JPS5931697A - 検体の前処理法 - Google Patents
検体の前処理法Info
- Publication number
- JPS5931697A JPS5931697A JP14050082A JP14050082A JPS5931697A JP S5931697 A JPS5931697 A JP S5931697A JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP S5931697 A JPS5931697 A JP S5931697A
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- Japan
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- nadh
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- ammonia
- sample
- enzyme
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は検体の前処理方法に関するものである。更に詳
細には、本発明は尿、血液等の検体中に存在する目的物
質な７ンそニア生成系で定量するにあたり、予め、検体
中に存在するアンモニアを消去せしめる方法に関するも
のである。
細には、本発明は尿、血液等の検体中に存在する目的物
質な７ンそニア生成系で定量するにあたり、予め、検体
中に存在するアンモニアを消去せしめる方法に関するも
のである。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体に存在する反応
生成物として、アンモニアを生ずる物質、例えばクレア
チニン、尿素等の定置はクレアチニンあるいは尿素と特
異的に反応する試薬例えばアルカリピロリン酸（クレア
チニンの場合：、Ｔａｆｆｅ法）やジアセチルモノオキ
シム（尿素の場合： Ｆｅａｒｏｎ反応）を添加し、化
学反応により生じた物質の吸収極大なもって測定する方
法があった。
生成物として、アンモニアを生ずる物質、例えばクレア
チニン、尿素等の定置はクレアチニンあるいは尿素と特
異的に反応する試薬例えばアルカリピロリン酸（クレア
チニンの場合：、Ｔａｆｆｅ法）やジアセチルモノオキ
シム（尿素の場合： Ｆｅａｒｏｎ反応）を添加し、化
学反応により生じた物質の吸収極大なもって測定する方
法があった。
しかしながらこの化学的呈色法は検体中ＩＣ目的物質と
同様の呈色を示す物質が多数存在するという欠点があっ
て好ましくない。
同様の呈色を示す物質が多数存在するという欠点があっ
て好ましくない。
他の方法として、検体中のクレアチニンあるいは尿素を
アンモニアに変換せしめる酵素を用いてクレアチニンあ
るいは尿素をアンモニアに変換せしめ、生成したアンモ
ニアを定量することによりクレアチニンあるいは尿素の
量を知る方法があった。しかしこの方法も検体中にすで
に多量のアンモニアが混在するため、簡単な方法ながら
正確に定量できないという欠点があった。
アンモニアに変換せしめる酵素を用いてクレアチニンあ
るいは尿素をアンモニアに変換せしめ、生成したアンモ
ニアを定量することによりクレアチニンあるいは尿素の
量を知る方法があった。しかしこの方法も検体中にすで
に多量のアンモニアが混在するため、簡単な方法ながら
正確に定量できないという欠点があった。
本発明者等は、上記アンモニアの混在する検体でしかも
アンモニアを反応生成物として生じる物質の定量を研究
の結果、本発明を見い出した。即ち、本発明は検体中の
目的物質を定量するにあたり、検体にグルタミン酸脱水
素酵素（以下ＧｚＤＨという）、２−オキソゲルタール
酸（以下α−にＧという）、還元型ニコチンアミドアＰ
ニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨという）そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド十 （以下ＮＡＤという）を還元する酵素及び基質を添加混
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去せしめ
、その際生成されたＮＡＤＨをＮＡＤＨを還元せしめる
酵素を用いて再度ＮＡＤＨに変換せしめることを特徴と
する検体の前処理方法であり、更にはウレアーゼを添加
混合することを特徴とする検体の前処理方法を提供する
。
アンモニアを反応生成物として生じる物質の定量を研究
の結果、本発明を見い出した。即ち、本発明は検体中の
目的物質を定量するにあたり、検体にグルタミン酸脱水
素酵素（以下ＧｚＤＨという）、２−オキソゲルタール
酸（以下α−にＧという）、還元型ニコチンアミドアＰ
ニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨという）そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド十 （以下ＮＡＤという）を還元する酵素及び基質を添加混
