JPH08252098A - アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 - Google Patents
アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法Info
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- JPH08252098A JPH08252098A JP187396A JP187396A JPH08252098A JP H08252098 A JPH08252098 A JP H08252098A JP 187396 A JP187396 A JP 187396A JP 187396 A JP187396 A JP 187396A JP H08252098 A JPH08252098 A JP H08252098A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中のアンモニウムイオンを消去する方法
及び試料中の特定成分を測定する方法の提供。 【解決手段】 α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水
素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬は、溶液状
態において長期間安定であり、また血清などの生体試料
中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンを効率良く
消去できる。従って、この試薬を生体試料に添加して試
料中に当初存在するアンモニウムイオンを消去し、しか
る後に、生体試料中の特定成分よりアンモニウムイオン
を発生させて該特定成分を測定する場合に、該特定成分
を極めて正確に測定することができる。
及び試料中の特定成分を測定する方法の提供。 【解決手段】 α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水
素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬は、溶液状
態において長期間安定であり、また血清などの生体試料
中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンを効率良く
消去できる。従って、この試薬を生体試料に添加して試
料中に当初存在するアンモニウムイオンを消去し、しか
る後に、生体試料中の特定成分よりアンモニウムイオン
を発生させて該特定成分を測定する場合に、該特定成分
を極めて正確に測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アンモニウムイオ
ンの消去方法、及び試料中の特定成分の測定方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、試料中の特定成分から
アンモニウムイオンを発生させて発生したアンモニウム
イオンに基づいて特定成分を測定する場合、試料中に当
初から存在する内因性アンモニウムイオンを酵素反応に
より消去し、正確に該特定成分を測定する方法に関する
ものである。本発明は、特に、臨床検査において有効な
方法である。
ンの消去方法、及び試料中の特定成分の測定方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、試料中の特定成分から
アンモニウムイオンを発生させて発生したアンモニウム
イオンに基づいて特定成分を測定する場合、試料中に当
初から存在する内因性アンモニウムイオンを酵素反応に
より消去し、正確に該特定成分を測定する方法に関する
ものである。本発明は、特に、臨床検査において有効な
方法である。
【０００２】
【従来の技術】試料中の特定成分を測定するとき、試料
等にアンモニウムイオンが存在すると、その特定成分を
正確に測定できないことがある。例えば、試料中の特定
成分からアンモニウムイオンを発生させ、そのアンモニ
ウムイオンの量を測定することにより、該特定成分の量
を測定する場合、その試料に当初からアンモニウムイオ
ンが含まれているときは、該特定成分の量を正確に測定
できにくい。そのような特定成分として、尿素窒素、ク
レアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、カルシウムイオン等が知られている。これらの成分
は、以下の式のように、アンモニウムイオンを酵素反応
により発生させて、測定できる。
等にアンモニウムイオンが存在すると、その特定成分を
正確に測定できないことがある。例えば、試料中の特定
成分からアンモニウムイオンを発生させ、そのアンモニ
ウムイオンの量を測定することにより、該特定成分の量
を測定する場合、その試料に当初からアンモニウムイオ
ンが含まれているときは、該特定成分の量を正確に測定
できにくい。そのような特定成分として、尿素窒素、ク
レアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、カルシウムイオン等が知られている。これらの成分
は、以下の式のように、アンモニウムイオンを酵素反応
により発生させて、測定できる。
【０００３】
【化１】ウレアーゼによる尿素窒素の測定 （α−ＫＧはα−ケトグルタル酸を意味し、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元
型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
還元型を意味する）
（Ｐ）Ｈはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元
型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
還元型を意味する）
【０００４】
【化２】
【０００５】
【化３】
【０００６】
【化４】
【０００７】
【化５】
【０００８】
【化６】
【０００９】一方、測定しようとする試料中にも、アン
モニウムイオンが当初から存在することも多い。なお、
本明細書では、このような試料中にあらかじめ存在する
アンモニウムイオンを内因性アンモニウムイオンと記載
することもある。それらの内因性アンモニウムイオンが
存在すると、酵素反応によりアンモニウムイオンを発生
させて特定成分を測定しようとするとき、試料中のアン
モニウムイオンが測定値に正誤差を与えて、該成分を正
確に測定することはできない。そのため、内因性アンモ
ニウムイオンを、あらかじめ、消去しておくことが必要
となる。一方、尿素窒素などの測定すべき試料中の生体
成分は不安定であるため、測定はなるべく迅速に、しか
もできるだけ温和な条件で行われるのが望ましい。この
様な条件に適している内因性アンモニウムイオンの消去
方法は、酵素を使用した方法である。そのような方法と
して、以下の式に示されるように、内因性アンモニウム
イオンとα−ケトグルタル酸（以下α−ＫＧと記載する
こともある）とをグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬ
ＤＨと記載することもある）の存在下、グルタミン酸に
変換させて該アンモニウムイオンを消去する方法（ＧＬ
ＤＨ法）が考えられる。
モニウムイオンが当初から存在することも多い。なお、
本明細書では、このような試料中にあらかじめ存在する
アンモニウムイオンを内因性アンモニウムイオンと記載
することもある。それらの内因性アンモニウムイオンが
存在すると、酵素反応によりアンモニウムイオンを発生
させて特定成分を測定しようとするとき、試料中のアン
モニウムイオンが測定値に正誤差を与えて、該成分を正
確に測定することはできない。そのため、内因性アンモ
ニウムイオンを、あらかじめ、消去しておくことが必要
となる。一方、尿素窒素などの測定すべき試料中の生体
成分は不安定であるため、測定はなるべく迅速に、しか
もできるだけ温和な条件で行われるのが望ましい。この
様な条件に適している内因性アンモニウムイオンの消去
方法は、酵素を使用した方法である。そのような方法と
して、以下の式に示されるように、内因性アンモニウム
イオンとα−ケトグルタル酸（以下α−ＫＧと記載する
こともある）とをグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬ
ＤＨと記載することもある）の存在下、グルタミン酸に
変換させて該アンモニウムイオンを消去する方法（ＧＬ
ＤＨ法）が考えられる。
【００１０】
【化７】
【００１１】この方法は、補酵素として、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと記
載することもある）またはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと記載する
こともある）を使用しなければならない。しかし、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈは２００〜４２０ｎｍの領域の波長に大きな
吸収をもつ。なお、本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを表わすものとする。
一方、中間体としてアンモニウムイオンを経由して特定
成分を測定するときも、前記した反応式から明らかなよ
うに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いており、従ってＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの反応前後のこの領域の波長における吸光度の
増減を利用して測定することも多い。この場合、該特定
成分を測定しようとすると、試料中の内因性アンモニウ
ムイオンを消去するために用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが残存
し、そのためＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が多くなり、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの干渉をうけ、測定可能な吸光度の範囲を越え
てしまい、該特定成分の測定値が正確でなくなることが
ある。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自身は、還元作用があるの
