JPS5931697A - 検体の前処理法 - Google Patents
検体の前処理法Info
- Publication number
- JPS5931697A JPS5931697A JP14050082A JP14050082A JPS5931697A JP S5931697 A JPS5931697 A JP S5931697A JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP S5931697 A JPS5931697 A JP S5931697A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nadh
- specimen
- ammonia
- sample
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は検体の前処理方法に関するものである。更に詳
細には、本発明は尿、血液等の検体中に存在する目的物
質な7ンそニア生成系で定量するにあたり、予め、検体
中に存在するアンモニアを消去せしめる方法に関するも
のである。
細には、本発明は尿、血液等の検体中に存在する目的物
質な7ンそニア生成系で定量するにあたり、予め、検体
中に存在するアンモニアを消去せしめる方法に関するも
のである。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体に存在する反応
生成物として、アンモニアを生ずる物質、例えばクレア
チニン、尿素等の定置はクレアチニンあるいは尿素と特
異的に反応する試薬例えばアルカリピロリン酸(クレア
チニンの場合:、Taffe法)やジアセチルモノオキ
シム(尿素の場合: Fearon反応)を添加し、化
学反応により生じた物質の吸収極大なもって測定する方
法があった。
生成物として、アンモニアを生ずる物質、例えばクレア
チニン、尿素等の定置はクレアチニンあるいは尿素と特
異的に反応する試薬例えばアルカリピロリン酸(クレア
チニンの場合:、Taffe法)やジアセチルモノオキ
シム(尿素の場合: Fearon反応)を添加し、化
学反応により生じた物質の吸収極大なもって測定する方
法があった。
しかしながらこの化学的呈色法は検体中IC目的物質と
同様の呈色を示す物質が多数存在するという欠点があっ
て好ましくない。
同様の呈色を示す物質が多数存在するという欠点があっ
て好ましくない。
他の方法として、検体中のクレアチニンあるいは尿素を
アンモニアに変換せしめる酵素を用いてクレアチニンあ
るいは尿素をアンモニアに変換せしめ、生成したアンモ
ニアを定量することによりクレアチニンあるいは尿素の
量を知る方法があった。しかしこの方法も検体中にすで
に多量のアンモニアが混在するため、簡単な方法ながら
正確に定量できないという欠点があった。
アンモニアに変換せしめる酵素を用いてクレアチニンあ
るいは尿素をアンモニアに変換せしめ、生成したアンモ
ニアを定量することによりクレアチニンあるいは尿素の
量を知る方法があった。しかしこの方法も検体中にすで
に多量のアンモニアが混在するため、簡単な方法ながら
正確に定量できないという欠点があった。
本発明者等は、上記アンモニアの混在する検体でしかも
アンモニアを反応生成物として生じる物質の定量を研究
の結果、本発明を見い出した。即ち、本発明は検体中の
目的物質を定量するにあたり、検体にグルタミン酸脱水
素酵素(以下GzDHという)、2−オキソゲルタール
酸(以下α−にGという)、還元型ニコチンアミドアP
ニンジヌクレオチド(以下NADHという)そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド十 (以下NADという)を還元する酵素及び基質を添加混
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去せしめ
、その際生成されたNADHをNADHを還元せしめる
酵素を用いて再度NADHに変換せしめることを特徴と
する検体の前処理方法であり、更にはウレアーゼを添加
混合することを特徴とする検体の前処理方法を提供する
。
アンモニアを反応生成物として生じる物質の定量を研究
の結果、本発明を見い出した。即ち、本発明は検体中の
目的物質を定量するにあたり、検体にグルタミン酸脱水
素酵素(以下GzDHという)、2−オキソゲルタール
酸(以下α−にGという)、還元型ニコチンアミドアP
ニンジヌクレオチド(以下NADHという)そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド十 (以下NADという)を還元する酵素及び基質を添加混
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去せしめ
、その際生成されたNADHをNADHを還元せしめる
酵素を用いて再度NADHに変換せしめることを特徴と
