩＬ１ｍ、、、ク
ト、　ｘ　Ｏ，６６５−イヌリンｍｇ／ｍｌｂ〕　動物
試料 試料容量　　　　　　　　０．０５　ｄキュベツト容量
　　　　　１．２２ゴ ムＥ７２．クトーＸ　Ｘ　　１．１４３−イヌリン〜／
ゴ希釈試料に２いては、結果１ｃｉｏを掛ける。

Ｄ）結果 ａ）精確度 第１表中には水溶液又は果合した家兎血清中のイヌリナ
ーゼもしくはβ−フルクトシダーゼを用いたイヌリン測
定６１０回の平均値及び分散度が記載されている。変動
係数はβ−フルクトシダーゼの使用において≦３％の値
であシ；ＤＯ水分解酵素゛としてイヌリン測定を便用す
る際には変動係数≦１％である。

表　　１　表 水溶液及び集合家兎血清中のイヌリナ ーゼもしくはβ−フルクトシダーゼで のイヌリン測定の精確度 Ｎ　−実施した測定数 ＥＩＤＶ−標準偏差 ＶＫ　−変動係数 Ｓ四−平均値誤差 ｂ）再現性 第２表中には種々の基質濃度で、水溶液及び集合家兎血
清中のイヌリナーゼもしくはβ−フルクトシダーゼを使
用したイヌリン測定側結果を示した。

示された値はすべての濃度範囲において優れた再現率を
示す。

第　　２　　表 種々の濃度における、水溶液及び果合家兎血清中のイヌ
リナーゼもしくはβ−フルクトシダーゼ七用いたイヌリ
ン測定の結果（各測定１０回の平均値〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イヌリンを酵素的に反応させてフルクトースとし、
   場合により試料中に存在するグルコースを酵素的に除去
   し、遊離したフルクトースを公知法により酵素的に測定
   することを特徴とするイヌリンの測定法。 ２、フルクトースへのイヌリンの酵素的変換をイヌリナ
   ーゼ又はβ−フルクトシダーゼを用いて行なう特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ６、フルクトースをＡＴＰと共にヘキソキナーゼにより
   フルクトース−６−ホスフェートに変換し、これをグル
   コース−６−ホスフェート−イソメラーゼによりグルコ
   ース−６−ホスフェートに異性化し、グルコース−６−
   ホスフェートをＮＡＤＰと共にグルコース−６−ホスフ
   ェート−デヒドロゲナーゼによりグルコネート−６−ホ
   スフェートとＮＡＤＰＨに変換し、ＮＡＤＰＨの増加を
   測定する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、場合により試料中に存在するグルコースをグルコー
   スオキシダーゼ及びＨ＿２Ｏ＿２により除去する特許請
   求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
   法。 ５、イヌリンをフルクトースに加水分解する酵素、フル
   クトースの測定に必要な酵素、補酵素及び助剤並びに場
   合によりグルコースオキシダーゼ及び過酸化水素を含有
   することを特徴とするイヌリンの測定試薬。 ６、イヌリンをフルクトースに加水分解するための酵素
   としてイヌリナーゼ又はβ−フルクトシダーゼを含有す
   る特許請求の範囲第５項記載の測定試薬。 ７、次の成分： ａ）クエン酸塩緩衝剤０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌを含
   有する緩衝溶液、ｐＨ４．０〜６．０ ｂ）緩衝溶液ａ）中にイヌリナーゼ０．５〜５Ｕ／ｍｌ
   及び場合によりグルコースオキシダーゼ５０〜３００Ｕ
   ／ｍｌを含有する酵素溶液、 ｅ）場合により緩衝溶液ａ）中の０．１〜２％過酸化水
   素溶液、 ｄ）トリエタノールアミン緩衝剤０．１〜２ｍｍｏｌ／
   ｌ、ｐＨ６．０〜８．０中に、 ＮＡＤＰ０．５〜３ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ１．０〜５ｍｍｏｌ／ｌ マグネシウム塩１．０〜１０ｍｍｏｌ／ｌを含有する補
   酵素溶液、 ｅ）ヘキソキナーゼ４０〜４００Ｕ／ｍｌ、グルコース
   −６−ホスフェート−イソメラーゼ１０００Ｕ／ｍｌ及
   び グルコース−６−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ２０
   〜２００Ｕ／ｍｌ、 を含有する酵素溶液、 からなる特許請求の範囲第５項又は第６項記載の試薬。 ８、溶液ｂ）のかわりに、緩衝溶液ａ）中にβ−フルク
   トシダーゼ２０００〜１００００Ｕ／ｍｌ及び場合によ
   りグルコースオキシダーゼ５０〜３００Ｕ／ｍｌを含有
   する酵素溶液ｂ′）を含有する特許請求の範囲第７項記
   載の試薬。 ９、次の成分： ａ）クエン酸塩緩衝剤０．２ｍｏｌ／ｌ含有する緩衝溶
   液、ｐＨ５．０、 ｂ）緩衝溶液ａ）中にイヌリナーゼ０．７５Ｕ／ｍｌ及
   び場合によりグルコースオキシダーゼ１２５Ｕ／ｍｌを
   含有する酵素溶液、 ｃ）場合により緩衝溶液ａ）中の０．３％４過酸化水素
   溶液、 ｄ）０．３ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．
   ６、中に、 ＮＡＤＰ１ｍｍｏｌ／ｌ、 ＡＴＰ２．５ｍｍｏｌ／ｌ、 硫酸マグネシウム４．０ｍｍｏｌ／ｌ、を含有する補酵
   素溶液、 ｅ）ヘキソキナーゼ１４０Ｕ／ｍｌ、 グルコース−６−ホスフェート−イソメラーゼ３５０Ｕ
   ／ｍｌ及び、 グルコース−６−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ７０
   Ｕ／ｍｌ を含有する酵素溶液、 からなる特許請求の範囲第５項又は第６項記載の試薬。 １０、溶液ｂ）のかわりに、緩衝溶液ａ）中にβ−フル
   クトシダーゼ６０００Ｕ／ｍｌ及び場合によりグルコー
   スオキシダーゼ１２５Ｕ／ｍｌを含有する酵素溶液ｂ′
   ）を含有する特許請求の範囲第９項記載の試薬。