で、大量に使用すると、試料中の特定成分を測定する方
法のうちでも特に酸化反応を利用して特定成分を測定し
ようとする方法に悪影響を与える。よって、従来のＧＬ
ＤＨ法により内因性アンモニウムイオンを消去するとき
は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを大量に使用しなければならないの
で、ＧＬＤＨ法による消去方法は、使用しにくいという
欠点がある。
ドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと記
載することもある）またはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと記載する
こともある）を使用しなければならない。しかし、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈは２００〜４２０ｎｍの領域の波長に大きな
吸収をもつ。なお、本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを表わすものとする。
一方、中間体としてアンモニウムイオンを経由して特定
成分を測定するときも、前記した反応式から明らかなよ
うに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いており、従ってＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの反応前後のこの領域の波長における吸光度の
増減を利用して測定することも多い。この場合、該特定
成分を測定しようとすると、試料中の内因性アンモニウ
ムイオンを消去するために用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが残存
し、そのためＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が多くなり、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの干渉をうけ、測定可能な吸光度の範囲を越え
てしまい、該特定成分の測定値が正確でなくなることが
ある。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自身は、還元作用があるの
で、大量に使用すると、試料中の特定成分を測定する方
法のうちでも特に酸化反応を利用して特定成分を測定し
ようとする方法に悪影響を与える。よって、従来のＧＬ
ＤＨ法により内因性アンモニウムイオンを消去するとき
は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを大量に使用しなければならないの
で、ＧＬＤＨ法による消去方法は、使用しにくいという
欠点がある。
【００１２】一方、ＧＬＤＨ法の改良法で、かつ、少量
のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用する方法も、提案されている。
すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが酸化されて生じるＮＡＤ
（Ｐ） + を、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）以外
の脱水素酵素（以下、共役脱水素酵素と記載することも
ある）とその基質の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生
することで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを少量にする方法
も知られている。このような共役脱水素酵素を用いる方
法としては、以下の式に示すように、イソクエン酸及び
イソクエン酸脱水素酵素を用いるイソクエン酸脱水素酵
素法（特開昭６２−６７００）、グルコース及びグルコ
ース脱水素酵素を用いるグルコース脱水素酵素法（特開
平５−１０３６９７）が知られている。
のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用する方法も、提案されている。
すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが酸化されて生じるＮＡＤ
（Ｐ） + を、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）以外
の脱水素酵素（以下、共役脱水素酵素と記載することも
ある）とその基質の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生
することで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを少量にする方法
も知られている。このような共役脱水素酵素を用いる方
法としては、以下の式に示すように、イソクエン酸及び
イソクエン酸脱水素酵素を用いるイソクエン酸脱水素酵
素法（特開昭６２−６７００）、グルコース及びグルコ
ース脱水素酵素を用いるグルコース脱水素酵素法（特開
平５−１０３６９７）が知られている。
【００１３】
【化８】
【００１４】しかし、イソクエン酸脱水素酵素法におい
ては、アンモニウムイオンの消去のための試薬、例えば
イソクエン酸は、溶液中で安定性が悪い。そのため、試
薬を溶解して長時間経過した後は、試料中の特定成分を
正確に測定できないという問題点があった。また、イソ
クエン酸脱水素酵素法に用いられるイソクエン酸脱水素
酵素は、金属要求性なので、ＥＤＴＡ等のキレート化剤
を添加することにより、反応が停止する。従ってこのキ
レート化剤を、特定成分の測定に用いる第２試薬に添加
することにより、アンモニウムイオンの消去反応を停止
させるとともに、目的とする特定成分の定量を行う方法
が採用されている。一方、臨床検査分野では、一般に、
血液を採取する際、血液を凝固をさせないためにＥＤＴ
Ａやクエン酸等のキレート化剤を血液に添加し、カルシ
ウムイオンをキレート化する。このような処理をした生
体試料を測定するとき、上記のイソクエン酸脱水素酵素
法では、イソクエン酸脱水素酵素の反応が阻害され、ア
ンモニウムイオンの消去反応が阻害される可能性があ
る。また、試料中の特定成分として臨床的に意義がある
ロイシンアミノペプチダーゼを測定する際に、前記反応
式で示したようにロイシンアミドを基質に用いる場合、
内因性アンモニウムイオンの存在は測定誤差を及ぼすの
で、あらかじめ消去することが望ましいが、イソクエン
酸脱水素酵素法を用いると、キレート化剤が試薬中に存
在することになるので、Ｍｇ2+またはＭｎ2+で活性化さ
れるロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害してしま
う。さらに、前記反応式で示したようにトランスグルタ
ミナーゼによって試料中の特定成分としてカルシウムイ
オンを定量しようとするときも、内因性のアンモニウム
イオンを消去することが望ましいが、キレート化剤を利
用するイソクエン酸脱水素酵素法を用いると、カルシウ
ムイオンがキレート化されてしまうので、使用できな
い。このように、金属要求性の酵素を用い、かつ、アン
モニウムイオンが反応中間体である試料中の特定成分の
測定方法においては、内因性アンモニウムイオンの消去
法としてイソクエン酸脱水素酵素法は適切ではない。
ては、アンモニウムイオンの消去のための試薬、例えば
イソクエン酸は、溶液中で安定性が悪い。そのため、試
薬を溶解して長時間経過した後は、試料中の特定成分を
正確に測定できないという問題点があった。また、イソ
クエン酸脱水素酵素法に用いられるイソクエン酸脱水素
酵素は、金属要求性なので、ＥＤＴＡ等のキレート化剤
を添加することにより、反応が停止する。従ってこのキ
レート化剤を、特定成分の測定に用いる第２試薬に添加
することにより、アンモニウムイオンの消去反応を停止
させるとともに、目的とする特定成分の定量を行う方法
が採用されている。一方、臨床検査分野では、一般に、
血液を採取する際、血液を凝固をさせないためにＥＤＴ
Ａやクエン酸等のキレート化剤を血液に添加し、カルシ
ウムイオンをキレート化する。このような処理をした生
体試料を測定するとき、上記のイソクエン酸脱水素酵素
法では、イソクエン酸脱水素酵素の反応が阻害され、ア
ンモニウムイオンの消去反応が阻害される可能性があ
る。また、試料中の特定成分として臨床的に意義がある
ロイシンアミノペプチダーゼを測定する際に、前記反応
式で示したようにロイシンアミドを基質に用いる場合、
内因性アンモニウムイオンの存在は測定誤差を及ぼすの
で、あらかじめ消去することが望ましいが、イソクエン
酸脱水素酵素法を用いると、キレート化剤が試薬中に存
在することになるので、Ｍｇ2+またはＭｎ2+で活性化さ
れるロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害してしま
う。さらに、前記反応式で示したようにトランスグルタ
ミナーゼによって試料中の特定成分としてカルシウムイ
オンを定量しようとするときも、内因性のアンモニウム
イオンを消去することが望ましいが、キレート化剤を利
用するイソクエン酸脱水素酵素法を用いると、カルシウ
ムイオンがキレート化されてしまうので、使用できな
い。このように、金属要求性の酵素を用い、かつ、アン
モニウムイオンが反応中間体である試料中の特定成分の
測定方法においては、内因性アンモニウムイオンの消去
法としてイソクエン酸脱水素酵素法は適切ではない。
【００１５】一方、グルコース脱水素酵素法において
も、該酵素法で基質として使用されるグルコースの影響
により測定できる特定成分の範囲が限定される等の問題
がある。即ち、臨床検査分野用の自動分析装置を用いる
場合、尿素窒素などと同時にグルコ−スを測定すること
が一般化されているので、グルコ−ス脱水素酵素法にお
いては、基質として用いるグルコ−スがグルコ−スの測
定系に影響を及ぼす可能性がある。そのため、この分野
でのグルコース脱水素酵素法の使用は限定されてしま
う。また、グルコース脱水素酵素法の問題点のひとつ
に、グルコース脱水素酵素の阻害剤に適当なものがない
ことがあげられる。現に、特開平５−１０３６９７に記
載されている阻害剤は、モノヨード酢酸であるが、モノ
ヨード酢酸は、タンパク質、特に酵素のＳＨ基に特異的
に反応する物質の一種で、アルコール脱水素酵素やホス
ホグリセルアルデヒド脱水素酵素等の、活性中心にＳＨ
基をもつ酵素の活性を阻害してしまう物質であるため、
このような阻害剤を用いると、試料中の特定成分の測定