する検体の前処理方法であり、更にはウレアーゼを添加
混合することを特徴とする検体の前処理方法を提供する
。
本発明の特色とするところは、検体中にすでに存在する
アンモニアを、GtDH,α−KG、 NADHによっ
てグルタミン酸と水に変化せしめるに、その際生成され
たNADHをNADHを還元せしめる酵素を用いて再度
NADHに変換せしめる点にあり更にはウレアーゼによ
って尿素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめ、その際生成されたNADHを再度NADHに変
換せしめる点にある。
アンモニアを、GtDH,α−KG、 NADHによっ
てグルタミン酸と水に変化せしめるに、その際生成され
たNADHをNADHを還元せしめる酵素を用いて再度
NADHに変換せしめる点にあり更にはウレアーゼによ
って尿素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめ、その際生成されたNADHを再度NADHに変
換せしめる点にある。
ここに本発明のアンモニア消去の反応系の一例を式(1
)で表わすと下記の通りとなる。
)で表わすと下記の通りとなる。
本発明において検体中存在するアンモニアをあらかじめ
消去させるには、第一に、既存のアンモニアとα−にG
より水とグルタミン酸を生成するG/!、DHが必須と
なる。
消去させるには、第一に、既存のアンモニアとα−にG
より水とグルタミン酸を生成するG/!、DHが必須と
なる。
この反応系には助酵票としてNADHの存在が必須であ
る。
る。
しかし、このGtDHi 及びNADHは後に定量す
る際の反応生成物であるアンモニアにも影豐するため、
すでに検体中に存在するアンそニアを予め消去するため
に必要な充分量を添加することはできない。
る際の反応生成物であるアンモニアにも影豐するため、
すでに検体中に存在するアンそニアを予め消去するため
に必要な充分量を添加することはできない。
そこで本発明は、目的物質の定量に影響を及ぼさない程
度のGtDH及びNADH添加量とするためNADHを
還元する酵素と基質を反応系に共存させることによって
NADHをNADHに変化せしめG/、DH及びNAD
Hの添加量を極力おさえることによって上記問題を解決
せしめ(5) た。
度のGtDH及びNADH添加量とするためNADHを
還元する酵素と基質を反応系に共存させることによって
NADHをNADHに変化せしめG/、DH及びNAD
Hの添加量を極力おさえることによって上記問題を解決
せしめ(5) た。
すなわちGtDH,NADHの添加量を少なくするため
に反応で生成するNAD を還元するインクエン酸脱
水素酵素(以下1CDHという)等のNAD を還元
する酵素を過剰のインクエン酸等のNADHを還元する
酵素反応基質と一緒に添加しておいて2−オキソゲルタ
ール酸(以下a−にGという)を生成させると同時にア
ンモニアをα−にGによって完全に水とグルタミン酸に
変化させてしまうのである。
に反応で生成するNAD を還元するインクエン酸脱
水素酵素(以下1CDHという)等のNAD を還元
する酵素を過剰のインクエン酸等のNADHを還元する
酵素反応基質と一緒に添加しておいて2−オキソゲルタ
ール酸(以下a−にGという)を生成させると同時にア
ンモニアをα−にGによって完全に水とグルタミン酸に
変化させてしまうのである。
式(1)の反応においてα−にGからグルタミン酸の変
化によりてNADHがNAD になると340nfn
による吸光度が一且は減少するが、l0DHによって再
びNADHに変化するために340a+i+による吸光
度は上昇し、吸光度の変化がなくなりたらアンモニアが
全部消費されたことになる 本発明のアンモニア消費群のうち、GtDHは必須であ
るが助酵素のNAD十を還元する酵素は1cDl−1r
−限らずNA[)十を助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することかできる。
化によりてNADHがNAD になると340nfn
による吸光度が一且は減少するが、l0DHによって再
びNADHに変化するために340a+i+による吸光
度は上昇し、吸光度の変化がなくなりたらアンモニアが
全部消費されたことになる 本発明のアンモニア消費群のうち、GtDHは必須であ
るが助酵素のNAD十を還元する酵素は1cDl−1r
−限らずNA[)十を助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することかできる。
例えばNAD+の場合は1CDH(EC1,1,1,4
1) 6ホスホグルコン酸脱水素酵素(以下6−PGD
Hという)(EC1,1,l。43〕 などがあり、
これらを用いる場合は、それぞれ過剰の基質としてイソ
クエン酸6PGをそれぞれ選択1して添加すればよい。
1) 6ホスホグルコン酸脱水素酵素(以下6−PGD
