JPH11165A - ウレアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規なウレアーゼ阻害剤及びこれを用いた尿素
窒素測定法、並びに試薬の提供。 【解決手段】水酸基を有するチオール化合物を含んでな
るウレアーゼ阻害剤、該阻害剤を用いたウレアーゼを律
速酵素として利用する尿素窒素の測定法、並びにこれに
用いる試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウレアーゼ阻害剤
及び該阻害剤を使用した、血清等体液中の尿素窒素の測
定方法並びにそれに用いられる試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】尿素はタンパク質代謝の終末産物であ
り、主として腎から排泄される。尿素の血中濃度は、体
内に於ける生成、体内分布、腎からの排泄等のバランス
によって決定されるので、その血中濃度や尿中排泄量の
測定は、タンパク質の代謝動態とその異常を判定する上
で極めて重要である。

【０００３】尿素窒素を測定する方法としては、例えば
微量拡散法，インドフェノール反応発色法，アンモニア
電極法，グルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと略
記する。）による紫外部測定法等の、ウレアーゼと尿素
とを反応させ生成するアンモニアの量を測定することに
より行う方法が知られている。

【０００４】近年、臨床検査分野に於ける自動分析装置
の普及に伴い、簡便且つ短時間で測定が可能であり、且
つ共存物質の影響のないレートアッセイ法による尿素窒
素測定法の開発が望まれている。

【０００５】一般に、レートアッセイ法により酵素の基
質となる物質を定量する場合には、酵素の基質に対する
Km値が基質濃度よりも十分大きいことが必要である。し
かしながら、ウレアーゼの尿素に対するKm値は数mM程度
と比較的小さく、レートアッセイ法により尿素窒素の測
定を行うには、反応時の尿素濃度を低くする必要があ
り、試料を高倍率に希釈する手間が必要となるため、こ
れを自動分析装置を用いる測定法に応用することは困難
であった。

【０００６】このような問題を解決するために、ウレア
ーゼの尿素に対する見かけのKm値を好ましい程度にまで
増大させ得るウレアーゼ阻害剤の開発が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、新規なウレアーゼ阻害剤
及び該阻害剤を使用した、尿素窒素測定法並びにそのた
めの試薬の提供をその課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、水酸基を有す
るチオール化合物を含んでなるウレアーゼ阻害剤の発明
である。

【０００９】また、本発明は、ウレアーゼを律速酵素と
して用いる尿素窒素の測定法であって、ウレアーゼの阻
害剤として水酸基を有するチオール化合物を用いること
を特徴とする、該測定法の発明である。

【００１０】更に、本発明は、アミノ酸脱水素酵素の基
質、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤＨと略記する。）又は還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（以下、ＮＡ
ＤＰＨと略記する。）の存在下、試料にアミノ酸脱水素
酵素を作用させ、次いでこれにウレアーゼと、水酸基を
有するチオール化合物とを加えて反応を行わせ、ＮＡＤ
Ｈ又はＮＡＤＰＨの減少速度に基づいて測定を行うこと
を特徴とする尿素窒素の測定法の発明である。

【００１１】また、本発明は、ウレアーゼと、水酸基を
有するチオール化合物とを含んでなることを特徴とす
る、尿素窒素測定用試薬の発明である。

【００１２】更にまた、本発明は、α−ケトグルタル酸
（以下、α−ＫＧと略記する。）又はその塩、ＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨ、及びグルタミン酸脱水素酵素（以下、
ＧＬＤＨと略記する。）を含んでなる試薬と、ウレアー
ゼ、及び水酸基を有するチオール化合物を含んでなる試
薬、とを組み合わせてなる尿素窒素測定用キットの発明
である。

【００１３】即ち、本発明者等は、新たなウレアーゼ阻
害剤として使用可能な化合物を求めて鋭意研究を重ねた
結果、ウレアーゼ等の所謂ＳＨ酵素の安定化剤として従
来から知られていたチオール化合物のうち、水酸基を有
するチオール化合物が、意外にも、ウレアーゼ拮抗阻害
作用を有していることを見出し、該チオール化合物をウ
レアーゼ阻害剤として使用すれば、意外にも良好な測定
感度を有する尿素窒素測定法を構築し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１４】本発明の水酸基を有するチオール化合物と
しては、分子中に少なくとも１以上の水酸基と１以上の
チオール基とを有するものであって、ウレアーゼ拮抗阻
害作用を有するものであれば、これら以外の置換基を有
していてもよく、特に限定されない。該チオール化合物
としては、例えば水酸基とチオール基とを有する炭化水
素が好ましく挙げられ、このような炭化水素としては、
上記した如き性質を有するものであれば、直鎖状、分子
状或いは環状何れにてもよく、特に限定されないが、例
えば炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルカン等の直
鎖状炭化水素を基本骨格とするもの等が挙げられる。ま
た、該チオール化合物分子中のＳＨ基の位置としては、
特に限定されないが、該チオール化合物分子の末端に結
合しているものが好ましい。

