WO1995006136A1 - Reactif pour l'analyse du glucose - Google Patents

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WO1995006136A1
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glucose
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Hiroyuki Tsubota
Reiko Shimada
Original Assignee
Iatron Laboratories, Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for measuring glucose. More particularly, it relates to an improved liquid reagent for long-term stable glucose measurement. Background art
  • Measurement of glucose in biological fluids such as blood and urine is one of the important items for diagnosing various diseases such as diabetes and hypoglycemia and for observing the course of treatment.
  • methods for measuring glucose in clinical tests are roughly divided into reduction methods, enzymatic methods, condensation methods and simple measurement methods.
  • the reducing method measures other reducing substances besides glucose, so an enzymatic method (glucose oxidase method) with excellent specificity was introduced in the 1950s.
  • the HK-G6PDH method using hexokinase hereinafter abbreviated as HK
  • G6PDH glucose 16-phosphate dehydrogenase
  • the HK-G6PDH method is a useful measurement method that can obtain accurate glucose measurement values, but long-term storage is difficult because reagent components are composed of unstable substances. Therefore, enzymes, substrates and the like are generally supplied as lyophilized products, and are dissolved in a buffer or the like before use.
  • the stability of the reagent after dissolution has been required in terms of workability and cost.
  • a technology relating to the stability of a glucose measuring reagent has been disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-140899. ing.
  • JP-A-56-140899 discloses that a sulfhydryl compound (for example, reduced glutathione, N-acetylcysteine) and / or a chelating agent (for example, EDTA, EGTA), a bactericide and a pH buffer are present. Describes a technique for stabilizing the reagent.
  • This technology basically consists of a reagent obtained by dissolving and mixing a lyophilized product, and improves the stability of an aqueous solution (solution B) of components other than coenzyme. At most about 10 days.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-24900 discloses a group that can be stored for a long period Techniques relating to a stabilized liquid enzyme composition for quantifying Lucose are disclosed. It consists of two reagent systems, an enzyme reagent (hexokinase and G6PDH) and a coenzyme reagent (ATP and NAD) .
  • the enzyme reagent contains about 20 to 40% (v / v) of a polyol organic solvent. Adjust the pH to about 7.5 by adding stabilizers such as EDTA, antioxidants such as albumin and polyvinylpyrrolidone, and a microbial inhibitor of sodium azide. Furthermore, about 5 to 20% (v / v) of a polyorganic organic solvent is added to the coenzyme reagent to adjust the pH to about 7.5.
  • the polyol (glycerin, etc.)-Containing reagent itself has viscosity, and when polyvinylpyrrolidone is used in combination with antioxidant _M, the viscosity of the reagent increases, which causes inconveniences such as reduced reagent dispensing accuracy in an automatic analyzer. In addition, there are problems such as insufficient stability of the enzymes NAD and ATP.
  • reaction formula of the HK-G 6 PDH method is as follows.
  • ATP is adenosine 5, monophosphate
  • ADP is adenosine 5, monophosphate
  • NADP + is oxidized nicotinamide adenine dinucleotide acid
  • the stability of the glucose measurement reagent obtained by blending those components is also synergistically improved by the combination of the components, or conversely, becomes unstable.
  • measurement was carried out by mixing with a sample in the form of a one-reagent system, which is mainly used in application methods.
  • two-reagent systems have become common due to the spread of automatic analyzers.
  • the combination of the reagent compositions is such that ATP, which is the substrate of the first enzyme, is generally contained in the starting reagent (second reagent), and all the remaining components are contained in the first reagent. There are many cases.
  • an enzyme such as HK or G 6 PDH (or both enzymes) was used as the second reagent, but in this case, the stability of the enzyme was a problem. Also, even when ATP was used as the second reagent, sufficient storage stability could not be obtained.
  • Glucokinase Bacillus stearothermophilus
  • G1cK Glucokinase -derived glucokinase
  • HK derived from genetically modified yeast and their chemically modified enzymes have been improved, but storage stability as a whole liquid reagent has been improved. It was difficult to get sex.