Hという)(EC1,1,l。43〕 などがあり、
これらを用いる場合は、それぞれ過剰の基質としてイソ
クエン酸6PGをそれぞれ選択1して添加すればよい。
更には検体中に多量存在するアンモニアを反応生成物と
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレアーゼを
添加することにより尿素を消去せしめることが出来る。
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレアーゼを
添加することにより尿素を消去せしめることが出来る。
これによって目的物質を定量するに用いる酵素がウレア
ーゼを混在する粗酵素の時に効果的である。
ーゼを混在する粗酵素の時に効果的である。
このようにして、検体中にすでに存在していたアンモニ
アは消去され、目的物質より7ンそニアを生成せしめる
酵素の作用tこよって生成するアンモニアは直接測定で
きる状態となったわけである。
アは消去され、目的物質より7ンそニアを生成せしめる
酵素の作用tこよって生成するアンモニアは直接測定で
きる状態となったわけである。
このように本発明はアンモニア混存検体中のアンモニア
を生成せしめる物質の定量においで、予じめ検体中ンこ
存在するアンモニアを消去せしめたために引続き同一反
応系で直接アンモニアを生成せしめる物質の定量を可能
としたもので、アンモニアを生成せしめる物質の自動分
析にきわめて適した方法である。
を生成せしめる物質の定量においで、予じめ検体中ンこ
存在するアンモニアを消去せしめたために引続き同一反
応系で直接アンモニアを生成せしめる物質の定量を可能
としたもので、アンモニアを生成せしめる物質の自動分
析にきわめて適した方法である。
次に本発明の実施例を示す
実施 例 クレアチニンの定置の場合a−KG
a、9mM NADH0,06mM イソクエン酸 4.5mM 塩化マグネシウム 4.5 mMiCDH2
,2LI/窮1 GzDH(牛肝臓由来) 】su7mtGzDH(
酵母) 30u/mj以上を含有する0、1
M)!Jス塩酸緩衝液(PH7,5) 3dに2mMア
ンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン含有
検体(A=0.12wr9/Kl、 B=0.24mf
l/d。
a、9mM NADH0,06mM イソクエン酸 4.5mM 塩化マグネシウム 4.5 mMiCDH2
,2LI/窮1 GzDH(牛肝臓由来) 】su7mtGzDH(
酵母) 30u/mj以上を含有する0、1
M)!Jス塩酸緩衝液(PH7,5) 3dに2mMア
ンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン含有
検体(A=0.12wr9/Kl、 B=0.24mf
l/d。
C−0,48膳y/d%D−0.96mg/WJ) z
oμtを添加した。
oμtを添加した。
それぞれ25℃で5分間保温した1340nmの吸光度
を測定し、吸光度の変化が停止したところで5mM N
ADPI−140stを添加し、340 nm の吸
光度の増加を約2分間追跡した後、20u/d クレア
チニンデイミナーゼ 50μtを添加L、340 nm
の吸光度の減少を測定した。
を測定し、吸光度の変化が停止したところで5mM N
ADPI−140stを添加し、340 nm の吸
光度の増加を約2分間追跡した後、20u/d クレア
チニンデイミナーゼ 50μtを添加L、340 nm
の吸光度の減少を測定した。
△E A−0,042B−0,085C=0.169
D−0,339であった。
D−0,339であった。
これを次式により針算した結果、検体中にすでに存在し
ていたアンモニア2mMは完全に消去され、引き続ぎ測
定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中のクレ
アチニン含量が定量された。
ていたアンモニア2mMは完全に消去され、引き続ぎ測
定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中のクレ
アチニン含量が定量された。
クレアチニン量
△E、、、NADHの減少による吸光度の減少a、s+
−NADHのxmMの吸光度 3.14−全反応液量 0.02−検体量113−ク
レアチニンの分子量 実 施 例 2 クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用いてのクレア
チニンの定量の場合 α−にG 3.9mM NADH0,06mM イソクエン酸 4.5mM塩化マグネ
シウム 4.5 mMiCDH2,2u/
1l GtDH(牛肝臓由来) 18u/IRIG/、
DH(酵母) 30u/II/以上を含有
する。、 IM ) vス塩酸緩衝液(PH7,5)3
1!/に2r11N71アンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体(0,481