【００１５】このような本発明の水酸基とチオール基と
を有する炭化水素としては、例えば、下記一般式〔Ｉ〕
で示す直鎖状炭化水素が挙げられる。

【００１６】

【化５】

【００１７】（式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は夫々独立して、水酸
基，チオール基又は水素原子を表す。但し、Ｒ¹，Ｒ²，
ｎ個のＲ³及びｎ個のＲ⁴のうち、少なくとも１つは水酸
基であり、少なくとも１つはチオール基である。） 尚、一般式〔Ｉ〕に於けるｎの数は、通常２〜６、好ま
しくは２〜４である。

【００１８】上記した如きチオール化合物の具体例とし
ては、例えばジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記
す。）、ジチオエリスリトール（以下、ＤＴＥと略記す
る。）、メルカプトエタノール（以下、ＭＥと略記す
る。）、チオグリセロール（以下、ＴＧと略記する。）
等が好ましく挙げられる。尚、本発明のウレアーゼ阻害
剤は、上記した如き化合物を、単独で含有するものであ
っても良いし、二種以上適宜組み合わせて含有するもの
であっても良い。

【００１９】本発明のウレアーゼ阻害剤は、ウレアーゼ
を律速酵素として用いる自体公知のレートアッセイ法に
よる尿素窒素測定法に於いて用いられる試薬中に、ウレ
アーゼ阻害剤として添加して使用することができる。

【００２０】本発明の尿素窒素測定法に於いて、ウレア
ーゼ阻害剤として用いられる水酸基を有するチオール化
合物の使用濃度は、使用するチオール化合物の種類によ
ってウレアーゼに対する阻害率が異なることや、ウレア
ーゼの由来等により該チオール化合物による阻害率が異
なること等の理由により、ウレアーゼの種類及びその使
用量或いは検量範囲（直線性）をどのように設定するか
により大きく変動するため一概には言えないが、ウレア
ーゼ反応を行う際の反応液中の濃度として、通常５mM〜
500mM、好ましくは20mM〜200mMの範囲から適宜選択すれ
ばよい。より具体的には、例えば、30mg／mlの尿素窒素
標準液を用いた場合に測定感度が300×10^-4（ΔE_340nm
／min）付近で、100mg／dl以上の検量範囲を得るには、
例えば、ウレアーゼ濃度が2U／ml〜20U／mlで、ＤＴＴ
添加量が20mM〜200mMである組合せ，ウレアーゼ濃度が
１U／ml〜10U／mlで、ＭＥ添加量が20mM〜200mMである
組合せ，ウレアーゼ濃度が１U／ml〜５U／mlで、ＴＧ添
加量が100mM〜200mMである組合せ，ウレアーゼ濃度が１
U／ml〜２U／mlで、ＤＴＥ添加量が100mM〜200mMである
組合せ等が挙げられる。

【００２１】本発明の測定法は、本発明の水酸基を有す
るチオール化合物をウレアーゼ阻害剤として用いる以外
は、ウレアーゼを律速酵素として用いる自体公知の尿素
窒素測定法に準じて実施すればよく、使用される試薬類
もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。
即ち、ウレアーゼを律速酵素として用いる自体公知の尿
素窒素測定法に於いて、本発明に係る水酸基を有するチ
オール化合物をウレアーゼ阻害剤として用い、自体公知
の該尿素窒素測定法に準じて測定を行うことにより、例
えば血液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析液等の
生体由来試料中の尿素窒素を容易に且つ精度よく測定す
ることができる。

【００２２】ウレアーゼを律速酵素として用いる自体公
知の尿素窒素測定法としては、先ず、例えばアミノ酸脱
水素酵素の基質と、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、
試料にアミノ酸脱水素酵素を作用させて試料中のアンモ
ニアを消去し、次いでこれにウレアーゼ阻害剤の存在
下、ウレアーゼを反応させて試料中の尿素を加水分解し
てアンモニアに変換し、アンモニアの生成量に対応する
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度を求め、これに基づ
いて尿素窒素の測定を行う方法（以下、カイネティック
・ウレアーゼ−アミノ酸脱水素酵素法と略記する。）が
挙げられる。より具体的には、例えばアミノ酸脱水素酵
素としてＧＬＤＨを、また、アミノ酸脱水素酵素の基質
としてα−ＫＧを使用して、下記式〔Ｉ〕の反応により
試料中のアンモニアを消去し、次いで下記式〔II〕の反
応により試料中の尿素を加水分解してアンモニアに変換
し、生成するアンモニアの生成速度を、下記式〔III〕
の反応によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度として
求め、これに基づいて尿素窒素の測定を行う、という方
法（以下、カイネティック・ウレアーゼ−ＧＬＤＨ法
と、略記する。）〔CLIN. CHEM., 25/10, 1721-1729
（1979）等〕である。また、例えば下記式〔IV〕の反応
により試料中のアンモニアを消去した後、エチレンジア
ミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略記する。）によりイソ
クエン酸脱水素酵素（以下、ＩＣＤＨと略記する。）を
阻害して、更に、下記式〔II〕及び〔III〕の反応によ
りＮＡＤＰＨの減少速度を求め、これに基づいて尿素窒
素の測定を行う方法（以下、ＩＣＤＨ共役法と略記す
る。）（特公平2-18073号公報、特公平2-18075号公報、
特公平2-18076号公報等）等も好ましく挙げられる。