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去せしめ
、その際生成されたＮＡＤＨをＮＡＤＨを還元せしめる
酵素を用いて再度ＮＡＤＨに変換せしめることを特徴と
する検体の前処理方法であり、更にはウレアーゼを添加
混合することを特徴とする検体の前処理方法を提供する
。
本発明の特色とするところは、検体中にすでに存在する
アンモニアを、ＧｔＤＨ，α−ＫＧ、 ＮＡＤＨによっ
てグルタミン酸と水に変化せしめるに、その際生成され
たＮＡＤＨをＮＡＤＨを還元せしめる酵素を用いて再度
ＮＡＤＨに変換せしめる点にあり更にはウレアーゼによ
って尿素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめ、その際生成されたＮＡＤＨを再度ＮＡＤＨに変
換せしめる点にある。
アンモニアを、ＧｔＤＨ，α−ＫＧ、 ＮＡＤＨによっ
てグルタミン酸と水に変化せしめるに、その際生成され
たＮＡＤＨをＮＡＤＨを還元せしめる酵素を用いて再度
ＮＡＤＨに変換せしめる点にあり更にはウレアーゼによ
って尿素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめ、その際生成されたＮＡＤＨを再度ＮＡＤＨに変
換せしめる点にある。
ここに本発明のアンモニア消去の反応系の一例を式（１
）で表わすと下記の通りとなる。
）で表わすと下記の通りとなる。
本発明において検体中存在するアンモニアをあらかじめ
消去させるには、第一に、既存のアンモニアとα−にＧ
より水とグルタミン酸を生成するＧ／！、ＤＨが必須と
なる。
消去させるには、第一に、既存のアンモニアとα−にＧ
より水とグルタミン酸を生成するＧ／！、ＤＨが必須と
なる。
この反応系には助酵票としてＮＡＤＨの存在が必須であ
る。
る。
しかし、このＧｔＤＨｉ 及びＮＡＤＨは後に定量す
る際の反応生成物であるアンモニアにも影豐するため、
すでに検体中に存在するアンそニアを予め消去するため
に必要な充分量を添加することはできない。
る際の反応生成物であるアンモニアにも影豐するため、
すでに検体中に存在するアンそニアを予め消去するため
に必要な充分量を添加することはできない。
そこで本発明は、目的物質の定量に影響を及ぼさない程
度のＧｔＤＨ及びＮＡＤＨ添加量とするためＮＡＤＨを
還元する酵素と基質を反応系に共存させることによって
ＮＡＤＨをＮＡＤＨに変化せしめＧ／、ＤＨ及びＮＡＤ
Ｈの添加量を極力おさえることによって上記問題を解決
せしめ（５） た。
度のＧｔＤＨ及びＮＡＤＨ添加量とするためＮＡＤＨを
還元する酵素と基質を反応系に共存させることによって
ＮＡＤＨをＮＡＤＨに変化せしめＧ／、ＤＨ及びＮＡＤ
Ｈの添加量を極力おさえることによって上記問題を解決
せしめ（５） た。
すなわちＧｔＤＨ，ＮＡＤＨの添加量を少なくするため
に反応で生成するＮＡＤ を還元するインクエン酸脱
水素酵素（以下１ＣＤＨという）等のＮＡＤ を還元
する酵素を過剰のインクエン酸等のＮＡＤＨを還元する
酵素反応基質と一緒に添加しておいて２−オキソゲルタ
ール酸（以下ａ−にＧという）を生成させると同時にア
ンモニアをα−にＧによって完全に水とグルタミン酸に
変化させてしまうのである。
に反応で生成するＮＡＤ を還元するインクエン酸脱
水素酵素（以下１ＣＤＨという）等のＮＡＤ を還元
する酵素を過剰のインクエン酸等のＮＡＤＨを還元する
酵素反応基質と一緒に添加しておいて２−オキソゲルタ
ール酸（以下ａ−にＧという）を生成させると同時にア
ンモニアをα−にＧによって完全に水とグルタミン酸に
変化させてしまうのである。
式（１）の反応においてα−にＧからグルタミン酸の変
化によりてＮＡＤＨがＮＡＤ になると３４０ｎｆｎ
による吸光度が一且は減少するが、ｌ０ＤＨによって再
びＮＡＤＨに変化するために３４０ａ＋ｉ＋による吸光
度は上昇し、吸光度の変化がなくなりたらアンモニアが
全部消費されたことになる 本発明のアンモニア消費群のうち、ＧｔＤＨは必須であ
るが助酵素のＮＡＤ十を還元する酵素は１ｃＤｌ−１ｒ
−限らずＮＡ［）十を助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することかできる。
化によりてＮＡＤＨがＮＡＤ になると３４０ｎｆｎ
による吸光度が一且は減少するが、ｌ０ＤＨによって再
びＮＡＤＨに変化するために３４０ａ＋ｉ＋による吸光
度は上昇し、吸光度の変化がなくなりたらアンモニアが
全部消費されたことになる 本発明のアンモニア消費群のうち、ＧｔＤＨは必須であ
るが助酵素のＮＡＤ十を還元する酵素は１ｃＤｌ−１ｒ
−限らずＮＡ［）十を助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することかできる。
例えばＮＡＤ＋の場合は１ＣＤＨ（ＥＣ１，１，１，４
１） ６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６−ＰＧＤ
Ｈという）（ＥＣ１，１，ｌ。４３〕 などがあり、
これらを用いる場合は、それぞれ過剰の基質としてイソ
クエン酸６ＰＧをそれぞれ選択１して添加すればよい。