に利用する酵素が限定されてしまう。したがって、試料
中の特定成分を測定する方法で内因性アンモニウムイオ
ンが存在すると特定成分を正確に測定できない場合にお
いて、使用に際して汎用性をもち、かつ、使用する試薬
を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定でき
る、内因性アンモニウムイオンの消去方法が求められて
いた。
も、該酵素法で基質として使用されるグルコースの影響
により測定できる特定成分の範囲が限定される等の問題
がある。即ち、臨床検査分野用の自動分析装置を用いる
場合、尿素窒素などと同時にグルコ−スを測定すること
が一般化されているので、グルコ−ス脱水素酵素法にお
いては、基質として用いるグルコ−スがグルコ−スの測
定系に影響を及ぼす可能性がある。そのため、この分野
でのグルコース脱水素酵素法の使用は限定されてしま
う。また、グルコース脱水素酵素法の問題点のひとつ
に、グルコース脱水素酵素の阻害剤に適当なものがない
ことがあげられる。現に、特開平５−１０３６９７に記
載されている阻害剤は、モノヨード酢酸であるが、モノ
ヨード酢酸は、タンパク質、特に酵素のＳＨ基に特異的
に反応する物質の一種で、アルコール脱水素酵素やホス
ホグリセルアルデヒド脱水素酵素等の、活性中心にＳＨ
基をもつ酵素の活性を阻害してしまう物質であるため、
このような阻害剤を用いると、試料中の特定成分の測定
に利用する酵素が限定されてしまう。したがって、試料
中の特定成分を測定する方法で内因性アンモニウムイオ
ンが存在すると特定成分を正確に測定できない場合にお
いて、使用に際して汎用性をもち、かつ、使用する試薬
を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定でき
る、内因性アンモニウムイオンの消去方法が求められて
いた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、試料中の特
定成分を測定する方法で、かつ、試料中に、アンモニウ
ムイオンが当初から存在すると特定成分を正確に測定で
きない場合、あらかじめ、その試料中のアンモニウムイ
オンを消去する方法を提供することである。また、その
場合、試料中のアンモニウムイオンを消去することによ
り、試料中の該特定成分を正確に測定する方法を提供す
ることである。さらに、その方法において、入手しやす
い試薬を用い、使用に際して汎用性をもち、かつ、用い
る試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測
定できる方法を、提供することである。
定成分を測定する方法で、かつ、試料中に、アンモニウ
ムイオンが当初から存在すると特定成分を正確に測定で
きない場合、あらかじめ、その試料中のアンモニウムイ
オンを消去する方法を提供することである。また、その
場合、試料中のアンモニウムイオンを消去することによ
り、試料中の該特定成分を正確に測定する方法を提供す
ることである。さらに、その方法において、入手しやす
い試薬を用い、使用に際して汎用性をもち、かつ、用い
る試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測
定できる方法を、提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記現状
に鑑み、試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオ
ンの影響を受けない、試料中の特定の生体成分の正確な
測定方法で、かつ、測定試薬が安定な方法について、鋭
意、検討した。その結果、驚くべきことに、内因性アン
モニウムイオンにα−ケトグルタル酸とグルタミン酸脱
水素酵素とを作用させて内因性アンモニウムイオンをグ
ルタミン酸に変換させるグルタミン酸脱水素酵素による
内因性アンモニウムイオンの消去法（ＧＬＤＨ法）にお
いて、ギ酸脱水素酵素（以下、ＦＤＨと記載することも
ある）を共役脱水素酵素として用いるＧＬＤＨ法の改良
法により、使用する試薬を溶解して長時間放置しても、
高濃度のアンモニウムイオンを消去でき、かつ、試料中
の特定の生体成分が正確に測定できることを見い出し
た。本発明は、かかる知見により見い出されたものであ
る。
に鑑み、試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオ
ンの影響を受けない、試料中の特定の生体成分の正確な
測定方法で、かつ、測定試薬が安定な方法について、鋭
意、検討した。その結果、驚くべきことに、内因性アン
モニウムイオンにα−ケトグルタル酸とグルタミン酸脱
水素酵素とを作用させて内因性アンモニウムイオンをグ
ルタミン酸に変換させるグルタミン酸脱水素酵素による
内因性アンモニウムイオンの消去法（ＧＬＤＨ法）にお
いて、ギ酸脱水素酵素（以下、ＦＤＨと記載することも
ある）を共役脱水素酵素として用いるＧＬＤＨ法の改良
法により、使用する試薬を溶解して長時間放置しても、
高濃度のアンモニウムイオンを消去でき、かつ、試料中
の特定の生体成分が正確に測定できることを見い出し
た。本発明は、かかる知見により見い出されたものであ
る。
【００１８】本発明は、試料に、α−ケトグルタル酸、
グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及び
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作
用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去
する方法である。なお、このアンモニウムイオン消去方
法をアンモニウムイオンの本発明消去方法と記載するこ
ともある。また、本発明は、試料中の特定成分からアン
モニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定す
る方法において、あらかじめ、その試料に、α−ケトグ
ルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素
酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元
型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイ
オンを消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在
下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生さ
せて試料中の特定成分を測定する方法である。なお、こ
の試料中の特定成分を測定する方法を、本発明の特定成
分測定方法と記載することもある。本明細書において、
特定成分とは、測定対象と決められた成分をいうものと
する。
グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及び
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作
用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去
する方法である。なお、このアンモニウムイオン消去方
法をアンモニウムイオンの本発明消去方法と記載するこ
ともある。また、本発明は、試料中の特定成分からアン
モニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定す
る方法において、あらかじめ、その試料に、α−ケトグ
ルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素
酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元
型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイ
オンを消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在
下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生さ
せて試料中の特定成分を測定する方法である。なお、こ
の試料中の特定成分を測定する方法を、本発明の特定成
分測定方法と記載することもある。本明細書において、
特定成分とは、測定対象と決められた成分をいうものと
する。
【００１９】本発明の特定成分測定方法は、通常、試料
中のアンモニウムイオンの消去反応、特定成分の測定反
応の２段階反応により実施できる。試料中のアンモニウ
ムイオンの消去反応は、試料中のアンモニウムイオンを
消去するための試薬であって、α−ケトグルタル酸、グ
ルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む
試薬を用いることにより実現できる。本発明の特定成分
測定方法は、試料中の特定成分を測定するキットであっ
て、 ｉ）上記の試料中のアンモニウムイオンを消去するため
の試薬からなる第１試薬、及び ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生
させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含
む第２試薬、 からなるキットを用いて実現できる。この第１試薬は、
溶液状態で安定である。したがって、第２試薬を安定な
溶液にすると、本発明のキットは、液状試薬として使用
できる。
中のアンモニウムイオンの消去反応、特定成分の測定反
応の２段階反応により実施できる。試料中のアンモニウ
ムイオンの消去反応は、試料中のアンモニウムイオンを
消去するための試薬であって、α−ケトグルタル酸、グ
ルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む
試薬を用いることにより実現できる。本発明の特定成分
測定方法は、試料中の特定成分を測定するキットであっ
て、 ｉ）上記の試料中のアンモニウムイオンを消去するため
の試薬からなる第１試薬、及び ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生
させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含
む第２試薬、 からなるキットを用いて実現できる。この第１試薬は、
溶液状態で安定である。したがって、第２試薬を安定な