19/Isl )20μLを添加した。これを25℃で
5分間保温した後340 am の吸光度を測定し吸光
度の変化が停止したところで、5mM NADFIH4
0at を添加し、340 nm の吸光度の増加
を約2分間追跡した後、 20u/mg クレアチニ
ンデイミナーゼの粗酵素液50μtを添加し340 n
mの吸光度の減少を測定した。
−NADHのxmMの吸光度 3.14−全反応液量 0.02−検体量113−ク
レアチニンの分子量 実 施 例 2 クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用いてのクレア
チニンの定量の場合 α−にG 3.9mM NADH0,06mM イソクエン酸 4.5mM塩化マグネ
シウム 4.5 mMiCDH2,2u/
1l GtDH(牛肝臓由来) 18u/IRIG/、
DH(酵母) 30u/II/以上を含有
する。、 IM ) vス塩酸緩衝液(PH7,5)3
1!/に2r11N71アンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体(0,481
19/Isl )20μLを添加した。これを25℃で
5分間保温した後340 am の吸光度を測定し吸光
度の変化が停止したところで、5mM NADFIH4
0at を添加し、340 nm の吸光度の増加
を約2分間追跡した後、 20u/mg クレアチニ
ンデイミナーゼの粗酵素液50μtを添加し340 n
mの吸光度の減少を測定した。
このときの吸光度の変化は0.327であった。
この吸光度変化は、クレアチニン含量の2倍近いIIh
を示した。
を示した。
一方クレアチニン含有検体を添加した際にウレテーゼを
検体当りIOL+添加した場合についても、同様の操作
を行ない340 nrn の吸光度の減少を測定した
ところ0169であった。
検体当りIOL+添加した場合についても、同様の操作
を行ない340 nrn の吸光度の減少を測定した
ところ0169であった。
この吸光度変化は、クレアチニン含量に一致した。
(ト1 )
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ 検体中の目的物質を定量するにあたり、検体ニクル
タミン酸脱水素酵素、2−オキソグルタ÷ル酸、還元型
ニコチンアミド7デニンジヌクレオチドそしてニコチン
アミド7デニンジヌクレオチドを還元する酵素及び基質
を添加混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消
去せしめ、その際生成されたニコチンアミド7デニンジ
ヌクレオチドをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
を還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニコチンアミド
7デニンジヌクレオチドに変換せしめることを特徴とす
る検体の前処理方法。 ■ 更にウレアーゼを添加混合することを特徴とする特
許請求範囲第1項記載の検体の前処理方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5931697A true JPS5931697A (ja) | 1984-02-20 |
JPH0218075B2 JPH0218075B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270074
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14050082A Granted JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5931697A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61247400A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-04 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050082A patent/JPS5931697A/ja active Granted
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61247400A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-04 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0218075B2 (ja) | 1990-04-24 |
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