【００２３】

【式１】

【００２４】これら自体公知の尿素窒素測定法に於いて
用いられる試薬類としては、例えばカイネティック・ウ
レアーゼ−アミノ酸脱水素酵素法の場合、例えばα−Ｋ
Ｇ又はその塩等のアミノ酸脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨ、例えばＧＬＤＨ等のアミノ酸脱水素酵
素、ウレアーゼ等の試薬類が挙げられる。また、ＩＣＤ
Ｈ共役法の場合、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤＨ又はＮ
ＡＤＰＨ、イソクエン酸、ＧＬＤＨ、ＩＣＤＨ、マグネ
シウムイオン、ＥＤＴＡ等の試薬類が挙げられる。

【００２５】本発明の測定法に使用されるウレアーゼと
しては、その由来は特に限定されず、通常この分野で使
用されるもの、例えば、ナタマメ、藻類等の植物に由来
するもの、例えば、細菌、糸状菌等の微生物に由来する
ものや動物に由来するもの等が好ましく挙げられる。ウ
レアーゼの使用濃度としては、尿素窒素測定時の濃度が
自体公知の測定法で用いられる濃度範囲となるように尿
素窒素測定用試薬中に添加されればよく、尿素窒素測定
時の濃度として、通常0.01〜100U／ml、好ましくは0.1
〜30U／mlの範囲から適宜選択される。

【００２６】本発明の測定法に使用されるアミノ酸脱水
素酵素としては、通常この分野で使用される、例えばＧ
ＬＤＨ、アラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素等が
好ましく挙げられる。また、これらアミノ酸脱水素酵素
の由来は特に限定されないが、例えば、細菌、カビ等の
微生物に由来するもの、牛、豚等の動物に由来するもの
等が好ましく挙げられる。これらアミノ酸脱水素酵素の
使用濃度としては、用いるアミノ酸脱水素酵素の種類に
より異なるため一概には言えないが、尿素窒素測定時の
濃度が自体公知の測定法で用いられる濃度範囲となるよ
うに尿素窒素測定用試薬中に添加されればよく、尿素窒
素測定時の濃度として、通常0.1〜100U／ml、好ましく
は５〜50U／mlの範囲から適宜選択される。

【００２７】本発明の測定法に使用されるアミノ酸脱水
素酵素の基質としては、特に限定されず、例えばアミノ
酸脱水素酵素としてＧＬＤＨを用いる場合は、α−ＫＧ
又はその塩であり、例えばアラニン脱水素酵素を用いる
場合は、ピルビン酸であり、例えばロイシン脱水素酵素
を用いる場合は、α−ケトイソペンタン酸、α−ケトイ
ソヘキサン酸、α−ケトペンタン酸、α−ケトブタン
酸、α−ケトヘキサン酸等、通常この分野で使用される
ものが挙げられる。また、α−ＫＧの塩としては、例え
ばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等が挙
げられる。これらアミノ酸脱水素酵素の基質の使用濃度
としては、用いる基質の種類等により異なるため一概に
は言えないが、尿素窒素測定時の濃度が自体公知の測定
法で用いられる濃度範囲となるように尿素窒素測定用試
薬中に添加されればよく、尿素窒素測定時の濃度とし
て、通常0.1mM〜20mM、好ましくは１mM〜15mMの範囲か
ら適宜選択される。

【００２８】本発明の測定法に使用されるＮＡＤＨ又は
ＮＡＤＰＨとしては、通常この分野で使用されるもので
あればよく、その使用濃度としては、尿素窒素測定時の
濃度が自体公知の測定法で用いられる濃度範囲となるよ
うに尿素窒素測定用試薬中に添加されればよく、尿素窒
素測定時の濃度として、通常0.01〜１mM、好ましくは0.
1〜0.5mMの範囲から適宜選択される。

【００２９】本発明の測定法に使用されるＩＣＤＨとし
ては、その由来は特に限定されないが、通常この分野で
使用されているもの、例えば、細菌、カビ等の微生物に
由来するもの、牛、豚等の動物に由来するもの等が好ま
しく挙げられる。ＩＣＤＨの使用濃度としては、尿素窒
素測定時の濃度が自体公知の測定法で用いられる濃度範
囲となるように尿素窒素測定用試薬中に添加されればよ
く、尿素窒素測定時の濃度として、通常0.1〜20U／ml、
好ましくは0.3〜10U／mlの範囲から適宜選択される。

