JP3310295B2 - グルコース測定用試薬 - Google Patents
グルコース測定用試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、グルコースの測定用試薬に関する。より詳
細には、長期間安定なグルコース測定用の改良された液
状試薬に関するものである。
細には、長期間安定なグルコース測定用の改良された液
状試薬に関するものである。
背景技術 血液や尿等の生体液中のグルコースの測定は、糖尿病
や低血糖症等の種々の疾病の診断や、治療経過の観察の
重要な項目の一つである。現在、臨床検査におけるグル
コーの測定法としては、還元法、酵素法、縮合法と簡易
測定法等に大別される。これらのうち還元法はグルコー
ス以外に他の還元物質なども測定されるため、1950年代
より特異性に優れた酵素法（グルコースオキシダーゼ
法）が導入された。また、より特異的なグルコース測定
法として、ヘキソキナーゼ（以下、HKと略記する）とグ
ルコース−６−燐酸脱水素酵素（以下、G6PDHと略記す
る）とを用いるHK−G6PDH法が標準法として採用されて
いる。
や低血糖症等の種々の疾病の診断や、治療経過の観察の
重要な項目の一つである。現在、臨床検査におけるグル
コーの測定法としては、還元法、酵素法、縮合法と簡易
測定法等に大別される。これらのうち還元法はグルコー
ス以外に他の還元物質なども測定されるため、1950年代
より特異性に優れた酵素法（グルコースオキシダーゼ
法）が導入された。また、より特異的なグルコース測定
法として、ヘキソキナーゼ（以下、HKと略記する）とグ
ルコース−６−燐酸脱水素酵素（以下、G6PDHと略記す
る）とを用いるHK−G6PDH法が標準法として採用されて
いる。
このHK−G6PDH法は正確なグルコース測定値を得るこ
とができる有用な測定法であるが、試薬構成成分が不安
定な物質から構成されているので、長期保存が難しい。
そこで、一般的に酵素や基質等は凍結乾燥品として供給
され、使用時に緩衝液等で溶解して用いられていた。し
かし、作業性やコスト面からも溶解後の試薬の安定性が
要求されるようになり、例えば特開昭56−140899号公報
のようにグルコース測定用試薬の安定性に関する技術が
開示されている。
とができる有用な測定法であるが、試薬構成成分が不安
定な物質から構成されているので、長期保存が難しい。
そこで、一般的に酵素や基質等は凍結乾燥品として供給
され、使用時に緩衝液等で溶解して用いられていた。し
かし、作業性やコスト面からも溶解後の試薬の安定性が
要求されるようになり、例えば特開昭56−140899号公報
のようにグルコース測定用試薬の安定性に関する技術が
開示されている。
前記特開昭56−140899号公報には、スルフヒドリル化
合物（例えば還元型グルタチオン、Ｎ−アセチルシステ
イン）及び／又はキレート剤（例えばEDTA、EGTA）並び
に殺菌剤及びpH緩衝剤を存在させることにより、試薬の
安定性を図った技術が記載されている。この技術は、基
本的には凍結乾燥品を溶解して混合した試薬を主眼に構
成されており、補酵素以外の成分の水溶液（Ｂ液）の安
定性を改善するもので、その安定性はせいぜい10日程度
である。
合物（例えば還元型グルタチオン、Ｎ−アセチルシステ
イン）及び／又はキレート剤（例えばEDTA、EGTA）並び
に殺菌剤及びpH緩衝剤を存在させることにより、試薬の
安定性を図った技術が記載されている。この技術は、基
本的には凍結乾燥品を溶解して混合した試薬を主眼に構
成されており、補酵素以外の成分の水溶液（Ｂ液）の安
定性を改善するもので、その安定性はせいぜい10日程度
である。
また、特開昭63−24900号公報には、長期間（１年以
上）保存可能なグルコース定量用安定化液体酵素組成物
に関する技術が開示されている。これは試薬構成を酵素
試薬（ヘキソキナーゼ及びG6PDH）と補酵素試薬（ATP及
びNAD）の２試薬系として、酵素試薬には約20〜40％（v
/v）のポリオール有機溶媒、安定剤系のEDTA、アルブミ
ンやポリビニルピロリドン等の酸化防止剤及びアジ化ナ
トリウムの微生物抑制剤を添加して、pHを約7.5に調整
する。更に補酵素試薬には約５〜20％（v/v）のポリオ
ール有機溶媒を添加して、pHを約7.5に調整するという
ものである。
上）保存可能なグルコース定量用安定化液体酵素組成物
に関する技術が開示されている。これは試薬構成を酵素
試薬（ヘキソキナーゼ及びG6PDH）と補酵素試薬（ATP及
びNAD）の２試薬系として、酵素試薬には約20〜40％（v
/v）のポリオール有機溶媒、安定剤系のEDTA、アルブミ
ンやポリビニルピロリドン等の酸化防止剤及びアジ化ナ
トリウムの微生物抑制剤を添加して、pHを約7.5に調整
する。更に補酵素試薬には約５〜20％（v/v）のポリオ
ール有機溶媒を添加して、pHを約7.5に調整するという
ものである。
しかしながら、ポリオール（グリセリン等）含有試薬
自体が粘性を有しており、更に酸化防止剤としてポリビ
ニルピロリドンを併用すると試薬の粘性が高くなり、自
動分析装置において、試薬分注精度の低下等の不都合が
生じ、また、特に補酵素NAD、ATPの安定性が不十分であ
る等の問題を有している。
自体が粘性を有しており、更に酸化防止剤としてポリビ
ニルピロリドンを併用すると試薬の粘性が高くなり、自
動分析装置において、試薬分注精度の低下等の不都合が