溶液にすると、本発明のキットは、液状試薬として使用
できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明のアンモニウムイオンの消
去法は、従来のＧＬＤＨ法において、更に共役脱水素酵
素としてギ酸脱水素酵素を用いるものであり、その方法
を反応式で示すと以下のようになる。
去法は、従来のＧＬＤＨ法において、更に共役脱水素酵
素としてギ酸脱水素酵素を用いるものであり、その方法
を反応式で示すと以下のようになる。
【００２１】
【化９】
【００２２】本明細書において、当初から存在するアン
モニウムイオンとは、主に、測定処理前から試料中に存
在していたアンモニウムイオン、すなわち、内因性アン
モニウムイオンをいう。ただし、アンモニウムイオンの
本発明消去反応に使用する試薬に混在していたアンモニ
ウムイオンをも含めるものとする。
モニウムイオンとは、主に、測定処理前から試料中に存
在していたアンモニウムイオン、すなわち、内因性アン
モニウムイオンをいう。ただし、アンモニウムイオンの
本発明消去反応に使用する試薬に混在していたアンモニ
ウムイオンをも含めるものとする。
【００２３】本発明の試料とは、特定成分を含むもので
あれば、特に限定しない。血清、血漿、尿等の生体試料
及びそれらを処理した液、並びにそれらのモデルサンプ
ルを例示できる。通常、試料は１〜１００μｌの量で使
用する。アンモニウムイオンの本発明消去反応は、通
常、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ
酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型を含む試薬を使用できる。通常、
この試薬を第１試薬として、特定成分を測定するキット
中に含むことができる。
あれば、特に限定しない。血清、血漿、尿等の生体試料
及びそれらを処理した液、並びにそれらのモデルサンプ
ルを例示できる。通常、試料は１〜１００μｌの量で使
用する。アンモニウムイオンの本発明消去反応は、通
常、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ
酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型を含む試薬を使用できる。通常、
この試薬を第１試薬として、特定成分を測定するキット
中に含むことができる。
【００２４】本発明に用いられるグルタミン酸脱水素酵
素（ＧＬＤＨ）の由来は、特に限定されないが、牛の肝
臓や細菌由来のものが好ましい。第１試薬中のＧＬＤＨ
の濃度は好ましくは０．１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さ
らに好ましくは１〜７０ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
素（ＧＬＤＨ）の由来は、特に限定されないが、牛の肝
臓や細菌由来のものが好ましい。第１試薬中のＧＬＤＨ
の濃度は好ましくは０．１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さ
らに好ましくは１〜７０ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
【００２５】第１試薬に用いられるα−ケトグルタル酸
の量は、特に限定されないが、０．１〜５０ｍＭ、好ま
しくは１〜３０ｍＭである。
の量は、特に限定されないが、０．１〜５０ｍＭ、好ま
しくは１〜３０ｍＭである。
【００２６】本発明に用いられるギ酸脱水素酵素（ＦＤ
Ｈ）の由来は特に限定されないが、細菌、エンドウ、イ
ンゲン豆、ニワトリ、牛の肝臓由来のものが好ましい。
特に、細菌由来のものが好ましい。第１試薬に用いられ
るＦＤＨの濃度は好ましくは０．０１〜１００ｕｎｉｔ
／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５ｕｎｉｔ／ｍｌの
範囲である。
Ｈ）の由来は特に限定されないが、細菌、エンドウ、イ
ンゲン豆、ニワトリ、牛の肝臓由来のものが好ましい。
特に、細菌由来のものが好ましい。第１試薬に用いられ
るＦＤＨの濃度は好ましくは０．０１〜１００ｕｎｉｔ
／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５ｕｎｉｔ／ｍｌの
範囲である。
【００２７】第１試薬のギ酸の量は、特に限定されない
が、１〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭで
ある。
が、１〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭで
ある。
【００２８】本発明に用いられるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ
の由来は特に限定されるものではない。ただし、ＧＬＤ
ＨまたはＦＤＨがＮＡＤＨ依存性の場合は、補酵素とし
てＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ依存性の場合はＮＡＤＰＨを用
いるとよい。第１試薬のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃
度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０
ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜２ｍＭである。通常、
第２試薬を添加したときＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定す
るための波長での吸光度が２を越えないように、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ濃度を選択する。これらの消去のための試薬の
量が少ないと反応が進みにくいことがあり、多いと試薬
が無駄なことがあり、また、試料中の特性成分を測定で
きなくなることがある。
の由来は特に限定されるものではない。ただし、ＧＬＤ
ＨまたはＦＤＨがＮＡＤＨ依存性の場合は、補酵素とし
てＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ依存性の場合はＮＡＤＰＨを用
いるとよい。第１試薬のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃
度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０
ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜２ｍＭである。通常、
第２試薬を添加したときＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定す
るための波長での吸光度が２を越えないように、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ濃度を選択する。これらの消去のための試薬の
量が少ないと反応が進みにくいことがあり、多いと試薬
が無駄なことがあり、また、試料中の特性成分を測定で
きなくなることがある。
【００２９】アンモニウムイオンの本発明消去反応にお
いて、反応溶液のｐＨは、好ましくは６〜１１、さらに
好ましくは７〜１０である。ｐＨが６未満または１１を
越えるときは、反応が進行しにくいことがある。該消去
のための緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリエタノールア
ミン緩衝液、硼酸緩衝液等を使用できる。該消去反応の
温度は、通常、１０〜５０℃である。第１試薬の量は、
適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、
２０〜２００容量が好ましい。
いて、反応溶液のｐＨは、好ましくは６〜１１、さらに
好ましくは７〜１０である。ｐＨが６未満または１１を
越えるときは、反応が進行しにくいことがある。該消去
のための緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリエタノールア
ミン緩衝液、硼酸緩衝液等を使用できる。該消去反応の
温度は、通常、１０〜５０℃である。第１試薬の量は、
適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、
２０〜２００容量が好ましい。
【００３０】アンモニウムイオンの本発明消去反応は、
α−ケトグルタル酸、ＧＬＤＨ、ＦＤＨ、ギ酸、及びＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、上記した緩衝液に加えてア
ンモニウムイオンを消去するための試薬を調製し、この
試薬を試料に添加して、上記した温度で数分間反応させ
ることによって実施できる。尚、この試薬は、本発明の
試料中の特定成分を測定するキットの構成要素である第
１試薬として用いられる。本発明の第１試薬は、溶液状
態において長期保存して安定であり、従って、測定キッ
トの構成要素として極めて好ましいものである。
α−ケトグルタル酸、ＧＬＤＨ、ＦＤＨ、ギ酸、及びＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、上記した緩衝液に加えてア
ンモニウムイオンを消去するための試薬を調製し、この
試薬を試料に添加して、上記した温度で数分間反応させ
ることによって実施できる。尚、この試薬は、本発明の
試料中の特定成分を測定するキットの構成要素である第
１試薬として用いられる。本発明の第１試薬は、溶液状
態において長期保存して安定であり、従って、測定キッ
トの構成要素として極めて好ましいものである。
【００３１】アンモニウムイオンの本発明消去反応は、
内因性アンモニウムイオンが存在すると該特定成分を正
確に測定できない場合に適用すると有効である。
内因性アンモニウムイオンが存在すると該特定成分を正
確に測定できない場合に適用すると有効である。
【００３２】本発明において、アンモニウムイオンを発
生させてその試料中の特定成分を測定する方法として
は、従来の技術の項で述べたように、ウレアーゼによる
尿素窒素の測定、クレアチニンデイミナーゼによるクレ
アチニンの測定、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼ
によるクレアチニンの測定、クレアチナーゼによるクレ
アチンの測定、ロイシンアミドによるロイシンアミノペ
プチダーゼの測定、トランスグルタミナーゼによるカル
シウムイオンの測定を例示できる。
生させてその試料中の特定成分を測定する方法として
は、従来の技術の項で述べたように、ウレアーゼによる
尿素窒素の測定、クレアチニンデイミナーゼによるクレ
アチニンの測定、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼ
によるクレアチニンの測定、クレアチナーゼによるクレ
アチンの測定、ロイシンアミドによるロイシンアミノペ
プチダーゼの測定、トランスグルタミナーゼによるカル
シウムイオンの測定を例示できる。
【００３３】ウレアーゼによる尿素窒素の測定方法に用
いる試薬としては、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができ
る。
いる試薬としては、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができ
る。
【００３４】クレアチニンデイミナーゼによるクレアチ
ニンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチニンデ
イミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを
含む試薬を用いることができる。クレアチニナーゼ及び
クレアチナーゼによるクレアチニンの測定は、クレアチ
ニナーゼ、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることがで
きる。
ニンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチニンデ
イミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを
含む試薬を用いることができる。クレアチニナーゼ及び
クレアチナーゼによるクレアチニンの測定は、クレアチ
ニナーゼ、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることがで
きる。
【００３５】クレアチナーゼによるクレアチンの測定方
法に用いる試薬としては、クレアチナーゼ、ウレアー
ゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬
を用いることができる。
法に用いる試薬としては、クレアチナーゼ、ウレアー
ゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬
を用いることができる。
【００３６】ロイシンアミドによるロイシンアミノペプ
チダーゼの測定方法に用いる試薬としては、Ｌ−ロイシ
ンアミド、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含
む試薬を用いることができる。
チダーゼの測定方法に用いる試薬としては、Ｌ−ロイシ
ンアミド、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含
む試薬を用いることができる。
【００３７】トランスグルタミナーゼによるカルシウム
イオンの測定方法に用いる試薬としては、ａｐｏ−トラ
ンスグルタミナーゼ、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
グルタミン、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを
含む試薬を用いることができる。通常、これらの特定成
分の測定反応のための試薬を第２試薬として、試料中の
特定成分を測定する本発明のキット中に含むことができ
る。ただし、これらの試薬の中で、アンモニウムイオン
の本発明消去反応に含まれている成分、すなわちα−Ｋ
Ｇ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧＬＤＨに関しては、それぞれ、
省略することができる。第２試薬の量は、適宜変えるこ
とができるが、通常、試料１容量に対し、５〜８０容量
が好ましい。
イオンの測定方法に用いる試薬としては、ａｐｏ−トラ
ンスグルタミナーゼ、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
グルタミン、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを
含む試薬を用いることができる。通常、これらの特定成
分の測定反応のための試薬を第２試薬として、試料中の
特定成分を測定する本発明のキット中に含むことができ
る。ただし、これらの試薬の中で、アンモニウムイオン
の本発明消去反応に含まれている成分、すなわちα−Ｋ
Ｇ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧＬＤＨに関しては、それぞれ、
省略することができる。第２試薬の量は、適宜変えるこ
とができるが、通常、試料１容量に対し、５〜８０容量
が好ましい。
【００３８】これらの特定成分の測定に用いる試薬、す
なわち、第２試薬の中には、ギ酸脱水素酵素阻害剤をい
れておくことが好ましい。すなわち、ギ酸脱水素酵素阻
害剤の存在下、試料中の特定成分を測定する方法が好ま
しい。なぜなら、試料中の内因性アンモニウムイオンの
消去のための反応系におけるギ酸脱水素酵素によるＮＡ
Ｄ（Ｐ）+ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応は、試料中の特
定成分を測定するための反応系の最終反応であるＮＡＤ
（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+ への反応の逆反応となり、
従って、内因性アンモニウムイオンの消去のための反応
系で用いたギ酸脱水素酵素が、試料中の特定成分を測定
するための反応系においてもそのまま存在すると、特定
成分の測定値に誤差を与えてしまうからである。ギ酸脱
水素酵素阻害剤としては、アジ化ナトリウム、銅等の重
金属またはｐ−クロルメルクリ安息香酸を例示すること
ができる。そのうち、反応性、毒性及び環境の面からア
ジ化ナトリウムが特に好ましい。ギ酸脱水素酵素阻害剤
の使用量は、試料中に残存していると考えられるギ酸脱
水素酵素の量に応じて決定すればよい。
なわち、第２試薬の中には、ギ酸脱水素酵素阻害剤をい
れておくことが好ましい。すなわち、ギ酸脱水素酵素阻
害剤の存在下、試料中の特定成分を測定する方法が好ま
しい。なぜなら、試料中の内因性アンモニウムイオンの
消去のための反応系におけるギ酸脱水素酵素によるＮＡ
Ｄ（Ｐ）+ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応は、試料中の特
定成分を測定するための反応系の最終反応であるＮＡＤ
（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+ への反応の逆反応となり、
従って、内因性アンモニウムイオンの消去のための反応
系で用いたギ酸脱水素酵素が、試料中の特定成分を測定
するための反応系においてもそのまま存在すると、特定
成分の測定値に誤差を与えてしまうからである。ギ酸脱
水素酵素阻害剤としては、アジ化ナトリウム、銅等の重
金属またはｐ−クロルメルクリ安息香酸を例示すること
ができる。そのうち、反応性、毒性及び環境の面からア
ジ化ナトリウムが特に好ましい。ギ酸脱水素酵素阻害剤
の使用量は、試料中に残存していると考えられるギ酸脱
水素酵素の量に応じて決定すればよい。
【００３９】上記した特定成分を測定するために用いる
各試薬は、従来採用されている公知の量を用い、公知の
条件下で、試料中の特定成分と反応させて特定成分から
アンモニウムイオンを発生させ、この発生したアンモニ
ウムイオンに基づき特定成分を測定することができる。
実際に測定を実施するには、試薬に前記した内因性アン
モニウムイオンを消去するための試薬を加えて消去反応
を実施した後、そのまま上記の特定成分を測定するため
の各試薬を試料に添加して公知の方法に従って特定成分
の測定を行うことができる。
各試薬は、従来採用されている公知の量を用い、公知の
条件下で、試料中の特定成分と反応させて特定成分から
アンモニウムイオンを発生させ、この発生したアンモニ
ウムイオンに基づき特定成分を測定することができる。
実際に測定を実施するには、試薬に前記した内因性アン
モニウムイオンを消去するための試薬を加えて消去反応
を実施した後、そのまま上記の特定成分を測定するため
の各試薬を試料に添加して公知の方法に従って特定成分
の測定を行うことができる。
【００４０】アンモニウムイオンの本発明消去反応にお
いては、α−ＫＧ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下、ＧＬＤ
Ｈの作用により、当初から存在しているアンモニウムイ
オンが消去される。試料中の特定成分を測定するとき
は、アンモニウムイオンの本発明の消去反応により、当
初から存在していたアンモニウムイオンが特定成分の測
定に影響することを回避することができる。また、この
消去反応において、試薬の１つとして用いたＮＡＤ
（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）+ に変換されるが、本発明で
は、ＦＤＨ及びギ酸の作用により、その消去反応により
生成したＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻し、再利
用することができる。したがって、使用するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈは少量ですみ、多量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが特定成
分の測定に影響するのを回避することができる。
いては、α−ＫＧ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下、ＧＬＤ
Ｈの作用により、当初から存在しているアンモニウムイ
オンが消去される。試料中の特定成分を測定するとき
は、アンモニウムイオンの本発明の消去反応により、当
初から存在していたアンモニウムイオンが特定成分の測
定に影響することを回避することができる。また、この
消去反応において、試薬の１つとして用いたＮＡＤ
（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）+ に変換されるが、本発明で