  • the largest destabilizing factors are NADP +, a coenzyme, and ATP, a substrate, and especially the degradation of NAD P + that impairs storage stability. Met.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve such conventional problems, and as a result, have found a reagent composition having sufficient storage stability as a liquid reagent.
  • the present invention is based on such findings. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to at least glucokinase (GlcK) or hexokinase (HK), glucose 16-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and adenosine 5, monophosphate
  • ATP oxidized nicotinamide amide adenine dinucleotide acid
  • NADP + oxidized nicotinamide amide adenine dinucleotide acid
  • FIG. 1 is a graph showing the stability when the reagent of the present invention was stored at 4.
  • FIG. 2 is a graph showing the stability when the reagent of the present invention is stored at 10 ° C.
  • FIG. 3 is a graph showing the stability when the comparative reagent was stored in step 4.
  • HK coenzyme substrate
  • analyte glucose
  • ATP analyte
  • the glucose measuring reagent of the present invention is a glucose measuring reagent of the present invention.
  • ATP contained in the first reagent is stable in an alkaline buffer solution of about pH 7.5 to 10. Therefore, the first reagent is dissolved in a buffer solution of pH 7.5 to 9.5. A pH exceeding pH 9.5 is not preferable from the viewpoint of enzyme stability.
  • the buffer any buffer usually used at a pH value in the above range, for example, a tris (hydroxymethyl) aminomethane (hereinafter abbreviated as Tris) buffer (pH 9.0) can be used.
  • Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • HK and G1cK include enzymes whose pH stability is weakly alkaline (pH 7 to 9.5), such as yeast-derived HK and Bacillus' stear saccharophilus.
  • the compounding amount may be an amount capable of expressing the enzyme activity, and it is preferable to add at least 0.2 U or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be in the range of 0.2 to 100 U in consideration of cost and the like.
  • G6 PDH is an enzyme whose pH stability is weakly alkaline ( ⁇ 7-9.5), such as Leuconostoc.
  • the amount of the enzyme added may be an amount capable of expressing the enzyme activity, and is preferably used by adding at least 0.5 U or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be in the range of 0.5 to 100 U in consideration of cost and the like.
  • ATP is preferably incorporated in an amount of 0.5-5 mM, more preferably 1-3 mM.
  • a magnesium salt chelating agent for example, ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as EDTA)] may be added to the first reagent.
  • NADP + added to the second reagent is stable in the acidic buffer
  • NADP + can be dissolved in a buffer having a pH of 3 to 5 to prepare the second reagent.
  • the buffer any buffer usually used at a pH value in the above range, for example, an acetic acid buffer (pH 4.0) can be used.
  • NADP + is preferably:! ⁇ 20 mM, more preferably 5 ⁇ : L OmM.
  • a magnesium salt may be added to the second reagent as needed.
  • the mixed solution be adjusted to a pH of about 7.5 to 8.5, and the buffer concentrations of the first and second reagents and the The mixing ratio may be set as appropriate.
  • Example 1 A first reagent and a second reagent having the following compositions were prepared.
  • the first reagent and the second reagent prepared in the above (1) were separately stored at 4 or 10 and used for automatic analysis of glucose after a certain period of time.
  • the storage period up to the measurement is as follows: immediately after preparation, one week, two weeks, one month, three months, six months, After September, 12 months, 13 months, 15 months, and 18 months, 10 ° C storage reagents immediately after preparation, 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months Monthly, September, December, March, and May.
  • glucose aqueous solutions ie, 76 Omg / d 1 glucose aqueous solution ( ⁇ in the figure), 57 OmgZd 1 glucose aqueous solution ( ⁇ in the figure), and 38 Omg / d 1 glucose aqueous solution ( ( ⁇ in the figure) or 19 OmgZd 1-glucose aqueous solution (* in the figure)]
  • two kinds of sera ⁇ and ⁇ in the figure
  • the measurement procedure is as follows.For the sample 3 ⁇ l, apply the first reagent 3201 to the sample, warm it at 37 ° C for 5 minutes, and then apply the second reagent 80 ⁇ l, and then add the sample at 37 ° C. After incubating for 5 minutes at, the absorbance at 340 nm was measured.