【００３０】本発明の測定法に使用されるイソクエン酸
の使用濃度としては、尿素窒素測定時の濃度が自体公知
の測定法で用いられる濃度範囲となるように尿素窒素測
定用試薬中に添加されればよく、尿素窒素測定時の濃度
として、通常１mM〜20mM、好ましくは５mM〜15mMの範囲
から適宜選択される。

【００３１】本発明の測定法に使用されるマグネシウム
イオンとしては、特に限定されず、例えば、酢酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等の通常
この分野で用いられるマグネシウム塩類に由来するもの
が全て挙げられる。これらマグネシウム塩類の使用濃度
としては、尿素窒素測定時の濃度が自体公知の測定法で
用いられる濃度範囲となるように尿素窒素測定用試薬中
に添加されればよく、尿素窒素測定時の濃度として、通
常１mM〜300mM、好ましくは50mM〜200mMの範囲から適宜
選択される。尚、上記のマグネシウム塩類は、夫々単独
で用いても良いし、二種以上適宜組み合わせて用いても
良い。

【００３２】本発明の測定法に使用されるＥＤＴＡの使
用濃度としては、尿素窒素測定時の濃度が自体公知の測
定法で用いられる濃度範囲となるように尿素窒素測定用
試薬中に添加されればよく、尿素窒素測定時の濃度とし
て、通常１〜300mM、好ましくは50〜200mMの範囲から適
宜選択される。

【００３３】本発明の測定法を２試薬系測定法により実
施するには、例えば以下の如く行えばよい。即ち、例え
ばカイネティック・ウレアーゼ−ＧＬＤＨ法の場合、先
ず、例えば血液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析
液等の生体由来試料と、例えばα−ＫＧ又はその塩、Ｎ
ＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、及びＧＬＤＨ、要すれば緩衝
剤、防腐剤、界面活性剤、賦活剤、キレート剤、安定化
剤等を含む試薬とを混合し、通常10〜50℃、好ましくは
20〜40℃で通常２〜60分間、好ましくは３〜30分間反応
させる。次いで、該反応液と、例えばウレアーゼ及び本
発明のウレアーゼ阻害剤、要すれば緩衝剤、防腐剤、界
面活性剤、賦活剤、キレート剤、安定化剤等を含む試薬
とを混合し、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃で、Ｎ
ＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度を単位時間当たりの34
0nmに於ける吸光度変化量として測定する。得られた単
位時間当たりの吸光度変化量を、例えば予め尿素窒素濃
度既知の標準液等を試料として上記と同様にして求め
た、尿素窒素濃度と単位時間当たりの吸光度変化量との
関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試
料中の尿素窒素の値が求められる。また、例えばＩＣＤ
Ｈ共役法の場合、先ず、例えば血液、血清、血漿、尿、
髄液、腹腔液、透析液等の生体由来試料と、例えばα−
ＫＧ又はその塩、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、イソクエン
酸、ＧＬＤＨ、ＩＣＤＨ及びマグネシウムイオン、要す
れば緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、賦活剤、キレート
剤、安定化剤等を含む試薬とを混合し、通常10〜50℃、
好ましくは20〜40℃で通常２〜60分間、好ましくは３〜
30分間反応させる。次いで、該反応液と、例えばウレア
ーゼ、本発明のウレアーゼ阻害剤及びＥＤＴＡ、要すれ
ば緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、賦活剤、キレート剤、
安定化剤等を含む試薬とを混合し、通常10〜50℃、好ま
しくは20〜40℃で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度
を単位時間当たりの340nmに於ける吸光度変化量として
測定する。得られた単位時間当たりの吸光度変化量を、
例えば予め尿素窒素濃度既知の標準液等を試料として上
記と同様にして求めた、尿素窒素濃度と単位時間当たり
の吸光度変化量との関係を示す検量線に当てはめること
により、生体由来試料中の尿素窒素の値が求められる。