は、ＦＤＨ及びギ酸の作用により、その消去反応により
生成したＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻し、再利
用することができる。したがって、使用するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈは少量ですみ、多量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが特定成
分の測定に影響するのを回避することができる。
【００４１】試料中の特定成分の量の測定は、その特定
成分からアンモニウムイオンを発生させ、その発生した
アンモニウムイオンの量を測定して行う。本発明におい
て、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分
からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分
を測定するには、試料中の特定成分よりアンモニウムイ
オンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素
阻害剤を含む前記した第２試薬を、試料からアンモニウ
ムイオンを消去した液に、そのまま、添加して行なうこ
とができる。試薬中の特定成分から発生したアンモニウ
ムイオンは、ＧＬＤＨ及びα−ＫＧの作用により、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）+ に変換させる。よって、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量から、原理的には、発生したアン
モニウムイオンを測定でき、したがって、試薬中の特定
成分を測定できることになる。
成分からアンモニウムイオンを発生させ、その発生した
アンモニウムイオンの量を測定して行う。本発明におい
て、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分
からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分
を測定するには、試料中の特定成分よりアンモニウムイ
オンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素
阻害剤を含む前記した第２試薬を、試料からアンモニウ
ムイオンを消去した液に、そのまま、添加して行なうこ
とができる。試薬中の特定成分から発生したアンモニウ
ムイオンは、ＧＬＤＨ及びα−ＫＧの作用により、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）+ に変換させる。よって、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量から、原理的には、発生したアン
モニウムイオンを測定でき、したがって、試薬中の特定
成分を測定できることになる。
【００４２】しかし、第２試薬の添加後、初めのうち
は、ＦＤＨ活性が残っているので、ＧＬＤＨにより変換
されたＮＡＤ（Ｐ）+ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻ることも
ある。したがって、第２試薬の添加後、初めのうちは、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量からは、発生したアンモニウム
イオンを正確に測定しずらい。しかしながら、ギ酸脱水
素酵素阻害剤の作用によりＦＤＨ活性が実質上無くなる
と、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）+ は、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈに戻らなくなる。その結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の単位時間当たりの減少量は、特定成分から発生したア
ンモニウムイオンの量にのみ依存してくる。したがっ
て、ＦＤＨ活性が実質上無くなったとき、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの単位時間当たりの減少量を測定して、すなわち、試
料中の特定成分を正確に測定できる。また、本発明の特
定成分測定方法は、測定時間が短いので、試料の量と試
薬量の少量化により、簡単に自動分析装置に適用できる
方法である。
は、ＦＤＨ活性が残っているので、ＧＬＤＨにより変換
されたＮＡＤ（Ｐ）+ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻ることも
ある。したがって、第２試薬の添加後、初めのうちは、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量からは、発生したアンモニウム
イオンを正確に測定しずらい。しかしながら、ギ酸脱水
素酵素阻害剤の作用によりＦＤＨ活性が実質上無くなる
と、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）+ は、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈに戻らなくなる。その結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の単位時間当たりの減少量は、特定成分から発生したア
ンモニウムイオンの量にのみ依存してくる。したがっ
て、ＦＤＨ活性が実質上無くなったとき、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの単位時間当たりの減少量を測定して、すなわち、試
料中の特定成分を正確に測定できる。また、本発明の特
定成分測定方法は、測定時間が短いので、試料の量と試
薬量の少量化により、簡単に自動分析装置に適用できる
方法である。
【００４３】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。 実施例１ アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素
窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測
定
する。 実施例１ アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素
窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測
定
【００４４】試料： 試料は、アンモニウムイオン１０
ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を
用いた。
ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を
用いた。
【００４５】第１試薬： 第１試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， ギ酸 １００ｍＭ， ＦＤＨ ２ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＨ ０．５ｍＭ， ＧＬＤＨ ６０ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００４６】第２試薬： 第２試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， ウレア−ゼ ４ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮａＮ3 ０．１％， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００４７】測定：試料０．０５ｍｌに第１試薬２．０
０ｍｌを加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬
２．００ｍｌを加えて３７℃で１分間放置した後、３４
０ｎｍにて２分間、吸光度の変化（時間当たりの吸光度
変化量）を測定する。あらかじめ作成した検量線より、
試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表１
に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニ
ウムイオン１０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確
に、尿素窒素を測定できる。
０ｍｌを加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬
２．００ｍｌを加えて３７℃で１分間放置した後、３４
０ｎｍにて２分間、吸光度の変化（時間当たりの吸光度
変化量）を測定する。あらかじめ作成した検量線より、
試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表１
に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニ
ウムイオン１０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確
に、尿素窒素を測定できる。
【００４８】実施例２ アンモニウムイオン２０ｍｇ／
ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の
尿素窒素の測定 アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍ
ｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１
試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因
性アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘
らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の
尿素窒素の測定 アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍ
ｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１