１） ６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６−ＰＧＤ
Ｈという）（ＥＣ１，１，ｌ。４３〕 などがあり、
これらを用いる場合は、それぞれ過剰の基質としてイソ
クエン酸６ＰＧをそれぞれ選択１して添加すればよい。
更には検体中に多量存在するアンモニアを反応生成物と
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレアーゼを
添加することにより尿素を消去せしめることが出来る。
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレアーゼを
添加することにより尿素を消去せしめることが出来る。
これによって目的物質を定量するに用いる酵素がウレア
ーゼを混在する粗酵素の時に効果的である。
ーゼを混在する粗酵素の時に効果的である。
このようにして、検体中にすでに存在していたアンモニ
アは消去され、目的物質より７ンそニアを生成せしめる
酵素の作用ｔこよって生成するアンモニアは直接測定で
きる状態となったわけである。
アは消去され、目的物質より７ンそニアを生成せしめる
酵素の作用ｔこよって生成するアンモニアは直接測定で
きる状態となったわけである。
このように本発明はアンモニア混存検体中のアンモニア
を生成せしめる物質の定量においで、予じめ検体中ンこ
存在するアンモニアを消去せしめたために引続き同一反
応系で直接アンモニアを生成せしめる物質の定量を可能
としたもので、アンモニアを生成せしめる物質の自動分
析にきわめて適した方法である。
を生成せしめる物質の定量においで、予じめ検体中ンこ
存在するアンモニアを消去せしめたために引続き同一反
応系で直接アンモニアを生成せしめる物質の定量を可能
としたもので、アンモニアを生成せしめる物質の自動分
析にきわめて適した方法である。
次に本発明の実施例を示す
実施 例 クレアチニンの定置の場合ａ−ＫＧ
ａ、９ｍＭ ＮＡＤＨ０，０６ｍＭ イソクエン酸 ４．５ｍＭ 塩化マグネシウム ４．５ ｍＭｉＣＤＨ２
，２ＬＩ／窮１ ＧｚＤＨ（牛肝臓由来） 】ｓｕ７ｍｔＧｚＤＨ（
酵母） ３０ｕ／ｍｊ以上を含有する０、１
Ｍ）！Ｊス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５） ３ｄに２ｍＭア
ンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン含有
検体（Ａ＝０．１２ｗｒ９／Ｋｌ、 Ｂ＝０．２４ｍｆ
ｌ／ｄ。
ａ、９ｍＭ ＮＡＤＨ０，０６ｍＭ イソクエン酸 ４．５ｍＭ 塩化マグネシウム ４．５ ｍＭｉＣＤＨ２
，２ＬＩ／窮１ ＧｚＤＨ（牛肝臓由来） 】ｓｕ７ｍｔＧｚＤＨ（
酵母） ３０ｕ／ｍｊ以上を含有する０、１
Ｍ）！Ｊス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５） ３ｄに２ｍＭア
ンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン含有
検体（Ａ＝０．１２ｗｒ９／Ｋｌ、 Ｂ＝０．２４ｍｆ
ｌ／ｄ。
Ｃ−０，４８膳ｙ／ｄ％Ｄ−０．９６ｍｇ／ＷＪ） ｚ
ｏμｔを添加した。
ｏμｔを添加した。
それぞれ２５℃で５分間保温した１３４０ｎｍの吸光度
を測定し、吸光度の変化が停止したところで５ｍＭ Ｎ
ＡＤＰＩ−１４０ｓｔを添加し、３４０ ｎｍ の吸
光度の増加を約２分間追跡した後、２０ｕ／ｄ クレア
チニンデイミナーゼ ５０μｔを添加Ｌ、３４０ ｎｍ
の吸光度の減少を測定した。
を測定し、吸光度の変化が停止したところで５ｍＭ Ｎ
ＡＤＰＩ−１４０ｓｔを添加し、３４０ ｎｍ の吸
光度の増加を約２分間追跡した後、２０ｕ／ｄ クレア
チニンデイミナーゼ ５０μｔを添加Ｌ、３４０ ｎｍ
の吸光度の減少を測定した。
△Ｅ Ａ−０，０４２Ｂ−０，０８５Ｃ＝０．１６９
Ｄ−０，３３９であった。
Ｄ−０，３３９であった。
これを次式により針算した結果、検体中にすでに存在し
ていたアンモニア２ｍＭは完全に消去され、引き続ぎ測
定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中のクレ
アチニン含量が定量された。
ていたアンモニア２ｍＭは完全に消去され、引き続ぎ測
定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中のクレ
アチニン含量が定量された。
クレアチニン量
△Ｅ、、、ＮＡＤＨの減少による吸光度の減少ａ、ｓ＋
−ＮＡＤＨのｘｍＭの吸光度 ３．１４−全反応液量 ０．０２−検体量１１３−ク
レアチニンの分子量 実 施 例 ２ クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用いてのクレア
チニンの定量の場合 α−にＧ ３．９ｍＭ ＮＡＤＨ０，０６ｍＭ イソクエン酸 ４．５ｍＭ塩化マグネ
シウム ４．５ ｍＭｉＣＤＨ２，２ｕ／
１ｌ ＧｔＤＨ（牛肝臓由来） １８ｕ／ＩＲＩＧ／、
ＤＨ（酵母） ３０ｕ／ＩＩ／以上を含有