生じ、また、特に補酵素NAD、ATPの安定性が不十分であ
る等の問題を有している。
近年、特に試薬形態を供給時から液状とし、ユーザー
の作業性を向上させることが求められている。また、こ
れらの試薬は多くの場合、自動分析機にて使用されるの
で、試薬構成を２試薬系とし、しかも試薬組成物の安定
性を長期間（例えば半年から１年）維持する必要があ
る。
の作業性を向上させることが求められている。また、こ
れらの試薬は多くの場合、自動分析機にて使用されるの
で、試薬構成を２試薬系とし、しかも試薬組成物の安定
性を長期間（例えば半年から１年）維持する必要があ
る。
ここで、HK−G6PDH法の反応式は以下のとおりであ
る。
る。
前記の式中で、ATPはアデノシン5'−三燐酸、ADPはア
デノシン5'−二燐酸、NADP+は酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド燐酸である。
デノシン5'−二燐酸、NADP+は酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド燐酸である。
前記反応の各構成成分のそれぞれに異なる安定条件が
存在するので、それらの成分を配合してなるグルコース
測定用試薬の安定性も各成分の組み合わせにより相乗的
に向上したり、逆に不安定になる場合があった。
存在するので、それらの成分を配合してなるグルコース
測定用試薬の安定性も各成分の組み合わせにより相乗的
に向上したり、逆に不安定になる場合があった。
また、従来は主に用手法で用いる１試薬系の形態で試
料と混合して測定が実施されていたが、自動分析機の普
及によって２試薬系が通常となっている。これらの２試
薬系において、試薬組成の組み合わせは、一般的に初発
酵素の基質であるATPを開始試薬（第二試薬）に含有さ
せ、残りの成分をすべて第一試薬に含有されるケースが
多い。その他には、第二試薬としてHK又はG6PDH（もし
くは両酵素とも）などの酵素を使用する場合があった
が、この場合には酵素の安定性が問題であった。また第
二試薬にATPを用いた場合でも充分な保存性を得ること
はできなかった。
料と混合して測定が実施されていたが、自動分析機の普
及によって２試薬系が通常となっている。これらの２試
薬系において、試薬組成の組み合わせは、一般的に初発
酵素の基質であるATPを開始試薬（第二試薬）に含有さ
せ、残りの成分をすべて第一試薬に含有されるケースが
多い。その他には、第二試薬としてHK又はG6PDH（もし
くは両酵素とも）などの酵素を使用する場合があった
が、この場合には酵素の安定性が問題であった。また第
二試薬にATPを用いた場合でも充分な保存性を得ること
はできなかった。
酵素の安定化に関しては、酵素自身の高度な精製によ
って有害な共雑酵素を除去することや、耐熱酵素類、例
えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Batillus st
earothermophilus）由来のグルコキナーゼ（以下、GlcK
と略す）、遺伝子組換えによる酵母由来のHKなどやそれ
らの化学修飾酵素を用いることによって改善されてきた
が、液状試薬全体としての保存安定性を得ることは難し
かった。
って有害な共雑酵素を除去することや、耐熱酵素類、例
えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Batillus st
earothermophilus）由来のグルコキナーゼ（以下、GlcK
と略す）、遺伝子組換えによる酵母由来のHKなどやそれ
らの化学修飾酵素を用いることによって改善されてきた
が、液状試薬全体としての保存安定性を得ることは難し
かった。
安定化された酵素類以外の構成成分のうち、不安定化
要因の最も大きな成分は、補酵素であるNADP+や基質で
あるATPであり、特にNADP+の劣化が保存安定性を阻害す
る原因であった。
要因の最も大きな成分は、補酵素であるNADP+や基質で
あるATPであり、特にNADP+の劣化が保存安定性を阻害す
る原因であった。
本発明者等はこうした従来の問題点を解消すべく種々
鋭意検討した結果、液状試薬としての充分な保存安定性
を有する試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見
に基づくものである。
鋭意検討した結果、液状試薬としての充分な保存安定性
を有する試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見
に基づくものである。
発明の開示 本発明は、少なくともグルコキナーゼ（GlcK）又はヘ
キソキナーゼ（HK）、グルコース−６−燐酸脱水素酵素
（G6PDH）及びアデノシン5'−三燐酸（ATP）を含む第一
試薬と、少なくとも酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸（NADP+）を含む第二試薬とからなり、
第一試薬のpHが7.5〜9.5であり、第二試薬のpHが３〜５
であり、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴とす
る、グルコース測定用試薬に関する。
キソキナーゼ（HK）、グルコース−６−燐酸脱水素酵素
（G6PDH）及びアデノシン5'−三燐酸（ATP）を含む第一