試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因
性アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘
らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００４９】実施例３ アンモニウムイオン３０ｍｇ／
ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の
尿素窒素の測定 アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍ
ｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１
試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因
性アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘
らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の
尿素窒素の測定 アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍ
ｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１
試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。
結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因
性アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘
らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００５０】比較例１〜３ ギ酸及びＦＤＨを第１試薬
に入れない場合の試料中の尿素窒素の測定 試料： 比較例１、２または３は、それぞれ、実施例
１、２または３と同様の試料を使用した。
に入れない場合の試料中の尿素窒素の測定 試料： 比較例１、２または３は、それぞれ、実施例
１、２または３と同様の試料を使用した。
【００５１】第１試薬： 第１試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， ＮＡＤＨ ０．５ｍＭ， ＧＬＤＨ ６０ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５２】第２試薬： 第２試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ ２０ｍＭ， ウレア−ゼ ４ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮａＮ3 ０．１％， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５３】測定： 比較例の第１試薬及び第２試薬を
用い、実施例１〜３の試料を、実施例１と同様に操作
し、比較例１〜３の結果を得た。それを表１に示す。ア
ンモニウムイオンが増加するに従い、見掛上、尿素窒素
の量が増加する現象が観察される。
用い、実施例１〜３の試料を、実施例１と同様に操作
し、比較例１〜３の結果を得た。それを表１に示す。ア
ンモニウムイオンが増加するに従い、見掛上、尿素窒素
の量が増加する現象が観察される。
【００５４】
【表１】 表１ 尿素窒素（５０ｍｇ／ｄｌ）の測定 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 含有アンモニウムイオン濃度 尿素窒素の測定結果 （ｍｇ／ｄｌ） （ｍｇ／ｄｌ） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 実施例１ １０ ５０．３ 実施例２ ２０ ５０．２ 実施例３ ３０ ５０．２ 比較例１ １０ ５７．５ 比較例２ ２０ ６５．９ 比較例３ ３０ ７３．０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 実施例１〜３は、ＦＤＨおよびギ酸を含む
【００５５】実施例４ 試薬溶解液を１週間放置した場
合の、本発明のギ酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒
素の測定 試料： 試料１は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの水溶
液を用いた。試料２は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌ及
びアンモニウムイオン濃度３００ｍｇ／ｄｌを含む水溶
液を用いた。
合の、本発明のギ酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒
素の測定 試料： 試料１は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの水溶
液を用いた。試料２は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌ及
びアンモニウムイオン濃度３００ｍｇ／ｄｌを含む水溶
液を用いた。
【００５６】試薬： 第１試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， ギ酸 １５ｍＭ， 塩化マグネシウム ０．２ｍＭ， ＦＤＨ １ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ， ＧＬＤＨ ５ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５７】第２試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， ＥＤＴＡ １００ｍＭ， ウレア−ゼ ８．２ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮａＮ3 ０．１％， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５８】試薬は、調製した第１試薬及び第２試薬を
３０℃で７日放置したものを使用した。一方、対照とし
て、調製したての第１試薬及び第２試薬を用いた。
３０℃で７日放置したものを使用した。一方、対照とし
て、調製したての第１試薬及び第２試薬を用いた。
【００５９】測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を
２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試
薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分
間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍに
て測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の
尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表２に示す。
ギ酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置して
も、尿素窒素を正確に測定することができることが判明
した。
２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試
薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分
間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍに
て測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の
尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表２に示す。
ギ酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置して
も、尿素窒素を正確に測定することができることが判明
した。
【００６０】比較例４ 試薬溶解液を１週間放置した場
合の、従来のイソクエン酸脱水素酵素法による試料中の
尿素窒素の測定 試料： 試料１及び試料２は、実施例４と同様のものを
用いた。 試薬： 第１試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， イソクエン酸 １５ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， 塩化マグネシウム ０．２ｍＭ， イソクエン酸脱水素酵素 １ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ， ＧＬＤＨ ５ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。第２試薬
は、実施例４と同様なものを用いた。試薬は、調製した
第１試薬及び第２試薬を３０℃で７日放置したものを使
用した。一方、対照として、調製したての第１試薬及び
第２試薬を用いた。
合の、従来のイソクエン酸脱水素酵素法による試料中の
尿素窒素の測定 試料： 試料１及び試料２は、実施例４と同様のものを
用いた。 試薬： 第１試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， イソクエン酸 １５ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， 塩化マグネシウム ０．２ｍＭ， イソクエン酸脱水素酵素 １ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ， ＧＬＤＨ ５ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。第２試薬
は、実施例４と同様なものを用いた。試薬は、調製した
第１試薬及び第２試薬を３０℃で７日放置したものを使
用した。一方、対照として、調製したての第１試薬及び
第２試薬を用いた。