【００３４】また、本発明の測定法は、１試薬系測定法
により実施しても良く、この場合は、例えば以下の如く
行えばよい。即ち、例えばカイネティック・ウレアーゼ
−ＧＬＤＨ法の場合、例えば血液、血清、血漿、尿、髄
液、腹腔液、透析液等の生体由来試料と、例えばα−Ｋ
Ｇ又はその塩、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、、ＧＬＤＨ、
ウレアーゼ及び本発明のウレアーゼ阻害剤、要すれば緩
衝剤、防腐剤、界面活性剤、賦活剤、キレート剤、安定
化剤等を含む試薬とを混合し、通常10〜50℃、好ましく
は20〜40℃で反応させ、反応開始から通常１〜30分後、
好ましくは１〜10分後からのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの
減少速度を単位時間当たりの340nmに於ける吸光度変化
量として測定する。得られた単位時間当たりの吸光度変
化量を、例えば予め尿素窒素濃度既知の標準液等を試料
として上記と同様にして求めた、尿素窒素濃度と単位時
間当たりの吸光度変化量との関係を示す検量線に当ては
めることにより、生体由来試料中の尿素窒素の値が求め
られる。また、例えばＩＣＤＨ共役法の場合、例えば血
液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析液等の生体由
来試料と、例えばα−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤＨ又はＮ
ＡＤＰＨ、イソクエン酸、ＧＬＤＨ、ＩＣＤＨ、マグネ
シウムイオン、ウレアーゼ、本発明のウレアーゼ阻害剤
及びＥＤＴＡ、要すれば緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、
賦活剤、キレート剤、安定化剤等を含む試薬とを混合
し、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃で反応させ、反
応開始から通常１〜30分後、好ましくは１〜10分後から
のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度を単位時間当たり
の340nmに於ける吸光度変化量として測定する。得られ
た単位時間当たりの吸光度変化量を、例えば予め尿素窒
素濃度既知の標準液等を試料として上記と同様にして求
めた、尿素窒素濃度と単位時間当たりの吸光度変化量と
の関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来
試料中の尿素窒素の値が求められる。

【００３５】本発明の尿素窒素測定用試薬は、例えば血
液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析液等の生体由
来試料中の尿素窒素を測定するために使用されるもの
で、ウレアーゼの阻害剤として本発明に係る水酸基を有
するチオール化合物を用いる以外は、上記した如き自体
公知の、ウレアーゼを律速酵素として用いる尿素窒素測
定法に使用される試薬類を、この分野で通常使用される
濃度範囲で含有するように調製されたものであり、構成
要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べたとおり
である。

【００３６】本発明の尿素窒素測定用試薬は、１試薬系
測定用として調製されたものでも２試薬系測定法用とし
て調製されたものでも又それ以上に分けたものでも何れ
にても良く、特に限定されない。尚、２試薬以上の試薬
に分けた場合には、検量範囲（直線性）、測定精度等の
点を考慮すると、以下のような組成としておくことが望
ましい。即ち、先ず、カイネティック・ウレアーゼ−Ｇ
ＬＤＨ法用の試薬の場合、第一試薬にα−ＫＧ又はその
塩、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、及びＧＬＤＨを、第二試
薬にウレアーゼ及び本発明のウレアーゼ阻害剤を含有さ
せておくことが望ましい。また、ＩＣＤＨ共役法用の試
薬の場合、第一試薬にα−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤＨ又
はＮＡＤＰＨ、イソクエン酸、ＧＬＤＨ、ＩＣＤＨ、マ
グネシウムイオンを、第二試薬にウレアーゼ、本発明の
ウレアーゼ阻害剤及びＥＤＴＡを含有させておくことが
望ましい。

【００３７】本発明の尿素窒素測定用試薬中には、緩衝
剤が含まれていても良い。本発明に於いて使用される緩
衝剤としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、例えばＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２−ヒドロキシ
−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジ
ニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）等のグット
緩衝剤等、この分野に於いて通常用いられるものであれ
ばよく、特に限定されない。これら緩衝剤は、尿素窒素
測定時のpHが、通常pH２〜pH12、好ましくはpH６〜pH10
の範囲となるように用いられる。また、これら緩衝剤の
使用濃度としては、尿素窒素測定時の濃度が自体公知の
測定法で用いられる濃度範囲となるように尿素窒素測定
用試薬中に添加されればよく、尿素窒素測定時の濃度と
して、通常１mM〜５Ｍ、好ましくは５mM〜２Ｍの範囲か
ら適宜選択される。

【００３８】また、本発明の尿素窒素測定用試薬中に
は、例えばアジ化ナトリウム，抗生物質等の防腐剤、例
えばアスコルビン酸，グルコース，牛血清アルブミン等
の安定化剤、例えばアデノシン ５’−二リン酸，塩化
ナトリウム，塩化カリウム等の賦活剤、例えばポリ（エ
チレングリコール）アルキルエーテル，ポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、例えば
ＥＤＴＡ，ヒドロキシエチルイミノ二酢酸，ジヒドロキ
シエチルグリシン等のキレート剤等、通常この分野で用
いられる試薬類が、通常この分野で用いられる濃度範囲
で含まれていてもよい。