試薬と、少なくとも酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸（NADP+）を含む第二試薬とからなり、
第一試薬のpHが7.5〜9.5であり、第二試薬のpHが３〜５
であり、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴とす
る、グルコース測定用試薬に関する。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明試薬を４℃で保存した場合の安定性
を示すグラフである。
を示すグラフである。
第２図は、本発明試薬を10℃で保存した場合の安定性
を示すグラフである。
を示すグラフである。
第３図は、比較用試薬を４℃で保存した場合の安定性
を示すグラフである。
を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。
一般的にHK及びG6PDHを使用した従来のグルコース測
定試薬は、１試薬で使用されていたが、自動分析機の発
達とともに測定物（グルコース）と始めに反応するHKの
補酵素（基質）であるATPを開始試薬とした２試液型試
薬が多くなった。その理由としては、グルコースと最初
に反応する初発酵素のHKとATPのうちいずれかを後から
加えることによって、G6PDH反応以下の検体ブランクを
差し引くことができるからである。また、ATPを使用す
る理由としては、タンパク質であるHKに比べて扱いやす
いためであった。
定試薬は、１試薬で使用されていたが、自動分析機の発
達とともに測定物（グルコース）と始めに反応するHKの
補酵素（基質）であるATPを開始試薬とした２試液型試
薬が多くなった。その理由としては、グルコースと最初
に反応する初発酵素のHKとATPのうちいずれかを後から
加えることによって、G6PDH反応以下の検体ブランクを
差し引くことができるからである。また、ATPを使用す
る理由としては、タンパク質であるHKに比べて扱いやす
いためであった。
こうした考え方は、酵素の精製度が不良であった時代
にはごく一般的であった。しかし、高度に精製した酵素
及び基質標品が手に入る現在においては、より安定な条
件を設定することに重点をおくことができるのである。
従って、まったく従来では考えつかなかった試薬組成の
組み合わせが開発されたのである。
にはごく一般的であった。しかし、高度に精製した酵素
及び基質標品が手に入る現在においては、より安定な条
件を設定することに重点をおくことができるのである。
従って、まったく従来では考えつかなかった試薬組成の
組み合わせが開発されたのである。
本発明のグルコース測定用試薬は、 （１）GlcK又はHKと、G6PDHと、ATPとを含み、pHが7.5
〜9.5の液状第一試薬と、 （２）NADP+を含み、pHが３〜５の液状第二試薬と から構成される。
〜9.5の液状第一試薬と、 （２）NADP+を含み、pHが３〜５の液状第二試薬と から構成される。
第一試薬に含まれるATPは、pH7.5〜10程度のアルカリ
緩衝液中で安定であるので、第一試薬は、pH7.5〜9.5の
緩衝液に溶解させる。pH9.5を越えるpHは酵素安定性の
点から好ましくない。また緩衝液としては、前記の範囲
のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えばトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略
する）緩衝液（pH9.0）を用いることができる。
緩衝液中で安定であるので、第一試薬は、pH7.5〜9.5の
緩衝液に溶解させる。pH9.5を越えるpHは酵素安定性の
点から好ましくない。また緩衝液としては、前記の範囲
のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えばトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略
する）緩衝液（pH9.0）を用いることができる。
HK及びGlcKとしては、pH安定性が弱アルカリ（pH7〜
9.5）にある酵素、例えば酵母由来のHKやバチルス・ス
テアロサーモフィルス（Batillus stearothermophilu
s）由来のGlcKなどを用いるのが好ましく、配合量は、
酵素活性を発現し得る量を添加すればよく、少なくとも
0.2U以上添加して用いるのが好ましい。上限は特に限定
されないが、コスト等を考慮して0.2〜100Uの範囲で用
いればよい。
9.5）にある酵素、例えば酵母由来のHKやバチルス・ス
テアロサーモフィルス（Batillus stearothermophilu
s）由来のGlcKなどを用いるのが好ましく、配合量は、
酵素活性を発現し得る量を添加すればよく、少なくとも
0.2U以上添加して用いるのが好ましい。上限は特に限定
されないが、コスト等を考慮して0.2〜100Uの範囲で用
いればよい。
G6PDHとしても、pH安定性が弱アルカリ（pH7〜9.5）
にある酵素、例えばリュウコノストック・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）由来の酵素が好適
であり、配合量は、酵素活性を発現し得る量を添加すれ
ばよく、少なくとも0.5U以上添加して用いるのが好まし
い。上限は特に限定されないが、コスト等を考慮して0.