【００６１】測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を
２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試
薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分
間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍに
て測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の
尿素窒素の濃度を求める。結果を表２に示す。イソクエ
ン酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置する
と、アンモニウムイオンの存在下では、尿素窒素を測定
できないことが判明した。
２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試
薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分
間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍに
て測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の
尿素窒素の濃度を求める。結果を表２に示す。イソクエ
ン酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置する
と、アンモニウムイオンの存在下では、尿素窒素を測定
できないことが判明した。
【００６２】
【表２】 表２ 尿素窒素（５０ｍｇ／ｄｌ）の測定 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 条件 放置期間 アンモニウムイオン 尿素窒素の測定結果 （ｍｇ／ｄｌ） （ｍｇ／ｄｌ） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 実施例４ ７日 ３００ ４９．７ 実施例４ ７日 ０ ５０．３ 実施例４ ０ ３００ ５０．０ 実施例４ ０ ０ ４９．８ 比較例４ ７日 ３００ 測定不能 比較例４ ７日 ０ ５０．１ 比較例４ ０ ３００ ４９．９ 比較例４ ０ ０ ５０．２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 測定不能：吸光度の変化量が一定にならないのでデータ得られず
【００６３】実施例５ アンモニウムイオンの消去能 本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するための試
薬のアンモニウムイオンの消去能を調べるため、下記の
組成の水溶液２ｍｌに０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液
または生理食塩水を０．０２ｍｌ添加し、３４０ｎｍの
波長で５分間吸光度を測定した。その時の吸光度の変化
の様子を図１に示す。試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， ギ酸 １００ｍＭ， ＦＤＨ １ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＨ ０．３５ｍＭ， ＧＬＤＨ ３０ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。図１か
ら、本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するため
の試薬を加えることによって、５分後にはアンモニウム
イオンを完全に消去できることが判明した。
薬のアンモニウムイオンの消去能を調べるため、下記の
組成の水溶液２ｍｌに０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液
または生理食塩水を０．０２ｍｌ添加し、３４０ｎｍの
波長で５分間吸光度を測定した。その時の吸光度の変化
の様子を図１に示す。試薬は、 グッド緩衝液 １００ｍＭ， α- ＫＧ １０ｍＭ， ギ酸 １００ｍＭ， ＦＤＨ １ｕｎｉｔ／ｍｌ， ＮＡＤＨ ０．３５ｍＭ， ＧＬＤＨ ３０ｕｎｉｔ／ｍｌ， を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。図１か
ら、本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するため
の試薬を加えることによって、５分後にはアンモニウム
イオンを完全に消去できることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】本発明によれば、本発明で用いる測定試
薬を溶解して長時間経過した場合であっても安定であ
り、従ってそれらの測定試薬を用いることによって、測
定時に誤差を与えやすい、試料中の内因性のアンモニウ
ムイオンを効率良く消去することができ、試料中の特定
成分を正確に精度良く測定することができる。特に、本
発明によれば、試料中にあらかじめ存在する高濃度のア
ンモニウムイオンを短時間で消去でき、試料中の特定成
分を正確に精度良く測定することができる。また、臨床
検査で繁用されている生化学自動分析装置でも測定する
ことができる。したがって、臨床検査に寄与すること大
である。
薬を溶解して長時間経過した場合であっても安定であ
り、従ってそれらの測定試薬を用いることによって、測
定時に誤差を与えやすい、試料中の内因性のアンモニウ
ムイオンを効率良く消去することができ、試料中の特定
成分を正確に精度良く測定することができる。特に、本
発明によれば、試料中にあらかじめ存在する高濃度のア
ンモニウムイオンを短時間で消去でき、試料中の特定成
分を正確に精度良く測定することができる。また、臨床
検査で繁用されている生化学自動分析装置でも測定する
ことができる。したがって、臨床検査に寄与すること大
である。
【図１】生理食塩水と０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液
を試料とし、これらに本発明の内因性アンモニウムイオ
ンを消去するため試薬を添加したときの３４０ｎｍにお
ける吸光度の変化の様子を示す。縦軸に吸光度、横軸に
時間を表わす。
を試料とし、これらに本発明の内因性アンモニウムイオ
ンを消去するため試薬を添加したときの３４０ｎｍにお
ける吸光度の変化の様子を示す。縦軸に吸光度、横軸に
時間を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/58 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/58
Claims (5)
- 【請求項１】 試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミ
ン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させ
て、試料中に当初から存在するアンモニウムイオンを消
去する方法。 - 【請求項２】 試料中の特定成分からアンモニウムイオ
ンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法におい
て、あらかじめ、その試料に、α−ケトグルタル酸、グ
ルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用
させて、試料中に当初から存在するアンモニウムイオン
を消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試
料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試
料中の特定成分を測定する方法。 - 【請求項３】 ギ酸脱水素酵素阻害剤がアジ化ナトリウ
ムである請求項２記載の試料中の特定成分を測定する方
法。 - 【請求項４】 試料中のアンモニウムイオンを消去する
ための試薬であって、α−ケトグルタル酸、グルタミン
酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬。 - 【請求項５】 試料中の特定成分を測定するキットであ
って、 ｉ）請求項４記載の試薬からなる第１試薬、及び ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生
させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含
む第２試薬、からなるキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00187396A JP3614962B2 (ja) | 1995-01-20 | 1996-01-10 | アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2458095 | 1995-01-20 | ||
| JP7-24580 | 1995-01-20 | ||
| JP00187396A JP3614962B2 (ja) | 1995-01-20 | 1996-01-10 | アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08252098A true JPH08252098A (ja) | 1996-10-01 |
| JP3614962B2 JP3614962B2 (ja) | 2005-01-26 |
Family
ID=26335164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00187396A Expired - Fee Related JP3614962B2 (ja) | 1995-01-20 | 1996-01-10 | アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3614962B2 (ja) |
-
1996
- 1996-01-10 JP JP00187396A patent/JP3614962B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3614962B2 (ja) | 2005-01-26 |
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