【００３９】本発明の尿素窒素測定用試薬キットは、例
えば血液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析液等の
生体由来試料中の尿素窒素を測定するために使用される
もので、このようなキットとしては以下の如きものが望
ましい。即ち、例えばカイネティック・ウレアーゼ−Ｇ
ＬＤＨ法用キットの場合、α−ＫＧ又はその塩，ＮＡＤ
Ｈ又はＮＡＤＰＨ，及びＧＬＤＨを含んでなる試薬と、
ウレアーゼ及び本発明の阻害剤を含んでなる試薬、とを
組み合わせてなるものが挙げられる。また、例えばＩＣ
ＤＨ共役法用キットの場合、α−ＫＧ又はその塩，ＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨ，ＧＬＤＨ，イソクエン酸，ＩＣＤ
Ｈ及びマグネシウムイオンを含んでなる試薬と、ウレア
ーゼ，ＥＤＴＡ及び本発明の阻害剤を含んでなる試薬、
とを組み合わせてなるものが挙げられる。尚、夫々の構
成要素の好ましい態様、具体例等については先に述べた
通りである。また、当該キットには、必要に応じて、尿
素窒素標準品が組み合わされていてもよい。

【００４０】以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明
を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何等限
定されるものではない。

【００４１】

【実施例】

実施例１ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、試料中の尿素窒素を
測定し、その検量範囲（直線性）を検討した。 〔試料〕尿素 51.6mgを10mlの蒸留水に溶解したものを
原液（尿素窒素 約241mg／dlに相当）とし、これを15
段階に希釈したものを試料とした。 〔試薬〕 （試薬１） Ｒ−１；α−ＫＧ 10mM、ＮＡＤＰＨ 0.36mM及びＧＬ
ＤＨ 18U／mlを含有する10mM Bicine−NaOH緩衝液（p
H9.5）をＲ−１とした。 Ｒ−２；ウレアーゼ（ナタマメ由来、ベーリンガーマン
ハイム社製。以下同じ。）0.30U／mlを含有する100mM
Bicine−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （試薬２） Ｒ−１；試薬１と同じ。 Ｒ−２；ウレアーゼ 4.69U／ml及びＤＴＴ 50mMを含
有する100mM Bicine−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２と
した。 （試薬３） Ｒ−１；試薬１と同じ。 Ｒ−２；ウレアーゼ 1.08U／ml及びＭＥ 50mMを含有
する100mM Bicine−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とし
た。 （試薬４） Ｒ−１；試薬１と同じ。 Ｒ−２；ウレアーゼ 6.93U／ml、ＤＴＴ 50mM及びＭ
Ｅ 50mMを含有する100mM Bicine−NaOH緩衝液（pH7.
0）をＲ−２とした。 〔測定条件〕測定パラメータを以下のように設定して、
各試料中の尿素窒素を測定した。 測定方法；レートＡ［２２］−［２７］ 試料量 ；５μl Ｒ−１ ；２００μl Ｒ−２ ；５０μl 測定波長；４０５／３４０ｎｍ 測定温度；３７℃ 〔結果〕得られた測定結果を用いて作成した検量線を図
１に示す。尚、図１に於いて、縦軸は尿素窒素濃度（mg
／dl）を、横軸は単位時間当たりの吸光度変化量を夫々
示し、−○−は本発明のウレアーゼ阻害剤を含有しない
試薬（試薬１）を用いた場合の検量線を、−●−は本発
明のウレアーゼ阻害剤であるＤＴＴを含有する試薬（試
薬２）を用いた場合の検量線を、−◇−は本発明のウレ
アーゼ阻害剤であるＭＥを含有する試薬（試薬３）を用
いた場合の検量線を、−◆−は本発明のウレアーゼ阻害
剤であるＤＴＴとＭＥとを含有する試薬（試薬４）を用
いた場合の検量線を夫々示す。図１の結果から明らかな
ように、試薬１を用いた場合、即ち、本発明の阻害剤を
含有しない試薬を用いて測定を行った場合には、測定範
囲（直線性）が狭く、高値の尿素窒素を精度よく測定し
得ないことが判る。これに対し、試薬２及び試薬３、即
ち、本発明のウレアーゼ阻害剤であるＤＴＴ又はＭＥを
含有した試薬を用いて測定を行った場合には、良好な検
量範囲（直線性）を有し、何れも高値の尿素窒素を精度
よく測定できることが判る。また、本発明のウレアーゼ
阻害剤であるＤＴＴ及びＭＥを併用した試薬（試薬４）
を用いて測定を行った場合も、同様に良好な検量範囲
（直線性）を有し、高値の尿素窒素を高精度に測定し得
ることが判る。