  • the glucose measuring reagent of the present invention can be stored in a liquid state in a dark place or a light place at room temperature or at a low temperature for a long period of time (at least about 2 years). Therefore, it can be stored for a long time at the site where clinical tests are performed, and can be inserted into an automatic analyzer or the like as it is without the need for dissolution operation.

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Description

明 細 書
グルコース測定用試薬 技術分野
本発明は、 グルコースの測定用試薬に関する。 より詳細には、 長期間安定なグ ルコース測定用の改良された液状試薬に関するものである。 背景技術
血液や尿等の生体液中のグルコースの測定は、 糖尿病や低血糖症等の種々の疾 病の診断や、 治療経過の観察の重要な項目の一つである。 現在、 臨床検査におけ るグルコ一の測定法としては、 還元法、 酵素法、 縮合法と簡易測定法等に大別さ れる。 これらのうち還元法はグルコ一ス以外に他の還元物質なども測定されるた め、 1 950年代より特異性に優れた酵素法 （グルコースォキシダ一ゼ法） が導 入された。 また、 より特異的なグルコース測定法として、 へキソキナーゼ （以下、 HKと略記する） とグルコース一 6—燐酸脱水素酵素 （以下、 G6 PDHと略記 する） とを用いる HK— G 6 PDH法が標準法として採用されている。
この HK— G 6 PDH法は正確なグルコース測定値を得ることができる有用な 測定法であるが、 試薬構成成分が不安定な物質から構成されているので、 長期保 存が難しい。 そこで、 一般的に酵素や基質等は凍結乾燥品として供給され、 使用 時に緩衝液等で溶解して用いられていた。 しかし、 作業性やコスト面からも溶解 後の試薬の安定性が要求されるようになり、 例えば特開昭 56— 140899号 公報のようにグルコ一ス測定用試薬の安定性に関する技術が開示されている。 前記特開昭 56— 140899号公報には、 スルフヒドリル化合物 （例えば還 元型グルタチオン、 N—ァセチルシスティン） 及び/又はキレート剤 （例えば E DTA、 EGTA) 並びに殺菌剤及び pH緩衝剤を存在させることにより、 試薬 の安定性を図った技術が記載されている。 この技術は、 基本的には凍結乾燥品を 溶解して混合した試薬を主眼に構成されており、 補酵素以外の成分の水溶液 （B 液） の安定性を改善するもので、 その安定性はせいぜい 10日程度である。
また、 特開昭 63— 24900号公報には、 長期間 （ 1年以上） 保存可能なグ ルコース定量用安定化液体酵素組成物に関する技術が開示されている。 これは試 薬構成を酵素試薬 （へキソキナーゼ及び G6PDH) と補酵素試薬 （ATP及び NAD) の 2試薬系として、 酵素試薬には約 20〜40% (v/v) のポリオ一 ル有機溶媒、 安定剤系の EDTA、 アルブミンやポリビニルピロリ ドン等の酸化 防止剤及びアジ化ナトリウムの微生物抑制剤を添加して、 pHを約 7. 5に調整 する。 更に補酵素試薬には約 5〜 20% (v/v) のポリオ一ル有機溶媒を添加 して、 pHを約 7. 5に調整するというものである。
しかしながら、 ポリオール （グリセリン等） 含有試薬自体が粘性を有しており、 更に酸化防 _Mとしてポリビニルピロリ ドンを併用すると試薬の粘性が高くなり、 自動分析装置において、 試薬分注精度の低下等の不都合が生じ、 また、 特に補酵 素 NAD、 ATPの安定性が不十分である等の問題を有している。