5〜100Uの範囲で用いればよい。
にある酵素、例えばリュウコノストック・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）由来の酵素が好適
であり、配合量は、酵素活性を発現し得る量を添加すれ
ばよく、少なくとも0.5U以上添加して用いるのが好まし
い。上限は特に限定されないが、コスト等を考慮して0.
5〜100Uの範囲で用いればよい。
ATPは、好ましくは0.5〜5mM、より好ましくは１〜3mM
の量で配合する。第一試薬には、その他必要に応じて、
マグネシウム塩やキレート剤〔例えば、エチレンジアミ
ン四酢酸（以下、EDTAと略する）〕などを添加してもよ
い。
の量で配合する。第一試薬には、その他必要に応じて、
マグネシウム塩やキレート剤〔例えば、エチレンジアミ
ン四酢酸（以下、EDTAと略する）〕などを添加してもよ
い。
第二試薬に添加されるNADP+は酸性緩衝液中で安定で
あるので、NADP+をpH3〜５の緩衝液に溶解して、第二試
薬を調製することができる。また緩衝液としては、前記
の範囲のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えば酢
酸緩衝液（pH4.0）を用いることができる。NADP+は、好
ましくは１〜20mM、より好ましくは５〜10mMの量で配合
することができる。第二試薬には、そのほか必要に応じ
てマグネシウム塩を添加してもよい。第一試薬と第二試
薬とを混合した後に、混合液が約pH7.5〜8.5になるよう
にすることが好ましく、第一試薬と第二試薬の緩衝液濃
度や、その混合比を適宜設定すればよい。
あるので、NADP+をpH3〜５の緩衝液に溶解して、第二試
薬を調製することができる。また緩衝液としては、前記
の範囲のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えば酢
酸緩衝液（pH4.0）を用いることができる。NADP+は、好
ましくは１〜20mM、より好ましくは５〜10mMの量で配合
することができる。第二試薬には、そのほか必要に応じ
てマグネシウム塩を添加してもよい。第一試薬と第二試
薬とを混合した後に、混合液が約pH7.5〜8.5になるよう
にすることが好ましく、第一試薬と第二試薬の緩衝液濃
度や、その混合比を適宜設定すればよい。
実施例 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ （１）以下の組成の第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬 62.5mM トリス緩衝液（pH9.0） 31.25mM 塩化カリウム 18.25mM 塩化マグネシウム 2.5mM EDTA 2.5mM ATP 1U/ml GlcK 1U/ml G6PDH 第二試薬 120mM 酢酸緩衝液（pH4.0） 2.5mM EDTA 2.5mM NADP （２）安定性 前記（１）で調製した第一試薬及び第二試薬を、別々
に４℃又は10℃で保存し、一定期間経過後にグルコース
の自動分析に使用した。測定実施までの保存期間は、第
１図及び第２図に示すとおり、４℃保存試薬に関して、
調製直後、１週間後、２週間後、１月後、３月後、６月
後、９月後、12月後、13月後、15月後及び18月後であ
り、10℃保存試薬に関して、調製直後、２週間後、１月
後、３月後、６月後、９月後、12月後、13月後及び15月
後であった。
に４℃又は10℃で保存し、一定期間経過後にグルコース
の自動分析に使用した。測定実施までの保存期間は、第
１図及び第２図に示すとおり、４℃保存試薬に関して、
調製直後、１週間後、２週間後、１月後、３月後、６月
後、９月後、12月後、13月後、15月後及び18月後であ
り、10℃保存試薬に関して、調製直後、２週間後、１月
後、３月後、６月後、９月後、12月後、13月後及び15月
後であった。
また、検体としては、４種のグルコース水溶液〔すな
わち、760mg/dlグルコース水溶液（図中の□）、570mg/
dlグルコース水溶液（図中の△）、380mg/dlグルコース
水溶液（図中の○）若しくは190mg/dlグルコース水溶液
（図中の＊）〕、そして２種の血清（図中の●及び▲）
を用いた。
わち、760mg/dlグルコース水溶液（図中の□）、570mg/
dlグルコース水溶液（図中の△）、380mg/dlグルコース
水溶液（図中の○）若しくは190mg/dlグルコース水溶液
（図中の＊）〕、そして２種の血清（図中の●及び▲）
を用いた。
測定操作は、検体３μｌに第一試薬320μｌを加え、3
7℃で５分間加温した後、第二試薬80μｌを加え、37℃
で５分間保温した後に、340nmの吸光度を測定した。