【００４２】実施例２ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、試料中の尿素窒素を
測定し、その検量範囲（直線性）を検討した。 〔試料〕尿素 49.2mgを10mlの蒸留水に溶解したものを
原液（尿素窒素 約230mg／dlに相当）とし、これを15
段階に希釈したものを試料とした。 〔試薬〕 （試薬１〜３） Ｒ−１；α−ＫＧ 10mM、ＮＡＤＰＨ 0.36mM及びＧＬ
ＤＨ 18U／mlを含有する10mM Bicine−NaOH緩衝液（p
H9.5）をＲ−１とした。 Ｒ−２；所定の本発明のウレアーゼ阻害剤であるチオー
ル化合物 100mM及び所定濃度のウレアーゼ（ナタマメ
由来、ベーリンガーマンハイム社製）を含有する100mM
Bicine−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 尚、各試薬のＲ−１に含有されたチオール化合物の種類
とウレアーゼ濃度とを表１に示す。 〔測定条件〕実施例１と同じ。 〔結果〕得られた測定結果を用いて作成した検量線を図
２に示す。尚、図２に於いて、縦軸は尿素窒素濃度（mg
／dl）を、横軸は単位時間当たりの吸光度変化量を夫々
示し、−○−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるＤＴＴ
を含有する試薬（試薬１）を用いた場合の検量線を、−
●−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるＭＥを含有する
試薬（試薬２）を用いた場合の検量線を、−◇−は本発
明のウレアーゼ阻害剤であるＴＧを含有する試薬（試薬
３）を用いた場合の検量線を用いた場合の検量線を夫々
示す。

【００４３】比較例１ 〔試料〕実施例２と同じ。 〔試薬〕 （試薬４〜８） Ｒ−１；実施例２の試薬１〜３と同じ。 Ｒ−２；所定の水酸基を有さないチオール化合物 100m
Mと所定濃度のウレアーゼ（ナタマメ由来、ベーリンガ
ーマンハイム社製）を含有する100mM Bicine−NaOH緩
衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 尚、各試薬のＲ−１に含有されたチオール化合物の種類
とウレアーゼ濃度とを表１に併せて示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【００４６】〔測定条件〕実施例１と同じ。 〔結果〕得られた測定結果を用いて作成した検量線を図
２に併せて示す。尚、図２に於いて、縦軸は尿素窒素濃
度（mg／dl）を、横軸は単位時間当たりの吸光度変化量
を夫々示し、−◆−は水酸基を有さないチオール化合物
であるＮ−アセチルシステインを含有する試薬（試薬
４）を用いた場合の検量線を、−△−は水酸基を有さな
いチオール化合物であるチオリンゴ酸を含有する試薬
（試薬５）を用いた場合の検量線を、−★−は水酸基を
有さないチオール化合物であるグルタチオンを含有する
試薬（試薬６）を用いた場合の検量線を、−□−は水酸
基を有さないチオール化合物である２−メルカプトエタ
ンスルホン酸Ｎａを含有する試薬（試薬７）を用いた場
合の検量線を、−▽−は水酸基を有さないチオール化合
物である２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを含
有する試薬（試薬８）を用いた場合の検量線を夫々示
す。図２の結果から明らかなように、試薬１、試薬２及
び試薬３、即ち、本発明のウレアーゼ阻害剤（水酸基を
有するチオール化合物）であるＤＴＴ、ＭＥ又はＴＧを
含有した試薬を用いて測定を行った場合、何れも良好な
検量範囲（直線性）を有し、高値の尿素窒素を精度よく
測定できることが判る。これに対し、試薬４〜試薬８、
即ち、水酸基を有さないチオール化合物を含有した試薬
を用いて測定を行った場合、何れも測定範囲（直線性）
が狭く、高値の尿素窒素を精度よく測定し得ないことが
判る。

【００４７】実施例３ 血液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液、透析液等の生体
由来試料中の尿素窒素の測定を実施するために使用され
る測定用キットの代表的な例としては、以下のようなも
のが挙げられる。 （１）第一試薬（pH8.5〜pH10.5）：以下の試薬類を含
有。 α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ＧＬＤ
Ｈ。 （２）第二試薬（pH6.5〜pH9.0）：以下の試薬類を含
有。 ウレアーゼ 水酸基を有するチオール化合物。

【００４８】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、新規なウレ
アーゼ阻害剤及び該阻害剤を使用した尿素窒素測定法並
びに試薬を提供するものであり、本発明を使用すること
により、良好な測定感度で尿素窒素の測定を高精度に実
施し得るという効果を奏するので、斯業に貢献するとこ
ろ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた検量線を示したものであ
る。