近年、 特に試薬形態を供給時から液状とし、 ユーザーの作業性を向上させるこ とが求められている。 また、 これらの試薬は多くの場合、 自動分析機にて使用さ れるので、 試薬構成を 2試薬系とし、 しかも試薬組成物の安定性を長期間 （例え ば半年から 1年） 維持する必要がある。
ここで、 HK— G 6 PDH法の反応式は以下のとおりである。
HK
グルコース + AT P ^グルコース一 6—燐酸 +AD P
Mg2+
G 6 PDH
グルコース一 6—燐酸 +NADP+ ^6—ホスホーグルコン酸
+ NADPH + H+ 前記の式中で、 AT Pはアデノシン 5， 一三燐酸、 ADPはアデノシン 5， 一二燐酸、 NADP+は酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド憐酸であ る
前記反応の各構成成分のそれぞれに異なる安定条件が存在するので、 それらの 成分を配合してなるグルコース測定用試薬の安定性も各成分の組み合わせにより 相乗的に向上したり、 逆に不安定になる場合があった。 また、 従来は主に用手法で用いる 1試薬系の形態で試料と混合して測定が実施 されていたが、 自動分析機の普及によって 2試薬系が通常となっている。 これら の 2試薬系において、 試薬組成の組み合わせは、 一般的に初発酵素の基質である AT Pを開始試薬 （第二試薬） に含有させ、 残りの成分をすベて第一試薬に含有 されるケースが多い。 その他には、 第二試薬として HK又は G 6 PDH (もしく は両酵素とも） などの酵素を使用する場合があつたが、 この場合には酵素の安定 性が問題であった。 また第二試薬に AT Pを用いた場合でも充分な保存性を得る ことはできなかった。
酵素の安定化に関しては、 酵素自身の高度な精製によって有害な共雑酵素を除 去することや、 耐熱酵素類、 例えばバチルス 'ステア口サ一モフィルス
(Batillus stearothermophilus ) 由来のグルコキナーゼ （以下、 G 1 cKと略す） 、 遺伝子組換えによる酵母由来の HKなどやそれらの化学修飾 酵素を用いることによって改善されてきたが、 液状試薬全体としての保存安定性 を得ることは難しかった。
安定化された酵素類以外の構成成分のうち、 不安定化要因の最も大きな成分は、 補酵素である N A D P +や基質である A T Pであり、 特に N A D P+の劣化が保存 安定性を阻害する原因であった。
本発明者等はこうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討した結果、 液状 試薬としての充分な保存安定性を有する試薬組成を見出した。 本発明は、 こうし た知見に基づくものである。 発明の開示
本発明は、 少なくともグルコキナーゼ （Gl cK)又はへキソキナーゼ （HK) 、 グルコース一 6—燐酸脱水素酵素 （G6PDH) 及びアデノシン 5， 一三燐酸
(ATP) を含む第一試薬と、 少なくとも酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチド憐酸 （NADP+) を含む第二試薬とからなり、 第一試薬の pHが
7. 5〜9. 5であり、 第二試薬の pHが 3〜 5であり、 そしてそれぞれ液状試 薬であることを特徴とする、 グルコース測定用試薬に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明試薬を 4でで保存した場合の安定性を示すグラフである。 第 2図は、 本発明試薬を 10°Cで保存した場合の安定性を示すグラフである。 第 3図は、 比較用試薬を 4でで保存した場合の安定性を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
一般的に H K及び G 6 P D Hを使用した従来のグルコース測定試薬は、 1試薬 で使用されていたが、 自動分析機の発達とともに測定物 （グルコース） と始めに 反応する HKの補酵素 （基質） である ATPを開始試薬とした 2試液型試薬が多 かった。 その理由としては、 グルコースと最初に反応する初発酵素の HKと AT Pのうちいずれかを後から加えることによって、 G 6 PDH反応以下の検体ブラ ンクを差し引くことができるからである。 また、 AT Pを使用する理由としては、 タンパク質である HKに比べて扱いやすいためであった。