7℃で５分間加温した後、第二試薬80μｌを加え、37℃
で５分間保温した後に、340nmの吸光度を測定した。
それぞれの測定結果を第１図（４℃保存試薬）及び第
２図（10℃保存試薬）に示す。
２図（10℃保存試薬）に示す。
比較例 （１）以下の組成からなる比較例の第一試薬及び第二試
薬を調製した。
薬を調製した。
第一試薬 62.5mM トリス緩衝液（pH7.8） 31.25mM 塩化カリウム 18.25mM 塩化マグネシウム 2.5mM EDTA 2.0mM NADP 1U/ml GlcK 1U/ml G6PDH 第二試薬 100mM グリシン緩衝液（pH9.0） 10mM ATP （２）安定性 比較用として前記（１）で調製した第一試薬及び第二
試薬を10℃にて保存し、調製直後、２週間後、１月後、
２月後、３月後、４月後、５月後及び６月後に前記実施
例と同様の試験を行い、試薬の安定性を確認した。結果
を第３図に示す。検体としては、２種のグルコース水溶
液〔すなわち、760mg/dlグルコース水溶液（図中の
□）、380mg/dlグルコース水溶液（図中の○）〕、そし
て２種の血清（図中の●及び▲）を用いた。
試薬を10℃にて保存し、調製直後、２週間後、１月後、
２月後、３月後、４月後、５月後及び６月後に前記実施
例と同様の試験を行い、試薬の安定性を確認した。結果
を第３図に示す。検体としては、２種のグルコース水溶
液〔すなわち、760mg/dlグルコース水溶液（図中の
□）、380mg/dlグルコース水溶液（図中の○）〕、そし
て２種の血清（図中の●及び▲）を用いた。
産業上の利用分野 本発明のグルコース測定用試薬は、液状のままで、暗
所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間（少なくと
も２年程度）にわたって安定に貯蔵することができる。
従って、臨床検査を実施する現場で長期に保存してお
き、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、そのまま
自動分析機などに挿入することができる。
所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間（少なくと
も２年程度）にわたって安定に貯蔵することができる。
従って、臨床検査を実施する現場で長期に保存してお
き、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、そのまま
自動分析機などに挿入することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。
者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/54 C12Q 1/32 C12Q 1/48 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】少なくともグルコキナーゼ又はヘキソキナ
ーゼ、グルコース−６−燐酸脱水素酵素及びアデノシン
5'−三燐酸を含む第一試薬と、少なくとも酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試薬と
からなり、第一試薬のpHが7.5〜9.5であり、第二試薬の
pHが３〜５であり、そしてそれぞれ液状試薬であること
を特徴とする、グルコース測定用試薬。 - 【請求項２】第一試薬がグルコキナーゼ又はヘキソキナ
ーゼを0.2U以上含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項３】第一試薬がグルコース−６−燐酸脱水素酵
素を0.5U以上含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項４】第一試薬がアデノシン5'−三燐酸を0.5〜5
mM含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項５】第一試薬がマグネシウム塩又はキレート剤
を更に含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項６】第二試薬が酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド燐酸を１〜20mM含有する請求項１に記載
の試薬。 - 【請求項７】第二試薬がマグネシウム塩を更に含有する
請求項１に記載の試薬。 - 【請求項８】第一試薬と第二試薬との混合液のpHが7.5
〜8.5となるように第一試薬及び第二試薬の緩衝液濃度
を調整した、請求項１に記載の試薬。
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