【図２】実施例２及び比較例１で得られた検量線を示し
たものである。

【符号の説明】

図１に於いて、−○−は本発明のウレアーゼ阻害剤を含
有しない試薬（試薬１）を用いた場合の検量線を、−●
−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるジチオスレイトー
ルを含有する試薬（試薬２）を用いた場合の検量線を、
−◇−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるメルカプトエ
タノールを含有する試薬（試薬３）を用いた場合の検量
線を、−◆−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるジチオ
スレイトールとメルカプトエタノールとを含有する試薬
（試薬４）を用いた場合の検量線を夫々示す。図２に於
いて、−○−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるジチオ
スレイトールを含有する試薬（試薬１）を用いた場合の
検量線を、−●−は本発明のウレアーゼ阻害剤であるメ
ルカプトエタノールを含有する試薬（試薬２）を用いた
場合の検量線を、−◇−は本発明のウレアーゼ阻害剤で
あるチオグリセロールを含有する試薬（試薬３）を用い
た場合の検量線を、−◆−は水酸基を有さないチオール
化合物であるＮ−アセチルシステインを含有する試薬
（試薬４）を用いた場合の検量線を、−△−は水酸基を
有さないチオール化合物であるチオリンゴ酸を含有する
試薬（試薬５）を用いた場合の検量線を、−★−は水酸
基を有さないチオール化合物であるグルタチオンを含有
する試薬（試薬６）を用いた場合の検量線を、−□−は
水酸基を有さないチオール化合物である２−メルカプト
エタンスルホン酸Ｎａを含有する試薬（試薬７）を用い
た場合の検量線を、−▽−は水酸基を有さないチオール
化合物である２−メルカプト−１−メチルイミダゾール
を含有する試薬（試薬８）を用いた場合の検量線を夫々
示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水酸基を有するチオール化合物を含んで
   なるウレアーゼ阻害剤。
2. 【請求項２】 水酸基を有するチオール化合物が、水酸
   基とチオール基とを有する炭化水素である請求項１に記
   載のウレアーゼ阻害剤。
3. 【請求項３】 水酸基を有するチオール化合物が、下記
   一般式〔Ｉ〕で示される化合物である請求項１に記載の
   ウレアーゼ阻害剤。 【化１】 （式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は夫々独立して、水酸基，チオール基
   又は水素原子を表す。但し、Ｒ¹，Ｒ²，ｎ個のＲ³及び
   ｎ個のＲ⁴のうち、少なくとも１つは水酸基であり、少
   なくとも１つはチオール基である。）
4. 【請求項４】 ウレアーゼを律速酵素として用いる尿素
   窒素の測定法であって、ウレアーゼの阻害剤として水酸
   基を有するチオール化合物を用いることを特徴とする、
   該測定法。
5. 【請求項５】 アミノ酸脱水素酵素の基質、及び還元型
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの存在
   下、試料にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、次いでこれ
   にウレアーゼと、水酸基を有するチオール化合物とを加
   えて反応を行わせ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドホスフェートの減少速度に基づいて測定を行うこ
   とを特徴とする尿素窒素の測定法。
6. 【請求項６】 水酸基を有するチオール化合物が、水酸
   基とチオール基とを有する炭化水素である請求項４又は
   ５に記載の尿素窒素の測定法。
7. 【請求項７】 水酸基を有するチオール化合物が、下記
   一般式〔Ｉ〕で示される化合物である請求項４又は５に
   記載の尿素窒素の測定法。 【化２】 （式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は夫々独立して、水酸基，チオール基
   又は水素原子を表す。但し、Ｒ¹，Ｒ²，ｎ個のＲ³及び
   ｎ個のＲ⁴のうち、少なくとも１つは水酸基であり、少
   なくとも１つはチオール基である。）
8. 【請求項８】 ウレアーゼと、水酸基を有するチオール
   化合物とを含んでなることを特徴とする、尿素窒素測定
   用試薬。
9. 【請求項９】 水酸基を有するチオール化合物が、水酸
   基とチオール基とを有する炭化水素である請求項８に記
   載の尿素窒素測定用試薬。
10. 【請求項１０】 水酸基を有するチオール化合物が、下
    記一般式〔Ｉ〕で示される化合物である請求項８に記載
    の尿素窒素測定用試薬。 【化３】 （式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は夫々独立して、水酸基，チオール基
    又は水素原子を表す。但し、Ｒ¹，Ｒ²，ｎ個のＲ³及び
    ｎ個のＲ⁴のうち、少なくとも１つは水酸基であり、少
    なくとも１つはチオール基である。）
11. 【請求項１１】 α−ケトグルタル酸又はその塩、還元
    型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、及
    びグルタミン酸脱水素酵素を含んでなる試薬と、ウレア
    ーゼ、及び水酸基を有するチオール化合物を含んでなる
    試薬、とを組み合わせてなる尿素窒素測定用キット。
12. 【請求項１２】 水酸基を有するチオール化合物が、水
    酸基とチオール基とを有する炭化水素である請求項１１
    に記載の尿素窒素測定用キット。
13. 【請求項１３】 水酸基を有するチオール化合物が、下
    記一般式〔Ｉ〕で示される化合物である請求項１１に記
    載の尿素窒素測定用キット。 【化４】 （式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は夫々独立して、水酸基，チオール基
    又は水素原子を表す。但し、Ｒ¹，Ｒ²，ｎ個のＲ³及び
    ｎ個のＲ⁴のうち、少なくとも１つは水酸基であり、少
    なくとも１つはチオール基である。）