こうした考え方は、 酵素の精製度が不良であった時代にはごく一般的であった。 しかし、 高度に精製した酵素及び基質標品が手に入る現在においては、 より安定 な条件を設定することに重点をおくことができるのである。 従って、 まったく従 来では考えつかなかった試薬組成の組み合わせが開発されたのである。
本発明のグルコース測定用試薬は、
(1) G 1 c K又は HKと、 G6 PDHと、 AT Pとを含み、 pHが 7. 5〜 9. 5の液状第一試薬と、
(2) NAD P+を含み、 p Hが 3〜 5の液状第二試薬と
から構成される。
第一試薬に含まれる ATPは、 pH7. 5〜 10程度のアルカリ緩衝液中で安 定であるので、 第一試薬は、 pH7. 5〜9. 5の緩衝液に溶解させる。 pH 9. 5を越える pHは酵素安定性の点から好ましくない。 また緩衝液としては、 前記の範囲の pH値で通常使用される任意の緩衝液、 例えばトリス （ヒドロキシ メチル） ァミノメタン （以下、 トリスと略する） 緩衝液 （pH9. 0) を用いる ことができる。 HK及び G 1 c Kとしては、 pH安定性が弱アルカリ （pH7〜9. 5) にあ る酵素、 例えば酵母由来の HKやバチルス 'ステア口サ一モフィルス
(Batillus stearothermophilus ) 由来の G 1 c Kなどを用いるのが好 ましく、 配合量は、 酵素活性を発現し得る量を添加すればよく、 少なくとも 0. 2 U以上添加して用いるのが好ましい。 上限は特に限定されないが、 コスト 等を考慮して 0. 2〜 100 Uの範囲で用いればよい。
G6 PDHとしても、 pH安定性が弱アルカリ （ρΗ7〜9. 5) にある酵素、 例えばリュウコノストツク . メセンテロイデス （Leuconostoc
mesenteroides ) 由来の酵素が好適であり、 配合量は、 酵素活性を発現し得 る量を添加すればよく、 少なくとも 0. 5 U以上添加して用いるのが好ましい。 上限は特に限定されないが、 コスト等を考慮して 0. 5〜100Uの範囲で用い ればよい。
ATPは、 好ましくは 0. 5〜5 mM、 より好ましくは 1〜3 mMの量で配合 する。 第一試薬には、 その他必要に応じて、 マグネシウム塩ゃキレート剤 〔例え ば、 エチレンジァミン四酢酸 （以下、 EDTAと略する） 〕 などを添加してもよ い。
第二試薬に添加される N A D P +は酸性緩衝液中で安定であるので、 N A D P + を pH3〜5の緩衝液に溶解して、 第二試薬を調製することができる。 また緩衝 液としては、 前記の範囲の pH値で通常使用される任意の緩衝液、 例えば酢酸緩 衝液 （pH4. 0) を用いることができる。 NADP+は、 好ましくは：！〜 20 mM、 より好ましくは 5〜： L OmMの量で配合することができる。 第二試薬には、 そのほか必要に応じてマグネシウム塩を添加してもよい。 第一試薬と第二試薬と を混合した後に、 混合液が約 pH 7. 5〜8. 5になるようにすることが好まし く、 第一試薬と第二試薬の緩衝液濃度や、 その混合比を適宜設定すればよい。
実施例
以下、 実施例によつて本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ( 1 ) 以下の組成の第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬
6 2. 5mM トリス緩衝液 （pH 9. 0)
3 1. 2 5mM 塩化カリウム
1 8. 2 5mM 塩化マグネシウム
2. 5mM EDTA
2. 5mM ATP
1 UZm 1 G 1 c K
1 U/m 1 G 6 PDH
第一試薬
1 2 OmM 酢酸緩衝液 （pH 4. 0)
2. 5mM EDTA
2. 5mM NADP
(2) 安定性
前記 （1 ) で調製した第一試薬及び第二試薬を、 別々に 4 又は 1 0でで保存 し、 一定期間経過後にグルコースの自動分析に使用した。 測定実施までの保存期 間は、 第 1図及び第 2図に示すとおり、 4で保存試薬に関して、 調製直後、 1週 間後、 2週間後、 1月後、 3月後、 6月後、 9月後、 1 2月後、 1 3月後、 1 5 月後及び 1 8月後であり、 1 0°C保存試薬に関して、 調製直後、 2週間後、 1月 後、 3月後、 6月後、 9月後、 1 2月後、 1 3月後及び 1 5月後であった。