する。、 ＩＭ ） ｖス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）３
１！／に２ｒ１１Ｎ７１アンモニア並びに２ｍＭ尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（０，４８１
１９／Ｉｓｌ ）２０μＬを添加した。これを２５℃で
５分間保温した後３４０ ａｍ の吸光度を測定し吸光
度の変化が停止したところで、５ｍＭ ＮＡＤＦＩＨ４
０ａｔ を添加し、３４０ ｎｍ の吸光度の増加
を約２分間追跡した後、 ２０ｕ／ｍｇ クレアチニ
ンデイミナーゼの粗酵素液５０μｔを添加し３４０ ｎ
ｍの吸光度の減少を測定した。
−ＮＡＤＨのｘｍＭの吸光度 ３．１４−全反応液量 ０．０２−検体量１１３−ク
レアチニンの分子量 実 施 例 ２ クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用いてのクレア
チニンの定量の場合 α−にＧ ３．９ｍＭ ＮＡＤＨ０，０６ｍＭ イソクエン酸 ４．５ｍＭ塩化マグネ
シウム ４．５ ｍＭｉＣＤＨ２，２ｕ／
１ｌ ＧｔＤＨ（牛肝臓由来） １８ｕ／ＩＲＩＧ／、
ＤＨ（酵母） ３０ｕ／ＩＩ／以上を含有
する。、 ＩＭ ） ｖス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）３
１！／に２ｒ１１Ｎ７１アンモニア並びに２ｍＭ尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（０，４８１
１９／Ｉｓｌ ）２０μＬを添加した。これを２５℃で
５分間保温した後３４０ ａｍ の吸光度を測定し吸光
度の変化が停止したところで、５ｍＭ ＮＡＤＦＩＨ４
０ａｔ を添加し、３４０ ｎｍ の吸光度の増加
を約２分間追跡した後、 ２０ｕ／ｍｇ クレアチニ
ンデイミナーゼの粗酵素液５０μｔを添加し３４０ ｎ
ｍの吸光度の減少を測定した。
このときの吸光度の変化は０．３２７であった。
この吸光度変化は、クレアチニン含量の２倍近いＩＩｈ
を示した。
を示した。
一方クレアチニン含有検体を添加した際にウレテーゼを
検体当りＩＯＬ＋添加した場合についても、同様の操作
を行ない３４０ ｎｒｎ の吸光度の減少を測定した
ところ０１６９であった。
検体当りＩＯＬ＋添加した場合についても、同様の操作
を行ない３４０ ｎｒｎ の吸光度の減少を測定した
ところ０１６９であった。
この吸光度変化は、クレアチニン含量に一致した。
（ト１ ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ 検体中の目的物質を定量するにあたり、検体ニクル
タミン酸脱水素酵素、２−オキソグルタ÷ル酸、還元型
ニコチンアミド７デニンジヌクレオチドそしてニコチン
アミド７デニンジヌクレオチドを還元する酵素及び基質
を添加混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消
去せしめ、その際生成されたニコチンアミド７デニンジ
ヌクレオチドをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
を還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニコチンアミド
７デニンジヌクレオチドに変換せしめることを特徴とす
る検体の前処理方法。 ■ 更にウレアーゼを添加混合することを特徴とする特
許請求範囲第１項記載の検体の前処理方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931697A true JPS5931697A (ja) | 1984-02-20 |
| JPH0218075B2 JPH0218075B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14050082A Granted JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5931697A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61247400A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-04 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050082A patent/JPS5931697A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61247400A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-04 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0218075B2 (ja) | 1990-04-24 |
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