また、 検体としては、 4種のグルコース水溶液 〔すなわち、 7 6 Omg/d 1 グルコース水溶液 （図中の□) 、 57 OmgZd 1 グルコース水溶液 （図中の△) 、 3 8 Omg/d 1グルコース水溶液 （図中の〇） 若しくは 1 9 OmgZd 1グル コース水溶液 （図中の *) 〕 、 そして 2種の血清 （図中の ·及び▲) を用いた。 測定操作は、 検体 3 μ 1に第一試薬 3 2 0 1を力 Uえ、 3 7°Cで 5分間加温し た後、 第二試薬 8 0 μ 1を力 Πえ、 3 7 °Cで 5分間保温した後に、 3 4 0 nmの吸 光度を測定した。
それぞれの測定結果を第 1図 （4°C保存試薬） 及び第 2図 （1 0°C保存試薬） に示す。 比較例
(1) 以下の組成からなる比較用の第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬
62. 5mM トリス緩衝液 （pH 7. 8)
31. 25mM 塩化カリウム
18. 25mM 塩化マグネシウム
2. 5mM EDTA
2. OmM NADP
1 U/m 1 G 1 c K
lU/ml G6PDH
第二試薬
10 OmM グリシン緩衝液 （pH 9. 0)
1 OmM ATP
(2) 安定性
比較用として前記 （1) で調製した第一試薬及び第二!^を 10でにて保存し、 調製直後、 2週間後、 1月後、 2月後、 3月後、 4月後、 5月後及び 6月後に前 記実施例と同様の試験を行い、 試薬の安定性を確認した。 結果を第 3図に示す。 検体としては、 2種のグルコース水溶液 〔すなわち、 760mgZd lグルコ一 ス水溶液 （図中の□) 、 38 OmgZd 1グルコース水溶液 （図中の〇） 〕 、 そ して 2種の血清 （図中の ·及ぴ蛊） を用いた。 産業上の利用分野
本発明のグルコース測定用試薬は、 液状のままで、 暗所又は明所にて、 常温な いし低温下で長期間 （少なくとも 2年程度） にわたつて安定に貯蔵することがで きる。 従って、 臨床検査を実施する現場で長期に保存しておき、 使用に際しては、 溶解操作の必要もなく、 そのまま自動分析機などに挿入することができる。
以上、 本発明を特定め態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形は本発明 の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 少なくともグルコキナーゼ又はへキソキナーゼ、 グルコース一 6—燐酸脱水 素酵素及びアデノシン 5， 一三燐酸を含む第一試薬と、 少なくとも酸化型ニコチ ンアミ ドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試薬とからなり、 第一試薬の pHが 7. 5〜9. 5であり、 第二試薬の pHが 3〜 5であり、 そしてそれぞれ 液状試薬であることを特徴とする、 グルコース測定用試薬。
2. 第一試薬がグルコキナーゼ又はへキソキナーゼを 0. 2U以上含有する請求 項 1に記載の試薬。
3. 第一試薬がグルコース一 6—憐酸脱水素酵素を 0. 5 U以上含有する請求項 1に記載の試薬。
4. 第一試薬がアデノシン 5， 一三燐酸を 0. 5〜 5 mM含有する請求項 1に記 載の試薬。
5. 第一試薬がマグネシゥム塩又はキレート剤を更に含有する請求項 1に記載の
6. 第二試薬が酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド燐酸を 1〜20 mM含有する請求項 1に記載の試薬。
7. 第二試薬がマグネシウム塩を更に含有する請求項 1に記載の試薬。
8. 第一試薬と第二試薬との混合液の pHが 7. 5〜8. 5となるように第一試 薬及び第二試薬の緩衝液濃度を調整した、 請求項 1に記載の試薬。
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